CN101056651A - 增强针对疫苗的免疫应答的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于增强针对抗原或疫苗的免疫应答的方法，所述方法包括基本上与施用有效量的抗原或疫苗同时进行口腔粘膜施用有效量的Th1刺激性细胞因子，优选地是干扰素。

Description

增强针对疫苗的免疫应答的方法
                         发明背景
发明领域
本发明涉及用于增强对接种的免疫应答的方法。更具体地，涉及干扰素、和/或其它Th1刺激性细胞因子的应用，如在用于增强在疫苗施用后的免疫应答的免疫佐剂中的应用。
相关技术的描述
疫苗是本领域内已知的。一般地，它们包括杀死的或减毒的病原体和亚单位疫苗，或包括另一种抗原的疫苗，其中针对所述另一种抗原的免疫应答是需要的，施用所述疫苗，目的是预防、改善或治疗传染性疾病。
特别地，亚单位疫苗是基于衍生于病原体的成分的抗原的疫苗，所述抗原被认为是由宿主免疫系统介导的保护的重要靶点。尽管已证明是高度安全的，但是，由于它们所基于的抗原有极低的免疫原性或是非免疫原性的，所以亚单位疫苗经常诱导不充分的免疫应答。
因此，为了提高免疫原性，亚单位疫苗通常需要包括或与佐剂一起施用。免疫学将佐剂定义为“用于增强抗原性的载体”(Stedman′s MedicalDictionary，2003)。因此，当与抗原一起施用时，与单独的抗原相比较，佐剂是增强其抗原性的物质。
尽管许多类型的佐剂已经用于动物模型，并且经典的实验包括油包水的乳剂，其中抗原溶液在矿物油(弗氏不完全佐剂)中乳化，有时包括杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)，吸附抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸铝)的混悬液，皂角苷和衍生于LPS的产物，目前，基于铝的矿物盐是人疫苗制剂常规所包含的唯一的佐剂。尽管是安全的，这样的盐是抗体诱导的微弱佐剂，并且不能刺激经典的细胞介导的免疫应答。
抗体和细胞介导的应答的诱导都需要提供针对侵入的病原体的高度有效的抵御，目的是限制它们扩散或消除它们。疫苗需要提供或诱导2种类型的信号，以便激发强的、保护性的免疫应答。首先，疫苗需要递送所述抗原，其引发T和B淋巴细胞上的抗原特异性受体。其次，有效的疫苗需要通过抗原呈递细胞诱导共刺激性分子的表达，然后其提高引发抗原的淋巴细胞促进强应答。当应用含有活的病原体的疫苗时，这种第二信号通常由与干扰素相关的因子提供，但是通常在亚单位疫苗中缺少这种第二信号，这导致它们极低的免疫原性。加入可以促成这种第二信号的佐剂将增强疫苗的效力，并且还可以控制所激发的免疫应答的类型。
这些信号指导宿主的免疫系统向后续的效应器机制发展，其突出了针对所给的传染性介质的全面免疫应答的类型和效力的特征。
细胞因子代表在针对抗原和传染性介质的免疫应答过程期间，参与免疫活性细胞之间的通讯的主要因子，所述免疫活性细胞包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、和树突细胞。关于小鼠和人T辅助(Th)克隆的许多研究提供了大量的证据证明由Th细胞(叫作Th1和Th2)展现出的不同的活性的存在，其是从细胞因子分泌的模式推断出来的。因此，认为IFN-γ或IL-4的产生分别是Th1或Th2应答的典型特点。Th1型的免疫应答通常与小鼠中IgG2a的产生和细胞免疫性的发展相关，而Th2型应答与IgE产生、嗜伊红粒细胞和巨细胞的产生相关。通常认为Th1型免疫应答的诱导有助于产生针对病毒和某些细菌感染的保护性免疫应答。在这点上，重要地，注意到临床上可用的佐剂，诸如基于铝的矿物盐，倾向于诱导Th2型免疫应答，其可以引起促成它们不必要的副作用的变态反应。
在高危组，包括老年人和具有损害的免疫应答的个体中，流感接种减少由流感传染引起的发病率和死亡率，但是在所有受体中其不是完全保护性的(Oxford等.，2003)。由于这样的疫苗激发极少的细胞毒性T细胞应答，并且血凝素抑制性(HI)抗体滴度通常用作保护的替代标记，所以认为由常规所用的亚单位疫苗提供的保护主要是由于针对病毒血凝素的抗体的产生。针对病毒抗原的中和性抗体(IgG2a)的产生需要CD4+T辅助细胞的参与，其识别与MHC类别II抗原相关的抗原，并且在针对流感接种“处于危险中”未应答者中观察到HLA-DRB1*7多态性频率的增加(Gelder等.，2002)。
高度有效的佐剂的缺乏组成了成功开发疫苗，特别是针对胞内病原体、需要细胞免疫性的那些疫苗的显著的障碍。目前，存在对于有效的非毒性组合物或能够增强针对流感和其它疫苗的抗体应答的方法的尚未满足的需要。
在这方面，由于上文证明的特点，在本领域将细胞因子，和特别的是干扰素(IFNs)，视作可能的佐剂(Heat等.，1992)。
干扰素是多功能细胞因子，其基于结构分类为：
i)I型IFNs，由没有内含子的基因编码，并且其包括由所有的细胞型有效产生的IFN-α家族，其中的至少13种功能性IFN-α亚型，IFN-β和IFN-ω。
ii)II型IFN，由含有单个内含子的基因编码，也叫作IFN-γ，并且主要由T细胞和NK细胞应答特异的抗原或促分裂原而产生。
