ES2298304T3 - Composiciones y procedimientos para la deteccion y tratamiento de anormalidades proliferativas asociadas con la sobreexpresion de gen like-1 de transcetolasa humano. - Google Patents
Composiciones y procedimientos para la deteccion y tratamiento de anormalidades proliferativas asociadas con la sobreexpresion de gen like-1 de transcetolasa humano. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento in vitro para la detección de trastornos caracterizados por una proliferación anormal de células en un individuo, que comprende a. detectar el nivel de expresión de gen like-1 de transcetolasa humano en una muestra biológica obtenida de dicho individuo y en una muestra de ensayo testigo; b. valorar el diagnóstico de la comparación de dicho nivel de expresión en la muestra obtenida de dicho individuo con dicho nivel de expresión en la muestra de ensayo testigo, en que una expresión significativamente elevada en la muestra obtenida de dicho individuo es una sobreexpresión y es indicativa de trastornos caracterizados por una proliferación anormal de células.
Description
Composiciones y procedimientos para la detección
y tratamiento de anormalidades proliferativas asociadas con la
sobreexpresión de gen like-1 de transcetolasa
humano.
La presente invención se refiere a
procedimientos para el tratamiento y la diagnosis de trastornos
asociados con células anormalmente proliferadoras. En un aspecto la
invención se refiere a procedimientos que son esencialmente útiles
para la detección de tumores y sus etapas precursoras basados en la
detección de la sobreexpresión de gen like-1 de
transcetolasa humano en muestras biológicas. En otro aspecto, la
invención se refiere a procedimientos para el tratamiento de
trastornos asociados con la sobreexpresión de gen
like-1 de transcetolasa humano. Los procedimientos
para el tratamiento pueden incluir aproximaciones terapéuticas
génicas así como procedimientos para inhibir o reducir la actividad
de polipéptidos like-1 de transcetolasa.
A pesar de los significativos esfuerzos de
investigación científica y médica, las enfermedades neoplásticas
continúan siendo una causa principal de mortalidad humana. Por
ejemplo, cada año más de 340.000 personas en Alemania desarrollan
cáncer y más de 210.000 mueren de la enfermedad. Los tumores
epiteliales representan la mayoría de los cánceres: el cáncer de
pulmón es la causa principal de muertes por cáncer en hombres, y el
cáncer de mamas es la causa principal en mujeres. La segunda causa
principal de muertes por cáncer en ambos sexos es el cáncer
colon-rectal (Becker, N. y Wahrendorf, J., (1997)
Atlas of Cancer Mortality in the Federal Republic of Genrmany
1981-1990, Springer-Verlag, Berlin,
Keidelberg).
Una razón importante para esta situación
insatisfactoria es que la mayoría de las enfermedades neoplásticas
son diagnosticadas en etapas relativamente tardías, cuando las
células tumorales aisladas o los agregados de células tumorales
pequeñas ya fueron liberadas del tumor primario y distribuidas en el
conjunto del organismo del hospedante y pueden haber provocado ya
eventualmente una enfermedad metastática oculta o manifiesta. Los
cánceres tempranos y, en particular, los
pre-cánceres habitualmente no provocan ningún
síntoma y no son advertidos por los respectivos pacientes.
Para superar esto, se requieren más esfuerzos de
investigación y programas clínicos para mejorar las tecnologías de
detección temprana del cáncer, así como para desarrollar verdaderas
estrategias de vacunas preventivas o terapéuticas para inmunizar
los pacientes antes de que surja un cáncer definido o después de la
extirpación de un cáncer o sus precursores para prevenir que las
células cancerígenas aisladas diseminadas (DTCs) que puedan haber
sido liberadas desde el neoplasma antes o durante una intervención
quirúrgica primaria.
Para unos pocos cánceres, en particular el
cáncer de cuello uterino, podrían ser establecidos programas de
detección temprana. La posterior reducción de las tasas de
mortalidad asociadas con estos neoplasmas específicos demostraron
convincentemente la elevada eficacia de los programas de detección
temprana.
En resumen, desgraciadamente los procedimientos
de diagnóstico usados hasta ahora son relativamente insensibles y
corren el riesgo de producir falsos resultados positivos debido a la
falta de especifidad. Además de ello, usando los actuales
procedimientos de diagnóstico, no puede ser prevista ninguna
conclusión relativa al grado de malignidad, progreso del tumor y su
capacidad potencial de producir metástasis.
Por tanto, el uso de marcadores moleculares de
diagnóstico fiables sería altamente ventajoso para la comprensión de
la base molecular de los tumores epiteliales, por ejemplo, tumores
de colon, para distinguir tejido benigno del maligno y para graduar
y clasificar carcinomas, particularmente para pacientes con cáncer
metastático que tienen un pronóstico muy malo. Puede esperarse que
estos marcadores sean útiles también para el desarrollo de nuevas
vías terapéuticas para el tratamiento del cáncer.
La comprensión de los acontecimientos
moleculares que subyacen en la transición de una célula normal a una
célula tumoral de grados diferentes de agresividad y la
disponibilidad de sistemas experimentales apropiados para
seleccionar genes asociados con el cáncer son requisitos previos
absolutos para la identificación de estos nuevos marcadores de
diagnóstico y dianas de fármacos terapéuticos.
Está comúnmente aceptado que la tumorigénesis
representa un procedimiento complejo de múltiples etapas en el que
los cambios genéticos y los factores medioambientales se cree que
desregulan los procedimientos celulares que controlan la
proliferación y diferenciación celular. Este procedimiento de
múltiples etapas está bien ilustrado, por ejemplo, por los cánceres
de colon-rectales, que normalmente se desarrollan
durante décadas y parece que requieren múltiples acontecimientos
genéticos para completarse (para una revisión, véase Kinzler y
Vogelstein, 1996, Cell 87, 159-170). Tanto la
herencia como genes alterados (que da lugar a una marcada
predisposición) como la estabilidad genómica (provocada por agentes
genotóxicos a partir del medio ambiente) dan lugar a mutaciones
somáticas adicionales que contribuyen a este procedimiento.
Claramente, la lista de factores decisivos causalmente involucrados
en la formación de tumores está lejos de ser completa y
evidentemente variará dependiendo del tipo de tumor.
Por tanto, el problema técnico que subyace en la
presente invención es proporcionar medios para el diagnóstico y la
terapia de tumores epiteliales, que superen las desventajas de los
procedimientos de diagnóstico y terapéuticos actualmente
disponibles.
La solución a dicho problema técnico se consigue
proporcionando las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
La presente invención se basa en los
descubrimientos de los inventores, de que el gen
like-1 de transcetolasa humano como es proporcionado
en la SEQ. ID. 1 (TKT-L1, TKR: NM_012253; Número de
acceso: X91817) es altamente sobreexpresado en tejido de carcinoma
de colon, carcinoma pancreático, cáncer de pulmón y cáncer gástrico
en comparación con el nivel encontrado en el respectivo tejido
testigo normal. Esto es especialmente útil par fines de
diagnóstico, ya que la enzima transcetolasa no es comparativamente
sobreexpresada en el tejido tumoral.
A partir del documento WO 01/92310 se conoce que
las transcetolasa TKTL2 es una diana útil para la inhibición de la
proliferación tumoral. Los autores suponen que la expresión de la
proteína TKTL2 en la actividad enzimática de TKTL2 aumenta en las
células tumorales. Por lo tanto, sugieren que la TKTL2 es una diana
para la inhibición de la proliferación tumoral.
Cascante et al. 2000 (en NUTRITION AND
CANCER, Vol. 36, nº 2, páginas 150-154, XP008012308)
se ocupan de la transcetolasa TKT (EC 2.2.1.1). Los autores
demuestran que los testigos de TKT controlan el flujo de sustrato
de trayectoria no oxidativa. En base a sus descubrimientos, suponen
que la supresión de la proliferación de tumores requiere la
inhibición de la actividad enzimática de TKT. Además de ello, los
autores llegaron a la conclusión de que la inhibición satisfactoria
de la proliferación tumoral usando la oxitiamina análoga de tiamina
es el resultado de una inhibición de TKT. En consecuencia, proponen
la TKT como diana relevante para una nueva terapia
anti-cancerígena.
Coy et al., 1996 (en GENOMICS Vol. 32, nº
3, páginas 309-316, XP000616489 ISSN:
0888-7543) y los autores del documento WO 07/05253
fueron los primeros en describir la identificación del gen de TKTL1
(gen relacionado con transcetolasa/TKR = gen tipo 1 de
transcetolasa/TKTL1). Los autores suponen que las mutaciones en el
gen de TKTL1 son responsables de la enfermedad neurológica
"síndrome de Wemicke-Korsakoff". Una relación
entre TKTL1 y el cáncer no era explícita ni implícitamente
considerada en estas publicaciones.
En primer lugar, la presente invención ha
mostrado que un procedimiento para el diagnóstico de tumores puede
estar basado en la detección de la sobreexpresión de productos de
gen like-1 de transcetolasa en muestras biológicas.
Según la presencia o ausencia detectada y/o el nivel de productos
like-1 de transcetolasa, es posible predecir el
transcurso de la enfermedad, para valorar un pronóstico y adaptar
una terapia adecuada para los pacientes.
Además de ello, la invención hace posible
procedimientos terapéuticos aplicables a trastornos asociados con la
sobreexpresión de productos de gen like-1 de
transcetolasa. Por otra parte, la invención proporciona
procedimientos que usan ácidos nucleicos o polipéptidos
like-1 de transcetolasa para la terapia de
trastornos. Por otra parte, la invención proporciona procedimientos
basados en la reducción de la actividad enzimática de polipéptidos
de gen like-1 de transcetolasa. Por tanto, es un
aspecto de la invención proporcionar un procedimiento para la
manipulación racional de tumores basado en la obtención de productos
génicos like-1 de transcetolasa en muestras de
pacientes y la adaptación de una terapia correlacionada con la
sobreexpresión detectada de dichos productos génicos.
Finalmente, la presente invención se refiere a
estuches de ensayo de diagnóstico e investigación y a composiciones
farmacéuticas útiles para realizar los procedimientos descritos en
la presente memoria descriptiva.
Figura 1: Detección de la sobreexpresión de
gen like-1 de transcetolasa mediante
RT-PCR en carcinomas de colon; el diagrama
muestra la inducción de expresión del gen like-1 de
transcetolasa en tejido de carcinoma de colon en comparación con
tejido testigo.
Figura 2: Detección de la sobreexpresión de
gen like-1 de transcetolasa en adenocarcinomas de
pulmón; el diagrama muestra la inducción de la expresión de gen
like-1 de transcetolasa en tejido de adenocarcinoma
de pulmón en comparación con tejido testigo.
Figura 3: Detección de la sobreexpresión de
gen like-1 de transcetolasa por
RT-PCR en carcinomas de estómago; el diagrama
muestra la inducción de la expresión de gen like-1
de transcetolasa en tejido de carcinomas del estómago en
comparación con tejido testigo.
Figura 4: Detección de la sobreexpresión de
transcetolasa por RT-PCR en carcinomas de colon;
el diagrama muestra la inducción de la expresión de transcetolasa
en tejido de carcinoma de colon en comparación con tejido
testigo.
Figura 5: Detección de la sobreexpresión de
transcetolasa por RT-PCR en adenocarcinomas de
pulmón; el diagrama muestra la inducción de la expresión de
transcetolasa en tejido de adenocarcinoma de pulmón en comparación
con tejido testigo.
Figura 6: Detección de la sobreexpresión de
transcetolasa por RT-PCR en carcinomas del
estómago; el diagrama muestra la inducción de la expresión de
transcetolasa en tejido de carcinoma del estómago en comparación con
el tejido testigo.
La presente invención proporciona procedimientos
para la detección y el tratamiento de trastornos caracterizados por
una proliferación celular anormal como, por ejemplo, cánceres.
Es un primer aspecto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la detección de trastornos
caracterizados por una proliferación celular anormal como por
ejemplo, cánceres basados en la determinación de la presencia o
ausencia y/o el nivel de expresión de gen like-1 de
transcetolasa humana (TKT-L1, TKR: NM_012253;
Número de acceso: X91817) en muestras biológicas.
