CN107456575A - 一种二氧化锰纳米佐剂及其制备方法、应用 - Google Patents

一种二氧化锰纳米佐剂及其制备方法、应用 Download PDF

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CN107456575A CN201710795715.4A CN201710795715A CN107456575A CN 107456575 A CN107456575 A CN 107456575A CN 201710795715 A CN201710795715 A CN 201710795715A CN 107456575 A CN107456575 A CN 107456575A
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陈倩
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Abstract

本发明提供了一种二氧化锰纳米材料，包括二氧化锰纳米颗粒以及复合在所述二氧化锰纳米颗粒表面被载物质；所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原。本发明提供的二氧化锰纳米材料，极大地提高了免疫佐剂CpG的免疫刺激作用，用于提高疫苗的免疫保护功能，解决了寡聚核苷酸CpG作为免疫刺激剂，难以进入机体淋巴结，需要大量CpG才能实现对免疫反应的有效提高的固有缺陷；而且作为疫苗佐剂，可载带抗原尤其是蛋白质抗原，有效提高淋巴结中免疫细胞对抗原的摄取，从而提高抗原的免疫原性。同时，该纳米佐剂生物可降解，在弱酸环境下如溶酶体中，可逐渐降解为锰离子(Mn2+)，最终排出体外。

Description

一种二氧化锰纳米佐剂及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术与疫苗技术领域，具体涉及一种二氧化锰纳米材料及其制备方法、应用，尤其涉及一种二氧化锰纳米佐剂及其制备方法、应用。
背景技术
疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。疫苗保留了病原体刺激机体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原体后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如细胞因子、活性生理物质、特殊抗体等；当机体再次接触到这种病原体时，免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原体的伤害。自问世以来，疫苗在保护人类健康方面发挥了巨大作用。然而，目前针对一些重大疾病尤其是传染性疾病如艾滋病、疟疾等以及恶性肿瘤的疫苗则尚未研发出来。疫苗主要由抗原(多为蛋白质抗原或多肽)和免疫佐剂组成。因此，有效提高抗原的免疫原性和佐剂的免疫激活作用是疫苗研发的两个主要策略。
目前，凭借其独特的理化性质，纳米材料作为载体在提高抗原免疫原性方面已显示出良好的应用前景。迄今为止，绝大部分纳米材料主要通过包裹、共价连接或静电吸附等携带抗原，促进免疫细胞对抗原的摄入。然而，这些材料的抗原载带能力尚不理想，难以有效提高抗原的免疫原性。
作为临床唯一批准使用的疫苗佐剂，铝佐剂可有效促进抗原诱导体液免疫反应，但难以诱导细胞免疫反应，这对于清除内源性病原体如艾滋病毒以及肿瘤细胞显然是不行的。同时，铝佐剂具有一定副作用，可引起注射部位的炎症和过敏反应。
因此，如何开发一种更合适、更安全的新型疫苗佐剂成为疫苗研发领域的关键策略，也是领域内诸多具有前瞻性的研究人员广为关注的焦点之一。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种二氧化锰纳米材料及其制备方法、应用，特别是一种二氧化锰纳米佐剂及其制备方法、应用，本发明提供的二氧化锰纳米材料，可有效促进蛋白质抗原的免疫原性，以及寡聚核苷酸CpG的免疫刺激活性，同时可降解，而且制备方法简单易行，适用于大规模生产应用。
本发明提供了一种二氧化锰纳米材料，包括二氧化锰纳米颗粒以及复合在所述二氧化锰纳米颗粒表面被载物质；
所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；
所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原。
优选的，所述二氧化锰纳米材料的粒径为15～100nm。
优选的，所述二氧化锰与所述CpG寡聚核苷酸的摩尔比为0.8：(0.006～0.02)。
优选的，所述二氧化锰与所述蛋白质抗原的摩尔比为0.8：(0.02～0.06)；
