CN107847567B - 方法 - Google Patents

方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107847567B
CN107847567B CN201680023471.1A CN201680023471A CN107847567B CN 107847567 B CN107847567 B CN 107847567B CN 201680023471 A CN201680023471 A CN 201680023471A CN 107847567 B CN107847567 B CN 107847567B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
checkpoint inhibitor
antigenic molecule
photosensitizer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680023471.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107847567A (zh
Inventor
A·霍格希特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PCI Biotech AS
Original Assignee
PCI Biotech AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PCI Biotech AS filed Critical PCI Biotech AS
Publication of CN107847567A publication Critical patent/CN107847567A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107847567B publication Critical patent/CN107847567B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种在受试者中引起免疫反应的方法，包括向所述受试者施用抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂，并且用有效激活所述光敏剂的波长的光辐照所述受试者以引起免疫反应。优选地，所述方法是一种疫苗接种方法。本发明还提供相关的方法、组合物、细胞、用途、产品和试剂盒。

Description

方法
技术领域
本发明涉及一种疫苗接种或免疫方法，其涉及如本文所定义的光敏剂、抗原分子(例如疫苗成分)、检查点抑制剂(和任选的Toll-样受体(TLR)的配体)的使用，并且用有效激活所述光敏剂的波长的光进行辐照。本发明还涉及抗原，例如在这种方法中使用的疫苗组合物。本发明还提供一种产生抗原呈递细胞的方法，所述抗原呈递细胞可以用于引起免疫反应(例如用于疫苗接种)，其涉及使用如上相同的成分以将抗原分子(例如疫苗成分)引入到细胞以实现抗原呈递以及在这种方法中使用的抗原组合物。本发明还提供通过这种方法在体外产生的细胞用于在体内施用于患者以引发免疫反应(例如以实现疫苗接种)的用途。本发明还提供一种将抗原分子内化到细胞的方法。
背景技术
疫苗接种涉及施用抗原分子以激发免疫系统而刺激针对病原体的适应性免疫的发展。疫苗可以防止或改善由于感染的发病率。疫苗接种是防止感染性疾病最有效的方法，并且由于疫苗接种的普遍免疫性很大程度上是天花在全球根除和疾病(例如世界上许多种中的脊髓灰质炎、麻疹和破伤风)限制的原因。
疫苗的活性试剂可以是致病病原体的完整无缺但是灭活的(非感染性的)或减毒的(具有降低的感染性)形式，或者是已经发现具有免疫原性的病原体的纯化成分(例如，病毒外部的外壳蛋白)。制备类毒素以用于免疫对抗基于毒素的疾病，例如破伤风的破伤风痉挛毒素的变型以除去其毒性作用但保留其免疫原性作用。
由于大多数的疫苗通过内吞作用通过抗原呈递细胞而被摄取并经由内涵体被运送到溶酶体以进行抗原消化和经由MHC II类途径的呈递，疫苗接种主要活化CD4辅助性T细胞和B细胞。为了对抗失调或疾病(例如癌症)以及细胞内感染，细胞毒性CD8T细胞反应的激发是重要的。然而，由于在将抗原递送至细胞溶质以及至抗原呈递的MHC I类途径中的困难，细胞毒性CD8T细胞的诱发常常失败。光化学内化(PCI)提高了分子向细胞溶质的递送，并且采用PCI的疫苗接种方法是已知的。PCI是使用光敏剂结合辐照步骤以活化该试剂的技术，并且已知能实现共同施用到细胞的分子释放进入细胞的细胞溶质。这项技术允许在辐照后，被细胞摄取进入到细胞器(例如内涵体)的分子从这些细胞器释放进入到细胞溶质。PCI提供了一种用于将另外的膜不能渗透的(或渗透性差的)分子引入到细胞的细胞溶质的机制，该方式不引起普遍的细胞破坏或细胞死亡。
光化学内化(PCI)的基本方法描述于WO 96/07432和WO 00/54802，其通过引用的方式并入本文中。在这种方法中，使待内化的分子(在本发明中其会是抗原分子)和光敏剂与细胞接触。光敏剂和待内化的分子被摄取进入到细胞内的细胞膜限制的亚区室中，即它们胞饮进入细胞内囊泡(例如溶酶体或内涵体)。当将细胞暴露于合适波长的光时，光敏剂被活化，其直接或间接产生破坏细胞内囊泡的膜的活性种(reactive species)。这使得内化的分子释放进入到细胞溶质。
发现了在这种方法中，大部分细胞的功能性或生存力没有受到有害影响。因此，这种方法(被称为“光化学内化”)的功用被建议用于将多种不同的分子(包括治疗剂)运送到细胞溶质(即进入到细胞的内部)。
WO 00/54802使用了这种一般方法来呈递或表达转移分子于细胞表面上。因此，在分子运送和释放到细胞溶质后，该分子(或其部分)可以被运送到细胞的表面，其中其可以呈递在细胞的外面，即在细胞表面上。这种方法在疫苗接种领域具有特别的功用，其中疫苗成分(即抗原或免疫原)可以引入到细胞用于在该细胞的表面上的呈递以引起、加快或加强免疫反应。
虽然疫苗接种已经取得了一些显著的成功，但是仍然有对于替代的和改善的疫苗接种方法的需求。本发明解决了这种需求。
发明内容
本发明的发明人已经惊奇地发现一种涉及如本文所述的光敏剂、抗原分子(例如疫苗成分)和检查点抑制剂(和任选的TLR配体)的使用，并且用有效激活所述光敏剂的波长的光进行辐照的方法引起提高的疫苗接种或提高的免疫反应。
如会在以下实施例中更详细的描述地，已经表明本发明的方法引起提高的疫苗接种或提高的免疫反应，例如产生增加量的抗原特异性T细胞。另外，实施例显示，在癌症疫苗接种的情况下，根据本发明的方法引起肿瘤体积的减小。
虽然不期望受到理论的束缚，相信本发明的方法引起在MHC I类分子上增加的抗原呈递，引起增强的CD8+T细胞应答和因此提高的疫苗接种方法。
本发明的方法的结果显示抗原特异性T细胞数量增加，和通过T细胞的TNF-α和IFNγ的产生增加，其与增加的或提高的抗原呈递有关。
因此，在本发明的一个方面提供了一种在受试者中引起免疫反应的方法，包括向所述受试者施用抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂，并且用有效激活所述光敏剂的波长的光辐照所述受试者，其中引起免疫反应。
在本发明的另一个方面提供了一种在细胞表面上表达抗原分子或其部分的方法，包括：
a)提供第一细胞和第二细胞，其中所述抗原分子或其部分待表达于所述第一细胞上，检查点抑制剂可以与所述第二细胞结合，其中所述第一细胞和第二细胞可以是相同细胞或不同细胞；
b)将至少所述第一细胞与所述抗原分子、光敏剂和任选的TLR配体接触；
c)将至少所述第二细胞与检查点抑制剂接触，和
d)用有效激活所述光敏剂的波长的光辐照至少所述第一细胞，其中所述抗原分子释放到细胞的溶质中，并且所述抗原分子或其部分随后呈递在所述第一细胞的表面上，
其中所述第一细胞和第二细胞在所述辐照之前、期间和/或之后彼此接触。
优选地，这些方法(和随后描述的方法)采用仅上述在所述方法中的三种活性组分(试剂)并且在方法中所述试剂以适当的水平(例如以以下描述的最小水平)出现，这样它们影响方法的功效(即在提高PCI疫苗接种/抗原呈递/免疫反应激发中发挥积极作用)。因此优选地所述试剂出现在不含其他活性组分的缓冲液中。另外，(然而)试剂可以如下文所述加入例如TLR配体。
在这种方法中，如本文定义的所述抗原分子和所述光敏剂，以及任选的所述检查点抑制剂(和任选的所述TLR配体，当使用时)，各自被摄取进入到细胞内囊泡；并且当辐照细胞时，细胞内囊泡的膜被破坏而将所述抗原分子释放到细胞的溶质中。
被摄取的多种试剂可以被摄取到相同或彼此相对不同的细胞内囊泡中。已经发现由光敏剂产生的活性种类可以扩展到包含它们的囊泡外和/或囊泡可以合并使得囊泡的内容物通过破坏的囊泡的合并而释放。如本文所述，“摄取”表示被摄取的分子整个包含在囊泡内。细胞内囊泡被膜限制并且可以是内吞作用后产生的任意的这种囊泡，例如内涵体或溶酶体。
如本文所用地，“破坏的”区室指该区室的膜的完整性永久或暂时的破坏，足以允许包含在其内的抗原分子释放。
如本文所指的“光敏剂”是当该试剂在合适的波长和强度以产生活化的种类的光照下被激活时，能够将吸收的光的能量转化为化学反应的化合物。这些过程的高反应性终产物可以引起细胞和血管毒性。方便地，这种光敏剂可以是局部化到细胞内区室的一种，特别是内涵体或溶酶体。
光敏剂可以通过多种机制直接或间接地发挥它们的作用。因此例如，当被光活化时，一些光敏剂变为直接有毒，而其他则产生有毒类(toxic species)，例如氧化试剂(如单线态氧或其他反应性氧类)，其对细胞材料和生物分子(例如脂类、蛋白和核酸)具有极其的破坏性。
一些这种光敏剂在本领域是已知的并且描述于包括WO96/07432的文献中，其通过引用的方式并入本文中，并且可以用在本发明的方法中。有许多已知的光敏剂，包括卟啉类、酞菁类(phthalocyanines)、红紫素类(purpurins)、二氢卟吩类(chlorins)、苯并卟啉类、亲溶酶体弱碱类(lysomotropic weak bases)、萘酞菁类、阳离子染料类和四环素类或其衍生物(Berg等，(1997)，J.Photochemistry andPhotobiology,65,403-409)。其他光敏剂包括得克萨卟啉类、脱镁叶绿酸类、卟啉烯类、菌绿素类、二氢卟酚酮类(ketochlorins)、血卟啉衍生物、和由5-氨基乙酰丙酸及其衍生物诱导的内源光敏剂、光卟啉、光敏剂之间的二聚物或其他结合物。
卟啉类是研究最广泛的光敏剂。它们的分子结构包括通过次甲基桥连接在一起的四个吡咯环。它们是天然化合物，其常常能形成金属复合物。例如在氧运输蛋白血红蛋白的情况下，铁原子被引入到血红素B的卟啉核。
二氢卟吩类是大的杂环类的芳香环，在核心由三个吡咯和一个吡咯啉通过四个次甲基连接组成。不像卟啉，因此二氢卟吩主要是芳香族的，但是通过环的整体环境不是芳香族的。
技术人员会理解哪些光敏剂适合用于本发明。尤其优选的是定位在细胞的内涵体或溶酶体的光敏剂。因此，光敏剂优选是接受进入溶酶体或内涵体的内部区室的试剂。优选地光敏剂通过内吞作用摄取到细胞内区室。优选的光敏剂是二磺化铝酞菁或四磺化铝酞菁(例如AIPcS2a)、磺化四苯基卟啉类(TPPSn)、磺化四苯基菌绿素类(例如TPBS2a)、耐尔蓝、二氢卟酚e6衍生物、尿卟啉I、叶赤素、血卟啉和亚甲基蓝。另外合适的用于本发明的光敏剂在WO03/020309中描述，其也通过引用的方式并入本文中，即磺化内消旋-四苯基二氢卟吩类，优选TPCS2a。优选的光敏剂为两亲性光敏剂(例如二磺化光敏剂)，例如两亲性酞菁类、卟啉类、二氢卟吩类(chlorins)和/或菌绿素类，并且特别包括TPPS2a(二磺酸四苯基卟啉)、AIPcS2a(二磺酸铝酞菁)、TPCS2a(二磺酸四苯基卟吩)(tetraphenyl chlorindisulfonate)和TPBS2a(二磺酸四苯基菌绿素)(tetraphenylbacteriochlorindisulfonate)或其药学上可接受的盐。也优选亲水性光敏剂，例如TPPS4(内消旋四磺酸四苯基卟啉)。特别优选的光敏剂是磺化铝酞菁类、磺化四苯基卟啉类、磺化四苯基卟吩类(sulfonatedtetraphenylchlorins)和磺化四苯基菌绿素类(sulfonatedtetraphenylbacteriochlorins)，优选TPCS2a、AIPcS2a、TPPS4和TPBS2a。在本发明一个特别优选的实施方案中，光敏剂是二氢卟吩TPCS2a(磺化四苯基卟吩，例如
Figure BDA0001441672340000045
)。
光敏剂可以连接到载体以提供光敏性试剂。因此，在本发明的该实施方案的一个优选的方面，光敏性试剂是光敏剂与如式(I)所定义的壳聚糖的结合物：
Figure BDA0001441672340000041
其中，n是大于或等于3的整数；
R在所述化合物中出现n次，并且在所述总的Rn基团的0.1％-99.9％(优选0.5％-99.5％)中，每个R是选自如下的基团A：
Figure BDA0001441672340000042
其中每个R1，其可以相同或不同，选自H、CH3和-(CH2)b-CH3；a为1、2、3、4或5；并且b为0、1、2、3、4或5(其中反离子(counter-ion)可以是例如Cl-)；优选地R1为CH3并且b为1，
和
Figure BDA0001441672340000043
其中Y为O、S、SO2、-NCH3或-N(CH2)dCH3；c＝1、2、3、4或5；并且d＝1、2、3、4或5，优选Y为NCH3并且c为1，
其中每个R基团可以相同或不同，并且在所述总Rn基团的0.1％-99.9％(优选0.5％-99.5％)中，每个R是选自如下的基团B：
Figure BDA0001441672340000044
其中
e为0、1、2、3、4或5；并且f为1、2、3、4或5；优选地e和f＝1，
R2是选自如下的基团：
Figure BDA0001441672340000051
W为选自O、S、NH或N(CH3)的基团；优选为NH，
R3为选自如下的基团：
Figure BDA0001441672340000052
V为选自CO、SO2、PO、PO2H或CH2的基团；优选CO，并且
R4是(在邻位、间位或对位取代的)基团，其可以相同或不同，选自H、-OH、-OCH3、-CH3、-COCH3、C(CH3)4、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2和-NCOCH3，优选为H，
其中每个R基团可以相同或不同。
壳聚糖聚合物具有至少3个单元(n＝3)。然而，优选n为至少10、20、50、100、500、1000，例如10至100或10至50。
在一个优选的实施方案中，R2选自如下
Figure BDA0001441672340000061
在一个进一步优选的实施方案中R3选自如下
Figure BDA0001441672340000062
Figure BDA0001441672340000071
优选地R2或R3为TPPa、TPCa1或TPCc1。