最初被认为是简单的抗病毒物质，后来表明I型IFNs显示出各种生物作用，包括在实验动物模型以及在患者中的抗肿瘤活性。
已经表明I型和II型IFNs在体外对抗体产生和T细胞增殖发挥有效的抑制性作用，这引起这样的问题，即，这些细胞因子是否将在体内以刺激性或抑制性的方式起作用。最近，在不同的模型系统中获得的全体数据表明I型IFN在诱导Th1型免疫应答和支持某些T细胞亚型的增殖、功能性活性和存活中的重要性(Belardelli F.和Gresser I.，1996；和Tough等.，1996)。
I型干扰素是目前在临床实践中应用最广泛的细胞因子。特别地，IFN-α在全世界多于40个国家中用于治疗一些病毒疾病(特别是丙型肝炎)和各种类型的人癌症，包括一些血液恶性病(毛细胞白血病，慢性髓细胞白血病，一些B和T细胞淋巴瘤)和某些实体瘤，诸如黑素瘤，肾癌和卡波西肉瘤。相反，发现IFN-γ有限的临床应用，至少部分是由于毒性。在最近的几年间，一些研究提供了这样的证据，即，由I型和II型IFNs行使的生物作用可以在活性类型上在不同的实验模型中基本上不同。在一些情形中，诸如黑素瘤和多发性硬化中，IFN-γ的临床应用引起与关于用I型IFN所获得的那些作用相反的作用。
尽管其广泛的临床应用，I型IFN还没有用作人中的疫苗佐剂。
IFNs在体内作为疫苗中的佐剂的相关应用已经为II型IFN(即，IFN-γ)显示出来。特别地，在EP 0241725中，描述了一种疫苗，其含有衍生于用约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)的剧毒YM系感染的小鼠血细胞的粗蛋白提取物，其包括IFN-γ作为佐剂。包含在疫苗中的IFN-γ的用量指定在每剂1,000-10,000单位范围内，其中产生所述佐剂效果的IFN-γ的用量指定在100-50,000单位。所用的剂量是5,000单位，即使低于200单位的剂量也表明是有效的。
一些现有技术文献考虑到I型IFN作为佐剂的应用，并且表明，当用作疫苗佐剂时，I型IFN增强体内的保护性Th1型应答。
IFN-α是一种有力的多克隆B细胞激活剂，其诱导强的初级体液免疫应答，所述体液免疫应答特征在于同种型转换和抗病毒激发的保护(LeBon等.，2001)。事实上，已经表明由浆细胞样树突状细胞应答病毒感染而分泌的IFN-α诱导B淋巴细胞分化成为产生抗原的浆细胞，并且必要地产生应答流感感染的特异性和多克隆的IgGs(Jego，2003)。并且，还表明IFN-α刺激特征为Th1免疫性的IgG2a抗体应答和抗病毒感染的保护(Le Bon等.，2001)，并且还表明，当与流感疫苗混合并且肌内注射时，其为异常有力的佐剂(Proietti等.，2002)。相反，佐剂，诸如明矾，加强产生特征为Th2应答的IgG1。还表明IFN-α显著地增强人扁桃腺B细胞应答抗IgM抗体的增殖。另外，口腔粘膜施用的IFN-α，当与人流感疫苗混合并且同时施用时，表明其为活性粘膜佐剂，导致分泌性IgA增强的水平(Proietti等.，2002)。
I型干扰素，主要为干扰素α(IFN-α)和干扰素β(IFN-β)，作为针对传染性介质的先天性免疫应答的部分在黏膜表面产生。重组IFN-α的口腔粘膜施用模拟IFN的口腔粘膜产生，并且表明其赋予抗病毒感染和肿瘤细胞增殖的保护(Tovey和Maury，1999)。不存在循环水平的IFN时，保护通过刺激细胞免疫性而无毒性地发生(Eid等.，1999)。特别地，口腔粘膜施用IFN-α刺激树突细胞的成熟和抗原呈递，和I型T辅助(Th1)淋巴细胞针对外来抗原的应答(Belardelli等.，2002)。因此，口腔粘膜IFN治疗在正在进行的免疫反应中，最有效地刺激宿主抵御，不管是应答病毒或肿瘤抗原。
美国专利号6,007,805和6,436,391公开了干扰素α亚型在疫苗组合物，特别是抗病毒疫苗组合物中作为佐剂的应用。
还存在对于与抗癌疫苗一起应用的有效佐剂的需求。例如，尽管黑素瘤是一种原型免疫原性肿瘤，但是大多数的肿瘤抗原也是自身抗原，由于针对自身抗原的耐受性，这限制了癌症疫苗的治疗效力。因此，即使已经应用了许多接种方法，衍生于MAGE家族黑素瘤抗原的疫苗，包括tyosinasc，Melan-A/MART-1，MAGE-A3/MAGE-A6，Trp-2，和gp100，仅仅引起细胞毒性T细胞的瞬时活化和有限的临床反应。这些包括直接免疫(肽疫苗)，表达所述肽的病毒载体或裸DNA，或转载抗原的呈递细胞，诸如带有抗原的树突细胞(基于树突细胞的抗原)。
细胞的过继转移提供一种克服耐受性的方式，其通过选择并且活化与消除淋巴的T调控细胞组合的高度反应性的T细胞亚群。因此，自体肿瘤反应性T细胞的过继转移以及伴随着非重度骨髓抑制消除淋巴的化学治疗(环磷酰胺和fluarabine)的高剂量IL-2的治疗，导致对MART-1黑素细胞分化抗原特异性的T细胞克隆群体的体内快速生长，并且在患有标准治疗难以控制的进行性疾病(IV期黑素瘤)的患者中导致迁移性肿瘤的破坏和目的临床反应。一些具有伴随的肿瘤衰退的患者还表现出自体免疫黑素细胞破坏的迹象，包括白斑和前色素层炎(Dudley等.，2002)。添加CpG寡聚核苷酸显著地加强自体肿瘤反应性T细胞的过继转移的抗肿瘤活性以及伴随着非重度骨髓抑制消除淋巴的化学治疗的高剂量IL-2的治疗的抗肿瘤活性(Restifo，2004)。
