KR20220002968A - 면역 증강용 망간 조합물 - Google Patents
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Abstract
새롭게 침전된 망간 및/또는 콜로이드 망간을 포함하는 면역 증강 조성물 및 백신 조성물, 이의 제조 방법, 및 면역화 및/또는 백신접종 증강을 위한 이의 용도.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 19일에 중국 국가지식재산관리국에 제출된 중국 특허출원 번호 201910319344.1의 우선권을 주장하며, 이는 전체가 참고로 여기에 통합된다.
기술분야
본 발명은 면역 증강을 위한 2가 망간 콜로이드 또는 새롭게 침전된 2가 망간, 및 그의 용도를 제공하며, 그의 용도는 예를 들어, 면역보조제(immunoadjuvant)로서 용도이며, 항바이러스 또는 항종양 적용을 위한 용도일 수 있다.
신체는 선천성 면역계 및 후천성 면역계를 통해 외부의 병원체로부터 자신을 보호한다. 선천성 면역은 후천성 면역을 촉진시키는 효과를 갖는다. 신체가 병원체에 감염되면, 먼저 선천성 면역 반응을 시작하고, 패턴 인식 수용체를 통해 병원체의 병원체 관련 분자 패턴을 인식하고, TLR 경로(1), RLR 경로(2), cGAS-STING 경로(3), 인플라마좀 활성화(4) 등과 같은 다양한 신호 경로를 활성화한다. 이러한 경로의 활성화는 I형 인터페론, IL-1β, IL-18 등을 포함한 많은 다운스트림 사이토카인의 생성으로 이어진다.
I형 인터페론은 자가분비 및 측분비(paracrine) 경로를 통해 JAK-STAT 경로를 활성화하고, 다수의 항바이러스 유전자의 발현을 유도하고, 바이러스 감염에 저항하는 효과를 달성할 수 있다(5, 6). 동시에, I형 인터페론은 항원 제시 세포의 성숙을 촉진할 수 있다(7). 항원 제시 세포는 병원성 미생물 또는 종양 항원을 T 세포에 제시하고, 항원 특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 활성화하고, 또한 B 세포 활성화를 촉진하여 항원 특이적 항체를 생성하고, 기억 B 세포 및 면역 기억의 생성을 촉진할 수 있다.
염증유발 인자(pro-inflammatory factor) IL-1β는 CD4+ T 세포에 직접 작용하고, T 세포의 증식을 촉진할 수 있으며(8); IL-18은 Th1 면역 반응(response)을 효과적으로 향상시킬 수 있고, T 세포 및 NK 세포의 증식 및 세포 독성을 촉진할 수도 있다(9).
현재 인간에 대한 사용을 위해 FDA에 의해 승인된 4가지 보조제: 알루미늄 보조제, MF59, AS03, 및 AS04가 있다. 알루미늄 보조제는 1920년부터 널리 사용되어 왔으며, A형 간염(HAV) 백신, B형 간염(HBV) 백신, 디프테리아-파상풍-백일해(DTP) 백신, 인유두종바이러스(HPV) 백신, 헤모필루스 인플루엔자(HiB) 백신, 등에 사용된다. 알루미늄 보조제는 Th2 반응(항체 생성에 기반한 체액 면역)만 활성화할 수 있으며, Th1 반응(CD8+ T 세포에 기반한 세포 면역)은 활성화할 수 없다(10). AS04는 MPL 및 알루미늄염을 함유한 보조제이며, HPV 백신 및 HBV 백신에 사용된다. 보조제는 NF-kB를 활성화하고, 염증유발 인자를 생성할 수 있으며, 알루미늄 보조제가 원래 가지고 있지 않은 Th1 반응을 활성화하는 능력을 가지고 있다. MF59는 유상(oil phase)으로서의 스쿠알렌으로 만든 유중수(water-in-oil) 보조제이다. 분해성 스쿠알렌인 Tween 80 및 Span 85를 함유하고 있으며, 인플루엔자 백신에 사용된다. 메커니즘은 여전히 불분명하다. 체내 반감기는 42시간이며, Th1 반응 및 Th2 반응을 동시에 활성화시킬 수 있다. AS03은 인플루엔자 백신에 사용되는 알파 토코페롤, 스쿠알렌 및 Tween 80을 함유한 수중유(oil-in-water) 보조제이지만, AS03이 함유된 H1N1 인플루엔자 바이러스 백신 PandemrixTM은 기면증(narcolepsy)을 유발할 수 있다(11). AS03은 NF-kB 경로를 활성화하여 염증유발인자의 생성을 유도하고, 면역 세포를 동원하며, 항체 생성을 유도할 수 있다.
현재, 임상 적용이 승인되지 않았지만 실험실에서 사용될 수 있는 보조제가 많이 있으며, 그 중 많은 것이 좋은 효과를 나타내지만, 부작용으로 인해 임상 적용이 제한된다. 예를 들어, 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)의 광유(mineral oil)는 신진대사가 좋지 않아, 주사 부위에 결절(nodules)이 형성될 것이다. 또한, 인터루킨-2 및 인터페론과 같은 사이토카인 유형 보조제가 있다. 그들의 단점은 비싸다는 것이다.
현재, cGAS-STING 경로를 활성화하는 리간드가 DMXAA(12), c-di-GMP(13), cGAMP(14) 및 키토산(15)과 같은 보조제로서 사용될 수 있음을 증명하는 보고가 있다.
CN107412260A에는 2가 망간이 cGAS-STING 경로 활성화제이고, 면역 증강 효과가 있으며, 예를 들어 면역보조제로서 사용될 수 있음이 개시되어 있다. 그러나, 추가 연구에서, 본 발명자는 예기치 않게 2가 망간 자체가 여전히 일부 결함을 갖고 있으며, 결함 중 적어도 하나를 제거하기 위해 개선된 해결방안이 필요하다는 것을 발견했다.
본 발명자들은 2가 망간의 면역 증강 효과를 더 연구한 결과, 2가 망간 용액이 체내에서 면역 증강 효과를 생성할 수 있지만, 이러한 면역 증강 효과가 충분히 높지 않음을 발견하였다. 보다 중요하게, 연구 과정에서, 면역 증강 효과를 향상시키기 위해 2가 망간 용액의 농도가 증가될 때, 망간 침전을 생성하기 쉽고, 이는 균일하고 안정적인 고농도 2가 망간 용액을 얻을 수 없게 하므로, 반복성을 효과적으로 보장할 수 없다는 것을 발견했다. 이 망간 침전물은 저장 시간이 증가함에 따라 점차적으로 응집되고 성장한다.
원하는 고농도 2가 망간 용액을 사용할 수 없는 경우, 본 발명자들은 2가 망간 침전물을 사용하여 면역 증강 효과를 시험하기 위한 연구를 계속해야 했다. 실험 작업의 부주의(negligence)로 인해, 본 발명자는 우연히(inadvertently) 상이한 기간 동안 방치된 2가 망간 침전물을 사용했다. 본 발명자들은 예기치 않게 상이한 저장 시간을 갖는 2가 망간 침전물이 상이한 면역 증강 효과를 가지며, 새로운 침전물의 면역 증강 효과가 더 긴 저장 시간을 갖는 망간 침전물의 면역 증강 효과보다 현저히 우수함을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 2가 망간 용액을 상이한 시간 동안 저장된 2가 망간 침전물과 비교하였고, 예기치 않게 새롭게 침전된 망간염의 면역 증강 효과가 2가 망간 용액의 면역 증강 효과보다 훨씬 더 우수하다는 것을 발견하였다.
상이한 2가 망간 시스템을 시험하는 과정에서, 본 발명자들은 또한 2가 망간 화합물이 콜로이드성 용액을 형성할 수 있다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 더욱 놀라운 것은 망간 콜로이드가 새롭게 침전된 망간과 대등하거나 더 강한 면역 증강 효과를 보인다는 것이다.
본 발명자들은 상기 지견에 기초하여 본 발명을 완성하였으며, 다음과 같은 기술적 해결방안을 제시하였다.
일 측면에서, 본 발명은 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.
일 실시양태에서, 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드는 인산망간, 탄산망간, 수산화망간 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
바람직하게는, 새롭게 침전된 망간의 비침전 형태에서 침전된 형태로의 전환 시간은 1일 이하, 또는 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간, 또는 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
A) 백신 면역원, 및
B) 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
임의적으로, 성분 A 및 B는 동일 및/또는 별도 용기에 있을 수 있다.
바람직하게는, 상기 백신 면역원은 바이러스, 박테리아 및/또는 기생충으로부터 유래되고,
예를 들어, 상기 바이러스는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 바이러스는 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 플라비바이러스과(Flaviviridae), 파필로마바이러스과(Papillomaviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae), 및 레트로바이러스과(Retroviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 바이러스는 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), HIV 및 HBV로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 상기 박테리아는 그람-음성 박테리아(Gram-negative bacteria) 및 그람-양성 박테리아(Gram-positive bacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 살모넬라(Salmonella), 메닝고코커스(Meningococcus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 시트로박터 프로인디이(Citrobacter freundii), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumanni)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, 예를 들어, 상기 백신 면역원은 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 간염 바이러스(hepatitis virus)(예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스), 소아마비 바이러스(polio virus), 광견병 바이러스(rabies virus), HPV 바이러스, 뇌염 바이러스(encephalitis virus)(예를 들어, B형 뇌염 바이러스), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 풍진 바이러스(rubella virus), 파상풍균(Clostridium tetani), 백일해균(Bordetella pertussis), 디프테리아 간균(Diphtheria bacillus), 나병균(Mycobacterium leprae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 수막구균(Neisseria meningitidis), 폐렴구균(Diplococcus pneumonlae) 및 이들의 조합으로부터 유래된다.
다른 측면에서, 본 발명은
1) 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 제공하는 단계; 및
2) 임의적으로, 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드로 전환시키는 단계를 포함하는, 면역 증강용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드는 인산망간, 탄산망간, 수산화망간 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 새롭게 침전된 망간을 형성하기 위해 비침전 형태에서 침전 형태로의 전환을 위한 시간은 1일 이하, 또는 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 이하, 또는 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분 이하이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
1) 백신 면역원을 제공하는 단계; 및
2) 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 제공하는 단계를 포함하는, 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 백신 면역원은 상기 기재된 바와 같이 바이러스, 박테리아 및/또는 기생충으로부터 유래되며, 여기서 반복되지 않을 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 선천성 면역 및/또는 후천성 면역을 개선하기 위해 면역 증강용 조성물 또는 백신 조성물의 제조에 있어서 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원은 I형 인터페론의 발현을 증가시킴으로써 선천성 면역 및/또는 후천성 면역을 향상시킨다. 일부 다른 실시양태에서, 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원은 염증 인자의 절단을 유도하여 활성 형태의 염증 인자를 생성함으로써 선천성 면역 및/또는 후천성 면역을 개선한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원은 항체 생성을 촉진함으로써 선천성 면역 및/또는 후천성 면역을 개선한다.
일 측면에서, 본 발명은 면역 증강용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 증강 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 면역 증강은 예를 들어, A) 선천성 면역 및/또는 후천성 면역을 개선하는 것, B) I형 인터페론의 발현을 증가시키는 것, C) 활성 형태의 염증 인자의 생성을 유도하는 것, D) 항체 생성을 촉진하는 것, E) T 세포의 증식을 촉진하는 것, 및/또는 F) 수지상 세포의 성숙을 촉진하는 것이다.
바람직하게는, 상기 투여는 근육내 주사, 피부내 주사(intradermal injection), 피하 주사(subcutaneous injection), 정맥 주사, 점막 투여 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, 상기 면역 증강은 질환, 예를 들어 세균 감염, 진균 감염, 바이러스 감염, 기생충 감염, 종양 또는 자가면역질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용된다.