所述二氧化锰与所述多肽抗原的摩尔比为0.8：(0.06～0.2)。
优选的，所述抗原包括艾滋病毒抗原、结核杆菌抗原、疟疾抗原、人乳头状瘤病毒抗原和肿瘤相关抗原中的一种或多种。
本发明提供了一种二氧化锰纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
A)将氯化锰溶液和被载物质溶液进行混合后，孵育得到复合物；
所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原；
B)将上述步骤得到的复合物与氢氧化钠溶液进行反应后，得到二氧化锰纳米材料。
优选的，所述氯化锰与所述CpG寡聚核苷酸的摩尔比为1：(0.006～0.02)；
所述氯化锰与所述蛋白质抗原的摩尔比为1：(0.02～0.06)；
所述氯化锰与所述多肽抗原的摩尔比为1：(0.06～0.2)；
所述氯化锰与所述氢氧化钠的摩尔比为1：(8～32)。
优选的，所述氯化锰溶液的浓度为80～200μg/mL；
所述CpG寡聚核苷酸溶液的浓度为20～60μg/mL；
所述蛋白质抗原溶液的浓度为650～1500μg/mL；
所述多肽抗原溶液的浓度为90～200μg/mL；
所述氢氧化钠溶液的浓度为300～800μg/mL。
优选的，所述孵育的时间为15～30分钟；
所述反应的时间为1～3小时。
上述技术方案任意一项所述的二氧化锰纳米材料或上述技术方案任意一项所制备的二氧化锰纳米材料在疫苗领域的应用。
本发明提供了一种二氧化锰纳米材料，包括二氧化锰纳米颗粒以及复合在所述二氧化锰纳米颗粒表面被载物质；所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原。与现有技术相比，本发明针对现有的疫苗佐剂难以诱导细胞免疫反应，对于清除内源性病原体存在的劣势，而且铝佐剂还具有一定副作用，可引起注射部位的炎症和过敏反应等缺陷。本发明提供的二氧化锰纳米材料，极大地提高了免疫佐剂CpG的免疫刺激作用，从而可以用于提高疫苗的免疫保护功能，有效的解决了寡聚核苷酸CpG作为免疫刺激剂，难以进入机体淋巴结，需要使用大量CpG才能实现对免疫反应的有效提高的固有缺陷；而且作为疫苗佐剂，可有效载带抗原尤其是蛋白质抗原或多肽抗原，有效提高淋巴结中免疫细胞对抗原的摄取，从而大大提高抗原的免疫原性。同时，该纳米佐剂生物可降解，在弱酸环境下如溶酶体中，可逐渐降解为锰离子(Mn2+)，最终排出体外。
实验结果表明，与游离的CpG和鸡卵清白蛋白抗原相比，二氧化锰纳米佐剂(MnO2-CpG,MnO2-OVA)可更加有效地激活专职性抗原呈递细胞-树突状细胞以及相关细胞因子(白介素12-IL-12和肿瘤坏死因子-TNF-α)的大量分泌；MnO2-CpG纳米佐剂还可极大地促进蛋白质抗原的交叉呈递效率，从而大大有利于激活机体的细胞免疫反应；动物实验结果进一步表明，无需借助其他荧光分子，二氧化锰纳米疫苗(MnO2-CpG+MnO2-OVA纳米佐剂混合物)的磁共振成像功能即可为确定最佳免疫周期提供直接信息，该纳米佐剂疫苗可通过促进OVA抗原和CpG免疫激活剂有效迁移至淋巴结大大提高抗原的交叉呈递效率，从而极大地促进机体抗原特异性细胞免疫反应的发生，包括大大增强CD8+T淋巴细胞(CTL)的杀伤功能和增殖能力以及机体干扰素(IFN-γ)的大量产生，最终有效抑制肿瘤的恶性进展。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的MnO2-OVA纳米颗粒和MnO2-CpG纳米颗粒的透射电子显微镜照片；
图2为本发明实施例1制备的MnO2-OVA纳米颗粒和MnO2-CpG纳米颗粒的动态光散射表征曲线图；
图3为本发明实施例2得到的MnO2-OVA纳米颗粒溶液和MnO2-CpG纳米颗粒溶液的酸响应性和磁共振成像评价结果；
图4为本发明实施例3得到的MnO2-OVA纳米颗粒和MnO2-CpG纳米颗粒对树突状细胞的细胞毒性评价结果；
图5为本发明实施例4中MnO2-OVA纳米颗粒和MnO2-CpG纳米颗粒对树突状细胞成熟和抗原交叉呈递效率的影响作用评价结果；
图6为本发明实施例5中二氧化锰纳米佐剂疫苗(MnO2-OVA+MnO2-CpG)对小鼠细胞免疫反应和在体水平抗原交叉呈递效率的影响作用评价结果；
图7为本发明实施例6中二氧化锰纳米佐剂疫苗(MnO2-OVA+MnO2-CpG)对稳定表达OVA抗原的黑色素瘤的预防作用评价结果；
图8为本发明提供的二氧化锰纳米材料合成的示意简图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用生化试剂、生物医药技术或疫苗领域的常规纯度。
本发明提供了一种二氧化锰纳米材料，包括二氧化锰纳米颗粒以及复合在所述二氧化锰纳米颗粒表面被载物质；
