KR20180026658A - 방법 - Google Patents

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안데르스 호그셋
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피씨아이 바이오테크 에이에스
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Abstract

본 발명은 대상체에게 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제를 투여하는 단계, 및 상기 대상체를 면역 반응을 생성하기 위해 감광화제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로 조사하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 생성하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 방법은 백신접종의 방법이다. 본 발명은 또한 관련 방법, 조성물, 세포, 용도, 제품 및 키트를 제공한다.

Description

방법
본 발명은 감광화제, 항원 분자, 예를 들어, 백신 성분, 본원에 정의된 바와 같은 관문 억제제(및 임의로 톨-유사 수용체(TLR)에 대한 리간드)의 사용 및, 및 감광화제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로의 조사를 포함하는 백신접종 또는 면역화 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 방법에 유용한 항원, 예를 들어, 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기와 동일한 성분을 사용하여 항원 분자, 예를 들어, 백신 성분을 세포 내로 도입하여, 항원 제시를 달성함을 포함하는, 면역 반응을 생성하기 위해, 예를 들어, 백신접종을 위해 사용될 수 있는 항원 제시 세포의 생성방법, 및 그러한 방법에 유용한 항원 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 면역 반응을 유도하기 위해, 예를 들어, 백신접종을 달성하기 위해 생체내에서 환자로 투여하기 위한, 그러한 방법에 의해 시험관내에서 생성되는 세포의 용도를 제공한다. 세포 내로의 항원 분자의 내재화 방법도 또한 제공된다.
백신접종은 면역계가 병원체에 대한 적응 면역의 발생을 자극하게 하기 위한 항원 분자의 투여를 포함한다. 백신은 감염을 예방하거나 그로부터의 이환율을 개선시킬 수 있다. 백신접종은 감염성 질환의 가장 효율적인 예방 방법이며, 백신접종으로 인한 보편화된 면역성은 세계적인 천연두의 근절 및 세계 다수 지역으로부터의 소아마비, 홍역 및 파상풍과 같은 질환의 제한의 주된 원인이다.
백신의 활성제는 무손상 형태할 수 있지만, 원인이 되는 병원체의 불활성화(비-감염성) 또는 약독화(감염성이 감소됨) 형태, 또는 면역원성인 것으로 밝혀진 병원체의 정제된 성분(예를 들어, 바이러스의 외부 코트 단백질)일 수 있다. 독성 효과는 제거하지만 면역원성 효과는 유지하도록 하는 파상풍의 테타노스파스민(tetanospasmin) 독소의 변형과 같이 독소-기반 질환에 대한 면역화를 위해 톡소이드가 생성된다.
대부분의 백신이 세포내이입(endocytosis)을 통해 항원 제시 세포에 의해 흡수되며, 항원 소화 및 MHC 부류-II 경로를 통한 제시를 위해 엔도좀을 통해 리소좀으로 운반되기 때문에, 백신접종은 주로 CD4 T-헬퍼 세포 및 B 세포를 활성화시킨다. 암 및 세포내 감염과 같은 장애 또는 질환과 싸우기 위하여, 세포독성 CD8 T-세포 반응의 자극이 중요하다. 그러나, 세포독성 CD8 T 세포의 유도는 보통 항원을 시토졸로, 그리고 항원 제시의 MHC 부류-I 경로로 전달함에 있어서의 어려움으로 인하여 실패한다. 광화학 내재화(PCI)는 시토졸로의 분자의 전달을 향상시키며, PCI를 사용한 백신접종 방법이 알려져 있다. PCI는 감광화제를 활성화시키기 위한 조사 단계와 병용하여 감광화제를 사용하는 기술이며, 세포에 동시-투여되는 분자가 세포의 시토졸로 방출되는 것을 달성하는 것으로 알려져 있다. 이러한 기술은 세포에 의해 세포소기관, 예를 들어, 엔도좀으로 흡수되는 분자가 조사 후에 이들 세포소기관으로부터 시토졸로 방출되게 한다. PCI는 달리 막-불투과성(또는 약한 투과성) 분자를 광범위한 세포 손상 또는 세포사를 야기하지 않는 방식으로 세포의 시토졸 내로 도입하기 위한 메커니즘을 제공한다.
광화학 내재화(PCI)의 기본 방법은 제WO 96/07432호 및 제WO 00/54802호에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다. 이러한 방법에서는, 내재화될 분자(본 발명에서 항원 분자일 것임) 및 감광화제가 세포와 접촉한다. 감광화제 및 내재화될 분자는 세포 내의 세포막-결합 하위구획(subcompartment) 내로 흡수되며, 즉, 그들은 세포내 소낭(예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀) 내로 세포내이입된다. 적절한 파장의 광으로의 세포의 노출시, 감광화제가 활성화되며, 이것이 세포내 소낭의 막을 손상하는 반응성 화학종을 직접적으로 또는 간접적으로 생성한다. 이것은 내재화된 분자가 시토졸 내로 방출되게 한다.
이러한 방법에서 세포의 대다수의 기능성 또는 생존력이 불리하게 영향을 받지 않는 것으로 관찰되었다. 따라서, "광화학 내재화"로 명명되는 이러한 방법은 치료제를 포함하는 각종 상이한 분자들을 시토졸 내로, 즉, 세포의 내부로 운반하는데 유용한 것으로 제안되었다.
제WO 00/54802호는 세포 표면상에 전달 분자를 제시하거나 발현하기 위해 이러한 일반적인 방법을 이용한다. 따라서, 세포 시토졸 내로의 분자의 운반 및 방출 후에, 이것(또는 그 분자의 일부)은 세포의 표면으로 운반될 수 있으며, 여기서, 이것은 세포의 외측에, 즉, 세포 표면상에 제시될 수 있다. 이러한 방법은 백신접종 분야에서 특히 유용한데, 여기서는 면역 반응을 유도하거나 촉진시키거나 보강하기 위해 백신 성분, 즉, 항원 또는 면역원이 그 세포의 표면상의 제시를 위해 세포로 도입될 수 있다.
백신접종이 일부 주목할만한 성공을 달성하였지만, 대안적인 개선된 백신접종 방법이 여전히 필요하다. 본 발명은 이러한 필요에 대해 다루고 있다.
본 발명자들은 놀랍게도, 감광화제, 항원 분자, 예를 들어, 백신 성분, 및 본원에 정의된 바와 같은 관문 억제제(및 임의로 TLR 리간드)의 사용 및 감광화제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로의 조사를 포함하는 방법이 유리하게도 개선된 백신접종 또는 개선된 면역 반응을 야기하는 것을 발견하였다.
하기 실시예에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이, 본 발명의 방법이 개선된 백신접종 또는 개선된 면역 반응, 예를 들어, 증가된 양의 항원-특이 T 세포의 생성을 야기하는 것으로 입증되었다. 또한, 실시예들은, 암 백신접종의 맥락에서, 본 발명이 따르는 방법이 종양 체적 감소를 야기함을 나타낸다.
이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법이 MHC 부류 I 분자상의 증가된 항원 제시를 야기하여, 증가된 CD8+ T 세포 반응과 그에 따른 개선된 백신접종 방법을 야기하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 방법을 사용한 결과는 증가된 수의 항원-특이 T 세포, 및 증가되거나 개선된 항원 제시와 상호관련이 있는 T 세포에 의한 증가된 TNF-α 및 IFNγ 생성을 나타낸다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 대상체에게 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제를 투여하는 단계, 상기 대상체를 감광화제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로 조사하는 단계(여기서, 면역 반응이 생성된다)를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 항원 분자 또는 이의 부분을 세포의 표면 상에 발현시키는 방법을 제공한다:
a) 상기 항원 분자 또는 이의 부분을 발현시키고자 하는 제1 세포 및 관문 억제제가 결합될 수 있는 제2 세포를 제공하는 단계(여기서, 상기 제1 및 제2 세포는 동일한 세포이거나 상이한 세포일 수 있다),
b) 적어도 상기 제1 세포를 상기 항원 분자, 감광화제, 및 임의로 TLR 리간드와 접촉시키는 단계,
c) 적어도 제2 세포를 관문 억제제와 접촉시키는 단계, 및
d) 적어도 제1 세포를 감광화제를 활성화시키기에 유효한 파장의 광으로 조사하는 단계(여기서, 상기 항원 분자는 세포의 시토졸 내로 방출되고 항원 분자 또는 이의 부분은 후속적으로 제1 세포의 표면 상에 제시된다),
여기서, 상기 제1 및 제2 세포는 조사 전, 조사 동안 그리고/또는 조사 후 서로 접촉한다.
바람직하게는 이러한 방법들(및 후속적으로 기재된 방법들)은 상기 방법에서 상기한 3개의 활성 성분(제제)만을 사용하며, 제제는 이들이 방법의 효능에 영향을 미치도록(즉, PCI 백신접종/항원 제시/면역 반응 자극을 증진시키는데 능동적인 역할을 갖도록) 방법에서 적절한 수준으로(예를 들어, 아래 기재되는 최소 수준으로) 존재한다. 따라서, 바람직하게는, 제제는 다른 활성 성분이 없는 완충제 중에 존재한다. 그러나, 또한 제제, 예를 들어, TLR 리간드가 이후에 기재된 바와 같이 첨가될 수 있다.
이러한 방법에서, 상기 항원 분자 및 상기 감광화제, 및 임의로 본원에 정의된 바와 같은 관문 억제제(및, 사용되는 경우, 임의로 상기 TLR 리간드)는 각각 세포내 소낭 내로 흡수되며; 세포가 조사되는 경우, 세포내 소낭의 막이 손상되어, 항원 분자를 세포의 시토졸 내로 방출한다.
흡수되는 다양한 제제들이 서로에 대해 동일하거나 상이한 세포내 소낭 내로 흡수될 수 있다. 감광제에 의해 생성되는 활성 화학종은 이들이 함유되어 있는 소낭 너머까지 미칠 수 있고/있거나 소낭이 유착되어 손상된 소낭과의 유착에 의해 소낭의 내용물이 방출되게 할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본원에 언급된 바와 같이, "흡수된"은 흡수된 분자가 완전히 소낭 내에 함유되는 것을 의미한다. 세포내 소낭은 막으로 구획되어 있으며, 세포내이입 후에 생성되는 임의의 이러한 소낭, 예를 들어, 엔도좀 또는 리소좀일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "손상된" 구획은 구획 내에 함유된 항원 분자의 방출을 가능하게 하기에 충분한, 영구적인 또는 일시적인 그 구획의 막의 온전성의 손상을 지칭한다.
본원에 언급된 바와 같은 "감광화제"는 제제가 활성화된 화학종을 생성하기에 적절한 파장 및 세기의 조명에서 활성화되는 경우 흡수된 광 에너지를 화학 반응으로 변환시킬 수 있는 화합물이다. 이들 과정의 고도의 반응성 최종 산물은 세포- 및 혈관 독성을 야기할 수 있다. 통상적으로, 이러한 감광화제는 세포내 구획, 특히 엔도좀 또는 리소좀으로 국소화시킨 것일 수 있다.
감광제는 직접적으로 또는 간접적으로 다양한 메커니즘에 의해 이들의 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 특정 감광제는 광에 의해 활성화되는 경우 직접적으로 독성이 되는 반면, 다른 것들은 독성 화학종, 예를 들어 산화제, 예를 들어, 일중항 산소(singlet oxygen) 또는 세포 물질 및 생체분자, 예를 들어, 지질, 단백질 및 핵산에 대해 매우 손상적인 다른 반응성 산소 화학종을 생성하는 작용을 한다.
다양한 이러한 감광화제가 당업계에 알려져 있으며, 본원에 참조로 포함된 제WO96/07432호를 포함하는 문헌에 기재되어 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린, 벤조포르피린, 리소좀 투과성 약염기, 나프탈로시아닌, 양이온성 염료 및 테트라사이클린 또는 이의 유도체를 포함하는 많은 공지된 감광화제가 존재한다(문헌 참조; Berg et al., (1997), J. Photochemistry and Photobiology, 65, 403-409). 다른 감광화제는 텍사피린, 페오포비드, 포르피센, 박테리오클로린, 케토클로린, 헤마토포르피린 유도체, 및 5-아미노레불린산 및 이의 유도체에 의해 유도된 내인성 감광제, 포토프린, 감광제 간의 이량체 또는 다른 접합체를 포함한다.
포르피린은 가장 광범위하게 연구된 감광화제이다. 이들의 분자 구조는 메틴 브릿지를 통해 함께 연결된 4개의 피롤 환을 포함한다. 이들은 종종 금속-복합체를 형성할 수 있는 천연 화합물이다. 예를 들어, 산소 운반 단백질 헤모글로빈의 경우, 철 원자가 헴(heme) B의 포르피린 코어 내로 도입된다.
클로린은 코어에서 4개의 메틴 결합을 통해 결합된 3개의 피롤 및 1개의 피롤린으로 이루어진 커다란 헤테로사이클릭 방향족 환이다. 따라서, 클로린은, 포르피린과는 달리, 대부분 방향족이지만 환의 전체 둘레를 통해 방향족인 것은 아니다.
숙련자는 어떤 감광제가 본 발명에 사용하기에 적합한지를 인지할 것이다. 세포의 엔도좀 또는 리소좀에 위치하는 감광화제가 특히 바람직하다. 따라서, 감광화제는 바람직하게는 리소좀 또는 엔도좀의 내부 구획 내로 흡수되는 제제이다. 바람직하게는, 감광화제는 세포내이입에 의해 세포내 구획 내로 흡수된다. 바람직한 감광제는 디- 및 테트라술폰화 알루미늄 프탈로시아닌(예를 들어, AlPcS2a), 술폰화 테트라페닐포르핀(TPPSn), 술폰화 테트라페닐 박테리오클로린(예를 들어, TPBS2a), 나일 블루(nile blue), 클로린 e6 유도체, 유로포르피린 I, 필로에리트린, 헤마토포르피린 및 메틸렌 블루이다. 본 발명에 사용하기 위한 추가의 적절한 감광제, 즉, 술폰화 메소-테트라페닐 클로린, 바람직하게는 TPCS2a는 또한 본원에 참조로 포함되는 제WO03/020309호에 기재되어 있다. 바람직한 감광화제는 양친매성 감광제(예를 들어, 디술폰화 감광제), 예를 들어, 양친매성 프탈로시아닌, 포르피린, 클로린 및/또는 박테리오클로린이며, 특히, TPPS2a(테트라페닐포르핀 디술포네이트), AlPcS2a(알루미늄 프탈로시아닌 디술포네이트), TPCS2a(테트라페닐 클로린 디술포네이트) 및 TPBS2a(테트라페닐 박테리오클로린 디술포네이트) 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 또한, 친수성 감광화제, 예를 들어, TPPS4(메소-테트라페닐포르핀 테트라술포네이트)가 바람직하다. 특히 바람직한 감광화제는 술폰화 알루미늄 프탈로시아닌, 술폰화 테트라페닐포르핀, 술폰화 테트라페닐클로린 및 술폰화 테트라페닐 박테리오클로린, 바람직하게는 TPCS2a, AlPcS2a, TPPS4 및 TPBS2a이다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 감광화제는 클로린 TPCS2a(디술폰화 테트라페닐 클로린, 예를 들어, 암피넥스(Amphinex)®)이다.
감광제는 담체에 연결되어 감광화제를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 양태의 바람직한 측면에서, 감광화제는 화학식 I에 정의된 바와 같은 감광제 및 키토산의 접합체이다:
Figure pct00001
상기 화학식 I에서,
n은 3 이상의 정수이고;
R은 상기 화합물에서 n회를 나타내며,
상기 전체 Rn 기의 0.1% 내지 99.9%(바람직하게는 0.5% 내지 99.5%)에서, 각 R은
Figure pct00002
및
Figure pct00003
로부터 선택되는 기 A이고;
여기서, 각 R1은, 동일하거나 상이할 수 있고, H, CH3 및 -(CH2)b-CH3으로부터 선택되며; a는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; b는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고(여기서, 짝이온은, 예를 들면, Cl-일 수 있다); 바람직하게는 R1은 CH3이고, b는 1이며
Y는 O; S; SO2; -NCH3 ; 또는 -N(CH2)dCH3이고; c=1, 2, 3, 4 또는 5이고; d=1, 2, 3, 4 또는 5이며, 바람직하게는 Y는 NCH3이고 c는 1이며,
각 R 기는 동일하거나 상이할 수 있고,
상기 전체 Rn 기의 0.1% 내지 99.9%(바람직하게는 0.5% 내지 99.5%)에서, 각 R은
Figure pct00004
및
Figure pct00005
로부터 선택되는 기 B이고;
여기서, e는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고; f는 1, 2, 3, 4 또는 5이며; 바람직하게는 e 및 f=1이고,
R2는
Figure pct00006
및
Figure pct00007
로부터 선택되는 기이고;
W는 O, S, NH 또는 N(CH3)로부터 선택되는 기; 바람직하게는 NH이고,
R3은
Figure pct00008
및
Figure pct00009
로부터 선택되는 기이고,
V는 CO, SO2, PO, PO2H 또는 CH2로부터 선택되는 기; 바람직하게는 CO이고,
R4는 동일하거나 상이할 수 있고, H, -OH, -OCH3, -CH3, -COCH3, C(CH3)4, -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2 및 -NCOCH3로부터 선택되는 기(o, m 또는 p 위치에서 치환됨), 바람직하게는 H이고,
여기서, 각 R 기는 동일하거나 상이할 수 있다.
키토산 중합체는 적어도 3개의 단위(n=3)를 갖는다. 그러나, 바람직하게는 n은 적어도 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 예를 들어, 10 내지 100 또는 10 내지 50이다.
바람직한 양태에서 R2는
Figure pct00010
및
Figure pct00011
로부터 선택된다.
추가의 바람직한 양태에서 R3은
Figure pct00012
및
Figure pct00013
로부터 선택된다.
바람직하게는 R2 또는 R3은 TPPa, TPCa1 또는 TPCc1이다.
기 A는 전체 Rn 기의 70 내지 95%를 제공할 수 있고 기 B는 전체 Rn 기의 5 내지 30%를 제공할 수 있다.
가장 바람직한 양태에서 감광제와 키토산의 접합체는 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00014
및
Figure pct00015
상기 구조에서, 제공된 A/B % 값은 기 A 또는 B인 Rn 기의 비율을 나타낸다. 별표는 키토산 중합체의 나머지를 표시한다.
이들 화합물은 숙련자에게 친숙할 해당 분야에 표준인 절차를 사용하는 합성 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이것은 본원에 참고로 포함된 제WO2013/189663호에 상세하게 기재되어 있다.
본원에 언급된 바와 같은 "항원" 분자는, 적절한 방식으로 면역계 또는 면역 세포에 제시되는 경우, 그 자체 또는 이의 부분이 면역 반응을 자극할 수 있는 분자이다. 따라서, 유리하게, 항원 분자는 백신 항원 또는 백신 성분, 예를 들어, 폴리펩티드 함유 엔티티(entity)일 것이다. 아래에 논의된 바와 같이, 항원 분자는 하나 이상의 항원, 예를 들어, 둘 이상의 항원 펩티드를 포함할 수 있다.