상기 바이러스는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게 상기 바이러스는 헤르페스바이러스과, 랍도바이러스과, 필로바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 코로나바이러스과, 피코르나바이러스과, 헤파토바이러스과, 플라비바이러스과, 파필로마바이러스과, 폭스바이러스과, 및 레트로바이러스과로 이루어진 군으로부터 선택되고, 구체적으로 상기 바이러스는 단순 포진 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 백시니아 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스), 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, HPV 바이러스, 뇌염 바이러스(예를 들어, B형 뇌염 바이러스), 유행성 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 박테리아는 그람-음성 박테리아 및 그람-양성 박테리아로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니아, 헤모필루스 인플루엔자, 살모넬라, 메닝고코커스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균, 클렙시엘라 뉴모니아, 클렙시엘라 옥시토카, 엔테로박터 클로아카에, 시트로박터 프로인디이, 슈도모나스 에루기노사, 아시네토박터 바우만니, 파상풍 간균(tetanus bacillus), 백일해 간균(pertussis bacillus), 디프테리아 간균(diphtheria bacillus), 나병 간균(leprosy bacillus), 결핵 간균(tuberculosis bacillus), 수막구균(meningococcus), 폐렴구균(pneumococcus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 기생충은 세포내 기생충이고, 바람직하게는 플라스모듐(Plasmodium), 톡소플라스마(Toxoplasma), 트리파노소마(Trypanosoma), 쉬스토소마(Schistosoma), 필라리아(Filaria) 및 리슈마니아(Leishmania)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 자가면역질환은 I형 당뇨병, 건선, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 종양은 난소암, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 악성 흑색종, 두경부암, 육종, 담관암, 방광암, 신장암, 결장암, 태반 융모막암, 자궁경부암, 고환암, 자궁암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 면역 증강용 조성물은 추가의 예방 치료제와 함께 이를 필요로 하는 대상체에 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
본 발명의 백신 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계로서, 성분 A 및 B는 이들이 상이한 용기에 있을 때 동일한 시점 또는 상이한 시점에 투여될 수 있는 단계; 및/또는
본 발명의 면역 증강용 조성물 및 임의의 백신 면역원을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역화 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 투여는 근육내 주사, 피부내 주사(intradermal injection), 피하 주사(subcutaneous injection), 정맥 주사, 점막 투여 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
특히, 상기 면역화는 질환, 예를 들어 세균 감염, 진균 감염, 바이러스 감염, 기생충 감염, 종양 또는 자가면역질환을 예방하기 위해 사용된다. 질병은 상기 언급된 것과 동일하므로, 여기서는 반복하지 않는다.
일부 실시양태에서, 면역 증강용 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에 다른 예방/치료제와 함께 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 I형 인터페론 기능을 향상시키기 위한 약제의 제조에서 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증 인자의 절단을 유도하여 활성 형태를 생성하기 위한 약제의 제조에서 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 생성을 촉진하기 위한 약제의 제조에서 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 면역보조제로서 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역보조제는 T 세포 활성화 및/또는 항체 생성을 활성화시킨다. 바람직하게는, 면역보조제는 세균 감염, 바이러스 감염, 기생충, 자가면역질환 및 암으로부터 선택된 질환의 치료를 위한 백신 조성물에 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 항원을 내부에 함유하는 제1 용기; 및 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 포함하는 제2 용기를 포함하는, 면역용 키트(a kit for immunization)를 제공한다. 바람직하게는, 상기 제1 용기 및/또는 상기 제2 용기는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 특히, 상기 키트는 본 발명의 하나 이상의 목적을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 항원 및 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드, 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원은 동일 용기에 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 항원은 바이러스 또는 박테리아 또는 기생충 항원, 예를 들어 간염 바이러스 A, B, C, D 및 E-3, HIV, 헤르페스 바이러스 유형 1, 2, 6 및 7, 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 수두-대상포진 바이러스(varicella-zoster virus), 유두종 바이러스(papilloma virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 아데노바이러스(adenovirus), 번야 바이러스(Bunya virus)(한타바이러스(Hantavirus)), 콕사사키 바이러스(Coxasackie virus), 피코르나바이러스(picornavirus), 로타바이러스(rotavirus), 호흡기 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 수두 바이러스(pox virus), 라이노바이러스(rhinovirus), 풍진바이러스(rubella virus), 유두종 바이러스(papilloma virus), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus) 및 홍역 바이러스(measles virus), 결핵 및 나병을 일으키는 마이코박테리움(mycobacterium), 폐렴구균(pneumococcus), 호기성 그람-음성 간균(aerobic Gram-negative bacilli), 마이코플라스마(mycoplasma), 포도상구균 감염(staphylococcal infections), 연쇄상구균 감염(streptococcal infections), 살모넬라(salmonella) 및 클라미디아(chlamydia), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 말라리아(malaria), 리슈만편모충증(leishmaniasis), 트리파노소마증(trypanosomiasis), 톡소플라스마증(toxoplasmosis), 주혈흡충증(schistosomiasis) 및 사상충증(filariasis)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드, 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원, 및/또는 항원은 유효량으로 존재한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드, 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 I형 인터페론의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드, 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 세포에 적용하는 것을 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) 세포에서 I형 인터페론의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 비치료적 목적을 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드, 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 염증 인자의 절단을 유도하여 그의 활성 형태를 생성하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드, 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 상기 세포에 적용하는 것을 포함하는, 시험관 내에서 세포에서 염증 인자의 절단을 유도하여 활성 형태를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 비치료적 목적을 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드, 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항체 생성을 촉진하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드, 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 세포에 적용하는 것을 포함하는, 시험관 내에서 항체를 생성하도록 세포를 촉진하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 설명된 방법은 비치료적 목적을 위한 것이다.
이하, 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 통하여 본 발명의 상술한 측면 및 다른 측면이 명확하게 설명될 것이다. 본 발명을 예시하기 위해, 도면의 실시양태가 현재 바람직하지만, 본 발명은 개시된 특정 실시양태로 제한되지 않는 것으로 이해된다.
도 1은 새롭게 침전된 망간 및 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 우수한 보조제인 것을 예시한다. 도 1의 A는 용액에서 2가 망간의 상이한 상태를 보여준다. 도 1의 B는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 투과 전자 현미경 이미지를 보여준다. 도 1의 C는 면역화 후 OVA 항체 IgG1의 수준을 나타내고; 도 1의 D는 MnCl2 용액 및 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 근육내 주사 후 체류 시간(retention time)의 비교를 보여준다.
도 2는 생리 식염수(normal saline)에서 다른 음이온과 혼합된 MnCl2 용액의 상이한 기존 상태 및 특성, 이러한 침전물 또는 콜로이드가 보조제로서 I형 인터페론 또는 염증 인자를 활성화하는 능력을 예시한다. 도 2의 A는 MnCl2 용액 및 상이한 농도의 탄산 이온, 중탄산염 이온, 인산 이온, 인산 일수소 이온 및 수산화 이온에 의해 형성된 상이한 상태를 보여준다. 도 2의 B는 I형 인터페론을 활성화하고, 염증 인자 IL-1β의 생성을 유도하고, 항체를 생성하기 위해 OVA 단백질과 혼합된 보조제로 작용하는 상이한 상태의 망간 이온의 능력을 보여준다. 도 2의 C는 레이저 포인터를 사용하여 망간 이온 및 다른 음이온에 의해 형성된 생성물의 틴들 효과(Tyndall effect)를 보여준다.
도 3은 치킨 오브알부민(OVA)이 각각 포함된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4) 또는 알루미늄 보조제의 근육내 주사에 의해 마우스의 면역화 후 10일(A), 17일(B), 24일(C) 및 31일(D)에 생성된 항-OVA 항체의 수준을 예시한다.
도 4는 OVA와 각각 혼합된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4) 또는 콜레라 독소 B(CTB) 보조제의 비강 점적(nasal drip)을 통해 마우스를 면역시킨 후 폐포 세척액(alveolar lavage fluid)(A), 구강 세척액(oral lavage fluid)(B), 혈청 IgA(C) 및 혈청 IgG1(D)에서 항-OVA 항체의 수준을 나타낸다.
도 5는 도 1 및 2의 방법에 따라 OVA와 혼합된 보조제로서 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)를 마우스에 근육내 주사(A) 또는 비강내 면역화(B) 후 1 내지 6개월 동안 측정된 혈청, 구강 세척액 및 폐포 세척액 내의 항-OVA 항체의 수준을 예시한다.
도 6은 MnCl2에 의한 I형 인터페론 경로의 활성화 및 인플라마좀(inflammasome) 활성화를 예시한다. 도 6의 A 및 B는 마우스 복막 대식세포의 MnCl2 처리 후 I형 인터페론, 다운스트림 유도성 인자 ISG54 및 바이페린(viperin)의 발현 수준을 나타내며, 대조군(control)으로서 알루미늄 보조제를 사용한다. 도 6의 C 및 D는 MnCl2가 인플라마좀 활성화를 활성화하는 것을 나타내며, 대조군으로서 알루미늄 보조제를 사용한다. 도 6의 E 및 F는 MnCl2에 의해 활성화된 인플라마좀의 활성화가 NLRP3 및 ASC에 의존함을 보여준다.
도 7은 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 CD4+ T 세포의 증식을 촉진한다는 것을 예시하며, 대조군으로서 알루미늄 보조제를 사용한다.
도 8은 근육내 주사 또는 점막 면역화를 위한 보조제로서 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 사용된 마우스에 의해 생성된 항체의 수준은 cGAS-STING 경로 및 인플라마좀 경로에 의존함을 보여준다.
도 9는 수지상 세포의 성숙을 촉진하고 T 세포를 활성화시키는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 능력이 cGAS-STING 경로 및 인플라마좀 경로에 의존함을 예시한다. 도 9의 A는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 항원 제시 세포 BMDC의 성숙을 유도함을 보여준다. 도 9의 B는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)와 항원 OVA가 CD4+ T 세포의 증식을 촉진하는 것을 보여준다. 도 9의 C는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 마우스를 면역화한 후 CD8+ T 세포 활성화를 촉진하기 위한 보조제로 사용됨을 보여준다.
도 10은 보조제로서의 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 불활성화된 수포성 구내염 바이러스(VSV) 및 단순 포진 바이러스(HSV-1)의 면역 보호를 유의하게 향상시킨다는 것을 보여준다. 도 10의 A는 실험 흐름을 보여준다. 도 10의 B는 불활성화된 VSV 바이러스를 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6의 용량으로 희석하여 마우스를 면역화시키고, 14일 후 마우스의 생존율을 관찰한 것을 나타낸다. 도 10의 C는 10-3의 용량으로 희석된 VSV 불활성화된 바이러스로 마우스를 면역시킨 후 14일 동안 마우스의 사망 곡선을 관찰한 것을 나타낸다. 도 10의 D는 VSV 바이러스로 감염 4일째에 마우스의 뇌에서 바이러스 역가(titers)를 나타낸다. 도 10의 E 내지 G는 불활성화된 HSV-1 바이러스에 망간 콜로이드를 첨가하는 것이 유사한 보호 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
도 11은 보조제로서 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 불활성화된 인플루엔자 바이러스 PR8의 면역 보호 효과를 유의하게 향상시킴을 보여준다. 도 11의 A 및 B는 1, 10-1, 10-2, 및 10-3의 용량으로 희석된 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 비강내 점적한 후 7일째 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스의 생존율 및 체중 변화를 나타낸다. 도 11의 C 및 D는 비강내 점적액으로 마우스를 2회 면역시킨 후 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스의 생존율 및 체중 변화를 나타낸다.
도 12는 보조제로서 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 인플루엔자 서브유닛 HA 백신의 면역 보호 효과를 유의하게 향상시킴을 예시한다. 도 12의 A는 마우스의 근육내 주사 후 14일, 21일 및 28일 후에 마우스 혈청에서 항-HA IgG1 항체 함량을 나타낸다. 도 12의 B는 마우스의 비강 점적 면역화 후 14일, 21일 및 28일 후에 마우스의 혈청 내 항-HA IgA 항체 함량을 나타낸다. 도 12의 C는 인플루엔자 바이러스로 감염 후 마우스의 체중 변화를 나타낸다. 도 12의 D는 감염 5일째에 마우스 폐 조직의 병리학적 변화를 보여준다.
도 13은 동종 인플루엔자 바이러스(WSN) 및 이종 인플루엔자 바이러스(H3N2)에 대한 불활성화된 인플루엔자 바이러스 및 서브유닛 백신의 보호 효과를 향상시키기 위한 보조제로서 망간 콜로이드 Mn2OHPO4의 용도를 예시한다. 도 13의 A는 면역화 후 WSN 바이러스 감염된 마우스의 체중 변화를 나타내고; 도 13의 B는 면역화 후 H3N2 바이러스 감염된 마우스의 체중 변화를 나타낸다.
도 14는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 계내(in situ) 종양의 성장 및 전이를 유의하게 억제한다는 것을 예시한다. 도 14의 A는 피하 종양의 크기를 보여주는 상이한 시간에서의 이미지이다. 도 14의 B는 종양 접종 후 종양 체적의 변화를 보여준다. 도 14의 C는 종양 접종 후 마우스의 생존 곡선을 보여준다. 도 14의 D는 종양이 폐 조직으로 전이되었음을 나타내며, 이는 상이한 면역화 방법 후 21일에 사진 촬영된 것이다. 도 14의 E는 도 14의 D에서 종양 세포 수의 통계를 보여준다.
도 15는 피하 종양(B16-F10 흑색종 모델)의 치료에서 화학요법 약물 사이클로포스파미드(CTX)와 조합된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 효과를 예시한다. 도 15의 A는 상이한 처리 후 14일에 종양의 사진을 보여준다. 도 15의 B는 마우스 피하 B16-F10 종양의 성장 곡선을 나타낸다. 도 15의 C는 도 15의 B에서 14일에 상응하는 그룹의 마우스의 종양 중량을 나타낸다.