所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；
所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原。
本发明对所述CpG寡聚核苷酸的定义没有特别限制，以本领域技术人员熟知的CpG寡聚核苷酸(CpG-ODN)即可，即含有CPG基序的寡聚核苷酸，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择。
本发明对所述CpG寡聚核苷酸的含量没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规载带含量即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述二氧化锰与所述CpG寡聚核苷酸的摩尔比优选为0.8：(0.006～0.02)，更优选为0.8：(0.007～0.014)，更优选为0.8：(0.009～0.012)，具体可以为0.8：0.009。
本发明对所述抗原没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规抗原即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述抗原优选包括蛋白质抗原和/或多肽抗原，更优选为蛋白质抗原或多肽抗原。
本发明对所述抗原的具体选择没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规抗原即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述抗原优选包括艾滋病毒抗原、结核杆菌抗原、疟疾抗原、人乳头状瘤病毒抗原和肿瘤相关抗原中的一种或多种。在本发明中，具体的，在研究阶段采用鸡卵清白蛋白作为模式抗原对上述抗原进行替代研究。
本发明对所述抗原的含量没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规载带含量即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述二氧化锰与所述蛋白质抗原的摩尔比优选为0.8：(0.02～0.06)，更优选为0.8：(0.025～0.055)，更优选为0.8：(0.03～0.05)，具体可以为0.8：0.05。所述二氧化锰与所述多肽抗原的摩尔比优选为0.8：(0.06～0.2)，更优选为0.8：(0.09～0.15)，更优选为0.8：(0.1～0.13)，具体可以为0.8：0.1。
本发明对所述二氧化锰纳米材料的粒径没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规纳米材料的粒径即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述二氧化锰纳米材料的粒径优选为15～100nm，更优选为18～80nm，更优选为20～60nm，更优选为23～40nm，具体平均粒径可以为25nm。
本发明对所述复合的具体方式没有特别限制，以本领域技术人员熟知的载体与被载物质的载带方式即可，本发明所述复合优选包括吸附、接枝、配位中的一种或多种。
本发明在MnO2纳米颗粒的形成过程中，首先Mn2+与CpG寡聚核苷酸或蛋白质或多肽抗原中的羧基或巯基进行配位，之后在碱性条件下，形成MnO2颗粒。CpG寡聚核苷酸和/或蛋白质抗原或多肽抗原位于MnO2颗粒表面，由于其呈负电性，可通过静电排斥发挥分散剂作用，抑制颗粒团聚，从而得到二氧化锰纳米颗粒。
本发明还提供了一种二氧化锰纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
A)将氯化锰溶液和被载物质溶液进行混合后，孵育(即室温下静置)得到复合物；
所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原；
B)将上述步骤得到的复合物与氢氧化钠溶液进行反应后，得到二氧化锰纳米材料。
本发明所述制备方法中所述原料或产品的性质、结构以及比例等优选原则或具体优选方案与前述二氧化锰纳米材料的优选原则和具体优选方案均一致，在此不再一一赘述。
本发明首先将氯化锰溶液和被载物质溶液进行混合后，孵育得到复合物；所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原。
在本发明中，被载物质可以是CpG寡聚核苷酸和抗原，当同时加入两种不同的被载物质后，可形成同时负载CpG寡聚核苷酸和抗原的二氧化锰纳米材料，也可以形成分别负载CpG寡聚核苷酸和抗原的二氧化锰纳米材料，本领域技术人员可以根据实际需要、产品要求和质量要求进行选择和调整，而且本发明二氧化锰-CpG纳米佐剂(二氧化锰负载有CpG寡聚核苷酸)还可与二氧化锰-抗原纳米佐剂(二氧化锰负载有抗原)混合使用，作为疫苗诱导有效的免疫保护作用。
