KR20040006196A

KR20040006196A - 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물

Info

Publication number: KR20040006196A
Application number: KR1020020040189A
Authority: KR
Inventors: 오유경; 박정숙; 김종국; 정미숙; 고정재
Original assignee: 오유경
Priority date: 2002-07-11
Filing date: 2002-07-11
Publication date: 2004-01-24

Abstract

본 발명은 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 어쥬반트 효과가 있는 것으로 알려진 인터류킨-2 등의 유전자 어쥬반트 플라스미드를 폴리에틸렌 이민 등의 양이온성 고분자와 복합 조성물로 항원 물질과 같이 투여하여 면역원성을 증강시키는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 양이온성 고분자와 어쥬반트 유전자의 조성물은 외부의 분해효소로부터 어쥬반트 유전자를 안전하게 보호하여 유전자의 체내 체류 시간을 증가시키고 세포에서의 발현효율도 증가시키는 특징을 가지고 있어 동시에 투여되는 항원의 면역원성을 효과적으로 증진시키는데 사용될 수 있다.

Description

양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물 {Composition of genetic adjuvants comprising cationic polymer}

본 발명은 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 항원 물질과 같이 투여되어 면역원성을 증강시키는 어쥬반트 효과가 있는 것으로 알려진 인터류킨-2 등의 유전자 어쥬반트 플라스미드를 폴리에틸렌 이민 등의 양이온성 고분자를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

최근 항원성 단백이나 펩티드를 이용한 서브유니트 백신(subunit vaccine)과 항원 유전자를 이용한 유전자 백신 (DNA vaccine)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이들 백신은 기존의 불활성화 또는 약독화 백신에 비하여 부작용의 우려는 감소하는 장점이 있는 반면, 면역원성 (immunogenicity)이 약하여 이들 백신에 대한 면역반응을 효율적으로 증강시키는 어쥬반트 (adjuvant)의 개발이 당 분야에서 절실히 요구되고 있다 (O'Hagan.;J. Pharm. Pharmacol.,50,pp1-10, 1998).

어쥬반트는 강력한 T세포 매개 면역반응을 야기시키기 위하여 항원과 함께 투여되는 물질로 항원 제시 세포(APC)에 의해 인식되어 면역계를 활성화시켜 예방 백신 및 치료 백신의 효능을 증가시키는 용도를 갖는다. 면역 어쥬반트는 감염질환 및 암에 대해 숙주 저항성을 갖는 비특이적 자극작용과, 예방 백신의 면역원성 상승작용 및 치료 백신의 면역원성 상승작용으로서의 용도를 가진다. 이 어쥬반트는 세포가 매개하는 면역 반응(T 세포 반응, 지연된 과민성 반응), 체액성 반응(B 세포 반응, 항체 생산), 또는 이 두 반응 모두를 증진시킨다. 체액성 면역의 자극작용은 박테리아 감염질환, 일부 바이러스에 의한 감염 질환을 예방하는 데 뿐 아니라 순환성 암을 치료하는 요법에 중요하고, 한편, 세포성 면역은 고형의 종양 세포 치료요법 및 일부 바이러스에 의한 질환에 매우 중요하다.

현재 어쥬반트 중 인체에 사용이 승인된 것은 침강 알루미늄 (aluminum)류가 거의 유일하나, 이는 다른 어쥬반트들보다 비교적 약한 면역 반응 증강 효과를 나타내고 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 백신 등에는 면역반응 유도작용을 거의 나타내지 않아 적용 가능한 항원이 제한된다(Claessson et al.;J.Pediatr.,112,pp695-702, 1988; Alving et al.;AIDS Res. Hum. Retroviruses,8,pp1427-1430, 1992). 침강 알루미늄 류는 면역 반응 면에서도 Th2 면역반응을 자극하여 주로 체액성 면역을 증강시키므로 (Audibert and Lise;Immunol. Today,14, pp281-284, 1993), 세포독성(cytotoxic) T 세포 면역반응의 증강이 필요한 세포내 생장세균이나 인간 면역결핍성 바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV) 등에 대한 백신의 어쥬반트로 사용하는 데에 한계가 있다 (Alving et al.;Ann. N.Y. Acad. Sci.,690, pp265-275, 1993). 또한, 알루미늄 어쥬반트가 함유되는 백신은 생체내 분해가 어렵고 (Nixon et al.;Viral Immunol.,5, pp141-150, 1992) 알루미늄이 동결시 응집 침강하는 물성으로 인하여 동결건조 형태로 보관하기가 어려운 단점이 있다 (Warren et al.;Annu. Rev. Immunol.,4, pp369-388, 1986). 최근에 응용되고 있는 프로인트 어쥬반트(Freund's adjuvant)나 콜레라 톡신 B 등은 어쥬반트로서의 효과는 강력하나 인체에 사용시 안전성이 문제로 남아있다 (O'Hagan.;J. Pharm. Pharmacol.,50, pp1-10, 1998).

