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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich grundsätzlich auf Nukleinsäuren, die
als Proben zur Diagnostik von Krebs geeignet sind, sowie auf Verfahren,
die hiermit in Verbindung stehen. Insbesondere betrifft die vorliegende
Erfindung Kits und Verfahren, die geeignet sind, Krankheiten der
Prostata durch Messungen von Genprodukten zu diagnostizieren, identifizieren,
sowie deren Verlauf zu überwachen.
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Das
Prostatakarzinom (PCA) ist die zweithäufigste krebskorrelierte Todesursache
von Männern
in den Vereinigten Staaten (Boring, 1993). Die zunehmende Häufigkeit
von Prostatakrebs im Verlauf der letzten Dekade führte dazu,
dass Prostatakrebs der am meisten verbreitete Krebs von allen ist
(Carter und Coffey, 1990). Obwohl Prostatakrebs der am häufigsten
vorkommende Krebs in Männern
in den Vereinigten Staaten ist (annähernd 200.000 neudiagnostizierte
Fälle/Jahr),
ist nur wenig über
die molekularen Veränderungen,
die zu seiner Entstehung und dem Fortschreiten führen, bekannt (Boring et al.,
1993). Nach Schätzungen
der American Cancer Society steigt die Zahl von Todesfällen aufgrund
von PCA mit über
8 % jährlich.
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Eine
ungewöhnliche
Begleiterscheinung ist es, dass die meisten Prostatatumore keine
lebensbedrohlichen Zustände
darstellen. Beweise aus Autopsien belegen, dass 11 Millionen amerikanische
Männer
Prostatakrebs haben (Dbom, 1983). Diese Zahlen stimmen mit der Tatsache überein,
dass das Prostatakarzinom einen in die Länge gezogenen normalen Verlauf
zeigt, bei dem verhältnismäßig wenige
Tumoren während
der Lebenszeit des Patienten bis zur klinischen Bedeutung fortschreiten.
Sofern der Krebs gut ausdifferenziert, auf das Organ beschränkt und
fokal ist, wenn er entdeckt wird, führt eine Behandlung von älteren Patienten
nicht zu einer Verlängerung
der Lebenserwartung.
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Für die relativ
wenigen Prostatakarzinomen, die natürlich weiter wachsen ist es
unglücklicherweise wahrscheinlich,
dass sie zu dem Zeitpunkt, an dem sie klinisch nachgewiesen werden,
bereits metastasiert sind. Die Überlebensrate
von Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs ist ziemlich niedrig.
Zwischen diesen beiden Extremen finden sich Patienten mit Prostatatumoren,
die metastasieren werden, es aber bislang noch nicht getan haben.
Für diese
Patienten führt
eine chirurgische Entfernung der Prostata zur Heilung und verlängert deren
Lebenserwartung. Aus diesem Grund ist es entscheidend, zu bestimmen,
in welche Gruppe neu diagnostizierte Patienten fallen, um eine optimale
Behandlung und damit das Überleben
des Patienten zu gewährleisten.
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Obwohl
bereits klinische und pathologische Zustandsuntersuchungen und histologische
Bewertungssysteme (z. B. Gleason) eingesetzt wurden, um eine Prognose
für eine
Patientengruppe bereitzustellen, wobei die Prognose auf dem Grad
der Tumordifferenzierung oder dem Typ der Granulamuster basierte
(Carter und Coffey, 1989; Diamond et al., 1982), sind diese Systeme
nicht in der Lage, den Verlauf des Krebses vorherzusagen. Es wurden
auch die Verwendung von computerbasierten Bildanalysen von histologischen
Schnitten einer primären
Läsion,
auf deren „nuclear
roundness" als Hilfe
im Management der einzelnen Patienten vorgeschlagen (Diamond et
al., 1982), jedoch ist diese Methode nur eingeschränkt nutzbar,
um den Verlauf der Krankheit zu untersuchen.
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Vor
kurzem durchgeführte
Studien, konnten verschiedene, wiederholt auftretende genetische
Veränderungen
im Prostatakrebs identifizieren, mit eingeschlossen: 1.) den Verlust
von Allelen (insbesondere der Verlust der Chromosomen 8p und 16q)
(Bova et al., 1993; Macoska et al., 1994; Carter et. al., 1990);
2.) eine generalisierte DNA-Hypermethylierung
(Isaacs et al., 1994); 3.) Punktmutationen oder Deletionen des Retinoblastomgenes
(Rb) und des p53 Genes (Bookstein et al., 1990a; Bookstein et al.,
1990b; Isaacs et al., 1991); 4.) Veränderungen im Expressionsmuster
von einzelnen Zell-Zelladhäsionsmolekülen (z.
B. E-cadherin/alpha-Catenin) (Carter et al., 1990; Morton et al.,
1993; Umbas et al., 1992) sowie Aneuploidie und Aneusomie von Chromosomen,
insbesondere der Chromosomen 7 und 8, die mittels Fluoreszenz in
situ Hybridisierung (FISH) nachgewiesen wurden (Macoska et al.,
1994; Visakorpi et al., 1994; Takahashi et al., 1994; Alcaraz et al.,
1994).
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Es
konnte gezeigt werden, dass die Analyse des DNA-Gehaltes/Ploidie
unter Verwendung von Durchflusszytometrie und FISH geeignet ist,
um die Aggressivität
von Prostatakrebs vorherzusagen (Pearsons et al., 1993; Macoska
et al., 1994; Visakorpi et al., 1994; Takahashi et al., 1994; Alcaraz
et al., 1994; Pearsons et al., 1993). Diese Methoden sind jedoch
teuer, zeitintensiv und die zuletzt genannte Technologie erfordert
die Bereitstellung von zentromerspezifischen Proben zur Analyse.
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Es
wurde auch berichtet, dass spezifische Kernmatrixproteine mit Prostatakrebs
in Verbindung stehen (Partin et al., 1993). Diese Proteinmarker
können
jedoch ganz offensichtlich nicht zwischen gutartiger Prostatahyperplasie
und Prostatakrebs zu unterscheiden (Partin et al., 1993). Leider
haben Marker, die nicht zwischen gutartigen und bösartigen
Prostatatumoren unterscheiden können,
einen sehr geringen Wert.
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Es
ist ferner bekannt, dass die Transformation und das Tumorwachstum
mit einer Veränderung
im Grad der Boten-RNA-Spezien assoziiert ist (Slamon et al., 1984;
Sager et al., 1993; Mok et al., 1994; Watson et al., 1994). Kürzlich wurde
eine Abwandlung der PCR-Analyse, bekannt als RNA-Fingerprinting,
verwendet, um unterschiedlich exprimierte Boten-RNA in Gebärmutter-
oder Brustkrebskarzinomen zu identifizieren (Liang et al., 1992;
Sager et al., 1993; Mok et al., 1994; Watson et al., 1994). Hierzu
wurden zufällige
Primer verwendet, um einen „Fingerabdruck" der gesamten zellulären DNA
zu erzeugen, anschließend
wurden die amplifizierten Fragmente mittels hochauflösender Gelelektrophorese
aufgetrennt, so dass es möglich
war, RNA-Spezien zu identifizieren, die in Krebszellen entweder
hochreguliert oder herunterreguliert waren. Die Ergebnisse dieser
Untersuchungen zeigten die Anwesenheit von mehreren Markern, die
potentiell für
die Diagnose von Brust- oder Gebärmutterkrebs
geeignet wären,
einschließlich
des α6-Integrin
(Sager et al., 1993), des DEST001 und DEST002 (Watson et al., 1994)
und des LF4.0 (Mok et al., 1994).
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Es
bleiben dennoch Lücken
im Stand der Technik bezogen auf die Identifizierung von Genen,
die mit dem Fortschreiten von Prostatakrebs in Verbindung stehen
und die zur Entwicklung von diagnostischen Verfahren führen, um
den Krankheitsverlauf zu überwachen.
Die Identifizierung von Genen, die bei Prostatakrebs differentiell
exprimiert sind, wäre
daher von besonderer Bedeutung für
die Entwicklung eines schnellen, kostengünstigen Verfahrens zur Diagnose
von Prostatakrebs.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich an die Mängel im Stand der Technik,
RNA-Spezien, die in menschlichen Prostataerkrankungen differentiell
exprimiert sind, zu identifizieren und zu charakterisieren. Sie soll
ferner Verfahren zur Identifizierung solcher RNA-Spezien bereitstellen.
Solche RNA-Spezien und die korrespondierenden kodierten Proteinspezien
sind zum Beispiel als Marker für
Prostataerkrankungen und als Zielmoleküle für ein therapeutisches Eingreifen
bei Prostataerkrankungen geeignet. Die offenbarten Verfahren können auch
auf andere Gewebe angewandt werden, um differentiell exprimierte
Gene zu identifizieren, die als Marker für verschiedene physiologische
Zustände
dieses Gewebes dienen.
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Die
identifizierten Marker einer Prostataerkrankung können im
Weiteren dazu verwendet werden, spezifische Oligonukleotidproben
und Primer zu designen. Sofern solche Proben und Primer in Verbindung
mit Nukleinsäurehybridisierung
und Amplifikationsverfahren eingesetzt werden, erlauben sie eine
schnelle Analyse einer Prostatabiopsie, Serumproben usw. Dies kann Ärzte darin
unterstützen,
Prostataerkrankungen zu diagnostizieren und einen optimalen Behandlungsverlauf
für Personen
mit Prostatatumoren in verschiedenen Stadien der Malignität zu bestimmen.
