ES2316501T3 - Moleculas marcadoras asociadas con tumores pulmonares. - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado regulado por incremento en tumores pulmonares seleccionado de (a) una molécula de ácido nucleico que presenta la secuencia representada en la figura 1, figura 2 o figura 3; (b) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia diferente de la secuencia del ADNc o ARNm de (a) debido a la degeneración del código genético; y; (c) una molécula de ácido nucleico que es complementaria o inversamente complementaria a las moléculas de ácido nucleico de (a) o (b).

Description

Moléculas marcadoras asociadas con tumores pulmonares.

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos y polipéptidos asociados con cáncer de pulmón. La invención se refiere más específicamente a ácidos nucleicos y a los polipéptidos transcritos de los mismos cuya expresión está significativamente alterada en asociación con cáncer de pulmón. La invención se refiere a una serie de transcritos diferencialmente cortados y empalmados del gen descrito en este documento que están asociados con tumores del tracto respiratorio. Además, la presente invención proporciona un procedimiento para el diagnóstico precoz de tumores pulmonares.

En los países desarrollados, las tasas de mortalidad por cáncer descendieron a lo largo de la década pasada. Una excepción de este descenso en las tasas de mortalidad producidas por cáncer es el cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón en general es uno de los pocos cánceres en el mundo que todavía está mostrando una incidencia creciente. El cáncer de pulmón es la principal causa de muertes por cáncer tanto en hombres como en mujeres. Además, hasta este momento, la tasa de supervivencia en cáncer de pulmón es mala y, a pesar de los esfuerzos científicos y médicos en el campo del cáncer de pulmón, apenas se ha producido un aumento en la tasa de supervivencia.

En los tumores pulmonares, como en la mayoría del resto de tumores, hay una fuerte correlación entre el resultado de los pacientes tras la terapia inicial y la fase en la que se ha diagnosticado la enfermedad. Así, cuanto más temprano pueda detectarse el cáncer, mayores son las probabilidades del paciente de sobrevivir. Por tanto, se requieren procedimientos de prueba sensibles para detectar los tumores en fases tempranas.

Los procedimientos más prometedores para el diagnóstico precoz de tumores son aquellos en los que participan marcadores moleculares característicos para células tumorales.

El cáncer de pulmón es una enfermedad bastante heterogénea. Los múltiples reguladores del crecimiento celular pueden estar implicados en la génesis del cáncer. Estos elementos reguladores del ciclo celular pueden ser tanto reguladores positivos, llamados oncógenos cuando están mutados, de manera que se consigue un estado transformado, como reguladores negativos, llamados genes supresores de tumores. El número de factores que se sabe que está implicado en la regulación del ciclo celular y que son candidatos potenciales para el desarrollo del cáncer supera hasta este momento los 100 y sigue aumentando.

Las moléculas que están implicadas en la aparición del estado canceroso de una célula pueden usarse para discriminar entre células cancerosas y tejido normal. Por tanto, el tejido canceroso puede detectarse mediante la detección de moléculas características de las células cancerosas. Esto resulta ser complejo debido al gran número de moléculas que están potencialmente implicadas en la producción de cáncer.

Para mejorar el diagnóstico de tumores existe la necesidad de nuevas moléculas marcadoras para uso en el diagnóstico de cánceres, y especialmente de cáncer de pulmón, que permitan la detección precoz específica y den la oportunidad de tratar los trastornos en una fase temprana.

La presente invención proporciona ácidos nucleicos y polipéptidos asociados con cáncer de pulmón. Según la presente invención, estas moléculas pueden usarse como marcadores moleculares que permiten la detección integral de tumores pulmonares, incluso en fases tempranas.

En la técnica se conocen ácidos nucleicos cromosómicos y homólogos de ratón de los ácidos nucleicos de LUMA1 descritos según la presente invención. La secuencia humana cromosómica del gen de LUMA1 fue descrita por Tracey, A. bajo el nº de acceso AL359711.18 en la base de datos EMBUGenBank/DDBJ (fecha de presentación: 1 de marzo de 2001). Un homólogo de ratón para ARNm de LUMA1 fue descrita por Arakawa, T. y col. en 2001 bajo el nº de acceso BB653919 en la base de datos EMBUGenBank/DDBJ (fecha de presentación: 6 de julio de 2001). El tumor de hígado de ratón se proporcionó como fuente de tejido del que se había aislado el ácido nucleico. Otro homólogo de ratón que presenta homología de secuencias con las secuencias de LUMA1 descritas en este documento se publicó bajo el nº de acceso BI107698 en la base de datos de ácidos nucleicos de NCI-NIH (fecha de creación: 28 de junio de 2001). Drmanac, RT. y col, describieron en el documento WO0175067 bajo la Sec. ID. nº 5135 un ácido nucleico humano que presentaba homología con el ácido nucleico de LUMA1 descrito en este documento. Ninguno de estos documentos hizo una descripción en cuanto a los sitios de corte y empalme ni con respecto a las variantes de corte y empalme que pueden existir para los ácidos nucleicos transcritos a partir de la secuencia cromosómica. En este contexto no se da ninguna información respecto a la asociación del nivel de expresión de las secuencias de LUMA1 con tumores en seres humanos.

Chen, Sei-Yu y col. describen en el documento WO0161055 secuencias de ácidos nucleicos para uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores pulmonares (genes LSG específicos de pulmón) y procedimientos asociados con dichos genes. En este documento no se da ninguna información respecto a LUMA1 o alguna información que pueda llevar a la identificación de variantes de corte y empalme de LUMA1 asociadas con tumores.

Por tanto, la presente invención proporciona polipéptidos y ácidos nucleicos como se definen en las reivindicaciones adjuntas cuya expresión se altera significativamente asociada con tumores pulmonares, que permiten una mejora del pronóstico y diagnóstico de enfermedades asociadas con anomalías del crecimiento de células, Además, los ácidos nucleicos descritos en este documento comprenden transcritos que surgen del corte y empalme alternativo de genes que no se producen en tejido normal en el grado en el que pueden encontrarse en tejido tumoroso.

Durante los experimentos que llevaron a la presente invención se identificó un gen cuya expresión está asociada con tumores pulmonares. La presente invención se basa además en los hallazgos de los inventores mostrados en los ejemplos 1 y 2 de que el nivel de expresión de los ácidos nucleicos, además de los polipéptidos transcritos a partir del gen marcador presentado en este documento en la figura 1-7 en muestras, permite diagnosticar y clasificar trastornos proliferativos celulares tales como, por ejemplo, tumores pulmonares, para predecir el curso de la enfermedad y para seguir la enfermedad después de la terapia inicial.

Por tanto, la presente invención proporciona ácidos nucleicos y polipéptidos novedosos asociados con cáncer de pulmón como se describen en las reivindicaciones adjuntas.

Además, la invención proporciona vectores y huéspedes recombinantes que comprenden estos ácidos nucleicos y polipéptidos. La invención también proporciona anticuerpos y cebadores de ácidos nucleicos y su uso para el diagnóstico de tumores. Estos productos se describen en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, el procedimiento según la presente invención es especialmente útil para la detección precoz de tumores pulmonares y para la detección de células tumorales diseminadas en el curso del diagnóstico de la enfermedad residual mínima.

En otro aspecto de la presente invención, los ácidos nucleicos o polipéptidos descritos en este documento pueden usarse en el curso del diagnóstico de tumores pulmonares en muestras tales como resecciones, biopsias tumorales o similares. En este aspecto, la descripción proporciona un procedimiento que permite construir una estrategia para la terapia de enfermedades según sus propiedades moleculares. Según la presente descripción, el nivel de dichos polipéptidos y/o ácidos nucleicos puede usarse como un marcador molecular para el pronóstico, control y el diseño de una estrategia de tratamientos tumorales.

La presente invención proporciona ácidos nucleicos y polipéptidos asociados a tumores caracterizados por las secuencias dadas en la figura 1-7.

Las moléculas marcadoras, como se usan en la presente invención, pueden comprender ácidos nucleicos y polinucleótidos. En el nivel de ácidos nucleicos, las moléculas marcadoras pueden ser ADN o ARN que comprenden ADN genómico, ADNc y ARN tal como ARNm o ARNnh. En una realización preferida de la invención, los ácidos nucleicos que surgen de acontecimientos particulares de corte y empalme diferencial pueden ser moléculas marcadoras.

Expresión, como se usa según la presente invención, puede comprender, por ejemplo, la expresión de proteínas. La transcripción a ARN y, por tanto, el nivel de ARNm, también pueden entenderse como expresión según la presente invención.

Se dice que la expresión de un compuesto está significativamente alterada según la presente invención si el nivel de expresión se diferencia en más del 30%. La alteración de la expresión puede comprender, por ejemplo, aumento de la expresión o reducción de la expresión de dicho compuesto. Otro aspecto de la expresión alterada puede ser una alteración de modo que el compuesto se exprese bajo circunstancias de tipo no salvaje. Esto puede comprender que el compuesto se exprese, por ejemplo, en situaciones que naturalmente suprimen la expresión, o no se exprese en situaciones que naturalmente inducen la expresión del compuesto.

La alteración de la expresión como se usa en este documento también puede comprender una alteración en el modelo de transcripción de un gen. Por ejemplo, la alteración del modelo de transcripción puede comprender el corte y empalme alternativo del gen. Las alteraciones en el modelo de transcripción pueden influir los polipéptidos traducidos de los transcritos alterados o puede limitarse a regiones sin traducir. La alteración en el modelo de transcripción de un gen puede comprender el uso de exones novedosos en los transcritos, deleciones de exones en los transcritos o la variación en las relaciones de diferentes variantes de corte y empalme en células. Por tanto, las alteraciones en los modelos transcripcionales de genes como se usan en este documento pueden comprender la producción de ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, ARNm, ADNc, etc. que contienen tramos adicionales de secuencias de ácidos nucleicos en comparación con ácidos nucleicos de tipo salvaje que se producen en tejidos de control. Alternativamente, los ácidos nucleicos producidos por modelos de corte y empalme alternativo pueden producir ácidos nucleicos en los que faltan tramos de secuencias de ácidos nucleicos presentes en polinucleótidos de tipo salvaje. La presencia de tramos adicionales puede producirse simultáneamente con la ausencia de tramos de la secuencia original en transcritos individuales. Las alteraciones en la expresión de genes como se usa en el contexto de la presente invención también puede comprender una alteración en el nivel de expresión de variantes de corte y empalme de genes. Esto puede incluir el aumento o la reducción de la expresión de variantes de corte y empalme particulares, además de la expresión de variantes no presentes en el tejido de tipo salvaje o la ausencia de expresión de variantes de corte y empalme presentes en el tejido de tipo salvaje. En una realización, la alteración de la expresión de las variantes de corte y empalme puede comprender la alteración de las relaciones de diferentes variantes de corte y empalme en dicho tejido.

Ácidos nucleicos, como se usan en el contexto de la presente invención, son preferentemente polinucleótidos o fragmentos de los mismos. Los polinucleótidos preferidos comprenden al menos 20 nucleótidos consecutivos, preferentemente al menos 30 nucleótidos consecutivos y más preferentemente al menos 45 nucleótidos consecutivos que son idénticos, comparten homología de secuencias o codifican polipéptidos idénticos u homólogos, en comparación con los polipéptidos asociados con los trastornos proliferativos descritos en este documento. Los ácidos nucleicos según la presente invención también pueden ser complementarios de cualquiera de dichos polinucleótidos. Los polinucleótidos pueden incluir, por ejemplo, moléculas monocatenarias (sentido o antisentido) o bicatenarias, y pueden ser ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN comprenden tanto ARNnh (que contiene intrones) como ARNm (que no contiene intrones). Según la presente invención, los polinucleótidos también pueden ligarse a cualquier otra molécula, tal como materiales de soporte o moléculas de marcadores de detección, y pueden contener, pero no las necesitan, secuencias codificantes o no codificantes adicionales.

Los polinucleótidos según la presente descripción pueden ser secuencias nativas o variantes de las mismas. Las variantes pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de forma que no disminuya la inmunogenicidad del polipéptido codificado respecto a las proteínas nativas respectivas. Las variantes muestran preferentemente el 70%, más preferentemente al menos el 80%, y lo más preferido al menos el 90% de identidad de secuencias respecto a las moléculas de ácidos nucleicos nativos usadas en los procedimientos según la presente invención. Aquellos expertos en la materia conocen procedimientos para la determinación de la similitud de secuencias.

Un ejemplo para detectar la similitud de secuencias puede llevarse a cabo usando el software bioinformático FastA y/o BlastN accesible en el servidor HUSAR de DKFZ Heidelberg.

Además, los ácidos nucleicos son todos polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones restrictivas con sondas específicas de las secuencias descritas en este documento. Las condiciones restrictivas aplicadas para la reacción de hibridación son conocidas para aquellos expertos en la materia y pueden aplicarse como se describen en Sambrook y col. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989.

