ES2617434T3 - Péptidos NEIL3 y vacunas que incluyen los mismos - Google Patents

Péptidos NEIL3 y vacunas que incluyen los mismos Download PDF

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Abstract

Un péptido aislado de menos de 15 aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en (i) y (ii) a continuación: (i) un péptido aislado de (a) o (b) a continuación: (a) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 24, 33, 35, 41 y 43; (b) un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 24, 33, 35, 41 y 43, en la que 1 o 2 aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos, en el que el péptido tiene inducibilidad de CTL; y (ii) un péptido aislado de (c) o (d) a continuación: (c) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 5, 3, 4, 6, 11, 15, 17, 21 y 22; (d) un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 5, 3, 4, 6, 11, 15, 17, 21 y 22, en la que 1 o 2 aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos, en el que el péptido tiene inducibilidad de CTL.

Description

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En la presente, los péptidos de la presente invención también se pueden describir como “péptidos NEIL3” o “polipéptidos NEIL3”.
III. Preparación de los péptidos NEIL3
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos se pueden preparar sintéticamente, mediante tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar individualmente o como polipéptidos más largos, incluyendo dos o más péptidos. Los péptidos se pueden aislar, es decir, purificar o aislar prácticamente libres de otras proteínas de células hospedantes que se presentan en la naturaleza y fragmentos de las mismas, o cualesquiera otras sustancias químicas.
Los péptidos de la presente invención pueden contener modificaciones, tales como glicosilación, oxidación de la cadena lateral, o fosforilación, siempre y cuando las modificaciones no destruyan la actividad biológica de los péptidos como se describe en la presente. Otras modificaciones incluyen la incorporación de D-aminoácidos u otros miméticos de aminoácidos que se puedan utilizar, por ejemplo, para aumentar la vida media sérica de los péptidos.
Un péptido de la presente invención se puede obtener a través de síntesis química con base en la secuencia seleccionada de aminoácidos. Por ejemplo, los métodos convencionales para síntesis de péptidos que se pueden adoptar para la síntesis incluyen:
(i)
Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii)
The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis (en japonés), Maruzen Co., 1975;
(iv)
Basics and Experiment of Peptide Synthesis (en japonés), Maruzen Co., 1985;
(v)
Development of Pharmaceuticals (segundo volumen) (en japonés), Vol. 14 (síntesis de péptidos), Hirokawa, 1991;
(vi)
documento WO99/67288; y
(vii) Barany G. y Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, “Solid Phase Peptide Synthesis”, Academic Press, New York, 1980, 100-118.
Alternativamente, los péptidos de la presente se pueden obtener al adoptar cualesquiera métodos conocidos de ingeniería genética para la producción de péptidos (por ejemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Por ejemplo, en primer lugar, un vector adecuado que alberga un polinucleótido que codifica el péptido objetivo en una forma que se puede expresar (por ejemplo, en dirección 3’ de una secuencia reguladora correspondiente a una secuencia promotora) se prepara y transforma en una célula hospedante adecuada. Estos vectores y células hospedantes también se proporcionan por la presente invención. La célula hospedante se cultiva luego para producir el péptido de interés. El péptido también se puede producir in vitro adoptando un sistema de traducción in vitro.
IV. Polinucleótidos
La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente de la presente invención. Éstos incluyen los polinucleótidos derivados del gen NEIL3 que se presenta en la naturaleza (No. de acceso GenBank NM_018248 (por ejemplo, SEC ID NO: 44)) y aquellos que tienen una de las secuencias nucleotídicas modificada conservativamente del mismo. En la presente, la frase “secuencia nucleotídica modificada conservativamente” se refiere a secuencias que codifican las secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, muchos de los ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. De esta forma, en cada posición en la que se especifica una alanina por un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son “variaciones silenciosas”, que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente, que codifica un péptido, también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina, y TGG, que es normalmente el único codón para triptófano) se puede modificar para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un péptido se describe implícitamente en cada secuencia descrita.
El polinucleótido de la presente invención puede estar compuesto de ADN, ARN, o derivados de los mismos. Como se conoce bien en la técnica, una molécula de ADN está compuesta de bases tales como las bases A, T, C y G, que se presentan en la naturaleza, y T se reemplaza por U en un ARN. Un experto reconocerá que las bases que no se presentan en la naturaleza también se pueden incluir en los polinucleótidos.
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El polinucleótido de la presente invención puede codificar múltiples péptidos de la presente invención, con o sin secuencias de aminoácidos intermedias. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos intermedia puede proporcionar un sitio de escisión (por ejemplo, la secuencia para reconocimiento de enzimas) del polinucleótido o de los péptidos traducidos. Además, el polinucleótido puede incluir cualesquiera secuencias adicionales para la secuencia codificante que codifica el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido recombinante que incluye secuencias reguladoras requeridas para la expresión del péptido, o puede ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores, etc. En general, estos polinucleótidos recombinantes se pueden preparar mediante la manipulación de polinucleótidos a través de técnicas recombinantes convencionales utilizando, por ejemplo, polimerasas y endonucleasas.
Se pueden utilizar técnicas tanto recombinantes como de síntesis química para producir los polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleótido se puede producir mediante la inserción en un vector adecuado, que se puede expresar cuando se transfecta en una célula competente. Alternativamente, un polinucleótido se puede amplificar utilizando técnicas de PCR o la expresión en hospedantes adecuados (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Alternativamente, un polinucleótido se puede sintetizar utilizando las técnicas de fase sólida, como se describe en Beaucage SL y Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.