Dieselben Proben und Primer können
auch für
eine in situ Hybridisierung oder in situ PCR-Nachweise und die Diagnose
von Prostatakrebs eingesetzt werden.
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Die
identifizierten Marker der Prostataerkrankungen können auch
eingesetzt werden, um die gesamte Länge von Gensequenzen, einschließlich der
regulatorischen Elemente für
die Genexpression aus genomischen humanen DNA-Bibliotheken zu identifizieren
und zu isolieren. Die cDNA-Sequenzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung
identifiziert wurden, werden zunächst
als Hybridisierungsproben eingesetzt, um genomische, humane DNA-Bibliotheken
mit Standardverfahren zu durchsuchen. Sobald partielle genomische
Klone identifiziert wurden, werden die Gene in ihrer Gesamtlänge über das
so genannte „chromosomal
walking" (ebenso
bekannt unter „überlappende
Hybridisierung")
isoliert. Siehe z. B. Chinault & Carbon „Overlap
Hybridization Screening: Isolation and Characterization of Overlapping
DNA Fragments Surrounding the LEU2 Gene on Yeast Chromosome III." Gene 5: 111-126,
1979. Sich nicht wiederholende Sequenzen am oder nahe des Endes
eines partiellen genomischen Klons werden dann als Hybridisierungsproben
für ein
weiteres Screening der genomischen Bibliothek verwendet, um schlussendlich
die gesamte Gensequenz des Krebsmarkers der von Interesse ist, zu
isolieren. Es ist dem Fachmann bewusst, dass vollständige Gensequenzen
unter Verwendung von kurzen exprimierten Sequenzstücken (ESTs),
die nachfolgende beschrieben sind, sowie unter Verwendung von derzeit
verfügbaren
Verfahren (Sambrook et al., 1989; Chinault & Carbon, 1979) erhältlich sind.
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Die
identifizierten Marker können
auch dazu verwendet werden, cDNA-Sequenzen zu identifizieren und
zu isolieren. Beim Umsetzen dieses Verfahrens werden die EST-Sequenzen, die in
der vorliegenden Offenbarung identifiziert wurden, als Hybridisierungsproben
eingesetzt, um menschliche cDNA-Bibliotheken mit Standardverfahren
zu screenen. Vorzugsweise wird eine menschliche cDNA-Bibliothek
von hoher Qualität,
die kommerziell oder anders erhältlich
ist, eingesetzt. Die Bibliothek wird z. B. auf Agaroseplatten, die
Nährstoffe, Antibiotika
und andere gängige
Inhaltsstoffe enthalten, ausplattiert. Einzelne Kolonien werden
auf Nylon- oder Nitrozellulosemembranen transferiert und die EST-Proben
werden mit den komplementären
Sequenzen auf den Membranen hybridisiert. Die Hybridisierung wird
mittels radioaktiver oder enzymgekoppelter Anhänge, die mit der Hybridisierung
assoziieren, nachgewiesen. Positive Kolonien werden vermehrt und
sequenziert, z. B. mit der Dideoxynukleotidsequenzierung oder ähnlichen
Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Vergleiche
der geklonten cDNA-Sequenzen mit bekannten menschlichen oder tierischen
cDNA- oder genomischen Sequenzen werden mit Hilfe von Computerprogrammen
und dem Fachmann wohl bekannten Datenbanken durchgeführt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden ein Nukleinsäuresegment
und einzelne Nukleinsäuren, wie
sie in Anspruch 1 bis 4 definiert sind, bereitgestellt. Die einzelnen
Nukleinsäuren
der vorliegenden Erfindung sind Teil eines Expressionsvektors und
werden in Form von kodierten Proteinen oder Peptiden exprimiert. Solche
Proteine oder Peptide können
in bestimmten Ausführungsformen
als Antigene zur Anregung einer monoklonalen oder polyklonalen Antikörperproduktion
eingesetzt werden.
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Es
werden außerdem
Oligonukleotidhybridisierungsproben und Primer bereitgestellt, die
mit spezifischen Markern der Prostataerkrankung hybridisieren. Diese
Proben und Primer schließen
die Sequenz, die als SEQ ID Nr: 1 bezeichnet ist, mit ein. Die Verfügbarkeit
von Proben und Primern, die spezifisch für solche einzigartigen Marker
sind, bildet die Grundlage für
die diagnostischen Kits, die zur Unterscheidung zwischen BPH, einem
organdefinierten Prostatakrebs und einem Prostatatumor mit fortschreitendem
Metastasierungspotential geeignet sind.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst außerdem Kits, die zum Nachweis
von Prostatazellen in biologischen Proben, wie sie in den Ansprüchen 9,
10 und 11 definiert sind, geeignet sind. So ein Kit kann ein oder mehrere
Primerpaare zu Amplifizierung von Nukleinsäuren, die den Prostatamarkergenen
entsprechen, umfassen. Das Kit kann außerdem Proben von Gesamt-mRNA,
die von Gewebe aus verschiedenen physiologischen Stadien, wie normal,
BPH, abgegrenzter Tumor und progressiv metastasierender Tumor abgeleitet
sind und die z. B. als Kontrollen verwendet werden können. Das
Kit kann außerdem
Puffer, Nukleotidbasen und andere Zusammensetzungen, die in einer
Hybridisierung und/oder Amplifizierungsreaktion eingesetzt werden, enthalten.
Jede Lösung
oder Zusammensetzung kann in einem Röhrchen oder einer Flasche aufbewahrt
sein und alle Röhrchen
können
in einer abgeschlossenen Box zur kommerziellen Nutzung enthalten
sein. Ein weiteres Kit der vorliegenden Erfindung umfasst Oligonukleotidproben,
die mit hoher Affinität
zu Markern der Prostataerkrankung in einer Northern Blot Assay binden,
sowie Behälter
für jede
dieser Proben. Ein weiteres Kit zum Nachweis von Prostatakrebszellen
in einer biologischen Probe umfasst Antikörper, die spezifisch für die Proteine
sind, die von den Nukleinsäuremarkern
der Prostataerkrankung kodiert werden. Die Erfindung umfasst weiterhin
eine isolierte Nukleinsäure,
die zwischen 14 und 100 Basen lang ist und entweder identisch zu oder
komplementär
zu einem Teil mit derselben Länge
ist, der innerhalb der Sequenz mit dem SEQ ID Nr: 1, wie sie in
Anspruch 3 definiert ist, liegt.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Proteine und Peptide mit
Aminosäuresequenzen,
die durch die vorweg genannten isolierten Nukleinsäuresegmente,
wie sie in den Ansprüchen
5 und 6 definiert sind, kodiert werden. Die Erfindung umfasst weiterhin
ein Verfahren, wie es in den Ansprüchen 7 und 8 definiert ist,
zum Nachweis von Prostatakrebszellen in biologischen Proben unter
Verwendung von Hybridisierungsprimern und -proben, die derart gestaltet
wurden, dass sie spezifisch mit Prostatakrebsmarkern hybridisieren. Dieses
Verfahren umfasst weiterhin den Schritt, die Menge der Nukleinsäureamplifikationsprodukte,
die gebildet wurden, zu messen.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG:
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1:
Die normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 25 (SEQ ID Nr:
1) zeigt, dass diese in Prostatakrebs und gutartigen Prostatawucherungen
im Vergleich zu normalem Prostatagewebe überexprimiert ist. Die Werte
sind besonders hoch bei metastasierendem Prostatakrebs. N = normale
Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane
Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender
Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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2:
Die normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 27 (SEQ ID Nr:
2) zeigt, dass sie in Prostatakrebs verglichen mit normaler oder
benigner Prostata erhöht
ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH),
NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs,
LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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3:
Eine normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 28 (SEQ ID Nr:
3) zeigt, dass diese im Prostatakrebs, besonders im metastasierenden
Prostatakrebs vergliche mit normalem oder benignem Prostatagewebe
erhöht
ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH),
NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs,
LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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4:
Eine normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 31 (SEQ ID Nr:
4) zeigt, dass diese im gutartigen (benignen) und malignen Prostatagewebe
im Vergleich zu normalem Prostatagewebe überexprimiert ist. N = normale
Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane
Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender
Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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5:
Eine normierte quantitative RT-PCR einer Sequenz des menschlichen
Fribronektingenes (SEQ ID Nr: 7) zeigt, dass diese im BPH und Prostatakrebs
verglichen mit normalem Prostatagewebe herunterreguliert ist. N
= normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB =
perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs,
LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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6:
Eine normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 33 (SEQ ID Nr:
5) zeigt, dass diese im Prostatakrebs verglichen mit normalem oder
benignem Prostatagewebe überexprimiert
ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH),
NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs,
LM = metastasierender Lyrnphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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7:
Eine quantitative RT-PCR von TGF-β1
zeigt, dass dies im Prostatakrebs verglichen mit benigner Prostatahyperplasie überexprimiert
ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH),
NB = perkutane Biopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs,
LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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8:
Eine quantitative RT-PCR des Zyklin A (SEQ ID Nr: 8) zeigt, dass
dieses im Prostatakrebs verglichen mit normalem Prostatagewebe und
benigner Prostatahyperplasie überexprimiert
ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH),
NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs,
LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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9: Dargestellt sind Oligonukleotide, die
in RT-PCR-Untersuchungen des Her2/neu und eines verkürzten Her2/neu
eingesetzt werden. Die Bindungsstellen der PCR-Primer sind mit P1
(Neu5'), P2 (Neu3') und P5 (NeuT3') markiert. Die verkürzte Form
des Her2/neu enthält
die P1-Bindungsstelle. Die Regionen, die kodierende Sequenzen innerhalb
des Her2/neu enthalten, sind: ECD (extrazelluläre Domain), MD (Membrandomän) und ICD
(intrazelluläre
Domain).