이러한 많은 항원 또는 항원 백신 성분은 당해 분야에 알려져 있으며, 모든 방식의 박테리아 또는 바이러스 항원 또는 실제로 원생동물 또는 고등 생물을 포함하는 임의의 병원성 종의 항원 또는 항원 성분을 포함한다. 통상적으로 백신의 항원 성분은 전체 생물(살아 있던지, 죽어 있던지 또는 약독화되어 있던지), 즉 전체 세포 백신으로 구성되지만, 또한 서브-유닛(sub-unit) 백신, 즉, 생물의 특정 항원 성분, 예를 들어 단백질 또는 펩티드, 또는 심지어 탄수화물을 기반으로 한 백신도 광범위하게 연구되었고 문헌에 보고되었다. 임의의 이러한 "서브-유닛"-기반의 백신 성분은 본 발명의 항원 분자로서 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명은 펩티드 백신 분야에서 특히 유용하다. 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 항원 분자는 펩티드(보다 짧은 길이 및 보다 긴 길이의 펩티드, 즉, 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드, 및 또한, 단백질 분자 또는 이의 단편, 예를 들어 5 내지 500개, 예를 들어 10 내지 250개, 예컨대 15 내지 75개, 또는 8 내지 25개 아미노산의 펩티드를 포함하는 것으로 본원에 정의됨)이다.
예를 들어, AIDS/HIV 감염 또는 인플루엔자, 개 파보바이러스, 소 백혈병 바이러스, 간염 등과 같은 바이러스 질환 및 감염의 치료에서 다수의 펩티드 백신 후보물질이 문헌에 제안되었다(예를 들어, 문헌 참조; Phanuphak et al., Asian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997, 15(1), 41-8; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 1994, 69(4), 811-20; Casal et al., J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7; Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(4), 1709-14; Naruse et al., Proc. Natl. Sci. USA, 1994 91(20), 9588-92; Kabeya et al., Vaccine 1996, 14(12), 1118-22; Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(23) 9174-8). 유사하게, 박테리아 펩티드는 실제로 다른 생물 또는 종으로부터 유래된 펩티드 항원처럼 사용될 수 있다.
병원성 생물로부터 유래된 항원에 더하여, 펩티드도 암 또는 다발성 경화증과 같은 다른 질환에 대한 백신으로서의 사용이 제안되었다. 예를 들어, 돌연변이체 종양유전자 펩티드는 세포독성 T-림프구의 자극에서 항원으로서 작용하는 암 백신으로서 전망이 밝다(문헌 참조; Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995, 121, 443-451; Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17, 316-327). 합성 펩티드 백신도 전이성 흑색종의 치료를 위해 평가되었다(문헌 참조; Rosenberg et al., Nat. Med. 1998, 4(3), 321-7). 다발성 경화증의 치료를 위한 T-세포 수용체 펩티드 백신은 문헌[참조; Wilson et al., J. Neuroimmunol. 1997, 76(1-2), 15-28]에 기재되어 있다. 임의의 이러한 펩티드 백신 성분은 본 발명의 항원 분자로서 사용될 수 있으며, 실제로 문헌에서 펩티드 백신으로서 기재되거나 제안된 펩티드 중 임의의 것일 수 있다. 따라서, 펩티드는 합성이거나 생물로부터 분리되거나 달리 유래될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 항원은 흑색종 항원이다. "흑색종 항원"은 하나 이상의 상이한 항원을 포함할 수 있다.
예를 들어, 하나의 측면에서, 흑색종 항원은 흑색종 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 항원 펩티드 또는 T-세포 에피토프, 예를 들어, gp100, 멜란(Melan)-A, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-3 및 티로시나제 관련 단백질-2(TRP-2) 또는 이의 펩티드 에피토프로부터 선택되는 하나 이상이다. 이들 및 추가의 적합한 흑색종 항원의 상세사항은 문헌[참조; Renkvist et al., Cancer Immunol. Immunother. 50:3-15, 2001 (및 그 안의 참고문헌), and Hodi, Clin. Cancer. Res. 12:673-678, 2006]에 개시되어 있으며, 이들은 본원에 참고로 포함된다. 특히, gp100, 멜란-2, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-3 및 TRP-2 및 이들의 펩티드 에피토프는 상기 문헌[Renkvist et al.]에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 상기 문헌[Renkvist et al.]에 개시된 바와 같이 gp100, 멜란-2, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-3 또는 TRP-2, 또는 이들의 개시된 펩티드 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진 항원 또는 당해 분야에 알려져 있는 표준 비교 기술을 사용하여 (관련있는 비교 창에 걸쳐) 이와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 조합의 사용까지 확대된다. 바람직한 양태에서, 항원은 TRP-2 및/또는 gp100, 바람직하게는 TRP-2이다.
펩티드 항원, 예를 들어, 최대 적어도 200개 아미노산이 주문 펩티드 합성을 수행하는 회사, 예를 들어, United BioSystems Inc(이전에는 United Peptide Corp., Herndon, VA, USA))로부터 수득될 수 있다.
대안적인 바람직한 양태에서, 항원 분자는 인간 유두종 바이러스(HPV)로부터 유래된다. 유두종 바이러스 게놈은 숙주 세포의 초기 감염 직후 발현되는 6개(E1, E2, E4, E5, E6 및 E7) 개방형 판독 프레임(ORF)을 암호화하는 초기 영역(E), 및 주 캡시드 단백질 L1 및 부 캡시드 단백질 L2를 암호화하는 후기 영역(L)으로 나뉜다. 모든 바이러스 ORF는 하나의 DNA 가닥상에 암호화된다.
바람직한 양태에서, 항원 분자는 단백질 또는 펩티드, 또는 이의 단편, 즉, 바람직하게는 본원에 언급되는 초기 또는 후기 단백질 중 하나의 단백질 또는 이의 부분인 인간 유두종 바이러스(HPV)로부터의(예를 들어, 상기 바이러스로부터 유래된) 항원을 포함한다. 따라서, HPV 항원은 하나 이상의 알려져 있는 항원 펩티드 또는 T-세포 에피토프, 예를 들어, 임의의 유형의 HPV 유래의 임의의 알려져 있는 항원으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. HPV 유형 및 항원의 상세사항은 문헌[참조; Ma et al. Current Cancer Therapy Reviews 6: 81-103, 2010]에서 찾아볼 수 있다.
예를 들어, 항원 펩티드는 HPV-16 및/또는 HPV-18형 HPV 또는 31형 또는 45형 HPV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항원은 E1, E2, E4, E5, E6 또는 E7 단백질 중 임의의 것 또는 L1 및 L2 단백질 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 항원 펩티드는 HPV-16 및 18의 E2, E6 및 E7 단백질 중 하나 이상으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 양태에서, 항원 분자는 HPV-16 E7 서열 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8 에피토프는 볼드체로 나타나 있음)을 함유한다. 따라서, HPV 항원은 35개 아미노산 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 항원 분자는 오직 CD8 에피토프 RAHYNIVTF, 즉, 더 짧은 펩티드일 수 있다.
HPV 펩티드 항원은 주문 펩티드 합성을 수행하는 회사, 예를 들어, United BioSystems Inc(이전에는 United Peptide Corp., Herndon, VA, USA)로부터 수득될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명에 따르는 항원 분자는 하나 이상의 항원(별도의 분자로서), 예를 들어, 둘 이상의 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 분자가 항원 펩티드인 경우, 이것은 하나 이상의 항원 펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 항원의 혼합물이 항원 분자로서 사용될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 동일한 단백질 항원의, 예를 들어, 상이한 영역(및 에피토프)을 나타낼 수 있거나 (예를 들어, 동일한 종양 타입에서 발현되는) 상이한 단백질 항원으로부터 선택된 영역(에피토프)을 나타낼 수 있는 상이한 펩티드들의 혼합물일 수 있다. 별도의 항원이 사용된다면, 이들은 본 발명의 용도 도는 방법에서 별도로, 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 항원이 본원에 기재된 방법 또는 용도에서 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 본 발명의 다른 양태들에서, 예를 들어, 본원에 기재된 조성물, 용도, 제품 및 키트에서 하나의 측면을 형성하는 항원 분자는 유사하게 하나 이상의 항원을 포함할 수 있다. 대안에서, 항원 분자는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 단일 분자일 수 있다.
항원 분자는 일단 광화학 내재화 과정에 의해 세포 시토질에 방출되면, 세포의 항원-처리 기작에 의해 처리될 수 있다. 따라서, 세포의 표면상에 발현되거나 제시되는 항원 분자는 내재화(세포내이입)되는 항원 분자의 부분 또는 단편일 수 있다. 제시되거나 발현되는 항원 분자의 "부분"은 바람직하게는 세포 내의 항원-처리 기작에 의해 생성되는 부분을 포함한다. 그러나, 부분은 적절한 항원 설계(예를 들어, pH 감수성 결합)를 통해 또는 다른 세포 처리 수단을 통해 달성될 수 있는 다른 수단에 의해 생성될 수 있다. 편리하게, 이러한 부분은 예를 들어, 5개 초과, 예를 들어, 10 또는 20개 초과의 아미노산 크기의 펩티드의 경우에, 면역 반응을 생성하기에 충분한 크기의 것이다.
본원에 정의된 바와 같은 "관문 억제제"는 면역 관문를 표적으로 하는 제제, 즉 관문 억제제이다. 면역 관문는, 예를 들어, 관문 단백질 및 지질을 포함한다. 관문 단백질은 어떤 세포가 건강하고 어떤 세포가 면역계에 의해 손상되는지를 식별함으로써 면역계를 조절한다. 세포가 이의 표면 상에 또는 관련 T 세포의 표면 상에 충분한(또는 충분히 활성화된) 관문 단백질을 갖지 않는다면, 이것은 면역계에 의해 손상될 수 있으며, 따라서 관문 단백질은 면역계에서 "브레이크"로서 작용한다.
가장 잘 알려진 관문 단백질 중의 하나는 세포독성 T-림프구 항원-4, 또는 CTLA4(CD152(분화 152의 클러스터)로도 알려짐)이다. 이 분자는 면역 반응을 하향조절하는 단백질 수용체이다. CTLA4는 T 세포의 표면에서 발견되며, 이것은 항원에 대한 세포 면역 공격을 유도한다. T 세포 공격은 "오프" 스위치로서 작용하는 CTLA4 수용체를 자극함으로써 진화(turned off)될 수 있다. 일단 세포독성 T 세포가 활성화되면 이것은 이의 표면 상에서 CTLA4를 발현시키며, 이것은 그후 항원-제시 세포 상에서 이들의 상호 공유된 리간드, B7-1 및 B7-2에 대해 공동-자극 분자 CD28과 경쟁한다. 이러한 균형은 T 세포 기능이 자기-한정된 방식으로 진행되도록 하면서 세포독성 활성을 저지한다.
관문 단백질의 추가의 예는 PD-L1(예정된 사멸 리간드 1; Programmed Death Ligand 1)이며, 이것은 40kDa 타입 1 막관통 단백질이다. PD-L1에 대한 수용체가 PD-1이며, 이것은 면역글로불린 상과에 속하고 T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 수용체이다. PD-1 수용체/PD-L1 리간드 착물의 형성은 림프절에서 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전송하며, 그 PD-1을 보완하여 또한 세포자멸사를 통해 림프절에서의 외래 항원-특이 T 세포의 축적을 제어할 수 있다. 따라서, PD-L1은 T-세포가 건강한 세포를 공격하는 것을 막는다. PD-L1이 T-세포의 표면 상에서 PD-1 수용체를 활성화시키는 경우, T-세포는 자신을 손상하도록 신호를 받는다.
기타의 관문 단백질은 CD-137(4-1BB) 공동자극 관문 단백질; 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3, CD223), 내성 T 세포 상에서 PD-1과 공동발현되는 CD4-관련 역제 수용체; B7 상과 단백질 B7-H3 및 B7-H4 및 T 세포 단백질 TIM3을 포함한다. 인지질, 예를 들어, 세포자멸사 동안 외부 막 표면으로 전좌되어 부식하는 세포 물질의 처리 및 정리 동안 일어나는 과잉 면역 활성화를 억제시키는 정상 세포의 인지질인 포스파티딜세린(PS)이 또한 관문 분자로서 작용할 수 있다. PS의 외재화는 대식세포를 간접적으로 자극하여, 수지상 세포 항원 제시의 억제를 초래한다. PD-L1처럼, 외재화 PS는 비정상적으로 일부 종양 세포 및 종양-유래 미세소포에 의해 발현된다.
본 발명에 따르는 관문 억제제는 관문 분자 자체와 또는 이들의 결합 파트너, 예를 들어, 리간드와의 상호작용에 의해 이들 관문 분자(예를 들어, 관문 단백질 또는 지질) 중의 어느 것의 활성을 표적화하거나 억제할 수 있다.
관문 억제제(면역 관문 조절제, 또는 CPM으로도 알려짐)는 T/B 세포 활성화를 통해 달성되는 세포사를 방지하는데 있어서의 관문 분자의 효과를 낮춘다. 관문 분자를 억제하는 능력은 적합한 모델에서, 예를 들어, 이의 결합 파트너에 대한, 예를 들어, B7-1 또는 B7-2(CTLA-4의 경우) 또는 PD-L1(PD-1의 경우)에 대한 결합을 방지함으로써 평가할 수 있다.
몇몇 관문 억제제, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[참조; Creelan (2014) Cancer Control 21:80-89]에 기재된 억제제가 알려져 있으며 본 발명에서 사용될 수 있다.
관문 억제제는 항체일 수 있으며, 적합한 항체가 상업적으로 이용 가능하다. 바람직하게는 항체는 단클론성 항체이다.
예를 들자면, 항-CTLA-4 및 항-PD-1 항체가 Bio X Cell(West Lebanon, USA)로부터 이용 가능하다. 관문 억제제인 다른 특이 항체의 예는 다음을 포함한다: 트레메리무맙(CP-675,206), CTLA-4에 대해 높은 친화도를 갖는 인간 IgG2 단클론성 항체; 리필리무맙(MDX-010), CTLA-4에 대한 인간 IgG1 단클론성 항체; 니볼루맙(BMS-936558), 검출 가능한 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)이 본질적으로 결핍된 인간 단클론성 항-PD1 IgG4 항체; MK-3475(이전에는 람브롤리주맙), Fc-매개된 ADCC를 방지하도록 설계된 C228P에 돌연변이를 함유하는 인간화 IgG4 항-PD-1 항체; 우렐루맙(BMS-663513), 완전 인간 IgG4 단클론성 항-CD137 항체; 항-LAG-3 단클론성 항체(BMS-986016); 및 바티툭시맙(키메라 3G4), PS에 대한 키메라 IgG3 항체. 본원에 논의되거나 달리 이용 가능한 임의의 적합한 관문 억제제가 본 발명에서 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서 관문 억제제는 CTLA-4 및/또는 PD-1을 표적화한다. 바람직한 양태에서 CTLA-4를 표적화하는 관문 억제제 및 PD-1을 표적화하는 관문 억제제 둘 다가 사용될 수 있다(예를들면 이들 표적에 대한 항체). 바람직하게는 관문 억제제는 CTLA-4 및/또는 PD-1에 대한 항체이며 B7-1/B7-2에 대한 CTLA-4의 및/또는 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 방지하거나 억제한다. 본원에 논의된 바와 같이 CTLA-4 및 PD-1은 바람직하게는 각각 서열의 UniProt 데이터베이스 수납 번호 P1640, 버젼 3(2003년 1월 10일) 및 서열의 수납 번호 Q15116 버젼 3(2007년 4월 17일)에 제시된 바와 같은 서열, 또는 당업계에서 일상적인 방법을 사용하여 전장 서열에 걸쳐 평가된 바와 같이 이에 대해 적어도 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 지닌 서열을 갖는다.
대안적인 전략은 종양 세포 표면 상에서 PD-1에 대한 리간드인 PD-L1을 억제하는 것이며, 따라서 PD-L1의 억제제가 또한 관문 억제제로서 본 발명에 포함된다. 예를 들면, MPDL3280A(RG7446)는 인간 IgG1-카파 항-PD-L1 단클론성 항체이며 본 발명에 따라 사용될 수 있다. MEDI4736은 또 다른 IgG1-카파 PD-L1 억제제이다.
또 다른 대안적인 방안은 B7-DC-Fc 융합 단백질을 사용하여 PD-1 수용체를 경쟁적으로 차단시키는 것이며, 따라서 이러한 융합 단백질이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 추가의 대안적인 방안에서 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체에 대한 항체가 면역요법제로서 사용될 수 있다. 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR)는 NK 세포독성 활성을 하향조절하는 NK 세포 상의 수용체이다. HLA 부류 I 대립유전자-특이 KIR 수용체는 세포용해 (CD56dimCD16+) NK 세포에서 발현되는 반면, CD56brightCD16- NK 서브세트는 이러한 KIR이 결핍된다. 이러한 방식으로, 억제성 KIR이 종양부근 NK 세포 침윤물에서 선택적으로 발현되는 것으로 보이며, 따라서, PD-L1과 유사하게, 종양에 의해 선임되는 관문 경로인 것으로 보인다. 이와 같이, 항체를 사용한 특이 KIR의 억제는 NK 세포의 지속적인 생체내 활성화를 야기할 것이다. 예를 들면, 리릴루맙(IPH2102)은 KIR에 대한 완전 인간 단클론성 항체이며 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 하나 이상의(예를들면 둘 이상의) 관문 억제제가 사용될 수 있으며, 이들은 별도로, 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 2, 3 또는 4개의 관문 억제제, 예를 들어, CTLA4 및 PD-1에 대한 관문 억제제, 예를들면 항-CTLA4 및 항-PD-1가 방법에서 사용될 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 관문 억제제가 본원에 기재된 본 발명의 기타 양태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 조성물, 용도, 제품 및 키트에서 제공될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 양태에서 관문 억제제에 대한 언급은 하나 이상의 관문 억제제를 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 톨-유사 수용체(TLR)에 대한 리간드의 사용을 추가로 포함한다. 본 발명의 모든 측면에서 하나 이상의(예를 들어, 둘 ㅇ이상의) TLR 리간드가 사용될 수 있으며, 이들은 별도로, 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 양태에서 TLR 리간드에 대한 언급은 하나 이상의 TLR 리간드를 포함한다.
톨-유사 수용체는 내재 면역계에서 뿐만 아니라 소화계에서 주요한 역할을 하는 단백질의 부류이다. TLR 및 인터류킨-1 수용체는 인터류킨-1 수용체/톨-유사 수용체 상과라고 불리는 수용체 상과를 형성한다. 이러한 과의 모든 구성원은 톨-IL-1 수용체 도메인(TIR)을 갖는다. 인터류킨-1 수용체(IL-1R) 과의 구성원은 세포외 면역글로불린-유사 도메인 및 세포내 톨/인터류킨-1R(TIR) 도메인을 특징으로 한다. 서브기 2 TIR 도메인을 갖는 수용체가 TLR로 간주된다.