V. Exosomas
La presente invención proporciona además vesículas intracelulares denominadas exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos de la presente invención y los antígenos HLA sobre su superficie. Los exosomas se pueden preparar, por ejemplo, al utilizar los métodos detallados en las publicaciones de Kohyo de la solicitud de patente japonesa No. Hei 11-510507 y en el documento WO99/03499, y se pueden preparar utilizando las APC obtenidas de pacientes que sean sujetos para tratamiento y/o prevención. Los exosomas de la presente invención se pueden inocular como vacunas, similarmente a los péptidos de la presente invención.
El tipo de antígenos HLA incluido en los complejos debe coincidir con el del sujeto que requiere tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, para los japoneses, HLA-A24 y HLA-A2, en particular HLA-A*2402 y HLA-A*0201 y HLAA*0206, a menudo son adecuados. El uso del tipo A24 o el tipo A2 que se expresa altamente entre japoneses y caucásicos es favorable para obtener resultados efectivos, y son de utilidad los subtipos, tales como A*2402, A*0201 y A*0206. Típicamente, en la clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investiga por adelantado, lo cual permite la selección adecuada de péptidos que tengan altos niveles de afinidad de unión a este antígeno, o que tengan inducibilidad de CTL mediante la presentación de antígenos. Además, para obtener péptidos que muestren alta afinidad de unión e inducibilidad de CTL, se puede realizar la sustitución, supresión o adición de 1
o 2 aminoácidos con base a la secuencia de aminoácidos del péptido parcial NEIL3 que se presenta en la naturaleza.
En caso de utilizar el antígeno HLA tipo A2 para el exosoma de la presente invención, son de utilidad los péptidos que incluyen la secuencia de las SEC ID NOs: 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21 y 22.
Alternativamente, en caso de utilizar el antígeno HLA tipo A24 para el exosoma de la presente invención, son de utilidad los péptidos que tienen una secuencia según cualquiera de las SEC ID NOs: 24, 33, 35, 41 y 43.
VI. Células que presentan antígenos (APC)
La presente invención también proporciona las APC aisladas que presentan complejos formados con antígenos HLA y los péptidos de la presente invención sobre sus superficies. Las APC se pueden derivar de pacientes que sean sujetos a tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar como vacunas por sí mismas o en combinación con otros fármacos, entre los que se incluyen los péptidos de la presente invención, exosomas, o los CTL.
Las APC no se limitan a un tipo particular de células, e incluyen las DC, células de Langerhans, macrófagos, células B y células T activadas, que se sabe que presentan antígenos proteinosos sobre su superficie celular para que sean reconocidos por los linfocitos. Debido a que la DC es una APC representativa que tiene la mayor actividad inducitora de CTL entre las APC, las DC son de utilidad como las APC de la presente invención.
Por ejemplo, las APC de la presente invención se pueden obtener al inducir las DC de monocitos de sangre periférica y luego al ponerlas en contacto (estimularlas) con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando los péptidos de la presente invención se administran a los sujetos, las APC que presentan los péptidos de la presente invención se inducen en el cuerpo del sujeto. Por lo tanto, las APC de la presente invención se pueden obtener al recolectar las APC del sujeto después de administrar los péptidos de la presente invención al sujeto. Alternativamente, las APC de la presente invención se pueden obtener al poner en contacto las APC recolectadas de un sujeto con el péptido de la presente invención.
Las APC de la presente invención se pueden administrar a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer en el sujeto por sí mismas o en combinación con otros fármacos, entre los que se incluyen los péptidos, exosomas o los CTL de la presente invención. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir las etapas de:
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Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar para tratar y/o prevenir cánceres, y/o la prevención de la recurrencia post-operatoria del mismo en sujetos o pacientes, entre los que se incluyen seres humanos y cualquier otro mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, ratones, ratas, cobayas, conejos, gatos, perros, ovejas, cabras, cerdos, ganado vacuno, caballos, monos, babuinos, y chimpancés, en particular un animal comercialmente importante o un animal domesticado.
La presente descripción también proporciona el uso de un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a)
un péptido de la presente invención;
(b)
un ácido nucleico que codifica ese péptido según se expone en la presente en una forma expresable;
(c)
una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención sobre su superficie; y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención en la fabricación de una composición o sustancia farmacéutica para el tratamiento o prevención del cáncer o tumor. Alternativamente, la presente invención proporciona además un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a)
un péptido de la presente invención;
(b)
un ácido nucleico que codifica ese péptido según se expone en la presente en una forma expresable;
para utilizarse en el tratamiento o prevención del cáncer o tumor.
La presente descripción proporciona además un método o procedimiento para fabricar una composición o sustancia farmacéutica para el tratamiento o prevención del cáncer o tumor, en el que el método o procedimiento incluye la etapa de formular un portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable con un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a)
un péptido de la presente invención;
(b)
un ácido nucleico que codifica ese péptido según se expone en la presente en una forma expresable;
(c)
una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención sobre su superficie; y
(d)
una célula T citotóxica de la presente invención
como ingredientes activos.
La presente descripción también proporciona un método o procedimiento para fabricar una composición o sustancia farmacéutica para el tratamiento o prevención del cáncer o tumor, en el que el método o procedimiento incluye las etapas de mezclar un ingrediente activo con un portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable, en el que el ingrediente activo se selecciona de entre:
(a)
un péptido de la presente invención;
(b)
un ácido nucleico que codifica ese péptido según se expone en la presente en una forma expresable;
(c)
una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención sobre su superficie; y
(d)
una célula T citotóxica de la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que los péptidos entre los que se incluyen la secuencia de aminoácidos de las SEC ID NOs: 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 y 43 son los péptidos epitópicos restringidos a HLA-A24 o HLA-A2, o los candidatos que pueden inducir una respuesta inmunitaria potente y específica. Por lo tanto, las sustancias o composiciones farmacéuticas de la presente que incluyen cualquiera de estos péptidos con las secuencias de aminoácidos de las SEC ID NOs: 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 y 43 son particularmente adecuadas para la administración a sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2. Lo mismo se aplica a las sustancias o composiciones farmacéuticas que incluyen los polinucleótidos que codifican
40 cualquiera de estos péptidos (es decir, los polinucleótidos de la presente invención).