Es un segundo aspecto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para el tratamiento de trastornos
caracterizados por una proliferación celular anormal como, por
ejemplo, cánceres, usando productos génicos like-1
de transcetolasa humana como agentes terapéuticamente activos.
Un tercer aspecto de la presente invención es un
estuche de ensayo de investigación o diagnóstico para realizar la
reacciones involucradas en la detección de la presencia o ausencia
y/o el nivel de sobreexpresión de gen like-1 de
transcetolasa humana.
Un cuarto aspecto de la presente invención se
refiere a composiciones farmacéuticas aplicables en el tratamiento
de trastornos según la presente invención.
Los productos génicos like-1 de
transcetolasa usados en el contexto de la presente invención pueden
comprender polipéptidos y ácidos nucleicos codificados por gen
like-1 de transcetolasa.
Los polipéptidos y polinucleótidos usados para
realizar el procedimiento según la presente invención son aislados.
Esto significa que las moléculas son separadas de su entorno
original. Las proteínas que se producen de forma natural son
aisladas si se separan de parte o de la totalidad de los materiales,
que coexisten en el entorno natural. Los polinucleótidos son
aislados, por ejemplo, si son clonados en vectores.
Las moléculas de ácidos nucleicos
like-1 de transcetolasa usadas para realizar un
procedimiento según la presente invención pueden comprender
polinucleótidos o sus fragmentos. Los polinucleótidos preferidos
pueden comprender al menos 20 nucleótidos consecutivos,
preferentemente al menos 30 nucleótidos consecutivos y más
preferentemente al menos 45 nucleótidos consecutivos, que son
iguales, comparte homología de secuencias o codifican polipéptidos
iguales u homólogos en comparación con los polipéptidos
like-1 de transcetolasa de tipo salvaje, pero no
codifican otros polipéptidos de tipo transcetolasa o
transcetolasas. Los ácidos nucleicos según la presente invención
proporcionan procedimientos para la detección y el tratamiento de
trastornos caracterizados por una proliferación celular anormal
como, por ejemplo, cánceres.
Es un primer aspecto de la presente invención
proporcionar un procedimiento in vitro para la detección de
trastornos caracterizados por una proliferación celular anormal
como, por ejemplo, cánceres basados en la determinación de la
presencia o ausencia y/o el nivel de expresión de gen
like-1 de transcetolasa humana como se proporciona
en la SEQ. ID. 1 (TKT-L1, TKR: NM_012253; Número de
acceso X91817) en muestras biológicas. El procedimiento in
vitro propuesto comprende las etapas:
(a) detectar el nivel de expresión de gen
like-1 de tanscetolasa humana en una muestra
biológica obtenida de dicho individuo y en una muestra de ensayo
testigo, y
(b) valorar el diagnóstico de la comparación de
dicho nivel de expresión en la muestra obtenida a partir de dicho
individuo con dicho nivel de expresión en la muestra de ensayo
testigo, de forma una expresión significativamente elevada en la
muestra obtenida de dicho individuo es una sobreexpresión y es
indicativa de trastornos caracterizados por una proliferación
celular anormal.
Otro aspecto de la presente invención es un
estuche de ensayo de investigación o diagnóstico que realiza las
reacciones involucradas en ese procedimiento in vitro, es
decir, para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de
sobreexpresión de gen tipo 1 de transcetolasa humana.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al uso de un inhibidor de la actividad
like-1 de transcetolasa para elaborar composiciones
farmacéuticas aplicables en el tratamiento de trastornos
caracterizados por una proliferación celular anormal asociada con
la sobreexpresión de productos génicos like-1 de
transcetolasa.
Los productos génicos like-1 de
transcetolasa como se usan en el contexto de la presente invención
pueden comprender polipéptidos y ácidos nucleicos codificados por el
gen like-1 de transcetolasa.
Los polipéptidos y polinucleótidos usados para
realizar el procedimiento in vitro según la presente
invención son aislados. Esto significa que las moléculas son
separadas de su entorno original. Las proteínas que se producen de
forma natural son aisladas si son separadas de alguna parte o la
totalidad de los materiales, que coexisten en el entorno natural.
Los polinucleótidos son aislados, por ejemplo, si son clonados en
vectores.
Las moléculas de ácidos nucleicos
like-1 de transcetolasa usadas para realizar un
procedimiento según la presente invención pueden comprender
polinucleótidos o sus fragmentos. Los polinucleótidos preferidos
pueden comprender al menos 20 nucleótidos, preferentemente al menos
30 nucleótidos consecutivos y más preferentemente al menos 45
nucleótidos consecutivos que sean iguales, compartan homología de
secuencias o codifiquen polipéptidos iguales u homólogos, en
comparación con el tipo salvaje aplicado como se describe por
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
Edition, 1989.
La presente invención comprende también
polinucleótidos que, debido a la degeneración del código genético,
codifican los polipéptidos nativamente codificados por ácidos
nucleicos like-1 de transcetolasa humana, aunque no
muestran el porcentaje de homología de secuencias anteriormente
descrito en la secuencia de ácidos nucleicos. Estos ácidos
nucleicos pueden surgir, por ejemplo, cambiando los codones
presentes en las secuencias descritas por codones degenerados y
preparando así un ácido nucleico sintético. La preparación de estas
secuencias de ácidos nucleicos artificiales puede ser conseguida
mediante los procedimientos conocidos por los expertos en la
técnica.
Las secuencias de nucleótidos
like-1 de transcetolasa humanas usadas según la
presente invención pueden estar unidas a una diversidad de otras
secuencias de ácidos nucleicos que usan las técnicas conocidas de
DNA recombinante. Las secuencias pueden ser clonadas, por ejemplo,
en cualquiera de una diversidad de vectores de clonación, como
plásmido, fagémidos, derivados de fagos lambda y cósmidos. Además de
ello los vectores como los vectores de expresión, vectores de
replicación, vectores de generación de sondas y vectores de
secuenciado pueden estar unidos a las secuencias descritas en la
presente memoria descriptiva.
Las secuencias que pueden ser clonadas a los
ácidos nucleicos según la presente invención comprenden también
tanto secuencias codificadoras como secuencias no codificadoras y
secuencias reguladoras que incluyen promotores, mejoradores y
terminadores. Las secuencias de ácidos nucleicos
like-1 de transcetolasa humanas descritas en la
presente memoria descriptiva pueden estar presentes, por ejemplo, en
combinación con otras secuencias codificadoras. Estas secuencias
pueden codificar una diversidad de proteínas como enzimas,
receptores, antígenos, fragmentos inmunógenos de epitopos, proteínas
de unión, etc. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden estar
unidas directamente o pueden estar separadas por una extensión de
ácidos nucleicos que codifiquen un separador o zona conectora. Las
secuencias de ácidos nucleicos pueden estar separadas también por
una extensión de ácidos nucleicos que puede ser separada después de
la transcripción de la secuencia. Las secuencias no codificadoras,
que pueden estar unidas a las secuencias descritas en la presente
memoria descriptiva pueden ser, por ejemplo, regiones promotoras,
mejoradoras, elementos reguladores en cis, regiones sin traducir en
5', terminadores, etc.
En una realización preferida, los
polinucleótidos like-1 de transcetolasa humana
pueden ser formulados de forma que sean capaces de acceder a las
células procarióticoas o eucarióticas como las células de mamíferos
y ser expresados en dichas células. Estas formulaciones pueden ser
útiles, por ejemplo, para fines terapéuticos. La expresión de
secuencias de ácidos nucleicos en células dianas puede ser
conseguida mediante cualquier procedimiento conocido por los
expertos en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden estar unidos,
por ejemplo, a elementos que sean adecuados para hacer posible su
expresión en una célula hospedante. Estos elementos pueden
comprender promotores y mejoradores, como los promotores CMV, SV40,
RSV, metalotioneina I o polihedrina respectivamente o mejoradores
CMV o SV40. Los posibles procedimientos para la expresión son, por
ejemplo, la incorporación del polinucleótido en un vector viral que
incluya adenovirus, virus adeno-asociados,
retrovirus, virus vacunales o virus pox. Los vectores virales para
los fines de la expresión de ácidos nucleicos en células hospedantes
de mamíferos pueden comprender pcDNA3, pMSX, pKCR, pEFBOS, cDM8,
pCEV4, etc. Estas técnicas son conocidas por los expertos en la
técnica.
Los fragmentos de la secuencia
like-1 de transcetolasa humana usados en la presente
invención pueden comprender oligonucleótidos como sondas de ácidos
nucleicos para fines de hibridación, cebadores para reacciones de
amplificación o constructos antisentido para ser usados en técnicas
antisentido. Las sondas de ácidos nucleicos según la presente
invención pueden ser cualquier sonda de ácidos nucleicos que tenga
una secuencia al menos 80% idéntica a una parte de al menos 15
nucleótidos consecutivos de la secuencia de ácidos nucleicos de gen
like-1 de transcetolasa humana o su complementario
o complementario inverso a esa secuencia, pero que no se hibrida a
otra transcetolasa o secuencia de tipo transcetolasa. Los cebadores
de ácidos nucleicos según la presente invención se caracterizan
además porque se hibridan bajo condiciones restrictivas a ácidos
nucleicos de la secuencia descrita en la presente memoria
descriptiva. Las sondas pueden ser cualesquiera nucleótidos que sean
adecuados para llevar a cabo una reacción de amplificación
específica. Por tanto, los cebadores usados según la presente
invención pueden ser oligómeros de ácidos nucleicos de al menos 15
nucleótidos consecutivos con una identidad de secuencias de la
menos 80% en comparación con la secuencia de gen
like-1 de transcetolasa humana o pueden ser
complementarias o complementarias inversas a esta secuencia. Los
cebadores según la presente invención se hibridan específicamente a
la secuencia descrita en la presente memoria descriptiva o una parte
de los mismos bajo condiciones adecuadamente aplicas en el
transcurso de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos,
pero no se hibridan a otra atranscetolasa o secuencia de tipo
transcetolasa. Los oligonucleótidos antisentido usados en la
presente invención pueden ser moléculas de ácidos nucleicos
complementarias inversas respecto a los transcriptos de la secuencia
codificadora descrita, que son capaces de unirse a los transcriptos
mediante emparejamiento de bases y de forma que inhiben o reducen
la expresión de dicha secuencia codificadora.
Los ácidos nucleicos usados según la presente
invención pueden ser también ácidos nucleicos previamente tratados
por vía química. Estos ácidos nucleicos previamente tratados por vía
química pueden comprender cualquier ácido nucleico descrito en la
presente memoria descriptiva, que haya sido tratado con un agente
químico adecuado para dar lugar a modificaciones en las moléculas
del ácido nucleico. Dichas modificaciones pueden comprender, por
ejemplo modificaciones específicas de bases particulares en el ácido
nucleico. Estos tratamientos químicos pueden comprender un
tratamiento, por ejemplo, con bisulfito de sodio, hidrazina o
permanganato de potasio. Las secuencias de interés especial en
experimentos que usan tratamiento químico previo de ácidos nucleicos
pueden comprender, por ejemplo, regiones codificadoras o no
codificadoras de las secuencias. Ejemplos de regiones no
codificadoras que pueden ser tratadas mediante productos químicos
son regiones promotoras o islas CpG en UTRs en 5'.
Los polipéptidos like-1 de
transcetolasa humanos usados según la presente invención pueden
comprender cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, que
incluyen proteínas de longitud completa, en las que los residuos de
aminoácidos están unidos mediante enlaces de péptidos covalentes.
Por tanto, un polipéptido que comprende una parte de una de las
anteriores proteínas like-1 de transcetolasa
humanas, por ejemplo, una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos de proteína like-1 de transcetolasa
humana, pueden consistir completamente en la parte, o la parte puede
estar presente en un polipéptido mayor que contenga secuencias
adicionales. Las secuencias adicionales pueden ser derivadas de la
proteína nativa o pueden ser heterólogas, y estas secuencias pueden
ser (aunque no es necesario) inmunorreactivas y/o antigénicas. Como
se detalla con posterioridad, estos polipéptidos pueden ser
aislados de tejido tumoral o preparados por medios sintéticos o
recombinantes.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
un polipéptido que exhibe propiedades biológicas del polipéptido
like-1 de transcetolasa humana se entiende que es un
polipéptido que tiene al menos una de las actividades, como
actividades enzimáticas (actividad de transcetolasa), entre
actividades de interacción de proteínas, responsables de la
actividad enzimática a la presencia de tiaminas, o propiedades
antígenas o inmunógenas, por ejemplo, capacidad de unión a un
anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido (es decir, que
comprende una parte inmunógena) de dicho polipéptido
like-1 de transcetolasa humana.
