KR20090021295A

KR20090021295A - 생물활성 정제된 ＨｓｐＥ7 조성물

Info

Publication number: KR20090021295A
Application number: KR1020087031841A
Authority: KR
Inventors: 게리 로우즈; 존 웹; 마빈 시겔; 피터 엠타쥐
Original assignee: 엔벤타 바이오파마슈티칼스 코퍼레이션
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-30
Publication date: 2009-03-02
Also published as: CA2653474A1; RU2008151516A; EP2032165A1; AU2007266235A1; MX2008015293A; CN101489588A; WO2007137427A1; BRPI0712729A2; ZA200810740B; US20110142873A1; EP2032165A4; JP2009538836A

Abstract

정제된 Hsp65-E7 융합 단백질(HspE7)의 생물학적 활성을 증가시키는 방법이 제공된다. 본 방법은 CpG, TLR3 아고니스트, 예를 들어 PolyLC, PolyICLC, 모노-포스포릴-리피드 A(MPL), MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM), 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제와 함께 HspE7을 혼합하는 것을 포함하며, 또한 이 조성물을 사용함으로써 필요로 하는 포유동물 또는 대상자에서 종양 또는 바이러스 발생을 감소시키는 방법이 제공된다.

Hsp65, HPV E7, HspE7, 면역화, 보조제

Description

생물활성 정제된 ＨｓｐＥ7 조성물{BIOACTIVE PURIFIED HSPE7 COMPOSITIONS}

본 발명은 면역학 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HspE7을 포함하는 조성물 및 그것의 사용 방법을 제공한다.

백신접종 및 면역요법 전략은 복잡하게 구성된 일련의 세포 상호작용의 조작과 관련된다. 세포 상호작용은 면역 감시를 포함하는데, 이에 의해서 보편적인 항원 제시 세포(APC)와 특정한 수지상 세포(DC)가 만나서 항원을 포착하고, 항원으로부터 펩티드 에피토프를 생성한 후, 이 에피토프를 주 조직적합 복합체(MHC)에 의해 암호화되는 분자들의 인식 부위에 내려놓는다. DC 표면으로의 이출 후, 에피토프-보유 MHC 분자가 T 세포에 에피토프-MHC 복합체를 제시하여 T 세포를 활성화시킨다. 활성화된 CD4+ T 헬퍼(Th) 세포가 다른 DC로 케모카인 및 사이토카인 신호를 송달하고, 이들에 의해 나이브(naive) CD8+ T 세포가 활성화되고, 이들 세포는 항원-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)로 형질전환된다. 활성화된 T-헬퍼 세포는 또한 B 세포와 상호작용하여 이들에게 분자 신호를 제공함으로써, 분화, 클론 확장, 및 적응 면역의 체액 반응 개시시에 분비되는 항체 이소타입의 정의를 제어한다.

백신접종 및 면역요법은 어떤 감염성 질환이나 암과 같은 장애의 예방 또는 치료를 위한 매력적인 접근법이다. 그러나, 이러한 치료의 성공은 종종 면역치료 과정에 고유한 몇몇 단점들에 의해, 예를 들어 선택된 세포독성 T 림프구(CTL) 에피토프의 불량한 면역원성에 의해 제한된다. 면역반응을 증가시키기 위한 표준 방법은 면역원과는 별도로 보조제(adjuvant)를 사용하는 것인데, 이것은 전형적으로 사용 전에 면역원과 혼합된다. 명반 및 불완전 프레운드 보조제(IFA; incomplete Freund's adjuvant)가 보조제로서 잘 알려진 예들이다. 또한, 어떤 미생물에 의한 천연 산물이 보조제로서 유용한 것으로 밝혀졌다. 일반적인 예로서 그람 음성 박테리아로부터의 지질다당질, 및 그람 음성 및 그람 양성 박테리아로부터의 뮤레인 또는 펩티도글리칸(PG)이라고도 하는 박테리아 세포벽 글리코펩티드가 있다.

미생물 보조제는 포유동물 세포의 패턴 인식 수용체(PRR)를 활성화시킴으로써 전-염증 효과를 발휘할 것으로 생각된다. Toll-형 수용체(TLR)라고 알려진 포유동물 표면 수용체는 PRR 시스템에서 중요한 수용체 부류 중 하나이다. TLR의 활성화는 세포내 신호화 연속단계를 촉발하여 전사인자 NFκB 및 AP1을 유도하며, 이것은 이어서 케모카인 및 어떤 사이토카인과 같은 전-염증 매개인자를 암호화하는 유전자의 발현을 자극한다. 지금까지 인간에게서 11개의 상이한 TLR이 확인되었으며, 각 TLR은 특유의 미생물 화합물 하위집단을 인식할 수 있는 능력을 가진다.

예들 들어, LPS는 TLR4에 대한 리간드이고, 펩티도글리칸은 TLR2에 대한 리간드이다. 또한, TLR들은 특유의 리간드 특이성을 갖는 헤테로다이머를 형성할 수 있다. 예를 들어, 미코플라스마로부터의 대식세포-활성화 리포펩티드 2(MALP-2)는 TLR2/TLR6 헤테로다이머에 대한 리간드이고, 박테리아 리포펩티드 Pam3Cys-Ser-Lys (4)는 TLR1/TLR2 헤테로다이머에 대한 리간드이다.

인간 유두종바이러스(HPV)의 E7 단백질은 작은(대략 10,000Mw) 발암성 Zn-결합 인단백질인데, 발암성은 아마도 망막모세포종 유전자 산물인 Rb(전사인자 E2F와 결합하여 그것을 불활성화시키는 종양 억제인자)와 결합하는 능력 때문인 것 같다. 전사인자 E2F는 티미딘 키나제, c-myc, 디히드로폴레이트 환원효소 및 DNA 중합효소 알파를 암호화하는 것들을 포함하여 다수의 성장-관련 유전자의 전사를 제어한다. Rb-E2F 복합체 형성은 G0 및 G1 기에서 후기 유전자의 발현을 방해하며, 이들의 발현은 Rb-E2F 복합체가 해리되어 활성 전사인자 E2F가 유리되도록 프로그램된 S 기에만 제한된다. 따라서, E7은 이것이 바이러스 라이프사이클 전체에서 발현될 뿐더러, 실제로 HPV 감염에 의해 야기된 후기 자궁경부암종에서 발현되는 오직 2개의 바이러스 단백질 중 하나이기 때문에, 유두종바이러스 감염에 있어서 면역학적 개입을 위한 매력적인 표적이 된다.

보조제와 HPV16 단백질의 동시-투여가 보고되었다. 예를 들어, Freyschmidt 등(Freyschmidt E-J., et al., 2004, Antiviral Ther. 9:479-489)은 지질다당질 (LPS), 메틸화되지 않은 CpG 및 소르비톨이 수지상 세포의 HPV16 L1-E7 융합 입자-유도 자극을 증진시켰음을 증명한다. Kim 등(Kim T-Y., et al., 2002, Cancer Res. 62:7234-7240)은 HPV E7과 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN) 1826의 동시-송달이 HPV16에 대한 보호 면역을 증가시킨다는 것을 교시한다. 또한, Chen 등(Chen Y-F., et al., 2004, J. Virol. 78:1333-1343)은 CpG ODN 1826 또는 프레운드 보조제와 동시-투여된 HPV E5에 의한 E5-함유 종양 성장의 제거를 보고하였다.

WO 99/07860는 HPV 감염에서 항-E7 면역반응을 도출하기 위한 백신 제제로서 유용한 재조합 Hsp65-E7 융합 단백질(HspE7)의 제조를 개시한다. 설명된 HspE7 융합 단백질은 E. coli에서 발현되며, E7-특이적 CD8 면역반응을 도출하는 능력에 있어서 생물학적으로 활성이다.

발명의 개요

본 발명은 HspE7을 포함하는 조성물 및 그것의 사용 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 정제된 Hsp65-HPV E7 융합체(HspE7)를 포함하는 조성물 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명의 목적은 개선된 HspE7 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라서, 정제된 HspE7의 생물학적 활성을 증가시키는 방법이 제공되며, 이것은 HspE7을 CpG, TLR3 아고니스트, 모노-포스포릴-리피드 A(MPL), MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM), 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제와 함께 혼합하는 것을 포함한다. 바람직하게, 면역자극제는 1회분 용량(dose) 당 약 1ug 내지 약 5000ug의 양으로 HspE7과 동시-투여된다. 본 발명의 어떤 양태에서, 면역자극제는 PolyI:C, 또는 폴리-리신, 폴리-아르기닌 또는 대부분의 양이온계 아미노산을 포함하는 양이온계 펩티드와 같은 양이온계 폴리머와 복합체화된 PolyI:C이다. 본 발명의 다른 양태에서, 면역자극제는 PolyICLC이다. 또한, 정제된 HspE7은 겔 전기영동, HPLC, 또는 두 가지 모두를 사용하여 측정했을 때 약 95% 내지 약 99.99%의 순도를 가진다.

또한, 본 발명은 정제된 HspE7, 및 CpG, TLR3 아고니스트, MPL, MPL-TDM 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제를 포함하는 조성물에 관련된다. 바람직하게, 면역자극제는 1회분 용량 당 약 1ug 내지 약 5000ug의 양으로 존재한다. 본 발명의 어떤 양태에서, 면역자극제는 PolyI:C, 또는 폴리-리신, 폴리-아르기닌 또는 대부분의 양이온계 아미노산을 포함하는 양이온계 펩티드와 같은 양이온계 폴리머와 복합체화된 PolyI:C이다. 본 발명의 다른 양태에서, 면역자극제는 PolyICLC이다. 또한, 정제된 HspE7은 겔 전기영동, HPLC, 또는 두 가지 모두를 사용하여 측정했을 때 약 95% 내지 약 99.99%의 순도를 가진다.

또한, 본 발명은 포유동물 또는 대상자에서 종양 부담 또는 바이러스 발생을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 이것은 정제된 HspE7, 및 CpG, TLR3 아고니스트, MPL, MPL-TDM 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제를 포함하는 조성물을 그것을 필요로 하는 대상자에 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게, 면역자극제는 1회분 용량 당 약 1ug 내지 약 5000ug의 양으로 동시-투여된다. 본 발명의 어떤 양태에서, 면역자극제는 PolyI:C, 또는 폴리-리신, 폴리-아르기닌 또는 대부분의 양이온계 아미노산을 포함하는 양이온계 펩티드와 같은 양이온계 폴리머와 복합체화된 PolyI:C이다. 본 발명의 다른 양태에서, 면역자극제는 PolyICLC이다. 또한, 정제된 HspE7은 겔 전기영동, HPLC, 또는 두 가지 모두를 사용하여 측정했을 때 약 95% 내지 약 99.99%의 순도를 가진다.

더 이상으로, 본 발명은 정제된 HspE7, 및 CpG, TLR3 아고니스트, MPL, MPL-TDM 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제, 그리고 그것의 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 바람직하게, 면역자극제는 1회분 용량 당 약 1ug 내지 약 5000ug의 양으로 존재한다. 본 발명의 어떤 양태에서, 면역자극제는 PolyI:C, 또는 폴리-리신, 폴리-아르기닌 또는 대부분의 양이온계 아미노산을 포함하는 양이온계 펩티드와 같은 양이온계 폴리머와 복합체화된 PolyI:C이다. 본 발명의 다른 양태에서, 면역자극제는 PolyICLC이다. 또한, 정제된 HspE7은 겔 전기영동, HPLC, 또는 두 가지 모두를 사용하여 측정했을 때 약 95% 내지 약 99.99%의 순도를 가진다.

본 발명은 HPV 단백질 항원에 대항하는, 그리고 특정 구체예에서 HPV 단백질 항원을 발현하는 종양 또는 HPV-감염 세포에 대항하는 면역반응을 증진시키기 위한 조성물의 사용에 관한 것이다. 상기 조성물은 그것을 필요로 하는 대상자에서 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 조성물의 투약(dosing) 일정에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 적어도 2번의 1회분 용량을 포함하는 투약 일정으로 투여된다. 1회분 용량은 매일, 또는 날짜 간격을 두고, 또는 이들을 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명의 개요가 반드시 본 발명의 특징으로 모두 설명하는 것은 아니다.

도면의 간단한 설명

본 발명의 이들 및 다른 특징들이 첨부된 도면을 참조하여 다음의 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 다양한 HspE7 제제의 항-종양 활성을 나타낸다. 프로세스 L: 프로세스 L HspE7은 고순도 HspE7 제제이다. 프로세스 A HspE7은 저순도 HspE7이다(WO 99 /07860에 설명된). 확립된 E7-발현 TC-1 종양을 보유한 마우스의 목덜미에 프로세스 A 또는 프로세서 L에 의해 생산된 HspE7의 등급화된 용량을 피하 주사하고(n = 30/군/용량), 49일간 종양 성장을 추적했다. RD4 - 프로세스 L HspE7(▼); RD5 - 프로세스 L HspE7(◆); CL4 - 프로세스 A HspE7(○); CL6 - 프로세서 A HspE7(□). X 축: TC-1 분석에 사용된 HspE7의 용량, ug.