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10: Eine normierte quantitative RT-PCR des Transkriptes,
welche die Gesamtlänge
des Her2/neu enthält,
zeigt, dass dieses im Prostatakrebs verglichen mit normalem Prostatagewebe
und benigner Prostatahyperplasie überexprimiert ist. N = normale
Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie
des Prostatakrebses, T = primärer
Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses,
NC = Negativkontrolle.
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11: Eine normierte quantitative RT-PCR des verkürzten Transkriptes
des Her2/neu (SEQ ID Nr: 9) zeigt, dass dieses im Prostatakrebs
verglichen mit normalem Prostatagewebe und benigner Prostatahyperplasie überexprimiert
ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH),
NB = perkutane Biopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs,
LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
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12: Dargestellt ist die Amplifikation der β-Aktin cDNA
aus 25 cDNAs, die aus verschiedenen Prostatageweben synthetisiert
wurden. Physiologisch betrachtet sind diese Gewebe entweder normale
Prostatas, Prostatadrüsen
mit BPH oder Prostatatumoren, wie sie in Tabelle 4 beschrieben sind.
Die bildliche Darstellung umfasst außerdem einen Molekulargewichtsmarker,
der als „Leiter" zu erkennen ist
und drei isolierte Banden, die PCR-Produkte aus Pools von (links
nach rechts) normalem, BPH- und Prostatakrebsgewebe darstellen.
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13: Dargestellt ist die Amplifikation eines cDNA-Fragmentes,
welches von dem UC42 mRNA der verschiedenen, in Tabelle 4 beschriebenen
individuellen Prostatakazinome abstammt. Wenig oder kaum detektierbare
Expression dieser mRNA kann in einem Pool von normalem Prostatagewebe
oder einem Pool von Prostatadrüsen
mit BPH gezeigt werden. Starke Signale bei 7 von 10 untersuchten
Karzinomen deuten auf eine hochsignifikante Induktion dieses Genes
in vielen Prostatatumoren hin. Die normierten Daten sind gaphisch
dargestellt.
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14: Dargestellt ist die Amplifikation eines cDNA-Fragmentes,
das von Hek (UC205) mRNA aus den verschiedenen Prostatakarzinomen
abgeleitet ist, wie in Tabelle 4 beschrieben ist. Viele, jedoch
nicht alle Prostatadrüsen
mit BPH weisen einen erhöhten
Grad an Hek-Expression auf, als es im Pool von normalem Drüsengewebe
zu sehen ist. Die Untersuchung eines Gels weist außerdem darauf
hin, dass sich einige der PCRs nicht in de linearen Phase ihrer
Amplifikationskurven befinden. Die Daten wurden auf dem IS 1000
festgehalten und normiert, wie in Tabelle 4 beschrieben.
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15: Dargestellt ist eine β-Aktin Normierung der gepoolten
cDNAs. Pools von cDNAs, die entweder aus normalem Prostatagewebe
(N), Prostatadrüsen
mit BPH (B) oder Prostatatumoren (C) synthetisiert wurden, wurden
als Templates für
die β-Aktin
cDNA-Amplifikation
eingesetzt. Es wurden vier identische Ansätze von PCRs vorbereitet. Diese
wurden nach unterschiedlichen Anzahlen der PCR-Zyklen abgestoppt
und untersucht. Die Daten der 22 Zyklen wurden numerisch mittels
IS1000 festgehalten und dazu verwendet bereinigte Statistiken zu
erhalten. Eine normalisierte Statistik wurde erhalten, indem die
durchschnittliche Intensität
der drei aufgetragenen Banden einzeln durch den jeweiligen Wert
der Einzelbanden geteilt wurde. Diese bereinigte Statistiken wurde
dann dazu verwendet, die Daten, die von der Hek (UC205) mRNA erhalten
wurden, zu normieren. Die Hek mRNA ist in BPH und Prostatakrebspoolen
häufiger
vorhanden, als in dem Pool des normalen Prostatagewebes. Bei 34
und 37 Zyklen waren die PCRs für
die BPH- und Krebspoole in der linearen Phase ihrer Amplifikationskurven.
Die Daten wurden auf die β-Aktin Daten normiert.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Früherkennung, Diagnose, Prognose
und Behandlung von Prostataerkrankungen wie Prostatakrebs oder benigner Prostatahyperplasie
(BPH). Es werden Marker der Prostataerkrankung in Form von Nukleinsäuresequenzen,
die aus menschlichen Prostatatumoren oder Prostatakrebszelllinien
isoliert wurden, offenbart. Diese Marker sind Indikatoren über die
malignen Veränderungen
des Prostatagewebes und haben einen diagnostischen Wert bezüglich einer
potentiellen Metastasierung von malignen Prostatatumoren.
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In
der vorliegenden Erfindung sind alle Ausführungsbeispiele auf die Nukleinsäuresequenz
SEQ ID Nr: 1, die hierin offenbart wird, begründet. Alle anderen Sequenzen
und ihre Anwendungen, auf die hierin Bezug genommen wird, sind nicht
Teil der Erfindung. Es ist für
den Fachmann erkennbar, dass die offenbarte Nukleinsäuresequenz
für eine
Vielzahl von Anwendungen im Nachweis von Prostatakrebs, der Diagnose,
der Prognose und der Behandlung Verwendung findet. Beispiele für solche
Anwendungen umfassen die Amplifikation von Markern der Prostataerkrankung
unter Verwendung von spezifischen Primern, der Nachweis von Markern der
Prostataerkrankungen durch die Hybridisierung mit Oligonukleotidproben,
die Aufnahme der isolierten Nukleinsäuren in Vektoren, die Expression
der RNA, Peptide oder Polypeptide von diesen Vektoren, die Entwicklung
von immunologischen Reagenzien, die den durch den Marker kodierten
Produkten entsprechen und die therapeutische Behandlung von Prostatakrebs
unter Verwendung von Antikörpern,
Anti-Sense-Nukleinsäuren oder
anderen Hemmstoffen, die spezifisch für die identifizierten Prostatakrebsmarker
sind.
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A. Nukleinsäuren
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Wie
hierin beschrieben, sind Marker der Prostataerkrankungen mittels
RNA-Fingerprinting oder quantitativer RT-PCR identifiziert worden.
Dies umfasst sowohl bislang unbekannte Genprodukte, die Nukleinsäureprodukte
des α6-Integrin
Genes, des PAP-Genes, des Fibronektingenes und des Zyklin A-Genes
sowie des verkürzten
Nukleinsäureproduktes
des Her2/neu-Genes. Die drei zuletzt genannten Genprodukte wurden auch
in anderen Krebsformen identifiziert, jedoch stellt die vorliegende
Erfindung den ersten Bericht über
deren Überexpression
im Prostatakrebs dar.
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Die
Nukleinsäuresequenz
SEQ ID Nr: 1 der vorliegenden Erfindung findet Verwendung als Hybridisierungsprobe
und Amplifikationsprimer. Diese Nukleinsäure kann z. B. in der diagnostischen
Evaluierung von Gewebeproben, oder zur Klonierung von cDNAs mit
der kompletten Länge
oder genomischen Klonen hiervon eingesetzt werden. In besonderen
Ausführungsformen
bestehen diese Proben und Primer aus Oligonukleotidfragmenten. Solche
Fragmente sollten ausreichend lang sein, um spezifische Hybridisierungen
in einer RNA oder DNA aus der Gewebeprobe zu erlauben. Die Sequenzen
sind typischerweise 10 bis 20 Nukleotide lang, können aber auch länger sein.
Längere
Sequenzen, z. B. 40, 50, 100, 500 und auch bis zur vollständigen Länge sind
von besonderen Ausführungsbeispielen
bevorzugt.
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Die
Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung können
kontinuierliche Abfolgen von 10, 15, 17, 20, 30, 40, 50, 60, 75
oder 100 oder 500 Nukleotiden aus der Sequenz SEQ ID Nr: 1 sein.
Moleküle,
die zu den oben erwähnten
Sequenzen komplementär
sind und unter hochstrigenten Bedingungen an diese Sequenzen binden,
werden ebenso berücksichtigt.
Diese Proben sind in einer Vielzahl von Hybridisierungsausführungsformen
einsetzbar, wie der Southern und Norther Blot-Technologie. In einigen
Fällen
ist zu berücksichtigen,
dass Proben verwendet werden, die unter Umständen mit einer Vielzahl von
Zielsequenzen hybridisieren, ohne dass dadurch ihre Fähigkeit
einer effizienten Krebsdiagnose beeinträchtigt wird.