따라서 최근 보다 안전하고 효과적인 어쥬반트로서 사이토카인을 백신항원과 함께 투여하는 방법들이 당 분야에서 연구되고 있다. 면역 증강 효과 면에서 인터류킨-12 등의 사이토카인은 점막면역에 강력한 어쥬반트로 작용한다는 것이 알려지고 있다 (Arulanadam et al.;J. Infect. Dis.,180, pp940-949, 1999). 또한, 사이토카인은 Th1 면역반응과 Th2 면역반응을 증강시키는 타입(type)이 존재하므로 백신에 따라 적합한 사이토카인을 선택하여 보다 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 장점이 있다. 예로 인터류킨-12는 Th1 사이토카인으로서 세포 매개성 면역반응 (cell-mediated immunity)을 증강시켜 세포 내에서 생장하는 리슈만 편모충(Leishmania major)에 대한 면역반응이나 (Afonso et al.;Science,263, pp235-237, 1994) HIV-1에 대한 면역반응을 증강시킨다는 것이 보고된 바 있고 (Hall;Science,263, pp1685-1686, 1994), 인터류킨-2는 인플루엔자 서브유닛 백신에 대한 면역반응을 증강시킨다는 것이 알려진 바 있다 (Babai et al.;Vaccine,17, pp1223-1238, 1999). 한편 Th2 사이토카인인 인터류킨-4를 어쥬반트로 사용한 경우, 백신에 대한 Th2 면역반응이 증강되는 것이 보고된 바 있다 (Chow et al.;J. Immunol.,160, pp1320-1329, 1998). 그러나 인터류킨-12를 단백질 형태로 체내 투여 후의 혈중 반감기는 3.3 시간에 불과하다는 보고(Trinchieri;Blood,84, pp4008-4027, 1994)에서 나타난 바와 같이, 단백질 형태로 사이토카인을 투여할 경우, 체내에서의 신속한 단백 분해로 면역증강효과를 얻기 위하여 고가의 사이토카인을 수회 반복 투여해야 하므로 (Hughes et al.;Vaccine,10, pp226-230, 1992) 환자의 의료비용 및 투여 빈도면에서 실용화되기에 어려운 문제점이 있다 (Dong etal.;Plenum Press, 1995).

이러한 기술상의 문제점을 보완하기 위하여 최근 어쥬반트로 사이토카인을 유전자 형태로 항원 물질과 같이 투여하는 연구들이 시도되고 있다. 인터류킨-2 유전자 플라스미드는 간염 표면 항원 유전자 백신이나 HIV 타입-1 백신에 대한 세포 매개성 면역반응을 향상시킨다는 것이 보고되어 있고(Geissler et al.;J. Virol.,5, pp4284-4292, 1999; Xin et al.;Immunol.,94, pp438-444, 1998), 인터류킨-6 유전자는 인플루엔자 바이러스 백신의 면역반응을 증강시킨다는 것이 연구되었다 (Larsen et al.;J. Virol.,72, pp1704-1708, 1998). 또한 사이토카인 유전자 플라스미드의 어쥬반트로서의 안전성 (safety)도 최근 보고된 바 있다 (Ishii et al.;Gene Ther.,6, pp237-244, 1999).

