WO2022218471A1 - Tktl1 inhibitoren für die antivirale therapie - Google Patents

Tktl1 inhibitoren für die antivirale therapie Download PDF

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WO2022218471A1
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Johannes F. Coy
Ralf SCHIERL
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TAVARGENIX GmbH
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to inhibitors of the transketolase TKTL1 (hereinafter referred to as “TKTL1 inhibitor” or “TKTL1 inhibitors”) for use in antiviral therapy, in particular the therapy of RNA viruses and in particular also of SARS-CoV-2 infections and Covid -19 diseases.
  • TKTL1 inhibitor inhibitors of the transketolase TKTL1
  • TKTL1 inhibitors for use in antiviral therapy, in particular the therapy of RNA viruses and in particular also of SARS-CoV-2 infections and Covid -19 diseases.
  • SARS-CoV-2 corona virus
  • SARS-CoV-2 In addition to the asymptomatic courses of infection, there are many people suffering from SARS-CoV-2 who have flu-like symptoms such as cough, sore throat, diarrhea or fever. In addition, in contrast to the flu, there are also symptoms such as loss of taste and other symptoms or failures associated with the function of nerve cells. Such neurologically associated symptoms such as limitations in cognitive performance, tiredness, chronic fatigue syndrome, which manifest themselves long after the acute SARS-CoV-2 infection has disappeared, represent a major health problem for those infected. A subgroup of SARS -CoV-2 infected people also develop pneumonia, sometimes bilateral pneumonia. Multiple organ failure resulting in death can also result from a SARS-CoV-2 infection.
  • Such severe courses of a SARS-CoV-2 infection often lead to an overreaction, ie an excessive response of the immune system, in which, for example, immune cells migrate into the lungs and inhibit their functionality.
  • Drugs that inhibit the activity of the immune system such as dexamethasone, show positive effects on the course of the disease. Nevertheless, a high proportion of those patients who have a severe course of SARS-CoV-2 infection die. So far none are sufficient Effective therapies are available that can be used to prevent or treat severe courses of Covid-19 disease.
  • virus-specific therapy strategies based on virus-specific structures can quickly fail, because among the numerous virus mutants that occur naturally, some have also developed that are insensitive to the active substances in question or to vaccines. In principle, it is also not possible to predict which virus mutation or which virus will appear next and pose a danger to humans in the future. A timely development and planning of virus-specific therapy strategies is therefore very difficult or almost impossible.
  • the genome of viruses consists of either RNA or DNA.
  • the SARS-CoV-2 virus belongs to the RNA viruses.
  • RNA viruses After infection and release of their viral RNA in a cell, RNA viruses depend on the replication (multiplication) of this viral RNA taking place quickly and in the largest possible quantity. Ribose-5-phosphate (R5P) from the host cell is required for this replication.
  • R5P Ribose-5-phosphate
  • DNA viruses also need R5P for their propagation in the host cell, because deoxyribose-5-phosphate, an essential component of their DNA, is produced from ribose-5-phosphate.
  • R5P is provided via the pentose phosphate (PPP) pathway. According to conventional wisdom, this can be carried out both via the oxidative part and via the non-oxidative part of the PPP.
  • Transketolases are key enzymes of the PPP. They form dimers and are activated by the binding of a molecule of thiamine diphosphate and a divalent cation. This transketolase enzyme activity can be altered through the formation of a heterodimer from a TKT and a transketolase-like-1 (TKTL1) protein (Li et al., 2019).
  • Li et al. describe that the formation of TKTLl-TKT heterodimers allows cells to reprogram R5P metabolism when more R5P is needed, which is primarily the case for nucleotide and DNA synthesis during the S phase of the cell is, increased TKTL1 levels lead to increased formation of TKTLl-TKT heterodimers. These promote R5P production.
  • Li et al. show that the basic R5P service of a cell is provided via the TKT-TKT homodimer.
  • an “intracellular turbo program” is started via the expression of TKTL1 and the resulting TKT-TKTL1 heterodimer formation, which promotes increased formation of R5P in order to enable cell division and thus cell proliferation .
  • the object of the present invention is to provide an agent for combating viral infections, in particular RNA virus infections, which is also particularly suitable for combating SARS-CoV-2 viruses.
  • TKTL1 inhibitor at least one inhibitor of the transketolase TKTL1 (hereinafter referred to as “TKTL1 inhibitor”) for use in the medical-therapeutic treatment of virus infections (antiviral therapy), in particular the treatment (therapy) of RNA - Viral infections and in particular the treatment (therapy) of SARS-CoV-2 infections and associated diseases such as COVID-19.
  • TKTL1 inhibitor at least one inhibitor of transketolase TKTL1 (“TKTL1 inhibitor” for short) as the active ingredient of an antiviral and in particular virostatic (virus-inhibiting) drug.
  • inhibitor stands here in the context for a (i.e. in principle any) agent and in particular a (any) substance, namely substance or mixture of substances including pharmaceutical compositions, which is suitable for reducing the activity of TKTL1 to cause (induce) a polypeptide directly or indirectly in an individual or in cells of an individual.
  • means or material substances include in particular:
  • Inhibitors of the transcription of the TKTL1 gene for example substances that bind to the TKTL1 promoter and thereby limit or prevent its activity, such as resveratrol, which inhibits the TKTL1 promoter in a dose-dependent manner.
  • Inhibitors of the translation of TKTL1 mRNA for example inhibitory RNAs such as antisense constructs, siRNAs, sh-RNAs, ribozymes.
  • Inhibitors of the enzyme reaction of TKTL1 and/or the TKTL1-TKT heterodimer complex in particular drugs that inhibit this enzyme reaction restrict or prevent.
  • drugs that inhibit this enzyme reaction restrict or prevent.
  • These also include in particular antagonists of cofactors of TKTL1 polypeptides such as antithiamine compounds,
  • Inhibitors of the formation of the TKTL1-TKT heterodimer complex in particular active substances which restrict or prevent the formation of the heterodimer.
  • RNA is synonymous here for ribonucleic acid(s).
  • DNA is synonymous here for deoxyribonucleic acid.
  • the present invention is based on the surprising finding that inhibition of the enzyme TKTL1 and thus inhibition of the enzyme activity of the TKTL1/TKT heterodimer in human cells results in the proliferation (replication) of the virus RNA or virus DNA being significantly inhibited , but the host cell itself remains capable of surviving and the human organism suffers no permanent and irreversible damage.
  • TKTL1 and/or the TKTL1/TKT heterodimer would be of a magnitude that, according to Bojkova et al. (2020) is required to slow down or prevent virus multiplication, leads to inhibition of cell division and thus to serious side effects including death.
  • transketolases and in particular TKTL1 as a key enzyme in the regulation of cell cycle and cell division, are considered to be fundamentally relevant for the viability of cells, they appeared unsuitable as possible targets for an antiviral therapy strategy according to current teaching, because serious side effects were to be expected.
  • TKTL1 inhibitors in the treatment of viral infections and in particular SARS-CoV-2 infections is based on the surprising finding that the biosynthesis of the virus nucleic acid and thus the virus replication (virus replication) in the human host cell by TKTL1- Inhibitors can be significantly inhibited or reduced without endangering the survival of the host cell and thus without any risk of damage to the human body.
  • TKTL1 inhibitor interferes with the metabolism of the host cell and thus the entire human body and causes insufficient ribose-5-phosphate building blocks (R5P) to be available for virus replication and thus the virus Multiplication is slowed down or even completely prevented without irreversibly damaging the cell and the entire human body.