用MAGE 3蛋白疫苗和1.0CpG一起治疗IV期黑素瘤导致1CR，2PR，2SD，和2PD(Davis，2004)。
CpG寡聚核苷酸增强针对宽范围抗原的体液和细胞介导的抗原特异性反应。非甲基化的CpG基序是一些病原体相关的分子模式(PAMPs)的一种，所述的分子模式通过在抗原呈递细胞(APC)表面上存在的Toll样受体(TLR)激活先天免疫系统。CpG激活TLR-9，所述TLR-9只在人B细胞和浆细胞样(plasmacytold)树突状细胞(pDC)的表面上发现。Toll样受体，诸如TLR-9，作用为先天和适应性免疫反应之间的桥梁，其导致B细胞的直接活化和免疫球蛋白的产生，pDC的活化，MHC类别II抗原的增量调节，B7表达，和CD40表达，和增强的抗原呈递，以及CD4+和CD8+T细胞的活化和Th1细胞因子反应。CpG寡聚核苷酸的活性取决于I型IFN受体信号，并且添加外源I型IFN可以避开所述途径的上游损伤，并且可以取代CpG和在不存在任何微生物刺激物时诱导共同刺激分子的增量调节。并且，在IFN-α/β受体-/-小鼠(IFNAR1-/-)或在用多克隆抗IFN-α/β抗体处理的正常小鼠中，CpG寡聚核苷酸缺乏佐剂活性(Le Bon，等.，2001；和Proietti等.，2002)。
因此，尽管潜在有效的重组抗原的可用性，对接种的应答的微弱性或不存在和患者的顺应性仍旧是预防性或治疗性亚单位疫苗的主要关注点。亚单位疫苗的弱免疫原性使得对于这些疫苗有必要给予多次，以便激发满意的应答，这使得缺乏患者顺应性成为显著问题。
因此，这样的组合物将有广泛的应用，其提高抗原的免疫原性，并且始终如一地促进强免疫应答，诱导血清转化/血清保护所需要的减少疫苗剂量的数目，甚至是单一剂量。
本文所引用的任何文献不是意欲承认这样的文献是相关的现有技术，或是本申请的任何权利要求的可专利性的可考虑的材料。关于内容的任何陈述或任何文献的日期是基于申请人在递交时可获得的信息，并不组成关于这样的陈述的正确性的认可。
                      发明概述
本发明涉及增强针对疫苗的免疫应答的方法，其通过基本上与疫苗施用同时进行口腔粘膜施用一定量的干扰素和/或其它Th1-刺激性细胞因子，足以增强针对所述疫苗的免疫应答。被增强的免疫应答可以是体液或细胞应答之一或两者。在保护性免疫治疗中，本发明特别有效地增强针对疫苗的Th1型体液免疫应答。
由于它增强针对疫苗的抗体和细胞免疫应答，所以，当基本上与疫苗的施用同时施用时，口腔粘膜施用的干扰素和/或其它细胞因子有效地作为免疫佐剂。所增强的免疫应答特征在于长期的抗体产生和免疫记忆。由于干扰素、和/或其它细胞因子的口腔粘膜施用不涉及将干扰素和/或其它细胞因子转运到血流中，所以可以安全地应用大量的干扰素和/或其它细胞因子，而不会激发毒性反应。这比已知的和目前可用的佐剂，诸如明矾有着巨大的进步。
                  附图简述
图1A显示IFN-α在接种后15天对抗流感抗体应答的作用。抗体应答应用用于特异性免疫球蛋白亚类的抗原捕获ELISA检测而确定：总IgG，IgG1，IgG2a，和IgA，如在图中所示。在单独，或与105IU重组IFN-α混合im施用，或者与105IU重组IFN-αom同时施用VAXIGRIPTM抗流感疫苗后，测量每种抗体亚类。
图1B显示IFN-α在接种后30天对抗流感抗体应答的作用。抗体应答应用用于特异性免疫球蛋白亚类的抗原捕获ELISA检测而确定：总IgG，IgG1，IgG2a，和IgA，如在图中所示。在单独施用，或与105IU重组IFN-α混合im施用，或者与105IU重组IFN-αom同时施用VAXIGRIPTM抗流感疫苗后，测量每种抗体亚类。
图2A显示IFN-α在再接种后对抗流感抗体应答的作用。将小鼠在第0天接种，接种通过注射15毫克单独的、或与105IU重组IFN-α混合的，或者与105IU重组IFN-αom同时施用的VAXIGRIPTM抗流感疫苗而进行。在第90天，将动物再次接种，接种通过im注射15毫克单独的、或与105IU重组IFN-α混合的，或者与105IU重组IFN-αom同时施用的VAXIGRIPTM抗流感疫苗而进行。在第105天，抗流感抗体应答应用用于特异性免疫球蛋白亚类的抗原捕获ELISA检测而确定：总IgG，IgG1，IgG2a，和IgA，如在图中所示。
图2B显示IFN-α在再接种后对抗流感抗体应答的作用。将小鼠在第0天接种，接种通过注射15毫克单独的、或与105IU重组IFN-α混合的，或者与105IU重组IFN-αom同时施用的VAXIGRIPTM抗流感疫苗而进行。在第90天，将动物再次接种，接种通过im注射15毫克单独的、或与105IU重组IFN-α混合的，或者与105IU重组IFN-αom同时施用的VAXIGRIPTM抗流感疫苗而进行。在第120天，抗流感抗体应答应用用于特异性免疫球蛋白亚类的抗原捕获ELISA检测而确定：总IgG，IgG1，IgG2a，和IgA，如在图中所示。
