CN101489588A - 生物活性的纯化HspE7组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高纯化的Hsp65－E7融合蛋白(HspE7)的生物活性的方法。该方法包括将HspE7与选自CpG、TLR3激动剂(如PolyLC、PolyICLC)、单磷酰脂质A(MPL)、MPL－海藻糖6，6’－二霉菌酸酯(MPL－TDM)和抗－CD40的免疫刺激剂一起混合。本发明还提供包括HspE7和CpG、TLR3激动剂(如PolyIC、PolyICLC)、单磷酰脂质A(MPL)、MPL－海藻糖6，6’－二霉菌酸酯(MPL－TDM)和抗－CD40中的一种或多种的组合物及通过使用该组合物在需要的哺乳动物或对象中减低肿瘤或病毒的发展的方法。

Description

生物活性的纯化HspE7组合物

技术领域

本发明涉及免疫学领域。进一步，本发明提供包含HspE7的组合物及其使用方法。

背景技术

疫苗接种和免疫治疗指的是一系列复杂设计的细胞相互作用序列的操作。细胞相互作用包括免疫监视，从而总的来说抗原呈递细胞(APC)及具体地说树突细胞(DC)与抗原相遇并摄取抗原，由抗原产生肽表位，并加载表位到由主要组织相容性复合体(MHC)编码的分子的识别槽裂(recognition cleft)中。在输出到DC表面后，负载有表位的MHC分子向T细胞呈递表位-MHC复合体并激活T细胞。激活的CD4+T辅助(Th)细胞向其它的DC传递趋化因子和细胞因子信号，使它们随之能够激活幼稚CD8+T细胞，从而将这些细胞转化成抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。激活的T辅助细胞也与B细胞相互作用，从而向它们提供控制分化、克隆扩增和在发生适应性免疫的体液应答时分泌的抗体同种型定义的分子信号。

疫苗接种和免疫治疗是预防或治疗多种病症(如特定的传染性疾病或癌症)的有吸引力的途径。但是，这种治疗的成功经常受到免疫治疗方案固有的几种缺陷的限制，例如，所选择的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的免疫原性较差。增强免疫应答的标准方法是使用与免疫原隔离的且通常在使用前与免疫原混合的佐剂。明矾(Alum)和弗氏不完全佐剂(IFA)是公知的佐剂的例子。特定的微生物天然产物也已显示可用作佐剂。常用的实例包括来自革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)及来自革兰氏阴性和革兰氏阳性两种细菌的细菌胞壁糖肽，也称作胞壁质或肽聚糖(PG)。

微生物佐剂被认为通过激活哺乳动物细胞中的模式识别受体(PRR)发挥其促炎性(pro-inflammatory)效应。称作Toll样受体(TLR)的哺乳动物表面受体是PRR系统中的关键受体种类之一。TLR的激活引发导致转录因子NFκB和AP1的诱导产生的细胞内信号级联，转录因子NFκB和AP1的诱导随之激发编码促炎介体(如趋化因子和特定的细胞因子)的基因的表达。到目前为止已经在人体中鉴定了11种不同的TLR，且各TLR具有识别微生物化合物的独特亚类的能力。

例如，LPS是TLR4的配体，肽聚糖是TLR2的配体。TLR也可以形成具有独特配体特异性的异二聚体。例如，来自支原体的巨噬细胞活化脂肽-2(MALP-2)是TLR2/TLR6异二聚体的配体，而细菌脂肽Pam3Cys-Ser-Lys(4)是TLR1/TLR2异二聚体的配体。

人乳头状瘤病毒(HPV)的E7蛋白是小的(大约10000Mw)、Zn-结合磷蛋白，它很可能由于其结合视网膜母细胞瘤基因产物Rb(结合并灭活转录因子E2F的肿瘤抑制因子)的能力而具有致癌性。转录因子E2F控制许多生长相关基因(包括编码胸苷激酶、c-myc、二氢叶酸还原酶和DNA聚合酶α的基因)的转录。Rb-E2F复合体的形成阻止后面的基因在G0和G1期中的表达，从而将其表达限制在S期中，Rb-E2F复合体在S期中按程序解离而释放出活性的转录因子E2F。因此E7代表了在乳头状瘤病毒感染中用于进行免疫干预的吸引人的靶标，因为它在整个病毒生活周期中表达且实际上它是在由HPV感染引起的晚期宫颈癌期间表达的仅有的两种病毒蛋白质之一。

已经有人报道了佐剂与HPV16蛋白的共同施用。例如，Freyschmidt等人(Freyschmidt E-J.等，2004，Antiviral Ther.9：479-489)证明脂多糖(LPS)、非甲基化的CpG和山梨糖醇增强了HPV16L1-E7融合颗粒诱导的树突细胞的激发。Kim等人(Kim T-Y.等，2002 CancerRes.62：7234-7240)指出HPV E7与CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)1826共用增强了对抗HPV 16的保护性免疫。Chen等人(Chen Y-F.等，2004，J.Virol.78：1333-1343)也报道了利用与CpG ODN 1826或弗氏佐剂共用的HPV E5消除含E5的肿瘤的生长。

WO99/07860公开了可在HPV感染期间用作引起抗-E7免疫应答的疫苗试剂的重组Hsp65-E7融合蛋白(HspE7)的制备。其中描述的HspE7融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)中表达且在引起E7特异性CD8免疫应答的能力方面具有生物活性。

发明内容

本发明涉及包含HspE7的组合物及其使用方法。更具体地说，本发明提供包含纯化的Hsp65-HPV E7融合蛋白(HspE7)的组合物及使用方法。

本发明的目的是提供一种改良的HspE7组合物。

按照本发明，提供了一种提高纯化的HspE7的生物活性的方法，包括将HspE7与选自CpG、TLR3激动剂、单磷酰脂质A(MPL)、MPL-海藻糖6，6’-二霉菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激剂一起混合。优选地，免疫刺激剂以每剂大约1μg至大约5000μg的量与HspE7共同施用。在本发明的一些方面中，免疫刺激剂是PolyI：C或与阳离子聚合物(如聚赖氨酸、聚精氨酸或包括大部分阳离子氨基酸的阳离子肽)复合的PolyI：C。在本发明的其它方面中，免疫刺激剂是PolyICLC。另外，纯化的HspE7使用凝胶电泳、HPLC或同时使用这两种方法测定的HspE7纯度为大约95％至大约99.99％。

本发明还涉及包含纯化的HspE7和选自CpG、TLR3激动剂、MPL、MPL-TDM和抗-CD40的免疫刺激剂的组合物。优选所述免疫刺激剂以每剂大约1μg至大约5000μg的量存在。在本发明的一些方面中，免疫刺激剂是PolyI：C或与阳离子聚合物(如聚赖氨酸、聚精氨酸或包括大部分阳离子氨基酸的阳离子肽)复合的PolyI：C。在本发明的其它方面中，免疫刺激剂是PolyICLC。另外，纯化的HspE7使用凝胶电泳、HPLC或同时使用这两种方法测定的HspE7纯度为大约95％至大约99.99％。

本发明还涉及减低在哺乳动物或对象中肿瘤负荷或病毒发展的方法，包括向需要的对象施用包含纯化的HspE7和选自CpG、TLR3激动剂、MPL、MPL-TDM和抗-CD40的免疫刺激剂的组合物。优选免疫刺激剂以每剂大约1μg至大约5000μg的量共同施用。在本发明的一些方面中，免疫刺激剂是PolyI：C或与阳离子聚合物(如聚赖氨酸、聚精氨酸或包括大部分阳离子氨基酸的阳离子肽)复合的PolyI：C。在本发明的其它方面中，免疫刺激剂是PolyICLC。另外，纯化的HspE7使用凝胶电泳、HPLC或同时使用这两种方法测定的HspE7纯度为大约95％至大约99.99％。

本发明进一步提供包括纯化的HspE7和选自CpG、TLR3激动剂、MPL、MPL-TDM和抗-CD40的免疫刺激剂及其使用说明的试剂盒。优选免疫刺激剂以每剂大约1μg至大约5000μg的量存在。在本发明的一些方面中，免疫刺激剂是PolyI：C或与阳离子聚合物(如聚赖氨酸、聚精氨酸或包括大部分阳离子氨基酸的阳离子肽)复合的PolyI：C。在本发明的其它方面中，免疫刺激剂是PolyICLC。另外，纯化的HspE7使用凝胶电泳、HPLC或同时使用这两种方法测定的HspE7纯度为大约95％至大约99.99％。

本发明涉及所述组合物用于增强抗HPV蛋白质抗原的免疫应答的用途，及在特别的实施方式中，用于增强抗肿瘤或抗表达HPV蛋白质抗原的HPV感染细胞的免疫应答的用途。该组合物可以用于在需要的对象中预防或治疗癌症。

本发明还涉及组合物的给药时间表。在本发明的特定方面中，本发明的组合物按照包括至少两个剂量的给药时间表施用。所述剂量可以在连续的几日内施用，或者在非连续的几日内施用，或者组合这两种方式。

该发明内容并不必然地描述本发明的所有特征。

附图简要说明

本发明的这些特征和其它特征通过下面参照附图对本发明所作的说明将变得更加清楚，附图中：

图1显示了各种HspE7制剂的抗肿瘤活性。方法L：方法L HspE7是高纯度的HspE7制剂。方法A HspE7是低纯度的HspE7(WO99/07860中进行了描述)。携带已建立的表达E7的TC-1肿瘤的小鼠在颈背部皮下注射梯度剂量的由方法A或方法L制备的HspE7(n＝30/组/剂量)，并随后使肿瘤生长49天。RD4-方法L HspE7(▼)；RD5-方法L HspE7(◆)；CL4-方法A HspE7(○)；CL6-方法A HspE7(□)。X轴：TC-1分析中使用的HspE7的剂量(以μg计)。

图2显示HspE7在包含CpG的寡核苷酸(TLR9激动剂)存在的情况下诱导E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的能力得到增强。给幼稚C57B1/6小鼠皮下注射单独的HspE7或HspE7+30μg CpG寡核苷酸，且通过ELISPOT测量E7-特异性脾细胞的数目。从左至右(每项处理两只小鼠为一组)，免疫抗原为400μg方法A HspE7(WO99/07860中描述的低纯度HspE7)、400μg方法A HspE7+30μg CpG寡核苷酸、400μg方法L HspE7(高纯度HspE7)、400μg方法L HspE7+30μg CpG寡核苷酸。用于ELISPOT分析的回忆抗原为HBV核心抗原(HBVcAg)(93-100)无关对照肽(实心条)、E7(49-57)特异性肽(灰色条)、仅具有培养基的对照(空心条)。