현재까지의 사이토카인 플라스미드를 이용한 어쥬반트 유전자에 대한 연구는 아직 초기단계로 대부분이 사이토카인 어쥬반트 유전자를 동물에 직접 투여하고 있다. 그러나, 사이토카인 플라스미드 유전자를 어쥬반트로 사용하는 것 역시 체내 세포 외부의 핵산 분해 효소의 존재로 그 안정성 면에서는 크게 개선되어야 할 필요성이 있다. 어쥬반트 유전자 플라스미드를 체내에 유전자 자체 형태로 직접 투여시 플라스미드가 세포 내로 수송되기 전 단계에서 세포외부의 핵산 분해효소에 의하여 다량 분해되고 발현 효율도 낮다는 것은 유전자 치료분야에서 일반적으로 인식되고 있는 것으로 (Manthorpe et al.;Gene Ther.,4, pp419-431, 1993), 사이토카인 플라스미드를 어쥬반트로 사용하는 경우에도 현재까지는 수회의 반복 투여 (boosting dose)가 필요한 실정이다. 따라서, 당 분야에서 어쥬반트 유전자가 체내에서 보다 효율적으로 발현되기 위하여는 어쥬반트 유전자의 체내 투여 후의 분해를 방지하고 보다 지속적인 어쥬반트 효과를 나타낼 수 있는 어쥬반트 유전자의 효과적인 조성물 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 어쥬반트 유전자의 면역 유도 기능을 높이기 위하여 예의 노력한 결과, 당 분야에서 유전자 자체 형태 (naked DNA)로만 사용되어온 인터류킨-2 등의 어쥬반트 유전자를 양이온성 고분자와 복합 조성물 형태로 사용하여, 외부의 분해효소로부터 유전자가 안전하게 보호되며 체내에서 지속시간이 증가되고 투여부위에서의 발현효율도 증가되는 특징을 가지고 있으며, 같이 투여되는 항원물질의 면역원성을 현저히 증진시키는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 체내 투여시 안전하고 세포 내로의 수송이 용이하며 핵산 분해효소에 의해 목적 유전자가 분해되는 것을 방지할 수 있는 양이온성 고분자를 어쥬반트 유전자와 복합하여 투여하는 새로운 어쥬반트 유전자 조성물을 제공하고, 동시에 투여되는 항원의 면역원성을 증강시키는 어쥬반트 유전자 조성물을 함유하는 약학조성물에 관한 것이다.

도 1 은 인터류킨-2 어쥬반트 유전자 및 정량용 돌연변이 유전자의 제작과정을 도식화한 것이고,

도 2a 는 일정량의 검체를 표준 유전자와 함께 정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative PCR)을 수행한 다음 전기영동 사진이고,

도 2b 는 인터류킨-2 어쥬반트 유전자의 농도 정량을 위한 검량선이고,

도 3 은 양이온성 고분자를 여러농도로 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물들의 전기영동 패턴을 나타낸 젤 사진이고,

도 4a 는 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물을 사용한 경우, 세포당 발현된 전사체의 양을 어쥬반트 유전자 단독으로 사용한 경우와 비교한 그래프이고,

도 4b 는 어쥬반트 유전자 단독으로 사용한 경우, 유전자의 근육세포주 중 유전자 발현도를 정량성 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative RT-PCR)으로 측정한 전기영동 사진이고,

도 4c 는 어쥬반트 유전자 조성물을 사용한 경우, 유전자의 근육세포주 중 유전자 발현도를 정량성 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative RT-PCR)으로 측정한 전기영동 사진이고,

도 5a 는 어쥬반트 유전자를 단독으로 사용한 경우, 어쥬반트 유전자의 DNA분해효소에 대한 시간별 안정성을 측정한 전기영동 사진이고,

도 5b 는 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물을 사용한 경우, 어쥬반트 유전자의 DNA 분해효소에 대한 시간별 안정성을 측정한 전기영동 사진이고,

도 6 은 본 발명의 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물을 사용한 경우, 동시투여된 항원물질의 면역원성 증강효과를 효소 면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)으로 측정한 결과를 나타낸 것이고,

도 7a 는 정상 대조군 마우스의 간 조직 절편의 조직염색사진이고,

도 7b 는 정상 대조군 마우스의 폐 조직 절편의 조직염색사진이고,

도 7c 는 정상 대조군 마우스의 신장 조직 절편의 조직염색사진이고,

도 7d 는 어쥬반트 유전자 조성물을 마우스에 근육 주사한 후의 마우스 간 조직 절편의 조직염색사진이고,

도 7e 는 어쥬반트 유전자 조성물을 마우스에 근육 주사한 후의 마우스 폐 조직 절편의 조직염색사진이고,

도 7f 는 어쥬반트 유전자 조성물을 마우스에 근육 주사한 후의 마우스 신장 조직 절편의 조직염색사진이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 양이온성 고분자를 어쥬반트용 유전자의 안정화제로 사용하는 새로운 용도를 제공하며, 어쥬반트 유전자를 양이온성 고분자와 함께 투여하는 투여방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

어쥬반트 유전자를 유전자 자체 형태로 투여시, 생체 내에서 핵산 분해효소에 의하여 신속히 분해되어 어쥬반트 성질을 잃어버리는 체내 안전성 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자의 조성물을 제조하였다.

본 발명에서 어쥬반트 유전자를 양이온성 고분자와의 복합 조성물을 제조하는 방법은

1) 어쥬반트 유전자 플라스미드를 대량으로 정제하는 단계;

2) 양이온성 고분자 용액을 제조하는 단계;

3) 양이온성 고분자와 어쥬반트 유전자를 일정 비율로 혼합하고 복합 조성물을 형성시키는 단계로 구성된다.