图2C显示IFN-α在再接种后对抗流感分泌性s-IgA抗体应答的作用。将小鼠在第0天接种，接种通过注射15毫克单独的、或与105IU重组IFN-α混合的，或者与105IU重组IFN-αom同时施用的VAXIGRIPTM抗流感疫苗而进行。在第90天，将动物再次接种，接种通过im注射15毫克单独的、或与105IU重组IFN-α混合的，或者与105IU重组IFN-αom同时施用的VAXIGRIPTM抗流感疫苗而进行。在第120天，分泌性s-IgA抗流感抗体应答应用对分泌性s-IgA特异的抗原捕获ELISA检测而确定，如在图中所示。
                    发明详述
本发明基于这样令人惊讶的发现，即，用重组干扰素α(IFN-α)通过口腔粘膜途径治疗动物显著地增强了针对远离(distant)肌内注射(im)的商购流感疫苗(VAXIGRIPTM，Avantis Pasteur MSD)的体液应答。事实上，发现所检测的全部4类流感特异性免疫球蛋白(总IgG，IgG1，IgG2a，和IgA)在针对伴随着IFN-α口腔粘膜(om)施用的流感接种的应答中以剂量依赖型方式显著地增加了。甚至更加显著地，在某些条件下，口腔粘膜施用的IFN-α的免疫佐剂作用更高于当IFN-α与流感疫苗混合并且将所述混合物肌内(im)注射时所获得的效果。
这些结果可以从先前研究的结果得到部分的解释，先前的研究结果表明，在不存在IFN蛋白的全身性吸收时，由于趋化因子(其调控淋巴细胞的运输)，诸如Crg2的快速诱导，IFN-α的口腔粘膜施用导致免疫活性细胞从外周淋巴节向全身性注射的抗原(不论是肿瘤或病毒抗原)位点迅速迁移。相反，在远离接种位点的位点肠胃外注射IFN-α更可能诱导树突细胞和其它抗原呈递细胞向IFN注射位点并且远离接种位点迁移，因此减少针对流感疫苗的体液应答。
这是首次证明在本文中叫作“免疫佐剂”的物质，当在远离接种位点施用时，可以增强针对疫苗的免疫应答。应用术语“免疫佐剂”是由于干扰素不是作用为典型的佐剂，典型的佐剂是必须与疫苗混合以便增强所述疫苗的抗原性的一种物质。另一方面，本发明中干扰素的功能不仅仅是由于其免疫刺激性作用，例如，如在美国专利6,361,769和6,660,258和美国专利公布2003/0108519中所公开的那样。这些先前的专利公开内容，其涉及口腔粘膜施用的干扰素用于治疗病毒、肿瘤、和其它病原体的免疫刺激性作用，依赖于快速细胞免疫应答。因此，观察到的治疗效果发生在建立有效的抗体应答之前，因此其从未被研究过，并且，无论如何，不可能包含在其中所报道的许多实验中。事实上，是否能够期望干扰素对抗体产生发挥刺激性和抑制性作用已经是一个公开的问题。因此，本申请所报道的免疫佐剂的效果不同于，并且预计其不是来自，干扰素的免疫刺激性作用和干扰素的佐剂作用的先前的报道。为了区别本发明与Proietti，2002的实施方案，其包括与作为佐剂的IFN-α混合的疫苗的口腔粘膜施用，因此，本发明明确地排除om IFN与口腔粘膜施用的疫苗的联合应用。
含有单一的口腔粘膜施用的干扰素的制剂，诸如片剂或锭剂，其在接种时服用，显著地增加了抗体应答，并且因此增加保护的程度，不仅用于流感疫苗，而且还期望将其用于所有的疫苗。口腔粘膜IFN制剂的独特的优点是，它可以用于提高已被适当的管理机构审核批准的具体疫苗的保护性作用，不需要向所述机构重新注册所述疫苗，而必须与疫苗混合施用的新型佐剂则需要这样的情形。
许多研究已经表明，通过天然流感病毒感染获得的粘膜免疫性，其是由于在呼吸道中存在分泌性s-IgA引起，比由肠胃外接种所诱导的血清IgG引起的全身免疫性更加有效地预防感染，特别是抗变种病毒感染。参见Ito等.，2003。免疫个体中的血清IgG似乎对预防致死性肺炎而不是抗感染保护是重要的。IFN-α的口腔粘膜施用将血清IgA抗流感抗体增加到与当IFN-α与所述疫苗混合并且肌内注射所述混合物时的程度相比相似的或更高的程度。在口腔粘膜施用IFN-α后，在肺部观察到对抗流感s-IgA抗体产生的相似的作用。实验结果还表明，口腔粘膜IFN-α还减少接种后获得最大抗体应答并且因此全面保护所需要的时间。
由I型IFN或IFN-α诱导的免疫应答是Th1型应答，其特征在于特异性Ig模式，即，在小鼠中，特征在于循环IgG2a和/或分泌性IgA的特异性诱导，其赋予免受病原体攻击的保护，诸如细菌或病毒的攻击。
在本发明的非毒性免疫佐剂组合物中，IFN可以是属于I型IFN家族的任何干扰素，或者它可以是IFN-γ，有时称为II型IFN。在这一点上，在人中最有效的剂量是在105-108IU，优选地106-107IU范围内。
下述是可以用于本发明的IFN来源的非限制性实例：来自健康供体的受激白细胞的天然IFN-α(不同IFN-α亚型的混合物或单独的IFN-α亚型)或来自Namalwa细胞的淋巴样IFN-α：合成型I型IFN，诸如共有IFN(CIFN)；重组IFN-β(可商购获得，为REBIFTM，Serono；AVONEXTM，Biogen；和BETASERONTM，Berlex)或重组IFN-α亚型，诸如IFN-α2a(可商购获得，为ROFERONTM，Roche)和IFN-α2b(可商购获得，为INRON-ATM，Schering Plough)，或IFN-ω；由DNA穿梭方法或定点诱变产生的新的IFN分子，条件是它们用于上述提及的表示为每疫苗剂量的剂量中；和重组人IFN-α或IFN-β分子，其具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加或另外可用天然存在的多态性获得的，诸如GenOdys多肽。参见，WO 02/101048(参见WO 02/083733，WO 03/000896，及其它)。