TLR은 미생물로부터 유래되는 구조적으로 보존된 분자를 인식하는 센티넬(sentinel) 세포, 예를 들어, 대식세포 및 수지상 세포에서 통상적으로 발현되는 단일의 막-스패닝, 비-촉매 수용체이다. 일단 이들 미생물이 물리적 장벽, 예를 들어, 피부 또는 장관 점막을 침입하면, 이들은 TLR에 의해 인식되며, 이것이 면역 세포 반응을 활성화시킨다. 이들 수용체는 병원체의 기능에 중요한 것으로 여겨지며 돌연변이를 통해 변하기 어려운 병원체-관련 분자와 같은 분자를 인식한다. 이들은 박테리아 세포-표면 지질다당류(LPS), 지질단백질, 지질펩티드 및 지질아라비노만난; 단백질, 예를 들어, 박테리아 편모 유래의 플라젤린; 바이러스의 이중-가닥 RNA; 또는 박테리아 및 바이러스 DNA의 비메틸화 CpG 아일랜드(island); 및 또한, 진핵 DNA의 프로모터에서 관찰되는 CpG 아일랜드; 및 특정의 기타 RNA 및 DNA 분자를 포함할 수 있다. TLR의 대부분에 있어서, 리간드 인식 특이성은 이제 유전자 표적화에 의해 확립되었다.
대부분의 포유류 종은 10 내지 15가지 유형의 톨-유사 수용체를 갖는 것으로 추정되었다. 13가지의 TLR(간단히 TLR1 내지 TLR13으로 명명)이 인간 및 마우스에서 함께 확인되었다(마우스에서 13가지 및 인간에서 10가지).
TLR 수용체에 대한 모든 리간드는 본 발명에 포함된다. 용어 "리간드"는 생물학적 목적을 제공하기 위해 생체분자와 복합체를 형성하는 물질을 의미하는 것으로 의도된다. TLR 리간드의 맥락에서, 이것은 표적 TLR상의 부위에 결합하는 신호 촉발 분자이다. 리간드가 이의 동족 수용체에 결합하는 경우, 이는 수용체의 화학적 입체형태를 변경시킬 수 있다. 수용체 단백질의 입체형태 상태가 이의 기능적 상태를 결정한다.
따라서, 본 발명에 따르는 TLR 리간드는 적어도 하나의 또는 하나 이상의 톨-유사 수용체(TLR)에 결합하며, TLR의 활성화, 예를 들어, TLR-매개된 세포 신호전달의 활성화를 야기하는 분자이다.
TLR 신호전달은 2개의 별개의 신호전달 경로, MyD88-의존성 및 TRIF-의존성 경로로 나뉜다. 본 발명에 따르는 TLR 리간드는 이들 2개의 경로 중 하나 또는 둘 다를 활성화시킨다. 따라서, 본 발명에 따르는 리간드는 하나 이상의 TLR에 결합하고, 리간드의 결합시 수용체의 입체형태 변화를 통해 TLR의 활성화, 예를 들어, TLR 신호전달의 활성화를 야기하는 분자이다.
MyD88-의존성 반응은 TLR 수용체의 이량체화시에 발생하며, TLR3을 제외한 모든 TLR에 의해 사용된다. 이의 주요 효과는 NFκB 및 미토겐-활성화 단백질 키나제의 활성화이다. 리간드 결합 및 수용체에서 발생하는 입체형태 변화는 어댑터 단백질 MyD88, TIR 과의 구성원을 동원한다. 그후, MyD88은 IRAK 4, IRAKI 및 IRAK2를 동원한다. 이어서, IRAK 키나제가 단백질 TRAF6을 인산화시키고 활성화시키며, 이는 차례로 IKKβ로의 결합을 촉진시키기 위해 단백질 TAK1 및 그 자체를 폴리유비퀴닌화시킨다. TAK1은 결합시에 IKKβ를 인산화하고, 이것은 그후 IκB를 인산화하여 그 분해를 야기하고 NFκB가 세포 핵으로 확산되어 전사를 활성화하고, 결과적으로 염증성 사이토킨의 유도를 가능하게 한다.
또 다른 경로는 TRIF-의존성 경로이며, 이것은 TLR3 및 TLR4 둘 다에 의해 사용된다. TLR3에 있어서, dsRNA(또는 유사 - 하기 참조)는 수용체의 활성화를 야기하여, 어댑터 TRIF를 동원한다. TRIF는 키나제 TBK1 및 RIP1을 활성화하며, 이는 신호전달 경로에서 한 분지를 생성한다. TRIF/TBK1 신호전달 복합체는 IRF3을 인산화시켜, 이것이 핵으로 전좌되게 하고, 인터페론 I형이 생성되게 한다. 한편, RIP1의 활성화는 MyD88-의존성 경로와 동일한 방식으로 폴리유비퀴틴화 및 TAK1 및 NFκB 전사의 활성화를 야기한다.
TLR 신호전달의 활성화를 결정하기 위한 표준 방법, 예를 들어, 적절한 신호전달 단백질의 인산화 상태의 결정 방법이 당업계에 알려져 있다. 대안적으로, 당업계에 널리 알려져 있는 방법에 의하여, 예를 들어, 특정 TLR을 암호화하는 유전자를 유전학적으로 결실시키고 리간드의 효과가 유지되는지를 결정함으로써 리간드가 TLR을 통해 작용하는지를 결정할 수 있다. 이러한 방법은 상업적으로 이용 가능한 트랜스제닉 녹-아웃(knock-out) 마우스에서 시험관내 그리고 생체내 둘 다에서 사용될 수 있다(TLR2, 3 및 4 녹-아웃은 The Jackson Laboratory로부터 입수가능하며, TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 9 녹-아웃은 OrientalBioService Inc로부터 입수가능함). 또한, NF-κB/AP1 활성화의 분석을 통하여 TLR의 자극을 연구하기 위하여 설계된 HEK-Blue™ 세포(Invivogen, San Diego, CA, USA))가 이용 가능하다. 이러한 세포는 TLR 2 내지 9 및 13에 대하여 이용 가능하다. 또한, TLR 길항제, 예를 들어, Invivogen으로부터 이용 가능한 것들을 사용하여 TLR의 길항작용이 추정의 리간드의 작용을 억제하는지를 결정할 수 있다. 따라서, 분자가 TLR 리간드, 예를 들어, 특이 TLR 리간드인지를 결정하는 방법이 당업계에 널리 알려져 있다.
TLR의 구조는 류신-풍부 반복(LRR) 엑토도메인, 나선형 막횡단 도메인 및 세포내 톨/IL-1 수용체 상동성(TIR) 신호전달 도메인으로 이루어진다. 엑토도메인은 다양한 수의 LRR을 함유하며, 편자 형상으로 굽혀진 솔레노이드와 비슷하다. 양 말단에, 편자의 소수성 코어를 보호하는 말단 LRR이 존재한다. 이들 엑토도메인은 매우 가변적이다. 이들은 지질다당류, 지질펩티드, 사이토신-포스페이트-구아닌(CpG) DNA, 플라젤린, 이미다조퀴놀린 및 ds/ssRNA를 포함하는 다양한 병원체-관련 모티프의 인식에 직접 연루된다. TIR 신호전달 복합체는, 수용체 활성화시, 수용체와 어댑터 TIR 도메인 간에 형성된다.
수용체 TLR 7, 8 및 9는 다른 TLR보다 더 긴 아미노산 서열을 갖는 과이다. 이들은 세포내로 국소화되며, 비-자가 핵산에 반응하여 신호를 낸다. 또한, 이들은 이들의 LRR14과 15 사이에 불규칙한 세그먼트를 함유한다.
TLR 수용체의 서열은 알려져 있으며, 본원에 기재된 리간드에 의한 이들 수용체로의 결합은, 예를 들어, 전술된 바와 같이 평가될 수 있다. 예로써, 알려져 있는 TLR 아미노산 서열이 하기 표 1에 나타나 있다.
TLR NCBI
참조
서열 		UniProtKB / Swiss-Prot
참조
톨-유사 수용체 1 전구체 (호모 사피엔스) NP_003254.2
 Q15399
톨-유사 수용체 2 전구체 (호모 사피엔스) NP_003255.2 O60603
톨-유사 수용체 3 전구체 (호모 사피엔스) NP_003256.1 O15455
톨-유사 수용체 4 동형체 C (호모 사피엔스) NP_003257.1 O00206
톨-유사 수용체 5 전구체 (호모 사피엔스) NP_003259.2
 O60602
톨-유사 수용체 6 전구체 (호모 사피엔스) NP_006059.2 Q9Y2C9
톨-유사 수용체 7 전구체 (호모 사피엔스) NP_057646.1 Q9NYK1
톨-유사 수용체 8 전구체 (호모 사피엔스) NP_619542.1 Q9NR97
톨-유사 수용체 9 전구체 (호모 사피엔스) NP_059138.1
 Q9NR96
톨-유사 수용체 10 동형체 a (호모 사피엔스) NP_001017388.1
 Q9BXR5
톨-유사 수용체 11 (마우스) Q6R5P0
톨-유사 수용체 12 (마우스) Q6QNU9
톨-유사 수용체 (마우스)　 Q6R5N8
TLR1은 리간드가 지질단백질 및 다중 트리아실 지질펩티드, 예를 들어, 박테리아로부터 유래되는 것들을 포함하는 세포-표면 수용체이다. TLR1은 그것 자체에서 리간드를 인식하지 않고, 오히려, 이것은 TLR2와의 복합체로 작용한다. 따라서, 리간드는 TLR1과 TLR2 간의 복합체를 인식한다. TLR1은 TLR2와 조합되어(이종이량체로서) 펩티도글리칸 및 (트리아실) 지질단백질을 인식한다.
지질단백질/펩티드는 단백질/펩티드에 연결된 지질로 이루어진 분자이다. 박테리아는 이러한 분자를 발현한다. 트리아실 지질단백질/펩티드는 3개의 아실 기를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 TLR1 리간드는 트리아실 지질펩티드이다.
TLR1 리간드는 Invivogen 또는 Enzo Life Sciences(Farmingdale, NY, USA)로부터 구매할 수 있다. 예를 들어, Pam3CSK4(Invivogen)는 박테리아 LP의 아실화 아미노 말단을 모방하는 합성 트리아실화 지질펩티드(LP)이다.
대안적으로, TLR2와 복합체화된 TLR1의 선택적 효능제인 Pam3Cys-Ser-(Lys)4 트리하이드로클로라이드(Enzo Life Sciences)가 사용될 수 있다.
TLR2는 넓은 기의 그람-양성 및 그람-음성 박테리아 둘 다의 종, 및 마이코플라스마 및 효모를 대표하는 매우 다양한 미생물 분자에 의해 자극되는 세포 표면 수용체이다. TLR2는 그람-양성 박테리아 유래의 세포-벽 성분, 예를 들어, 펩티도글리칸, 지질테이코산 및 지질단백질, 마이코박테리아 유래의 지질아라비노만난 및 효모 세포벽 유래의 지모산을 인식한다.
바람직한 TLR2 리간드는 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 유래의 지질글리칸, 예를 들어, 지질아라비노만난 및 지질만난이다. 특히 바람직한 지질글리칸은 TLR2에 특이적인 지질다당류(LPS)이다. 이들 분자는 공유 결합에 의해 연결되는 지질 및 다당류를 가지며, 그람-음성 박테리아의 외측 멤버에서 관찰되고, 내독소로서 작용한다. 바람직한 특징에서, LPS는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas Gingivalis) 유래의 것이다. LPS는 지질 A로 명명된 특정 탄수화물 지질 모이어티에 의해 박테리아 외막에 부착된 다당류 영역으로 이루어진다. 내독소로도 알려져 있는 지질 A는 LPS의 면역자극 활성의 원인이 된다.
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가장 활성이 있는 형태의 지질 A는 6개의 지방 아실 기를 함유하며, 병원성 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라(Salmonella) 종에서 관찰된다.
다른 바람직한 TLR2 리간드는, 예를 들어, 상이한 박테리아 종, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 기원한 지질테이코산; 예를 들어, 박테리아 종, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스, 에스케리키아 콜라이 균주(예를 들어, 0111:B4 또는 K12), 스타필로 코커스 아우레우스 등 유래의 펩티도글리칸; 합성 지질단백질, 예를 들어, 합성 디아실화 지질단백질 또는 합성 트리아실화 지질단백질 및 β-1,3-글리코시드 결합에 의해 연결된 반복 글루코스 단위를 갖는 글루칸인 지모산(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래)이다. TLR2 리간드는 Invivogen으로부터 상업적으로 이용 가능하다.
TLR3은 세포 구획 내에서 관찰된다. 본 발명에 따르는 바람직한 리간드는 바이러스 dsRNA를 모방하는 이중-가닥 RNA 분자, 예를 들어, 폴리아데닐-폴리우리딜산(폴리A:U)) 또는 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리(l:C))이다. 폴리(I:C)가 특히 바람직하다.
이중-가닥 RNA(dsRNA)는 모든 세포에서 관찰되는 DNA와 유사하게 2개의 상보적인 가닥을 갖는 RNA이다. dsRNA는 일부 바이러스(이중-가닥 RNA 바이러스)의 유전 물질을 형성한다. 이중-가닥 RNA, 예를 들어, 바이러스 RNA 또 는 siRNA는 진핵생물에서 RNA 간섭, 및 척추동물에서 인터페론 반응을 촉발시킬 수 있다.
바람직한 특징에서, 리간드는 폴리(l:C)이다. 폴리 l:C는 하나의 가닥이 이노신산의 중합체이고 다른 가닥이 시티딜산의 중합체인 미스매치된 이중-가닥 RNA이다. 이러한 분자는 널리 알려져 있는 기술에 의해 생성될 수 있다. 다양한 상업적 공급처가 존재하며, 예를 들어, 하기의 것은 Invivogen으로부터 구매가능하며, 바람직한 양태를 형성한다:
- 고분자량 및 1.5-8 kb의 평균 크기를 갖는 폴리(I:C)(HMW), 및
- 저분자량 및 0.2-1 kb의 평균 크기를 갖는 폴리(I:C)(LMW). 고분자량 및 저분자량 형태 둘 다가 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 형태이다.
TLR4는 또한 세포 표면상에서 관찰되며, 특히 지질다당류(LPS), 몇몇의 열 충격 단백질, 피브리노겐, 헤파린 설페이트 단편, 히알루론산 단편, 니켈 및 다양한 오피오이드 약물을 포함하는 몇몇의 리간드 유형을 갖는다. 바람직한 측면에서, 리간드는 LPS이다. LPS는 다양한 박테리아 종으로부터, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 0111:B4 또는 K12 또는 살모넬라로부터 기원할 수 있으며(페놀-물 혼합물에 의해 추출), 바람직한 특징에서, LPS는 에스케리키아 콜라이 또는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 예를 들어, 균주 R595 유래의 것이다. 다른 바람직한 측면에서, TLR4 리간드는 박테리아(예를 들어, 살모넬라 미네소타 R595)로부터 분리되거나 합성에 의해 제조될 수 있는 모노포스포릴 지질 A(MPLA)이다. 일반적으로, TLR4 리간드는 예를 들어, Invivogen으로부터 상업적으로 이용 가능하다.
TLR5는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아 둘 다, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 등 유래의 리간드 플라젤린에 결합한다. 플라젤린은 중공 관상으로 스스로 정렬되어 박테리아 편모에서 필라멘트를 형성하는 구형 단백질이다. 이것은 약 30,000 내지 60,000 달톤의 질량을 갖는다. 플라젤린은 박테리아 편모의 주요 치환체이며, 거의 모든 편모 박테리아에 다량 존재한다. 따라서, 바람직한 TLR5 리간드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 박테리아 유래의 플라젤린이다. TLR5 리간드는, 예를 들어, Invivogen으로부터 상업적으로 이용 가능하다.
TLR6은 다수의 디아실 지질펩티드에 결합한다. 상기 논의된 바와 같이, 지질펩티드는 박테리아에서 발견되며, 펩티드에 연결된 지질을 포함한다. 디아실 지질펩티드는 2개의 아실 기를 가지며, 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 TLR6 리간드를 형성한다. TLR6 리간드는 Invivogen으로부터 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF)은 MALP-2, 마이코플라스마 퍼멘탄스(M. fermentans) 유래의 지질단백질(LP)과 유사한 마이코플라스마 살리바리움(Mycoplasma salivarium)으로부터 유래된 합성 지질단백질이다. 마이코플라스마 LP, 예를 들어, FSL-1은 디아실화 시스테인 잔기를 함유하는 반면, 박테리아 LP는 트리아실화 잔기를 함유한다. FSL-1은 TLR2와 조합된 TLR6에 의해 인식되는 반면, 박테리아 LP는 상기 논의된 바와 같은 TLR2 및 TLR1의 조합에 의해 인식된다.
TLR7 리간드는 작은 합성 화합물 이미다조퀴놀린, 염기 유사체, 예를 들어, 아데닌 및 구아노신 유사체(예를 들어, 록소리빈(loxoribine)) 및 브로피리민(bropirimine) 및 또한 단일-가닥 RNA를 포함한다.
이미다조퀴놀린 화합물은 바람직하게는 하기에 나타낸 화학식을 갖는 이중 환상 유기 분자이며, 여기서, R1 및 R2에서 기는 달라질 수 있다.
바람직하게는 이미다조퀴놀린 화합물은 화학식 1 및 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는다:
Figure pct00017
상기 화학식 1에서,
R1은, 예를 들어, 하이드록실 기로 임의로 치환된 아미노-알킬 기이고, R2는 산소 또는 질소 기로 임의로 차단된 알킬 기이며; 여기서, 바람직하게는
R1은 N-CH2-C(CH3)2-R3이고;
R2는 -CH2-X-CH2CH3 또는 수소원자이고;
R3은 OH 또는 수소원자이고 X는 O 또는 NH이거나.
또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
상기 화학식에서 알킬 기는 C1-C10 기일 수 있다.
이러한 화합물의 예는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 레시퀴모드(Resiquimod)(또는 R848)(1-[4-아미노-2-(에톡시메틸)이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-2-메틸프로판-2-올), 이미퀴모드(Imiquimod)(3-(2-메틸프로필)-3,5,8-트리아자트리사이클로[7.4.9.02,6]트리데카-1(9),2(6),4,7,10,12-헥사엔-7-아민) 및 가디퀴모드(R1은 N-CH2-C(CH3)2OH이고; R2는 -CH2-NH-CH2CH3이다); 1-[4-아미노-2- (에틸아미노메틸)이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-2-메틸프로판-2-올)(모두 InvivoGen(San Diego CA, USA)으로부터 이용 가능함). 바람직한 양태에서 화합물은 레시퀴모드 및 이미퀴모드로부터 선택된다.
이들 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염도 본 발명에 포함된다. 적절한 염은, 예를 들어, 아세트산염, 브롬화물, 염화물, 시트르산염, 염산염, 말레산염, 메실산염, 질산염, 인산염, 황산염, 주석산염, 올레산염, 스테아르산염, 토실레이트, 칼슘, 메글루민, 칼륨 및 나트륨 염을 포함한다.
록소리빈은 위치 N7 및 C8에서 유도체화된 구아노신 유사체이다. 이러한 뉴클레오시드는 면역계의 매우 강력한 자극제이다. 브로피리민은 하기에 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 항암 및 항바이러스 특성을 갖는 실험 약물이다:
Figure pct00018
단일 가닥 RNA는 바람직한 TLR7 리간드, 예를 들어, ssPolyU이며, 여기서 바람직하게는 상기 단일 가닥 분자는 20 내지 200개 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 분자는 합성에 의해 용이하게 생성될 수 있다.