  • R5P ribose-5-phosphate building blocks
  • the use according to the invention of the TKTL1 inhibitors represents a therapy strategy which does not address virus-specific structures but rather factors which originate from the infected host cell and are required by the virus for its multiplication.
  • an antiviral therapy strategy is available which, firstly, can be successfully used against a broad spectrum of viruses and, secondly, which is also effective in the case of mutations in the virus (virus mutants).
  • This also allows protection against viruses that will only emerge in the future.
  • the invention described allows protection against viruses without knowing their RNA or DNA sequence. In comparison to a vaccination, no lead time is required for the development of a drug, so that a therapy is available immediately. This enables the protection of civilization and mammals in general from existing and future viruses and diseases that emanate and will emanate from them. For the first time there is a protection of existence against viral diseases.
  • the inhibitor is a substance or mixture of substances that is capable and suitable for specifically restricting or preventing the transcription of the TKTL1 gene.
  • a substance is particularly suitable which is able and suitable to bind to the TKTL1 promoter of the cell and thereby restrict or prevent its activity.
  • resveratrol in particular has proven to be a suitable inhibitor of the TKTL1 promoter (Kumar B, 2018).
  • the inhibitor is a substance or mixture of substances which is/are suitable for specifically inhibiting the translation of the TKTL1 mRNA.
  • at least one substance is particularly suitable that is selected from the group of TKTL1 mRNA-specific antisense constructs, TKTL1 mRNA-specific siRNAs, TKTL1 mRNA-specific sh RNAs, TKTL1 mRNA-specific ribozymes and other TKTL1 mRNA-specific inhibitory RNAs .
  • the inhibitor is a substance or mixture of substances which is/are suitable for restricting or preventing the enzyme reaction of TKTL1 and/or the TKTL1-TKT heterodimer complex.
  • At least one substance is particularly suitable for this purpose, which is selected from the group of antithiamine compounds and other antagonists, in particular from antagonists from the group of cofactors of the enzyme TKTL1.
  • the TKTL1 inhibitor is an inhibitory thiamine analog. All previously known transketolase enzymes, including TKTL1, depend on the function of thiamine (vitamin Bl) as a coenzyme. Thiamine analogs such as oxythiamine act as thiamine antagonists and can be used to inhibit transketolases (cf. EP1354961A1).
  • a preferred inhibitory thiamine analogue is the substance benfo-oxythiamine (B-OT).
  • B-OT is a precursor ("prodrug", prodrug") of oxythiamine, can be administered orally and releases oxythiamine shortly after absorption into the mammalian organism. B-OT can reach all cells in all parts of the body via the bloodstream.
  • oxythiamine can penetrate the blood-brain barrier and consequently can also be used successfully in viral infections in the brain
  • the chemical structure (structural formula) of benfo-oxythiamine is known, e.g. from EP1354961A1.
  • Bojkova et al. (2020) described the minimum concentration for the human Caco-2 cell lines at the cell culture level. In their investigations, Bojkova et al. (2020) that at least a 5 mM concentration of B-OT is required to inhibit SARS-CoV-2 virus proliferation in the SARS-CoV-2 infected Caco-2 cell lines.
  • the present invention was based shown that administration of less than 35 mg B-OT per day and 70 kg body weight of the patient, ie less than 0.5 mg per kg body weight per day and accordingly less than a 1 nanomolar (1 nM) concentration of B- OT per kg body weight and per day is sufficient to inhibit the multiplication of SARS-CoV-2 viruses in the human body.
  • the dose/dosage of the TKTL1 inhibitor benfo-oxythiamine is per kg of patient body weight and per day 7 pg ⁇ pg B-OT ⁇ 430 pg, preferably 14 pg ⁇ pg B-OT ⁇ 215 pg and more preferably 14 pg ⁇ pg B-OT ⁇ 130 pg.
  • the benfo-oxythiamine in the case of benfo-oxythiamine as a TKTL1 inhibitor, is used in a dose of less than 0.5 mg, preferably less than 0.3 mg per kg of the patient's body weight and per day.
  • B-OT benfo-oxythiamine
  • the TKTL1 inhibitor is a substance or mixture of substances which is suitable for restricting or preventing the formation (formation) of the TKTL1-TKT heterodimer complex.
  • Fig. 1 The reduction in SARS-Cov-2 viral load and survival of the Caco-2 cells after inhibition of TKTL1 translation using TKTL1 -specific siRNA
  • Fig. 2 The reduction in SARS-Cov-2 viral load and survival of the Caco-2 cells after inhibition of TKT translation using TKT-specific siRNA
  • Fig. 3 The reduction in the viral load of the human cytomegalovirus (HCMV) and survival of the Caco-2 cells after inhibition of TKTL1 translation using TKTL1 -specific siRNA
  • Fig. 4 The reduction in the viral load of the human cytomegalovirus (HCMV) and survival of Caco-2 cells after inhibition of TKT translation using TKT-specific siRNA
  • Fig. 5 The dose-dependent reduction in SARS-Cov-2 viral load and survival of Caco-2 cells after inhibition of the TKTL1 promoter using different doses of resveratrol
  • Example 1 siRNA inhibition of (a) TKTL1 compared to siRNA inhibition of (b) TKT in SARS-CoV-2 infected mammalian cells
  • SARS-CoV-2 infected Caco-2 cells were transfected with (a) human TKTL1 -specific siRNAs and (b) human TKT-specific siRNAs using a transfection reagent consisting of polycationic and neutral lipids (here METAFECTENE® from Biontex Laboratories GmbH, Kunststoff). and transfected with (c) an siRNA negative control (here the AllStars negative control siRNA from Qiagen, which according to the manufacturer does not show any homology to any known mammalian gene).
  • siRNA negative control siRNA here the AllStars negative control siRNA from Qiagen, which according to the manufacturer does not show any homology to any known mammalian gene.
  • siRNA or small interfering RNA, are short RNA molecules that do not code for proteins, but combine with complementary single-stranded RNA molecules, thereby preventing their normal function.
  • siRNA sequences were used:
  • TKT specific 5'-AAUGAUGGCUGUUGGCUGGTT-3'
  • RTqPCR reverse transcriptase quantitative PCR
  • RTqPCR reverse transcriptase quantitative PCR
  • Western blot analyzes 72 h and 96 h after transfection in the SARS-CoV-2 infected and siRNA-transfected Caco -2 cells performed.
  • the ability of the SARS-CoV-2 viruses to replicate after transfection of the Caco-2 cells with the various siRNAs was determined using immunostaining for the SARS-CoV-2 spike (S) protein. Using spike protein staining, the percentage of virus inhibition in cells transfected with (a) TKTL1 or (b) TKT siRNA compared to (c) cells transfected with the siRNA negative control was calculated.
  • the cell viability of the SARS-CoV-2-infected Caco-2 cells transfected with the various siRNAs was determined using a methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.
  • MTT methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide
  • TKTL1-specific siRNA In the cells transfected with TKTL1-specific siRNA (compared to cells transfected with non-targeted control duplexes) there was an inhibition of TKTL1 translation.
  • the inhibition of TKTL1 translation to a level at which cells remained viable led to a significant reduction in the replication ability of the SARS-CoV-2 viruses.
  • HMCV human cytomegalovirus
  • Example 2 siRNA inhibition of (a) TKTL1 compared to siRNA inhibition of (b) TKT in human cytomegalovirus (HCMV) infected mammalian cells
  • HCMV human cytomegalovirus
  • the Caco-2 cells were transfected with the siRNA sequences for TKTL1 and TKT mentioned in Example 1. Effective silencing was demonstrated using RTqPCR (reverse transcriptase quantitative PCR) and western blot analysis. These analyzes were carried out 72 h and 96 h after transfection. The viability of the HMCV-infected cells was determined using the MMT assay.
