DE60224778T2

DE60224778T2 - Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung und zur Detektion von proliferativen Störungen die mit der Überexpression des menschlichen "Transketolase like-1" gens in Zusammenhang stehen

Info

Publication number: DE60224778T2
Application number: DE2002624778
Authority: DE
Inventors: Johannes Dr. Coy
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2002-04-19
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2022-04-20
Also published as: AU2003224067A1; ES2298304T3; DE60224778D1; CA2480276C; CA2480276A1; US20050158726A1; JP2005523025A; CN101955997A; US8216792B2; JP4239824B2; EP1354961A1; CN101684499A; US7655398B2; ATE384804T1; EP1354961B1; CN1646703A; US20100136577A1; WO2003089667A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung und Diagnose von Erkrankungen, die mit abnormal proliferierenden Zellen in Zusammenhang stehen. In einem Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren, die besonders für die Detektion von Tumoren und ihren Vorläuferstadien, basierend auf der Detektion der Überexpression des humanen Transketolase-like-1-Gens in biologischen Proben, geeignet sind. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die mit der Überexpression des humanen Transketolase-like-1-Gens in Zusammenhang stehen. Zu Verfahren für die Behandlung können gentherapeutische Ansätze zählen sowie Verfahren zur Hemmung oder Reduktion der Aktivität von Transketolase-like-1-Polypeptiden.
Trotz signifikanter wissenschaftlicher und medizinischer Forschungsanstrengungen bleiben neoplastische Krankheiten weiterhin eine Hauptursache für die humane Mortalität. Zum Beispiel erkranken jedes Jahr mehr als 340.000 Menschen in Deutschland an Krebs und mehr als 210.000 erliegen ihrer Krankheit. Epitheltumore stellen die Mehrheit der Krebserkrankungen dar: Lungenkrebs ist die Hauptursache der Krebstode bei Männern, und Brustkrebs ist die Hauptursache bei Frauen. Die zweite Hauptursache der Krebstode für beide Geschlechter ist kolorektaler Krebs (Becker, N. and Wahrendorf, J., (1997) Atlas of Cancer Mortality in the Federal Republic of Germany 1981–1990, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg).
Ein Hauptgrund für diese unbefriedigende Situation ist, dass die meisten neoplastischen Krankheiten erst in relativ späten Stadien diagnostiziert werden, wenn bereits isolierte Tumorzellen oder kleine Tumorzellaggregate von dem primären Tumor freigesetzt und im gesamten Organismus des Wirts verteilt wurden und schließlich möglicherweise bereits eine verborgene oder offene metastatische Krankheit verursacht haben. Frühe Krebsstadien und insbesondere Krebsvorläuferstadien verursachen üblicherweise keine Symptome und werden durch die jeweiligen Patienten nicht realisiert.
Um dies zu überwinden, sind weitere Forschungsanstrengungen und klinische Programme erforderlich, sowohl um die Technologien der Krebsfrüherkennung zu verbessern, als auch um echte präventive oder therapeutische Impfstrategien zu entwickeln, um Patienten entweder zu immunisieren, bevor ein definierter Krebs aufgetreten ist, oder nach der Resektion eines Krebses oder seiner Vorläufer, um das Überleben von gestreuten Krebszellen (DTCs – disseminated isolated cancer cells) zu verhindern, welche möglicherweise entweder vor oder während des primären chirurgischen Eingriffes von dem Neoplasma freigesetzt wurden.
Für wenige Krebsarten, insbesondere Krebs des Gebärmutterhalses, konnten effiziente Krebsfrüherkennungsprogramme etabliert werden. Die anschließende Reduzierung der Mortalitätsraten in Zusammenhang mit diesen spezifischen Neoplasmen demonstrierte überzeugend die hohe Effektivität der Früherkennungsprogramme.
Zusammenfassend sind die bisher verwendeten Diagnoseverfahren leider relativ unempfindlich und beinhalten das Risiko falschpositiver Ergebnisse aufgrund fehlender Spezifität. Darüber hinaus können durch die Verwendung der aktuellen Diagnoseverfahren keine exakten Schlüsse hinsichtlich des Malignitätsgrades, des Tumorfortschritts und seines Metastasenbildungspotentials gezogen werden.
Somit wäre die Verwendung zuverlässiger diagnostischer Molekularmarker von großem Vorteil für ein Verständnis der Molekularbasis von Epitheltumoren, z. B. Kolon tumore, zur Unterscheidung von gutartigem von bösartigem Gewebe und zur Einordnung und Einstufung von Karzinomen, besonders bei Patienten mit metastasenbildendem Krebs mit einer sehr schlechten Prognose. Es kann erwartet werden, dass solche Marker auch für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Möglichkeiten für die Krebsbehandlung von Nutzen sind.
Das Verständnis der molekularen Ereignisse, die dem Übergang von einer normalen Zelle in eine Tumorzelle mit unterschiedlichen Aggressivitätsgraden zugrunde liegen, und die Verfügbarkeit entsprechender Experimentsysteme zur Auswahl von Genen, die mit Krebs in Zusammenhang gebracht werden, sind die absoluten Voraussetzungen für die Identifikation solcher neuartigen Diagnosemarker und therapeutischen Arzneimittelziele.
Es ist allgemein anerkannt, dass die Tumorgenese einen komplexen mehrstufigen Prozess darstellt, bei dem man davon ausgeht, dass genetische Veränderungen und Umweltfaktoren diejenigen Zellprozesse deregulieren, welche die Zellproliferation und -differenzierung steuern. Dieser mehrstufige Prozess ist zum Beispiel durch kolorektale Krebse gut veranschaulicht, welche sich typischerweise über Jahrzehnte hinweg entwickeln und die, wie es scheint, mehrere genetische Ereignisse für ihre fertige Entstehung erfordern (für einen Überblick siehe Kinzler and Vogelstein, 1996, Cell 87, 159–170). Sowohl die Vererbung veränderter Gene (was in einer gekennzeichneten Prädisposition resultiert) als auch genomische Instabilität (verursacht durch genotoxische Agenzien aus der Umwelt) führen zu zusätzlichen somatische Mutationen zu diesem Prozess beitragen. Zweifellos ist die Liste der entscheidenden Mitspieler, die kausal an der Tumorbildung beteiligt sind, weit davon entfernt, vollständig zu sein, und sie variiert offensichtlich in Abhängigkeit von der Art des Tumors.
Somit ist das technische Problem, welches der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, die Bereitstellung von Mitteln für die Diagnose und Therapie von Epitheltumoren, welche die Nachteile der derzeit verfügbaren Diagnose- und Therapieverfahren überwinden.
Die Lösung für das technische Problem wird durch das Bereitstellen der in den Ansprüchen dargelegten Ausführungsformen erzielt.
Die vorliegende Erfindung basiert auf den Erkenntnissen des Erfinders, dass das humane Transketolase-like-1-Gen, das in SEQ. ID. Nr. 1 (siehe TKT-L1, TKR: NM_012253; Zugangsnummer: X91817) angegeben ist, in Gewebe des Kolonkarzinoms, des Pankreaskarzinoms, bei Lungenkrebs und bei Magenkrebs im Vergleich zu dem Level, welches in entsprechendem normalem Kontrollgewebe gefunden wurde, hoch überexprimiert ist. Dies ist von besonderer Bedeutung für diagnostische Zwecke, da das Transketolase-Enzym in Tumorgewebe nicht vergleichbar überexprimiert ist.
Aus der WO 01/92310 ist bekannt, dass TKTL2-Transketolase ein geeignetes Ziel für die Hemmung der Tumorproliferation ist. Die Autoren vermuten, dass die TKTL2-Proteinexpression und die TKTL2-Enzymaktivität in Tumorzellen erhöht sind. Daher schlagen sie TKTL2 als Ziel für die Hemmung der Tumorproliferation vor.
Cascante et al. 2000 (in NUTRITION AND CANCER, Vol. 36, Nr. 2, Seite 150–154, XP008012308) behandeln Transketolase-TKT (EC 2.2.1.1). Die Autoren demonstrieren, dass TKT den nicht-oxidativen Weg des Substratflusses steuert. Auf der Grundlage ihrer Befunde nehmen sie an, dass eine Unterdrückung der Tumorproliferation die Hemmung der TKT-Enzymaktivität erfordert. Ferner schlussfolgern die Autoren, dass die erfolgreiche Hemmung der Tumorproliferation durch die Verwendung des Thiaminanalogons Oxythiamin das Resultat einer Hemmung von TKT ist. Infolgedessen schlagen sie TKT als relevantes Ziel für eine neuartige Antikrebstherapie vor.
Coy et al., 1996 (in GENOMICS Vol. 32, Nr. 3, Seite 309–316, XP000616489, ISSN: 0888–7543) und die Autoren von WO 97/05253 waren die ersten, die die Identifikation des TKTL1-Gens (Transketolase-verwandtes Gen/TKR = Transketolase-like-1-Gen/TKTL1) offenbarten. Die Autoren nehmen an, dass Mutationen im TKTL1-Gen für die neurologische Krankheit „Wernicke-Korsakoff-Syndrom" verantwortlich sind. Eine Beziehung zwischen TKTL1 und Krebs wurde in diesen Veröffentlichungen weder explizit noch implizit in Betracht gezogen.
Mit der vorliegenden Erfindung wurde erstmalig gezeigt, dass ein Verfahren für die Diagnose von Tumoren auf der Detektion der Überexpression von Transketolase-like-1-Genprodukten in biologischen Proben basieren kann. Entsprechend der detektierten Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von Transketolase-like-1-Genprodukten ist es möglich, den Verlauf der Krankheit vorherzusagen, die Prognose zu bewerten und eine adäquate Therapie für Patienten zuzuschneiden.
Ferner ermöglicht die Erfindung therapeutische Verfahren, die bei Erkrankungen in Zusammenhang mit der Überexpression von Transketolase-like-1-Genprodukten anwendbar sind. Einerseits stellt die Erfindung Verfahren unter Verwendung von Transketolase-like-1-Nukleinsäuren oder -Polypeptiden für die Therapie der Erkrankungen bereit. Andererseits stellt die Erfindung Verfahren auf der Grundlage der Reduzierung der enzymatischen Aktivität von Transketolase-like-1-Gen-Polypeptiden bereit. Somit ist ein Aspekt der Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens für das rationale Tumor-Management auf der Grundlage der Detektion von Transketolase-like-1-Genprodukten in Patientenproben und das Zuschneiden einer mit der detektierten Überexpression der Genprodukte korrelierenden Therapie.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Diagnose- und Forschungskits und pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Durchführung der hierin offenbarten Verfahren von Nutzen sind.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Detektion der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens mittels RT-PCR bei Kolonkarzinomen; das Diagramm zeigt die Induktion der Expression des Transketolase-like-1-Gens im Gewebe des Kolonkarzinoms im Vergleich zu Kontrollgewebe.
2: Detektion der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens mittels RT-PCR bei Lungenadenokarzinomen; das Diagramm zeigt die Induktion der Expression des Transketolase-like-1-Gens im Gewebe des Lungenadenokarzinoms im Vergleich zu Kontrollgewebe.
3: Detektion der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens mittels RT-PCR bei Karzinomen des Magens; das Diagramm zeigt die Induktion der Expression des Transketolase-like-1-Gens im Gewebe von Karzinomen des Magens im Vergleich zu Kontrollgewebe.
4: Detektion der Überexpression von Transketolase mittels RT-PCR bei Kolonkarzinomen; das Diagramm zeigt die Induktion der Expression von Transketolase im Gewebe des Kolonkarzinoms im Vergleich zu Kontrollgewebe.
5: Detektion der Überexpression von Transketolase mittels RT-PCR bei Lungenadenokarzinomen; das Diagramm zeigt die Induktion der Expression von Transketolase im Gewebe des Lungenadenokarzinoms im Vergleich zu Kontrollgewebe.
6: Detektion der Überexpression von Transketolase mittels RT-PCR bei Karzinomen des Magens; das Diagramm zeigt die Induktion der Expression von Transketolase im Gewebe des Karzinoms des Magens im Vergleich zu Kontrollgewebe.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Detektion und Behandlung von Erkrankungen bereit, die durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Krebs.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens für die Detektion von Erkrankungen, die durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Krebs, basierend auf der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Expressionslevels des humanen Transketolase-like-1-Gens (TKT-L1, TKR: NM_012253; Zugangsnummer: X91817) in biologischen Proben.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens für die Behandlung von Erkrankungen, die durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Krebs, unter Verwendung humaner Transketolase-like-1-Genprodukte als therapeutisch aktive Agenzien.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Forschungs- oder Diagnosetestkit zur Durchführung der Reaktionen, die an der Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels der Überexpression des humanen Transketolase-like-1-Gens beteiligt sind.
Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von Erkrankungen gemäß der vorliegenden Erfindung anwendbar sind.
Transketolase-like-1-Genprodukte, wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, können Polypeptide und Nukleinsäuren umfassen, die durch das Transketolase-like-1-Gen codiert werden.
Die für die Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptide und Polynukleotide sind isoliert. Dies bedeutet, dass die Moleküle aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt wurden. Natürlich vorkommende Proteine sind isoliert, wenn sie von einigen oder allen Materialien getrennt sind, welche in der natürlichen Umgebung koexistieren. Polynukleotide sind zum Beispiel isoliert, wenn sie in Vektoren geklont sind.
Humane Transketolase-like-1-Nukleinsäuremoleküle, die für die Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Polynukleotide oder Fragmente davon umfassen. Bevorzugte Polynukleotide können mindestens 20 konsekutive Nukleotide umfassen, vorzugsweise mindestens 30 konsekutive Nukleotide und bevorzugter mindestens 45 konsekutive Nukleotide, die identisch sind, eine gemeinsame Sequenzhomologie aufweisen oder im Vergleich zu Transketolase-like-1-Polypeptiden des Wildtyps identische oder homologe Polypeptide codieren, jedoch keine anderen Transketolase-like-Polypeptide oder Transketolasen codieren. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Detektion und Behandlung von Erkrankungen bereit, welche durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Krebs.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines In-vitro-Verfahrens zur Detektion von Erkrankungen, die durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Krebs, auf der Grundlage der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels der Expression des humanen Transketolase-like-1-Gens, wie in SEQ. ID. Nr. 1 (siehe TKT-L1, TKR: NM_012253; Zugangsnummer X91817) angegeben, in biologischen Proben. Das vorgeschlagene In-vitro-Verfahren umfasst folgende Schritte:

(a) die Detektion des Expressionslevels des humanen Transketolase-like-1-Gens in einer biologischen Probe, die von dem Individuum gewonnen wurde, und in einer Test-Kontrollprobe, und
(b) das Fällen einer Diagnose anhand des Vergleichs des Expressionslevels in der Probe, die aus dem Individuum gewonnen wurde, mit dem Expressionslevel in der Test-Kontrollprobe, wobei eine signifikant erhöhte Expression in der aus dem Individuum gewonnenen Probe eine Überexpression ist und Erkrankungen anzeigt, die durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Forschungs- oder Diagnosetestkit zur Durchführung der Reaktionen, die an diesem In-vitro-Verfahren beteiligt sind, d. h. für die Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels der Überexpression des humanen Transketolase-like-1-Gens.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Inhibitors der Transketolase-like-1-Aktivität zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von Erkrankungen anwendbar sind, die durch abnormale Zellproliferation in Zusammenhang mit der Überexpression von Transketolase-like-1-Genprodukten gekennzeichnet sind.
Transketolase-like-1-Genprodukte, wie sie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Polypeptide und Nukleinsäuren umfassen, welche durch das Transketolase-like-1-Gen codiert werden.
Die Polypeptide und Polynukleotide, die für die Durchführung des In-vitro-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind isoliert. Dies bedeutet, dass die Moleküle aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt wurden. Natürlich vorkommende Proteine sind isoliert, wenn sie von einigen oder allen Materialien getrennt wurden, welche in der natürlichen Umgebung koexistieren. Polynukleotide sind zum Beispiel isoliert, wenn sie in Vektoren geklont sind.
Humane Transketolase-like-1-Nukleinsäuremoleküle, die für die Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Polynukleotide oder Fragmente davon umfassen. Bevorzugte Polynukleotide können mindestens 20 konsekutive Nukleotide umfassen, vorzugsweise mindestens 30 konsekutive Nukleotide und bevorzugter mindestens 45 konsekutive Nukleotide, die identisch sind, eine gemeinsame Sequenzhomologie aufweisen oder im Vergleich zum Wildtyp identische oder homologe Polypeptide codieren, bei Anwendung wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edition, 1989 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynukleotide, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes diejenigen Polypeptide codieren, welche nativ durch humane Transketolase-like-1-Nukleinsäuren codiert werden, während sie nicht den Prozentsatz der Sequenzhomologie zeigen, wie er oben innerhalb der Nukleinsäuresequenz beschrieben wurde. Solche Nukleinsäuren können zum Beispiel durch den Austausch der Codons, welche in den offenbarten Sequenzen vorliegen, durch degenerierte Codons entstehen, wodurch eine synthetische Nukleinsäure hergestellt wird. Die Herstellung solcher künstlicher Nukleinsäuresequenzen kann durch die Verfahren erreicht werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Die humanen Transketolase-like-1-Nukleotidsequenzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können unter Verwendung der bekannten rekombinanten DNA-Techniken zu einer Vielzahl anderer Nukleinsäuresequenzen zusammengefügt werden. Die Sequenzen können zum Beispiel in einen der vielfältigen Klonvektoren geklont werden, wie Plasmide, Phagemide, Lambda-Phagen-Derivate und Cosmide. Ferner können Vektoren wie Expressionsvektoren, Replikationsvektoren, Sondenerzeugungsvektoren und Sequenzierungsvektoren mit den hierin offenbarten Sequenzen zusammengefügt werden.
Sequenzen, die mit den Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung geklont werden können, umfassen sowohl codierende Sequenzen als auch nicht-codierende Sequenzen und regulatorische Sequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancer und Terminatoren. Die hierin offenbarten humanen Transketolase-like-1-Nukleinsäuresequenzen können zum Beispiel in Kombination mit anderen codierenden Sequenzen vorliegen. Diese Sequenzen können eine Vielzahl von Proteinen codieren, wie Enzyme, Rezeptoren, Antigene, immunogene Fragmente oder Epitope, Bindungsproteine usw. Die Nukleinsäuresequenzen können direkt zusammengefügt sein, oder sie können durch einen Nukleinsäureabschnitt getrennt sein, welcher eine Spacer- oder Linker-Region codiert. Die Nukleinsäuresequenzen können auch durch einen Nukleinsäureabschnitt getrennt sein, der nach der Transkription der Sequenz entfernt werden kann. Nicht-codierende Sequenzen, die mit den hierin offenbarten Sequenzen zusammengefügt werden können, können zum Beispiel Promotorregionen, Enhancer, Cis-Regulationselemente, unübersetzte 5'-Regionen, Terminatoren usw. sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die humanen Transketolase-like-1-Polynukleotide so formuliert sein, dass sie in der Lage sind, in prokaryotische oder eukaryotische Zellen, wie Säugetierzellen, einzudringen und in diesen Zellen exprimiert zu werden. Solche Formulierungen können zum Beispiel für therapeutische Zwecke von Nutzen sein. Die Expression von Nukleinsäuresequenzen in Zielzellen kann durch jedes Verfahren erreicht werden, welches dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist. Die Nukleinsäuren können zum Beispiel mit Elementen zusammengefügt werden, die in der Lage sind, ihre Expression in einer Wirtszelle zu ermöglichen. Solche Elemente können Promotoren oder Enhancer umfassen, wie CMV-, SV40-, RSV-, Metallothionein I- oder Polyhedrin-Promotoren bzw. CMV- oder SV40-Enhancer. Mögliche Verfahren für die Expression sind zum Beispiel der Einschluss des Polynukleotids in einen viralen Vektor, einschließlich Adenovirus, adeno-assoziierter Virus, Retrovirus, Vakziniavirus oder Pockenvirus. Virale Vektoren zum Zweck der Expression von Nukleinsäuren in Säugetierwirtszellen können pcDNA3, pMSX, pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4 usw. umfassen. Diese Techniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Fragmente der hierin verwendeten humanen Transketolase-like-1-Sequenz können Oligonukleotide wie Nukleinsäuresonden für Hybridisierungszwecke, Primer für Amplifizierungsreaktionen oder Antisense-Konstrukte zur Verwendung bei Antisense-Techniken umfassen. Nukleinsäuresonde gemäß der vorliegenden Erfindung kann jede Nukleinsäuresonde sein, die eine Sequenz aufweist, die mindestens zu 80% identisch mit einem Teil von mindestens 15 konsekutiven Nukleotiden der humanen Transketolase-like-1-Gen-Nukleinsäuresequenz ist, oder komplementär oder revers-komplementär zu einer solchen Sequenz ist, jedoch nicht mit einer anderen Transketolase- oder Transketolase-ähnlichen Sequenz hybridisiert. Die Nukleinsäuresonden gemäß der vorliegenden Erfindung sind ferner dadurch gekennzeichnet, dass sie unter stringenten Bedingungen zu Nukleinsäuren mit der hierin offenbarten Sequenz hybridisieren. Primer können alle Nukleotide sein, die geeignet sind, eine spezifische Amplifizierungsreaktion durchzuführen. Somit können die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Primer Nukleinsäureoligomere mit mindestens 15 konsekutiven Nukleotiden mit einer Sequenzidentität von mindestens 80% im Vergleich zu der humanen Transketolase-like-1-Gensequenz sein, oder sie können komplementär oder revers-komplementär zu einer solchen Sequenz sein. Die Primer gemäß der vorliegenden Erfindung hybridisieren spezifisch mit der hierin offenbarten Sequenz oder mit einem Teil davon, und zwar unter Bedingungen, die im Verlauf einer Nukleinsäure-Amplifizierungsreaktion geeigneterweise angewandt werden. Jedoch hybridisieren sie nicht mit einer anderen Transketolase- oder Transketolase-ähnlichen Sequenz. Antisense-Oligonukleotide, wie hierin verwendet, können Nukleinsäuremoleküle sein, die revers-komplementär zu den Transkripten der offenbarten Codiersequenz sind, und die in der Lage sind, sich durch Basenpaarung an die Transkripte zu binden und so die Expression der Codiersequenz hemmen oder reduzieren.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuren können auch chemisch vorbehandelte Nukleinsäuren sein. Solche chemisch vorbehandelte Nukleinsäure kann jede hierin offenbarte Nukleinsäure sein, welche mit einem chemischen Agens behandelt wurde, das geeignet ist, zu Modifikationen in den Nukleinsäuremolekülen zu führen. Die Modifikationen können zum Beispiel spezifische Modifikationen bestimmter Basen innerhalb der Nukleinsäure umfassen. Solche chemischen Behandlungen können die Behandlung mit z. B. Natriumbisulfit, Hydrazin oder Kaliumpermanganat umfassen. Die Sequenzen von besonderem Interesse bei Experimenten unter Verwendung der chemischen Vorbehandlung von Nukleinsäuren können zum Beispiel codierende oder nicht-codierende Regionen der Sequenzen umfassen. Beispiele nicht-codierender Regionen, die mit Chemikalien behandelt werden können, sind Promotorregionen oder CpG-Inseln in 5'-UTRs.
Humane Transketolase-like-1-Polypeptide, wie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, können Aminosäureketten jeder Länge umfassen, einschließlich Proteine kompletter Länge, wobei die Aminosäurereste durch kovalente Peptidbindungen verbunden sind. So kann ein Polypeptid, welches einen Abschnitt eines der oben genannten humanen Transketolase-like-1-Proteine umfasst, z. B. ein Protein, welches die Aminosäuresequenz des humanen Transketolase-like-1-Proteins umfasst, komplett aus dem Abschnitt bestehen, oder der Abschnitt kann innerhalb eines größeren Polypeptids, welches zusätzliche Sequenzen enthält, vorliegen. Die zusätzlichen Sequenzen können von dem nativen Protein abgeleitet sein oder sie können heterolog sein, und solche Sequenzen können (müssen aber nicht) immunreativ und/oder antigen sein. Wie unten detailliert ausgeführt wird, können solche Polypeptide aus Tumorgewebe isoliert oder durch synthetische oder rekombinante Mittel hergestellt werden.
Wie hierin verwendet, wird ein Polypeptid, das biologische Eigenschaften des humanen Transketolase-like-1-Polypeptids zeigt, als ein Polypeptid verstanden, welches mindestens eine der Aktivitäten des humanen Transketolase-like-1-Polypeptids zeigt, wie enzymatische Aktivitäten (Transketolase-Aktivität), Interprotein-Interaktions-aktivitäten, Enzymatische Aktivität als Reaktion auf die Anwesenheit von Thiamin oder antigene oder immunogene Eigenschaften, wie z. B. die Fähigkeit zur Bindung eines Antikörpers direkt an das Polypeptid (d. h. es umfasst einen immunogenen Abschnitt).
Ein immunogener Abschnitt, wie hierin verwendet, ist ein Abschnitt eines Proteins, welcher durch einen B-Zellen- und/oder T-Zellen-Oberflächenantigenrezeptor erkannt wird. Die immunogenen Abschnitte umfassen mindestens 5 Aminosäurereste, bevorzugter mindestens 10 Aminosäurereste und am bevorzugtesten mindestens 15 Aminosäurereste des hierin offenbarten Proteins. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden bestimmte Domains des Proteins gelöscht, zum Beispiel transmembrane Domainen oder N-Terminus-Leader-Sequenzen.