도 2는 CpG-함유 올리고뉴클레오티드(TLR9 아고니스트)의 존재하에 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구를 유도하는 HspE7의 능력의 증대를 나타낸다. HspE7을 단독으로, 또는 HspE7과 30ug CpG 올리고뉴클레오티드를 나이브 C57B1/6 마우스에 피하 주사하고, ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 좌측에서 우측으로(처치 당 2마리 마우스), 면역화 항원은 400ug 프로세스 A HspE7(WO 99/07860에 설명된 저순도 HspE7); 400ug 프로세스 A HspE7 + 30ug CpG 올리고뉴클레오티드; 400ug 프로세스 L HspE7(고순도 HspE7); 400ug 프로세스 L HspE7 + 30ug CpG 올리고뉴클레오티드였다. ELISPOT 분석에 사용된 리콜(recall) 항원은 HBV 코어 항원 (HBVcAg)(93-100) 무관 대조군 펩티드(검은 막대); E7(49-57)-특이적 펩티드(회색 막대); 배지 단독 대조군(흰 막대)이었다.

도 3은 PAM3CysSK4(TLR2 아고니스트)를 제외하고, PolyI:C(TRL3 아고니스트) 또는 CpG 올리고뉴클레오티드(TLR9 아고니스트)와 함께 프로세스 L HspE7(정제된 HspE7)을 동시-주사함에 의한 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구를 유도하는 HspE7의 능력을 증대를 나타낸다. 마우스에 프로세스 L HspE7과 TLR 아고니스트의 혼합물(용액)을 명시된 용량으로 피하 주사하고, ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 좌측에서 우측으로(처치 당 2마리 마우스), 면역화 항원은 50ug 프로세스 L HspE7 + 10ug CpG 올리고뉴클레오티드; 50ug 프로세스 L HspE7 + 1OOug poly I:C; 50ug 프로세스 L HspE7 + 20ug Pam3CysSK4; 또는 나이브 마우스였다. ELISPOT 분석에 사용된 리콜 항원은 HBVcAg(93-100) 무관 대조군 펩티드(빗살무늬 막대); E7(49-57)-특이적 펩티드(검은 막대); 배지 단독 대조군(흰 막대)이었다.

도 4는 모노-포스포릴-리피드 A(MPL; TLR4 아고니스트)의 존재하에 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구를 유도하는 프로세스 L HspE7의 능력의 증대를 나타낸다. 나이브 C57B1/6 마우스에 프로세스 L HspE7을 단독으로(정제된 HspE7), 또는 HspE7에 더하여 MPL + TDM을 피하 주사하고, ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 좌측에서 우측으로(처치 당 2마리 마우스), 면역화 항원은 400ug 프로세스 L HspE7; MPL + TDM(Ribi) 중의 400ug 프로세스 L HspE7 또는 나이브 마우스였다. ELISPOT 분석에 사용된 리콜 항원은 HBVcAg(93-100) 무관 대조군 펩티드(검은 막대); E7(49-57)-특이적 펩티드(빗살무늬 막대); 배지 단독 대조군(흰 막대)이었다.

도 5는 PolyICLC(TLR3 아고니스트)의 존재하에 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구를 유도하는 프로세스 L HspE7의 능력의 증대를 나타낸다. 프로세스 L HspE7을 단독으로(정제된 HspE7), 또는 HspE7 + PolyICLC의 등급화된 용량을 나이브 C57B1/6 마우스에 피하 주사하고, ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 좌측에서 우측으로(처치 당 2마리 마우스), 면역화 항원은 400ug 프로세스 L HspE7; 400ug 프로세스 L HspE7 + 100ug PolyICLC; 400ug 프로세스 L HspE7 + 10ug PolyIC LC; 400ug 프로세스 L HspE7 + 1ug PolyICLC; 400ug 프로세스 L HspE7 + O.1ug PolyICLC; 100ug PolyICLC 단독 또는 나이브 마우스였다. ELISPOT 분석에 사용된 리콜 항원은 HBVcAg(93-100) 무관 대조군 펩티드(회색 막대); E7(49-57)-특이적 펩티드(점무늬 막대); 배지 단독 대조군(흰 막대)이었다.

도 6은 종양 발생에 대한 프로세스 L HspE7 또는 프로세스 A HspE7의 효과를 나타낸다. 다양한 HspE7 제제의 항-종양 활성을 프로세스 A HspE7(저순도 HspE7, WO 99/07860에 설명됨)의 투여, 또는 프로세스 L HspE7(정제된 HspE7)과 CpG 올리고뉴클레오티드의 동시-투여에 의해 측정했다. 확립된 E7-발현 TC-1 종양을 보유한 마우스의 목덜미에 프로세스 A HspE7을 단독으로 또는 상이한 용량의 CpG 올리고뉴클레오티드와 혼합된 프로세스 L HspE7의 등급화된 용량을 피하 주사하고(n = 30/군), 49일간 종양 성장을 추적했다. 3ug CpG 올리고뉴클레오티드 + 프로세스 L HspE7(■); 10ug CpG 올리고뉴클레오티드 + 프로세스 L HspE7(▲); 30ug CpG 올리고뉴클레오티드 + 프로세스 L HspE7(▼); 프로세스 A HspE7(◆); 평균 프로세스 A Hsp E7 이력(○). X 축 - TC-1 분석에 사용된 HspE7, ug.

도 7은 PolyI:C와 프로세스 L HspE7(정제된 HspE7)을 조합함에 의한 프로세스 L HspE7의 항-종양 활성의 증가를 나타낸다. 확립된 E7-발현 TC-1 종양을 보유한 마우스의 목덜미에 프로세스 L HspE7을 단독으로 또는 PolyI:C와 조합된 프로세스 L Hsp E7의 등급화된 용량을 피하 주사하고(n = 20/군), 49일간 종양 성장을 추적했다. 프로세스 L HspE7을 800ug 주사한 마우스의 약 50%에서 49일째에 종양이 나타났다. HspE7(■); HspE7 + PolyI:C(▲). X 축 - TC-1 분석에 사용된 HspE7, ug.

도 8은 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구 유도에 대한, 정제된 HspE7(프로세스 L HspE7)과 혼합된 명반 보조제, 또는 불완전 프레운드 보조제(IFA)의 효과를 나타낸다. 프로세스 L HspE7을 단독으로, 또는 프로세스 L HspE7, CpG 올리고뉴클레오티드, 명반 및 불완전 프레운드 보조제(IFA)의 다양한 조합을 명시된 용량으로 마우스에 피하 주사하고, ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 좌측에서 우측으로(처치 당 2마리 마우스), 면역화 항원은 400ug 프로세스 L HspE7; IFA 중의 400ug 프로세스 L HspE7; IFA 중의 400ug 프로세스 L HspE7 + CpG 올리고뉴클레오티드; 400ug 프로세스 L HspE7 + 명반; 400ug 프로세스 L HspE7 + 명반 + CpG 올리고뉴클레오티드; 400ug 프로세스 L HspE7 + CpG 올리고뉴클레오티드 또는 나이브였다. ELISPOT 분석에 사용된 리콜 항원은 HBVcAg(93-100) 무관 대조군 펩티드(빗살무늬 막대); E7(49-57)-특이적 펩티드(점무늬 막대); 배지 단독 대조군(흰색 막대)이었다.

도 9는 다양한 TLR 아고니스트 또는 아고니스트성 항-CD40 항체의 존재하에 동시-투여되었을 때 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구를 유도하는 HspE7의 능력을 비교한 것이다. HspE7과 Imiquimod(TLR7 아고니스트), PAM3CysSK4(TLR1/2 아고니스트) 또는 LPS(TLR4 아고니스트)의 동시-투여 후에는 무시할 만한 수의 E7-특이적 T 세포가 도출되었다. 반면에, HspE7과 CpG 올리고뉴클레오티드 또는 아고니스트성 항-CD40 항체의 동시-투여 후에는 상당한 수의 E7-특이적 T 세포가 도출되었다. 정제된 HspE7(프로세스 L HspE7)과 명시된 TLR-아고니스트의 혼합물을 마우스에 피하 주사하고, ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 좌측에서 우측으로(처치 당 2마리 마우스), 면역화 항원은 400ug 프로세스 L HspE7; 400ug 프로세스 L HspE7 + 100ug Imiquimod; 400ug 프로세스 L HspE7 + 30ug LPS; 400ug 프로세스 L HspE7 + 25ug PAM3CysSK4; 400ug 프로세스 L HspE7 + 25ug 항-CD40 항체(클론 1C1O); 400ug 프로세스 L HspE7 + 30ug CpG 올리고뉴클레오티드; 또는 나이브 마우스였다. ELISPOT 분석에 사용된 리콜 항원은 HBVcAg(93-100) 무관 대조군 펩티드(검은 막대); E7(49-57)-특이적 펩티드(빗살무늬 막대); 배지 단독 대조군(흰 막대)이었다.

도 10은 IFN-감마 ELISPOT를 이용하여 측정했을 때 클래스 I-제한 CD8+ T 세포 반응을 도출하는 능력에 대한 1일 1회 프라임-부스트 전략의 효과를 나타낸다. HspE7(100ug)과 polyICLC(10ug)로 C57B1/6 마우스(군 당 2마리)를 하루 간격으로 1일 1회 최대 4일까지 면역화했다. 항원에 최초 노출하고 7일 후에 모든 동물을 안락사시키고 비장을 채취하여 분석에 사용했다. IFN-감마 ELISPOT에 의해 16E7.49-57.Db 펩티드로의 자극에 대한 클래스 I-제한 CD8+ T 세포 반응을 평가했다(리콜 항원 - 흰 막대; 배지 단독 대조군 - 검은 막대). 좌측에서 우측으로(처치 당 2마리 마우스), 면역화 항원은 400㎍ polyICLC(1회 투약); 100㎍ 프로세스 L HspE7 + 10㎍ polyICLC(1회 투약); 100㎍ 프로세스 L HspE7 + 10㎍ polyICLC(2회 투약); 100㎍ 프로세스 L HspE7 + 10㎍ polyICLC(3회 투약); 100㎍ 프로세스 L HspE7과 10㎍ polyICLC(4회 투약); 나이브 마우스였다.

도 11은 체액 면역에 대한 HspE7 + PolyICLC의 동시-면역화의 효과를 나타낸다. C57B1/6 마우스 군(n = 5)을 1개월 간격(1일, 28일)으로 다음의 제제들로 2번 면역화했다: (X 축, 좌측에서 우측으로) 버퍼, 500㎍ HspE7, 12.5㎍ PolyICLC, 500㎍ HspE7 + 1.25㎍ PolyICLC, 500㎍ HspE7 + 12.5㎍ PolyICLC 또는 500㎍ HspE7 + 125㎍ PolyICLC. 혈청 항체 분석용 혈액 샘플을 투약 7일 전에(d-7, 베이스라인), 그리고 21일, 49일 및 77일에 채취했다. 표준 ELISA에 의해 각 마우스로부터의 혈청을 E7과 HspE7에 대한 항체(IgG1, IgG2b 및 IgG2c)의 존재에 대해 시험했다. 데이터는 분석 플레이트 바탕값(0.2 OD 단위로 정의됨)보다 큰 흡광도를 산출하는 최고 혈청 희석으로서 표현된다. 패널 A) 항-E7 IgG1 역가; B) 항-HspE7 IgG1 역가; C) 항-E7 IgG2b 역가; D) 항-HspE7 IgG2b 역가; E) 항-E7 IgG2c 역가; F) 항-HspE7 IgG2c 역가. 흰 막대 - 사전-채혈 대조군; 빗살무늬 막대 - 21일 채혈; 검은 막대 - 49일 채혈; 점무늬 막대 - 77일 채혈.

도 12는 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응을 도출하는데 있어서 외인성 항원 + PolyICLC를 사용한 면역화의 결과를 나타낸다. 400㎍ HspE7 단독, 400㎍ HspE7 + 100㎍ polyICLC, 400㎍ HspE7 + 10ug polyICLC, 400㎍ HspE7 + 1ug polyICLC, 400㎍ HspE7 + 0.1ug polyICLC, 100ug polyICLC 단독 또는 버퍼(대조군)로 C57B1/6 마우스(군 당 2마리 마우스)를 피하 면역화했다. 면역화 7일 후에 H-2D^b-제한 에피토프 E7(49-57)에 대한 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 IFN-감마 ELISPOT에 의해 평가했다. ELISPOT 리콜 항원: 흰 막대 - 배지 대조군; 회색 막대 - E7 펩티드; 검은 막대 - HBVCor 펩티드.

도 13은 확립된 거대 TC-1 종양의 퇴화의 유도에서 HspE7 + PolyICLC를 사용한 멀티-용량 면역화의 결과를 나타낸다. C57B1/6 마우스(군 당 15마리 마우스)에E7-발현 TC-1.K 종양 세포(6x10⁴)를 이식하고(0일), 다음의 제제들로 4일 연속하여 1일 1회 투약, 치료했다: 버퍼 단독(흰 사각형); 100ug HspE7 단백질(흰 삼각형); 10ug PolyICLC(흰 원); 또는 100ug HspE7 단백질 + 10ug Poly ICLC(검은 원), 이식 28일 후에 시작함. 데이터는 시간 경과에 따른 각 군에 대한 평균 종양 부피로서(패널 A) 또는 각 군 내 개별 동물에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피(패널 B)로서 제시된다.