  • the ability of the HCM viruses to replicate after transfection of the Caco-2 cells with the various siRNAs was determined using a fluorescence-based antiviral assay (Dal Pozzo et al 2008). Based on the EYFP signals of the recombinant viruses, the percentage of virus inhibition in the cells transfected with (a) TKTL1 or (b) TKT siRNA compared to the (c) cells transfected with the siRNA negative control was calculated. The results are shown in Figures 3 and 4.
  • IC50 50% inhibitory concentration
  • Example 4 Use of B-OT as a TKTLl inhibitor for the purpose of inhibiting the SARS-CoV-2 virus replication in the human body
  • CRP C-reactive protein
  • IL-6 interleukin-6
  • the organic compound resveratrol (empirical formula C14H12O3) from the group of polyphenols is known to those skilled in the art as an inhibitor of the TKTL1 promoter.
  • Kumar B. (2018) describes that treatment of HeLa cells with 50 mM resveratrol for 48 h led to a 75% reduction in TKTL1 promoter activity compared to untreated cells. At the same time, however, this also led to a significant decrease in the viability of the HeLa cells.
  • resveratrol was used to prevent virus replication in SARS-CoV-2 infected Caco-2 cells.
  • the SARS-CoV-2 infected Caco-2 cells were treated with different concentrations of resveratrol for 24 h.
  • RTqPCR was performed. The results of this RTqPCR show a reduction in TKTLl mRNA depending on the resveratrol concentration used: the higher the concentration, the greater the reduction.
  • Example 1 the survivability of the Caco-2 cells was determined using the MTT assay and the replication ability of the SARS-CoV-2 viruses using immunostaining for the SARS-CoV-2 spike (S) protein. SARS-CoV-2-infected Caco-2 cells without resveratrol treatment served as controls.
  • Diaz-Moralli S Diaz-Moralli S, Aguilar E, Marin S, Coy JF, Dewerchin M, Antoniewicz MR, Meca-Cortes O, Notebaert L, Ghesquiere B, Eelen G, Thomson TM, Carmeliet P, Cascante M. (2016):
  • TKTL1 Transketolase-Like Protein 1

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Abstract

Wenigstens ein Inhibitor der Transketolase TKTL1 wird bei Patienten zur Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere RNA-Virusinfektionen und insbesondere auch von SARS-CoV-2-Infektionen eingesetzt.

Description

TKTL1 Inhibitoren für die antivirale Therapie
B e s chre ib un g
Die Erfindung betrifft Inhibitoren der Transketolase TKTL1 (im folgenden kurz "TKTL1- Inhibitor" oder "TKTL1 -Inhibitoren") zur Anwendung bei der antiviralen Therapie, insbesondere der Therapie von RNA-Viren und insbesondere auch von SARS-CoV-2- Infektionen und Covid-19-Erkrankungen.
Im Jahr 2019 wurde in China ein neues Corona-Virus mit dem Namen SARS-CoV-2 beschrieben, das Menschen infiziert und sich schnell ausbreitet. Ein Teil der infizierten Menschen entwickelt eine Erkrankung, die als COVID-19 bezeichnet wird, und bei der es zu einer Schädigung der Lunge kommt, die auch zu einem Sauerstoffdefizit und Atemnot fuhrt. Im März 2020 erklärte die WHO den Ausbruch der SARS-CoV-2-Infektionen zur Pandemie. Eine Infektion mit dem SARS-CoV-2-Virus kann im Gegensatz zur Infektion mit Grippeviren auch ohne Symptome (asymptomatisch) verlaufen, was dazu fuhrt, dass scheinbar gesunde Menschen andere Menschen mit SARS-CoV-2-Viren anstecken können. Dies erschwert massiv die Eindämmung von SARS-CoV-2-Infektionen. Neben den asymptomatischen Infektionsverläufen gibt es viele an SARS-CoV-2-erkrankte Menschen, die grippeähnliche Symptome wie Husten, Halsschmerzen, Durchfall oder Fieber aufweisen. Daneben gibt es im Gegensatz zur Grippe auch Symptome wie den Verlust des Geschmackssinns und andere mit der Funktion von Nervenzellen assoziierte Symptome oder Ausfälle. Solche neurologisch assoziierten Symptome wie z.B. Einschränkungen der kognitiven Leistungsfähigkeit, Müdigkeit, Chronisches Fatigue- Syndrom, die sich auch noch lange nach dem Verschwinden der aktuten SARS-CoV-2-Infektion manifestieren, stellen ein großes gesundheitliches Problem von Infizierten dar. Eine Subgruppe von SARS-CoV-2-Infizierten entwickelt auch Lungenentzündungen, teilweise beidseitige Lungenentzündungen. Auch multiples Organversagen mit Todesfolge kann aus einer SARS-CoV-2-Infektion resultieren. Bei solchen schweren Verläufen einer SARS-CoV-2-Infektion kommt es oft zu einer Überreaktion, d.h. einer zu starken Antwort des Immunsystems, bei der z.B. Immunzellen in die Lunge einwandem und deren Funktionalität hemmen. Medikamente, die die Aktivität des Immunsystems hemmen, wie z.B. Dexamethason, zeigen positive Effekte auf diesen Krankheitsverlauf. Trotzdem verstirbt ein hoher Anteil derjenigen Patienten, die einen schweren Verlauf einer SARS-CoV-2-Infektion haben. Bislang sind keine ausreichend wirksamen Therapien verfügbar, die für die Verhinderung oder die Therapie von schweren Verläufen einer Covid-19-Erkrankung eingesetzt werden können.
Auch im Fall vieler anderer Viruserkrankungen stehen zur Bekämpfung der Virusinfektion bei Patienten bisher keine ausreichend effektiven Wirkstoffe zur Verfügung. Beispielsweise gibt es bisher keine ausreichende Therapie für das durch Viren ausgelöste Dengue Fieber oder schwere Formen einer Herpes-Infektion des Auges, die zur Erblindung führen.
Die meisten der im Stand der Technik bekannten therapeutischen Bekämpfungsstrategien bei viralen Erkrankungen zielen darauf ab, das Virus selbst unschädlich zu machen, z.B. prophylaktische Therapien mittels Impfstoff oder lindernde und heilende Therapien mittels Verabreichung von antiviralen Wirkstoffen. Diesen Strategien gemein ist, dass sie Virus- spezifische Strukturen (Epitope / Enzyme) angreifen. Allerdings können sich Viren aufgrund ihrer Fähigkeit, innerhalb kürzester Zeit ihr Genom zu verändern, sehr schnell an neue Umweltbedingungen anpassen. Das verdeutlichen aktuell die neuen Varianten des SARS- CoV2-Virus, die sich besser ausbreiten können oder sich besser gegenüber dem körpereigenem Immunsystem schützen können oder besser gegenüber Impfungen geschützt sind oder gar eine Zunahme der Letalität der Infektionen zur Folge haben. Deshalb können Therapiestrategien auf der Basis Virus-spezifischer Strukturen schnell versagen, weil sich unter den natürlicherweise und zahlreich entstehenden Virus-Mutanten auch solche entwickelt haben, die gegenüber den betreffenden Wirkstoffen oder bezüglich Impfstoffen unempfindlich sind. Grundsätzlich gilt außerdem, dass sich nicht Vorhersagen lässt, welche Virusmutation oder welches Virus als nächstes neu auftreten und zukünftig eine Gefahr für Menschen darstellen wird. Eine rechtzeitige Entwicklung und Planung Virus- spezifischer Therapiestrategien ist daher sehr schwierig bis nahezu unmöglich.