基团A可以提供总的Rn基团的70至95％，基团B可以提供总的Rn基团的5至30％。在一个最优选的实施方案中光敏剂和壳聚糖的结合物选自：
17：B:25％，A:75％
Figure BDA0001441672340000072
19：B:25％，A:75％
Figure BDA0001441672340000073
33：B:10％；A:90％
Figure BDA0001441672340000074
37：B:10％；A:90％
Figure BDA0001441672340000081
在以上结构中，所提供的A/B％值是指为基团A或基团B的Rn基团的比例。星号表示壳聚糖聚合物的残余。
这些化合物可以通过合成方法制得，所述合成方法利用本领域的步骤标准，其对于技术人员来说会是熟悉的并且详细描述于WO2013/189663，其通过引用的方式并入本文中。
如本文所指的“抗原”分子是当以合适的方式呈递到免疫系统或免疫细胞时，其本身或其部分能够激发免疫反应的分子。因此，有利地，抗原分子会是疫苗抗原或疫苗成分，例如含有多肽的实体。如以下讨论地，抗原分子可以包含多于一种抗原，例如两种或多种抗原肽。
本领域已知许多这种抗原或抗原疫苗成分，并且包括所有形式的细菌或病毒抗原或包括原生动物或更高级有机体的任意病原种类的真正的抗原或抗原成分。虽然传统上疫苗的抗原成分已经包含完整有机体(不论是活的、死的或减毒的)(即完整细胞疫苗)，另外亚单位疫苗(即基于有机体的特定抗原成分(例如蛋白或肽或甚至碳水化合物)的疫苗)已经被广泛研究并报道于文献中。任意这种“亚单位”基的疫苗成分可以用作本发明的抗原分子。
然而，本发明发现在肽疫苗领域的特别功用。因此，根据本发明的一种优选的抗原分子是肽(其在此定义为包括较短和较长长度的肽，即肽、寡肽或多肽，以及蛋白质分子或其片段，例如5-500(如10至250，如15至75或8至25)个氨基酸的肽)。
在文献中已经推荐了大量的肽疫苗候选物，例如在病毒疾病和感染(如AIDS/HIV感染或流感、犬细小病毒、牛白血病病毒、肝炎等)的治疗中(参见例如Phanuphak等,AsianPac.J.Allergy.Immunol.1997,15(1),41-8；Naruse,Hokkaido Igaku Zasshi 1994,69(4),811-20；Casal等,J.Virol.,1995,69(11),7274-7；Belyakov等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95(4),1709-14；Naruse等,Proc.Natl.Sci.USA,1994 91(20),9588-92；Kabeya等,Vaccine 1996,14(12),1118-22；Itoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83(23)9174-8。类似地可以使用细菌肽，事实上可以是来自其他有机体或物种的肽抗原。
除了来自病原有机体的抗原，肽已经被建议用作疫苗对抗癌症或者其他疾病，例如多发性硬化。例如，突变的原癌基因肽有很大希望作为癌症疫苗，在激发细胞毒性T淋巴细胞中起抗原作用(Schirrmacher,Journal of Cancer Research and ClinicalOncology 1995,121,443-451；Curtis Cancer Chemotherapy and Biological ResponseModifiers,1997,17,316-327)。一种合成肽疫苗也已经被评价用于治疗转移性黑素瘤(Rosenberg等,Nat.Med.1998,4(3),321-7)。用于多发性硬化的治疗的T细胞受体肽疫苗在Wilson等，J.Neuroimmunol.1997,76(1-2),15-28中描述。任意这种肽疫苗成分可以用作本发明的抗原分子，事实上可以是在文献中描述为或建议为肽疫苗的任意肽。因此肽可以是合成的或分离自或否则源自有机体。
在本发明的一个优选的实施方案中，抗原是黑素瘤抗原。“黑素瘤抗原”可以包括一种或多种不同的抗原。
例如，在一个方面，黑素瘤抗原是黑素瘤蛋白或肽，例如抗原肽或T细胞表位，例如选自gp100、黑色素-A、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-3和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)或其肽表位中的一种或多种。这些和另外合适的黑素瘤抗原的细节描述于Renkvist等,CancerImmunol.Immunother.50:3-15,2001(和其中的参考文献)以及Hodi,Clin.Cancer.Res.12:673-678,2006，其通过引用的方式并入本文中。特别地，gp100、黑色素-A、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-3和TRP-2以及它们的肽表位描述于之前的Renkvist等。因此本发明延伸到使用gp100、黑色素-A、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-3或TRP-2，或包含或由它们公开的(如在之前的Renkvist等中公开的)肽表位组成的抗原或使用本领域已知的标准比较技术(在相关的比较窗口中)与其具有至少95％序列同一性的序列或其任意组合。在一个优选的实施方案中，抗原是TRP-2和/或gp100，优选为TRP-2。
肽抗原(例如多达至少200个氨基酸)可以获得自执行定制肽合成的公司，例如United BioSystems Inc(原来的United Peptide Corp.,赫恩登,弗吉尼亚,美国)。
在一个可选的优选的实施方案中，抗原分子来自人乳头瘤病毒(HPV)。乳头瘤病毒基因组被分为早期区(E)(编码6个(E1、E2、E4、E5、E6和E7)开放阅读框(ORF)，该开放阅读框在最初感染宿主细胞后立即表达)和晚期区(L)(编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2)。所有的病毒ORF编码在一条DNA链上。
在一个优选的实施方案中，抗原分子包含蛋白或肽或其片段，即来自人乳头瘤病毒(HPV)的抗原(如源自所述病毒)，其优选是本文所指的早期或晚期蛋白中的一种蛋白或其部分。因此，HPV抗原可以是一种或多种已知的抗原肽或T细胞表位，例如选自来自HPV的任意类型的任意已知抗原的一种或多种。HPV类型和抗原的详述可以在Ma等CurrentCancer Therapy Reviews 6:81-103,2010中找到。
例如，抗原肽可以源自HPV-16和/或HPV-18型HPV，或31型或45型HPV。例如，抗原可以源自E1、E2、E4、E5、E6或E7蛋白中的任意或L1和L2蛋白中的任意。抗原肽可以源自HPV-16和18的E2、E6和E7蛋白的一种或多种。在一个优选的实施方案中，抗原分子含有HPV-16E7序列GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8表位以粗体示出)。因此，HPV抗原可以是35个氨基酸的肽。或者，抗原分子可以是只有CD8表位RAHYNIVTF，即一种较短的肽。
HPV肽抗原可以获得自执行定制肽合成的公司，例如United BioSystems Inc(原来的United Peptide Corp.,赫恩登,弗吉尼亚,美国)。
如以上讨论地，根据本发明的抗原分子可以包含一种或两种抗原(作为分离的分子)，例如两种或多种抗原。例如，当抗原分子是抗原肽时，它可以包含一种或多种抗原肽。因此抗原的混合物可以用作抗原分子。这可以是，例如，不同肽的混合物，其可以代表例如相同蛋白抗原的不同区(和表位)或者可以代表来自(在相同的肿瘤类型中表达的)不同蛋白抗原的所选区(表位)。如果使用分离的抗原，它们可以在本发明的用途和方法中分开、同时或顺序使用。例如，2、3或4种抗原可以用在本文描述的方法或用途中。类似地，形成本文描述的发明的其他实施方案的一个方面(例如在本文描述的组合物、用途、产品和试剂盒中)的抗原分子可以类似地包含多于一种抗原。或者抗原分子可以是含有一个或多个表位的单个分子。
一旦通过光化学内化过程释放在细胞溶质中，抗原分子就可以通过细胞的抗原处理机制处理。因此，表达或呈递到细胞表面上的抗原分子可以是内化的(胞饮的)抗原分子部分或片段。呈递或表达的抗原分子的“部分”优选包含由细胞内的抗原处理机制产生的部分。然而，所述部分可以通过其他方式产生，所述其他方式可以通过适当的抗原设计(例如pH敏感键)或通过其他细胞处理方式实现。方便地，这些部分具有足够的尺寸以产生免疫反应，例如尺寸为大于5(例如大于10或20)个氨基酸的肽的情况。
如本文定义的“检查点抑制剂”是靶向免疫检查点的试剂，即为一种检查点抑制剂。免疫检查点包括(例如)检查点蛋白和脂质。检查点蛋白通过鉴别哪些细胞是健康的和哪些细胞应该被免疫系统消灭来调节免疫系统。如果细胞在其表面或相关T细胞的表面上不具有足够的(或足够活化的)检查点蛋白，它可能被免疫系统消灭，并且因此检查点蛋白在免疫系统上起“刹车”作用。
一种最著名的检查点蛋白是细胞毒性T淋巴细胞抗原-4，或CTLA4(或被称为CD152(分化群152))。该分子是下调免疫反应的蛋白受体。CTLA4发现于T细胞表面，其引起对抗原的细胞免疫攻击。可以通过激发CTLA4受体(其作为“关闭”开关)来关闭T细胞攻击。一旦细胞毒性T细胞活化，其表达CTLA4于其表面，然后CTLA4与共刺激分子CD28竞争它们互相共享的配体，抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2。该平衡保持了检查时的细胞毒活性，同时允许T细胞发挥作用以自限性方式进行。
检查点蛋白的另一个实例是PD-L1(程序性死亡配体1)，其是40kDa的1型跨膜蛋白。PD-L1的受体是PD-1，其是属于免疫球蛋白超家族并表达于T细胞和祖B细胞上的细胞表面受体。PD-1受体/PD-L1配体复合物的形成传输抑制信号，所述抑制信号减少CD8+T细胞在淋巴结的增殖，并且作为其补充，PD-1也能够通过凋亡控制外源抗原特异性T细胞在淋巴结的积累。因此，PD-L1防止T细胞攻击健康细胞。当PD-L1活化T细胞表面上的PD-1受体时，T细胞被发信号消灭自己。
其他检查点蛋白包括CD-137(4-1BB)(一种共刺激检查点蛋白)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3，CD223)(一种与耐受T细胞上的PD-1共表达的CD4相关抑制受体)、B7超家族蛋白B7-H3和B7-H4和T细胞蛋白TIM3。磷脂也可以作为检查点分子起作用，例如磷酯酰丝氨酸(PS)，其是正常细胞中的磷脂，在凋亡期间移位到外部膜表面，抑制过量的免疫活化，所述免疫活化另外在处理和清理衰老的细胞物质期间发生。PS的外化间接刺激巨噬细胞，引起树突细胞抗原呈递的抑制。像PD-L1，外化的PS由一些肿瘤细胞和肿瘤来源的微泡异常的表达。
根据本发明的检查点抑制剂可以通过它们本身与检查点分子或与它们的结合配偶体(例如配体)相互作用而靶向或抑制任意这些检查点分子(例如检查点蛋白或脂质)的活性。
检查点抑制剂(也称为免疫检查点调节剂或CPMs)减少了检查点分子对防止通过T/B细胞活化实现的细胞死亡的作用。抑制检查点分子的能力可以在适当的模型中进行评价，例如通过防止结合到其结合配偶体，如结合到B7-1或B7-2(对于CTLA-4)或结合到PD-L1(对于PD-1)。
一些检查点抑制剂是已知的并且可以用于本发明，例如在Creelan(2014)CancerControl 21:80-89(其通过引用的方式并入本文中)中描述的那些抑制剂。
检查点抑制剂可以是抗体，并且合适的抗体是商业可得的。优选地所述抗体是单克隆抗体。
作为实例，抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体可从Bio X Cell(西黎巴嫩，美国)获得。为检查点抑制剂的其他具体的抗体的实例包括：曲美木单抗(Tremelimumab)(CP-675,206)(一种对CTLA-4具有高亲和性的人IgG2单克隆抗体)、易普利姆玛(Ipilimumab)(MDX-010)(一种抗CTLA-4的人IgG1单克隆抗体)、纳武单抗(Nivolumab)(BMS-936558)(一种本质上缺乏可检测的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的人单克隆抗PD1IgG4抗体)、MK-3475(以前的lambrolizumab)(一种设计用于防止Fc介导ADCC的含有在C228P处的突变的人源化IgG4抗PD-1抗体)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)(BMS-663513)(一种全人源IgG4单克隆抗CD137抗体)、抗LAG-3单克隆抗体(BMS-986016)和巴维昔单抗(Bavituximab)(嵌合的3G4)(一种抗PS的嵌合IgG3抗体)。如本文所讨论的或其他可获得的可以用于本发明的任意合适的检查点抑制剂。
在一个优选的实施方案中，检查点抑制剂靶向CTLA-4和/或PD-1。在一个优选的实施方案中，可以使用靶向CTLA-4的检查点抑制剂和靶向PD-1的检查点抑制剂二者(例如针对那些靶标的抗体)。优选地检查点抑制剂是抗CTLA-4和/或PD-1的抗体并阻止或抑制CTLA-4结合B7-1/B7-2和/或阻止或抑制PD-1结合PD-L1。如本文讨论地，CTLA-4和PD-1优选分别具有UniProt数据库登录号P1640，序列第3版(2003年1月10日)和登录号Q15116序列第3版(2007年4月17日)所示的序列或具有如使用本领域常规方法在全长序列上评估的与其有至少70、80、90、95、96、97、98或99％序列同一性的序列。
一种可选的策略是抑制肿瘤细胞表面的PD-L1(PD-1的配体)，并且因此PD-L1的抑制剂作为检查点抑制剂也包含在本发明中。例如，MPDL3280A(RG7446)是一种人IgG1-κ抗PD-L1单克隆抗体并且可以根据本发明使用。MEDI4736是另一种IgG1-κPD-L1抑制剂。
另一个可选的方案是使用B7-DC-Fc融合蛋白竞争性封闭PD-1受体，并且这样的融合蛋白因此也可以用于本发明。在一个进一步可选的方案中，针对杀伤细胞免疫球蛋白样受体的抗体可以用作免疫治疗剂。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是NK细胞上的受体，其下调NK细胞毒活性。HLA I类等位基因特异性KIR受体表达在溶细胞(CD56dimCD16+)NK细胞中，而CD56brightCD16-NK子集缺乏这些KIR。按照这些线路，抑制性KIR似乎选择性地在癌周NK细胞渗透物中表达并且因此似乎作为肿瘤增选的检查点途径，类似于PD-L1。如此，使用抗体抑制特定的KIR应该引起持续的NK细胞的体内激活。例如，lirilumab(IPH2102)是针对KIR的全人源单克隆抗体并且可以根据本发明使用。