La parte inmunógena, como se usa en la presente
memoria descriptiva, es una parte de una proteína que es reconocida
por un receptor de antígenos de superficie de células B y/o células
T. Las partes inmunógenas comprenden al menos 5 residuos de
aminoácidos, más preferentemente al menos 10 residuos de aminoácidos
y lo más preferentemente al menos 15 residuos de aminoácidos de la
proteína descrita en la presente memoria descriptiva. En una
realización preferida de la presente invención, los dominios
particulares de la proteína como, por ejemplo, los dominios de
transmembranas o secuencias líderes N-terminales han
sido borradas.
Las partes inmunógenas según la presente
invención reaccionan con antisueros o anticuerpos específicos con la
misma o casi la misma intensidad que las proteínas nativas de
longitud completa. Las partes inmunógenas son generalmente
identificadas usando técnicas bien conocidas en el estado de la
técnica. Las técnicas posibles son, por ejemplo, la selección de los
polipéptidos en cuando a la capacidad de reaccionar con anticuerpos
específicos para antígenos, antisueros y/o líneas o clones de
células T.
Los polipéptidos like-1 de
transcetolasa humanos usados según la presente invención comprenden
también variantes de las proteínas nativas. Estas variantes pueden
diferir de la proteína nativa en una o más alteraciones como
sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. La
inmunorreactividad y/o la actividad biológica de las variantes según
la presente invención no están sustancialmente disminuidas en
comparación con las proteínas nativas. En una realización preferida
de la invención, la inmunorreactividad y/o la actividad están
disminuidas en menos de 50%, en una realización más preferida, la
inmunorreactividad y/o la actividad están disminuidas en menos de
20% en comparación con los polipéptidos nativos. En otra realización
preferida de la presente invención, las variantes de los
polipéptidos se pueden hacer variar, de forma que se aumente, se
disminuya o se pierda la actividad de la proteína nativa. Estas
variantes pueden ser empleadas, por ejemplo, en la terapia de
trastornos asociados con la sobreexpresión de gen
like-1 de transcetolasa humano. En una realización
preferida, las variantes pueden ser deficientes en una o más partes
como, por ejemplo, las secuencias líderes
N-terminales, dominios de transmembranas o
secuencias pequeñas N- y/o C-terminales. Las
variantes exhiben preferentemente 70%, más preferentemente al menos
90% y lo más preferentemente al menos 95% de identidad respecto a
los polipéptidos descritos según la presente invención.
Las variantes usadas según la presente invención
comprenden preferentemente sustituciones conservadoras, de forma que
los aminoácidos son sustituidos con aminoácidos cambiados con
propiedades similares. Las propiedades afectadas pueden incluir la
polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o
naturaleza anfifática de los residuos de aminoácidos.
Las variantes usadas según la invención pueden
comprender también secuencias líderes terminales adicionales,
conectores o secuencias que hagan posible la síntesis, purificación
o estabilidad de los polipéptidos de una forma más fácil o más
cómoda.
Las variantes de los polipéptidos usados en los
procedimientos según la presente invención pueden ser producidos por
medio de procedimientos convencionales de biología molecular (véase,
por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Clining, A
Laboratory Manual, 2nd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY). Por ejemplo, es posible introducir
mutaciones diferentes en las moléculas de ácidos nucleicos de la
invención. Como consecuencia, puede ser sintetizado un polipéptido
like-1 de transcetolasa humano con propiedades
biológicas posiblemente modificadas. Una posibilidad es la
producción de mutantes de deleción en los que las moléculas de
ácidos nucleicos son producidas mediante deleciones continuas a
partir de extremo terminal en 5' o 3' de la secuencia de DNA
codificadora y que conduce a la síntesis de polipéptidos que están
acortados en consecuencia. Otra posibilidad es la introducción de
mutaciones de puntos únicos en posiciones en las que una
modificación de la secuencia de aminoácidos ejerce influencia, por
ejemplo, la actividad enzimática de la regulación de la enzima.
Mediante este procedimiento pueden ser producidas muteinas, por
ejemplo, que poseen un valor de Km modificado o que ya no se
someten a los mecanismos de regulación que existen normalmente en la
célula, por ejemplo, co respecto a una regulación alostérica o
modificación covalente. Estas muteinas pueden ser ventajosas, por
ejemplo, como compuestos terapéuticamente útiles, por ejemplo,
antagonistas.
Para la manipulación en células procarióticas
por medio de ingeniería genética, las moléculas de ácidos nucleicos
usadas para los procedimientos de la invención o partes de estas
moléculas pueden ser introducidas en plásmidos que permitan una
mutagénesis o una modificación de una secuencia mediante
recombinación de secuencias de DNA. A través de procedimientos
convencionales (Sambrook et al, supra), pueden ser
intercambiadas bases y ser añadidas secuencias sintéticas. Con el
fin de conectar los fragmentos de DNA unos con otros, pueden ser
añadidos adaptadores o conectores a los fragmentos. Además de ello,
pueden ser realizadas manipulaciones que proporciones sitios de
escisión adecuados o que separen DNA superfluo o sitios de escisión.
Si son posibles inserciones, pueden ser realizadas deleciones o
sustituciones, en mutagénesis in vitro, reparación de
cebadores, restricción o ligadura. Como procedimiento de análisis
puede ser usado habitualmente un análisis de secuencias, análisis de
restricción u otros procedimientos bioquímicos o de biología
molecular.
Los polipéptidos pueden comprender polipéptidos
de fusión o quiméricos que contengan las secuencias descritas en la
presente memoria descriptiva. Las proteínas de fusión comprenden el
polipéptido de la invención, una parte del mismo o variantes del
polipéptido de la invención o partes del mismo junto con cualquier
segundo y otros polipéptidos, tal como una vez más el polipéptido de
la invención, una parte del mismo o variantes del polipéptido de la
invención o partes del mismo y/o cualesquiera polipéptidos
heterólogos. Los polipéptidos heterólogos pueden comprender enzimas,
moléculas receptoras, antígenos, epitopos antígenos o inmunógenos o
sus fragmentos, anticuerpos o sus fragmentos, polipéptidos
señalizadores o polipéptidos transductores de señales, etc. La
proteína inmunógena puede ser capaz, por ejemplo, de provocar una
respuesta de recuerdo. Ejemplos de estas proteínas incluyen las
proteínas del tétanos, tuberculosis y hepatitis (véase, por ejemplo,
Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91
(1997)). En una realización de la invención, los péptidos de fusión
pueden ser construidos para una detección o purificación aumentada
de los polipéptidos. Para los fines de pueden ser añadidas a los
polipéptidos etiquetas de purificación, como por ejemplo etiquetas
de his, etiquetas de myc etc. Para los fines de detección pueden
ser fusionadas a los polipéptidos partes antígenas de detección,
enzimas, secuencias cromogénicas, etc. Las proteínas de fusión de la
presente invención pueden incluir (pero no es necesario) un péptido
conector entre el primero y segundo polipéptidos.
Una secuencia de ácidos nucleicos que codifique
una proteína de fusión usada en la presente invención es construida
usando técnicas de DNA recombinante conocidas para ensamblar
secuencias de ácidos nucleicos separadas que codifiquen el primero
y segundo polipéptidos en un vector de expresión apropiado. El
extremo en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifique el
primer polipéptido es ligado, con o sin un conector péptido, al
extremo en 5' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifique el
segundo polipéptido que asegure los marcos de lectura apropiados de
las secuencias para permitir la traducción de mRNA de las dos
secuencias de ácidos nucleicos en una única proteína de fusión que
retenga la actividad biológica del primero y segundo
polipéptidos.
Puede ser empleada una secuencia conectora de
péptidos para separar el primero y el segundo polipéptidos en una
distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en
sus estructuras secundaria y terciara. Esta secuencia conectora de
péptidos es incorporada en la proteína de fusión usando técnicas
estándar bien conocidas en el estado de la técnica. Las secuencias
conectoras de péptidos adecuadas pueden ser escogidas basadas en los
siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación
extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura
secundaria que pueda interaccionar con epitopos funcionales en el
primero y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos
hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epitopos
funcionales de polipéptidos. Las secuencias conectoras de péptidos
preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. Pueden ser usados
también otros aminoácidos casi neutros como Thr y Ala en la
secuencia conectora. Las secuencias de aminoácidos que pueden ser
útilmente empleadas como conectores incluyen las descritas epor
Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:8258-8262, 1986; patente de EE.UU. nº 4.935.233
y patente de EE.UU. nº 4.751.180. La secuencia conectora puede tener
de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Las secuencias de
péptidos no son necesarias cuando el primero y segundo polipéptidos
tienen regiones de aminoácidos N-terminales no
esenciales que pueden ser usadas para separar los dominios
funcionales y evitar una interferencia estérica.
Los polipéptidos like-1 de
transcetolasa humanos para ser usados en el procedimiento según la
presente invención y los ácidos nucleicos que codifican estos
polipéptidos pueden ser aislados a partir de tejido tumoral usando
cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos en el
estado de la técnica. Las secuencias de ácidos nucleicos
correspondientes a un gen (o parte del mismo) que codifican uno de
los polipéptidos tumorales de la invención pueden ser aisladas a
partir de una biblioteca de cDNA tumoral usando una técnica de
sustracción. Pueden ser obtenidas así secuencias parciales de
ácidos nucleicos para diseñar para diseñar cebadores de
oligonucleóticos para la amplificación de secuencias de ácidos
nucleicos de longitud completa a partir de una biblioteca de ácidos
nucleicos genómicos humana o a partir de una biblioteca de cDNA
tumoral es una reacción de cadenas de polimerasa (PCR), usando
técnicas bien conocidas en el estado de la técnica (véase, por
ejemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Pres, NY, 1989).
Para esta aproximación, pueden ser diseñados cebadores específicos
para secuencias basados en las secuencias de nucleótidos
proporcionadas en la presente invención y pueden ser adquiridos o
sintetizados.
Los polipéptidos like-1 de
transcetolasa humanos usados para el procedimiento descrito en la
presente invención pueden ser generados también por medios
sintéticos. En particular, pueden ser generados polipéptidos
sintéticos que tengan menos de aproximadamente 100 aminoácidos y,
generalmente, menos de aproximadamente 50 aminoácidos usando
técnicas bien conocidas por los expertos ordinarios en la técnica.
Por ejemplo, estos polipéptidos pueden ser sintetizados usando
cualesquiera técnicas en fase sólida disponibles en el comercio,
como el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en
el que los aminoácidos son secuencialmente añadidos a una cadena de
aminoácidos en crecimiento (véase, por ejemplo, Merrifield J. Am.
Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963). La instalación para
una síntesis automatizada de polipéptidos está disponible en el
comercio en proveedores como Perkin Elmer/Applied BioSystems
Division (Foster City, Calif.) y se puede hacer funcionar según las
instrucciones del fabricante.
Las secuencias de ácidos nucleicos ligadas que
codifican los polipéptidos usados para los procedimientos descritos
en la presente memoria descriptiva están funcionalmente unidos a
elementos reguladores transcripcionales o translacionales adecuados
conocidos por el experto en la técnica. Los elementos reguladores
responsables de la expresión de ácidos nucleicos pueden estar
colocados, por ejemplo, en 5' respecto a la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica los primeros polipéptidos, en las secuencias
codificadoras en 3' respecto a las secuencias de ácidos nucleicos
que codifican el primero y otros polipéptidos. Los codones de
detención necesarios para terminar las señales de terminación de
traducción y transcripción están presentes en 3' respecto a la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica el segundo
polipéptido.