Los cánceres que serán tratados por las sustancias o composiciones farmacéuticas de la presente invención no están limitados, e incluyen cualquier cáncer en el cual esté implicado NEIL3 (por ejemplo, se sobre-exprese), por ejemplo cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer hepático, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, cáncer prostático,
45 carcinoma renal, SCLC, tumor de tejido blando, AML y CML.
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Las sustancias o composiciones farmacéuticas de la presente pueden contener, además de los ingredientes activos mencionados anteriormente, otros péptidos que tengan la capacidad de inducir los CTL contra células cancerosas, otros polinucleótidos que codifican los otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos, etc. En la presente, los otros péptidos que tienen la capacidad de inducir los CTL contra células cancerosas se ejemplifican por antígenos específicos del cáncer (por ejemplo, los TAA identificados), aunque no se limitan a los mismos.
Si es necesario, las sustancias o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir opcionalmente otras sustancias terapéuticas como un ingrediente activo, siempre y cuando la sustancia no inhiba el efecto antitumoral del ingrediente activo, por ejemplo cualquiera de los péptidos de la presente. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir sustancias o composiciones antiinflamatorias, analgésicos, sustancias quimioterapéuticas, y similares. Además de otras sustancias terapéuticas en el medicamento mismo, los medicamentos de la presente invención también se pueden administrar secuencial o concurrentemente con una o más de otras sustancias o composiciones farmacológicas. Las cantidades de medicamento y la sustancia o composición farmacológica dependen, por ejemplo, del tipo de sustancias o composiciones farmacológicas que se utilizan, la enfermedad que será tratada, y el calendario y vías de administración.
Se debe entender que, además de los ingredientes particularmente mencionados en la presente, las sustancias o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir otras sustancias o composiciones convencionales en la técnica habiendo considerado el tipo de formulación en cuestión.
En una realización de la presente invención, las sustancias o composiciones farmacéuticas de la presente se pueden incluir en artículos de fabricación y kits que contengan los materiales útiles para el tratamiento de las condiciones patológicas de la enfermedad que será tratada, por ejemplo el cáncer. El artículo de fabricación puede incluir un recipiente de cualquiera de las sustancias o composiciones farmacéuticas de la presente con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. La etiqueta en el recipiente deberá indicar la sustancia o composición utilizada para el tratamiento o prevención de una o más condiciones de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar las direcciones de administración, etc.
Además del recipiente descrito anteriormente, un kit que incluye una sustancia o composición farmacéutica de la presente invención puede incluir opcionalmente además un segundo recipiente que aloje un diluyente farmacéuticamente aceptable. Además puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de envase con las instrucciones para utilizarse.
Las composiciones farmacéuticas, si se desea, se pueden presentar en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contengan el ingrediente activo. El paquete puede incluir, por ejemplo, una lámina de metal o plástico, tal como un envase de blíster. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración.
(1) Sustancias o composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos como el ingrediente activo
Los péptidos de la presente invención se pueden administrar directamente como una sustancia o composición farmacéutica, o si es necesario, que se haya formulado mediante métodos de formulación convencionales. En el último caso, además de los péptidos de la presente invención, se pueden incluir portadores, excipientes, y demás que se utilicen por lo general para fármacos, según sea adecuado sin limitaciones particulares. Los ejemplos de estos portadores son agua esterilizada, disolución salina fisiológica, amortiguador de fosfato, fluido para cultivos, y demás. Además, las sustancias o composiciones farmacéuticas pueden contener según sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos, y demás. Las sustancias o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar para fines anticancerosos.
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar en combinación, lo cual incluye dos o más de los péptidos de la presente invención, para inducir el CTL in vivo. Los péptidos pueden estar en un cóctel o se pueden conjugar entre sí utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos se pueden enlazar o expresar químicamente como una secuencia polipeptídica de fusión individual que puede tener uno o varios aminoácidos como un enlazador (por ejemplo, enlazador de lisina: K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715). Los péptidos en la combinación pueden iguales o diferentes. Al administrar los péptidos de la presente invención, los péptidos se presentan en alta densidad por los antígenos HLA sobre las APC, luego se inducen los CTL que reaccionan específicamente frente al complejo formado entre el péptido presentado y el antígeno HLA. Alternativamente, las APC (por ejemplo, las DC) se retiran de los sujetos y luego se estimulan por los péptidos de la presente invención para obtener las APC que presentan cualquiera de los péptidos de la presente invención sobre su superficie celular. Estas APC se vuelven a administrar a los sujetos para inducir los CTL en los sujetos, y como resultado, se puede aumentar la agresividad hacia el endotelio asociado al tumor.
Las sustancias o composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o prevención del cáncer, que incluye cualquiera de los péptidos de la presente invención como el ingrediente activo, pueden incluir un adyuvante, de tal forma que se establecerá efectivamente una inmunidad celular, o se pueden administrar con otros ingredientes activos, y se
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Alternativamente, la presente invención proporciona un método para preparar una célula que presenta antígenos (APC), que induce específicamente una actividad CTL contra NEIL3, en el que el método puede incluir una de las siguientes etapas:
(a)
poner en contacto una APC con un péptido de la presente invención in vitro, y
(b)
introducir en una APC un polinucleótido que codifica un péptido de la presente invención.
(2) Método para inducir los CTL
Además, la presente invención proporciona métodos para inducir los CTL utilizando los péptidos, polinucleótidos, exosomas o las APC de la presente invención.