Die immunogenen Abschnitte gemäß der vorliegenden Erfindung reagieren mit Antiseren oder spezifischen Antikörpern mit der gleichen oder nahezu der gleichen Intensität wie native Proteine kompletter Länge. Die immunogenen Abschnitte werden grundsätzlich unter Verwendung von in der Technik gut bekannter Verfahren identifiziert. Mögliche Verfahren sind zum Beispiel das Screening der Polypeptide auf die Fähigkeit, mit antigenspezifischen Antikörpern, Antiseren und/oder T-Zelllinien oder -klonen zu reagieren.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten humanen Transketolase-like-1-Polypeptide umfassen auch Varianten der nativen Proteine. Diese Varianten können sich von dem nativen Protein in einer oder mehreren Veränderungen unterscheiden, wie Substitutionen, Löschungen, Additionen und/oder Einschübe. Die Immunreaktivität und/oder biologische Aktivität der Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung wird im Vergleich zu den nativen Proteinen nicht wesentlich verringert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verringert sich die Immunreaktivität und/oder Aktivität um weniger als 50%, und in einer bevorzugteren Ausführungsform verringert sich die Immunreaktivität und/oder Aktivität um weniger als 20% im Vergleich zu den nativen Polypeptiden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Varianten der Polypeptide variiert werden, und zwar so, dass die Aktivität des nativen Proteins erhöht wird, verringert wird oder verloren geht. Diese Varianten können zum Beispiel bei der Therapie von Erkrankungen in Zusammenhang mit der Überexpression des humanen Transketolase-like-1-Gens eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können Varianten in einem oder mehreren Abschnitten, wie zum Beispiel N-Terminus-Leader-Sequenzen, transmembrane Domainen oder kleinen N- und/oder C-Terminus-Sequenzen fehlerhaft sein. Diese Varianten zeigen vorzugsweise 70%, bevorzugter mindestens 90% und am bevorzugtesten mindestens 95% Identität mit den gemäß der vorliegenden Erfindung offenbarten Polypeptiden.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Varianten umfassen vorzugsweise konservative Substitutionen, so dass die veränderten Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt werden. Zu den betreffenden Eigenschaften können zählen: Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilität und/oder die amphipathische Natur der Aminosäurereste.
Die gemäß der Erfindung verwendeten Varianten können auch zusätzliche Terminus-Leader-Sequenzen, Linker oder Sequenzen, welche die Synthese, Aufreinigung oder Stabilität der Polypeptide auf eine einfachere oder bequemere Art und Weise ermöglichen, umfassen.
Varianten der in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptide können mittels konventioneller molekularbiologischer Prozesse hergestellt werden (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Zum Beispiel ist es möglich, unterschiedliche Mutationen in die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung einzufügen. Aufgrund dessen kann ein humanes Transketolase-like-1-Polypeptid mit möglicherweise modifizierten biologischen Eigenschaften synthetisiert werden. Eine Möglichkeit ist die Herstellung von Deletionsmutanten, in welchen Nukleinsäuremoleküle durch kontinuierliche Deletionen vom 5'- oder 3'-Terminus der codierenden DNA-Sequenz erzeugt werden, und die zur Synthese von Polypeptiden führen, die dementsprechend verkürzt sind. Eine weitere Möglichkeit ist das Einfügen von Einzelpunktmutationen an Positionen, wo eine Modifikation der Aminosäuresequenz z. B. die Enzymaktivität oder die Regulation des Enzyms beeinflusst. Durch dieses Verfahren können zum Beispiel Muteine hergestellt werden, welche einen modifizierten Km-Wert besitzen oder welche nicht mehr den Regulationsmechanismen unterliegen, welche normalerweise in der Zelle existieren, z. B. hinsichtlich der allosterischen Regulation oder kovalenten Modifikation. Solche Muteine könnten z. B. als therapeutisch nützliche Zusammensetzungen, z. B. Antagonisten, von Bedeutung sein.
Für die Manipulation in prokaryotischen Zellen mit Hilfe von Gentechnik können die Nukleinsäuremoleküle, die für die Verfahren der Erfindung verwendet werden, oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingefügt werden, welche eine Mutagenese oder eine Modifikation einer Sequenz durch Rekombination von DNA-Sequenzen zulassen. Mittels konventioneller Verfahren (siehe Sambrook et al., oben) können Basen ausgetauscht werden, und natürliche oder synthetische Sequenzen können hinzugefügt werden. Um die DNA-Fragmente miteinander zu verknüpfen, können Adapter oder Linker zu den Fragmenten hinzugefügt werden. Ferner können Manipulationen durchgeführt werden, welche geeignete Spaltstellen bereitstellen, oder welche überflüssige DNA oder Spaltstellen entfernen. Wenn Einschübe, Deletionen oder Substitutionen möglich sind, können In-vitro-Mutagenese, Primer-Repa ratur, Restriktion oder Ligation durchgeführt werden. Als Analyseverfahren können üblicherweise Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und andere biochemische oder molekularbiologische Verfahren verwendet werden.
Die Polypeptide können Fusions- oder chimäre Polypeptide sein, welche die hierin offenbarten Sequenzen enthalten. Fusionproteine umfassen das erfindungsgemäße Polypeptid, einen Abschnitt davon oder Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Abschnitte davon zusammen mit allen zweiten und weiteren Polypeptiden, wie noch einmal das erfindungsgemäße Polypeptid, ein Abschnitt davon oder Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Abschnitte davon und/oder alle heterologen Polypeptide. Heterologe Polypeptide können Enzyme, Rezeptormoleküle, Antigene, antigene oder immunogene Epitope oder Fragmente davon, Antikörper oder Fragmente davon, Signalisierungspolypeptide oder Signalübermittlungspolypeptide usw. umfassen. Das immunogene Protein kann zum Beispiel in der Lage sein, eine Erinnerungsreaktion hervorzurufen. Zu Beispielen solcher Proteine zählen Tetanus-, Tuberkulose- und Hepatitis-Proteine (siehe zum Beispiel Stoute et al. New Engl. J. Med., 336:86–91 (1997)). In einer Ausführungsform der Erfindung können die Fusionspeptide für die verstärkte Detektion oder Aufreinigung der Polypeptide konstruiert sein. Zum Zweck der Aufreinigung können Tags, wie z. B. his-Tags, myc-Tags usw., zu den Polypeptiden hinzugefügt sein. Zum Zweck der Detektion antigener Abschnitte können Enzyme, chromogene Sequenzen usw. mit den Polypeptiden verschmolzen sein. Zu den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung kann (muss jedoch nicht) ein Linker-Peptid zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid zählen.
Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein Fusionsprotein codiert, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird konstruiert unter Verwendung bekannter rekombinanter DNA-Techniken zum Einbauen separater, das erste und zweite Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenzen in einen geeigneten Expressionsvektor. Das 3'-Ende einer Nukleinsäuresequenz, welche das erste Polypeptid codiert, ist mit oder ohne einem Peptid-Linker an das 5'-Ende einer Nukleinsäuresequenz, welche das zweite Polypeptid codiert, ligiert. Dadurch werden passende Leserahmen der Sequenzen sichergestellt, die eine mRNA-Translation der beiden Nukleinsäuresequenzen in ein einzelnes Fusionsprotein erlauben, welches die biologische Aktivität von sowohl dem ersten als auch dem zweiten Polypeptid beibehält.
Eine Peptid-Linker-Sequenz kann eingesetzt werden, um das erste und zweite Polypeptid mit einem ausreichenden Abstand zu trennen, der sicherstellt, dass sich jedes Polypeptid in seine sekundäre und tertiäre Struktur faltet. Eine solche Peptid-Linker-Sequenz wird mit Hilfe von Standardverfahren, die in der Technik gut bekannt sind, in das Fusionsprotein eingefügt. Geeignete Peptid-Linker-Sequenzen können auf der Grundlage der folgenden Faktoren ausgewählt werden: (1) ihre Fähigkeit, eine flexible erweiterte Konformation anzunehmen; (2) ihre Unfähigkeit, eine sekundäre Struktur anzunehmen, die mit funktionalen Epitopen auf dem ersten und zweiten Polypeptid interagieren könnte; und (3) das Fehlen hydrophober oder geladener Reste, die mit den funktionalen Epitopen der Polypeptide reagieren könnten. Zu bevorzugten Peptid-Linker-Sequenzen zählen Gly-, Asn- und Ser-Reste. Andere nahezu neutrale Aminosäuren wie Thr und Ala können auch in der Linker-Sequenz verwendet werden. Zu Aminosäuresequenzen, welche auch brauchbar als Linker eingesetzte werden können, zählen diejenigen, die in Maratea et al., Gene 40: 39–46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258–8262, 1986; US-Patentschrift Nr. 4,935,233 und US-Patentschrift Nr. 4,751,180 offenbart sind. Die Linker-Sequenz kann eine Länge von 1 bis etwa 50 Aminosäuren aufweisen. Peptidsequenzen sind nicht erforderlich, wenn das erste und zweite Polypeptid nicht-essentielle N-Terminus- Aminosäureregionen aufweisen, welche verwendet werden können, um die funktionalen Domainen zu trennen und sterische Interferenz zu verhindern.
Die in dem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung verwendeten humanen Transketolase-like-1-Polypeptide und Nukleinsäuren, die solche Polypeptide codieren, können unter Verwendung eines der vielfältigen, die in der Technik gut bekannten Verfahren aus Tumorgewebe isoliert werden. Nukleinsäuresequenzen, welche einem Gen (oder einem Abschnitt davon) entsprechen, das/der eines der erfindungsgemäßen Tumorpolypeptide codiert, können auch unter Verwendung einer Subtraktionstechnik aus einer Tumor-cDNA-Bibliothek isoliert werden. So gewonnene unvollständige Nukleinsäuresequenzen können verwendet werden, um Oligonukleotidprimer zu konstruieren für die Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen kompletter Länge aus einer humanen genomischen Nukleinsäurebibliothek oder aus einer Tumor-cDNA-Bibliothek in einer Polymerasekettenreaktion (PCR – polymerase chain reaction), und zwar unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind (siehe zum Beispiel Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich Ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989). Für diesen Ansatz können sequenzspezifische Primer auf der Grundlage der hierin bereitgestellten Nukleotidsequenzen entworfen und erworben oder synthetisiert werden.
Die humanen Transketolase-like-1-Polypeptide, die für das hierin offenbarte Verfahren verwendet werden, können auch mit synthetischen Mitteln erzeugt werden. Insbesondere können synthetische Polypeptide mit weniger als etwa 100 Aminosäuren und üblicherweise weniger als etwa 50 Aminosäuren unter Verwendung von Verfahren erzeugt werden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Zum Beispiel können solche Polypeptide unter Verwendung eines der kommerziell verfügbaren Festphasenver fahren synthetisiert werden, wie dem Merrifield-Festphasen-Syntheseverfahren, bei dem Aminosäuren sequentiell zu einer wachsenden Aminosäurekette hinzugefügt werden (siehe zum Beispiel Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2146, 1963). Vorrichtungen für die automatisierte Synthese von Polypeptiden sind im Handel von Lieferanten wie Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, Kalif.) erhältlich und können gemäß der Herstelleranweisungen bedient werden.
Die ligierten Nukleinsäuresequenzen, welche die in den hierin offenbarten Verfahren verwendeten Polypeptide codieren, sind funktionsfähig mit geeigneten Transkriptions- oder Translationsregulationselementen verbunden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Die Regulationselemente, die für die Nukleinsäureexpression verantwortlich sind, können sich z. B. 5' zu der Nukleinsäuresequenz, welche das erste Polypeptid innerhalb der codierenden Sequenzen codiert, oder 3' zu den Nukleinsäuresequenzen, welche das erste oder ein weiteres Polypeptid codieren, befinden. Stoppcodons, die zum Beenden von Translations- und Trans kriptionsterminierungssignalen erforderlich sind, befinden sich 3' zu der Nukleinsäuresequenz, die das zweite Polypeptid codiert.