在本发明用于口腔粘膜施用的干扰素剂量形式的药物组合物中，可以应用各种用于IFN的运载体(vehicles)和赋形剂，这对于熟练的技术人员是显而易见的。代表性的配制技术在尤其在Remington 1995及其先前的版本中教导。所述IFN制剂可以包括稳定性增强剂，诸如甘氨酸或丙氨酸，如在美国专利号4,496,537中所描述的，和/或一种或多种载体，诸如载体蛋白。例如，对于人的治疗，药物级别的人血清白蛋白，任选地通常与用作稀释剂的磷酸缓冲的盐一起应用。在用于IFN的赋形剂是人血清白蛋白的情形中，所述人血清白蛋白可以衍生于人血清，或可以是重组源性的。通常当应用血清白蛋白时，它将是同源源性的。
IFN可以通过任何方式施用，所述方式提供IFN与受体的口腔粘膜腔接触足够的时间，以允许所述干扰素有效地增强针对同时施用的疫苗的免疫应答。这需要使得干扰素与口腔粘膜接触至少约5秒钟的时间，优选地1-2分钟，并且可能地长达5分钟，即，5-360秒。因此，口腔粘膜施用明确地不同于口服施用。如果口服施用的片剂或液体组合物只是吞咽下去的话，不会存在干扰素和口腔粘膜足够的接触时间，从而不足以允许针对所述疫苗的免疫应答的增强。
在这些参量中，应该清楚地明白，本发明方法所有的IFN剂量形式不限于任何具体形式的制剂。IFN可以深深地施用到口腔粘膜腔内；这可以用液体、固体或气溶胶、以及鼻内滴剂或喷雾剂获得。因此，所述制剂包括，但不限于，液体、喷雾剂、糖浆、锭剂、口腔或舌下片剂、和喷雾器制剂。本领域的技术人员应该意识到，对于气溶胶或喷雾器制剂，制备物的颗粒大小可以是重要的，并且将明白颗粒大小可以改进的方法。因此，对于气溶胶或制剂，所述颗粒大小必须这样大以便允许干扰素在鼻咽粘膜处沉积，以致它可以在那里停留需要的时间段。意欲施用到肺部的制剂不被考虑成为口腔粘膜制剂，这是因为颗粒大小会如此的小以至于不在鼻咽粘膜处沉积并且直接进入到肺部，肺部是它的理想的作用位点并且在此处它进入循环。
口腔粘膜应用的代表性的干扰素制剂包括下述(所有的％都是w/w)：
片剂：葡萄糖BP 45％；明胶BP 30％；小麦淀粉BP 11％；carmellose钠BP 5％；卵白蛋白BPC 4％；亮氨酸USP 3％；丙二醇BP 2％；和5×106IU IFN-α2。所述片剂原样应用，并且允许在嘴中缓慢地溶解，或者当需要时可以溶解在水中并且保留在嘴中。
可以制备干扰素贴片(paste)，如在美国专利号4,675,184中所描述的那样，从丙三醇45％，钠CMC 2％，柠檬酸缓冲液(pH 4.5)25％，蒸馏水至100％，和5×106IU IFN-α2制备。所述干扰素贴片可以粘附到口腔粘膜上。
同样地，可以制备含漱剂或糖浆，通过将需要量的干扰素添加到可商购获得的漱口水或咳嗽糖浆制剂中而制备。
在本说明书中描述的动物实验中，口腔粘膜施用通过将IFN制剂深深施用到鼻腔内而实现，以便它迅速地分布到鼻咽腔内，即，受体哺乳动物的口和咽部，以便使其与该腔内侧粘膜接触。
从本发明人早先的实验室工作已知，干扰素的口腔粘膜施用没有导致循环水平的IFN的出现(Eid等.，1999和US 6,361,769)。
尽管本描述的要点是涉及作为免疫佐剂的干扰素，但是本发明还延伸到已知在抗体产生和/或刺激Th1应答中起作用的其它细胞因子的应用。对于本发明人，美国专利6,660,258集中描述以诱导宿主刺激作用的防御机制的剂量口腔粘膜施用任何Th1或Th2特异性细胞因子。在其中公开的Th1细胞因子中，除了干扰素外，有IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，和肿瘤坏死因子β(TNF-β或淋巴毒素)。因此，这些细胞因子，单独或者与干扰素和/或相互组合，也可以以本文对于干扰素所描述的相同的方式用作本发明的免疫佐剂(mutatusmutandi)。因此，对于每种的有效剂量可以容易地由本领域的普通技术人员确定，而无需过度实验。
抗原包括纯化的或部分纯化的蛋白制剂、肽、碳水化合物或脂质抗原，和/或与全细胞，特别是与所述抗原混合的树突细胞相关的抗原。总体上，可以将任何病原体或肿瘤和/或分化相关的抗原视作可能的免疫原，在IFN作为免疫佐剂时同时给予，并且可以由本领域的技术人员容易地鉴定。
尽管本说明书的实验涉及流感疫苗VAXIGRIPTM，但是完全希望本发明将增强针对施用的任何疫苗的免疫应答。尽管术语“疫苗”通常用来指意欲诱导预防的接种，当贯穿本说明书和权利要求应用时，所述术语还意欲包括用于治疗目的的接种。例如，包括肿瘤相关的抗原的疫苗意欲诱导针对肿瘤的免疫应答。针对病毒颗粒的疫苗不仅可以用来产生针对所述病毒的预防，还能根除现存的病毒感染。因此，例如，疫苗可以用于抗HBV和其它抗AIDS和HCV的，其正在积极的开发中。针对淀粉体β斑的活性疫苗也在开发中，用于治疗阿尔茨海默病。因此，术语“疫苗”应用于任何抗原的施用，目的是诱导针对所述抗原或原位存在的可交叉反应的抗原的免疫应答。优选的疫苗包括流感，天花，炭疽，乙型肝炎病毒，人乳头瘤病毒(human pappilloma virus)，单纯疱疹病毒，脊髓灰质炎，肺结核或抗癌疫苗。