在本发明的方法中可以使用一种或多种(例如两种或多种)检查点抑制剂，其可以分别、同时或依次使用。例如，在本方法中可以使用2、3或4种检查点抑制剂，例如针对CTLA4和PD-1(例如抗CTLA4和抗PD-1)的检查点抑制剂。类似地，可以在本文描述的本发明的其他实施方案中提供一种或多种检查点抑制剂，例如在本文描述的组合物、用途、产品和试剂盒中。因此，在本文描述的发明的实施方案中，提到检查点抑制剂时包含一种或多种检查点抑制剂。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法此外还涉及Toll样受体(TLR)的配体的使用。在本发明的所有方面，可以使用一种或多种(例如两种或多种)TLR配体，其可以分别、同时或依次使用。因此，在本文描述的发明的实施方案中，提到TLR配体时包含一种或多种TLR配体。
Toll样受体是在先天免疫系统以及消化系统中发挥关键作用的一类蛋白。TLR和白细胞介素-1受体形成一个受体超家族，命名为白细胞介素-1受体/Toll样受体超家族。该家族的所有成员具有Toll-IL-1受体域(TIR)。白细胞介素-1受体(IL-1R)家族的成员的特征在于细胞外免疫球蛋白样域和细胞内Toll/白细胞介素-1R(TIR)域。具有亚群2TIR域的受体被认为是TLR。
TLR为通常表达在岗哨细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)的单个、跨膜、非催化性受体，其识别来自微生物的结构保守的分子。一旦这些微生物打破了物理屏障(例如皮肤或肠道粘膜)，它们就被TLR识别，TLR激活免疫细胞反应。这些受体识别分子，例如病原体相关的分子，其被认为对于病原体的功能是关键的并且是难于通过突变改变的。它们可以包括细菌细胞表面脂多糖类(LPS)、脂蛋白类、脂肽类和脂阿拉伯甘露聚糖；蛋白类，例如来自细菌鞭毛的鞭毛蛋白；病毒的双链RNA；或者细菌或病毒DNA的未甲基化的CpG岛；和在真核DNA的启动子中发现的CpG岛；以及特定的其他RNA和DNA分子。对于大多数的TLR，配体识别特异性现在已经由基因靶向建立。
已经预计大多数的哺乳动物种类具有10至15种类型的Toll样受体。在人类和小鼠中一共已经鉴别了13种TLR(简单命名为TLR1至TLR13)(在小鼠中13种，并且在人类中10种)。
本发明包含针对TLR受体的所有配体。术语“配体”意于表示与生物分子形成复合物以用于生物目的的物质。在TLR配体的情况下，其是一种信号触发分子，结合到靶标TLR上的位点。当配体结合到其同源受体，其可以改变受体的化学构象。受体蛋白的构象状态决定了其功能状态。
因此，根据本发明的TLR配体是结合到至少一种，或者一种或多种，toll样受体(TLR)并导致TLR的活化的分子，例如TLR介导的细胞信号传递的活化。
TLR信号传递分为两个不同的信号传递途径，MyD88依赖性途径和TRIF依赖性途径。根据本发明的TLR配体激活这两个途径中的一者或二者。因此，根据本发明的配体是结合到一种或多种TLR并导致TLR活化的分子，例如在配体结合时通过受体的构象改变发生的TLR信号传递的活化。
MyD88依赖性反应发生在TLR受体的二聚化上，并且被除了TLR3的每个TLR利用。它的主要作用是NFкB和有丝分裂原活化蛋白激酶的活化。发生在受体的配体结合和构象改变募集接头蛋白MyD88，TIR家族的一个成员。之后MyD88募集IRAK4、IRAKI和IRAK2。之后IRAK激酶磷酸化和活化蛋白质TRAF6，其转而聚泛素化蛋白质TAK1以及聚泛素化其自身以促进结合到IKKβ。一旦结合，TAK1磷酸化IKKβ，之后IKKβ磷酸化IKB引起它的降解并允许NFкB扩散到细胞核并激活转录和随之发生的炎性细胞因子的诱导。
另一个途径是TRIF依赖性途径，其被TLR3和TLR4二者使用。对于TLR3，dsRNA(或类似的-参见以下)导致受体的活化，募集接头TRIF。TRIF激活激酶TBK1和RIP1，其在信号传递途径中产生分支。TRIF/TBK1信号传递复合物磷酸化IRF3允许其移位到核并产生干扰素I型。同时，RIP1的活化以与MyD88依赖性途径一样的方式引起TAK1的聚泛素化和活化以及NFкB的转录。
本领域已知用于确定TLR信号传递的活化的标准方法，例如确定适当的信号传递蛋白的磷酸化状态。或者，通过本领域熟知的方法可以确定配体是否通过TLR起作用，例如通过遗传上删除编码特定TLR的基因并确定配体的作用是否保留。这种方法可以在体外和体内用于转基因敲除的小鼠，所述转基因敲除的小鼠是商业可得的(TLR2、3和4敲除可从杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)获得，TLR1、2、3、4、5、6、7和9敲除可从OrientalBioService Inc获得)。另外，HEK-BlueTM细胞(Invivogen,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)是可得的，其设计用于通过分析NF-κB/AP1活化来研究TLR的激发。针对TLR2-9和13这种细胞是可得的。并且，TLR拮抗剂(例如可从Invivogen获得的那些)可以用于确定TLR的拮抗是否抑制假定配体的作用。因此，确定一个分子是否是TLR配体(例如一种特定的TLR配体)的方法在本领域是熟知的。
TLR的结构由富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat(LRR))胞外结构域、螺旋跨膜域和细胞内Toll/IL-1受体同源物(TIR)信号传递结构域组成。胞外结构域含有不同数量的LRR并类似于弯曲成马蹄形的电磁铁。在两个末端均有末端LRR，所述末端LRR保护马蹄的疏水核心。这些胞外结构域是高度可变的。它们直接参与各种病原体相关基序的识别，所述病原体相关基序包括脂多糖、脂肽、胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)DNA、鞭毛蛋白、咪唑喹啉和ds/ssRNA。一旦受体活化，在受体和接头TIR结构域之间形成TIR信号传递复合物。
受体TLR 7、8和9是一个具有比其他TLR更长氨基酸序列的家族。它们位于细胞内并对非自身核酸响应发出信号。它们在它们的LRR14和15之间也含有不规则片段。
TLR受体的序列是已知的并且通过本文描述的配体结合到那些受体可以进行评价，例如如上文所述。作为实例，已知的TLR氨基酸序列显示于下表1中。
表1
Figure BDA0001441672340000131
Figure BDA0001441672340000141
TLR1是细胞表面受体，其配体包括脂蛋白类和多三酰基脂肽(multiple triacyllipopeptide)类，例如源自细菌的那些。TLR1自身不识别配体，而是在与TLR2的复合物中起作用。因此，配体识别TLR1和TLR2之间的复合物。TLR1结合TLR2(作为异二聚体)识别肽聚糖和(三酰基)脂蛋白类。
脂蛋白/脂肽是一种由连接到蛋白/肽的脂质组成的分子。细菌表达这种分子。三酰基脂蛋白/三酰基脂肽包含三个酰基基团。优选地用于根据本发明的用途的TLR1配体是三酰基脂肽。
TLR1配体可以从Invivogen或Enzo Life Sciences(法明代尔，纽约，美国)购得。例如，Pam3CSK4(Invivogen)是一种合成的三酰脂肽(LP)，其模拟细菌LP的酰化的氨基末端。
或者，可以使用Pam3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸化物(Enzo Life Sciences)，其是与TLR2复合的TLR1的选择性激动剂。
TLR2是细胞表面受体，其被代表革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的二者、以及支原体和酵母的广泛种类的组的多种系列的微生物分子刺激。TLR2识别细胞壁成分，例如来自革兰氏阳性细菌的肽聚糖、脂磷壁酸和脂蛋白，来自分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖和来自酵母细胞壁的酵母聚糖。
优选的TLR2配体是脂聚糖类，例如来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的脂阿拉伯甘露聚糖和脂甘露聚糖。特别优选的脂聚糖类是特异于TLR2的脂多糖(LPS)类。这些分子具有由共价键连接的脂质和多糖并且发现于革兰氏阴性细菌的外部构件并作为内毒素起作用。在一个优选的特征中，LPS来自牙龈卟啉单胞菌(PorphyromonasGingivalis)。LPS由多糖区组成，所述多糖区通过称作脂质A的特异的碳水化合物脂质部分锚定在外部细菌膜。脂质A(也被称作内毒素)负责LPS的免疫刺激活性。
Figure BDA0001441672340000151
脂质A的最具有活性的形式含有6个脂肪酰基并发现于病原菌，例如大肠杆菌和沙门氏菌。
其他优选的TLR2配体是脂磷壁酸类(例如源自不同细菌种类，如枯草杆菌和金黄色葡萄球菌)、肽聚糖类(例如来自细菌物种，如枯草杆菌、大肠杆菌株(例如0111:B4或K12)、金黄色葡萄球菌和其他)、合成的脂蛋白类(例如合成的二酰基脂蛋白或合成的三酰基脂蛋白和酵母聚糖(例如来自酿酒酵母)其是一种具有由β-1,3-糖苷连接连接的重复葡萄糖单元的葡聚糖。TLR2配体是从Invivogen商业可得的。
TLR3发现于细胞区室。根据本发明优选的配体是模拟病毒dsRNA的双链RNA分子，例如聚腺苷酸-聚尿苷酸(Poly(A:U))或聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(I:C))。Poly(I:C)是特别优选的。
双链RNA(dsRNA)是具有两条互补链的RNA，类似于在所有细胞中发现的DNA。dsRNA形成一些病毒(双链RNA病毒)的遗传物质。双链RNA(例如病毒RNA或siRNA)可以触发真核细胞中的RNA干扰以及脊椎动物中的干扰素反应。
在一个优选的特征中，配体为Poly(I:C)。Poly I:C是错配的双链RNA，具有作为肌苷酸聚合物的一条链和作为胞苷酸聚合物的另一条链。这种分子可以通过熟知的技术产生。存在多种商业来源，例如以下可从Invivogen购得并且形成优选的实施方案：
-Poly(I:C)(HMW)，具有高分子量和1.5-8kb的平均尺寸，以及
-Poly(I:C)(LMW)，具有低分子量和0.2-1kb的平均尺寸。
高分子量和低分子量形式二者都是用于根据本发明的用途的优选形式。
TLR4也发现于细胞表面并具有几种配体类型，包括尤其是脂多糖(LPS)、几种热休克蛋白、纤维蛋白原、硫酸肝素片段、玻尿酸片段、镍和多种阿片类药物。在一个优选的方面，配体是LPS。LPS可以源自多种细菌物种，例如来自大肠杆菌0111:B4或K12或沙门氏菌(由苯酚-水混合物提取)，在一个优选的特征中，LPS来自大肠杆菌或来自明尼苏达沙门氏菌(例如R595株)。
在另一个优选的方面，TLR4配体是单磷酰脂质A(MPLA)，其可以分离自细菌(例如明尼苏达沙门氏菌R595)或合成制备。一般而言，TLR4配体是商业可得的(例如从Invivogen)。
TLR5结合到来自革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(例如枯草杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌和其他)的配体鞭毛蛋白。鞭毛蛋白是将自身以中空圆柱进行排列以形成细菌鞭毛的丝状体的球状蛋白。它具有30000至60000道尔顿的质量。鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要取代物，并且大量存在于几乎所有的生有鞭毛的细菌上。因此，优选的TLR5配体是鞭毛蛋白，优选来自如上所述的细菌。TLR5配体是商业可得的(例如从Invivogen)。
TLR6结合到多二酰基脂肽。如上所讨论地，脂肽发现于细菌并包含连接到肽的脂质。二酰基脂肽具有2个酰基基团并形成用于根据本发明的用途的优选的TLR6配体。TLR6配体是可从Invivogen商业可得的。例如，FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF)是来自唾液支原体的合成脂蛋白，类似于MALP-2(一种发酵支原体衍生的脂肽(LP))。
支原体LP(例如FSL-1)含有二酰基半胱氨酸残基，然而细菌LP含有三酰基的一种。FSL-1被与TLR2结合的TLR6识别，然而细菌LP如上所讨论地被TLR2和TLR1的结合识别。
TLR7配体包括小的合成化合物咪唑喹啉、碱基类似物(例如腺嘌呤和鸟苷类似物(如洛索立宾))和溴匹立明以及单链RNA。
咪唑喹啉化合物是双循环有机分子，优选具有以下所示的公式，其中R1和R2处的基团可以有多种变化。
优选地咪唑喹啉化合物具有式1：
Figure BDA0001441672340000161
其中R1为氨基-烷基基团，任选地被取代(例如用羟基基团)，并且R2为烷基基团，任选地用氧或氮基团打断；其中优选地
R1，为N-CH2-C(CH3)2-R3；
R2为-CH2-X-CH2CH3或氢原子；
R3为OH或氢原子且X为O或NH；
或者其药学上可接受的盐。
在上式中，烷基基团可以是C1-C10基团。
本领域已知这些化合物的实例，例如瑞喹莫德(或R848)(1-[4-氨基-2-(乙氧甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇)、咪喹莫特(3-(2-甲基丙基)-3,5,8-三氮杂三环[7.4.9.02’6]十三-1(9),2(6),4,7,10,12-六乙二胺-7-氨)和gardiquimod(R1为N-CH2-C(CH3)2OH；R2为-CH2-NH-CH2CH3；1-[4-氨基-2-(乙基氨基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇)(所有可获得自InvivoGen(圣地亚哥加利福尼亚，美国))。在一个优选的实施方案中，化合物选自瑞喹莫德和咪喹莫特。
这些化合物药学上可接受的盐也包含在本发明中。合适的盐包括例如醋酸盐、溴化物、氯化物、柠檬酸盐、盐酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、油酸盐、硬脂酸盐、甲苯磺酸盐、钙、甲葡胺、钾和钠盐。
洛索立宾是在位置N7和C8上衍生的鸟苷类似物。该核苷是一种非常强烈的免疫系统刺激剂。
溴匹立明是一种具有抗癌和抗病毒性质的实验药物，具有如以下所示的结构：
Figure BDA0001441672340000171
单链RNA是一种优选的TLR7配体，例如ssPolyU，其中优选地所述单链分子的长度是20至200个核苷酸。这种分子可以容易地合成产生。
TLR8配体一般是小的合成化合物或单链RNA。优选地所述TLR8配体是如上所述的ssPolyU分子。