도 14는 HspE7 항원 + TLR3 아고니스트를 사용한 멀티-용량 면역화의 결과를 나타낸다. (A) C57B1/6 마우스(군 당 2마리 마우스)를, 0일에 한번(검은 사각형), 0일 및 2일에 2번(흰 사각형) 또는 0일 및 4일에 2번(검은 원), 재조합 HspE7 단백질(100ug) + TLR3 아고니스트 PolyICLC(10ug)로 피하 면역화했다. 명시된 시간 지점(최초 면역화 후 경과일)에서 IFN-감마 ELISPOT로 H-2D^b-제한 에피토프 E7(49-57)에 대한 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 평가했다. (B) 4일간 매일 재조합 HspE7 단백질(100ug)과 TLR3 아고니스트 PolyICLC(10ug)를 함께 사용하거나, 1일날에 1번 함께 사용하거나, 또는 1일날에 1번 재조합 HspE7 단백질(100ug)과 TLR3 아고니스트 PolyICLC(10ug)를 함께 사용하고, 2, 3 및 4일에는 PolyICLC(10ug)만을 사용하여 C57B1/6 마우스(군 당 4마리 마우스)를 피하 면역화했다. 최초 면역화 7일 후에 H-2D^b-제한 에피토프 E7(49-57)에 대한 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 IFN-감마 ELISPOT에 의해 평가했다.

도 15는 HspE7 항원 + TLR3 아고니스트를 사용한 멀티-용량 면역화의 결과를 나타낸다. (A) C57B1/6 마우스(군 당 2마리 마우스)를 명시된 날짜 동안 매일 1일 1회 재조합 HspE7 단백질(100ug) + PolyICLC(10ug)로 면역화하거나, 또는 HspE7 단백질(400ug) + PolyICLC(40ug)로 단 1회만 투약하여 면역화했다. 최초 면역화 7일 후에 IFN-감마 ELISPOT에 의해 H-2D^b-제한 에피토프 E7(49-57)에 대한 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 평가했다. (B) 나이브 마우스(우측 패널) 또는 4일간 매일 1일 1회 HspE7 단백질(100ug) + PolyICLC(10ug)을 투약한 마우스(좌측 패널)로부터의 비장세포를 E7(49-57) 펩티드 로딩 PE-콘쥬게이트 H-2D^b 펜타머(Proimmune)로 염색하고, 표면은 항-CD8 및 항-CD44 mAb로 염색했다. 나타낸 세포는 게이트형 CD8+ 양성 개체군이다. (C) C57B1/6 마우스(군 당 2마리 마우스)를 재조합 HspE7 단백질(100ug)과 PolyICLC(10ug)로 명시된 날짜 동안 매일 1일 1회 면역화했다. 명시된 시간 지점(최초 면역화 후 경과일)에서 IFN-감마 ELISPOT에 의해 H-2D^b-제한 에피토프 E7(49-57)에 대한 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 평가했다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 HspE7을 포함하는 조성물 및 그것의 사용 방법에 관한 것이다.

바람직한 구체예가 다음에 설명된다.

본 발명은 정제된 HspE7, 제한은 아니지만 TLR 아고니스트와 같은 면역자극제, 및 선택적으로 다른 제약학적으로 허용되는 성분들을 포함하는 조성물을 제공한다. 면역자극제는 TLR3, 또는 TLR9 아고니스트일 수 있지만, 다른 TLR 아고니스트들도 사용될 수 있다. 정제된 HspE7과 혼합될 수 있는 면역자극제의 예로는, 제한은 아니지만, CpG-함유 올리고뉴클레오티드(TLR9 아고니스트), TLR3 아고니스트, 예를 들어 이중-가닥 RNA(dsRNA) 또는 PolyI:C, 또는 폴리-L-리신을 갖는 PolyI:C (PolyICLC), 모노-포스포릴-리피드 A(MPL; TLR4 아고니스트) 또는 MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM), 및 항-CD40이 있다.

정제된 HspE7은 약 95% 내지 약 99.99%, 또는 이 사이의 어떤 양의 HspE7을 포함하고, 나머지 구성요소로서 HspE7 제조 및 정제 후에 존재하게 되는 성분들을 포함하는 것을 특징으로 하는 HspE7 제제를 의미한다. 예를 들어, 정제된 HspE7은 HspE7을 약 95% 내지 약 98% 또는 이 사이의 어떤 양, 또는 약 97% 내지 약 99.6% 또는 이 사이의 어떤 양으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 정제된 HspE7은 HspE7을 약 95, 96, 97, 98, 99, 99.2, 99.4, 99.6, 99.8, 99.9, 99.95, 99.99% 또는 이 사이의 어떤 양으로 포함할 수 있다. 정제된 HspE7의 예로서 프로세스 L HspE7이 있다.

HspE7, 또는 프로세스 L HspE7의 순도는 어떤 공지된 순도 평가 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, 예를 들어 HPLC, 또는 겔 전기영동 등의 방법을 사용한다. 예를 들어, 환원 및 비-환원 겔 전기영동(SDS를 함유한 1% PAGE, ±베타-메르캅토에탄올)의 조합이 당업자에게 알려져 있다.

Hsp65-HPV E7 융합 산물(HspE7)은 다양한 방법에 따라서, 예를 들어 WO 99/ 07860(본원에 참고자료로 포함된다)에 개시된 방법에 따라서 생성될 수 있다. 본원에 설명된 대로 사용하기 위해 HspE7 제제는 이후 더 정제된다. 추가 정제는 크기 배제, 이온-교환(양이온, 음이온 또는 둘 모두), 친화성, 역상, 또는 다른 크로마토그래피법 중 하나 이상을 이용하는 크로마토그래피, 크기, 전하 또는 둘 모두에 의한 겔 전기영동, 유레아 또는 구아니딘 염산염 등의 무질서 유발 시약을 이용한 변성, 염 또는 pH 침전, 막 여과 등을 포함하여, 당업자에게 공지된 어떤 정제 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

WO 99/07860에 개시된 HspE7은, 예를 들어 본원에 설명된 고순도 HspE7(프로세스 L HspE7)에 비하여 약 95% 미만의 순도를 포함하는 저순도 제제이다. 저순도 형태의 HspE7은 프로세스 A HspE7, 또는 프로세스 A라고 언급한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 프로세스 A HspE7은 더 정제된 HspE7, 예를 들어 프로세스 L HspE7과 비교하여 증진된 생물학적 활성을 가져오는 하나 또는 하나 이상의 성분을 포함한다(예를 들어, 도 1 및 2 참조). 그러나, 본원에 설명된 대로, 선행기술의 HspE7(프로세스 A HspE7)이 저독성 HspE7을 생산하기 위해 약 95% 내지 약 99.99% 또는 이 사이의 어떤 양의 순도로 더 정제되는 경우(프로세스 L HspE7)에는 HspE7의 생물학적 활성의 손실이 관찰된다(도 1 및 2; 프로세스 L HspE7 대 프로세스 A HspE7; 및 실시예 2 및 3 참조). 도 1에 나타낸 대로, 프로세스 L HspE7(정제된 HspE7)의 사용은 유사한 용량 범위에 걸쳐서 저순도 프로세스 A HspE7을 사용하여 관찰된 것만큼 종양 발생에 유의한 감소를 나타내지는 않는다. 그러나, 하기 설명된 대로, 고순도 HspE7, 제한은 아니지만, 예를 들어 프로세스 L HspE7은 TLR 아고니스트 등과 같은 면역자극제와 함께 동시-투여되었을 경우에는 생물학적 활성을 나타낸다. 정제된 HspE7과 면역자극제를 포함하는 정제된 HspE7 조성물은 다른 제약학적으로 허용되는 성분들을 더 포함할 수 있다. 면역자극제는 TLR3 아고니스트 또는 TLR9 아고니스트일 수 있지만, 다른 TLR 아고니스트 또는 보조제, 예를 들어 CD40도 사용될 수 있다.

정제된 HspE7과 혼합될 수 있는 면역자극제의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, CpG-함유 올리고뉴클레오티드(TLR9 아고니스트), PolyI:C, PolyICLC(TLR3 아고니스트), 모노-포스포릴-리피드 A(MPL; TLR4 아고니스트), MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM), 및 항-CD40 항체가 있다. CpG 올리고뉴클레오티드의 비제한적 예로는 클래스 B 타입 코어 서열: GACGTT을 포함하는 CpG가 있으며, 예를 들어 CpG 1982, 1826 또는 1668 등이다. CpG 1982는 다음의 서열을 가진다: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ ID NO:1). CpG 1982는 포스포로티오에이트 백본과 함께 이용할 수 있다(Invitrogen, 명칭: ZOO FZE FOE ZZO OZE FZE OT). CpG 1826은 다음의 서열을 가진다: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO:2). CpG 1668은 다음의 서열을 가진다: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ ID NO:3). 바람직하게, CpG 올리고뉴클레오티드 1982 및 1668은 포스포로티오에이트 백본을 포함한다. 1668을 포함하여, 최적 뮤린 클래스 B 타입 코어 서열(GACGTT)을 갖는 몇몇 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 프로세스 L HspE7의 활성을 증대시키는데 매우 활성인 것으로 밝혀졌다. 유사하게, CpG 클래스 C 타입 올리고뉴클레오티드(2395)가 매우 활성인 것으로 판명되었다. 그러나, 클래스 A 타입 CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 ELISPOT 분석에서 HspE7의 활성을 증대시키는데 훨씬 덜 효과적인 것으로 밝혀졌다. A, B 및 C 클래스 CpG의 설명에 관해서는 Vollmer J. 등(Vollmer J., et al., 2004, Eur J. Immunol. 34:251-262)을 참조한다.

다른 제제들과 조합된 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)를 포함하여, PolyI:C 리보핵산에서 개선된 안정성 프로파일, 예를 들어 내인성 RNAse들에 대한 감소된 감수성이 증명되었다. dsRNA는, 예를 들어 리피드 소포에 캡슐되거나, 또는 폴리양이온계 폴리머와 복합체화될 수 있다. 이러한 폴리머의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 대부분의 양이온계 아미노산을 포함하는 펩티드, 폴리-리신, 폴리-아르기닌 등이 있다. 미국특허 제4,346,538호는 13-35kDa MW 범위의 비교적 분자량이 높은 폴리-L-리신인 PolyI:C와 카르복시메틸셀룰로스를 포함하는 PolyI:C 복합체("Poly ICLC"); 및 이러한 조성물의 제조 및 사용 방법을 설명한다. 일부 암, 일부 바이러스 질환, 예를 들어 HIV 또는 에볼라, 또는 다발성 경화증의 치료에서 치료제로서 PolyICLC의 사용이 또한 제안되었다(미국특허 공보 제2006/0223742호).

어떤 구체예에서, 이중-가닥 RNA PolyI:C 리보핵산은 PolyI 올리고뉴클레오티드 및 PolyC 올리고뉴클레오티드를 역-평행 염기쌍 배열로 포함한다. 이러한 이중-가닥 핵산 분자의 가닥들은 수소 결합을 통하여 질서정연한 방식으로 상호작용하는데, 이것을 "Watson-Crick" 염기쌍이라고도 한다. 또한, 비-정규 수소 결합에 의해 변이형 염기쌍이 발생할 수 있는데, 예로서 Hoogsteen 염기쌍이 있다. 어떤 열역학적, 이온 또는 pH 조건에서는 3중 나선이 발생할 수 있는데, 특히 리보핵산에서 그러하다. 이들 및 다른 변이형 수소 결합 또는 염기쌍들은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참고자료로서 포함되는 Lehninger - Principles of Biochemistry, 3rd edition(Nelson and Cox, eds., Worth Publishers, New York)에서 찾을 수 있다.

"PolyI" 올리고뉴클레오티드는 대부분의 이노신, 이노신-유사체 뉴클레오시드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 이노신-유사체 뉴클레오시드는, 예를 들어 7-데아자이노신, 2'-O-메틸-이노신, 7-티오-7,9-디데아자이노산, 포르마이신 B, 8-아자이노신, 9-데아자이노신, 알로퓨리놀 리보시드, 8-브로모-이노신, 8-클로로이노신 등을 포함한다.

"PolyC" 올리고뉴클레오티드는 대부분의 시티딘, 시티딘-유사체 뉴클레오시드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 시티딘-유사체 뉴클레오시드는, 예를 들어 5-메틸시티딘, 2'-O-메틸-시티딘, 5-(1-프로핀일)시티딘 등을 포함한다.

또한, 비-정규 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드간 결합을 포함하는 핵산이 보조제로서 사용된 경우 개선된 안정성 프로파일을 제공하는 한편, 변형된 면역자극 효과를 제공하거나, 또는 본원에 설명된 HspE7 조성물의 생물학적 활성을 변형시킬 수 있다. "정규" 뉴클레오시드는 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 데옥시우리딘, 데옥시시티딘, 데옥시이노신, 아데노신, 구아노신, 5-메틸우리딘, 우리딘 및 시티딘과 같은 자연발생 뉴클레오시드를 포함한다. 변형된 면역자극 효과는 적응, 선천 또는 체액 면역반응의 더 빠른 반응으로서 나타나거나, 또는 조금 덜 즉각적이기는 하지만 더 오래 지속되는 반응일 수 있다.

비-정규 뉴클레오시드의 예들이 본 분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 "잠금 핵산" 또는 "LNA"가 있다. LNA는 2'-4' 환상 결합을 갖는 뉴클레오시드로서, WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 0148190, WO 02/28875, WO 03/006475, WO 03/09547, WO 2004/083430, US 6,268,490, US 6,79449, US 7, 034,133에 설명된다. 다른 비-LNA 이환 뉴클레오시드들도 본 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 다음과 같다.