도 16은 피하 종양(B16-F10 흑색종 모델)의 치료에서 PD1 항체 약물과 조합된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 효과를 예시한다. 도 16의 A는 상이한 처리 후 종양의 사진을 보여준다. 도 16의 B는 종양의 성장 곡선을 보여준다. 도 16의 C는 도 16의 B에서 상응하는 그룹의 마우스의 종양 중량을 나타낸다. 도 16의 D 내지 E는 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 분석된 종양에 침윤된 CD8+ T 세포의 수를 나타낸다.
도 17은 피하 종양(MC38 결장암 모델)의 치료에서 PD1 항체 약물과 조합된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 효과를 예시한다. 도 17의 A는 상이한 처리 후 종양의 사진을 보여준다. 도 17의 B는 종양의 성장 곡선을 보여준다. 도 17의 C는 도 17의 B에서 상응하는 그룹의 종양 중량을 보여준다. 도 17의 D는 DAPI 및 CD8+ T 세포의 면역형광 염색(immunofluorescence staining)이 있는, 도 17의 A의 상응하는 그룹에서 종양의 조직 섹션을 보여준다.
도 1은 새롭게 침전된 망간 및 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 우수한 보조제인 것을 예시한다. 도 1의 A는 용액에서 2가 망간의 상이한 상태를 보여준다. 도 1의 B는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 투과 전자 현미경 이미지를 보여준다. 도 1의 C는 면역화 후 OVA 항체 IgG1의 수준을 나타내고; 도 1의 D는 MnCl2 용액 및 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 근육내 주사 후 체류 시간(retention time)의 비교를 보여준다.
도 2는 생리 식염수(normal saline)에서 다른 음이온과 혼합된 MnCl2 용액의 상이한 기존 상태 및 특성, 이러한 침전물 또는 콜로이드가 보조제로서 I형 인터페론 또는 염증 인자를 활성화하는 능력을 예시한다. 도 2의 A는 MnCl2 용액 및 상이한 농도의 탄산 이온, 중탄산염 이온, 인산 이온, 인산 일수소 이온 및 수산화 이온에 의해 형성된 상이한 상태를 보여준다. 도 2의 B는 I형 인터페론을 활성화하고, 염증 인자 IL-1β의 생성을 유도하고, 항체를 생성하기 위해 OVA 단백질과 혼합된 보조제로 작용하는 상이한 상태의 망간 이온의 능력을 보여준다. 도 2의 C는 레이저 포인터를 사용하여 망간 이온 및 다른 음이온에 의해 형성된 생성물의 틴들 효과(Tyndall effect)를 보여준다.
도 3은 치킨 오브알부민(OVA)이 각각 포함된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4) 또는 알루미늄 보조제의 근육내 주사에 의해 마우스의 면역화 후 10일(A), 17일(B), 24일(C) 및 31일(D)에 생성된 항-OVA 항체의 수준을 예시한다.
도 4는 OVA와 각각 혼합된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4) 또는 콜레라 독소 B(CTB) 보조제의 비강 점적(nasal drip)을 통해 마우스를 면역시킨 후 폐포 세척액(alveolar lavage fluid)(A), 구강 세척액(oral lavage fluid)(B), 혈청 IgA(C) 및 혈청 IgG1(D)에서 항-OVA 항체의 수준을 나타낸다.
도 5는 도 1 및 2의 방법에 따라 OVA와 혼합된 보조제로서 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)를 마우스에 근육내 주사(A) 또는 비강내 면역화(B) 후 1 내지 6개월 동안 측정된 혈청, 구강 세척액 및 폐포 세척액 내의 항-OVA 항체의 수준을 예시한다.
도 6은 MnCl2에 의한 I형 인터페론 경로의 활성화 및 인플라마좀(inflammasome) 활성화를 예시한다. 도 6의 A 및 B는 마우스 복막 대식세포의 MnCl2 처리 후 I형 인터페론, 다운스트림 유도성 인자 ISG54 및 바이페린(viperin)의 발현 수준을 나타내며, 대조군(control)으로서 알루미늄 보조제를 사용한다. 도 6의 C 및 D는 MnCl2가 인플라마좀 활성화를 활성화하는 것을 나타내며, 대조군으로서 알루미늄 보조제를 사용한다. 도 6의 E 및 F는 MnCl2에 의해 활성화된 인플라마좀의 활성화가 NLRP3 및 ASC에 의존함을 보여준다.
도 7은 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 CD4+ T 세포의 증식을 촉진한다는 것을 예시하며, 대조군으로서 알루미늄 보조제를 사용한다.
도 8은 근육내 주사 또는 점막 면역화를 위한 보조제로서 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 사용된 마우스에 의해 생성된 항체의 수준은 cGAS-STING 경로 및 인플라마좀 경로에 의존함을 보여준다.
도 9는 수지상 세포의 성숙을 촉진하고 T 세포를 활성화시키는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 능력이 cGAS-STING 경로 및 인플라마좀 경로에 의존함을 예시한다. 도 9의 A는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 항원 제시 세포 BMDC의 성숙을 유도함을 보여준다. 도 9의 B는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)와 항원 OVA가 CD4+ T 세포의 증식을 촉진하는 것을 보여준다. 도 9의 C는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 마우스를 면역화한 후 CD8+ T 세포 활성화를 촉진하기 위한 보조제로 사용됨을 보여준다.
도 10은 보조제로서의 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 불활성화된 수포성 구내염 바이러스(VSV) 및 단순 포진 바이러스(HSV-1)의 면역 보호를 유의하게 향상시킨다는 것을 보여준다. 도 10의 A는 실험 흐름을 보여준다. 도 10의 B는 불활성화된 VSV 바이러스를 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6의 용량으로 희석하여 마우스를 면역화시키고, 14일 후 마우스의 생존율을 관찰한 것을 나타낸다. 도 10의 C는 10-3의 용량으로 희석된 VSV 불활성화된 바이러스로 마우스를 면역시킨 후 14일 동안 마우스의 사망 곡선을 관찰한 것을 나타낸다. 도 10의 D는 VSV 바이러스로 감염 4일째에 마우스의 뇌에서 바이러스 역가(titers)를 나타낸다. 도 10의 E 내지 G는 불활성화된 HSV-1 바이러스에 망간 콜로이드를 첨가하는 것이 유사한 보호 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
도 11은 보조제로서 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 불활성화된 인플루엔자 바이러스 PR8의 면역 보호 효과를 유의하게 향상시킴을 보여준다. 도 11의 A 및 B는 1, 10-1, 10-2, 및 10-3의 용량으로 희석된 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 비강내 점적한 후 7일째 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스의 생존율 및 체중 변화를 나타낸다. 도 11의 C 및 D는 비강내 점적액으로 마우스를 2회 면역시킨 후 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스의 생존율 및 체중 변화를 나타낸다.
도 12는 보조제로서 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 인플루엔자 서브유닛 HA 백신의 면역 보호 효과를 유의하게 향상시킴을 예시한다. 도 12의 A는 마우스의 근육내 주사 후 14일, 21일 및 28일 후에 마우스 혈청에서 항-HA IgG1 항체 함량을 나타낸다. 도 12의 B는 마우스의 비강 점적 면역화 후 14일, 21일 및 28일 후에 마우스의 혈청 내 항-HA IgA 항체 함량을 나타낸다. 도 12의 C는 인플루엔자 바이러스로 감염 후 마우스의 체중 변화를 나타낸다. 도 12의 D는 감염 5일째에 마우스 폐 조직의 병리학적 변화를 보여준다.
도 13은 동종 인플루엔자 바이러스(WSN) 및 이종 인플루엔자 바이러스(H3N2)에 대한 불활성화된 인플루엔자 바이러스 및 서브유닛 백신의 보호 효과를 향상시키기 위한 보조제로서 망간 콜로이드 Mn2OHPO4의 용도를 예시한다. 도 13의 A는 면역화 후 WSN 바이러스 감염된 마우스의 체중 변화를 나타내고; 도 13의 B는 면역화 후 H3N2 바이러스 감염된 마우스의 체중 변화를 나타낸다.
도 14는 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)가 계내(in situ) 종양의 성장 및 전이를 유의하게 억제한다는 것을 예시한다. 도 14의 A는 피하 종양의 크기를 보여주는 상이한 시간에서의 이미지이다. 도 14의 B는 종양 접종 후 종양 체적의 변화를 보여준다. 도 14의 C는 종양 접종 후 마우스의 생존 곡선을 보여준다. 도 14의 D는 종양이 폐 조직으로 전이되었음을 나타내며, 이는 상이한 면역화 방법 후 21일에 사진 촬영된 것이다. 도 14의 E는 도 14의 D에서 종양 세포 수의 통계를 보여준다.
도 15는 피하 종양(B16-F10 흑색종 모델)의 치료에서 화학요법 약물 사이클로포스파미드(CTX)와 조합된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 효과를 예시한다. 도 15의 A는 상이한 처리 후 14일에 종양의 사진을 보여준다. 도 15의 B는 마우스 피하 B16-F10 종양의 성장 곡선을 나타낸다. 도 15의 C는 도 15의 B에서 14일에 상응하는 그룹의 마우스의 종양 중량을 나타낸다.
도 16은 피하 종양(B16-F10 흑색종 모델)의 치료에서 PD1 항체 약물과 조합된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 효과를 예시한다. 도 16의 A는 상이한 처리 후 종양의 사진을 보여준다. 도 16의 B는 종양의 성장 곡선을 보여준다. 도 16의 C는 도 16의 B에서 상응하는 그룹의 마우스의 종양 중량을 나타낸다. 도 16의 D 내지 E는 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 분석된 종양에 침윤된 CD8+ T 세포의 수를 나타낸다.
도 17은 피하 종양(MC38 결장암 모델)의 치료에서 PD1 항체 약물과 조합된 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 효과를 예시한다. 도 17의 A는 상이한 처리 후 종양의 사진을 보여준다. 도 17의 B는 종양의 성장 곡선을 보여준다. 도 17의 C는 도 17의 B에서 상응하는 그룹의 종양 중량을 보여준다. 도 17의 D는 DAPI 및 CD8+ T 세포의 면역형광 염색(immunofluorescence staining)이 있는, 도 17의 A의 상응하는 그룹에서 종양의 조직 섹션을 보여준다.
정의
본원에 사용된 용어 "선천성 면역(innate immunity)"은 생식계열(germline) 발달 및 진화 동안 형성된 자연 면역 방어 기능, 즉, 비특이적 면역으로도 알려진, 출생 후에 이미 보유하고 있는 비특이적 방어 기능을 지칭한다. 선천성 면역은 다양한 세포 및 분자, 예를 들어 대식세포, 자연 킬러 세포, 보체, 사이토카인(IL, CSF, IFN, TNF, TGF-β), 케모카인(CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12 등과 같은 CC 케모카인, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9 등과 같은 CXC 케모카인, C 케모카인, CX3C 케모카인을 포함), 리소자임 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "후천성 면역(adaptive immunity)"은 획득된 면역 또는 특이적 면역으로도 알려져 있으며, 세포 면역 및 체액 면역을 포함하는 항원 분자의 자극 후에 형성된 항원에 대한 신체의 특이적 면역을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "보조제(adjuvant)" 또는 "면역보조제(immunoadjuvant)"는 특정 항원을 구성하지 않지만 공동-투여된 항원에 대한 면역 반응의 강도 및 지속 기간을 향상시키는 작용제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "2가 망간" 또는 "2가 망간 화합물"은 염산염, 탄산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염, 주석산염, 푸마르산염, 말레산염, 젖산염, 벤젠술폰산염, 판토텐산염, 아스코르브산염, 수산화물 등, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 2가 망간 화합물은 약학적으로 허용가능하다.
본원에 사용된 용어 "콜로이드 망간(colloidal manganese)" 또는 "망간 콜로이드(manganese colloid)"는 2가 망간 및 음이온에 의해 형성된 콜로이드로서, 콜로이드 상태에 있는 것(콜로이드 용액이라고도 함)을 지칭한다. 용어 "콜로이드(colloid)"는 당업자에 의해 이해된다. 예를 들어, 콜로이드 입자의 입자 크기는 일반적으로 약 1 내지 100 nm, 특히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 nm, 또는 1 내지 20, 5 내지 20 nm, 10 nm와 같은 상기 값들 중 임의의 2개 사이의 값이다. 일반적으로, 콜로이드 용액은 빛에 노출될 때 틴들(Tyndall) 효과를 나타낸다. 콜로이드 입자의 입자 크기 범위가 나노미터 정도임을 고려하면, 본원에서 "망간 콜로이드"는 입자 크기 범위에 따라 "나노 망간"으로 지칭될 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "새롭게 침전된 망간(newly precipitated manganese)"은 미침전 형태(예를 들어, 용액 형태)에서 침전 형태로 전환 후 단기간 상태로 존재하는 2가 망간 화합물을 지칭한다. 단기간은 일반적으로 1일 이하, 일반적으로 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 이하, 예를 들어 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분 이하이다.