La presente invención también proporciona los métodos para inducir los CTL utilizando un polinucleótido que codifica un polipéptido que sea capaz de formar una subunidad del receptor de células T (TCR) que reconoce un complejo de los péptidos de la presente invención y los antígenos HLA. De preferencia, los métodos para inducir los CTL pueden incluir al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en:
a) poner en contacto una célula T CD8 positiva con una célula que presenta antígenos y/o un exosoma que presenta sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención; y
b) introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido que es capaz de formar una subunidad del TCR que reconoce un complejo de un péptido de la presente invención y un antígeno HLA en una célula CD8 positiva.
Cuando los péptidos, los polinucleótidos, las APC, o los exosomas de la presente invención se administran a un sujeto, los CTL son inducidos en el cuerpo del sujeto y se intensifica la resistencia de la respuesta inmunitaria dirigida a las células cancerosas. De esta forma, los métodos de la presente descripción incluyen la etapa de administrar los péptidos, los polinucleótidos, las APC o los exosomas de la presente invención a un sujeto.
Alternativamente, los CTL también se pueden inducir al utilizarlos ex vivo, y después de inducir los CTL, los CTL activados se pueden devolver al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir las etapas de:
a: recolectar las APC de un sujeto;
b: poner en contacto las APC de la etapa a con el péptido; y
c: co-cultivar las APC de la etapa b con las células CD8 positivas.
Las APC que se subcultivan con las células CD8 positivas en la etapa c anterior también se pueden preparar al transferir un gen que incluye un polinucleótido de la presente invención en las APC, como se describió anteriormente en la sección “VI. Células que presentan antígenos”, aunque no se limitan a las mismas, y para el presente método se pueden utilizar cualesquiera de las APC que presentan efectivamente sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido de la presente invención.
En lugar de estas APC, también se pueden utilizar los exosomas, que presentan sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido de la presente invención. A saber, la presente invención puede incluir la etapa de cocultivar exosomas que presentan sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido de la presente invención. Estos exosomas se pueden preparar mediante los métodos descritos anteriormente en la sección “V. exosomas”.
Además, el CTL se puede inducir al introducir un gen que incluye un polinucleótido que codifica la subunidad del TCR que se une al péptido de la presente invención en las células CD8 positivas. Esta transducción se puede realizar como se describió anteriormente en la sección “VIII. Receptor de células T (TCR)”.
Además, la presente descripción proporciona un método o procedimiento para fabricar una sustancia o composición farmacéutica que induce los CTL, en el que el método incluye la etapa de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un portador farmacéuticamente aceptable.
(3) Método para inducir una respuesta inmunitaria
Además, la presente invención proporciona métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra una enfermedad relacionada con NEIL3. Las enfermedades adecuadas pueden incluir cáncer, por ejemplo, de manera enunciativa, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer hepático, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, cáncer prostático, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejido blando, AML y CML.
Los métodos pueden incluir la etapa de administrar la sustancia o sustancias o composición o composiciones que contengan cualquiera de los péptidos de la presente invención o los polinucleótidos que los codifican. El presente método inventivo también puede contemplar la administración de exosomas o las APC que presentan cualquiera de
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Además, el producto de transcripción de NEIL3 (por ejemplo, SEC ID NO: 45) se puede cuantificar utilizando cebadores mediante métodos de detección a base de amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Estos cebadores se pueden preparar con base en la información de secuencias disponible del gen.
Específicamente, una sonda o cebador utilizados para el método de la presente se hibrida bajo condiciones rigurosas, moderadamente rigurosas, o poco rigurosas al ARNm de NEIL3. En el sentido en el que se utiliza en la presente, la frase “condiciones rigurosas (de hibridación)” se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda o cebador se hibridarán a su secuencia diana, aunque no a otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia, y serán diferentes bajo diferentes circunstancias. La hibridación específica de secuencias más largas se observa a mayores temperaturas que las secuencias más cortas. En general, la temperatura de una condición rigurosa se selecciona para que sea de aproximadamente 5ºC menor que el punto de fusión térmico (Tm) para una secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica, un pH y una concentración de ácido nucleico definidos) a la cual el 50% de las sondas complementarias a su secuencia diana se hibridan a la secuencia diana en equilibrio. Debido a que las secuencias diana están en general presentes en exceso, a una Tm, el 50% de las sondas se ocupan en equilibrio. Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración salina es menor que aproximadamente 1,0 M de ion sodio, típicamente aproximadamente 0,01 hasta 1,0 M de ion sodio (u otras sales) a pH de 7,0 hasta 8,3, y la temperatura es al menos aproximadamente 30ºC para las sondas o cebadores cortos (por ejemplo, 10 hasta 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas o cebadores más largos. Las condiciones rigurosas también se pueden alcanzar con la adición de sustancias desestabilizantes, tales como formamida.
Alternativamente, para el diagnóstico de la presente descripción se puede detectar el producto de traducción. Por ejemplo, se puede determinar la cantidad de la proteína NEIL3 (SEC ID NO: 45) o el fragmento inmunológico de la misma. Los métodos para determinar la cantidad de proteína como el producto de traducción incluyen métodos de inmunoensayos que utilizan un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Además, para la detección se puede utilizar cualquier fragmento o modificación (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab’)2, Fv, etc.) del anticuerpo, siempre y cuando el fragmento o anticuerpo modificado conserve la capacidad de unión a la proteína NEIL3. Por la presente invención también se proporcionan estos anticuerpos contra los péptidos de la presente invención y los fragmentos de los mismos. Son bien conocidos los métodos para preparar estos tipos de anticuerpos para la detección de proteínas, y se puede emplear cualquier método en la presente invención para preparar estos anticuerpos y los equivalentes de los mismos.