Das Genom von Viren besteht entweder aus RNA oder aus DNA. Das SARS-CoV-2-Virus gehört zu den RNA- Viren.
RNA-Viren sind nach Infektion und Freisetzung ihrer Viren-RNA in einer Zelle darauf angewiesen, dass die Replikation (V ervielfaltigung) dieser Virus-RNA schnell und in möglichst großer Menge erfolgt. Für diese Replikation wird zwingend Ribose-5-Phosphat (R5P) aus der Wirtszelle benötigt.
Auch DNA-Viren benötigen für ihre Vermehrung in der Wirtszelle R5P, denn Desoxyribose- 5-Phosphat als wesentlicher Baustein ihrer DNA wird aus Ribose-5-Phosphat hergestellt. Somit sind sowohl RNA-Viren als auch DNA-Viren von der R5P-Synthese der Wirtszelle abhängig. In Säugerzellen wird R5P über den Pentose-Phosphat-Stoffwechselweg (PPP) bereitgestellt. Laut gängiger Lehrmeinung kann dies sowohl über den oxidativen Teil als auch über den nicht-oxidativen Teil des PPP durchgefuhrt werden.
Transketolasen (TKT) sind Schlüsselenzyme des PPP. Sie bilden Dimere und werden durch die Bindung eines Moleküls Thiamindiphosphat und eines zweiwertigen Kations aktiviert. Diese Transketolase-Enzymaktivität kann durch die Bildung eines Heterodimers aus einem TKT und einem Transketolase-like-1 (TKTL1) Protein verändert werden (Li et al., 2019).
Li et al. (2019) beschreiben, dass die Bildung von TKTLl-TKT-Heterodimeren den Zellen ermöglicht, den R5P-Metabolismus umzuprogrammieren: Wenn mehr R5P benötigt wird, was vor allem bei der Nukleotid- und DNA-Synthese während der S-Phase der Zelle der Fall ist, führen erhöhte TKTL1 -Spiegel zur vermehrten Bildung von TKTLl-TKT-Heterodimeren. Diese fördern die R5P-Produktion. Mit anderen Worten und vereinfacht zeigen Li et al., dass die R5P-Grundversorgung einer Zelle über das TKT-TKT-Homodimer bereitgestellt wird. Benötigt die Zelle zusätzlich eine große Menge R5P, so wird über die Expression von TKTL1 und die daraus resultierende TKT-TKTL1 -Heterodimerbildung gewissermaßen ein „intrazelluläres Turboprogramm“ gestartet, dass eine verstärkte Bildung von R5P fördert, um eine Zellteilung und damit eine Zellvermehrung zu ermöglichen.
Untersuchungen von Bojkova et al. (2020) mit SARS-CoV-2 infizierten Zellen der menschlichen Zelllinie Caco-2 haben gezeigt, dass bei den SARS-CoV-2 infizierten Zellen der PPP der Zellen aktiviert ist.
Bojkova et al. (2020) untersuchten auch, ob die Replikation von SARS-CoV-2 durch TKT- Inhibitoren beeinflusst werden kann. Der Einsatz des TKT-Inhibitors Benfooxythiamin (B-OT), ein Prodrug des TKT-Inhibitors Oxythiamin (der ein hemmendes Analogon von Thiamin ist), führte zu einer Hemmung der Replikation von SARS-CoV-2-Viren in den Wirtszellen. Allerdings wurde das B-OT in einer Konzentration von mindestens 5 mM B-OT benötigt, um die Vermehrung der SARS-CoV-2-Viren zu hemmen. Übertragen auf einen Menschen würde das einer zu verabreichenden Menge an B-OT von mindestens 1 Gramm B-OT pro kg Körpergewicht entsprechen, d.h. bei einem 70 kg schweren Menschen einer zu verabreichenden Menge von 70 Gramm B-OT. Dieser Wert liegt außerhalb der normalerweise oder auch nur ausnahmsweise eingesetzten Wirkstoffmenge, und er liegt weit über den im Stand der Technik für den Menschen bekannten tolerablen Mengen an Oxythiamin, was auf B-OT übertragen werden darf. Der Fachmann geht deshalb davon aus, dass B-OT und TKT-Inhibitoren per se keine nutzbare Option im Hinblick auf einen Wirkstoff zur Virushemmung darstellt.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur Bekämpfung von viralen Infektionen, insbesondere von RNA- Virus-Infektionen bereit zu stellen, das insbesondere auch zur Bekämpfung von SARS-CoV-2-Viren geeignet ist.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung von wenigstens einem Inhibitor der Transketolase TKTL1 (im folgenden kurz "TKTL1 -Inhibitor") zur Verwendung bei der medizinisch-therapeutischen Behandlung von Virus-Infektionen (antivirale Therapie), insbesondere der Behandlung (Therapie) von RNA- Virusinfektionen und insbesondere auch der Behandlung (Therapie) von SARS-CoV-2-Infektionen und damit einhergehenden Erkrankungen wie z.B. COVID-19.
Mit anderen Worten: Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der technischen Lehre der Anwendung von wenigstens einem Inhibitor der Transketolase TKTL1 (kurz "TKTL1- Inhibitor") als Wirkstoff eines antiviral und insbesondere virostatisch (virushemmend) wirkenden Arzneimittels.
Begriffsdefinitionen:
- Der Begriff "Inhibitor" steht hier im Kontext für ein (d.h. prinzipiell jedes) Mittel und insbesondere eine (jede) stoffliche Substanz, nämlich Stoff oder Stoffgemisch einschließlich pharmazeutischer Zusammensetzungen, das/die/der dazu geeignet ist, eine Verringerung der Aktivität des TKTL1 -Polypeptids bei einem Individuum oder in Zellen eines Individuums direkt oder indirekt zu bewirken (herbeizuführen). Zu diesen Mitteln bzw. stofflichen Substanzen gehören insbesondere:
(a) Inhibitoren der Transkription des TKTLl-Gens, beispielsweise stoffliche Substanzen, die an den TKTL1 -Promotor binden und dadurch dessen Aktivität einschränken oder unterbinden, wie z.B. Resveratrol, das dosisabhängig den TKTL1 -Promotor hemmt.
(b) Inhibitoren der Translation der TKTLl-mRNA, beispielsweise inhibitorische RNAs wie z.B. Antisense-Konstrukte, siRNAs, sh-RNAs, Ribozyme.
(c) Inhibitoren der Enzymreaktion von TKTL1 und/oder des TKTL1-TKT- Heterodimerkomplexes, insbesondere Wirkstoffe, die diese Enzymreaktion einschränken oder unterbinden. Hierzu gehören insbesondere auch Antagonisten von Cofaktoren von TKTL1 -Polypeptiden wie z.B. Antithiamin- Verbindungen,
(d) Inhibitoren der Bildung des TKTLl-TKT-Heterodimerkomplexes, insbesondere Wirkstoffe, die die Heterodimer-Bildung einschränken oder unterbinden.
- Der Begriff "RNA" steht hier synonym für Ribonukleinsäure(n).
- Der Begriff "DNA" steht hier synonym für Desoxyribonukleinsäure.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass eine Hemmung des Enzyms TKTL1 und damit eine Hemmung der Enzymaktivität des TKTLl/TKT-Heterodimers in menschlichen Zellen dazu führt, dass die Vermehrung (Replikation) der Virus-RNA oder Virus-DNA signifikant gehemmt ist, die Wirtszelle selbst aber überlebensfahig bleibt und der menschliche Organismus keine dauerhaften und irreversiblen Schäden davon trägt.