- 추가의 C-3',C-5'-에탄오 결합을 갖는 바이시클로[3.3.0]뉴클레오시드;

- 추가의 C-1',C-6'- 또는 C-6',C-4'-메탄오 결합을 갖는 바이카르보시클로 [3.1.0]뉴클레오시드;

- 미변형 뉴클레오시드와 함께 다이머로서 합성된 추가의 C-2',C-3' 디옥살란 고리를 함유하는 바이시클로[3.3.0]- 및 [4.3.0]-뉴클레오시드, 이때 추가의 고리는 천연 포스포르디에스테르 결합을 치환하는 뉴클레오시드간 결합의 일부이다; 아미드- 및 술폰아미드-타입 뉴클레오시드간 결합의 일부로서 C-2',C-3'-메탄오 결합을 갖는 바이시클로[3.1.0]뉴클레오시드를 함유하는 다이머;

- 포름아세탈 뉴클레오시드간 결합을 통해 트라이머의 중앙에 편입된 바이시클로[3.3.0] 글루코오스 유도 뉴클레오시드 유사체;

- 5-원 고리 2개와 3-원 고리 1개가 백본을 구성하고 있는 트리시클로-DNA;

- 1,5-안히드로헥시톨 핵산; 및

- 추가의 C-2',C-3'-연결된 6- 및 5-원 고리를 갖는 바이시클릭[4.3.0]- 및 [3.3.0]-뉴클레오시드

dsRNA에 사용될 수 있는 다른 비-정규 뉴클레오시드 및 비-정규 뉴클레오시드간 결합("백본")은, 예를 들어 Freier, 1997(Nucleic Acids Res. 25:4429-4443) 또는 Praseuth 등(Biochimica et Biophysica Acta 1489:181-206)에 설명된다.

본 발명의 정제된 HspE7은 프로세스 L HspE7(또는 프로세스 L)이라고 한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 프로세스 L HspE7의 정제 동안 HspE7 제제로부터 하나 또는 하나 이상의 성분이 제거될 수 있으며, 이 하나 또는 하나 이상의 성분은 저순도(프로세스 A) HspE7 제제에 보조제-유사 활성을 부여할 수 있는 것이다. 그러나, HspE7 조성물의 임상시험 및 규제승인을 위해 조성물 중 미지 성분의 퍼센트는 최소화될 필요가 있다.

HspE7의 생물학적 활성은 HspE7에 의한 시험관내 또는 생체내 생물학적 활성의 매개, 증대, 또는 자극 중 어느 것을 의미한다. 또한, 생물학적 활성은 HspE7에 의한 시험관내 또는 생체내 생물학적 활성의 억제를 포함할 수 있다. 많은 이러한 활성이 알려져 있으며, HspE7의 생물학적 활성을 측정하기 위한 기초로서 사용될 수 있다. 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 유도를 이용하여 HspE7의 생물학적 활성을 측정할 수 있다. 이 특성을 측정하기 위해 고안된 한 분석 타입(ELISPOT)에서는 관심 화합물 또는 혼합물로 C57B1/6 마우스를 처치한 후, 주어진 수의 비장세포 당 IFN-감마 생산 세포의 수를 측정한다(실시예 2 참조). 대안의 분석은 TC-1 종양을 가진 마우스를 관심의 화합물 또는 혼합물로 처치하고, 일정 시간 후, 예를 들어 49일 후 종양 발생을 측정함으로써 HspE7의 항-종양 활성을 측정하는 것을 포함한다(실시예 2 참조). 또는 달리, 당업자에게 공지되어 있는 세포용해 활성의 자극(CTL 분석)도 사용될 수 있다. 또한, 생물학적 활성은 다양한 타입 및 서브타입의 특정 항체들의 생산을 포함하여, 면역원 또는 항원에 대한 특이적 세포-매개 또는 체액 반응의 유도를 포함할 수 있다.

HspE7의 정제로 인한 활성의 손실은 HspE7 조성물에 TLR 아고니스트 등의 적합한 보조제 또는 면역자극제를 첨가함으로써 회복될 수 있다. HspE7 조성물을 다시 설계하기 위해서 HspE7 활성을 회복시키는 효능에 대해 보조제들이 시험되었다. 이들 보조제들은 CpG 올리고뉴클레오티드, PolyI:C, PolyICLC, MPL, MPL-TDM, Imi-quimod, 러프 LPS(지질다당질), 스무스 LPS, Pam3CysSK4, 항-CD40, 명반, 및 불완전 프레운드 보조제(IFA)를 포함한다.

"보조제" 또는 "면역자극제"는 면역원과 조합되었을 때 면역원에 대한 면역반응을 증진 또는 증대시키는 물질, 또는 화합물의 조합이다. 면역반응의 증진 또는 증대는 본원에 설명된 것들을 포함하여 표준 분석법에 의해서 측정될 수 있다. 보조제 또는 면역자극제는 하나, 또는 하나 이상의 화합물로 이루어질 수 있다.

"면역반응"은 적응, 체액, 선천 및 세포-매개 시스템을 포함하여, 면역 시스템의 전-염증 또는 항-염증 반응을 의미한다. 용어 "조절하다" 또는 "조절" 등은 선택된 파라미터의 증가 또는 감소를 의미한다.

정제된 HspE7에 명반 또는 불완전 프레운드 보조제(IFA; 도 8, 실시예 6 참조) 등의 몇몇 잘 공지된 보조제의 첨가는 정제 후 관찰된 HspE7, 예를 들어 프로세스 L HspE7과 관련된 생물학적 활성의 손실을 회복시키지 못했다. 유사하게, 러프 LPS(실시예 7, 도 9), Imiquimod(실시예 7, 도 9), 또는 Pam3CysSK4(실시예 7, 도 9)도 HspE7 생물학적 활성을 증대시키지 못했다. 그러나, 정제된 HspE7과 CpG 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 실시예 3, 도 2 및 3), PolyI:C(실시예 4, 도 3), PolyICLC(도 5), 모노-포스포릴-리피드 A(MPL; 도 4), 또는 항-CD40(도 9)의 혼합은 고순도 HspE7과 관련된 생물학적 활성을 회복시켰다. CpG 올리고뉴클레오티드, PolyI:C, 또는 PolyICLC는 HspE7의 부재하에 투여된 경우에는 이런 활성을 나타내지 않았다.

따라서, 본 발명은 또한 정제된 HspE7을 CpG 올리고뉴클레오티드, PolyI:C, PolyICLC, 모노-포스포릴-리피드 A(MPL), MPL-TDM, 및 항-CD40로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제와 혼합하거나, 또는 함께 동시-투여하는 것을 포함하는 고순도 HspE7의 생물학적 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 면역자극제는 약 0.1ug 내지 약 20mg, 또는 이 사이의 어떤 양, 예를 들어 약 1ug 내지 약 5000ug/1회분 용량, 또는 이 사이의 어떤 양, 약 10ug 내지 약 1000ug, 또는 이 사이의 어떤 양, 또는 약 30ug 내지 약 1000ug, 또는 이 사이의 어떤 양의 양으로 존재한다. 예를 들어, 약 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 50.0 60.0, 70.0, 80.0, 90.0, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000ug, 또는 이 사이의 어떤 양이 1회분 용량으로 사용될 수 있다. 유사하게, 정제된 HspE7은 약 0.1ug 내지 약 20mg, 또는 이 사이의 어떤 양, 예를 들어 약 1ug 내지 약 2000ug/1회분 용량, 또는 이 사이의 어떤 양, 약 10ug 내지 약 1000ug, 또는 이 사이의 어떤 양, 또는 약 30ug 내지 약 1000ug, 또는 이 사이의 어떤 양의 양으로 존재한다. 예를 들어, 약 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 50.0 60.0, 70.0, 80.0, 90.0, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000ug, 또는 이 사이의 어떤 양이 1회분 용량으로 사용될 수 있다.

"유효량"은 원하는 또는 명시된 면역학적 또는 치료적 효과를 야기하는데 효과적인 본 발명의 화합물 또는 조성물의 양을 말한다. 포유동물 또는 대상자에서 달성되어야 하는 1회분 용량의 비제한적 예는 HspE7, 면역자극제 또는 이 두 가지 모두에 대해 약 0.3mg/kg이며, 이것은 HspE7, 면역자극제 또는 이 두 가지 모두에 대해 약 0.03mg/kg 내지 약 30.0mg/kg의 범위일 수 있거나, 또는 필요에 따라 이들 사이의 어떤 양일 수 있다. 그러나, HspE7, 면역자극제 또는 이 두 가지 모두에 대해 0.03mg/kg 미만 또는 30mg/kg 이상의 1회분 용량도 사용될 수 있으며, 본원에서 역시 고려된다. 당업자는 HspE7, 면역자극제 또는 이 두 가지 모두에 대한 적합한 1회분 용량을 결정할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 정제된 HspE7와 CpG, TLR3 아고니스트, 예를 들어 PolyI:C 또는 PolyICLC, MPL, 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역자극제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게, 면역자극제는 상기 정의된 대로 약 0.1 ug 내지 약 20mg/1회분 용량, 또는 이 사이의 어떤 양으로 존재한다.

또한, 본 발명은 정제된 HspE7과 CpG, TLR3 아고니스트, 예를 들어 PolyI:C 또는 PolyICLC, MPL, 및 항-CD40로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역자극제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상자, 동물, 또는 환자에서 종양 성장을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 면역자극제는 상기 정의된 대로 약 0.1ug 내지 약 20mg/1회분 용량, 또는 이 사이의 어떤 양으로 이것을 필요로 하는 대상자, 동물, 또는 환자에게 제공된다.

용어 "환자" 또는 "대상자"는 인간 및 기타 영장류, 반려동물, 동물원의 동물, 및 농장의 동물을 포함하는 포유동물 및 기타 동물을 말하며, 예를 들어 고양이, 개, 설치류, 래트, 마우스, 햄스터, 토끼, 말, 소, 양, 돼지, 염소; 가금류 등을 포함한다.

본 발명의 HspE7 조성물은 어떤 적합한 제약학적 담체 또는 염과 혼합될 수 있다. "제약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 비교적 비독성의 무기산 및 유기산 부가 염, 및 염기 부가 염을 말한다. 이들 염은 화합물의 최종 분리 및 정제 동안 제자리 제조될 수 있다. 특히, 산 부가 염은 자유 염기 형태의 정제된 화합물을 적합한 유기산 또는 무기산과 별도로 반응시키고, 형성된 염을 분리함으로써 제조될 수 있다. 전형적인 산 부가 염으로는 브롬화수소산염, 염산염, 황산염, 중황산염, 인산염, 질산염, 아세트산염, 옥살레이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락티오바이오네이트, 술파메이트, 말로네이트, 살리실레이트, 프로피오네이트, 메틸렌-비스-β 히드록시나프토에이트, 겐티세이트, 이세티오네이트, 디-p-톨루오일타르트레이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 시클로헥실술파메이트, 및 퀴나테스라우릴술포네이트 염 등이 있다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 포함되는 S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 66, 1-19(1977)을 참조한다. 또한, 염기 부가 염은 산 형태의 정제된 화합물을 적합한 유기염기 또는 무기염기와 별도로 반응시키고, 형성된 염을 분리함으로써 제조될 수 있다. 염기 부가 염은 제약학적으로 허용되는 금속 및 아민 염을 포함한다. 적합한 금속염은 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 바륨염, 아연염, 마그네슘염, 및 알루미늄염을 포함한다. 나트륨염 및 칼륨염이 바람직하다. 적합한 무기염기 부가 염은 수소화 나트륨, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘, 수산화 알루미늄, 수산화 리튬, 수산화 마그네슘, 수산화 아연을 포함하는 금속 염기로부터 제조된다. 적합한 아민 부가 염은 안정한 염을 형성할 수 있는 충분한 염기성을 갖는 아민으로부터 제조되며, 바람직하게는 낮은 독성 및 의약 용도에의 허용성 때문에 의약화학에서 빈번히 사용되는 아민들을 포함하는데, 예를 들어 암모니아, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질페네틸아민, 디에틸아민, 피페라진, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 수산화 테트라메틸암모늄, 트리에틸아민, 디벤질아민, 에펜아민, 데히드로아비에틸아민, N-에틸피페리딘, 벤질아민, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 염기성 아미노산, 예를 들어 리신 및 아르기닌, 및 디시클로헥실아민 등이 있다.

본 발명의 HspE7 조성물은 주사, 피부 패치, 또는 경구 경로를 포함하는 어떤 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 면역자극제, 예를 들어 항-CD40, 또는 TLR 아고니스트, 예를 들어 CpG, TLR3 아고니스트, 예를 들어 PolyI:C 또는 PolyICLC, 또는 MPL, 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염과 혼합된 정제된 HspE7을 포함하는 화합물과 하나 이상의 제약학적 또는 생리학적으로 허용되는 버퍼, 담체, 부형제 또는 희석제, 및 선택적으로 다른 치료제들을 포함하는 인체 및 수의학용의 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물이 개별적으로, 또는 두 가지 이상의 화합물을 포함하는 혼합물로 투여될 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 또한, 본 발명은 TLR 아고니스트, 예를 들어 CpG 또는 PolyI:C, 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염과 혼합된 정제된 HspE7을 포함하는 화합물의, 염증 면역반응이 유리한 감염 또는 병리, 또는 질환 상태 또는 이상의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 사용을 포함한다.