La presente invención también proporciona polinucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, codifican los polipéptidos nativamente codificados por los ácidos nucleicos descritos, aunque no muestran el porcentaje de homología de secuencia que se describe anteriormente dentro de la secuencia de ácidos nucleicos. Tales ácidos nucleicos pueden surgir cambiando los codones presentes en las secuencias descritas por codones degenerados y preparándose así un ácido nucleico sintético.

Las secuencias de nucleótidos según la presente invención pueden unirse a una variedad de otras secuencias de ácidos nucleicos usando las conocidas técnicas de ADN recombinante. Las secuencias pueden clonarse, por ejemplo, en cualquiera de una variedad de vectores de clonación, tales como plásmidos, fagémidos, derivados del fago lambda y cósmidos. Además, vectores tales como los vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación pueden unirse con las secuencias descritas en este documento. Secuencias de especial interés, que podrían clonarse con los ácidos nucleicos según la presente invención, son, por ejemplo, secuencias no codificantes y secuencias reguladoras que incluyen promotores, potenciadores y terminadores.

Los polinucleótidos pueden formularse de tal manera que pueden entran en las células de mamíferos y puedan expresarse en dichas células. Tales formulaciones pueden ser útiles para fines terapéuticos. La expresión de secuencias de ácidos nucleicos en células diana puede lograrse mediante cualquier procedimiento conocido para aquellos expertos en la materia. Los ácidos nucleicos pueden unirse, por ejemplo, a elementos que son aptos para permitir su expresión en una célula huésped. Tales elementos pueden comprender promotores o potenciadores, tales como promotores de CMV, SV40, RSV, metalotioneína I o polihedrina, respectivamente, potenciadores de CMV o SV40. Procedimientos posibles para la expresión son, por ejemplo, la incorporación de los polinucleótidos a un vector vírico que incluya adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, virus de la variolovacuna o virus de la viruela. Vectores víricos para el fin de la expresión de ácidos nucleicos en células huésped de mamífero pueden comprender pADNc3, pMSX, pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, etc. Estas técnicas son conocidas para aquellos expertos en la materia.

Otras formulaciones para la administración con fines terapéuticos incluyen sistemas de dispersiones coloidales tales como por ejemplo complejos de macromoléculas, microesferas, perlas, micelas y liposomas.

Generalmente, por medio de los procedimientos convencionales de biología molecular es posible (véase, por ejemplo, Sambrook y col., anteriormente) introducir diferentes mutaciones en las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Como resultado se sintetizan los polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares o polipéptidos relacionados con ellos con propiedades biológicas posiblemente modificadas. Una posibilidad es la producción de mutantes de deleción, en los que las moléculas de ácidos nucleicos se producen mediante continuas deleciones del extremo 5' o 3' de la secuencia de ADN codificante y llevan a la síntesis de polipéptidos que, por consiguiente, están acortados. Otra posibilidad es la introducción de una única mutación puntual en las posiciones en las que una modificación de la secuencia de aminoácidos influye, por ejemplo, sobre las propiedades específicas de proliferación, Mediante este procedimiento pueden producirse, por ejemplo, muteínas que poseen un valor de Km modificado o que ya no son objeto de los mecanismos de regulación que normalmente existen en la célula, por ejemplo, con respecto a la regulación alostérica o modificación covalente. Tales muteínas también pueden ser valiosas como antagonistas terapéuticamente útiles del marcador inventivo asociado a tumores pulmonares.

Para la manipulación de células procariotas por medio de manipulación genética, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención o partes de estas moléculas pueden introducirse en plásmidos, permitiendo una mutagénesis o una modificación de una secuencia mediante recombinación de secuencias de ADN. Por medio de procedimientos convencionales (véase Sambrook y col., anteriormente), las bases pueden intercambiarse y pueden añadirse secuencias naturales o sintéticas. Con el fin de ligar los fragmentos de ADN entre sí pueden añadirse adaptadores o conectores a los fragmentos. Además, pueden realizarse manipulaciones que proporcionen sitios de escisión adecuados o que eliminen ADN o sitios de escisión superfluos. Si son posibles inserciones, deleciones o sustituciones, pueden realizarse mutagénesis in vitro, reparación, restricción o ligado de cebadores. Como procedimiento de análisis se usan normalmente análisis de secuencias, análisis de restricción y otros procedimientos bioquímicos o de biología molecular.

Los polipéptidos codificados por las diversas variantes de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención muestran ciertas características comunes tales como actividad en la regulación de la proliferación y diferenciación celulares, peso molecular, reactividad inmunológica o conformación o propiedades físicas como la movilidad electroforética, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, óptimo de pH, óptimo de temperatura.

La invención se refiere además a vectores que contienen las moléculas inventivas de ácidos nucleicos asociadas a tumores pulmonares. Preferentemente son plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores normalmente usados en el campo de la ingeniería genética. Los vectores adecuados para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los vectores de expresión duales basados en T7 (expresión en procariotas y en eucariotas) para la expresión en células de mamífero y vectores derivados de baculovirus para la expresión en células de insecto. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico de la invención está operativamente ligada a los elementos reguladores en el vector recombinante de la invención que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARNm en células procariotas y/o eucariotas que pueden traducirse. La secuencia de nucleótidos que va a transcribirse puede estar operativamente ligada a un promotor como un promotor de T7, metalotioneína I o polihedrina.

En otra realización, la presente invención se refiere a células huésped recombinantes que contienen transitoria o establemente las moléculas o vectores de ácidos nucleicos de la invención. Se entiende que una célula huésped es un organismo que puede capturar ADN recombinante in vitro y, si es el caso, sintetizar los polipéptidos codificados por las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Preferentemente, estas células son células procariotas o eucariotas, por ejemplo, células de mamífero, células bacterianas, células de insecto o células de levadura. Las células huésped de la invención se caracterizan preferentemente por el hecho de que la molécula de ácido nucleico introducida de la invención es bien heteróloga con respecto a la célula transformada, es decir, que no se produce naturalmente en estas células, o bien está localizada en un lugar en el genoma diferente del de la secuencia correspondiente de procedencia natural.

Otra realización de la invención se refiere a un polipéptido que presenta una propiedad biológica del marcador inventivo asociado al tumor pulmonar y está codificado por las moléculas de ácidos nucleicos de la invención, así como a los procedimientos para su producción, por los cuales, por ejemplo, una célula huésped de la invención se cultiva en condiciones que permiten la síntesis del polipéptido y el polipéptido se aísla posteriormente de las células cultivadas y/o del medio de cultivo. El aislamiento y la purificación del polipéptido recombinantemente producido puede llevarse a cabo mediante medios convencionales que incluyen cromatografía preparativa y separaciones por afinidad e inmunológicas usando, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra las proteínas marcadoras inventivas asociadas a tumores pulmonares, o, por ejemplo, puede purificarse sustancialmente mediante el procedimiento de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67; 31-40 (1988). Sin embargo, estos polipéptidos no sólo comprenden polipéptidos producidos por recombinación, sino que incluyen polipéptidos aislados de procedencia natural, polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos o polipéptidos relacionados son muy entendidos en la técnica. Estos polipéptidos están preferentemente en una forma sustancialmente purificada.

La producción de un polipéptido según la presente invención puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un sistema de transcripción y/o traducción in vitro sin células. Tales sistemas son conocidos para aquellos expertos en la materia. Un ejemplo puede comprender un sistema de traducción in vitro como se proporciona por Rapid translation System de Roche molecular Biochemicals.

Los polipéptidos como se usan en la presente invención comprenden al menos una porción inmunogénica de las proteínas marcadoras inventivas asociadas a tumores pulmonares descritas en este documento. Los polipéptidos pueden ser de cualquier longitud. La porción inmunogénica como se usa anteriormente es una porción de una proteína que es reconocida por un receptor del antígeno de superficie de las células B y/o células T. Las porciones inmunogénicas comprenden al menos 10 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 20 residuos de aminoácidos de la proteína asociada con un tumor pulmonar. En una realización preferida de la presente invención se han eliminado dominios particulares de las proteínas, tales como por ejemplo dominios transmembrana o secuencias conductoras del extremo N, Las porciones inmunogénicas reaccionan con antisueros o anticuerpos específicos en la misma o casi la misma intensidad que las proteínas nativas de longitud completa.

Las porciones inmunogénicas se identifican generalmente usando técnicas muy conocidas en la técnica. Técnicas posibles son, por ejemplo, el cribado de los polipéptidos según la capacidad para reaccionar con anticuerpos específicos para antígeno, antisueros y/o líneas o clones de células T.

Los polipéptidos asociados con tumores pulmonares también pueden comprender variantes de las proteínas nativas. Estas variantes pueden diferenciarse de la proteína nativa en una o más alteraciones tales como sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. La inmunorreactividad de las no está sustancialmente disminuida en comparación con las proteínas nativas. Preferentemente, la inmunorreactividad disminuye menos del 50%, más preferentemente la inmunorreactividad disminuye menos del 20% en comparación con los polipéptidos nativos.

En una realización preferida, las variantes pueden carecer de una o más porciones, tales como por ejemplo secuencias conductoras del extremo N, dominios transmembrana o pequeñas secuencias del extremo N y/o C. Las variantes presentan el 70%, más preferentemente al menos el 90% y lo más preferido al menos el 95% de identidad con los polipéptidos descritos según la presente invención.

Las variantes de la presente invención son preferentemente sustituciones conservativas, de manera que los aminoácidos cambiados están sustituidos por aminoácidos con propiedades similares. Las propiedades en cuestión pueden incluir polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o naturaleza anfipática de los residuos de aminoácidos. Las variantes también pueden comprender secuencias conductoras de extremos adicionales, conectores o secuencias que permiten la síntesis, purificación o estabilidad de los polipéptidos en un modo más sencillo o más cómodo.

Los polipéptidos según la presente descripción también comprenden polipéptidos que sean polipéptidos de fusión o quiméricos que comprenden la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácidos nucleicos del marcador inventivo asociado a tumores pulmonares descrito en este documento. Los polipéptidos pueden fusionarse con cualquier adecuada secuencia de aminoácidos. Estas secuencias pueden comprender, por ejemplo, fragmentos antigénicos, receptores, enzimas, toxinas, epítopes quelantes, etc. Las secuencias de aminoácidos que están fusionadas con los polipéptidos descritos pueden ser marcas útiles en la purificación o recuperación de los polipéptidos, tales como por ejemplo marcas de his o marcas de myc. Las secuencias de aminoácidos fusionadas juntas pueden ligarse directamente o pueden separarse mediante cualquier secuencia conectora o espaciadora adecuada para el fin particular.

Los polipéptidos y polinucleótidos según la presente invención se aíslan. Esto significa que las moléculas se retiran de su entorno original. Las proteínas de procedencia natural se aíslan si se separan de alguno o todos los materiales que coexisten en el entorno natural. Los polinucleótidos se aíslan, por ejemplo, si se clonan en vectores.

Además, la presente invención proporciona agentes de unión tales como anticuerpos y fragmentos de unión con el antígeno que se unen específicamente a las proteínas asociadas a los tumores pulmonares descritos en este documento.

El término agente de unión comprende una variedad de sustancias tales como oligopéptidos, anticuerpos, moléculas peptidomiméticas que comprenden oligopéptidos de unión a antígenos, ácidos nucleicos, carbohidratos, compuestos orgánicos, etc. Anticuerpo según la presente invención se refiere preferentemente a anticuerpos que están constituidos esencialmente por anticuerpos monoclonales combinados con diferentes especificidades epitópicas, además de distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de un antígeno que contiene fragmentos de los polipéptidos de la invención mediante procedimientos muy conocidos para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Köhler y col., Nature 256 (1975), 495). Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Abm) pretende incluir moléculas intactas, además de fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2) que pueden unirse específicamente a la proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión a tejidos no específicos que un anticuerpo intacto. (Wahl y col., J. Nucl. Med, 24:316-325 (1983)). Por tanto, se prefieren estos fragmentos, además de los productos de una biblioteca de expresión de Fab u otras inmunoglobulinas. Además, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados.