Da die Teilung und damit Vermehrung von Zellen für den menschlichen Organismus lebensnotwendig ist, war zu erwarten, dass eine Hemmung von TKTL1 und/oder des TKTLl/TKT-Heterodimers in einer Größenordnung, die gemäß Bojkova et al. (2020) erforderlich ist, um eine Virusvermehrung zu bremsen oder zu unterbinden, zu einer Hemmung der Zellteilung und damit zu schweren Nebenwirkungen bis hin zum Tod führt. Auch und gerade weil Transketolasen und insbesondere TKTL1 als Schlüsselenzym bei der Regulation von Zellzyklus und Zellteilung als grundlegend relevant für die Lebensfähigkeit von Zellen erachtet werden, erschienen sie nach gängiger Lehrmeinung ungeeignet als mögliche Targets für eine antivirale Therapiestrategie, weil schwere Nebenwirkungen zu erwarten waren.
Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass die Hemmung der Enzymaktivität des TKTLl/TKT-Heterodimers in den Virus-infizierten menschlichen Wirtszellen dazu führt, dass die für die Virus-Nukleinsäurebiosynthese und damit die Vermehrung der Virus-Nukleinsäure (RNA oder DNA) erforderliche massive (starke) Steigerung der Ribose-5-Phosphat (R5P)- Produktion über den Stoffwechsel der Wirtszellen unterbunden bzw. signifikant gehemmt wird, andererseits aber die für das Überleben der Wirtszelle benötigten Mengen an R5P erhalten bleiben.
Mit anderen Worten: Der Verwendung von TKTL1 -Inhibitoren bei der Behandlung von Virusinfektionen und insbesondere auch von SARS-CoV-2-Infektionen liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass die Biosynthese der Virus-Nukleinsäure und damit die Virus- Vermehrung (Virus-Replikation) in der menschlichen Wirtszelle durch TKTL1- Inhibitoren signifikant gehemmt bzw. verringert werden kann, ohne dass das Überleben der Wirtszelle dadurch gefährdet ist und damit auch ohne ein Risiko von Schäden für den menschlichen Körper.
Mit der erfindungsgemäßen Verwendung des TKTL1 -Inhibitors wird in den Stoffwechsel der Wirtszelle und damit des gesamten menschlichen Körpers eingegriffen und bewirkt, dass nicht mehr ausreichend Ribose-5-Phosphat-Bausteine (R5P) für die Virus-Replikation zur Verfügung stehen und somit die Virus Vermehrung gebremst oder sogar ganz verhindert ist, ohne dass die Zelle und der gesamte menschliche Körper dadurch irreversibel geschädigt werden. Damit geht der Vorteil einher, dass nicht das Virus selbst (direkt) das Wirkstofftarget ist, sondern der Wirtszellmetabolismus, und dass deshalb etwaige Virus-Mutationen den Erfolg der erfindungsgemäßen Anwendung nicht beeinträchtigen.
Die erfindungsgemäße Anwendung der TKTL1 -Inhibitoren stellt eine Therapiestrategie dar, die nicht Virus-spezifische Strukturen adressiert, sondern vielmehr Faktoren, die von der infizierten Wirtszelle stammen und vom Virus für seine Vermehrung benötigt werden. Damit steht eine antivirale Therapiestrategie zur Verfügung, die erstens gegen ein breites Spektrum an Viren erfolgsversprechend eingesetzt werden kann, und die zweitens auch bei Mutationen des Virus (Virusmutanten) wirksam sind. Dies erlaubt auch einen Schutz vor Viren, die erst in Zukunft entstehen werden. Die beschriebene Erfindung erlaubt einen Schutz vor Viren, ohne deren RNA- oder DNA- Sequenz zu kennen. Damit wird im Vergleich zu einer Impfung keine Vorlaufzeit für die Entwicklung eines Medikamentes benötigt, so dass sofort eine Therapie existiert. Dies ermöglicht den Schutz der Menschheit und der Säugetiere allgemein vor bestehenden und künftigen Viren und Erkrankungen, die von diesen ausgehen und ausgehen werden. Erstmals ist damit ein Daseinsschutz gegenüber Virenerkrankungen existent.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ein Stoff oder Stoffgemisch, der/das fähig und geeignet ist, spezifisch die Transkription des TKTLl-Gens einzuschränken oder zu unterbinden. Hierfür kommt insbesondere eine Substanz in Betracht, die fähig und geeignet ist, an den TKTL1 -Promotor der Zelle zu binden und dadurch dessen Aktivität einzuschränken oder zu unterbinden. In der Praxis hat sich insbesondere Resveratrol als geeigneter Inhibitor des TKTL1 -Promotors erwiesen (Kumar B, 2018).
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ein Stoff oder Stoffgemisch, der/das dazu geeignet ist, spezifisch die Translation der TKTLl-mRNA zu hemmen. Hierfür kommt insbesondere wenigstens eine Substanz in Betracht, die aus der Gruppe der TKTL1- mRNA spezifischen Antisense-Konstrukte, TKTLl-mRNA spezifischen siRNAs, TKTL1- mRNA spezifischen sh-RNAs, TKTLl-mRNA spezifischen Ribozyme und anderen TKTLl- mRNA spezifischen inhibitorischen RNAs ausgewählt ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ein Stoff oder Stoffgemisch, der/das dazu geeignet ist, die Enzymreaktion von TKTL1 und/oder des TKTL1-TKT- Heterodimerkomplexes einzuschränken oder zu unterbinden. Hierfür kommt insbesondere wenigstens eine Substanz in Betracht, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Antithiamin- Verbindungen und anderen Antagonisten, insbesondere von Antagonisten aus der Gruppe der Cofaktoren des Enzyms TKTL1.
In einer in der Praxis erprobten Ausführungsform ist der TKTL1 -Inhibitor ein inhibitorisches Thiaminanalogon. Alle bisher bekannten Transketolase-Enzyme einschließlich der TKTL1 sind von Thiamin (Vitamin Bl) als Coenzym funktionsabhängig. Thiaminanaloga wie z.B. Oxythiamin wirken als Thiamin- Antagonisten und können zur Hemmung der Transketolasen eingesetzt werden (vgl. EP1354961A1).
Ein bevorzugtes inhibitorisches Thiaminanalogon ist die Substanz Benfo-Oxythiamin (B-OT). B-OT ist eine Vorstufe ("Pro-Pharmakon", Prodrug") von Oxythiamin, ist oral applizierbar und setzt schon kurz nach der Aufnahme in den Säugerorganismus Oxythiamin frei. Über den Blutkreislauf kann B-OT zu allen Zellen in allen Teilen des Körpers gelangen. In-vivo- Pharmakokinetik-Daten haben gezeigt, dass Oxythiamin die Blut-Hirn-Schranke durchdringen kann und folglich auch bei Virusinfektionen im Gehirn mit Aussicht auf Erfolg einsetzbar ist. Die chemische Struktur (Strukturformel) von Benfo-Oxythiamin ist bekannt, z.B. aus EP1354961A1.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass für eine Hemmung der Enzymaktivität von TKTL1 im TKTLl/TKT-Heterodimer im menschlichen Organismus eine Konzentration an B-OT ausreichend ist, die mehr als 1000-fach geringer ist als die von Bojkova et al. (2020) für die menschlichen Caco-2-Zellinien auf Zellkulturebene beschriebene Mindestkonzentration. In ihren Untersuchungen zeigen Bojkova et al. (2020), dass mindestens eine 5 mM Konzentration von B-OT benötigt wird, um die Vermehrung des SARS-CoV-2-Virus in den mit SARS-CoV- 2 infizierten Caco-2-Zelllinien zu hemmen. Unerwartet und überraschend für den Fachmann hat sich jedoch im Verlauf der Untersuchungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, gezeigt, dass eine Gabe von unter 35 mg B-OT pro Tag und 70 kg Körpergewicht des Patienten, d.h. weniger als 0,5 mg pro kg Körpergewicht pro Tag und dementsprechend weniger als eine 1 nanomolare (1 nM) Konzentration von B-OT pro kg Körpergewicht und pro Tag, ausreichend ist, um die Vermehrung von SARS-CoV-2-Viren im menschlichen Körper zu hemmen.