本发明对所述氯化锰溶液的浓度没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规氯化锰溶液的浓度即可，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，所述氯化锰溶液的浓度优选为80～200μg/mL，更优选为100～180μg/mL，更优选为120～160μg/mL。
本发明对所述被载物质溶液的浓度没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规的浓度即可，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，所述被载物质溶液的浓度，即所述CpG寡聚核苷酸溶液的浓度优选为20～60μg/mL，更优选为30～50μg/mL，更优选为35～45μg/mL。所述蛋白质抗原溶液的浓度优选为650～1500μg/mL，更优选为750～1400μg/mL，更优选为850～1300μg/mL，更优选为950～1200μg/mL。所述多肽抗原溶液的浓度优选为90～200μg/mL，更优选为110～180μg/mL，更优选为130～160μg/mL，更优选为140～150μg/mL。
本发明对所述CpG寡聚核苷酸的加入量没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规加入量即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述氯化锰与所述CpG寡聚核苷酸的摩尔比优选为1：(0.006～0.02)，更优选为1：(0.007～0.014)，更优选为1：(0.009～0.012)，具体可以为1：0.009。在本发明中，由于实际中的客观因素，基于严谨的表述方式，产品中的锰的摩尔含量相当于投料量的80％左右。
本发明对所述抗原的加入量没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规加入量即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述二氧化锰与所述蛋白质抗原的摩尔比优选为1：(0.02～0.06)，更优选为1：(0.025～0.055)，更优选为1：(0.03～0.05)，具体可以为1：0.05。所述二氧化锰与所述多肽抗原的摩尔比优选为1：(0.06～0.2)，更优选为1：(0.09～0.15)，更优选为1：(0.1～0.13)，具体可以为1：0.1。在本发明中，由于实际中的客观因素，基于严谨的表述方式，产品中的锰的摩尔含量相当于投料量的80％左右。
本发明对所述混合的方式没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规混合方式即可，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述混合优选为搅拌混合，更具体的步骤优选为：
在磁力搅拌的过程中，将被载物质溶液(CpG寡聚核苷酸溶液和/或抗原溶液)滴加至氯化锰溶液中。
本发明对所述滴加的速度没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规滴加速度即可，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求和功能用途进行调整和选择。
本发明对所述孵育的具体时间没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规时间即可，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述孵育的时间优选为15～30分钟，更优选为18～28分钟，更优选为20～25分钟。
在本发明中，在上述混合孵育过程中，氯化锰与CpG或蛋白质抗原或多肽抗原通过生物矿化作用，即Mn2+与CpG或蛋白质或多肽中的羧基或巯基进行配位，结合在一起形成复合物。
本发明随后将上述步骤得到的复合物与氢氧化钠溶液进行反应后，得到二氧化锰纳米材料。
本发明对所述氢氧化钠的加入量没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规加入量即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述氯化锰与所述氢氧化钠的摩尔比优选为1：(8～32)，更优选为1：(11.5～25)，更优选为1：(12～20)。