Los agentes de unión según la presente descripción pueden emplearse, por ejemplo, para la inhibición de la actividad de los polipéptidos marcadores inventivos asociados a tumores pulmonares descritos en este documento. En este respecto, el término "agentes de unión" se refiere a agentes que se unen específicamente a los polipéptidos transcritos de los ácidos nucleicos novedosos asociados a tumores pulmonares y, por tanto, inhiben la actividad de dicho polipéptido. Tales agentes de unión pueden comprender, por ejemplo, ácidos nucleicos (ADN, ARN, ANP, etc.), polipéptidos (anticuerpos, receptores, fragmentos antigénicos, oligopéptidos), carbohidratos, lípidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (iones de metales, compuestos de azufre, boranos, silicatos, agentes reductores, agentes oxidantes). Los agentes de unión pueden interactuar preferentemente con el polipéptido mediante unión a epítopes, que son esenciales para la actividad biológica. La interacción puede ser reversible o irreversible. La unión puede ser una unión no covalente o incluso covalente con el polipéptido. Además, los agentes de unión pueden introducir alteraciones en el polipéptido que alteren o disminuyan la actividad biológica del polipéptido inventivo.

Para ciertos fines, por ejemplo procedimientos diagnósticos, el anticuerpo o agente de unión de la presente invención puede marcarse de forma detectable, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato metálico o una enzima. Además, puede emplearse cualquier procedimiento adecuado para la detección de la interacción intermolecular.

Se dice que el anticuerpo o el agente de unión con el antígeno reaccionan específicamente si reacciona a un nivel detectable con una proteína descrita en este documento, y no reacciona significativamente con otras proteínas. Los anticuerpos según la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. Otras moléculas que pueden unirse específicamente pueden ser, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos tales como fragmentos Fab, moléculas de ARN o polipéptidos. Según la presente invención, los agentes de unión pueden usarse aislados o en combinación. Por medio de la combinación es posible lograr un mayor grado de sensibilidad.

Los anticuerpos pueden comprender otros sitios de unión bien para agentes terapéuticos u otros polipéptidos o bien pueden acoplarse a dichos agentes terapéuticos o polipéptidos. Los agentes terapéuticos pueden comprender fármacos, toxinas, radionúclidos y derivados de los mismos. Los agentes pueden acoplarse a los agentes de unión directa o indirectamente, por ejemplo, mediante un conector o grupo portador. El grupo conector puede funcionar, por ejemplo, con el fin de permitir la reacción de acoplamiento entre el agente de unión y el agente terapéutico u otro o bien el conector puede actuar como un espaciador entre las distintas partes de la molécula de fusión. El conector también puede escindirse bajo ciertas circunstancias, de manera que libere el agente unido bajo dichas condiciones. Los agentes terapéuticos pueden acoplarse covalentemente a grupos portadores directamente o mediante un grupo conector. El agente también puede acoplarse no covalentemente al soporte. Soportes que pueden usarse según la presente invención son, por ejemplo, albúminas, polipéptidos, polisacáridos o liposomas.

El anticuerpo puede acoplarse a uno o más agentes. Los múltiples agentes acoplados a un anticuerpo pueden ser todos de la misma especie o pueden ser varios agentes diferentes unidos a un anticuerpo.

La invención también se refiere a un animal no humano transgénico, tal como ratón transgénico, ratas, hámsteres, perros, monos, conejos, cerdos, C. elegans y peces tales como pez torpedo, que comprende una molécula o vector de ácido nucleico de la invención, en el que preferentemente dicha molécula o vector de ácido nucleico puede estar establemente integrado en el genoma de dicho animal no humano, de forma que preferentemente la presencia de dicha molécula o vector de ácido nucleico lleve a la expresión del polipéptido marcador inventivo asociado a tumores pulmonares (o polipéptidos relacionados) de la invención o pueda expresarse de otro modo transitoriamente en el animal no humano. Dicho animal puede tener una o varias copias de las mismas moléculas o diferentes de ácidos nucleicos que codifican una o varias formas del polipéptido marcador inventivo asociado a tumores pulmonares o formas mutantes del mismo. Este animal tiene numerosas utilidades, que incluyen como modelo de investigación para la regulación de la proliferación y diferenciación celulares y, por tanto, presenta un animal novedoso y valioso en el desarrollo de terapias, tratamiento, etc. para enfermedades producidas por la deficiencia o el fallo de la proteína marcadora inventiva asociada a tumores pulmonares que participa en el desarrollo de trastornos proliferativos celulares, por ejemplo tumores pulmonares. Por consiguiente, en este caso, el mamífero no humano es preferentemente un animal de laboratorio tal como un ratón o rata.

Preferentemente, el animal no humano transgénico de la invención comprende además al menos un alelo de tipo salvaje inactivado del gen correspondiente que codifica el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares. Esta realización permite, por ejemplo, el estudio de la interacción de diversas formas mutantes de los polipéptidos marcadores inventivos asociados a tumores pulmonares en la aparición de los síntomas clínicos de enfermedad asociados con la regulación de la proliferación y diferenciación celulares. Todas las aplicaciones que se han tratado anteriormente en este documento con respecto a un animal transgénico también se aplican a animales que llevan dos, tres o más transgenes. También puede desearse inactivar la expresión o función de la proteína marcadora inventiva asociada a tumores pulmonares en una cierta fase del desarrollo y/o vida del animal transgénico. Esto puede lograrse usando, por ejemplo, promotores específicos para tejidos, del desarrollo y/o regulados por células y/o inducibles que conducen la expresión de, por ejemplo, un antisentido o ribozima dirigida contra el transcrito de ARN que codifica el marcador inventivo asociado a tumores pulmonares que codifica ARNm; véase también anteriormente. Un sistema inducible adecuado es, por ejemplo, la expresión génica regulada por tetraciclinas como se describe, por ejemplo, por Gossen y Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547-5551) y Gossen y col, (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62). Similarmente, la expresión de la proteína mutante asociada a tumores pulmonares puede controlarse mediante tales elementos reguladores.

Además, la invención también se refiere a una célula de mamífero transgénico que contiene (preferentemente establemente integrado en su genoma o transitoriamente introducido) una molécula de ácido nucleico según la invención o parte de la misma, en la que la transcripción y/o expresión de la molécula de ácido nucleico o parte de la misma lleva a la reducción de la síntesis de una proteína marcadora inventiva asociada a tumores pulmonares. En una realización preferida, la reducción se logra mediante un antisentido, sentido, ribozima, efecto de cosupresión y/o mutante dominante. "Antisentido" y "nucleótidos antisentido" significan constructos de ADN o ARN que bloquean la expresión del producto génico de procedencia natural. En otra realización preferida, la secuencia de ácidos nucleicos nativos que codifica el polipéptido marcador inventivo asociado a tumores pulmonares puede alterarse o sustituirse por una variante de dicha secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, por medio de recombinación, convirtiéndose así el gen marcador inventivo asociado a tumores pulmonares en no funcional. Por tanto, según experimentos de desactivación puede producirse un organismo que carece de actividad del polipéptido marcador inventivo asociado a tumores pulmonares.

La provisión de la molécula de ácido nucleico según la invención abre la posibilidad de producir animales no humanos transgénicos con un reducido nivel de proteína marcadora inventiva asociada a tumores pulmonares como se describe anteriormente y, por tanto, con un defecto en la regulación de la proliferación y diferenciación celulares. Las técnicas para lograr esto son muy conocidas para el experto en la materia. Éstas incluyen, por ejemplo, la expresión de ARN antisentido, ribozimas, de moléculas que combinan funciones de antisentido y ribozimas y/o de moléculas que proporcionan un efecto de cosupresión. Si se usa la solución de antisentido para la reducción de la cantidad de proteínas marcadoras inventivas asociadas a tumores pulmonares en células, la molécula de ácido nucleico que codifica el ARN antisentido es preferentemente de origen homólogo con respecto a la especie de animal usada para la transformación. Sin embargo. también es posible usar moléculas de ácidos nucleicos que muestren un alto grado de homología a las moléculas de ácidos nucleicos que se producen endógenamente que codifican una proteína marcadora asociada inventiva a tumores pulmonares. En este caso, la homología es preferentemente superior al 80%, particularmente superior al 90% y todavía más preferentemente superior al 95%. La reducción de la síntesis de un polipéptido según la invención en las células de mamífero transgénico puede dar como resultado una alteración en, por ejemplo, la degradación de proteínas endógenas, En animales transgénicos que comprenden tales células, esto puede llevar a diversos cambios fisiológicos, del desarrollo y/o morfológicos.

Por tanto, la presente invención también se refiere a animales no humanos transgénicos que comprenden las células transgénicas anteriormente descritas. Éstos pueden mostrar, por ejemplo, una deficiencia en la regulación de la proliferación y/o diferenciación celulares en comparación con animales de tipo salvaje debido a la presencia estable o transitoria de un ADN extraño que da como resultado al menos una de las siguientes características:

(a) interrupción de un gen(es) endógeno(s) que codifica(n) el marcador inventivo asociado a tumores pulmonares;

(b) expresión de al menos un ARN antisentido y/o ribozima contra un transcrito que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención;

(c) expresión de un ARNm sentido y/o no traducible de la molécula de ácido nucleico de la invención;

(d) expresión de un anticuerpo de la invención;

(e) incorporación de una copia funcional o no funcional de la secuencia reguladora de la invención; o

(f) incorporación de una molécula o vector de ADN recombinante de la invención.

Los procedimientos para la producción de un animal no humano transgénico de la presente invención, preferentemente un ratón transgénico, son muy conocidos para el experto en la materia. Tales procedimientos comprenden, por ejemplo, la introducción de una molécula o vector de ácido nucleico de la invención en una célula germinativa, una célula embriónica, célula madre o un óvulo o una célula derivada de los mismos. El animal no humano puede usarse en un procedimiento de cribado y puede ser un animal sano no transgénico, o puede tener un trastorno, preferentemente un trastorno producido por al menos una mutación en la proteína marcadora asociada a tumores pulmonares. Tales animales transgénicos son muy aptos, por ejemplo, para estudios farmacológicos de fármacos a propósito de formas mutantes del polipéptido marcador inventivo asociado a tumores pulmonares anteriormente descrito. La producción de embriones transgénicos y el cribado de éstos pueden realizarse, por ejemplo, como se describe por A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. El ADN de las membranas embrionarias de embriones puede analizarse usando, por ejemplo, transferencias de Southern con una sonda apropiada, técnicas de amplificación basadas en ácidos nucleicos (por ejemplo PCR) etc.; véase anteriormente.

Otro aspecto de la presente descripción es una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de trastornos asociados con proliferación celular anómala. Los polipéptidos, polinucleótidos y agentes de unión (esp. anticuerpos) según la presente invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas o inmunogénicas.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por cualquier vía adecuada conocida para aquellos expertos en la materia. La administración puede comprender, por ejemplo, inyección, tal como por ejemplo inyección intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea, administración intranasal, por ejemplo mediante aspiración, o administración por vía oral. La dosificación adecuada para garantizar el beneficio farmacéutico del tratamiento debería elegirse según parámetros conocidos para aquellos expertos en la materia tales como edad, sexo, peso corporal, etc. del paciente.

Las composiciones farmacéuticas comprenden dichos compuestos y un vehículo fisiológicamente aceptable. El tipo de vehículo que va a emplearse en las composiciones farmacéuticas de esta invención variará dependiendo del modo de administración. Para administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo comprende preferentemente agua, solución salina, alcohol, un lípido, una cera y/o un tampón. Para administración por vía oral puede emplearse cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y/o carbonato de magnesio. También pueden emplearse microesferas biodegradables (por ejemplo, glicólido poliláctico) como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.897.268 y 5.075.109.

Una composición farmacéutica o vacuna puede contener, por ejemplo, ADN que codifica uno o más polipéptidos según la presente descripción. El ADN puede administrarse en un modo que permita que los polipéptidos se generen in situ. Los sistemas de expresión adecuados son conocidos para aquellos expertos en la materia. Los ácidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, constructos antisentido. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender moléculas de ácidos nucleicos que pueden expresarse en un sistema huésped de mamífero o humano que comprende un sistema vírico u otro sistema de expresión, por ejemplo un sistema de vector adenovírico.

El ácido nucleico también puede administrarse como un ácido nucleico desnudo. En este caso pueden emplearse sistemas de liberación físicos apropiados que potencian la captación de ácido nucleico, tales como el recubrimiento de ácido nucleico sobre perlas biodegradables que son eficientemente transportadas a las células. La administración de ácidos nucleicos desnudos puede ser útil, por ejemplo, con el fin de expresión transitoria dentro de un huésped o célula huésped.

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos. Los polipéptidos incorporados a las composiciones farmacéuticas pueden ser el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares. Opcionalmente, el polipéptido puede administrarse en combinación con uno o varios polipéptidos distintos conocidos tales como por ejemplo enzimas, anticuerpos, factores reguladores, tales como ciclinas, cinasas dependientes de ciclinas o CKI, o toxinas.