图3显示通过方法L HspE7(纯化的HspE7)和Poly I：C(TLR3激动剂)或CpG寡核苷酸(TLR9激动剂)而非PAM3CysSK4(TLR2激动剂)的共注射，HspE7诱导E7特异性CD8-阳性T淋巴细胞的能力得到增强。小鼠以标示剂量皮下注射方法L HspE7加TLR激动剂的混合物(溶液)，且E7-特异性脾细胞的数目通过ELISPOT进行测量。从左至右(每项处理两只小鼠为一组)，免疫抗原为50μg方法L HspE7+10μg CpG寡核苷酸、50μg方法L HspE7+100μg Poly I：C、50μg方法L HspE7+20μg PAM3CysSK4或幼稚小鼠。用于ELISPOT分析的回忆抗原为HBVcAg(93-100)无关对照肽(阴影条)、E7(49-57)特异性肽(实心条)、仅具有培养基的对照(空心条)。

图4显示在单磷酰脂质A(MPL，TLR4激动剂)存在下方法LHspE7诱导E7特异性CD8-阳性T淋巴细胞的能力得到增强。幼稚C57B1/6小鼠皮下注射单独的方法L HspE7(纯化的HspE7)或者HspE7加上MPL+TDM，且E7-特异性脾细胞的数目通过ELISPOT进行测量。从左至右(每项处理两只小鼠为一组)，免疫抗原为400μg方法L HspE7、MPL+TDM(Ribi)中的400μg方法L HspE7或幼稚小鼠。用于ELISPOT分析的回忆抗原为HBVcAg(93-100)无关对照肽(实心条)、E7(49-57)特异性肽(阴影条)、仅具有培养基的对照(空心条)。

图5显示在Poly ICLC(TLR3激动剂)存在下方法L HspE7诱导E7特异性CD8-阳性T淋巴细胞的能力得到增强。给幼稚C57B1/6小鼠皮下注射单独的方法L HspE7(纯化的HspE7)或者HspE7加上梯度剂量的Poly ICLC，且E7-特异性脾细胞的数目通过ELISPOT进行测量。从左至右(每项处理两只小鼠为一组)，免疫抗原为400μg方法LHspE7、400μg方法L HspE7+100μg Poly ICLC、400μg方法LHspE7+10μg Poly ICLC、400μg方法L HspE7+1μg Poly ICLC、400μg方法L HspE7+0.1μg Poly ICLC、仅100μg Poly ICLC或幼稚小鼠。用于ELISPOT分析的回忆抗原为HBVcAg(93-100)无关对照肽(灰色条)、E7(49-57)特异性肽(点画条)、仅具有培养基的对照(空心条)。

图6显示方法L HspE7或方法A HspE7对肿瘤发病率的影响。各种HspE7制剂的抗肿瘤活性通过施用方法A HspE7(低纯度的HspE7，在WO99/07860中进行了描述)或者共同施用方法L HspE7(纯化的HspE7)和CpG寡核苷酸来确定。携带已建立的表达E7的TC-1肿瘤的小鼠在颈背部皮下注射单独的方法A HspE7或与不同剂量CpG寡核苷酸混合的梯度剂量的方法L HspE7(n＝30/组)，并随后使肿瘤生长49天。3μg CpG寡核苷酸+方法L HspE7(■)；10μg CpG寡核苷酸+方法L HspE7(▲)；30μg CpG寡核苷酸+方法L HspE7(

)；方法A HspE7(◆)；平均的方法A HspE7历史数据(○)。X轴：TC-1分析中使用的HspE7的μg数。

图7显示通过结合Poly I：C和方法L HspE7(纯化的HspE7)使得方法L HspE7的抗肿瘤活性增加。携带已建立的表达E7的TC-1肿瘤的小鼠在颈背部皮下注射单独的梯度剂量的方法L HspE7或与PolyI：C组合的方法L HspE7(n＝20/grp)，并随后使肿瘤生长49天。注射了800μg方法L HspE7的小鼠中大约50％在第49天具有肿瘤。HspE7(■)；HspE7+Poly I：C(▲)。X轴：TC-1分析中使用的HspE7的μg数。

图8显示与纯化的HspE7(方法L HspE7)混合的佐剂明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)对于诱导E7特异性、CD8-阳性T淋巴细胞的作用。小鼠以标示剂量皮下注射单独的方法L HspE7或者方法L HspE7、CpG寡核苷酸、明矾和弗氏不完全佐剂(IFA)的各种组合，且E7-特异性脾细胞的数目通过ELISPOT进行测量。从左至右(每项处理两只小鼠为一组)，免疫抗原为400μg方法L HspE7、IFA中的400μg方法LHspE7、IFA中的400μg方法L HspE7+CpG寡核苷酸、400μg方法LHspE7+明矾、400μg方法L HspE7+明矾+CpG寡核苷酸、400μg方法L HspE7+CpG寡核苷酸或幼稚小鼠。用于ELISPOT分析的回忆抗原为HBVcAg(93-100)无关对照肽(阴影条)、E7(49-57)特异性肽(点画条)、仅具有培养基的对照(空心条)。

图9显示HspE7在各种TLR激动剂或激动性抗-CD40抗体存在的情况下共同施用时诱导E7特异性CD8-阳性T淋巴细胞的能力的对比。在将HspE7与咪喹莫特(TLR7激动剂)、PAM3CysSK4(TLR1/2激动剂)或LPS(TRL4激动剂)共同施用后，诱导的E7特异性T细胞的数目是微不足道的。相反，在将HspE7与CpG寡核苷酸或激动性抗-CD40抗体共同施用后诱导出大量的E7特异性T细胞。给小鼠皮下注射纯化的HspE7(方法L HspE7)加所示的TLR激动剂的混合物，且E7-特异性脾细胞的数目通过ELISPOT进行测量。从左至右(每项处理两只小鼠为一组)，免疫抗原为400μg方法L HspE7、400μg方法L HspE7+100μg咪喹莫特、400μg方法L HspE7+30μg LPS、400μg方法L HspE7+25μg PAM3CysSK4、400μg方法L HspE7+25μg抗-CD40抗体(克隆1C10)、400μg方法L HspE7+30μg CpG寡核苷酸或幼稚小鼠。用于ELISPOT分析的回忆抗原为HBVcAg(93-100)无关对照肽(实心条)、E7(49-57)特异性肽(阴影条)、仅具有培养基的对照(空心条)。

图10显示每日初免-加强(prime-boost)策略对通过IFN-γELISPOT测量的诱导I类限制CD8+T细胞应答的能力的影响。C57B1/6小鼠(每组两只)按每日间隔用HspE7(100μg)和Poly ICLC(10μg)进行免疫，每天一次，最多进行4天。在第一次抗原刺激(antigen exposure)后7天，将所有动物无痛致死并取脾细胞进行分析。使用IFN-γELISPOT评定在用16E7.49-57.Db肽刺激时的I类限制CD8+T细胞应答(回忆抗原-空心条；仅培养基对照-实心条)。从左至右(每项处理两只小鼠为一组)免疫抗原为：40μg Poly ICLC与400μg方法L HspE7(一剂)、10μg Poly ICLC与100μg方法L HspE7(一剂)、10μg Poly ICLC与100μg方法L HspE7(两剂)、10μg Poly ICLC与100μg方法L HspE7(三剂)、10μg Poly ICLC与100μg方法L HspE7(四剂)、幼稚小鼠。

图11显示HspE7加Poly ICLC的联合免疫对体液免疫的影响。C57B1/6小鼠的组(n＝5)用(X轴上从左至右)缓冲液、500μg HspE7、12.5μg Poly ICLC、500μg HspE7+1.25μg Poly ICLC、500μg HspE7+12.5μg Poly ICLC或500μg HspE7+125μg Poly ICLC按月间隔免疫两次(第1、28天)。在给药之前7天(d-7，基线)和在第21、49和77天采取血样进行血清抗体分析。通过标准ELISA检测取自小鼠个体的血清中抗E7和HspE7的抗体(IgG1、IgG2b和IgG2c)的存在。数据表示为获得高于分析板背景(确定为0.2OD单位)的吸光度的血清最高稀释度。图A)抗-E7 IgG1效价；B)抗-HspE7 IgG1效价；C)抗-E7IgG2b效价；D)抗-HspE7 IgG2b效价；E)抗-E7 IgG2c效价；F)抗-HspE7 IgG2c效价。空心条-预取血对照；阴影条-第21天取血；实心条-第49天取血；带状条-第77天取血。

图12显示外源抗原加Poly ICLC进行免疫诱导抗原特异性CD8⁺T细胞应答的结果。C57B1/6小鼠(每组两只小鼠)用单独的400μgHspE7、100μg Poly ICLC与400μg HspE7、10μg Poly ICLC与400μgHspE7、1μg Poly ICLC与400μg HspE7、0.1μg Poly ICLC与400μgHspE7、单独的100μg Poly ICLC或缓冲液(对照)进行皮下免疫。免疫后七天，通过IFN-γELISPOT评价对H-2D^b限制性表位E7_49-57的抗原特异性CD8T细胞应答。用于ELISPOT的回忆抗原：空心条-培养基对照；灰色条-E7肽；黑色条-HBVCor肽。

图13显示HspE7加Poly ICLC的多剂量免疫诱导大的、已建立的TC-1肿瘤发生退化的结果。C57B1/6小鼠(每组15只小鼠)在第0天用表达E7的TC-1.K肿瘤细胞(6×10⁴)接种并在接种后的第28天开始用4个连续日剂量的单独缓冲液(空心方块)、100μg HspE7蛋白(空心三角)、10μg Poly ICLC(空心圆圈)或100μg HspE7蛋白+10μg PolyICLC(实心圆圈)进行处理。数据表示为随时间变化的各组的中值肿瘤体积(图面A)或表示为随时间变化的各组内动物个体的肿瘤体积(图面B)。

