ES2929532T3 - Combinaciones de inhibidores de puntos de control y vacunas y su uso en inmunoterapia - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describe una vacuna que comprende un antígeno y un inhibidor de puntos de control. También se describe en el presente documento un método para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto. El método puede comprender administrar la vacuna al sujeto que la necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Combinaciones de inhibidores de puntos de control y vacunas y su uso en inmunoterapia
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a vacunas combinadas con anticuerpos inhibidores de puntos de control, y al uso de dicha combinación para la inmunoterapia.
ANTECEDENTES
Las vacunas se utilizan para estimular una respuesta inmunitaria en un individuo con el fin de proporcionarle protección y/o tratamiento contra una enfermedad concreta. Algunas vacunas incluyen un antígeno para inducir la respuesta inmunitaria. Algunos antígenos provocan una fuerte respuesta inmunitaria, mientras que otros antígenos provocan una respuesta inmunitaria débil. Una respuesta inmunitaria débil a un antígeno puede reforzarse incluyendo un adyuvante en la vacuna. Los adyuvantes vienen en muchas formas diferentes, por ejemplo, sales de aluminio, emulsiones de aceite, componentes estériles de bacterias u otros patógenos, citoquinas, etc.
La proteína de muerte celular programada 1, también conocida como PD-1, es una molécula proteica de superficie celular de 288 aminoácidos que en los seres humanos está codificada por el gen PDCD1. Esta proteína se expresa en las células pro-B y se cree que desempeña un papel en su diferenciación. La PD1 es una proteína de membrana de tipo I de 268 aminoácidos y miembro de la familia ampliada CD28/CTLA-4 de reguladores de células T. La estructura de la proteína incluye un dominio IgV extracelular seguido de una región transmembrana y una cola intracelular. La cola intracelular contiene dos sitios de fosforilación localizados en un motivo inhibidor basado en tirosinas de inmunorreceptores y en un motivo interruptor basado en tirosinas de inmunorreceptores, lo que sugiere que PD-1 regula negativamente las señales del TCR.
PD-1 tiene dos ligandos, PD-L1 y PD-L2, que son miembros de la familia B7. La proteína PD-L1 se regula en los macrófagos y las células dendríticas (DC) en respuesta al tratamiento con LPS y GM-CSF, y en las células T y B tras la señalización de los receptores de células T y B, mientras que en los ratones en reposo, el ARNm de PD-L1 puede detectarse en el corazón, el pulmón, el timo, el bazo y el riñón. PD-L1 se expresa en casi todas las líneas celulares tumorales murinas, incluyendo el mieloma PA1, el mastocitoma P815 y el melanoma B 16 tras el tratamiento con IFN-Y. La expresión de PD-L2 es más restringida y se expresa principalmente en las CD y en unas pocas líneas tumorales.
Hay estudios que sugieren que PD-1 y sus ligandos regulan negativamente las respuestas inmunitarias. Se ha demostrado que los ratones con eliminación de PD-1 desarrollan una glomerulonefritis similar al lupus y una cardiomiopatía dilatada en los fondos C57BL/6 y BALB/c, respectivamente. In vitro, el tratamiento de células T estimuladas con anti-CD3 con PD-L1-Ig da lugar a una reducción de la proliferación de células T y de la secreción de IFN-y. Parece que la sobrerregulación de PD-L1 puede permitir a los cánceres evadir el sistema inmunitario del huésped. Se ha demostrado que la expresión de PD-L1 se correlaciona de forma inversa con el recuento de linfocitos T CD8+ intraepiteliales, lo que sugiere que la presencia de PD-L1 en las células tumorales puede suprimir las células T CD8+ antitumorales.
LAG3 y TIM3 son algunas de las muchas moléculas receptoras en la superficie de los linfocitos T que ejercen funciones inhibitorias.
El dominio de inmunoglobulina de células T y dominio de mucina 3 (TIM-3; también conocido como HAVCR2), es una proteína humana codificada por el gen HAVCR2. TIM-3 es un receptor de superficie de la proteína expresado por las células T activadas de las células T CD4 Th1 y CD8 citotóxicas productoras de IFNgamma. Su ligando es la galectina-9, que se expresa abundantemente en el microambiente tumoral, e induce la muerte celular y el agotamiento de las células T CD4 y CD8. Las pruebas de que Tim-3 es un punto de control inmunitario clave en la supresión inmunitaria inducida por un tumor o por un virus provienen de la demostración de que las células T CD8 que expresan Tim-3 son la población de células T CD8 más suprimida o disfuncional en modelos preclínicos.
El gen de activación de linfocitos 3 (Lag-3 también conocido como CD223) es un miembro de la superfamilia de las Ig que se expresa sólo en las células T activadas y toleradas, que se une a las moléculas MHC-II y que se sabe que transduce señales inhibitorias. LAG-3 está marcadamente sobrerregulado en las células T agotadas en comparación con las células T efectoras o de memoria. LAG-3 regula negativamente la expansión de las células T al inhibir los flujos de calcio inducidos por los receptores de células T, controlando así el tamaño del grupo de memoria de células T . Los estudios han demostrado que, en el contexto del cáncer, LAG3 está sobrerregulado en los TIL y el bloqueo de LAG-3 puede mejorar las respuestas inmunitarias de las células T antitumorales. El bloqueo de LAG-3 en un modelo viral crónico que evoca el agotamiento de las células T CD8, puede vigorizar las respuestas de las células T CD8.
En conjunto, estas proteínas mencionadas, junto con otros receptores inhibidores, como CTLA-4, son actores importantes en el agotamiento de las células T CD8 que tiene lugar en condiciones inmunológicas crónicas como la infección viral crónica y el cáncer, tanto en modelos experimentales como en humanos. Estas características y funciones conocidas de PD1-1, CTLA-4, TIM-3 y LAG-3 las convierten en una atractiva diana para la modulación inmunológica en el ámbito de las vacunas.
Las vacunas también se administran de muchas maneras diferentes (por ejemplo, por inyección, por vía oral, etc.) en muchos tejidos diferentes (por ejemplo, intramuscular, nasal, etc.). Sin embargo, no todos los procedimientos de administración son iguales. Algunos procedimientos de administración permiten un mayor cumplimiento dentro de una población de individuos, mientras que otros procedimientos de administración pueden afectar a la inmunogenicidad y/o seguridad de la vacuna.
En consecuencia, sigue siendo necesaria una inmunoterapia más eficaz que utilice antígenos sintéticos combinados con inhibidores de puntos de control, en particular TIM-3, y LAG-3. Además, sigue siendo necesario mejorar los procedimientos de tratamiento para mejorar la respuesta inmunitaria generada por la combinación de inhibidores de puntos de control y antígenos sintéticos.
Baghdadi et al., 2014 (MABS, vol 6, no.5, páginas 1124-1132) divulgan que los miembros de la familia de genes TIM son moléculas de superficie de tipo I que se expresan en las células inmunitarias y desempeñan funciones en la regulación de los brazos innato y adaptativo del sistema inmunitario.
Baghdadi et al, 2012 (Cancer Immunology Immunotherapy, vol 62, no.4, páginas 629-637) divulgan que la manipulación terapéutica de TIM-3 y TIM-4 puede proporcionar una estrategia para mejorar la eficacia clínica de la inmunoterapia contra el cáncer.
El documento WO 2005/097211 divulga composiciones que contienen un antígeno y una molécula de direccionamiento TIM.
SUMARIO DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
La presente invención proporciona una combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada con el citomegalovirus (CMV), el herpes, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del papiloma humano (VPH), la hepatitis C, la hepatitis B, la gripe, el virus respiratorio sincitial (VRS), la malaria o el C. difficile, aumentando una respuesta inmunitaria de células T CD8+ en un sujeto, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
administrar al sujeto una vacuna primaria y una vacuna de refuerzo que comprenda una molécula de ADN que codifique un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: un antígeno CMV, un antígeno herpes, un antígeno VIH, un antígeno VPH, un antígeno VHC, un antígeno VHB, un antígeno gripe, un antígeno VRS, un antígeno Plasmodium falciparum y un antígeno C. difficile, y
después de la vacunación de refuerzo, administrar al sujeto el anticuerpo TIM-3.
La presente invención también proporciona una combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención del cáncer, mediante el aumento de una respuesta inmunitaria de células T CD8+, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
administrar al sujeto una vacunación primaria y una vacunación de refuerzo de una molécula de ADN que codifica un antígeno cancerígeno seleccionado del grupo que consiste en: PSA, PSMA, STEAP, PSCA, pAp , antígeno WT1, tirosinasa, NYES01, PRAME, MAGE o hTERT, y
después de la vacunación de refuerzo, administrar al sujeto el anticuerpo TIM-3.
Aspectos de la presente invención incluyen composiciones para potenciar una respuesta inmunitaria contra un antígeno en un sujeto que lo necesite, que comprenden el anticuerpo TIM-3 en combinación con un antígeno sintético capaz de generar una respuesta inmunitaria en el sujeto, o un fragmento biológicamente funcional o una variante del mismo. Parte de la divulgación, pero no parte de la invención, incluye composiciones para potenciar una respuesta inmunitaria contra un antígeno en un sujeto que lo necesita, que comprenden el anticuerpo LAG-3 en combinación con un antígeno sintético capaz de generar una respuesta inmunitaria en el sujeto, o un fragmento biológicamente funcional o una variante del mismo
El antígeno sintético puede ser un ADN aislado que codifica para el antígeno
Preferentemente, el antígeno sintético puede seleccionarse del grupo que consiste en: hTERT, próstata, WT1, tirosinasa, NYES01, PRAME, MAGE, CMV, herpes, VIH, VPH, VHC, VHB, gripe, VRS, Plasmodium falciparum y C. difficle.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento también pueden incluir un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los aspectos de la invención también incluyen procedimientos para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto que la necesita, administrando al sujeto cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento. Los procedimientos para aumentar una respuesta inmunitaria también pueden incluir una etapa de electroporación.
Otros aspectos de la invención incluyen procedimientos de administración de un inhibidor de puntos de control en combinación con un antígeno para mejorar la respuesta inmunitaria del antígeno, donde el inhibidor de puntos de control se administra después de una administración primaria y de refuerzo del antígeno. Cualquier referencia a un procedimiento de tratamiento debe interpretarse como las sustancias y composiciones para su uso en dicho tratamiento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
En la FIG. 1 se presentan gráficos que muestran un aumento del 30% en las respuestas de las células T inducidas por la terapia conjunta con el anticuerpo anti PDL1 y las vacunas contra el VPH.
La FIG 2. Proporciona gráficos que representan el total de células T CD8+ específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con PD1. El gráfico de la izquierda muestra los porcentajes de células T CD3+CD8+ específicas de hTERT que muestran una doble liberación de las citoquinas IFNy y TNFa. Los experimentos se realizaron de forma independiente al menos dos veces y los datos representan la media ± SEM de cuatro ratones por grupo.
La FIG 3. Proporciona gráficos que representan el total de células T CD8+ específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con TIM3. El gráfico de la izquierda muestra los porcentajes de células T CD3+CD8+ específicas de hTERT que muestran una doble liberación de las citoquinas IFNy y TNFa. Los experimentos se realizaron de forma independiente al menos dos veces y los datos representan la media ± SEM de cuatro ratones por grupo.
La FIG 4. Proporciona gráficos que representan el total de células T CD8+ específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con LAG3. El gráfico de la izquierda muestra los porcentajes de células T CD3+CD8+ específicas de hTERT que muestran una doble liberación de las citoquinas IFNy y TNFa. Los experimentos se realizaron de forma independiente al menos dos veces y los datos representan la media ± SEM de cuatro ratones por grupo.
La Fig. 5. Proporciona resultados de citometría de flujo para la adminisración temprana de puntos de control mAb. (A) muestra los gráficos que representan las células T CD8 específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con o sin PD1, TIM3 y LAG3 poco después de la inmunización de cebado. (B) muestra gráficos que representan las células T CD8 específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con o sin PD1, TIM3 y LAG3 poco después de la inmunización de refuerzo.
La Fig. 6. Proporciona resultados de citometría de flujo para la administración tardía de puntos de control mAb. (A) muestra los gráficos que representan las células T CD8 específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con o sin PD1, TIM3 y LAG3 poco después de la inmunización de cebado. (B) muestra gráficos que representan las células T CD8 específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con o sin PD1, TIM3 y LAG3 poco después de la inmunización de refuerzo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
La presente invención se refiere a una vacuna que puede utilizarse para aumentar o mejorar una respuesta inmunitaria, es decir, crear una respuesta inmunitaria más eficaz, combinando una vacuna, en muchos casos un antígeno sintético, con un inhibidor de puntos de control, en particular anticuerpos TIM-3. Parte de la divulgación, pero no parte de la invención, se refiere a una vacuna que puede utilizarse para aumentar o mejorar una respuesta inmunitaria, es decir, crear una respuesta inmunitaria más eficaz, combinando una vacuna, en muchos casos un antígeno sintético, con un inhibidor de puntos de control, en particular anticuerpos PD1, PDL1 y LAG-3. En algunos casos de la invención, los anticuerpos, en particular los anticuerpos TIM-3 , pueden administrarse en combinación con el antígeno; mientras que, en otros casos, los anticuerpos, en particular los anticuerpos TIM-3 , pueden administrarse por separado del antígeno de la vacuna. En algunos casos de la divulgación, los anticuerpos, en particular los anticuerpos LAG-3, pueden administrarse en combinación con el antígeno; mientras que, en otros casos, los anticuerpos, en particular los anticuerpos LAG-3, pueden administrarse por separado del antígeno de la vacuna. En algunos casos de la invención los anticuerpos, en particular los anticuerpos TIM-3, comprenden una secuencia de ADN que codifica dicho anticuerpo, que incluye al menos las regiones variables de la inmunoglobulina. En algunos casos de la divulgación los anticuerpos, en particular los anticuerpos LAG-3, comprenden una secuencia de ADN que codifica dicho anticuerpo, que incluye al menos las regiones variables de la inmunoglobulina.
La vacuna de la presente invención puede aumentar la respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto mediante el aumento de la respuesta de las células T CD8+ en comparación con la vacuna que no incluye inhibidores del punto de control. Este aumento de la respuesta de las células T CD8+ tiene actividad citolítica y segrega la citoquina antiviral interferón-gamma (IFN-y).
Aspectos de la presente invención incluyen composiciones para potenciar una respuesta inmunitaria contra un antígeno en un sujeto que lo necesita, que comprenden el anticuerpo TIM-3 en combinación con un antígeno sintético capaz de generar una respuesta inmunitaria en el sujeto, o un fragmento biológicamente funcional o una variante del mismo. Aspectos de la divulgación, pero no aspectos de la invención, incluyen composiciones para potenciar una respuesta inmunitaria contra un antígeno en un sujeto que lo necesita, que comprenden el anticuerpo LAG-3 en combinación con un antígeno sintético capaz de generar una respuesta inmunitaria en el sujeto, o un fragmento biológicamente funcional o una variante del mismo.