在“为什么能够根据流感疫苗所显示的结果就可以预计本发明可用于任何这样的疫苗”的原因中，是这样的事实，即，当在混合物中施用时，已知干扰素作为佐剂是有效的。参见，例如，Proietti，2002，WO 02/083170和Le Bon等.，2001。并且，一旦确定口腔粘膜施用的干扰素增强针对遥远地但是同时施用的抗原的免疫应答，当受试者接种引起免疫应答的任何抗原时，没有理由不相信这样的事实应该是真实的。口腔粘膜施用的干扰素对于治疗的已知作用(例如，参见U.S.6,361,769)，与干扰素作为佐剂的已知作用组合，将允许人们合理地将流感疫苗所显示的结果推断到任何其它的疫苗。
已知现存的意欲提高疫苗免疫原性的佐剂，诸如明矾，具有严重的副作用。尽管本发明所用的疫苗可以在其组合物中包含佐剂，但是理想地能够除去这样的佐剂并且仍旧具有有令人满意的免疫应答的疫苗。希望口腔粘膜施用的干扰素免疫佐剂的应用将提供这样的目的。然而，没有佐剂时，任何疫苗可能不具有可测量的免疫反应，在这种程度上来说，本发明的免疫佐剂的作用必须在具体病例的基础上进行测试。
在每种佐剂化或没有佐剂化的疫苗剂量中抗原的存在量，被选作能够在接种的受试者中诱导保护性免疫应答的量。这一用量将取决于具体的抗原和典型的佐剂的可能存在，并且可以由本领域的熟练的人员所确定。一般地，每剂量应该含有1-1000毫克的抗原，优选地10-200μg。其它成分也可以有利地存在于所述疫苗中或佐剂化的疫苗中。
在一些情形中，由于期望的效果和应用的便利，疫苗或佐剂化的疫苗可以皮下或肌内注射。对于一些疫苗，可以有效地实行皮内注射，并且可以考虑适于将相应数目的树突分子募集到注射位点的其它递送系统。然而，口腔粘膜施用被排除在外。
特别是对于通过这些感染途径传播的那些传染性介质，诸如病毒的呼吸感染，例如，流感病毒感染，也包括所述疫苗鼻内施用到肺部和口服施用。
此外，所述疫苗的鼻内、口服或任何其它粘膜施用，或者直接佐剂化的疫苗还代表一种有价值的选择，其通过应用非常实用的疫苗递送方式而导致诱导潜在的保护性的局部和/或全身性的免疫性。
在这一点上，本领域熟练的技术人员可以确定作为接种所针对抵消的抗原功能的最适当的制剂。
所述疫苗组合物可以以任何常规方式配制成为药物制剂，其包括无菌生理相容性载体，诸如盐溶液，赋形剂，佐剂(如果有的话)，防腐剂，稳定剂，等。
疫苗可以以液体或以冻干的形式，在使用前溶解于无菌载体中。由于它们有效地用于获得抗原的缓慢释放，所以在所述制剂中存在明矾或脂质体样颗粒也是可能的。允许疫苗缓慢释放的其它方法可以由本领域的技术人员容易地确定，并且包含在本发明范围内。
因此，用于每种制剂的所述药用载体运载体或辅助剂可以由本领域的技术人员容易地确定。
本发明的方法可以用于传染性疾病和癌症的预防和治疗性治疗。特别地，本发明的方法可以用于预防病毒和细菌疾病的治疗(即，预防性疫苗)以及用于严重慢性传染性疾病的治疗(即，治疗性疫苗)。此外，当应用适当的抗原时，所述方法还可以用于预防和治疗癌症或其它疾病和病况。
这可以通过应用下列抗原而实现，即，针对与人恶性病相关的传染性介质的抗原，所述人恶性疾病例如，EBV，HPV和H.pilori，或充分确定的肿瘤相关抗原，诸如特征为人黑素瘤的那些，例如，MAGE抗原，thyrosinase gap100，和MART，以及在其它人肿瘤中的那些抗原。
特别地，本发明的方法特别适用于接种所谓的低或无应答的受试者，诸如免疫损害应答的受试者，诸如维持血液透析、移植的和AIDS患者。一般地，本发明的方法有利地适用于接种在需要更早的血清转化/血清保护的任何情况下处于感染高危期的个体。
这些特征特别是指针对HBV的接种。
作为附加的实例，本发明的方法可以特别有价值地用于在极少应答标准接种的年老的个体中诱导针对流感病毒的保护。
对于HBV疫苗以及其它病毒疫苗，s.c.或肌内途径注射可以是优选的，而在其它情形中，就功效和/或患者顺应性而言，鼻内施用到肺部可以表现出优点，特别是对于能够通过呼吸系统感染宿主的介质。
甚至当所述疫苗口服施用时，也可以应用本发明的方法。疫苗的口服施用包括吞咽疫苗，并且因此不包括口腔粘膜递送，口腔粘膜递送需要与口腔粘膜至少5秒钟的接触时间。因此，如果所述疫苗要口服施用，干扰素和/或其它Th1刺激性细胞因子仍可以在疫苗口服施用之前或之后的短时间内被经口腔粘膜施用。关于基本上与鼻内递送疫苗到肺部同时的口腔粘膜施用干扰素和/或其它Th1刺激性细胞因子，同样是正确的。
本发明的免疫佐剂可以与初次接种以及与再次接种联合应用。因此，针对所述抗原的免疫应答可以在受试者暴露于所述抗原的任何时间而增强，包括再次接种以及在接种后暴露于针对受试者接种的所述抗原。因此，免疫佐剂的施用还可以发生在受试者暴露于所讨论的抗原的时刻。例如，如果一个人针对炭疽免疫，保护针对可能的生物危险的攻击，并且一段时间后受试者暴露于在这样的攻击中的存在的炭疽，本发明的免疫佐剂的施用将增强针对所述抗原的保护性回忆免疫应答。回忆应答是针对接种后循环中的记忆细胞的激活的应答。并且，由于干扰素是多克隆B细胞激活剂，所以期望所述免疫应答不仅包括所述受试者抗针对他或她所接种的特异性抗原，而且还表现出一定程度的针对受试者将来可能暴露于的相关的和可能突变的抗原的交叉保护。这对于针对流感的保护是特别重要的，已知其表现出抗原转变和遗传漂变。