본 발명에서는 어쥬반트로서의 기능이 알려진 인터류킨-2 유전자를 폴리에틸렌이민 등의 양이온성 고분자와 혼합하고 실온에 방치하여 복합체를 형성시킨 다음 복합체의 형성을 아가로즈 젤상의 전기영동 패턴의 변화로서 확인하였다. 또한 폴리에틸렌이민과 복합체를 형성한 어쥬반트 유전자는 유전자 분해효소에 대하여 안정성이 크게 증가되는 것을 관찰하였다.

이와 같이 양이온성 고분자와 유전자 어쥬반트 유전자의 복합 조성물을 사용시 같이 투여되는 항원 물질의 면역원성이 보다 효과적으로 증진되어 어쥬반트 기능이 향상된 것을 확인하였다.

단계 1)에서 어쥬반트 유전자로는 인터페론 감마 (interferon-gamma), 인터류킨-1 베타, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-10, 인터류킨-12, 인터류킨-15, 인터류킨-18 등의 사이토카인 유전자, 란테스 (RANTES), 인터류킨-8, CCL19 (EBV-induced molecule 1 ligand chemokine), CXCL12 (stromal cell-derived factor 1),대식세포염증단백질 1-α(macrophage inflammatory protein 1-alpha, MIP-1 α), 대식세포염증단백질-2 (macrophage inflammatory protein-2, MIP-2), 대식세포 화학주성인자 단백질-1 (macrophage chemoattractant protein-1, MCP-1), 인터페론 유도 단백질-10 (Interferon-inducible protein-10, IP-10) 등의 케모카인 유전자, 림포락틴 (lympholactin) 유전자, 열충격단백질(heat shock protein) 유전자 등으로부터 선택된 어쥬반트 유전자, 보다 바람직하게는 인터류킨-2를 포함하는 어쥬반트 유전자를 의미한다.

단계 2)에서 어쥬반트 유전자와 복합체를 형성하는 양이온성 고분자로서는 폴리에틸렌 이민과 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 페길레이티드 (pegylated) 폴리에틸렌이민, 히스티딜레이티드 (histidylated) 폴리에틸렌이민, 락토실레이티드 (lactosylated) 폴리에틸렌이민, 엽산 공유결합형 (folate-conjugated) 폴리에틸렌이민, 멜리틴 공유결합형 (melittin-conjugated) 폴리에틸린 이민 등의 폴리에틸렌이민 유도체, 폴리라이신, 키토산(chitosan), 스퍼민(spermine), 프로타민 (protamine), 폴리아미도아민 (polyamidoamine), 폴리프로필렌이민 (polypropyleneimine), 폴리브렌 (polybrene) 및 디이에이이 덱스트란 (DEAE-dextran)으로부터 선택된 양이온성 고분자, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌이민을 포함하는 양이온성 고분자를 의미한다.

단계 3)에서 양이온성 고분자와 어쥬반트 유전자의 조성물을 제조하는 방법으로는 양이온성 고분자의 물성에 따라 플라스미드와 고분자 혼합물을 일정시간 정치하여 플라스미드와 고분자의 복합체를 형성시키거나, 고분자의 특정 융점 (melting point)을 이용한 코아설베이션 (coacervation)법 또는 용해도 차이를 이용한 상분리 (phase separation) 기법 등이 사용될 수 있으며, 양이온성 고분자를 0.1 내지 200%(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 100%(w/v)으로 함유하는 조성물 제조방법을 의미한다.

본 발명의 어쥬반트 유전자를 양이온성 고분자와 복합 조성물로서 항원 물질과 같이 투여하는 경우에는 기존에 사용되고 있는 어쥬반트 유전자를 그 자체로 투여하는 경우 보다 유전자 분해 효소에 대한 안정성이 크게 증가되기 때문에 기존의 어쥬반트 유전자 사용시 한계점으로 지적된 체내의 낮은 발현 효율 문제를 극복할 수 있다. 또한, 양이온성 고분자와 목적하는 어쥬반트 유전자를 복합 조성물 형태로 제조하여 항원 물질과 같이 체내로 투여하므로 항원 물질의 면역원성을 증강시킬 수 있다.

본 발명은 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물 및 약학적 허용성 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 면역성 증강을 위한 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 어쥬반트 유전자 조성물과의 혼합물로 항원을 추가로 포함하는 약학조성물을 제공한다.