TLR9配体包括未甲基化的CpG寡聚脱氧核苷酸DNA。“CpG”寡聚核苷酸(或CpG ODN)是这种配体的一个实例，并且是一种短的单链合成DNA分子，其引起胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸(“C)”结合到鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸(“G”)。“p”是指连续核苷酸之间的磷酸二酯连接，虽然一些ODN具有修饰的硫代磷酸(PS)骨架。如本文所指，CpG核苷酸被称为CpG基序。CpG基序是未甲基化的。含有CpG基序的序列被认为是病原体相关分子模式(PAMP)，由于它们在微生物基因组中丰富而在脊椎动物基因组中罕有。CpG PAMP被模式识别受体(PRR)Toll样受体9(TLR9)识别。TLR9识别特定的未甲基化的CpG寡聚核苷酸(ODN)序列，所述未甲基化的CpG寡聚核苷酸(ODN)序列从哺乳动物DNA区分出微生物DNA。
已经描述了三种主要类型的刺激性ODN：A、B和C型。A型CpG ODN由混合的磷酸二酯/硫代磷酸骨架构成，并且含有一个或多个CpG基序作为回文序列的部分。A型CpG ODN在3’和5’末端具有poly G尾(一种促进多连体形成的结构基序)。A型CpG ODN通常在一端或两端含有7至10个硫代磷酸修饰的碱基，以抵抗被核酸酶降解并增加ODN的稳定性。例如，内部回文序列的长度可以是8至16(优选10、12或14)个碱基对并且在碱基的顺序上变化，然而模式5’-Pu Pu CG Pu:Py CG Py Py-3’(其中与回文中心(用“：”标记)等距的Pu、Py碱基是互补的)是优选的。在DNA链的一端发现的polyG尾可以在长度上变化。
B型CpG ODN可以具有一个或多个含有CpG基序的6mer共有序列。人共有序列可以含有序列5’-Pu Py C G Py Pu-3’。(小鼠序列可以是不同的。)B型CpG ODN具有全部硫代磷酸的(PS修饰的)骨架，并且长度一般是18至28(例如18-22)个核苷酸。B型CpG ODN的一个实例是ODN 1826，其具有序列5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’。
C型CpG ODN结合了A类型和B类型二者的特征。C型CpG ODN全部由硫代磷酸核苷酸组成并含有含一个或多个CpG基序的回文序列。C型CpG ODN的一个实例是ODN2395，其具有序列5’-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3’(回文用下划线标注)。
另外，也可以使用P型CpG ODN，其含有两个回文序列，使得它们形成更高的有序结构。
CpG寡聚核苷酸可以通过本领域已知的标准寡聚核苷酸合成方法来合成。
因此用于本发明用途的CpG寡聚核苷酸延伸至6-50个碱基，优选18-27个，优选20-25个碱基的单链寡聚核苷酸，其包括至少一个CpG基序和至少一个碱基在所述基序的每个3’和5’侧，其中所述CpG基序是接有通过磷酸键或硫代磷酸键连接的鸟嘌呤的胞嘧啶，其中胞嘧啶的嘧啶环是未甲基化的。在一个实施方案中，一个或多个基序两侧具有序列，其与一个或多个基序提供回文序列。如本文所指的“回文序列”提供连接到反向的互补序列的正向序列，这样序列可以形成发夹，例如cggcgc:gcgccg(其中回文的中心用“:”标记)。CpG基序可以形成序列的中心和/或在回文序列中的其他处。优选地回文序列(包括正向序列和反向序列二者)的长度是8至16个碱基，优选10-12或10-14个碱基。
在一个进一步优选的方面，CpG寡聚核苷酸序列含有回文序列。
5’-Pu Pu CG Pu:Py CG Py Py-3’，其中与回文中心(用“：”标记)等距的Pu、Py碱基是互补的和/或一个或多个共有序列5’-Pu Py CG Py Pu-3’。任选地CpG寡聚核苷酸可以在3’或5’端含有长度为3至8个碱基的poly G尾。
在本发明的一个优选的实施方案中，CpG寡聚核苷酸是C型CPG ODN，为具有10-14个碱基的回文序列的18-27个碱基和硫代磷酸骨架。特别优选的是ODN 2395，其具有序列：
5’-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3’(回文序列用下划线标注)。
在本发明的一个可选的优选的实施方案中，CpG寡聚核苷酸是B类型CPG ODN，为18-22个碱基和硫代磷酸骨架。特别优选的是ODN 1826，其具有序列：
5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’。
TLR11和TLR12配体包括前纤维蛋白(profilin)，其是一种参与肌动蛋白细胞骨架的动态翻转和重建的肌动蛋白结合蛋白。因此优选的TLR11/12配体是来自弓形虫(Toxoplasma gondii)的前纤维蛋白，其是一种引起疾病弓形虫病的必要的、细胞内、寄生性原生动物。前纤维蛋白可以从例如Enzo Life Sciences购得。
TLR13配体包括细菌核糖体RNA序列“CGGAAAGACC”,并且包含该核苷酸序列的核苷酸和该配体形成本发明的一个优选的方面。具有序列5’-GGACGGAAAGACCCCGUGG-3’的寡聚核苷酸是TLR13配体并且可从例如Invivogen购得。
因此，优选地所述TLR配体是TLR 2、3、4、7、8或9配体，优选地为如上所述的配体。在一个优选的实施方案中，TLR配体是TLR 3配体，优选地为如上所述。在一个可选的优选的实施方案中，TLR配体是TLR 4配体，优选为如上所述。在另一个可选的优选的实施方案中，TLR配体是TLR7-9配体或TLR7配体或TLR8配体或TLR 9配体，优选为如上所述。
如本文所用，“表达”或“呈递”是指抗原分子或其部分出现在所述细胞的表面上，这样该分子的至少一部分暴露于和可进入包围该细胞的环境，优选地这样可以针对呈递的分子或其部分产生免疫反应。在“表面”上的表达可以实现，其中待被表达的分子与细胞膜和/或可以出现在该膜或导致出现在该膜的成分接触。
本文所用的术语“细胞”包括所有的真核细胞(包括昆虫细胞和真菌细胞)。因此具有代表性的“细胞”包括所有类型的哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和原生动物。然而，优选地，细胞是哺乳动物细胞，例如来自猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠，但是最优选是来自人的细胞。
在本发明的方法中，使用第一细胞，其能呈递抗原分子或其部分于其表面。因此，用于本发明的方法、用途等的第一细胞可以是任意能在其表面上表达或呈递一种待施用到或运送到其细胞溶质的分子的细胞。
第一细胞方便地为免疫细胞，即参与免疫反应的细胞。然而，其他细胞也可以呈递抗原到免疫系统并且这些也落入本发明的范围。因此，根据本发明的第一细胞有利地为如下文所述的抗原呈递细胞。抗原呈递细胞可以参与如本文所定义的免疫反应的任意方面或“部分(arm)”。
细胞毒性细胞的激发要求通过抗原呈递细胞以特定的方式(例如MHC I类呈递)将抗原呈递到待被刺激的细胞(例如CD8+细胞毒性T细胞的活化要求MHC-1抗原呈递)。抗体产生细胞也可以通过抗原呈递细胞由抗原呈递来刺激。
抗原可以通过内吞作用由抗原呈递细胞接受并且在胞摄囊泡中降解为肽。这些肽可以在内涵体中结合到MHC II类分子并运送到细胞表面，在那里肽-MHC II类复合体可以被CD4+辅助性T细胞识别并诱发免疫反应。或者，细胞溶质中的蛋白可以被(例如被蛋白酶体)降解并通过TAP(与抗原呈递相关的转运体)的方式运送进内质网，在那里肽可以结合到MHC I类分子并被运送到细胞表面(Yewdell和Bennink,1992,Adv.Immunol.52:1-123)。如果肽是外源抗原来源，肽-MHC I类复合体会被CD8+细胞毒性T细胞(CTL)识别。CTLs会结合到肽-MHC(HLA)I类复合体并因此被活化，开始增殖并形成CTL的克隆。靶细胞和其他在细胞表面上具有相同肽-MHC I类复合体的靶细胞可以被CTL克隆杀死。如果可以引进细胞溶质足够量的抗原，就可以建立针对外源抗原的免疫(在前的Yewdell和Bennink,1992；Rock,1996,Immunology Today 17:131-137)。这是其中癌症疫苗开发的基础。最大的实践问题之一是将足够量的抗原(或抗原的部分)引进到细胞溶质。这可以根据本发明解决。
如前面提到地，一旦通过光化学内化过程被释放到细胞溶质中，抗原分子可以通过细胞的抗原处理机制处理并以适当的方式(例如由I类MHC)呈递到细胞表面上。该处理可以涉及抗原的降解，例如蛋白或多肽抗原降解为肽，然后这些肽与MHC的分子复合用于呈递。因此，根据本发明表达到或呈递到细胞的表面上的抗原分子可以是内化的(内吞的)抗原分子的部分或片段。
多种不同的细胞类型可以呈递抗原于其表面，包括例如，淋巴细胞(T细胞和B细胞二者)、树突细胞和巨噬细胞等。其他包括例如癌细胞，例如黑素瘤细胞。这些细胞在本文称为“抗原呈递细胞”。“专职抗原呈递细胞”是主要参与将抗原呈递到免疫系统的效应器细胞的免疫系统的细胞，在本领域是已知的并描述于文献中，并且包括B淋巴细胞、树突细胞和巨噬细胞。优选地细胞是专职抗原呈递细胞。
对于通过抗原呈递细胞将抗原呈递到细胞毒性T细胞(CTL)来说，抗原分子需要进入抗原呈递细胞的细胞溶质(Germain,Cell,1994,76,287-299)。
在本发明的实施方案中，例如涉及体外或离体方法，或者体内方法，第一细胞(或在体内方法中呈递抗原的细胞)优选为树突细胞。树突细胞是形成部分哺乳动物免疫系统的免疫细胞。它们的主要功能是处理抗原材料并将其呈递在免疫系统的其他细胞的表面上。一旦活化，它们迁移到淋巴结，在那里它们与T细胞和B细胞相互作用而启动适应性免疫反应。
树突细胞可源自造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转变为不成熟树突细胞，其特征在于高的内吞活性和低的T细胞活化潜能。一旦它们与呈递的抗原接触，它们就活化为成熟的树突细胞并开始迁移到淋巴结。不成熟树突细胞吞噬病原体并将它们的蛋白降解为小片，并且一旦成熟，使用MHC分子呈递那些片段在它们的细胞表面。
树突细胞可以源自任意合适来源的树突细胞，例如来自皮肤、鼻内层、肺、胃和肠或血。在本发明的一个特别优选的实施方案中，树突细胞来自骨髓。
树突细胞可以从自然来源分离用于本发明的体外方法或者可以在体外产生。树突细胞产生于单核细胞，即白细胞，白细胞在体内循环并且依赖正确的信号可以分化为树突细胞或巨噬细胞。单核细胞转而从骨髓中的干细胞形成。单核细胞衍生的树突细胞可以在体外由外周血单核细胞(PBMC)产生。在组织培养瓶中将PBMC铺板允许单核细胞的附着。用白细胞介素4(IL-4)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理这些单核细胞导致在大约一周后分化为不成熟树突细胞(iDC)。用肿瘤坏死因子(TNF)的后续处理进一步将iDC分化为成熟的树突细胞。
在另一个优选的方面，第一细胞(或在体内呈递抗原的细胞)可以是巨噬细胞。
如本文所述的第二细胞是检查点抑制剂可以与其结合的细胞。这种细胞可以表达检查点分子，例如检查点蛋白或脂质，或检查点抑制剂可以与之结合的其受体或配体。如本文所用地提及被检查点抑制剂结合是指产生特定的结合相互作用(例如到结合配偶体)，例如抗体到含有在第二细胞上出现的相关表位的靶标分子。第一细胞和第二细胞可以是单个细胞，例如均能表达抗原分子或其部分于其表面上并结合检查点抑制剂。然而，方便地，它们是单独的细胞。在这种情况下，在一个优选的特征中，第二细胞是免疫系统的细胞，尤其优选为T细胞或B细胞并且优选为一旦表达在第一细胞上就能特异性识别抗原分子或其部分的细胞。虽然不期望受到理论的束缚，相信在其中使用第一细胞和第二细胞的该方法中，第一细胞表达抗原分子或其部分，第二细胞被所述第一细胞上的所述表达刺激，其中通过使用检查点抑制剂提高该刺激。当使用单细胞时，产生的细胞具有提高的能力以激活免疫反应或易于发生免疫反应。
如本文所用，“接触”是指将不同的成分(例如第一细胞和光敏剂和/或抗原分子(和任选的TLR配体)，或第二细胞和检查点抑制剂)如本文限定地在适于内化到细胞和/或检查点抑制剂结合的条件下(例如，优选在合适的营养培养基中在37℃，例如25-39℃或在体温下体内，即36-38℃)彼此进行物理接触。类似地，第一细胞和第二细胞(当不同时)可以彼此接触以允许这些细胞之间的相互作用，例如由呈递抗原分子的第一细胞激发第二细胞。该接触可以发生在贯穿所述方法中或可以仅仅发生在所述方法的部分中，例如在辐照发生后。
在体外当使用第一细胞和第二细胞时，可以使用多种不同的组合和时机。因此，例如，所有不同的试剂和细胞可以在所述方法期间彼此接触或者细胞和/或试剂可以在不同的时间点加入。如本文所述，当“至少”第一细胞或第二细胞与一种或多种试剂接触时，第一细胞或第二细胞必须存在，但是另外，其他细胞也可以存在。第一细胞与至少光敏剂和抗原分子(和任选地检查点抑制剂)接触，第二细胞与至少检查点抑制剂接触。这可以在单独的容器内实现或者所需的成分可以一起加入。当第一细胞和第二细胞是单细胞时，多种试剂全部添加到相同的细胞，但是添加的顺序可以变化。
因此，如本文所定义地，第一细胞可以与光敏剂和抗原分子(和任选地TLR配体)顺序或同时接触。任选地，检查点抑制剂也可以与第一细胞接触。优选地并且方便地，一种或多种成分同时(单独或一起)与第一细胞接触。例如，至少光敏剂和抗原分子(和任选地TLR配体)可以同时与细胞接触并且检查点抑制剂也可以同时加入或可以在那些成分(有或没有第二细胞加入，当第二细胞与第一细胞不同时)之前或之后加入。光敏剂和抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体，当使用时)可以被细胞接受进入相同或不同的细胞内区室(例如它们可以共移位)。
将细胞暴露于合适波长的光以活化光敏化合物，所述光敏化合物转而导致细胞内区室膜的分解。方便地，这在向第一细胞加入抗原分子和光敏剂后进行，但是也可以在该添加之后进行。
WO 02/44396(其通过引用的方式并入本文中)描述了一种方法，其中方法中步骤的顺序可以这样安排，例如光敏剂与细胞接触并在待内化的分子(在这种情况下是抗原分子)与细胞接触之前通过辐照活化。这种方法利用了以下事实：在辐照时，待内化的分子没必要出现在与光敏剂相同的细胞亚区室。
因此，在一个实施方案中，如本文定义地，所述光敏剂和/或所述抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体，当使用时)一起或单独地(相对于彼此)应用到第一细胞。然后当至少光敏剂和抗原分子出现在相同的细胞内区室时进行辐照。这被称为“光后”方法。
在一个可选的实施方案中，如本文定义地，可以首先通过将所述第一细胞与光敏剂接触，接着与抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体，当使用时)接触进行所述方法，并且辐照在光敏剂摄入细胞内区室后，但是在抗原分子细胞接受到含有所述光敏剂的细胞内区室(例如在光暴露时，它可以出现在不同的细胞内区室)之前进行，优选在细胞摄取进入到任意细胞内区室之前，例如在任意细胞摄取之前。因此，例如光敏剂可以在辐照后施用，然后施用剩余的试剂。这是所谓的“光前”方法。