Pueden usarse polipéptidos o fragmentos de los mismos que comprendan una porción inmunogénica de una proteína asociada a tumores pulmonares en composiciones inmunogénicas, en las que el polipéptido estimula, por ejemplo, la propia respuesta inmunitaria del paciente a células tumorales. Un paciente puede estar aquejado de una enfermedad, o puede estar libre de enfermedad detectable. Por consiguiente, los compuestos descritos en este documento pueden usarse para tratar cáncer o para inhibir el desarrollo de cáncer. Los compuestos pueden administrarse o antes de o tras un tratamiento convencional de tumores tales como extirpación quirúrgica de tumores primarios, tratamiento mediante la administración de radioterapia, procedimientos quimioterapéuticos convencionales o cualquier otro modo de tratamiento del cáncer respectivo o sus precursores.

Las composiciones inmunogénicas tales como vacunas pueden comprender uno o más polipéptidos y un potenciador no específico de respuestas inmunitarias, en las que el potenciador no específico de respuestas inmunitarias puede provocar o potenciar una respuesta inmunitaria a un antígeno exógeno. En las vacunas de esta invención puede emplearse cualquier potenciador no específico de respuestas inmunitarias adecuado. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno del rápido catabolismo, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador no específico de la respuesta inmunitaria, tal como lípido A, Bordetella pertussis o Mycobacterlum tuberculosis. Tales adyuvantes están comercialmente disponibles, por ejemplo, como adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) y adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.).

Las composiciones farmacéuticas y vacunas también pueden contener otros epítopes de antígenos tumorales, bien incorporados en una proteína de fusión como se describe anteriormente (es decir, un único polipéptido que contiene múltiples epítopes) o presentes dentro de un polipéptido separado.

Los trastornos caracterizados por proliferación celular anómala, como se usa en el contexto de la presente invención, pueden comprender, por ejemplo, neoplasias tales como tumores benignos y malignos, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas o displasias. Los tumores pueden comprender tumores de cabeza y cuello, tumores del tracto respiratorio, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del aparato urinario, tumores del aparato reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema nervioso central y periférico, tumores de la piel y sus anejos, tumores de los tejidos blandos y huesos, tumores del sistema linfopoyético y hematopoyético, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer anogenital, etc.

En la invención, los trastornos son tumores pulmonares. Tumores pulmonares según la presente invención comprenden afecciones del tracto respiratorio caracterizadas por propiedades de crecimiento anómalo de células o tejidos en comparación con las propiedades de crecimiento de células o tejidos de control normales. El crecimiento de las células o tejidos puede, por ejemplo, acelerarse anómalamente o puede regularse anómalamente. La regulación anómala, como se usa anteriormente, puede comprender cualquier forma de presencia ausencia de respuestas de tipo no salvaje de las células o tejidos a influencias reguladoras del crecimiento de procedencia natural. Las anomalías en el crecimiento de las células o tejidos pueden ser, por ejemplo, neoplásicas o hiperplásicas. En una realización preferida de la invención, los tumores pulmonares son cánceres o afecciones precancerosas del tracto respiratorio.

Una muestra según el procedimiento de la presente invención es cualquier muestra que puede contener células, tejidos o líquidos corporales. Además, cualquier muestra que contenga potencialmente las moléculas marcadoras que van a detectarse puede ser una muestra según la presente invención. Tales muestras son, por ejemplo, sangre, plasma, suero, muestras obtenidas con hisopo. lavados, esputo, muestras de células y tejidos o biopsias.

Las biopsias, como se usan en el contexto de la presente invención, pueden comprender, por ejemplo, muestras de resección de tumores, muestras de tejido preparadas por medios endoscópicos o biopsias por punción. Además, cualquier muestra que contenga potencialmente las moléculas marcadoras que van a detectarse puede ser una muestra según la presente invención.

El procedimiento para la detección del nivel de los polinucleótidos o polipéptidos según la presente invención es cualquier procedimiento que sea apto para detectar cantidades muy pequeñas de moléculas específicas en muestras. La reacción de detección según la presente invención puede ser, por ejemplo, una detección o en el nivel de ácidos nucleicos o en el nivel de polipéptidos. La detección puede ser o una detección del nivel de polipéptidos o ácidos nucleicos en células en total o en lisados celulares o una detección del nivel de polipéptidos o ácidos nucleicos en distintas regiones subcelulares. Los procedimientos para determinar la distribución subcelular de los compuestos son conocidos para aquellos expertos en la materia. En una realización de la invención, la detección de las moléculas marcadoras puede comprender la detección de variantes de corte y empalme particulares. En otra realización de la presente invención, el procedimiento de detección puede comprender la detección de metilación de moléculas de ácidos nucleicos en muestras.

Formatos aplicables para la reacción de detección según la presente invención pueden ser técnicas de transferencia, tales como transferencia de Western, transferencia de Southern, transferencia de Northern. Las técnicas de transferencia son conocidas para aquellos expertos en la materia y pueden realizarse, por ejemplo, como electrotransferencias, transferencias semisecas, transferencias a vacío o transferencias por puntos. Además, para la detección de moléculas pueden aplicarse procedimientos inmunológicos tales como, por ejemplo, inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos tales como ELISA, RIA, ensayos de flujo lateral, etc.

Los procedimientos para la detección de metilación de ácidos nucleicos son conocidos para aquellos expertos en la materia y pueden comprender, por ejemplo, procedimientos que emplean pretratamiento químico de ácidos nucleicos con, por ejemplo, bisulfito de sodio, permanganato o hidracina, y posterior detección de la modificación por medio de endonucleasas de restricción específicas o por medio de sondas específicas, por ejemplo, en el curso de una reacción de amplificación. Además, la detección de metilación puede realizarse usando endonucleasas de restricción específicas para metilación.

En una realización preferida de la invención, la detección del nivel de moléculas marcadoras se lleva a cabo mediante detección del nivel de ácidos nucleicos que codifican las moléculas marcadoras o fragmentos de las mismas presentes en la muestra. Los medios para la detección de moléculas de ácidos nucleicos son conocidos para aquellos expertos en la materia. El procedimiento para la detección de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante una reacción de unión de la molécula que va a detectarse a sondas de ácidos nucleicos complementarios, proteínas con especificidad de unión por los ácidos nucleicos o cualquier otra entidad que reconozca y se una específicamente a dichos ácidos nucleicos. Este procedimiento puede realizarse tanto in vitro como directamente in situ, por ejemplo, en el curso de una reacción de detección por tinción. Otro modo de detectar las moléculas marcadoras en una muestra en el nivel de ácidos nucleicos realizado en el procedimiento según la presente invención es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que puede llevarse a cabo en un modo cuantitativo, tal como por ejemplo PCR, LCR o NASBA.

En otra realización preferida de la invención, la detección del nivel de moléculas marcadoras se lleva a cabo determinando el nivel de expresión de una proteína. La determinación de las moléculas marcadoras en el nivel de proteína puede llevarse a cabo, por ejemplo, en una reacción que comprende un agente de unión específico para la detección de las moléculas marcadoras. Estos agentes de unión pueden comprender, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos, anticuerpos híbridos bifuncionales, peptidomiméticos que contienen epítopes mínimos de unión a antígenos, etc. Los agentes de unión pueden usarse en muchas técnicas de detección diferentes, por ejemplo en transferencia de Western, ELISA, ensayo de flujo lateral, aglutinación en látex, tiras inmunocromatográficas o inmunoprecipitación. Generalmente, la detección basada en el agente de unión puede llevarse a cabo tanto in vitro como directamente in situ, por ejemplo, en el curso de una reacción de tinción inmunocitoquímica. Según la presente invención, para determinar la cantidad de polipéptidos particulares en disoluciones de muestras biológicas puede usarse cualquier otro procedimiento adecuado, tales como procedimientos bioquímicos, químicos, físicos o físico-químicos.

En una realización preferida de la invención, el nivel de marcadores es significativamente elevado en comparación con una muestra de prueba no tumorosa. En este caso, el marcador está sobreexpresado en la muestra. En una realización preferida de la invención, el nivel de variantes de corte y empalme particulares del gen marcador está alterado en las muestras de prueba en comparación con el tejido de tipo salvaje. Esto puede llevar a niveles alterados de variantes de corte y empalme, nuevas variantes de corte y empalme, neopéptidos, relaciones alteradas de diferentes variantes de corte y empalme de genes.

La detección del nivel de marcadores moleculares según la presente invención puede ser la detección del nivel de moléculas marcadoras individuales en mezclas de reacción separadas, además de la detección simultánea de una combinación de marcadores. La combinación puede comprender los marcadores moleculares descritos en este documento y adicionalmente más moléculas marcadoras útiles para la detección de tumores.

La detección puede llevarse a cabo en disolución o usando reactivos fijados a una fase sólida. La detección de uno o más marcadores moleculares puede realizarse en una única mezcla de reacción o en dos mezclas de reacción o mezclas de reacción separadas, Las reacciones de detección de varias moléculas marcadoras pueden realizarse, por ejemplo, simultáneamente en recipientes de reacción de múltiples pocillos. Los marcadores característicos de los tumores pulmonares descritos en este documento pueden detectarse usando reactivos que reconocen específicamente estas moléculas. Simultáneamente pueden detectarse uno o más marcadores adicionales usando reactivos que los reconocen específicamente. La reacción de detección para cada marcador individual puede comprender una o más reacciones con agentes de detección o reconocer las moléculas marcadoras iniciales o preferentemente reconocer moléculas usadas para reconocer otras moléculas. Tal reacción puede comprender, por ejemplo, el uso de anticuerpos primarios y secundarios y más. La reacción de detección puede comprender además una reacción indicadora que indica el nivel de los polipéptidos inventivos asociados con tumores pulmonares. La reacción indicadora puede ser, por ejemplo, una reacción que produce un compuesto coloreado, una reacción de bioluminiscencia, una reacción de fluorescencia, generalmente una reacción que emite radiación, etc.

En una realización preferida, la detección de tejidos que expresan productos génicos marcadores se lleva a cabo en forma de procedimientos de obtención de imágenes moleculares, Los procedimientos respectivos son conocidos para aquellos expertos en la materia. Los procedimientos de obtención de imágenes para uso en el contexto de la presente invención pueden comprender, por ejemplo, MRI, SPECT, PET y otros procedimientos adecuados para la obtención de imágenes in vivo.

En una realización, el procedimiento puede basarse en la conversión enzimática de compuestos inertes o marcados en moléculas detectables en el curso de los procedimientos de obtención de imágenes moleculares mediante las moléculas marcadoras. En otra realización, el procedimiento de obtención de imágenes moleculares puede basarse en el uso de compuestos que llevan una marca adecuada para la obtención de imágenes moleculares in vivo, tales como radioisótopos, iones metálicos, etc., que se une específicamente a moléculas marcadoras in vivo.

En una realización preferida de la invención, estos compuestos son compuestos no tóxicos y pueden eliminarse de la circulación de los organismos, tales como los seres humanos, en un periodo de tiempo que permite realizar la detección de la marca acumulada en el tejido tumoral que sobreexpresa el gen del marcador respectivo. En otra realización preferida de la invención, los compuestos se usan para la obtención de imágenes moleculares, para la cual la eliminación de la circulación no es relevante para realizar la reacción de obtención de imágenes moleculares. Esto puede ser, por ejemplo, debido al bajo ruido producido por las moléculas en circulación, etc. Los compuestos para uso en los procedimientos de obtención de imágenes moleculares se administran en forma farmacéuticamente aceptable en composiciones que pueden comprender adicionalmente cualquier otra sustancia adecuada, tal como por ejemplo otras sustancias diagnósticamente útiles, sustancias terapéuticamente útiles, sustancias de vehículo o similares.

Las moléculas marcadoras descritas según la presente invención pueden usarse para el diagnóstico, control del curso de la enfermedad y pronóstico en trastornos proliferativos celulares tales como, por ejemplo, tumores pulmonares.

El diagnóstico de trastornos asociados con la expresión del gen inventivo como se usa en este documento puede comprender, por ejemplo, la detección de células o tejidos afectados por crecimiento anómalo. En una realización preferida, diagnóstico significa la detección primaria de una enfermedad en un organismo o muestra. Según la presente invención, el procedimiento para el diagnóstico de tumores pulmonares puede aplicarse en pruebas de cribado rutinarias para aspectos preventivos con el fin de detectar dicha enfermedad en una fase temprana de la aparición del trastorno. En otra realización preferida, el procedimiento diagnóstico puede usarse para determinar la enfermedad residual mínima de un tumor después de la terapia primaria. En este respecto, el procedimiento de la invención puede aplicarse para determinar células en muestras corporales que muestran expresión anómala de moléculas marcadoras según la presente invención característica de tumores pulmonares. Por tanto, en los líquidos corporales puede detectarse una propagación de células afectadas.

En una realización de la invención, los procedimientos descritos en este documento pueden usarse para la detección e identificación de metástasis. El procedimiento puede aplicarse o para la detección de metástasis en tejidos u órganos corporales mediante los procedimientos de detección descritos en este documento, o las metástasis pueden diagnosticarse con respecto al pronóstico y predicción del curso de la enfermedad.