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Zahlreiche
Proben und Primer können
aus der offenbarten Nukleotidsequenz konstruiert werden. Primer
können
beliebiger Länge
sein, sind jedoch typischerweise 10 bis 20 Basen lang.
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Die
Verwendung von Hybridisierungsproben, die zwischen 14 und 100 Nukleotiden
lang sind, erlauben die Bildung eines Duplexmoleküles, das
sowohl stabil wie selektiv ist. Es werden im Allgemeinen Moleküle, die komplementäre Sequenzen über einen
Bereich von mehr als 20 Basen Länge
aufweisen, bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrides
zu erhöhen
und die Qualität
und den Grad der im einzelnen erhaltenen Hybridmoleküle zu verbessern.
Es ist grundsätzlich
zu bevorzugen, Nukleinsäuremoleküle im Bereich
von 20 bis 30 Nukleotiden Länge
oder noch länger
zu konstruieren. Solche Fragmente können z. B. durch eine direkte Synthese
des Fragmentes mittels chemischer Mittel hergestellt werden oder
durch das Einbringen der ausgewählten
Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Produktion.
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Demgemäß können die
Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung wegen ihrer Fähigkeiten
selektive Duplexmoleküle
mit komplementären
Bereichen aus Genen oder RNAs zu bilden, eingesetzt werden oder
sie können
als Primer zur Amplifikation von DNA oder RNA aus Gewebe bereitgestellt
werden. Abhängig von
der anvisierten Verwendung werden sinnvollerweise verschiedene Bedingungen
der Hybridisierung eingesetzt, um unterschiedliche Abstufungen der
Selektivität
der Probe bezogen auf die Zielsequenz zu erreichen.
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Für Anwendungen,
die eine hohe Selektivität
erfordern, wird man typischerweise relativ stringente Bedingungen
zur Bildung von Hybriden einsetzen, z. B. wird man einen relativ
niedrigen Salzgehalt und/oder hohe Temperaturen wählen, nämlich z.
B. 0,02 M bis 0,10 M NaCl bei Temperaturen von 50° C bis 70° C. Derart hoch
stringente Bedingungen erlauben wenig wenn überhaupt irgendwelche Fehlpaarungen
zwischen der Probe und dem Template- oder Zielstrang und sind insbesondere
geeignet zur Isolierung spezifischer Gene oder dem Nachweis spezifischer
RNA-Transkripte geeignet. Es ist allgemein bekannt, dass Hybridisierungsbedingungen
noch stringenter gemacht werden können durch die Zugabe von zunehmenden
Mengen an Formamid.
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Für einige
Anwendungen, z. B. den Austausch von Aminosäuren durch zielgerichtete Mutagenese,
ist es anerkannt, dass niedrigere stringente Bedingungen erforderlich
sind. Unter solchen Bedingungen kann eine Hybridisierung erfolgen,
obwohl die Sequenzen der Probe und des Zielstranges nicht perfekt
komplementär sind,
sondern an einer oder mehreren Positionen Fehlpaarungen auftreten.
Hybridisierungsbedingungen können
weniger stringent gemacht werden durch zunehmende Salzkonzentration
und abnehmende Temperatur. Mittelmäßig stringente Bedingungen
können
z. B. durch 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von etwa 37° C bis etwa
55° C erreicht
werden, während
niedrig stringente Bedingungen bei etwa 0,15 M bis 0,9 M Salz und einem
Temperaturbereich von etwa 20° C
bis etwa 55° C
gegeben sind. Hybridisierungsbedingungen können folglich leicht verändert werden
und folglich ist das Verfahren der Wahl in Abhängigkeit von dem erwünschten Resultat.
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Die
nachfolgenden Codon-Aufstellungen können in einem zielgerichteten
Mutageneseplan eingesetzt werden, um Nukleinsäuren zu generieren, die die
gleiche oder eine leicht veränderte
Aminosäuresequenz
der anfangs gegebenen Nukleinsäure
kodieren:
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Gemäß anderer
Ausführungsbeispiele
kann die Hybridisierung bei Bedingungen von z. B. 50 mM Tris-HCl
(pH 8,3), 75 MM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol,
bei Temperaturen zwischen annähernd
20° C bis
37° C erreicht
werden. Weitere eingesetzte Hybridisierungsbedingungen können annähernd 10
mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 μM MgCl2,
bei Temperaturen im Bereich von annähernd 40° C bis 72° C einschließen.
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In
besonderen Ausführungsformen
kann es vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung
in Kombination mit geeigneten Mitteln wie einem Label zur Bestimmung
der Hybridisierung einzusetzen. Eine Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln
sind im Stand der Technik bekannt und schließen fluoreszierende, radioaktive,
enzymatische oder andere Liganden wie Avidin/Biotin, die nachgewiesen
werden können,
mit ein. In bevorzugten Ausführungsbeispielen
kann es wünschenswert
sein, ein fluoreszierendes Label oder ein Enzym Tag wie Urease,
alkalische Phosphatase oder Peroxidase einzusetzen, anstatt radioaktive oder
auf andere Weise die Umwelt belastende Reagenzien zu verwenden.
Im Fall von Enzym Tags sind colorimetrische Indikatorsubstanzen
bekannt, die eingesetzt werden können,
um ein für
das menschliche Auge sichtbares oder spektrophotometrisch messbares
Detektionsmittel bereitzustellen, um die spezifische Hybridisierung
mit den komplementäre
Nukleinsäure
enthaltenden Proben zu identifizieren.
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Es
ist grundsätzlich
angestrebt, dass die Hybridisierungsproben, die hierin beschrieben
sind, sowohl als Reagenz in Hybridisierungslösungen wie auch in PCRs zum
Nachweis der Expression der korrespondierenden Gene geeignet sind
als auch in Ausführungsformen,
die eine feste Phase einsetzen. In Ausführungsformen, die eine feste
Phase einsetzen, ist die zu testende DNA (oder RNA) an eine ausgewählte Matrix
oder Oberfläche
adsorbiert oder sonst wie aufgebracht. Diese fixierte Einzelstrangnukleinsäure wird
dann in einer Hybridisierung mit ausgewählten Proben und unter gewünschten
Bedingungen eingesetzt. Die ausgewählten Bedingungen sind abhängig von
den Umständen,
insbesondere sind sie abhängig
von den erforderlichen Kriterien (z. B. dem G+C-Gehalt, dem Typ
der Zielnukleinsäure,
der Quelle der Nukleinsäure,
der Größe der Hybridisierungsprobe
usw.). Im Anschluss an einen Waschschritt der hybridisierten Oberfläche, um
nicht spezifisch gebundene Probenmoleküle zu entfernen, wird die Hybridisierung
mit Hilfe von Labeln nachgewiesen und ggf. quantifiziert.
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Es
ist offensichtlich, dass die Erfindung nicht auf die speziell hierin
offenbarten Proben beschränkt
ist und es ist insbesondere beabsichtigt, dass hierin auch Nukleinsäuresequenzen
eingeschlossen sind, die mit den offenbarten Sequenzen hybridisieren
oder funktionelle Sequenzanaloga dieser Sequenzen sind. Es kann z.
B. eine Teilsequenz eingesetzt werden, um ein strukturell verwandtes
Gen oder die gesamte genomische Länge oder den cDNA-Klon, von
welchem sie abstammt, zu identifizieren. Dem Fachmann sind die Verfahren zur
Herstellung von cDNA- oder genomischen Bibliotheken, die als Ziele
für die
oben beschriebenen Proben eingesetzt werden können (Sambrook et al., 1989)
wohl bekannt.
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Bei
Anwendungen, in welchen die Nukleinsäuresegmente der vorliegenden
Erfindung in einem Vektor, wie einem Plasmid, Cosmiden oder Viren
inkorporiert werden, können
diese Segmente mit anderen DNA-Sequenzen wie Promotoren, Polyadenalierungssignalen,
Restriktionsenzymschnittstellen, multiplen Klonierungsstellen oder
anderen kodierenden Segmenten oder ähnlichem kombiniert sein, so
dass die Gesamtlänge
erheblich variieren kann. Es muss berücksichtigt werden, dass ein
Nukleinsäurefragment
von nahezu jeder Länge
verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die
Handhabung bei der Herstellung und der Verwendung des beabsichtigten
rekombinanten DNA-Protokolls limitiert wird.
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DNA-Segmente,
die ein spezifisches Gen kodieren, können in rekombinante Wirtszellen
eingebracht werden und für
die Expression eines spezifischen strukturellen oder regulatorischen
Proteins verwendet werden. Alternativ können durch die Anwendung von
gentechnischen Verfahren, Teilbereiche oder Derivate der ausgewählten Gene
eingesetzt werden. Es besteht auch die Möglichkeit, stromaufwärts (eng.
upstream) gelegene Bereiche, die regulatorische Regionen wie Promotorregionen
enthalten, zu isolieren und nachfolgend zur Expression von ausgewählten Genen
einzusetzen.
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In
dem Fall, in dem Expressionsprodukte erzeugt werden sollen, ist
es möglich,
dass die Nukleinsäuresequenzen
variieren, während
sie die Fähigkeit
behalten, dasselbe Produkt zu kodieren. Es wird Bezug genommen auf
die oben erwähnte
Kodierungstabelle, die es dem Fachmann erlaubt, eine beliebige Nukleinsäure, die
für ein
Produkt einer vorgegebenen Nukleinsäure kodiert, zu verändern.