如本文所用，“内化”是指细胞内(例如细胞溶质的)分子传递。在本案中，“内化”可以包括将分子从细胞内/膜界定的区室释放进入到细胞的溶质的步骤。
如本文所用，“细胞摄取”或“移位”是指内化步骤中的一个，其中细胞膜外的分子(例如通过内吞或其他合适的摄取机制)接受进入细胞这样它们在外围细胞膜的内部发现，例如进入到细胞内膜限制的区室(例如内质网、高尔基体、溶酶体、内涵体等)或与其相关联。
将细胞与多种试剂接触的步骤可以以任意方便的或期望的方式进行。因此，如果接触步骤要在体外进行，细胞可以方便地保持在水介质(例如合适的细胞培养基)中，并且在合适的时间点，在适当的条件下可以将多种试剂简单添加到培养基，例如以合适的浓度和合适的时间长度。例如，在无血清培养基或含血清培养基的存在下，可以将细胞与试剂接触。
以下评述讨论多种试剂单独地应用于细胞。然而，如上所讨论地，这些试剂可以一起、单独、同时或依次地应用于细胞。如本文所述，在本发明的方法中使用的多种试剂可以在体外或体内应用于细胞。在后者的情况下，所述应用可以经由如下文更详细的描述的直接(即局部)或间接(即系统或非局部)施用。
将光敏剂以合适的浓度和合适的时间长度与细胞(或待处理的受试者，其中存在这种细胞)接触，所述合适的浓度和合适的时间长度可以容易地由技术人员使用常规技术确定，并且会依赖于这样的因素，例如所用的特定的光敏剂和靶细胞类型和位置。光敏剂的浓度是合宜的，这样一旦被摄取进入细胞(例如进入到一个或多个其细胞内区室或与一个或多个其细胞内区室相关联)并被辐照活化，一个或多个细胞结构分解，例如一个或多个细胞内区室被溶解或分解。例如，如本文所述的光敏剂可以以例如10至50μg/ml的浓度使用。
对于体外使用，该范围可以宽得多，例如0.0005-500μg/ml。对于体内人的治疗，当系统施用时，光敏剂可以以0.05-20mg/kg体重的范围使用。或者，可以使用0.005-20mg/kg体重的范围用于系统施用。更方便地，局部施用光敏剂，例如通过皮内、皮下或瘤内施用，并且在该情况下，剂量可以是1-5000μg，例如10-2500、25-1000、50-500、10-300或100-300μg的范围。优选地所述剂量选自25μg、50μg、100μg、150μg、200μg和250μg。优选地所述剂量为75-125μg，例如100μg。所提供的剂量是对于平均重量(即70kg)的人而言。对于皮内注射，光敏剂剂量可以溶解于100μl-1ml，即浓度可以在1-50000μg/ml的范围。在较小的动物中，浓度范围可以是不同的并且可以相应地调节，虽然当局部施用时，对于不同的动物，剂量上小的变化是必要的。
待使用的抗原的浓度会依赖于待使用的抗原。方便地，可以在体外使用浓度为0.001-500μg/ml(例如20-500、20-300、20-100μg/ml、20-50、10-50、5-50、1-50、0.01-50或0.001-50μg/ml)的抗原。对于肽抗原，可以使用较低的浓度，例如0.001-500μg/ml，例如0.001-1、5、25、50或100μg/ml。对于蛋白抗原，可以使用更高的浓度，例如为0.5-500μg/ml。对于体内使用，蛋白抗原剂量可以是0.5-500μg的范围，例如10-100μg或10-200μg。对于肽抗原，可以采用的体内剂量为0.1-4000μg，例如0.1-2000μg、0.1-1000μg或0.1-500μg，例如0.1-200μg。这种剂量对于局部施用是合适的。当抗原分子含有多于一种抗原时，上述浓度可以应用到所使用的总抗原或所使用的每种抗原。合适的浓度可以依赖考虑的试剂摄取进入考虑的细胞的效率和期望在细胞中实现的终浓度来确定。
待使用的检查点抑制剂的浓度将依赖待使用的检查点抑制剂。方便地，可以在体外使用0.001-500μg/ml(例如20-500、20-300、20-100μg/ml、20-50、10-50、5-50、1-50、0.01-50或0.001-50μg/ml)的浓度。对于体内使用，检查点抑制剂剂量可以是在0.5-500μg，例如10-100μg或10-200μg的范围。在一个优选的实施方案中，可以使用100μg或200μg的剂量。这种剂量适于局部施用。对于系统(例如静脉内或腹膜内)施用，剂量可以是在0.1-45mg/kg的范围，例如1-40、5-35、10-30或15-25mg/kg，例如5-10mg/kg或2-5mg/kg，例如3mg/kg。当使用多于一种检查点抑制剂时，上述浓度可以应用到所使用的总检查点抑制剂或所使用的每种检查点抑制剂。
合适的浓度可以依赖考虑的检查点抑制剂对考虑的细胞的效率和期望在细胞中实现的终浓度来确定。
如本文所定义的TLR配体的浓度，当使用时，也依赖待使用的特定的分子，并且技术人员会知晓合适的浓度或剂量。当使用多于一种TLR配体时，以下浓度可以应用到所使用的总的TLR配体或所使用的每种TLR配体。
合适的体外和体内浓度或剂量的实例如下表2所示。
表2
Figure BDA0001441672340000231
因此，例如，方便地可以在体外使用1-100μg/ml(例如20-100μg/ml或20-50μg/ml)的浓度。可以使用体内剂量为10-1000μg的咪唑喹啉化合物，例如可以在小鼠中采用20-100μg，在人中采用10μg-10mg。对于在人中例如咪喹莫特的局部施用，可以例如以1-5mg/cm2，如2.5mg/cm2，使用2.5-50mg的剂量。对于瑞喹莫德，剂量可以是0.1-50mg，例如1-5mg，例如以1-5mg/cm2。类似的剂量适于gardiquimod。对于咪唑喹啉化合物的皮内注射，可以使用较小的剂量，例如可以使用至少10μg或50μg，例如10μg-1mg。类似的剂量可以用于CpG寡聚核苷酸和其他的TLR配体。Poly(IC)可以以在小鼠中1-100μg(例如5μg或10μg)和在人中1μg-10mg的体内剂量施用。
在大多数情况下，如本文定义的光敏剂、抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体(当使用时))一起施用，但是这可以变化。因此，对于每种不同的成分考虑施用(或与细胞接触)的不同时机或方式或位点，这种方法包含在如本文所述的发明的范围内。
在一个实施方案中，特别是在本发明的体内方法和用途中，光敏剂、抗原分子(和TLR配体(当使用时))一起施用并与检查点抑制剂分开施用。分开施用可以是同时的(例如当经由不同的施用途径在体内使用时)或可以是连续的。在一个体内实例中，检查点抑制剂可以相对于其他试剂在多个时刻施用，例如在治疗的过程中，相对于可以施用例如1、2或3次的其他试剂，其可以施用3、4、5或6或更多次。本发明的方法包括其中在PCI方法中的光照发生在所有相关试剂已经接触细胞(或已经体内施用)之后(或在光照后允许内化进入相关区室之前不久)的方法。因此，检查点抑制剂可以与其他成分分开施用，例如以独立的配方。如果使用多于一种检查点抑制剂(或抗原或TLR配体)，可以相对于彼此分开、同时或依次施用不同的检查点抑制剂(抗原或TLR配体)。
在一个实施方案中，其中在方法中使用TLR配体，如本文定义的TLR配体(例如CpG寡聚核苷酸或咪唑喹啉化合物、LPS或poly(IC)分子)与抗原分开施用，例如以独立的配方，例如霜或凝胶，或系统地，例如通过口服(例如用瑞喹莫德)。因此，在一个实施方案中，TLR配体(例如CpG寡聚核苷酸或咪唑喹啉化合物)可以在施用抗原和/或光敏剂之前施用，例如24小时之前，例如通过本地(局部)前处理。在一些情况下，TLR配体(例如Poly(IC)或LPS)在抗原分子之前、一起或之后施用。
TLR配体可以相对于其他试剂分开施用，例如在光照前大约2小时。在一个可选的实施方案中，所述试剂可以与抗原一起，或在同一时间(即同时)施用。检查点抑制剂(和优选地所描述的用于方法中的所有试剂)优选在光照的120、72小时内，优选地在光照的48、24、12、6、4、2、1小时、30或15分钟内施用(即在光照前或光照后)
如本文限定的细胞(第一或第二细胞(视情况而定)或体内的相关等效细胞)和光敏剂和/或抗原分子和/或检查点抑制剂(和TLR配体(当使用时))之间的接触方便地为15分钟至24小时，例如30分钟至4小时，优选1.5至2.5小时。或者，时间范围可以是约1小时至约48小时，例如约2小时至约40小时，或约6小时至约36小时，例如12小时至30小时，如16小时至20小时，如18小时或约18小时。
在一个优选的实施方案中，第一细胞(或体内的等效细胞)的最初孵育是与光敏剂一起。在一个实施方案中，光敏剂和抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体，当使用时)的施用之间的时间为大约几个小时。例如，光敏剂可以在光照之前的16至20小时(例如18小时)应用，而抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体，当使用时)可以在光照之前的1至3小时(例如2小时)施用。因此，光敏剂和抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体，当使用时)的施用之间的时间可以为15至23小时的范围。
因此，如本文限定地，在与光敏剂孵育后，然后将第一细胞(或体内等效细胞)与抗原(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体，当使用时)孵育。方便地，在与光敏剂/抗原接触之后并在辐照之前(例如30分钟至4小时，如1.5至2.5小时，取决于与光敏剂和抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体，当使用时)孵育的时机)，可以将细胞置于无光敏剂/无抗原培养基中。
如果第二细胞不也是第一细胞，类似的考虑应用于针对第二细胞与检查点抑制剂(和其他试剂(当存在时))的接触时间。因此，例如，第二细胞可以与检查点抑制剂接触以上表明的时间，虽然如果单独处理第一细胞，所述第二细胞的辐照不必需发生。
体内合适的方法和孵育的时间(借此将多种试剂与靶细胞接触)会取决于这样的因素，例如施用的方式和所使用的试剂的类型。例如，如果将试剂注射进待治疗/辐照的肿瘤、组织或器官，相比于位于注射点更远距离的细胞，注射点附近的细胞会更快地接触并因此趋向于摄取或结合一种或多种试剂，而位于距离注射点更远距离的细胞可能在更晚的时间点和更低的浓度接触试剂。方便地，可以使用6-24小时的时间。
另外，通过静脉注射或口服施用的试剂可能需要一些时间以到达靶细胞，因此其可能需要更长的施用后时间(例如几天)来使足够量或最优量的试剂积累在靶细胞或组织中和/或上。因此，对于体内的个别细胞所要求的施用时间好像随着这些和其他参数改变。
然而，虽然体内的情况比体外更复杂，但是本发明的基本概念仍是相同的，即分子与靶细胞接触的时机必须如此：辐照发生之前，合适量的光敏剂已经被靶细胞接受并且：(i)在辐照之前或期间，抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体(当使用时))或者已经被摄取或者在与靶细胞充分接触之后会被摄取进入细胞，例如进入到相对于光敏剂相同或不同的细胞内区室，或者(ii)在辐照后，抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体(当使用时))与细胞充分接触一段时间以允许其被摄取进入细胞。类似地，检查点抑制剂与靶细胞的接触必须如此：检查点抑制剂的结合能发生并且这种结合应该优选在已经摄取抗原分子的细胞在细胞表面上呈递该分子或其部分的时候完成。
对于本文所述的试剂的体内施用，可以使用本领域常见或标准的任意施用方式，例如注射、灌注、局部施用、经皮施用、体表内和体表外等。对于体内使用，本发明可以用于任意相关组织，所述组织含有含光敏剂的化合物或抗原分子定位在其中的细胞，包括体液位置以及实体组织。所有的组织都可以被处理，只要光敏剂被靶细胞接受并且光能被合适地传递。优选的施用方式，例如对于光敏剂(和/或抗原分子和TLR配体，当使用时)是皮内、皮下、局部或瘤内施用或注射，优选地所述施用是通过皮内注射或瘤内注射。对于检查点抑制剂施用可以是例如通过系统(如静脉)施用或通过瘤内施用。或者，如在实施例中表明地，可以使用腹膜内施用。
为了达到期望的结果(例如抗原呈递、产生免疫反应或疫苗接种)，可以重复该方法或其部分，例如可以进行“再次疫苗接种”。因此，该方法以其整体可以在适当的间隔后进行多次(例如2、3或更多次)，或者可以重复该方法的部分，例如进一步施用如本文限定的检查点抑制剂(和/或TLR配体，当使用时)或额外的辐照步骤。例如，该方法或该方法的部分可以再次进行，在其第一次进行后的大约几天，例如5至60天(如7、14、15、21、22、42或51天)，例如7至20天，优选14天，或数周，例如1至5周(如1、2、3或4周)。在适当的时间间隔(例如每两周或14天)可以将该方法的全部或部分重复多次。在一个优选的实施方案中，该方法重复至少一次。在另一个实施方案中，该方法重复两次。
在一个实施方案中，除了进行该方法多次外，检查点抑制剂可以额外地单独施用，例如在每次进行该方法之前或之后，例如1、2或3或更多次，例如如在实施例中所述。
在一个可选的实施方案中，本发明的方法的部分可以在进行本发明的方法之前进行。例如，在进行本发明的方法之前在没有检查点抑制剂时，该方法可以进行一次或多次，例如两次。或者，在进行本发明的方法之前在没有光敏剂和光照(和任选地TLR配体)时，该方法可以进行一次或多次，例如两次。该方法的部分可以在进行本发明的方法之前的大约几天进行，例如7至14天，或者数周，例如1、3或4周。该方法的部分可以在进行本发明的方法之前以这些时间间隔重复一次或多次。因此，在一个优选的方面，抗原分子施用(例如到受试者)等于或大于2次(例如以以上讨论的时间间隔)，其中至少所述抗原分子的施用根据本发明的方法进行。
另外描述地，本发明提供如本文所述的一种方法，其使用抗原分子、光敏剂和任选地TLR配体(而不是检查点抑制剂)，该方法联合施用(细胞接触)检查点抑制剂进行(一次或多次)并且所述方法可以按照优选的实施方案并针对如本文所述的方法和用途以及用于用途的产品进行。
“辐照”以活化光敏剂是指如下文所述地直接或间接地施用光。因此，可以用光源光照受试者或细胞，例如直接地(例如在体外的单个细胞)或间接地，例如在体内当细胞在皮肤表面下时或者是细胞层的形式时，不是所有的都直接受到光照，即没有其他细胞的遮挡。对细胞或受试者的光照可以发生在施用如本文限定的光敏剂、抗原分子(和任选地检查点抑制剂和/或TLR配体)之后的大约18-24小时。
活化光敏剂的光辐照步骤可以根据本领域公知的技术和步骤进行。待使用的光的波长根据待使用的光敏剂选择。合适的人造光源在本领域是公知的，例如使用蓝(400-475nm)或红(620-750)波长的光。对于TPCS2a，可以使用400至500nm的波长，更优选400至450nm，例如430-440nm，甚至更优选大约435nm或435nm的波长。合适的情况下，可以用绿光活化光敏剂(例如卟啉或二氢卟吩)，例如可以用绿光活化KillerRed(Evrogen，莫斯科，俄罗斯)光敏剂。