TLR8 리간드는 일반적으로 작은 합성 화합물 또는 단일-가닥 RNA이다. 바람직하게는 상기 TLR8 리간드는 상기한 바와 같은 ssPolyU 분자이다.
TLR9 리간드는 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 DNA를 포함한다. "CpG" 올리고뉴클레오티드(또는 CpG ODN)는 이러한 리간드의 일례이며, 구아닌 트리포스페이트 데옥시뉴클레오티드("G")로의 사이토신 트리포스페이트 데옥시뉴클레오티드("C")의 결합으로부터 야기되는 짧은 단일-가닥 합성 DNA 분자이다. "p"는 연속 뉴클레오티드 간의 포스포디에스테르 결합을 말하지만, 일부 ODN은 대신에 변형된 포스포로티오에이트(PS) 골격을 갖는다. 본원에 언급된 바와 같이, CpG 뉴클레오티드를 CpG 모티프라고 한다. CpG 모티프는 비메틸화된다. CpG 모티프를 함유하는 서열은 이들이 미생물 게놈에서 풍부하나 척추동물 게놈에서 희귀하기 때문에, 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)으로 여겨진다. CpG PAMP는 패턴 인식 수용체(PRR) 톨-유사 수용체 9(TLR9)에 의해 인식된다. TLR9는 포유류 DNA로부터 미생물 DNA를 구별하는 특정 비메틸화 CpG 올리고뉴클레오티드(ODN) 서열을 인식한다.
자극성 ODN의 3가지 주요 유형이 기재되어 있다: A, B 및 C형. A형 CpG ODN은 혼합된 포스포디에스테르/포스포로티오에이트 골격으로 구성되며, 팔린드롬 서열의 부분으로서 하나 이상의 CpG 모티프를 함유한다. A형 CpG ODN은 3' 및 5' 말단에 폴리 G 테일을 갖는다(연쇄체(concatemer)의 형성을 용이하게 하는 구조적 모티프). A형 CpG ODN은 전형적으로 한 말단 또는 양 말단에 7 내지 10개의 포스포로티오에이트-변형 염기를 함유하며, 이는 뉴클레아제에 의한 분해에 저항하고 ODN의 안정성을 증가시킨다. 예를 들어, 내부 팔린드롬 서열은 8 내지 16개(바람직하게는 10, 12 또는 14개) 염기 쌍 길이일 수 있으며, 염기의 순서가 달라질 수 있으나, 패턴, 5'-PuPuCGPu:PyCGPyPy-3'이 바람직하며, 여기서, ":"으로 표시된 팔린드롬 중심으로부터 등거리의 Pu, Py 염기는 상보적이다. DNA 가닥의 어느 하나의 말단에서 발견되는 폴리 G 테일은 길이가 달라질 수 있다.
B형 CpG ODN은 CpG 모티프를 함유하는 하나 이상의 6mer 컨센서스 서열을 가질 수 있다. 인간 컨센서스 서열은 서열 5'-Pu Py C G Py Pu-3'을 함유할 수 있다(마우스 서열은 상이할 수 있다). B형 CpG ODN은 완전히 포스포로티오에이트화된(PS-변형된) 골격을 가지며, 일반적으로 18 내지 28개(예를 들어, 18 내지 22개) 뉴클레오티드 길이이다. B형 CpG ODN의 예는 서열 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'을 갖는 ODN 1826이다.
C형 CpG ODN은 A 및 B형 둘 다의 특징을 조합한다. C형 CpG ODN은 전적으로 포스포로티오에이트 뉴클레오티드로 구성되며, 하나 이상의 CpG 모티프를 함유하는 팔린드롬 서열을 함유한다. C형 CpG ODN의 일례는 서열 5'- tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3'(팔린드롬은 밑줄이 그어 있음)을 갖는 ODN 2395이다.
또한, 고도로 정렬된 구조를 형성하게 하는 2개의 팔린드롬 서열을 함유하는 P형 CpG ODN이 또한 사용될 수 있다.
CpG 올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려져 있는 표준 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 의해 합성될 수 있다.
따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 CpG 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 CpG 모티프 및 3' 및 5' 측 각각에서 상기 모티프의 측면에(flanking) 적어도 하나의 염기를 포함하는 6 내지 50개 염기, 바람직하게는 18 내지 27개, 바람직하 게는 20 내지 25개 염기의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드까지 확대되며, 여기서 상기 CpG 모티프는 사이토신에 이어서 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합된 구아닌이고, 시토신의 피리미딘 고리는 비메틸화된다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 모티프는 하나 이상의 모티프와 함께 팔린드롬 서열을 제공하는 서열이 측면에 배치된다. 본원에 언급된 바와 같이, "팔린드롬 서열", 예를 들어, cggcgc:gcgccg(여기서, 팔린드롬의 중심은 ":"로 표시되어 있음)는 서열이 헤어핀을 형성할 수 있도록 역으로 상보적 서열에 결합된 정방향 서열을 제공한다. CpG 모티프는 서열의 중심을 형성할 수 있고/있거나 팔린드롬 서열 내의 다른 곳에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 팔린드롬 서열(정방향 및 역방향 서열 둘 다 포함)은 8 내지 16개, 바람직하게는 10 내지 12개 또는 10 내지 14개 염기 길이이다.
추가의 바람직한 측면에서 CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 팔린드롬 서열 5'-Pu Pu CG Pu:Py CG Py Py-3' 및/ 또는 컨센서스 서열 5'-Pu Py CG Py Pu-3' 중 하나 이상을 함유하며, 여기서, ":"으로 표시된 팔린드롬 중심으로부터 등거리의 Pu, Py 염기는 상보적이다. 임의로, CpG 올리고뉴클레오티드는 3' 또는 5' 말단에 3 내지 8개 염기 길이의 폴리 G 테일을 함유할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 10 내지 14개 염기의 팔린드롬 서열 및 포스포로티오에이트 골격을 갖는 18 내지 27개 염기의 C형 CPG ODN이다. 하기의 서열을 갖는 ODN 2395가 특히 바람직하다:
5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3'(팔린드롬 서열은 밑줄이 그어져 있음).
본 발명의 대안적인 바람직한 양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 18 내지 22개 염기 및 포스포로티오에이트 골격의 B형 CPG ODN이다. 하기의 서열을 갖는 ODN 1826이 특히 바람직하다:
5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'.
TLR11 및 12 리간드는 동적 전환 및 액틴 세포골격의 재구성에 관여하는 액틴-결합 단백질인 프로필린(profilin)을 포함한다. 따라서, 바람직한 TLR11/12 리간드는 톡소플라스마증 질환을 야기하는 오블리게이트(obligate)의, 세포내, 기생 원생동물인 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii)로부터 유래된 프로필린이다. 프로필린은 예를 들어, Enzo Life Sciences로부터 구매할 수 있다.
TLR13 리간드는 박테리아 리소좀 RNA 서열 "CGGAAAGACC" 및 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 이러한 리간드는 본 발명의 바람직한 양태를 형성한다. 서열 5'-GGACGGAAAGACCCCGUGG-3'을 갖는 올리고뉴클레오티드는 TLR13 리간드이며, 예를 들어, Invivogen으로부터 구매할 수 있다.
따라서, 바람직하게는, 상기 TLR 리간드는 TLR 2, 3, 4, 7, 8 또는 9 리간드, 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 리간드이다. 바람직한 양태에서, TLR 리간드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 TLR 3 리간드이다. 대안적인 바람직한 양태에서, TLR 리간드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 TLR 4 리간드이다. 또 다른 대안적인 바람직한 양태에서, TLR 리간드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 TLR7 내지 9 리간드, 또는 TLR7 리간드 또는 TLR8 리간드 또는 TLR 9 리간드이다.
본원에 사용되는 "발현하는" 또는 "제시하는"은 분자의 적어도 일부분이 그 세포의 주변의 환경에 노출되거나 접근 가능하게 하는, 바람직하게는, 면역 반응이 제시된 분자 또는 그의 부분에 대하여 생성될 수 있게 하는 상기 세포의 표면상의 항원 분자 또는 이의 부분의 존재를 지칭한다. "표면"상의 발현이 달성될 수 있으며, 여기서, 발현될 분자는 세포막 및/또는 상기 막에 존재하거나 존재하게 될 수 있는 성분과 접촉된다.
용어 "세포"는 본원에서 (곤충 세포 및 진균 세포를 포함하여) 모든 진핵 세포를 포함하는 것으로 사용된다. 따라서, 대표적인 "세포"는 모든 유형의 포유류 및 비-포유류 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 진균 세포 및 원생동물을 포함한다. 그러나, 바람직하게는, 세포는 포유류, 예를 들어, 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그 유래의 세포이지만, 가장 바람직하게는 인간 유래의 세포이다.
본 발명의 방법에서 이의 표면 상에 항원 분자 또는 이의 부분을 제시할 수 있는 제1 세포가 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법, 용도 등에 적용되는 제1 세포는 이의 시토졸로 투여되거나 전달되는 분자를 이의 표면 상에 발현 또는 제시할 수 있는 임의의 세포일 수 있다.
제1 세포는 편리하게는 면역 세포, 즉, 면역 반응에 관여하는 세포이다. 그러나, 다른 세포가 또한 항원을 면역계에 제시할 수 있으며 이들 또한 본 발명의 범위내에 든다. 따라서, 본 발명에 따르는 제1 세포는 유리하게는 이하에 기재되는 바와 같은 항원-제시 세포이다. 항원-제시 세포는 본원에 정의된 바와 같이 면역 반응의 임의의 측면 또는 "아암(arm)"에 관여할 수 있다.
세포독성 세포의 자극은 항원-제시 세포에 의해 특정 방식으로 항원이, 자극될 세포에 제시되는 것, 예를 들어, MHC 부류 I 제시를 필요로 한다(예를 들어, CD8+ 세포독성 T-세포의 활성화는 MHC-1 항원 제시를 필요로 한다). 또한, 항체-생성 세포는 항원-제시 세포에 의한 항원의 제시에 의해 자극될 수 있다.
항원은 세포내이입에 의해 항원-제시 세포에 의해 흡수되고, 세포내이입 소낭에서 펩티드로 분해될 수 있다. 이들 펩티드는 엔도좀에서 MHC 부류 II 분자에 결합하고, 세포 표면으로 운반될 수 있고, 여기서, 펩티드-MHC 부류 II 복합체는 CD4+ T 헬퍼 세포에 의해 인식되고 면역 반응을 유도할 수 있다. 대안적으로, 시토졸 내의 단백질은, 예를 들어, 프로테아좀에 의해 분해되고 TAP(항원 제시와 관련된 운반체)에 의해 소포체로 운반될 수 있으며, 여기서, 펩티드는 MHC 부류 I 분자에 결합하고 세포 표면으로 운반될 수 있다(문헌 참조; Yewdell and Bennink, 1992, Adv. Immunol. 52: 1-123). 펩티드가 외래 항원 기원의 것이면, 펩티드-MHC 부류 I 복합체는 CD8+ 세포독성 T-세포(CTL)에 의해 인식될 것이다. CTL은 펩티드-MHC(HLA) 부류 I 복합체에 결합하여, 활성화되며, 증식하기 시작하고 CTL의 클론을 형성할 것이다. 표적 세포 및 세포 표면상에 동일한 펩티드-MHC 부류 I 복합체를 갖는 다른 표적 세포는 CTL 클론에 의해 사멸될 수 있다. 충분한 양의 항원이 시토졸로 도입될 수 있다면, 외래 항원에 대한 면역성이 확립될 수 있다(문헌 참조; Yewdell and Bennink, 1992, supra; Rock, 1996, Immunology Today 17: 131-137). 이것은 특히 암 백신의 개발을 위한 기반이다. 현실적인 가장 큰 문제 중 하나는 충분한 양의 항원(또는 항원의 부분)을 시토졸 내로 도입하는 것이다. 이것은 본 발명에 따라 해결될 수 있다.
이전에 언급된 바와 같이, 항원 분자는 일단 광화학 내재화 과정에 의해 세포 시토질에 방출되면, 세포의 항원- 처리 기구에 의해 처리되고, 적절한 방식으로, 예를 들어, 부류 I MHC에 의해 세포 표면상에 제시될 수 있다. 이러한 처리는 항원의 분해, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드 항원의 펩티드로의 분해를 포함할 수 있으며, 이어서, 펩티드는 제시를 위하여 MHC의 분자와 복합체화된다. 따라서, 본 발명에 따르는 세포의 표면상에 발현되거나 제시되는 항원 분자는 내재화(세포내이입)되는 항원 분자의 부분 또는 단편일 수 있다.
예를 들어, 림프구(T 및 B 세포 둘 다), 수지상 세포, 대식세포 등을 포함하는 각종 상이한 세포 유형은 이들의 표면상에 항원을 제시할 수 있다. 다른 것들은 예를 들어, 암 세포, 예를 들어, 흑색종 세포를 포함한다. 이들 세포는 본원에 "항원-제시 세포"로 지칭된다. 면역계의 효과기 세포로의 항원의 제시에 주로 수반되는 면역계의 세포인 "전문 항원-제시 세포"는 당업계에 알려져 있으며, 문헌에 기재되어 있고, B 림프구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함한다. 바람직하게는 세포는 전문 항원-제시 세포이다.
세포독성 T-세포(CTL)로의 항원-제시 세포에 의한 항원 제시를 위하여, 항원 분자는 항원-제시 세포의 시토졸에 유입될 필요가 있다(문헌 참조; Germain, Cell, 1994, 76, 287-299).
예를 들어, 시험관내 또는 생체외 방법 또는 대안적으로 생체내 방법을 포함하는 본 발명의 양태에서, 제1 세포(또는 생체내 방법에서 항원을 제시하는 세포)는 바람직하게는 수지상 세포이다. 수지상 세포는 포유류 면역계의 부분을 형성하는 면역 세포이다. 이들의 주요 기능은 항원 물질을 처리하고, 표면상의 항원 물질을 면역계의 다른 세포에 제시하는 것이다. 일단 활성화되면, 이들은 림프절로 이동하며, 여기서 이들은 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 적응 면역 반응을 개시한다.
수지상 세포는 조혈 골수 전구 세포로부터 유래된다. 이들 전구 세포는 처음에 높은 세포내이입 활성 및 낮은 T-세포 활성화능을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포로 전환한다. 일단 이들이 제시 가능한 항원과 접촉하면, 이들은 성숙 수지상 세포로 활성화되고, 림프절로 이동하기 시작한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 식세포 작용시키고, 이들의 단백질을 작은 조각으로 분해하고, 성숙시에 MHC 분자를 사용하여 이들의 세포 표면에 이들 단편을 제시한다.
수지상 세포는 임의의 적절한 수지상 세포의 공급원으로부터, 예를 들어, 피부, 코, 폐, 위 및 장의 내면 라이닝 또는 혈액으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 수지상 세포는 골수로부터 유래된다.
수지상 세포는 본 발명의 시험관내 방법에 사용하기 위하여 천연 공급원으로부터 분리되거나, 시험관내에서 생성될 수 있다. 수지상 세포는 단핵구, 즉, 체내에서 순환하고, 올바른 신호에 따라, 수지상 세포 또는 대식세포 중 어느 하나로 분화할 수 있는 백혈구로부터 발생한다. 단핵구는 골수에서 줄기 세포로부터 형성된다. 단핵구-유도 수지상 세포는 시험관내에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성될 수 있다. 조직 배양 플라스크에 PBMC를 플레이팅하면, 단핵구가 부착하게 된다. 이들 단핵구를 인터류킨-4(IL-4) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)로 처리하면, 약 1주 내에 미성숙 수지상 세포(iDC)로의 분화가 야기된다. 종양 괴사 인자(TNF)로의 이후의 처리에 의해, iDC가 성숙 수지상 세포로 추가로 분화한다.
또 다른 바람직한 측면에서, 제1 세포(또는 생체내 항원을 제시하는 세포)는 대식세포일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 제2 세포는 관문 억제제가 결합할 수 있는 것이다. 이러한 세포는 관문 억제제가 결합할 수 있는 관문 분자, 예를 들어, 관문 단백질 또는 지질, 또는 이의 수용체 또는 리간드를 발현할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 관문 억제제에 의한 결합에 대한 언급은 예를 들어, 결합 파트너, 예를 들어 제2 세포 상에 존재하는 관련 에피토프를 함유하는 항체 또는 표적 분자에 대한 특이 결합 상호작용을 만드는 것을 지칭한다. 제1 및 제2 세포는 단세포일 수 있으며, 예를 들어, 둘 다 이의 표면 상에서 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하고 관문 억제제를 결합시킬 수 있다. 그러나, 그 결과, 이들은 별도의 세포이다. 이 경우에, 바람직한 특징에서, 제2 세포는 면역계의 세포, 특히 바람직하게는 T 또는 B 세포이며, 바람직하게는 일단 제1 세포 상에 발현되면 항원 분자 또는 이의 부분을 특이적으로 인식하는 세포이다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 제1 및 제2 세포가 사용되는 이러한 방법에서 제1 세포는 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하고 제2 세포는 상기 제1 세포 상에서의 상기 발현에 의해 자극되는 것으로 여겨지며, 여기서 자극은 관문 억제제의 사용에 의해 증진된다. 단세포만이 사용되는 경우, 생성되는 세포는 면역 반응을 활성화시키는 증진된 능력을 갖거나 면역 반응에 더욱 민감하다.
본원에 사용되는 "접촉하는"은 본원에 정의된 바와 같은 상이한 성분들, 예를 들어, 제1 세포와 감광화제 및/또는 항원 분자(및 임의로 TLR 리간드); 또는 제2 세포와 관문 억제제가 바람직하게는 적절한 영양 배지 중 37℃에서, 예를 들어, 25 내지 39℃에서, 또는 생체내에서 체온, 즉 36 내지 38℃에서 세포 내 내재화 및/또는 관문 억제제의 결합을 위하여 적절한 조건 하에서 서로 물리적으로 접촉되게 하는 것을 지칭한다. 유사하게, 제1 및 제2 세포(상이한 경우)는 이들 세포 사이의 상호작용, 예를 들어, 항원 분자를 제시하는 제1 세포에 의한 제2 세포의 자극을 가능케 하도록 서로 접촉될 수 있다. 이러한 접촉은 방법 전반에 걸쳐 일어날 수 있거나 방법의 단지 일부, 예를 들어, 조사가 일어난 후 발생할 수 있다.
시험관내에서 제1 및 제2 세포를 사용하여 경우, 각종 상이한 조합 및 타이밍이 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모든 상이한 제제 및 세포가 방법 동안 서로 접촉될 수 있고/있거나 제제가 상이한 시간에 첨가될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, "적어도" 제1 또는 제2 세포가 하나 이상의 제제와 접촉되는 경우, 제1 또는 제2 세포가 존재해야 하지만, 이에 더하여, 다른 세포가 또한 존재할 수 있다. 제1 세포는 적어도 감광화제 및 항원 분자(및 임의로 관문 억제제)와 접촉되고 제2 세포는 적어도 관문 억제제와 접촉된다. 이것은 별도의 용기에서 달성될 수 있거나 필요한 성분들이 함께 첨가될 수 있다. 제1 및 제2 세포가 단세포인 경우 다양한 제제가 모두 동일한 세포에 첨가되지만 첨가 순서는 달라질 수 있다.