본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 및 "포함하다(comprise)"는 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 또한, 달리 명시되지 않는 한 "또는"은 "및/또는"을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "바이러스, 박테리아 및/또는 기생충으로부터 유래된"은 불활성화된 바이러스, 박테리아 및/또는 기생충, 또는 상기 병원성 물질로부터 추출된 단백질 및/또는 핵산(또한, 절단, 가공 등의 후의 상기 언급된 물질을 포함), 또는 정제된 재조합 단백질 물질, 또는 화학적으로 합성된 펩타이드 단편 물질을 포함하는 것을 의미한다.
또한, 본원에 사용된 단수형은 명확하고 분명하게 하나의 지시체로 한정되지 않는 한, 복수형의 지시체를 포함함을 유의해야 한다. 그리고, 특정 값이 언급된 경우, 본원에서 달리 언급한다는 것을 명확하게 나타내지 않는 한, 적어도 그 값이 포함될 것이다.
수치가 근사치를 나타내는 경우, 특정 수치가 다른 실시양태를 형성함을 이해해야 한다. 사용된 "약 X"(여기서 X는 숫자)는 나열된 값의 ±10%(포함)를 의미한다. 존재하는 경우, 모든 범위가 포괄적이고, 결합 가능하다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 물, 완충 수용액, 인산 완충 식염수(PBS; phosphate buffered saline)와 같은 등장성 염 용액, 글루코스, 만니톨, 덱스트로스, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 탄산마그네슘, 0.3% 글리세린, 히알루론산, 에탄올, 또는 폴리프로필렌 글리콜, 트리글리세리드 등과 같은 폴리알킬렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체의 유형은 특히 본 발명에 따른 조성물이 구강(oral), 비강(nasal), 피부내(intradermal), 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular) 또는 정맥내(intravenous) 투여를 위해 제형화되는지 여부에 따라 달라진다. 본 발명에 따른 조성물은 첨가제로서 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염류, 완충제, 착색제, 착향료 및/또는 방향족 물질 등을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 구강, 비강, 피부내, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "투여(administration)"는 약리학적으로 사용가능한 방식으로 대상체에 물질을 제공하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적 유효량(pharmaceutical effective amount)" 및 "유효량(effective amount)"은 그것이 투여되는 대상체에 그의 이점을 나타내기에 충분한 용량을 지칭한다. 투여되는 실제 양과 투여의 속도 및 시간 경과는 치료될 사람의 상태 및 중증도에 따라 다를 것이다. 치료의 처방(예를 들어, 용량 결정)은 궁극적으로 일반의(general practitioner) 및 기타 의사의 책임이며, 일반적으로 치료될 질병, 개별 환자의 상태, 전달 위치, 적용 방법 및 의사에게 이미 알려진 기타 요인을 고려하여 결정을 하도록 의존한다.
본원에 사용된 용어 "대상체(subject)"는 동물을 의미하며, 인간 및 영장류와 같은 온혈 포유동물; 조류; 고양이, 개, 양, 염소, 소, 말 및 돼지와 같은 가축 또는 농장 동물; 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 실험 동물; 어류; 파충류; 동물원 동물 및 야생 동물 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
달리 명시되지 않는 한, 방법 및 제품의 실시양태에 개시된 임의의 구성요소, 요소, 속성 또는 단계는 본원에 개시된 임의의 다른 방법 및 제품에 적용될 수 있다.
본 발명 또는 본 문헌의 설명의 각각의 특허, 특허 출원, 또는 인용된 간행물은 그 전체가 참고로 본원에 통합된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 단지 예로서 설명된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 그 본질 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 본 발명에 다양한 변경 및 개질을 가할 수 있다 .
실시예
재료 및 방법
항체 및 시약
항체의 공급원은 이하와 같다: 항-GAPDH 항체(sc-25778)는 Santa Cruz에서 구입했다. 항-바이페린(viperin) 항체, 항-ISG54 항체, 항-Casp1/p20 항체, 항-IL1β/p17 항체 및 항-ASC 항체를 모두 공지된 방법에 따라 제조하고 사용하였다(16). 요컨대, 항원 단편의 cDNA를 pET-21b 벡터(Novagen)에 삽입하여, E. coli BL21(DE3)에서 발현시키고, 재조합 단백질을 Ni-NTA 친화 컬럼으로 정제한 다음, 마우스 또는 토끼에 주입하였으며, 이에 의해 해당 항원을 인식할 수 있는 항혈청을 얻었다.
달리 명시되지 않는 한, 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했다. 알루미늄 보조제(Imject Alum, Thermo, 77161), 마우스 IL-1베타 ELISA 키트(MULTI SCIENCES, EK201B2/2), 마우스 IL-18 ELISA 키트(MULTI SCIENCES, EK2181), 지질다당류(Sigma, L4130), 오브알부민(InvivoGen, #vac-pova)은 모두 상업적 제품이었다.
세포
L929-ISRE(pGL3 ISRE-루시퍼라제 플라스미드를 L929 세포로 안정적으로 형질감염시켜 수득됨, ATCC®CCL-1), BHK21(ATCC®CCL-10), B16-OVA(ATCC®CRL)-6322) 및 B16F10(ATCC®CRL-6475) 세포를 10% FBS(Gibco), 5㎍/ml 페니실린 및 10㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Gibco) 배지에서 배양하였다. 골수 유래 대식세포(BMDC)는 10ng/mL GM-CSF, 10ng/mL IL-4 및 10% FBS(Gibco)를 함유하는 RPMI-1640(Gibco) 배지에서 유도되었다. 3일째에 배지를 반(half)으로 교환하고, 7일째에 실험을 진행하였다. 머캅토글리콜산(BD, Sparks, MD)으로 유도한 후 5일째에 마우스로부터 복막 대식세포를 채취하여, 5% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. .
마우스
Tmem173-/- 마우스는 C57BL/6J 마우스의 접합체의 세포질에 Cas9 mRNA(100ng/㎕) 및 gRNA(50ng/㎕)를 주입함으로써 CRISPR-cas9 방법에 의해 확립되었다. Cas9 mRNA 및 단일 가이드 RNA(gRNA)는 mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra(Ambion, am1345)에 의해 시험관 내에서 전사되었다. Nlrp3-/-, Nlrc4-/-, Pycard-/- 및 Aim2-/- 녹아웃(knock-out) 마우스는 Vishva Dixit(Genentech Inc, USA)에서 제공되었다. Tmem173-/-Pycard-/- 이중 녹아웃 마우스는 Tmem173-/- 마우스를 Pycard-/-와 교배하여 확인되었다.
모든 마우스는 NIH(National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 무균 조건 하에 북경 대학의 실험 동물 센터에 수용되었다.
I형 IFN(IFN-I) 생물검정(bioassay)
I형 IFN의 농도는 공개된 방법에 따라 결정되었다(17). 간단히 말해서, IFN-자극 반응 요소(ISRE)를 pGL3-Basic 벡터(Promega)에 클로닝하여, IFN-민감성 루시퍼라제 벡터를 구축한 다음, L929 세포에 안정적으로 형질감염시켰다. L929-ISRE 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고, 세포 배양 상등액과 함께 인큐베이션하였다. 재조합 인간 및 마우스 IFN-β(R&D Systems)를 표준으로 사용했다. 4시간 후, L929-ISRE 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 리포터 분석 시스템(Luciferase Reporter Assay System)(Promega)으로 분석하였다.
바이러스 감염
단순 헤르페스 바이러스 1(HSV-1, Hongbing Shu, Wuhan University, ATCC®VR-1544) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV, Indiana strain, ATCC®VR-1238)는 상기 언급된 동료에 의해 친절하게 기증되었다. H1N1 인플루엔자 바이러스 PR8 균주(Yonghui Zhang, Tsinghua University, ATCC® VR-95). H1N1 인플루엔자 바이러스 WSN 균주, A/WSN/33(H1N1)(Wenjun Liu, Institute of Microbiology, CAS). H3N2 인플루엔자 바이러스 균주, H3N2 아형 A/Jiangxi/2005(Min Fang, Institute of Microbiology, CAS). BHK21 세포를 사용하여, HSV-1 및 VSV 바이러스의 역가를 결정했다. MDCK 세포를 사용하여, 인플루엔자 바이러스 역가를 결정했다.
바이러스 증폭 및 정제: HSV-1 및 VSV 바이러스를 베로(vero) 세포에서 증폭시켰다. PR8, WSN 및 H3N2 인플루엔자 바이러스는 닭 배아에서 증폭되었다. 증폭된 바이러스를 PEG8000으로 정제하고, 정제된 바이러스를 0.2% 포름알데히드로 37℃에서 24시간 동안 불활성화시켰다. 플라크 분석(plaque assay)을 사용하여, 바이러스가 완전히 불활성화되었는지 측정한 다음, 불활성화된 바이러스를 사용하여 마우스를 면역화시켰다.
마우스 생존 실험: 8-12주령 마우스를 HSV-1(1.4×107 pfu/마우스) 및 VSV(8×108 pfu/마우스)로 정맥내 감염; 또는 8-12주령 마우스를 PR8(1×105 pfu/마우스), WSN(1×106 pfu/마우스) 및 H3N2(1×106 pfu/마우스)로 비강 내로 감염시켰다.
플라크 분석: BHK21 세포를 감염된 마우스 기관으로부터의 균질액(무혈청 DMEM에서 일련의 희석액)과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 배지를 0.5% 메틸셀룰로오스를 함유하는 무혈청 DMEM으로 교체하였다. 60시간 후, 세포를 0.5%(vol/vol) 글루타르알데히드로 고정하고, 1%(wt/vol) 크리스탈 바이올렛(70% 에탄올에 용해)으로 염색하였다. 플라크 형성 단위에서 바이러스 역가를 계산하기 위해 플라크를 카운팅(count)하였다.
단백질 발현 및 정제
인플루엔자 바이러스 HA1 단백질 정제 플라스미드는 Tsinghua University의 Zhang Yonghui Laboratory에서 제공되었다(18). 플라스미드는 HA 단백질(Gene ID: 956529)의 11-324개 아미노산을 발현했다. 박테리아 브로쓰(bacterial broth)가 0.6의 OD600에 도달했을 때, 0.5mM IPTG를 첨가하고 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 박테리아를 수집한 후, 초음파 처리 후 봉입체(inclusion bodies)를 수집하고, 변성 및 재생 후 HA1 단백질을 얻었다. 그런 다음, HA1 단백질을 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다.
면역원으로서 오브알부민(OVA)을 사용한 마우스 면역화
MnCl2 용액을 보조제로서 사용하여 근육내 주사에 의한 면역화는 100 μL PBS에 10 μg MnCl2 및 10 μg OVA 단백질을 첨가하고, 잘 혼합하여 5분 동안 방치한 후, 근육내 주사로 마우스를 면역화함으로써 수행하였다. MnCl2 용액을 보조제로서 사용하는 비강내 경로에 의한 면역화는 5 μg MnCl2 및 10 μg OVA 단백질을 20 μL PBS에 첨가하고, 잘 혼합하여 5분 동안 방치한 후, 비강내 경로로 마우스를 면역화함으로써 수행하였다. 망간 콜로이드를 보조제(예를 들어, Mn2OHPO4)로서 사용하여 근육내 주사에 의한 면역화는 10μg의 망간 콜로이드 및 10μg OVA 단백질을 100μL의 생리 식염수에 첨가하고, 잘 혼합하여 근육내 주사로 마우스를 면역화함으로써 수행하였다. 망간 콜로이드를 보조제로서 사용하는 비강내 경로에 의한 면역화는 5 μg 망간 콜로이드 및 10 μg OVA 단백질을 20 μL의 생리 식염수에 첨가하고, 잘 혼합하여 비강내 경로로 마우스를 면역화함으로써 수행하였다. 알루미늄 보조제를 이용한 근육내 주사에 의한 면역화는 10㎍/20μL 알루미늄 보조제 및 10㎍ OVA 단백질을 80 μL 생리 식염수에 첨가하고, 유화제로 유화시킨 후, 근육내 주사로 마우스를 면역화함으로써 수행하였다. 콜레라 독소 B(CTB)를 보조제로서 사용하여 비강내 경로에 의한 면역화는 5㎍ CTB 및 10㎍ OVA 단백질을 20 μL 생리 식염수에 첨가하고, 잘 혼합하여 비강내 경로로 마우스를 면역화함으로써 수행하였다.
ELISA에 의한 OVA-특이적 IgG1, IgG2c, 전체 IgG, 및 IgA 항체의 결정: 면역화된 마우스로부터의 희석된 혈청을 100㎍/ml OVA로 코팅된 ELISA 플레이트에서 인큐베이션하였다. 세척 후, HRP-콘쥬게이트된(conjugated) 마우스 IgG1(eBioscience, #18-4015-82), IgG2c(GeneTex, GTX77297), IgG total(Invitrogen, G21040), IgA(GeneTex, GTX77223)를 사용하여, 결합된 해당 항체를 검출하였다. 그 다음, 플레이트를 기질 TMB(eBioscience)와 함께 인큐베이션하고, 1M H3PO4로 반응을 종결시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
통계 분석
데이터를 분석하기 위해 T-테스트를 사용하였다. 생존 곡선을 비교하기 위해 Mantel-Cox 테스트를 사용하였다.