본 발명의 화합물은 제약학적 또는 생리학적으로 허용되는 농도의 염, 버퍼제, 보존제, 상용성 담체, 희석제, 부형제, 분산제 등 및 선택적으로 다른 치료 성분들을 함유할 수 있는 제약학적 또는 생리학적으로 허용되는 용액으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 당업자에게 공지된 제약학적으로 허용되는 다양한 표준 비경구 조제형으로 조제될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 선택적으로 제약학적 또는 생리학적으로 허용되는 버퍼, 담체, 부형제 또는 희석제에 포함된, 본 발명의 개시된 화합물 또는 조성물의 유효량을 함유할 수 있다. 용어 "제약학적 또는 생리학적으로 허용되는 버퍼, 담체, 부형제 또는 희석제"는 인체 또는 기타 동물 투여에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 용어 "담체"는 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분을 표시하며, 이것을 활성 성분과 함께 조합하여 적용을 촉진한다. 제약 조성물의 성분은 활성 화합물(들)의 바람직한 제약 효능을 실질적으로 손상시킬 수 있는 상호작용을 하지 않는 방식으로 본 발명의 폴리머와, 그리고 서로 혼합될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 조성물은 편의상 멸균 수성 제제를 포함하며, 이들은 수혜자의 혈액과 등장성으로 될 수 있다. 특히, 허용가능한 비히클 및 용매는 물, 링거액, 및 등장 염화나트륨 용액이다. 추가하여, 멸균 불휘발유가 용매 또는 현탁 매질로서 일반적으로 사용된다. 이를 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 어떤 저자극성 불휘발유가 사용될 수 있다. 추가하여, 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제제에 유용하다. 피하, 근육내, 복강내, 정맥내 등의 투여에 적합한 담체 조제형은, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995(본원에 참고자료로 포함된다)에서 찾을 수 있다.

조성물은 단위 제형 또는 투약 단위형으로 편리하게 제공될 수 있으며, 제약분야에 잘 공지된 방법 중 어느 것에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 화합물을 하나 이상의 부속 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 화합물을 액체 담체, 미립자 고체 담체, 또는 이 둘 모두와 균일하며 친밀하게 회합시킴으로써 제조된다. 본 발명의 화합물은 동결건조되어 저장되며, 사용 전에 혼합할 수 있는 키트로서 제공된다.

기타 송달 시스템으로는 시간-방출, 지연-방출, 또는 지속-방출 송달 시스템이 있다. 이러한 시스템에 의해 본 발명의 조성물의 반복 투여를 피할 수 있으며, 대상자와 의사의 편의가 증가된다.

약물을 함유하는 전술한 폴리머의 마이크로캡슐이, 예를 들어 미국특허 제5, 075,109호에 설명된다. 또한, 송달 시스템은 콜레스테롤과 같은 스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 및 모노-, 디-, 및 트리-글리세리드와 같은 지방산 또는 천연 지방을 포함하는 리피드와 같은 비-폴리머 시스템; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드-기재 시스템; 왁스 코팅; 종래의 결합제 및 부형제를 사용한 압축 정제; 부분적으로 융합된 임플란트 등을 포함한다.

만성 HPV 감염 또는 HPV 감염에 관련된 병리, 또는 면역 시스템 자극이 유리한 질환 또는 장애의 예방 또는 치료가 필요한 인간 또는 동물 환자에 투여되는 화합물의 최적량뿐만 아니라, 이러한 화합물을 포함하는 치료 또는 제약 조성물의 투여 방법은 제약, 의학, 및 수의학 분야의 당업자의 기술 범위 내이다. 인간 또는 동물 환자에 대한 투약량 결정은 만성 HPV 감염 또는 HPV 감염에 관련된 병리 또는 치료될 다른 질환 또는 장애의 성질, 환자의 상태, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이요법, 투여 시간, 기간, 및 경로, 화합물의 흡수율, 분포, 대사, 및 배출, 다른 약물과의 조합, 만성 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 병리 또는 치료될 다른 질환 또는 장애의 심한 정도, 그리고 치료될 병리 또는 질환 상태의 반응성에 의존하며, 바람직한 유효성 수준이 획득될 수 있도록 쉽게 최적화될 수 있다. 치료 과정은 수일에서 수 주 또는 수 개월까지, 또는 질환 상태가 치유되거나, 질환 상태의 허용가능한 감퇴 또는 예방이 달성될 때까지 지속될 수 있다. 최적의 투약 일정은 치료 유효성과 관련하여 환자 신체의 면역반응을 측정하여 계산될 수 있다. 당업자는 최적 투약량, 투약 방법, 및 반복 속도를 쉽게 결정할 수 있다. 최적 투약량은 면역조절 폴리머 화합물의 효능에 따라 변할 수 있으며, 일반적으로는 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적이라고 판명된 ED₅₀ 값에 기초하여 추정될 수 있다. 만성 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 병리, 또는 치료될 다른 질환 또는 장애를 위한 본 발명 화합물의 유효량, 이들 화합물, 아고니스트를 함유하는 송달 비히클, 및 치료 프로토콜은 종래 수단에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 의학 또는 수의학 분야의 의사는 1차 또는 1차 세트의 대상자 또는 환자에서 낮은 용량으로 치료를 개시하고, 다음에 2차 또는 후속 대상자 또는 환자, 또는 2차 또는 후속 세트의 대상자 또는 환자에서는 투약량을 증가시키거나, 투약량을 체계적으로 변화시킬 수 있으며, 환자 또는 대상자에 대한 화합물의 효과를 모니터하고, 바람직한 치료 효과가 최대화되도록 투약 또는 치료 섭생을 조정할 수 있다. 투약 및 치료 섭생의 최적화에 관한 추가적인 논의는 Benet, et al., Goodman & Gilman's(1996, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman, et al., Eds., McGraw-Hill, New York, Chapter 1, pp. 3-27; 본원에 참고자료로 포함된다) 또는 Bauer(L. A. Bauer, 1999, in Pharmacotherapy, A Pathophysiologic Approach, 4th Edition, DiPiro, et al., Eds., Appleton & Lange, Stamford, Connecticut,, Chapter 3, pp. 21-43; 본원에 참고자료로 포함된다)에서 찾을 수 있다.

다양한 투여 경로가 이용 가능하다. 특정 방식의 선택은 선택된 화합물, 치료될 특정 상태, 및 치료 효능에 필요한 투약량에 의존할 것이다. 일반적으로 말해서 본 발명의 방법은 의학적으로 허용되는 어떤 투여 방식을 사용하여 실시될 수 있으며, 이것은 임상적으로 허용되지 않는 부작용을 일으키지 않고 효과적인 수준의 면역반응을 야기하는 어떤 방식을 의미한다. 바람직한 투여 방식은 비경구 경로이지만, 경구 경로도 사용될 수 있다. 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.

본 발명과 관련하여, 본원에서 사용된 용어 "치료", "치료적 사용", 또는 "치료 섭생"은 본 발명의 조성물의 투여에 따른 예방, 경감, 및 치료적 양상을 포함하는 의미이며, 만성 HPV 감염 또는 만성 HPV 감염에 관련된 병리 또는 치료될 다른 질환 또는 장애에 의해 야기된 질환 상태, 이상, 증상, 징후, 또는 장애를 치료하는, 또는 이와 관련된 증상, 징후, 이상, 또는 장애의 진행을 예방, 방해, 지연, 또는 역전시키는 본원에서 청구된 화합물 전체 및 어느 것의 사용을 포함한다. 따라서, 만성 HPV 감염 또는 HPV 감염에 관련된 병리, 또는 신체의 면역반응의 자극이 유리한 다른 질환 또는 장애와 관련된 바람직하지 않은 질환 상태, 증상, 이상, 징후, 또는 장애의 어떤 예방, 개선, 완화, 역전 또는 완전한 제거가 본 발명에 의해 포함된다.

본 발명의 취지에 있어서, 암 치료법에 적용될 때 용어 "치료하는", "치료" 등의 의미는 광범위하며, 이 분야에서 일반적으로 받아들여지는 광범한 여러 상이한 개념들을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용될 때 이 용어는, 제한되는 것은 아니지만, 진행중인 질환의 시간 연장; 종양 감소; 질환 완화; 고통 완화; 삶의 질의 개선; 삶의 연장; 통증, 호흡곤란, 식욕부진 및 체중감소, 피로, 허약, 우울 및 불안, 혼란 등과 같은 증상의 개선 또는 제어; 환자의 편안함의 향상 등을 포함한다. 개별적 목표라 해도 전체적으로는 질환을 치유할 수 있다.

본 발명의 HspE7은 비-신생물성, HPV-감염 세포, 또는 HPV 유도 질환 상태, 제한은 아니지만, 예를 들어 생식기 사마귀, 과다증식 상태, 바이러스 감염 세포, 만성 바이러스 감염 세포 등을 치료하는데 사용될 수 있다.

용어 "암"은 많은 정의를 가진다. 미국 암학회에 따르면, 암은 비정상 세포의 제어되지 않는 성장(및 때로는 전파)을 특징으로 하는 질환군이다. 대체로 단일 상태로서 언급되지만, 그것은 실제로 200 가지 이상의 상이한 질환들로 구성된다. 암성 성장물은 이러한 세포가 생명 기관의 정상 기능을 방해하거나, 또는 신체 전체에 전파되었을 때 필수 시스템을 손상시켜 죽음에 이를 수 있다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물 또는 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상자 또는 동물에 투여하는 것을 포함하는 방법으로 동물 또는 대상자에서 감수성 신생물을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물이 치료제로서 효과적일 수 있는 상이한 타입의 암들의 비제한적 예들은 다음과 같다: 암종, 예를 들어 중추신경계의 신생물, 예를 들어 다형성아교모세포종, 별아교세포종, 핍지교종, 뇌실막 및 맥락막총 종양, 송과체 종양, 신경세포종양, 속질모세포종, 신경집종, 수막종, 및 수막육종증; 눈의 신생물, 예를 들어 기저세포 암종, 편평세포 암종, 흑색종, 횡문근육종, 및 망막모세포종; 내분비선의 신생물, 예를 들어 뇌하수체 신생물, 갑상선 신생물, 부신피질 신생물, 신경내분비계 신생물, 위장관췌장내분비계 신생물, 및 생식선 신생물; 두경부의 신생물, 예를 들어 두경부암, 구강, 인두 및 후두의 신생물, 및 치원종양; 흉부의 신생물, 예를 들어 거대세포 폐암종, 소세포 폐암종, 비소세포 폐암종, 악성 중피종, 흉선종, 및 흉부의 원발성 배아세포 종양; 소화관의 신생물, 예를 들어 식도, 위, 간, 담낭, 외분비 췌장, 소장, 충수, 및 복막의 신생물, 결장 및 직장의 선암종, 및 항문의 신생물; 비뇨생식관의 신생물, 예를 들어 신장세포 암종, 신우, 요관, 방광, 요도, 전립선, 음경, 고환의 신생물; 및 여성 생식기, 예를 들어 외음부 및 질, 자궁경부의 신생물, 자궁 체부의 선암종, 난소암, 여성 생식기 육종, 및 유방 신생물; 피부의 신생물, 예를 들어 기저세포 암종, 편평세포 암종, 피부섬유육종, 메켈(Merkel) 세포 종양, 및 악성 흑색종; 뼈 및 연조직의 신생물, 예를 들어 골육종, 악성 피부섬유종, 연골육종, 유잉육종, 원시 신경외배엽 종양, 및 혈관육종; 조혈계의 신생물, 예를 들어 골수이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, HTLV-1 및 5 T-세포 백혈병/림프종, 만성 림프구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 및 비만세포 백혈병; 및 소아의 신생물, 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 신경모세포종, 뼈 종양, 횡문근육종, 림프종, 및 신장 종양.

PCT 특허출원 WO 99/07860은 HspE7의 제조 방법에 더하여 다양한 타입의 HPV와 만성 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 병리에 의해 야기되거나 관련된 병리들 중 일부에 대한 비제한적 논의를 제공한다. 본 발명의 화합물이 치료제로서 효과적일 수 있는 상이한 타입의 만성 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 병리의 다른 (비제한적) 예들로는 자궁경부 상피내종양(예를 들어, HPV 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39), 보웬양 구진증(예를 들어, HPV 타입 16, 18, 33, 39), 부쉬케-로웬스타인 (Buschke-Lowenstein) 종양(예를 들어, HPV 타입 6, 11), 푸주한/육가공자 사마귀(예를 들어, HPV 타입 7), 피부 편평세포 암종(예를 들어, HPV 타입 38, 41, 48), 사마귀표피형성이상(예를 들어, HPV 타입 1-5, 7-9, 10, 12, 14, 15, 17-20, 23-25, 36, 47, 50), 각질가시세포종(예를 들어, HPV 타입 77), 구강 국소 상피증식 (Heck 병)(예를 들어, HPV 타입 13, 32), 신장이식 환자의 사마귀(예를 들어, HPV 타입 75-77), 보통 사마귀(심상성 사마귀), 사상 사마귀, 편평 사마귀, 발바닥, 손바닥 또는 모자이크 사마귀, 손톱주위 사마귀, 불응성 사마귀, 외음부 사마귀, 콘딜로마, 첨규 콘딜로마, 성병성 사마귀, 피부 유두종 질환, 편평세포 유두종, 이행세포 유두종(방광 유두종) 등이 있다.