상기 어쥬반트 유전자 조성물과의 혼합물로 추가되는 항원으로 간염바이러스 표면 항원을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

상기 조성물 총 중량에 대하여 상기 어쥬반트 유전자 조성물을 0.5 ~ 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 어쥬반트 유전자 조성물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 어쥬반트 유전자 조성물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 어쥬반트 유전자 조성물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 어쥬반트 유전자 조성물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 어쥬반트 유전자 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1주에 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 어쥬반트 유전자 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 어쥬반트 유전자 조성물은 경구, 비경구(경피, 피내, 근육내 및 정맥내 포함), 직장 및 흡입 중에서 선택되어지는 경로에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 근육내 주사법으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 사이토카인 어쥬반트 유전자 및 정량용 돌연변이 플라스미드의 제작

어쥬반트 유전자로 인터류킨-2 (interleukin-2, IL-2) 유전자를 얻기 위하여, IL-2 유전자의 529 bp DNA 단편 (포항공과대학교, 성영철 박사)을 pVAX 발현 벡터 (Invitrogen사)의 다중 클로닝 부위 (multicloning site) 내 NheI/BamHI 제한효소 부위에 삽입하여 플라스미드 pVAX/IL-2를 제작한 후, 이를 대장균 (Escherichia coli) DH5α(Takara사, cat no. 9027, 일본)에 형질전환하여 IL-2를 발현하는 형질전환 대장균을 선별하였다 (도 1 참조). 퀴아젠 메가 프렙 키트 (Qiagen Mega Prep kit, Qiagen사)를 이용하여 상기 형질전환 대장균으로부터pVAX/IL-2 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하였다.

인터류킨-2 유전자를 정량하기 위한 내부 표준 유전자 돌연변이 플라스미드 를 제작하기 위하여는 pVAX/IL-2를 NheI과 HindⅢ로 잘라내어 173bp가 소실된 IL-2의 유전자 조각 (fragment)을 얻은 다음 이를 원 pVAX 벡터 내로 다시 삽입하여 pVAXdmIL-2를 제작하였다 (도 1 참조).

실시예 2. 어쥬반트 유전자 체내 농도 측정을 위한 검량선 작성

검체 중에 존재하는 어쥬반트 유전자의 농도를 정량성 중합 효소 연쇄반응 방법으로 측정하기 위하여 실시예 1에서 분리 및 정제된 여러 가지의 기지 농도의 pVAXdmIL-2를 일정량의 미지의 농도의 pVAXmIL-2와 같이 혼합하고 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응의 프라이머로서는 pVAX 벡터의 염기서열 668-689번 및 786-808번 부위를 각각 특이적으로 인식하는 서열번호 1로 기재되는 센스 프라이머와 서열번호 2로 기재되는 안티센스 프라이머를 이용하였다. 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 유전자의 증폭은 94℃에서 5분간 변성시킨 후 95℃에서 40초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 33회 반복 실시한 후 72℃에서 5분간 추가로 반응시켰다. 이로부터 증폭된 중합 효소 연쇄반응 산물을 2% 아가로오즈 겔 (agarose gel) 상에서 전기영동을 수행한 결과, 본 발명의 pVAXmIL-2는 약 669 bp 위치에서 DNA 밴드가 검출되고 pVAXdmIL-2는 496 bp 위치에서 DNA 밴드가 검출되었다 (도 2a 참조). 내부 표준 물질 (internal standard, IS)로 사용된 돌연변이 유전자의 기지 농도의 로그값을 x축으로 하고 내부 표준물질 돌연변이 유전자와 어쥬반트 유전자의 밴드 밀도 비율의 로그값을 y 축으로 표시한 로그-로그 플랏트(log-log plot)에서 직선성의 검량선이 작성되었다 (도 2b 참조).

실시예 3. 어쥬반트 유전자 복합 조성물 제조

실시예 1의 어쥬반트 유전자인 인터류킨-2 유전자와 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민 용액(분자량 25,000, cat. # 40,872-7, Aldrich사, Wisconsin 주, 미국)의 복합 조성물 형태를 제조하였다. 1차적으로 분자량 25,000 달톤의 폴리에틸렌 이민 2.5 g을 0.1% 아세트산 10 ㎖에 녹여 25 % w/v의 폴리에틸렌 이민 용액을 제조하였다. 다음 단계로서 인터류킨-2 유전자 1 ㎍에 25%의 폴리에틸렌 이민을 0.3 ㎕ (조성물 1), 1.2 ㎕ (조성물 2), 3 ㎕ (조성물 3), 6 ㎕ (조성물 4)씩 각각 가하고 증류수를 적가하여 용액의 총 부피를 30 ㎕로 하여 조성물 중 폴리에틸렌 이민 최종농도를 0.25 내지 5%로 만든 다음, 15분간 실온에서 방치하여 복합 조성물을 제조하였다.