실시예 1. 용액 내 망간 화합물의 상태 및 보조제로서의 효과
실험 (a) MnCl2와 PBS의 반응에 의해 형성된 침전물, 망간 콜로이드 Mn2OHPO4의 제조
도 1의 A에 도시된 바와 같이, 실험에서, 생리 식염수(0.9% NaCl)는 실험실에서 준비하였고, PBS(pH 7.4)는 Gibco에서 구입하였다. 3개의 반응 시스템이 있었다: (1) 900㎕ 식염수와 100㎕ MnCl2(0.2M); (2) 900㎕ PBS와 100㎕ MnCl2(0.2M); (3) 850㎕ 식염수와 50㎕ Na3PO4, 그 후 100㎕ MnCl2(0.2M)를 첨가하여, 망간 콜로이드를 제조하였다. 이 실험에서 망간 콜로이드의 분자식은 X-선 광전자 분광법(XPS)에 의해 결정되어 Mn2OHPO4였다. 생리 식염수(1)에는 침전물이 없고, PBS(2)와 밤새 반응시키면 흰색 침전물이 생성되었다. 반응(3)에 의해 생성된 생성물은 침전물이 아닌 콜로이드였으며, 광선이 통과될 때 틴들(Tyndall) 효과를 나타냈다. 망간 콜로이드의 미세 구조는 도 1의 B에 도시된 바와 같이, 투과 전자 현미경으로 촬영되었으며, 입자의 크기는 직경이 약 10 nm였다.
실험 (b) PBS 중 망간 화합물 침전물과 망간 콜로이드 사이의 보조제 효과 비교
마우스를 체중에 따라 무작위로 6개의 그룹으로 나누었다: 1) PBS 대조군; 2) 항원 OVA(10μg); 3) 2일 반응 그룹, 생리 식염수 중 MnCl2(10μg MnCl2+OVA); 4) 5분 반응 그룹, PBS 중 MnCl2(10μg MnCl2+OVA); 5) 2일 반응 그룹, PBS 중 MnCl2(10μg MnCl2+OVA); 6) 30일 그룹, 망간 콜로이드(10μg Mn2OHPO4+OVA). 여기서 10μg은 망간 원소의 질량을 나타낸다. 각 그룹은 실험 설계에 따라 근육내 주사에 의한 마우스의 면역화를 위해 사용되었고, 0일, 7일, 14일에 마우스를 면역화하였다. 21일에, 혈액을 채취하여, 혈청을 분리하고, OVA에 대한 IgG1 항체 함량을 ELISA로 측정했다. 도 1의 C에 도시된 바와 같이, 짧은 시간 동안 MnCl2와 PBS의 반응으로부터의 생성물은 보조제 효과를 나타내지만, 장기간의 반응 후 생성물의 경우, 큰 입자로 응집되어 그 효과가 약해졌다. 콘트랙트(contract)에서, 망간 콜로이드(도면에서 MnJ로 약칭됨) Mn2OHPO4의 효과는 한 달 동안 보관된 후에도 양호한 상태를 유지했다. 이것은 망간 콜로이드가 양호하고 안정적인 보조제임을 나타낸다.
실험(c) 주사 부위에서 MnCl2 용액과 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)의 체류 시간 비교
마우스를 체중에 따라 무작위로 2개의 그룹으로 나누었다: MnCl2 용액 그룹(100μl 식염수에 용해된 20μg MnCl2)의 근육내 주사 및 망간 콜로이드 그룹(100㎕ 식염수에 현탁된 20μg 망간 콜로이드)의 근육내 주사. 여기서 20μg은 망간 원소의 질량을 나타낸다. 주사 후 상이한 시간에 주사 부위의 근육 0.1g을 취하여, 마이크로파 소화(digestion) 장치로 소화한 다음, ICP-MS(Thermo X SERIES II)로 망간 원소의 함량을 측정했다. 도 1의 D에 도시된 바와 같이, 망간 콜로이드는 주사 부위에 보다 오래 머무를 수 있으며, 이는 항체를 더 지속적으로 생성하도록 신체를 활성화할 수 있는 반면, 용액 내의 망간은 빠르게 대사된다.
실시예 2. 망간(II) 이온과 다른 음이온의 반응에 의해 생성된 침전물의 특성 및 세포 효과
실험 (a) 고정된 농도의 망간(II) 이온과 다른 농도의 음이온의 반응
생리 식염수 반응 시스템에서, 20mM MnCl2를 나트륨 염으로부터 상이한 농도(2.5, 5, 10, 20, 30, 40mM)에서 다른 음이온(Na2CO3, NaHCO3, Na3PO4, Na2HPO4, NaOH)과 반응시켰다. 도 2의 A에 도시된 바와 같이, 2가 유리(free) 망간은 CO3 2-와 반응하여 흑색 MnCO3 침전물을 생성하고; HCO3 -와 반응하여 흰색 Mn(HCO3)2 침전물을 생성하고; 저농도 PO4 3-와 반응하여 백색 침전물을 생성하고, 고농도 PO4 3-와 반응하여 연한 황색 콜로이드 물질을 생성하며, 이 두 생성물은 저농도에서 Mn3(PO4)2 및 고농도에서 Mn2OHPO4인 것으로 결정되며; 2가 유리 망간은 HPO4 2-와 반응하여 흰색 MnHPO4 침전물을 생성하고; OH-와 반응하여 황색을 띤 Mn(OH)2 침전물을 생성한다.
실험 (b) I형 인터페론을 활성화하고 IL-1β를 생성하는 염증 인자의 절단을 촉진하는 다양한 망간(II) 이온 생성물의 능력 및 보조제 효과의 비교
도 2의 B에 도시된 바와 같이, Eppendorf 튜브에서 왼쪽에서 오른쪽으로 순서대로 100μL 0.2 M MnCl2를 각각:
900μL 생리 식염수와 첨가하고 밤새 두었고(MnCl2),
100μL 0.5 M NaHCO3 + 800μL 생리 식염수와 첨가하고 밤새 두었고(Mn(HCO3)2가 생성됨),
100μL 0.5 M Na2CO3 + 800μL 생리 식염수와 첨가하고 밤새 두었고(MnCO3가 생성됨),
20μL 0.5 M Na2CO3 + 20μL 0.5 M NaOH+860 μL 생리 식염수와 첨가하고, 밤새 두었고(Mn2OHCO3 생성),
100μL 0.5 M NaH2PO4 + 800μL 생리 식염수와 첨가하고, 밤새 두었고(Mn(H2PO4)2가 생성됨),
100μL 0.5 M Na2HPO4 + 800μL 생리 식염수와 첨가하고, 밤새 두었고(MnHPO4가 생성됨),
26.6μL 0.5 M Na3PO4 + 873.4μL 생리 식염수와 첨가하고, 밤새 두었고(Mn3(PO4)2가 생성됨),
50μL 0.5 M Na3PO4 + 850μL 생리 식염수와 첨가하고, 밤새 두었고(Mn2(OH)PO4가 생성됨),
100μL 0.5M NaOH + 800μL 생리 식염수와 첨가하고, 밤새 두었다(Mn(OH)2가 생성됨).
상기 반응은 도 2에 도시된 바와 같이 콜로이드 또는 고체 침전물을 생성하였다. 침전물을 생리 식염수로 1회 세척하고, 후속 실험에 사용하였다(MnCl2의 경우, 식염수에 침전이 없어 세척을 수행하지 않았으므로, 용액을 실험에 사용하였음). 등몰량(500μM의 Mn2+를 함유)의 다양한 생성물을 사용하여, 18시간 동안 2 x 106 THP1 세포를 자극하고, 상등액에서 I형 인터페론의 수준을 결정했다. 생성물 중 Mn(H2PO4)2 생성물은 물에 쉽게 용해되기 때문에, 침전물이 거의 없고, 농도가 500μM 미만인 반면, 다른 음이온은 모든 Mn2+를 침전시킬 수 있다. 결과는 도 2의 B에 나타낸다. Mn2OHPO4 및 MnHPO4는 I형 인터페론의 생성을 상당히 활성화시킨다. 도면에 나타낸 바와 같이, P-IRF3는 I형 인터페론의 발현을 조절하는 주요 전사 인자이다. Mn2OHPO4 및 MnHPO4는 또한 IL-1β의 생성을 유의하게 유도한다. 그러나, 비-콜로이드 Mn(OH)2는 염증 인자 IL-1β의 생성이 아닌, I형 인터페론의 생성만을 활성화할 수 있다. 10㎍의 생성물(10㎍은 망간 원소의 질량을 나타냄)과 10㎍ OVA 단백질의 혼합물로 마우스를 매회 3회 면역화시켰다. 각 생성물을 테스트했다. 마우스 혈청을 채취하여, OVA에 대한 IgG1 항체의 함량을 측정하였다. Mn2OHPO4 및 MnHPO4는 침전된 망간 화합물보다 훨씬 더 나은 항체를 생성하도록 신체를 자극한다. 도면에서 가장 왼쪽 막대는 5분 동안 MnCl2와 PBS의 반응에 의해 형성된 침전물의 보조제 효과를 나타낸다. 밤새 반응에 의해 형성된 다른 침전물도 부분적인 보조제 효과를 갖는다. 실험에서 가장 좋은 효과를 나타낸 망간 콜로이드 Mn2OHPO4를 후속 실험을 위해 선택했다.
실험 (c) 상이한 망간(II) 이온 생성물의 틴들 효과 비교
도 2의 C에 도시된 바와 같이, 반응 생성물을 생리 식염수에 재현탁시키고, 레이저 포인터를 광원으로 사용하였다. Mn2OHPO4 생성물에서 틴들 효과가 가장 뚜렷한 반면에, MnHPO4 생성물에서는 부분적인 틴들 효과를 나타냄을 알 수 있다. 이는 MnHPO4 생성물의 직경이 100 nm보다 약간 큰 반면, Mn2OHPO4의 직경은 약 10 nm이기 때문일 수 있다.
실시예 3. 근육내 주사 및 점막 면역화를 위한 보조제로서의 망간 콜로이드
실험 (a) 근육내 주사를 위한 보조제로서의 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)
마우스를 체중에 따라 무작위로 6개의 그룹, 즉 PBS 대조군, 항원 OVA 그룹(10㎍), 망간 콜로이드 Mn2OHPO4 그룹(10㎍ Mn2OHPO4 + OVA) 및 저용량 알루미늄 보조제 그룹(440μg 알루미늄 보조제 + OVA), 중간 용량 알루미늄 보조제 그룹 (800μg 알루미늄 보조제 + OVA) 및 고용량 알루미늄 보조제 그룹(1220μg 알루미늄 보조제 + OVA)으로 나누었다. 각 그룹의 마우스를 실험 스킴(experimental scheme)의 양에 따라 근육내 주사하여 면역화하였고, 0일 및 10일에 1회 면역화하였다. 10일, 17일, 24일 및 31일에 혈액 샘플을 수집하여, 혈청을 분리하고, ELISA로 OVA에 대한 IgG1 항체의 함량을 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 10μg/마우스 용량의 망간 콜로이드 Mn2OHPO4는 고용량(1220μg/마우스) 알루미늄 보조제보다 더 효과적이었다. 이는 망간 콜로이드가 알루미늄 보조제보다 100배 낮은 용량으로 더 나은 효과를 달성할 수 있음을 나타내며, 이는 현재 널리 사용되는 알루미늄 보조제의 부작용을 크게 줄일 수 있다.
실험 (b) 점막 면역을 위한 보조제로서의 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)
도 4에 도시된 바와 같이, 각각 항원 OVA(10㎍)와 혼합된, 망간 콜로이드 Mn2OHPO4 또는 고전적 점막 면역보조제 콜레라 독소 B(CTB)의 동일한 양(5㎍/마우스)을 사용하여, 비강내 경로에 의해 마우스를 면역화하였다. 0일, 7일 및 14일에 예방접종을 실시하였다. 21일에 혈액 샘플을 수집하여, 혈청을 분리하고, 구강 세척액 및 폐포 세척액을 수집하고, ELISA에 의해 항-OVA IgA 항체 및 IgG1 항체의 함량을 측정하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 망간 콜로이드 Mn2OHPO4를 점막 보조제로서 사용한 경우, 보조제로서 콜레라 독소 B보다 폐포 세척액에서의 항체 함량이 더 높았다. 구강 세척 및 혈청에서, Mn2OHPO4의 효과는 동일한 양의 콜레라 독소 B와 동일했다. 이는 망간 콜로이드 Mn2OHPO4가 또한 우수한 점막 면역보조제임을 나타낸다.