Deshalb wird erfindungsgemäß im Fall von Benfo-Oxythiamin als TKTL1 -Inhibitor das B-OT in einer Dosis/Dosierung von 7 pg bis 430 pg (pg =Mikrogramm), vorzugsweise 14 pg bis 215 pg, besonders bevorzugt 14 pg bis 130 pg B-OT pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag appliziert/verabreicht. Mit anderen Worten: Die Dosis/Dosierung des TKTL1- Inhibitors Benfo-Oxythiamin beträgt pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag 7 pg < pg B-OT < 430 pg, vorzugsweise 14 pg < pg B-OT < 215 pg und besonders bevorzugt 14 pg < pg B-OT < 130 pg.
Generell gilt erfindungsgemäß, dass im Fall von Benfo-Oxythiamin als TKTL1 -Inhibitor das Benfo-Oxythiamin in einer Dosis von weniger als 0,5 mg, vorzugsweise weniger als 0,3 mg pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag zur Anwendung kommt.
Die Herstellung von Benfo-Oxythiamin (B-OT) gemäß EU-GMP-Leitfaden für Human- und Tierarzneimittel ist im Stand der Technik etabliert, was die Anwendung von Benfo-Oxythiamin in Säugetieren (z.B. Hunden, Katzen) und insbesondere auch im Menschen erlaubt.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist der TKTL1 -Inhibitor ein Stoff oder Stoffgemisch, der/das dazu geeignet ist, die Bildung (Formierung) des TKTL1-TKT- Heterodimerkomplexes einzuschränken oder zu unterbinden.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausfuhrungsbeispielen mit Tabellen und Figuren näher erläutert.
In den Figuren zeigen:
Fig. 1: Die Reduktion der SARS-Cov-2-Viruslast und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung der TKTL1 -Translation mittels TKTL1 -spezifischer siRNA Fig. 2: Die Reduktion der SARS-Cov-2-Viruslast und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung der TKT-Translation mittels TKT-spezifischer siRNA Fig. 3: Die Reduktion der Viruslast des humanen Cytomegalievirus (HCMV) und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung der TKTL1 -Translation mittels TKTL1 -spezifischer siRNA
Fig. 4: Die Reduktion der Viruslast des humanen Cytomegalievirus (HCMV) und Überleben der Caco-2-Zellen nach Hemmung der TKT-Translation mittels TKT-spezifischer siRNA
Fig. 5: Die dosisabhängige Reduktion der SARS-Cov-2- Viruslast und Überleben der Caco-2- Zellen nach Hemmung des TKTL1 -Promotors mittels unterschiedlicher Dosierungen von Resveratrol
Die Reduktion der Viruslast ist jeweils dargestellt als Reduktion um den angegebenen
Prozentwert.
Beispiel 1: siRNA-Inhibierung von (a) TKTL1 im Vergleich zur siRNA-Inhibierung von (b) TKT in SARS-CoV-2 infizierten Säugerzellen
SARS-CoV-2 infizierte Caco-2-Zellen wurden mittels einem aus polykationischen und neutralen Lipiden bestehenden Transfektionsreagenz (hier METAFECTENE® von Biontex Laboratories GmbH, München) mit (a) humanen TKTL1 -spezifischen siRNAs und (b) humanen TKT-spezifischen siRNAs sowie mit (c) einer siRNA-Negativkontrolle (hier der AllStars negative control siRNA von Qiagen, die laut Herstellerangaben keine Homologie zu irgendeinem bekannten Säugetiergen aufiveist) transfiziert. (siRNA bzw. small interfering RNA sind kurze RNA-Moleküle, die keine Proteine codieren, sondern sich mit komplementären einzelsträngigen RNA-Molekülen verbinden und dadurch deren normale Funktion unterbinden.)
Die folgenden siRNA- Sequenzen wurden eingesetzt:
(a) TKTL1 spezifisch:
1. 5'-GGAGUUGCAUGUGGAAUGG-3' (Diaz-Morelli et al. 2016)
2. 5' -UUAUUCACGAAGGAAACACUU- 3' (Heller et al. 2018)
3. 5' -UAAAUAACCAUAGUUUCUGGU- 3' (Heller et al. 2018)
(b) TKT spezifisch: 5'-AAUGAUGGCUGUUGGCUGGTT-3' (Lu et al. 2017) Das effektive Silencing (d.h. Gen-Stilllegung, Genexpressions-Knockdown mittels RNA- Interferenz) für (a) TKTL1 und (b) TKT in den SARS-CoV-2 infizierten und mit siRNA- transfizierten Caco-2-Zellen wurde anhand von RTqPCR (Reverse Transkriptase quantitative PCR) und Westemblot-Analysen belegt. Zur Bestimmung und Quantifizierung der TKTL1 / TKT-mRNAs sowie der TKTL1 / TKT-Proteine wurden 72 h und 96 h nach Transfektion RTqPCR (Reverse Transkriptase quantitative PCR) und Westemblot-Analysen in den SARS-CoV-2 infizierten und mit siRNA-transfizierten Caco-2-Zellen durchgeführt.
Die Replikationsfahigkeit der SARS-CoV-2-Viren nach Transfektion der Caco-2-Zellen mit den verschiedenen siRNAs wurde mittels Immunfarbung für das SARS-CoV-2 Spike (S)- Protein ermittelt. Anhand der Spike-Protein-Färbung wurde der prozentuale Anteil der Virushemmung in den mit (a) TKTL1 bzw. (b) TKT siRNA-transfizierten Zellen im Vergleich zu den (c) mit der siRNA negativ Kontrolle transfizierten Zellen errechnet.
Die Zellviabilität der mit den verschiedenen siRNA transfizierten, SARS-CoV-2-infizierten Caco-2-Zellen wurden mittels Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT)-Assay erhoben.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 1 und den Figuren 1 und 2 dargestellt.
In Abhängigkeit von den verschiedenen siRNA-Sequenzen wurden die folgenden Effekte hinsichtlich Reduktion der Viruslast und Überlebensfähigkeit der SARS-CoV-2-infizierten Caco-2-Zellen im Vergleich zu den mit der AllStars negative control siRNA transfizierten Caco-2-Zellen festgestellt:
In den mit TKTL1 -spezifischer siRNA transfizierten Zellen erfolgte (im Vergleich zu Zellen, die mit nicht zielgerichteten Kontrollduplexen transfiziert worden waren) eine Hemmung der TKTL1 Translation. Dabei führte die Hemmung der TKTL1 -Translation in einer Stärke, bei der Zellen weiterhin überlebensfahig blieben, zu einer signifikanten Reduktion der Replikationsfähigkeit der SARS-CoV-2 Viren.