따라서, 제1 세포는 본원에 정의된 바와 같은 감광화제 및 항원 분자(및 임의로 TLR 리간드)와 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다. 임의로 관문 억제제는 또한 제1 세포와 접촉될 수 있다. 바람직하게는, 및 편리하게는 성분들 중의 하나 이상은 제1 세포와 동시에(예를 들어, 별도로 또는 함께) 접촉된다. 예를 들면 적어도 감광화제 및 항원 분자(및 임의로 TLR 리간드)는 세포와 동시에 접촉될 수 있고 관문 억제제 또한 동시에 첨가될 수 있거나 (제2 세포가 제1 세포와 동일하지 않은 경우 제2 세포를 첨가하거나 첨가하지 않고서) 이들 성분 전 또는 후에 첨가될 수 있다. 감광화제 및 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)는 세포에 의해 동일하거나 상이한 세포내 구획으로 흡수될 수 있다(예를 들어, 이들은 공동-전좌될 수 있다).
세포는 감광화 화합물을 활성화시키기에 적합한 파장의 광에 노출되며, 이것이 세포내 구획 막의 손상을 야기한다. 편리하게는 이것은 항원 분자 및 감광화제를 제1 세포에 첨가한 후 수행되지만, 그 첨가 후 수행될 수도 있다.
제WO 02/44396호(이것은 본원에 참고로 포함됨)에는, 예를 들어, 감광화제가 세포와 접촉되고, 내재화되어야 하는 분자(이러한 경우에 항원 분자)가 세포와 접촉되기 전에 조사에 의해 활성화되도록 방법의 단계의 순서가 배열될 수 있는 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법은 내재화되어야 하는 분자가 조사시에 감광화제와 동일한 세포 하위구획에 존재할 필요가 없다는 사실을 이용한다.
따라서 하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 상기 감광화제 및/또는 상기 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)는 함께 또는 서로 별도로 제1 세포에 적용된다. 이어서, 조사는 적어도 감광화제 및 항원 분자가 동일한 세포내 구획에 나타나는 시기에 수행된다. 이것을 "이후 광(light after)" 방법이라고 한다.
대안적인 양태에서, 상기 방법은 상기 제1 세포를 먼저 감광화제와 접촉시킨 다음 본원에 정의된 바와 같이 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)와 접촉시킴으로써 수행될 수 있으며, 조사는 세포내 구획으로의 감광화제의 흡수 이후에, 그러나, 상기 감광화제를 함유하는 세포내 구획으로의 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)의 세포 흡수 이전에(예를 들어, 이것은 광 노출시에 상이한 세포내 구획에 존재할 수 있음), 바람직하게는 임의의 세포내 구획으로의 세포 흡수 이전에, 예를 들어, 임의의 세포 흡수 이전에 수행된다. 따라서, 예를 들어, 감광화제가 투여된 다음 조사 이후 잔여 제제의 투여가 행해질 수 있다. 이것이 소위 "이전 광(light before)" 방법이다.
본원에 사용되는 "내재화"는 분자의 세포내, 예를 들어, 시토졸 전달을 지칭한다. 본 발명의 경우에, "내재화"는 세포내/막 결합 구획으로부터 세포의 시토졸로의 분자의 방출 단계를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 "세포 흡수" 또는 "전좌"는 세포막의 외부에 있는 분자가 예를 들어, 세포내이입 또는 다른 적절한 흡수 메커니즘에 의해 외측에 있는 세포막의 내부에서 발견되도록 세포 내로, 예를 들어, 세포내 막-한정 구획, 예를 들어, 소포체, 골지체, 리소좀, 엔도좀 등 내로 흡수되거나 또는 이와 회합되는 내재화 단계 중 하나를 지칭한다.
세포를 다양한 제제와 접촉시키는 단계는 임의의 편리한 또는 요망되는 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 접촉 단계가 시험관내에서 수행되어야 한다면, 세포(들)는 편리하게 수성 배지, 예를 들어, 적절한 세포 배양 배지 중에 유지될 수 있으며, 적절한 시점에 다양한 제제가 적절한 조건하에, 예를 들어, 적절한 농도에서 적절한 기간 동안 간단하게 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 세포(들)는 무혈청 배지의 존재하에 또는 혈청-함유 배지와 함께 제제와 접촉될 수 있다.
하기의 언급은 세포(들)로의 다양한 제제의 개별적인 적용을 논의한다. 그러나, 상기 논의된 바와 같이, 이들 제제는 함께, 별도로, 동시에 또는 순차적으로 세포(들)에 적용될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 다양한 제제의 적용은 시험관내 또는 생체내에서 세포에 대하여 이루어질 수 있다. 후자의 경우에, 적용은 하기에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이 직접적인(즉, 국소화) 또는 간접적인(즉, 전신 또는 비-국소화) 투여를 통해 이루어질 수 있다.
감광화제는 통상의 기술을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 사용되는 특정 감광화제 및 표적 세포 유형과 위치와 같은 인자에 좌우되는 적절한 농도 및 적절한 기간 동안 세포(들)(또는 이러한 세포가 존재하는 치료하고자 하는 대상체)와 접촉된다. 감광화제의 농도는 편리하게는 일단 세포 내로, 예를 들어 이의 세포내 구획 중 하나 이상 내로 흡수되거나 이와 회합되고 조사에 의해 활성화되면, 하나 이상의 세포 구조가 손상되도록, 예를 들면 하나 이상의 세포내 구획이 용해되거나 손상되도록 하는 정도이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 감광화제는, 예를 들면 10 내지 50㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다.
시험관내 이용을 위하여, 범위는 훨씬 더 넓은 범위, 예를 들어 0.0005 내지 500㎍/㎖일 수 있다. 생체내 인간 치료를 위하여, 감광화제는 전신 투여되는 경우 0.05 내지 20㎎/㎏ 체중의 범위로 사용될 수 있다. 대안적으로, 전신 투여를 위하여 0.005 내지 20㎎/㎏ 체중의 범위가 사용될 수 있다. 더욱 편리하게, 감광화제는 예를 들어, 피내, 피하 또는 종양내 투여에 의해 국소 투여되며, 상기 경우에, 용량은 1 내지 5000㎍, 예를 들어, 10 내지 2500, 25 내지 1000, 50 내지 500, 10 내지 300 또는 100 내지 300㎍의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 용량은 25㎍, 50㎍, 100㎍, 150㎍, 200㎍ 및 250㎍으로부터 선택된다. 바람직하게는 용량은 75 내지 125㎍, 예를 들어, 100㎍이다. 제공되는 용량은 평균 체중(즉, 70㎏)의 인간에 대한 것이다. 피내 주사를 위하여, 감광제 용량은 100㎕ 내지 1㎖ 중에 용해될 수 있으며, 즉, 농도는 1 내지 50000㎍/㎖의 범위일 수 있다. 국소 투여되는 경우 상이한 동물에 대하여 용량의 적은 변동이 필요하지만, 보다 작은 동물에서, 농도 범위는 상이할 수 있으며, 이에 따라 조정될 수 있다.
사용될 항원의 농도는 사용될 항원에 좌우될 것이다. 편리하게, 0.001 내지 500㎍/㎖(예를 들어, 20 내지 500, 20 내지 300, 20 내지 100㎍/㎖, 20 내지 50, 10 내지 50, 5 내지 50, 1 내지 50, 0.01 내지 50 또는 0.001 내지 50㎍/㎖) 항원의 농도가 시험관내에서 사용될 수 있다. 펩티드 항원에 있어서, 예를 들어, 0.001 내지 500, 예를 들어, 0.001 내지 1, 5, 25, 50 또는 100㎍/㎖의 더 낮은 농도가 사용될 수 있다. 단백질 항원에 있어서, 예를 들어, 0.5 내지 500㎍/㎖의 더 높은 농도가 사용될 수 있다. 생체내 이용을 위하여, 단백질 항원 용량은 0.5 내지 500㎍, 예를 들어, 10 내지 100㎍ 또는 10 내지 200㎍ 범위일 수 있다. 펩티드 항원에 있어서, 0.1 내지 4000㎍, 예를 들어, 0.1 내지 2000㎍, 0.1 내지 1000㎍ 또는 0.1 내지 500㎍, 예를 들어, 0.1 내지 200㎍의 생체내 용량이 사용될 수 있다. 이러한 용량은 국소 투여에 적절하다. 상기 농도는 항원 분자가 하나 이상의 항원으로 이루어진 경우 사용되는 총 항원 또는 사용되는 각각의 항원에 적용될 수 있다. 적절한 농도는 대상 세포로의 대상 제제의 흡수의 효율 및 세포에서 달성하도록 요망되는 최종 농도에 따라 결정될 수 있다.
사용될 관문 억제제의 농도는 사용될 관문 억제제에 따라 좌우될 것이다. 편리하게 0.001-500㎍/ml(예를 들어, 20-500, 20-300, 20-100㎍/ml, 20-50, 10-50, 5-50, 1-50, 0.01-50, 또는 0.001-50㎍/ml)의 농도가 시험관내에서 사용될 수 있다. 생체내 사용을 위하여, 관문 억제제 용량은 0.5-500㎍, 예를 들어, 10-100㎍ 또는 10-200㎍의 범위일 수 있다. 바람직한 양태에서 100㎍ 또는 200㎍의 용량이 사용될 수 있다. 이러한 용량은 국소 투여에 적합하다. 전신, 예를 들어, 정맥내 또는 복강내 투여의 경우, 용량은 0.1-45mg/kg, 예를 들어, 1-40, 5-35, 10-30 또는 15-25mg/kg, 예를 들어, 5-10mg/kg 또는 2-5mg/kg, 예를 들어, 3mg/kg의 범위일 수 있다. 상기 농도는 하나 이상의 관문 억제제가 사용되는 경우 사용되는 총 관문 억제제 또는 사용되는 각각의 관문 억제제에 적용할 수 있다.
적절한 농도는 대상 세포에 대한 대상 관문 억제제의 효율 및 세포에서 달성하도록 요망되는 최종 농도에 따라 결정될 수 있다.
본원에 정의된 TLR 리간드의 농도는, 사용되는 경우, 또한 사용될 특정 분자에 따라 좌우될 것이며, 숙련가는 적합한 농도 또는 용량을 알 것이다. 아래 농도는 하나 이상의 TLR 리간드가 사용되는 경우 사용되는 총 TLR 리간드 또는 사용되는 각각의 TLR 리간드에 적용될 수 있다.
적합한 시험관내 및 생체내 농도 또는 용량의 예는 하기 표 2에 나타나 있다.
리간드 시험관내 농도 생체내 용량(바람직하게는 국소 투여에 대해)
LPS 0.001 -100 μg/ml 0.1-100μg
플라젤린 1-100 μg/ml 1-200μg
폴리(IC) 0.01-100 μg/ml 1μg-5mg (또는 10mg까지)
(예컨대, 10 μg-5mg)
ssPolyU 1-10 000 ng/ml 10μg-5mg
MPLA 1-10 000 ng/ml 2-500μg
이미다조퀴놀린 0.01-100 μg/ml 10-1000 μg (또는 10mg까지), 예컨대, 마우스에서 20-100μg 및 인간에서10 μg -10mg
CpG ODNs 1-100 μg/ml 10-1000 μg (또는 10mg까지) 예컨대, 마우스에서 20-100μg 및 인간에서 10 μg -10mg
따라서, 예를 들어, 편리하게 1 내지 100㎍/㎖(예를 들어, 20 내지 100㎍/㎖ 또는 20 내지 50㎍/㎖)의 농도가 시험관내에서 사용될 수 있다. 10 내지 1000㎍의 생체내 용량의 이미다조퀴놀린 화합물이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 마우스에서 20 내지 100㎍ 및 인간에서 10㎍ 내지 10㎎이 사용될 수 있다. 인간에서 예를 들어, 이미퀴모드의 국소 투여를 위하여, 2.5 내지 50㎎의 용량, 예를 들어, 1 내지 5㎎/㎠, 예를 들어, 2.5㎎/㎠가 사용될 수 있다. 레시퀴모드를 위하여, 용량은 0.1 내지 50㎎, 예를 들어, 1 내지 5㎎, 예를 들어, 1 내지 5㎎/㎠일 수 있다. 유사한 용량이 가디퀴모드에 대하여 적합하다. 이미다조퀴놀린 화합물의 피내 주사를 위하여, 더 작은 용량이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 적어도 10㎍ 또는 50㎍, 예를 들어, 10㎍ 내지 1㎎이 사용될 수 있다. 유사 용량이 CpG 올리고뉴클레오티드 및 다른 TLR 리간드에 대하여 사용될 수 있다. 폴리(IC)는 마우스에서 1 내지 100㎍, 및 인간에서 1㎍ 내지 10㎎의 생체내 용량으로 투여될 수 있다.
대부분의 경우에, 본원에 정의된 바와 같은 감광화제, 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)는 함께 투여되나, 이것은 달라질 수 있다. 따라서, 각각의 상이한 성분에 대하여 상이한 투여(또는 세포와 접촉되는) 시간 또는 방식 또는 부위가 고려되며, 이러한 방법은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
하나의 양태에서, 특히 본 발명의 생체내 방법 및 용도에서, 감광화제, 항원 분자(및 사용되는 경우 TLR 리간드)는 관문 억제제와 함께 및 별도로 투여된다. 별도의 투여는 동시(예를 들어, 상이한 투여 경로를 통해 생체내에서 사용되는 경우)일 수 있거나 연속적일 수 있다. 하나의 생체내 예에서, 관문 억제제는 서로에 대해 다회 투여될 수 있으며, 예를 들어, 치료 과정에서 예를 들어 1, 2 또는 3회 투여될 수 있는 다른 제제에 비해 3, 4, 5, 또는 6회 또는 그 이상의 횟수로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 PCI 방법에서 조명이 모든 관련 제제가 세포와 접촉한(또는 생체내 투여된) 후(또는 조명후 관련 구획으로 내재화되도록 하기 직전)에 일어나는 방법을 포함한다. 따라서, 관문 억제제는 다른 성분들과는 별도로, 예를 들어, 별도의 제형으로 투여될 수 있다. 하나 이상의 관문 억제제(또는 항원 또는 TLR 리간드)가 사용되는 경우, 상이한 관문 억제제들(항원 또는 TLR 리간드)은 서로에 대해 별도로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
TLR 리간드가 방법에서 사용되는 하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드, 예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드 또는 이미다조퀴놀린 화합물, LPS 또는 폴리(IC) 분자는 항원과는 별도로, 예를 들어, 개별 제형, 예를 들어, 크림 또는 겔로, 또는 전신으로, 예를 들어, 경구 투여(예를 들어, 레시퀴모드를 사용)를 통해 투여된다. 따라서, 하나의 양태에서, TLR 리간드, 예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드 또는 이미다조퀴놀린 화합물은 예를 들어, 국소(국부) 전처리에 의해 항원 및/또는 감광제의 투여 전에, 예를 들어, 24시간 전에 투여될 수 있다. 일부 경우에, TLR 리간드, 예를 들어, 폴리(IC) 또는 LPS는 항원 분자 이전에, 이와 함께 또는 이 이후에 투여된다.
TLR 리간드는 다른 제제에 대해 별도로, 예를 들어, 조명하기 대략 2시간 전에 투여될 수 있다. 대안적인 양태에서, 제제는 항원과 함께 또는 항원과 동시에, 즉 동시 투여될 수 있다. 관문 억제제(및 바람직하게는 방법에서 사용하기 위해 기재된 모든 제제)는 바람직하게는 조명(즉, 조명 전 또는 후)의 120, 72시간 이내, 바람직하게는 48, 24, 12, 6, 4, 2, 1시간, 30 또는 15분 이내에 투여된다.
세포(제1 세포 또는 제2 세포, 경우에 따라, 또는 생체내 관련 등가 세포)와 감광화제 및/또는 항원 분자 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 관문 억제제(및 사용되는 경우 TLR 리간드) 간의 접촉은 편리하게 15분 내지 24시간, 예를 들어, 30분 내지 4시간, 바람직하게는 1.5 내지 2.5시간이다. 대안적으로, 시간의 범위는 약 1시간 내지 약 48시간, 예를 들어, 약 2시간 내지 약 40시간 또는 약 6시간 내지 약 36시간, 예를 들어, 12시간 내지 30시간, 예를 들어, 16시간 내지 20시간, 예를 들어, 18시간 또는 약 18시간일 수 있다.
바람직한 양태에서, 제1 세포(또는 생체내 등가 세포)의 초기 배양은 감광화제와 함께 이루어진다. 하나의 양태에서 감광화제 및 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)의 투여 사이의 시간은 약 수 시간이다. 예를 들어, 감광화제는 조명 이전 16 내지 20시간, 예를 들어, 18시간에 적용될 수 있으며, 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)는 조명 이전 1 내지 3시간, 예를 들어, 2시간에 적용될 수 있다. 따라서, 감광화제 및 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)의 투여 사이의 시간은 15 내지 23시간의 범위일 수 있다.
따라서, 그후 제1 세포(또는 생체내 등가물)를 감광제와의 배양한 후 본원에 정의된 바와 같은 항원(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)와 배양한다. 편리하게, 세포를 감광제/항원과의 접촉 후에, 그리고 조사 전에, 감광제 및 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)와의 배양 시기에 따라, 예를 들어, 30분 내지 4시간, 예를 들어, 1.5 내지 2.5시간 동안 감광제/항원-부재 배지에 배치할 수 있다.
제2 세포가 또한 제1 세포가 아니라면, 유사한 고려사항들이 제2 세포와 관문 억제제(및, 존재하는 경우, 기타의 제제)와의 접촉 시간에 적용된다. 따라서, 예를 들어, 제2 세포는 상기 제시된 시간 동안 관문 억제제와 접촉될 수 있지만, 제1 세포에 별도로 처리된다면, 상기 제2 세포의 조사는 반드시 일어나지는 않을 수 있다.
생체내에서 다양한 제제를 표적 세포와 접촉시키는 적절한 방법 및 배양 시간은 투여 방식 및 사용되는 제제의 유형과 같은 인자에 좌우될 것이다. 예를 들어, 제제가 치료/조사될 종양, 조직 또는 기관 내로 주사된다면, 주사 지점 근처의 세포는 주사 지점으로부터 더 먼 거리에 위치한 세포보다 더욱 신속하게 하나 이상의 제제와 접촉하게 되고, 이에 따라 이를 흡수하거나 이에 결합하는 경향이 있을 것이며, 주사 지점으로부터 더 먼 거리에 위치한 세포는 아마도 이후의 시점에 더 낮은 농도로 제제와 접촉하게 될 것이다. 편리하게 6 내지 24시간이 사용될 수 있다.
또한, 정맥내 주사에 의해 또는 경구로 투여되는 제제는 표적 세포에 도달하는데 시간이 다소 걸릴 수 있으며, 이에 따라, 충분량 또는 최적량의 제제가 표적 세포 또는 조직에 축적되기 위해서는 더 긴 투여후 시간, 예를 들면 수 일이 걸릴 수 있다. 따라서, 생체내에서 개별 세포에 필요한 투여 시간은 아마도 이들 및 다른 파라미터에 따라 변할 것이다.