El control del curso de la enfermedad puede comprender determinar los niveles de moléculas marcadoras en diferentes momentos, comparar los niveles en los diferentes momentos y evaluar un diagnóstico sobre la progresión de la enfermedad respecto al periodo de tiempo recorrido. Por tanto, el control puede permitir la evaluación del pronóstico y/o el diseño de una terapia adecuada para un paciente particular.

El pronóstico del curso de la enfermedad de tumores pulmonares puede comprender determinar el nivel de expresión de una o más moléculas marcadoras, comparar los niveles con datos de estudios posteriores en una base de datos y pronosticar el curso de la enfermedad a partir de dicha comparación. El procedimiento puede comprender la detección de los niveles de un conjunto de moléculas marcadoras cuyos distintos niveles pueden caracterizar distintas fases en el curso de la enfermedad. Los niveles de una combinación de marcadores pueden ser un indicador del pronóstico del curso posterior de la enfermedad y puede sentar la base del diseño de una terapia adecuada.

La presente descripción proporciona además kits para uso, por ejemplo, en procedimientos de investigación o diagnósticos. Tales kits pueden contener dos o más componentes para realizar un ensayo científico o diagnóstico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o equipamiento. Un componente puede ser un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente con un polipéptido asociado con tumores pulmonares. Adicionalmente, el kit puede contener reactivos, tampones u otros conocidos en la técnica como necesarios para realizar el ensayo diagnóstico. Alternativamente, el kit de investigación o kit diagnóstico puede contener sondas de nucleótidos o cebadores para la detección de ADN o ARN. Un kit tal debería contener reactivos y tampones adicionales apropiados conocidos en la técnica.

Un kit puede comprender:

a) reactivos para la detección de las moléculas marcadoras moleculares

b) los reactivos y tampones comúnmente usados para llevar a cabo la reacción de detección, tales como tampones, marcadores de detección, sustancias portadoras y otros

d) una muestra de marcador para llevar a cabo una reacción de control positivo.

El reactivo para la detección del marcador incluye cualquier agente que pueda unirse a la molécula marcadora. Tales reactivos pueden incluir proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicoproteínas, proteoglicanos, polisacáridos o lípidos.

La muestra para llevar a cabo un control positivo puede comprender, por ejemplo, ácidos nucleicos en forma aplicable, tal como disolución o sal, péptidos en forma aplicable, muestras de secciones de tejido o células positivas que expresan las moléculas asociadas con tumores pulmonares.

En una realización preferida de la invención, la detección de las moléculas marcadoras se lleva a cabo sobre el nivel de polipéptidos. En esta realización, los agentes de unión pueden ser, por ejemplo, anticuerpos específicos para las moléculas marcadoras o fragmentos de los mismos.

En otra realización del kit de prueba, la detección de la molécula marcadora se lleva a cabo en el nivel de ácidos nucleicos. En esta realización de la invención, los reactivos para la detección pueden ser, por ejemplo, sondas de ácidos nucleicos o cebadores complementarios de dichos ácidos nucleicos de la molécula marcadora.

Los polipéptidos y/o polinucleótidos inventivos asociados a tumores pulmonares pueden usarse para la vacunación contra trastornos proliferativos celulares. La vacunación puede comprender administrar un compuesto inmunogénico a un individuo con el fin de estimular una respuesta inmunitaria dirigida contra dicho compuesto inmunogénico y así inmunizar dicho individuo contra dicho compuesto inmunogénico. La estimulación de una respuesta inmunitaria puede comprender inducir la producción de anticuerpos contra dicho compuesto, además de estimular células T citotóxicas. Con el fin de vacunación, los polipéptidos, ácidos nucleicos y agentes de unión según la presente invención pueden administrarse en una forma fisiológica aceptable. La composición que va a administrarse a individuos puede comprender uno o más componentes antigénicos, sustancias portadoras fisiológicamente aceptables o disoluciones tampón, inmunoestimulantes y/o adyuvantes. Los adyuvantes puede comprender, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund o adyuvante completo de Freund u otros adyuvantes conocidos para aquellos expertos en la
materia.

La composición puede administrarse por cualquier vía aplicable, tal como por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc. La dosificación de la composición depende del caso particular y del fin de la vacunación. Tiene que adaptarse a los parámetros del individuo tratado tales como edad, peso, sexo, etc. Además, debe tenerse en cuenta el tipo de la respuesta inmunitaria que va a provocarse. En general, puede preferirse si un individuo recibe 100 \mug - 1 g de un polipéptido según la presente invención o 10^{6} - 10^{12} MOI de un ácido nucleico recombinante, que contiene un ácido nucleico según la presente invención en una forma que puede expresarse in situ.

Los individuos para el fin de la vacunación pueden ser cualquier organismo que contenga los polipéptidos y/o polinucleótidos inventivos asociados a tumores pulmonares y que puedan verse afectados por trastornos proliferativos celulares.

La vacunación de individuos puede ser favorable, por ejemplo, en el caso de secuencias alteradas de tipo no salvaje o estructura de moléculas marcadoras asociadas con trastornos proliferativos celulares.

Los polipéptidos descritos en este documento también pueden emplearse en inmunoterapia adoptiva para el tratamiento del cáncer. La inmunoterapia adoptiva puede clasificarse ampliamente en o inmunoterapia activa o pasiva. En la inmunoterapia activa, el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmunitario huésped endógeno que va a reaccionar contra tumores mediante la administración de agentes que modifican la respuesta inmunitaria (por ejemplo, vacunas tumorales, adyuvantes bacterianos y/o citoquinas).

En la inmunoterapia pasiva, el tratamiento implica la administración de reactivos biológicos con inmunorreactividad tumoral establecida (tales como células efectoras o anticuerpos) que puede mediar directa o indirectamente efectos antitumorales y no depende necesariamente de un sistema inmunitario huésped intacto. Ejemplos de células efectoras incluyen linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos CD8+, linfocitos T cooperadores CD4+, linfocitos infiltrantes de tumor), células asesinas (tales como células asesinas naturales, células asesinas activadas por linfocinas), células B o células presentadoras de antígeno (tales como células dendríticas y macrófagos) que expresan los antígenos descritos. Los polipéptidos descritos en este documento también pueden usarse para generar anticuerpos o anticuerpos antiidiotípicos (como en la patente de EE.UU. nº 4.918.164) para inmunoterapia pasiva.

El procedimiento predominante para procurar números adecuados de células T para inmunoterapia adoptiva es hacer crecer células T inmunitarias in vitro. Las condiciones de cultivo para expandir las células T específicas para un único antígeno hasta un número de varios billones con retención del reconocimiento del antígeno in vivo son muy conocidas en la técnica. Estas condiciones de cultivo in vitro utilizan normalmente estimulación intermitente con antígeno, frecuentemente en presencia de citoquinas, tales como IL-2, y células nodrizas no divisoras. Como se observa anteriormente, los polipéptidos inmunorreactivos descritos en este documento pueden usarse para expandir rápidamente cultivos de células T específicas para antígeno con el fin de generar un número suficiente de células para inmunoterapia. En particular, las células presentadores de antígeno, tales como dendríticas, macrófagos o células B. pueden pulsarse con polipéptidos inmunorreactivos o transfectarse con una secuencia(s) de ácidos nucleicos usando técnicas habituales muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células presentadoras de antígeno pueden transfectarse con una secuencia de ácidos nucleicos, en la que dicha secuencia contiene una región promotora apropiada para aumentar la expresión, y pueden expresarse como parte de un virus recombinante u otro sistema de expresión. Para que las células T cultivadas sean eficaces en terapia, las células T cultivadas deben poder crecer y distribuirse ampliamente y sobrevivir a largo plazo in vivo. Los estudios han demostrado que las células T cultivadas pueden inducirse para que crezcan in vivo y para que sobrevivan a largo plazo en números sustanciales mediante estimulación repetida con antígeno complementado con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever, M. y col., "Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited", Immunological Reviews, 157:177, 1997).

Los polipéptidos descritos en este documento también pueden emplearse para generar y/o aislar células T reactivas con tumores, que entonces pueden administrarse al paciente, En una técnica, las líneas de células T específicas para antígeno pueden generarse mediante inmunización in vivo con péptidos cortos correspondientes a porciones inmunogénicas de los polipéptidos descritos. Los clones de CD8+ CTL específicos para antígeno resultantes pueden aislarse del paciente, expandirse usando técnicas de cultivo de tejido habituales y devolverse al paciente.

Alternativamente, los péptidos correspondientes a porciones inmunogénicas de los polipéptidos de la invención pueden emplearse para generar subconjuntos de células T reactivas con tumores mediante estimulación selectiva in vitro y expansión de células T autólogas para proporcionar células T específicas para antígeno que pueden transferirse posteriormente al paciente como se describe, por ejemplo, por Chang y col. (Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22(3), 213, 1996). Las células del sistema inmunitario, tales como células T, pueden aislarse de la sangre periférica de un paciente usando un sistema de separación celular comercialmente disponible, tal como el sistema CEPRATE^{TM} de CellPro Incorporated (Bothell, Wash.) (véanse la patente de EE.UU. nº 5.240.856; la patente de EE.UU. nº 5,215.926; el documento WO89/06280; el documento WO91/16116 y el documento WO92/07243). Las células separadas se estimulan con uno o más de los polipéptidos inmunorreactivos contenidos dentro de un vehículo de liberación, tal como una microesfera, para proporcionar células T específicas para antígeno. Entonces, la población de células T específicas para antígeno del tumor se expande usando técnicas habituales y las células se administran de nuevo el paciente.

En otra realización, los receptores de células T y/o de anticuerpos específicos para los polipéptidos pueden clonarse, expandirse y transferirse a otros vectores o células efectoras para uso en inmunoterapia adoptiva.

En otra realización, las células dendríticas singénicas o autólogas pueden pulsarse con péptidos correspondientes con al menos una porción inmunogénica de un polipéptido descrito en este documento. Las células dendríticas específicas para antígeno resultantes pueden o transferirse a un paciente o emplearse para estimular células T para proporcionar células T específicas para antígeno que, a su vez, pueden administrarse a un paciente. El uso de células dendríticas pulsadas con péptidos para generar células T específicas para antígeno y el posterior uso de tales células T específicas para antígeno para erradicar tumores en un modelo murino se ha demostrado por Cheever y col,. Immunological Reviews, 157:177,1997.

Adicionalmente, los vectores que expresan los ácidos nucleicos descritos pueden introducirse en células madre tomadas del paciente y propagarse mediante clonación in vitro para el trasplante autólogo de nuevo al mismo paciente.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención también pueden usarse como compuestos terapéuticos con el fin disminuir o eliminar tumores. Los anticuerpos pueden usarse por sí mismos (por ejemplo, para inhibir metástasis) o acoplarse a uno o más agentes terapéuticos. Agentes adecuados en este aspecto incluyen radionúclidos, inductores de la diferenciación, fármacos, toxinas y derivados de los mismos. Radionúclidos preferidos incluyen 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi. Fármacos preferidos incluyen metotrexato y análogos de pirimidina y purina. Inductores de la diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella y proteína antivírica de la hierba carmín.

La terapia de trastornos caracterizada por proliferación celular anómala puede comprender la administración de constructo antisentido o ribozimas. Los procedimientos para la administración de ribozimas o constructos antisentido son conocidos para aquellos expertos en la técnica. La administración puede tener lugar como administración de ácidos nucleicos desnudos o como administración de ácidos nucleicos que son aptos para la expresión de los productos activos relevantes in situ.

El tratamiento de trastornos puede comprender la administración de agentes de unión dirigidos contra las moléculas inventivas asociadas a tumores pulmonares. Estos agentes de unión pueden acoplarse, por ejemplo, a otros compuestos tales como toxinas, enzimas, radioisótopos etc.

La terapia de trastornos asociados con expresión anómala de las moléculas inventivas presentadas asociadas a tumores pulmonares puede comprender la administración de antagonistas o agonistas de las moléculas inventivas asociadas a tumores pulmonares, de componentes de unión de los polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares de inhibidores o potenciador de la expresión de los polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares o de fármacos identificables mediante ensayos en los que participa la medición de la actividad de los polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares. Los procedimientos para identificar estas sustancias son conocidos para aquellos expertos en la técnica.

Un ejemplo de un procedimiento para identificar un componente de unión de un polipéptido (o polipéptido relacionado) y/o polinucleótido inventivos asociados a tumores pulmonares puede comprender:

(a) poner en contacto el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares de la invención con un compuesto que va a cribarse; y

(b) determinar si el compuesto logra una actividad del polipéptido.