각각의 조성물에 대하여 플라스미드 DNA와 폴리에틸렌 이민 고분자간의 복합체를 형성시킨 다음, 복합체의 형성을 아가로즈 젤상의 전기영동 패턴의 변화로서 확인한 후, 실험에 사용하였다. 도 3은 조성물에 따른 아가로즈 젤상의 전기영동 패턴의 변화를 보여준다.

실험예 1. 세포내 어쥬반트 유전자 발현효율 측정

어쥬반트 유전자를 양이온성 고분자와 함께 배양 세포에 넣어 어쥬반트 유전자의 발현 효율을 측정하였다.

실시예 1의 인터류킨-2 어쥬반트 유전자(pVAXmIL-2) 단독 첨가군과 인터류킨-2 어쥬반트 유전자(pVAXmIL-2)와 폴리에틸렌이민(분자량 25,000, 2.5 % w/v, Aldrich사, 미국)의 복합 조성물 3 첨가군으로 나누어 수행하였다.

1 ㎍ 어쥬반트 유전자 단독 및 1 ㎍ 어쥬반트 유전자와 2.5% 폴리에틸렌 이민 복합조성물 각각을 C₂C₁₂근육 세포주(한국 생명 공학 연구원, 염영일 박사)에 가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 10% FBS 혈청(serum)을 함유한 세포 배양배지 RPMI-1640 (Gibco BRL사, 미국)에서 1시간 반응시킨 다음, 세포를 수회 배양배지로 수세하여 세포 내로 탐식 (endocytosis) 되지 않은 세포 표면상의 플라스미드를 제거하였다. 10%의 우혈청 (fetal calf serum)을 함유한 RPMI-1640 세포 배양 배지를 가하여 2일간 반응시켰다. 세포 내로 수송된 어쥬반트 유전자의 발현은 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)법을 사용하여 평가하였다.

도 4a에서 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물을 사용한 경우 세포 내 발현 정도는 7173 ±1667 mRNA 전사체/세포 (n=4) 이었으나, 어쥬반트 유전자를 단독으로 사용한 경우 세포내 발현 효율은 측정 감도 이하로서 관찰되지 않아, 어쥬반트 유전자 조성물의 사용이 세포내 발현 효율을 현저히 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다. 도 4b는 어쥬반트인 인터류킨-2 유전자를 단독으로 투여한 경우의 정량성 RT-PCR 결과의 대표적인 결과 사진이며, 도 4c는 인터류킨-2 유전자를 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민과 복합 조성물로서 투여한 경우의 세포내 발현을 나타내는 정량성 RT-PCR 결과의 대표적인 결과 사진으로, 내부 표준 물질 (internal standard, IS)로 사용된 돌연변이 유전자는 카피(copy)수의 감소에 따라 RT-PCR 산물이 감소하고, 발현량 측정 타겟인 어쥬반트 인터류킨-2 유전자의 단독 첨가군에서는 인터류킨-2 유전자의 RT-PCR 산물이 전혀 관찰되지 않았고(도 4b 참조), 어쥬반트 유전자 조성물로 첨가된 인터류킨-2 유전자 RT-PCR 산물은 내부표준물질의 카피수 감소에 따라 더 RT-PCR 산물이 증가하는 것이 관찰되어(도 4c 참조), 어쥬반트 유전자 조성물로 세포에 첨가되었을 때 세포내 발현 효율이 증가됨을 확인하였다.

실험예 2. 어쥬반트 유전자의 DNA 분해효소에 대한 안정성 평가

1 ㎍ 인터류킨-2 어쥬반트 유전자 단독 또는 1 ㎍ 인터류킨-2 유전자와 2.5 % 폴리에틸렌이민(분자량 25,000, Aldrich사)의 복합 조성물에 0.1 유니트(unit)의 DNA 분해효소(DNase I, Sigma사, 미국)를 각각 가하고 37℃에서 약 2시간 반응시킨 다음, 아가로즈 젤 상에 전기영동하고 브롬화 에티디움(ethidium bromide) 처리 후, 어쥬반트 유전자가 존재하는 비율을 젤 밀도 분석기 (densitometer, Vilber Loumat사, 프랑스)로 측정하였다. 젤 로딩(loading) 용액에 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate)를 0.3% 첨가하여 어쥬반트 유전자를 고분자 복합체에서 분리하여 전기영동을 수행하였다.