실시예 4. 근육내 주사 및 점막 면역화를 위한 보조제로서의 망간 콜로이드는 장기간 항체 생성을 촉진함
실험 (a) 망간 콜로이드 Mn2OHPO4는 근육내 주사 보조제로서 장기 지속 효과를 가짐
실시예 3에 기재된 방법을 사용하여, 보조제로서 망간 콜로이드 Mn2OHPO4로 마우스를 면역화하고, 근육내 주사에 의해 OVA와 혼합하고, 면역화 1주, 1개월, 3개월 및 6개월 후 혈청 내 항-OVA 항체의 함량을 측정하였다. 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, 혈청 내 항-OVA 항체는 6개월까지 여전히 높은 수준으로 유지되었으며, 이는 보조제로서의 망간 콜로이드 Mn2OHPO4가 지속적인 보호를 제공할 수 있음을 나타낸다. 마우스의 수명은 일반적으로 2년이다. 망간 콜로이드 Mn2OHPO4는 신체의 수명 주기 전반에 걸쳐 신체가 보호 항체를 생성하도록 촉진할 수 있을 것으로 예상된다.
실험 (b) 망간 콜로이드 Mn2OHPO4는 점막 면역 보조제로서 장기 지속 효과를 가짐
실시예 3의 방법을 참조하여, 마우스를 비강내 루트로 면역화시킨 후, 마우스의 혈액, 폐포 세척액 및 구강 세척액을 상이한 시점에서 수집하여, 항체 함량을 측정하였다. 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, 특정 항체의 농도는 면역화 후 6개월까지 높은 수준으로 유지되었으며, 이는 망간 콜로이드 Mn2OHPO4는 또한 점막 면역화에 사용될 때 지속적인 보호를 생성할 수 있음을 나타낸다.
실시예 5. 망간(II)은 염증 인자의 생성을 활성화함
염증 인자 IL-1β는 CD4+ T 세포에 직접 작용하고, T 세포의 증식을 촉진할 수 있다(8). IL-1α 및 IL-1β는 호중구(neutrophils)의 침윤을 촉진할 수 있고(19); 염증 인자 IL-18은 Th1 면역 반응을 효과적으로 향상시킬 수 있으며, T 세포 및 NK 세포의 증식과 세포 독성을 촉진할 수도 있다(9). 알루미늄 보조제의 보조 효과는 NLRP3 인플라마좀을 활성화하고 염증 인자를 방출함으로써 달성되는 것으로 보고되어서(20-22), MnCl2/망간 콜로이드 Mn2OHPO4 또는 알루미늄 보조제에 의한 염증 인자 활성화 능력을 시험 및 비교하였다.
MnCl2 및 망간 콜로이드 Mn2OHPO4는 염증 인자를 활성화하는 동일한 능력을 갖는다(도 2의 B 참조). 여기에서, MnCl2를 예로 사용한다. 마우스 복막 대식세포의 시험관 내의 1차 배양을 10, 20, 50, 100 μg/mL 염화망간 또는 알루미늄 보조제로 처리하였고, 인터페론에 의해 유도된 ISG54 및 바이페린(Viperin)을 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의해 검출하였다. 상등액의 총 I형 인터페론 함량(인터페론 α 및 인터페론 β 농도의 합)을 생물검정(Bioassay)에 의해 검출하였다. 결과를 도 6의 A 및 도 6의 B에 나타낸다. MnCl2만이 I형 인터페론의 발현을 활성화할 수 있으며, 알루미늄 보조제는 활성화할 수 없다. LPS로 전처리한 복막 대식세포에 동일한 농도의 염화망간 및 알루미늄 보조제를 처리한 후, 웨스턴 블로팅을 사용하여 상등액에서 caspase 1 및 IL-1β의 절단을 검출하였으며(상부 밴드는 전구체이고, 하부 밴드는 활성 형태의 caspase 1 및 IL-1β임), 상등액에서 염증 인자 IL-1β 및 IL-18의 생성이 ELISA에 의해 검출되었다. 결과를 도 6의 C 및 도 6의 D에 나타내었으며, 염증 인자를 활성화하는 MnCl2의 능력은 알루미늄 보조제의 능력보다 훨씬 더 강력하다. LPS로 전처리한 복막 대식세포에 MnCl2, ATP(고전적 NLRP3 인플라마좀 활성화제), 및 VacV(고전적 Aim2 인플라마좀 활성화제)를 처리하고, 웨스턴 블로팅을 사용하여 상등액에서 caspase 1 및 IL-1β의 절단을 검출하였다(상부 밴드는 전구체이고, 하부 밴드는 활성 형태의 caspase 1 및 IL-1β임). ELISA를 사용하여, 상등액에서 염증 인자 IL-1β 및 IL-18의 생성을 검출했다. 결과를 도 6의 E 및 도 6의 F에 나타낸다. NLRP3 녹아웃 세포에서, 염증 인자를 활성화시키는 MnCl2의 능력이 현저히 낮아지며, 이는 MnCl2가 주로 NLRP3 인플라마좀을 활성화시키는 것을 나타낸다.
실시예 6. 망간 콜로이드는 T 세포 증식을 촉진함
CFSE 염료로 표지된 1×106 개의 OT-Ⅱ 세포를 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 하루 후, 마우스를 OVA 단백질로 면역화시켰다. 마우스를 PBS 대조군, 상이한 양의 OVA 대조군(1μg, 2μg 및 5μg), 각각 1μg, 2μg 및 5μg OVA 단백질과 혼합된 10μg 망간 콜로이드의 그룹, 및 각각 1μg, 2μg 및 5μg OVA 단백질과 혼합된 1220μg 알루미늄 보조제의 그룹으로 분리하였다. 여기에 기재된 사용량은 1마리 마우스의 1회 면역화의 양이다. 면역화 3일 후에 림프절을 수집하고, 림프절에서 OT-Ⅱ 세포의 증식을 유세포 분석으로 분석했다.
도 7에 도시된 바와 같이, 각 도면의 가장 우측 피크는 마우스 신체에 주입된 원래의 OT-Ⅱ 세포이다. 세포가 분할될 때, 세포의 CFSE가 두 개의 세포로 고르게 분포되어, 세포에서 CFSE의 밝기가 감소하고, 왼쪽에 CFSE가 감소된 세포는 분할된 세포이다. 결과는 같은 양의 항원이 사용될 때, T 세포 증식을 촉진하는 망간 콜로이드의 능력이 알루미늄 보조제보다 강하고, 망간 콜로이드의 양이 알루미늄 보조제의 양의 단지 1/100만 있으면 유사한 효과를 달성한다는 것을 보여준다.
실시예 7. 망간 콜로이드(Mn
2
OHPO
4
)에 의해 활성화된 항체 생성은 STING 경로 및 인플라마좀 경로에 의존함
도 8에 도시된 바와 같이, 도 8의 A는, 동물당 10μg 망간 콜로이드 + 10μg OVA 단백질의 3회 근육내 주사 후, WT, Pycard 녹아웃(ASC 단백질 결핍), Sting 녹아웃(STING 단백질 결핍) 및 Pycard/Sting 이중 녹아웃 마우스의 ELISA에 의한 마우스 혈청 내 항-OVA IgG1, IgG2c 및 총 IgG의 함량을 나타낸다. 결과는 Pycard 또는 Sting 녹아웃 단독 마우스에서 콜로이드 망간(colloidal manganese)의 보조제 효과가 부분적으로 감소되는 반면, 이중 녹아웃 마우스에서는 망간 콜로이드의 보조제 효과가 크게 감소함을 보여준다. 도 8의 B는, 마우스당 5㎍의 망간 콜로이드 및 10㎍의 OVA 단백질로, 마우스를 점막을 통해 3회 면역시킨 후, ELISA에 의해 검출된 혈청, 폐포 세척액 및 구강 세척액 내의 분비성 항-OVA IgA 항체 함량을 나타낸다. 결과는 망간 콜로이드의 보조제 효과가 이중 녹아웃 마우스에서 유의하게 감소되었음을 보여준다.
실시예 8. 망간 콜로이드는 수지상 세포의 성숙을 촉진함
도 9에 도시된 바와 같이, 도 9의 A는 100, 200, 및 400μM 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)를 사용하여 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 20시간 동안 처리하고, 유세포 분석을 사용하여 수지상 세포 성숙의 마커인 CD86 단백질을 검출하였음을 나타낸다. 그 결과 야생형 마우스에서 망간 콜로이드 농도가 증가할수록 더 많은 수지상 세포의 성숙이 촉진되는 것으로 나타났다. 이중 녹아웃 세포에서는 세포 성숙을 촉진할 수 없다. 도 9의 B에서, 실시예 6에 기재된 방법은 T 세포 증식을 촉진하는데 있어서 망간 콜로이드의 효율을 시험하기 위해 4종의 마우스에 사용되었다. 결과는 이중 녹아웃 마우스에서, T 세포의 증식을 촉진하는 보조제로서 망간 콜로이드의 능력이 상당히 감소되었음을 보여주었으며, 이는 또한 수지상 세포의 성숙과도 일치한다. 도 9의 C에서, 야생형 마우스 및 이중 녹아웃 마우스에 마우스당 10㎍의 망간 콜로이드 + 10㎍의 OVA 단백질을 근육내 주사하고, CD8+ T 세포의 표면에서 OVA 테트라머(tetramer) 단백질 함량을 유세포 분석에 의해 분석하였다(OVA-특이적 CD8+ T 세포는 보조제의 활성화를 나타냄). 결과는 망간 콜로이드가 CD8+ T 세포의 면역 반응을 활성화할 수 있고, 이 활성화는 STING 및 ASC의 두 경로에 의존한다는 것을 보여준다.
실시예 9. 보조제로서의 망간 콜로이드는 불활성화된 수포성 구내염 바이러스(VSV) 및 단순 포진 바이러스(HSV-1)의 면역 보호 효과를 향상시킴
실험 (a) VSV 불활성화된 바이러스 백신
실험 절차는 도 10의 A에 도시되어 있다. 0일째에 마우스에 백신을 근육내 주사하고, 10일째에 마우스를 바이러스에 감염시키고, 14일째에 마우스 조직의 바이러스 역가를 측정하였다. 마우스를 관찰하고, 14일째까지 사망 곡선을 기록하였다.
PEG 정제된 VSV 바이러스를 불활성화하여 백신으로 사용하고, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 및 10-6 희석액으로 희석하여 마우스를 근육내 주사하여 면역화시켰다. 바이러스 농도가 충분히 높을 때, 백신은 바이러스가 단독으로 사용될 때 마우스를 보호하기에 충분한 면역 효과를 생성할 수 있다. 10배 희석한 후, 바이러스 농도가 10-3일 때, 마우스의 생존율은 8.3%에 불과했다. 바이러스 농도가 10-4, 10-5, 및 10-6일 때, 모든 마우스가 죽었다. 그러나, Mn2OHPO4 콜로이드를 보조제로서 첨가하여 10-3 농도로 불활성화된 바이러스로 마우스를 면역화했을 때, 도 10의 B 및 도 10의 C에 나타낸 바와 같이, 마우스의 생존율은 75%까지 증가하였다. 도 10의 D에 나타낸 바와 같이, 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)를 보조제로서 사용하여 저농도 면역원의 면역 효과를 증가시킬 수 있으므로, 소량의 면역원을 사용하여 좋은 보호 효과를 얻을 수 있으며, 마우스의 활성 바이러스 역가도 감소함을 보여준다.
실험 (b) HSV-1 불활성화된 바이러스 백신
PEG 정제된 HSV-1 바이러스를 불활성화시키고, 근육내 주사에 의해 마우스를 면역화하기 위한 백신으로 사용하였다. 바이러스 희석도가 10-1 및 10-2일 때, 바이러스는 단독으로 사용되었을 때 마우스를 보호하기에 충분한 면역 효과를 생성할 수 있었다. 그러나, 바이러스 희석도를 10-4로 줄였을 때, 마우스의 생존율은 16.7%에 불과했고, 농도가 보다 낮을 때 모든 마우스가 죽었다. 반면에, 도 10의 E 및 도 10의 F에 나타낸 바와 같이, 10-4 희석도로 Mn2OHPO4 콜로이드를 바이러스에 첨가하면, 마우스의 생존율은 100%까지 상승하였다. 또한, 도 10의 G에 나타낸 바와 같이, 마우스에서 활성 바이러스 역가가 감소하였다. 이것은 보조제로서 망간 콜로이드가 불활성화된 HSV-1 바이러스의 용량을 10배 감소시키면서 동일한 보호 효과를 얻을 수 있음을 나타낸다.
실험 (c) PR8 불활성화된 바이러스 백신으로 1회 점막 면역화
PEG 정제된 인플루엔자 PR8 바이러스를 불활성화시키고, 1, 10-1, 10-2, 및 10-3의 희석도로 희석하고, 마우스를 비강내 경로로 1회 면역화시켰다. 7일 후, 마우스를 인플루엔자 바이러스에 감염시키고, 마우스의 생존율 및 체중 변화를 기록하였다. 모든 용량은 보조제가 첨가되지 않았을 때 보호 효과가 없었고, 마우스의 체중은 죽을 때까지 떨어졌다. 반면에, Mn2OHPO4 콜로이드를 보조제로서 첨가하면, 마우스의 체중은 바이러스의 희석도가 10-1일 때 처음 4-5일에 떨어진 이후 증가한다. 도 11의 A 및 도 11의 B에 나타낸 바와 같이, 10일째에 체중은 바이러스 감염 전 수준으로 회복되었고, 상태가 개선되었다. 이 결과는 망간 콜로이드가 원래 비면역원성이거나 약한 면역원성인 면역원과 함께 보조제로서 사용되어, 대상체를 1회 면역화시킨 후 보호 효과를 생성할 수 있음을 나타낸다.