Die für die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptide können isoliert werden. Dies bedeutet, dass die Moleküle aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt werden können. Natürlich vorkommende Protein werden isoliert, wenn sie von einigen oder allen Materialen getrennt werden, welche in der natürlichen Umgebung koexistieren. Polynukleotide sind zum Beispiel isoliert, wenn sie in Vektoren geklont sind.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, die unten detaillierter beschrieben sind, können die in einem der hierin offenbarten Verfahre, verwendeten Polypeptide in einer isolierten, im Wesentlichen reinen Form hergestellt werden (d. h. die Polypeptide sind homogen, soweit es sie Bestimmung der Aminosäurenzusammensetzung und Primärsequenzanalyse betrifft). Vorzugsweise sind die Polypeptide zu mindestens etwa 90% rein, bevorzugter zu mindestens etwa 95% rein und am bevorzugtesten zu mindestens etwa 99% rein. Die im Wesentlichen reinen Polypeptide können zum Beispiel in pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung verwendet ferner Bindungsagenzien, die spezifisch an ein humanes Transketolase-like-1-Protein binden. Diese Bindungsagenzien können zum Beispiel Antikörper und Antigen-bindende Fragmente, bifunktionelle Hybridantikörper, Peptidomimetika-enthaltende minimale Antigen-bindende Epitope usw. umfassen.
Ein Antikörper oder Antigen-Bindungsagens reagiert spezifisch, wenn er/es auf einem erkennbaren Level mit einem hierin verwendeten Protein reagiert, und er/es nicht signifikant mit anderen Proteinen reagiert. Die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. In der Verwendung hierin soll der Begriff Antikörper oder monoklonaler Antikörper sowohl intakte Moleküle als auch Antikörperfragmente (wie zum Beispiel Fab- und F(ab')2-Fragmente) beinhalten, welche zur spezifischen Bindung an ein Protein in der Lage sind. Fab- und F(ab')2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment intakter Antikörper, sie verschwinden schneller aus dem Kreislauf, und sie können weniger nichtspezifische Gewebebindung aufweisen als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316–325 (1983). Somit sind diese Fragmente wie auch die Produkte einer Fab- oder einer anderen Immunglobulin-Expressionsbibliothek bevorzugt. Darüber hinaus zählen zu den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörpern Chimäre, Einzelketten- und humanisierte Anti körper.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Bindungsagenzien isoliert oder in Kombination verwendet werden. Mit Hilfe von Kombinationen ist es möglich, ein höheres Maß an Sensitivität zu erreichen. Der Begriff Antikörper betrifft vorzugsweise Antikörper, welche im Wesentlichen aus gepoolten monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen epitopen Spezifitäten bestehen, sowie einzelne monoklonale Antikörperpräparate.
Monoklonale Antikörper werden aus Antigen-haltigen Fragmenten des Polypeptids, welches in der Erfindung verwendet wird, hergestellt, und zwar unter Verwendung eines der vielfältigen Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt sind,; siehe z. B. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Bei einem solchen Verfahren wird ein Immunogen, welches das antigene Polypeptid oder einen synthetischen Teil davon umfasst, zu Beginn in irgendeines der großen Vielzahl von Säugetieren injiziert (z. B. Mäuse, Ratten, Hasen, Schafe und Ziegen). In diesem Schritt können die Polypeptide dieser Erfindung ohne Modifikation als das Immunogen dienen. Alternativ dazu kann insbesondere für relativ kurze Polypeptide eine bessere Immunreaktion ausgelöst werden, wenn das Polypeptid mit einem Trägerprotein, wie Rinderserumalbumin oder Keyhole Limpet Hemocyanin verbunden wird. Das Immunogen wird in den tierischen Wirt injiziert, vorzugsweise gemäß eines vorbestimmten Zeitplans, welcher eine oder mehrere Booster-Immunisierungen beinhaltet, und den Tieren wird periodisch Blut genommen. Polyklonale Antikörper, die spezifisch für das Polypeptid sind, können dann aus solchen Antiseren aufgereinigt werden, zum Beispiel durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des Polypeptids gekoppelt an einen geeigneten festen Träger.
Monoklonale Antikörper, die spezifisch sind für das antigene Polypeptid von Interesse, können zum Beispiel hergestellt werden unter Verwendung der Technik von Köhler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511–519, 1976 und Verbesserungen davon. Kurz, diese Verfahren beinhalten die Herstellung unsterblicher Zelllinien, die in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, welche die gewünschte Spezifität aufweisen (d. h. Reaktivität mit dem Polypeptid von Interesse). Solche Zelllinien können zum Beispiel aus Milzzellen hergestellt werden, die aus einem Tier gewonnen wurden, das wie oben beschrieben immunisiert wurde. Die Milzzellen werden dann immortalisiert, zum Beispiel durch Fusion mit einem Myelom-Zellfusionspartner, vorzugsweise einem, der gen-identisch mit dem immunisierten Tier ist. Eine Vielzahl von Fusionstechniken kann eingesetzt werden. Zum Beispiel können die Milzzellen und Myelomzellen für ein paar Minuten mit einem nichtionischen Detergens kombiniert und dann mit geringer Dichte auf ein selektives Medium plattiert werden, welches das Wachstum von Hybridzellen, jedoch nicht von Myelomzellen unterstützt. Eine bevorzugte Auswahltechnik verwendet die HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) – Auswahl. Nach einer ausreichenden Zeit, üblicherweise etwa 1 bis 2 Wochen, werden Kolonien von Hybriden beobachtet. Einzelne Kolonien werden ausgewählt und auf Bindungsaktivität gegen das Polypeptid getestet. Hybridomas mit einer hohen Reaktivität und Spezifität werden bevorzugt.
Monoklonale Antikörper können aus den Überständen wachsender Hybridomkolonien isoliert werden. Außerdem können verschiedene Techniken eingesetzt werden, um den Ertrag zu verbessern, wie die Injektion der Hybridomzelllinie in die Bauchfellhöhle eines geeigneten Wirbeltierwirtes wie einer Maus. Monoklonale Antikörper können dann aus dem Aszites-Fluid oder dem Blut gewonnen werden. Kontaminanten können durch konventionelle Techniken wie Chromatographie, Gelfiltration, Präzipitation und Extraktion aus den Anti körpern entfernt werden. Die humanen Transketolase-like-1-Polypeptide können im Aufreinigungsprozess, zum Beispiel in einem Affinitätschromatographieschritt, verwendet werden.
Die für humane Transketolase-like-1 spezifischen Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können weitere Bindungsstellen entweder für therapeutische Agenzien oder andere Polypeptide umfassen oder sie können an die therapeutischen Agenzien oder Polypeptide gekoppelt sein.
Therapeutische Agenzien können Arzneimittel, Toxine, Radionuklide oder Derivate davon umfassen. Die Agenzien können entweder direkt oder indirekt an die Bindungsagenzien gekoppelt sein, zum Beispiel durch eine Linker- oder Trägergruppe. Die Linker-Gruppe kann zum Beispiel so funktionieren, dass sie die Kopplungsreaktion zwischen dem Bindungsagens und dem therapeutischen oder anderen Agens ermöglicht oder der Linker kann als ein Spacer zwischen den einzelnen Teilen des Fusionsmoleküls agieren. Der Linker kann auch unter bestimmten Umständen spaltbar sein, um das gebundene Agens unter diesen Bedingungen freizusetzen. Die therapeutischen Agenzien können direkt oder über eine Linker-Gruppe kovalent an Trägergruppen gekoppelt sein. Das Agens kann auch nicht-kovalent an den Träger gekoppelt sein. Träger, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel Albumine, Polypeptide, Polysaccharide oder Liposome.
Die für humane Transketolase-like-1 spezifischen Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können an ein oder mehrere Agenzien gekoppelt sein. Die mehreren Agenzien, die an einen Antikörper gekoppelt sein können, können alle der gleichen Spezies angehören, oder es können mehrere unterschiedliche Agenzien an einen Antikörper gebunden sein.
Die hierin offenbarten Verfahren sind auf alle eukaryotischen Organismen anwendbar, die zu Erkrankungen neigen, welche mit der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens einhergehen. Individuen, wie sie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können zum Beispiel Säugetiere umfassen, wie z. B. Tiere von landwirtschaftlichem Interesse (Kühe, Schafe, Pferde, Schweine usw.), Gefährtentiere (Katzen, Hunde usw.), häufig für Forschungszwecke eingesetzte Tiere (Ratten, Mäuse, Hamster usw.) oder Menschen.
Die Diagnose, wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, kann das Bestimmen des Levels von humanen Transketolase-like-1-Genprodukten in einer Probe umfassen. Auf der Grundlage des bestimmten Levels der humanen Transketolase-like-1-Genprodukte in den Proben können Individuen in Untergruppen unterteilt werden. Die Untergruppen können nach klinischen Daten, wie z. B. Überleben, Wiederauftreten der Krankheit, Häufigkeit von Metastasen usw., in Relation zu den in den Proben bestimmten jeweiligen Leveln der Transketolase-like-1-Genprodukte erstellt werden.
Auf der Grundlage dieser Untergruppen kann eine Prognose erstellt werden. Gemäß der Untergruppen kann die Therapie der von den Tumore betroffenen Individuen zugeschnitten werden.
Zum Beispiel lassen die Überexpression des Transketolase-like-1-Gens und eine verstärkte Aktivität des Pentosephosphatzyklus bei einer Untergruppe der Kolon-, Magen-, Pankreas- und Lungentumore auf einen Mechanismus schließen, bei dem Thiamin (Vitamin B1) die Nukleinsäure-Ribosesynthese und die Tumorzellproliferation über den nicht-oxidativen Transketolase-Reaktionsweg fördert. Daher hat bei Krebspatienten die Thiamin-Einnahme direkte Auswirkungen auf die Wachstumsrate von Tumoren mit einer Überexpression des Transketolase-like-1-Gens. Dies stellt auch Hintergrundinformationen bereit und hilft bei der Entwicklung von Richtlinien für alternative Behandlungen mit Antithiamin-Transketolase-Inhibitoren im klinischen Umfeld. Klinische und experimentelle Daten demonstrieren die erhöhte Thiaminaufnahme humaner Tumore und ihre Interferenz mit experimenteller Chemotherapie. Die Analyse der RNA-Ribose zeigt, dass Glukose-Kohlenstoffe zu über 90% zur Ribosesynthese in kultivierten Zervix- und Pankreaskarzinomzellen beitragen, und dass Ribose primär über den Thiamin-abhängigen Transketolase-Reaktionsweg (>70%) synthetisiert wird. Antithiamin-Verbindungen hemmen in mehreren Tumormodellen in vitro und in vivo die Nukleinsäuresynthese und Tumorzellproliferation signifikant. Die medizinische Literatur liefert nur wenige Informationen hinsichtlich der Rolle der Thiamin-abhängigen Transketolase-Reaktion bei der Tumorzellen-Riboseproduktion, welche einen zentralen Prozess bei der de-novo-Nukleinsäuresynthese und den Salvage-Pathways für Purine darstellt.
Da in Tumoren der Thiamin-abhängige Transketolase-Reaktionsweg der zentrale Weg der Bereitstellung von Ribosephosphat für Nukleinsäuren ist, kann eine übermäßige Thiaminanreicherung für fehlgeschlagene therapeutische Versuche zum Beenden der Krebszellproliferation verantwortlich sein. Die Detektion einer Untergruppe von Kolon- und Lungentumoren mit einer Überexpression des Transketolase-like-1-Gens stellt einen wichtigen Schritt für eine individualisierte Krebstherapie bereit, und die begrenzte Verabreichung von Thiamin und eine begleitende Behandlung mit Transketolase-Inhibitoren ist ein rationalerer Ansatz zur Behandlung von Krebs.
Somit können auf der Grundlage der Detektion der Überexpression von TKT-L1 neue Behandlungsstrategien zugeschnitten werden, welche über Hormone, die den Glukosestoffwechsel betreffen, auf spezifische biochemische Reaktionen des Pentosephosphatzyklus abzielen, oder welche die Aufnahme von Thiamina, der Cofaktor der nicht-oxidativen Transketolase-Pentosephosphatzyklus-Reaktion, steuern, oder welche Krebspatienten mit Antithiamin-Analoga behandeln.
Folglich können in einer Ausführungsform der Erfindung solche Erkrankungen, die durch die Überexpression des humanen Transketolase-like-1-Gens gekennzeichnet sind, gemäß dem Level der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens behandelt werden. Die Verwendung der nicht-oxidativen Pentosephosphatzyklus-Reaktionen zur Hemmung der Glukose unter selektiver Ausnutzung der Reaktionswege für die Nukleinsäureproduktion bietet einen neuen Angriffspunkt für die Krebsbehandlung mit einer starken regulatorischen Wirkung auf den Zellzyklus.
In einer Ausführungsform kann die Behandlung von Erkrankungen, die in Zusammenhang mit der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens stehen, die eingeschränkte Verabreichung von Thiamin an die betroffenen Individuen umfassen. In einer weiteren Ausführungsform kann die Behandlung die Verabreichung von Transketolase-Inhibitoren, wie z. B. Antithiamin-Verbindungen, umfassen.