Los polipéptidos usados para los procedimientos
según la presente invención pueden ser aislados. Esto significa que
las moléculas pueden ser separadas de su entorno original. Las
proteínas que se producen de forma natural son aisladas si son
separadas de alguna parte o la totalidad de los materiales que
coexisten en el entorno natural. Los polinucleótidos son aislados,
por ejemplo, si son clonados en forma de vectores.
En ciertas realizaciones preferidas, descritas
más en detalle con posterioridad, los polipéptidos usados en un
procedimiento como el descrito en la presente memoria descriptiva
pueden ser preparados en una forma aislada sustancialmente pura (es
decir, los polipéptidos son homogéneos según se determina mediante
la composición de aminoácidos y análisis de secuencias primarias).
Preferentemente, los polipéptidos son al menos un 90% puros, más
preferentemente al menos aproximadamente 95% puros y lo más
preferentemente al menos aproximadamente 99% puros. Los polipéptidos
sustancialmente puros pueden ser empleados, por ejemplo, en
composiciones farmacéuticas.
Además de ello, la presente invención usa
agentes de unión que se unen específicamente a proteína
like-1 de transcetolasa humana. Estos agentes de
unión pueden comprender, por ejemplo, anticuerpos y
antígeno-fragmentos de unión, anticuerpos híbridos
bifuncionales, peptidomiméticos que contienen epitopos de unión a
antígenos mínimos, etc.
Un anticuerpo o agente de unión a antígenos se
dice que reacciona específicamente si reacciona a un nivel
detectable con una proteína usada en la presente memoria descriptiva
y no reacciona significativamente con otras proteínas. Los
anticuerpos según la presente invención pueden ser anticuerpos
monoclonales o policlonales. Como se usa en la presente memoria
descriptiva, el término anticuerpo o anticuerpo monoclonal está
previsto que incluya moléculas intactas así como fragmentos de
anticuerpos (como, por ejemplo, fragmentos de Fab y F(ab')2),
que son capaces de unirse específicamente a la proteína. Los
fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc de
anticuerpo intacto, desparecen más rápidamente de la circulación y
pueden tener menos un ión de tejido no específico que un anticuerpo
intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med.
24:316-325 (1983)). Por tanto, estos fragmentos son
preferidos, así como los productos de un Fab u otra biblioteca de
expresión de inmunoglobulinas. Además, los anticuerpos usados en la
presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena única
y humanizados.
Según la presente invención, pueden ser usados
agentes de unión aislados o en combinación, Por medio de una
combinación es posible conseguir un mayor grado de sensibilidad. El
término anticuerpo, preferentemente, se refiere a anticuerpos que
consisten esencialmente en anticuerpos monoclonales reunidos con
diferentes especificades epitópicas, así como distintas
preparaciones de anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales están hechos de un
antígeno que contiene fragmentos del polipéptido usado en la
invención, usando cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas
por los expertos ordinarios en la técnica; véase, por ejemplo,
Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988. En una de estas técnicas, un inmunógeno que
comprende el polipéptido antígeno o una parte sintética del mismo
es inicialmente inyectado en cualquiera de una amplia diversidad de
mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas y cabras).
En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir como
el inmunógeno sin modificación, De forma alternativa,
particularmente para polipéptidos de cadena relativamente corta,
puede ser provocada una respuesta inmune superior si el polipéptido
es unido a una proteína portadora, como albúmina de suero bovino o
hemocianina de lapa en ojo de cerradura. El inmunógeno es inyectado
en el hospedante animal, preferentemente según un esquema
predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones impulsoras y
los animales son sangrados periódicamente. Seguidamente pueden ser
purificados anticuerpos policlonales específicos para el
polipéptido a partir de antisueros, por ejemplo, mediante
cromatografía de afinidad, usando el polipéptido acoplado a un
soporte sólido adecuado.
Los anticuerpos monoclonales específicos para el
polipéptido antigénico de interés pueden ser preparados, or ejemplo,
usando la técnica de Köhler y Milstein, Eur. J. Immunol.
6:511-519, 1976, y mejoras par la misma.
Brevemente, estos procedimientos incluyen la preparación de líneas
celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la
especifidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de
interés). Estas líneas celulares pueden ser producidas, por
ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal
inmunizado como se describió anteriormente. Las células de bazo son
seguidamente inmortalizadas, por ejemplo, mediante fusión con un
asociado de fusión de células de mieloma, preferentemente uno que
sea sinérgico con el animal inmunizado. Puede ser empleada una
diversidad de técnicas de fusión. Popr ejemplo, las células de bazo
y las células de mieloma pueden ser combinadas con un detergente no
iónico durante unos pocos minutos y seguidamente dispuestas en
placas a baja densidad en un medio selectivo que soporte el
crecimiento de células híbridas, pero no células de mieloma. Una
técnica de selección preferida usa una selección de HAT
(hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo
suficiente, habitualmente de forma aproximada 1 a 2 semanas, son
observadas colonias de híbridos. Las colonias únicas son
seleccionadas y ensayadas en cuanto a la actividad de unión frente
al polipéptido. Son preferidos hibridomas que tienen una reactividad
y especifidad elevadas.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados
de las materias sobrenadantes de colonias de hibridomas en
crecimiento. Además, pueden ser empleadas diversas técnicas para
mejorar el rendimiento, como inyección de la línea celular de
hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedante vertebrado
adecuado, como un ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden ser
seguidamente recogidos del fluido de ascitos o de la sangre. Los
contaminantes pueden ser separados de los anticuerpos mediante
técnicas convencionales, como cromatografía, filtración sobre gel,
precipitación y extracción. Los polipéptidos like-1
de transcetolasa humanos pueden ser usados en el procedimiento de
purificación, por ejemplo, en una etapa de cromatografía de
afinidad.
Los anticuerpos específicos
like-1 de transcetolasa humanos usados según la
presente invención pueden comprender sitios de unión adicionales
para gentes terapéuticos u otros polipéptidos o pueden ser acoplados
a dichos agentes terapéuticos o polipéptidos.
Los agentes terapéuticos pueden comprender
fármacos, toxinas, radio-núclidos y sus derivados.
Los agentes pueden ser acoplados a los agentes de unión directa o
indirectamente, por ejemplo, mediante un conector o grupo portador.
El grupo conector puede funcionar, por ejemplo, con el fin de hacer
posible la reacción de acoplamiento entre el agente de unión y el
terapéutico u otro agente o el conector pueden actuar como en
separador entre las distintas partes de la molécula de fusión. El
conector puede ser también escindible bajo ciertas circunstancias,
con el fin de liberar el agente unido bajo ciertas condiciones. Los
agentes terapéuticos pueden estar covalentemente acoplados a grupos
portadores directamente o a través de u n grupo conector. El agente
puede estar también acoplado de forma no covalente al portador. Los
portadores que pueden ser usados según la presente invención son,
por ejemplo, albúminas, polipéptidos, polisacáridos o liposomas.
Los anticuerpos específicos
like-1 de transcetolasa humanos usados según la
presente invención pueden estar acoplados a uno o más agentes. Los
múltiples agentes acoplados a un anticuerpo pueden ser todos de la
misma especie o pueden ser diversos agentes diferentes unidos a un
anticuerpo.
Los procedimientos descritos en la presente
memoria descriptiva son aplicables a todos los organismos
eucarióticos propensos a verse afectados por trastornos asociados
con la sobreexpresión de gen like-1 de
transcetolasa. Los individuos usados en el contexto de la presente
invención pueden comprender, por ejemplo, mamíferos, como animales
de interés agrícola (vacas, ovejas, caballos, cerdos, etc.),
animales de compañía (gatos, perros, etc.), animales comúnmente
empleados para un uso en investigación (ratas, ratones, hamsters,
etc.) o seres humanos.
El diagnóstico usado en el contexto de la
presente invención puede comprender la determinación del nivel de
productos de gen like-1 de transcetolasa humano en
una muestra. Basándose en el nivel determinado de productos de gen
like-1 de transcetolasa humano en las muestras, los
individuos pueden ser subdivididos en grupos. Los subgrupos pueden
ser creados según datos clínicos como, por ejemplo, supervivencia,
recurrencia de la enfermedad, frecuencia de metástatis, etc.,
relacionados con el nivel particular de productos de gen
like-1 de transcetolasa determinados en las
muestras.
Basándose en estos subgrupos, se puede hacer una
valoración del pronóstico. Según los subgrupos, puede ser adaptada
la terapia de los individuos afectados por los tumores.
Por ejemplo, la sobreexpresión de gen
like-1 de transcetolasa y la actividad aumentada del
ciclo de pentosa-fosfato en un subconjunto de
tumores de colon, estómago, páncreas y pulmón sugiere un mecanismo
mediante el cual la tiamina (vitamina Ba) favorece la síntesis de
ribosa de ácidos nucleicos y la proliferación de células tumorales a
través de la trayectoria de transcetolasa no oxidativa. Por lo
tanto, la absorción de tiamina de pacientes de cáncer tiene
consecuencias directas en cuanto a la velocidad de crecimiento de
tumores con una sobreexpresión de gen like-1 de
transcetolasa. Esto proporciona también una información de base y
ayuda a desarrollar normas generales para tratamientos alternativos
con inhibidores de transcetolasa anti-tiamina en el
ajuste clínico. Los datos clínicos y experimentales demuestran la
utilización aumentada de tiamina de tumores humanos y su
interferencia con la quimioterapia experimental. Un análisis de
RNA-ribosa indica que los átomos de carbono de
glucosa contribuyen por encima de un 90% de la síntesis de ribosa en
células cultivadas de carcinoma de cuello uterino y pancreático y
que la ribosa es sintetizada principalmente a través de la
trayectoria de transcetolasa dependiente de tiamina (>70%). Los
compuesto anti-tiamina inhiben significativamente la
síntesis de ácidos nucleicos y la proliferación de células tumorales
in vitro e in vivo en diversos modelos de tumores. La
bibliografía médica revela poca información relativa a la función
de la reacción de transcetolasa dependiente de tiamina en la
producción de ribosa de células tumorales, que es un procedimiento
central en la síntesis nueva de ácidos nucleicos y las
trayectorias de rescate para purinas.
Como la trayectoria de transcetolasa dependiente
de tiamina es la vía central que suministra fosfato de ribosa para
ácidos nucleicos en tumores, un complemento excesivo de tiamina
puede ser responsable de intentos terapéuticos fallidos para
terminar con la proliferación de células cancerígenas. La detección
de un subconjunto de tumores de colon y pulmón con una
sobreexpresión del gen like-1 de transcetolasa
proporciona una etapa importante para una terapia individualizada
del cáncer y la administración limitada de tiamina y un tratamiento
concomitante con inhibidores de transcetolasa son una aproximación
más racional para tratar el cáncer.
Por tanto, basándose en la detección de la
sobreexpresión de TKT-L2, pueden ser adaptadas
nuevas estrategias de tratamiento dirigiendo a diana reacciones
bioquímicas específicas del ciclo de pentosa-fosfato
mediante hormonas relacionadas con el metabolismo de la glucosa,
controlando la absorción de tiamina, el cofactor de la reacción del
ciclo de pentosa-fosfato de transcetolasa no
oxidativa, o tratando pacientes de cáncer con análogos de
anti-tiamina.
Por tanto, en una realización de la invención,
los trastornos caracterizados por la sobreexpresión de gen
like-1 de tasncetolasa humano pueden ser tratados de
acuerdo con el nivel de sobreexpresión de gen like-1
de transcetolasa. Usando el ciclo de
pentosa-fosfato no oxidativo, las reacciones para
inhibir la glucosa utilizado trayectorias selectivamente para la
producción de ácidos nucleicos ofrecen un nuevo sitio diana para el
tratamiento de cáncer con un fuerte efecto regulador sobre el ciclo
celular.
En una realización, el tratamiento de trastornos
asociados con la sobreexpresión de gen like-1 de
transcetolasa puede comprender la administración restringida de
tiamina a los individuos afectados. En otra realización, el
tratamiento puede comprender la administración de inhibidores de
transcetolasa, como por ejemplo compuestos
anti-tiaminas.