실험 (d) PR8 불활성화된 바이러스 백신으로 2회 점막 면역화
도 11의 C 및 도 11의 D에 나타낸 바와 같이, PEG 정제된 인플루엔자 PR8 바이러스를 불활성화하여, 1, 10-1, 10-2, 및 10-3의 희석도로 희석하고, 마우스를 점막 점적을 통해 2회(0일째 및 17일째) 면역화시켰다. 14일 후, 마우스를 인플루엔자 바이러스에 감염시키고, 마우스의 생존율 및 체중 변화를 기록하였다. 모든 용량은 보조제가 첨가되지 않았을 때 보호 효과가 없었고, 마우스의 체중은 죽을 때까지 계속 떨어졌다. 반면에, Mn2OHPO4 콜로이드를 보조제로서 첨가하여, 10-1의 용량으로 희석된 바이러스로 마우스를 2회 면역화시킨 후, 마우스의 체중은 마우스가 바이러스에 감염된 후 단지 10% 감소한 다음, 빠르게 회복되었으며; 한편, 마우스는 희석되지 않은 바이러스로 면역화된 후 체중이 감소하지 않았으며, 감염 증상을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 원래 면역 효과가 없었던 백신에 보조제로서 망간 콜로이드를 첨가한 후, 2회 면역화 후에 상당한 예방 효과가 달성되었음을 보여주었다.
실시예 10. 보조제로서의 망간 콜로이드는 인플루엔자 서브유닛 백신의 보호 효과를 향상시킴
마우스를 체중에 따라 무작위로 4개의 그룹: 블랭크 대조군(ctrl), HA 항원 그룹(HA), HA 항원 및 망간 콜로이드 그룹(HA+Mn), HA 항원 및 알루미늄 보조제 그룹(HA+Al)으로 나누었다. 근육내 주사 후, 14일, 21일 및 28일에 마우스 혈청에서 항-HA IgG1 항체가 검출되었다. 도 12의 A에 나타낸 바와 같이, HA 단백질(5μg/마우스)을 단독으로 사용한 경우, 검출 가능한 특정 항체가 생성되지 않았으며; Mn2OHPO4 콜로이드(50㎍/마우스)를 보조제로서 첨가한 경우, 근육내 주사 면역화 후 생성된 항-HA IgG1 항체의 양은 알루미늄 보조제(800㎍/마우스)보다 유의하게 높았다. 비강내 면역을 위한 보조제로서 망간 콜로이드와 CTB의 효과를 비교한 결과, Mn2OHPO4 콜로이드(20μg/마우스)를 보조제로서 첨가했을 때, 항-HA IgA 항체 수준은 면역화의 4주 후 보조제로서 CTB(5㎍/마우스)의 수준보다 유의하게 더 높았다. 그리고 마우스가 보조제로서 망간 콜로이드로 면역화된 후, 마우스의 체중에는 변화가 없었고, 폐에 염증도 없었다. 마우스를 보조제로서 알루미늄 보조제 및 CTB로 면역화시킨 후, 마우스는 약간의 체중 감소 후에 약간 회복되었다. 도 12의 C 및 도 12의 D에 나타낸 바와 같이, 폐에 소량의 염증이 있었다. 이러한 결과는 망간 콜로이드가 기존의 보조제보다 더 안전하고 효과적인 서브유닛 백신의 보조제로서 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 11. 보조제로서의 망간 콜로이드는 동종 인플루엔자 바이러스(WSN) 및 이종 인플루엔자 바이러스(H3N2)에 대한 불활성화된 인플루엔자 바이러스 및 서브유닛 백신의 보호 효과를 향상시킴
실험 (a) 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)와 혼합된 불활성화된 PR8 바이러스 또는 PR8-HA1 단백질 백신은 WSN 바이러스 감염을 예방함
마우스를 체중에 따라 무작위로 5개의 그룹: 블랭크 대조군(con), 불활성화된 바이러스 PR8 그룹, 불활성화된 바이러스 PR8 + 망간 콜로이드 그룹(PR8+MnJ), PR8-HA1 단백질 그룹(HA1) 및 PR8-HA1 단백질 + 망간 콜로이드 그룹(HA1+MnJ)으로 나누었다. 0일, 7일 및 14일에 마우스를 면역화하고, 21일에 마우스를 WSN 바이러스에 감염시켰다. 마우스의 체중을 연속 14일 동안 기록하였다. 도 13의 A에 나타낸 바와 같이, 망간 콜로이드가 있는 실험 그룹에서, 마우스의 체중은 줄어들지 않았으며, 이는 바이러스의 보호 효과가 우수함을 나타내며, 보조제가 없는 그룹 및 블랭크 대조군은 마우스의 체중이 빠르게 감소하였다.
실험 (b) 망간 콜로이드(Mn2OHPO4)와 혼합된 불활성화된 PR8 바이러스 또는 PR8-HA1 단백질 백신은 H3N2 바이러스 감염을 예방함
마우스를 체중에 따라 무작위로 5개의 그룹: 블랭크 대조군(con), 불활성화된 바이러스 PR8 그룹, 불활성화된 바이러스 PR8 + 망간 콜로이드 그룹(PR8+MnJ), PR8-HA1 단백질 그룹(HA1) 및 PR8-HA1 단백질 + 망간 콜로이드 그룹(HA1+MnJ)으로 나누었다. 0일, 7일 및 14일에 마우스를 면역화하고, 21일에 마우스를 H3N2 바이러스에 감염시켰다. 마우스의 체중을 연속 14일 동안 기록하였다. 도 13의 B에 나타낸 바와 같이, H3N2 바이러스 독성은 마우스의 사망을 일으키지 않을 것이다. 단지 블랭크 대조군 및 불활성화된 바이러스 단독 그룹에서, 회복 전 마우스의 체중이 80% 감소하였고, HA1 단독 그룹에서는 회복 전 마우스의 체중이 90% 감소하였다. 컨트랙트(contract)에서, 망간 콜로이드가 있는 HA1 그룹에서 마우스의 체중은 기본적으로 감소하지 않았으며, 망간 콜로이드가 있는 불활성화된 바이러스 그룹에서는 단지 5%의 체중 감소 후에 체중이 회복되었다.
실시예 12. 면역 증강제로서의 망간 콜로이드는 항종양 효과를 향상시킴
실험 (a) 망간 콜로이드 Mn2OHPO4 백신은 계내(in situ) 종양 성장을 억제함
마우스를 체중에 따라 무작위로 4개의 그룹: 블랭크 대조군(con), OVA 대조군, OVA 및 망간 콜로이드 그룹(OVA+Mn), 그리고 OVA 및 알루미늄 보조제 그룹(OVA+Al)으로 나누었다. 실험 스킴에 따라 마우스를 3회(7일에 1회) 면역화시킨 후, B16/OVA 흑색종 세포를 피하 접종하여, 계내 종양 모델을 확립하였다. 도 14의 A 내지 도 14의 C에 나타낸 바와 같이, 알루미늄 보조제의 사전 사용은 종양 성장을 억제하지 못하고 마우스의 생존율을 향상시킬 수 없으며; 반면에 망간 콜로이드의 사전 사용은 종양 성장을 크게 억제하고, 마우스의 생존율을 높일 수 있다. 도 14의 B에 나타낸 바와 같이, 종양 접종 21일 후, 대조군 마우스의 평균 종양 크기는 1906 mm3이고, OVA 그룹 마우스의 평균 종양 크기는 925.5 mm3이고, 망간 콜로이드로 면역화된 마우스의 평균 종양 크기는 222.9 mm3이고, 알루미늄 보조제 그룹 마우스의 평균 종양 크기는 1946 mm3이었다. 도 14의 C에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스의 생존 기간은 26일이었고, 망간 콜로이드로 면역화된 마우스의 생존 기간은 49일이었으며, 알루미늄 보조제로 면역화된 마우스의 생존 기간인 27일보다 현저히 더 길었다. 이러한 결과는 망간 콜로이드가 계내 종양에 대한 신체의 능력을 향상시키는 면역 증강제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
실험 (b) 망간 콜로이드 Mn2OHPO4 백신은 종양 전이를 억제함
Mn2OHPO4 콜로이드 및 알루미늄 보조제를 각각 항원 OVA와 혼합하여, 마우스를 면역화시켰다. 면역화는 체내 면역 반응을 활성화시키기 위해 7일에 1회씩 3회 실시하였다. B16-OVA 종양을 꼬리 정맥에 주입하여, 종양 전이 모델을 확립했다. 종양 주입 21일 후 마우스를 희생시키고, 폐 조직을 적출하였다. 도 14의 D에 나타낸 바와 같이, 블랭크 대조군 마우스의 폐는 흑색종으로 덮여 있고, OVA만으로 면역화된 마우스의 폐에는 일정 수의 흑색종이 나타난 반면에, OVA + 망간 콜로이드로 면역화된 마우스의 폐에는 종양이 거의 없었다. 종양 조직을 분쇄한 후, 유세포 분석기로 종양 세포의 수를 계산한 결과, 도 14의 E에 나타낸 바와 같이, OVA + 망간 콜로이드로 면역화된 마우스의 폐에 있는 종양 세포의 수가 다른 두 그룹보다 현저히 적었다. 그 결과는 망간 콜로이드가 전이성 종양에 대한 신체의 능력을 향상시키는 면역 증강제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
실험 (c) 항종양을 위한 망간 콜로이드 Mn2OHPO4와 사이클로포스파미드의 조합
마우스에 흑색종 B16-F10을 피하 접종한 후, 무작위로 4개의 그룹: 대조군(con), Mn2OHPO4 콜로이드 그룹(5 mg/kg), 사이클로포스파미드 일수화물(CTX) 그룹(140 mg/kg) 및 조합 그룹(CTX+Mn)으로 나누었다. 사이클로포스파미드(CTX)는 임상 실습에서 널리 사용되는 항종양 화학요법 약물이다. Mn2OHPO4 콜로이드를 i.m. (종양 접종 후 2일마다 1회 처리)으로 주사하고, CTX를 i.p.(종양 접종 후 6일, 9일, 12일째에 1회 처리)로 주사하였고, 대조군에는 동일한 양의 생리 식염수를 투여하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 망간 콜로이드와 CTX의 조합은 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있다. 종양 접종 14일 후, 마우스를 희생시키고, 종양을 절개하고, 체적을 측정했다. 도 15의 B에 나타낸 바와 같이, 대조군의 평균 종양 크기는 960.1 mm3이고, 망간 콜로이드 단독으로 처리된 마우스의 종양 크기는 659.5 mm3이고, CTX 단독으로 처리된 마우스의 종양 크기는 393.9 mm3이고, 조합 그룹에서 마우스의 종양 크기는 238 mm3였다. 각 종양의 무게를 동시에 측정하였으며, 도 15의 C에 나타낸 바와 같이, 결과는 망간 콜로이드와 CTX의 조합이 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 이것은 면역 증강제로서의 망간 콜로이드가 화학요법과 같은 전통적인 치료를 증강시키고, 그 조합이 종양 성장에 상당한 억제 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실험 (d) 흑색종에 대한 망간 콜로이드 Mn2OHPO4와 PD-1 항체의 조합
마우스에 흑색종 B16-F10의 피하 접종 후, 마우스를 무작위로 4개의 그룹: 대조군(con), Mn2OHPO4 콜로이드 그룹(5 mg/kg), 항-PD1 항체 그룹(200 ㎍/마우스) 및 조합 그룹(항-PD1+Mn)으로 나누었다. PD1 항체는 최근 몇 년 동안 면역요법에 사용되는 신약이다. PD1 항체(Clone 29 F.1A12, BioXCell)를 종양 접종 후 3일째, 7일째 및 11일째에 1회 처리에 사용하였고, 매회 복강내 주사를 위해 200 μl PBS에 200 μg 항체를 용해시켰다. 도 16의 A 내지 C에 나타낸 바와 같이, 종양 접종 15일 후, 마우스를 희생시키고, 종양을 절개하고 측정하였다. 대조군 마우스의 평균 종양 크기는 1847 mm3이었고, 망간 콜로이드 단독 그룹 마우스의 평균 종양 크기는 797.3 mm3였다. PD1 항체 그룹 마우스의 평균 종양 크기는 687.3 mm3인 반면에, 조합 처리 그룹 마우스의 평균 종양 크기는 342 mm3이었으며, 이는 PD1 항체 단독 투여 그룹보다 유의하게 낮았다. 유세포 분석을 사용하여, 종양에 침윤된 CD8+ T 세포의 비율을 분석했다. 망간 콜로이드는 PD1 항체 약물의 효과를 27.7%에서 45.4%로 증가시켰다. 이것은 망간 콜로이드가 흑색종 치료에서 PD1 항체 약물과 상승적으로 작용할 수 있음을 나타낸다.