图14显示使用HspE7抗原加TLR3激动剂的多剂量免疫策略的结果。(A)C57B1/6小鼠(每组2只小鼠)用重组HspE7蛋白(100μg)加TLR3激动剂Poly ICLC(10μg)进行皮下免疫，在第0天免疫一次(实心方块)，或者在第0和2天免疫两次(空心方块)，或者在第0和4天免疫两次(实心圆圈)。在所示的时间点(第一次免疫后的天数)通过IFN-γ ELISPOT评定对H-2D^b限制性表位E7_49-57的抗原特异性CD8T细胞应答。(B)C57B1/6小鼠(每组4只小鼠)用重组HspE7蛋白(100μg)加TLR3激动剂Poly ICLC(10μg)进行皮下免疫，连续4天每天一起免疫，或者仅在第1天一起免疫一次，或者在第1天一起免疫一次后在第2、3和4天仅使用Poly ICLC(10μg)进行免疫。第一次免疫后七天，通过IFN-γELISPOT评价对H-2D^b限制性表位E7_49-57的抗原特异性CD8T细胞应答。

图15显示使用HspE7抗原加TLR3激动剂的多剂量免疫策略的结果。(A)C57B1/6小鼠(每组2只小鼠)用重组HspE7蛋白(100μg)加Poly ICLC(10μg)在所示数目的连续数天内每天进行免疫或者用单剂量的HspE7蛋白(400μg)加Poly ICLC(40μg)进行免疫。第一次免疫后七天，通过IFN-γ ELISPOT评价对H-2D^b限制性表位E7_49-57的抗原特异性CD8T细胞应答。(B)来自幼稚小鼠(右图面)或接受了四个连续日剂量的HspE7蛋白(100μg)加Poly ICLC(10μg)的小鼠(左图面)的脾细胞用负载有E7_49-57肽的PE偶联的H-2D^b五聚体(Proimmune)进行染色且用抗-CD8和抗-CD44mAb进行表面染色。显示出的细胞表示选出的(gated)CD8⁺阳性群。(C)C57B1/6小鼠(每组2只小鼠)用重组HspE7蛋白(100μg)加Poly ICLC(10μg)在所示数目的连续数天内每天进行免疫。在所示的时间点(第一次免疫后的天数)通过IFN-γELISPOT评价对H-2D^b限制性表位E7_49-57的抗原特异性CD8T细胞应答。

具体实施方式

本发明涉及包含HspE7的组合物及其使用方法。

下面是对优选实施方式的说明。

本发明提供包含与免疫刺激剂(例如，但不限于TLR激动剂)和任选的其它药物学上可接受的成分在一起的纯化HspE7的组合物。免疫刺激剂可以是TLR3或TLR9激动剂，但也可以采用其它TLR激动剂。可以与纯化的HspE7混合的免疫刺激剂的例子包括，但不限于包含CpG的寡核苷酸(TLR9激动剂)、TLR3激动剂(例如双链RNA(dsRNA)或Poly I：C，或者具有聚-L-赖氨酸的Poly I：C(polyICLC))、单磷酰脂质A(MPL，TLR4激动剂)或MPL-海藻糖6，6’-二霉菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD-40。

纯化的HspE7意思是特征为包含约95％至约99.99％的HspE7或该范围内的任何量的HspE7的HspE7制剂，其余的成份包括在HspE7制备和纯化后存在的成分。例如，纯化的HspE7其特征可以是包含约95％至约98％或该范围内的任何量的HspE7，或者约97至约99.6％或该范围内的任何量的HspE7。纯化的HspE7可以包含约95、96、97、98、99、99.2、99.4、99.6、99.8、99.9、99.95、99.99％或其间的任何量的HspE7。纯化的HspE7的例子是方法L HspE7(Process L HspE7)。

HspE7或方法L HspE7的纯度可以使用任何已知的纯度测定方法确定，包括例如，但不限于HPLC或凝胶电泳。例如，还原和非还原凝胶电泳的组合(含有SDS±β-巯基乙醇的1％PAGE)应当是本领域技术人员已知的。

Hsp65-HPV E7融合产物(HspE7)可以按照多种方法产生，例如在WO99/07860(其通过引用并入本申请)中公开的方法。为了如这里所述进行应用，HspE7制备之后进行进一步的纯化。进一步的纯化可以使用任何已知的纯化方法完成，包括利用尺寸排阻、离子交换(阳离子、阴离子或两者)、亲和、反相中的一种或多种的色谱方法或其它色谱方法，根据尺寸、电荷或者两者进行的凝胶电泳，使用离液剂(例如，但不限于脲或盐酸胍)的变性，盐或pH沉淀，膜过滤等等，这些应当是本领域技术人员已知的。

WO99/07860中公开的HspE7是纯度比此处描述的高纯度HspE7(方法L HspE7)低的制剂(例如，包含低于约95％的纯度)。HspE7的低纯度形式称作方法A HspE7(Process A HspE7)或者方法A。不希望受到理论的限制，方法A HspE7包含一种或一种以上的导致其生物活性与进一步纯化的HspE7(例如方法L HspE7)相比提高的成分(例如参见图1和2)。但是，如此处所描述的，当现有技术的HspE7(方法AHspE7)进一步纯化到约95％至约99.99％或其间的任何值的纯度(方法L HspE7)以产生低毒性HspE7时，观察到了HspE7生物活性的损失(见图1和2，方法L HspE7对方法A HspE7，及实施例2和3)。如图1中所示，使用方法L HspE7(纯化的HspE7)没有表现出与在相似的剂量范围内使用低纯度方法A HspE7观察到的同样显著的肿瘤发病率的降低。但是，如下面所描述的，高纯度的HspE7(例如，但不限于方法L HspE7)在与免疫刺激剂(例如，但不限于TLR激动剂)共同施用时表现出生物活性。包含纯化的HspE7和免疫刺激剂的纯化HspE7组合物可以进一步包含其它药物上可接受的成分。免疫刺激剂可以是TLR3或TLR9激动剂，但是，也可以采用其它TLR激动剂或佐剂，例如CD40。

可以与纯化的HspE7混合的免疫刺激剂的例子包括，但不限于包含CpG的寡核苷酸(TLR9激动剂)、PolyI：C、PolyICLC(TLR3激动剂)、单磷酰脂质A(MPL，TLR4激动剂)、MPL-海藻糖6，6’-二霉菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD-40抗体。CpG寡核苷酸的非限制性的例子可以包括例如，包含B类型式的核心序列(class B type core sequence)：GACGTT的CpG，例如并不认为是限制性的CpG1982、1826或1668。CpG1982具有以下序列：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ IDNO：1)。CpG 1982可采用硫逐磷酸酯骨架(来自Invitrogen，且表示为：ZOO FZE FOE ZZO OZE FZE OT)获得。CpG 1826具有以下序列：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO：2)。CpG 1668包括以下序列：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ ID NO：3)。优选地，CpG寡核苷酸1982和1668包括硫逐磷酸酯骨架。具有最佳的鼠B类型式核心序列(GACGTT)的几种包含CpG的寡核苷酸(包括1668)显示出在增强方法L HspE7的活性方面是高活性的。类似地，CpG C类型式的寡核苷酸(2395)被发现是高活性的。但是A类型式的包含CpG的寡核苷酸在ELISPOT试验中增强HspE7活性的效率要低得多。对于CpG的A、B和C类的解释参见Vollmer J.等的文章(Vollmer J.等，2004，Eur J.Immunol.34：251-262)。

PolyIC核糖核酸(包括与其它物质结合的双链核糖核酸(dsRNA))显示出改善的稳定性特征，例如对外源RNA水解酶的感受性降低。dsRNA可以例如包被在脂囊泡中或与聚阳离子聚合物复合。这种聚合物的例子包括，但不限于包括大部分阳离子氨基酸的肽、聚赖氨酸、聚精氨酸等等，美国专利4346538描述了包括相对高分子量的polyI：C、MW范围为13-35kD的聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素的polyIC复合物(“polyICLC”)、制备方法和使用该复合物的方法。也已有人提出将polyICLC用作治疗某些癌症、某些病毒性疾病(如HIV或埃博拉)及多发性硬化的治疗剂(美国公开2006/0223742)。

双链RNA PolyIC核糖核酸在某些实施方式中可以包括反平行碱基配对结构的polyI寡核苷酸和polyC寡核苷酸。这种双链核酸分子的链按照有序的方式通过氢键发生相互作用(也称为“沃森-克里克”碱基配对)。也可以通过非规范氢键产生变异的碱基配对(包括Hoogsteen碱基配对)。在某些热力学、离子或pH条件下，可以产生三重螺旋，特别是对于核糖核酸。这些和其它的变异氢键或碱基配对是现有技术中已知的，且可以在例如Lehninger-Principles ofBiochemistry，第三版(Nelson和Cox编辑，Worth Publishers，NewYork.)中找到，此处通过引用并入本申请中。

“polyI”寡核苷酸包括大部分的肌苷、肌苷类似物核苷或其组合。肌苷类似物核苷包括例如7-脱氮肌苷、2’-O-甲基-肌苷、7-硫-7，9-二脱氮肌苷、间型霉素B、8-氮肌苷、9-脱氮肌苷、别嘌呤醇核糖核苷、8-溴-肌苷、8-氯肌苷等等。

“polyC”寡核苷酸包括大部分的胞苷、胞苷类似物核苷或其组合。胞苷类似物核苷包括例如5-甲基胞苷、2’-O-甲基-胞苷、5-(1-炔丙基)胞苷等等。

包含非规范核苷和/或核苷间连接的核酸在用作佐剂时还可以提供改善的稳定性特征，并引起免疫刺激效应的改变，或改变这里描述的HspE7组合物的生物活性。“规范”核苷包括天然发生的核苷，如脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧肌苷、腺苷、鸟苷、5-甲基尿苷、尿苷和胞苷。改变的免疫刺激效应可以表现为更快的适应性应答、先天或体液免疫应答，或者可以是持续更长时间但更少即时性的应答。

非规范核苷的例子在本领域中是公知的，且包括例如，“锁核酸”或“LNA”。LNA是一种如在WO 99/14226、WO 00/56746、WO00/56748、WO 01/25248、WO 0148190、WO 02/28875、WO 03/006475、WO 03/09547、WO 2004/083430、US 6268490、US 679449、US 7034133中描述的具有2′-4′环连接的核苷。其它非LNA双环核苷在本领域中也是公知的，例如：