도 5a에서 보이는 것처럼 어쥬반트 인터류킨-2 유전자를 단독으로 DNA 분해효소 0.1 유니트(unit)와 반응시킨 경우에는 1시간 내에 유전자가 모두 분해되는 것을 관찰하였으며, 도 5b에서는 어쥬반트 유전자를 폴리에틸렌이민과 복합 조성물 형태로 투여한 경우에는 8 시간 후에도 어쥬반트 유전자가 분해효소에 대하여 안정한 것을 확인하였다. 이상의 결과로서, 어쥬반트 유전자의 발현을 위한 유전자 안정성에 폴리에틸렌이민과의 복합조성물의 형태가 더욱 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 3. 면역효소 측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 이용한 어쥬반트 유전자의 면역 유도능 평가

어쥬반트 유전자를 B형 간염 바이러스 표면항원(Hepatitis B virus Surface Antigen; HBs Ag)과 동시 투여한 후, 항체 생성속도 및 생성량을 관찰하여 면역유도능을 평가하기 위하여, 항원 단독투여군, 인터류킨-2 어쥬반트 유전자와 항원의 병용투여군 및 폴리에틸렌이민과 복합 조성물 형태의 인터류킨-2 어쥬반트 유전자와 항원의 병용투여군과 비교하였다.

3.1 동물실험용 고용량 플라스미드 유전자와 폴리에틸렌 이민 복합 조성물의 제조

인터류킨-2 어쥬반트 유전자 100 ㎍에 분자량 25,000 달톤의 폴리에틸렌 이민 200 mM 15 ㎕를 가하고 5% 포도당 용액을 적가하여 총 부피를 100 ㎕로 만든 다음 (폴리에틸렌 이민 최종 농도 75%) 볼텍싱(vortexing)하고 상온에서 15분간 방치한 다음 동물에 투여하였다.

3.2 동물 투여군

B형 간염 바이러스 표면항원 10㎍ 및 인터류킨-2 유전자 100㎍을 약 6-8 주령의 Balb/c 실험용 생쥐 (mouse, 서울대학교 동물 사육 센터, 한국)에 근육 투여하여 면역화로 인한 항체생성을 유도하고, 2 - 3주 후부터 수주간 혈액을 채취하였다.

그룹 1 : B형 간염 표면항원 10㎍ 투여군

그룹 2 : B형 간염 표면항원 10㎍ 및 어쥬반트 유전자 단독(IL-2 유전자 100㎍) 투여군

그룹 3 : B형 간염 표면항원 10㎍ 및 어쥬반트 유전자 조성물(IL-2 유전자 100㎍와 폴리에틸렌이민 75%) 투여군

채취된 검체 중의 항체 농도를 정량하기 위하여 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)를 B형 간염 표면 항원으로 코팅한 다음 0.1% 트윈 20(Tween 20)이 포함된 인산완충액 (phosphate-buffered saline: PBS)으로 씻은 후, 1% 우혈청 (bovine serum)이 포함된 인산완충액으로 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 상기의 실험용 생쥐에서 채취한 혈액을 10,000×g로 원심분리한 후, 항체가 있는 상층액인 혈청을 수집하였다. 항체를 포함한 혈청을 여러 배수 (1:33, 1:100, 1:330, 1:1000, 1:3300)로 희석하여 플레이트에 가하고 37℃에서 반응을 진행하였다. 호올스래디쉬 퍼록시데이즈(Horseradish peroxidase)가 결합된 항 마우스 IgG 항체(HRP-anti-mouse IgG antibody, ICN Pharmaceuticals사, Ohio 주, 미국)를 1:500 희석된 상태로 넣고 37℃에서 반응시킨 다음, PBS-1.0% 트윈 용액으로4 회 씻은 후 기질 (substrate)인 1-스텝 터보 TMB-ELISA 용액(3,3,5,5-tetramethyl benzidine substrate solution, Pierce 사, cat no. 34022, 미국)을 100㎕ 넣고 반응시킨 후 ELx 800 ELISA 리더 (Bio-Tek Instrument사, Winooski,미국)로 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 항원-항체 반응 정도를 판단하였다.

도 6의 결과를 보면 면역유도 4주 경과 후, 항원물질 단독 투여군에 비해 항원물질과 어쥬반트유전자 단독 투여군의 경우는 항체 생성능이 조금 높았으나, 어쥬반트 유전자 조성물의 경우 2배 이상의 항체 생성을 보였다. 면역유도 8주 경과 후에도 항원물질 단독 투여군에 비해 인터류킨-2 어쥬반트 유전자를 단독으로 항원물질과 같이 투여한 경우는 약간 항체가 더 생성이 되었으나, 어쥬반트 유전자를 폴리에틸렌이민(75 % w/v)과 복합 조성물 형태로 투여한 경우에는 IgG 타입 항체의 생성이 1.5배 정도로 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 이 결과로 항체생성을 돕는 인터류킨-2 같은 어쥬반트 유전자를 폴리에틸렌이민과 복합조성물형태로 투여하는 경우에 탁월한 면역반응 상승효과를 유도할 수 있음을 확인하였다.