El antígeno sintético puede ser un ADN aislado que codifica para el antígeno
Preferentemente, el antígeno sintético puede seleccionarse del grupo que consiste en: hTERT, próstata, WT1, tirosinasa, NYES01, PRAME, MAGE, CMV, herpes, VIH, VPH, VHC, VHB, gripe, VRS, Plasmodium falciparum y C. difficle.
El antígeno del VPH puede ser dominios E6 y E7 de subtipos seleccionados del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58, y una combinación de ellos.
El antígeno del VIH puede seleccionarse del grupo que consiste en: Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, y Gag, y una combinación de ellos.
El antígeno de la gripe puede seleccionarse del grupo que consiste en: HI HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, antígeno BHA, y cualquier combinación de los mismos.
El antígeno de Plasmodium falciparum incluye un antígeno del circunsporozoito (CS).
El antígeno de C. difficle puede seleccionarse del grupo que consiste en: Toxina A y Toxina B, y una combinación de ellas.
El antígeno del VHC puede seleccionarse del grupo que consiste en: E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b, y una combinación de ellas.
El antígeno del VHB puede seleccionarse del grupo que consiste en: antígeno de superficie tipo A, antígeno de superficie tipo B, antígeno de superficie tipo C, antígeno de superficie tipo D, antígeno de superficie tipo E, antígeno de superficie tipo F, antígeno de superficie tipo G, antígeno de superficie tipo H y antígeno del núcleo, y una combinación de los mismos.
El antígeno del VRS puede seleccionarse del grupo que consiste en: F, G, NS1, NS2, N, M, M2-1, M2-2, P, SH y L, y una combinación de ellas.
El antígeno sintético puede ser hTERT, antígeno WT1, tirosinasa, NYES01 o PRAME.
El antígeno prostético puede seleccionarse del grupo que consiste en: PSA, PSMA, STEAP, PSCA y PAP, y una combinación de ellos.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento también pueden incluir un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los aspectos de la invención también incluyen procedimientos para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto que la necesita, administrando al sujeto cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento. Los procedimientos para aumentar una respuesta inmunitaria también pueden incluir una etapa de electroporación.
1. Definiciones
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la materia. En caso de conflicto, prevaleceré el presente documento, incluidas las definiciones. A continuación se describen los procedimientos y materiales preferidos, aunque en la préctica o en los ensayos de la presente invención pueden utilizarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. Los materiales, los procedimientos, y los ejemplos divulgados aquí son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Los términos "comprende(s)", "incluye(n)", "tiene(n)", "puede(n)", "contiene(n)" y sus variantes, tal y como se utilizan aquí, pretenden ser expresiones, términos o palabras transitorias abiertas que no excluyen la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas singulares "un", "y" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones "que comprenden", "que consisten en" y "que consisten esencialmente en" las realizaciones o los elementos presentados en el presente documento, tanto si se exponen explícitamente como si no.
"Adyuvante", tal como se utiliza en el presente documento, significa cualquier molécula añadida a la vacuna descrita en el presente documento para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos, y en particular se refiere a los anticuerpos inhibidores de puntos de control.
"Inhibidor de puntos de control", tal y como se utiliza en el presente documento, son inhibidores o moléculas que bloquean los puntos de control inmunitarios tal y como se entiende comúnmente en el campo de la inmunoterapia del cáncer. Más comúnmente, los inhibidores de puntos de control son anticuerpos que bloquean estos puntos de control inmunológicos, como el PD1 (en la célula T) a su ligando PDL1 (en la célula dendrítica). Algunos ejemplos de inhibidores de puntos de control conocidos son ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab y otros.
"Secuencia codificante" o "ácido nucleico codificante", tal como se utiliza aquí, significa los ácidos nucleicos (molécula de ARN o ADN) que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia codificadora puede incluir además señales de iniciación y terminación vinculadas de forma operativa a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero al que se le administre el ácido nucleico.
"Complemento" o "complementario", tal como se utiliza aquí, puede significar un ácido nucleico de Watson-Crick (por ejemplo, A-T/U y C-G) o el emparejamiento de bases de Hoogsteen entre nucleótidos o análogos de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico.
"Electroporación", "electropermeabilización" o "mejora electrocinética" ("EP"), tal y como se utilizan indistintamente en este documento, significa el uso de un pulso de campo eléctrico transmembrana para inducir vías microscópicas (poros) en una biomembrana; su presencia permite que biomoléculas como plásmidos, oligonucleótidos, ARNip, fármacos, iones y agua pasen de un lado a otro de la membrana celular.
"Fragmento" o "fragmento inmunogénico", tal y como se utiliza aquí, significa una secuencia de ácido nucleico o una porción de la misma que codifica un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Los fragmentos pueden ser fragmentos de ADN seleccionados entre al menos una de las diversas secuencias de nucleótidos que codifican fragmentos de proteínas que se exponen a continuación. Los fragmentos pueden comprender al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 95% de una o más de las secuencias de ácido nucleico que se exponen a continuación. En algunas realizaciones, los fragmentos pueden comprender al menos 20 nucleótidos o más, al menos 30 nucleótidos o más, al menos 40 nucleótidos o más, al menos 50 nucleótidos o más, al menos 60 nucleótidos o más, al menos 70 nucleótidos o más, al menos 80 nucleótidos o más, al menos 90 nucleótidos o más, al menos 100 nucleótidos o más, al menos 150 nucleótidos o más, al menos 200 nucleótidos o más, al menos 250 nucleótidos o más, al menos 300 nucleótidos o más, al menos 350 nucleótidos o más, al menos 400 nucleótidos o más, al menos 450 nucleótidos o más, al menos 500 nucleótidos o más, al menos 550 nucleótidos o más, al menos 600 nucleótidos o más, al menos 650 nucleótidos o más, al menos 700 nucleótidos o más, al menos 750 nucleótidos o más, al menos 800 nucleótidos o más, al menos 850 nucleótidos o más, al menos 900 nucleótidos o más, al menos 950 nucleótidos o más, o al menos 1000 nucleótidos o más de al menos una de las secuencias de ácido nucleico establecidas a continuación.
Fragmento o fragmento inmunogénico, tal como se utiliza aquí, también significa una secuencia polipeptídica o una porción de la misma que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Los fragmentos pueden ser fragmentos polipeptídicos seleccionados entre al menos una de las diversas secuencias de aminoácidos que se exponen a continuación. Los fragmentos pueden comprender al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 95% de una o más de las proteínas que se indican a continuación. En algunas realizaciones, los fragmentos pueden comprender al menos 20 aminoácidos o más, al menos 30 aminoácidos o más, al menos 40 aminoácidos o más, al menos 50 aminoácidos o más, al menos 60 aminoácidos o más, al menos 70 aminoácidos o más, al menos 80 aminoácidos o más, al menos 90 aminoácidos o más, al menos 100 aminoácidos o más, al menos 110 aminoácidos o más, al menos 120 aminoácidos o más, al menos 140 aminoácidos o más, al menos 150 aminoácidos o más, al menos 160 aminoácidos o más, al menos 170 aminoácidos o más, al menos 180 aminoácidos o más, al menos 190 aminoácidos o más, al menos 200 aminoácidos o más, al menos 210 aminoácidos o más, al menos 230 aminoácidos o más, o al menos 240 aminoácidos o más de al menos una de las proteínas establecidas a continuación.
El "constructo genético", tal como se utiliza aquí, se refiere a las moléculas de ADN o ARN que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia codificadora incluye señales de iniciación y terminación unidas de forma operativa a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células del individuo al que se le administra la molécula de ácido nucleico. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "forma expresable" se refiere a los constructos genéticos que contienen los elementos reguladores necesarios enlazados a una secuencia codificadora que codifica una proteína de manera que, cuando está presente en la célula del individuo, la secuencia codificadora se expresará.
"Idéntico" o "identidad", tal como se utiliza aquí en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, significa que las secuencias tienen un porcentaje específico de residuos que son iguales en una región específica. El porcentaje puede calcularse alineando óptimamente las dos secuencias, comparando las dos secuencias en la región especificada, determinando el número de posiciones en las que el residuo idéntico aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la región especificada y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia. En los casos en los que las dos secuencias tienen longitudes diferentes o el alineamiento produce uno o más extremos escalonados y la región de comparación especificada incluye una sola secuencia, los residuos de la secuencia única se incluyen en el denominador pero no en el numerador del cálculo. Al comparar el ADN y el ARN, la timina (T) y el uracilo (U) pueden considerarse equivalentes. La identificación puede realizarse manualmente o mediante un algoritmo informático de secuencias como BLAST o BLAST 2.0.
Por "respuesta inmunitaria", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende la activación del sistema inmunitario de un huésped, por ejemplo, el de un mamífero, en respuesta a la introducción de un antígeno. La respuesta inmunitaria puede ser en forma de respuesta celular o humoral, o ambas.
"Ácido nucleico" u "oligonucleótido" o "polinucleótido", tal como se utiliza aquí, significa al menos dos nucleótidos unidos covalentemente. La representación de una sola cadena también define la secuencia de la cadena complementaria. Así, un ácido nucleico también abarca la cadena complementaria de una cadena simple representada. Muchas variantes de un ácido nucleico pueden utilizarse para el mismo fin que un ácido nucleico determinado. Por lo tanto, un ácido nucleico también abarca los ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y sus complementos. Una sola cadena proporciona una sonda que puede hibridarse con una secuencia objetivo en condiciones de hibridación estrictas. Así, un ácido nucleico también abarca una sonda que se hibrida en condiciones de hibridación estrictas.
Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, o pueden contener porciones de secuencia tanto bicatenario como monocatenario. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN, o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribo y ribo-nucleótidos, y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse por procedimientos de síntesis química o por procedimientos recombinantes.
"Unido operativamente", tal como se utiliza aquí, significa que la expresión de un gen está bajo el control de un promotor con el que está conectado espacialmente. Un promotor puede situarse a 5' (corriente arriba) o a 3' (corriente abajo) de un gen bajo su control. La distancia entre el promotor y un gen puede ser aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y el gen que controla en el gen del que deriva el promotor. Como se sabe en la técnica, la variación de esta distancia puede acomodarse sin pérdida de la función del promotor.
Un "péptido", "proteína" o "polipéptido", tal como se utiliza aquí, puede significar una secuencia enlazada de aminoácidos y puede ser natural, sintético o una modificación o combinación de natural y sintético.
Por "promotor", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende una molécula sintética o de origen natural que es capaz de conferir, activar o potenciar la expresión de un ácido nucleico en una célula. Un promotor puede comprender una o más secuencias reguladoras transcripcionales específicas para mejorar aún más la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o temporal de la misma. Un promotor también puede incluir elementos distales potenciadores o represores, que pueden estar situados a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor puede provenir de fuentes como virus, bacterias, hongos, plantas, insectos y animales. Un promotor puede regular la expresión de un componente génico de forma constitutiva o diferencial con respecto a la célula, el tejido u órgano en el que se produce la expresión o, con respecto a la etapa de desarrollo en la que se produce la expresión, o en respuesta a estímulos externos como tensiones fisiológicas, patógenos, iones metálicos o agentes inductores. Ejemplos representativos de promotores incluyen el promotor del bacteriófago T7, el promotor del bacteriófago T3, el promotor SP6, el operador-promotor lac, el promotor tac, el promotor tardío del SV40, el promotor temprano del SV40, el promotor RSV-LTR, el promotor IE del CMV, el promotor temprano del SV40 o el promotor tardío del SV40 y el promotor IE del CMV.
Los términos "péptido señal" y "secuencia líder" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia de aminoácidos que puede unirse en el extremo amino de un antígeno sintético, incluyendo algunos de los ejemplos citados en el presente documento. Los péptidos señalizadores/secuencias líderes suelen dirigir la localización de una proteína. Los péptidos señalizadores/secuencias líderes utilizados en el presente documento facilitan preferentemente la secreción de la proteína desde la célula en la que se produce. Los péptidos señalizadores/secuencias líderes suelen escindirse del resto de la proteína, a menudo denominada proteína madura, al ser secretada por la célula. Los péptidos señalizadores/secuencias líderes se unen en el extremo N de la proteína.
"Sujeto", tal y como se utiliza aquí, puede significar un mamífero que quiere o necesita ser inmunizado con la vacuna aquí descrita. El mamífero puede ser un humano, un chimpancé, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo, un pollo, un ratón o una rata.
"Sustancialmente idéntico", tal como se utiliza en el presente documento, puede significar que una primera y segunda secuencia de aminoácidos son al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,o 99% en una región de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o más aminoácidos. Sustancialmente idéntica también puede significar que una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico son al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,o 99% en una región de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o más nucleótidos.
"Tratamiento" o "tratar", tal como se utiliza aquí, puede significar la protección de un animal de una enfermedad a través de medios de prevención, supresión, represión o eliminación completa de la enfermedad. La prevención de la enfermedad implica la administración de una vacuna de la presente invención a un animal antes de la aparición de la enfermedad. La supresión de la enfermedad implica la administración de una vacuna de la presente invención a un animal después de la inducción de la enfermedad pero antes de su aparición clínica. Reprimir la enfermedad implica administrar una vacuna de la presente invención a un animal después de la aparición clínica de la enfermedad.
"Variante" utilizado aquí con respecto a un ácido nucleico significa (i) una porción o fragmento de una secuencia de nucleótidos de referencia; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos de referencia o una porción de la misma; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico de referencia o al complemento del mismo; o (iv) un ácido nucleico que hibrida en condiciones estrictas con el ácido nucleico de referencia, el complemento del mismo, o una secuencia sustancialmente idéntica.
La variante puede definirse además como un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, supresión o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que conserva al menos una actividad biológica. Ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a un anticuerpo específico o de promover una respuesta inmunitaria. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína de referencia con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, la sustitución de un aminoácido por otro de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad, grado y distribución de las regiones cargadas) se reconoce en la técnica como algo que típicamente implica un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, tal como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en la consideración de su hidrofobicidad y su carga. Se sabe en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden ser sustituidos y seguir conservando la función proteica. En un aspecto, se sustituyen aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. La hidrofilicidad de los aminoácidos también puede utilizarse para revelar las sustituciones que harían que las proteínas conservaran su función biológica. La consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite calcular la mayor hidrofilicidad media local de ese péptido, una medida útil que, según se ha informado, se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. La sustitución de aminoácidos con valores de hidrofilicidad similares puede dar lugar a que los péptidos conserven la actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones pueden realizarse con aminoácidos que tengan valores de hidrofilicidad dentro de un margen de ±2. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influidos por la cadena lateral concreta de ese aminoácido. En consonancia con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos y, en particular, de las cadenas laterales de esos aminoácidos, tal y como revelan la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la carga, el tamaño y otras propiedades.
Una variante puede ser una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica en toda la longitud de la secuencia genética completa o en un fragmento de la misma. La secuencia de ácido nucleico puede ser 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica en toda la longitud de la secuencia genética o de un fragmento de la misma. Una variante puede ser una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos o en un fragmento de la misma. La secuencia de aminoácidos puede ser 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos o en un fragmento de la misma
"Vector", tal como se utiliza aquí, significa una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un vector viral, un bacteriófago, un cromosoma artificial bacteriano o un cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser de ADN o de ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico autorreplicante y, preferentemente, es un plásmido de ADN.