특정 치료 섭생은 특정 만성 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 병리 또는 치료될 다른 질환 또는 장애의 성질, 심한 정도, 및 전체적 환자 상태에 따라서 변화할 수 있는 시간 기간 동안 지속될 수 있으며, 수일, 수 주, 수 개월 또는 그 이상 동안 화합물-함유 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 치료 후, 환자는 환자 상태의 변화와 장애 또는 질환 상태의 증상, 징후, 또는 이상상태의 개선에 대해서 모니터된다. 조성물의 투약량은 환자가 현재 투약량 수준에 유의하게 반응하지 않는 경우 증가될 수 있으며, 또는 1회분 용량은 장애 또는 질환 상태의 증상의 개선이 관찰되거나, 또는 장애 또는 질환 상태가 제거된 경우 감소될 수 있다.

최적 투약 일정을 이용하여 본 발명의 화합물의 치료적 유효량을 송달한다. 본 발명의 취지에 있어서, 본원에 개시된 화합물과 관련하여 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은, 바람직하게는 독성, 자극 또는 알레르기 반응과 같은 바람직하지 않은 부작용 없이 의도된 목적으로 달성하는데 효과적인 화합물의 양을 말한다. 개별 환자의 요구가 다를 수 있지만, 제약 조성물의 유효량의 최적 범위의 결정은 본 분야의 기술범위 내이다. 인체의 1회분 용량은 동물 연구로부터 추정될 수 있다 (A.S. Katocs, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., (1995), Chapter 30; 본원에 참고자료로 포함된다). 일반적으로, 당업자에 의해 조정될 수 있는, 제약 조성물의 치료적 유효량을 제공하기 위해 필요한 투약량은 수혜자의 나이, 건강, 신체 상태, 체중, 질환 또는 장애의 종류 및 정도, 치료 빈도, 동시 요법의 성질, 및 바람직한 효과의 성질 및 범위에 따라 다를 것이다.

본 발명의 어떤 구체예에서, 치료 섭생이라고도 하는 투약 일정은 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일 또는 그 이상에 걸쳐 본원에 설명된 조성물의 유효량의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 4일의 투약 일정(이 경우, 0일(0)이 투약 개시일이다)에 대해서 1회분 용량은 매일, 또는 날짜 간격을 두고, 또는 이들을 조합하여 투여될 수 있다. 어떤 예에서, 투약 일정은 0일 및 1일; 0일 및 2일; 0일 및 3일; 0일 및 4일; 0일, 1일 및 2일; 0일, 1일 및 3일; 0일, 1일 및 4일; 0일, 2일 및 3일; 0일, 2일 및 3일; 0일, 2일 및 4일; 0일, 3일 및 4일; 등의 투여를 포함한다.

다른 구체예에서, 투약 일정은 연속적인 것, 예를 들어 피부 패치 또는 임플란트에 의해 투여되는 서방 조제형인 것이 효과적일 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 정제된 HspE7, 면역자극제 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 제공된다. 면역자극제는 CpG-함유 올리고뉴클레오티드, TLR3 아고니스트, 예를 들어 PolyI:C 또는 polyICLC, 모노-포스포릴-리피드 A(MPL), MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM) 및 항-CD40를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 뉴클레오시드, 뉴클레오시드간 결합 및 본원에 설명된 조성물 중 어느 것을 갖는 polyI:C 핵산을 포함한다. 키트는 1회용 장치, 예를 들어 패치, 임플란트 또는 주사기에 미리 패키지된 정제된 HspE7과 면역자극제의 1회-투약 조제형을 제공할 수 있다. 또는 달리, 키트는 약학 또는 의사 또는 다른 적합한 사람에 의한 투여의 관점에서 1회-투약 단위로 나눠져 있을 수 있는 멀티-용량 조제형을 제공할 수 있다.

본 발명은 분자생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액 중 펩티드 합성, 고체상 펩티드 합성, 및 면역학의 종래 기술을 사용한다. 이러한 과정은, 예를 들어 참고자료로 포함되는 다음 교과서들에 설명된다.

1. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), whole of Vols I, II, and III;

2. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, including Gait, pp. 1-22; Atkinson et al., pp. 35-81; Sproat et al., pp. 83- 115; and Wu et al., pp. 135-151;

3. Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R.W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970;

4. Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, whole of text;

5. J. F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactive, Germany); 6. Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp.1-284, Academic Press, New York;

7. Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer- Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg;

8. Handbook of Experimental Immunology, Vols. 1-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications.

본 발명은 다음 실시예에서 더 예시될 것이다.

실시예 1: HspE7 제조

Hsp65-E7 융합체(HspE7)를 WO 99/07860(본원에 참고자료로 포함됨)에 설명된 대로 얻었다. HspE7은 Hsp65 유전자(pET65H)의 카르복시-말단 단부에 삽입된 완전 HPV16 E7-코딩 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 이 HspE7을 프로세스 A HspE7이라고 하며, Nventa Biopharmaceuticals Corporation에 요청하여 입수할 수 있다.

사용 전에, HspE7을 95% 이상의 순도로 정제한다. HspE7 발현 E. coli의 파종 배양물을 250L 발효 배지에 접종했다. 발효 과정 동안 효모 추출물과 글루코오스를 영양물로서 첨가하고, 순수한 산소를 발효 용기에 불어넣어 충분한 폭기를 공급했다. IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 HspE7의 발현을 유도했다. 다음에, 발효장치의 내용물을 < 20℃까지 냉각하고, 원심분리하여 세포 페이스트를 수집했다. 세포 페이스트를 유레아와 술피톨리시스(sulfitolysis) 시약을 함유하는 버퍼 중에 재현탁했다. 술피톨리시스 시약은 HspE7에 있는 술프히드릴기를 S-술포시스테인으로 전환시켰다. HspE7 용액을 PEI(폴리에틸렌이민)으로 침전시켜 정화시킨 후, 그 산물을 해당 pI에서 침전시켰다. 다음에, HspE7을 일련의 양이온 및 음이온-교환 크로마토그래피 단계를 사용하여 균질하게 정제하고, 변형된 술프히드릴을 DTT(디티오트레이톨)로 환원시켰다. 마지막으로, HspE7을 한외여과 및 히스티딘/만니톨 버퍼 투석을 행하고, -70℃에 저장했다. 정제된 형태의 HspE7를 프로세스 L HspE7로 명명한다. HspE7의 순도를 겔 전기영동에 의해 측정했다.

하기 개략된 대로, 고순도 프로세스 L HspE7은 저순도(프로세스 A HspE7) 산물과 비교하여 생물학적 활성을 손실한 것이 관찰되었다. 저순도 HspE7 산물(프로세스 A HspE7)은 WO 99/07860에 개시된 대로의 생물학적 활성을 나타냈다.

실시예 2: HspE7 제제의 생물학적 활성 측정

IFN -감마의 비장세포 생산에 대한 항원-특이적 자극: ELISPOT 분석

E7-특이적 CD8-양성 T 림프구(IFN-감마 생산 세포)를 유도하는 HspE7의 능력 의 증대를 ELISPOT(Asai, T., et al., 2000, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7(2): 145-154)에 의해 E7 펩티드의 존재하에 다음과 같이 측정했다: 총 부피 200ul로 보조제와 함께 또는 보조제 없이 HspE7로 마우스를 목덜미에 피하 면역화했다. 5 내지 7일 후 마우스를 죽이고, 이들의 비장을 제거하여 단일 세포 현탁액으로 처리했다. 세포를 완전 RPMI 중에서 항-마우스 IFN-감마 항체로 먼저 코팅해둔 밀리포어 필터 플레이트 위에 평판했다. 플레이트를 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 세포를 세척하고, 플레이트를 비오틴화 2차 항-마우스 IFN-감마 항체와 함께 인큐베이션하여 IFN-감파 스폿을 검출했다. Vectastain ABC Elite 키트와 AEC 기질을 사용하여 스폿을 시각화했다. Zeiss 자동 ELISPOT 계수기에서 스폿을 계수했다.

종양 퇴화 분석

HPV16 E6 및 E7 암유전자로 안정하게 트랜스펙트된 폐 상피 종양인 종양 셀라인 TC-1.K를 포함하는 분석에 의해 종양 퇴화를 측정했다. TC-1.K 세포를 마우스에 이식한 다음, 7일 후에 시험 샘플을 주사하고, 이후 규칙적으로 종양을 촉진했다. 이 분석은 본질적으로 Chu, N.R., et al.(Chu, N.R., et. al., 2000, Clin Exp Immunol 121 (2):216-225)에 설명된 대로, TC-1.K 종양 세포를 파종 배양하여 세포 수를 늘린 다음, 7-14주령 C57BL/6 마우스에 이식하는 것을 포함한다. 종양 이식 7일 후에 종양을 지닌 마우스를 시험 샘플 및 대조군 샘플로 처치했다. 전형적으로 180마리 마우스 군을 6개의 동일한 군으로 나누고, 각 군에 대조군(비히클만), 또는 50, 100, 200, 400 또는 800㎍의 HspE7 기준 샘플을 주사했다. 14, 28 및 49일에 마우스에서 종양을 촉진했다.

도 1에 나타낸 대로, 프로세스 A HspE7의 항-종양 활성은 프로세스 L HspE7보다 높으며, 프로세스 L HspE7의 유사 용량과 비교하여 더 낮은 용량에서 동일한 또는 감소된 종양 발생을 달성한다. 이 분석을 위하여, 확립된 TC-1 종양을 보유한 마우스의 목덜미에 프로세스 A 또는 프로세스 L에 의해 생산된 HspE7의 등급화된 용량을 피하 주사하고(n = 30/군/용량), 49일간 종양 성장을 추적했다.

실시예 3: HspE7 에 대한 TLR9 아고니스트 CpG 의 효과

E7-특이적 CD8-양성 T 림프구를 유도하는 HspE7의 능력의 증대를 CpG 올리고뉴클레오티드(TLR9 아고니스트)의 존재하에 측정했다. 실시예 2에 설명된 대로, 두 상이한 정제 과정에 의해 생산된 HspE7(400ug 프로세스 A HspE7 또는 400ug 프로세스 L HspE7)을 단독으로, 또는 HspE7(400ug 프로세스 A HspE7 또는 400ug 프로세스 L HspE7)과 30ug CpG(TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT; SEQ ID NO:1; Invitrogen에서 입수가능함, 포스포로티오에이트 백본을 포함하며, ZOO FZE FOE ZZO OZE FZE OT로 명명된다)를 함께 나이브 C57B1/6 마우스에 피하 주사했다. 5일 후 마우스로부터 비장을 제거하고, 리콜 항원으로서 E7-특이적 클래스 I MHC 결합 펩티드 E7(49-57) (RAHYNIVTF; Dalton Chemical Laboratories), 또는 대조군 펩티드 HBCAg(93-100) (MGLKFRQL; Dalton Chemical Laboratories)를 사용하여 ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다.

도 2에 나타낸 결과는 정제된 HspE7(프로세스 L HspE7)이 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구를 소량 유도함을 나타낸다. 프로세스 A HspE7은 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구를 더욱 많이 유도한다. 그러나, 프로세스 L HspE7과 프로세스 A HspE7의 유도는 모두 TLR9 아고니스트 CpG(프로세스 A HspE7 + CpG 또는 프로세스 L HspE7 + CpG)의 존재하에 3 내지 100배 증진된다.

1668을 포함하여, 최적 뮤린 클래스 B 타입 코어 서열(GACGTT)을 가진 몇몇 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 ELISPOT 분석 및 TC-1 종양 퇴화 분석에서 HspE7의 활성을 증대시키는데 매우 활성인 것으로 나타났다(데이터 나타내지 않음). 유사하게, CpG 클래스 C 타입 올리고뉴클레오티드(2395)도 매우 활성인 것으로 판명되었다. 그러나, 클래스 A 타입 CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 ELISPOT 분석에서 HspE7의 활성을 증대시키는데 훨씬 덜 효과적인 것으로 판명되었다(Vollmer J., et al., 2004, Eur. J. Immunol. 34:251-262 참조).

이들 데이터는 정제된 HspE7이 생물학적으로 활성이며, HspE7(프로세스 A 또는 프로세스 L HspE7)의 생물학적 활성이 면역자극제인 CpG를 첨가함으로써 증가될 수 있음을 증명한다.

실시예 4: HspE7 에 대한 추가 TLR 아고니스트들의 효과

E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 HspE7(프로세스 L HspE7) 유도를 증대시키는 다른 TLR 아고니스트들의 능력을 TLR3 아고니스트 PolyI:C(Sigma Cat #P1913), 및 TLR2 아고니스트 PAM3CysSK4(Invivogen Cat# TLR1-pms) 및 TLR9 아고니스트 CpG(실시예 3 참조)를 사용하여 측정했다.

마우스에 HspE7과 TLR-아고니스트의 혼합물을 피하 주사했다. 이 연구를 위하여, 프로세스 L HspE7 50ug를 10ug CpG, 20ug Pam3CysSK4 또는 100ug PolyI:C와 함께 주사했다. 5일 후 마우스로부터 비장을 제거하고, 리콜 항원으로서 E7-특이 적 클래스 I MHC 결합 펩티드 E7(49-57) 또는 대조군 펩티드 HBCAg(93-100)을 사용하여 ELISPOT(실시예 3에 개략된 대로)에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 결과를 도 3에 나타낸다.

도 3에서 볼 수 있는 대로, HspE7과 CpG의 동시-주사는 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 현저한 증대를 가져온다. 또한, TLR3 아고니스트 PolyI:C의 동시-투여에서도 유사한 증가가 관찰된다. 그러나, TLR2 아고니스트 Pam3CysSK4은 IFN-감마 생산 세포의 증대에 있어 무시할 만한 결과를 가져왔다.