La verificación puede comprender detectar el
nivel de productos de gen like-1 de transcetolasa
humano en muestras tomadas para diferentes valores del tiempo y
determinar los cambios de dicho nivel. Según dichos cambios, puede
ser seguido el transcurso de la enfermedad. El transcurso de la
enfermedad puede ser usado para seleccionar estrategias de terapia
para el individuo particular.
Otro aspecto del diagnóstico y verificación del
transcurso de la enfermedad según la presente invención puede
comprender la detección de una enfermedad residual mínima. Esto
puede comprender, por ejemplo, la detección de productos de gen
like-1 de transcetolasa humano en una o más muestras
corporales a continuación de la terapia inicial de un individuo una
vez o para varios valores del tiempo. según el nivel de productos de
gen like-1 de transcetolasa humano detectados en la
muestra, se puede seleccionar una terapia adecuada para el individuo
particular.
En otra realización preferida, el procedimiento
de diagnóstico es llevado a cabo para detectar células tumorales
diseminadas en muestras biológicas como un diagnóstico de la
enfermedad residual mínima (MRD).
Los trastornos caracterizados por una
proliferación celular anormal, como se usa en el contexto de la
presente invención, pueden comprender, por ejemplo, neoplasmas como
tumores benignos y malignos, carcinomas, sarcomas, leucemias,
linfomas o displasias. Los tumores pueden comprender tumores de
cabeza y cuello, tumores del tracto respiratorio, tumores del tracto
gastrointestinal, tumores del sistema urinario, tumores del sistema
reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema
nervioso central y periférico, tumores de la piel y sus anejos,
tumores de tejidos blandos y huesos, tumores del sistema
linfopoyético y hematopoyético, etc.
En una realización preferida el tumor es, por
ejemplo, cáncer de cabeza y cuello, cáncer del tracto respiratorio,
cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer de piel y sus anejos,
cáncer del sistema nervioso central y periférico, cáncer del
sistema urinario, cáncer del sistema reproductor, cáncer del sistema
endocrino, cáncer de tejidos blandos y huesos, cáncer del sistema
hematopoyético y linfopoyético. En la realización más preferida de
la invención, el carcinoma es cáncer cervical, cáncer de colon,
cáncer gástrico, cáncer de mamas, cáncer de vejiga, etc.
Los tumores según la presente invención pueden
comprender tumores que muestran la intervención de nódulos de
nódulos linfáticos (tumores de nódulos positivos) así como tumores
sin extensión detectable de nódulos linfáticos (tumores de nódulos
negativos). En una realización de la invención, los tumores
gastrointestinales son tumores sin extensión detectable de nódulos
linfáticos.
Una muestra según el procedimiento de la
presente invención puede comprender cualquier muestra que comprenda
células o debris celular. Las muestras pueden comprender muestras de
relevancia clínica, como por ejemplo secreciones, como jugo
gástrico, bilis o jugo pancreático, frotis vaginal, fluidos
corporales como suero, sangre, plasma, orina, semen, heces, biopsias
y muestras de células y tejidos. Las biopsias usadas en el contexto
de la presente invención pueden comprender, por ejemplo, muestras de
resección de tumores, muestras de tejidos preparadas por medios
endoscópicos o biopsias con agujas de órganos. Además de ello,
cualquier muestra que contenga potencialmente las moléculas
marcadoras que van a ser detectadas puede ser una muestra según la
presente invención.
Estas muestras pueden comprender, por ejemplo,
células intactas, células lisadas o cualesquiera líquidos que
contengan proteínas, péptidos o ácidos nucleicos. Incluso los
sólidos, a los que las células, fragmentos de células o moléculas
marcadoras, como ácidos nucleicos like-1 de
transcetolasa humanos o proteínas like-1 de
transcetolasa humanas, que se pueden adherir pueden ser muestras
según la presente invención. Estos sólidos pueden comprender, por
ejemplo, membranas, cristales inclinados, gránulos, etc.
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La preparación de una muestra puede comprender,
por ejemplo, obtener una muestra de un tejido, un fluido corporal o
células, de debris celular de un paciente. Según la presente
invención, la preparación de la muestra puede comprender también
varias etapas de preparaciones adicionales de la muestra, como
preparación de disecciones, preparación de células lisadas,
preparación de hileras de tejidos, aislamiento de polipéptidos de
ácidos nucleicos, preparación de péptidos fijados a una fase sólida
o ácidos nucleicos o preparación de gránulos, membranas o placas
inclinadas a las que las moléculas que van a ser determinadas son
acopladas de forma covalente o no covalente.
El procedimiento para la detección del nivel de
producto génico like-1 de transcetolasa humano según
la presente invención es cualquier procedimiento que sea adecuado
para detectar cantidades muy pequeñas de moléculas específicas
biológicamente activas en muestras biológicas. La reacción de
detección según la presente invención es una detección sobre el
nivel de ácidos nucleicos o sobre el nivel de polipéptidos.
La detección se puede llevar a cabo en solución
o usando reactivos fijados a una fase sólida. La detección de uno o
más marcadores moleculares, como polipéptidos o ácidos nucleicos, se
puede realizar en una única mezcla de reacción o en dos o en
mezclas de reacción separadas. Alternativamente, las reacciones de
detección para varias moléculas marcadoras pueden ser realizadas,
por ejemplo, de forma simultánea en recipientes de reacción de
pocillos múltiples. La característica de los marcadores para los
productos génicos like-1 de transcetolasa humanos
puede ser detectada usando reactivos que reconozcan específicamente
estas moléculas. La reacción de detección par las moléculas
marcadoras puede comprender una o más reacciones con agentes de
detección que reconozcan las moléculas marcadoras iniciales o que
reconozcan las moléculas previas usadas para reconocer otras
moléculas.
La reacción de detección puede comprender
adicionalmente una reacción reportera que indique la presencia o
ausencia y/o el nivel de marcadores de genes like-1
de transcetolasa humanos. La reacción reportera puede ser, por
ejemplo, una reacción que produzca un compuesto coloreado, una
reacción de bioluminiscencia, una reacción de fluorescencia,
generalmente una reacción de emisión de radiación, etc. En una
realización preferida, pueden ser reconocidas diferentes moléculas
marcadoras por agentes que producen diferentes señales reporteras,
de forma que puedan ser distinguidas las señales que se refieren a
moléculas marcadoras.
Los formatos aplicables para la reacción de
detección según la presente invención pueden ser técnicas de
transferencia, como Western-Bolt,
Southern-blot, Northern-blot. Las
técnicas de transferencia son conocidos por los expertos ordinarios
en la técnica y pueden ser realizadas, por ejemplo, en forma de
electro-transferencias, transferencias semisecas,
transferencias a vacío o transferencias de goteo. Puede ser
aplicable también una reacción de amplificación para la detección,
por ejemplo, de moléculas de ácidos nucleicos. Además de ello pueden
ser aplicados procedimientos inmunológicos para la detección de
moléculas como, por ejemplo, ensayos de inmunoprecipitación o
inmunológicos, como ELISA, RIA, ensayos de flujo lateral,
procedimientos inmuno-citoquímicos, etc.
En una realización preferida de la invención, la
detección del nivel de productos génicos like-1 de
transcetolasa humanos se lleva a cabo mediante la detección del
nivel de ácidos nucleicos que codifican los productos génicos
like-1 de transcetolasa humanos o sus fragmentos,
presentes en la muestra. Los medios para la detección de moléculas
de ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la técnica. El
procedimiento para la detección de ácidos nucleicos se puede llevar
a cabo, por ejemplo, mediante una reacción de unión de la molécula
que va a ser detectada a sondas de ácidos nucleicos complementarias,
proteínas con especifidad de unión por ácidos nucleicos o
cualesquiera otras entidades que reconozcan y se unan
específicamente a dichos ácidos nucleicos. Este procedimiento puede
ser realizado también in vitro o directamente in situ,
por ejemplo, en el transcurso de una reacción de teñido de
detección. Otra forma de detectar los productos génicos
like-1 de transcetolasa humanos en una muestra sobre
el nivel de ácidos nucleicos realizado en el procedimiento según la
presente invención es una reacción de amplificación de ácidos
nucleicos, que se puede llevar a cabo de una manera cuantitativa
como, por ejemplo, la reacción de cadena de polimerasa. En una
realización preferida de la presente invención puede ser usada RTT
PCR en tiempo real para cuantificar el nivel de RNA
like-1 de tanscetolasa en muestras de tumores.
En otra realización preferida de la invención,
la detección del nivel de productos génicos like-1
de transcetolasa humanos se lleva a cabo determinando el nivel de
expresión de una proteína. La determinación de productos génicos
like-1 de transcetolasa humanos sobre el nivel de
proteína se puede llevar a cabo, por ejemplo, en una reacción que
comprenda un anticuerpo específico para la detección de proteína
like-1 de transcetolasa humana. Los anticuerpos
pueden ser usados en muchas técnicas de detección diferentes, por
ejemplo, en transferencia Western, ELISA o inmunoprecipitación.
Generalmente, la detección basada en anticuerpos se puede llevar a
cabo también in vitro así como directamente in situ,
por ejemplo, en el trascurso de una reacción de teñido
inmuno-histoquímica. Puede ser usado cualquier otro
procedimiento para determinar la cantidad de polipéptidos
particulares en muestra biológicas según la presente invención.
En una realización preferida de la invención, el
nivel de productos génicos like-1 de transcetolasa
humanos es significativamente elevado en comparación con una muestra
de ensayo testigo. En este caso, el gen like-1 de
transcetolasa humano es sobreexpresado en la muestra.
Un ejemplo para el diagnóstico de trastornos
asociados con la expresión de gen like-1 de
transcetolasa humano puede comprender la detección de
auto-anticuerpos dirigidos contra polipéptidos
codificados pr el gen like-1 de transcetolasa
humano. Los polipéptidos usados para los procedimientos según la
presente invención pueden ser usados para detectar la presencia o
ausencia de estos anticuerpos en fluidos corporales mediante
procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la detección de
tejidos que expresan productos génicos like-1 de
transcetolasa se lleva a cabo en forma de procedimientos de
formación de imágenes moleculares. Los respectivos procedimientos
son conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Los
procedimientos de formación de imágenes para ser usados en el
contexto de la presente invención pueden comprender, por ejemplo,
MRI, SPECT, PET y otros procedimientos adecuados para la formación
de imágenes in vivo.
En una realización, el procedimiento puede estar
basado en la conversión enzimática de compuestos inertes o marcados
en moléculas detectables en el transcurso de procedimientos de
formación de imágenes moleculares por moléculas
like-1 de transcetolasa. En otra realización, el
procedimiento de formación de imágenes moleculares puede estar
basado en el uso de compuestos que porten un marcador adecuado para
la formación de imágenes moleculares in vivo, como
radioisótopos, iones metálicos, etc., que se unen específicamente a
moléculas like-1 de transcetolasa in
vivo.
En una realización preferida de la invención,
estos compuestos son compuestos no tóxicos y pueden ser eliminados
de la circulación de organismos, como de seres humanos, en un
período de tiempo, lo que permite la realización de la detección de
marcador acumulado en el gen like-1 de transcetolasa
que sobreexpresa tejido tumoral. En otra realización preferida de la
invención, son usados compuestos para la formación de imágenes
moleculares, para lo que la desaparición de la circulación no es
relevante en la realización de la reacción de formación de imágenes
moleculares. Esto puede ser debido, por ejemplo, al bajo valor de
fondo producido por las moléculas en circulación, etc. Los
compuestos para ser usados en procedimientos de formación de
imágenes moleculares son administrados en forma farmacéutica
aceptable en composiciones que pueden comprender adicionalmente
cualesquiera otras sustancias adecuadas como, por ejemplo, otras
sustancias útiles para diagnósticos, sustancias terapéuticamente
útiles, sustancias portadoras o similares.
Otro aspecto de la presente invención es un
estuche de ensayo para realizar el procedimiento según la presente
invención. El estuche de ensayo puede ser, por ejemplo, un estuche
de ensayo de diagnóstico o un estuche de ensayo de
investigación.