Para la citación de intervalos numéricos en el presente documento, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.
2. Vacuna
Se proporcionan aquí vacunas que comprenden un antígeno e inhibidores de puntos de control, preferentemente anticuerpos inhibidores de puntos de control. Los anticuerpos son preferentemente el anticuerpo TIM-3. En parte de la divulgación, pero no de la invención los anticuerpos son el anticuerpo PD1, el anticuerpo PDL1 y/o el anticuerpo LAG-3. La combinación puede ser una formulación única o puede estar separada y administrarse en secuencia (primero el antígeno y luego el inhibidor de puntos de control, o primero el inhibidor de puntos de control y luego el antígeno). La vacuna puede aumentar la presentación del antígeno y la respuesta inmunitaria general al antígeno en un sujeto. La combinación de antígeno e inhibidor de puntos de control induce el sistema inmunitario de forma más eficaz que una vacuna compuesta únicamente por el antígeno. Esta respuesta inmune más eficiente proporciona una mayor eficacia en el tratamiento y/o prevención de cualquier enfermedad, en particular el cáncer, el patógeno o el virus.
El antígeno y los inhibidores del punto de control, preferentemente el anticuerpo TIM-3, de la vacuna pueden administrarse juntos o por separado al sujeto que los necesite. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno y los inhibidores del punto de control, son el anticuerpo PD1, el anticuerpo PDL1, y/o el anticuerpo LAG-3, de la vacuna pueden administrarse juntos o por separado al sujeto que los necesite. En algunos casos, los inhibidores del punto de control pueden administrarse por separado del antígeno de la vacuna.
En algunas realizaciones, los inhibidores del punto de control pueden administrarse al menos una hora, dos horas, tres horas, cuatro horas, cinco horas, seis horas, siete horas, ocho horas, nueve horas, diez horas, once horas, doce horas, trece horas, catorce horas, quince horas, dieciséis horas, diecisiete horas, dieciocho horas, veinte horas, veintiuna horas, veintidós horas, veintitrés horas, veinticuatro horas, treinta y seis horas, cuarenta y ocho horas, sesenta horas, setenta y dos horas, ochenta y cuatro horas o noventa y seis horas antes o después de la administración del antígeno al sujeto. En otras realizaciones, el anticuerpo PD1 o el anticuerpo PDL1 puede administrarse al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 60 días o 90 días antes o después de la administración del antígeno al sujeto.
En otras realizaciones, los inhibidores del punto de control pueden administrarse al menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas o 15 semanas antes o después de la administración del antígeno al sujeto. En otras realizaciones, el anticuerpo PD1 o el anticuerpo PDL1 puede administrarse entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 15 semanas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 10 semanas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 5 semanas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 1 semana, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 60 horas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 48 horas, entre aproximadamente 24 horas y aproximadamente 15 semanas, entre aproximadamente 60 horas y aproximadamente 15 semanas, entre aproximadamente 96 horas y aproximadamente 15 semanas, de 1 día a 15 semanas, de 5 días a 15 semanas, de 10 días a 15 semanas, de 15 días a 15 semanas, de 20 días a 15 semanas, de 25 días a 15 semanas, de 30 días a 15 semanas, de 1 semana a 15 semanas, de 5 semanas a 15 semanas o de 10 semanas a 15 semanas antes o después de la administración del antígeno al sujeto.
La vacuna de la presente invención puede tener las características requeridas de las vacunas efectivas, tales como ser segura para que la vacuna en sí misma no cause enfermedad o muerte; ser protectora contra la enfermedad resultante de la exposición a patógenos vivos tales como virus o bacterias; inducir anticuerpos neutralizantes para prevenir la infección de las células; inducir células T protectoras contra patógenos intracelulares; y proporcionar facilidad de administración, pocos efectos secundarios, estabilidad biológica y bajo coste por dosis. Como parte de la invención, la vacuna puede lograr algunas o todas estas características combinando el antígeno con los inhibidores del punto de control, preferentemente el anticuerpo TIM-3 como se discute a continuación. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, la vacuna puede lograr algunas o todas estas características combinando el antígeno con los inhibidores del punto de control, el anticuerpo PD1, el anticuerpo PDL1 y/o el anticuerpo LAG-3 como se discute a continuación.
La vacuna puede modificar además la presentación del epítopo dentro del antígeno para inducir una mayor respuesta inmunitaria al antígeno que una vacuna que comprenda el antígeno solo. La vacuna puede inducir además una respuesta inmunitaria cuando se administra en diferentes tejidos, como el músculo o la piel.
a. Inhibidores del punto de control
Los inhibidores de puntos de control pueden ser cualquier antagonista de los diversos puntos de control inmunitarios, y son preferentemente anticuerpos que bloquean los puntos de control inmunitarios. Los anticuerpos pueden ser una proteína que incluya un Fab, monoclonal o policlonal. Los anticuerpos también pueden ser un constructo de expresión de ADN que codifica y puede expresar anticuerpos funcionales. Como parte de la invención, la vacuna puede comprender además un anticuerpo TIM-3. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, la vacuna puede comprender además un anticuerpo LAG-3. El anticuerpo puede ser un anticuerpo sintético compuesto por una secuencia de ADN que codifica al menos las regiones variables de una inmunoglobulina. Dicho anticuerpo puede generarse mediante la identificación o el cribado del anticuerpo descrito anteriormente, que es reactivo o se une al antígeno descrito anteriormente. El procedimiento de identificación o cribado del anticuerpo puede utilizar el antígeno en metodologías conocidas por los expertos en la materia para identificar o cribado del anticuerpo. Dichas metodologías pueden incluir, pero no se limitan a, la selección del anticuerpo a partir de una biblioteca (por ejemplo, visualización de fagos) y la inmunización de un animal seguida del aislamiento y/o purificación del anticuerpo. Véanse, por ejemplo, los procedimientos disponibles en Rajan, S., y Sidhu, S., Methods in Enzymology, vol 502, Capítulo Uno "Simplified Synthetic Antibody Libraries (2012).
Los anticuerpos TIM-3 y LAG-3 también pueden combinarse con otros anticuerpos inhibidores de puntos de control, incluyendo también PD1, PDL1, CTLA4, CD40 y otros. Los inhibidores de puntos de control pueden ser un producto conocido como, por ejemplo, nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, BMS-936559 (véase ClinicalTrials.gov Identifier NCT02028403), MPDL3280A (Roche, véase ClinicalTrials.gov Identifier NCT02008227), MDX1105-01 (Bristol Myers Squibb, véase ClinicalTrials.gov Identifier NCT00729664), MEDI4736 (MedImmune, véase ClinicalTrials.gov Identifier NCT01693562), y MK-3475 (Merck, véase ClinicalTrials.gov Identifier NCT02129556).
Anticuerpo sintético (forma de ADN)
El anticuerpo puede estar codificado por una secuencia de ácido nucleico (cDNA) que codifica para los elementos siguientes:
El anticuerpo puede incluir un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera. El polipéptido de cadena pesada puede incluir una región de cadena pesada variable (VH) y/o al menos una región de cadena pesada constante (CH). La al menos una región de cadena pesada constante puede incluir una región de cadena pesada constante 1 (CH1), una región de cadena pesada constante 2 (CH2), y una región de cadena pesada constante 3 (CH3), y/o una región bisagra.
En algunas realizaciones, el polipéptido de cadena pesada puede incluir una región VH y una región CH1. En otras realizaciones, el polipéptido de cadena pesada puede incluir una región VH, una región CH1, una región bisagra, una región CH2 y una región CH3.
El polipéptido de cadena pesada puede incluir un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad ("CDR"). El conjunto CDR puede contener tres regiones hipervariables de la región VH. Partiendo del N-terminal del polipéptido de la cadena pesada, estas CDR se denominan "CDR1", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Las CDR1, CDR2 y CDR3 del polipéptido de la cadena pesada pueden contribuir a la unión o al reconocimiento del antígeno.
El polipéptido de cadena ligera puede incluir una región de cadena ligera variable (VL) y/o una región de cadena ligera constante (CL). El polipéptido de cadena ligera puede incluir un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad ("CDR"). El conjunto CDR puede contener tres regiones hipervariables de la región VL. Partiendo del N-terminal del polipéptido de la cadena ligera, estas CDR se denominan "CDR1", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Las CDR1, CDR2 y CDR3 del polipéptido de la cadena ligera pueden contribuir a la unión o al reconocimiento del antígeno.
El anticuerpo puede comprender un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") de la cadena pesada y de la cadena ligera, respectivamente interpuestas entre un conjunto de marco ("FR") de la cadena pesada y de la cadena ligera que proporcionan soporte a las CDR y definen la relación espacial de las CDR entre sí. El conjunto de CDR puede contener tres regiones hipervariables de una región V de la cadena pesada o ligera. Partiendo del extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones se denominan "CDR1", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, puede incluir seis CDRs, comprendiendo el conjunto de CDRs de cada una de las regiones V de la cadena pesada y ligera.
El anticuerpo puede ser una inmunoglobulina (Ig). Las Ig pueden ser, por ejemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. La inmunoglobulina puede incluir el polipéptido de cadena pesada y el polipéptido de cadena ligera. El polipéptido de cadena pesada de la inmunoglobulina puede incluir una región VH, una región CH1, una región bisagra, una región CH2 y una región CH3. El polipéptido de cadena ligera de la inmunoglobulina puede incluir una región VL y una región CL.
Además, la enzima proteolítica papaína escinde preferentemente las moléculas de IgG para producir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión al antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir las moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluido el fragmento F(ab')2 , que comprende los dos sitios de unión al antígeno. En consecuencia, el anticuerpo puede ser el Fab o el F(ab')2. El Fab puede incluir el polipéptido de cadena pesada y el polipéptido de cadena ligera. El polipéptido de cadena pesada del Fab puede incluir la región VH y la región CH1. La cadena ligera del Fab puede incluir la región VL y la región CL.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo totalmente humano. El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo de una especie no humana que se une al antígeno deseado con una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana.
b. Antígeno
La vacuna también puede comprender un antígeno, o un fragmento o variante del mismo. El antígeno puede ser cualquier cosa que induzca una respuesta inmunitaria en un sujeto. Como parte de la invención, el antígeno puede ser una secuencia de ácido nucleico. Como parte de la invención, la secuencia de ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno puede ser una secuencia de aminoácidos, o una combinación de una secuencia de aminoácidos y una secuencia de ácidos nucleicos. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, la secuencia de ácido nucleico puede ser ARN, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de ARN con ADN y/o ADNc. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir secuencias adicionales que codifican secuencias enlazadoras o de etiqueta que se unen al antígeno mediante un enlace peptídico. La secuencia de aminoácidos puede ser una proteína, un péptido, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos.
El antígeno puede estar contenido en una proteína, un ácido nucleico, o un fragmento del mismo, o una variante del mismo, o una combinación de los mismos de cualquier número de organismos, por ejemplo, un virus, un parásito, una bacteria, un hongo o un mamífero. El antígeno puede estar asociado a una enfermedad autoinmune, una alergia o un asma. En otras realizaciones, el antígeno puede estar asociado con el cáncer, el herpes, la gripe, la hepatitis B, la hepatitis C, el virus del papiloma humano (VPH) o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Preferentemente, el antígeno puede estar asociado a la gripe o al VIH.
Algunos antígenos pueden inducir una fuerte respuesta inmunitaria. Otros antígenos pueden inducir una respuesta inmunitaria débil. El antígeno puede provocar una mayor respuesta inmunitaria cuando se combina con el anticuerpo PD1 o el anticuerpo PDL1, como se ha descrito anteriormente.
(1) Antígenos virales
El antígeno puede ser un antígeno viral, o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno viral puede ser de un virus de una de las siguientes familias: Adenoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae o Togaviridae. Como parte de la invención, el antígeno viral puede ser de los virus del papiloma, por ejemplo, el virus del papiloma humano (VPH), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), los virus de la hepatitis, por ejemplo, el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la gripe, el virus sincitial respiratorio (VSR), el herpes simple 1 (herpes oral), el herpes simple 2 (herpes genital), el herpes zoster (varicela-zóster, también conocida como, varicela), citomegalovirus (CMV), por ejemplo el humano, o virus causantes de cáncer. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno viral puede ser del virus de la poliomielitis, del virus de la hepatitis A (VHA), del virus de la hepatitis D (VHD) y del virus de la hepatitis E (VHE), del virus de la viruela (Variola mayor y menor), del virus de la vaccinia, de los rinovirus, del virus del dengue, de los virus de la encefalitis equina, del virus de la rubéola, del virus de la fiebre amarilla, Virus Norwalk, virus de la leucemia humana de células T (HTLV-I), virus de la leucemia de células pilosas (HTLV-II), virus de la encefalitis de California, virus Hanta (fiebre hemorrágica), virus de la rabia, virus de la fiebre de Ébola, virus de Marburgo, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de Epstein-Barr (EBV), flavivirus, virus de la fiebre aftosa, virus chikungunya, virus Lassa o arenavirus.
(a) Antígeno de la hepatitis
Los inhibidores del punto de control pueden asociarse o combinarse con un antígeno del virus de la hepatitis (es decir, el antígeno de la hepatitis), o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. Como parte de la invención, el antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno o inmunógeno del virus de la hepatitis B (VHB), y/o del virus de la hepatitis C (VHC). Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno o inmunógeno del virus de la hepatitis A (VHA), del virus de la hepatitis D (VHD) y/o del virus de la hepatitis E (VHE). En algunas realizaciones de la invención, el antígeno de la hepatitis puede ser una molécula(s) de ácido nucleico, como un plásmido(s), que codifica uno o más de los antígenos del VHB y del VHC. En algunas realizaciones de la divulgación, pero que no forman parte de la invención, el antígeno de la hepatitis puede ser una molécula(s) de ácido nucleico, como un plásmido(s), que codifica uno o más de los antígenos del VHA, el VHD y el VHE. El antígeno de la hepatitis puede ser de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de proteínas de longitud completa.
El antígeno de la hepatitis puede comprender secuencias de consenso y/o modificación para mejorar la expresión. Las modificaciones genéticas que incluyen la optimización de codones, la optimización del ARN y la adición de una secuencia líder de inmunoglobulina de alta eficiencia para aumentar la inmunogenicidad de los constructos pueden incluirse en las secuencias consenso modificadas. El antígeno de consenso de la hepatitis puede comprender un péptido señal, como un péptido señal de inmunoglobulina, como un péptido señal de IgE o IgG, y en algunas realizaciones, puede comprender una etiqueta HA. Los inmunógenos pueden diseñarse para provocar respuestas inmunitarias celulares más fuertes y amplias que los correspondientes inmunógenos optimizados por el codón.
Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHA. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la cápside del VHA, una proteína no estructural del VHA, un fragmento de la misma, una variante de la misma o una combinación de las mismas.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHC. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la nucleocápside del v Hc (es decir, la proteína del núcleo), una proteína de la envoltura del VHC (por ejemplo, E1 y E2), una proteína no estructural del VHC (por ejemplo, NS1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b), un fragmento de la misma, una variante de la misma o una combinación de las mismas.
Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHD. El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno delta del VHD, un fragmento del mismo o una variante del mismo.
Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHE. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la cápside del VHE, un fragmento del mismo o una variante del mismo.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHB. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína del núcleo del VHB, una proteína de superficie del VHB, una ADN polimerasa del VHB, una proteína del VHB codificada por el gen X, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína del núcleo del VHB del genotipo A, una proteína del núcleo del VHB del genotipo B, una proteína del núcleo del VHB del genotipo C, una proteína del núcleo del VHB del genotipo D, una proteína del núcleo del VHB del genotipo E, una proteína del núcleo del VHB del genotipo F, una proteína del núcleo del VHB del genotipo H, una proteína de superficie del VHB del genotipo A, una proteína de superficie del VHB del genotipo B, una proteína de superficie del VHB del genotipo C, una proteína de superficie del v Hb del genotipo D, una proteína de superficie del VHB del genotipo E, una proteína de superficie del VHB del genotipo F, una proteína de superficie del VHB del genotipo G, una proteína de superficie del VHB del genotipo H, un fragmento de la misma, una variante de la misma o una combinación de las mismas. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína del núcleo del VHB de consenso, o una proteína de superficie del VHB de consenso.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo A del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia de consenso de la proteína de núcleo del genotipo A del VHB o una secuencia de proteína de núcleo de consenso del genotipo A del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo B del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína central del genotipo B del VHB o una secuencia de proteína central consenso del genotipo B del VHB.
En todavía otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo C del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína central del genotipo C del VHB, o una secuencia de proteína central consenso del genotipo C del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo D del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo D del VHB o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo D del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo E del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo E del VHB, o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo E del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo F del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo F del VHB o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo F del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo G del VHB, una secuencia líder de IgE unida a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo G del VHB o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo G del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo H del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo H del VHB, o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo H del VHB.
En todavíía otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo A del VHB, una secuencia líder de IgE unida a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo A del VHB, o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo A del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del VHB del genotipo B, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del VHB del genotipo B, o una secuencia de proteína de superficie consenso del VHB del genotipo B.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del VHB del genotipo C, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del VHB del genotipo C, o una secuencia de proteína de superficie consenso del VHB del genotipo C.
En todavía otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo D del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo D del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo D del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo E del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo E del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo E del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo F del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo F del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo F del VHB.
En todavía otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo G del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo G del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo G del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo H del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo H del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo H del VHB.
(b) Antígeno del virus del papiloma humano (VPH)
los inhibidores del punto de control pueden asociarse o combinarse con un antígeno del virus del papiloma humano (VPH), o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno del VPH puede ser de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 y 58, que causan cáncer de cuello uterino, cáncer de recto y/u otros cánceres. El antígeno del VPH puede ser de los tipos 6 y 11 del VPH, que causan verrugas genitales, y se sabe que son causas de cáncer de cabeza y cuello.
Los antígenos del VPH pueden ser los dominios E6 o E7 de cada tipo de VPH. Por ejemplo, para el VPH tipo 16 (VPH16), el antígeno del VPH16 puede incluir el antígeno E6 del v Ph 16, el antígeno E7 del VPH16, fragmentos, variantes o combinaciones de los mismos. Del mismo modo, el antígeno del VPH puede ser el VPH 6 E6 y/o E7, el VPH 11 E6 y/o E7, el VPH 18 E6 y/o E7, el VPH 31 E6 y/o E7, el VPH 33 E6 y/o E7, el VPH 52 E6 y/o E7, o el VPH 58 E6 y/o e 7, fragmentos, variantes o combinaciones de los mismos.
(c) Antígeno del VRS
Los inhibidores del punto de control también pueden asociarse o combinarse con un antígeno del VRS o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno del VRS puede ser una proteína de fusión del VRS humano (también denominada en el presente documento "VRS F", "proteína F del VRS" y "proteína F"), o un fragmento o variante del mismo. La proteína de fusión del VRS humano puede estar conservada entre los subtipos A y B del VRS. El antígeno del VRS puede ser una proteína F del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23994.1). El antígeno del VRS puede ser una proteína F del VRS de la cepa A2 del v Rs (GenBank AAB59858.1), o un fragmento o variante del mismo. El antígeno del VRS puede ser un monómero, un dímero o un trímero de la proteína F del VRS, o un fragmento o variante del mismo. El antígeno del VRS puede ser una secuencia optimizada de aminoácidos del VRS F, o un fragmento o variante del mismo.
La forma de postfusión del VRS F provoca anticuerpos neutralizantes de alto título en los animales inmunizados y protege a los animales de la exposición al VRS. La presente invención utiliza esta inmunorespuesta en las vacunas reivindicadas. Según la invención, la proteína RSV F puede estar en una forma de prefusión o forma de postfusión.
El antígeno del VRS también puede ser la glicoproteína de fijación del VRS humano (también denominada aquí "VRS G", "proteína G del VRS" y "proteína G"), o un fragmento o variante de la misma. La proteína G del VRS humano difiere entre los subtipos A y B del VRS. El antígeno puede ser la proteína G del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23993). El antígeno del VRS puede ser la proteína G del VRS del subtipo B aislado H5601, del subtipo B aislado H1068, del subtipo B aislado H5598, del subtipo B aislado HI 123, o un fragmento o variante del mismo. El antígeno del VRS puede ser una secuencia de aminoácidos optimizada del VRS G, o un fragmento o variante del mismo.
En otras realizaciones, el antígeno del VRS puede ser la proteína no estructural 1 del VRS humano ("proteína NS1"), o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína NS1 del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23987.1). El antígeno humano del VRS también puede ser la proteína no estructural 2 del VRS ("proteína NS2"), o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína NS2 del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23988.1). El antígeno del VRS puede ser además la proteína de la nucleocápside ("N") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína N del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23989.1). El antígeno del VRS puede ser la proteína fosfoproteína ("P") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína P del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23990.1). El antígeno del VRS también puede ser la proteína de la matriz ("M") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína M del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23991.1).
En todavía otras realizaciones, el antígeno del VRS puede ser la proteína hidrófoba pequeña ("SH") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína SH del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23992.1). El antígeno del VRS también puede ser la proteína de la matriz 2-1 ("M2-1") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína RSV M2-1, o un fragmento o variante de la misma, de la cepa RSV Long (GenBank AAX23995.1). El antígeno del VRS puede ser además la proteína de la matriz 2-2 ("M2-2") del Vr S humano, o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína M2-2 del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23997.1). El antígeno humano del VRS puede ser la proteína Polimerasa L ("L") del VRS, o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína L del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23996.1).
En otras realizaciones, el antígeno del VRS puede tener una secuencia de aminoácidos optimizada de las proteínas NS1, NS2, N, P, M, SH, M2-1, M2-2 o L. El antígeno del VRS puede ser una proteína humana del VRS o un antígeno recombinante, como cualquiera de las proteínas codificadas por el genoma del VRS humano.
En otras realizaciones, el antígeno RSV puede ser, pero no se limita a, la proteína RSV F de la cepa RSV Long, la proteína RSV G de la cepa RSV Long, la secuencia de aminoácidos RSV G optimizada, el genoma RSV humano de la cepa RSV Long, la secuencia de aminoácidos optimizada de RSV F, la proteína RSV NS1 de la cepa RSV Long, la proteína RSV NS2 de la cepa RSV Long, la proteína RSV N de la cepa r Sv Long, la proteína RSV P de la cepa RSV Long, la proteína M del VRS de la cepa larga del VRS, la proteína SH del VRS de la cepa larga del VRS, la proteína M2-1 del VRS de la cepa larga del v Rs , la proteína M2-2 del VRS de la cepa larga del VRS, la proteína L del VRS de la cepa larga del VRS, la proteína G del VRS de la cepa aislada H5601 del subtipo B del VRS, la proteína G del VRS de la cepa aislada H1068 del subtipo B del VRS, la proteína G del VRS de la cepa aislada H5598 del subtipo B del VRS, la proteína G del VRS de la cepa aislada H1123 del subtipo B del VRS, o sus fragmentos o variantes.
(d) Antígeno de la gripe
Los inhibidores del punto de control pueden asociarse o combinarse con un antígeno de la gripe o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. Los antígenos de la gripe son aquellos capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más serotipos de la gripe. El antígeno puede comprender el producto de traducción de longitud completa HA0, la subunidad hA 1, la subunidad HA2, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. El antígeno de la hemaglutinina de la gripe puede ser una secuencia consenso derivada de múltiples cepas del serotipo H1 de la gripe A, una secuencia consenso derivada de múltiples cepas del serotipo H2 de la gripe A, una secuencia híbrida que contenga porciones de dos secuencias consenso diferentes derivadas de conjuntos diferentes de múltiples cepas del serotipo HI de la gripe A o una secuencia consenso derivada de múltiples cepas de la gripe B.
El antígeno de la gripe también puede contener al menos un epítopo antigénico que puede ser eficaz contra determinados inmunógenos de la gripe contra los que se puede inducir una respuesta inmunitaria. El antígeno puede proporcionar un repertorio completo de sitios inmunogénicos y epítopos presentes en un virus de la gripe intacto. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina de consenso que puede derivarse de secuencias de antígeno de hemaglutinina de una pluralidad de cepas del virus de la gripe A de un serotipo, como una pluralidad de cepas del virus de la gripe A del serotipo HI o del serotipo H2. El antígeno puede ser una secuencia híbrida de antígeno de hemaglutinina de consenso que puede derivarse de la combinación de dos secuencias diferentes de antígeno de hemaglutinina de consenso o de porciones de las mismas. Cada una de las dos secuencias de antígeno de hemaglutinina consenso diferentes puede derivarse de un conjunto diferente de una pluralidad de cepas del virus de la gripe A de un serotipo, como una pluralidad de cepas del virus de la gripe A del serotipo HI. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina de consenso que puede derivarse de secuencias de antígeno de hemaglutinina de una pluralidad de cepas del virus de la gripe B.
En algunas realizaciones, el antígeno de la gripe puede ser HI HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA o un antígeno BHA. Alternativamente, el antígeno de la gripe puede ser un antígeno de hemaglutinina consenso que comprende una secuencia de aminoácidos consenso HI o una secuencia de aminoácidos consenso H2. El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una secuencia HI consenso híbrida sintética que comprende porciones de dos secuencias HI consenso diferentes, cada una de ellas derivada de un conjunto de secuencias diferente de la otra. Un ejemplo de antígeno consenso de HA que es una proteína híbrida sintética consenso de HI es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos U2. El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína de hemaglutinina consenso derivada de secuencias de hemaglutinina de cepas de gripe B, como una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos consenso BHA.
El antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además uno o más elementos de secuencia de aminoácidos adicionales. El antígeno de hemaglutinina de consenso puede comprender además en su N-terminal una secuencia de aminoácidos líder de IgE o IgG. El antígeno de hemaglutinina de consenso puede comprender además una etiqueta inmunogénica que es un epítopo inmunogénico único que puede ser detectado por anticuerpos fácilmente disponibles. Un ejemplo de tal etiqueta inmunogénica es la etiqueta hA de la gripe de 9 aminoácidos que puede estar unida en el extremo C de la hemaglutinina de consenso. En algunas realizaciones, el antígeno hemaglutinina de consenso puede comprender además en su N-terminal una secuencia de aminoácidos líder de IgE o IgG y en su C-terminal una etiqueta HA.
El antígeno de hemaglutinina de consenso puede ser una proteína de hemaglutinina de consenso que consiste en secuencias de aminoácidos de gripe consensuadas o fragmentos y variantes de las mismas. El antígeno de hemaglutinina de consenso puede ser una proteína de hemaglutinina de consenso que comprenda secuencias de proteínas no relacionadas con la gripe y secuencias de proteínas de la gripe o fragmentos y variantes de las mismas.
Entre los ejemplos de una proteína HI de consenso se incluyen los que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos HI de consenso o los que comprenden además elementos adicionales como una secuencia líder de IgE, o una etiqueta HA o tanto una secuencia líder de IgE como una etiqueta HA.
Entre los ejemplos de proteínas H2 consensuadas se incluyen las que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos H2 de consenso o las que comprenden además una secuencia líder de IgE, o una etiqueta de HA, o tanto una secuencia líder de IgE como una etiqueta de HA.
Los ejemplos de proteínas híbridas consenso HI incluyen las que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos consenso U2 o las que comprenden además una secuencia líder IgE, o una etiqueta HA, o ambas, una secuencia líder IgE y una etiqueta HA.
Entre los ejemplos de proteínas híbridas de hemaglutinina de la gripe B de consenso se incluyen las que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos de BHA de consenso o pueden comprender una secuencia líder de IgE, o una etiqueta de HA, o tanto una secuencia líder de IgE como una etiqueta de HA.
La proteína hemaglutinina consenso puede ser codificada por un ácido nucleico de hemaglutinina consenso, una variante del mismo o un fragmento del mismo. A diferencia de la proteína hemaglutinina de consenso, que puede ser una secuencia de consenso derivada de una pluralidad de diferentes secuencias de hemaglutinina de diferentes cepas y variantes, el ácido nucleico de la hemaglutinina de consenso se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de proteína de consenso y las secuencias de codificación utilizadas pueden diferir de las utilizadas para codificar las secuencias de aminoácidos particulares en la pluralidad de diferentes secuencias de hemaglutinina de las que se deriva la secuencia de proteína de hemaglutinina de consenso. La secuencia de ácido nucleico consenso puede estar optimizada en cuanto a codones y/o ARN.
La secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso puede comprender una secuencia de Kozak en la región no traducida de 5'. La secuencia de ácido nucleico consenso de la hemaglutinina puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia líder. La secuencia codificadora de una secuencia líder terminal N está a 5' de la secuencia codificadora de la hemaglutinina. El líder N-terminal puede facilitar la secreción. El líder N-terminal puede ser un líder IgE o un líder IgG. La secuencia de ácido nucleico consenso de la hemaglutinina puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican una etiqueta inmunogénica. La etiqueta inmunogénica puede estar en el extremo C de la proteína y la secuencia que la codifica está a 3' de la secuencia codificadora de la HA. La etiqueta inmunogénica proporciona un epítopo único para el que existen anticuerpos fácilmente disponibles, de modo que dichos anticuerpos pueden utilizarse en ensayos para detectar y confirmar la expresión de la proteína. La etiqueta inmunogénica puede ser una etiqueta H en el extremo C de la proteína.
(e) Antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Los inhibidores del punto de control pueden asociarse o combinarse con un antígeno del VIH o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. Los antígenos del VIH pueden incluir secuencias de consenso modificadas para los inmunógenos. Las modificaciones genéticas que incluyen la optimización de codones, la optimización del ARN y la adición de una secuencia líder de inmunoglobina de alta eficiencia para aumentar la inmunogenicidad de los constructos pueden incluirse en las secuencias consenso modificadas. Los nuevos inmunógenos pueden diseñarse para provocar respuestas inmunitarias celulares más fuertes y amplias que los correspondientes inmunógenos optimizados por codones.