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B. Kodierte Proteine
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Sobald
die gesamte Kodierungssequenz eines mit einem Marker assoziierten
Genes bestimmt worden ist, kann das Gen in ein geeignetes Expressionssystem
inseriert werden. Das Gen kann in einer beliebigen Zahl von verschiedenen
rekombinanten DNA-Expressionssystemen
exprimiert werden, um eine große
Ausbeute an Polypeptidprodukten zu erzeugen, die dann gereinigt
werden können
und dazu eingesetzt werden können,
um aus Tieren mittels Impfung Antisera zu generieren, die in weiterführenden
Studien eingesetzt werden können.
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Beispiele
für Expressionssysteme,
die dem Fachmann wohl bekannt sind, schließen Bakterien wie E. coli,
Hefen wie Pichia pastoris, Baculoviren und Säugetierexpressionssysteme wie
in COS oder CHO-Zellen ein. Es kann ein vollständiges Gen exprimiert werden
oder alternativ Fragmente des Genes, die Teile des Polypeptides
kodieren, erzeugt werden.
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In
bestimmten, breiten Anwendungen der Erfindung wurde die Gensequenz,
die das Polypeptid kodiert, daraufhin analysiert, ob vermeintliche
Transmembransequenzen nachzuweisen sind. Solche Sequenzen sind typischerweise äußerst hydrophob
und können
leicht unter Verwendung von Standardsoftware für die Sequenzanalyse, wie MacVector
(IBI, New Haven, CT), nachgewiesen werden. Die Anwesenheit von Transmembransequenzen
ist oft schädlich,
wenn ein rekombinantes Protein einem Expressionssystem synthetisiert
werden soll, insbesondere bei E. coli, da sie zur Bildung von unlöslichen
Aggregaten führen,
welche schwierig in die native Konformation des Proteins zu überführen sind.
Die Deletion von Transmembransequenzen verändert normalerweise die Konformation
der übrigen
Proteinstruktur nicht signifikant.
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Außerdem sind
Transmembransequenzen, die schon per Definition in der Membran eingebettet
sind, nicht erreichbar. Antikörper
gegen solche Sequenzen können
sich daher in in vivo oder in situ Untersuchungen als nicht geeignet
erweisen. Die Deletion von transmembrankodierenden Sequenzen aus
Genen, die für
eine Expression verwendet werden sollen, kann mittels Standardtechniken
erfolgen. Es können
z. B. zufällig
platzierte Restrektionsenzymschnittstellen verwendet werden, um
ein gewünschtes
DNA-Fragment auszuschneiden oder es kann eine PCR-Amplifizieruung
verwendet werden, um nur einen gewünschten Teil des Genes zu amplifizieren.
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Computerisierte
Sequenzanalysen können
eingesetzt werden, um den Bereich der vorherbestimmbaren, hauptsächlichen
antigenbestimmenden Epitope eines Polypeptides zu bestimmen. Software,
die in der Lage ist, eine solche Analyse auszuführen, kann kommerziell erworben
werden, z. B. MacVector (IBI, New Haven, CT). Die Software verwendet
typischerweise Standardalogarithmen wie den Kyte/Doolittle oder
den Hopp/Woods-Ansatz zur Lokalisierung hydrophiler Sequenzen, die
an der Oberfläche
eines Proteins gefunden werden können
und daher wahrscheinlich als Antigendeterminante agieren.
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Sobald
diese Analyse durchgeführt
ist, können
Polypeptide erzeugt werden, die wenigstens die wesentlichen Merkmale
der Antigendeterminanten enthalten und die zur Erzeugung von Antisera
gegen das Polypeptid verwendet werden können. Minigene oder fusionierte
Gene, die diese Determinanten kodieren, können konstruiert werden und
in Expressionsvektoren unter Verwendung von Standardverfahren, z.
B. unter Verwendung der PCR-Klonierungsverfahren, inseriert werden.
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Das
Gen oder Genfragment, welches ein Polypeptid kodiert, kann in einen
Expressionsvektor unter Verwendung von Standardsubklonierungsverfahren
inseriert werden. Es kann ein E. coli Expressionsvektor eingesetzt
werden, der das rekombinante Polypeptid als Fusionsprotein produziert,
wodurch eine schnelle Affinitätsreinigung
des Proteins ermöglicht
wird. Beispiele für
solche Fusionsproteinexpressionssysteme sind das Glutation S-Transferasesystem
(Pharmacia, Piscalaway, NJ), das Maltose bindende Proteinsystem
(NEB, Beverley, MA), das FLAG-System (IBI, New Haven, CT) und das
6 × His-System
(Qiagen, Chatsworth, CA).
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Einige
dieser Systeme erzeugen rekombinante Polypeptide, die nur wenige
zusätzliche
Aminosäuren umfassen,
für die
es unwahrscheinlich ist, dass sie die antigenen Fähigkeiten
des rekombinanten Polypeptids beeinträchtigen. So fügen z.B.
sowohl das FLAG-System als auch das 6 × His-System nur kurze Frequenzen hinzu,
von denen es bekannt ist, dass sie nur wenig immunogen sind und
die die Faltung des Polypeptids in eine native Konformation nicht
negativ beeinflussen. Andere Fusionssysteme sind derart konstruiert,
dass sie Fusionsprodukte erzeugen, wobei der Fusionspartner leicht
von dem erwünschten
Polypeptid abzutrennen ist. In einem Ausführungsbeispiel ist der Fusionspartner
mit dem rekombinanten Polypeptid über eine Peptidsequenz, die
eine spezifische Erkennungssequenz für eine Protease enthält, verbunden.
Beispiele für
geeignete Sequenzen sind solche, die von der Tabakmosaikvirus-Protease
(Life Technologies, Gaithersburg, MD) oder von dem Faktor Xa (New
England Biolabs, Beverley, MA) erkannt werden.
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Das
verwendete Expressionssystem kann auch durch den Bakulovirus Polyhedronpromoter
angetrieben werden. Das Gen, welches das Polypeptid kodiert, kann
unter Verwendung von Standardverfahren derart verändert werden,
dass es für
das Klonieren in den Bakulovirusvektor geeignet ist. Ein Bakulovirusvektor
ist der pBlueBac Vektor (Invitrogen, Sorrento, CA). Der Vektor,
der das Gen für
das Polypeptid trägt,
wird in Spodoptera frugiperda Zellen (Sf9) unter Verwendung eines
Standardprotokolls transfiziert und die Zellen werden kultiviert
und anschließend
verarbeitet, um das rekombinante Antigen zu erhalten. Siehe Summers
et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell
Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station; U.S.
Patent-Nr. 4,215,051.
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Als
eine Alternative zu den rekombinanten Polypeptiden können synthetische
Peptide, die den Antigendeterminanten entsprechen, erzeugt werden.
Solche Peptide sind wenigstens sechs Aminosäurereste lang und können bis
zu etwa 35 Reste enthalten, was in etwa auch die oberen Grenze der
automatischen Peptidsynthese-Maschinen ist, wie etwa derer, die
von Applied Biosystems bezogen werden können (Foster City, CA). Die
Verwendung solcher kleinen Peptide zur Impfung erfordert normalerweise
die Konjugierung der Peptide mit einem immunogenen Trägerprotein,
wie Hepatitis B Oberflächenantigen,
Keyhole Limpet Hämocyanin oder
bovinem Serumalbumin. Die Verfahren, um diese Koppelung durchzuführen, sind
wohl bekannt im Stand der Technik.
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Es
können
ferner Aminosäuresequenzvarianten
des Polypeptids erzeugt werden. Diese können z. B. seltene Sequenzvarianten
des Polypeptids, die aufgrund natürlich Variation innerhalb einer
Population auftreten, sein oder sie können als Homologe in anderen
Spezies gefunden werden. Es kann sich auch um Sequenzen handeln,
die nicht natürlich
auftreten, die aber der natürlichen
Sequenz ausreichend ähnlich
sind, so dass ihre Funktion und das Auslösen einer Immunreaktion, welche
mit den natürlichen
Formen des Polypeptids kreuzreagiert, ähnlich ist. Solche Sequenzvarianten
können
unter Verwendung von Standardverfahren der gezielten Mutagenese,
wie sie hierin auch für
das Entfernen von Transmembransequenzen beschrieben wurde, hergestellt
werden.
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Aminosäuresequenzvarianten
des Polypeptids können
auch Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten sein. Bei
Deletionsvarianten fehlen ein oder mehrere Reste des nativen Proteins,
wobei die fehlenden Reste nicht essentiell für die Funktion oder Immunogenität sind.
Solche Varianten sind beispielhaft mit dem Fehlen der Transmembransequenzen
dargestellt. Ein anderer häufiger
Typ von Deletionsvarianten sind solche, denen eine Signalsequenz
fehlt, die für
die Sekretion verantwortlich ist, oder solche, denen eine Signalsequenz
fehlt, die dafür
verantwortlich ist, dass ein Protein an einem bestimmten Teil einer
Zelle bindet. Ein Beispiel für
die zuletzt genannte Sequenz ist die SH2-Domain, die eine Proteinbindung
an den Phosphotyrosinrest induziert.