在本发明中，当所述被载物质为CpG寡聚核苷酸时，所述氯化锰与所述氢氧化钠的摩尔比更优选为1：(8～12)，更优选为1：(8～10)，具体可以为1：8；当所述被载物质为蛋白质抗原时，所述氯化锰与所述氢氧化钠的摩尔比更优选为1：(10～30)，更优选为1：(12～25)，更优选为1：(15～22)，具体可以为1：20；当所述被载物质为多肽抗原时，所述氯化锰与所述氢氧化钠的摩尔比更优选为1：(8～15)，更优选为1：(9～14)，更优选为1：(10～12)，具体可以为1：10。
本发明对所述反应的具体时间没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规反应时间即可，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述反应的时间优选为1～3小时，更优选为1.5～2.5小时。
本发明加入氢氧化钠，诱发如下化学反应，参见式(I)
2MnCl2+4NaOH+O2→MnO2+4NaCl+4H2O (I)。
本发明在MnO2形成过程中，CpG和/或抗原位于MnO2颗粒表面，由于其呈负电性，能起到分散的作用，抑制颗粒团聚，最终获得二氧化锰纳米颗粒。
本发明对所述制备方法的温度没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规温度即可，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述制备方法的温度优选为室温，即15～25℃。
本发明为保证产品的性能，完整优化整体制备流程，所述反应后优选还包括后处理步骤。本发明对所述后处理步骤没有特别限制，以本领域技术人员熟知的后处理步骤即可，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述后处理步骤优选包括分离步骤，更具体优选为透析。
本发明还提供了上述技术方案任意一项所述的二氧化锰纳米材料或上述技术方案任意一项所制备的二氧化锰纳米材料在疫苗领域的应用。
本发明对所述应用的具体方面没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规类似应用即可，本领域技术人员可以根据实际情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述应用包括疫苗纳米佐剂，具体可以为用于增强免疫佐剂的活性或抗原免疫原性的纳米佐剂，而且二氧化锰-CpG纳米佐剂还可与二氧化锰-抗原纳米佐剂混合使用，作为疫苗诱导有效的免疫保护作用。
本发明上述步骤提供了一种二氧化锰纳米材料及其制备方法、应用，本发明通过生物矿化作用载带CpG或抗原，合成方法简单，适合于规模化生产应用，载带能力大，作为纳米佐剂可有效促进蛋白质抗原或多肽抗原的免疫原性，以及寡聚核苷酸CpG的免疫刺激活性。而且具有酸响应性且生物可降解，当纳米佐剂被免疫细胞如树突状细胞摄入后，其在溶酶体酸性环境中，可逐渐降解为锰离子，最终排出体外；同时，其在降解过程中，还可改变溶酶体膜的完整性，有效提高抗原的交叉呈递效率；此外，本发明制备的二氧化锰纳米佐剂，还具有磁共振成像功能，可为优化免疫策略提供重要指导。
参见图8，图8为本发明提供的二氧化锰纳米材料合成的示意简图。
实验结果表明，与游离的CpG和鸡卵清白蛋白抗原相比，二氧化锰纳米佐剂(MnO2-CpG,MnO2-OVA)可更加有效地激活专职性抗原呈递细胞-树突状细胞以及相关细胞因子(白介素12-IL-12和肿瘤坏死因子-TNF-α)的大量分泌；MnO2-CpG纳米佐剂还可极大地促进蛋白质抗原的交叉呈递效率，从而大大有利于激活机体的细胞免疫反应；动物实验结果进一步表明，无需借助其他荧光分子，二氧化锰纳米疫苗(MnO2-CpG+MnO2-OVA纳米佐剂混合物)的磁共振成像功能即可为确定最佳免疫周期提供直接信息，该纳米佐剂疫苗可通过促进OVA抗原和CpG免疫激活剂有效迁移至淋巴结大大提高抗原的交叉呈递效率，从而极大地促进机体抗原特异性细胞免疫反应的发生，包括大大增强CD8+T淋巴细胞(CTL)的杀伤功能和增殖能力以及机体干扰素(IFN-γ)的大量产生，最终有效抑制肿瘤的恶性进展。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种二氧化锰纳米材料及其制备方法、应用进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
实施例1
制备二氧化锰-抗原(MnO2-OVA)和二氧化锰-CpG(MnO2-CpG)纳米佐剂