En algunas realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo A, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de la envoltura del subtipo A, o una secuencia de proteína de la envoltura consenso del subtipo A.
En otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo B, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de la envoltura del subtipo B, o una secuencia de proteína de la envoltura consenso del subtipo B.
En todavía otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo C, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo C, o una secuencia de proteína de la envoltura consenso del subtipo C.
En otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de envoltura consenso del subtipo D, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso para la proteína de envoltura del subtipo D, o una secuencia de proteína de envoltura consenso del subtipo D.
En algunas realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de envoltura consenso del subtipo B Nef-Rev, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso para la proteína del subtipo B Nef-Rev, o una secuencia de proteína consenso del subtipo B Nef-Rev.
En otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN consenso de Gag del subtipo A, B, C y D, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína del subtipo A, B, C y D de Gag, o una secuencia de proteína consenso de Gag del subtipo A, B, C y D.
En todavía otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser una secuencia de ADN MPol o una secuencia de proteína MPol. El antígeno del VIH puede ser ácido nucleico o secuencias de aminoácidos de Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag, o cualquier combinación de ellos.
(f) ANTÍGENOS DEL HERPES, INCLUIDOS EL HCMV, EL HSV1, EL HSV2, EL CEHV1 Y EL VZV
Los antígenos herpéticos comprenden proteínas inmunogénicas que incluyen gB, gM, gN, gH, gL, gO, gE, gI, gK, gC, gD, UL128, UL130, UL-131A, UL-83 (pp65), ya sea de HCMV, HSV1, HSV2, CeHV1 o VZV. En algunas realizaciones, los antígenos pueden ser HSV1-gH, HSV1-gL, HSV1-gC, HSV1-gD, HSV2-gH, HSV2-gL, HSV2-gC, HSV2-gD, VZV-gH, VZV-gL, VZV-gM, VZV-gN, CeHV1-gH, CeHV1-gL, CeHV1-gC, CeHV1-gD, VZV-gE o VZV-gI.
(2) Antígenos de parásitos
Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno puede ser un antígeno parasitario o un fragmento o variante del mismo. El parásito puede ser un protozoo, un helminto o un ectoparásito. El helminto (es decir, el gusano) puede ser un gusano plano (por ejemplo, las lombrices y las tenias), un gusano con cabeza de espina o un gusano redondo (por ejemplo, los oxiuros). Los ectoparásitos pueden ser piojos, pulgas, garrapatas y ácaros.
El parásito puede ser cualquier parásito que cause las siguientes enfermedades: Queratitis por Acanthamoeba, Amebiasis, Ascariasis, Babesiosis, Balantidiasis, Baylisascariasis, Enfermedad de Chagas, Clonorquiasis, Cochliomyia, Criptosporidiosis, Difilobotriasis, Dracunculiasis, Equinococosis, Elefantiasis, Enterobiasis, Fascioliasis, Fasciolopsiasis, Filariasis, Giardiasis, Gnatostomiasis, Himenolepiasis, Isosporiasis, Fiebre de Katayama, Leishmaniasis, Enfermedad de Lyme, Paludismo, Metagonimiasis, Miasis, Oncocercosis, Pediculosis, Sarna, Esquistosomiasis, Enfermedad del sueño, Estrongiloidiasis, Taeniasis, Toxocariasis, Toxoplasmosis, Triquinosis y Triquuriasis.
El parásito puede ser Acanthamoeba, Anisakis, Ascaris lumbricoides, Botfly, Balantidium coli, Bedbug, Cestoda (tenia), Chiggers, Cochliomyia hominivorax, Entamoeba histolytica, Fasciola hepatica, Giardia lamblia, Hookworm, Leishmania, Linguatula serrata , Tenia del hígado, Loa loa, Paragonimus - Tenia del pulmón, Oxiuros, Plasmodium falciparum, Schistosoma, Strongyloides stercoralis, Ácaros, Tenia, Toxoplasma gondii, Tripanosoma, Látigo o Wuchereria bancrofti.
(a) Antígeno de la malaria
Los inhibidores del punto de control pueden asociarse o combinarse con un antígeno de la malaria (es decir, el antígeno PF o el inmunógeno PF), o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno puede proceder de un parásito causante de la malaria. El parásito causante del paludismo puede ser el Plasmodium falciparum. El antígeno de Plasmodium falciparum puede incluir el antígeno del circunsporozoito (CS).
En algunas realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser moléculas de ácido nucleico como plásmidos que codifican uno o más de los inmunógenos de P. falciparum CS; LSA1; TRAP; CelTOS; y Amal. Los inmunógenos pueden ser de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de proteínas de longitud completa. Los inmunógenos comprenden secuencias de consenso y/o modificaciones para mejorar la expresión.
En otras realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser una secuencia consenso de TRAP, que también se denomina SSP2, diseñada a partir de una compilación de todas las secuencias de longitud completa de TRAP/SSP2 de Plasmodium falciparum en la base de datos GenBank (28 secuencias en total). Los inmunógenos TRAP de consenso (es decir, el inmunógeno ConTRAP) pueden comprender un péptido señal como un péptido señal de inmunoglobulina como un péptido señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, pueden comprender una etiqueta HA.
En otras realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser CelTOS, que también se denomina Ag2 y es un antígeno de Plasmodium altamente conservado. Los antígenos CelTOS de consenso (es decir, el inmunógeno ConCelTOS) pueden comprender un péptido señal como un péptido señal de inmunoglobulina como un péptido señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, pueden comprender una etiqueta HA.
En otras realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser Ama1, que es un antígeno de Plasmodium altamente conservado. El antígeno de la malaria también puede ser una secuencia consenso de Ama1 (es decir, el inmunógeno ConAmaI) que comprende, en algunos casos, un péptido señal como un péptido señal de inmunoglobulina como un péptido señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, puede comprender una etiqueta HA.
En algunas realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser un antígeno CS de consenso (es decir, inmunógeno CS de consenso) que comprende en algunos casos, un péptido señal como un péptido señal de inmunoglobulina como un péptido señal de IgE o IgG y en algunas realizaciones, puede comprender una etiqueta HA.
En otras realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser una proteína de fusión que comprende una combinación de dos o más de las proteínas PF establecidas en el presente documento. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden comprender dos o más del inmunógeno Consenso CS, el inmunógeno ConLSA1, el inmunógeno ConTRAP, el inmunógeno ConCelTOS y el inmunógeno ConAma1 unidos directamente adyacentes entre sí o unidos con un espaciador o uno o más aminoácidos entre ellos. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende dos inmunógenos PF; en algunas realizaciones la proteína de fusión comprende tres inmunógenos PF, en algunas realizaciones la proteína de fusión comprende cuatro inmunógenos PF, y en algunas realizaciones la proteína de fusión comprende cinco inmunógenos PF. Las proteínas de fusión con dos inmunógenos de Consenso PF pueden comprender: CS y LSA1; CS y TRAP; CS y CelTOS; CS y Ama1; LSA1 y TRAP; LSA1 y CelTOS; LSA1 y Ama1; TRAP y CelTOS; TRAP y Ama1; o CelTOS y Amal. Las proteínas de fusión con tres inmunógenos de Consenso PF pueden comprender: CS, LSA1 y TRAP; CS, LSA1 y CelTOS; CS, LSA1 y Ama1; LSA1, TRAP y CelTOS; LSA1, TRAP y Ama1; o TRAP, CelTOS y Amal. Las proteínas de fusión con cuatro inmunógenos de Consenso PF pueden comprender: CS, LSA1, TRAP y CelTOS; CS, LSA1, TRAP y Ama1; CS, LSA1, CelTOS y Ama1; CS, TRAP, CelTOS y Ama1; o LSA1, TRAP, CelTOS y Amal. Las proteínas de fusión con cinco inmunógenos del FP de Consenso pueden comprender CS o CS-alt, LSA1, TrAP, CelTOS y Amal.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión comprenden un péptido señal unido al extremo N. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión comprenden múltiples péptidos señal unidos al terminal N de cada inmunógeno de Consenso PF. En algunas realizaciones, puede incluirse un espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión. En algunas realizaciones, el espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión puede ser un sitio de escisión proteolítica. En algunas realizaciones, el espaciador puede ser un sitio de corte proteolítico reconocido por una proteasa que se encuentra en las células a las que se pretende administrar y/o absorber la vacuna. En algunas realizaciones, puede incluirse un espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión, en la que el espaciador es un sitio de escisión proteolítica reconocido por una proteasa que se encuentra en las células a las que se pretende administrar y/o absorber la vacuna, y las proteínas de fusión comprenden múltiples péptidos señal unidos al terminal N de cada inmunógeno PF de consenso, de manera que al escindirse el péptido señal de cada inmunógeno PF de consenso transloca el inmunógeno PF de consenso al exterior de la célula.
(3) Antígenos bacterianos
Como parte de la invención, el antígeno puede ser un antígeno de Clostridium difficile .
Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno puede ser un antígeno bacteriano o un fragmento o variante del mismo. La bacteria puede ser de cualquiera de los siguientes filos: Acidobacterias, Actinobacterias, Aquificae, Bacteroidetes, Caldiserica, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Elusimicrobia, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacterias, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospira, Planctomycetes, Proteobacterias, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria, Thermotogae y Verrucomicrobia.
La bacteria puede ser una bacteria grampositiva o una bacteria gramnegativa. La bacteria puede ser una bacteria aeróbica o una bacteria aneróbica. La bacteria puede ser una bacteria autótrofa o una bacteria heterótrofa. La bacteria puede ser mesófila, neutrófila, extremófila, acidófila, alcalófila, termófila, psicófila, halófila u osmófila.
La bacteria puede ser una bacteria de ántrax, una bacteria resistente a los antibióticos, una bacteria causante de enfermedades, una bacteria de intoxicación alimentaria, una bacteria infecciosa, una bacteria de Salmonella, una bacteria de Staphylococcus, una bacteria de Streptococcus o una bacteria de tétanos. La bacteria puede ser una micobacteria, Clostridium tetani, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) o Clostridium difficile. La bacteria puede ser Mycobacterium tuberculosis.
(a) Antígenos de Mycobacterium tuberculosis
Los inhibidores del punto de control pueden asociarse o combinarse con un antígeno de Mycobacterium tuberculosis (es decir, antígeno de TB o inmunógeno de TB), o fragmento del mismo, o variante del mismo. El antígeno de la tuberculosis puede ser de la familia de antígenos de la tuberculosis Ag85, por ejemplo, Ag85A y Ag85B. El antígeno de la tuberculosis puede ser de la familia Esx de antígenos de la tuberculosis, por ejemplo, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV y EsxW.
En algunas realizaciones, el antígeno de la tuberculosis puede ser moléculas de ácido nucleico tales como plásmidos que codifican uno o más de los inmunógenos de Mycobacterium tuberculosis de la familia Ag85 y de la familia Esx. Los inmunógenos pueden ser de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de proteínas de longitud completa. Los inmunógenos pueden incluir secuencias de consenso y/o modificaciones para mejorar la expresión. Los inmunógenos de consenso pueden comprender un péptido señal, como un péptido señal de inmunoglobulina, como un péptido señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, pueden comprender una etiqueta HA.
(4) Antígenos fúngicos
Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el antígeno puede ser un antígeno fúngico o un fragmento o variante del mismo. El hongo puede ser una especie de Aspergillus, Blastomyces dermatitidis, levaduras Candida (por ejemplo, Candida albicans), Coccidioides, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, dermatofitos, especies de Fusarium , Histoplasma capsulatum, Mucoromycotina, Pneumocystis jirovecii, Sporothrix schenckii, Exserohilum o Cladosporium.
(5) Marcadores de cáncer
Los marcadores son proteínas conocidas que están presentes o reguladas frente a ciertas células cancerosas. Mediante la metodología de generar antígenos que representen dichos marcadores de forma que se rompa la tolerancia a sí mismos, se puede generar una vacuna contra el cáncer. Estas vacunas contra el cáncer pueden incluir los inhibidores de los puntos de control para mejorar la respuesta inmunitaria. Los siguientes son algunos antígenos del cáncer:
1. a. hTERT
La hTERT es una transcriptasa inversa de la telomerasa humana que sintetiza una etiqueta TTAGGG en el extremo de los telómeros para prevenir la muerte celular debida al acortamiento cromosómico. Las células hiperproliferativas con una expresión anormalmente alta de hTERT pueden ser el objetivo de la inmunoterapia. Estudios recientes demuestran que la expresión de hTERT en células dendríticas transfectadas con genes hTERT puede inducir células T citotóxicas CD8+ y provocar la aparición de células T CD4+ de forma específica a un antígeno.
El hTERT puede administrarse en los vectores descritos en el presente documento, y combinarse con inhibidores de puntos de control en varios esquemas de vacunación, incluyendo el del Ejemplo, a continuación.
b. antígenos prostáticos
Los siguientes son antígenos capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra un antígeno prostático. Los antígenos de consenso que pueden comprender epítopos que los hacen particularmente eficaces como inmunógenos contra las células del cáncer de próstata, pueden ser inducidos. El antígeno prostático de consenso puede comprender el producto de traducción de longitud completa, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos.
Los antígenos prostáticos pueden incluir uno o más de los siguientes: Antígeno PSA, antígeno PSMA, antígeno STEAP, antígeno PSCA, antígeno de fosfatasa ácida prostática (PAP) y otros marcadores de cáncer de próstata conocidos. Las proteínas pueden comprender secuencias homólogas a los antígenos prostáticos, fragmentos de los antígenos prostáticos y proteínas con secuencias homólogas a fragmentos de los antígenos prostáticos.
Los antígenos de la próstata pueden administrarse en los vectores descritos en el presente documento, y combinarse con inhibidores de puntos de control en varios programas de vacunación, incluido el del Ejemplo, a continuación.
c. WT1
El antígeno puede ser el gen supresor de tumores de Wilm 1 (WT1), un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación del mismo. WT1 es un factor de transcripción que contiene en el extremo N un dominio de unión al ADN rico en prolina/glutamina y en el extremo C cuatro motivos de dedos de zinc. WT1 desempeña un papel en el desarrollo normal del sistema urogenital e interactúa con numerosos factores, por ejemplo, p53, un conocido supresor de tumores y la serina proteasa HtrA2, que escinde WT1 en múltiples sitios tras el tratamiento con un fármaco citotóxico.
La mutación de WT1 puede conducir a la formación de tumores o cánceres, por ejemplo, el tumor de Wilm o los tumores que expresan WT1. El tumor de Wilm suele formarse en uno o ambos riñones antes de hacer metástasis en otros tejidos, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, el tejido hepático, el tejido del sistema urinario, el tejido linfático y el tejido pulmonar. En consecuencia, el tumor de Wilm puede considerarse un tumor metastásico. El tumor de Wilm suele aparecer en niños pequeños (por ejemplo, menores de 5 años) y en formas tanto esporádicas como hereditarias. En consecuencia, la vacuna puede utilizarse para tratar a los sujetos que padecen el tumor de Wilm. La vacuna también puede utilizarse para tratar a sujetos con cánceres o tumores que expresan WT1 para prevenir el desarrollo de dichos tumores en los sujetos. El antígeno WT1 puede diferir del gen WT1 nativo, "normal", y por lo tanto, proporcionar terapia o profilaxis contra un tumor que exprese el antígeno WT1. Las proteínas pueden comprender secuencias homólogas a los antígenos WT1, fragmentos de los antígenos WT1 y proteínas con secuencias homólogas a fragmentos de los antígenos WT1.