실험예 4. 급성독성 실험

1. 근육 투여

ICR계 마우스를 6마리 씩을 1군으로 하여 본 발명의 실시예 3의 양이온성 고분자를 함유한 어쥬반트 유전자 조성물을 100 ㎍/마우스의 용량으로 주 1회 씩 4주간 근육투여를 반복한 다음, 간 (도 7d), 폐 (도 7e), 신장 (도 7f) 조직에서의 독성여부를 당분야에서 상용적으로 쓰이고 있는 헤마톡실린-에오신 조직 염색 방법으로 염색하여 광학 현미경 하에서 100 배 확대배율로 관찰한 결과, 6마리 모두에서 대조군의 간 (도 7a), 폐 (도 7b), 신장 (도 7c)과 별다른 조직학적인 변화를 찾아볼 수 없었으며 사망한 예가 한 마리도 없었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물은 목적하는 어쥬반트 유전자의 체내의 유전자 분해효소로부터 어쥬반트 유전자를 안전하게 보호할 뿐 아니라 투여조직에서 어쥬반트 유전자의 발현효율을 증가시켜 같이 투여된 항원물질의 면역 유도능을 보다 효과적을 증강시키는 특징을 가지고 있어 어쥬반트 유전자의 효능을 높이는 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물.
제 1항에 있어서, 양이온성 고분자를 0.1 내지 200% w/v 농도로 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물.
제 1항에 있어서, 양이온성 고분자는 폴리에틸렌 이민, 페길레이티드 (pegylated) 폴리에틸렌이민, 히스티딜레이티드(histidylated) 폴리에틸렌이민, 락토실레이티드(lactosylated) 폴리에틸렌이민, 엽산공유결합형 (folate-conjugated) 폴리에틸렌이민, 멜리틴 공유결합형(melittin-conjugated) 폴리에틸린 이민을 포함하는 폴리에틸린 이민 유도체, 폴리라이신, 키토산(chitosan), 스퍼민(spermine), 프로타민(protamine), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 폴리프로필렌이민 (polypropyleneimine), 폴리브렌(polybrene) 및 디이에이이 덱스트란(DEAE-dextran)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 어쥬반트 유전자 조성물.
제 1항에 있어서, 어쥬반트 유전자는 인터페론 감마(IFN-γ), 사이토카인 유전자, 케모카인 유전자, 림포락틴 (lympholactin) 유전자, 열충격단백질 (heat shock protein) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 어쥬반트 유전자 조성물.
제 4항에 있어서, 사이토카인 유전자는 인터류킨-1 베타, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-10, 인터류킨-12, 인터류킨-15, 인터류킨-18 유전자이고, 케모카인 유전자는 란테스(RANTES), 인터류킨-8, CCL19 (EBV-induced molecule 1 ligand chemokine), CXCL12 (stromal cell-derived factor 1), 대식세포염증단백질 1-α(macrophage inflammatory protein 1-alpha, MIP-1 α), 대식세포염증단백질-2 (macrophage inflammatory protein-2, MIP-2), 대식세포 화학주성인자 단백질-1 (macrophage chemoattractant protein-1, MCP-1), 인터페론 유도 단백질-10 (Interferon-inducible protein-10, IP-10) 유전자임을 특징으로 하는 어쥬반트 유전자 조성물.
양이온성 고분자를 함유하는 어쥬반트 유전자 조성물 및 약학적 허용성 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 면역성 증강을 위한 약학조성물.
제 6항에 있어서, 어쥬반트 유전자 조성물과의 혼합물로 항원을 추가로 포함하는 것이 특징인 약학조성물.
제 7항에 있어서, 항원은 간염 바이러스 표면 항원임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항 또는 제 6항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 어쥬반트 유전자 조성물을 0.5 ~ 50%로 포함하는 조성물.
제 6항에 있어서, 어쥬반트 유전자 조성물을 유효성분으로 하는 약학조성물을 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1주에 1회 내지 수회 투여하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 어쥬반트 유전자 조성물을 유효성분으로 하는 약학조성물을 근육내 주사법으로 투여하는 것을 특징으로 하는 조성물.