首先，在磁力搅拌器搅拌过程中，将0.5mL OVA溶液(45μM)或CpG溶液(16μM)逐滴加至1mL氯化锰溶液(MnCl2,1mM)中，室温下孵育15～30分钟；之后，向上述溶液中加入12μL氢氧化钠溶液(1M)，继续反应1.5小时；最后，将反应液置于透析袋中(截留分子量为3500Da)透析4～6小时，每小时更换一次新鲜透析液(去离子水)，即可获得呈黄褐色的MnO2-OVA和MnO2-CpG纳米佐剂。
利用电感耦合等离子体光谱法(ICP-AES)对本发明实施例1制备的MnO2-OVA和MnO2-CpG纳米佐剂中MnO2的浓度进行检测，结果表明两种纳米佐剂中MnO2的浓度均为0.53mM，即约80％MnCl2最终反应转化为MnO2。
对本发明实施例1制备的MnO2-OVA和MnO2-CpG纳米佐剂的粒径和表面电荷进行表征。
参见图1，图1为本发明实施例1制备的MnO2-OVA纳米颗粒和MnO2-CpG纳米颗粒的透射电子显微镜照片。
参见图2，图2为本发明实施例1制备的MnO2-OVA纳米颗粒和MnO2-CpG纳米颗粒的动态光散射表征曲线图。
由图1和图2可知，本发明实施例1制备的MnO2-OVA和MnO2-CpG纳米材料的粒径和电位分别为37.4±4.6nm，-20.5±2.0mV以及27.9±2.3nm，-19.5±2.2mV。
实施例2
二氧化锰纳米佐剂的酸响应性和磁共振成像
将MnO2-OVA和MnO2-CpG纳米佐剂分别用不同pH条件的磷酸盐缓冲液(pH7.4,pH5.0)稀释5倍，室温下孵育，观察溶液的颜色变化。同时，分别将上述四种溶液进行梯度稀释，之后利用磁共振成像仪检测T1增强的磁共振信号(R1)。
参见图3，图3为本发明实施例2得到的MnO2-OVA纳米颗粒溶液和MnO2-CpG纳米颗粒溶液的酸响应性和磁共振成像评价结果。
结果如图3所示，MnO2-OVA和MnO2-CpG在酸性环境下由黄褐色变为无色溶液，说明二氧化锰纳米佐剂已溶解为锰离子。同时，结果表明，MnO2-OVA和MnO2-CpG在酸性环境下均可显著增强T1磁共振成像信号。
实施例3
二氧化锰纳米佐剂对树突状细胞的细胞毒性评价
首先，通过脱颈椎处死C57小鼠，无菌分离提取骨髓，裂解红细胞后，制备单细胞悬液，进行细胞计数。之后，利用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的RPMI1640完全培养基(含10％胎牛血清、青链霉素和β-巯基乙醇)稀释至4×105/mL，接种至细菌培养皿中(直径6cm)，置于细胞培养箱中培养；于第3天补充同体积的新鲜培养基(含GM-CSF)，第6天进行半量换液，第7天即可获得纯度为90％的树突状细胞，备用。
将MnO2-OVA和MnO2-CpG用不含刺激因子的RPMI1640培养基进行梯度稀释，并与适量树突状细胞混合均匀，接种至96孔培养板中，置于细胞培养箱中培养24小时，之后利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)对细胞活力进行检测。
参见图4，图4为本发明实施例3得到的MnO2-OVA纳米颗粒和MnO2-CpG纳米颗粒对树突状细胞的细胞毒性评价结果。
结果如图4所示，MnO2-OVA和MnO2-CpG对树突状细胞基本无毒，即使在最高浓度下，细胞活力仍保持在90％以上。
实施例4
二氧化锰纳米佐剂对树突状细胞成熟以及抗原交叉呈递效率的影响作用评价
根据实施例3中细胞活力评价结果，分别设阴性对照组、阳性对照组(脂多糖-LPS)、CpG、GpC、MnO2-CpG、OVA、OVA+CpG、OVA+MnO2-CpG、MnO2-OVA、MnO2-OVA+CpG、MnO2-OVA+MnO2-CpG与树突状细胞孵育24小时，其中OVA、CpG和LPS的工作浓度分别为20μg/mL、0.8μg/mL和1μg/mL，MnO2浓度为16μM。
之后，再利用流式细胞仪评价树突状细胞成熟(CD11c+CD80+CD86+)和OVA抗原交叉呈递(OVA257-264+CD11c+)效率的变化；同时，利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中成熟相关细胞因子IL-12p40和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达水平变化。
参见图5，图5为本发明实施例4中MnO2-OVA纳米颗粒和MnO2-CpG纳米颗粒对树突状细胞成熟和抗原交叉呈递效率的影响作用评价结果。
结果如图5A-C所示，与CpG相比，MnO2-CpG纳米佐剂可显著促进树突状细胞的成熟和相关细胞因子的分泌；与OVA相比，MnO2-OVA纳米佐剂可显著促进IL-12p40和TNF-α的分泌；且与其他处理组相比，MnO2-OVA+MnO2-CpG对树突状细胞的激活作用最强。同时，结果表明，MnO2-CpG可显著促进OVA抗原的交叉呈递效率(图5D)，这对于诱导细胞免疫反应是极其有利的。
实施例5
二氧化锰纳米佐剂疫苗对小鼠细胞免疫反应的影响作用