Los antígenos WT1 pueden administrarse en los vectores descritos en el presente documento, y combinarse con inhibidores de puntos de control en diversos esquemas de vacunación, incluido el del Ejemplo, a continuación.
d. Antígeno tirosinasa
El antígeno tirosinasa (Tyr) es un objetivo importante para la eliminación mediada por el sistema inmunitario, ya que induce (1) la inmunidad humoral a través de las respuestas de las células B para generar anticuerpos que bloquean la producción de la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), retrasando así las células supresoras derivadas de los mieloides (MDSC) y suprimiendo el crecimiento del tumor; (2) aumentar los linfocitos T citotóxicos, como los CD8+ (CTL), para que ataquen y eliminen las células tumorales; (3) aumentar las respuestas de los linfocitos T auxiliares; (4) y aumentar las respuestas inflamatorias a través de IFN-y y TFN-a o, preferentemente, todo lo anterior.
La tirosinasa es una enzima que contiene cobre y que se encuentra en los tejidos vegetales y animales. La tirosinasa cataliza la producción de melanina y otros pigmentos mediante la oxidación de fenoles como la tirosina. En el melanoma, la tirosinasa puede desregularse, dando lugar a un aumento de la síntesis de melanina. La tirosinasa es también una diana del reconocimiento de las células T citotóxicas en los sujetos que padecen melanoma. En consecuencia, la tirosinasa puede ser un antígeno asociado al melanoma.
El antígeno puede comprender epítopos proteicos que los hacen particularmente eficaces como inmunógenos contra los que se pueden inducir respuestas inmunitarias anti-Tyr. El antígeno Tyr puede comprender el producto de traducción de longitud completa, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos.
El antígeno Tyr puede comprender una proteína de consenso. El antígeno Tyr induce respuestas de células T específicas al antígeno y de anticuerpos de alto título, tanto sistémicamente como contra todas las células cancerosas y relacionadas con el tumor. De este modo, se proporciona una respuesta inmunitaria protectora contra la formación de tumores mediante vacunas que comprenden el antígeno consenso Tyr. En consecuencia, cualquier usuario puede diseñar una vacuna de la presente invención para incluir un antígeno Tyr para proporcionar una amplia inmunidad contra la formación de tumores, la metástasis de los tumores y el crecimiento de los mismos. Las proteínas pueden comprender secuencias homólogas a los antígenos Tyr, fragmentos de los antígenos Tyr y proteínas con secuencias homólogas a fragmentos de los antígenos Tyr.
Los antígenos Tyr pueden administrarse en los vectores descritos en el presente documento, y combinarse con inhibidores de puntos de control en varios esquemas de vacunación, incluido el del Ejemplo, a continuación.
e. NYES01
El NY-ESO-1 es un antígeno testicular expresado en varios cánceres donde puede inducir inmunidad celular y humoral. Los estudios de expresión génica han demostrado la sobrerregulación del gen de NY-ESO-1, CTAG1B, en los liposarcomas mixoides y de células redondas. Las proteínas pueden comprender secuencias homólogas a los antígenos NYES01, fragmentos de los antígenos NYES01 y proteínas con secuencias homólogas a fragmentos de los antígenos NYES01.
Los antígenos NYES01 pueden administrarse en los vectores descritos en el presente documento, y combinarse con inhibidores del punto de control en varios esquemas de vacunación, incluido el del Ejemplo, a continuación.
f. PRAME
El antígeno del melanoma expresado preferentemente en los tumores (antígeno PRAME) es una proteína que en los humanos está codificada por el gen PRAME. Este gen codifica un antígeno que se expresa predominantemente en los melanomas humanos y que es reconocido por los linfocitos T citolíticos. No se expresa en los tejidos normales, excepto en los testículos. El gen también se expresa en las leucemias agudas. Se han observado cinco variantes de transcripción empalmadas alternativamente que codifican la misma proteína para este gen. Las proteínas pueden comprender secuencias homólogas a los antígenos PRAME, fragmentos de los antígenos PRAME y proteínas con secuencias homólogas a fragmentos de los antígenos PRAME.
Los antígenos PRAME pueden administrarse en los vectores descritos en el presente documento, y combinarse con inhibidores del punto de control en varios esquemas de vacunación, incluido el del Ejemplo, a continuación.
g. MAGE
MAGE significa antígeno asociado al melanoma, y en particular antígeno 4 asociado al melanoma (MAGEA4). MAGE-A4 se expresa en las células germinales masculinas y en las células tumorales de varios tipos histológicos, como los carcinomas gastrointestinales, esofágicos y pulmonares. MAGE-A4 se une a la oncoproteína Gankyrin. Esta unión específica de MAGE-A4 está mediada por su terminal C. Los estudios han demostrado que la MAGE-A4 exógena puede inhibir parcialmente el crecimiento independiente de la adhesión de las células que sobreexpresan la Gankirina in vitro y suprimir la formación de tumores migrados a partir de estas células en ratones lampiños. Esta inhibición depende de la unión entre MAGE-A4 y Gankyrin, lo que sugiere que las interacciones entre Gankyrin y MAGE-A4 inhiben la carcinogénesis mediada por Gankyrin. Es probable que la expresión de MAGE en el tejido tumoral no sea una causa, sino un resultado de la génesis del tumor, y que los genes MAGE participen en el proceso inmunitario dirigiéndose a las células tumorales tempranas para su destrucción.
La proteína del antígeno 4 asociado al melanoma (MAGEA4) puede estar implicada en el desarrollo embrionario y en la transformación y/o progresión tumoral. MAGEA4 se expresa normalmente en los testículos y la placenta. Sin embargo, MAGEA4 puede expresarse en muchos tipos diferentes de tumores, por ejemplo, melanoma, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de pulmón y carcinoma de mama. En consecuencia, MAGEA4 puede ser un antígeno asociado a una variedad de tumores.
El antígeno MAGEA4 puede inducir respuestas de células T específicas de antígeno y/o de anticuerpos de alto título, induciendo o provocando así una respuesta inmunitaria dirigida o reactiva contra el cáncer o el tumor que expresa el antígeno. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida o provocada puede ser una respuesta inmunitaria celular, humoral o tanto celular como humoral. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria celular inducida o provocada puede incluir la inducción o secreción de interferón-gamma (IFN-y) y/o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). En otras realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida o provocada puede reducir o inhibir uno o más factores de supresión inmunitaria que promueven el crecimiento del tumor o del cáncer que expresa el antígeno, por ejemplo, pero sin limitarse a, factores que subregulan la presentación del CMH, factores que sobrerregulan las células T reguladoras específicas del antígeno (Tregs), PD-L1, FasL, citoquinas como IL-10 y TFG-p, macrófagos asociados al tumor, fibroblastos asociados al tumor.
El antígeno MAGEA4 puede comprender epítopos proteicos que los hacen particularmente eficaces como inmunógenos contra los que se pueden inducir respuestas inmunitarias anti-MAGEA4. El antígeno MAGEA4 puede comprender el producto de traducción de longitud completa, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. El antígeno MAGEA4 puede comprender una proteína de consenso.
La secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno consenso MAGEA4 puede ser optimizada con respecto al uso de codones y los correspondientes transcritos de ARN. El ácido nucleico que codifica el antígeno de consenso MAGEA4 puede estar optimizado en cuanto a codones y ARN para su expresión. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno consenso MAGEA4 puede incluir una secuencia Kozak (por ejemplo, GCC ACC) para aumentar la eficiencia de la traducción. El ácido nucleico que codifica el antígeno consenso MAGEA4 puede incluir múltiples codones de parada (por ejemplo, TGA TGA) para aumentar la eficiencia de la terminación de la traducción.
Los antígenos MAGE pueden administrarse en los vectores descritos en el presente documento, y combinarse con inhibidores del punto de control en varios esquemas de vacunación, incluido el del Ejemplo, a continuación.
c. Vector
Como parte de la divulgación, pero no de la invención, la vacuna puede comprender uno o más vectores que incluyen un ácido nucleico que codifica el antígeno y el anticuerpo PD1 o el anticuerpo PDL1. Los uno o más vectores pueden ser capaces de expresar el antígeno y el anticuerpo PDl o el anticuerpo PDL1. El vector puede tener una secuencia de ácido nucleico que contenga un origen de replicación. El vector puede ser un plásmido, un bacteriófago, un cromosoma artificial bacteriano o un cromosoma artificial de levadura. El vector puede ser un vector extracromosómico de autorreplicación o un vector que se integra en el genoma del huésped.
El uno o más vectores pueden ser un constructo de expresión, que generalmente es un plásmido que se utiliza para introducir un gen específico en una célula diana. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula, la proteína codificada por el gen es producida por los complejos ribosomales de la maquinaria celular de transcripción y traducción. El plásmido suele estar diseñado para contener secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y que conducen a la transcripción eficiente del gen transportado en el vector de expresión. Los vectores de la presente invención expresan grandes cantidades de ARN mensajero estable y, por tanto, proteínas.
Los vectores pueden tener señales de expresión como un promotor fuerte, un codón de terminación fuerte, el ajuste de la distancia entre el promotor y el gen clonado, y la inserción de una secuencia de terminación de la transcripción y una PTIS (secuencia de iniciación de la traducción portátil).
(1) Vectores de expresión
El vector puede ser un plásmido circular o un ácido nucleico lineal. El plásmido circular y el ácido nucleico lineal son capaces de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula sujeta apropiada. El vector puede tener un promotor unido de forma operable a la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno, o a la secuencia de nucleótidos que codifica el adyuvante, que puede estar unido de forma operable a señales de terminación. El vector también puede contener las secuencias necesarias para la correcta traducción de la secuencia de nucleótidos. El vector que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible, que inicia la transcripción sólo cuando la célula huésped está expuesta a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, el promotor también puede ser específico de un tejido u órgano concreto o de una fase de desarrollo.
(2) Vectores circulares y lineales
El vector puede ser un plásmido circular, que puede transformar una célula diana por integración en el genoma celular o existir de forma extracromosómica (por ejemplo, plásmido de replicación autónoma con un origen de replicación).
El vector puede ser pVAX, pcDNA3.0, o provax, o cualquier otro vector de expresión capaz de expresar el ADN que codifica el antígeno, o el adyuvante y que permite a una célula traducir la secuencia a un antígeno que es reconocido por el sistema inmunitario, o el adyuvante.
También se proporciona en el presente documento una vacuna de ácido nucleico lineal, o casete de expresión lineal ("LEC"), que es capaz de ser administrada eficientemente a un sujeto mediante electroporación y que expresa uno o más antígenos deseados, o uno o más adyuvantes deseados. El LEC puede ser cualquier ADN lineal desprovisto de cualquier columna vertebral de fosfato. El ADN puede codificar uno o más antígenos, o uno o más adyuvantes. El LEC puede contener un promotor, un intrón, un codón de parada y/o una señal de poliadenilación. La expresión del antígeno o del adyuvante puede ser controlada por el promotor. El LEC no puede contener ningún gen de resistencia a los antibióticos y/o una columna vertebral de fosfato. El LEC no puede contener otras secuencias de ácido nucleico que no estén relacionadas con la expresión del gen del antígeno deseado, o con la expresión del adyuvante deseado.
El LEC puede derivarse de cualquier plásmido capaz de ser linealizado. Como parte de la invención, el plásmido puede ser capaz de expresar el antígeno. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el plásmido puede ser capaz de expresar el anticuerpo PD1 o el anticuerpo PDL1. Como parte de la divulgación, pero no de la invención, el plásmido puede ser capaz de expresar el anticuerpo PD1 o el anticuerpo PDL1. El plásmido puede ser pNP (Puerto Rico/34) o pM2 (Nueva Caledonia/99). El plásmido puede ser WLV009, pVAX, pcDNA3.0, o provax, o cualquier otro vector de expresión capaz de expresar a Dn que codifique el antígeno, o que codifique el adyuvante, y que permita a una célula traducir la secuencia a un antígeno que sea reconocido por el sistema inmunitario, o el adyuvante.
El LEC puede ser pcrM2. El LEC puede ser pcrNP. pcrNP y pcrMR pueden derivarse de pNP (Puerto Rico/34) y pM2 (Nueva Caledonia/99), respectivamente.
(3) Promotor, intrón, codón de parada y señal de poliadenilación
El vector puede tener un promotor. Un promotor puede ser cualquier promotor que sea capaz de impulsar la expresión del gen y regular la expresión del ácido nucleico aislado. Dicho promotor es un elemento de secuencia de acción cis necesario para la transcripción a través de una ARN polimerasa dependiente del ADN, que transcribe la secuencia del antígeno, o la secuencia del adyuvante descrita en el presente documento. La selección del promotor utilizado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación concreta. El promotor puede situarse aproximadamente a la misma distancia del inicio de la transcripción en el vector que del sitio de inicio de la transcripción en su entorno natural. Sin embargo, la variación de esta distancia puede acomodarse sin pérdida de la función del promotor.
El promotor puede estar unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno y a las señales necesarias para la poliadenilación eficiente del transcrito, los sitios de unión al ribosoma y la terminación de la traducción. El promotor puede estar unido de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico que codifica el adyuvante y a las señales necesarias para la poliadenilación eficiente del transcrito, los sitios de unión a los ribosomas y la terminación de la traducción.
El promotor puede ser un promotor del CMV, un promotor temprano del SV40, un promotor tardío del SV40, un promotor de la metalotioneína, un promotor del virus del tumor mamario murino, un promotor del virus del sarcoma de Rous, un promotor de la polihedrina u otro promotor que haya demostrado ser eficaz para la expresión en células eucariotas.
El vector puede incluir un potenciador y un intrón con sitios donantes y aceptores de empalme funcionales. El vector puede contener una región de terminación de la transcripción a continuación del gen estructural para permitir una terminación eficiente. La región de terminación puede obtenerse del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse de genes diferentes.
d. Excipientes y otros componentes de la vacuna
La vacuna puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser moléculas funcionales como vehículos, adyuvantes distintos del anticuerpo PD1 o del anticuerpo PDL1, portadores o diluyentes. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un agente facilitador de la transfección, que puede incluir agentes activos de superficie, como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freunds, análogo del LPS, incluido el lípido monofosforil A, péptidos de muramilo, análogos de quinona, vesículas como el escualeno y el escualeno, ácido hialurónico, lípidos, liposomas, iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas, u otros agentes facilitadores de la transfección conocidos.