그럼에도 불구하고, 생체내 상황이 시험관내 보다 더욱 복잡하긴 하지만, 본 발명의 기본 개념은 여전히 동일하며, 즉, 분자가 표적 세포와 접촉하게 되는 시간은, 조사가 발생하기 전에 적절한 양의 감광화제가 표적 세포에 의해 흡수되고, (i) 조사 전에 또는 그 동안에 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)가 표적 세포와 충분히 접촉한 후에 세포 내로, 예를 들어, 감광화제와 비교하여 동일하거나 상이한 세포내 구획 내로 흡수되었거나, 그에 흡수될 것이거나, 또는 (ii) 조사 후에 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)가 이의 세포 내로의 흡수를 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 세포와 접촉하도록 하는 시간이어야 한다. 유사하게, 관문 억제제와 표적 세포와의 접촉은, 관문 억제제의 결합이 일어날 수 있고 이 결합이 바람직하게는 항원 분자를 흡수한 세포가 세포의 표면 상에 분자 또는 이의 부분을 제시하는 시간까지 완료되도록 이루어져야 한다.
본원에 기재된 제제의 생체내의 투여를 위하여, 당업계에 통상적이거나 표준인 임의의 투여 방식, 예를 들어, 주사, 주입, 국소 투여, 경피 투여, 체표면 내부 및 외부 둘 다로의 투여 등이 사용될 수 있다. 생체내 사용을 위하여, 본 발명은 체액 위치 및 고형 조직을 포함한, 감광화제 함유 화합물 또는 항원 분자가 국소화되는 세포를 함유하는 임의의 조직과 관련하여 사용될 수 있다. 감광제가 표적 세포에 의해 흡수되고 광이 적절하게 전달될 수 있는 한은 모든 조직이 처리될 수 있다. 바람직한 투여 방식은, 예를 들어, 감광화제(및/또는 항원 분자 및 사용되는 경우 TLR 리간드)의 경우 피내, 피하, 국소 또는 종양내 투여 또는 주사이며, 바람직하게는, 상기 투여는 피내 주사 또는 종양내 주사에 의해 이루어진다. 관문 억제제의 경우 투여는, 예를 들어, 전신, 예를 들어, 정맥내 투여에 의해 또는 종양내 투여에 의해 이루어질 수 있다. 대안으로, 실시예에 입증된 바와 같이, 복강내 투여가 사용될 수 있다.
원하는 결과, 예를 들어, 항원 제시, 면역 반응의 생성 또는 백신접종을 달성하기 위하여, 상기 방법 또는 이의 일부가 반복될 수 있으며, 예를 들어, "재-백신접종"이 일어날 수 있다. 따라서, 상기 방법은 그 전체가 적절한 간격 후에 다수회(예를 들어, 2, 3회 또는 그 이상) 수행될 수 있거나, 상기 방법의 부분, 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 관문 억제제(및/또는 사용되는 경우 TLR 리간드)의 추가의 투여 또는 추가의 조사 단계가 반복될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법 또는 상기 방법의 부분은 그것이 처음 수행된지 약 수 일 후, 예를 들어, 5 내지 60일(예를 들어, 7, 14, 15, 21, 22, 42 또는 51일), 예를 들어, 7 내지 20일, 바람직하게는 14일 또는 수 주, 예를 들어, 1 내지 5주(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4주) 후에 다시 수행될 수 있다. 상기 방법의 전부 또는 일부는 적절한 시간 간격으로, 예를 들어, 2주 또는 14일마다 다수회 반복될 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은 적어도 1회 반복된다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 2회 반복된다.
하나의 양태에서, 상기 방법을 다수회 수행하는 이외에, 관문 억제제가 별도로, 예를 들어, 방법의 각각의 수행 전 또는 후에, 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같이 1, 2 또는 3회 또는 그 이상의 횟수로 추가로 투여될 수 있다.
대안적인 양태에서, 본 발명의 방법의 일부는 본 발명의 방법이 수행되기 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 본 발명의 방법이 수행되기 전에 관문 억제제의 부재하에 1회 이상, 예를 들어, 2회 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 본 발명의 방법이 수행되기 전에 감광제 및 조명(및 임의로 TLR 리간드)의 부재하에 1회 이상, 예를 들어, 2회 수행될 수 있다. 상기 방법의 일부는 본 발명의 방법이 수행되기 약 수 일, 예를 들어, 7 또는 14일 또는 수 주, 예를 들어, 1, 3 또는 4주 전에 수행될 수 있다. 상기 방법의 일부는 본 발명의 방법이 수행되기 전에 이러한 시간 간격으로 1회 이상 반복될 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 항원 분자는 (예를 들어, 상기 논의된 시간 간격으로) 2회 이상 (예를 들어, 대상체에게) 투여되며, 여기서, 적어도 상기 항원 분자의 투여는 본 발명의 방법에 따라 수행된다.
대안적으로 기재된 본 발명은 관문 억제제로의 (1회 이상의) 투여(세포 접촉)와 함께 수행되는, 항원 분자, 감광화제 및 임의로 TLR 리간드(그러나 관문 억제제는 아님)를 사용하는 본원에 기재된 바와 같은 방법을 제공하며, 상기 방법은 바람직한 양태와 비슷하게 본원에 기재된 바와 같은 방법 및 용도 및 사용을 위한 제품에 대해 수행될 수 있다.
감광화제를 활성화시키기 위한 "조사"는 아래에 기재된 바와 같이 직접적인 또는 간접적인 광의 투여를 지칭한다. 따라서, 대상체 또는 세포는, 예를 들어, 직접적으로(예를 들어, 시험관내에서 단세포에) 또는 간접적으로, 예를 들어, 생체내에서 세포가 피부의 표면 아래 있거나 또는 모두가 다른 세포의 차단이 없는, 즉, 직접 조명되는 것이 아닌 세포층의 형태인 경우에 광원으로 조명될 수 있다. 세포 또는 대상체의 조명은 본원에 정의된 바와 같은 감광화제, 항원 분자(및 사용되는 경우, 임의로 관문 억제제 및/또는 TLR 리간드)를 투여한지 대략 18 내지 24시간 후에 일어날 수 있다.
감광화제를 활성화시키기 위한 광 조사 단계는 당업계에 잘 알려진 기술 및 절차에 따라 일어날 수 있다. 사용되는 광의 파장은 사용되는 감광화제에 따라 선택된다. 적합한 인공 광원, 예를 들어, 청색(400 내지 475㎚) 또는 적색(620 내지 750㎚) 파장 광의 이용이 당업계에 잘 알려져 있다. TPCS2a에 있어서, 예를 들어, 400 내지 500㎚, 더욱 바람직하게는 400 내지 450㎚, 예를 들어, 430 내지 440㎚, 더더욱 바람직하게는 대략 435㎚ 또는 435㎚의 파장이 이용될 수 있다. 경우에 따라, 감광제, 예를 들어, 포르피린 또는 클로린은 녹색 광에 의해 활성화될 수 있으며, 예를 들어, 킬러레드(KillerRed)(Evrogen, Moscow, Russia) 감광제는 녹색 광에 의해 활성화될 수 있다.
적합한 광원, 예를 들어, PCI Biotech AS의 LumiSource® 램프가 당업계에 잘 알려져 있다. 대안적으로, 최대 60㎽의 조정가능한 출력 전력 및 430 내지 435㎚의 발광 스펙트럼을 갖는 LED-기반의 조명 장치가 사용될 수 있다. 적색 광에 있어서, 적합한 조명원은 PCI Biotech AS 652㎚ 레이저 시스템 SN576003 다이오드 레이저이지만, 임의의 적합한 적색 광원이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 세포가 광에 노출되는 시간은 달라질 수 있다. 시토졸 내로의 분자의 내재화 효율은 광에 대한 노출 증가와 함께 최대치로 증가하며, 이를 넘어서면, 세포 손상 및 이에 따른 세포사가 증가한다.
조사 단계를 위한 바람직한 기간은 표적, 감광제, 표적 세포 또는 조직에 축적되는 감광제의 양 및 감광제의 흡수 스펙트럼과 광원의 방출 스펙트럼 사이의 중첩과 같은 인자에 좌우된다. 일반적으로, 조사 단계를 위한 기간은 대략 수 초 내지 수 분 또는 최대 수 시간(심지어 최대 12시간), 예를 들어, 바람직하게는 최대 60분, 예를 들어, 0.25 또는 1 내지 30분, 예를 들어, 0.5 내지 3분 또는 1 내지 5분 또는 1 내지 10분, 예를 들어, 3 내지 7분, 바람직하게는 대략 3분, 예를 들어, 2.5 내지 3.5분이다. 더 짧은 조사 시간, 예를 들어, 1 내지 60초, 예를 들어, 10 내지 50, 20 내지 40 또는 25 내지 35초가 사용될 수도 있다.
적절한 광 선량은 당업계의 숙련가에 의해 선택될 수 있으며, 다시 사용되는 감광제 및 표적 세포 또는 조직에 축척된 감광제의 양에 좌우될 것이다. 광 선량은 통상 가시광선 스펙트럼의 (예를 들어, 사용되는 감광제에 따라, 적색 영역에서 또는 청색 광이 사용된다면 청색 영역에서) 더 높은 흡광계수를 갖는 감광제가 사용되는 경우 더 낮다. 예를 들어, 최대 60㎽의 조정가능한 출력 전력 및 430 내지 435㎚의 발광 스펙트럼을 갖는 LED-기반의 조명 장치가 사용되는 경우, 0.05 내지 20㎽/㎠, 예를 들어, 2.0㎽/㎠의 플루엔스 범위에서 0.24 내지 7.2J/㎠ 범상기 광 선량이 사용될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, LumiSource® 램프가 사용된다면, 0.1 내지 20(예를 들어, LumiSource®에 의해 제공되는 바와 같이 13)㎽/㎠의 플루엔스 범위에서 0.1 내지 6J/㎠의 범상기 광 선량이 적절하다. 적색 광에 있어서, 0.1 내지 5㎽/㎠, 예를 들어, 0.81㎽/㎠의 플루엔스 범위에서 0.03 내지 1J/㎠, 예를 들어, 0.3J/㎠의 광 선량이 사용될 수 있다.
또한, 세포 생존력이 유지되어야 한다면, 과도한 수준의 독성 화학종의 생성이 회피되어야 하고, 이에 따라 관련 파라미터가 조정될 수 있다.
본 발명의 방법은 광화학 치료, 즉, 감광화제의 활성화시 독성 화학종의 생성을 통한 광역학 치료법 효과에 의해 불가피하게 일부 세포 손상을 야기할 수 있다. 제안된 용도에 따라, 이러한 세포사는 중요하지 않을 수 있으며 실제로 일부 응용(예를 들어, 암 치료)에 유리할 수 있다. 그러나, 대부분의 양태에서, 제시 세포로부터 면역 반응의 생성을 가능하게 하도록 세포사가 회피된다. 생존 세포의 분율 또는 비율이 감광화제의 농도에 비하여 광 선량을 선택함으로써 조절되도록 본 발명의 방법은 변형될 수 있다. 다시, 이러한 기술은 당업계에 알려져 있다.
바람직하게는, 실질적으로 모든 세포, 또는 상당한 대다수(예를 들어, 세포의 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80, 85, 90 또는 95%)는 죽지 않는다. PCI 치료 후의 시험관내 세포 생존율은 MTS 시험과 같은 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 측정될 수 있다. 하나 이상의 세포 유형의 생체내 세포사는, 예를 들어, 현미경 관찰에 의해 투여 지점의 1㎝ 반경(또는 조직의 소정의 깊이) 내에서 평가될 수 있다. 세포사가 즉시 발생하지 않을 수 있기 때문에, 세포사 %는 수 시간의 조사(예를 들어, 조사 후 최대 4시간) 내에 생존가능하게 남아 있는 세포의 백분율을 말하나, 바람직하게는 조사한지 4시간 이상 후에 생존가능한 세포 %를 말한다.
상기 방법은 생체내에서, 시험관내에서 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외에서 사용되어, 생체내에서의 투여를 위해 세포를 생성하거나, 상기 방법은 생체내에서 사용된다. 따라서, 바람직한 특징에서, 상기 방법은 대상체에서 면역 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 바람직한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제 및 임의로 본원에 상기 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 투여하는 단계 및 상기 감광화제를 활성화하기에 유효한 파장의 광으로 상기 대상체를 조사하는 단계(여기서, 면역 반응이 생성된다)를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
생성될 수 있는 "면역 반응"은 체액성 및 세포-매개의 면역, 예를 들어, 항체 생성의 자극 또는 세포독성 또는 킬러 세포의 자극일 수 있으며, 이는 이들의 표면상에 "외래" 항원을 발현하는 세포를 인식하고 손상(또는 달리 제거)할 수 있다. 따라서, 용어 "면역 반응의 자극"은 모든 유형의 면역 반응 및 면역 반응을 자극하기 위한 메커니즘을 포함하며, CTL의 자극을 포함하고, 이것이 본 발명의 바람직한 양태를 형성한다. 바람직하게는, 자극되는 면역 반응은 세포독성 CD8 T 세포이다. 면역 반응의 정도는 면역 반응의 마커, 예를 들어, 분비된 분자, 예를 들어, TNF-α 또는 IFNγ 또는 항원 특이 T 세포의 생성에 의해 평가(예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같이 평가)될 수 있다.
세포독성 세포 또는 항체-생성 세포의 자극은 항원-제시 세포에 의해, 예를 들어, MHC 부류 I 제시에 의해 특정 방식으로 항원이, 자극될 세포에 제시되는 것을 필요로 한다(예를 들어, CD8+ 세포독성 T-세포의 활성화는 MHC-I 항원 제시를 필요로 한다). 바람직하게는, 면역 반응은 MHC-I 제시를 통해 자극된다.
바람직하게는, 면역 반응은 질환, 장애 또는 감염, 예를 들어, 비정상적인 세포 증식을 포함하는 병태, 예를 들어, 암 또는 감염, 예를 들어, 감염과 같은 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 따라서, 추가의 바람직한 양태에서 본 발명은 대상체에게 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제를 투여하는 단계 및 상기 대상체를 상기 감광화제를 활성화시키기에 유효한 파장의 광으로 조사하는 단계(여기서, 면역 반응이 생성된다)을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서 암은 흑색종이다. 흑색종은 피부색의 원인이 되는 어두운 색소인 멜라닌의 생성에 책임이 있는 세포인 멜라닌세포의 악성 종양이다. 이들 세포는 주로 피부에서 발생하지만, 장 및 눈을 포함하는 신체의 다른 부분에서도 관찰된다. 흑색종은 멜라닌세포를 함유하는 신체의 임의의 부분에서 기원할 수 있다.
본원에 언급된 "흑색종"은, 예를 들어, 표재 확산 흑색종, 결절성흑색종, 악성 흑점자 흑색종, 결합조직형성흑색종, 말단흑자흑색종 및 무색소흑색종, 폴립성 흑색종(polypoid melanoma), 작은 신경-유사 세포가 있는 흑색종 및 스피츠모반의 특징이 있는 흑색종을 포함하는 모든 유형의 흑색종을 포함한다.
흑색종의 대다수가 피부에 의해 발생하지만(피부 악성 흑색종), 흑색종은 또한 신체 내의 다른 곳에서, 예컨대, 내부 기관에서, 예를 들어, 점막에서 발생할 수 있다. 투명 세포 육종은 연조직의 악성 흑색종이다. 흑색종은 또한 눈(포도막 흑색종), 외음부, 질 또는 직장에서도 발생할 수 있다. 이들 흑색종도 본 발명의 범주에 포함된다. 바람직하게는, 치료될 흑색종은 피부 흑색종이다. 또한, 흑색종은 전이 흑색종, 즉, 1차 흑색종으로부터 기원하지만, 상이한 위치로 전이되어 2차 종양을 제공하는 세포까지 확대된다. 본원에 기재된 흑색종의 치료 또는 예방은 1차 흑색종 및/또는 1차 흑색종으로부터 유래하는 2차 종양의 치료까지 확대된다. 이와 같이, 본 발명은 또한 전이성 흑색종의 치료에 유용하다.
대안적인 양태에서, 암은 유두종 바이러스, 특히 인간 유두종 바이러스(HPV)와 관련이 있거나, 이에 의해 유발/유도된다. 상기 논의된 바와 같이, 유두종 바이러스 게놈은 숙주 세포의 초기 감염 직후에 발현되는 6개(E1, E2, E4, E5, E6 및 E7)의 개방형 판독 프레임(ORF)을 암호화하는 초기 영역(E), 및 주 캡시드 단백질 L1 및 부 캡 시드 단백질 L2를 암호화하는 후기 영역(L)으로 나뉜다. 모든 바이러스 ORF는 하나의 DNA 가닥상에 암호화된다. HPV 감염으로부터 야기되는 암과 관련이 있을 수 있는, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 HPV 항원은 본원에 논의된 바와 같은 하나 이상의 알려져 있는 항원 펩티드 또는 T-세포 에피토프일 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 몇몇 유형의 HPV가 존재하며, 본 발명에 따른 HPV와 관련된 암은 임의의 유형의 HPV, 예를 들어, HPV-16 및/또는 HPV-18, 또는 HPV-31 또는 HPV-45와 관련이 있거나 이로부터 야기될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 항원은 E1, E2, E4, E5, E6 또는 E7 단백질 중 임의의 것 또는 L1 및 L2 단백질 중 임의의 것으로부터 유도될 수 있다. 따라서, 항원 분자는 HPV-16 및 18의 E2, E6 및 E7 단백질 중 하나 이상으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 양태에서, 항원 분자는 HPV-16 E7 서열 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8 에피토프는 볼드체로 나타나 있음)을 함유한다. 따라서, HPV 항원은 35개 아미노산 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 항원 분자는 오직 CD8 에피토프 RAHYNIVTF, 즉, 더 짧은 펩티드일 수 있다.
대안적인 양태에서, 질환, 장애 또는 감염은 바이러스 감염, 바람직하게는 유두종 바이러스 감염, 특히 인간 유두종 바이러스(HPV) 감염이다.
바람직하게는, 상기 방법은 백신접종을 위해 사용된다. 본원에 언급되는 "백신접종"은 질환, 장애 또는 감염의 발생(또는 추가의 발생)에 대하여 예방적이거나 치료적인 면역 반응을 이끌어내기 위한 항원(또는 항원을 함유하는 분자)의 사용이며, 여기서 상기 질환, 장애 또는 감염은 항원의 비정상적인 발현 또는 존재와 관련이 있다. 바람직하게는, 질환은 암, 예를 들어, 흑색종 또는 유두종 바이러스, 예를 들어, HPV와 관련이 있는 암이다. 하나의 양태에서, 백신접종은 예를 들어, 본원에 논의된 암의 치료에서 치료적 백신접종이다. 대안적인 양태에서, 백신 접종은 예를 들어, 암을 예방하거나, 치료적 백신접종을 사용한 더 조기의 암의 치료 후에 발생하는 추가의 암을 줄이기 위한 예방적 백신접종이다. 추가의 양태에서, 감염, 예를 들어, 바이러스 감염, 예를 들어, HPV 감염에 대한 면역 반응이 생성되어야 하는 경우, 백신접종은 성질이 예방적이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 방법, 예를 들어, 백신접종의 대상체는 포유류, 바람직하게는 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니피그이지만, 가장 바람직하게 대상체는 인간이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 방법은 상승효과를 달성하며, 즉, 세포 표면 제시 또는 생성된 면역 반응의 정도는 (i) 관문 억제제(및 TLR 리간드)의 부재하에 항원 분자 및 감광화제(및 조명)를 사용하여 상기 방법을 수행하는 것 및 (ii) 감광화제 및 조사 단계의 부재하에 항원 분자 및 관문 억제제(및 임의로 TLR 리간드)를 사용하여 상기 방법을 수행하는 것에 의해 관찰되는 향상을 합한 것보다 더 크게 향상되며, 즉, 방법 간의 상승효과가 관찰된다. 세포 표면 제시 또는 면역 반응 생성의 수준은 적절한 수단, 예를 들어, 항원-특이 CD8+ 세포의 개수 또는 면역 반응 활성화 마커, 예를 들어, IFNγ 또는 TNFα의 수준에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용되는 "상승효과"는 단지 상가적인 효과를 넘어서는 양적인 개선을 말한다.