Los polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares pueden usarse para cribar proteínas u otros compuestos que se unen a los polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares o proteínas u otros compuestos a los que se une el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares. La unión del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares y la molécula puede activar (agonista), aumentar, inhibir (antagonista) o reducir la actividad del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares o la molécula unida. Ejemplos de tales moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas (por ejemplo, receptores) o moléculas pequeñas.

Preferentemente, la molécula está muy relacionada con el ligando natural del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares, por ejemplo, un fragmento del ligando, o un sustrato natural, un ligando, un mimético estructural o funcional; véase, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology 1(2) (1991); capítulo 5. Similarmente, la molécula puede estar muy relacionada con el receptor natural al que puede unirse el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares, o al menos, un fragmento del receptor que puede unirse mediante el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares (por ejemplo, sitio activo). En cualquier caso, la molécula puede diseñarse racionalmente usando técnicas conocidas.

Preferentemente, el cribado de estas moléculas implica producir células apropiadas que expresan el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares, bien como una proteína secretada o en la membrana celular. Células preferidas incluyen células de mamíferos, levadura, Drosophila o E. coli. Entonces, las células que expresan el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares (o membrana celular que contiene el polipéptido expresado) se ponen preferentemente en contacto con un compuesto de prueba que contiene potencialmente la molécula para observar la unión, estimulación o inhibición de actividad del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares.

El ensayo puede probar simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares, en el que la unión se detecta mediante una marca, o en un ensayo que implica la competición con un competidor marcado. Además, el ensayo puede probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por la unión al polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares.

Alternativamente, el ensayo puede llevarse a cabo usando preparaciones sin células, polipéptido/molécula fijados a un soporte sólido, bibliotecas de productos químicos o mezclas de productos naturales. El ensayo también puede comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una disolución que contiene el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares, medir la actividad o unión del polipéptido/molécula inventiva asociado a tumores pulmonares y comparar la actividad o unión del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares con un patrón.

Preferentemente, un ensayo ELISA puede medir el nivel o la actividad de polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares en una muestra (por ejemplo, muestra biológica) usando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede medir el nivel o la actividad de polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares mediante la unión, directa o indirectamente, con el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares o compitiendo por un sustrato con el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares. Todos estos ensayos anteriores pueden usarse como marcadores diagnósticos o pronósticos. Las moléculas descubiertas usando estos ensayos pueden usarse para tratar la enfermedad o provocar un resultado particular en un paciente (por ejemplo, eliminación de un tumor epitelial o parada de la progresión del crecimiento tumoral) mediante la activación o inhibición de la molécula inventiva asociada a tumores pulmonares. Además, los ensayos pueden descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares a partir de células o tejidos adecuadamente
manipulados.

Se describe un procedimiento para identificar compuestos que se unen al polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto de unión candidato con un polipéptido de la invención (el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares); y (b) determinar si se ha producido la unión.

Además, se describe un procedimiento para identificar activadores/agonistas o inhibidores/antagonistas del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto candidato con un polipéptido de la invención; b) ensayar una actividad biológica y (c) determinar si se ha alterado una actividad biológica del polipéptido de la invención.

El documento describe un procedimiento para identificar y obtener un candidato a fármaco para terapia de un trastorno caracterizado por proliferación celular anómala que comprende las etapas de

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(a) poner en contacto el polipéptido asociado a tumores pulmonares de la presente invención o una célula que expresa dicho polipéptido en presencia de componentes que pueden proporcionar una señal detectable en respuesta

a una regulación alterada de la proliferación celular

a una diferenciación celular alterada, cribándose dicho candidato a fármaco en condiciones que permitan la degradación de proteínas, y

(b) detectar la presencia o ausencia de una señal o aumento de la señal generada por la degradación de proteínas, en la que la presencia o el aumento de la señal es indicativa de un fármaco putativo.

Los experimentos usando animales o células o líneas celulares aisladas pueden usarse para examinar el comportamiento proliferativo de células o tejidos en función de la acción del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares. Pueden emplearse los mismos procedimientos para el estudio de la diferenciación celular.

El fármaco candidato puede ser un único compuesto o una pluralidad de compuestos. El término "pluralidad de compuestos" en un procedimiento de la invención debe entenderse como una pluralidad de sustancias que pueden o no ser idénticas.

Dicho compuesto o pluralidad de compuestos puede sintetizarse químicamente o producirse microbiológicamente y/o comprender, por ejemplo, muestras, por ejemplo, extractos de células de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Además, dicho(s) compuesto(s) pueden conocerse en la técnica, pero hasta este momento no se sabe que pueden suprimir o activar los polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares. La mezcla de reacción puede ser un extracto sin células o puede comprender un cultivo de células o tejidos. Los sistemas adecuados para el procedimiento de la invención son conocidos para el experto en la materia y se describen generalmente, por ejemplo, en Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, tercera edición (1994) y en los ejemplos adjuntos. La pluralidad de compuestos puede añadirse, por ejemplo, a la mezcla de reacción, medio de cultivo, inyectarse a una célula o aplicarse de otro modo al animal transgénico. La célula o tejido que puede emplearse en el procedimiento de la invención es preferentemente una célula huésped, célula de mamífero o animal transgénico no humano de la invención como se describe anteriormente en este documento en las realizaciones.

Si una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos se identifica en el procedimiento de la invención, entonces es posible tanto aislar el compuesto de la muestra original identificada que contiene el compuesto que puede suprimir como activar el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares, o bien la muestra original puede subdividirse adicionalmente, por ejemplo, si está constituida por una pluralidad de compuestos diferentes, de manera que se reduzca el número de sustancias diferentes por muestra y el procedimiento se repita con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden realizarse varias veces, preferentemente hasta que la muestra identificada según el procedimiento de la invención sólo comprenda un número limitado de sustancias o sólo una sustancia. Preferentemente, dicha muestra comprende sustancias de propiedades químicas y/o físicas similares, y lo más preferido dichas sustancias son
idénticas.

El experto en la materia conoce varios procedimientos para producir y cribar grandes bibliotecas para identificar compuestos que tienen afinidad específica por una diana. Estos procedimientos incluyen el procedimiento de expresión en fagos, en el que péptidos aleatorios se expresan en fagos y se criban mediante cromatografía de afinidad para un receptor inmovilizado; véanse, por ejemplo, los documentos WO91/17271, WO92/01047, US-A-5.223.409. En otra solución, las bibliotecas combinatorias de polímeros inmovilizados sobre un chip se sintetizan usando fotolitografía; véanse, por ejemplo, los documentos US-A-5.143.854, WO90/15070 y WO92/10092. Los polímeros inmovilizados se ponen en contacto con un receptor marcado y se exploran para marcas para identificar polímeros que se unen al receptor, La síntesis y el cribado de bibliotecas de péptidos en soportes de membrana de celulosa continua que pueden usarse para identificar ligandos de unión del polipéptido de la invención y, por tanto, posibles inhibidores y activadores, se describe, por ejemplo, en Kramer, Methods Mol. Biol. 87 (1998), 25-39. Este procedimiento también puede usarse, por ejemplo, para determinar los sitios de unión y los motivos de reconocimiento en el polipéptido de la invención. En un modo similar se determinó la especificidad del sustrato de la chaperona DnaK y los sitios de contacto entre interleucina 6 humana y su receptor; véanse Rudiger, EMBO J. 16 (1997), 1501-1507 y Weiergraber, FEBS Lett. 379 (1996), 122-126, respectivamente. Además, los procedimientos anteriormente mencionados pueden usarse para la construcción de supertopos de unión derivados del polipéptido de la invención. Una solución similar se describió satisfactoriamente para antígenos de péptidos del anticuerpo monoclonal anti-p24 (VIH-1); véase Kramer, Cell 91 (1997), 799-809. Una ruta general para el análisis de huella genética de interacciones péptido-anticuerpo usando la biblioteca de péptidos de aminoácidos agrupados se describió en Kramer, Mol. Immunol. 32 (1995), 459-465. Además, los antagonistas del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares de la invención pueden derivarse e identificarse de anticuerpos monoclonales que reaccionan específicamente con el polipéptido de la invención según los procedimientos que se describen en Doring, Mol. Immunol. 31 (1994), 1059-1067.

Más recientemente, el documento WO98/25146 describió procedimientos adicionales para cribar bibliotecas de complejos para compuestos que tienen una propiedad deseada, especialmente la capacidad de agonizar, unirse a o antagonizar un polipéptido o su receptor celular. Los complejos en tales bibliotecas comprenden un compuesto a prueba, una marca que registra al menos una etapa en la síntesis del compuesto y una cadena susceptible a modificación por una molécula indicadora. La modificación de la cadena se usa para expresar que un complejo contiene un compuesto que tiene una propiedad deseada. La marca puede descodificarse para revelar al menos una etapa en la síntesis de un compuesto tal. Otros procedimientos para identificar compuestos que interactúan con los polipéptidos según la invención o moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales moléculas son, por ejemplo, el cribado in vitro con el sistema de expresión en fagos, además de ensayos de unión en filtro o midiendo en "tiempo real" la interacción usando, por ejemplo, el aparato BIAcore (Pharmacia).

Todos estos procedimientos pueden usarse para identificar activadores/agonistas e inhibidores/antagonistas del polipéptido asociado a tumores pulmonares o polipéptidos relacionados de la invención.

Pueden emplearse diversas fuentes para la estructura básica de dicho activador o inhibidor y comprenden, por ejemplo, análogos de miméticos del polipéptido de la invención. Los análogos de miméticos del polipéptido de la invención o fragmentos biológicamente activos de los mismos pueden generarse, por ejemplo, substituyendo los aminoácidos que se espera sean esenciales para la actividad biológica con, por ejemplo, estereoisómeros, es decir, D-aminoácidos; véase, por ejemplo, Tsukida, J. Med. Chem. 40 (1997), 3534-3541, Además, en el caso en que usen para el diseño fragmentos de análogos biológicamente activos, los componentes pro-miméticos pueden incorporarse a un péptido para reestablecer al menos algunas de las propiedades conformacionales que puedan haberse perdido con la eliminación de parte del polipéptido original; véase, por ejemplo, Nachman, Regul. Pept. 57 (1995), 359-370. Además, el polipéptido asociado a tumores pulmonares de la invención puede usarse para identificar miméticos de péptidos químicos sintéticos que se unen a o pueden funcionar como un ligando, sustrato, componente de unión o receptor del polipéptido de la invención tan eficazmente como el polipéptido natural; véase, por ejemplo, Engleman, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2284-2292. Por ejemplo, pueden realizarse simulaciones de plegamientos y los rediseños informáticos de motivos estructurales del polipéptido de la invención usando programas informáticos apropiados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). Puede usarse el modelado informático del plegamiento de proteínas para el análisis conformacional y energético de modelos detallados de péptidos y proteínas (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol, 376 (1995), 37-45). En particular, pueden usarse programas apropiados para la identificación de sitios interactivos del polipéptido asociado a tumores pulmonares y su posible receptor, su ligando u otras proteínas que interaccionan mediante búsquedas asistidas por ordenador para secuencias de péptidos complementarios (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120. Además, en la técnica anterior se describen sistemas informáticos apropiados para el diseño de proteínas y péptidos, por ejemplo, en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Los resultados obtenidos de los análisis informáticos anteriormente descritos pueden usarse, por ejemplo, para la preparación de peptidomiméticos de la proteína de la invención o fragmentos de los mismos. Tales análogos de pseudopéptidos de la secuencia de aminoácidos naturales de la proteína pueden imitar muy eficazmente la proteína parental (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por ejemplo, la incorporación de residuos de aminoácidos * aquirales fácilmente disponibles en una proteína de la descripción o un fragmento de la misma da como resultado la sustitución de enlaces amida por unidades de polimetileno de una cadena alifática, proporcionándose así una estrategia conveniente para construir un peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777). En la técnica anterior se describen análogos de peptidomiméticos superactivos de hormonas de péptidos pequeños en otros sistemas (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Los peptidomiméticos apropiados de la proteína de la presente invención también pueden identificarse mediante la síntesis de bibliotecas combinatorias de peptidomiméticos mediante alquilación sucesiva de amidas y probando los compuestos resultantes, por ejemplo, para sus propiedades de unión e inmunológicas. Los procedimientos para la generación y uso de bibliotecas combinatorias de peptidomiméticos se describen en la técnica anterior, por ejemplo, en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 y Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Además, puede usarse una estructura tridimensional y/o cristalográfica del polipéptido de la invención para el diseño de inhibidores de peptidomiméticos de la actividad biológica del polipéptido de la invención (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

El diseño basado en la estructura y la síntesis de moléculas sintéticas de bajo peso molecular que imitan la actividad del polipéptido biológico nativo se describen adicionalmente en, por ejemplo, Dowd, Nature Biotechnol. 16 (1998), 190-195; Kieber-Emmons, Current Opinion Biotechnol. 8 (1997), 435-441; Moore, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 115-119; Mathews, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 121-125; Mukhija, European J. Biochem. 254 (1998), 433-438.