Das Monitoring kann die Detektion des Levels humaner Transketolase-like-1-Genprodukte in Proben umfassen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen wurden, sowie das Bestimmen der Veränderungen dieser Level. Gemäß dieser Veränderungen kann der Verlauf der Krankheit verfolgt werden. Der Verlauf der Krankheit kann wiederum verwendet werden, um Therapiestrategien für das bestimmte Individuum auszuwählen.
Ein weiterer Aspekt der Diagnose und des Monitorings des Krankheitsverlaufs gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Detektion minimaler Resterkrankung umfassen. Dies kann zum Beispiel die Detektion eines Levels humaner Transketolase-like-1-Genprodukte in einer oder mehreren Körperproben nach anfänglicher Therapie eines Individuums einmalig oder zu mehreren Zeitpunkten umfassen. Gemäß des Levels humaner Transketolase-like-1-Genprodukte, das in den Proben festgestellt wurde, kann eine geeignete Therapie für das bestimmte Individuum ausgewählt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Diagnoseverfahren durchgeführt, um gestreute Tumorzellen in biologischen Proben zu detektieren, als Diagnose einer minimalen Resterkrankung (MRD – minimal residual disease).
Erkrankungen, die durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, können zum Beispiel Neoplasmen wie benigne und maligne Tumore, Karzinome, Sarkome, Leukämien, Lymphome oder Dysplasien umfassen. Tumore können Tumore des Kopfes und des Halses, Tumore der Atemwege, Tumore des Magen-Darm-Traktes, Tumore der Harnwege, Tumore des Fortpflanzungssystems, Tumore des endokrinen Systems, Tumore des zentralen und peripheren Nervensystems, Tumore der Haut und ihrer Fortsätze, Tumore der Weichgewebe und Knochen, Tumore des lymphopoetischen und hämatopoetischen Systems usw. umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Tumor zum Beispiel Krebs des Kopfes und des Halses, Krebs der Atemwege, Krebs des Magen-Darm-Traktes, Krebs der Haut und ihrer Fortsätze, Krebs des zentralen und peripheren Nervensystems, Krebs der Harnwege, Krebs des Fortpflanzungssystems, Krebs des endokrinen Systems, Krebs der Weichgewebe und Knochen oder Krebs des hämatopoetischen und lymphopoetischen Systems. In der bevorzugtesten Ausführungsform der Erfindung ist das Karzinom Gebärmutterhalskrebs, Kolonkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs, Blasenkrebs usw.
Die Tumore gemäß der vorliegenden Erfindung können Tumore umfassen, welche erkennbare Lymphknotenbeteiligung zeigen (knotenpositive Tumore) sowie Tumore ohne erkennbare Ausbreitung zu den Lymphknoten (knotennegative Tumore). In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Magen-Darm-Tumore Tumore ohne erkennbare Ausbreitung zu den Lymphknoten.
Eine Probe gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jede Probe umfassen, die Zellen oder Zelltrümmer umfasst. Proben können Proben mit klinischer Relevanz umfassen, wie z. B. Sekrete, wie Magensaft, Galle oder Pankreassaft, Abstriche, Körperflüssigkeiten, wie Serum, Blut, Plasma, Urin, Samen, Stuhl, Biopsien oder Zell- und Gewebeproben. Biopsien, wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, können z. B. Resektionsproben von Tumoren, Gewebeproben hergestellt durch endoskopische Mittel oder Nadelbiopsien von Organen umfassen. Ferner kann jede Probe, die potentiell die zu erkennenden Markermoleküle enthält, eine Probe gemäß der vorliegenden Erfindung sein.
Solche Proben können zum Beispiel intakte Zellen, lysierte Zellen oder alle Flüssigkeiten, die Proteine, Peptide oder Nukleinsäuren enthalten, umfassen. Sogar Feststoffe, an denen Zellen, Zellfragmente oder Markermoleküle, wie humane Transketolase-like-1-Nukleinsäuren oder humane Transketolase-like-1-Proteine, anhaften können, können Proben gemäß der vorliegenden Erfindung sein. Solche Feststoffe können zum Beispiel Membranen, Glasobjektträger, Perlen usw. sein.
Die Herstellung einer Probe kann z. B. das Gewinnen einer Probe aus einem Gewebe, einer Körperflüssigkeit, aus Zellen oder aus Zelltrümmern von einem Patienten umfassen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Herstellung der Probe auch mehrere Schritte der weiteren Bearbeitung der Probe umfassen, wie die Herstellung von Präparaten, die Herstellung lysierter Zellen, die Herstellung von Gewebeanordnungen, die Isolierung von Polypeptiden oder Nukleinsäuren, die Herstellung von fixierten Festphasenpeptiden oder Nukleinsäuren oder die Herstellung von Perlen, Membranen oder Objektträgern, an welche die zu bestimmenden Moleküle kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt werden.
Das Verfahren zur Detektion des Levels des humanen Transketolase-like-1-Genproduktes gemäß der vorliegenden Erfindung ist jedes Verfahren, welches geeignet ist, sehr kleine Mengen spezifischer biologisch aktiver Moleküle in biologischen Proben zu erkennen. Die Detektionsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Detektion entweder auf dem Nukleinsäurelevel oder auf dem Polypeptidlevel.
Die Detektion kann in Lösung oder unter Verwendung von Reagenzien, die an einer Festphase fixiert sind, durchgeführt werden. Die Detektion von einem oder mehreren Molekularmarkern, wie z. B. Polypeptide oder Nukleinsäuren, kann in einer einzelnen Reaktionsmischung oder in zwei oder separaten Reaktionsmischungen durchgeführt werden. Alternativ dazu können die Detektionsreaktionen für mehrere Markermoleküle zum Beispiel gleichzeitig in Multi-Well-Reaktionsgefäßen durchgeführt werden. Die Marker, die charakteristisch für die humanen Transketolase-like-1-Genprodukte sind, können unter Verwendung von Reagenzien erkannt werden, welche diese Moleküle spezifisch erkennen. Die Detektionsreaktion für die Markermoleküle kann eine oder mehrere Reaktionen mit Detektionsagenzien umfassen, welche entweder die Anfangsmarkermoleküle erkennen oder die vorherigen Moleküle erkennen, die zur Detektion anderer Moleküle verwendet wurden.
Die Detektionsreaktion kann ferner eine Reporterreaktion umfassen, welche die Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder das Level der humanen Transketolase-like-1-Genmarker anzeigt. Die Reporterreaktion kann zum Beispiel eine Reaktion sein, die eine farbige Verbindung erzeugt, eine Biolumineszenzreaktion, eine Fluoreszenzreaktion, generell eine Strahlungs-emittierende Reaktion usw. In einer bevorzugten Ausführungsform können unterschiedliche Markermoleküle durch Agenzien erkannt werden, die unterschiedliche Reportersignale erzeugen, so dass die Signale, die sich auf Markermoleküle beziehen, unterschieden werden können.
Anwendbare Formate für die Detektionsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung können Blotting-Techniken wie Western-Blot, Southern-Blot oder Northern-Blot sein. Die Blotting-Techniken sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt und können zum Beispiel als Elektro-Blots, semitrockene Blots, Vakuum-Blots oder Dot-Blots durchgeführt werden. Amplifizierungsreaktionen können auch für die Detektion von z. B. Nukleinsäuremolekülen anwendbar sein. Ferner können immunologische Verfahren für die Detektion von Molekülen angewandt werden, wie zum Beispiel Immunpräzipitation oder immunologische Assays wie ELISA, RIA, Lateral-Flow-Assays, immunzytochemische Verfahren usw.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Detektion des Levels der humanen Transketolase-like-1-Genprodukte durch Detektion des Levels der Nukleinsäuren, welche die humanen Transketolase-like-1-Genprodukte oder Fragmente davon, die in der Probe vorliegen, codieren. Die Mittel zur Detektion von Nukleinsäuremolekülen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Das Verfahren für die Detektion von Nukleinsäuren kann zum Beispiel durch eine Bindungsreaktion des zu erkennenden Moleküls an komplementäre Nukleinsäuresonden, Proteine mit Bindungsspezifität für Nukleinsäuren oder andere Einheiten, welche die Nukleinsäuren spezifisch erkennen und sich an sie binden, durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann sowohl in vitro als auch direkt in situ durchgeführt werden, zum Beispiel im Verlauf einer Detektionseinfärbungsreaktion. Eine weitere Möglichkeit der Detektion der humanen Transketolase-like-1-Genprodukte in einer Probe auf dem Nukleinsäurelevel, durchgeführt in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, ist eine Amplifizierungsreaktion von Nukleinsäuren, welche in einer quantitativen Art und Weise durchgeführt werden kann, wie zum Beispiel die Polymerasekettenreaktion. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine Echtzeit-RT-PCR verwendet werden, um das Level der Transketolase-like-1-RNA in Proben von Tumoren zu quantifizieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Detektion des Levels der humanen Transketolase-like-1-Genprodukte durch die Bestimmung des Expressionslevels eines Proteins. Die Bestimmung der humanen Transketolase-like-1-Genprodukte auf dem Proteinlevel kann zum Beispiel in einer Reaktion erfolgen, welche einen Antikörper umfasst, der spezifisch für die Detektion des humanen Transketolase-like-1-Proteins ist. Die Antikörper können bei vielen unterschiedlichen Detektionstechniken verwendet werden, zum Beispiel bei Western-Blot, ELISA oder Immunpräzipitation. Generell kann die Antikörper-basierte Detektion sowohl in vitro als auch direkt in situ erfolgen, zum Beispiel im Verlauf einer immunhistochemischen Einfärbungsreaktion. Jedes andere Verfahren zur Bestimmung der Menge von bestimmten Polypeptiden in biologischen Proben kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Level der humanen Transketolase-like-1-Genprodukte im Vergleich zu einer Test-Kontrollprobe signifikant erhöht. In diesem Fall ist das humane Transketolase-like-1-Gen in der Probe überexprimiert.
Ein Beispiel für die Diagnose von Erkrankungen, die mit der Expression des humanen Transketolase-like-1-Gens, einhergehenkann die Detektion von Auto-Antikörpern umfassen, welche gegen Polypeptide gerichtet sind, die von dem humanen Transketolase-like-1-Gen codiert werden. Die für die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptide können verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit solcher Antikörper in Körperflüssigkeiten durch Verfahren zu erkennen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Detektion von Geweben, welche Transketolase-like-1-Genprodukte exprimieren, in Form von Molekular-Imaging-Verfahren. Die entsprechenden Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt. Imaging-Verfahren zur Verwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel MRI, SPECT, PET und andere Verfahren, die zum in vivo Imaging geeignet sind, umfassen.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren auf der enzymatischen Umwandlung von inerten oder markierten Verbindungen zu Molekülen basieren, welche im Verlauf von Molekular-Imaging-Verfahren durch die Transketolase-like-1-Moleküle erkennbar sind. In einer weiteren Ausführungsform kann das Molekular-Imaging-Verfahren auf der Verwendung von Verbindungen basieren, welche eine geeignete Kennzeichnung für das in vivo Molekular-Imaging tragen, wie Radioisotope, Metallionen usw., welche sich spezifisch an Transketolase-like-1-Moleküle in vivo binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind diese Verbindungen nicht-toxische Verbindungen und können aus dem Blutkreislauf von Organismen, wie Menschen, eliminiert werden, und zwar in einer Zeitspanne, die das Durchführen der Detektion von Kennzeichnungen erlaubt, welche sich in dem Tumorgewebe, das das Transketolase-like-1-Gen überexprimiert, angesammelt haben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden für das Molekular-Imaging solche Verbindungen verwendet, bei denen die Eliminierung aus dem Blutkreislauf für die Durchführung der Molekular-Imaging-Reaktion nicht relevant ist. Dies kann zum Beispiel aufgrund des geringen Hintergrundes, der durch die zirkulierenden Moleküle usw. erzeugt wird, der Fall sein. Die Verbindungen zur Verwendung bei Molekular-Imaging-Verfahren werden in pharmazeutisch akzeptabler Form in Zusammensetzungen verabreicht, welche außerdem sämtliche anderen geeigneten Substanzen umfassen können, wie z. B. andere diagnostisch nützliche Substanzen, therapeutisch nützliche Substanzen, Trägersubstanzen und dergleichen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit für die Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Kit kann zum Beispiel ein Diagnosekit oder ein Forschungskit sein.
Ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens ein Agens, welches für die Detektion der hierin offenbarten Moleküle geeignet ist. Ferner kann ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung Folgendes umfassen:

a) Reagenzien für die Detektion der humanen Transketolase-like-1-Genprodukte,
b) Reagenzien und Puffer, die üblicherweise für die Durchführung der Detektionsreaktion verwendet werden, wie z. B. Puffer, Detektionsmarker, Trägersubstanzen und andere,
c) eine humane Transketolase-like-1-Probe zum Durchführen einer positiven Kontrollreaktion.