合适的光源在本领域是公知的，例如PCI Biotech AS的
Figure BDA0001441672340000261
lamp。或者，可以使用具有上至60mW的可调节的输出功率和430-435nm的发射光谱的LED基光照设备。对于红光，合适的光照源是PCI Biotech AS 652nm激光系统SN576003二极管激光，尽管可以使用任意合适的红光源。
在本发明的方法中细胞暴露于光的时间可以变化。分子内化进入细胞溶质的效率随着对光的暴露增加而增加直至最大值，超过最大值时细胞损伤和因此的细胞死亡增加。
对于辐照步骤的优选时间长度取决于这样的因素，例如靶标、光敏剂、在靶细胞或组织中积累的光敏剂的量和光敏剂的吸收光谱与光源的发射光谱之间的重叠。一般地，对于辐照步骤的时间长度是在秒至分钟的数量级或上至几小时(甚至上至12小时)，例如优选上至60分钟，例如0.25或1至30分钟，例如0.5至3分钟或1至5分钟或1至10分钟，例如3至7分钟，并优选地大约3分钟，例如2.5至3.5分钟。也可以使用较短的辐照时间，例如1至60秒，例如10-50、20-40或25-35秒。
合适的光剂量可以由本领域技术人员选择并也取决于所用的光敏剂和在靶细胞或组织中积累的光敏剂的量。当使用具有更高的可见光谱的消光系数(例如在红光区域，或蓝光区域(如果使用蓝光)，取决于所用的光敏剂)的光敏剂时，光剂量通常较低。例如，当采用具有上至60mW的可调节的输出功率和430-435nm的发射光谱的LED基光照设备时，在0.05-20mW/cm2范围(例如2.0mW/cm2)的能量密度下可以使用0.24-7.2J/cm2范围的光剂量。或者，例如如果采用
Figure BDA0001441672340000271
lamp，在0.1-20(例如如
Figure BDA0001441672340000272
提供的13)mW/cm2范围的能量密度下0.1-6J/cm2范围的光剂量是合适的。对于红光，可以使用在0.1-5mW/cm2范围(例如0.81mW/cm2)的能量密度下的0.03-1J/cm2(例如0.3J/cm2)的光剂量。
另外，如果要保持细胞生存活力，有毒种类的超水平产生是要避免的并且可以相应地调节相关参数。
由于光化学处理(即通过光动力治疗作用)通过在光敏剂活化时产生有毒种类，本发明的方法可能不可避免地产生一些细胞损伤。取决于建议的用途，该细胞损伤可能不是结果，而可能实际上对一些应用(例如癌症治疗)有利。然而，在大多数的实施方案中，要避免细胞死亡以允许产生来自呈递细胞的免疫反应。可以改进本发明的方法，这样通过选择与光敏剂的浓度相关的光剂量调节存活细胞的部分或比例。另外，这种技术在本领域是已知的。
优选地，基本上所有的细胞或绝大多数(例如至少75％，更优选至少80、85、90或95％的细胞)没有被杀死。PCI处理之后的体外细胞生存活力可以通过本领域已知的标准技术(如MTS检测)测量。在体内一种或多种细胞类型的细胞死亡可以在施用点的1cm半径内(或在组织的一定深度处)评价，例如通过显微术。由于细胞死亡不会立即发生，细胞死亡％是指在辐照几小时内(例如辐照后上至4小时)仍然存活的细胞的百分数，但是优选地是指辐照4小时或更多小时后存活细胞％。
本文描述的方法可以在体内、体外或离体进行。优选地，该方法在体外或离体使用以产生用于体内施用的细胞或者该方法在体内施用。因此，在一个优选的特征中，该方法可以用于在受试者中引起免疫反应。
如上文所述，在一个优选的方面，本发明提供一种在受试者中引起免疫反应的方法，该方法包括向所述受试者施用如上文限定的抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和任选地TLR配体，并且用有效激活所述光敏剂的波长的光辐照所述受试者，其中引起免疫反应。
可能引起的“免疫反应”可以是体液和细胞介导的免疫，例如抗体产生的刺激，或细胞毒细胞或杀伤细胞的刺激，其可以识别并破坏(或消除)在它们的表面上表达“外源”抗体的细胞。因此，术语“激发免疫反应”包括用于激活它们的所有类型的免疫反应和机制并包括激发CTL(其形成本发明的一个优选方面)。优选地，被激发的免疫反应是细胞毒性CD8T细胞。免疫反应的程度可以通过免疫反应的标志物(例如分泌的分子(如TNF-α或IFNγ)或抗原特异性T细胞的产生)来评价(例如如在实施例中所述地进行评价)。
细胞毒细胞或抗体产生细胞的激发需要待呈递到细胞的抗原以特定的形式被抗原呈递细胞激发，例如MHC I类呈递(例如CD8+细胞毒性T细胞需要MHC-I抗原呈递)。优选地免疫反应经由MHC-I呈递激发。
优选地，免疫反应用于治疗或预防疾病、失调或感染，例如涉及异常细胞增殖的状况，例如癌症或感染(如病毒感染，如肝炎)。因此，在一个进一步优选的实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂，并且用有效激活所述光敏剂的波长的光辐照所述受试者，其中引起免疫反应。
在一个实施方案中，所述癌症是黑素瘤。黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤，所述黑素细胞是负责产生黑色素的细胞，黑色素负责皮肤颜色。这些细胞在皮肤中是主导的，但是也在身体的其他部分发现，包括肠和眼。黑素瘤可以在含有黑素细胞的任意身体部位产生。
如本文所述的“黑素瘤”包括所有类型的黑素瘤，包括例如浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、肢端雀斑性黑素瘤和无黑素性黑素瘤、息肉样恶性黑素瘤、伴小痣样细胞的黑素瘤和具有Spitz痣特征的黑素瘤。
虽然大多数的黑素瘤发生在皮肤(皮肤恶性黑素瘤)，但是黑素瘤也可以发生在身体的别处，例如内脏器官中，例如粘膜中。透明细胞肉瘤是软组织的恶性黑素瘤。黑素瘤也可以发生在眼部(葡萄膜黑素瘤)、阴户、阴道或直肠。这些黑素瘤也包括在本发明的范围内。优选地待治疗的黑素瘤是皮肤黑素瘤。黑素瘤也延伸到转移性黑素瘤，即源于一级黑素瘤的细胞转移到不同的场所而产生二级肿瘤。如本文所述的黑素瘤的治疗或预防延伸至一级黑素瘤和/或源于一级黑素瘤的二级肿瘤的治疗。如此，本发明也具有治疗转移性黑素瘤的功用。
在一个可选的实施方案中，癌症与乳头瘤病毒相关或由其引起/诱导，尤其是人乳头瘤病毒(HPV)。如上所讨论地，乳头瘤病毒基因组被分为早期区(E)(编码6个(E1、E2、E4、E5、E6和E7)开放阅读框(ORF)，该开放阅读框在最初感染宿主细胞后立即表达)和晚期区(L)(编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2)。所有的病毒ORF编码在一条DNA链上。根据本发明可以使用的HPV抗原可以是如本文讨论的一种或多种已知抗原肽或T细胞表位，所述HPV抗原可以与HPV感染引起的癌症相关。如上所讨论地，存在几种类型的HPV，并且根据本发明与HPV相关的癌症可以与HPV的任意类型相关或由其导致，例如HPV-16和/或HPV-18，或HPV-31或HPV-45。根据本发明待使用的抗原可以衍生自E1、E2、E4、E5、E6或E7蛋白中的任意或L1和L2蛋白中的任意。因此，抗原分子可以衍生自HPV-16和18的E2、E6和E7蛋白中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，抗原分子含有HPV-16E7序列GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8表位用粗体示出)。因此，HPV抗原可以是35个氨基酸的肽。或者，抗原分子可以仅是CD8表位RAHYNIVTF，即一个较短的肽。
在一个可选的实施方案中，疾病、失调或感染是病毒感染，优选乳头瘤病毒感染，特别是人乳头瘤病毒(HPV)感染。
优选地该方法用于疫苗接种。如本文所述，“疫苗接种”是抗原(或含有抗原的分子)引起免疫反应的用途，所述免疫反应是预防性的或治疗性的对抗疾病、失调或感染的发展(或进一步发展)，其中该疾病、失调或感染与该抗原的异常表达或呈递相关。优选地所述疾病是癌症，例如黑素瘤或与乳头瘤病毒(如HPV)相关的癌症。在一个实施方案中，疫苗接种是治疗性的，例如在本文讨论的癌症的治疗中。在一个可选的实施方案中，疫苗接种是预防性的，例如用于预防癌症或在用治疗性的疫苗接种治疗早期的癌症后来减少进一步的癌症发展。在另一个实施方案中，当要引起针对感染的免疫反应时，例如病毒感染(如HPV感染)，疫苗接种在本质上是预防性的。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述方法(即疫苗接种)的受试者是哺乳动物，优选为猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但是最优选地受试者是人。
优选地本文所述的方法实现协同作用，即细胞表面呈递或引起的免疫反应的提高的程度高于通过如下观察到的结合的提高的程度：(i)在不存在检查点抑制剂(和TLR配体)下，用抗原分子和光敏剂(和光照)进行所述方法，和(ii)在不存在光敏剂和/或辐照步骤下，用抗原分子和检查点抑制剂(和任选地TLR配体)进行所述方法，即观察到所述方法之间的协同作用。细胞表面呈递或免疫反应产生的程度可以通过合适的方式评价，例如抗原特异性CD8+细胞的数量或免疫反应活化的标志物(如IFNγ或TNFα)的水平。
如本文所用的“协同作用”是指超过仅仅的附加效应的数量的提高。
在本发明的方法中使用的多种试剂可以单独、依次或同时施用给受试者。
以上讨论的与表达抗原分子或其部分于本发明的细胞表面上的方法的方面和特征，在适当的情况下，也可应用于以上引起免疫反应的方法，反之亦然。
本发明也提供一种用于将抗原分子引入细胞的溶质的方法，包括
a)提供第一细胞和第二细胞，其中所述抗原分子或其部分待表达于所述第一细胞上，检查点抑制剂可以与所述第二细胞结合，其中所述第一细胞和第二细胞可以是相同细胞或不同细胞；
b)将至少所述第一细胞与所述抗原分子、光敏剂和任选的TLR配体接触；
c)将至少所述第二细胞与检查点抑制剂接触，和
d)用有效激活所述光敏剂的波长的光辐照至少所述第一细胞，其中所述抗原分子释放到细胞的溶质中，并且所述抗原分子或其部分随后呈递在所述第一细胞的表面上，
其中所述第一细胞和第二细胞在所述辐照之前、期间和/或之后彼此接触。一旦被活化，含有所述化合物的所述细胞内的细胞内区室将在这些区室中包含的分子释放到细胞溶质中。
以上发明的方法可以用于体外或体内，例如用于原位治疗或用于离体治疗，随后将处理的细胞施用到机体。
本发明进一步提供一种表达抗原分子或其部分于它的表面的细胞或其群体，所述细胞通过如本文限定的任意方法可以获得(或得到)。本发明也提供用于预防或治疗用途的细胞或细胞群，如下文所述。
细胞群可以以药物组合物提供，所述药物组合物包含额外的一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
本发明也提供一种药物组合物，其包含如本文限定的抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和任选地TLR配体以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
可以根据药学领域已知的技术和步骤以任意方便的方式配制这些组合物(和本发明的产品)，例如使用一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。如本文所述的“药学上可接受”是指与组合物(或产品)的其他组分相容以及物理上可接受到接受者的组分。组合物和载体或赋形剂物质的性质、剂量等可以根据施用的选择和期望的途径、治疗的目的等以常规方式选择。剂量也可以以常规方式确定并且可以取决于分子(或组合物或产品的成分)的性质、治疗的目的、患者的年龄、施用的方式等。关于光敏剂，也应该考虑当辐照时破坏膜的效力/能力。
细胞(例如抗原呈递细胞)可以在体外制备。在治疗方法中，这些细胞可以体内施用于机体或施用于离体机体组织，这样那些细胞可以激发免疫反应，例如用于预防或治疗目的。
因此，本发明进一步提供如本文限定的细胞群(或含有其的组合物)或如本文限定的抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和任选地TLR配体，用于预防或治疗或用于在受试者中激发免疫反应(例如用于疫苗接种目的，例如用于激发CTL)，优选用于在所述受试者中治疗或预防疾病、失调或感染，特别用于治疗或预防癌症，如黑素瘤或与乳头瘤病毒(如HPV)相关的癌症。可替代地限定的，本发明提供(i)细胞群，(ii)如本文限定的组合物或(iii)抗原分子和/或光敏剂和/或检查点抑制剂和任选地TLR配体，用于制备用于激发受试者中免疫反应(例如用于激发CTL)(优选地用于在所述受试者中治疗或预防疾病、失调或感染，优选地用于疫苗接种和/或治疗或预防癌症，例如黑素瘤或与乳头瘤病毒(如HPV)相关的癌症)的药物的用途，其中优选地所述免疫反应由如本文限定的方法激发。
所述激发、治疗或预防优选地包括将所述药物施用给所述受试者。
所述抗原分子、光敏剂和检查点抑制剂(和任选地TLR配体)可以在组合物中结合和出现。替代的表达为，本发明提供如本文限定的抗原分子和/或光敏剂和/或检查点抑制剂和任选地TLR配体(当使用时)在制备用于激发受试者中免疫反应(例如用于激发受试者中的CTL)(优选在所述受试者中治疗或预防疾病、失调或感染，特别是用于疫苗接种目的)的药物中的用途，其中所述药物包含用于施用给所述受试者的表达抗原分子或其部分于所述细胞的表面的细胞群，所述细胞可以通过如本文限定的方法获得。优选地所述细胞群通过这样的方法获得。所述群用于施用给所述受试者。
在一个可选的实施方案中，本发明提供一种如本文限定的抗原分子、光敏剂和检查点抑制剂和任选地TLR配体，用于在细胞的表面表达所述抗原分子或其部分以激发受试者中的免疫反应(例如用于激发CTL)，优选用于在所述受试者中治疗或预防疾病、失调或感染，其中所述用途包含如本文限定的方法，优选地用于制备细胞群(例如树突细胞)。然后这些细胞可以施用给受试者。
本发明进一步提供一种产品，其包含如本文限定的抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和任选地TLR配体作为结合的制剂，用于在如本文限定的方法中激发受试者的免疫反应(或用于表达抗原分子或其部分于细胞的表面或用于内化抗原分子进入细胞的溶质)中同时、单独或依次使用，优选地用于在受试者中治疗或预防疾病、失调或感染。
本发明也提供一种试剂盒，用于激发受试者中的免疫反应，优选用于在所述受试者中治疗或预防疾病、失调或感染，例如用于疫苗接种或免疫，或在如本文限定的方法中用于表达抗原分子或其部分于细胞的表面或用于内化抗原分子进入细胞的溶质，所述试剂盒包含
第一容器，其包含如本文限定的光敏剂；
第二容器，其包含如本文限定的所述抗原分子；
第三容器，其包含如本文限定的检查点抑制剂；和任选地
第四容器，其包含如本文所述的TLR配体。
本发明的产品和试剂盒可以用于实现如本文限定的细胞表面呈递(或治疗方法)。