También es muy conocido para el experto en la materia que es posible diseñar, sintetizar y evaluar miméticos de compuestos orgánicos pequeños que, por ejemplo, pueden actuar como sustrato o ligando para el polipéptido asociado a tumores pulmonares de la invención o el polipéptido relacionado. Por ejemplo, se ha descrito que los miméticos de D-glucosa de hapalosina presentaron una eficiencia similar a la hapalosina en la antagonización de la proteína asociada a la resistencia a múltiples fármacos en citotoxicidad; véase Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987.

La molécula de ácido nucleico de la invención también puede servir de diana para activadores e inhibidores. Los activadores pueden comprender, por ejemplo, proteínas que se unen al ARNm de un gen que codifica el polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares, estabilizándose así la conformación nativa del ARNm y facilitándose la transcripción y/o traducción, por ejemplo, del mismo modo que la proteína Tat actúa en ARN de VIH. Además, en la bibliografía se describen procedimientos para identificar moléculas de ácidos nucleicos tales como un fragmento de ARN que imita la estructura de un molécula de ARN diana definida o sin definir a la que se une un compuesto dentro de una célula dando como resultado el retraso del crecimiento celular o muerte celular; véase, por ejemplo, el documento WO98/18947 y las referencias citadas en él. Estas moléculas de ácidos nucleicos pueden usarse para identificar compuestos desconocidos de interés farmacéutico y/o agrícola y para identificar dianas de ARN desconocidas para uso en el tratamiento de una enfermedad. Estos procedimientos y composiciones pueden usarse en el cribado de antibióticos, bacteriostáticos novedosos o modificaciones de los mismos o para identificar compuestos útiles para alterar los niveles de expresión de proteínas codificadas por una molécula de ácido nucleico. Alternativamente, por ejemplo, la estructura conformacional del fragmento de ARN que imita el sitio de unión puede emplearse en el diseño racional de fármacos para modificar antibióticos conocidos para hacer que se unan más ávidamente a la diana. Una metodología tal es la resonancia magnética nuclear (RMN), que es útil para identificar estructuras conformacionales de fármacos y ARN. Todavía otros procedimientos son, por ejemplo, los procedimientos de diseño de fármacos, como se describen en los documentos WO95/35367, US-A-5.322.933, en los que puede deducirse la estructura cristalina del fragmento de ARN y se utilizan programas informáticos para diseñar compuestos de unión novedosos que pueden actuar como antibióticos.

Algunos cambios genéticos llevan a estados conformacionales alterados de las proteínas. Por ejemplo, algunos polipéptidos mutantes inventivos asociados a tumores pulmonares pueden poseer una estructura terciaria que les convierte en mucho menos capaces de degradar proteínas. La restitución de la conformación normal o regulada de las proteínas mutadas es el medio más elegante y específico para corregir estos defectos moleculares, aunque puede ser difícil. Por tanto, las manipulaciones farmacológicas pueden apuntar a la restitución de la conformación de tipo salvaje del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares. Por tanto, las moléculas de ácidos nucleicos y polipéptidos codificados de la presente invención también pueden usarse para diseñar y/o identificar moléculas que pueden activar la función de tipo salvaje del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares o polipéptido
relacionado.

Los compuestos que pueden probarse e identificarse pueden ser bibliotecas de expresión, por ejemplo, bibliotecas de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, hormonas, peptidomiméticos, ANP o similares (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 y referencias citadas anteriormente). Además, los genes que codifican un regulador putativo del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares y/o que ejercen sus efectos aguas arriba o abajo del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares pueden identificarse usando, por ejemplo, mutagénesis por inserción usando, por ejemplo, vectores que eligen como diana genes conocidos en la técnica. Dichos compuestos también pueden ser derivados o análogos funcionales de inhibidores o activadores conocidos. Tales compuestos útiles pueden ser, por ejemplo, factores transactivadores que se unen al polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares o secuencias reguladoras del gen que lo codifica. La identificación de factores transactivadores puede llevarse a cabo usando procedimientos habituales en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, anteriormente, y Ausubel, anteriormente). Para determinar si una proteína se une a la propia proteína o a secuencias reguladoras pueden llevarse a cabo análisis habituales de desplazamiento en geles nativos, Con el fin de identificar un factor transactivador que se una a la proteína o secuencia reguladora, la proteína o secuencia reguladora puede usarse como un reactivo de afinidad en procedimientos habituales de purificación de proteínas, o como una sonda para el cribado de una biblioteca de expresión. La identificación de moléculas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que interactúan con los polipéptidos inventivos asociados a tumores pulmonares descritos anteriormente también puede lograrse, por ejemplo, como se describe en Scofield (Science 274 (1996), 2063-2065) mediante el uso de la levadura denominada "sistema de dos híbridos". En este sistema, el polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico según la invención o un parte más pequeña del mismo se liga al dominio de unión de ADN del factor de transcripción GAL4. Una cepa de levadura que expresa este polipéptido de fusión y que comprende un gen indicador lacZ accionado por un promotor apropiado, que es reconocido por el factor de transcripción GAL4, se transforma con una biblioteca de ADNc que expresará proteínas o péptidos vegetales de la misma fusionadas a un dominio de activación. Por tanto, si un péptido codificado por uno de los ADNc puede interactuar con el péptido de fusión que comprende un péptido de un polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares, el complejo puede dirigir la expresión del gen indicador. De este modo, las moléculas de ácidos nucleicos según la invención y el péptido codificado pueden usarse para identificar péptidos y proteínas que interactúan con la proteína inventiva asociada a tumores pulmonares. Entonces, para el experto en la materia es evidente que este sistema y similares pueden explotarse adicionalmente para la identificación de inhibidores de la unión de las proteínas inventivas asociadas a tumores pulmonares.

Una vez se ha identificado el factor transactivador, la modulación de su unión a o regulación de la expresión del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares puede proseguir empezando con, por ejemplo, el cribado de inhibidores contra la unión del factor transactivador a la proteína de la presente invención. Entonces, la activación o represión de las proteínas inventivas asociadas a tumores pulmonares podría lograrse en animales aplicando el factor transactivador (o su inhibidor) o el gen que lo codifica, por ejemplo, en un vector de expresión. Además, si la forma activa del factor transactivador es un dímero, los mutantes negativos del dominante del factor transactivador podrían prepararse con el fin de inhibir su actividad. Además, con la identificación del factor transactivador, entonces pueden identificarse más componentes en la ruta que llevan a la activación (por ejemplo, transducción de señales) o represión de un gen que participa en el control del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares. Entonces, la modulación de las actividades de estos componentes puede proseguir con el fin de desarrollar fármacos y procedimientos adicionales para modular el metabolismo de la degradación de proteínas en animales. Por tanto, la presente descripción también describe el uso del sistema de dos híbridos como se define anteriormente para la identificación del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares o activadores o inhibidores del polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares.

Los compuestos aislados mediante los procedimientos anteriores también sirven como compuestos guía para el desarrollo de compuestos análogos. Los análogos deberían tener una configuración electrónica estabilizada y conformación molecular que permitiera que grupos funcionales clave se presentaran al polipéptido inventivo asociado a tumores pulmonares o a su posible receptor en sustancialmente el mismo modo que el compuesto guía. En particular, los compuestos análogos tienen propiedades electrónicas espaciales que son comparables a la región de unión, pero pueden ser moléculas más pequeñas que el compuesto guía que frecuentemente tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 2 kD y preferentemente inferior a aproximadamente 1 kD. La identificación de compuestos análogos puede realizarse mediante uso de técnicas tales como análisis del campo autoconsistente (SCF), análisis de interacción de configuraciones (CI) y análisis de dinámica en modo normal. Están disponibles programas informáticos para implementar estas técnicas; por ejemplo, Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, Nueva York, 1989). Los procedimientos para la preparación de derivados y análogos químicos son muy conocidos para aquellos expertos en la materia y se describen en, por ejemplo, Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, editorial Springer, Nueva York Inc., 175 Fifth Avenue, Nueva York, N.Y. 10010 EE.UU, y Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, EE.UU. Además, dichos derivados y análogos pueden probarse para sus efectos según procedimientos conocidos en la técnica; véase también anteriormente. Además, pueden usarse peptidomiméticos y/o el diseño asistido por ordenador de derivados y análogos apropiados, por ejemplo, según los procedimientos descritos anteriormente.

En una realización preferida de los procedimientos anteriormente descritos, dicha célula es una célula de o se obtiene mediante un procedimiento de la invención o está comprendida en el animal no humano transgénico anteriormente descrito.

Una vez se ha identificado y obtenido el compuesto, se proporciona preferentemente en una forma terapéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un procedimiento para la detección de cánceres de pulmón basado en la determinación del nivel de expresión del gen inventivo asociado a tumores pulmonares en muestras biológicas. Además, la presente invención describe un kit de prueba de investigación o diagnóstico como se describe en las reivindicaciones adjuntas para realizar las reacciones que participan en la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de sobreexpresión del gen inventivo asociado a tumores pulmonares.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 Variante 1 de ARNm de LUMA1 humana y la isoforma 1 de la proteína LUMA1 codificada;

la fig. 2 Variante 2 de ARNm de LUMA1 humana. El corte y empalme diferencial del exón 7 lleva a la deleción de parte del exón 7 que introduce un marco de lectura en la secuencia de 3' de la variante de corte y empalme. En comparación con la variante 1 de ARNm, la proteína codificada en la variante 2 es más corta que la proteína en la variante 1 de ARNm. El desplazamiento del marco lleva a una isoforma de proteína con una secuencia de extremo carboxi diferente;

la fig. 3 Variante 3 de ARNm de LUMA1 humana. Esta variante se caracteriza por una deleción de 3 pb y un sitio de poliadenilación diferente que lleva a una secuencia de 3' más corta;

la fig. 4 Variante 4 de ARNm de LUMA1 humana. Esta variante se caracteriza por una deleción del exón 3;

la fig. 5 Variante 5 de ARNm de LUMA1 humana. Esta variante se caracteriza por una deleción del exón 3 y el exón 4;

la fig. 6 Variante 6 de ARNm de LUMA1 humana. Esta variante se caracteriza por una deleción del exón 3, 4 y 5;

la fig. 7 Secuencia genómica del gen de LUMA1 humana. Las secuencias del exón de LUMA1 se muestran en letras rojas o magenta y están subrayadas. La secuencia genómica alberga del exón 1 al exón 8 de LUMA1. Pueden detectarse dos sitios aceptores de corte y empalme diferentes en el exón 3 que llevan a un codón adicional que está indicado por (>). El exón 3 o exones 3 y 4 o exones 3, 4 y 5 están diferencialmente cortados y empalmados. Además, se ha detectado el corte y empalme diferencial de parte del exón 7. Mientras que las deleciones del exón 3, exones 3 y 4 y exones 3, 4 y 5 llevan a una deleción del marco de secuencias de aminoácidos de LUMA1 internas, el corte y empalme diferencial de parte del exón 7 genera un desplazamiento del marco, Este desplazamiento del marco genera diferentes isoformas de la proteína LUMA1 de extremo carboxi. Los dos sitios aceptores de corte y empalme en el exón 7 están indicados por (>). Además, se indican dos sitios de poliadenilación diferentes del gen de LUMA1;

la fig. 8 Secuencia de ARNm de LUMA1 de ratón;

la fig. 9 Comparación de la secuencia de nucleótidos de ARNm de LUMA1 humana y de ratón. En toda la secuencia codificante puede detectarse una fuerte conservación de secuencias durante la evolución;

la fig. 10 Comparación de la secuencia de nucleótidos de ARNm de LUMA1 humana y de ratón. Los bloques de secuencias que son idénticos en LUMA1 humana y de ratón están en un recuadro en azul;

la fig. 11 Comparación de secuencias de aminoácidos de proteína LUMA1 humana y de ratón. Los bloques de secuencias que son idénticos en LUMA1 humana y de ratón están en un recuadro en azul. Las secuencias de péptidos sumamente conservadas son actualmente indicativas de una función sumamente conservada durante evolución;

la fig. 12 Estructura genómica del gen de LUMA 1. Los exones cortados y empalmados diferencialmente tres, cuatro y cinco se representan en gris. La parte cortada y empalmada diferencialmente del exón siete también se representa en gris;

la fig. 13 - 17 Detección de la expresión de LUMA1 en adenocarcinomas de pulmón usando la técnica de PCR en tiempo real (ABI TaqMan 7700). Para la amplificación del gen de LUMA1 se usaron los siguientes cebadores: LUMA1-A: CTCGTCAGGCGACCTTATATC; LUMA1-B: TGTCAGTTGAACATTTTCTGCC. Para el análisis se usaron muestras correspondientes de tumor y normales;

la fig. 18 Electroforesis en gel de la PCR de punto final de la amplificación del transcrito de LUMA1 en adenocarcinomas de pulmón y tejido normal correspondiente. En el tumor T1 y T3 se observó una expresión potenciada de LUMA1, en el tumor T4 y T5 una fuerte sobreexpresión de LUMA1 en comparación con la muestra normal correspondiente. Los productos de PCR analizados en el gel de agarosa se derivaron de las reacciones de PCR en tiempo real mostradas en la figura 13 - 17;

la fig. 19 Electroforesis en gel de la PCR de punto final de la amplificación del transcrito de LUMA1 en adenocarcinomas de pulmón y tejido normal correspondiente. Mientras que en la muestra normal N1, N3 y N4 no se detectó transcrito de LUMA1, en el adenocarcinoma de pulmón T1 y T3 se detectó la expresión del transcrito de LUMA1. En T4 no fue visible la amplificación. En T2 y T5 se detectó una expresión potenciada. Para la amplificación del gen de LUMA1 se usaron los siguientes cebadores: LUMA1-C: CTCGTCAGGCGATACTCCC; LUMA1-D: CACCAGTCAGCTCTAAATGGG;

Los siguientes ejemplos sólo se facilitan con el fin de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención descrita en este documento.