실험 (e) 결장암에 대한 망간 콜로이드 Mn2OHPO4와 PD-1 항체의 조합
마우스에 결장암 MC38 세포를 피하 접종하고, 무작위로 4개 그룹: 대조군 항체군(이소타입, 200㎍/마우스), Mn2OHPO4 콜로이드 및 대조군 항체군(이소타입+Mn), 항-PD1 항체군(200μg/마우스) 및 조합 그룹(항-PD1+Mn)으로 나누었다. PD-1 항체의 사용은 실험 (d)와 동일하였다. 접종 20일 후, 마우스를 희생시키고, 종양을 절개하여 측정하였다. 대조군 마우스의 평균 종양 크기는 319.8 mm3이었고, 망간 단독으로 처리된 마우스의 종양 크기는 126.9 mm3이었고, PD1 항체 약물 단독으로 처리된 마우스의 종양 크기는 143.1 mm3이었다. 조합 처리 그룹의 종양 크기는 도 17의 B에 나타낸 바와 같이 66.74 mm3이었다. 종양 조직 섹션을 DAPI 및 CD8+ T 세포의 면역형광 염색에 적용하였다. PD1 항체와 망간 콜로이드의 조합으로 처리된 마우스의 종양에 침윤된 CD8+ T 세포의 비율은 도 17의 D에 나타낸 바와 같이 유의하게 증가되었음을 알 수 있다. 이것은 망간 콜로이드가 결장암 치료에서 PD1 항체 약물과 상승적으로 작용할 수 있음을 나타낸다.
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Claims (41)
- 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원(source)을 포함하는, 면역 증강용 조성물.
- 제1항에 있어서,
면역보조제(immunoadjuvant)로서 사용되는, 면역 증강용 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드는 인산망간, 탄산망간, 수산화망간 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 증강용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
새롭게 침전된 망간 형태를 형성하기 위해 비침전 형태에서 침전 형태로의 망간의 전환을 위한 시간은 1일 이하, 또는 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 이하, 또는 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분 이하인, 면역 증강용 조성물.
- A, 백신 면역원, 및
B, 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 포함하며,
임의적으로, 성분 A 및 성분(들) B는 동일 및/또는 별도 용기에 있을 수 있는, 백신 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 백신 면역원은 바이러스, 박테리아 및/또는 기생충으로부터 유래되고,
예를 들어, 상기 바이러스는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 바이러스는 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 플라비바이러스과(Flaviviridae), 파필로마바이러스과(Papillomaviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae), 및 레트로바이러스과(Retroviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 바이러스는 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), HIV 및 HBV로 이루어진 군으로부터 선택되고;
예를 들어, 상기 박테리아는 그람-음성 박테리아(Gram-negative bacteria) 및 그람-양성 박테리아(Gram-positive bacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 살모넬라(Salmonella), 메닝고코커스(Meningococcus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 시트로박터 프로인디이(Citrobacter freundii), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumanni)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
특히, 예를 들어, 상기 백신 면역원은 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 간염 바이러스(hepatitis virus)(예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스), 소아마비 바이러스(polio virus), 광견병 바이러스(rabies virus), HPV 바이러스, 뇌염 바이러스(encephalitis virus)(예를 들어, B형 뇌염 바이러스), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 풍진 바이러스(rubella virus), 파상풍균(Clostridium tetani), 백일해균(Bordetella pertussis), 디프테리아 간균(Diphtheria bacillus), 나병균(Mycobacterium leprae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 수막구균(Neisseria meningitidis), 폐렴구균(Diplococcus pneumonlae) 및 이들의 조합으로부터 유래되는, 백신 조성물.
- 제5항 또는 제6항에 있어서,
새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드는 인산망간, 탄산망간, 수산화망간 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 백신 조성물.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
새롭게 침전된 망간 형태를 형성하기 위해 비침전 형태에서 침전 형태로의 망간의 전환을 위한 시간은 1일 이하, 또는 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 이하, 또는 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분 이하인, 백신 조성물.
- 1) 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 제공하는 단계; 및
2) 임의적으로, 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드로 전환하는 단계를 포함하는, 면역 증강용 조성물의 제조 방법.
- 제9항에 있어서,
새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드는 인산망간, 탄산망간, 수산화망간 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 증강용 조성물의 제조 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서,
새롭게 침전된 망간을 형성하기 위해 비침전 형태에서 침전 형태로의 망간의 전환을 위한 시간은 1일 이하, 또는 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 이하, 또는 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분 이하인, 면역 증강용 조성물의 제조 방법.
- 1) 백신 면역원을 제공하는 단계; 및
2) 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원을 제공하는 단계를 포함하는, 백신 조성물의 제조 방법.
- 제12항에 있어서,
백신 면역원은 바이러스, 박테리아 및/또는 기생충으로부터 유래되고,
예를 들어, 상기 바이러스는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 바이러스는 헤르페스바이러스과, 랍도바이러스과, 필로바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 코로나바이러스과, 피코르나바이러스과, 헤파드나바이러스과, 플라비바이러스과, 파필로마바이러스과, 폭스바이러스과, 및 레트로바이러스과로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 바이러스는 단순 포진 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 백시니아 바이러스, HIV 및 HBV로 이루어진 군으로부터 선택되고;
예를 들어, 상기 박테리아는 그람-음성 박테리아 및 그람-양성 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니아, 헤모필루스 인플루엔자, 살모넬라, 메닝고코커스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균, 클렙시엘라 뉴모니아, 클렙시엘라 옥시토카, 엔테로박터 클로아카에, 시트로박터 프로인디이, 슈도모나스 에루기노사 및 아시네토박터 바우만니로 이루어진 군으로부터 선택되고;
구체적으로, 예를 들어 상기 백신 면역원은 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스), 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, HPV 바이러스, 뇌염 바이러스(예를 들어, B형 뇌염 바이러스), 유행성 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 파상풍 간균(tetanus bacillus), 백일해 간균(pertussis bacillus), 디프테리아 간균(diphtheria bacillus), 나병 간균(leprosy bacillus), 결핵 간균(tuberculosis bacillus), 수막구균(meningococcus), 폐렴구균(pneumococcus) 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 백신 조성물의 제조 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서,
새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드는 인산망간, 탄산망간, 수산화망간 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 백신 조성물의 제조 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
새롭게 침전된 망간을 형성하기 위해 비침전 형태에서 침전 형태로의 망간의 전환을 위한 시간은 1일 이하, 또는 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 이하, 또는 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분 이하인, 백신 조성물의 제조 방법.
- 면역 증강용 조성물 또는 백신 조성물의 제조에 있어서 새롭게 침전된 망간, 망간 콜로이드 및/또는 새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드를 형성할 수 있는 공급원의 용도.
- 제16항에 있어서,
면역 증강용 조성물이 면역보조제인, 용도.
- 제16항 또는 제17항에 있어서,
새롭게 침전된 망간 및/또는 망간 콜로이드는 인산망간, 탄산망간, 수산화망간 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
새롭게 침전된 망간을 형성하기 위해 비침전 형태에서 침전 형태로의 망간의 전환을 위한 시간은 1일 이하, 또는 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 이하, 또는 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분 이하인, 용도.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 증강은 선천성 면역 및/또는 후천성 면역을 개선하는 것인, 용도.
- 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 증강은 I형 인터페론의 발현을 증가시키는 것인, 용도.
- 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 증강은 염증 인자의 절단(cleavage)을 유도하여 활성 형태를 생성하는 것인, 용도.
- 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 증강은 항체 생성을 촉진하는 것인, 용도.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역 증강용 조성물 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득한 면역 증강용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 면역 증강 방법으로서,
구체적으로, 상기 면역 증강은 예를 들어,
A) 선천성 면역 및/또는 후천성 면역을 개선하는 것,
B) I형 인터페론의 발현을 증가시키는 것,
C) 활성 형태의 염증 인자의 생성을 유도하는 것,
D) 항체 생성을 촉진하는 것,
E) T 세포의 증식을 촉진하는 것, 및/또는
F) 수지상 세포의 성숙을 촉진하는 것인, 면역 증강 방법.
- 제24항에 있어서,
상기 투여는 근육내 주사, 피부내 주사(intradermal injection), 피하 주사(subcutaneous injection), 정맥 주사, 점막 투여 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 증강 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 면역 증강은 질환, 예를 들어 세균 감염, 진균 감염, 바이러스 감염, 기생충 감염, 종양 또는 자가면역질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용되는 것인, 면역 증강 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게 상기 바이러스는 헤르페스바이러스과, 랍도바이러스과, 필로바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 코로나바이러스과, 피코르나바이러스과, 헤파토바이러스과, 플라비바이러스과, 파필로마바이러스과, 폭스바이러스과, 및 레트로바이러스과로 이루어진 군으로부터 선택되고, 구체적으로 상기 바이러스는 단순 포진 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 백시니아 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스), 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, HPV 바이러스, 뇌염 바이러스(예를 들어, B형 뇌염 바이러스), 유행성 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 증강 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 박테리아는 그람-음성 박테리아 및 그람-양성 박테리아로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니아, 헤모필루스 인플루엔자, 살모넬라, 메닝고코커스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균, 클렙시엘라 뉴모니아, 클렙시엘라 옥시토카, 엔테로박터 클로아카에, 시트로박터 프로인디이, 슈도모나스 에루기노사, 아시네토박터 바우만니, 파상풍 간균(tetanus bacillus), 백일해 간균(pertussis bacillus), 디프테리아 간균(diphtheria bacillus), 나병 간균(leprosy bacillus), 결핵 간균(tuberculosis bacillus), 수막구균(meningococcus), 폐렴구균(pneumococcus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 증강 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 자가면역질환은 I형 당뇨병, 건선, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 증강 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 종양은 난소암, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 악성 흑색종, 두경부암, 육종, 담관암, 방광암, 신장암, 결장암, 태반 융모막암, 자궁경부암, 고환암, 자궁암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 증강 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기생충은 세포내 기생충이고, 바람직하게는 플라스모듐(Plasmodium), 톡소플라스마(Toxoplasma), 트리파노소마(Trypanosoma), 쉬스토소마(Schistosoma), 필라리아(Filaria) 및 리슈마니아(Leishmania)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 증강 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
추가의 예방/치료제를 대상체에 투여하는 것을 더 포함하는, 면역 증강 방법.
- 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계로서, 성분 A 및 B는 이들이 상이한 용기에 있을 때 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있는 단계; 및/또는
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역 증강용 조성물 및 임의의 백신 면역원을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역화 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 투여는 근육내 주사, 피부내 주사(intradermal injection), 피하 주사(subcutaneous injection), 정맥 주사, 점막 투여 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역화 방법.
- 제33항 또는 제34항에 있어서,
상기 면역화는 질환, 예를 들어 세균 감염, 진균 감염, 바이러스 감염, 기생충 감염, 종양 또는 자가면역질환을 예방하기 위해 사용되는 것인, 면역화 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 바이러스는 헤르페스바이러스과, 랍도바이러스과, 필로바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 코로나바이러스과, 피코르나바이러스과, 헤파토바이러스과, 플라비바이러스과, 파필로마바이러스과, 폭스바이러스과, 및 레트로바이러스과로 이루어진 군으로부터 선택되고, 구체적으로 상기 바이러스는 단순 포진 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 백시니아 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스), 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, HPV 바이러스, 뇌염 바이러스(예를 들어, B형 뇌염 바이러스), 유행성 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역화 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 박테리아는 그람-음성 박테리아 및 그람-양성 박테리아로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니아, 헤모필루스 인플루엔자, 살모넬라, 메닝고코커스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균, 클렙시엘라 뉴모니아, 클렙시엘라 옥시토카, 엔테로박터 클로아카에, 시트로박터 프로인디이, 슈도모나스 에루기노사, 아시네토박터 바우만니, 파상풍 간균(tetanus bacillus), 백일해 간균(pertussis bacillus), 디프테리아 간균(diphtheria bacillus), 나병 간균(leprosy bacillus), 결핵 간균(tuberculosis bacillus), 수막구균(meningococcus), 폐렴구균(pneumococcus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역화 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 자가면역질환은 I형 당뇨병, 건선, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역화 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 종양은 난소암, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 악성 흑색종, 두경부암, 육종, 담관암, 방광암, 신장암, 결장암, 태반 융모막암, 자궁경부암, 고환암, 자궁암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역화 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기생충은 세포내 기생충이고, 바람직하게는 플라스모듐(Plasmodium), 톡소플라스마(Toxoplasma), 트리파노소마(Trypanosoma), 쉬스토소마(Schistosoma), 필라리아(Filaria) 및 리슈마니아(Leishmania)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역화 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
추가의 예방제를 대상체에 투여하는 것을 더 포함하는, 면역화 방법.
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