Un estuche de ensayo según la presente invención
comprende al menos un agente adecuado para detectar las moléculas
descritas en la presente memoria descriptiva. Además de ello, un
estuche de ensayo según la presente invención puede comprender:
a) reactivos para la detección de los productos
génicos like-1 de transcetolasa humanos;
b) reactivos y tampones comúnmente usados para
llevar a cabo la reacción de detección, como tampones, marcadores de
detección, sustancias portadoras y otros;
c) una muestra like-1 de
transcetolasa humana para llevar a cabo una reacción testigo
positiva.
El reactivo para la detección del gen
like-1 de transcetolasa humano puede incluir
cualquier agente capaz de unirse a la molécula
like-1 de transcetolasa humana. Estos reactivos
pueden incluir proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, ácidos
nucleicos péptidos, glicoproteínas, proteoglicanos, polisacáridos o
lípidos.
La muestra like-1 de
transcetolasa humana para llevar a cabo un testigo positivo puede
comprender, por ejemplo, ácidos nucleicos like-1 de
transcetolasa humanos o polipéptidos o fragmentos de los mismos en
forma aplicable, como una solución o sal, péptidos en forma
aplicable, muestras de sección de tejidos o células positivas.
En una realización preferida de la invención, la
detección de producto génico like-1 de transcetolasa
humano se lleva a cabo sobre el nivel de polipéptidos. En esta
realización, el agente de unión puede ser, por ejemplo, un
anticuerpo específico para el tipo 1 de transcetolasa humano o un
fragmento del mismo.
En otra realización del estuche de ensayo, la
detección de productos génicos like-1 de
transcetolasa humanos se lleva a cabo sobre el nivel de ácidos
nucleicos. En esta realización de la invención, el reactivo para la
detección puede ser, por ejemplo, una sonda de ácidos nucleicos o un
cebador inverso-complementario a dicho ácido
nucleico like-1 de transcetolasa humano.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere al uso de uno o más de los compuestos útiles para los
procedimientos según la presente invención como una molécula de
ácido nucleicos, un vector recombinante, un polipéptido, una
secuencia de RNA antisentido, un ribozima o un anticuerpo para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
cáncer, preferentemente cáncer de colon, carcinoma pancreático,
cáncer gástrico o cáncer de pulmón.
Los polipéptidos, polinucleótidos y agentes de
unión útiles en el procedimiento según la presente invención pueden
ser incorporados en composiciones farmacéuticas o inmunógenas. Las
composiciones farmacéuticas comprenden dichos compuestos y un
vehículo fisiológicamente aceptable.
Una composición farmacéutica o vacuna puede
contener, por ejemplo, DNA que codifique uno o más polipéptidos
según la presente invención. El DNA puede ser administrado en una
forma que permita que los polipéptidos en generados in situ.
Los sistemas de expresión adecuados son conocidos por los expertos
en la técnica. La expresión de los polipéptidos puede ser, por
ejemplo, persistente o transitoria. En composiciones farmacéuticas
y/o vacunas, que proporciona la expresión in situ de
polipéptidos, los ácidos nucleicos pueden estar presentes en
cualquier sistema de suministro adecuado conocido por los expertos
ordinarios en la técnica, que incluyen sistemas de expresión de
ácidos nucleicos, bacterias y sistemas de expresión virales. Los
sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados comprenden las
necesarias secuencias reguladoras de ácidos nucleicos para la
expresión en el paciente, como promotores adecuados, terminadores,
etc. Los sistemas de suministro bacterianos emplean, por ejemplo,
la administración de una bacteria que exprese un epitopo de un
antígeno celular en su superficie celular. En una realización
preferida, el ácido nucleico puede ser introducido usando un sistema
de expresión viral como, por ejemplo, un virus de vacuna,
retrovirus o adenovirus, que pueden incluir el uso de un virus
competente de replicación no patógeno. Se describen sistemas
adecuados, por ejemplo, por Fisher-Hoch et
al., PNAS 86:317-321, 1989; Flexner et
al., Ann. N.Y. Acad Sci 569:86-103, 1989;
Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990;
patentes de EE.UU. nº 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documento WO
89/01973; patentes de EE.UU. nº 4.777.127; GB 2.200.651; EP
0.345.242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques
6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science
252:431-434, 1991; Kolls et al., PNAS
91:215-219, 1994; Kass-Eisler et
al., PNAS 90:11498-11502, 1993; Guzman et
al., Curculation 88:2838-2848. 1993 y Guzman
et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993. En otra
realización pueden ser usadas células de mamíferos transgénicos
para el suministro y/o expresión de los ácidos nucleicos. Los
procedimientos para producir constructos de ácidos nucleicos
adecuados para la expresión in situ de polipéptidos son
conocidos por los expertos en la técnica.
En otra realización de la invención los ácidos
nucleicos pueden ser, por ejemplo, constructos antisentido.
El ácido nucleico puede ser administrado también
en forma de un ácido nucleico purificado. En este caso pueden ser
empleados sistemas de suministro físico apropiados, que aumenten la
absorción del ácido nucleico, como un revestimiento del ácido
nucleico sobre gránulos biodegradables, que son eficazmente
transportados a las células. La administración de ácidos nucleicos
purificados puede ser útil, por ejemplo, para los fines de una
expresión transitoria en un hospedante o células hospedante.
Alternativamente, las composiciones
farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos. Los
polipéptidos incorporados en las composiciones farmacéuticas pueden
ser polipéptidos like-1 de transcetolasa humanos en
combinación con uno o más de otros polipéptidos conocidos como, por
ejemplo, enzimas, anticuerpos, factores reguladores como ciclinas,
quinasas dependientes de ciclinas o CKIs o toxinas.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser
administradas de cualquier forma adecuada conocida por los expertos
en la técnica. La administración puede comprender una inyección, por
ejemplo, una inyección intracutánea, intramuscular, intravenosa o
subcutánea, administración intranasal, por ejemplo, por aspiración o
administración oral. Una dosificación adecuada para asegurar la
ventaja farmacéutica del tratamiento debe ser escogida según
parámetros como la edad, sexo, peso corporal etc. del paciente,
conocidos por el experto en la técnica.
El tipo de vehículo que va a ser empleado en las
composiciones farmacéuticas de esta invención variará dependiendo
del modo de administración. Para una administración parenteral, como
una inyección subcutánea, el vehículo comprende preferentemente
agua, solución salina, alcohol, un lípido, una cera y/o un tampón.
Para una administración oral, puede ser empleado cualquiera de los
vehículos anteriores o un vehículo sólido como manitol, lactosa,
almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa,
glucosa, sacarosa y/o carbonato de magnesio. Pueden ser empleadas
también microesferas biodegradables (por ejemplo, glicólido
poliláctico) como vehículos para las composiciones farmacéuticas de
esta invención. Microesferas biodegradables adecuadas son descritas,
por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.897.268 y
5.075.109.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser incorporados además en composiciones inmunógenas.
Los constituyentes de una composición inmunógena
pueden comprender vacunas, antígenos, fragmentos antigénicos o
ácidos nucleicos que codifiquen antígenos o fragmentos antigénicos
que van a ser expresados in situ. Estos compuestos pueden
estar presentes como polipéptidos o como ácidos nucleicos que
permitan que los pelipéptidos sean expresados in situ. Las
composiciones inmunógenas comprenden dichos compuestos y
adicionalmente un adyuvante inmunoestimulante o inmunógeno.
Los polipéptidos de la presente invención o los
fragmentos de los mismos, que comprenden una parte inmunógena de una
proteína like-1 de transcetolasa humana, pueden ser
usados en composiciones inmunógenas, en las que el polipéptido, por
ejemplo, estimule la propia respuesta inmune del paciente a las
células tumorales. Un paciente puede estar afectado con una
enfermedad, o puede estar exento de enfermedad detectable.
Consecuentemente, los compuestos descritos en la presente memoria
descriptiva pueden ser usados para tratar el cáncer o para inhibir
el desarrollo del cáncer. Los compuestos pueden ser administrados
antes o a continuación de un tratamiento convencional de tumores
como la extirpación quirúrgica de tumores primarios, el tratamiento
mediante administración de radioterapia, procedimientos
quimioterapéuticos convencionales o cualquier otro modo de
tratamiento del respectivo cáncer o sus precursores.
Las composiciones inmunógenas como las vacunas
pueden comprender uno o más polipéptidos y un mejorador de la
respuesta inmune no específico, en que el mejorador de la respuesta
inmune no específico es capaz de provocar o aumentar una respuesta
inmune a un antígeno exógeno. Ejemplos de mejoradores de respuesta
inmunes no específicos incluyen adyuvantes, microesferas
biodegradables (por ejemplo, galáctido poliláctico) y, por ejemplo,
liposomas en los que el polipéptido puede ser incorporado. Las
composiciones farmacéuticas y vacunas pueden contener también otros
epitopos de antígenos tumorales, incorporados en una proteína de
fusión como se describió anteriormente (es decir, un único
polipéptido que contiene múltiples epitopos) o presentes en un
polipéptido separado.
Puede ser empleado cualquier mejorador de la
respuesta inmune adecuado en las vacunas de la invención. Por
ejemplo, puede ser incluido un adyuvante. La mayoría de los
adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el
antígeno de un rápido catabolismo, como hidróxido de aluminio o
aceite mineral, y un estimulador o específico de respuesta inmune,
como lípido A, Bordatella pertussis o Mycobacterium
tuberculosis. Estos adyuvantes están disponibles en el comercio
como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de
Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) y adyuvante 65 de Merck
(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.).
Los polipéptidos para fines terapéuticos,
polinucleótidos o agentes de unión, pueden ser administrados en una
diversidad de formas. Las formas posibles pueden comprender, por
ejemplo, una inyección intracutánea, intramuscular, intravenosa o
subcutánea, una administración intranasal, por ejemplo, mediante
aspiración, o una administración oral.
Otro aspecto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para una terapia y/o vacunación. Según
la presente invención, una terapia de trastornos de proliferación
celular puede llevarse a cabo usando polipéptidos y/o
polinucleótidos like-1 de transcetolasa humanos. La
terapia puede ser, por ejemplo, una inmunoterapia o terapia de genes
somáticos.
Los polipéptidos y/o polinucleótidos
like-1 de transcetolasa humanos pueden ser usados
según la presente invención para una vacunación contra trastornos
de proliferación celular. La vacunación según la presente invención
puede comprender administrar un compuesto inmunógeno a un individuo
para los fines de estimular una respuesta inmune dirigida contra
dicho compuesto inmunógeno y, por tanto, inmunizar dicho individuo
contra dicho compuesto inmunógeno. La estimulación de una respuesta
inmune puede comprender inducir la producción de anticuerpos contra
dicho compuesto así como estimular células T citotóxicas. Para los
fines de vacunación los polipéptidos, ácidos nucleicos y agentes de
unión según la presente invención pueden ser administrados en una
forma fisiológica aceptable. La composición que va a ser
administrada a individuos puede comprende uno o más componentes
antigénicos, sustancias portadoras fisiológicamente aceptables o
soluciones tamponantes, inmunoestimulantes y/o adyuvantes. Los
adyuvantes pueden comprender, por ejemplo, adyuvante incompleto de
Freund o adyuvante completo de Freund u otros adyuvantes conocidos
por un experto en la técnica.
La composición puede ser administrada en
cualquier forma aplicable como, por ejemplo, intravenosa,
subcutánea, intramuscular, etc. La dosificación de la composición
depende del caso particular y la finalidad de la vacunación. Tiene
que ser adaptada a parámetros por el individuo tratado como la edad,
peso, sexo, etc. Además de ello, tiene que ser tenida en cuenta el
tipo de respuesta inmune que va a ser provocada. En general, puede
ser preferible que un individuo reciba 100 mg - 1 g de un
polipéptido según la presente invención o
10^{6}-10^{12} MOI de un ácido nucleico
recombinante, que contenga un ácido nucleico según la presente
invención en una forma que pueda ser expresada in situ.
Los individuos para los fines de la vacunación
pueden ser cualesquiera organismos que contengan proteínas
like-1 de transcetolasa y sean capaces de resultar
afectados por trastornos proliferativos.
La vacunación de individuos puede ser favorable,
por ejemplo, en el caso de secuencias de tipo no salvaje alteradas o
estructuras o moléculas marcadoras asociadas con trastornos de
proliferación celular.
Los polipéptidos descritos en la presente
memoria descriptiva pueden ser empleados también en inmunoterapia
adoptiva para el tratamiento del cáncer. La inmunoterapia adoptiva
puede ser clasificada ampliamente en inmunoterapia activa o pasiva.
En la inmunoterapia activa, el tratamiento se basa en la
estimulación in vivo del sistema inmune del hospedante
endógeno para que reacciones frente a tumores con la administración
de agentes modificadores de la respuesta inmune (por ejemplo,
vacunas tumorales, adyuvantes bacterianos y/o citoquinas).
En inmunoterapia pasiva, el tratamiento incluye
el suministro de reactivos biológicos con reactividad inmune tumoral
establecida (como células efectoras o anticuerpos) que pueden mediar
directa o indirectamente efectos antitumorales y no depende
necesariamente de un sistema inmune intacto del hospedante. Ejemplos
de células efectoras incluyen linfocitos T (por ejemplo, linfocitos
T citotóxico CD8+, helper T CD4+, linfocitos de infiltración de
tumores), células asesinas (como células asesinas naturales, células
asesinas activadas por linfoquina), células B o células que
presentan antígenos (como céljlas dendríticas y macrófagos) que
expresan los antígenos descritos. Los polipéptidos descritos en la
presente memoria descriptiva pueden ser usados también para generar
anticuerpos o anticuerpos anti-idiotípicos (como en
la patente de EE.UU. nº 4.918.164) para una inmunoterapia
pasiva.
El procedimiento predominante para procurar los
números adecuados de células T para una inmunoterapia adoptiva es
hacer crecer células T inmunes in vitro. Las condiciones de
cultivo para la expansión de células T específicas para antígenos
únicos hasta varios miles de millones en número con una retención
del reconocimiento de antígenos in vivo son bien conocidas
en la técnica. Estas condiciones de cultivo in vitro utilizan
normalmente una estimulación intermitente con antígeno, a menudo en
presencia de citoquinas, como IL-2, y células
alimentadoras no divisorias. Como se indicó anteriormente, los
polipéptidos inmunorreactivos descritos en la presente memoria
descriptiva pueden ser usados para expandir rápidamente cultivos de
células T específicas para antígenos con el fin de generar un número
suficiente de células para inmunoterapia. En particular, las células
que presentan antígenos, como las células dendríticas, macrófagos o
células B, pueden ser impulsadas con polipéptidos o transfectadas
con secuencia(s) de ácidos nucleicos, usando técnicas
estándar bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células que
presentan antígenos pueden ser transfectadas con una secuencia de
ácidos nucleicos, en que dicha secuencia contiene una región
promotora apropiada para aumentar la expresión y puede ser expresada
como parte de un virus recombinante u otro sistema de expresión.
Para que las células T cultivadas sean efectivas en una terapia, las
células T cultivadas deben ser capaces de crecer y distribuirse
ampliamente y sobrevivir a largo plazo in vivo. Unos
estudios han demostrado que lasa células T cultivadas pueden ser
inducidas a crecer in vivo y a sobrevivir a largo plazo en
números sustanciales mediante una estimulación repetida con antígeno
complementado con IL-2 (véase, por ejemplo,
Cheever, M. et al, "Therapy With Cultured T Cells:
Principles Revisited", Immunological Reviews, 157:177, 1977).
Los polipéptidos descritos en la presente
memoria descriptiva pueden ser empleados también para generar y/o
aislar células T reactivas con tumores, que pueden ser seguidamente
administradas al paciente. En una técnica, las líneas celulares T
específicas para antígenos pueden ser generadas mediante
inmunización in vivo con péptidos cortos correspondientes a
partes inmunógenas de los polipéptidos descritos. Los clones CD8+
CTL específicos para antígenos pueden ser aislados a partir del
paciente, expandidos usando técnicas estándar de cultivo de tejidos
y devueltos al paciente.
Alternativamente, los péptidos correspondientes
a las partes inmunógenas de los polipéptidos de la invención pueden
ser empleados para generar subconjuntos de células T reactivas con
tumores mediante estimulación in vitro selectiva y expansión
de células T autólogas para proporcionar células T específicas para
antígenos que pueden ser posteriormente transferidas al paciente
como se describe, por ejemplo, por Chang et al. (Crit. Rev.
Oncol. Hematol. 22(3), 213, 1996). Las células del sistema
inmune, como las células T, pueden ser aisladas de la sangre
periférica de un paciente usando un sistema de separación celular
disponible en el comercio, como CellPro Incorporated's (Bothell,
Wash.) sistema CEPRATE® (véanse la patente de EE.UU. nº 5.240.856;
patente de EE.UU. nº 5.215.926; documentos WO 89/06280; WO 91/16116
y WO 92/07243). Las células separadas son estimuladas con uno o más
de los polipéptidos inmunorreactivos contenidos en un vehículo de
suministro, como una microesfera, para proporcionar células T
específicas para antígenos. La población de células T específicas
para antígenos tumorales es seguidamente expandida usando técnicas
estándar y las células son nuevamente administradas al paciente.
En otra realización, los receptores de células T
y/o anticuerpos específicos para los polipéptidos pueden ser
clonados, expandidos y transferidos a otros vectores o células
efectoras para ser usados en inmunoterapia adoptiva.
En una realización adicional, las células
dendríticas singeneicas o autólogas pueden ser impulsadas con
péptidos correspondientes a al menos una parte inmunógena de un
polipéptido descrito en la presente memoria descriptiva. Las
células dendríticas específicas para antígenos resultantes pueden
ser transferidas a un paciente o empleadas para estimular células T
para proporcionar células T específicas para antígenos que, a su
vez, pueden ser administradas a un paciente. El uso de células
dendríticas impulsadas por péptidos para generar células T
específicas para antígenos y el posterior uso de estas células T
específicas para antígenos para erradicar tumores en un modelo de
múridos ha sido demostrado por Cheever et al., Immunological
Reviews, 157:177, 1997.
Adicionalmente, pueden ser introducidos vectores
que expresan los ácidos nucleicos descritos en células troncales del
paciente y clonalmente propagadas in vitro para un nuevo
trasplante autólogo al mismo paciente.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención pueden ser usados también como compuestos terapéuticos con
el fin de disminuir o eliminar tumores. Los anticuerpos pueden ser
usados por sí mismos (por ejemplo, para inhibir metástasis) o
acoplados a uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados a
este respecto incluyen radio-núclidos, inductores de
diferenciación, fármacos, toxinas y sus derivados. Los
radio-núclidos preferidos incluyen 90Y, 1231, 1251,
1311, 136Re, 188Re, 211At y 212Bi. Los fármacos preferidos incluyen
metotrexato y pirimidina y análogos de purina. Los inductores de
diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido
butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricino, abrina, toxina de
difteria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas,
toxina de Shigella y proteína antiviral de espinaca.
Adicionalmente, los procedimientos para el
tratamiento de trastornos asociados con la sobreexpresión de gen
like-1 de transcetolasa pueden comprender cualquier
procedimiento adecuado para la reducción de la actividad de
polipéptido like-1 de transcetolasa en un individuo
o en células de un individuo. Estos procedimientos pueden
comprender una reducción de la actividad de polipéptido
like-1 de transcetolasa por medio de la reducción
de la expresión génica o por medio de la reducción de la actividad
enzimática. Ejemplos pueden comprender la administración de
constructos antisentido, de ribozimas, de inhibidores de enzimas, la
administración de antagonistas de cofactores de polipéptidos
like-1 de transcetolasa, como por ejemplo
compuestos de antitiamina, o la administración reducida de
cofactores esenciales para la actividad enzimática (por ejemplo,
tiamina).
Los procedimientos para la administración de
ribozimas o constructos antisentido son conocidos por los expertos
en la técnica. La administración puede tener lugar como una
administración de ácidos nucleicos purificados o como una
administración de ácidos nucleicos que son adecuados para la expresión de los productos activos relevantes in situ.
administración de ácidos nucleicos que son adecuados para la expresión de los productos activos relevantes in situ.
En una realización preferida, la terapia de
trastornos asociados con la sobreexpresión de gen
like-1 de transcetolasa comprende la administración
de compuestos de antitiamina, o la reducción de la absorción te
tiamina para individuos que muestran trastornos caracterizados por
la sobreexpresión de gen like-1 de
transcetolasa.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a un procedimiento para identificar y obtener
un candidato de fármaco para la terapia de colon, estómago, tumores
pancreáticos o de pulmón que comprende las etapas de poner en
contacto un polipéptido TKT-L1 como el usado en el
procedimiento de la presente invención o una célula que expresa
dicho polipéptido en presencia de componentes capaces de
proporcionar una señal detectable en respuesta a la actividad de
transcetolasa, a la regulación alterada de la proliferación celular
y a detectar la presencia o ausencia de una señal o aumenta la señal
generada a partir de la actividad de transcetolasa o la regulación
alterada de la proliferación celular, en el que la ausencia o
disminución de la señal es indicativa de un fármaco putativo.
El candidato de fármaco puede ser un único
compuesto o una pluralidad de compuestos. La expresión "pluralidad
de compuestos" en un procedimiento de la invención debe
entenderse como una pluralidad de sustancias que pueden ser o no
ser idénticas.
Dicho compuesto o pluralidad de compuestos
pueden ser químicamente sintetizados o microbiológicamente
producidos y/o comprendidos, por ejemplo, en muestras, por ejemplo,
extractos de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos.
Además de ello, dicho(s) compuesto(s) puede(n)
ser conocido(s) en la técnica pero no se conocía hasta ahora
que eran capaces de suprimir o activar polipéptidos
TKT-L1. La mezcla de reacción puede ser un extracto
exento de células o puede comprender un cultivo de células o
tejidos. Los ajustes adecuados para el procedimiento de la invención
son conocidos por el experto en la técnica y son generalmente
descritos por Alberts et al., Molecular Biology of the Cell,
tercera edición (1994) y en los ejemplos anejos. La pluralidad de
compuestos puede ser añadida, por ejemplo, a la mezcla de reacción,
medio de cultivo, inyectada a una célula o aplicada de cualquier
otro modo al animal transgénico. La célula o tejido que puede ser
empleado en el procedimiento de la invención preferentemente es una
célula hospedante, célula de mamífero o animal transgénico no humano
de la invención descrito en las realizaciones anteriores de la
presente memoria descriptiva.
Si una muestra que contiene un compuesto o una
pluralidad de compuesto es identificada en el procedimiento de la
invención, entonces es posible aislar el compuesto de la muestra
original que se identificó que contenía el compuesto capaz de
suprimir o activar TAT-L2, o se puede subdividir
adicionalmente la muestra original, por ejemplo, si consiste en una
pluralidad de compuestos diferentes, con el fin de reducir el número
de sustancias diferentes por muestra y repetir el procedimiento con
las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la
complejidad de las muestras, las etapas anteriormente descritas
pueden ser realizadas varias veces, preferentemente hasta que la
muestra identificada según el procedimiento de la invención
comprenda solamente un número limitado o solamente una
sustancia(s). Preferentemente, dicha muestra comprende
sustancias de propiedades químicas y/o físicas similares, y lo más
preferentemente dichas sustancias son iguales.
Los compuestos que pueden ser ensayados e
identificados según un procedimiento de la invención pueden ser
péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos
orgánicos pequeños, hormonas, peptidomiméticos, PNAs o
similares.
Los compuestos aislados mediante los
procedimientos anteriores sirven también como compuestos principales
para el desarrollo de compuestos análogos. Los análogos deben tener
una configuración electrónica estabilizada y una conformación
molecular que permita que los grupos funcionales clave sean
presentados a TKT-L1 sustancialmente de la misma
forma que el compuesto principal. En particular, los compuestos
análogos tienen propiedades electrónicas espaciales que son
comparables a la región de unión, pero pueden ser moléculas más
pequeñas que el compuesto principal, que tienen frecuentemente un
peso molecular de aproximadamente 2 kD y preferentemente por debajo
de aproximadamente 1 kD. La identificación de compuestos análogos se
puede realizar a través de técnicas como análisis de campos
auto-congruentes (SCF), análisis de interacción de
configuraciones (CI) y análisis de características dinámicas de modo
normal. Están disponibles programas de ordenador para poner en
práctica estas técnicas, por ejemplo, Rein,
Computer-Assisted Moling of
Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York,
1989). Los procedimientos para la preparación de derivados químicos
y análogos son bien conocidos por los expertos en la técnica y son
descritos, por ejemplo, por Beilstein, Handbook of Organic
Chemistry, Springer edition, New York Inc., 175 Fifth Avenue, New
York, N.Y. 10010 U.S.A. y Organic Syntehsis, Wiley, New York, USA.