-具有附加的C-3′，C-5′-亚乙基桥的双环[3.3.0]核苷；

-具有附加的C-1′，C-6′-或C-6′，C-4′亚甲基桥的双碳环[3.1.0]核苷；

-与未修饰的核苷合成为二聚体的包含附加的C-2′，C-3′二氧戊环(dioxalane)的双环[3.3.0]-和[4.3.0]核苷，其中附加的环为代替天然的磷酸二酯键的核苷间连接的部分；二聚体包含具有作为酰胺-和磺酰胺-型核苷间连接的部分的C-2′，C-3′-亚甲基桥的双环[3.1.0]核苷；

-通过核苷间缩醛键(formacetal internucleoside linkage)加入到三聚体的中间的双环[3.3.0]葡萄糖衍生的核苷类似物；

-两个五元环和一个三元环构成骨架的三环-DNA；

-1，5-失水己糖醇核酸；以及

-具有附加的C-2′，C-3′-连接的六元和五元环的双环[4.3.0]-和[3.3.0]核苷。

可用于dsRNA中的其它非规范核苷和非规范核苷间连接(“骨架”)描述于如Freier，1997(Nucleic Acids Res.25：4429-4443)或Praseuth等人(Biochimica et Biophysica Acta 1489：181-206)中。

本发明的纯化HspE7称为方法L HspE7(或方法L)。不期望被理论限制，一种或多于一种成分可以在方法L HspE7的纯化过程中从HspE7制剂中除去，而该一种或多于一种成分可能赋予低纯度的(方法A)HspE7制剂佐剂样活性。但是，为了HspE7组合物的临床试验和获得监管部门批准，需要将未知成分在组合物中的百分比最小化。

HspE7的生物活性是指HspE7对体外或体内生物活性的任何调节、增强或刺激。生物活性也可以包括HspE7对体外和体内生物活性的抑制。许多这种活性是已知的并且可用作确定HspE7的生物活性的基础。例如，其不被认为是限制性的，E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的诱导可用于确定HspE7的生物活性。在设计用于测量这种性质的一种类型的分析中(ELISPOT)，在用试验化合物或混合物处理C57B1/6小鼠之后，确定每一给定数目的脾细胞中产生IFN-γ的细胞的数目(见实施例2)。另一种分析方法包括通过用试验化合物或混合物处理具有TC-1肿瘤的小鼠并在一段时间(例如49天间隔)后确定肿瘤发病率的百分比来确定HspE7的抗肿瘤活性(见实施例2)。可选择地，如本领域技术人员应知道的，也可以采用细胞溶解活性的刺激(CTL分析)。生物活性也可以包括对免疫原或抗原的特异性细胞介导应答的或体液应答的诱导，包括各种类型和亚型的特异性抗体的产生。

由HspE7的纯化导致的活性损失可以通过向HspE7组合物中加入适当的佐剂或免疫刺激剂(例如，但不限于TLR激动剂)来恢复。为了设计-回复HspE7组合物，测试了佐剂恢复HspE7活性的效能。这些佐剂包括CpG寡核苷酸、PolyI：C、PolyICLC、MPL、MPL-TDM、咪喹莫特、粗糙型LPS(脂多糖)、光滑型LPS、Pam3CysSK4、抗-CD40、明矾和弗氏不完全佐剂(IFA)。

“佐剂”或“免疫刺激剂”是当与免疫原结合时增强或增加对免疫原的免疫应答的物质或化合物的组合。可以采用标准分析方法(包括这里描述的那些分析方法)确定免疫应答的增强或增加。佐剂或免疫刺激剂可以由一种或多于一种化合物组成。

“免疫应答”指免疫系统的促炎症反应或抗炎症反应，包括适应性、体液、先天和细胞介导的体系。术语“调节(modulate)”或“调节(modulation)”等指增大或减小选定的参数。

向纯化HspE7中加入几种公知的佐剂，例如明矾或弗氏不完全佐剂(IFA；见图8，实施例6)，没有恢复纯化后所观察到的与HspE7(例如，但不限于方法L HspE7)相关的生物活性的损失。类似地，粗糙型LPS(实施例7、图9)、咪喹莫特(实施例7、图9)或Pam3CysSK4(实施例7、图9)的混合也没有增加HspE7生物活性。然而，纯化HspE7与CpG寡核苷酸(例如实施例3、图2和3)、PolyI：C(实施例4、图3)、PolyICLC(图5)、单磷酰脂质A(MPL；图4)或抗-CD40(图9)的混合引起与高纯度HspE7相关的生物活性的恢复。当CpG寡核苷酸、PolyI：C或PolyICL在不存在HspE7的情况下施用时，它们的加入没有表现出这种活性。

因此，本发明还涉及一种增加高纯度HspE7的生物活性的方法，包括将纯化HspE7与选自CpG寡核苷酸、PolyI：C、PolyICLC、单磷酰脂质A(MPL)、MPL-TDM和抗-CD40的免疫刺激剂一起混合或共同施用。优选地，免疫刺激剂以大约0.1μg至大约20mg的量或其间内的任何量存在，例如大约1μg至大约5000μg/剂或其间的任何量，大约10μg至大约1000μg或其间的任何量，或者大约30μg至大约1000μg或其间的任何量。例如，可以采用大约0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000、1500、2000、5000、10000、20000μg的剂量或其间的任何量。类似地，纯化HspE7以大约0.1μg至大约20mg的量或其间的任何量存在，例如大约1μg至大约2000μg/剂或其间的任何量，大约10μg至大约1000μg或其间的任何量，或者大约30μg至大约1000μg或其间的任何量。例如，可以采用大约0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000、1500、2000、5000、10000、20000μg的剂量或其间的任何量。

“有效量”指本发明的化合物或组合物有效地产生所希望的或所指出的免疫或治疗效果的量。在哺乳动物或对象中要达到的剂量的非限制性实例是大约0.3mg/kg的HspE7、免疫刺激剂或这两者，并且该剂量可以按照需要为大约0.03mg/kg至大约30.0mg/kg的HspE7、免疫刺激剂或这两者，或者其间的任何量。然而，也可以采用低于0.3mg/kg或高于30.0mg/kg的HspE7、免疫刺激剂或这两者的剂量，并且其也包括在本发明中。本领域的技术人员应该能够确定HspE7、免疫刺激剂或这两者的适当的剂量。

此外，本发明提供包含纯化HspE7和选自CpG、TLR3激动剂(例如PolyI：C或PolyICLC)、MPL和抗-CD40的免疫刺激剂的组合物。优选地，免疫刺激剂如以上所限定的以每剂大约0.1μg至大约20mg的量，或者其间的任何量存在。

本发明还涉及在对象、动物或患者中减低肿瘤生长的方法，包括施用包含纯化HspE7和选自CpG、TLR3激动剂(例如PolyI：C或PolyICLC)、MPL和抗-CD40的免疫刺激剂的组合物。优选地对于需要的对象、动物或患者，免疫刺激剂如以上所限定的以每剂大约0.1μg至大约20mg的量，或者其间的任何量存在。

术语“患者”或“对象”指包括人类和其它灵长类、宠物、动物园和农场动物(包括但不限于猫、狗、啮齿类、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、马、牛、绵羊、猪、山羊)、禽类等的哺乳动物和其它动物。

本发明的HspE7组合物可以与任何适合的药用载体或盐混合。“药物学上可接受的盐”指相对无毒的、本发明化合物的无机和有机酸加成盐和碱加成盐。这些盐可以在化合物的最后的分离和纯化过程中原位制备。特别地，可以通过独立地使游离碱形式的纯化化合物分别与适合的有机或无机酸反应并分离如此形成的盐来制备酸加成盐。示例性的酸加成盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐(naphthylate)、甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖醛酸盐(lactiobionate)、氨基磺酸盐、丙二酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、亚甲基-双-β羟基萘甲酸盐、龙胆酸盐、羟乙基磺酸盐、双对甲苯酰酒石酸盐、甲烷磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸月桂基磺酸酯(quinateslaurylsulphonate)盐等等。参见，例如S.M.Berge等人，“Pharmaceutical Salts，”J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)，其通过引用并入本申请。可以通过独立地使酸形式的纯化化合物与合适的有机或无机碱反应并分离如此形成的盐来制备碱加成盐。碱加成盐包括药物学上可接受的金属和胺盐。适合的金属盐包括钠、钾、钙、钡、锌、镁和铝盐。优选为钠和钾盐。适合的无机碱加成盐优选由金属碱制备，所述金属碱包括氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌。适合的胺碱加成盐由具有足够形成稳定的盐的碱度的胺制备，并且优选包括由于其低毒性和可医用性而常用于药物化学中的那些胺，例如氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、氢氧化四甲铵、三乙胺、二苄胺、二苯羟甲胺(ephenamine)、脱氢枞胺、N-乙基哌啶、苄胺、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸)和二环己基胺等等。

本发明的HspE7组合物可以通过任何合适的途径施用，包括注射、皮肤贴片或口服。因此，在一个方面中，本发明提供一种用于人类和兽医学用途的药物组合物，该组合物包括包含与免疫刺激剂(例如，抗-CD40或包括CpG、TLR3激动剂(如PolyI：C或PolyICLC)、或MPL的TLR激动剂)混合的纯化HspE7或其药物学上可接受的盐的复合物，以及一种或多种药物学上或生理学上可接受的缓冲液、载体、赋形剂或稀释剂，和任选地其它治疗剂。应注意，本发明的化合物可以单独施用或者以包含两种或多种化合物的混合物施用。本发明还包括包含与TLR激动剂(包括CpG或PolyI：C)混合的纯化HspE7或其药物学上可接受的盐的复合物用于制备预防或治疗其中炎症免疫应答有益的感染或病状、或者疾病状态或情况的药剂的用途。

本发明的化合物可以以药物学上或生理学上可接受的溶液施用，所述溶液可以含有药物学上或生理学上可接受的浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、稀释剂、赋形剂、分散剂等，和任选的其它治疗成分。因此，如本领域技术人员应知道的，本发明的化合物和组合物可以被配制成各种标准的药物学上可接受的非肠道剂型。