Das Reagens für die Detektion des humanen Transketolase-like-1-Gens kann jedes Agens beinhalten, welches in der Lage ist, an das humane Transketolase-like-1-Molekül zu binden. Zu solchen Reagenzien können Proteine, Polypeptide, Nukleinsäuren, Peptidnukleinsäuren, Glykoproteine, Proteoglykane, Polysaccharide oder Lipide zählen.
Die humane Transketolase-like-1-Probe für die Durchführung einer positiven Kontrolle kann zum Beispiel humane Transketolase-like-1-Nukleinsäuren oder -Polypeptide oder Fragmente davon in anwendbarer Form, wie z. B. eine Lösung oder ein Salz, Peptide in anwendbarer Form, Gewebeabschnittsproben oder positive Zellen umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Detektion des humanen Transketolase-like-1-Genproduktes auf dem Polypeptidlevel. In dieser Ausführungsform kann das Bindungsagens zum Beispiel ein Antikörper sein, der für das humane Transketolase-like-1 oder ein Fragment davon spezifisch ist.
In einer weiteren Ausführungsform des Testkits erfolgt die Detektion der humanen Transketolase-like-1-Genprodukte auf dem Nukleinsäurelevel. In dieser Ausführungsform der Erfindung kann das Reagens für die Detektion zum Beispiel eine Nukleinsäuresonde sein oder ein Primer, der revers-komplementär zu der humanen Transketolase-like-1-Nukleinsäure ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von einer oder mehreren der Verbindungen, die für die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wie z. B. ein Nukleinsäuremolekül, ein rekombinanter Vektor, ein Polypeptid, eine Antisense-RNA-Sequenz, ein Ribozym oder ein Antikörper für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs, vorzugsweise Kolonkrebs, Pankreaskarzinom, Magenkrebs oder Lungenkrebs.
Die für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung geeigneten Polypeptide, Polynukleotide und Bindungsagenzien können in pharmazeutische oder immunogene Zusammensetzungen eingeschlossen sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen die Verbindungen und einen physiologisch akzeptablen Träger.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine Vakzine können zum Beispiel DNA enthalten, welche ein oder mehrere Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung codiert. Die DNA kann in einer Art und Weise verabreicht werden, welche es gestattet, die Polypeptide in situ zu erzeugen. Geeignete Expressionssysteme sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Die Expression der Polypeptide kann zum Beispiel persistierend oder transient sein. In pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Vakzinen, welche für die In-situ-Expression der Polypeptide sorgen, können die Nukleinsäuren innerhalb eines beliebigen, geeigneten, dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannten Bereitstellungssystems vorliegen, einschließlich Nukleinsäureexpressionssysteme, Bakterien- und Virenexpressionssysteme. Geeignete Nukleinsäureexpressionssysteme umfassen die notwendigen regulatorischen Nukleinsäuressequenzen für die Expression im Patienten, wie geeignete Promotoren, Terminatoren usw. Bakterielle Bereitstellungssysteme können zum Beispiel die Verabreichung eines Bakteriums vorsehen, welches ein Epitop eines Zellantigens auf seiner Zelloberfläche exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Nukleinsäure mittels eines viralen Expressionssystems, wie z. B. Vakziniavirus, Retrovirus oder Adenovirus, eingefügt werden, welches die Verwendung eines nicht-pathogenen, replikationskompetenten Virus beinhalten kann. Geeignete Systeme sind zum Beispiel in Fisher Hoch et al., PNAS 86:317–321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad Sci. 569:86–103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17–21, 1990; US-Patentschrift Nr. 4,603,112 , 4,769,330 und 5,017,487 ; WO 89/01973 ; US-Patentschrift Nr. 4,777,127 ; GB 2,200,651 ; EP 0,345,242 ; WO 91/02805 ; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988 ; Rosenfeld et al., Science 252:431–434, 1991; Kolls et al., PNAS 91:215–219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90: 11498–11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838–2848, 1993 und Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202–1207, 1993 offenbart. In einer weiteren Ausführungsform können transgene Säugetierzellen für die Bereitstellung und/oder Expression der Nukleinsäuren verwendet werden. Die Verfahren für die Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten, die für die In-situ-Expression von Polypeptiden geeignet sind, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Nukleinsäuren zum Beispiel Antisense-Konstrukte sein.
Die Nukleinsäure kann auch als eine nackte Nukleinsäure verabreicht werden. In diesem Fall können entsprechende physische Bereitstellungssysteme eingesetzt werden, welche die Aufnahme der Nukleinsäure verbessern, wie z. B. mit der Nukleinsäure beschichtete biologisch abbaubare Perlen, die wirksam in die Zellen transportiert werden. Die Verabreichung nackter Nukleinsäuren kann zum Beispiel zum Zweck der transienten Expression innerhalb eines Wirtes oder einer Wirtszelle von Nutzen sein.
Alternativ dazu können die pharmazeutischen Zusammensetzungen ein oder mehrere Polypeptide umfassen. Die Polypeptide, die in pharmazeutische Zusammensetzungen eingefügt sind, können die humanen Transketolase-like-1- Polypeptide in Kombination mit einem oder mehreren anderen bekannten Polypeptiden sein, wie zum Beispiel Enzyme, Antikörper, regulatorische Faktoren, wie Cycline, Cyclinabhängige Kinasen oder CKIs, oder Toxine.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf jede geeignete Art und Weise verabreicht werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist. Die Verabreichung kann zum Beispiel eine Injektion, wie z. B. intrakutane, intramuskuläre, intravenöse oder subkutane Injektion, intranasale Verabreichung, zum Beispiel durch Einatmen, oder orale Verabreichung umfassen. Eine geeignete Dosierung zur Sicherstellung des pharmazeutischen Nutzens der Behandlung sollte gemäß der Parameter wie Alter, Geschlecht, Körpergewicht usw. des Patienten gewählt werden, was dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist.
Die Art des Trägers, der in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung eingesetzt wird, variiert in Abhängigkeit von der Art der Verabreichung. Für die parenterale Verabreichung, wie subkutane Injektion, umfasst der Träger vorzugsweise Wasser, Salzlösung, Alkohol, ein Lipid, ein Wachs und/oder einen Puffer. Für die orale Verabreichung kann jeder der oben genannten Träger oder ein fester Träger, wie Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glukose, Saccharose und/oder Magnesiumcarbonat, eingesetzt werden. Biologisch abbaubare Mikrosphären (z. B. polylaktisches Glykolid) können auch als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung eingesetzt werden. Geeignete biologisch abbaubare Mikrosphären sind zum Beispiel in den US-Patentschriften Nr. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ferner in immunogene Zusammensetzungen eingeschlossen sein.
Die Konstituenten einer immunogenen Zusammensetzung können Vakzine, Antigene, Antigenfragmente oder Nukleinsäuren umfassen, die Antigene oder Antigenfragmente codieren, welche in situ exprimiert werden sollen. Diese Verbindungen können als Polypeptide vorliegen oder als Nukleinsäuren, welche es gestatten, dass die Polypeptide in situ exprimiert werden. Immunogene Zusammensetzungen umfassen die Verbindungen und zusätzlich ein immunstimulierendes oder immunogenes Adjuvans.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon, welche einen immunogenen Abschnitt eines humanen Transketolase-like-1-Proteins umfassen, können in immunogenen Zusammensetzungen verwendet werden, wobei das Polypeptid z. B. die eigene Immunreaktion des Patienten auf Tumorzellen stimuliert. Ein Patient kann von einer Krankheit betroffen sein, oder er kann frei von einer erkennbaren Erkrankung sein. Dementsprechend können die hierin offenbarten Verbindungen verwendet werde, um Krebs zu behandeln oder um die Entwicklung von Krebs zu hemmen. Die Verbindungen können entweder vor oder nach einer konventionellen Behandlung von Tumoren, wie der chirurgischen Entfernung primärer Tumore, der Behandlung durch Verabreichung von Strahlentherapie, konventioneller chemotherapeutischer Verfahren oder einer anderen Art der Behandlung des entsprechenden Krebses oder seiner Vorläufer, verabreicht werden.
Immunogene Zusammensetzungen wie Vakzinen können ein oder mehrere Polypeptide und einen nicht-spezifischen Immunreaktions-Enhancer umfassen, wobei der nichtspezifische Immunreaktions-Enhancer in der Lage ist, eine Immunreaktion auf ein exogenes Antigen auszulösen oder zu verstärken. Zu Beispielen nicht-spezifischer Immunreaktions-Enhancer zählen Adjuvanzien, biologisch abbaubare Mikrosphären (z. B. polylaktisches Galaktid) und zum Beispiel Liposome, in welche das Polypeptid eingefügt werden kann. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Vakzinen können auch andere Epitope wie Tumorantigene enthalten, entweder eingeschlossen in ein Fusionsprotein wie oben beschrieben (d. h. ein einzelnes Polypeptid, welches mehrere Epitope enthält), oder innerhalb eines separaten Polypeptids vorliegend.
Jeder geeignete Immunreaktions-Enhancer kann in den Vakzinen dieser Erfindung eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein Adjuvans eingeschlossen sein. Die meisten Adjuvanzien enthalten eine Substanz, die zum Schutz des Antigens gegen schnellen Katabolismus ausgelegt ist, wie Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, und einen nichtspezifischen Stimulator der Immunreaktion, wie Lipid A, Bordetella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis. Solche Adjuvanzien sind im Handel erhältlich, zum Beispiel als inkomplettes Freund's Adjuvans und komplettes Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) und Merck Adjuvans 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ).
Für therapeutische Zwecke können Polypeptide, Polynukleotide oder Bindungsagenzien in einer Vielzahl von Möglichkeiten verabreicht werden. Zu diesen Möglichkeiten zählen zum Beispiel intrakutane, intramuskuläre, intravenöse oder subkutane Injektion, intranasale Verabreichung, zum Beispiel durch Einatmung, oder orale Verabreichung.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens für die Therapie und/oder Impfung. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Therapie von zellproliferativen Erkrankungen unter Verwendung von humanen Transketolase-like-1-Polypeptiden und/oder Polynukleotiden erfolgen. Die Therapie kann zum Beispiel eine Immuntherapie oder eine somatische Gentherapie sein.
Die humanen Transketolase-like-1-Polypeptide und/oder Polynukleotide können gemäß der vorliegenden Erfindung zur Impfung gegen zellproliferative Erkrankungen verwendet werden. Die Impfung gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Verabreichung einer immunogenen Verbindung an ein Individuum zum Zweck der Stimulierung einer Immunreaktion, die gegen die immunogene Verbindung gerichtet ist, umfassen und so dieses Individuum gegen die immunogene Verbindung immunisieren. Das Stimulieren einer Immunreaktion kann das Induzieren der Produktion von Antikörpern gegen die Verbindung sowie das Stimulieren zytotoxischer T-Zellen umfassen. Zum Zweck der Impfung können die Polypeptide, Nukleinsäuren und Bindungsagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung in einer physiologisch akzeptablen Form verabreicht werden. Die Zusammensetzung, die an Individuen zu verabreichen ist, kann eine oder mehrere antigene Komponenten, physiologisch akzeptable Trägersubstanzen oder Pufferlösungen, Immunstimulanzien und/oder Adjuvanzien umfassen. Adjuvanzien können zum Beispiel inkomplettes Freund's Adjuvans oder komplettes Freund's Adjuvans oder andere Adjuvanzien, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, umfassen.
Die Zusammensetzung kann auf jede anwendbare Art und Weise verabreicht werden, wie z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär usw. Die Dosierung der Zusammensetzung ist abhängig vom bestimmten Fall und Zweck der Impfung. Sie muss an Parameter des behandelten Individuums angepasst werden, wie Alter, Gewicht, Geschlecht usw. Ferner muss die Art der auszulösenden Immunreaktion berücksichtigt werden. Im Allgemeinen kann es bevorzugt sein, wenn ein Individuum 100 μg–1 g eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung erhält, oder 10⁶–10¹² MOI einer rekombinanten Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Form enthält, die in situ exprimiert werden kann.
Individuen zum Zweck der Impfung können alle Organismen sein, welche Trans ketolase-like-1-Proteine enthalten, und welche von zellproliferativen Erkrankungen betroffen sein können.
Die Impfung von Individuen kann z. B. im Falle von veränderten, Nicht-Wildtyp-Sequenzen oder Strukturen von Markermolekülen in Zusammenhang mit zellproliferativen Erkrankungen günstig sein.