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Substitutionsvarianten
enthalten typischerweise eine alternative Aminosäure an einer oder mehreren Stellen
innerhalb des Proteins und können
derart konstruiert sein, die eine oder mehrere Eigenschaften des Polypeptids,
wie die Stabilität
gegenüber
einer proteolytischen Spaltung, zu verändern. Substitutionen sind vorzugsweise
konservierend, was bedeutet, dass eine Aminosäure durch eine Aminosäure von ähnlicher
Größe oder
Ladung ersetzt wird. Konservierende Substitutionen sind im Stand
der Technik wohl bekannt und schließen z. B. den Austausch von
Alanin gegen Serin, Arginin gegen Lysin, Asparagin gegen Glutamin
oder Histidin, Aspartat gegen Glutamat, Zystein gegen Serin, Glutamin
gegen Asparagin, Glutamat gegen Aspartat, Glycin gegen Prolin, Histidin
gegen Asparagin oder Glutamin, Isoleucin gegen Leucin oder Valin,
Leucin gegen Valin oder Isoleucin, Lysin gegen Argin, Glutamin oder
Glutamat, Methionin gegen Leucin oder Isoleucin, Phenylalanin gegen
Lycosin, Leucin oder Methionin, Serin gegen Threonin, Threonin gegen
Serin, Tryptophan gegen Tyrosin, Tyrosin gegen gegen Tryptophan
oder Phenylalanine und Valin gegen Isoleucin oder Leucin ein.
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Insertionsvarianten
schließen
solche Fusionsproteine mit ein, die z. B. eine schnelle Aufreinigung
des Polypeptids erlauben. Insertionsvarianten schließen außerdem Hybridproteine
ein, die Sequenzen aus anderen Proteinen oder Polypeptiden tragen,
die homolog zu dem Polypeptid sind. Es kann z.B. eine Insertionsvariante
Teile einer Aminosäuresequenz
des Polypeptids einer Spezies gemeinsam mit einem Anteil des homologen
Polypeptids einer anderen Spezies einschließen. Weitere Insertionsvarianten
schließen
solche ein, in welche zusätzliche
Aminosäuren
innerhalb der kodierenden Sequenz des Peptides eingeführt wurden.
Hierbei handelt es sich normalerweise um kleinere Einfügungen als
bei den oben beschriebenen Fusionsproteinen, und sie werden eingeführt, um
z. B. eine Proteasenschnittstelle zu zerstören.
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Die
hauptsächlichen
immunogenen Determinanten des Polypeptids können über einen empirischen Ansatz
identifiziert werden, bei welchem Teile des Gens, die das Polypeptid
kodieren, in einem rekombinanten Wirt exprimiert werden und die
hierbei entstehenden Proteine auf ihre Fähigkeit, eine Immunantwort
auszulösen,
getestet werden. Es kann z.B. eine PCR verwendet werden, um eine
Vielzahl von Peptiden zu erzeugen, denen zunehmend länger werdende
Fragmente des C-terminalen Endes des Proteines fehlen. Die immunoprotektive
Aktivität
dieser Peptide hilft dann, solche Fragmente oder Domänen des
Polypeptids zu identifizieren, die für diese Aktivität erforderlich
sind. Weitere Untersuchungen, bei denen nur eine geringe Anzahl
von Aminosäuren
bei jedem Schritt entfernt werden, erlauben dann die Lokalisierung
der immunogenen Determinanten des Polypeptids.
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Ein
weiteres Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden ist die Verwendung
von nachahmenden Peptiden (eng. peptide mimetics). Solche nachahmende
Peptide sind Peptide, die Moleküle
enthalten, die Elemente einer sekundären Proteinstruktur nachahmen.
Siehe z. B. Johnson et al., „Peptide
Turn Mimetics" in
BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall,
New York (1993). Der Grund, nachgeahmte Peptide einzusetzen, ist,
dass das Peptidrückgrad
eines Proteins in erster Linie besteht, um die Orientierung der
Aminosäureseitenketten
derart zu erweitern, dass molekulare Interaktion wie die mit Antikörpern und
Antigenen ermöglicht
werden. Von einem nachgeahmten Peptid wird erwartet, dass es molekulare Interaktionen
in ähnlicher
Weise wie das natürliche
Molekül
ermöglicht.
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Erfolgreiche
Anwendungen des Konzeptes der nachahmenden Peptide haben sich daher
auf das Nachahmen von β-Faltblättern innerhalb
eines Proteins konzentriert, die als hoch immunogen bekannt sind. Gleichermaßen können β-Faltblattstrukturen
innerhalb eines Polypeptides mittels computerbasierter Algorithmen
wie sie hierin besprochen wurden, vorhergesagt werden. Sobald die
Bestandteile der Aminosäuren
des Faltblattes bestimmt sind, können
nachahmende Peptide hergestellt werden, die eine ähnliche
räumliche
Orientierung der wesentlichen Elemente der Aminosäureseitenketten
erreichen.
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C. Herstellung von Antikörpern, die
spezifisch für
die kodierten Proteine sind
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1. Expression des Proteins
von klonierten cDNAs
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Die
cDNA, wie sie in SEQ ID Nr: 1 dargelegt ist, kann als Peptid oder
Protein exprimiert werden. Die Veränderung von DNA-Segmenten zur
Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen kann unter
Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren zur
rekombinanten Expression durchgeführt werden. Nach hiesiger Auffassung
kann nahezu jedes Expressionssystems zur Expression der beanspruchten
Proteinsequenzen verwendet werden.
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Sowohl
cDNA wie genomische Sequenzen sind für eine eukaryontische Expression
geeignet, da die Wirtszelle normalerweise das genomische Transkript
bearbeitet, um eine funktionelle mRNA zur Übersetzung in ein Protein bereitzustellen.
Darüber
hinaus ist es möglich,
Teilsequenzen zur Herstellung von Antikörpern gegen bestimmte Teile
eines Genproduktes zu verwenden, auch wenn die Gesamtsequenz des
entsprechenden Genproduktes unbekannt bleibt. Es stehen Computerprogramme
zur Verfügung,
die bei der Auswahl von Bereichen, die eine potentiell immunologische
Bedeutung haben, unterstützen.
Eine Software, die beispielsweise in der Lage ist, eine solche Analyse
auszuführen,
ist MacVector (IBI, New Haven, CT) und bereits kommerziell erhältlich.
Die Software verwendet typischerweise Standardalogarithmen wie das
Kyte/Doolittle oder Hopp/Woods Verfahren zur Lokalisierung hydrophiler
Sequenzen, die typischerweise auf der Oberfläche von Proteinen gefunden
werden und daher mit hoher Wahrscheinlichkeit als immunogene Determinanten
agieren.
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Die
hierin verwendeten Begriffe „gentechnisch
veränderte" und „rekombinante" Zellen sollen sich
auf eine Zelle beziehen, in welche ein exogenes DNA-Segment oder
Gen, wie eine cDNA oder ein Gen, von Menschenhand eingefügt wurde.
Auf diese Art und Weise sind gentechnisch veränderte Zellen von natürlich auftretenden
Zellen unterscheidbar, welche keine rekombinant eingeführten exogenen
DNA-Segmente oder Gene enthalten. Rekombinante Zellen umfassen solche,
die eine eingefügte
cDNA oder genomische Gensequenz haben und auch solche, die Gene
tragen, die in der Nähe
eines heterologen Promotors liegen, der natürlicherweise nicht mit diesem
bestimmten eingeführten
Gen verbunden ist.
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Um
ein rekombinant kodiertes Protein oder Peptid zu exprimieren, unabhängig, ob
es eine mutierte oder Wildtypform ist, würde man einen Expressionsvektor
herstellen, der die beanspruchte isolierte Nukleinsäure unter
der Kontrolle eines oder mehrerer operativ verbundener Promotoren
enthält.
Um eine kodierende Sequenz „unter
die Kontrolle" eines
Promotors zu bringen, würde
das 5' Ende in der
Transkriptionsinitiationsstelle des transkriptionellen Leserahmens,
der grundsätzlich
zwischen etwa 1 und etwa 50 Nukleotiden „downstream" (d.h. 3') des gewählten Promotors
liegt, positionieren. Der „upstream" Promotor stimuliert
die Transkription der DNA und sorgt für die Expression des kodierten
rekombinanten Proteins. Dies ist die Bedeutung von „rekombinanter
Expression" in diesem
Zusammenhang.
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Zahlreiche
Standardverfahren sind verfügbar,
um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die geeignete Nukleinsäuren und
transkriptionelle/translationelle Kontrollsequenzen enthalten, um
eine Protein- oder Peptidexpression in einer Vielzahl von Wirtsexpressionssystemen
zu ermöglichen.
Die Zelltypen, welche für die
Expression zur Verfügung
stehen, schließen
Bakterien wie E. coli und B. subtilis, der mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA
transformiert ist, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA Expressionsvektoren
ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Ausgewählte Beispiele
der prokaryotischen Wirte sind E. coli Stamm RR1, E. coli LE392,
E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC Nr. 31537) sowie E. coli W3110 (F-,
Lambda-, Prototroph, ATCC Nr. 273325), Bazilli wie Bacillus subtilis
und andere Enterobakteriaceae wie Salmonella typhimorium, Serratia
marcesenses und verschiedene Pseudomonas-Spezien.