本发明的药物组合物可以包含有效量的目前公开的化合物或组合物，任选包括在药物学上或生理学上可接受的缓冲液、载体、赋形剂或稀释剂中。术语“药物学上或生理学上可接受的缓冲液、载体、赋形剂或稀释剂”指适于向人类或其它动物施用的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂(dilutant)或包封物质。术语“载体”指天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其结合以利于应用。药物组合物中的成分能够与本发明的聚合物以不存在实质上会破坏所需的活性化合物的药物功效的相互作用的方式彼此混合。

适合非肠道施用的组合物方便地包括可以与接受者的血液等渗的无菌水性制剂。可接受的载体和溶剂为水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油通常被用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，如油酸的脂肪酸可用于制备可注射剂。适合于皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内等施用的载体配方可以在Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，A.R.Gennaro编辑，MackPublishing Co.，Easton，Pa.(1995)中找到，其通过引用并入本文。

组合物可以方便地以单位剂型或剂量单位形式存在，并且可以通过药剂学领域中公知的任何方法制备。所有方法包括将化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般而言，通过将化合物均匀且紧密地与液体载体、细微分割的固体载体或者这两者结合来制备组合物。本发明的化合物可以冻干贮存，并且以使用前混合的试剂盒形式提供。

其它给药系统可以包括长效的(time-release)、延释的(delayed-release)或缓释给药系统。这些系统可以避免重复施用本发明的组合物，从而提高了对于对象和医师的便利性。

含有药物的前述聚合物的微囊在如美国专利5075109中进行了描述。给药系统也包括非聚合物系统，例如：脂质，包括甾醇类(如胆固醇、胆固醇酯)以及脂肪酸或中性脂肪(如甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯)、水凝胶释放系统、硅橡胶系统、基于肽的系统、蜡包衣、使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂、局部融合埋植剂(partially fusedimplant)等等。

对需要预防或治疗慢性HPV感染或与HPV感染有关的病状、或者其中免疫系统的刺激有益的疾病或障碍的人类或动物患者施用化合物的最佳量的确定以及施用包含这些化合物的治疗或药物组合物的方法是药学、医学和兽医领域中的技术人员所熟知的。人类或动物患者的给药剂量(dosing)取决于要治疗的慢性HPV感染或与HPV感染有关的病状或者其它疾病或障碍的性质、患者的状态、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、持续时间和施用途径、化合物的吸收率、分布、代谢速率、排泄、与其它药物的结合、要治疗的慢性HPV感染或与HPV感染有关的病状或者其它疾病或障碍的严重度以及治疗的病状或疾病状况的反应性，并且可以容易地进行优化以获得所需水平的效应。疗程可以持续几天至几周或几个月，或者直到实现治愈或达到疾病状况可接受的减轻或防止。可以结合治疗效果由测量患者体内的免疫应答来计算最佳给药时间表。普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以根据免疫调节聚合化合物的效力进行变化，并且通常可以根据在体外和体内动物模型中发现有效的ED₅₀值来估计。用于治疗或预防要治疗的慢性HPV感染或与HPV感染有关的病状或者其它疾病或障碍的本发明化合物的有效量、含有这些化合物的输送载体、激动剂和治疗方案可以通过常规方法确定。例如，医生或兽医可以对第一个对象或患者或者第一组对象或患者以低剂量的化合物开始治疗，然后对第二个或后续的对象或患者、或者第二组或后续组的对象或患者增加剂量或系统地改变给药方案，监控其对于患者或对象的效果并调整剂量或治疗方案以使所希望的治疗效果最大化。剂量和治疗方案最优化的进一步的讨论可以在Goodman & Gilman′s中Benet等人(1996，The PharmacologicalBasis of Therapeutics，第九版，Hardman等人编辑，McGraw-Hill，NewYork，Chapter 1，pp.3-27；其通过引用并入本文)或Bauer(L.A.Bauer，1999，在Pharmacotherapy，A Pathophysiologic Approach中，第四版，DiPiro等人编辑，Appleton & Lange，Stamford，Connecticut，，Chapter 3，pp.21-43；其通过引用并入本文)的文章中找到。

可以采用多种给药途径。所选择的特定的方式将取决于选择哪种化合物、被治疗的特定的病症以及达到治疗效果所需的剂量。一般来说，可以采用医学上可接受的任何给药方式实施本发明的方法，这意味着可以采用产生有效水平的免疫应答而不引起临床上不能接受的副作用的任何方式。尽管也可以采用口服，但是优选的给药方式为非肠道途径。术语“非肠道”包括皮下、真皮内、静脉内、肌肉内或腹腔内注射或者灌注技术。

在本发明的上下文中，如此处所用的术语“治疗”、“治疗用途”、“治疗方案”指的是包括施用本发明的组合物的预防、减轻和治疗的用药程式，并且包括目前要求保护的化合物对要治疗的由慢性HPV感染引起的疾病状态、状况、症状、征兆或障碍或与HPV感染有关的病状或者其它疾病或障碍进行治疗，或者预防、阻碍、延缓或逆转与其有关的症状、征兆、状况或障碍的进展的任何和所有的用途。因此，对与慢性HPV感染有关的不希望的疾病状态、症状、状况、征兆或障碍或与HPV感染有关的病状，或者其中刺激机体免疫应答有益的其它疾病或障碍的任何预防、改善、减轻、逆转或完全消除都被本发明包括。

为了本发明的目的，如用于癌症治疗的术语“治疗(treating和treatment)”的含义是广义的，并且包括本领域通常接受的很多种不同的概念。因此，如此处所使用的，这个术语包括，但不限于进行性疾病的时间延长、肿瘤减小、疾病减轻、痛苦缓解、生存质量改善、生命延长、如疼痛、呼吸困难、食欲不振和体重减轻、疲劳、衰弱、抑郁和焦虑、意识模糊等症状的改善或控制、患者舒适度提高等等。个别的目标甚至可以是完全治愈疾病。

本发明的HspE7可用于治疗非肿瘤、HPV感染细胞或HPV诱导的疾病状态，例如但不限于生殖器疣、过度增殖状态、病毒感染细胞、慢性病毒感染细胞等等。

术语“癌症”具有许多定义。根据美国癌症协会的定义，癌症是一类以异常细胞的不受控生长(并且有时扩散)为特征的疾病。尽管癌症经常指单一的状况，但是它事实上包括多于200种不同的疾病。当这种细胞阻止了重要器官的正常功能时，肿瘤生长可以具有杀伤性或在体内扩散，从而破坏重要的系统。本发明的组合物可以通过包括向需要的动物或对象施用有效量的本发明的化合物或组合物的方法用于治疗动物或对象中的易感肿瘤。

本发明的化合物作为治疗剂可有效对抗的不同类型的癌症的非限制性例子包括：恶性肿瘤，例如包括多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜和脉络丛瘤、松果体瘤、神经元肿瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、脑脊膜瘤和脑膜肉瘤的中枢神经系统肿瘤；包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、横纹肌肉瘤和视网膜母细胞瘤的眼部肿瘤；包括垂体瘤、甲状腺瘤、肾上腺皮质瘤、神经内分泌系统瘤、胃肠胰内分泌系统瘤和生殖腺瘤的内分泌腺肿瘤；包括头颈癌，口腔、咽和喉部肿瘤，以及牙源性肿瘤的头颈部肿瘤；包括大细胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺癌和胸部原发性生殖细胞肿瘤的胸部肿瘤；包括食管、胃、肝、胆囊、胰腺外分泌部、小肠、阑尾和腹膜肿瘤、结直肠腺癌和肛门肿瘤的消化道肿瘤；包括肾细胞癌、肾盂、输尿管、膀胱、尿道、前列腺、阴茎、睾丸肿瘤的泌尿生殖道肿瘤；以及女性生殖器官，包括外阴和阴道、子宫颈肿瘤、子宫体腺癌、卵巢癌、子宫肉瘤(gynecologic sarcomas)和乳腺癌；包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维肉瘤、Merkel细胞瘤和恶性黑色素瘤的皮肤肿瘤；包括骨源性肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、原发性神经外胚层瘤和血管肉瘤的骨和软组织肿瘤；包括骨髓发育异常综合征、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、HTLV-1和5T-细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤和肥大细胞白血病的造血系统肿瘤；以及包括急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、成神经细胞癌、骨肿瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤和肾肿瘤的儿童肿瘤。

除了制备HspE7的方法之外，PCT专利申请WO 99/07860提供了关于多种类型的HPV和由慢性HPV感染引起的、与其相联系或相关的一些病状或与HPV感染伴随的病状的非限制性的讨论。本发明的化合物作为治疗剂可有效对抗的不同类型的慢性HPV感染或与HPV感染相关的病状的其它(非限制性)例子包括：宫颈上皮内瘤变(例如，HPV型16、18、31、33、35、39)、鲍恩样丘疹病(例如，HPV型16、18、33、39)、布-勒二氏瘤(Buschke-Lowenstein tumor)(例如，HPV型6、11)、寻常疣/屠夫疣(Butcher′s warts)(例如，HPV型7)、皮肤鳞状细胞癌(例如，HPV型38、41、48)、疣状表皮发育不良(例如，HPV型1-5、7-9、10、12、14、15、17-20、23-25、36、47、50)、角化棘皮瘤(例如HPV型77)、口腔局灶性上皮增生病(Heck′s病)(例如，HPV型13、32)、肾移植病人中的疣(例如，HPV型75-77)、单纯疣(寻常性疣)、丝状疣、扁平疣、脚底、手掌或镶嵌疣、甲周疣、难治性疣、生殖器疣、湿疣、尖锐湿疣、性病疣、皮肤乳头瘤病毒病、鳞状细胞乳头状瘤、移行细胞乳头状瘤(膀胱乳头状瘤)等等。

特定的治疗方案可以持续一段时间，其可以根据要治疗的具体的慢性HPV感染或与HPV感染相关的病状或者其它疾病或障碍的性质、其严重程度和患者的总体状况而改变，并且可以包括几天、几周、几个月或更长时间内每天一次至几次施用含有化合物的组合物。治疗后，监控患者状况的改变以及障碍或疾病状态的症状、征兆或者情况的减轻。在患者对目前的剂量水平反应不明显的情况下组合物的剂量可以增加，或者如果观察到障碍或疾病状态的症状得到减轻或障碍或疾病状态已经除去，则可以减小剂量。