Hierin offenbarte Polypeptide können auch bei adoptiver Immuntherapie für die Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Adoptive Immuntherapie kann allgemein entweder in aktive oder passive Immuntherapie eingeteilt werden. Bei der aktiven Immuntherapie beruht die Behandlung auf der in-vivo Stimulation des endogenen Wirtsimmunsystems zur Reaktion gegen Tumore mittels Verabreichung von Immunreaktion-modifizierenden Agenzien (zum Beispiel Tumorvakzinen, bakterielle Adjuvanzien und/oder Zytokine).
Bei der passiven Immuntherapie beinhaltet die Behandlung die Bereitstellung biologischer Reagenzien mit etablierter Tumor-Immun-Reaktivität (wie Effektorzellen oder Antikörper), welche direkt oder indirekt Antitumoreffekte vermitteln können und nicht notwendigerweise von einem intakten Wirtsimmunsystem abhängig sind. Zu Beispielen von Effektorzellen zählen T-Lymphozyten (zum Beispiel zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, CD4+ T-Helfer, Tumor-infiltrierende Lymphozyten), Killerzellen (wie natürliche Killerzellen, Lymphokinaktivierte Killerzellen), B-Zellen oder Antigenpräsentierende Zellen (wie dendritische Zellen und Makrophagen), welche die offenbarten Antigene exprimieren. Die hierin offenbarten Polypeptide können auch verwendet werden, um Antikörper oder anti-idiotypische Antikörper (wie in US-Patentschrift Nr. 4,918,164 ) für die passive Immuntherapie zu erzeugen.
Das vorrangige Verfahren der Bereitstellung adäquater Zahlen von T-Zellen für die adoptive Immuntherapie ist das Züchten immuner T-Zellen in vitro. Die Kulturbedingungen zum Expandieren einzelner antigenspezifischer T-Zellen zu einer Zahl von mehreren Milliarden unter Beibehaltung der Antigendetektion in vivo sind in der Technik gut bekannt. Diese in vitro Kulturbedingungen nutzen normalerweise die intermittierende Stimulation mit Antigen aus, häufig in Gegenwart von Zytokinen, wie IL-2 und nicht-teilenden Feederzellen. Wie oben festgestellt, können die hierin beschriebenen immunreaktiven Polypeptide zum schnellen Expandieren antigenspezifischer T-Zell-Kulturen verwendet werden, um ausreichende Anzahlen von Zellen für die Immuntherapie zu erzeugen. Insbesondere können Antigen-präsentierende Zellen wie dendritische Zellen, Makrophagen- oder B-Zellen mit immunreaktiven Polypeptiden gepulst oder mit (einer) Nukleinsäuresequenz(en) transfiziert werden, und zwar unter Verwendung von Standardtechniken, die in der Technik gut bekannt sind. Zum Beispiel können Antigen-präsentierende Zellen mit einer Nukleinsäuresequenz transfiziert werden, wobei die Sequenz eine Promotorregion enthält, welche für die Erhöhung der Expression geeignet ist, und sie können als Teil eines rekombinanten Virus oder eines anderen Expressionssystems exprimiert werden. Damit kultivierte T-Zellen in der Therapie wirksam sind, müssen die kultivierten T-Zellen in der Lage sein, zu wachsen und sich weit zu verbreiten und in vivo langfristig zu überleben. Studien haben gezeigt, dass kultivierte T-Zellen induziert werden können, um in vivo zu wachsen und langfristig in einer wesentlichen Anzahl zu überleben, und zwar durch wiederholte Stimulation mit Antigen ergänzt mit IL-2 (siehe zum Beispiel Cheever, M. et al., „Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited", Immunological Reviews, 157:177, 1997).
Die hierin offenbarten Polypeptide können auch eingesetzt werden, um Tumor-reaktive T-Zellen zu erzeugen und/oder zu isolieren, welche dann an den Patienten verabreicht werden können. Bei einem Verfahren können antigenspezifische T-Zelllinien durch In-vivo-Immunisierung mit kurzen Peptiden, welche den immunogenen Abschnitten der offenbarten Polypeptide entsprechen, hergestellt werden. Die so entstehenden antigenspezifischen CD8+ CTL-Klone können aus dem Patienten isoliert, mittels standardmäßigen Gewebekulturtechniken expandiert und an den Patienten zurückgegeben werden.
Alternativ dazu können Peptide, die immunogenen Abschnitten der Polypeptide der Erfindung entsprechen, eingesetzt werden, um Tumor-reaktive T-Zell-Untergruppen durch selektive In-vitro-Stimulation und Expansion von autologen T-Zellen herzustellen, um antigenspezifische T-Zellen bereitzustellen, welche anschließend an den Patienten übertragen werden können, wie zum Beispiel beschrieben durch Chang et al. (Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22 (3), 213, 1996). Zellen des Immunsystems, wie T-Zellen, können aus dem peripheren Blut eines Patienten isoliert werden, und zwar unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Zellseparationssystems, wie dem CEPRATE^TM-System von CellPro Incorporated (Bothell, Wash.) (siehe US-Patentschrift Nr. 5,240,856 ; US-Patentschrift Nr. 5,215,926 ; WO 89/06280 ; WO 91/16116 und WO 92/07243 ). Die getrennten Zellen werden mit einem oder mehreren der immunreaktiven Polypeptide stimuliert, die in einem Bereitstellungsvehikel, wie einer Mikrosphäre, enthalten sind, um antigenspezifische T-Zellen bereitzustellen. Die Population von Tumor-antigenspezifischen T-Zellen wird dann mit Hilfe von Standardtechniken expandiert, und die Zellen werden an den Patienten zurück verabreicht.
In einer weiteren Ausführungsform können T-Zell- und/oder Antikörper-Rezeptoren, die spezifisch für die Polypeptide sind, geklont, expandiert und in andere Vektoren oder Effektorzellen übertragen werden, zur Verwendung bei der adoptiven Immuntherapie.
In einer weiteren Ausführungsform können syngene oder autologe dendritische Zellen mit Peptiden gepulst werden, welche mindestens einem immunogenen Abschnitt eines hierin offenbarten Polypeptides entsprechen. Die daraus entstehenden antigenspezifischen dendritischen Zellen können entweder in einen Patienten übertragen werden, oder sie können zum Stimulieren von T-Zellen eingesetzt werden, um antigenspezifische T-Zellen bereitzustellen, welche wiederum an einen Patienten verabreicht werden können. Die Verwendung von Peptid-gepulsten dendritischen Zellen zum Erzeugen antigenspezifischer T-Zellen und die anschließende Verwendung solcher antigenspezifischer T-Zellen zum Vernichten von Tumoren in einem murinen Modell wurde durch Cheever et al., Immunological Reviews, 157:177, 1997 demonstriert.
Außerdem können Vektoren, welche die offenbarten Nukleinsäuren exprimieren, in Stammzellen eingefügt werden, die dem Patienten entnommen wurden, und klonal in vitro propagiert werden, für die autologe Transplantation zurück in denselben Patienten.
Monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch als therapeutische Verbindungen verwendet werden, um Tumore zu verkleinern oder zu eliminieren. Die Antikörper können allein verwendet werden (zum Beispiel um Metastasen zu hemmen) oder gekoppelt mit einem oder mehreren therapeutischen Agenzien. Zu geeigneten Agenzien in dieser Hinsicht zählen Radionuklide, Differenzierungsinduktoren, Arzneimittel, Toxine und Derivate davon. Zu bevorzugten Radionukliden zählen 90Y, 1231, 1251, 1311, 186Re, 188Re, 211At und 212Bi. Zu bevorzugten Arzneimitteln zählen Methotrexat und Pyrimidin- und Purinanaloga. Zu bevorzugten Differenzierungsinduktoren zählen Phorbolester und Buttersäure. Zu bevorzugten Toxinen zählen Ricin, Abrin, Diptherintoxin, Choleratoxin, Gelonin, Pseudomonas exotoxin, Shigella toxin und Pokeweed antivirales Protein.
Ferner können Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen in Zusammenhang mit der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens sämtliche Verfahren umfassen, die geeignet sind, die Aktivität des Transketolase-like-1-Polypeptids in einem Individuum oder in Zellen eines Individuums zu reduzieren. Diese Verfahren können eine Reduktion der Aktivität des Transketolase-like-1-Polypeptids durch die Reduktion der Genexpression oder durch die Reduktion der enzymatischen Aktivität umfassen. Beispiele können die Verabreichung von Antisense-Konstrukten, von Ribozymen, von Enzyminhibitoren, die Verabreichung von Antagonisten von Cofaktoren von Transketolase-like-1-Polypeptiden, wie z. B. Antithiamin-Verbindungen, oder die reduzierte Verabreichung von essentiellen Cofaktoren für die enzymatische Aktivität (z. B. Thiamin) umfassen.
Die Verfahren für die Verabreichung von Ribozymen oder Antisense-Konstrukten sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Die Verabreichung kann als Verabreichung nackter Nukleinsäuren oder als Verabreichung von Nukleinsäuren, die für die in-situ Expression der relevanten aktiven Produkte geeignet sind, erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Therapie von Erkrankungen, die mit der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens einhergehen, die Verabreichung von Antithiamin-Verbindungen oder die Reduktion der Thiamin-Aufnahme bei Individuen, welche Erkrankungen zeigen, die durch die Überexpression des Transketolase- like-1-Gens gekennzeichnet sind.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren und Gewinnen eines Arzneimittel-Kandidaten für die Therapie von Kolon-, Magen-, Pankreas- oder Lungentumoren. Das Verfahren umfasst die Schritte des In-Kontakt-Bringens eines TKT-L1-Polypeptids, wie im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, oder einer Zelle, welche das Polypeptid exprimiert, mit veränderter Regulation der Zellproliferation, und zwar in Gegenwart von Komponenten, welche in der Lage sind, ein erkennbares Signal als Reaktion auf die Transketolase-Aktivität zu liefern, und des Detektierens der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder der Erhöhung des Signals, welches durch die Transketolase-Aktivität oder veränderte Regulation der Zellproliferation erzeugt wird, wobei die Abwesenheit oder Verringerung des Signals ein putatives Arzneimittel anzeigt.
Der Arzneimittel-Kandidat kann eine einzelne Verbindung oder eine Vielzahl von Verbindungen sein. Der Begriff „Vielzahl von Verbindungen" in einem Verfahren der Erfindung ist als eine Vielzahl von Substanzen zu verstehen, welche identisch sein können oder nicht.
Die Verbindung oder Vielzahl von Verbindungen kann chemisch synthetisiert oder mikrobiologisch erzeugt und/oder zum Beispiel in Proben von z. B. Zellextrakten von z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen enthalten sein. Ferner kann (können) die Verbindung(en) in der Technik bekannt sein, jedoch ist bisher noch nicht bekannt, dass sie in der Lage sind, TKT-L1-Polypeptide zu unterdrücken oder zu aktivieren. Die Reaktionsmischung kann ein zellfreies Extrakt sein oder sie kann eine Zell- oder Gewebekultur umfassen. Geeignete Abläufe für die Verfahren der Erfindung sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind zum Beispiel allgemein in Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Third Edition (1994) und in den beigefügten Beispielen beschrieben. Die Vielzahl von Verbindungen kann z. B. zu der Reaktionsmischung oder dem Kulturmedium zugegeben, in eine Zelle injiziert oder anderweitig bei dem transgenen Tier angewandt werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das in dem Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann, ist vorzugsweise eine Wirtszelle, eine Säugetierzelle oder ein nichthumanes transgenes Tier der Erfindung, wie in den obigen Ausführungsformen beschrieben.
Wenn eine Probe, die eine Verbindung oder eine Vielzahl von Verbindungen enthält, bei dem Verfahren der Erfindung identifiziert wird, dann ist es entweder möglich, die Verbindung aus der ursprünglichen Probe zu isolieren, die dahingehend identifiziert wurde, dass sie die Verbindung enthält, welche das TKT-L1 unterdrückt oder aktiviert, oder man kann die ursprüngliche Probe weiter unterteilen, zum Beispiel dann, wenn sie aus einer Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen besteht, um die Anzahl unterschiedlicher Substanzen pro Probe zu reduzieren und das Verfahren mit den Unterteilungen der ursprünglichen Probe zu wiederholen. In Abhängigkeit von der Komplexität der Proben können die oben beschriebenen Schritte mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise bis die gemäß des Verfahrens der Erfindung identifizierte Probe nur noch eine begrenzte Anzahl der Substanzen oder nur noch eine Substanz umfasst. Vorzugsweise umfasst die Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften, und am bevorzugtesten sind die Substanzen identisch.
Die Verbindungen, die gemäß eines Verfahrens der Erfindung getestet und identifiziert werden können, können Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Peptidomimetika, PNAs oder dergleichen sein.