El agente facilitador de la transfección es un polianión, un polication, incluyendo el poli-L-glutamato (LGS), o un lípido. El agente facilitador de la transfección es poli-L-glutamato, y el poli-L-glutamato puede estar presente en la vacuna a una concentración inferior a 6 mg/ml. El agente facilitador de la transfección también puede incluir agentes activos de superficie como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freunds, análogo de LPS que incluye el lípido monofosforilo A, péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas como el escualeno y el ácido hialurónico también pueden utilizarse administrados junto con el constructo genético. Las vacunas con plásmidos de ADN también pueden incluir un agente facilitador de la transfección, como lípidos, liposomas, incluyendo liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, como una mezcla de ADN-liposoma (véase, por ejemplo WO9324640), iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas, u otros agentes facilitadores de la transfección conocidos. El agente facilitador de la transfección es un polianión, un polication, incluido el poli-L-glutamato (LGS), o un lípido. La concentración del agente de transfección en la vacuna es inferior a 4 mg/ml, inferior a 2 mg/ml, inferior a 1 mg/ml, inferior a 0,750 mg/ml, inferior a 0,500 mg/ml, inferior a 0,250 mg/ml, inferior a 0,100 mg/ml, inferior a 0,050 mg/ml o inferior a 0,010 mg/ml.
El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un adyuvante además del anticuerpo PD1 o el anticuerpo PDL1. El adyuvante adicional puede ser otros genes que se expresan en un plásmido alternativo o se administran como proteínas en combinación con el plásmido anterior en la vacuna. El adyuvante puede seleccionarse del grupo que consiste en: a-interferón (IFN- a), p-interferón (IFN-p), Y-interferón, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), quimioquina atrayente de células T cutáneas (CTACK) quimioquina expresada por el timo epitelial (TECK), quimioquina epitelial asociada a la mucosa (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86, incluida la IL-15 con la secuencia de señal suprimida y opcionalmente con el péptido señal de la IgE. El adyuvante puede ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, o una combinación de ellos.
Otros genes que pueden ser útiles como adyuvantes además del anticuerpo PD1 o el anticuerpo PDL1 incluyen los que codifican m Cp -1, MlP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-7, IL-22, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor del TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta al interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y sus fragmentos funcionales.
La vacuna puede comprender además un agente facilitador de vacunas genéticas como se describe en el documento U.S. Serie No. 021,579 presentado el 1 de abril de 1994.
La vacuna puede formularse según el modo de administración que se vaya a utilizar. Una composición farmacéutica vacunal inyectable puede ser estéril, libre de pirógenos y de partículas. Se puede utilizar una formulación o solución isotónica. Los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. La vacuna puede comprender un agente vasoconstrictor. Las soluciones isotónicas pueden incluir solución salina tamponada con fosfato. La vacuna puede comprender además estabilizadores que incluyen gelatina y albúmina. Los estabilizadores pueden permitir que la formulación sea estable a temperatura ambiente o de la habitación durante largos períodos de tiempo, incluyendo LGS o policationes o polianiones.
3. Procedimiento de vacunación
La presente invención también se dirige a un procedimiento para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto. El aumento de la respuesta inmunitaria puede utilizarse para tratar y/o prevenir enfermedades en el sujeto. El procedimiento puede incluir la administración al sujeto de la vacuna aquí divulgada. El sujeto al que se le administra la vacuna puede tener una respuesta inmunitaria aumentada o potenciada en comparación con un sujeto al que se le administra el antígeno solo. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria puede aumentar entre 0,5 y 15 veces, entre 0,5 y 10 veces, o entre 0,5 y 8 veces. Alternativamente, la respuesta inmunitaria en el sujeto al que se le ha administrado la vacuna puede aumentar al menos 0,5 veces, al menos 1,0 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2,0 veces, al menos 2,5 veces.5 veces, al menos 3 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4 veces, al menos 4,5 veces, al menos 5 veces, al menos 5,5 veces, al menos 6 veces, al menos 6,5 veces, al menos 7 veces.0 veces, al menos 7,5 veces, al menos 8 veces, al menos 8,5 veces, al menos 9 veces, al menos 9,5 veces, al menos 10 veces, al menos 10,5 veces, al menos 11 veces.0 veces, al menos 11,5 veces, al menos 12 veces, al menos 12,5 veces, al menos 13 veces, al menos 13,5 veces, al menos 14 veces, al menos 14,5 veces o al menos 15 veces.
En todavía otras realizaciones alternativas, la respuesta inmunitaria en el sujeto al que se le ha administrado la vacuna puede aumentar entre un 50% y un 1500%, entre un 50% y un 1000%, o entre un 50% y un 800%. En otras realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto al que se le ha administrado la vacuna puede aumentar al menos en un 50%, al menos en un 100%, al menos en un 150%, al menos en un 200%, al menos en un 250%, al menos en un 300%, al menos en un 350%, al menos en un 400%, al menos en un 450%, al menos en un 500%, al menos en un 550%, al menos en un 600%, al menos un 650%, al menos un 700%, al menos un 750%, al menos un 800%, al menos un 850%, al menos un 900%, al menos un 950%, al menos un 1000%, al menos un 1050%, al menos un 1100%, al menos un 1150%, al menos un 1200%, al menos un 1250%, al menos un 1300%, al menos un 1350%, al menos un 1450%, o al menos un 1500%.
La dosis de la vacuna puede estar entre 1 |jg y 10 mg de componente activo/kg de peso corporal/tiempo, y puede ser de 20 jg a 10 mg de componente/kg de peso corporal/tiempo. La vacuna puede administrarse cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días. El número de dosis de la vacuna para un tratamiento eficaz puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
а. Administración
La vacuna puede formularse de acuerdo con técnicas estándar bien conocidas por los expertos en el arte farmacéutico. Dichas composiciones pueden administrarse en dosis y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las artes médicas, teniendo en cuenta factores como la edad, el sexo, el peso y la condición del sujeto en particular, y la vía de administración. El sujeto puede ser un mamífero, tal como un humano, un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, un gato, un perro, una rata o un ratón.
La vacuna puede administrarse de forma profiláctica o terapéutica. En la administración profiláctica, las vacunas pueden administrarse en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria. En las aplicaciones terapéuticas, las vacunas se administran a un sujeto que las necesita en una cantidad suficiente para provocar un efecto terapéutico. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva" Las cantidades efectivas para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición particular del régimen de vacunas administrado, la forma de administración, la etapa y la gravedad de la enfermedad, el estado general de salud del paciente y el juicio del médico que prescribe.
La vacuna puede administrarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, como se describe en Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)) Felgner et al. (Pat. de EE.UU. No. 5,580,859, emitido el 3 de diciembre de 1996) Felgner (U.S. Pat. No. 5,703,055, emitido el 30 de diciembre de 1997); y Carson et al. (Pat. de EE.UU. No.
5,679,647, emitido el 21 de octubre de 1997). El ADN de la vacuna puede complejizarse en partículas o perlas que pueden administrarse a un individuo, por ejemplo, mediante una pistola de vacunas. Un experto en la materia sabrá que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración del vector de expresión.
La vacuna puede administrarse por diversas vías. Las vías de administración típicas incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular o subcutánea. Otras vías son la administración oral, la intranasal y la intravaginal. Para el ADN de la vacuna en particular, la vacuna puede ser administrada en los espacios intersticiales de los tejidos de un individuo (Felgner et al., U.S. Pat. Números 5.580.859 y 5,703,055. La vacuna también puede administrarse en el músculo, o puede administrarse mediante inyecciones intradérmicas o subcutáneas, o por vía transdérmica, como por ejemplo mediante iontoforesis. También puede emplearse la administración epidérmica de la vacuna. La administración epidérmica puede implicar la irritación mecánica o química de la capa más externa de la epidermis para estimular una respuesta inmunitaria al irritante (Carson et al., U.S. Pat. N° 5.679.647.
La vacuna también puede formularse para su administración por vía nasal. Las formulaciones adecuadas para la administración nasal, en las que el portador es un sólido, pueden incluir un polvo grueso con un tamaño de partícula, por ejemplo, del orden de 10 a 500 micrones, que se administra de la forma en que se toma el tabaco, es decir, por inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente con el polvo acercado a la nariz. La formulación puede ser un aerosol nasal, gotas nasales, o mediante la administración de un aerosol por nebulizador. La formulación puede incluir soluciones acuosas u oleosas de la vacuna.
La vacuna puede ser una preparación líquida como una suspensión, un jarabe o un elixir. La vacuna también puede ser una preparación para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable), como una suspensión o emulsión estéril.
La vacuna puede incorporarse en liposomas, microesferas u otras matrices poliméricas (Feigner et al., U.S. Pat. N° 5.703.055 Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2a ed. 1993)). Los liposomas pueden estar formados por fosfolípidos u otros lípidos, y pueden ser portadores no tóxicos, fisiológicamente aceptables y metabolizables que son relativamente sencillos de fabricar y administrar.
La vacuna puede administrarse mediante electroporación, como por ejemplo mediante un procedimiento descrito en la Patente de EE.UU. n° 7.664.545. La electroporación puede ser por un procedimiento y/o aparato descrito en la Patente de EE.UU. n° 6.302.874, 5,676,646, 6,241,701, 6,233,482, 6,216,034, 6,208,893, 6,192,270, 6,181,964, б, 150,148, 6,120,493, 6,096,020, 6,068,650,y 5,702,359.
La electroporación puede llevarse a cabo mediante un dispositivo mínimamente invasivo.
El dispositivo de electroporación mínimamente invasivo ("MID") puede ser un aparato para inyectar la vacuna descrita anteriormente y el fluido asociado en el tejido corporal. El dispositivo puede comprender una aguja hueca, un casete de ADN y medios de suministro de fluidos, en los que el dispositivo está adaptado para accionar los medios de suministro de fluidos en uso para inyectar simultáneamente (por ejemplo, automáticamente) el ADN en el tejido corporal durante la inserción de la aguja en dicho tejido corporal. Esto tiene la ventaja de que la capacidad de inyectar el ADN y el fluido asociado gradualmente mientras se inserta la aguja conduce a una distribución más uniforme del fluido a través del tejido corporal. El dolor experimentado durante la inyección puede reducirse debido a la distribución del ADN que se inyecta en una zona más amplia.
El MID puede inyectar la vacuna en el tejido sin el uso de una aguja. El MID puede inyectar la vacuna en forma de una pequeña corriente o chorro con tal fuerza que la vacuna atraviesa la superficie del tejido y entra en el tejido y/o músculo subyacente. La fuerza detrás de la pequeña corriente o chorro puede ser proporcionada por la expansión de un gas comprimido, como el dióxido de carbono a través de un micro-orificio en una fracción de segundo. Los ejemplos de dispositivos de electroporación mínimamente invasivos, y los procedimientos para utilizarlos, se describen en la Solicitud de patente estadounidense n° 20080234655 Patente estadounidense n° 6.520.950; Patente estadounidense n° 7.171.264; Patente estadounidense n° 6.208.893; Patente estadounidense NO. 6,009,347; Patente de EE.UU. n° 6.120.493; Patente estadounidense n° 7.245.963; Patente estadounidense n° 7.328.064y Patente estadounidense n° 6.763.264.
El MID puede comprender un inyector que crea un chorro de líquido de alta velocidad que perfora el tejido sin dolor. Estos inyectores sin aguja están disponibles en el mercado. Entre los ejemplos de inyectores sin aguja que pueden utilizarse en el presente documento figuran los descritos en la Patente de EE.UU. n° 3.805.783; 4,447,223; 5,505,697; y 4,342,310.
Una vacuna deseada en una forma adecuada para el electrotransporte directo o indirecto puede ser introducida (por ejemplo, inyectada) usando un inyector sin aguja en el tejido a tratar, generalmente contactando la superficie del tejido con el inyector para accionar la administración de un chorro del agente, con fuerza suficiente para causar la penetración de la vacuna en el tejido. Por ejemplo, si el tejido a tratar es la mucosa, la piel o el músculo, el agente se proyecta hacia la superficie de la mucosa o de la piel con la fuerza suficiente para hacer que el agente penetre a través del estrato córneo y en las capas dérmicas, o en el tejido subyacente y el músculo, respectivamente.
Los inyectores sin aguja son muy adecuados para administrar vacunas en todo tipo de tejidos, especialmente en la piel y las mucosas. En algunas realizaciones, se puede utilizar un inyector sin aguja para propulsar un líquido que contenga la vacuna hacia la superficie y la piel o la mucosa del sujeto. Ejemplos representativos de los diversos tipos de tejidos que pueden tratarse con los procedimientos de la invención incluyen el páncreas, la laringe, la nasofaringe, la hipofaringe, la orofaringe, el labio, la garganta, el pulmón, el corazón, el riñón, el músculo, la mama, el colon, la próstata, el timo, el testículo, la piel, el tejido mucoso, el ovario, los vasos sanguíneos o cualquier combinación de los mismos.
El MID puede tener electrodos de aguja que electroporan el tejido. La pulsación entre varios pares de electrodos en una matriz de electrodos múltiple, por ejemplo, dispuesta en patrones rectangulares o cuadrados, proporciona mejores resultados que la pulsación entre un par de electrodos. Divulgado, por ejemplo, en la Patente estadounidense n° 5.702.359 titulada "Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes" es una matriz de agujas en la que una pluralidad de pares de agujas pueden ser pulsadas durante el tratamiento terapéutico. En esa aplicación, las agujas estaban dispuestas en un conjunto circular, pero tenían conectores y aparatos de conmutación que permitían una pulsación entre pares opuestos de electrodos de aguja. Se puede utilizar un par de electrodos de aguja para suministrar vectores de expresión recombinantes a las células. Dicho dispositivo y sistema se describe en la Patente de EE.UU. n° 6.763.264. Alternativamente, se puede utilizar un dispositivo de una sola aguja que permita la inyección del ADN y la electroporación con una sola aguja parecida a una aguja de inyección normal y que aplique pulsos de menor voltaje que los suministrados por los dispositivos utilizados actualmente, reduciendo así la sensación eléctrica experimentada por el paciente.
El MID puede comprender uno o más conjuntos de electrodos. Las matrices pueden comprender dos o más agujas del mismo diámetro o de diámetros diferentes. Las agujas pueden estar separadas de manera uniforme o irregular. Las agujas pueden tener entre 0,0127 centímetros y 0,0762 centímetros, entre 0,0254 centímetros y 0,0635 centímetros; o entre 0,0381 centímetros y 0,0508 centímetros. La aguja puede tener un diámetro de 0,0175 centímetros. Las agujas pueden ser de 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm, 2,0 mm, 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm, o más espaciadas.
El MID puede consistir en un generador de pulsos y un inyector de vacunas de dos o más agujas que administran la vacuna y los pulsos de electroporación en una sola etapa. El generador de pulsos puede permitir la programación flexible de los parámetros de pulsos e inyecciones a través de un ordenador personal operado por una tarjeta flash, así como el registro y almacenamiento exhaustivo de los datos de electroporación y del paciente. El generador de pulsos puede suministrar una variedad de pulsos de voltios durante períodos cortos de tiempo. Por ejemplo, el generador de pulsos puede suministrar tres pulsos de 15 voltios de 100 ms de duración. Un ejemplo de este tipo de MID es el sistema Elgen 1000 de Inovio Biomedical Corporation, que se describe en laPatente estadounidense n° 7.328.064.