Diese Experimente zeigen folglich, dass durch die Hemmung von TKTL1 in einem Ausmaß, das das Überleben der Zelle nicht beeinträchtigt, die Vermehrung des SARS-CoV-2 Virus deutlich gehemmt werden kann. Die Parallel-Ansätze mit TKT-spezifischer siRNA als Inhibitor der Translation der TKT- mRNA zeigen, dass die Hemmung der TKT-Translation zwar ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der Viruslast in den SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zellen führt. Allerdings reduziert sie auch die Lebensfähigkeit der Zellen in erheblichem Umfang. Das zeigt, dass das human-therapeutische Fenster der Hemmung von TKT für eine Hemmung der SARS-CoV-2- Virus Vermehrung sich mit der Schädigung der menschlichen Zelle stark überschneidet und damit praktisch nicht vorhanden ist. Mit anderen Worten: das Ausmaß der Hemmung von TKT, das notwendig ist, um eine Hemmung der SARS-CoV-2-Virusvermehrung zu bewirken, ist so groß, dass die menschliche Zelle so stark geschädigt wird, dass diese abstirbt. Bei Verabreichung eines Inhibitors der Transketolase TKT in Dosen, die zu einer Hemmung der SARS-CoV-2-Virusvermehrung führen, würden im menschlichen Körper so starke Schäden entstehen, dass eine therapeutische Nutzung der TKT-Hemmung zwecks Hemmung der SARS- CoV-2-Virenvermehrung im menschlichen Körper ausgeschlossen werden muss.
Fazit: Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung von TKTL1 -spezifischer siRNA als Inhibitor der TKTL1 bei SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zellen bewirkt, dass die Vermehrung der Viren in den Wirtszellen unterbunden wird und die Wirtszellen dabei überleben.
Paralleluntersuchungen in vitro mit dem Humanen Cytomegalievirus (HMCV) (siehe hier Beispiel 2) bestätigen, dass mit der Maßnahme der siRNA-Inhibierung von TKTL1 die Virus Vermehrung in den Wirtszellen unterbunden werden kann, ohne dabei das Überleben der Wirtszelle zu gefährden.
Beispiel 2: siRNA-Inhibierung von (a) TKTL1 im Vergleich zur siRNA-Inhibierung von (b) TKT in mit dem Humanen Cytomegalievirus (HCMV) infizierten Säugerzellen
Die Effekte einer siRNA-Inhibierung von TKTL1 einerseits und TKT andererseits wurden an mit dem humanen Cytomegalievirus (HCMV) infizierten Caco-2-Zellen untersucht. Zur Infizierung der Caco-2-Zellen wurden, wie bei Dal Pozzo et al. (2008) beschrieben, rekombinante HCMV-EYFP-Viren eingesetzt, die auch für das verstärkt gelb fluoreszierende Protein EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) kodieren. Damit kann die Replikationsfähigkeit des HCM- Virus mittels fluoreszenzbasierten antiviralen Assays (z.B. Dal Pozzo et al., 2008) bestimmt werden.
Die Caco-2-Zellen wurden mit den in Beispiel 1 genannten siRNA-Sequenzen für TKTL1 und TKT transfiziert. Das effektive Silencing wurde anhand von RTqPCR (Reverse Transkriptase quantitative PCR) und Westemblot-Analysen belegt. Diese Analysen wurden 72 h und 96 h nach Transfektion durchgefuhrt. Die Lebensfähigkeit der HMCV-infizierten Zellen wurde mittels MMT-Assay bestimmt.
Die Replikationsfähigkeit der HCM- Viren nach Transfektion der Caco-2-Zellen mit den verschiedenen siRNAs wurde mittels fluoreszenzbasiertem antiviralem Assay (Dal Pozzo et al 2008) bestimmt. Anhand der EYFP-Signale der rekombinanten Viren wurde der prozentuale Anteil der Virushemmung in den mit (a) TKTL1 bzw. (b) TKT siRNA-transfizierten Zellen im Vergleich zu den (c) mit der siRNA negativ Kontrolle transfizierten Zellen errechnet. Die Ergebnisse sind in den Figuren 3 und 4 dargestellt.
Diese Ergebnisse bestätigen die in Beispiel 1 mit SARS-CoV-2 erhaltenen Ergebnisse auch für HMCV-infizierte Zellen: Eine Inhibition von TKTL1 mittels TKTL1 -spezifischer siRNA als Inhibitor bewirkt, dass die Vermehrung der HMC-Viren in den Wirtszellen unterbunden wird und die Wirtszellen dabei überleben. Hingegen führt eine TKT-Inhibition mittels TKT- spezifischer siRNA zwar ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der Viruslast in den HMCV infizierten Caco-2-Zellen, allerdings bei erheblich herabgesetzter Lebensfähigkeit der Zellen.
Beispiel 3: Verwendung von B-OT als TKTL1 -Inhibitor in mit dem Humanen Cytomegalievirus (HCMV) infizierten Säugerzellen
Weiterhin wurde die Empfindlichkeit der HCMV-Replikation gegenüber B-OT in humanen Säugerzellen untersucht. Dazu wurden Experimente wie in der Arbeit von Dal Pozzo et al. 2008 beschrieben mit B-OT durchgeführt: Humane embryonale Lungenfibroblasten (HEL) wurden mit rekombinanten HCMV-EYFP-Viren infiziert, die zusätzlich für das verstärkt gelb fluoreszierende Protein (enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) kodieren (Dal Pozzo F, et al., 2008). Als Maß für die Virenvermehrung nach Infektion mit HCMV-EYFP wurde die Emission des EYFP-Proteins gemessen (Anregungs Wellenlänge: 485 nm / Emission: 530 ran). Dabei wurde die automatisiert gemessene, konstante und niedrige zellassoziierte Hintergrundemission von dem Fluoreszenz-Emissionswert abgezogen Zur Überprüfung des antiviralen Effektes von B-OT wurden die HCMV-EYFP-infizierten Zellen für 48 h mit unterschiedlichen B-OT-Konzentrationen (0 bis 20 mM B-OT) inkubiert. Es zeigte sich eine dosisabhängige Inhibition der Fluoreszenz (als Maß für die Virenvermehrung). Die erforderliche Substanzkonzentration, die die EYFP-Emission im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen (0 mM B-OT) um die Hälfte reduziert, wurde als die 50%ige Hemmkonzentration (IC50) im fluoreszenzbasierten antiviralen Assay definiert. Der hier ermittelte IC50 lag bei 0,5 mM B-OT.
Beispiel 4: Verwendung von B-OT als TKTLl-Inhibitor zwecks Hemmung der SARS- CoV-2-Virenvermehrung im menschlichen Körper
Aus Zhu et al 2020 ist bekannt, dass bei Patienten mit SARS-CoV-2-Infektionen und Covid-19- Erkrankungen die Beurteilung des Schweregrades der Erkrankung anhand der klinischen Werte von immun-entzündlichen Markern erfolgen kann. Hohe Werte für das proinflammatorische Zytokin IL-6 und/oder das C-reaktive Protein (CRP) sprechen für eine schwere Erkrankung und einen stark risikobehafteten Krankheitsverlauf. Das proinflammatorische Zytokin IL-6 spielt aufgrund seiner pleiotropen Eigenschaft eine Schlüsselrolle bei dem für Patienten mit SARS- CoV-2 Infektionen beschriebenen "Zytokinsturm". Seine konstitutive Expression verursacht Organschäden und starke Schmerzen (Zhu et al 2020; Gupta et al. 2020).