이들 결과는 Pam3CysSK4를 제외한 CpG 및 PolyI:C가 정제된 HspE7(프로세스 L HspE7)을 증대시키는데 효과적이며, 모든 보조제가 정제된 HspE7의 생물학적 활성을 증대시키는데 효과적이지는 않음을 시사한다. 추가 실험(도 4 및 5)은 정제된 HspE7과 PolyICLC(Oncovir, 3203 Cleveland Ave NW, Washington DC) 또는 MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM; Ribi ImminoChem Research Inc.; Oiso R., et al., Microb Pathog. 2005, Jul-Aug; 39(1-2):35-43 참조)의 혼합이 정제된 Hsp E7(즉, 95% 이상 순수한)의 면역학적 활성을 증대시키는데 또한 효과적이었음을 증명한다. 도 5에서, HspE7의 면역학적 활성의 증대는 면역자극제의 1000배 양에 걸쳐 검지될 수 있으며, 0.1ug PolyICLC에서 100ug PolyICLC까지 활성의 증대가 관찰된다.

실시예 5: HspE7 의 항-종양 활성

항-종양 활성에 대한 정제된 HspE7 제제의 효과를 실시예 3에 개략된 방법을 사용하여 시험했다. 데이터는 정제된 HspE7과 CpG 또는 PolyI:C의 조합이 정제된 HspE7(프로세스 L HspE7)만 사용한 것과 비교하여 항-종양 효능을 현저히 증가시킨다는 것을 나타낸다.

마우스의 옆구리에 6x10⁴ TC-1 종양 세포를 주사했다. 7일째에 확립된 TC-1 종양을 보유한 마우스의 목덜미에 희석제, 정제된 HspE7을 단독으로(실시예 1과 같이 제조; 프로세스 L); 순도 95% 미만의 HspE7(도 6); 또는 상이한 용량의 CpG(n = 30/군) 또는 PolyI:C(n = 20/군; 도 7)과 혼합된 정제된 HspE7의 등급화된 용량을 피하 주사했다. 추가 42일간 마우스에서 종양 성장을 추적했다. 종양 이식 후 49일째에 종양이 없는 마우스를 종양이 없는 것으로 간주했다. 희석제만 주사한 마우스는 49일째에 100%에서 종양이 나타났다. 선행 연구는 CpG 단독, 또는 PolyI:C 단독 사용은 종양 성장에 영향을 미치지 않음을 증명했다(데이터 나타내지 않음).

HspE7과 CpG의 동시-투여 결과를 도 6에 나타내고, HspE7과 PolyI:C의 동시-투여 결과를 도 7에 나타낸다.

도 6을 참조하면, 순도 95% 미만의 HspE7의 투여는 50 내지 800ug(HspE7 및 평균 HspE7 이력)의 용량 범위에 걸쳐서 종양 활성을 감소시켰고, 고 용량(800ug) HspE7("이력")에서는 약 15%의 종양 발생이 관찰되었다. 그러나, 정제된 HspE7과 CpG의 동시-주사는 종양 발생을 극적으로 감소시켰고, 약 25 내지 약 200ug HspE7의 용량은 종양 발생이 5% 미만이었다. 프로세스 B HspE7 400ug로 처치한 마우스에서는 약 27%가 이력 데이터로부터 예상될 수 있는 대로 49일째에 종양을 나타냈다. 그러나, 3ug의 CpG와 혼합하여 프로세스 L HspE7을 25ug 만큼 적은 양 주사한 마우스에서는 90%가 종양이 완전히 제거되었다.

도 7을 참조하면, 정제된 HspE7(순도 95% 이상; 프로세스 L HspE7)의 투여는 800ug(HspE7) 이하의 용량 범위에 걸쳐 종양 활성을 감소시키는데 있어서 순도 95%의 HspE7 만큼 효능 있지 않았으며, 고 용량(800ug) HspE7에서도 약 50%의 종양 발생이 관찰되었다. 그러나, 정제된 HspE7과 100ug PolyI:C의 동시-주사는 약 200ug의 HspE7 용량에서 종양 발생을 극적으로 감소시켜, 종양 발생이 5% 미만이었다.

이들 데이터는 정제된 HspE7이 항-종양 활성을 나타내며, 활성은 CpG와 같은 TLR9 아고니스트, 또는 TLR3 아고니스트인 PolyI:C와 함께 투여되었을 때 약 5 내지 약 80배가 증가됨을 증명한다.

실시예 6: HspE7 활성에 대한 종래 보조제의 효과

E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 정제된 HspE7 유도를 증대시키는 명반, 또는 불완전 프레운드 보조제(IFA)와 같은 종래 보조제의 능력을 측정했다.

마우스에 정제된 HspE7(400ug 프로세스 L HspE7; 프로세스 L)을 피하 주사하거나, 또는 명반(Pierce)과 1:1 혼합된, 또는 IFA(Bacto)와 1:1 혼합된 30ug CpG, 또는 명반 + 30ug CpG, 또는 IFA + 30ug CpG와 정제된 HspE7(400ug)를 함께 동시-주사했다. 5일 후 마우스로부터 비장을 제거하고, 리콜 항원으로서 E7-특이적 클래스 I MHC 결합 펩티드 E7(49-57)(16.E7.49-57.Db) 또는 대조군 펩티드 HBCAg(93-100)을 사용하여 ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 결과를 도 8에 나타낸다.

실시예 3 및 4에 제시된 결과와 일치하여, 정제된 HspE7(프로세스 L HspE7) 의 단독 주사는 비장세포에 의한 IFN-감마의 생산을 증대시키지 않았지만, HspE7과 CpG(프로세스 L HspE7 + CpG)의 동시-주사는 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 현저한 증대(10배 이상)를 가져왔다(도 8). 그러나, 정제된 HspE7과 IFA(프로세스 L HspE7 + IFA) 또는 명반(프로세스 L HspE7 + 명반)의 동시-주사는 E7-특이적 T 림프구의 자극을 인식할 수 있을 정도로 증대시키지 않았으며, 이것은 정제된 HspE7의 단독 투여의 효과와 일치한다.

정제된 HspE7을 CpG 및 명반(프로세스 L HspE7 + 명반 + CpG) 또는 IFA(프로세스 L HspE7 + IFA + CpG)과 함께 동시-투여하면, HspE7과 CpG(프로세스 L HspE7 + CpG)의 동시-주사에서 관찰된 증대와 유사하게 E7-특이적 T 림프구의 자극이 증대되었다. 이 데이터는 IFA와 명반이 HspE7의 억제 또는 자극에 있어서 중성이며, CpG가 명반 또는 IFA의 존재 여부와 무관하게 HspE7의 활성 증대에 대해 유사한 효과를 가진다는 것을 증명한다.

이들 데이터는 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 유도가 정제된 HspE7과 잘 알려진 보조제인 명반이나 불완전 프레운드 보조제(IFA)의 혼합에 의해서는 증대되지 않는다는 것을 나타낸다. 더 나아가, 이들 결과는 명반 및 불완전 프레운드 보조제를 포함하여, 모든 보조제가 정제된 HspE7의 생물학적 활성의 증대에 효과적이지는 않음을 증명한다.

실시예 7: HspE7 활성에 대한 추가 TLR 아고니스트들의 효과

이 실시예에서는 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 정제된 HspE7 유도를 증대시키는 Imiquimod, LPS, Pam3CysSK4, 또는 항-CD40의 효과를 측정했다.

마우스에 정제된 HspE7(400ug 프로세스 L HspE7; 프로세스 L), 또는 정제된 HspE7(400ug)와 1OOug Imiquimod(Invivogen # TLRL-IMQ), 30ug LPS(Sigma), 25ug Pam3CysSK4(Invivogen Cat# TLR1-pms), 25ug 항-CD40(R&D Systems; 클론 No.IC1O), 또는 30ug CpG의 혼합물을 피하 주사했다. 5일 후 마우스로부터 비장을 제거하고, E7-특이적 클래스 I MHC 결합 펩티드 E7(49-57)을 사용하여 ELISPOT에 의해 E7-특이적 비장세포의 수를 측정했다. 결과를 도 9에 나타낸다.

정제된 HspE7과 Imiquimod(TLR7 아고니스트), PAM3CysSK4(TLR2 아고니스트) 또는 LPS(TLR4 아고니스트)의 주 1회 동시-투여는 E7-특이적 T 림프구를 유도하는 정제된 HspE7의 능력을 증대시켰다(도 9). 그러나, HspE7에 항-CD40 또는 CpG를 첨가했을 때도 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 생성의 자극이 관찰되었다.

HspE7에 Imiquimod(TLR7 아고니스트), PAM3CysSK4(TLR2 아고니스트) 및 LPS (TLR4 아고니스트)를 첨가하여 IFN-감마 분비 세포의 수가 단지 약간 증가된 것이 관찰된 대로, 이들 결과는 또한 모든 TLR 아고니스트가 E7-특이적 CD8-양성 T 림프구의 생산을 증대시키는데 효과적이지는 않음을 증명한다.

실시예 8: 1일 1회 주사 일정

HspE7과 PolyICLC를 사용하여 마우스에서 CD8+ T 세포 반응을 도출하는 1일 1회 주사 섭생의 유용성을 평가했다. C57B1/6 마우스(군 당 2마리)를 1일 간격으로 HspE7(100ug)와 PolyICLC(10ug)로 1일 1회 최대 4일까지 면역화했다. 항원에 최초 노출하고 7일 후에 모든 동물을 안락사시키고, 이들의 비장세포를 채취하여 분석했다. IFN-감마 ELISPOT를 사용하여 16E7.49-57.Db 펩티드로의 자극에 대한 클 래스 I-제한 CD8+ T 세포 반응을 평가했다.

HspE7 + PolyICLC를 여러 번 주사한 군에서는 1회 주사한 군과 비교하여 반응 빈도에서 측정가능한 증가가 나타났다.

1일 1회 주사의 회수 증가는 반응 빈도의 증가와 상호관련된다. 최대 회수의 1일 1회 주사를 받은 군은 반응 빈도에 최대 증가를 나타냈다(도 10).

1일 1회 주사 전략의 사용은 다른 CoVal™ 항원과 조합하여, 또는 비-CoVal™ 항원과 조합하여 PolyICLC를 사용했을 때 증가된 CD8+ T 세포 반응을 도출하는데 있어서 유용성을 제공해야 한다. 추가하여, 이 전략은 매주 또는 2주 간격으로 재-시험감염시 후속 면역반응을 높이는 증가된 능력을 가질 수 있는 더 큰 CD8+ 메모리 풀을 가져올 수 있다.

실시예 9: HspE7 + PolyICLC 로의 면역화에 대한 체액 반응

PolyICLC는 항원에 대한 세포 면역반응 및 체액 면역반응을 모두 증대시키는 것으로 증명되었다. 체액 면역에 대한 HspE7 + PolyICLC의 동시-면역화의 효과를 조사하기 위해 C57B1/6 암컷 마우스 군(n=5/군)을 1개월 간격(1일, 28일)으로 2번 면역화했다. 버퍼, 500㎍ HspE7, 12.5㎍ PolyICLC, 500㎍ HspE7 + 1.25㎍ PolyIC LC, 500㎍ HspE7 + 12.5㎍ PolyICLC 또는 500㎍ HspE7 + 125㎍ PolyICLC로 마우스 군을 면역화했다. 투약 7일 전(d-7, 베이스라인)과 21일, 49일 및 77일에 혈청 항체 분석용 혈액 샘플을 채취했다. 표준 ELISA에 의해 각 마우스로부터의 혈청을 E7 및 HspE7에 대한 항체(IgG1, IgG2b 및 IgG2c)의 존재에 대해 시험했다. 간단히 말해서, 96-웰 플레이트를 E7 또는 HspE7로 하룻밤 코팅한 다음 세척하고 1.5% BSA 용액으로 차단했다. BAS 용액 중에 혈청의 50 희석액을 1로 시작하여 2배 연속 희석하여 각 웰에 혈청을 첨가했다. 세척 후에 적합한 면역글로빈 이소타입에 대한 비오틴 콘쥬게이트 항체와 함께 인큐베이션하여, HspE7(도 11B, D, F) 또는 E7(도 11A, C, E) 항원에 대한 결합된 IgG1(도 11A, B), IgG2b(도 11C, D) 또는 IgG2c(도 11E, F) 항체를 검출했다. 다음에, 플레이트를 세척하고, 스트렙토아비딘 콘쥬게이트 양고추냉이 퍼옥시다제와 함께 인큐베이션했다. 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질을 사용하여 색을 전개시키고, 자동 ELISA 플레이트 리더에서 450nm에서 착색 산물을 판독했다. 도 11의 데이터는 분석 플레이트 바탕값(0.2 OD 단위로서 정의됨)보다 큰 흡광도를 제공하는 최고 혈청 희석으로서 표현된다.