Como otro método para detectar el nivel de expresión del gen NEIL3 con base en su producto de traducción, la intensidad de tinción se puede medir vía análisis inmunohistoquímico utilizando un anticuerpo contra la proteína NEIL3. A saber, en esta medida, una tinción fuerte indica una presencia/nivel aumentado de la proteína y, al mismo tiempo, un alto nivel de expresión del gen NEIL3.
Se puede determinar que el nivel de expresión de un gen diana, por ejemplo el gen NEIL3, en células cancerosas está incrementado si el nivel aumenta a partir del nivel de control (por ejemplo, el nivel en células normales) del gen diana en, por ejemplo, el 10%, 25% o 50%, o aumenta hasta más de 1,1 veces, más de 1,5 veces, más de 2,0 veces, más de 5,0 veces, más de 10,0 veces, o más.
El nivel de control se puede determinar al mismo tiempo con las células cancerosas al utilizar una muestra o muestras recolectadas anteriormente y almacenadas de un sujeto o sujetos cuyo estado o estados mórbidos (cancerosos o no cancerosos) son conocidos. Además, las células normales obtenidas de regiones no cancerosas de un órgano que tiene el cáncer que será tratado se pueden utilizar como un control normal. Alternativamente, el nivel de control se puede determinar mediante un método estadístico en base a los resultados obtenidos analizando el nivel o niveles de expresión determinados anteriormente del gen NEIL3 en muestras provenientes de sujetos cuyos estados mórbidos son conocidos.
Además, el nivel control se puede derivar de una base de datos de patrones de expresión a partir de células ensayadas anteriormente. Además, de acuerdo con un aspecto de la presente descripción, el nivel de expresión del gen NEIL3 en una muestra biológica se puede comparar con múltiples niveles de control, que se determinan a partir de múltiples muestras de referencia. Se prefiere utilizar un nivel de control determinado a partir de una muestra de referencia derivada de un tipo de tejido similar al de la muestra biológica derivada de un sujeto. Además, se prefiere utilizar el valor estándar de los niveles de expresión del gen NEIL3 en una población con un estado mórbido conocido. El valor estándar se puede obtener mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, como valor estándar, se puede utilizar un intervalo de media +/-2 S.D. o media +/-3 S.D.
Cuando el nivel de expresión del gen NEIL3 se aumenta en comparación con el nivel de control normal, o es similar/equivalente al nivel control canceroso, al sujeto se le puede diagnosticar con el cáncer que será tratado.
Más específicamente, la presente descripción proporciona un método para (i) diagnosticar si un sujeto es sospechoso o no de tener un cáncer que será tratado y/o (ii) seleccionar a un sujeto para el tratamiento del cáncer, método el cual puede incluir las etapas de:
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Alternativamente, el diagnóstico se puede realizar mediante un método que permita la cuantificación directa de las células T específicas del antígeno mediante tinción con complejos multiméricos de HLA marcados con fluoresceína (por ejemplo, Altman, J. D. et al., 1996, Science 274: 94; Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330). También se ha proporcionado la tinción para linfocinas intracelulares, y los ensayos de liberación de interferón-gamma o ensayos ELISPOT. La tinción multimérica, la tinción para linfocinas intracelulares y los ensayos ELISPOT todos parecen ser al menos 10 veces más sensibles que los ensayos más convencionales (Murali-Krishna,
K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol.
8: 413). También se pueden utilizar pentámeros (por ejemplo, documento US 2004-209295A), dextrámeros (por ejemplo, documento WO 02/072631), y estreptámeros (por ejemplo, Nature medicine 6. 631-637 (2002)).
XI. Anticuerpos
La presente invención proporciona además anticuerpos que se unen al péptido de la presente invención. Los anticuerpos preferidos específicamente se unen al péptido de la presente invención y no se unirán (o se unirán débilmente) a los que no son péptidos de la presente invención. Alternativamente, los anticuerpos se unen al péptido de la invención, así como también a los homólogos de los mismos. Los anticuerpos contra el péptido de la invención pueden ser de utilidad en análisis de diagnóstico y pronóstico de cáncer, y metodologías para formación de imágenes. De manera similar, estos anticuerpos pueden ser de utilidad en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de otros cánceres, hasta el grado en que NEIL3 también se expresa o sobre-expresa en el paciente con cáncer. Además, los anticuerpos expresados intracelularmente (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios) pueden ser de utilidad terapéuticamente en el tratamiento de cánceres en los que está implicada la expresión de NEIL3, tales como, por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer hepático, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, cáncer prostático, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejido blando, AML y CML.
La presente descripción también proporciona diversos ensayos inmunológicos para la detección y/o cuantificación de proteína NEIL3 (SEC ID NO: 45) o los fragmentos de la misma, incluyendo el polipéptido que consiste en las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 y 43. Estos análisis pueden incluir uno o más anticuerpos anti-NEIL3 capaces de reconocer y unirse a una proteína NEIL3 o los fragmentos de la misma, según se adecuado. En la presente invención, los anticuerpos anti-NEIL3 que se unen al polipéptido NEIL3 de preferencia reconocen el polipéptido que consiste en las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 y 43. Una especificidad de unión del anticuerpo se puede confirmar con un ensayo de inhibición. Es decir, cuando la unión entre un anticuerpo que se analizará y la longitud completa del polipéptido NEIL3 se inhibe en la presencia de cualesquiera fragmentos polipeptídicos que consisten en la secuencia de aminoácidos de las SEC ID NOs: 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 y 43, se muestra que este anticuerpo se une específicamente al fragmento. En la presente invención, estos ensayos inmunológicos se realizan dentro de diversos formatos de ensayos inmunológicos bien conocidos en la técnica, incluyendo de manera enunciativa: diversos tipos de radioinmunoensayos, técnica de inmunocromatografía, ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes enlazados a enzimas (ELIFA), y similares.