因此，本发明的另一方面是治疗感染或对抗原的其它暴露，所述抗原是针对受试者先前通过口腔粘膜施用作为免疫佐剂的回忆应答增强量的干扰素而接种的抗原。
现在已经综合描述了本发明，其将通过参考下述实例而更易于理解，所述实例通过举例说明的方式提供，并不是意欲限制本发明。
                    实施例
实施例1：口腔粘膜施用的IFN-α对针对初次接种的流感疫苗的抗流感抗体应答的作用影响
10只6-8周龄的雄C57B1/6组在第0天通过肌内(im)施用15毫克VAXIGRIPTM(Aventis Pasteur MSD)而进行处理，所述VAXIGRIPTM是单独的或与等体积的含有增加量的(103，104，105，106，107IU)重组小鼠IFN-α或重组人IFN-α的PBS，或含有等于所用的干扰素的量的一定量的BSA的PBS混合。其它组小鼠通过肌内(im)注射接受疫苗，并且在相对于动物im接种的第-2，-1，0，+1或+2天，通过口腔粘膜(om)途径接受增加量的干扰素。其它组动物用IFN或BSA单独处理，通过im注射或通过om途径，并且不进行接种。
应用对下述免疫球蛋白亚型特异的抗原捕获ELISA检测：血清中的总IgG，IgG1，IgG2a，和IgA，和肺中的分泌性IgA，在第15天和30天确定抗原应答。
结果在图1A和图1B中显示。图1A显示15天后IFN-α对抗流感抗体应答的作用。对于所测量的每种抗体类型，左侧的柱体是在疫苗单独im施用没有同时施用干扰素后，中间柱体是疫苗im施用同时om施用IFN后，和右边的柱体是im施用疫苗和IFN的混合物后。图1B显示30天后IFN-α对抗流感抗体应答的作用。在每种情形中可以看出，当疫苗与om干扰素一起施用时，所述抗体应答比没有干扰素获得的应答更加显著。
尽管在大多数情形中，与疫苗混合肌内施用干扰素给出比om施用的干扰素稍微更好的结果，与im相反，舌下施用干扰素仍然存在本质上的优点。首先，im施用高剂量的干扰素通常有显著的副作用。其次，应用干扰素作为与疫苗分开施用但是在时间上基本上同时的免疫佐剂，仅需要注册含有干扰素的制剂。换句话说，应用om干扰素作为免疫佐剂可能不需要重新注册已经批准的疫苗。当所述干扰素是与疫苗混合的佐剂时，如本领域先前已知的那样，那么必须获得疫苗/佐剂混合物的独立注册，其是极端昂贵并且耗费时间的。
在疫苗领域内通常已知针对疫苗的IgG抗体应答峰值在初次接种后大约第30天出现。从图1A和1B的比较可以看出，由于om干扰素的施用，存在某种促进效应。
剂量应答曲线(未显示)确定，当施用最大量的干扰素(在这一具体实验中105)时，获得最佳应答。在小鼠中应用人干扰素的其它检测中，剂量应答曲线显示抗体应答增加到某一水平的峰值，并且然后下降。因此，预计存在干扰素用作免疫佐剂的最适用量，并且这一用量可以经验性地依据进行的人体测试而确定。
表1显示相似的实验在第15天后的结果，免疫球蛋白滴度表示为终点滴度而不是在固定的血清稀释物的光学密度。这一实验还确定IFN om施用提供了比单独的疫苗实质上更好的结果。然而，这一实验表明使用om干扰素的结果比使用干扰素和疫苗的im混合施用的结果好得多。
表1
 处理     免疫球蛋白：终点滴度
    IgG      IgG1      IgG2a
 VAXIGRIPTM     102,400     102,400     102,400
 IFN-α105IU OM     409,600     409,600     409,600
 IFN-α105IU IM     204,800     204,800     204,800
对于其中在第-2，-1，0，+1，和+2天施用干扰素的实验(未显示)的比较，确定当干扰素在第0天施用时获得最佳效果。当在第-1或-2天通过om途径施用时，结果基本上与完全没有施用干扰素相同。因此，显而易见，IFN施用的最佳时间是基本上与疫苗施用同时，其意味着在所述疫苗施用之前或之后的几个小时内。
实施例2：口腔粘膜施用的IFN-α对针对第二次接种的流感疫苗的抗流感抗体应答的影响
在实验2中，小鼠组以同实验1相同的方式施用，除了在第90天再次接种小鼠外。每个接种步骤，即，初次和再次接种步骤，用单独的VAXIGRIPTM，同IFN-α混合的VAXIGRIPTM，或伴随IFN-α施用的VAXIGRIPTM而进行。图2A，2B和2C显示这些实验的结果，对于图2A在第105天后测定，或在图2B和2C中在初次接种后第120天测定。Ig滴度表示为在特定的血清稀释的光学密度。光学密度在450nm测定，可以看出，已经在再次接种后第15天，在与IFN om施用的小鼠中存在抗体滴度的增加，特别是对于IgG2a，其为对于保护最重要的Ig亚型。30天后(图2B)，看得出使用om施用的干扰素存在十分显著的作用。事实上，所述效果看起来甚至比当干扰素与所述疫苗混合并且肌内施用时所获得的效果更高。类似地，30天后(图2C)，看得出使用om施用的干扰素对在支气管肺泡灌洗液中产生抗流感分泌性s-IgA也有十分显著的刺激作用。