最佳给药时间表用于递送治疗有效量的本发明的化合物。为了本发明的目的，此处公开的关于化合物的“有效量”或“治疗有效量”的术语指对达到预期目的有效的而优选没有不希望的副作用(如毒性、刺激或过敏反应)的化合物的量。尽管个别患者的需要可能改变，但是药物组合物有效量最佳范围的确定在本领域技术人员已知范围内。从动物研究可以推知出人类剂量(A.S.Katocs，Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第19版，A.R.Gennaro编辑，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，(1995)，Chapter 30；其通过引用并入本文)。一般来说，提供治疗有效量的药物组合物所需要的剂量(其可以被本领域技术人员调整)将根据接受者的年龄、健康、身体状况、体重、疾病或障碍的类型和程度、治疗频率、共同治疗的性质以及预期效果的性质和范围进行变化。

在本发明的一些实施方式中，给药时间表(也称为治疗方案)可以包括在至少两天、至少三天、至少四天或更多天内施用有效量的此处描述的组合物。例如，对于四天的剂量时间表(其中第0天(零)是初始剂量日)，可以在连续的几日内、或者在非连续的几日内、或者组合这两种方式施用药物。在一些实施例中，给药时间表可以包括在第0和第1天、第0和第2天、第0和第3天、第0和第4天、第0、第1和第2天、第0、第1和第3天、第0、第1和第4天、第0、第2和第3天、第0、第2和第3天、第0、第2和第4天、第0、第3和第4天施用，等等。

在另一实施方式中，给药时间表可以是有效地持续的，例如以通过皮肤贴片或植入片施用的缓释剂型。

在本发明的一些实施方式中，提供包括纯化HspE7、免疫刺激剂及使用说明的试剂盒。免疫刺激剂可以包括包含CpG的寡核苷酸、TLR3激动剂(如PolyI：C或PolyICLC)、单磷酰脂质A(MPL)、MPL-海藻糖6，6’-二霉菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40，包括但不限于具有任何核苷、核苷间连接和此处描述的组成的PolyIC核酸。试剂盒可以提供预先包装在一次性使用装置(例如贴片、植入片或注射器)中的纯化HspE7和免疫刺激剂的单剂量制剂。或者，试剂盒可以提供多剂量制剂，其可以在药房或者在施用的地点被医师或其它适当的人分成单剂量单位。

本发明利用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、液相肽合成法、固相肽合成法和免疫学的常规技术。这些过程在例如以下文献(其通过引用并入本文)中被描述：

1.Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第二版(1989)，全I，II和III卷；

2.Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(M.J.Gait编辑，1984)IRL Press，Oxford，包括Gait，pp.1-22；Atkinson等人，pp.35-81；Sproat等人，pp.83-115；和Wu等人，pp.135-151；

3.Animal Cell Culture：Practical Approach，第三版(John R.W.Masters编辑，2000)，ISBN 0199637970；

4.Immobilized Cells and Enzymes：A Practical Approach(1986)IRL Press，Oxford，全文；

5.J.F.Ramalho Ortigao，＂The Chemistry of Peptide Synthesis＂In：Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactive，Germany)；

6.Barany，G.和Merrifield，R.B.(1979)in The Peptides(Gross，E.和Meienhofer，J.编辑)，vol.2，pp.1-284，Academic Press，New York；

7.Bodanszky，M.(1984)Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.& Bodanszky，A.(1984)The Practiceof Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；

8.Handbook of Experimental Immunology，VoIs.1-IV，D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986，Blackwell Scientific Publications.

本发明将在以下实施例中进一步说明。

实施例

实施例1：HspE7制备

按照WO99/07860(其通过引用并入本文)中描述的得到Hsp65-E7融合物(HspE7)。HspE7为包括插入在Hsp65基因(pET65H)的羧基端末端的完整HPV16E7-编码区的融合蛋白。该HspE7称作方法AHspE7，并且可以按照需要从Nventa Biopharmaceuticals Corporation得到。

在使用前，将HspE7纯化至高于95％的纯度。表达HspE7的大肠杆菌的种子培养物用于接种250L发酵培养基。在发酵过程中，加入酵母提取液和葡萄糖作为养料，并向发酵容器中发散纯氧以提供充分的换气。通过加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导HspE7的表达。然后将发酵器的内容物冷却至低于20并通过离心收集细胞浆(cell paste)。将细胞浆重悬于含有尿素和亚硫酸盐解试剂的缓冲液中。亚硫酸盐解试剂将HspE7中的巯基转化成S-磺酰半胱氨酸。通过用PEI(聚乙烯亚胺)沉淀使HspE7溶液变得澄清，随后在其pI处使产物沉淀。然后采用一系列阳离子和阴离子交换层析步骤将HspE7纯化至均质，并用DTT(二硫苏糖醇)还原修饰的巯基。最后，HspE7进行超滤和透滤以进入组氨酸/甘露醇缓冲液中并在-70贮存。将HspE7的纯化形式称为方法L HspE7。通过凝胶电泳法确定HspE7的纯度。

如下所述，与低纯度的(方法A HspE7)产品相比，高度纯化的方法L HspE7观察到生物活性的损失。如WO99/07860中所公开的，低纯度的HspE7产品(方法A HspE7)表现出生物活性。

实施例2：HspE7制剂的生物活性的测定

脾细胞产生IFN-γ的抗原特异性刺激：ELISPOT分析

在E7肽存在的情况下通过ELISPOT(Asai，T.等人，2000，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7(2)：145-154)如下测定HspE7诱导E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞(IFN-γ产生细胞)的能力的增强：在颈背处皮下用HspE7(加入或不加入佐剂)以200μl的总体积对小鼠进行免疫。五至七天后将小鼠处死，取它们的脾脏并处理成单细胞悬液。将细胞接种在预先用抗小鼠IFN-γ抗体包被的微孔滤板上的完全RPMI中。将微孔滤板在37孵育20小时。洗掉细胞，并通过用生物素化二抗小鼠IFN-γ抗体孵育微孔滤板来检测IFN-γ斑点。用Vectastain ABC Elite试剂盒和AEC底物使斑点可见。利用Zeiss Automated ELISPOT计数器计算斑点。

肿瘤退化分析

采用包括肿瘤细胞系TC-1.K(一种用HPV16E6和E7肿瘤基因稳定转染的肺上皮细胞瘤)分析测定肿瘤退化。将TC-1.K细胞植入到小鼠体内，7天后施用测试样品，随后定期进行肿瘤触诊。基本上如ChuN.R.等人(Chu N.R.等人，2000，Clin Exp Immunol 121(2)：216-225)所描述的，分析包括接种用于培养的TC-1.K肿瘤细胞并在植入到7-14周龄的C57BL/6小鼠之前扩增细胞数目。肿瘤植入后7天，用测试和对照样品处理荷瘤小鼠。通常180只小鼠的组分成6个等分组，并且各组被注射对照样品(只具有溶剂)、或者50、100、200、400或800μg的HspE7参比样品。在14、28和49天触诊小鼠肿瘤。

如图1所示，方法A HspE7的抗肿瘤活性大于方法L HspE7的抗肿瘤活性，与类似剂量的方法L HspE7相比，方法A HspE7以较低的剂量达到相同或更低的肿瘤发病率。对于这个分析，给携带已建立的TC-1肿瘤的小鼠颈背部皮下注射由方法A或方法L制备的梯度剂量的HspE7(n＝30/组/剂量)，之后肿瘤生长49天。

实施例3：TLR9激动剂CpG对HspE7的影响

在CpG寡核苷酸(TLR9激动剂)存在的情况下测定HspE7诱导E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞能力的增强。用由两种不同的纯化方法制备的单独的HspE7(400μg方法A HspE7或400μg方法L HspE7)或HspE7(400μg方法A HspE7或400μg方法L HspE7)加30μg的CpG(TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT；SEQ ID NO：1；从Invitrogen获得，包括硫代磷酸酯骨架并指明为：ZOO FZE FOE ZZO OZE FZE OT)如实施例2中所述的对幼稚C57B1/6小鼠进行皮下注射。五天后，从小鼠摘取脾脏，并采用E7特异性I类MHC结合肽E7_49-57(RAHYNIVTF；Dalton Chemical Laboratories)或对照肽HBCAg_93-100(MGLKFRQL；Dalton Chemical Laboratories)作为回忆抗原通过ELISPOT测量E7特异性脾细胞的数目。

图2中示出的结果说明纯化的HspE7(方法L HspE7)表现出最小的诱导E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的作用。方法A HspE7表现出较大的E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞诱导作用。然而，在TLR9激动剂CpG存在的情况下(方法A HspE7+CpG或方法L HspE7+CpG)，方法L HspE7和方法A HspE7的诱导作用均被提高了3至100倍。

具有最佳鼠类B类型式核心序列(GACGTT)的几种包含CpG的寡核苷酸(包括1668)在ELISPOT分析和TC-1肿瘤退化分析中显示出在HspE7活性增强方面是高度活性的(数据未示出)。同样也发现CpG C类型式寡核苷酸(2395)是高度活性的。但是发现A类型式包含CpG的寡核苷酸在ELISPOT测定中增强HspE7活性的效应要低得多(见Vollmer J.等人.2004Eur.J.Immunol.34：251-262)。

这些数据证明纯化的HspE7是具有生物活性的，并且通过加入免疫刺激剂CpG可以提高HspE7(方法A或方法L HspE7)的生物活性。

实施例4：另外的TLR激动剂对HspE7的影响

采用TLR3激动剂PolyI：C(Sigma Cat #P1913)、TLR2激动剂PAM3Cys SK4(Invivogen Cat# TLR1-pms)和TLR9激动剂CpG(见实施例3)测定替代的TLR激动剂增强HspE7(方法L HspE7)诱导E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的能力。

用HspE7加TLR激动剂的混合物对小鼠进行皮下共注射。对于这个试验，将50μg方法L HspE7与10μg的CpG、20μg的Pam3CysSK4或100μg的PolyI：C一起共注射。五天后，从小鼠摘取脾脏，并采用E7特异性I类MHC结合肽E7_49-57或对照肽HBCAg_93-100作为回忆抗原通过E LISPOT(如实施例3中描述的)测量E7特异性脾细胞的数目。结果示于图3中。