HspE7을 단독으로 사용한 면역화는 HspE7 및 E7 모두에 대한 유의한 항체 반응을 야기했는데, 항-HspE7 반응은 1회 주사 후 나타난 반면, 항-E7 반응은 1회 주사 후에는 약했고, 2번 면역화 후에야 더욱 완전히 전개되었다. 두 경우 모두 생산된 항체의 이소타입은 IgG1이 우세했는데(도 11A, B), 이는 Th2 이동된 체액 반응을 시사한다. PolyICLC를 단독으로 사용한 면역화는 E7 또는 HspE7에 대한 항체 반응을 야기하지 않았다. HspE7 + PolyICLC로의 면역화는 더 강하며 더욱 빨리 전개되는 항체 반응을 가져왔다. 이것은 E7의 경우 가장 뚜렷했는데, 이때 면역반응은 Poly ICLC와 HspE7로 동시-면역화했을 때 1회 주사 후 두드러졌다. 또한, Th1 체액 반응이 상당히 더 컸는데, 그 결과 IgG2b&c(도 11C-F) 항체 이소타입이 증가된 비율로 생산되었다. 이 반응은 용량 의존적이었으며, 더 높은 PolyICLC 용량에서 더욱 현저했다. HspE7과 PolyICLC를 동시-주사했을 때 면역반응의 증가된 Th1 이동은 ELISPOT에 의해 관찰된 IFN-감마 생산 CD8-양성 T 림프구의 증가된 크기와 일치한다.

실시예 10: HspE7 과 PolyICLC 의 용량 범위

HspE7과 함께 송달되었을 때 TLR3 아고니스트가 E7-특이적 CD8 T 세포의 교차-프라이밍을 촉진할 수 있는 용량 범위를 조사했다. 도 12에 나타낸 대로, 본 출원인은 HspE7과 TLR3 아고니스트 PolyICLC로의 마우스 면역화가 IFN-감마 ELISPOT에 의해 측정했을 때 E7(49-57)-특이적 T 세포를 도출하는데 매우 효과적이었음을 관찰했다. 도출된 E7(49-57)-특이적 세포의 수는 사용된 PolyICLC 보조제의 용량에 의존적이었으며, 아주 낮은 용량(0.1ug PolyICLC)에서도 HspE7의 교차-프라이밍을 증대시킬 수 있었다.

실시예 11: HspE7 + PolyICLC 의 연속 1일 1회 투약에 의한 확립된 거대 종양의 퇴화

E7-발현 TC-1 종양 셀라인은 E7-통제 백신접종 전략의 유효성을 평가하기 위해 널리 사용되는 공격적이며, 빠르게 성장하는 종양 모델이다. 일반적으로 마우스에 TC-1 종양 셀라인을 10⁵ 내지 10⁶ 세포 이식하고, 7 내지 14일 후 일단 종양이 촉진되면 관심의 제제로 처치한다. 이 종양 모델에는 치료 창이 있는데, 이 시기 이후에는 항원-특이적 T 세포의 클론 확장보다 종양의 성장이 너무 빨라서 이미 종양 부담이 압도적으로 되어 종양이 극복될 수 없기 때문에 면역학적 개입이 더 이상 유용하지 않다.

이들 실험에 사용된 TC-1 종양 모델 시스템을 더 진행된 종양으로 전개시켰다. 도 13에 예시된 대로, TC-1 종양을 종래대로 7 내지 14일이 아니라 치료 전에 28일 동안 생체내에서 성장시켰다. 이 시점에서 평균 종양 크기는 더 큰 범위였으며, 모든 동물에서 종양이 촉진되었고, 일부 동물은 2000㎣를 초과하는 부피의 종양을 가졌다. 주목할 점은 4일 연속하여 매일 HspE7 + polyICLC로 피하 면역화된 마우스에서는 이런 매우 크고 확립된 종양이 일반적으로 4일 연속 1일 1회 투약하는 면역화 섭생을 시작하고 1주일 이내에 퇴화되기 시작했다는 것이다. 치료 기간 동안에는 종양 부피를 매일 측정했고, 이후 2-3일마다 측정했다. 전자 디지털 캘리퍼(Fowler Sylvac Ultra-Cal Mark III)를 사용하여 종양을 측정했고, 폭² x 길이 x 0.5로 계산했다. 종양은 대부분의 마우스(9마리 중 7마리)에서 치료 후 17일 동안 계속 퇴화되었다. 종양이 재출현한 마우스에서는 단지 이스케이프 변이체만 나타났으며, E7(49-57) 에피토프는 더 이상 발현되지 않았다(데이터 나타내지 않음). 버퍼, HspE7 단백질 또는 polyICLC 보조제만을 단독으로 4일 연속 1일 1회 투약한 마우스는 이런 거대 종양의 퇴화를 나타내지 않았다.

실시예 12: CD8 반응의 확장기 동안 반복 면역화의 증강 효과

마우스를 1일, 2일, 3일 또는 4일 연속하여 HspE7 + PolyICLC로 면역화했을 때, 도출된 E7(49-57)-특이적 T 세포의 수준은 각 연속 1일 1회 면역화 후 극적인 증가를 나타냈다(도 15A). 100ug HspE7 + 10ug polyICLC로 4일 연속 1일 1회 면역화한 후, E7(49-57)로의 자극에 반응하여 생체외에서 직접 IFN-감마를 생산하는 세 포의 수는 10⁶ 비장세포 당 10,000개에 근접했다. 실제로 정확한 IFN-감마 ELISPOT 정량을 위해 면역 동물로부터의 비장세포를 나이브 동물로부터의 비장세포로 1:16으로 희석하여 스폿을 자동 ELISPOT 리더에 의해 "계수가능한" 수까지 감소시켜야 했다. 이것은 HspE7 + PolyICLC을 1회 투약한 동물에서 관찰된 항원-특이적 세포의 수의 약 10배이다. 더욱 놀라운 것은 항원-특이적 세포의 이런 매우 높은 수에 마지막 면역화 후 3일 이내에 도달했다는 점이다(모든 마우스 군은 최초 면역화 7일 후에 분석했다). 4번의 연속 면역화가 단순히 마우스를 노출시킨 항원 양에 있어서의 추가 증가를 나타내지는 것은 아니었으며, 1회분 용량에 존재하는 항원/보조제의 양의 4배를 함유한 양으로 1회 면역화한 마우스는 E7(49-57)-특이적 T 세포 수의 증가를 나타내기는 했지만, 4회 연속 면역화한 마우스에서 관찰된 E7(49-57)-특이적 T 세포의 수보다는 여전히 훨씬 아래였다(도 15A). 또한, E7(49-57)-특이적 T 세포는 H-2Db/E7(49-57) 펜타머 시약을 사용한 유세포분석에 의해서 쉽게 검출할 수 있었다(도 15B). HspE7 + polyICLC로 4일 연속 1일 1회 면역화한 후, 일부 동물에서 E7(49-57)-특이적 T 세포 수는 CD8+ 비장세포의 총 수의 2.9%에 달했다. ELISPOT에 비해 MHC 클래스 I 펜타머 시약에 의한 E7-특이적 T 세포의 유세포분석 정량은 항원-특이적 세포의 수를 다수 과소평가했는데, 이것은 특히 4회 연속 면역화의 마지막 면역화 후 단지 3일 후에 유세포 분석이 수행되었기 때문으로 인한 항원-특이적 T 세포상의 표면 TCR의 하향-조절을 반영하는 것 같다. 실제로 도 5B에 나타낸 유세포분석 데이터의 면밀한 조사는 H-2D^b/E7(49-57) 펜타머-음성이며, 나이브 마우스와 비교하여 4일 연속 1일 1회 면역화한 마우스에서 CD44 활성화 마커를 발현하는 CD8+ 세포의 수가 훨씬 더 많다는 것을 확인한다. 활성화된 표현형을 가진 이들 CD8+ 세포는 이들의 생체내 활성화 상태의 결과로서 이들의 표면 TCR이 하향-조절된 항원-특이적 세포에 상응하는 것 같다. 게다가, 본 출원인은 또한 여러 번의 연속 1일 1회 면역화가 후속 면역반응의 지속기간에 유의한 영향을 미치는지 평가하기 위해 면역반응의 수축기를 분석했다. 도 15C에 나타낸 대로, 면역화 7일 후에 관찰된 최고 면역반응에는 큰 차이가 있었지만, E7-특이적 CD8+ 세포의 수는 1일에서 4일까지 연속 면역화의 회수와 무관하게 모든 마우스에서 면역화 후 13일까지 현저한 수축을 나타냈다. 그러나, E7-특이적 CD8+ 세포는 면역화 후 13일째에 ELISPOT에 의해 여전히 쉽게 검출가능했으며, 더 중요하게는 1차 반응의 최고점에서 더 많은 항원-특이적 T 세포의 수는 13일째에 관찰된 C7-특이적 CD8+ 세포의 잔류한 수와 상호관련됨을 주지하여야 한다.

후속 1차 CD8 T 세포 반응의 증대와 관련하여 반응의 확장기에 1차와 2차 주사 사이의 간격을 변화시키면서 2번 주사한 효과를 조사했다. 연구하는 동안에 간격을 변화시키면서 비장을 수집하여 후속 반응의 반응속도를 조사했다. HspE7 + PolyICLC의 1회 주사를 받은 마우스는 면역화 5일 후에 쉽게 검출가능한 반응을 나타냈으며, 이것은 이어서 면역화 후 7일째에 최고점에 이르렀다(도 14A). 이 반응은 9일까지 감퇴했으며, 본질적으로 11일까지 낮지만 (안정하고) 쉽게 검출가능한 수준까지 약화되었다. 반면에, 0일에 HspE7 + polyICLC로 1차 면역화한 다음, 2일에 동일하게 2차 면역화한 마우스는 1회 면역화한 마우스에서 도출된 것보다 훨씬 강한 반응을 나타냈다. 1회 면역화한 마우스에서 관찰된 대로, CD8 T 세포 반응은 7일째에 최대였지만, 항원-특이적 세포의 수는 전체적으로 상당히 더 높았다. 더욱이, 항원-특이적 세포 수는 9일째까지 하강했지만, 이 시점에 존재하는 항원-특이적 세포의 전체 수는 1회 면역화한 마우스에서 관찰된 것보다 상당히 더 높게 유지되었다. 2차 면역화가 1차 면역화 후 4일까지 지연되었을 때 그 효과는 훨씬 더 두드러졌다. 이 경우, 항원-특이적 T 세포의 수는 7일까지 계속 상승했으며, 9일까지도 최대에 도달하지 않았고, 이 시점에서 항원-특이적 세포의 빈도는 1회 면역화 후 관찰된 최대 수의 약 4배였다.

HspE7 + polyICLC의 1회 투약 후 polyICLC만을 3일 연속하여 투약하는 것이 HspE7 + polyICLC의 1회 투약을 받은 마우스와 비교하여 E7-특이적 CD8+ 세포의 수에 유의한 증가를 도출하지 못했다는 것이 관찰되었다(도 14B). 이 결과는 연속 1일 1회 면역화한 마우스에서 도출된 E7-특이적 CD8+ 세포의 극적인 확장이 단순히 보조제의 연속 존재의 간접적 결과는 아니며, 특이적 항원의 존재에 의존했음을 시사한다.

모든 인용문헌은 본원에 참고자료로 포함된다.

본 발명은 하나 이상의 구체예와 관련하여 설명되었다. 그러나, 청구범위에 한정된 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 많은 변화 및 변형이 만들어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims

HspE7을 CpG-함유 올리고뉴클레오티드, TLR3 아고니스트, 모노-포스포릴-리피드 A(MPL), MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM), 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제와 함께 투여하는 것을 포함하는, 정제된 HspE7의 생물학적 활성을 증가시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 면역자극제는 약 0.1ug 내지 약 20mg/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 정제된 HspE7은 1% PAGE를 이용하여 측정했을 때 약 95% 내지 약 99.99%의 순도인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 면역자극제는 TLR3 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, TLR3 아고니스트는 PolyICLC 또는 PolyI:C인 것을 특징으로 하는 방법.
정제된 HspE7 및 CpG-함유 올리고뉴클레오티드, TLR3 아고니스트, 모노-포스 포릴-리피드 A(MPL), MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM), 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제를 포함하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 면역자극제는 약 0.1ug 내지 약 20mg/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 정제된 HspE7은 1% PAGE를 이용하여 측정했을 때 약 95% 내지 약 99.99%의 순도인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 면역자극제는 TLR3 아고니스트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, TLR3 아고니스트는 PolyICLC 또는 PolyI:C인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항의 조성물을 그것을 필요로 하는 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 대상자에서 종양 또는 바이러스 발생을 감소시키는 방법.
정제된 HspE7 및 CpG-함유 올리고뉴클레오티드, TLR3 아고니스트, 모노-포스포릴-리피드 A(MPL), MPL-트레할로스 6,6'-디미콜레이트(MPL-TDM), 및 항-CD40으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역자극제, 그리고 사용 설명서를 포함하는 키트.
제 11 항에 있어서, 면역자극제는 약 0.1ug 내지 약 20mg/ml의 양으로 존재하고, 정제된 HspE7은 1% PAGE를 이용하여 측정했을 때 약 95% 내지 약 99.99%의 순도인 것을 특징으로 하는 키트.
제 11 항에 있어서, 면역자극제는 TLR3 아고니스트인 것을 특징으로 하는 키트.
제 11 항에 있어서, TLR3 아고니스트는 PolyICLC 또는 PolyI:C인 것을 특징으로 하는 키트.
필요로 하는 대상자에서 암의 예방 또는 치료를 위한 제 6 항의 조성물의 사용.
필요로 하는 대상자에서 종양 또는 바이러스 발생을 감소시키기 위한 제 6 항의 조성물의 사용.
제 11 항에 있어서, 상기 조성물을 적어도 2회 투약을 포함하는 투약 일정에 따라서 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항의 조성물을 그것을 필요로 하는 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 대상자에서 종양 또는 바이러스 발생을 예방하는 방법.