Im Rahmen von individuellen Heilversuchen bei hospitalisierten Patienten mit SARS-CoV-2 Infektionen und COVID-19 Erkrankung wurde unerwartet und überraschend für den Fachmann gefunden, dass bei einer täglichen Gabe von unter 20 mg B-OT pro 70 kg Körpergewicht des Patienten, d.h. weniger als 0,3 mg pro kg Körpergewicht und dementsprechend weniger als eine 1 nanomolare (1 nM) Konzentration von B-OT pro kg Körpergewicht, im Verlauf von 7 Tagen nicht nur eine mittels PCR nachgewiesene signifikante Reduktion der Viruslast, sondern auch eine deutliche Reduktion der Entzündungsparameter C-reaktives Protein (CRP) und Interleukin-6 (IL-6) festgestellt wurde: unter 7-tägiger B-OT-Therapie fiel der CRP-Wert im Durchschnitt von 77 pg/ml auf 5 pg/ml, während der IL-6 Wert von durchschnittlich 63 pg/ml auf 5 pg /ml fiel. Beispiel 5: Verwendung von Resveratrol als TKTLl-Inhibitor zwecks Hemmung der Virenvermehrung in SARS-CoV-2-infizierten Caco-2-Zellen
Die organische Verbindung Resveratrol (Summenformel C14H12O3) aus der Gruppe der Polyphenole ist dem Fachmann als Inhibitor des TKTL1 -Promotors bekannt. In Kumar B. (2018) ist beschrieben, dass eine Behandlung von HeLa-Zellen mit 50 mM Resveratrol für 48 h im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu einer 75%igen Reduktion der TKTL1- Promotoraktivität führte. Gleichzeitig führte dies allerdings auch zu einer signifikanten Abnahme der Lebensfähigkeit der HeLa-Zellen.
Bei den Untersuchungen im Rahmen dieses Beispiels 5 wurde Resveratrol eingesetzt, um in SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zellen die Virusreplikation zu unterbinden. Dazu wurden die SARS-CoV-2 infizierten Caco-2-Zellen für 24 h mit verschiedenen Resveratrol- Konzentrationen behandelt. Um den Effekt der reduzierten Promotoraktivität auf die TKTL1- mRNA-Produktion zu bestätigen, wurde eine RTqPCR durchgeführt. Die Ergebnisse dieser RTqPCR zeigen eine Reduktion der TKTLl-mRNA in Abhängigkeit von der eingesetzten Resveratrol-Konzentration: Je höher die Konzentration desto stärker die Reduktion. Weiterhin wurde - wie hier in Beispiel 1 beschrieben - die Überlebensfähigkeit der Caco-2-Zellen mittels MTT-Assay und die Replikationsfähigkeit der SARS-CoV-2 Viren mittels Immunfarbung für das SARS-CoV-2 Spike (S)-Protein ermittelt. Als Kontrolle dienten SARS-CoV-2-infizierte Caco-2-Zellen ohne Resveratrol-Behandlung.
Es zeigte sich, dass die Replikationsfahigkeit der SARS-CoV-2-Viren unter Resveratrol- Behandlung im Vergleich zur Kontrolle mit steigender Resveratroldosis abnahm, während die Lebensfähigkeit der SARS-CoV-2-infizierten Caco-2-Zellen in ausreichendem Maß bestehen blieb. So nahm unter einer Behandlung mit 25 mM Resveratrol für 48 h die Replikationsfähigkeit der SARS-CoV-2 Viren im Vergleich zur Kontrolle um 68% ab, während die Überlebensfahigkeit der Caco-2-Zellen 93% betrug. Die Ergebnisse sind in der Figur 5 graphisch dargestellt. Zitierte Nicht-Patent-Literatur:
Bojkova D, Costa R, Bechtel M, Ciesek S, Michaelis M, Cinatl jr. J (2020):
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Dal Pozzo F, Andrei G, Daelemans D, Winkler M, Piette J, De Clercq E, Snoeck R, (2008): Fluorescence-based antiviral assay for the evaluation of compounds against vaccinia virus, varicella zoster virus and human cytomegalovirus. Journal of Virological Methods 151 66-73. doi: 10.1016/j.j viromet.2008.03.025
Diaz-Moralli S, Aguilar E, Marin S, Coy JF, Dewerchin M, Antoniewicz MR, Meca-Cortes O, Notebaert L, Ghesquiere B, Eelen G, Thomson TM, Carmeliet P, Cascante M. (2016):
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A Major Threat to Human Health.
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Heller S, Maurer GD, Wanka C, Hofmann U, Luger AL, Bruns I, Steinbach JP, Rieger J. (2018): Gene Suppression of Transketolase-Like Protein 1 (TKTL1) Sensitizes Glioma Cells to hypoxia and Ionizing Radiation.
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Claims

An sp rüche
1) Inhibitor der Transketolase TKTL1 zur Anwendung bei der Behandlung von Virus- Infektionen, insbesondere RNA-Virusinfektionen und insbesondere auch von SARS- CoV-2-Infektionen.
2) Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das fähig und geeignet ist, spezifisch die Transkription des TKTLl-Gens einzuschränken oder zu unterbinden.
3) Inhibitor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das fähig und geeignet ist, an den TKTL1 -Promotor der Zelle zu binden und dadurch dessen Aktivität einzuschränken oder zu unterbinden.
4) Inhibitor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass er Resveratrol ist.
5) Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das dazu geeignet ist, spezifisch die Translation der TKTL1- mRNA zu hemmen.
6) Inhibitor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: Antisense-Konstrukte, siRNAs, Ribozyme und andere inhibitorische RNAs, jeweils spezifische für TKTLl-mRNA.
7) Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder Stoffgemisch ist, der/das dazu geeignet ist, die Enzymreaktion von TKTL1 und/oder des TKTLl-TKT-Heterodimerkomplexes einzuschränken oder zu unterbinden.
8) Inhibitor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: Antithiamin- Verbindungen und andere Antagonisten von Cofaktoren von TKTL1 -Polypeptiden.
9) Inhibitor nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es ein inhibitorisches Thiaminanalogon, insbesondere Oxythiamin, Benfo-Oxythiamin und/oder ein Benfo- Oxythiamin- Analogon ist, wobei im Fall von Benfo-Oxythiamin dieses in einer Dosis von 7 pg bis 430 pg, vorzugsweise 14 pg bis 215 pg, besonders bevorzugt 14 pg bis 130 pg Benfo-Oxythiamin pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag zur Anwendung kommt. 10) Inhibitor nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das inhibitorische
Thiaminanalogon der Wirkstoff Benfo-Oxythiamin ist und in einer Dosis von 7 pg bis 430 pg, vorzugsweise 14 pg bis 215 pg, besonders bevorzugt 14 pg bis 130 pg Benfo- Oxythiamin pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag zur Anwendung kommt. 11) Inhibitor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stoff oder
Stoffgemisch ist, der/das fähig und geeignet ist, die Bildung des TKTL1-TKT- Heterodimerkomplexes einschränken oder zu unterbinden.
12) Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei im Fall von Benfo-Oxythiamin als TKTL1 -Inhibitor das Benfo-Oxythiamin in einer Dosis von 7 pg bis 430 pg, vorzugsweise 14 pg bis 215 pg, besonders bevorzugt 14 pg bis 130 pg Benfo- Oxythiamin pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag zur Anwendung kommt.
13) Inhibitor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosis pro kg Körpergewicht des Patienten und pro Tag 14 pg bis 215 pg Benfo-Oxythiamin, vorzugsweise 14 pg bis 130 pg Benfo-Oxythiamin beträgt.
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