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Im
Allgemeinen enthalten Plasmidvektoren ein Replikon und Kontrolsequenzen,
die aus Spezies stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind
und in Verbindung mit diesem Wirt verwendet werden. Der Vektor trägt normalerweise
eine Replikationsstelle sowie eine Markersequenzen, die eine phenotypische
Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. So ist E. coli z.B.
oft mit pBR322 transformiert, einem Plasmid, das aus einer E. coli
Spezies stammt. Das Plasmid pBR322 enthält Gene für Ampizillin- und Tetracyclineresistenzen
und ermöglicht
daher eine leichte Identifikation transformierter Zellen. Das pBR
Plasmid oder andere mikrobische Plasmide oder Phagen müssen außerdem einen
Promotor enthalten, oder sollten derart verändert werden, dass sie einen
Promotor enthalten, welcher in den mikrobiellen Organismus zur Expression
eines eigenen Proteines verwendet werden kann.
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Darüber hinaus
enthalten Phagenvektoren ein Replikon und Kontrollsequenzen, die
mit dem Wirtsmikroorganismus kompatibel sind und als transformierende
Vektoren in Verbindung mit diesem Wirt eingesetzt werden können. Z.
B. kann der Phage Lambda GEMTM -11 zur Herstellung
eines rekombinanten Phagenvektors verwendet werden, der zur Transformierung
einer Wirtszelle wie dem E. coli LE392 eingesetzt werden kann.
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Weitere
verwendbare Vektoren schließen
die pIN Vektoren (Inouye et al., 1985) und pGEX Vektoren ein, die
zur Herstellung von löslichen
Fusionsproteinen mit Glutation S-Transferase
(GST) zur späteren
Aufreinigung und Abtrennungen oder Spaltungen geeignet sind. Weitere
geeignete Fusionsproteine sind solche mit β-Galactosidase, Ubiquitin oder ähnlichem.
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Promotoren,
die am häufigsten
in rekombinanten DNA-Konstrukten eingesetzt werden, schließen die β-Lactamase
(Penicillinase), Laktose und Tryptophan (trp) Promotorsysteme mit
ein. Obwohl dies die am häufigsten
verwendeten sind, sind auch andere mikrobielle Promotoren beschrieben
und eingesetzt worden und es wurden Details bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen
publiziert, so dass der Fachmann in der Lage ist, sie funktionell
mit einem Plasmidvektor zu ligieren.
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Zur
Expression in Saccharomyces wird üblicherweise das Plasmid YRp7
eingesetzt (Stinchcomb et al., 1979, Kingsman et al., 1979, Tschemper
et al., 1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1 Gen enthält, das
einen Selektionsmarker für
einen mutierten Hefestrang, dem die Fähigkeit, auf Tryptophan zu
wachsen, fehlt. Dies ist z. B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-I (Jones,
1977). Die Anwesenheit der trp1-Läsion als Eigenschaft des Hefewirtszellgenoms
ist eine wirkungsvolle Methode zum Nachweis der Transformation durch
das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
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Geeignete
Promotorsequenzen für
Hefevektoren schließen
die Promotoren für
die 3-Phosphoglyceratkinase
(Hitzeman et al., 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et
al., 1968, Holland et al., 1978) wie die Endolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat
Dehydrogenase, Hexokinase, Pyrovatdecarboxylase, Phosphofructokinase,
Glukose-6-Phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase,
Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Bei der Konstruktion
geeigneter Expressionsplasmide werden die Terminationssequenzen,
die mit diesen Genen assoziiert sind, in den Expressionsvektor 3' von der Sequenz,
die zu exprimieren ist, einligiert, um für eine Polyadenylierung der
mRNA und eine Termination zu sorgen.
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Weitere
geeignete Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der Transkriptionskontrolle über Wachstumsbedingungen
haben, schließen
die Promotorregionen der Alkoholdehydrogenase 2, des Isocytochrom
C, der sauren Phosphatase, den abbauenden Enzymen, die mit dem Stickstoffstoffwechsel
assoziiert werden und die im vorangegangenen erwähnten Glyceraldehy-3-Phosphatatdehydrogenase
sowie Enzyme, die für
die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind, ein.
-
Zusätzlich zu
Mikroorganismen können
auch Zellkulturen, die von vielzelligen Organismen abgeleitet sind,
als Wirtszellen verwendet werden. Grundsätzlich ist jede Zellkultur
einsetzbar, egal ob sie von einem Vertebraten oder Invertebraten
abstammt. Neben den Säugerzellen
sind auch Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Expressionsvirusvektoren
infiziert sind (z. B. Bakulovirus) und Pflanzenzellsysteme, die
mit rekombinanten Expressionsvektorviren infiziert sind (z. B. Cauliflower
Mosaik Virus, DaMV; Tabak Mosaik Virus, TMV) oder die mit rekombinanten
Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti Plasmid) transformiert sind,
wobei eine oder mehrere Kodierungssequenzen in dem Vektor enthalten
sind, eingeschlossen.
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In
einem geeigneten Insektensystem ist z. B. das Autograph californica
nuclear polyhidrosis Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder
Gene verwendet. Das Virus wächst
in Spodoptera frugiperda Zellen. Die isolierten Nukleinsäuresequenzen
werden in nichtessentielle Bereiche (z. B. das Polyhedringen) des Virus
einkloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV Promotors (z. B.
den Polyhedrinpromoter) gestellt. Eine erfolgreiche Insertion der
Kodierungssequenz führt
zu einer Inaktivierung des Polyhedringens und zur Bildung eines
nicht ummantelten rekombinanten Virus (d. h. dem Virus fehlt der
proteinhaltige Überzug,
der durch das Polyhedringen kodiert wird). Diese rekombinanten Viren
werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda Zellen zu infizieren,
in welchen die inserierten Gene exprimiert werden (z. B. U.S. Patent-Nr.
4,215,051 (Smith)).
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Beispiele
für geeignete
Säugerwirtszelllinien
sind VERO und HeLa Zellen, chinesische Hamster Ovar-Zelllinien (CHO),
W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN und MDCK Zelllinien. Zusätzlich können Wirtszelllinien
gewählt
werden, die die Expression von inserierten Sequenzen modulieren
oder verändern
und die Genprodukte in einer bestimmten gewünschten Art und Weise prozessieren.
Solche Modifizierungen (z. B. Glycosylierung) und Prozessierungen
(z. B. Spaltung) von Proteinprodukten können wichtig für die Funktion des
kodierten Proteins sein.
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Verschiedene
Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen
für die
posttranslationale Bearbeitung und Abänderung von Proteinen. Es können daher
geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte
Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteines sicherzustellen.
Expressionsvektoren, die in Säugerzellen
verwendet werden, schließen
normalerweise einen Replikationsstartpunkt (nach Bedarf), einen
Promotor, der vor dem zu Exprimierenden lokalisiert ist, sowie einige notwendige
Ribosomenbindestellen, RNA Splicestellen, Polyadenylierungssignale
und transkriptionale Terminatorsequenzen ein. Der Replikationsstartpunkt
kann entweder durch die Konstruktion eines Vektors, der einen exogenen
Startpunkt enthält,
wie er eventuell von einem SV40 oder anderem Virus abgeleitet werden
kann (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) oder kann durch eine aus der
Wirtszelle stammenden chromosomalen Replikationsfunktion bereitgestellt
werden. Sofern der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert,
ist der zuletzt genannte oft ausreichend.
-
Die
Promotoren können
aus dem Genom von Säugerzellen
stammen (z. B. Metallothioninpromotoren) oder von Säugerviren
abstammen (z. B. der Adenovirus Late Promotor; der Vaccinia Virus
7.5K Promotor). Weiterhin ist es möglich und kann wünschenswert
sein, Promotoren oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise
mit den gewünschten
Gensequenzen assoziiert sind, vorausgesetzt, dass diese Kontrollsequenzen
mit dem Wirtszellsystem kompatibel sind.
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Eine
Vielzahl von viral basierten Expressionssystemen kann verwendet
werden, so z. B. die weit verbreiteten Promotoren, die von Polyoma,
Adenovirus 2 und am häufigsten
von Simianvirus 40 (SV40) abstammen. Die frühen und späten Promotoren des SV40 Virus
sind insbesondere geeignet, da beide leicht aus dem Virus als Fragment,
das gleichzeitig den SV40 viralen Replikationsstartpunkt enthält, zu gewinnen
sind. Es können
auch kleinere oder größere SV40-Fragmente
verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die ungefähr 250 bp
Sequenz von der Hind III Restriktionsschnittstelle mit zur Bgl I
Restriktionsschnittstelle, auf der der virale Replikationsstartpunkt
lokalisiert ist, umfassen.
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In
Fällen,
in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor eingesetzt wird, kann
die kodierende Sequenz an einen Adenovirus transkriptions-/translationskontrollierenden
Komplex ligiert werden, z. B. den späten Promotor und die dreiteilige
Leadersequenz. Dieses chimäre
Gen kann dann in ein Adenovirusgenom inseriert werden unter Verwendung
in vitro oder in vivo Rekombination. Die Insertion in einen nichtessentiellen Bereich
des viralen Genoms (z. B. die Region E1 oder E3) führt zu einem
rekombinanten Virus, das lebensfähig
ist und in der Lage ist, Proteine in einer infizierten Wirtszelle
zu exprimieren.