Los ensayos inmunológicos pero no de anticuerpos relacionados de la descripción también pueden incluir ensayos de inmunogenicidad de células T (inhibidores o estimuladores), así como también ensayos de unión a MHC. Además, también se proporcionan por la invención los métodos para formación de imágenes inmunológicas capaces de detectar cánceres que expresan NEIL3, incluyendo, de manera enunciativa, métodos para formación de imágenes radioescintigráficas utilizando los anticuerpos marcados de la presente invención. Estos ensayos pueden ser de utilidad clínica en la detección, monitorización y pronóstico de cánceres que expresan NEIL3 tales como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer hepático, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, cáncer prostático, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejido blando, AML y CML.
La presente invención también proporciona un anticuerpo que se une al péptido de la invención. El anticuerpo de la invención se puede utilizar de cualquier forma, tales como los anticuerpos monoclonales o policlonales, e incluyen antisuero obtenido al inmunizar un animal, tal como un conejo, con el péptido de la invención, todas las clases de anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados producidos mediante recombinación genética.
Un péptido de la invención utilizado como un antígeno para obtener un anticuerpo se puede derivar de cualquier especie animal, aunque de preferencia se deriva de un mamífero tal como un ser humano, ratón o rata, de mayor preferencia de un ser humano. Un péptido derivado de un ser humano se puede obtener de las secuencias nucleotídicas o aminoácidos expuestas en la presente.
De acuerdo con la presente invención, el péptido que se utilizará como un antígeno de inmunización puede ser una proteína completa o un péptido parcial de la proteína. Un péptido parcial puede incluir, por ejemplo, el fragmento amino (N)-terminal o carboxi (C)-terminal de un péptido de la presente invención.
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En la presente, un anticuerpo se define como una proteína que reacciona con la longitud completa o un fragmento de un péptido NEIL3. En una realización preferida, el anticuerpo de la presente invención puede reconocer los fragmentos peptídicos de NEIL3 que consisten en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 y 43. Los métodos para sintetizar oligopéptidos son bien conocidos en las técnicas. Después de la síntesis, los péptidos se pueden purificar opcionalmente antes de utilizarse como inmunógeno. En la presente invención, el oligopéptido (por ejemplo, 9-o 10 mero) se puede conjugar
o enlazar con portadores para intensificar la inmunogenicidad. Es bien conocida como el portador la hemocianina de lapa californiana (KLH). También es bien conocido en la técnica el método para conjugar la KLH y el péptido.
Alternativamente, un gen que codifica un péptido de la invención o un fragmento del mismo se puede insertar en un vector de expresión conocido, que luego se utiliza para transformar una célula hospedante como se describe en la presente. El péptido deseado o fragmento del mismo se puede recuperar desde el exterior o interior de las células hospedantes mediante cualquier método estándar, y posteriormente se puede utilizar como un antígeno. Alternativamente, como el antígeno, se pueden utilizar células completas que expresan el péptido o sus lisados o un péptido sintetizado químicamente.
Cualquier animal mamífero se puede inmunizar con el antígeno, aunque de preferencia se toma en cuenta la compatibilidad con las células parentales utilizadas para la fusión celular. En general, se pueden utilizar animales de Rodentia, Lagomorpha o primates. Los animales de Rodentia incluyen, por ejemplo, ratones, ratas y hámsters. Los animales de Lagomorpha incluyen, por ejemplo, conejos. Los animales de primates incluyen, por ejemplo, un mono de Catarrhini (mono del viejo continente), tal como Macaca fascicularis, mono rhesus, babuino sagrado y chimpancés.
Los métodos para inmunizar animales con antígenos son conocidos en la técnica. La inyección intraperitoneal o la inyección subcutánea de antígenos es un método estándar para la inmunización de los mamíferos. Más específicamente, los antígenos se pueden diluir y suspender en una cantidad adecuada de disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), disolución salina fisiológica, etc. Si se desea, la suspensión del antígeno se puede mezclar con una cantidad adecuada de un adyuvante estándar, tal como adyuvante completo de Freund, se puede convertir en una emulsión y después se puede administrar a animales mamíferos. De preferencia, es seguido de diversas administraciones del antígeno mezclado con una cantidad adecuada del adyuvante incompleto de Freund cada 4 hasta 21 días. Para la inmunización también se puede utilizar un portador adecuado. Después de la inmunización como antes, el suero se puede examinar mediante un método estándar en busca de un aumento en la cantidad de anticuerpos deseados.
Los anticuerpos policlonales contra los péptidos de la presente invención se pueden preparar recolectando sangre del mamífero inmunizado examinado en busca del incremento de los anticuerpos deseados en el suero, y separando suero de la sangre mediante cualquier método convencional. Los anticuerpos policlonales incluyen suero que contiene los anticuerpos policlonales, así como también se puede aislar del suero la fracción que contiene los anticuerpos policlonales. La inmunoglobulina G o M se puede preparar a partir de una fracción que reconoce sólo el péptido de la presente invención, utilizando, por ejemplo, una columna de afinidad acoplada con el péptido de la presente invención, y purificando adicionalmente esta fracción utilizando una columna de proteína A o de proteína G.
Para preparar los anticuerpos monoclonales, se recolectan células inmunitarias provenientes del mamífero inmunizado con el antígeno, y se verifican en busca del nivel aumentado de los anticuerpos deseados en el suero como se describió anteriormente, y se someten a fusión celular. Las células inmunitarias utilizadas para la fusión celular de preferencia se pueden obtener del bazo. Otras células parentales preferidas que se fusionarán con el inmunocito anterior incluyen, por ejemplo, células de mieloma de los mamíferos, y de mayor preferencia células de mieloma que tengan una propiedad adquirida para la selección de células fusionadas mediante fármacos.