El MID puede ser un dispositivo y sistema CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA), que es un sistema modular de electrodos, que facilita la introducción de una macromolécula, como un ADN, en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. El sistema modular de electrodos puede comprender una pluralidad de electrodos de aguja; una aguja hipodérmica; un conector eléctrico que proporciona un enlace conductor desde un controlador de impulsos de corriente constante programable a la pluralidad de electrodos de aguja; y una fuente de energía. Un operador puede agarrar la pluralidad de electrodos de aguja que están montados en una estructura de soporte e insertarlos firmemente en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. A continuación, las macromoléculas se introducen a través de la aguja hipodérmica en el tejido seleccionado. El controlador de impulsos de corriente constante programable se activa y se aplica un impulso eléctrico de corriente constante a la pluralidad de electrodos de aguja. El impulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la macromolécula en la célula entre la pluralidad de electrodos. La muerte celular debida al sobrecalentamiento de las células se minimiza limitando la disipación de energía en el tejido en virtud de los pulsos de corriente constante. El dispositivo y el sistema de Cellectra se describen en la Patente de EE.UU. n° 7.245.963.
El MID puede ser un sistema Elgen 1000 (Inovio Pharmaceuticals). El sistema Elgen 1000 puede comprender un aparato que proporciona una aguja hueca; y medios de suministro de fluidos, en los que el aparato está adaptado para accionar los medios de suministro de fluidos en uso para inyectar simultáneamente (por ejemplo, automáticamente) el fluido, la vacuna descrita en el presente documento, en el tejido corporal durante la inserción de la aguja en dicho tejido corporal. La ventaja es que la capacidad de inyectar el fluido gradualmente mientras se inserta la aguja conduce a una distribución más uniforme del fluido a través del tejido corporal. También se cree que el dolor que se experimenta durante la inyección se reduce debido a la distribución del volumen de líquido que se inyecta en una zona más amplia.
Además, la inyección automática de fluido facilita la monitorización y el registro automáticos de una dosis real de fluido inyectado. Estos datos pueden ser almacenados por una unidad de control para fines de documentación si se desea.
Se apreciará que la tasa de inyección podría ser lineal o no lineal y que la inyección puede llevarse a cabo después de que las agujas se hayan insertado a través de la piel del sujeto a tratar y mientras se insertan más en el tejido corporal.
Los tejidos adecuados en los que el fluido puede ser inyectado por el aparato de la presente invención incluyen el tejido tumoral, la piel o el tejido hepático, pero puede ser el tejido muscular.
El aparato comprende además medios de inserción de la aguja para guiar la inserción de la aguja en el tejido corporal. La tasa de inyección de líquido se controla mediante la tasa de inserción de la aguja. Esto tiene la ventaja de que tanto la inserción de la aguja como la inyección del fluido pueden ser controladas de tal manera que la tasa de inserción puede ajustarse a la tasa de inyección según se desee. También hace que el aparato sea más fácil de manejar para el usuario. Si se desea, se pueden proporcionar medios para insertar automáticamente la aguja en el tejido corporal.
Un usuario podría elegir cuándo iniciar la inyección del fluido. Sin embargo, lo ideal es que la inyección comience cuando la punta de la aguja haya alcanzado el tejido muscular y el aparato puede incluir medios para detectar cuándo la aguja se ha insertado a una profundidad suficiente para que comience la inyección del fluido. Esto significa que la inyección de fluido puede iniciarse automáticamente cuando la aguja haya alcanzado la profundidad deseada (que normalmente será la profundidad a la que comienza el tejido muscular). La profundidad a la que comienza el tejido muscular podría tomarse, por ejemplo, como una profundidad de inserción de la aguja preestablecida, como un valor de 4 mm que se consideraría suficiente para que la aguja atravesara la capa de piel.
Los medios de detección pueden comprender una sonda de ultrasonido. Los medios de detección pueden comprender un medio para detectar un cambio de impedancia o resistencia. En este caso, los medios pueden no registrar como tales la profundidad de la aguja en el tejido corporal, sino que se adaptarán para detectar un cambio de impedancia o resistencia a medida que la aguja se desplaza desde un tipo diferente de tejido corporal hacia el músculo. Cualquiera de estas alternativas proporciona un medio relativamente preciso y sencillo de operar para detectar que la inyección puede comenzar. La profundidad de la inserción de la aguja puede registrarse además si se desea y podría utilizarse para controlar la inyección de fluido de forma que el volumen de fluido a inyectar se determine mientras se registra la profundidad de la inserción de la aguja.
El aparato puede comprender además: una base para soportar la aguja; y una carcasa para recibir la base dentro de la misma, en la que la base es movible con respecto a la carcasa de manera que la aguja se retrae dentro de la carcasa cuando la base está en una primera posición hacia atrás con respecto a la carcasa y la aguja se extiende fuera de la carcasa cuando la base está en una segunda posición hacia adelante dentro de la carcasa. Esto es ventajoso para un usuario, ya que la carcasa puede alinearse en la piel de un paciente, y las agujas pueden entonces insertarse en la piel del paciente moviendo la carcasa con respecto a la base.
Como se ha indicado anteriormente, es deseable lograr una tasa controlada de inyección de fluido, de manera que el fluido se distribuya uniformemente a lo largo de la aguja cuando se inserta en la piel. Los medios de suministro de fluido pueden comprender medios de accionamiento de pistón adaptados para inyectar fluido a un ritmo controlado. El medio de accionamiento del pistón podría, por ejemplo, ser activado por un servomotor. Sin embargo, los medios de accionamiento del pistón pueden ser accionados por la base que se mueve en la dirección axial con respecto a la carcasa. Se apreciará que podrían proporcionarse medios alternativos para el suministro de fluidos. Así, por ejemplo, en lugar de un sistema de jeringa y pistón, podría proporcionarse un recipiente cerrado que pueda apretarse para el suministro de fluidos a una tasa controlada o no controlada.
El aparato descrito anteriormente podría utilizarse para cualquier tipo de inyección. Sin embargo, se prevé que sea particularmente útil en el campo de la electroporación, por lo que puede comprender además medios para aplicar un voltaje a la aguja. Esto permite utilizar la aguja no sólo para la inyección, sino también como electrodo durante la electroporación. Esto es particularmente ventajoso, ya que significa que el campo eléctrico se aplica a la misma zona que el fluido inyectado. Tradicionalmente ha habido un problema con la electroporación en el sentido de que es muy difícil alinear con precisión un electrodo con el fluido previamente inyectado, por lo que los usuarios han tendido a inyectar un volumen mayor de fluido que el requerido sobre un área mayor y a aplicar un campo eléctrico sobre un área mayor para intentar garantizar un solapamiento entre la sustancia inyectada y el campo eléctrico. Utilizando la presente invención, tanto el volumen de fluido inyectado como el tamaño del campo eléctrico aplicado pueden reducirse al tiempo que se consigue un buen ajuste entre el campo eléctrico y el fluido.
La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes.
4. Ejemplos
Ejemplo 1
Los ratones fueron inmunizados dos veces a intervalos de dos semanas en tres grupos separados: vector pVAX solamente, vacuna de ADN (VPH) solamente y vacuna de ADN (VPH) combinada con mAb PDL1. Para la combinación, se administró un mAb PD1L a partir del día 10 después de la primera inmunización, y posteriormente cada tres días hasta que los ratones fueron sacrificados 8 días después de la última inmunización. Los datos, como se muestra en el gráfico de barras de la Fig. 1, muestran un aumento del 30% en las respuestas de las células T inducidas por la co-terapia con el anticuerpo anti PDL1.
El mAb de PDL1 puede generarse o puede obtenerse comercialmente, por ejemplo, CD274 (B7-H1, PD-L1) mAb de rata anti-ratón (clon 10F.9G2), conjugado PE-Cy®7 (Life Technologies).
Ejemplo 2
mAb
Los mAb de PDL1, PD1, TIM-3 y LAG-3 pueden generarse o pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, mAb de rata anti-ratón CD274 (B7-H1, Pd -L1) (clon 10F.9G2), conjugado PE-Cy®7 (Life Technologies o Bio X Cell), PD-1 de rata anti-ratón (clon RMP1-14 o J43), TIM-3 de rata anti-ratón (clon r Mt 3-23; Bio X Cell), LAG-3 de rata anti-ratón (clon C9B7W; Bio X Cell), respectivamente.
Inmunización de ratones
Los ratones C57BL/6 (n = 4) fueron inmunizados tres veces, con un intervalo de dos semanas entre las inmunizaciones, con 25 |jg del constructo hTERT con o sin la administración de los mAb's PD1, TIM3 y LAG3. Grupos de vacunación
Grupo II - hTERT
Grupo III - hTERT PD1
Grupo IV -hTER T+ TIM3
Grupo V - hTERT LAG3
Cada uno de los mAb fue administrado 3 días después de la segunda inmunización con hTERT.
Los datos representados en los gráficos de la Fig. 2-4 muestran que el bloqueo de los puntos de control inmunitarios después del refuerzo aumenta las respuestas inmunitarias para los anticuerpos anti PD-1, anti-TIM3 y anti-LAG3. Inducción de una mayor producción de IFNy de células T CD8+ específicas de hTERT tras la inmunización con ADN con inhibidores de puntos de control inmunitarios: Las respuestas de recuperación de citoquinas al antígeno hTERT se midieron una semana después de la última inmunización mediante ICS y citometría de flujo. Los gráficos de la derecha representan el total de células T CD8+ específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con PD1 (Fig. 2), TIM3 (Fig. 3) y LAG3 (Fig. 4). Los gráficos de la izquierda muestran los porcentajes de células T CD3+CD8+ específicas de hTERT que muestran una doble liberación de las citoquinas IFNy y TNFa (PD1 en la Fig.2, TIM3 en la Fig. 3, y LAG3 en la Fig. 4. Los experimentos se realizaron de forma independiente al menos dos veces y los datos representan la media ± SEM de cuatro ratones por grupo.
Los resultados muestran sorprendentemente que los anticuerpos anti-TIM3 y anti-LAG3 produjeron un incremento significativamente mayor de la respuesta inmune en los sujetos.
Ejemplo 3
Momento de la administración del inhibidor de puntos de control en relación con la vacunación Administración de inhibidores de puntos de control después de la inmunización primaria.
(A) Administración anticipada:
Los ratones C57BL/6 (n = 3-4) fueron inmunizados dos veces, con un intervalo de dos semanas entre las inmunizaciones, con 25 |jg del constructo hTERT con o sin la administración de los mAb's PD1, TIM3 y LAG3. La administración inicial de mAb de los inhibidores de puntos de control se realizó en el día 10 (D10), y luego en D13, D16 y D19.
(B) Los ratones C57BL/6 (n = 4) fueron inmunizados tres veces a intervalos de tres semanas con el constructo hTERT de 25ug con o sin la administración de los mAb's PD1, TIM3 y LAG3. La administración inicial de mAb fue a los 3 días después de la segunda inmunización, y posteriormente se administró cada tres días hasta el sacrificio.
La administración de los inhibidores de puntos de control inmunitarios de bloqueo es sensible al tiempo. Las respuestas de recuerdo específicas de IFNy al antígeno hTERT se midieron una semana después de la inmunización final por citometría de flujo durante la administración temprana de mAb frente a la administración posterior de puntos de control de mAb. Los gráficos de la Fig. 5 representan los resultados de las células T CD8 específicas de hTERT que expresan IFNy total en los ratones tratados con o sin PD1, TIM3 y LAG3 poco después de la inmunización de cebado. Los gráficos de la Fig. 6 representan las células T CD8 específicas de hTERT que expresan IFNy total para los ratones tratados con o sin PD1, TIM3 y LAG3 poco después de la inmunización de refuerzo. Por lo tanto, los datos muestran que la administración tardía produce resultados sorprendentes a la hora de impulsar la expansión de las células T específicas del antígeno mediante los inhibidores del punto de control, en comparación con la administración temprana, que muestra una inmunidad específica del antígeno más lenta.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada con el citomegalovirus (CMV), el herpes, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del papiloma humano (VPH), la hepatitis C, la hepatitis B, la gripe, el virus respiratorio sincitial (VRS), la malaria o el C. difficile, mediante el aumento de una respuesta inmunitaria de células T CD8+ en un sujeto, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
administrar al sujeto una primera vacuna y una vacuna de refuerzo que comprenda una molécula de ADN que codifique un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: un antígeno CMV, un antígeno herpes, un antígeno VIH, un antígeno VPH, un antígeno VHC, un antígeno VHB, un antígeno gripe, un antígeno VRS, un antígeno Plasmodium falciparum y un antígeno C. difficile , y
después de la vacunación de refuerzo, administrar al sujeto el anticuerpo TIM-3.
2. Una combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención del cáncer, mediante el aumento de una respuesta inmunitaria de células T CD8+, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
administrar al sujeto una vacunación primaria y una vacunación de refuerzo de una molécula de ADN que codifica un antígeno cancerígeno seleccionado del grupo que consiste en: PSA, PSMA, STEAP, PSCA, PAP, antígeno WT1, tirosinasa, NYES01, PRAME, MAGE o hTERT, y
después de la vacunación de refuerzo, administrar al sujeto el anticuerpo TIM-3.
3. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en la que el antígeno del VPH son los dominios E6 y E7 de subtipos seleccionados del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58, y una combinación de los mismos, o donde el antígeno del VIH se selecciona del grupo que consiste en: Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, y Gag, y una combinación de los mismos.
4. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el antígeno de la gripe se selecciona del grupo que consiste en: H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, antígeno BHA, y cualquier combinación de los mismos, o en los que el antígeno de Plasmodium falciparum incluye un antígeno del circunsporozoito (CS).
5. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el antígeno de C. difficile se selecciona del grupo que consiste en: Toxina A, y Toxina B, y una combinación de las mismas, o en la que el antígeno del VHC se selecciona del grupo que consiste en: E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b, y una combinación de ellas.
6. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el antígeno del VHB se selecciona del grupo que consiste en: antígeno de superficie tipo A, antígeno de superficie tipo B, antígeno de superficie tipo C, antígeno de superficie tipo D, antígeno de superficie tipo E, antígeno de superficie tipo F, antígeno de superficie tipo G, antígeno de superficie tipo H, y antígeno del núcleo, y una combinación de los mismos.
7. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el antígeno del VRS se selecciona del grupo que consiste en: F, G, NS1, NS2, N, M, M2-1, M2-2, P, SH y L, y una combinación de ellas.
8. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el antígeno del cáncer es un antígeno de la próstata y se selecciona del grupo que consiste en: PSA, PSMA, STEAp , PSCA y PAP, y una combinación de ellos.
9. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el antígeno del cáncer es el antígeno WT1, la tirosinasa, NYES01, PRAME, MAGE o hTERT.
10. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que el procedimiento comprende una etapa de electroporación.
12. La combinación de una molécula de ADN que codifica un antígeno y un anticuerpo TIM-3 antagonista para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además una etapa de administrar al sujeto una vacunación adicional de refuerzo de una molécula de ADN que codifica el antígeno antes de administrar el anticuerpo TIM-3, opcionalmente en la que cualquiera de las etapas de administración incluye la administración de la electroporación al sitio de administración.
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