实施例3：人体临床试验
为了检测所述免疫佐剂对人的作用，将进行下述临床检测。在随机分成2组的140名受试者群体中，一组用干扰素进行口腔粘膜处理，并且然后立即肌内接种VAXIGRIPTM，另一组用安慰剂om处理，并且然后立即im接种VAXIGRIPTM。干扰素将通过口腔粘膜途径施用，以含有五百万单位的ROFERONTM重组IFN-α的5ml盐溶液的剂量。教导受试者在咽下之前将所述盐溶液含在他们的嘴中2分钟。对照受试者只接受盐溶液，然后用VAXIGRIPTM im接种。受试者年龄在65-85岁，没有白血病或实体瘤，或自体免疫疾病，并且具有完好的扁桃腺。在先前的5年内，受试者都接受了流感疫苗。将在第21天测量抗体应答，测量通过血凝素抑制和通过用于确定免疫球蛋白亚类的抗原捕获ELISA而进行。还测量唾液中分泌性IgA水平。预计所述结果与在实施例1和2中引用的预临床动物实验获得的那些结果相当。
现在已经充分地描述了本发明，本领域的技术人员应该理解本发明可以在宽范围的等价参量、浓度、和条件下进行，不背离本发明的精神和范围和无需过度实验。
尽管本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，但是应该明白它可以进一步改进。这种应用意欲涵盖本发明的任何变化、应用、或调整，一般地，所述变化、应用、或调整遵循本发明的原理，并且包括从本公开内容的这样的偏离，即，所述偏离在已知的或本发明所属领域内的常规实践内，并且所述偏离可以被应用到在附上的权利要求范围内提出如下的上文的基本特征上。
本文所应用的所有参考文献，包括期刊论文或摘要、发表的或相应的美国或外国专利申请、颁发的美国或外国专利、或任何其它参考文献，通过参考完全并入本申请中，包括在所引用的参考文献中列出的所有的数据、表格、附图和正文。另外，本文所引用的参考文献内引用的参考文献的全部内容也通过参考完全并入本申请。
对于已知的方法步骤、常规方法步骤、已知的方法或常规方法的参考不以任何方式承认本发明的任何方面、描述或实施方案在相关领域中被公开、教导或暗示。
具体实施方案的前述描述将充分地揭示本发明的一般性质，其他人可以通过应用本领域内的技术知识(包括本文所引用的参考文献的内容)易于改进和/或调整关于这样的具体实施方案的各种应用，而无需过度实验，不背离本发明的一般概念。因此，基于本文所述的教导和指导，这样的调整和改进意欲属于所公开的实施方案的等价体的意思和范围内。应该理解本文的措词或术语是用于描述的目的，并不是限制，以致本说明书的术语或措词可以由熟练的技术人员根据本文所述的教导和指导，与本领域的普通技术人员的知识相结合而解释。
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Claims (16)

1.一种增强针对疫苗的免疫应答的方法，其包括：
(a)通过除口腔粘膜递送以外的方式，给受试者施用有效量的疫苗或抗原；和
(b)口腔粘膜施用一定量的干扰素和/或至少一种其它Th1刺激性细胞因子，足以增强针对所述疫苗的免疫应答，所述干扰素和/或其它细胞因子的施用是与所述疫苗的施用基本上是同时的。
2.按照权利要求1的方法，其中所述免疫应答是体液应答。
3.按照权利要求1的方法，其中所述免疫应答是细胞应答。
4.按照权利要求1的方法，其中所述疫苗是肌内施用的。
5.按照权利要求1的方法，其中所述疫苗是口服施用或鼻内施用到肺部的。
6.按照权利要求1的方法，其中所述疫苗是皮下或皮内施用的。
7.按照权利要求1的方法，其中所述干扰素是以保持所述干扰素与口腔粘膜接触至少5秒钟这样的方式施用的。
8.按照权利要求1的方法，其中所述干扰素是以保持所述干扰素与口腔粘膜接触至少1分钟这样的方式施用的。
9.按照权利要求1的方法，其中所述干扰素是以保持所述干扰素与口腔粘膜接触5-300秒钟这样的方式施用的。
10.按照权利要求1的方法，其中所述疫苗是在不存在佐剂情况下施用的。
11.按照权利要求1的方法，其中所述疫苗是佐剂化的疫苗。
12.按照权利要求1的方法，其中所述疫苗是流感、天花、炭疽、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒(human pappilloma virus)、单纯疱疹病毒、脊髓灰质炎、肺结核或抗癌疫苗。
13.按照权利要求1的方法，其中所述有效量的干扰素是在105-108IU范围内。
14.按照权利要求1的方法，其中所述有效量的干扰素是在106-107IU范围内。
15.按照权利要求1的方法，其中所述干扰素选自由I型干扰素或IFN-γ组成的组。
16.一种当受试者暴露于所述受试者先前已经被免疫的抗原时增强其免疫应答的方法，所述方法包括，当暴露于所述抗原时，以足以增强针对所述抗原的回忆应答的量，口腔粘膜施用干扰素，和/或一种或多种其它Th1刺激性细胞因子。
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