在另一个进一步的实施方案中，本发明提供一种在受试者中引起免疫反应(例如用于激发CTL)的方法，优选地在所述受试者中治疗或预防疾病、失调或感染，包括根据本文限定的方法制备细胞群和随后将所述细胞施用给所述受试者。
当将处理的细胞在体内施用时，由要求保护的本发明实现的抗原呈递可以有利地引起免疫反应的激发。优选地，产生赋予包含或含有所述抗原分子或其一部分的实体免受随后挑战的免疫反应，因此本发明发现了作为一种疫苗接种的方法的特殊功用。
所述疾病、失调或感染是任意可以通过免疫反应的产生来治疗或预防的疾病、失调或感染，例如通过消除异常或外源细胞，所述细胞可以基于抗原(或其表达水平)来鉴别，所述抗原允许相对于正常细胞进行辨别(和消除)。待使用的抗原分子的选择决定了待治疗的疾病、失调或感染。基于以上讨论的抗原分子，本文所述的方法、用途、组合物、产品、试剂盒等等可以用于治疗或预防(例如)感染(例如如上文所述的病毒或细菌感染)、癌症或多发性硬化。这种疾病、失调或感染的预防可能构成疫苗接种。
如本文定义地，“治疗”是指相对于治疗前的症状，减少、减轻或消除疾病、失调或感染的一种或多种正在治疗的症状。所述治疗可以包括在治疗癌症的情况下减少肿瘤的尺寸或体积或当治疗异常细胞增殖时减少异常细胞的数量。“防止”(或预防)是指延迟或防止疾病、失调或感染的症状的发生。预防可以是完全的(这样就没有疾病发生)或可以是仅在一些个体或一段有限的时间是有效的。
对于细胞的体内施用，可以使用本领域常见的或标准的细胞群的任意施用方式，例如通过合适的途径进行注射或灌注。方便地，细胞通过淋巴管内注射施用。优选地1×104至1×108个细胞施用给每公斤受试者(例如在人中每公斤1.4×104至2.8×106)。因此，例如，在人中，0.1-20×107个细胞的剂量可以以一个剂量，即每剂量，例如作为疫苗接种剂量施用。如果需要，该剂量可以在以后的时间重复。
附图说明
参照以下附图，本发明将在以下的非限制性实施例中进行更详细地描述，其中：
图1示出了PCI与检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。结果以在疫苗接种时间点的体积中的％示出肿瘤体积。
图2示出了用TRP-2肽再次激发脾细胞(分离自如表明的体内处理后的小鼠)后针对TRP-2五聚体染色的中值(抗原特异性％，总的CD8+细胞中的CD44+细胞)。
图3示出了用TRP-2肽再次激发脾细胞(分离自如表明的体内处理后的小鼠)后来自干扰素-γ(IFN-γ)细胞内染色的结果。
图4示出了用TRP-2肽再次激发脾细胞(分离自如表明的体内处理后的小鼠)后来自TNF-α细胞内染色的结果。
图5示出了PCI与检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1(一起使用)在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。结果显示肿瘤接种后的肿瘤体积中位数。
图6示出了PCI与检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1(一起使用)在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。结果显示肿瘤接种后的动物存活。
图7示出了当与poly(IC)结合使用时，PCI与检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1(一起使用)在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。结果显示肿瘤接种后的肿瘤体积中位数。
图8示出了当与poly(IC)结合使用时，PCI与检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1(一起使用)在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。结果显示肿瘤接种后的动物存活。
图9示出了PCI与检查点抑制剂抗PD-1在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。结果显示肿瘤接种后的肿瘤体积中位数。
图10示出了PCI与检查点抑制剂抗PD-1在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。结果显示肿瘤接种后的动物存活。
具体实施方式
实施例1
进行本研究以探究PCI结合检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。
材料和方法
小鼠
C57BL/6小鼠购自Harlan(霍斯特，荷兰)。所有的小鼠饲养在无特定病原体(SPF)条件下，并且所进行的操作得到了瑞士兽医当局的批准。
肿瘤接种
在第0天在小鼠的右侧将200000TC-1肿瘤细胞(得到约翰霍普金斯大学(3400N.Charles St.,巴尔的摩，MD 21218-2695)的授权)皮下接种于小鼠。
免疫方案
进一步的处理方案在表3中列出。在表3所示的时间点通过腹膜内注射施用检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1。检查点抑制剂的剂量为对于抗CTLA4每次注射100μg，对于抗PD-1每次注射200μg。两种检查点抑制剂均获得自Bio X Cell，10Technology Drive，2B室，西黎巴嫩，NH03784-1671，美国(mAb anti m CTLA-4，产品目录号BE0131和mAb anti m PD-1，产品目录号BE0146)。
表3
Figure BDA0001441672340000321
Figure BDA0001441672340000331
每次免疫都通过皮内施用50μg HPV长肽抗原GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(United Peptides(荷尔恩顿,维吉尼亚)、25μg TPCS2a(Amphinex,PCI Biotech AS)(用于接受PCI处理的动物)和5μg高分子量聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(IC))(InvivoGen(圣地亚哥,美国))的不同组合的混合物来进行。在不同的实验组中的组合示出于下表4中。
表4
组别编号 处理 动物数目
1 未处理的对照 5
2 抗PD-1 5
3 HPV肽+poly(IC) 5
4 HPV肽+PCI 5
5 HPV肽+poly(IC)+PCI 5
6 HPV肽+抗PD-1 5
7 HPV肽+poly(IC)+抗PD-1 5
8 HPV肽+PCI+抗PD-1 5
9 HPV肽+poly(IC)+PCI+抗PD-1 5
10 抗CTLA4 5
11 HPV肽+poly(IC)+PCI+抗CTLA4 5
12 HPV肽+抗CTLA4 2
每次免疫18小时后，使用LumiSource光照设备(PCI Biotech AS)进行光照6分钟。
通过用数显卡尺测量两个垂直直径测量肿瘤尺寸每周两次或三次。使用以下公式计算肿瘤体积：
V＝(W2×L)/2
其中W是所测量的肿瘤的宽度直径，L是长度直径。
结果在图1中示出，其显示了在检查点抑制剂与Poly(IC)、HPV和PCI一起施用的组中肿瘤体积减小。
实施例2
材料和方法
C57BL/6小鼠、TPCS2a和Poly(IC)如实施例1中所述。TRP-2肽(序列SVYDFFVWL)获得自United Peptides(荷尔恩顿,维吉尼亚)。
正常小鼠的皮内光敏作用和免疫
在腹部区域(3-4cm2)将小鼠剃毛，并如下说明在第0天、第14天和第35天用200μgTRP-2肽、100μg TPCS2a和10μg高分子量poly(IC)使用0.3ml BD Micro-FineTM+具有30G针头的胰岛素注射器(BD，新泽西州，USA)通过皮内注射免疫。疫苗是光保护的并且在制备的60分钟内使用。疫苗以两次注射施用，每次50μl，一次在腹中线的左侧一次在右侧。在疫苗注射后的特定时间点，通过皮下注射Zoletil(10mg/kg体重，维克，挪威)的混合物麻醉小鼠并在相关的地方光照该小鼠。在一些实验组中(见下文)，抗CTLA4(3mg/kg，腹膜内施用)刚好在每次免疫前施用。
免疫小鼠的光照
在免疫后18小时，使用LumiSource(PCI Biotech)进行疫苗接种位点光照6分钟。
通过五聚体染色和细胞内染色分析免疫反应
在第一次免疫后的第60天处死动物，移出脾，并用TRP-2肽再次激发脾细胞并随后针对干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)用细胞内染色分析。针对IFN-γ的细胞内染色在37℃下用TRP-2过夜激发24孔板中的脾细胞后进行。布雷菲德菌素A(BrefeldinA)在最后4小时期间加入。然后洗涤细胞并用4％甲醛PBS液在冰上固定10分钟。加入抗CD16/32来封闭与Fc受体的非特异性结合。然后用0.1％NP40PBS液渗透细胞3分钟并在用抗IFN-γ、抗CD8和抗CD44抗体(eBioscience或BD Pharmingen)染色之前进行洗涤。使用FACSCanto(BD Biosciences，圣何塞，美国)获得细胞并用FlowJo 8.5.2软件(Tree Star,Inc.,Ashland,OR)分析。使用抗TNF-α抗体，如针对IFN-γ所述地进行针对肿瘤坏死因子α(TNF-α)的细胞内染色。
包括以下的实验组：
1.未处理的小鼠未免疫或光照。
2.TRP-2：在所有免疫中用TRP-2肽免疫小鼠。它们是未光照的。
3.TRP-2+poly(IC):用TRP-2肽和10μg poly(IC)免疫小鼠。它们是未光照的。
4.TRP-2+PCI:用TRP-2肽和100μg TPCS2a免疫小鼠并光照。
5.TRP-2+poly(IC)+PCI:用TRP-2肽、10μg poly(IC)和100μg TPCS2a免疫小鼠并光照。
6.TRP-2+poly(IC)+PCI+抗CTLA4：用TRP-2肽、10μg poly(IC)、100μg TPCS2a免疫小鼠。抗CTLA4(3mg/kg，腹膜内施用)刚好在每次免疫前施用。动物经光照。
7.TRP-2+poly(IC)+抗CTLA4：用TRP-2肽和10μg poly(IC)免疫小鼠。抗CTLA4(3mg/kg，腹膜内施用)刚好在每次免疫前施用。动物未光照。
图2示出了用TRP-2肽再次激发脾细胞后针对TRP-2五聚体染色的中值(抗原特异性％，总的CD8+细胞中的CD44+细胞)。可以看出，当TRP-2抗原仅与poly(IC)(第3组)或仅与PCI(第4组)使用时，观察到与仅有抗原(第2组)所见的相比抗原特异性细胞的显著但是小的增加。向TRP-2肽+poly(IC)组合中加入抗CTLA4(第7组)与用TRP-2肽+poly(IC)看到的相比好像没有增加应答。将TRP-2肽+poly(IC)与PCI结合清楚地增强了免疫应答(第5组)，并且向该组合中加入抗CTLA4进一步增加了应答大于两倍，显示出在该实验体系中PCI和抗CTLA4在抗原特异性CD8+、CD44+T细胞的增殖上的协同作用。
图3示出了用TRP-2肽再次激发脾细胞后来自干扰素-γ(IFN-γ)细胞内染色的结果。对于这个标志物，抗CTLA4与PCI和poly(IC)的组合与用PCI+poly(IC)组合看到的相比好像没有增加该标志物的表达。
图4示出了用TRP-2肽再次激发脾细胞后来自TNF-α细胞内染色的结果。根据图2显示的结果，可以看出向TRP-2肽+poly(IC)组合中加入抗CTLA4(第7组)与用TRP-2肽+poly(IC)(第3组)看到的相比好像没有增加反应。然而，向TRP-2肽+poly(IC)+PCI组合中加入抗CTLA4明显增加了TNF-α表达反应，显示出在该实验体系中PCI和抗CTLA4在CD8+、CD44+T细胞中抗原诱导的TNF-α表达上的协同作用。
实施例3
进行本研究以探究PCI疫苗接种结合检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1(一起使用)在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。
材料和方法
小鼠如实施例1中所述。在第0天在小鼠的右侧将100000个TC-1肿瘤细胞(得自约翰霍普金斯大学(3400N.Charles St.,巴尔的摩，MD 21218-2695)的授权)皮下接种于小鼠。
检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1、光敏剂TPCS2a和HPV长肽抗原如实施例1中所述。
免疫方案
处理方案在表5中列出。
表5：处理方案
天 检查点抑制剂施用(i.p.)
0 肿瘤接种
4 x
7 第一次免疫 x
8 第一次光照
11 x
14 第二次免疫 x
15 第二次光照
18 x
21 第三次免疫 x
22 第三次光照
25 x
PCI处理的动物在每次免疫18小时后接受光照。使用LumiSource光照设备(PCIBiotech AS)进行光照6分钟。在表5所示的时间点通过腹膜内注射一起施用检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1。检查点抑制剂的剂量为对于抗CTLA4每次注射100μg，对于抗PD-1每次注射200μg。通过用数显卡尺测量两个垂直直径测量肿瘤尺寸每周两次或三次。肿瘤体积如实施例1中所述进行计算。
不同的实验组中使用的组合显示于表6中。
表6：实验组
Figure BDA0001441672340000351
Figure BDA0001441672340000361
结果显示于图5中，从图5可以看出施用检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1的组合在肿瘤生长上的作用很小，即使这些抑制剂与(由肿瘤表达的)HPV长肽抗原结合。然而，如果将PCI加入到具有检查点抑制剂的处理方案中时，观察到肿瘤生长的显著抑制。因此，，如从图6中可以看出，在最初PCI处理后的大约一周后启动，引起明显的肿瘤收缩，表明PCI诱导的免疫介导的抗肿瘤作用。PCI的作用也转化为动物存活的提高。
实施例4
进行本研究以研究PCI疫苗接种结合检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1(一起使用)和TLR配体poly(IC)在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。
材料和方法
如实施例3中所述将小鼠接种TC-1肿瘤细胞。
检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1、光敏剂TPCS2a、HPV长肽抗原和poly(IC)如实施例1中所述。
免疫方案
处理方案在表7中列出。
表7：处理方案
天 检查点抑制剂施用(i.p.)