Die durch die obigen Verfahren isolierten Verbindungen dienen auch als Leitverbindungen für die Entwicklung von Analogonverbindungen. Die Analoga sollten eine stabilisierte elektronische Konfiguration und molekulare Konformation aufweisen, welche es gestattet, dass funktionale Schlüsselgruppen dem TKT-L1 auf dem im Wesentlichen gleichen Weg präsentiert werden wie die Leitverbindung. Insbesondere haben die Analogonverbindungen räumliche elektronische Eigenschaften, welche mit der Bindungsregion vergleichbar sind, jedoch kann es sich bei ihnen um kleinere Moleküle als die Leitverbindung handeln, häufig mit einem Molekulargewicht von unter etwa 2 kD und vorzugsweise unter etwa 1 kD. Die Identifikation der Analogonverbindungen kann durch die Verwendung von Techniken wie der Analyse des selbstkonsistenten Feldes (SCF – self-consistent field), der Konfigurationsinteraktions- (CI) Analyse und der Analyse der Dynamik im normalen Modus erfolgen. Computerprogramme für die Implementierung dieser Techniken sind verfügbar, z. B. Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Verfahren für die Herstellung chemischer Derivate und Analoga sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und sind zum Beispiel in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer Edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, NY, 10010 USA und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA beschrieben. Ferner können die Derivate und Analoga gemäß in der Technik bekannter Verfahren auf ihre Wirksamkeit getestet werden; siehe auch oben. Ferner können Peptidomimetika und/oder Computer-unterstütztes Design von entsprechenden Derivaten und Analoga verwendet werden, zum Beispiel gemäß der oben beschriebenen Verfahren.
Nachdem die beschriebene Verbindung identifiziert und gewonnen wurde, wird sie vorzugsweise in einer therapeutisch akzeptablen Form bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Detektion und Behandlung von solchen Erkrankungen bereit, die durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Krebs. In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Detektion von Erkrankungen bereit, welche durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Krebs, und zwar auf der Grundlage der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Expressionslevels des humanen Transketolase-like-1-Gens in biologischen Proben. In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen bereit, die durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Krebs, und zwar unter Verwendung von humanen Transketolase-like-1-Genprodukten als therapeutisch aktive Agenzien. Die Erfindung stellt auch therapeutische Verfahren auf der Grundlage der Reduktion der enzymatischen Aktivität von Transketolase-like-1-Gen-Polypeptiden bereit. Ein Aspekt der Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens für das rationale Tumor-Management auf der Grundlage der Detektion von Transketolase-like-1-Genprodukten in Patientenproben und das Zuschneiden einer Therapie in Korrelation mit der detektierten Überexpression der Genprodukte. Ferner stellt die vorliegende Erfindung einen Forschungs- oder Diagnosetestkit für die Durchführung von Reaktionen bereit, welche an der Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels der Überexpression des humanen Transketolase-like-1-Gens beteiligt sind. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von Erkrankungen gemäß der vorliegenden Erfindung anwendbar sind.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich dem Zweck der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung des Umfangs der hierin offenbarten Erfindung.
Beispiel 1: Bestimmung des Levels der humanen Transketolase-like-1-mRNA in Kolonkarzinomgeweben
Präparate von Tumorbiopsien können in einer In-situ-Einfärbungsreaktion semiquantitativ auf das mRNA-Level des humanen Transketolase-like-1-Gens hin analysiert werden. Die Einfärbungsreaktion wird wie folgt durchgeführt:
Die Gewebepräparate werden in aufsteigenden Ethanolkonzentrationen bis zu 100% Ethanol inkubiert. Nach der Verdunstung des Alkohols werden die Präparate zur Vorbehandlung des Gewebes in 10 mM Citratpuffer (pH 6,0) gekocht. Die Hybridisierungsmischung wird durch Mischen von 50 μl verwendungsbereitem Hybridisierungspuffer (DAKO A/S, Glostrup, Dänemark) mit etwa 5–10 pmol der Sonden hergestellt. Die Sonden sind Fluorescein-markierte Oligonukleotide der folgenden Sequenz:
TCTCATCACAAGCAGCACAGGAC
Die Hybridisierungsmischung wird auf 95°C erhitzt und danach auf 37°C äquilibriert. Nach dem Kochvorgang werden die Präparate für 2 Stunden bei 37°C mit je 50 μl der Hybridisierungsmischung inkubiert. Die Präparate werden in überschüssigen Volumen der Waschpuffer zweimal in 2 × SSC bei Raumtemperatur für 15 Min. und einmal in 1 × SSC bei 50°C für 15 Min. gewaschen. Dann werden die Präparate zweimal bei Raumtemperatur in 2 × SSC gespült. Im Anschluss an diesen Waschvorgang werden die Präparate für 30 Min. mit Blockierungspuffer (NEN, Blockierungspuffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Dann folgt 1 Stunde Inkubation mit einem 1:100 verdünnten (in Blockierungspuffer, siehe oben) Anti-Fluorescein-AP (DAKO A/S). Die Präparate werden dann 2 Mal in 1 × PBS/0.1% Tritonx100 für 10 Min. bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem Waschungsschritt mit 1 × PBS, 50 mM MgCl₂ (pH 9,2) für 10 Min. bei Raumtemperatur.
Dann erfolgt die Einfärbungsreaktion mit NBT/BCIP (Sigma) für etwa 30 Min. bei Raumtemperatur. Die Einfärbungsreaktion wird durch eine kurze Inkubation mit 1 mM EDTA in PBS gestoppt. Schließlich werden die Präparate in H₂O_dest. getaucht und mit AquaTex (Merck) fixiert. Dann können die eingefärbten Präparate mikroskopisch analysiert werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass das humane Transketolase-like-1-Gen in Kolonkarzinomgewebe im Vergleich zu normalem Kolongewebe überexprimiert ist.
Beispiel 2.: Bestimmung des humanen Transketolase-like-1-Gens und des Transketolase-Levels in Geweben von Karzinomen und Kontrollgeweben unter Verwendung semiquantitativer RT-PCR
Proben von Kolonkarzinom, Adenokarzinom der Lunge und von Karzinomen des Magens werden verwendet, um das Level der humanen Transketolase-like-1-mRNA und das Level der human Transketolase-mRNA unter Verwendung semiquantitativer RT-PCR zu bestimmen. In dieser Studie werden Tumorbiopsien verwendet.
Tumore werden gesammelt, schockgefroren und bei –80°C gelagert. Durch histopathologische Analyse wird verifiziert, dass sie vorrangig aus neoplastischen Zellen bestehen. Die mRNA wird mittels Reagenzien von Qiagen (Qiagen, Hilden, Deutschland) aus Tumoren und patientenbezogenem normalem Gewebe isoliert, und Einzelstrang-cDNA wird mittels Superscript II (Life Technologies, Inc.) synthetisiert. Quantitative PCR erfolgt mit Hilfe des 7700 Sequence Detectors (TaqmanTM) und des SYBR Green PCR Master-Mix, wie im Herstellerhandbuch beschrieben (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Die PCR-Reaktionen erfolgen in 25 μl Volumen mit einer abschließenden Konzentration von 300 nmol für jeden Primer, bei 95°C für 15 Sek. und bei 60°C für 60 Sek., für 40 Zyklen. Die folgenden Primer werden für die quantitative PCR verwendet:
Die Spezifität der PCR-Produkte wird durch Gel-Elektrophorese verifiziert (Daten nicht gezeigt).
Die Ergebnisse zeigen, dass das humane Transketolase-like-1-Gen bei 1 von 10 Kolonkarzinomen, bei zwei von fünf Lungenadenokarzinomen und bei drei von fünf Karzinomen des Magens im Vergleich zu normalem Kontrollgewebe hoch überexprimiert ist.
Besonders das Ausmaß der Überexpression des Transketolase-like-1-Gens in den Proben ist auffällig. Bei insgesamt sechs von 20 Karzinomen zeigt sich mehr als die achtfache Überexpression des TKTL-1-Gens. Im Gegensatz dazu ist das Transketolase-Gen in keinem der Fälle signifikant überexprimiert.
Das Ergebnis zeigt, dass bei einer Untergruppe von Krebsen mit unterschiedlichem Ursprung das Transketolase-like-1-Gen überexprimiert ist. Das Transketolase-Gen ist im Gegensatz dazu in dem getesteten Tumorgewebe nicht unterschiedlich exprimiert.

Claims

Ein in-vitro Verfahren für den Nachweis von Erkrankungen, die durch eine abnormale Zellproliferation in einem Individuum gekennzeichnet sind, umfassend a. das Detektieren des Levels der Expression von humanem Transketolase like-1 Gen in einer von dem Individuum gewonnenen biologischen Probe und in einer Test-Kontrollprobe, b. das Fällen einer Diagnose anhand eines Vergleichs des besagten Expressionslevels in der von dem Individuum gewonnenen Probe mit dem besagten Expressionslevel in der Test-Kontrollprobe, wobei eine signifikant erhöhte Expression in der von dem Individuum gewonnenen Probe eine Überexpression darstellt und Erkrankungen, die durch eine abnormale Zellproliferation in einem Individuum gekennzeichnet sind, anzeigt.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die durch eine abnormale Zellproliferation in einem Individuum gekennzeichnete Erkrankung Krebs ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Krebs Darmkrebs, Lungenkrebs, Magenkrebs oder Pankreaskrebs ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die biologische Probe eine Körperflüssigkeit, ein Sekret, ein Abstrich, eine Biopsie, eine zellhaltige Flüssigkeit, lysierte Zellen, Zelltrümmer, Peptide der Nukleinsäuren ist/sind.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Probe Serum, Urin, Samen, Stuhl, Galle, eine Biopsie oder eine Zell- oder Gewebeprobe ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die Detektion des Expressionslevels des humanen Transketolase like-1 Gens auf einem Polypeptidlevel durchgeführt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die Detektion des Expressionslevels des humanen Transketolase like-1 Gens auf einem Nukleinsäurelevel durchgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Detektion auf dem Polypeptidlevel unter Einsatz eines Bindungsagens durchgeführt wird, das gegen humane Transketolase like-1 Polypeptide gerichtet ist.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Bindungsagens ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein ein antigen-bindendes Epitop umfassendes Peptidomimetic oder ein Miniantikörper ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 8 oder 9, wobei die Detektion ein immunzytochemisches Nachweisverfahren ist.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei für die Detektion wenigstens eine Nukleinsäuresonde verwendet wird, die mit einer humanen Transketolase like-1 Nukleinsäure hybridisiert.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, verwendet im Zuge eines in-vivo oder in-vitro Molecular Imaging Verfahrens.
Verwendung wenigstens einer Sonde für die Detektion von humanen Transketolase like-1 Gen-Expressionsprodukten in einer biologischen Probe zur Herstellung eines Kits für die Durchführung der in-vitro-Methode gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11.
Die Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Sonde eine Nukleinsäuresonde ist, die spezifisch mit humaner Transketolase like-1 Nukleinsäure hybridisiert, oder ein Antikörper ist, der spezifisch humanes Transketolase like-1 Protein bindet.
Verwendung eines Inhibitors der Transketolase like-1 Aktivität für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Erkrankungen, die durch eine abnormale Zellproliferation assoziiert mit einer Überexpression von Transketolase like-1 Genprodukten gekennzeichnet sind, wobei der Inhibitor der Transketolase like-1 Aktivität eine Antithiamin-Verbindung ist.
Ein Verfahren zur Identifizierung und Gewinnung eines Arzneimittel-Kandidaten für die Therapie von Tumoren des Kolons, der Lunge, des Pankreas oder des Magens, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen eines TKTL1 Polypeptids gemäß Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung oder einer Zelle, die dieses Polypeptid exprimiert, mit veränderter Regulation von Zellproliferation in Gegenwart von Komponenten, die fähig sind, ein detektierbares Signal als Antwort auf eine Transketolase-Aktivität abzugeben, und b) Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder der Zunahme eines Signals, das durch Transketolase Aktivität oder veränderte Regulation der Zellproliferation hervorgerufen worden ist, wobei die Anwesenheit oder Zunahme des Signals ein putatives Arzneimittel anzeigt.
Ein in-vitro Verfahren für Rationales Tumor-Management, umfassend a) Detektion des Levels der Überexpression von Transketolase like-1 Gen in biologischen Proben b) Bilden von Untergruppen gemäß den Levels des Transketolase like-1 Gens c) Zuschneidung einer adäquaten Therapie gemäß den Untergruppen, die die Reduktion der Transketolase like-1 Aktivität in Individuen oder in Zellen von Individuen umfasst.
Ein Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Reduktion der Transketolase like-1 Aktivität durch die Verabreichung von Antithiamin-Verbindungen, von Inhibitoren der Transketolase-Enzym-Aktivität, von Transketolase like-1 Antisense-Konstrukten, von für Transkeltolase-like1 spezifischen Ribozymen oder durch reduzierte Verabreichung von Thiamin erreicht wird.