如在图3中可以看到的，HspE7与CpG的共注射引起E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的显著增加。TLR3激动剂PolyI：C的共注射也观察到相似的增加。但是，TLR2激动剂Pam3CysSK4只引起IFNγ产生细胞微不足道的增加。

这些结果说明CpG和PolyI：C对增强纯化HspE7(方法L HspE7)的生物活性是有效的，而Pam3CysSK4是无效的，并且不是所有的佐剂对增强纯化HspE7的生物活性均有效。另外的试验(图4和5)证明，将纯化HspE7与PolyICLC(Oncovir，3203Cleveland Ave NW，Washington DC)或与MPL-海藻糖6，6’-二霉菌酸酯(MPL-TDM；得自Ribi ImminoChem Research Inc.；也参见Oiso R.等人，Microb Pathog.2005 JuI-Aug；39(1-2)：35-43)混合也有效地增强纯化HspE7(即高于95％纯度)的免疫活性。在图5中，显示HspE7的免疫活性的增强可以在免疫刺激剂的1000倍量的范围内检测到，0.1μg的PolyICLC至100μg的PolyICLC观察到活性增强。

实施例5：HspE7的抗肿瘤活性

采用实施例3中所述的方法检测纯化的HspE7制剂对抗肿瘤活性的影响。数据显示与单独的纯化HspE7(方法L HspE7)相比，将纯化HspE7与CpG或PolyI：C结合明显提高了抗肿瘤效力。

用6 x 10⁴TC-1肿瘤细胞在肋部对小鼠进行注射。在第7天，用稀释的单独纯化HspE7(按照实施例1制备；方法L)、低于95％纯度的HspE7(图6)或者与不同剂量的CpG(n＝30/组)或PolyI：C(n＝20/组；图7)混合的梯度剂量的纯化HspE7在颈背部对携带已建立的TC-1肿瘤的小鼠进行皮下注射。让小鼠肿瘤生长另外的42天。肿瘤植入后49天不具有肿瘤的小鼠被认为是无肿瘤的。只注射稀释液的小鼠百分之百在第49天具有肿瘤。先前的研究证明单独的CpG或单独的PolyI：C对肿瘤生长没有影响(数据未示出)。

HspE7与CpG共施用的结果示于图6中，HspE7与PolyI：C共施用的结果示于图7中。

参照图6，施用低于95％纯度的HspE7在50至800μg剂量范围内(HspE7和平均HspE7历史数据)降低了肿瘤活性，在高剂量(800μg)的HspE7下观察到大约15％的肿瘤发病率(“历史数据”)。然而，纯化HspE7与CpG共注射引起肿瘤发病率的急剧下降，大约25至大约200μg的HspE7产生低于5％的肿瘤发病率。如历史数据所预示的，用400μg方法B HspE7处理的小鼠大约27％在第49天具有肿瘤。但是，90％的用混合有3μg CpG的低至25μg的方法L HspE7注射的小鼠具有完全的肿瘤清除。

参照图7，可以看出在最高至800μg(HspE7)的剂量范围内，施用纯化HspE7(高于95％纯度；方法L HspE7)在降低肿瘤活性方面不如95％纯度的HspE7有效，在高剂量(800μg)的HspE7下观察到大约50％的肿瘤发病率。然而，纯化HspE7与100μg的PolyI：C共注射引起肿瘤发病率的急剧下降，大约200μg的HspE7导致低于5％的肿瘤发病率。

这些数据证明，当与TLR9激动剂(如CpG)或TLR3激动剂PolyI：C一起施用时，纯化HspE7表现出增加大约5至大约80倍的抗肿瘤活性。

实施例6：传统佐剂对HspE7活性的影响

测定了如明矾、弗氏不完全佐剂(IFA)的传统佐剂增强纯化HspE7对E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的诱导的能力。

用纯化HspE7(400μg方法L HspE7；方法L)对小鼠进行皮下注射，或用纯化HspE7(400μg)与30μg CpG(与明矾(Pierce)以1:1混合、或与IFA(Bacto)以1:1混合)一起、或与明矾+30μg CpG一起、或与IFA+30μg CpG一起对小鼠进行皮下共注射。五天后，从小鼠摘取脾脏，并采用E7特异性I类MHC结合肽E7(49-57)(16.E7.49-57.Db)或对照肽HBCAg(93-100)作为回忆抗原通过ELISPOT测量E7特异性脾细胞的数目。结果示于图8中。

与实施例3和4中给出的结果一致，注射单独的纯化HspE7(方法L HspE7)没有增强脾细胞生成IFN-γ的作用，但是HspE7和CpG(方法L HspE7+CpG)的共注射引起E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的明显(超过10倍)增加(图8)。然而，纯化HspE7与IFA(方法L HspE7+I FA)或与明矾(方法L HspE7+明矾)的共注射没有引起E7-特异性T淋巴细胞刺激的任何可观察到的增强，与单独施用纯化HspE7的效果相似。

与CpG和HspE7(方法L HspE7+CpG)的共注射所观察到的增强相似，纯化HspE7与CpG及明矾(方法L HspE7+明矾+CpG)或IFA(方法L HspE7+IFA+CpG)的共注射引起E7-特异性T淋巴细胞刺激的增强。这个数据说明，由于不管明矾或IFA是否存在，CpG对增强HspE7的活性都具有相似的作用，所以IFA和明矾是中性的，既不抑制也不刺激HspE7。

这些数据说明通过将纯化HspE7与公知佐剂明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)中的任一个混合没有增强E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的诱导。这些结果进一步证明不是所有的佐剂(包括明矾和弗氏不完全佐剂)对增强纯化HspE7的生物活性都是有效的。

实施例7：另外的TLR激动剂对HspE7活性的影响

在这个实施例中，测定了咪喹莫特、LPS、Pam3CysSK4或抗CD40增强纯化HspE7对E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的诱导的作用。

用纯化HspE7(400μg方法L HspE7；方法L)的混合物或者纯化HspE7(400μg)与100μg咪喹莫特(Invivogen # TLRL-IMQ)、30ug LPS(Sigma)、25ug Pam3CysSK4(Invivogen Cat# TLR1-pms)、25ug抗-CD40(R&D Systems；克隆号1C10)或30ug CpG一起对小鼠进行皮下注射。五天后，从小鼠摘取脾脏，并采用E7特异性I类MHC结合肽E7_49-57通过ELISPOT测量E7特异性脾细胞的数目。结果示于图9中。

纯化HspE7与咪喹莫特(TLR7激动剂)、PAM3CysSK4(TLR2激动剂)或LPS(TLR4激动剂)共同施用只微弱地增强了纯化HspE7诱导E7-特异性T淋巴细胞的能力(图9)。但是，通过将抗-CD40或CpG加入到HspE7中观察到对E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞生成的刺激。

这些结果进一步证明不是所有的TLR激动剂对增加E7-特异性CD8阳性T淋巴细胞的产生都是有效的，因为通过将咪喹莫特(TLR7激动剂)、PAM3CysSK4(TLR2激动剂)和LPS(TLR4激动剂)加入到HspE7中只观察到IFN-γ分泌细胞数目不大的增加。

实施例8：日注射方案

HspE7和PolyICLC被用于评价日注射方案在小鼠中引起CD8+T细胞应答的效用。C57B1/6小鼠(每组两只)按每日间隔用HspE7(100μg)和Poly ICLC(10μg)进行免疫，每天一次，最多进行4天。在第一次抗原刺激后7天，将所有动物无痛致死并取脾细胞进行分析。在用16E7.49-57.Db肽刺激下使用IFN-γELISPOT评价I类限制性CD8+T细胞应答。

与只接受单次注射的组相比，接受多次HspE7+polyICLC注射的组表现出应答频率可测量的增加。

增加日注射的次数与应答频率的增加相关。接受最大数目日注射的组表现出应答频率的最大增加(图10)。

日注射策略的使用应提供在采用polyICLC与其它CoValTM抗原结合或与非CoVal^TM抗原结合引起CD8+T-细胞应答增强的方面的效用。另外，这一策略可以产生较大的CD8+记忆池(memory pool)，所述记忆池在按每周或每两周间隔再次激发时可以具有更高的增强随后的免疫应答的能力。

实施例9：对HspE7+poly-ICLC免疫的体液应答

已经证明poly-ICLC增强对抗原的细胞和体液免疫应答。为了研究HspE7+poly-ICLC联合免疫对体液免疫的影响，C57B1/6雌性小鼠(n＝5/组)按月间隔免疫两次(第1、28天)。小鼠的各组用缓冲液、500μg HspE7、12.5μg Poly-ICLC、500μg HspE7+1.25μg Poly-ICLC、500μg HspE7+12.5μg Poly-ICLC或500μg HspE7+125μg Poly-ICLC进行免疫。在给药之前7天(d-7，基线)和在第21、49和77天采取血样进行血清抗体分析。通过标准ELISA检测取自小鼠个体的血清中抗E7和HspE7的抗体(IgG1、IgG2b和IgG2c)的存在。简单地说，用E7或HspE7包被96孔板过夜，洗涤并用1.5％BSA溶液封闭。以血清在BSA溶液中的1:50的稀释开始将血清以2倍的系列稀释加入到单个孔中。洗涤后，通过与生物素偶联的抗适当免疫球蛋白同种型的抗体一起孵育来检测结合的抗HspE7(图11B、D、F)或E7(图11A、C、E)的IgG1(图11A、B)、IgG2b(图11C、D)或IgG2c(图11E、F)抗体。然后洗涤板并与抗生蛋白链菌素偶联的辣根过氧化物酶一起孵育。使用四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色，并用自动ELISA读板仪在450nm处读取有色产物。图11中的数据表示为给出高于分析板背景(确定为0.2OD单位)的吸光度的血清最高稀释度。

用单独的HspE7进行免疫对HspE7和E7均产生明显的抗体应答，其中单次注射后抗HspE7应答显著，而单次注射后抗E7应答较弱而在两次免疫后发展得更充分。在两种情况中，产生的抗体同种型主要是IgG1(图11A、B)，表明为Th2转换的体液应答。用单独的Poly-ICLC免疫未产生对E7或HspE7的抗体应答。用HspE7+poly-ICLC免疫导致更强和更快地形成抗体应答。这在E7的情况中是最显著的，其中当poly-ICLC与HspE7联合免疫时，单次注射后免疫应答是显著的。此外，存在明显更强的Th1体液应答，从而引起更大比例的IgG2b和IgG2c(图11C-F)抗体同种型的产生。由于这种应答在较高剂量的polyICLC时更显著，所以它是剂量依赖的。当HspE7和poly-ICLC共注射时免疫应答的Th1转换的增加与通过ELISPOT观察到的IFNγ生成CD8阳性T淋巴细胞数目的增加一致。