0 肿瘤接种
4 x
7 第一次免疫 x
8 第一次光照
11 x
14 第二次免疫 x
15 第二次光照
18 x
21 第三次免疫 x
22 第三次光照
25 x
每次免疫都通过皮内施用50μg HPV长肽抗原、25μg TPCS2a(用于接受PCI处理的动物)和5μgPoly(IC)的不同组合组成的混合物来进行。PCI处理的动物在每次免疫18小时后接受光照。使用LumiSource光照设备(PCI Biotech AS)进行光照6分钟。在表7所示的时间点通过腹膜内注射一起施用检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1。检查点抑制剂的剂量为对于抗CTLA4每次注射100μg，对于抗PD-1每次注射200μg。肿瘤尺寸如实施例1中所述进行测量。
不同的实验组中使用的组合显示于表8中。
表8：实验组
组别编号 处理 动物数目
1 未处理 5
2 抗PD-1/抗CTLA4(i.p.) 5
3 HPV肽+poly(IC)(i.d.)+抗PD-1/抗CTLA4(i.p.) 5
4 HPV肽+poly(IC)+PCI(i.d.)+抗PD-1/抗CTLA4(i.p.) 5
5 HPV肽+poly(IC)+PCI(i.d.) 5
结果显示于图7中，从图7可以看出除了检查点抑制剂抗CTLA4和抗PD-1组合物外施用TLR3配体poly(IC)在肿瘤生长上具有显著的抑制作用。如从图8中可以看出，当将PCI加入到该处理中时，观察到剧烈增加的抗肿瘤作用，肿瘤体积的中位数缩小到低于实验开始时的尺寸的尺寸，并且收缩持续至少两周。PCI的作用也转化为动物存活的急剧提高。
实施例5
进行本研究以探究PCI疫苗接种结合检查点抑制剂抗PD-1在用于HPV诱导的癌症的TC-1小鼠模型中的作用。
材料和方法
如实施例3中所述将小鼠接种TC-1肿瘤细胞。
检查点抑制剂抗PD-1、光敏剂TPCS2a和HPV长肽抗原如实施例1中所述。
免疫方案
处理方案在表9中列出。
表9：处理方案
Figure BDA0001441672340000371
Figure BDA0001441672340000381
每次免疫都通过皮内施用50μg HPV长肽抗原和25μg TPCS2a(用于接受PCI处理的动物)的不同组合组成的混合物来进行。PCI处理的动物在每次免疫18小时后接受光照。使用LumiSource光照设备(PCI Biotech AS)进行光照6分钟。在表9所示的时间点通过腹膜内注射施用200μg检查点抑制剂抗PD-1。肿瘤尺寸如实施例1中所述进行测量。
不同的实验组中使用的组合显示于表10中。
表10：实验组
组别编号 处理 动物数目
1 未处理 5
2 HPV(i.d.)+抗PD-1(i.p.) 8
3 HPV(i.d.)+抗PD-1(i.p.)+PCI 8
结果显示于图9中，从图9可以看出与HPV肽抗原一起施用检查点抑制剂抗PD-1在肿瘤生长上具有小的抑制作用。然而，当将PCI加入到该处理方案中时，实现了肿瘤生长抑制的显著增加。因此，观察到明显的肿瘤收缩，这在仅用检查点抑制剂(+抗原)时没有看到。PCI的作用也转化为动物存活的提高，如从图10中可以看出。
序列表
<110> PCI生物技术有限公司
<120> 方法
<130> FP1V171447ZX
<150> GB 1503776.5
<151> 2015-03-05
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16)
<400> 1
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16)
<400> 2
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FSL-1 序列
<220>
<221> 二酰基半胱氨酸
<222> (1)
<223> X = 半胱氨酸-S-(2,3-双(棕榈酰氧基)丙基)
<400> 3
Xaa Gly Asp Pro Lys His Pro Lys Ser Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ODN 1826
<220>
<221> 硫代磷酸骨架
<222> (1)..(20)
<400> 4
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ODN 2395
<220>
<221> 硫代磷酸骨架
<222> (1)..(22)
<400> 5
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 发夹序列
<400> 6
cggcgcgcgc cg 12
<210> 7
<211> 10
<212> RNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 7
cggaaagacc 10
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 8
ggacggaaag accccgugg 19
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5

Claims (30)

1.抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和TLR3配体在制备药物中的用途，其中
所述光敏剂选自磺化四苯基卟啉、磺化四苯基卟吩或磺化四苯基菌绿素，
所述检查点抑制剂为选自抗CTLA4和/或抗PD-1的抗体，
所述TLR3配体是双链RNA分子；并且
所述抗原分子为能够激发免疫反应的肽，其中所述药物用于在受试者中激发免疫反应。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述检查点抑制剂为单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述检查点抑制剂选自(i)抗CTLA4和抗PD-1或(ii)抗CTLA4。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述TLR3配体是Poly(I:C)。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述抗原分子为疫苗抗原。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述抗原分子包含多于一种抗原。
7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述光敏剂选自TPCS2a、TPPS4或TPBS2a。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述光敏剂为TPCS2a。
9.如权利要求1-6或8任一项所述的用途，其中所述肽为黑素瘤肽或人乳头瘤病毒(HPV)肽。
10.如权利要求1-6或8任一项所述的用途，其中所述药物用于疫苗接种和/或治疗或预防癌症。
11.如权利要求1-6或8任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗或预防黑素瘤或与乳头瘤病毒相关的癌症。
12.如权利要求1-6或8任一项所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述哺乳动物是猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠或人。
14.如权利要求1-6、8或13任一项所述的用途，其中所述抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和所述TLR3配体分别提供在所述药物中，以允许同时、单独或依次施用给所述受试者。
15.一种能够激发免疫反应的药物组合物，其包含抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和TLR3配体，以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，其中
所述光敏剂选自磺化四苯基卟啉、磺化四苯基卟吩或磺化四苯基菌绿素，
所述检查点抑制剂为选自抗CTLA4和/或抗PD-1的抗体，
所述TLR3配体是双链RNA分子，并且
所述抗原分子为能够激发免疫反应的肽。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中
a)所述检查点抑制剂如权利要求2或3中定义，
b)所述TLR3配体如权利要求4中定义，
c)所述抗原分子如权利要求5、6或9任一项中定义，和/或
d)所述光敏剂如权利要求7或8中定义。
17.一种在细胞表面上表达抗原分子或其部分的体外或离体方法，包括：
a)提供第一细胞和第二细胞，所述抗原分子或其部分待表达于所述第一细胞上，检查点抑制剂可以与所述第二细胞结合，其中所述第一细胞和第二细胞可以是相同细胞或不同细胞，
b)将至少所述第一细胞与所述抗原分子、光敏剂和TLR3配体接触，
c)将至少所述第二细胞与检查点抑制剂接触，和
d)用有效激活所述光敏剂的波长的光辐照至少所述第一细胞，其中所述抗原分子释放到细胞的溶质中，并且所述抗原分子或其部分随后呈递在所述第一细胞的表面上，
其中所述第一细胞和第二细胞在所述辐照之前、期间和/或之后彼此接触，其中
所述光敏剂选自磺化四苯基卟啉、磺化四苯基卟吩或磺化四苯基菌绿素，
所述检查点抑制剂为选自抗CTLA4和/或抗PD-1的抗体，
所述TLR3配体是双链RNA分子，并且
所述抗原分子为能够激发免疫反应的肽。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述抗原分子如权利要求5、6或9任一项中定义，所述光敏剂如权利要求7或8中定义，所述检查点抑制剂如权利要求2或3中定义和/或所述TLR3配体如权利要求4中定义。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述抗原分子如权利要求5或6中定义，并且所述抗原呈递导致免疫反应的激发。
20.如权利要求17至19任一项所述的方法，其中所述第一细胞为抗原呈递细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述抗原呈递细胞为树突细胞或巨噬细胞。
22.如权利要求17至19或21任一项所述的方法，其中所述第二细胞为T细胞。
23.如权利要求17至19或21任一项所述的方法，其中所述第一细胞和第二细胞在所述方法期间彼此接触，并且所述抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和所述TLR3配体在所述方法期间接触这两种细胞。
24.如权利要求17至19或21任一项所述的方法，其中所述第一细胞和第二细胞与所述抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和所述TLR3配体同时、单独或依次接触。
25.如权利要求1-6、8或13任一项所述的用途，其中所述药物包含通过权利要求17至24任一项中定义的方法可获得的在细胞表面上表达抗原分子或其部分的所述细胞群，用于施用给所述受试者。
26.如权利要求25所述的用途，其中所述抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和所述TLR3配体用于如权利要求17至24任一项中定义的方法以获得用于制备所述药物的所述细胞群。
27.一种能够激发免疫反应的产品，其包含抗原分子、光敏剂、检查点抑制剂和TLR3配体，作为组合的制剂适用于同时、单独或依次使用，其中
所述光敏剂选自磺化四苯基卟啉、磺化四苯基卟吩或磺化四苯基菌绿素，
所述检查点抑制剂为选自抗CTLA4和/或抗PD-1的抗体，
所述TLR3配体是双链RNA分子，并且
所述抗原分子为能够激发免疫反应的肽。
28.如权利要求27所述的产品，其中
a)所述检查点抑制剂如权利要求2或3中定义，
b)所述TLR3配体如权利要求4中定义，
c)所述抗原分子如权利要求5、6或9任一项中定义，和/或
d)所述光敏剂如权利要求7或8中定义。
29.一种试剂盒，适用于激发受试者中的免疫反应，所述试剂盒包括
第一容器，其包含光敏剂；
第二容器，其包含抗原分子；
第三容器，其包含检查点抑制剂；和
第四容器，其包含TLR3配体，
其中
所述光敏剂选自磺化四苯基卟啉、磺化四苯基卟吩或磺化四苯基菌绿素，
所述检查点抑制剂为选自抗CTLA4和/或抗PD-1的抗体，
所述TLR3配体是双链RNA分子，并且
所述抗原分子为能够激发免疫反应的肽。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中
a)所述检查点抑制剂如权利要求2或3中定义，
b)所述TLR3配体如权利要求4中定义，
c)所述抗原分子如权利要求5、6或9任一项中定义，和/或
d)所述光敏剂如权利要求7或8中定义。
CN201680023471.1A 2015-03-05 2016-03-04 方法 Active CN107847567B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201503776A GB201503776D0 (en) 2015-03-05 2015-03-05 Compound and method
GB1503776.5 2015-03-05
PCT/EP2016/054714 WO2016139362A1 (en) 2015-03-05 2016-03-04 Method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107847567A CN107847567A (zh) 2018-03-27
CN107847567B true CN107847567B (zh) 2022-05-17

Family

ID=52998470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680023471.1A Active CN107847567B (zh) 2015-03-05 2016-03-04 方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11027017B2 (zh)
EP (1) EP3265120B1 (zh)
JP (2) JP2018508533A (zh)
KR (1) KR102708401B1 (zh)
CN (1) CN107847567B (zh)
AU (1) AU2016227629B2 (zh)
BR (1) BR112017018948A2 (zh)
CA (1) CA2978496A1 (zh)
GB (1) GB201503776D0 (zh)
WO (1) WO2016139362A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3427755B1 (en) 2009-04-13 2020-10-21 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Hpv particles and uses thereof
US9700639B2 (en) 2012-02-07 2017-07-11 Aura Biosciences, Inc. Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells
CA2924684C (en) 2013-09-18 2021-02-09 Aura Biosciences, Inc. Virus-like particle conjugates for diagnosis and treatment of tumors
US10561723B2 (en) 2015-07-21 2020-02-18 Theodore C. Marbley Treatment and prevention of anal conditions
JP2018532801A (ja) 2015-10-30 2018-11-08 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 標的化がん療法
IL269986B2 (en) * 2017-04-12 2024-06-01 Aura Biosciences Inc Integrated and focused treatment

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1633598A (zh) * 2001-10-05 2005-06-29 科勒制药股份公司 Toll样受体3信号传导的激动剂和拮抗剂
WO2014139597A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Pci Biotech As Method

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO180167C (no) 1994-09-08 1997-02-26 Photocure As Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol
GB9905911D0 (en) * 1999-03-15 1999-05-05 Photocure As Method
US7605238B2 (en) * 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
CZ301427B6 (cs) 2000-11-29 2010-02-24 Pci Biotech As Zpusob zavedení molekuly do cytosolu bunky
AU2002222104B2 (en) 2000-11-29 2007-06-28 Pci Biotech As Photochemical internalization for virus-mediated molecule delivery into the cyosol
GB0121023D0 (en) 2001-08-30 2001-10-24 Norwegian Radium Hospital Res Compound
GB2420784A (en) 2004-11-25 2006-06-07 Pci Biotech As Phototherapeutic amphiphilic phthalocyanine-based compounds where 1 peripheral ring system is more hydrophilic & has more hydrophilic groups than the other 3
GB0613753D0 (en) 2006-07-11 2006-08-23 Norwegian Radium Hospital Res Method
US8552154B2 (en) * 2008-09-26 2013-10-08 Emory University Anti-PD-L1 antibodies and uses therefor
GB0914287D0 (en) 2009-08-14 2009-09-30 Pci Biotech As Compositions
GB0914286D0 (en) 2009-08-14 2009-09-30 Pci Biotech As Method
WO2013106852A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 President And Fellows Of Harvard College Controlled delivery of tlr agonists in structural polymeric devices
GB201208548D0 (en) 2012-05-15 2012-06-27 Pci Biotech As Compound and method
CA2922320C (en) 2013-08-28 2022-11-22 Pci Biotech As Enhanced photochemical internalisation using a tlr ligand
WO2016089950A1 (en) * 2014-12-04 2016-06-09 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Cancer therapy targeting intercellular adhesion molecule 4 (icam4)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1633598A (zh) * 2001-10-05 2005-06-29 科勒制药股份公司 Toll样受体3信号传导的激动剂和拮抗剂
WO2014139597A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Pci Biotech As Method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CTLA-A and PD-1 pathway blockade:combinations in the clinic;Margaret K Callahan等;《Frontiers in oncology》;20150115;第4卷;第1页，第2页Table1 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017018948A2 (pt) 2018-04-17
AU2016227629B2 (en) 2022-02-24
EP3265120B1 (en) 2023-07-05
EP3265120C0 (en) 2023-07-05
EP3265120A1 (en) 2018-01-10
GB201503776D0 (en) 2015-04-22
US11027017B2 (en) 2021-06-08
CA2978496A1 (en) 2016-09-09
US20180050105A1 (en) 2018-02-22
JP7275185B2 (ja) 2023-05-17
WO2016139362A1 (en) 2016-09-09
JP2021102646A (ja) 2021-07-15
KR20180026658A (ko) 2018-03-13
CN107847567A (zh) 2018-03-27
KR102708401B1 (ko) 2024-09-20
AU2016227629A1 (en) 2017-09-21
JP2018508533A (ja) 2018-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107847567B (zh) 方法
JP7304307B2 (ja) 予防接種用化合物および免疫化用化合物、ならびに予防接種方法および免疫化方法
Zom et al. TLR ligand–peptide conjugate vaccines: toward clinical application
JP2022003043A (ja) 養子ｔ細胞療法と腫瘍溶解性ウイルス補助療法とを組み合わせる方法
AU2015233542B2 (en) A medicament for use in a method of inducing or extending a cellular cytotoxic immune response
Pordanjani et al. Extracellular vesicles in vaccine development and therapeutic approaches for viral diseases
US20240165263A1 (en) Targeting multiple t cell types using spherical nucleic acid vaccine architecture
KR20210052924A (ko) 작은 지질 나노 입자 및 이를 포함하는 암 백신
Swartz The Development of Cancer Vaccines Targeting Neoantigens for the Treatment
NZ629644B (en) A method of vaccination or immunisation involving the use of a photosensitizing agent, an antigenic molecule and a TLR ligand
WO2023211279A1 (en) Adjuvant combinations for neopeptide vaccines
US20180055920A1 (en) Vaccine, therapeutic composition and methods for treating or inhibiting cancer
Zom Adjuvant-conjugated peptide vaccines for immunotherapy of cancer
Ahmed Tumor cells surface-engineered with polymeric particles for use as cancer vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant