DE102021109341A1

DE102021109341A1 - TKTL1 Inhibitoren für die antivirale Therapie

Info

Publication number: DE102021109341A1
Application number: DE102021109341.4A
Authority: DE
Inventors: Johannes F. Coy; Ralf Schierl
Original assignee: Tavargenix GmbH
Current assignee: TAVARGENIX GMBH, DE
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2022-10-20
Also published as: EP4322929A1; WO2022218471A1; JP2024514188A

Abstract

Wenigstens ein Inhibitor der Transketolase TKTL1 wird bei Patienten zur Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere RNA-Virusinfektionen und insbesondere auch von SARS-CoV-2-Infektionen eingesetzt.

Description

Die Erfindung betrifft Inhibitoren der Transketolase TKTL1 (im folgenden kurz „TKTL1-Inhibitor“ oder „TKTL1-Inhibitoren“) zur Anwendung bei der antiviralen Therapie, insbesondere der Therapie von RNA-Viren und insbesondere auch von SARS-CoV-2-Infektionen und Covid-19-Erkrankungen.
Im Jahr 2019 wurde in China ein neues Corona-Virus mit dem Namen SARS-CoV-2 beschrieben, das Menschen infiziert und sich schnell ausbreitet. Ein Teil der infizierten Menschen entwickelt eine Erkrankung, die als COVID-19 bezeichnet wird, und bei der es zu einer Schädigung der Lunge kommt, die auch zu einem Sauerstoffdefizit und Atemnot führt. Im März 2020 erklärte die WHO den Ausbruch der SARS-CoV-2-Infektionen zur Pandemie. Eine Infektion mit dem SARS-CoV-2-Virus kann im Gegensatz zur Infektion mit Grippeviren auch ohne Symptome (asymptomatisch) verlaufen, was dazu führt, dass scheinbar gesunde Menschen andere Menschen mit SARS-CoV-2-Viren anstecken können. Dies erschwert massiv die Eindämmung von SARS-CoV-2-Infektionen. Neben den asymptomatischen Infektionsverläufen gibt es viele an SARS-CoV-2-erkrankte Menschen, die grippeähnliche Symptome wie Husten, Halsschmerzen, Durchfall oder Fieber aufweisen. Daneben gibt es im Gegensatz zur Grippe auch Symptome wie den Verlust des Geschmackssinns und andere mit der Funktion von Nervenzellen assoziierte Symptome oder Ausfälle. Solche neurologisch assoziierten Symptome wie z.B. Einschränkungen der kognitiven Leistungsfähigkeit, Müdigkeit, Chronisches Fatigue-Syndrom, die sich auch noch lange nach dem Verschwinden der aktuten SARS-CoV-2-Infektion manifestieren, stellen ein großes gesundheitliches Problem von Infizierten dar. Eine Subgruppe von SARS-CoV-2-Infizierten entwickelt auch Lungenentzündungen, teilweise beidseitige Lungenentzündungen. Auch multiples Organversagen mit Todesfolge kann aus einer SARS-CoV-2-Infektion resultieren. Bei solchen schweren Verläufen einer SARS-CoV-2-Infektion kommt es oft zu einer Überreaktion, d.h. einer zu starken Antwort des Immunsystems, bei der z.B. Immunzellen in die Lunge einwandern und deren Funktionalität hemmen. Medikamente, die die Aktivität des Immunsystems hemmen, wie z.B. Dexamethason, zeigen positive Effekte auf diesen Krankheitsverlauf. Trotzdem verstirbt ein hoher Anteil derjenigen Patienten, die einen schweren Verlauf einer SARS-CoV-2-Infektion haben. Bislang sind keine ausreichend wirksamen Therapien verfügbar, die für die Verhinderung oder die Therapie von schweren Verläufen einer Covid-19-Erkrankung eingesetzt werden können.
Auch im Fall vieler anderer Viruserkrankungen stehen zur Bekämpfung der Virusinfektion bei Patienten bisher keine ausreichend effektiven Wirkstoffe zur Verfügung. Beispielsweise gibt es bisher keine ausreichende Therapie für das durch Viren ausgelöste Dengue Fieber oder schwere Formen einer Herpes-Infektion des Auges, die zur Erblindung führen.
Die meisten der im Stand der Technik bekannten therapeutischen Bekämpfungsstrategien bei viralen Erkrankungen zielen darauf ab, das Virus selbst unschädlich zu machen, z.B. prophylaktische Therapien mittels Impfstoff oder lindernde und heilende Therapien mittels Verabreichung von antiviralen Wirkstoffen. Diesen Strategien gemein ist, dass sie Virus-spezifische Strukturen (Epitope / Enzyme) angreifen. Allerdings können sich Viren aufgrund ihrer Fähigkeit, innerhalb kürzester Zeit ihr Genom zu verändern, sehr schnell an neue Umweltbedingungen anpassen. Das verdeutlichen aktuell die neuen Varianten des SARS-CoV2-Virus, die sich besser ausbreiten können oder sich besser gegenüber dem körpereigenem Immunsystem schützen können oder besser gegenüber Impfungen geschützt sind oder gar eine Zunahme der Letalität der Infektionen zur Folge haben. Deshalb können Therapiestrategien auf der Basis Virus-spezifischer Strukturen schnell versagen, weil sich unter den natürlicherweise und zahlreich entstehenden Virus-Mutanten auch solche entwickelt haben, die gegenüber den betreffenden Wirkstoffen oder bezüglich Impfstoffen unempfindlich sind. Grundsätzlich gilt außerdem, dass sich nicht vorhersagen lässt, welche Virusmutation oder welches Virus als nächstes neu auftreten und zukünftig eine Gefahr für Menschen darstellen wird. Eine rechtzeitige Entwicklung und Planung Virus-spezifischer Therapiestrategien ist daher sehr schwierig bis nahezu unmöglich.
Das Genom von Viren besteht entweder aus RNA oder aus DNA. Das SARS-CoV-2-Virus gehört zu den RNA-Viren.
RNA-Viren sind nach Infektion und Freisetzung ihrer Viren-RNA in einer Zelle darauf angewiesen, dass die Replikation (Vervielfältigung) dieser Virus-RNA schnell und in möglichst großer Menge erfolgt. Für diese Replikation wird zwingend Ribose-5-Phosphat (R5P) aus der Wirtszelle benötigt.
Auch DNA-Viren benötigen für ihre Vermehrung in der Wirtszelle R5P, denn Desoxyribose-5-Phosphat als wesentlicher Baustein ihrer DNA wird aus Ribose-5-Phosphat hergestellt. Somit sind sowohl RNA-Viren als auch DNA-Viren von der R5P-Synthese der Wirtszelle abhängig.
In Säugerzellen wird R5P über den Pentose-Phosphat-Stoffwechselweg (PPP) bereitgestellt. Laut gängiger Lehrmeinung kann dies sowohl über den oxidativen Teil als auch über den nicht-oxidativen Teil des PPP durchgeführt werden.
Transketolasen (TKT) sind Schlüsselenzyme des PPP. Sie bilden Dimere und werden durch die Bindung eines Moleküls Thiamindiphosphat und eines zweiwertigen Kations aktiviert. Diese Transketolase-Enzymaktivität kann durch die Bildung eines Heterodimers aus einem TKT und einem Transketolase-like-1 (TKTL1) Protein verändert werden (Li et al., 2019).
Li et al. (2019) beschreiben, dass die Bildung von TKTL1-TKT-Heterodimeren den Zellen ermöglicht, den R5P-Metabolismus umzuprogrammieren: Wenn mehr R5P benötigt wird, was vor allem bei der Nukleotid- und DNA-Synthese während der S-Phase der Zelle der Fall ist, führen erhöhte TKTL1-Spiegel zur vermehrten Bildung von TKTL1-TKT-Heterodimeren. Diese fördern die R5P-Produktion. Mit anderen Worten und vereinfacht zeigen Li et al., dass die R5P-Grundversorgung einer Zelle über das TKT-TKT-Homodimer bereitgestellt wird. Benötigt die Zelle zusätzlich eine große Menge R5P, so wird über die Expression von TKTL1 und die daraus resultierende TKT-TKTL1-Heterodimerbildung gewissermaßen ein „intrazelluläres Turboprogramm“ gestartet, dass eine verstärkte Bildung von R5P fördert, um eine Zellteilung und damit eine Zellvermehrung zu ermöglichen.
Untersuchungen von Bojkova et al. (2020) mit SARS-CoV-2 infizierten Zellen der menschlichen Zelllinie Caco-2 haben gezeigt, dass bei den SARS-CoV-2 infizierten Zellen der PPP der Zellen aktiviert ist.
Bojkova et al. (2020) untersuchten auch, ob die Replikation von SARS-CoV-2 durch TKT-Inhibitoren beeinflusst werden kann. Der Einsatz des TKT-Inhibitors Benfooxythiamin (B-OT), ein Prodrug des TKT-Inhibitors Oxythiamin (der ein hemmendes Analogon von Thiamin ist), führte zu einer Hemmung der Replikation von SARS-CoV-2-Viren in den Wirtszellen. Allerdings wurde das B-OT in einer Konzentration von mindestens 5 mM B-OT benötigt, um die Vermehrung der SARS-CoV-2-Viren zu hemmen. Übertragen auf einen Menschen würde das einer zu verabreichenden Menge an B-OT von mindestens 1 Gramm B-OT pro kg Körpergewicht entsprechen, d.h. bei einem 70 kg schweren Menschen einer zu verabreichenden Menge von 70 Gramm B-OT. Dieser Wert liegt außerhalb der normalerweise oder auch nur ausnahmsweise eingesetzten Wirkstoffmenge, und er liegt weit über den im Stand der Technik für den Menschen bekannten tolerablen Mengen an Oxythiamin, was auf B-OT übertragen werden darf. Der Fachmann geht deshalb davon aus, dass B-OT und TKT-Inhibitoren per se keine nutzbare Option im Hinblick auf einen Wirkstoff zur Virushemmung darstellt.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur Bekämpfung von viralen Infektionen, insbesondere von RNA-Virus-Infektionen bereit zu stellen, das insbesondere auch zur Bekämpfung von SARS-CoV-2-Viren geeignet ist.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung von wenigstens einem Inhibitor der Transketolase TKTL1 (im folgenden kurz „TKTL1-Inhibitor“) zur Verwendung bei der medizinisch-therapeutischen Behandlung von Virus-Infektionen (antivirale Therapie), insbesondere der Behandlung (Therapie) von RNA-Virusinfektionen und insbesondere auch der Behandlung (Therapie) von SARS-CoV-2-Infektionen und damit einhergehenden Erkrankungen wie z.B. COVID-19.
Mit anderen Worten: Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der technischen Lehre der Anwendung von wenigstens einem Inhibitor der Transketolase TKTL1 (kurz „TKTL1-Inhibitor“) als Wirkstoff eines antiviral und insbesondere virostatisch (virushemmend) wirkenden Arzneimittels.
Begriffsdefinitionen:

- Der Begriff „Inhibitor“ steht hier im Kontext für ein (d.h. prinzipiell jedes) Mittel und insbesondere eine (jede) stoffliche Substanz, nämlich Stoff oder Stoffgemisch einschließlich pharmazeutischer Zusammensetzungen, das/die/der dazu geeignet ist, eine Verringerung der Aktivität des TKTL1-Polypeptids bei einem Individuum oder in Zellen eines Individuums direkt oder indirekt zu bewirken (herbeizuführen). Zu diesen Mitteln bzw. stofflichen Substanzen gehören insbesondere:
1. (a) Inhibitoren der Transkription des TKTL1-Gens, beispielsweise stoffliche Substanzen, die an den TKTL1-Promotor binden und dadurch dessen Aktivität einschränken oder unterbinden, wie z.B. Resveratrol, das dosisabhängig den TKTL1-Promotor hemmt.
2. (b) Inhibitoren der Translation der TKTL1-mRNA, beispielsweise inhibitorische RNAs wie z.B. Antisense-Konstrukte, siRNAs, sh-RNAs, Ribozyme.
3. (c) Inhibitoren der Enzymreaktion von TKTL1 und/oder des TKTL1-TKT-Heterodimerkomplexes, insbesondere Wirkstoffe, die diese Enzymreaktion einschränken oder unterbinden. Hierzu gehören insbesondere auch Antagonisten von Cofaktoren von TKTL1-Polypeptiden wie z.B. Antithiamin-Verbindungen,
4. (d) Inhibitoren der Bildung des TKTLI-TKT-Heterodimerkomplexes, insbesondere Wirkstoffe, die die Heterodimer-Bildung einschränken oder unterbinden.
- Der Begriff „RNA“ steht hier synonym für Ribonukleinsäure(n).
- Der Begriff „DNA“ steht hier synonym für Desoxyribonukleinsäure.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass eine Hemmung des Enzyms TKTL1 und damit eine Hemmung der Enzymaktivität des TKTL1/TKT-Heterodimers in menschlichen Zellen dazu führt, dass die Vermehrung (Replikation) der Virus-RNA oder Virus-DNA signifikant gehemmt ist, die Wirtszelle selbst aber überlebensfähig bleibt und der menschliche Organismus keine dauerhaften und irreversiblen Schäden davon trägt.
Da die Teilung und damit Vermehrung von Zellen für den menschlichen Organismus lebensnotwendig ist, war zu erwarten, dass eine Hemmung von TKTL1 und/oder des TKTL1/TKT-Heterodimers in einer Größenordnung, die gemäß Bojkova et al. (2020) erforderlich ist, um eine Virusvermehrung zu bremsen oder zu unterbinden, zu einer Hemmung der Zellteilung und damit zu schweren Nebenwirkungen bis hin zum Tod führt. Auch und gerade weil Transketolasen und insbesondere TKTL1 als Schlüsselenzym bei der Regulation von Zellzyklus und Zellteilung als grundlegend relevant für die Lebensfähigkeit von Zellen erachtet werden, erschienen sie nach gängiger Lehrmeinung ungeeignet als mögliche Targets für eine antivirale Therapiestrategie, weil schwere Nebenwirkungen zu erwarten waren.
Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass die Hemmung der Enzymaktivität des TKTL1/TKT-Heterodimers in den Virus-infizierten menschlichen Wirtszellen dazu führt, dass die für die Virus-Nukleinsäurebiosynthese und damit die Vermehrung der Virus-Nukleinsäure (RNA oder DNA) erforderliche massive (starke) Steigerung der Ribose-5-Phosphat (R5P)-Produktion über den Stoffwechsel der Wirtszellen unterbunden bzw. signifikant gehemmt wird, andererseits aber die für das Überleben der Wirtszelle benötigten Mengen an R5P erhalten bleiben.
Mit anderen Worten: Der Verwendung von TKTL1-Inhibitoren bei der Behandlung von Virusinfektionen und insbesondere auch von SARS-CoV-2-Infektionen liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass die Biosynthese der Virus-Nukleinsäure und damit die Virus-Vermehrung (Virus-Replikation) in der menschlichen Wirtszelle durch TKTL1-Inhibitoren signifikant gehemmt bzw. verringert werden kann, ohne dass das Überleben der Wirtszelle dadurch gefährdet ist und damit auch ohne ein Risiko von Schäden für den menschlichen Körper.
Mit der erfindungsgemäßen Verwendung des TKTL1-Inhibitors wird in den Stoffwechsel der Wirtszelle und damit des gesamten menschlichen Körpers eingegriffen und bewirkt, dass nicht mehr ausreichend Ribose-5-Phosphat-Bausteine (R5P) für die Virus-Replikation zur Verfügung stehen und somit die Virusvermehrung gebremst oder sogar ganz verhindert ist, ohne dass die Zelle und der gesamte menschliche Körper dadurch irreversibel geschädigt werden. Damit geht der Vorteil einher, dass nicht das Virus selbst (direkt) das Wirkstofftarget ist, sondern der Wirtszellmetabolismus, und dass deshalb etwaige Virus-Mutationen den Erfolg der erfindungsgemäßen Anwendung nicht beeinträchtigen.
Die erfindungsgemäße Anwendung der TKTL1-Inhibitoren stellt eine Therapiestrategie dar, die nicht Virus-spezifische Strukturen adressiert, sondern vielmehr Faktoren, die von der infizierten Wirtszelle stammen und vom Virus für seine Vermehrung benötigt werden. Damit steht eine antivirale Therapiestrategie zur Verfügung, die erstens gegen ein breites Spektrum an Viren erfolgsversprechend eingesetzt werden kann, und die zweitens auch bei Mutationen des Virus (Virusmutanten) wirksam sind. Dies erlaubt auch einen Schutz vor Viren, die erst in Zukunft entstehen werden. Die beschriebene Erfindung erlaubt einen Schutz vor Viren, ohne deren RNA- oder DNA-Sequenz zu kennen. Damit wird im Vergleich zu einer Impfung keine Vorlaufzeit für die Entwicklung eines Medikamentes benötigt, so dass sofort eine Therapie existiert. Dies ermöglicht den Schutz der Menschheit und der Säugetiere allgemein vor bestehenden und künftigen Viren und Erkrankungen, die von diesen ausgehen und ausgehen werden. Erstmals ist damit ein Daseinsschutz gegenüber Virenerkrankungen existent.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ein Stoff oder Stoffgemisch, der/das fähig und geeignet ist, spezifisch die Transkription des TKTL1-Gens einzuschränken oder zu unterbinden. Hierfür kommt insbesondere eine Substanz in Betracht, die fähig und geeignet ist, an den TKTL1 -Promotor der Zelle zu binden und dadurch dessen Aktivität einzuschränken oder zu unterbinden. In der Praxis hat sich insbesondere Resveratrol als geeigneter Inhibitor des TKTL1-Promotors erwiesen (Kumar B, 2018).
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ein Stoff oder Stoffgemisch, der/das dazu geeignet ist, spezifisch die Translation der TKTL1-mRNA zu hemmen. Hierfür kommt insbesondere wenigstens eine Substanz in Betracht, die aus der Gruppe der TKTL1-mRNA spezifischen Antisense-Konstrukte, TKTL1-mRNA spezifischen siRNAs, TKTL1-mRNA spezifischen sh-RNAs, TKTL1-mRNA spezifischen Ribozyme und anderen TKTL1-mRNA spezifischen inhibitorischen RNAs ausgewählt ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ein Stoff oder Stoffgemisch, der/das dazu geeignet ist, die Enzymreaktion von TKTL1 und/oder des TKTL1-TKT-Heterodimerkomplexes einzuschränken oder zu unterbinden. Hierfür kommt insbesondere wenigstens eine Substanz in Betracht, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Antithiamin-Verbindungen und anderen Antagonisten, insbesondere von Antagonisten aus der Gruppe der Cofaktoren des Enzyms TKTL1.
In einer in der Praxis erprobten Ausführungsform ist der TKTL1-Inhibitor ein inhibitorisches Thiaminanalogon. Alle bisher bekannten Transketolase-Enzyme einschließlich der TKTL1 sind von Thiamin (Vitamin B1) als Coenzym funktionsabhängig. Thiaminanaloga wie z.B. Oxythiamin wirken als Thiamin-Antagonisten und können zur Hemmung der Transketolasen eingesetzt werden (vgl. EP1354961A1 ).
Ein bevorzugtes inhibitorisches Thiaminanalogon ist die Substanz Benfo-Oxythiamin (B-OT). B-OT ist eine Vorstufe („Pro-Pharmakon“, „Prodrug") von Oxythiamin, ist oral applizierbar und setzt schon kurz nach der Aufnahme in den Säugerorganismus Oxythiamin frei. Über den Blutkreislauf kann B-OT zu allen Zellen in allen Teilen des Körpers gelangen. In-vivo-Pharmakokinetik-Daten haben gezeigt, dass Oxythiamin die Blut-Hirn-Schranke durchdringen kann und folglich auch bei Virusinfektionen im Gehirn mit Aussicht auf Erfolg einsetzbar ist. Die chemische Struktur (Strukturformel) von Benfo-Oxythiamin ist bekannt, z.B. aus EP1354961A1 .
Überraschenderweise wurde gefunden, dass für eine Hemmung der Enzymaktivität von TKTL1 im TKTL1/TKT-Heterodimer im menschlichen Organismus eine Konzentration an B-OT ausreichend ist, die mehr als 1000-fach geringer ist als die von Bojkova et al. (2020) für die menschlichen Caco-2-Zellinien auf Zellkulturebene beschriebene Mindestkonzentration. In ihren Untersuchungen zeigen Bojkova et al. (2020), dass mindestens eine 5 mM Konzentration von B-OT benötigt wird, um die Vermehrung des SARS-CoV-2-Virus in den mit SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zelllinien zu hemmen. Unerwartet und überraschend für den Fachmann hat sich jedoch im Verlauf der Untersuchungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, gezeigt, dass eine Gabe von unter 35 mg B-OT pro Tag und 70 kg Körpergewicht des Patienten, d.h. weniger als 0,5 mg pro kg Körpergewicht pro Tag und dementsprechend weniger als eine 1 nanomolare (1 nM) Konzentration von B-OT pro kg Körpergewicht und pro Tag, ausreichend ist, um die Vermehrung von SARS-CoV-2-Viren im menschlichen Körper zu hemmen.
Deshalb wird erfindungsgemäß im Fall von Benfo-Oxythiamin als TKTL1-Inhibitor das B-OT in einer Dosis/Dosierung von 7 µg bis 430 µg (µg =Mikrogramm), vorzugsweise 14 µg bis 215 µg, besonders bevorzugt 14 µg bis 130 µg B-OT pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag appliziert/verabreicht. Mit anderen Worten: Die Dosis/Dosierung des TKTL1-Inhibitors Benfo-Oxythiamin beträgt pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag 7 µg ≤ µg B-OT ≤ 430 µg, vorzugsweise 14 µg ≤ µg B-OT ≤ 215 µg und besonders bevorzugt 14 µg ≤ µg B-OT ≤ 130 µg.
Generell gilt erfindungsgemäß, dass im Fall von Benfo-Oxythiamin als TKTL1-Inhibitor das Benfo-Oxythiamin in einer Dosis von weniger als 0,5 mg, vorzugsweise weniger als 0,3 mg pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag zur Anwendung kommt.
Die Herstellung von Benfo-Oxythiamin (B-OT) gemäß EU-GMP-Leitfaden für Human- und Tierarzneimittel ist im Stand der Technik etabliert, was die Anwendung von Benfo-Oxythiamin in Säugetieren (z.B. Hunden, Katzen) und insbesondere auch im Menschen erlaubt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der TKTL1-Inhibitor ein Stoff oder Stoffgemisch, der/das dazu geeignet ist, die Bildung (Formierung) des TKTL1-TKT-Heterodimerkomplexes einzuschränken oder zu unterbinden.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen mit Tabellen und Figuren näher erläutert.
In den Figuren zeigen:

1: Die Reduktion der SARS-Cov-2-Viruslast und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung der TKTL1-Translation mittels TKTL1-spezifischer siRNA
2: Die Reduktion der SARS-Cov-2-Viruslast und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung der TKT-Translation mittels TKT-spezifischer siRNA
3: Die Reduktion der Viruslast des humanen Cytomegalievirus (HCMV) und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung der TKTL1-Translation mittels TKTL1-spezifischer siRNA
4: Die Reduktion der Viruslast des humanen Cytomegalievirus (HCMV) und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung der TKT-Translation mittels TKT-spezifischer siRNA
5: Die dosisabhängige Reduktion der SARS-Cov-2-Viruslast und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung des TKTL1-Promotors mittels unterschiedlicher Dosierungen von Resveratrol

Die Reduktion der Viruslast ist jeweils dargestellt als Reduktion um den angegebenen Prozentwert.
Beispiel 1: siRNA-Inhibierung von (a) TKTL1 im Vergleich zur siRNA-Inhibierung von (b) TKT in SARS-CoV-2 infizierten Säugerzellen
SARS-CoV-2 infizierte Caco-2-Zellen wurden mittels einem aus polykationischen und neutralen Lipiden bestehenden Transfektionsreagenz (hier METAFECTENE® von Biontex Laboratories GmbH, München) mit (a) humanen TKTL1-spezifischen siRNAs und (b) humanen TKT-spezifischen siRNAs sowie mit (c) einer siRNA-Negativkontrolle (hier der AllStars negative control siRNA von Qiagen, die laut Herstellerangaben keine Homologie zu irgendeinem bekannten Säugetiergen aufweist) transfiziert. (siRNA bzw. small interfering RNA sind kurze RNA-Moleküle, die keine Proteine codieren, sondern sich mit komplementären einzelsträngigen RNA-Molekülen verbinden und dadurch deren normale Funktion unterbinden.)
Die folgenden siRNA-Sequenzen wurden eingesetzt:

(a) TKTL1 spezifisch:
1. 1. 5'-GGAGUUGCAUGUGGAAUGG-3' (Diaz-Morelli et al. 2016)
2. 2. 5' -UUAUUCACGAAGGAAACACUU- 3' (Heller et al. 2018)
3. 3. 5' -UAAAUAACCAUAGUUUCUGGU- 3' (Heller et al. 2018)
(b) TKT spezifisch: 5'-AAUGAUGGCUGUUGGCUGGTT-3' (Lu et al. 2017)

Das effektive Silencing (d.h. Gen-Stilllegung, Genexpressions-Knockdown mittels RNA-Interferenz) für (a) TKTL1 und (b) TKT in den SARS-CoV-2 infizierten und mit siRNA-transfizierten Caco-2-Zellen wurde anhand von RTqPCR (Reverse Transkriptase quantitative PCR) und Westernblot-Analysen belegt. Zur Bestimmung und Quantifizierung der TKTL1 / TKT-mRNAs sowie der TKTL1 / TKT-Proteine wurden 72 h und 96 h nach Transfektion RTqPCR (Reverse Transkriptase quantitative PCR) und Westernblot-Analysen in den SARS-CoV-2 infizierten und mit siRNA-transfizierten Caco-2-Zellen durchgeführt.
Die Replikationsfähigkeit der SARS-CoV-2-Viren nach Transfektion der Caco-2-Zellen mit den verschiedenen siRNAs wurde mittels Immunfärbung für das SARS-CoV-2 Spike (S)-Protein ermittelt. Anhand der Spike-Protein-Färbung wurde der prozentuale Anteil der Virushemmung in den mit (a) TKTL1 bzw. (b) TKT siRNA-transfizierten Zellen im Vergleich zu den (c) mit der siRNA negativ Kontrolle transfizierten Zellen errechnet.
Die Zellviabilität der mit den verschiedenen siRNA transfizierten, SARS-CoV-2-infizierten Caco-2-Zellen wurden mittels Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT)-Assay erhoben.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 1 und den 1 und 2 dargestellt.
In Abhängigkeit von den verschiedenen siRNA-Sequenzen wurden die folgenden Effekte hinsichtlich Reduktion der Viruslast und Überlebensfähigkeit der SARS-CoV-2-infizierten Caco-2-Zellen im Vergleich zu den mit der AllStars negative control siRNA transfizierten Caco-2-Zellen festgestellt:

In den mit TKTL1-spezifischer siRNA transfizierten Zellen erfolgte (im Vergleich zu Zellen, die mit nicht zielgerichteten Kontrollduplexen transfiziert worden waren) eine Hemmung der TKTL1 Translation. Dabei führte die Hemmung der TKTL1-Translation in einer Stärke, bei der Zellen weiterhin überlebensfähig blieben, zu einer signifikanten Reduktion der Replikationsfähigkeit der SARS-CoV-2 Viren.

Diese Experimente zeigen folglich, dass durch die Hemmung von TKTL1 in einem Ausmaß, das das Überleben der Zelle nicht beeinträchtigt, die Vermehrung des SARS-CoV-2 Virus deutlich gehemmt werden kann.
Die Parallel-Ansätze mit TKT-spezifischer siRNA als Inhibitor der Translation der TKTmRNA zeigen, dass die Hemmung der TKT-Translation zwar ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der Viruslast in den SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zellen führt. Allerdings reduziert sie auch die Lebensfähigkeit der Zellen in erheblichem Umfang. Das zeigt, dass das human-therapeutische Fenster der Hemmung von TKT für eine Hemmung der SARS-CoV-2-Virusvermehrung sich mit der Schädigung der menschlichen Zelle stark überschneidet und damit praktisch nicht vorhanden ist. Mit anderen Worten: das Ausmaß der Hemmung von TKT, das notwendig ist, um eine Hemmung der SARS-CoV-2-Virusvermehrung zu bewirken, ist so groß, dass die menschliche Zelle so stark geschädigt wird, dass diese abstirbt. Bei Verabreichung eines Inhibitors der Transketolase TKT in Dosen, die zu einer Hemmung der SARS-CoV-2-Virusvermehrung führen, würden im menschlichen Körper so starke Schäden entstehen, dass eine therapeutische Nutzung der TKT-Hemmung zwecks Hemmung der SARS-CoV-2-Virenvermehrung im menschlichen Körper ausgeschlossen werden muss.
Fazit: Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung von TKTL1-spezifischer siRNA als Inhibitor der TKTL1 bei SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zellen bewirkt, dass die Vermehrung der Viren in den Wirtszellen unterbunden wird und die Wirtszellen dabei überleben.
Paralleluntersuchungen in vitro mit dem Humanen Cytomegalievirus (HMCV) (siehe hier Beispiel 2) bestätigen, dass mit der Maßnahme der siRNA-Inhibierung von TKTL1 die Virusvermehrung in den Wirtszellen unterbunden werden kann, ohne dabei das Überleben der Wirtszelle zu gefährden.
Beispiel 2: siRNA-Inhibierung von (a) TKTL1 im Vergleich zur siRNA-Inhibierung von (b) TKT in mit dem Humanen Cytomegalievirus (HCMV) infizierten Säugerzellen
Die Effekte einer siRNA-Inhibierung von TKTL1 einerseits und TKT andererseits wurden an mit dem humanen Cytomegalievirus (HCMV) infizierten Caco-2-Zellen untersucht. Zur Infizierung der Caco-2-Zellen wurden, wie bei Dal Pozzo et al. (2008) beschrieben, rekombinante HCMV-EYFP-Viren eingesetzt, die auch für das verstärkt gelb fluoreszierende Protein EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) kodieren. Damit kann die Replikationsfähigkeit des HCM-Virus mittels fluoreszenzbasierten antiviralen Assays (z.B. Dal Pozzo et al., 2008) bestimmt werden.
Die Caco-2-Zellen wurden mit den in Beispiel 1 genannten siRNA-Sequenzen für TKTL1 und TKT transfiziert. Das effektive Silencing wurde anhand von RTqPCR (Reverse Transkriptase quantitative PCR) und Westernblot-Analysen belegt. Diese Analysen wurden 72 h und 96 h nach Transfektion durchgeführt. Die Lebensfähigkeit der HMCV-infizierten Zellen wurde mittels MMT-Assay bestimmt.
Die Replikationsfähigkeit der HCM-Viren nach Transfektion der Caco-2-Zellen mit den verschiedenen siRNAs wurde mittels fluoreszenzbasiertem antiviralem Assay (Dal Pozzo et al 2008) bestimmt. Anhand der EYFP-Signale der rekombinanten Viren wurde der prozentuale Anteil der Virushemmung in den mit (a) TKTL1 bzw. (b) TKT siRNA-transfizierten Zellen im Vergleich zu den (c) mit der siRNA negativ Kontrolle transfizierten Zellen errechnet. Die Ergebnisse sind in den 3 und 4 dargestellt.
Diese Ergebnisse bestätigen die in Beispiel 1 mit SARS-CoV-2 erhaltenen Ergebnisse auch für HMCV-infizierte Zellen: Eine Inhibition von TKTL1 mittels TKTL1-spezifischer siRNA als Inhibitor bewirkt, dass die Vermehrung der HMC-Viren in den Wirtszellen unterbunden wird und die Wirtszellen dabei überleben. Hingegen führt eine TKT-Inhibition mittels TKT-spezifischer siRNA zwar ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der Viruslast in den HMCV infizierten Caco-2-Zellen, allerdings bei erheblich herabgesetzter Lebensfähigkeit der Zellen.
Beispiel 3: Verwendung von B-OT als TKTL1-Inhibitor in mit dem Humanen Cytomegalievirus (HCMV) infizierten Säugerzellen
Weiterhin wurde die Empfindlichkeit der HCMV-Replikation gegenüber B-OT in humanen Säugerzellen untersucht. Dazu wurden Experimente wie in der Arbeit von Dal Pozzo et al. 2008 beschrieben mit B-OT durchgeführt: Humane embryonale Lungenfibroblasten (HEL) wurden mit rekombinanten HCMV-EYFP-Viren infiziert, die zusätzlich für das verstärkt gelb fluoreszierende Protein (enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) kodieren (Dal Pozzo F, et al., 2008). Als Maß für die Virenvermehrung nach Infektion mit HCMV-EYFP wurde die Emission des EYFP-Proteins gemessen (Anregungswellenlänge: 485 nm / Emission: 530 nm). Dabei wurde die automatisiert gemessene, konstante und niedrige zellassoziierte Hintergrundemission von dem Fluoreszenz-Emissionswert abgezogen Zur Überprüfung des antiviralen Effektes von B-OT wurden die HCMV-EYFP-infizierten Zellen für 48 h mit unterschiedlichen B-OT-Konzentrationen (0 bis 20 mM B-OT) inkubiert. Es zeigte sich eine dosisabhängige Inhibition der Fluoreszenz (als Maß für die Virenvermehrung). Die erforderliche Substanzkonzentration, die die EYFP-Emission im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen (0 mM B-OT) um die Hälfte reduziert, wurde als die 50%ige Hemmkonzentration (IC50) im fluoreszenzbasierten antiviralen Assay definiert. Der hier ermittelte IC50 lag bei 0,5 mM B-OT.
Beispiel 4: Verwendung von B-OT als TKTL1-Inhibitor zwecks Hemmung der SARS-CoV-2-Virenvermehrung im menschlichen Körper
Aus Zhu et al 2020 ist bekannt, dass bei Patienten mit SARS-CoV-2-Infektionen und Covid-19-Erkrankungen die Beurteilung des Schweregrades der Erkrankung anhand der klinischen Werte von immun-entzündlichen Markern erfolgen kann. Hohe Werte für das proinflammatorische Zytokin IL-6 und/oder das C-reaktive Protein (CRP) sprechen für eine schwere Erkrankung und einen stark risikobehafteten Krankheitsverlauf. Das proinflammatorische Zytokin IL-6 spielt aufgrund seiner pleiotropen Eigenschaft eine Schlüsselrolle bei dem für Patienten mit SARS-CoV-2 Infektionen beschriebenen „Zytokinsturm“. Seine konstitutive Expression verursacht Organschäden und starke Schmerzen (Zhu et al 2020; Gupta et al. 2020).
Im Rahmen von individuellen Heilversuchen bei hospitalisierten Patienten mit SARS-CoV-2 Infektionen und COVID-19 Erkrankung wurde unerwartet und überraschend für den Fachmann gefunden, dass bei einer täglichen Gabe von unter 20 mg B-OT pro 70 kg Körpergewicht des Patienten, d.h. weniger als 0,3 mg pro kg Körpergewicht und dementsprechend weniger als eine 1 nanomolare (1 nM) Konzentration von B-OT pro kg Körpergewicht, im Verlauf von 7 Tagen nicht nur eine mittels PCR nachgewiesene signifikante Reduktion der Viruslast, sondern auch eine deutliche Reduktion der Entzündungsparameter C-reaktives Protein (CRP) und Interleukin-6 (IL-6) festgestellt wurde: unter 7-tägiger B-OT-Therapie fiel der CRP-Wert im Durchschnitt von 77 pg/ml auf 5 pg/ml, während der IL-6 Wert von durchschnittlich 63 pg/ml auf 5 pg /ml fiel.
Beispiel 5: Verwendung von Resveratrol als TKTL1-Inhibitor zwecks Hemmung der Virenvermehrung in SARS-CoV-2-infizierten Caco-2-Zellen
Die organische Verbindung Resveratrol (Summenformel C₁₄H₁₂O₃) aus der Gruppe der Polyphenole ist dem Fachmann als Inhibitor des TKTL1-Promotors bekannt. In Kumar B. (2018) ist beschrieben, dass eine Behandlung von HeLa-Zellen mit 50 µM Resveratrol für 48 h im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu einer 75%igen Reduktion der TKTL1-Promotoraktivität führte. Gleichzeitig führte dies allerdings auch zu einer signifikanten Abnahme der Lebensfähigkeit der HeLa-Zellen. Bei den Untersuchungen im Rahmen dieses Beispiels 5 wurde Resveratrol eingesetzt, um in SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zellen die Virusreplikation zu unterbinden. Dazu wurden die SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zellen für 24 h mit verschiedenen Resveratrol-Konzentrationen behandelt. Um den Effekt der reduzierten Promotoraktivität auf die TKTL1-mRNA-Produktion zu bestätigen, wurde eine RTqPCR durchgeführt. Die Ergebnisse dieser RTqPCR zeigen eine Reduktion der TKTL1-mRNA in Abhängigkeit von der eingesetzten Resveratrol-Konzentration: Je höher die Konzentration desto stärker die Reduktion. Weiterhin wurde - wie hier in Beispiel 1 beschrieben - die Überlebensfähigkeit der Caco-2-Zellen mittels MTT-Assay und die Replikationsfähigkeit der SARS-CoV-2 Viren mittels Immunfärbung für das SARS-CoV-2 Spike (S)-Protein ermittelt. Als Kontrolle dienten SARS-CoV-2-infizierte Caco-2-Zellen ohne Resveratrol-Behandlung. Es zeigte sich, dass die Replikationsfähigkeit der SARS-CoV-2-Viren unter Resveratrol-Behandlung im Vergleich zur Kontrolle mit steigender Resveratroldosis abnahm, während die Lebensfähigkeit der SARS-CoV-2-infizierten Caco-2-Zellen in ausreichendem Maß bestehen blieb. So nahm unter einer Behandlung mit 25 µM Resveratrol für 48 h die Replikationsfähigkeit der SARS-CoV-2 Viren im Vergleich zur Kontrolle um 68% ab, während die Überlebensfähigkeit der Caco-2-Zellen 93% betrug. Die Ergebnisse sind in der 5 graphisch dargestellt.
Zitierte Nicht-Patent-Literatur:

Bojkova D, Costa R, Bechtel M, Ciesek S, Michaelis M, Cinatl jr. J (2020): Targeting pentose phosphate pathway for SARS-CoV-2 therapy. bioRxiv preprint https://doi.org/10.1101/2020.08.19.257022
Dal Pozzo F, Andrei G, Daelemans D, Winkler M, Piette J, De Clercq E, Snoeck R, (2008): Fluorescence-based antiviral assay for the evaluation of compounds against vaccinia virus, varicella zoster virus and human cytomegalovirus. Journal of Virological Methods 151 66-73. doi: 10.1016/j.jviromet.2008.03.025
Diaz-Moralli S, Aguilar E, Marin S, Coy JF, Dewerchin M, Antoniewicz MR, Meca-Cortes O, Notebaert L, Ghesquière B, Eelen G, Thomson TM, Carmeliet P, Cascante M. (2016): A key role for transketolase-like 1 in tumor metabolic reprogramming. Oncotarget 7(32):51875-51897; doi: 10.18632/oncotarget. 10429; PMID: 27391434.
Gupta K. K., Khan M. A, Singh S. K (2020): Constitutive Inflammatory Cytokine Storm: A Major Threat to Human Health. Journal of Interferon & Cytokine Research. Jan 2020.19-23. http://doi.org/10.1089/jir.2019.0085
Heller S, Maurer GD, Wanka C, Hofmann U, Luger AL, Bruns I, Steinbach JP, Rieger J. (2018): Gene Suppression of Transketolase-Like Protein 1 (TKTL1) Sensitizes Glioma Cells to hypoxia and Ionizing Radiation. Int J Mol Sci. 2018 Jul 25;19(8):2168.
Kumar B (2018): Resveratrol inhibits expression of cancer-specific pentose phosphate pathway enzyme TKTL1. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 11:332. DOI: 10.22159/ajpcr.2018.v11i6.25021
Li Y, Yao CF, Xu FJ, Qu YY., Li JT, Lin Y, Cao ZL, Lin PC, Xu W, Zhao SM, & Zhao JY (2019): APC/C^CDH1 synchronizes ribose-5-phosphate levels and DNA synthesis to cell cycle progression. Nature Communications (2019) 10:2502; https://doi.org/10.1038/s41467-019-10375-x Lu H, Zhu H. (2017): Effect of siRNA-mediated gene silencing of transketolase on A549 lung cancer cells. Oncol Lett. 2017; 14(5): 5906-5912. DOI: 10.3892/ol.2017.6916.
Zhu Z, Cai T, Fan L, Lou K, Hua X, Huang Z, Gao G. (2010): Clinical value of immuneinflammatory parameters to assess the severity of coronavirus disease 2019. Int J Infect Dis. 2020 Jun; 95: 332-339. http://doi: 10.1016/j.ijid.2020.04.041

	siRNA TKTL1 (a1)	siRNA TKTL1 (a2)	siRNA TKTL1 (a3)	siRNA TKT (b)
Hemmung der TKTL1-Translation*	80%	78%	83%	3%
Hemmung der TKT-Translation*	1%	2%	1%	96%
Reduktion der Viruslast*	98%	96%	97%	60%
Überlebensfähigkeit der Caco-2 -Zellen*	97%	98%	91%	10%

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1354961 A1 [0018, 0019]

Claims

Inhibitor der Transketolase TKTL1 zur Anwendung bei der Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere RNA-Virusinfektionen und insbesondere auch von SARS-CoV-2-Infektionen.
Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das fähig und geeignet ist, spezifisch die Transkription des TKTL1-Gens einzuschränken oder zu unterbinden.
Inhibitor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das fähig und geeignet ist, an den TKTL1-Promotor der Zelle zu binden und dadurch dessen Aktivität einzuschränken oder zu unterbinden.
Inhibitor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass er Resveratrol ist.
Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das dazu geeignet ist, spezifisch die Translation der TKTL1-mRNA zu hemmen.
Inhibitor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: Antisense-Konstrukte, siRNAs, Ribozyme und andere inhibitorische RNAs, jeweils spezifische für TKTL1-mRNA.
Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das dazu geeignet ist, die Enzymreaktion von TKTL1 und/oder des TKTLI-TKT-Heterodimerkomplexes einzuschränken oder zu unterbinden.
Inhibitor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: Antithiamin-Verbindungen und andere Antagonisten von Cofaktoren von TKTL1-Polypeptiden.
Inhibitor nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es ein inhibitorisches Thiaminanalogon, insbesondere Oxythiamin, Benfo-Oxythiamin und/oder ein Benfo-Oxythiamin-Analogon ist, wobei im Fall von Benfo-Oxythiamin dieses in einer Dosis von 7 µg bis 430 µg, vorzugsweise 14 µg bis 215 µg, besonders bevorzugt 14 µg bis 130 µg Benfo-Oxythiamin pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag zur Anwendung kommt.
Inhibitor nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das inhibitorische Thiaminanalogon der Wirkstoff Benfo-Oxythiamin ist und in einer Dosis von 7 µg bis 430 µg, vorzugsweise 14 µg bis 215 µg, besonders bevorzugt 14 µg bis 130 µg Benfo-Oxythiamin pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag zur Anwendung kommt.
Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das fähig und geeignet ist, die Bildung des TKTL1-TKT-Heterodimerkomplexes einschränken oder zu unterbinden.
Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei im Fall von Benfo-Oxythiamin als TKTL1-Inhibitor das Benfo-Oxythiamin in einer Dosis von 7 µg bis 430 µg, vorzugsweise 14 µg bis 215 µg, besonders bevorzugt 14 µg bis 130 µg Benfo-Oxythiamin pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag zur Anwendung kommt.
Inhibitor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosis pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag 14 µg bis 215 µg Benfo-Oxythiamin, vorzugsweise 14 µg bis 130 µg Benfo-Oxythiamin beträgt.