Además de ello, dichos derivados y análogos pueden ser ensayados en
cuento a sus efectos según procedimientos conocidos en la técnica;
véase también lo que antecede. Además de ello, los peptidomiméticos
y/o diseño asistido por ordenador de los derivados y análogos
apropiados pueden ser usados, por ejemplo, según los procedimientos
descritos con anterioridad.
Una vez que ha sido identificado y obtenido el
compuesto, es preferentemente proporcionado en una forma
terapéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona procedimientos
para la detección y tratamiento de trastornos caracterizados por una
proliferación anormal de células como, por ejemplo, cánceres. En un
aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la
detección de trastornos caracterizados por una proliferación anormal
de células como, por ejemplo, cánceres, basado en la determinación
de la presencia o ausencia y/o el nivel de expresión de muestras
biológicas de gen like-1 de transcetolasa humano. En
un segundo aspecto, la presente invención proporciona un
procedimiento para el tratamiento de trastornos caracterizados por
una proliferación anormal de células como, por ejemplo, cánceres,
usando productos de gen like-1 de transcetolasa
humano como agentes terapéuticamente activos La invención
proporciona también procedimientos terapéuticos basados en la
reducción de la actividad enzimática de polipétidos de gen
like-1 de transcetolasa. Es un aspecto de la
invención proporcionar un procedimiento para la manipulación
racional de tumores basado en la detección de productos de gen
like-1 de transcetolasa en muestras de pacientes y
adaptarlos a una terapia correlacionada con la sobreexpresión
detectada de dichos productos génicos. Además de ello, la presente
invención proporciona un estuche de ensayo de investigación o
diagnóstico para realizar las reacciones involucradas en la
detección de la presencia o ausencia y/o en nivel de sobreexpresión
de gen like-1 de transcetolasa humano. Finalmente,
la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas
aplicables en el tratamiento de trastornos según la presente
invención.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
fines de ilustración solamente y no están destinados a limitar el
alcance de la invención descrita en la presente memoria
descriptiva.
Las disecciones de biopsias tumorales pueden ser
analizadas de forma semi-cuantitativa en cuanto al
gen like-1 de transcetolasa humano en una reacción
de teñido in situ. La reacción de teñido se realiza como
sigue:
Las disecciones de tejidos son incubadas en
concentraciones crecientes de etanol hasta etanol al 100%. Después
de una evaporación del alcohol, las disecciones se llevan a
ebullición en tampón de citrato 10 mM (pH 6,0) para el
pre-tratamiento del tejido. La mezcla de hibridación
se prepara mezclando 50 \mul de tampón de hibridación listo para
usar (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca) con aproximadamente
5-10 pmol de las sondas. Las sondas con
oligonucleótidos marcados con fluoresceína de la siguiente
secuencia:
TCTCATCACAAGCAGCACAGGAC
La mezcla de hibridación se calienta a 95ºC y
posteriormente se equilibra a 37ºC. Después del procedimiento de
ebullición, las disecciones se incuban cada una con 50 \mul de la
mezcla de hibridación durante 2 horas a 37ºC. Las disecciones se
lavan con volúmenes en exceso de los tampones de lavado dos veces en
2 x SSC a temperatura ambiente durante 15 minutos y una vez en 1 x
SSC a 50ºC durante 15 minutos. Seguidamente las disecciones se
aclaran dos veces a temperatura ambiente en 2 x SSC. A continuación
de este procedimiento de lavado, las disecciones se incuban durante
30 minutos con tampón de bloqueo (NEN, Blockingpugger) a temperatura
ambiente. Seguidamente se realiza una incubación de 1 hora con una
dilución 1:100 (en tampón de bloque, véase lo que antecede)
Anti-Fluorescein-AP (DAKO A/S). Las
disecciones se lavan seguidamente 2 veces en 1 x PBS/Tritonx100 a 1%
durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de una etapa de
lavado con 1 x PBS, MgCl_{2} 50 mM (pH 9,2) durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
Seguidamente se realiza la mezcla de tinción con
NBT/BCIP (Sigma) durante aproximadamente 30 minutos a temperatura
ambiente. La reacción de teñido es detenida mediante una incubación
corta con EDTA 1 mM en PBS. Finalmente las disecciones son
sumergidas en H_{2}O destilada y fijadas con AquaTex (Merck).
Seguidamente las disecciones teñidas pueden ser microscópicamente
analizadas.
Los resultados muestran que el gen
like-1 de transcetolasa humano es sobreexpresado en
tejido de carcinoma de colon en comparación con tejido de colon
normal.
Las muestras de carcinoma de colon,
adenocarcinoma del pulmón y carcinomas del estómago se usan para
determinar el nivel de mRNA like-1 de transcetolasa
humano y el nivel de mRNA de transcetolasa humano usando RT PCR
semi-cuantitativa. Son usadas biopsias tumorales en
este estudio.
Los tumores se recogen, se congelan en
sujeciones y se almacenan a -80ºC. Se verifica que están compuestos
predominantemente por células neoplásticas mediante un análisis
histopatológico. Se aísla mRNA de los tumores y tejido normal de
pacientes coincidentes usando reactivos de Qiagen (Qiagen, Hilden,
Alemania) y se sintetiza cDNA de cadena única usando Superscript II
(Life Technologies, Inc.). Se realiza una PCR cuantitativa usando
un detector de secuencias 7700 Sequence Detector (TaqmanTM) y el
dispositivo SYBR Green PCR Master-Mix, como se
describe en el manual de los fabricantes (Applied Biosystems, Foster
citY, CA).
Las reacciones de PCR se realizan en volúmenes
de 25 \mu con una concentración final de 300 nmol para cada
cebador, a 95ºC durante 15 segundos y a 60ºC durante 60 segundos,
durante 40 ciclos. Se usan los siguientes cebadores para la PCR
cuantitativa:
| Transcetolasa tipo 1: | Cebador A: | CACCTTGGGATTCTGTGTGC |
| Cebador B: | TCTCATC_{A}C_{AA}GC_{A}GCACAG |
| Transcetolasa: | Cebador A: | TGTGTCCAGTGCAGTAGTGG |
| Cebador B: | ACACTTCATACCCGCCCTAG |
La especifidad de los productos de PCR es
verificada mediante electroforesis sobre gel (datos no
mostrados).
Los resultados muestran que el gen
like-1 de transcetolasa humano es altamente
sobreexpresado en 1 de cada 10 carcinomas de colon, en dos de cada
cinco adenocarcinomas de pulmón y en tres de cada cinco carcinomas
de estómago en comparación con el tejido testigo normal.
Especialmente es apreciable el alcance de la
sobreexpresión del gen like-1 de transcetolasa en
las muestras. En total, seis de cada 20 carcinomas muestran una
sobreexpresión de más de ocho veces del gen TKT L-1.
Por el contrario, el gen de transcetolasa no se sobreexpresa
significativamente en ningún caso.
El resultado muestra que en un subconjunto de
cánceres de diferentes orígenes se sobreexpresa gen
like-1 de transcetolasa. Por el contrario, el gen de
transcetolasa no se expresa diferencialmente en el tejido tumoral
ensayado.
Claims (18)
1. Un procedimiento in vitro para la
detección de trastornos caracterizados por una proliferación
anormal de células en un individuo, que comprende
a. detectar el nivel de expresión de gen
like-1 de transcetolasa humano en una muestra
biológica obtenida de dicho individuo y en una muestra de ensayo
testigo;
b. valorar el diagnóstico de la comparación de
dicho nivel de expresión en la muestra obtenida de dicho individuo
con dicho nivel de expresión en la muestra de ensayo testigo, en que
una expresión significativamente elevada en la muestra obtenida de
dicho individuo es una sobreexpresión y es indicativa de trastornos
caracterizados por una proliferación anormal de células.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el trastorno caracterizado por una proliferación
anormal de células es cáncer.
3. El procedimiento según la reivindicación 2,
en el que el cáncer es un cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer
gástrico o cáncer pancreático.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que la muestra biológica
es un fluido corporal, una secreción, un frotis vaginal, una
biopsia, un líquido que contiene células, células lisadas, debris
celular, péptidos o ácidos nucleicos.
5. El procedimiento según la reivindicación 4,
en el que la muestra es suero, orina, semen, heces, bilis, una
biopsia o una muestra de células o tejidos.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que la detección de la
expresión del gen like-1 transcetolasa humano se
lleva a cabo en un nivel de polipéptidos.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que la detección de la
expresión del gen like-1 de transcetolasa humano se
lleva a cabo en un nivel de ácidos nucleicos.
8. El procedimiento según la reivindicación 6,
en el que la detección en el nivel de polipéptidos se lleva a cabo
usando un agente de unión dirigido contra polipéptidos
like-1 de transcetolasa humanos.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que el agente de unión es un anticuerpo, un fragmento de un
anticuerpo, un peptidomimético que comprende un epitopo de unión a
antígenos o un mini-anticuerpo.
10. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6, 8 ó 9, en el que la detección es un
procedimiento de detección inmuno-citoquímico.
11. El procedimiento según la reivindicación 7,
en el que es usada para la detección al menos una sonda de ácidos
nucleicos, que se hibrida a ácido nucleico like-1 de
transcetolasa humano.
12. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que es usado en el transcurso de un
procedimiento de formación de imágenes moleculares in vivo o
in vitro.
13. Uso de al menos una sonda para la detección
de productos de expresión de gen like-1 de
transcetolasa humano en muestras biológicas, para fabricar un
estuche de ensayo para realizar el procedimiento in vitro
según una o más de las reivindicaciones 1 a 11.
14. El uso de la reivindicación 13, en el que la
sonda es una sonda de ácidos nucleicos, que se hibrida
específicamente a ácidos nucleicos like-1 de
transcetolasa humanos o a un anticuerpo que se une específicamente a
proteínas like-1 de transcetolasa humanas.
15. Uso de un inhibidor de la actividad
like-1 de transcetolasa, para fabricar una
composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos
caracterizados por una proliferación anormal de células
asociados con la sobreexpresión de productos génicos
like-1 de transcetolasa, en el que el inhibidor de
la actividad like-1 de transcetolasa son compuestos
anti-tiamina.
16. Un procedimiento par identificar y obtener
un candidato de fármaco para la terapia de tumores de colon,
pulmón, páncreas o estómago, que comprende las etapas de
a) poner en contacto un polipéptido
TKT-L1 como el usado en el procedimiento de la
presente invención o una célula que exprese dicho polipéptido en
presencia de componentes capaces de proporcionar una señal
detectable en respuesta a la actividad de transcetolasa, para la
regulación alterada de la proliferación celular, y
b) detectar la presencia o ausencia de una señal
o aumento de la señal generada a partir de la actividad de
transcetolasa o la regulación alterada de la proliferación celular,
en que la ausencia o disminución de la señal es indicativa de un
fármaco putativo.
17. Un procedimiento in vitro para la
manipulación racional de tumores, que comprende
a) la detección del nivel de sobreexpresión de
gen like-1 de transcetolasa en muestras
biológicas;
b) la constitución de subgrupos según los
niveles de gen like-1 de transcetolasa;
c) la adaptación de una terapia adecuada según
los subgrupos que comprende la reducción de la actividad
like-1 de transcetolasa en individuos o en células
de individuos.
18. Un procedimiento según la reivindicación 17,
en el que la reducción de la actividad like-1 de
transcetolasa es conseguida mediante la administración de
compuestos anti-tiamina, de inhibidores de la
actividad enzimática de transcetolasa, de constructos antisentido
like-1 de transcetolasa, de ribozimas específicos
para tipo 1 de transcetolasa o mediante la administración reducida
de tiamina.
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