본 발명의 방법에 사용되는 다양한 제제는 별도로, 순차적으로 또는 동시에 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 세포의 표면상의 항원 분자 또는 이의 부분의 발현 방법과 관련하여 상기 논의된 측면 및 특징은, 적절한 경우, 상기 면역 반응의 생성 방법에도 적용가능하며 그 역도 가능하다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는, 항원 분자를 세포의 시토졸로 도입하는 방법을 제공한다:
a) 항원 분자 또는 이의 부분이 발현될 제1 세포 및 관문 억제제가 결합될 수 있는 제2 세포를 제공하는 단계(여기서, 상기 제1 및 제2 세포는 동일한 세포이거나 상이한 세포일 수 있다),
b) 적어도 상기 제1 세포를 상기 항원 분자, 감광화제, 및 임의로 TLR 리간드와 접촉시키는 단계,
c) 적어도 제2 세포를 관문 억제제와 접촉시키는 단계, 및
d) 적어도 제1 세포를 감광화제를 활성화시키기에 유효한 파장의 광으로 조사하는 단계(여기서, 상기 항원 분자는 세포의 시토졸 내로 방출되고 항원 분자 또는 이의 부분은 후속적으로 제1 세포의 표면 상에 제시된다),
여기서, 상기 제1 및 제2 세포는 상기 조사 전, 조사 동안 그리고/또는 조사 후 서로 접촉된다. 일단 활성화되면, 상기 화합물을 함유하는 상기 세포 내의 세포내 구획이 이들 구획에 함유된 분자를 시토졸로 방출한다.
상기 본 발명의 방법은, 예를 들어, 동소 처리 또는 생체외 처리에 이어서, 신체로의 처리된 세포의 투여를 위해 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 표면상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하는 세포 또는 이의 집단을 제공하며, 이 세포는 본원에 정의된 바와 같은 방법 중 임의의 것에 의해 수득가능하다(또는 수득된다). 또한, 본원에 하기에 기재된 바와 같이, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 세포 또는 세포 집단이 제공된다.
세포 집단은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제도 또한 포함하는 약제학적 조성물에 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제 및 임의로 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이들 조성물(및 본 발명의 제품)은, 예를 들어, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 이용하여 약제 기술분야에 알려진 기술 및 방법에 따라 임의의 편리한 방식으로 제형화될 수 있다. 본원에 언급된 "약제학적으로 허용가능한"은 조성물(또는 제품)의 다른 성분과 상용성이며, 수여자에게 생리학적으로 허용되는 성분을 말한다. 조성물의 성질 및 담체 또는 부형제 물질, 용량 등은 선택 및 요망되는 투여 경로, 치료 목적 등에 따라 통상적인 방식으로 선택될 수 있다. 용량도 마찬가지로 통상적인 방식으로 결정될 수 있으며, 분자(또는 조성물 또는 제품의 성분)의 성질, 치료 목적, 환자의 연령, 투여 방식 등에 좌우될 수 있다. 감광화제와 관련하여, 조사시 막을 손상하는 효력/능력도 고려되어야 한다.
세포, 예를 들어, 항원 제시 세포는 시험관내에서 제조될 수 있다. 치료 방법에서, 이들 세포는 이들 세포가 예를 들어, 예방적 또는 치료적 목적을 위해 면역 반응을 자극할 수 있도록 생체내에서 신체로 투여되거나 생체외에서 신체 조직으로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 또는 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 예를 들어, 백신접종 목적을 위한, 예를 들어, 대상체에서 CTL을 자극하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 특히, 암, 예를 들어, 흑색종 또는 유두종 바이러스, 예를 들어, HPV와 관련된 암을 치료하거나 예방하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 세포 집단(또는 이를 함유하는 조성물) 또는 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제 및 임의로 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 제공한다. 다르게 정의하면, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한(예를 들어, CTL을 자극하기 위한), 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한 그리고/또는 암, 예를 들어, 흑색종 또는 유두종 바이러스, 예를 들어, HPV와 관련된 암을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 (i) 세포 집단, (ii) 본원에 정의된 바와 같은 조성물 또는 (iii) 항원 분자 및/또는 감광화제 및/또는 관문 억제제 및 임의로 TLR 리간드의 용도를 제공하며, 여기서, 바람직하게는 상기 면역 반응은 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 자극된다.
상기 자극, 치료 또는 예방은 바람직하게는 상기 약제를 상기 대상체에게 투여함을 포함한다.
항원 분자, 감광화제 및 관문 억제제(및 임의로 TLR 리간드)가 조합되고, 조성물로 존재할 수 있다. 다르게 표현하면, 본 발명은 면역 반응을 자극하기 위한(예를 들어, 대상체에서 CTL을 자극하기 위한), 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 특히 백신접종 목적을 위한 약제의 제조에서의 항원 분자 및/또는 감광화제 및/또는 관문 억제제 및 임의로 본원에 정의된 바와 같은, 사용되는 경우, TLR 리간드의 용도를 제공하며, 여기서, 상기 약제는 상기 대상체로의 투여를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 세포의 표면상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하는 세포의 집단을 포함한다. 바람직하게는, 세포 집단은 이러한 방법에 의해 수득된다. 집단은 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
대안적인 양태에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위해(예를 들어, CTL을 자극하기 위해), 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위해, 세포의 표면상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하는데 이용하기 위한 항원 분자, 감광화제 및 관문 억제제 및 임의로 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 제공하며, 여기서, 상기 이용은 바람직하게는 세포의 집단, 예를 들어, 수지상 세포를 제조하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 방법을 포함한다. 그후, 이들 세포는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 추가로 바람직하게는 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위하여, 본원에 정의된 바와 같은 방법에서 대상체에서의 면역 반응의 자극에서의 동시의, 별도의 또는 순차적인 이용을 위한(또는 세포의 표면상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하기 위한 또는 항원 분자를 세포의 시토졸 내로 내재화하기 위한) 조합된 제제로서의, 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제 및 임의로 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 포함하는 제품을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 방법에서, 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 예를 들어, 백신접종 또는 면역화에 사용하기 위한, 또는 세포의 표면상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하기 위한, 또는 항원 분자를 세포의 시토졸 내로 내재화시키기 위한 키트를 제공하며, 여기서, 상기 키트는 다음을 포함한다:
본원에 정의된 바와 같은 감광화제를 함유하는 제1 용기;
본원에 정의된 바와 같은 상기 항원 분자를 함유하는 제2 용기;
본원에 정의된 바와 같은 관문 억제제를 함유하는 제3 용기; 및 임의로
본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 함유하는 제4 용기.
본 발명의 제품 및 키트는 본원에 정의된 바와 같은 세포 표면 제시(또는 치료 방법)를 달성하기 위하여 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 따라 세포의 집단을 제조하는 단계 및 이후에 상기 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한 대상체에서의 (예를 들어, CTL을 자극하기 위한) 면역 반응의 생성 방법을 제공한다.
청구된 발명에 의해 달성되는 항원 제시는 처리된 세포가 생체내에서 투여되는 경우, 유리하게 면역 반응의 자극을 유발할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 분자 또는 이의 부분을 포함하거나 함유하는 엔티티에 의한 이후의 시험감염(challenge)에 대하여 보호를 부여하는 면역 반응이 생성되며, 결과적으로, 본 발명은 백신접종 방법으로서 특히 유용하다.
질환, 장애 또는 감염은 면역 반응의 생성에 의해, 예를 들어, 정상 세포에 비한 식별(및 제거)을 가능하게 하는 항원(또는 이의 발현 수준)에 기초하여 확인될 수 있는 비정상 또는 외래 세포를 제거함으로써 치료되거나 예방될 수 있는 임의의 질환, 장애 또는 감염이다. 사용될 항원 분자의 선택은 치료될 질환, 장애 또는 감염을 결정한다. 상기 논의된 항원 분자에 기초하여, 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물, 제품, 키트 등은 예를 들어, 감염(예를 들어, 상기 언급된 바와 같은 바이러스 또는 박테리아), 암 또는 다발성 경화증을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 질환, 장애 또는 감염의 예방이 백신접종을 구성할 수 있다.
본원에 정의된 "치료"는, 치료 전에 증상에 비하여, 치료 중인 질환, 장애 또는 감염의 하나 이상의 증상을 감소, 완화 또는 제거하는 것을 말한다. 상기 치료는 암 치료의 경우에는 종양의 크기 또는 체적을 감소시킴을 포함하고 비정상적인 세포 증식을 치료하는 경우에는 비정상적인 세포의 수를 감소시킴을 포함할 수 있다. "예방"은 질환, 장애 또는 감염의 증상의 개시를 지연 또는 예방하는 것을 말한다. 예방은 절대적이거나(질환이 발생하지 않게 함) 일부 개체에서만 또는 제한된 시간 동안만 유효할 수 있다.
세포의 생체내 투여를 위하여, 당업계에 통상적이거나 표준인 세포 집단의 임의의 투여 방식, 예를 들어, 적절한 경로에 의한 주사 또는 주입이 사용될 수 있다. 편리하게, 세포는 림프절내 주사에 의해 투여된다. 바람직하게는, 대상체 ㎏당 1x104 내지 1x108개(예를 들어, 인간에서 ㎏당 1.4x104 내지 2.8x106개)의 세포가 투여된다. 따라서, 예를 들어, 인간에서, 0.1-20x107개 세포의 용량이 1회 용량으로, 즉, 용량마다, 예를 들어, 1회 백신접종 용량으로서 투여될 수 있다. 용량은 필요에 따라 이후의 회차에 반복될 수 있다.
본 발명은 이하에서 하기 도면을 참조하여 다음의 비제한적인 실시예에서 더욱 상세하게 기재될 것이며, 여기서:
도 1은 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 PCI와 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1의 효과를 나타낸다. 결과는 백신접종 시점에서 체적 %로서의 평균 종양 체적을 나타낸다.
도 2는 TRP-2 펩티드로 (제시된 바와 같이 생체내 처리 후 마우스로부터 분리된) 비장 세포의 재자극 후 TRP-2 오량체 염색에 대한 중앙값(총 CD8+ 세포 중의 항원-특이 CD44+ 세포 %)을 나타낸다.
도 3은 TRP-2 펩티드로 (제시된 바와 같이 생체내 처리 후 마우스로부터 분리된) 비장 세포의 재자극 후 인터페론-감마(IFN-감마) 세포내 염색으로부터의 결과를 나타낸다.
도 4는 TRP-2 펩티드로 (제시된 바와 같이 생체내 처리 후 마우스로부터 분리된) 비장 세포의 재자극 후 TNF-알파 세포내 염색으로부터의 결과를 나타낸다.
도 5는 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 PCI와 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1(함께 사용됨)의 효과를 나타낸다. 결과는 종양 접종 후의 중간 종양 체적을 나타낸다.
도 6은 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 PCI와 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1(함께 사용됨)의 효과를 나타낸다. 결과는 종양 접종 후의 동물 생존을 나타낸다.
도 7은 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 폴리(IC)와 함께 사용되는 경우 PCI와 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1(함께 사용됨)의 효과를 나타낸다. 결과는 종양접종 후 중간 종양 체적을 나타낸다.
도 8은 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 폴리(IC)와 함께 사용되는 경우 PCI와 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1(함께 사용됨)의 효과를 나타낸다. 결과는 종양 접종 후 동물 생존을 나타낸다.
도 9는 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 PCI와 관문 억제제 항-PD-1의 효과를 나타낸다. 결과는 종양 접종 후 중간 종양 체적을 나타낸다.
도 10은 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 PCI와 관문 억제제 항-PD-1의 효과를 나타낸다. 결과는 종양 접종 후 동물 생존을 나타낸다.
실시예
실시예 1
연구는 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1과 조합한 PCI의 효과를 조사하기 위해 수행되었다.
재료 및 방법
마우스
C57BL/6 마우스를 할란(Harlan)(Horst, The Netherlands)으로부터 구입하였다. 모든 마우스를 특정 병원체-부재(SPF) 조건하에 유지하고, 수행된 절차는 스위스 수의 당국에 의해 승인받았다.
종양 접종
마우스를 0일째에 200,000개 TC-1 종양 세포(The Johns Hopkins University, 3400 N. Charles St., Baltimore, MD 21218-2695로부터 인가받음)으로 이들의 우측 옆구리에 피하 저종하였다.
면역화 프로토콜
추가의 처리 스케줄은 표 3에 요약되어 있다. 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1을 표 3에 나타낸 시점에서 복강내 주사에 의해 투여하였다. 관문 억제제의 용량은 항-CTLA4의 경우 주사당 100㎍, 항-PD-1의 경우 200㎍이었다. 관문 억제제 둘 다는 Bio X Cell, 10 Technology Drive, Suite 2B, West Lebanon, NH03784-1671, USA(mAb 항 m CTLA-4, 카탈로그 BE0131 및 mAb 항 m PD-1, 카탈로그 BE0146)로부터 입수하였다.
일자 관문 억제제 투여 (i.p.)
0 종양 접종
5 1st 면역화 x
6 1st 조명
10 x
13 x
17 x
20 2nd 면역화 x
21 2nd 조명
24 x
27 x
31
각각의 면역화는 50㎍ HPV 긴 펩티드 항원 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(United Peptides (Herndon, VA), 25㎍ TPCS2a(Amphinex, PCI Biotech AS)(PCI 처리를 제공받은 동물의 경우) 및 5㎍ 고분자량 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리(IC))(InvivoGen (San Diego, USA))의 상이한 조합의 혼합물의 피내 투여에 의해 수행하였다. 상이한 실험군의 조합이 아래 표 4에 나타내어져 있다.
그룹 번호 처리 동물의 번호
1 비처리 대조군 5
2 항-PD-1 5
3 HPV 펩티드 + 폴리(IC) 5
4 HPV 펩티드+ PCI 5
5 HPV 펩티드 + 폴리(IC) + PCI 5
6 HPV 펩티드 + 항-PD-1 5
7 HPV 펩티드 + 폴리(IC) + 항-PD-1 5
8 HPV 펩티드+ PCI + 항-PD-1 5
9 HPV 펩티드 + 폴리(IC) + PCI + 항-PD-1 5
10 항-CTLA4 5
11 HPV 펩티드 + 폴리(IC) + PCI + 항-CTLA4 5
12 HPV 펩티드+ 항-CTLA4 2
각각의 면역화한지 18시간 후 조명을 LumiSource 조명 장치(PCI Biotech AS)를 사용하여 6분 동안 수행하였다.
종양 크기는 디지털 캘리퍼스로 두 개의 수직 직경을 측정함으로써 매주 2회 또는 3회 측정하였다. 종양 체적은 다음의 식을 사용하여 계산하였다:
V = (W2 x L)/2
여기서, W는 측정된 종양의 폭이고 L은 길이 직경이다.
결과가 도 1에 나타나 있으며, 이것은 관문 억제제가 폴리(IC), HPV 및 PCI와 투여된 기에서의 종양 체적의 감소를 나타낸다.
실시예 2
재료 및 방법
C57BL/6 마우스, TPCS2a 및 폴리(IC)는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. TRP-2 펩티드(서열 SVYDFFVWL)는 United 펩티드(Herndon, VA)로부터 입수하였다.
정상 마우스의 피내 감광화 및 면역화
마우스를 복부 부분(3-4cm2)을 면도하고 30G 바늘(BD, NJ, USA)이 있는 0.3ml BD Micro-Fine™+ 인슐린 시린지를 사용하여 피내 주사에 의해 아래 명시된 바와 같이 0일, 14일 및 35일째에 200㎍의 TRP-2 펩티드, 100㎍ TPCS2a 및 10㎍ 고분자량 폴리(IC)로 면역화하였다. 백신을 광을 보호하여 유지시키고, 제조 60분 내에 사용하였다. 백신을 복부 중앙선의 좌측 및 우측에 각각 50㎕의 2회 주사로 제공하였다. 백신 주사 후 명시된 시점에, 마우스를 졸레틸(10mg/kg 체중, Virbac, Norway)의 혼합물의 피하 주사에 의해 마취시키고, 관련있는 곳을 조명하였다. 몇몇 실험군(아래 참조)에서 항-CTLA4(3mg/kg, 복강내 투여)를 각 면역화 직전에 투여하였다.
면역화된 마우스의 조명
LumiSource(PCI Biotech)로의 백신접종 부상기 조명은 면역화한지 18시간 후 6분 동안 수행하였다.
오량체 염색 및 세포내 염색에 의한 면역 반응의 분석
1차 면역화한지 60일째에 동물을 희생시키고, 비장을 제거하고 비장 세포를 TRP-2 펩티드로 재자극한 다음 인터페론-감마(IFN-감마) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)에 대해 세포내 염색으로 분석하였다. IFN-γ에 대한 세포내 염색은 37℃에서 TRP-2 펩티드를 갖는 24-웰 플레이트에서 비장세포를 밤새 자극한 후 수행하였다. 브레펠딘 A를 마지막 4시간 동안 가하였다. 그후, 세포를 세척하고 빙상에서 10분 동안 PBS 중의 4% 포름알데히드로 고정하였다. 항-CD16/32를 가하여, Fc 수용체에 대한 비특히 결합을 차단하였다. 그후, 세포를 PBS 중의 0.1% NP40로 3분 동안 투과시키고 항-IFN-γ, 항-CD8 및 항-CD44 항체(eBioscience 또는 BD Pharmingen)로 염색하기 전에 세척하였다. 세포를 FACSCanto(BD Biosciences, San Jose, USA)를 사용하여 획득하고 FlowJo 8.5.2 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다. 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)에 대한 세포내 염색은 항-TNF-알파 항체를 사용하여 IFN-감마에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다.
다음의 실험군들이 포함되었다:
1. 비처리 마우스는 면역화하거나 조명하지 않았다.
2. TRP-2: 마우스를 모든 면역화에서 TRP-2 펩티드로 면역화하였다. 이들은 조명하지 않았다.
3. TRP-2 + 폴리 (IC): 마우스를 TRP-2 펩티드 및 10㎍ 폴리(IC)로 면역화하였다. 이들은 조명하지 않았다.
4. TRP-2 + PCI: 마우스를 TRP-2 펩티드 및 100㎍ TPCS2a로 면역화하고 조명하였다.
5. TRP-2 + 폴리 (IC) + PCI: 마우스를 TRP-2 펩티드, 10㎍ 폴리(IC) 및 100㎍ TPCS2a로 면역화하고 조명하였다.
6. TRP-2 + 폴리 (IC) + PCI + 항- CTLA4 : 마우스를 TRP-2 펩티드, 10㎍ 폴리(IC), 100㎍ TPCS2a로 면역화하였다. 항-CTLA4(3mg/kg, 복강내 투여)를 각각의 면역화 직전 투여하였다. 동물을 모두 조명하였다.