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Ejemplo 1 Análisis mediante RT-PCR en tiempo real de la expresión de LUMA1 en muestras de tumor que incluyen carcinoma de colon, carcinoma del estómago, cáncer de pulmón de células pequeñas y adenocarcinoma de pulmón

Se ha detectado una regulación por incremento de transcritos de LUMA1 en el 60% de los adenocarcinomas de pulmón probados, mientras que no se encontró regulación por incremento en carcinoma de colon, carcinoma del estómago y cáncer de pulmón de células pequeñas.

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1.1. Base teórica

Los valores cuantitativos se obtienen del número de ciclos umbral al que empieza a detectarse el aumento en la señal asociada con un crecimiento exponencial de productos de PCR (usando el software de análisis de PE Biosystems), según los manuales del fabricante.

Se añadieron 6,25 ng de ADNc de ARN total cebado con oligo dT a cada PCR en tiempo real. Se cuantificaron transcritos del gen beta-actina (actina ACTB, cebador actina 1 - CCTAAAAGCCACCCCACTTCTC, cebador actina 2 - ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG) que codifica actina humana, beta (AUIB) como control de ARN endógeno.

Los resultados finales, expresados como diferencias de orden N en la expresión génica diana respecto al gen de referencia ACTB, denominados "Ndiana", se determinaron del siguiente modo:

N_{diana} = 2^{(deltaCt_{muestra}-deltaCt_{gen \ de \ referencia})}

en la que los valores de delta Ct de la muestra y la referencia se determinan restando el valor de Ct medio del gen WT1 del valor de Ct medio del gen ACTB.

Los cebadores de los genes WT1 y ACTB se eligieron con la ayuda de los programas informáticos PRIMER (paquete informático Husar, DKFZ Heidelberg) y Primer Express (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Para la amplificación del gen de LUMA1 se usaron las siguientes secuencias de nucleótidos de cebadores: LUMA1-A: CTCGTCAGGCGACCTTATATC y LUMA1-B: TGTCAGTTGAACATTTTCTGCC; LUMA1-C: CTCGTCAGGC
GATACTCCC y LUMA1-D: CACCAGTCAGCTCTAAATGGG.

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1.2. Extracción de ARN

El ARN total fue extraído de especimenes de tejido usando QIAamp RNA Mini Protocol (Qiagen, Hilden, Alemania).

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1.3. Síntesis de ADNc

Se digirió 1 \mug de ARN total con ADNsa I durante 15 min a 25ºC en un volumen final de 20 \mul que contenía 1 \mul de ADNsa I calidad para amplificación (1 unidad/\mul; Invitrogen) y 2 \mul de tampón de reacción de ADNsa (10x; Invitrogen), La reacción se detuvo mediante la adición de 2 \mul de EDTA (25 mM; Invitrogen) e incubación durante 10 min a 65ºC.

La transcripción inversa se realizó durante 2 h a 37ºC en un volumen final de 40 \mul que contenía 4 \mul de 10x tampón RT, 4 \mul de dNTP 5 mM, 1 \mul de RNAsin 40 U/\mul (Promega), 4 \mul de cebador oligo dT 0,5 \mug/ml y 2 \mul de Omniscript 4 U/\mul (Qiagen, Hilden, Alemania). La transcriptasa inversa se inactivó mediante calentamiento a 93ºC durante 5 min y enfriamiento a 4ºC durante 5 min.

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1.4. Amplificación por PCR

Todas las reacciones de PCR se realizaron usando un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). La PCR se realizó usando la mezcla para PCR SYBR® Green (Perkin-Elmer Applied Biosystems). La condiciones de ciclado térmico comprendían una etapa de desnaturalización inicial a 95ºC durante 10 min y 40 ciclos a 95ºC durante 15 s y 60ºC durante 1 min. Los experimentos se realizaron por duplicado para cada punto de datos.

Como se muestra en la figura 13 - 17, se ha detectado una expresión potenciada de transcritos de LUMA1 en adenocarcinomas de pulmón. Para la amplificación de los transcritos de LUMA1 se usaron los siguientes cebadores: LUMA1-A: CTCGTCAGGCGACCTTATATC y LUMA1-B: TGTCAGTTGAACATTTTCTGCC. La PCR con los cebadores LUMA1-A y LUMAl-B amplifica la variante de corte y empalme que aloja el exón 7 completo, mientras que los cebadores LUMA1-C (CTCGTCAGGCGATACTCCC) Y LUMA1-D (CACCAGTCAGCTCTAAATGGG) amplifican la variante de corte y empalme que sólo representa parte del exón 7. Usando estas combinaciones de cebadores se observó una regulación por incremento de ambas variantes de corte y empalme en experimentos de PCR en tiempo real. En la figura 13 se muestra la amplificación en tiempo real del tumor 1 y la muestra normal 1 correspondiente (cebador LUMA1-A y LUMA1-B), Se observó una diferencia de ciclos umbral de tres, mientras que con los cebadores de referencia no se detectó diferencia para el gen ACTB (no mostrado). Esto indica una sobreexpresión de 8 veces del transcrito de LUMA1 en adenocarcinoma de pulmón del paciente 1. En el paciente 2 no se observaron diferencias entre el tejido normal y de adenocarcinoma de pulmón (fig, 14). En el paciente 3 mostró un sobreexpresión de 13 veces en el tejido tumoral (fig. 15). Los pacientes 4 y 5 se caracterizaron por la ausencia de transcrito de LUMA1 en tejido normal y una fuerte regulación por incremento en el tejido tumoral (superior a 4.000 veces) (fig. 16; 17).

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Ejemplo 2 Clonado de transcritos de LUMA1 cortados y empalmados diferencialmente

Usando cebadores específicos para el transcrito de LUMA1 se llevó a cabo la PCR con ADNc humano cebado aleatoriamente derivado de adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de colon y cerebro fetal.

Cebadores directos:

LUMA1-C: CTCGTCAGGCGATACTCCC; LUMA1-E: ATGGAAATCACCACTCTGAGAG: LUMA1-F:
TTGATCCAGAAAGTGTGTGAGC

Cebadores inversos:

LUMA1-G: TGCAGTTGGCCCAGCTTAGAA; LUMA1-H: AGTCTTTAAAAAGCGTTGCTGG

Para la amplificación se usaron las siguientes combinaciones de cebadores:

LUMA1-C + LUMA1-H; LUMA1-E + LUMA1-G; LUMA1-E + LUMA1-H; LUMA1-F + LUMA1-G; LUMA1-F + LUMA1-H

Las siguientes condiciones de PCR usadas fueron para amplificar los transcritos de LUMA1 cortados y empalmados diferencialmente:

95ºC 1 min, (95ºC 30 s, 60ºC 1 min, 68ºC 3,5 min) - 34 ciclos

Se usó la polimerasa TaqAdvantage (Clontech).

1 \mul de dNTP (20 mM), 0,5 \mul de 50x TaqAdvantage (Clontech), 2,5 \mul de 10x tampón, 3 \mul de ADNc (100 ng), 1,5 \mul (cebador directo, 10 \mum), 1,5 \mul (cebador inverso, 10 \mum), 15 \mul de H_{2}O.

Los productos de PCR se secuenciaron directamente o bien en primer lugar se clonaron en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y luego se secuenciaron. El análisis de secuencias y las búsquedas en bases de datos se realizaron con el paquete informático HUSAR (DKFZ Heidelberg). El análisis de secuencias de los productos de PCR clonados ha demostrado un corte y empalme extenso del transcrito de LUMA1. Se ha identificado un transcrito que se caracterizó por la ausencia del exón 3. Otro transcrito perdió el exón 3 y 4. Además, se ha clonado un transcrito en el que se desempalmó el exón 3, 4 y 5. El desempalme de los exones 3 ó 4 ó 5 o combinaciones de los mismos no cambia el marco de lectura y lleva a deleciones internas en las isoformas de la proteína LUMA1 codificada. A diferencia de estas variantes de corte y empalme, el corte y empalme diferencial en el exón 7 lleva a un desplazamiento del marco. Si el exón 7 completo está presente en el transcrito, el marco de lectura abierto casi se extiende hasta el extremo 3' del transcrito. Si la primera parte del exón 7 se desempalma, en el transcrito resultante se genera un desplazamiento del marco que lleva a un extremo carboxi más corto de la proteína codificada, Se mostró que ambas variantes de corte y empalme del exón 7 se regulaban por incremento en adenocarcinomas de pulmón (fig. 13-17; fig, 18-19).

Claims (11)

1. Un ácido nucleico aislado regulado por incremento en tumores pulmonares seleccionado de

(a) una molécula de ácido nucleico que presenta la secuencia representada en la figura 1, figura 2 o figura 3;

(b) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia diferente de la secuencia del ADNc o ARNm de (a) debido a la degeneración del código genético; y;

(c) una molécula de ácido nucleico que es complementaria o inversamente complementaria a las moléculas de ácido nucleico de (a) o (b).

2. Un vector recombinante que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. El vector recombinante de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico está operativamente ligada a elementos reguladores que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en células huésped procariotas y/o eucariotas.

4. Un huésped recombinante que contiene el vector recombinante de la reivindicación 2 ó 3 seleccionado de un grupo que está constituido por

a.

un animal no humano transgénico;

b.

una célula de mamífero;

c.

una célula bacteriana;

d.

una célula de insecto; y

e.

una célula de levadura.

5. El huésped recombinante de la reivindicación 4, en el que el animal no humano transgénico comprende además al menos un alelo de tipo salvaje inactivado del gen con la secuencia dada en la figura 7.

6. El huésped recombinante de la reivindicación 4 ó 5 en el que el animal no humano transgénico es un ratón o una rata.

7. Un procedimiento para preparar un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 que comprende

a.

tener dicho polipéptido expresado en

i.

el huésped recombinante de las reivindicaciones 4 - 5; o

ii.

un sistema de transcripción y/o traducción in vitro sin células usando el vector recombinante de las reivindicaciones 2 - 3; y

b.

recuperar dicho polipéptido.

8. Una molécula de polipéptido aislada que está codificada por una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 seleccionada de un grupo que está constituido por

(a)

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos dada en los aminoácidos 306 a 347 de la figura 1, los aminoácidos 305 a 311 de la figura 2 o los aminoácidos 305 a 345 de la figura 3; y

(b)

un polipéptido producido por el procedimiento de la reivindicación 7; y

(c)

un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de (a) o (b).

9. Un anticuerpo que reconoce y se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos dada en los aminoácidos 306 a 347 de la figura 1, los aminoácidos 305 a 311 de la figura 2 o los aminoácidos 305 a 345 de la figura 3; seleccionado de un grupo que comprende

a

un anticuerpo monoclonal;

b

un anticuerpo policlonal;

c

un fragmento Fab; y

d

un anticuerpo de cadena sencilla.

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10. Un par de cebadores de ácidos nucleicos seleccionado de un grupo que está constituido por

(a) LUMA1-A: CTCGTCAGGCGACCTTATATC y LUMA1-B: TGTCAGTTGAACATTTTCTGCC; y

(b) LUMA1-C: CTCGTCAGGCGATACTCCC y LUMA1-D: CACCAGTCAGCTCTAAATGGG.

11. Los ácidos nucleicos de la reivindicación 1, los polipéptidos de la reivindicación 8, el anticuerpo de la reivindicación 9 o el par de cebadores de ácidos nucleicos de la reivindicación 10 para el diagnóstico de tumores pulmonares.