El inmunocito anterior y las células de mieloma se pueden fusionar de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo el método de Milstein et al. (Galfre y Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).
Los hibridomas resultantes obtenidos por la fusión celular se pueden seleccionar al cultivarlos en un medio de selección estándar, tal como medio HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo celular típicamente se continúa en el medio HAT durante varios días hasta varias semanas, siendo el tiempo suficiente para permitir que mueran las otras células, con excepción del hibridoma deseado (las células no fusionadas). Luego, se puede realizar la dilución limitante estándar para seleccionar y clonar una célula de hibridoma que produzca el anticuerpo deseado.
Además del método anterior, en el cual se inmuniza un animal no humano con un antígeno para preparar el hibridoma, los linfocitos humanos, tales como aquellos infectados por el virus de EB, se pueden inmunizar con un péptido, células que expresen el péptido, o sus lisados, in vitro. Luego, los linfocitos inmunizados se fusionan con las células de mieloma derivadas de ser humano que son capaces de dividirse indefinidamente, tales como U266, para proporcionar un hibridoma que produce un anticuerpo humano deseado que es capaz de unirse al péptido (Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar No. Sho 63-17688).
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Los hibridomas obtenidos posteriormente se trasplantan en la cavidad abdominal de un ratón, y se extraen los fluidos ascíticos. Los anticuerpos monoclonales obtenidos se pueden purificar, mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, una columna de proteína A o proteína G, cromatografía de intercambio iónico con DEAE, o una columna de afinidad a la cual se acopla el péptido de la presente invención. El anticuerpo de la presente invención se puede utilizar no sólo para la purificación y detección del péptido de la presente invención, sino también como un candidato para los agonistas y antagonistas del péptido de la presente invención.
Alternativamente, una célula inmunitaria, tal como un linfocito inmunizado, que produce anticuerpos se puede inmortalizar mediante un oncogén y se puede utilizar para preparar los anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales obtenidos de esta forma también se pueden preparar recombinantemente utilizando técnicas de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Borrebaeck y Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers LTD (1990)). Por ejemplo, un ADN que codifica un anticuerpo se puede clonar a partir de una célula inmunitaria, tal como un hibridoma o un linfocito inmunizado que produce el anticuerpo, se puede insertar en un vector adecuado, y se puede introducir en células hospedantes para preparar un anticuerpo recombinante. La presente descripción también proporciona anticuerpos recombinantes preparados como se describió anteriormente.
Además, un anticuerpo de la presente invención puede ser un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo modificado, siempre y cuando se una a uno o más de los péptidos de la invención. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab, F(ab’)2, Fv o Fv monocatenario (scFv), en el cual los fragmentos Fv de las cadenas H y L se ligan mediante un enlazador adecuado apropiado (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Más específicamente, un fragmento de anticuerpo se puede generar al tratar un anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina. Alternativamente, un gen que codifica el fragmento de anticuerpo se puede construir, insertar en un vector de expresión y expresar en una célula hospedante adecuada (véanse, por ejemplo Co et al., J Immunol
152: 2968-76 (1994); Better y Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun y Skerra, Methods Enzymol
178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird y Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).
Un anticuerpo se puede modificar mediante la conjugación con una variedad de moléculas, tal como polietilenglicol (PEG). La presente descripción proporciona estos anticuerpos modificados. El anticuerpo modificado se puede obtener al modificar químicamente un anticuerpo. Estos métodos de modificación son convencionales en el campo.
Alternativamente, un anticuerpo de la presente invención se puede obtener como un anticuerpo quimérico, entre una región variable derivada de un anticuerpo no humano y la región constante derivada del anticuerpo humano, o como un anticuerpo humanizado, que incluye la región de determinante de la complementariedad (CDR) derivada del anticuerpo no humano, la región de estructura (FR) y la región constante derivada del anticuerpo humano. Estos anticuerpos se pueden preparar de acuerdo con una tecnología conocida. La humanización se puede realizar al sustituir las CDR de roedor o las secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). Por consiguiente, estos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en los que se ha sustituido menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana.
También se pueden utilizar anticuerpos totalmente humanos, que incluyen regiones variables humanas además de las región de estructura y región constante humanas. Estos anticuerpos se pueden producir utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los métodos in vitro implican el uso de bibliotecas recombinantes de fragmentos de anticuerpos humanos presentados en bacteriófagos (por ejemplo, Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol.
227:381 (1991). De manera similar, los anticuerpos humanos se pueden obtener al introducir un locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones en los cuales se hayan inactivado parcial o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes
U.S. Nos. 6.150.584, 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016.
Los anticuerpos obtenidos como en lo anterior se pueden purificar hasta homogeneidad. Por ejemplo, la separación y purificación del anticuerpo se puede realizar de acuerdo con los métodos de separación y purificación utilizados para proteínas generales. Por ejemplo, el anticuerpo se puede separar y aislar mediante el uso seleccionado y combinado adecuadamente de cromatografías en columna, tales como cromatografía de afinidad, filtro, ultrafiltración, desalación, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, y enfoque isoeléctrico (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), aunque no se limitan a los mismos. Como columna de afinidad, se pueden utilizar una columna de proteína A y una columna de proteína G. Las columnas de proteína A ilustrativas que se utilizarán incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS y Sepharosa F.F. (Pharmacia).
Una cromatografía ilustrativa, con la excepción de la afinidad, incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción, y similar (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Los procedimientos cromatográficos se pueden llevar a cabo mediante cromatografía en fase líquida, tal como HPLC y FPLC.