7. TRP-2 + 폴리 (IC) + 항- CTLA4 : 마우스를 TRP-2 펩티드 및 10㎍ 폴리(IC)로 면역화하였다. 항-CTLA4(3 mg/kg, 복강내 투여)를 각각의 면역화 직전 투여하였다. 동물은 조명하지 않았다.
도 2는 TRP-2 펩티드로 비장 세포의 재자극 후 TRP-2 오량체 염색에 대한 중앙값(총 CD8+ 세포 중의 항원-특이 CD44+ 세포 %)을 나타낸다. TRP-2 항원이 폴리(IC) 단독(그룹 3)과 또는 PCI 단독(그룹 4)과 사용되는 경우 항원-특이 세포의 유의적이지만 작은 증가가 항원 단독(그룹 2)에서 보여지는 바를 능가하여 관찰되었음을 알 수 있다. TRP-2 펩티드 + 폴리(IC) 조합(그룹 7)에 항-CTLA4를 첨가하면 TRP-2 펩티드 + 폴리(IC)에서 보여지는 바를 능가하여 반응을 증가시키는 것으로 나타나지 않았다. TRP-2 펩티드 + 폴리(IC)를 PCI와 조합하면 면역 반응이 명백히 증진되었으며(그룹 5), 항-CTLA4를 이러한 조합에 첨가하면 두 배 이상 더 반응이 증가되었으며, 이는 이러한 실험 시스템에서 항원 특이 CD8+, CD44+ T-세포의 증식시 PCI 및 항-CTLA4의 상승작용적 효과를 나타낸다.
도 3은 TRP-2 펩티드로 비장 세포의 재자극 후 인터페론-감마(IFN-감마) 세포내 염색으로부터의 결과를 나타낸다. 이러한 마커에 대해 항-CTLA4와 PCI 및 폴리(IC)의 조합은 PCI + 폴리(IC) 조합에서 보여지는 바를 능가하여 마커 발현을 증가시키는 것으로 나타나지 않았다.
도 4는 TRP-2 펩티드로 비장 세포의 재자극 후 TNF-알파 세포내 염색으로부터의 결과를 나타낸다. 도 2에 나타낸 결과에 따르면, 항-CTLA4를 TRP-2 펩티드 + 폴리(IC) 조합에 첨가하면(그룹 7) TRP-2 펩티드 + 폴리(IC) (그룹 3)에서 보여지는 바를 능가하여 반응이 증가되는 것으로 나타나지 않았다는 것을 알 수 있다. 그러나, 항-CTLA4를 TRP-2 펩티드 + 폴리(IC) + PCI 조합에 첨가하면 TNF-알파 발현 반응이 상당히 증가하였으며, 이는 이러한 실험 시스템에서 CD8+, CD44+ T-세포에서 항원 유도된 TNF-알파 발현에 대한 PCI 및 항-CTLA4의 상승작용적 효과를 나타낸다.
실시예 3
연구는 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1(함께 사용됨)과 조합된 PCI 백신접종의 효과를 조사하기 위해 수행되었다.
재료 및 방법
마우스는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 마우스를 0일째에 100,000개 TC-1 종양 세포(The Johns Hopkins University, 3400 N. Charles St., Baltimore, MD 21218-2695로부터 인가받음)로 이들의 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1, 감광화제 TPCS2a, 및 HPV 긴 펩티드 항원은 실시예 1에 기재된 바와 같았다.
면역화 프로토콜
처리 스케줄이 표 5에 요약되어 있다.
처리 스케줄
일자 관문 억제제 투여 (i.p.)
0 종양 접종
4 x
7 1st 면역화 x
8 1st 조명
11 x
14 2nd 면역화 x
15 2nd 조명
18 x
21 3rd 면역화 x
22 3rd 조명
25 x
PCI 처리된 동물을 각각의 면역화한지 18시간 후 조명하였다. 조명은 LumiSource 조명 장치(PCI Biotech AS)를 사용하여 6분 동안 수행하였다. 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1은 표 5에 나타낸 시점에서 복강내 주사에 의해 함께 투여하였다. 관문 억제제의 용량은 항-CTLA4의 경우 주사당 100㎍, 항-PD-1의 경우 200㎍이었다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼스로 두 개의 수직 직경을 측정함으로써 매주 2회 또는 3회 측정하였다. 종양 체적은 실시예 1에 기재된 바와 같이 계산하였다.
상이한 실험군에서 사용된 조합이 표 6에 나타내어져 있다.
실험군
그룹
번호 		처리 동물의 번호
1 비처리 5
2 항-PD-1/항CTLA4 (i.p.) 5
3 HPV 펩티드 (i.d.) + 항-PD-1/항CTLA4 (i.p.) 5
4 HPV 펩티드 + PCI (i.d.) 항-PD-1/항CTLA4 (i.p.) 5
결과는 도 5에 나타내어져 있으며, 이로부터 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1의 조합을 투여하는 것은, 이들 억제제가 종양에 의해 활성화되는 HPV 긴 펩티드 항원과 조합된다 하더라도, 종양 성장에 별로 영향이 없다는 것을 알 수 있다. 그러나, PCI가 관문 억제제로의 처리 섭생에 추가된다면, 종양 성장의 상당한 억제가 관찰되었다. 따라서, 명백한 종양 수축이 유도되었으며, 개시는 초기 PCI 처리한지 대략 1주 후에 일어났으며, 이는 PCI-유도된 면역학적으로 매개된 항-종양 효과를 나타낸다. PCI의 효과는 또한 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이 동물의 개선된 생존으로 해석된다.
실시예 4
연구는 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1(함께 사용됨) 및 TLR 리간드 폴리(IC)와 조합된 PCI 백신접종의 효과를 조사하기 위해 수행되었다.
재료 및 방법
마우스는 실시예 3에 기재된 바와 같이 TC-1 종양 세포로 접종하였다. 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1, 감광화제 TPCS2a, HPV 긴 펩티드 항원 및 폴리(IC)는 실시예 1에 기재된 바와 같았다.
면역화 프로토콜
처리 스케줄은 표 7에 개괄되어 있다.
처리 스케줄
일자 관문 억제제 투여 (i.p.)
0 종양 접종
4 x
7 1st 면역화 x
8 1st 조명
11 x
14 2nd 면역화 x
15 2nd 조명
18 x
21 3rd 면역화 x
22 3rd 조명
25 x
각각의 면역화는 50㎍ HPV 긴 펩티드 항원, 25㎍ TPCS2a(PCI 처리를 제공받은 동물의 경우) 및 5㎍ 폴리(IC)의 상이한 조합으로 이루어진 혼합물의 피내 주사에 의해 수행하였다. PCI 처리된 동물을 각각의 면역화한지 18시간 후에 조명하였다. 조명은 LumiSource 조명 장치(PCI Biotech AS)를 사용하여 6분 동안 수행하였다. 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1을 표 7에 나타낸 시점에서 복강내 주사에 의해 함께 투여하였다. 관문 억제제의 용량은 항-CTLA4의 경우 주사당 100㎍, 항-PD-1의 경우 200㎍이었다. 종양 크기는 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다.
상이한 실험군에서 사용된 조합이 표 8에 나타내어져 있다.
실험군
그룹 번호 처리 동물의 번호
1 비처리 5
2 항-PD-1/항CTLA4 (i.p.) 5
3 HPV 펩티드 + 폴리(IC) (i.d.) + 항-PD-1/항CTLA4 (i.p.) 5
4 HPV 펩티드 + 폴리(IC) + PCI (i.d.) + 항-PD-1/항CTLA4 (i.p.) 5
5 HPV 펩티드 + 폴리(IC) + PCI (i.d.) 5
결과가 도 7에 나타내어져 있으며, 이로부터 관문 억제제 항-CTLA4 및 항-PD-1의 조합에 더하여 TLR3 리간드 폴리(IC)를 투여하는 것이 종양 성장에 대해 상당한 억제 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다. PCI가 이 처리에 추가되는 경우, 강하게 증가된 항-종양 효과와 중간 실험 시작시 크기 아래 크기로의 종양 체적 수축이 관찰되었으며, 수축은 적어도 2주간 지속되었다. PCI의 효과는 또한 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이 동물의 강력하게 개선된 생존으로 해석된다.
실시예 5
연구는 HPV-유도된 암에 대한 TC-1 마우스 모델에서 관문 억제제 항-PD-1과 조합된 PCI 백신접종의 효과를 조사하기 위해 수행되었다.
재료 및 방법
마우스를 실시예 3에 기재된 바와 같이 TC-1 종양 세포로 접종하였다. 관문 억제제 항-PD-1, 감광화제 TPCS2a 및 HPV 긴 펩티드 항원은 실시예 1에 기재된 바와 같았다.
면역화 프로토콜
처리 스케줄은 표 9에 개괄되어 있다.
처리 스케줄
일자 항-PD-1 투여 ( i.p.)
0 종양 접종
4 x
7 1st 면역화 x
8 1st 조명
11 x
14 2nd 면역화 x
15 2nd 조명
18 x
21 3rd 면역화 x
22 3rd 조명
25 x
28 4th 면역화 x
29 4th 조명
32 x
36 x
각각의 면역화는 50㎍ HPV 긴 펩티드 항원 및 25㎍ TPCS2a(PCI 처리를 제공받은 동물의 경우)의 상이한 조합으로 이루어진 혼합물의 피내 투여에 의해 수행하였다. PCI 처리된 동물을 각각의 면역화한지 18시간 후 조명하였다. 조명은 LumiSource 조명 장치(PCI Biotech AS)를 사용하여 6분 동안 수행하였다. 관문 억제제 항-PD-1 200㎍을 표 9에 나타낸 시점에서 복강내 주사에 의해 투여하였다. 종양 크기는 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다.
상이한 실험군에서 사용된 조합이 표 10에 나타내어져 있다.
실험군
그룹 번호 처리 동물의 번호
1 비처리 5
2 HPV (i.d.) + 항-PD-1 (i.p.) 8
3 HPV (i.d.) + 항-PD-1 (i.p.) + PCI 8
결과가 도 9에 나타내어져 있으며, 이로부터 관문 억제제 항-PD-1을 HPV 펩티드 항원과 함께 투여하는 것이 종양 성장에 대해 작은 억제 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다. 그러나, PCI가 이러한 처리 섭생에 추가되는 경우, 종양 성장의 억제에 있어서 상당한 증가가 달성되었다. 따라서, 명백한 종양 수축이 관찰되었으며, 어떤 것은 관문 억제제(+ 항원) 단독에서는 나타나지 않았다. PCI의 효과는 또한 도 10으로부터 알 수 있는 바와 같이 동물의 개선된 생존으로 해석된다.

Claims (37)

  1. 대상체에서 면역 반응을 생성하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제를 투여하는 단계, 및
    상기 대상체를, 상기 감광화제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로 조사하는 단계(여기서 면역 반응이 생성됨)
    를 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 관문 억제제가 항체, 바람직하게는 단클론성 항체인, 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 관문 억제제가 항-CTLA4 및 항-PD-1, 바람직하게는 (i) 항-CTLA4 및 항-PD-1 또는 (ii) 항-CTLA4로부터 선택되는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체를 TLR 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR3 리간드, 바람직하게는 이중 가닥 RNA 분자, 바람직하게는 폴리(I:C)인, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 분자가 면역 반응을 자극할 수 있는 분자, 바람직하게는 백신 항원 또는 백신 성분이고, 그리고 바람직하게는 1 초과의 항원을 포함하는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 감광화제가 TPCS2a, AlPcS2a, TPPS4 및 TPBS2a, 바람직하게는 TPCS2a로부터 선택되는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 분자가 펩티드, 바람직하게는 흑색종 펩티드 또는 인간 유두종 바이러스(HPV) 펩티드인, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 백신접종의 방법인, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중의 어느 한 항에 있어서, 질환, 장애 또는 감염, 바람직하게는 암, 바람직하게는 흑색종 또는 유두종바이러스와 관련된 암을 치료하거나 예방하기 위한, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유류, 예를 들어, 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니피그이고, 가장 바람직하게는 상기 대상체가 인간인, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제 및 임의로 상기 TLR 리간드가 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 상기 대상체에 투여되는, 방법.
  13. 청구항 1, 6 또는 8 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 청구항 1 또는 7에 정의된 바와 같은 감광화제, 청구항 1 내지 3 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 관문 억제제 및 임의로 청구항 4 또는 5에 정의된 바와 같은 TLR 리간드, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 항원 분자 또는 이의 부분을 세포의 표면 상에 발현시키는 방법으로서,
    a) 상기 항원 분자 또는 이의 부분을 발현시키고자 하는 제1 세포 및 관문 억제제가 결합될 수 있는 제2 세포를 제공하는 단계(여기서 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포는 동일한 세포이거나 상이한 세포일 수 있음),
    b) 적어도 상기 제1 세포를 상기 항원 분자, 감광화제, 및 임의로 TLR 리간드와 접촉시키는 단계,
    c) 적어도 상기 제2 세포를 관문 억제제와 접촉시키는 단계, 및
    d) 적어도 상기 제1 세포를 상기 감광화제를 활성화시키기에 유효한 파장의 광으로 조사하는 단계(여기서 상기 항원 분자는 상기 세포의 시토졸 내로 방출되고, 그리고 상기 항원 분자 또는 이의 부분은 후속적으로 상기 제1 세포의 표면 상에 제시됨)
    를 포함하고,
    상기 제1 세포 및 상기 제2 세포는, 상기 조사 이전에, 상기 조사 동안 그리고/또는 상기 조사 후에 서로 접촉되는, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 항원 분자가 청구항 6 또는 8에 정의된 바와 같고, 상기 감광화제가 청구항 7에 정의된 바와 같고, 상기 관문 억제제가 청구항 2 또는 3에 정의된 바와 같고/같거나 상기 TLR 리간드가 청구항 4 또는 5에 정의된 바와 같은, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 항원 분자가 청구항 6에 정의된 바와 같고, 그리고 상기 항원 제시가 면역 반응의 자극을 유발하는, 방법.
  17. 청구항 14 내지 16 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시험관내 또는 생체외에서 수행되는, 방법.
  18. 청구항 14 내지 17 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포가 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포 또는 대식세포인, 방법.
  19. 청구항 14 내지 18 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포가 T 세포인, 방법.
  20. 청구항 14 내지 19 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포가 상기 방법 동안 서로 접촉되고, 그리고 상기 항원 분자, 상기 감광화제, 상기 관문 억제제 및 임의로 상기 TLR 리간드가 상기 방법 동안 상기 세포 둘 모두와 접촉되는, 방법.
  21. 청구항 14 내지 20 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포가 상기 항원 분자, 상기 감광화제 및 상기 관문 억제제 및 임의로 상기 TLR 리간드와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 접촉되는, 방법.
  22. 항원 분자 또는 이의 부분을 이의 표면 상에 발현하는 세포 또는 이의 집단으로서,
    상기 세포는 청구항 14 내지 21 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득가능하고, 상기 세포는 바람직하게는 수지상 세포인, 세포 또는 이의 집단.
  23. 청구항 22에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포의 집단 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 청구항 22에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포 집단 또는 청구항 13 또는 23에 정의된 바와 같은 조성물.
  25. 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한, 그리고/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한, 청구항 22에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포 집단 또는 청구항 13 또는 23에 정의된 바와 같은 조성물.
  26. 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한, 그리고/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한, 약제를 제조하기 위한, 청구항 22에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포 집단 또는 청구항 13 또는 23에 정의된 바와 같은 조성물의 용도.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 자극, 치료 또는 예방이 상기 약제를 상기 대상체에 투여함을 포함하는, 용도.
  28. 예방 또는 치료에서 사용하기 위한, 청구항 1, 6 또는 8 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 청구항 1 또는 7에 정의된 바와 같은 감광화제, 청구항 1 내지 3 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 관문 억제제, 및 임의로 청구항 4 또는 5에 정의된 바와 같은 TLR 리간드.
  29. 청구항 28에서, 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한, 그리고/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한 용도를 위한 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제 및 임의로 TLR 리간드 (여기서 바람직하게는 상기 용도는 청구항 1 내지 12 또는 14 내지 21 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법을 포함함).
  30. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 용도가 표면 상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하는 세포(여기서 상기 세포는 바람직하게는 수지상 세포임)의 집단을 제조하기 위해 청구항 14 내지 21 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법을 포함하는, 청구항 1 내지 6, 7 또는 8 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제 및 임의의 TLR 리간드.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 세포의 집단은 상기 대상체에 투여되는 것인, 항원 분자, 감광화제, 관문 억제제 및 임의의 TLR 리간드.
  32. 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한, 그리고/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 청구항 1, 6 또는 8 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항원 분자 및/또는 청구항 1 또는 7에 정의된 바와 같은 감광화제 및/또는 청구항 1 내지 3 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 관문 억제제, 및 임의로 청구항 4 또는 5에 정의된 바와 같은 TLR 리간드의 용도 (여기서 상기 면역 반응은 바람직하게는 청구항 1 내지 12 중의 어느 한 항의 방법으로 자극됨).
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 약제가 상기 대상체에 투여하기 위한 청구항 14 내지 21 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법으로 수득가능한 상기 세포의 표면 상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하는 세포의 집단을 포함하는, 용도.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 항원 분자 및/또는 상기 감광화제 및/또는 상기 관문 억제제 및 임의로 상기 TLR 리간드가 상기 약제의 제조를 위한 상기 세포의 집단을 수득하기 위해 청구항 14 내지 21 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에서 사용되는, 용도.
  35. 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 있어서, 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한, 그리고/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한, 또는 청구항 1 내지 12 또는 14 내지 21 중의 어느 한 항에 따르는 방법에서 세포의 표면 상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하기 위한 조합된 제제로서의, 청구항 1, 6 또는 8 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 청구항 1 또는 7에 정의된 바와 같은 감광화제, 청구항 1 내지 3 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 관문 억제제, 및 임의로 청구항 4 또는 5에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 포함하는, 제품.
  36. 청구항 1 또는 7에 정의된 바와 같은 감광화제를 함유하는 제1 용기;
    청구항 1, 6 또는 8 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항원 분자를 함유하는 제2 용기; 및
    청구항 1 내지 3 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 관문 억제제를 함유하는 제3 용기; 및 임의로
    청구항 4 또는 5에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 함유하는 제4 용기를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한, 그리고/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한, 또는 청구항 1 내지 12 또는 14 내지 21 중의 어느 한 항에 따르는 방법에서 세포의 표면 상에 항원 분자 또는 이의 부분을 발현하기 위한, 키트.
  37. 청구항 14 내지 21 중의 어느 한 항의 방법에 따라 세포의 집단을 제조하는 단계 및 이후에 상기 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바람직하게는 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위해, 바람직하게는 백신접종을 위해, 그리고/또는 암을 치료하거나 예방하기 위해, 대상체에서 면역 반응을 생성하는 방법.
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