实施例10：HspE7与polyICLC的剂量范围

研究了当TLR3激动剂与HspE7共同给予时，其能够促进E7特异性CD8T细胞的交叉激发(cross-priming)的剂量范围。如图12中所示，我们观察到，如通过IFN-γELISPOT所测得的，用HspE7加TLR3激动剂polyICLC对小鼠进行免疫在诱导E7_49-57特异性T细胞方面高度有效。诱导的E7_49-57特异性细胞的数目依赖于所使用的polyICLC佐剂的剂量，但是甚至非常低的剂量(0.1μg polyICLC)也能够增强HspE7的交叉激发。

实施例11：连续日剂量的HspE7加polyICLC引起的大的、已建立的肿瘤的退化

表达E7的TC-1肿瘤细胞系为广泛用于评价E7指引的疫苗接种方案的侵袭性、快速生长的肿瘤模型。通常，向小鼠植入TC-1肿瘤细胞系的10⁵至10⁶个细胞，并在7至14天后用试验物质进行处理，此时肿瘤是可触及的。在该肿瘤模型中，存在治疗窗，在这个时间后由于肿瘤生长得如此快，以至于抗原特异性T细胞的克隆扩增不能在肿瘤负荷占据优势之前战胜肿瘤，因此免疫干预不再有用。

用于这些试验中的TC-1肿瘤模型体系允许形成更加进展的肿瘤。如图13中所示，在处理前TC-1肿瘤允许在体内生长28天，而不是通常的7至14天。尽管在这个时间点存在大范围的平均肿瘤大小，但是所有的动物具有可触及的肿瘤，并且一些动物具有超过2000mm³体积的肿瘤。显著地是，随后接受4个连续的HspE7加PolyICLC日免疫的小鼠通常在开始该4个连续日剂量免疫方案的一周内开始使这些非常大的、已建立的肿瘤退化。在处理期中每天测量肿瘤体积，在这之后每2至3天测量肿瘤体积。肿瘤使用电子数字卡尺(FowlerSylvac Ultra-Cal Mark III)测量并以宽²×长×0.5计算。在多数(9只中的7只)小鼠中肿瘤在处理后继续退化17天。在再度出现肿瘤的小鼠中，只表示逃逸变体(escape variant)，不再表达E7_49-57表位(数据未示出)。接受4个连续日剂量的仅缓冲液、仅HspE7蛋白或仅polyICLC佐剂的小鼠没有表现出这些大肿瘤的退化。

实施例12：CD8应答的扩增期(expansion phase)中重复免疫的加强效应

当小鼠使用HspE7加polyICLC免疫连续1天、2天、3天或4天时，在各相继的日免疫之后诱导的E7_49-57特异性T细胞的水平经历急剧的增加(图15A)。在用100μg HspE7加10μg polyICLC进行4次连续日免疫后，响应E7_49-57刺激的离体的直接产生IFN-γ的细胞数目接近每10⁶个脾细胞10000个。事实上为了准确的IFN-γELISPOT定量，来自免疫动物的脾细胞必须用来自幼稚动物的脾细胞按1:16稀释，以使斑点降低至自动ELISPOT读取分析仪“可计数的”数目。这是在接受单剂量HspE7加polyICLC的动物中观察到的抗原特异性细胞数目的大约10倍。更令人惊奇的是，这些非常高数目的抗原特异性细胞在最后免疫的3天内达到(所有小鼠组在第一次免疫后7天进行分析)。4次连续免疫不只是表示小鼠接受的抗原数量的累加性的增加，因为给予存在于单次免疫中的包含4倍量的抗原/佐剂的单次免疫小鼠具有E7_49-57特异性T细胞数目的增加，但远低于在接受4次连续免疫的小鼠中所观察到的E7_49-57特异性T细胞的数目(图15A)。E7_49-57特异性T细胞也可以使用H-2Db/E7_49-57五聚体试剂通过流式细胞仪方便地检测(图15B)。在用HspE7加polyICLC进行4次连续日免疫后，一些动物中的E7_49-57特异性T细胞的数目高达CD8⁺脾细胞的总数的2.9％。采用MHC I类五聚体试剂进行E7特异性T细胞的流式细胞定量与ELISPOT相比有一些低估了抗原特异性细胞的数目，但是，这很可能是抗原特异性T细胞上的表面TCR的下调的反映，特别是由于流式细胞分析是在4次连续免疫的最后一次免疫后仅3天进行的。事实上，图15B中示出的流式细胞数据的更严格的检查证实，与幼稚小鼠相比在接受4次连续日免疫的小鼠中存在更高数目的H-2Db/E7_49-57五聚体阴性的CD8⁺细胞，但是它们表达CD44激活标志。这些具有激活表型的CD8⁺细胞很可能对应于由于其体内激活状态而下调其表面TCR的抗原特异性细胞。此外，我们也分析了免疫应答的缩减期(contraction phase)以评价是否连续多天的免疫对随后的免疫应答的持续时间具有明显影响。如图15C中所示，虽然在免疫后第7天观察到的峰免疫应答存在很大的不同，但是不管第1天至第4天进行的连续免疫的次数，所有小鼠免疫后第13天E7特异性CD8⁺细胞数目均发生明显缩减。然而，应该注意，E7特异性CD8⁺细胞在免疫后第13天仍可通过ELISPOT轻易检测到，并且更重要的是，在初级应答的峰值时较高的抗原特异性T细胞数目与第13天观察到的残存E7特异性CD8⁺细胞的数目相关。

研究了在应答的扩增期内给予两次注射但在第一次和第二次注射间具有不同时间间隔的方式对于增强随后的初级CD8T细胞应答的效果。在试验过程中以不同的间隔收集脾脏以研究随后的应答的动力学。给予HspE7加polyICLC单次注射的小鼠建立的应答在免疫后5天很容易检测到且随后在免疫后第7天达到峰值(图14A)。这种应答到第9天下降，并到第11天基本上减小至较低(但稳定)且易于检测到的水平。与此相反，在第0天给予HspE7加polyICLC的初次免疫然后在第2天给予第二次的相同免疫的小鼠建立的应答远强于在接受单次免疫的小鼠中引起的应答。如同在接受单次免疫的小鼠中观察到的，CD8T细胞应答在第7天最高，但抗原特异性细胞的总体数量达到明显更高的水平。而且，尽管抗原特异性细胞的数目到第9天下降，但是此时存在的抗原特异性细胞的总数目仍明显高于在接受单次免疫的小鼠中观察到的数目。当第二次免疫延迟至初次免疫后第4天时，效果甚至更加显著。在这种情况中，抗原特异性T细胞的数量继续增加到第7天并直到第9天才达到最大值，此时抗原特异性细胞的频率是单次免疫后观察到的最大数目的大约4倍。

可观察到，单剂量的HspE7加polyICLC之后接着3个连续剂量的单独polyICLC与接受单剂量HspE7加polyICLC的小鼠相比，没有引起E7特异性CD8⁺细胞数目的明显增加(图14B)。这个结果表明在接受连续日免疫的小鼠中引起的E7特异性CD8⁺细胞的急剧扩增不只是佐剂连续存在的间接结果，而是依赖于特异性抗原的存在。

所有的引文特此通过引用并入本申请。

本发明通过一个或多个实施方式进行说明。然而，对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离如权利要求书所限定的本发明的范围的情况下可以对本发明进行许多变化和改进。

Claims (19)

1、一种提高纯化的HspE7的生物活性的方法，包括与选自包含CpG的寡核苷酸、TLR3激动剂、单磷酰脂质A(MPL)、MPL-海藻糖6，6’-二霉菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激剂一起施用HspE7。

2、按照权利要求1所述的方法，其中所述免疫刺激剂以大约0.1μg至大约20mg/ml的量存在。

3、按照权利要求1所述的方法，其中所述纯化的HspE7使用1％PAGE测定的HspE7纯度为大约95％至大约99.99％。

4、按照权利要求1所述的方法，其中所述免疫刺激剂是TLR3激动剂。

5、按照权利要求4所述的方法，其中所述TLR3激动剂是PolyICLC或PolyI：C。

6、一种包含纯化的HspE7和选自包含CpG的寡核苷酸、TLR3激动剂、单磷酰脂质A(MPL)、MPL-海藻糖6，6’-二霉菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激剂的组合物。

7、按照权利要求6所述的组合物，其中所述免疫刺激剂以大约0.1μg至大约20mg/ml的量存在。

8、按照权利要求6所述的组合物，其中所述纯化的HspE7使用1％PAGE测定的HspE7纯度为大约95％至大约99.99％。

9、按照权利要求6所述的组合物，其中所述免疫刺激剂是TLR3激动剂。

10、按照权利要求9所述的组合物，其中所述TLR3激动剂是PolyICLC或PolyI：C。

11、一种减低对象中肿瘤或病毒的发展的方法，包括向需要的对象施用权利要求6的组合物。

12、一种包括纯化的HspE7和选自包含CpG的寡核苷酸、TLR3激动剂、单磷酰脂质A(MPL)、MPL-海藻糖6，6’-二霉菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激剂及使用说明的试剂盒。

13、按照权利要求11所述的试剂盒，其中所述免疫刺激剂以大约0.1μg至大约20mg/ml的量存在，且所述纯化的HspE7使用1％PAGE测定的HspE7纯度为大约95％至大约99.99％。

14、按照权利要求11所述的试剂盒，其中所述免疫刺激剂是TLR3激动剂。

15、按照权利要求11所述的试剂盒，其中所述TLR3激动剂是PolyICLC或PolyI：C。

16、权利要求6的组合物用于在需要的对象中预防或治疗癌症的用途。

17、权利要求6的组合物用于在需要的对象中减低肿瘤或病毒的发展的用途。

18、按照权利要求11所述的方法，其中所述组合物按照包括至少两个剂量的给药时间表施用。

19、一种在对象中预防肿瘤或病毒的发展的方法，包括向需要的对象施用权利要求6的组合物。

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