27
imagen18
diagnóstico como marcadores para cáncer, y al medir la expresión de NEIL3 en una muestra biológica (por ejemplo, una muestra celular), se puede diagnosticar el cáncer. Específicamente, la presente descripción proporciona un método para diagnosticar cáncer al determinar el nivel de expresión de NEIL3 en el sujeto. Los cánceres que se pueden diagnosticar por el método de la presente incluyen, de manera enunciativa, cáncer de vejiga, cáncer de
5 mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer hepático, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, cáncer prostático, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejido blando, AML y CML. Además, NSCLC, incluido el adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de célula escamosa pulmonar (SCC), también se puede diagnosticar o detectar mediante la presente invención.
Se puede proporcionar un resultado intermedio para examinar la condición del sujeto. Este resultado intermedio se
10 puede combinar con información adicional para ayudar a un doctor, enfermera u otro personal sanitario a diagnosticar que un sujeto padece la enfermedad. Alternativamente, la presente descripción se puede utilizar para detectar células cancerosas en un tejido derivado de un sujeto, y proporcionar a un doctor la información útil para diagnosticar que el sujeto padece la enfermedad.
Específicamente, la presente descripción proporciona los siguientes métodos [1] hasta [10]:
15 [1] Un método para diagnosticar cáncer, incluyendo dicho método las etapas de:
(a)
detectar el nivel de expresión del gen que codifica la secuencia de aminoácidos de NEIL3 en una muestra biológica; y
(b)
correlacionar un aumento en el nivel de expresión detectado en comparación con un nivel de control normal del gen con la presencia de la enfermedad.
20 [2] El método de [1], en el que el nivel de expresión es al menos 10% mayor que el nivel de control normal.
[3] El método de [1], en el que el nivel de expresión se detecta mediante un método seleccionado de entre:
(a)
detectar un ARNm que incluye la secuencia de NEIL3,
(b)
detectar una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de NEIL3, y
(c) detectar una actividad biológica de una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de 25 NEIL3.
[4] El método de [1], en el que el cáncer se selecciona del grupo de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer hepático, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, cáncer prostático, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejido blando, AML y CML.
30 [5] El método de [3], en el que el nivel de expresión se determina al detectar la hibridación de una sonda a un transcrito génico del gen.
[6] El método de [3], en el que el nivel de expresión se determina detectando la unión de un anticuerpo contra la proteína codificada por un gen como el nivel de expresión del gen.
[7] El método de [1], en el que la muestra biológica incluye biopsia, esputo, sangre, efusión pleural u orina.
35 [8] El método de [1], en el que la muestra biológica derivada de un sujeto incluye una célula epitelial.
[9] El método de [1], en el que la muestra biológica derivada de un sujeto incluye una célula cancerosa.
[10] El método de [1], en el que la muestra biológica derivada de un sujeto incluye una célula epitelial cancerosa.
Alternativamente, la presente descripción proporciona un método para detectar o identificar células cancerosas en
40 una muestra de tejido derivada de un sujeto, incluyendo dicho método la etapa de determinar el nivel de expresión del gen NEIL3 en una muestra biológica derivada de un sujeto, en el que un aumento en el nivel de expresión en comparación con un nivel de control normal de dicho gen indica la presencia o sospecha de células cancerosas en el tejido.
Este resultado se puede combinar con información adicional para ayudar a un doctor, enfermera u otro personal
45 sanitario a diagnósticar a un sujeto que sufre la enfermedad. En otras palabras, la presente descripción puede proporcionar a un doctor información útil para diagnosticar a un sujeto que sufre la enfermedad. Por ejemplo, de acuerdo con la presente descripción, cuando existe duda con respecto a la presencia de células cancerosas en el tejido obtenido de un sujeto, las decisiones clínicas se pueden alcanzar al considerar el nivel de expresión del gen NEIL3, más un aspecto diferente de la enfermedad que incluye la patología de tejidos, los niveles de marcadores
50 tumorales conocidos en sangre, y el curso clínico del sujeto, etc.
29
imagen19
imagen20
imagen21
imagen22
Relación de aumento observado de casos de NEIL3 en tejido correspondiente normal
canceroso en comparación con el tejido
Endometriosis
1/1
Cáncer esofágico
4/8
Cáncer hepático
6/10
NSCLC
7/7
Osteosarcoma
16/16
Cáncer pancreático
1/1
Cáncer prostático
10/10
Carcinoma renal
2/2
SCLC
12/12
Tumor de tejido blando
12/12
(Experimental 1) Predicción de los péptidos de unión a HLA-A2 derivados de NEIL3 La Tabla 2 muestra los péptidos de unión a HLA-A2 de NEIL3 en el orden de alta afinidad de unión. Se seleccionó
un total de 23 péptidos con potencial de capacidad de unión a HLA-A2 y se examinaron para determinar los péptidos
epitópicos (Tabla 2).
Tabla 2
Péptidos de unión a HLA-A2 derivados de NEIL3
Posición de partida
Secuencia Puntuación SEC ID NO.
NEIL3-A2-9mero
64 VLSLFNGYV 321,3 1
84
FMYFGPKAL 227,1 2
585
KQCNFFQWA 70,0 3
127
LICFFDSSV 61,8 4
416
FQNSPPASV 32,4 5
71
YVYSGVETL 31,0 6
41
RLAASTVVV 28,5 7
34
SLQGRALRL 21,4 8
298
IISWTSSRV 16,3 9
291
KLPTRNTII 15,0 10
271
RMTYFCPHC 13,6 11
492
NMTDGPRTL 12,7 12
NEIL3-A2-10mero
18 VLPGQAVTGV 271,9 13
212
QLTDEQIHHL 201,4 14
198
ALFDSGLHPA 173,3 15
181
LMDQNVLPGV 78,6 16
34
imagen23
imagen24
imagen25

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  1. imagen1
    imagen2
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