以雌性C57BL/6小鼠为对象，实验设PBS、OVA、OVA+CpG、OVA+MnO2-CpG、MnO2-OVA、MnO2-OVA+CpG、MnO2-OVA+MnO2-CpG共七组，每组6只。通过皮内注射途径免疫小鼠，每2周免疫一次，共三次。之后，于第三次免疫结束后2周，处死小鼠(图6A)，无菌采集小鼠脾总细胞(splenocytes)，分别利用流式细胞仪和酶联免疫吸附实验检测T细胞分泌γ-干扰素的能力变化、CD8+T淋巴细胞杀伤功能、CD8+T淋巴细胞增殖能力和血清中γ-干扰素的表达水平变化以及免疫反应的倾向性变化等。同时，在第一次免疫结束后3天，无菌采集腹股沟淋巴结，利用流式细胞仪分析抗原交叉呈递(OVA257-264+CD8+T细胞的比例)的变化情况。
参见图6，图6为本发明实施例5中二氧化锰纳米佐剂疫苗(MnO2-OVA+MnO2-CpG)对小鼠细胞免疫反应和在体水平抗原交叉呈递效率的影响作用评价结果。
结果如图6所示，与其他免疫组相比，MnO2-OVA+MnO2-CpG纳米佐剂疫苗可显著促进CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫反应(图6B-D)、促进血清中γ-干扰素的表达(图6E)，且其可显著促进机体细胞免疫倾向性的免疫反应发生(图6F)，这些结果与其可显著促进在体水平的抗原交叉呈递效率(图6G)密切相关。
实施例6
二氧化锰纳米佐剂疫苗对黑色素瘤的预防效果评价
参照实施例5所述方法，在第三次免疫结束后2周，于小鼠皮下注射3×105稳定表达OVA抗原的黑素瘤细胞(B16-OVA)或B16黑素瘤细胞(免疫反应特异性检测)，评价二氧化锰纳米佐剂疫苗对黑素瘤细胞的预防效果。
参见图7，图7为本发明实施例6中二氧化锰纳米佐剂疫苗(MnO2-OVA+MnO2-CpG)对稳定表达OVA抗原的黑色素瘤的预防作用评价结果。
结果如图7所示，二氧化锰纳米佐剂疫苗(MnO2-OVA+MnO2-CpG)可特异性地有效抑制B16-OVA黑色素瘤的生长。
以上对本发明提供的一种二氧化锰纳米佐剂及其制备方法、应用进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种二氧化锰纳米材料，其特征在于，包括二氧化锰纳米颗粒以及复合在所述二氧化锰纳米颗粒表面被载物质；
所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；
所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原。
2.根据权利要求1所述的二氧化锰纳米材料，其特征在于，所述二氧化锰纳米材料的粒径为15～100nm。
3.根据权利要求1所述的二氧化锰纳米材料，其特征在于，所述二氧化锰与所述CpG寡聚核苷酸的摩尔比为0.8：(0.006～0.02)。
4.根据权利要求1所述的二氧化锰纳米材料，其特征在于，所述二氧化锰与所述蛋白质抗原的摩尔比为0.8：(0.02～0.06)；
所述二氧化锰与所述多肽抗原的摩尔比为0.8：(0.06～0.2)。
5.根据权利要求1所述的二氧化锰纳米材料，其特征在于，所述抗原包括艾滋病毒抗原、结核杆菌抗原、疟疾抗原、人乳头状瘤病毒抗原和肿瘤相关抗原中的一种或多种。
6.一种二氧化锰纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将氯化锰溶液和被载物质溶液进行混合后，孵育得到复合物；
所述被载物质包括CpG寡聚核苷酸和/或抗原；所述抗原包括蛋白质抗原和/或多肽抗原；
B)将上述步骤得到的复合物与氢氧化钠溶液进行反应后，得到二氧化锰纳米材料。
7.根据权利要求6所述的二氧化锰纳米材料，其特征在于，所述氯化锰与所述CpG寡聚核苷酸的摩尔比为1：(0.006～0.02)；
所述氯化锰与所述蛋白质抗原的摩尔比为1：(0.02～0.06)；
所述氯化锰与所述多肽抗原的摩尔比为1：(0.06～0.2)；
所述氯化锰与所述氢氧化钠的摩尔比为1：(8～32)。
8.根据权利要求6所述的二氧化锰纳米材料，其特征在于，所述氯化锰溶液的浓度为80～200μg/mL；
所述CpG寡聚核苷酸溶液的浓度为20～60μg/mL；
所述蛋白质抗原溶液的浓度为650～1500μg/mL；
所述多肽抗原溶液的浓度为90～200μg/mL；
所述氢氧化钠溶液的浓度为300～800μg/mL。
9.根据权利要求6所述的二氧化锰纳米材料，其特征在于，所述孵育的时间为15～30分钟；
所述反应的时间为1～3小时。
10.权利要求1～5任意一项所述的二氧化锰纳米材料或权利要求6～10任意一项所制备的二氧化锰纳米材料在疫苗领域的应用。
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