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Es
können
auch spezifische Initiationssignale für eine effiziente Translation
der beanspruchten isolierten Nukleinsäurekodierungssequenz erforderlich
sein. Solche Signale schließen
das ATG Initiationskodon und nachfolgende Sequenzen ein. Exogene
Translationskontrollsignale, eingeschlossen das ATG Initiationskodon, können ebenfalls
benötigt
werden. Dem Fachmann ist dies jedoch bewusst und er ist auch in
der Lage, die notwendigen Signale bereitzustellen. So ist es z.
B. wohl bekannt, dass das Initationskodon mit dem Leserahmen in
der gewünschten
Kodierungssequenz „in-frame" (oder in derselben
Phase) sein muss, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten.
Solche exogenen Translationskontrollsignale und Initiationskodons
können
vielerlei Ursprung haben und z. B. natürlichen oder synthetischen
Ursprungs sein. Die Expressionseffizienz kann durch das Einbeziehen
von geeigneten Transkriptionsverstärkerelementen oder Transkriptionsterminatoren
(Bittner et al., 1987) erhöht
werden.
-
In
eukaryontischen Expressionssystemen ist es ebenfalls üblicherweise
gewünscht,
in die Transkriptionseinheit ein geeignetes Polyadenylierungssignal
(z. B. 5'-AATAAA-3') einzubeziehen,
sofern ein solches nicht in dem zu klonierenden Segment enthalten
ist. Typischerweise wird die Poly-A-Stelle etwa 30 bis 2.000 Nukleotide
stromabwärts
(downstream) der Terminationsstelle des Proteines platziert, wobei
die Position vor der Transkriptionstermination lokalisiert ist.
-
Für eine über einen
langen Zeitraum andauernde und ertragreiche Produktion des rekombinanten
Proteines ist eine stabile Expression zu bevorzugen. Es können beispielsweise
Zelllinien etabliert werden, die Konstrukte, welche Proteine kodieren,
stabil exprimieren. Anstatt Expressionsvektoren, die virale Replikationsstartpunkte
enthalten, zu verwenden, können
Wirtszellen mit Vektoren transformiert werden, die durch geeignete
Expressionskontrollelemente (z. B. Promotor-, Enhancersequenzen,
Transkriptionsterminatoren, Polyadenylationssigneale usw.) und einem
selektierbaren Marker kontrolliert werden. Nach dem Einführen der Fremd-DIVA
wird den gentechnisch veränderten
Zellen erlaubt, für
ein bis zwei Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen, bevor
sie auf ein Selektionsmedium umgestellt werden. Der selektierbare
Marker in dem rekombinanten Plasmid überträgt eine Resistenz gegenüber der
Selektion und erlaubt es dadurch, Zellen, welche das Plasmid stabil
in ihre Chromosomen integriert haben, in Form von Foci zu wachsen.
Diese können anschließend kloniert
werden und zu Zelllinien expandiert werden.
-
Es
können
eine Vielzahl von Selektionsthemen eingesetzt werden, welche das
Herpes Simplexvirus Thymidinkinase- (Wigler et al., 1977), das Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase-
(Szybalska et al., 1962) und das Adeninphosphoribosyltransferasegen
(Lowy et al., 1980), in entsprechenden tk-, hgprt- oder aprt-Zellen
einschließt,
jedoch nicht darauf beschränkt
sind. Es kann außerdem
eine Stoffwechselresistenz als Basis für eine Selektion auf DHFR,
welches eine Resistenz gegen Methotrexat vermittelt (Wigler et al.,
1980, O'Hare et
al., 1981); GPT, welches eine Resistenz gegen Mycophenolsäure überträgt (Mulligan
et al., 1981); NEO, welches eine Resistenz gegen das Aminoglycosid
G-418 überträgt (Colberre-Garapin
et al., 1981) und HYGRO, welches eine Resistenz gegen Hygromycin überträgt (Santerre
et al., 1984), verwendet werden.
-
Es
ist außerdem
zu überlegen;
dass die isolierte Nukleinsäure
der Erfindung überexprimiert
sein kann, d. h. in einem erhöhten
Maße verglichen
mit der natürlichen
Expression in der menschlichen Prostatazelle oder auch in Bezug
zur Expression von anderen Proteinen in der rekombinanten Wirtszelle
exprimiert sein kann. Eine solche Überexpression kann durch eine
Vielzahl von Verfahren einschließlich einer radioaktiven Markierung
und/oder einer Proteinaufreinigung abgeschätzt werden. Es sind jedoch
einfache und direkte Verfahren bevorzugt, z. B. solche, die ein
SDS/PAGE, Proteinfärbung
oder Western Blot Analyse, gefolgt von quantitativen Analysen wie
densitometrischen Bestimmungen der Ergebnisse im Gel oder Blot einschließen. Eine
spezifische Erhöhung
der Menge des rekombinanten Proteines oder Peptides im Vergleich
zu der Menge in der natürlichen
menschlichen Prostatazelle weist auf eine Überexpression hin, ebenso wie
die relative Häufigkeit des
spezifischen Proteins im Verhältnis
zu anderen Proteinen, die durch die Wirtszelle produziert werden
und z. B. in einem Gel sichtbar sind.
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2. Aufreinigung
von exprimierten Proteinen
-
Der
Begriff „gereinigtes
Protein oder Peptid",
wie er hierin verwendet wird, soll sich auf eine Zusammensetzung
beziehen, die von anderen Komponenten abtrennbar ist, wobei das
Protein oder Peptid bis zu jedem Reinheitsgrad im Verhältnis zu
der natürlich
gewinnbaren Form aufgereinigt werden kann, d. h. in diesem Fall
im Verhältnis
zu dessen Reinheit innerhalb eines Prostatazellextraktes. Ein gereinigtes
Protein oder Peptid bezieht sich daher auch auf ein Protein oder
Peptid, welches frei von der Umgebung ist, in welcher es normalerweise
auftritt.
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Generell
bezieht sich „gereinigt" auf eine Protein-
oder Peptidzusammensetzung, die einer Fraktionierung unterworfen
wurde, um verschiedene andere Komponenten abzutrennen, wobei die
Zusammensetzung im Wesentlichen ihre ausdrückliche biologische Aktivität behält. Wenn
der Begriff „im
Wesentlichen gereinigt" verwendet
wird, bezieht sich dies auf eine Zusammensetzung, in welcher das
Protein oder Peptid die Hauptkomponente der Zusammensetzung bildet,
so dass nahezu 50 % oder mehr Protein die Zusammensetzung bilden.
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Zahlreiche
Verfahren zur Bestimmung des Reinheitsgrades der Proteine oder Peptide
sind dem Fachmann im Stand der Technik bekannt. Diese schließen z. B.
die Bestimmung der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion ein
oder schließen
die Bestimmung der Anzahl der Polypeptide innerhalb einer Fraktion
mittels SDS/PAGE-Analyse ein. Ein bevorzugtes Verfahren zur Bewertung
der Reinheit einer Fraktion berechnet die spezifische Aktivität der Fraktion,
um sie mit der spezifischen Aktivität des Ausgangsextraktes zu
vergleichen und dabei den Grad der Reinheit zu berechnen, welcher
hierin durch die „-fache
Reinheitsnummer" angegeben wird.
Die tatsächlichen
Einheiten, die verwendet werden, um die Aktivitätsmenge darzustellen, sind
selbstverständlich
abhängig
von der speziellen Assay-Technik, die gewählt wurde, um im Anschluss
an die Reinigung zu erfolgen, sowie davon ob oder ob nicht das exprimierte
Protein oder Peptid eine nachweisbare Aktivität zeigt.
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Dem
Fachmann sind verschiedene Verfahren, die zur Proteinreinigung geeignet
sind, im Stand der Technik bekannt. Diese schließen z. B. die Fällung mit
Ammoniumsulfat, PEG, Antikörpern
oder ähnlichem oder
durch Hitzedenaturierung gefolgt von einer Zentrifugation, chromographischen
Schritten wie Ionenaustausch, Gelfiltration, reverse Phase, Hydroxylapatit
und Affinitätschromatographie;
isoelektrische Fokussierung; Gelelektrophorese und Kombinationen
dieser und weiterer Verfahren ein. Wie es allgemein im Stand der Technik
bekannt ist, ist davon auszugehen, dass die Reihenfolge beim Durchführen der
verschiedenen Aufreinigungsschritte verändert werden kann oder das
bestimmte Schritte übergangen
werden können
und das Verfahren dennoch eine geeignete Methode zur Herstellung
von im wesentlichen gereinigten Proteinen oder Peptiden darstellt.
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Es
gibt keine allgemeinen Anfordernisse, dass das Protein oder Peptid
immer im höchstmöglichen Reinheitsgrad
bereitgestellt werden muss. Tatsächlich
ist zu berücksichtigen,
dass weniger vollständig
gereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen nützlich sind.
Eine teilweise Aufreinigung kann erreicht werden durch den Einsatz
von weniger Aufreinigungsschritten in Kombination oder durch die
Verwendung von verschiedenen Alternativen, dasselbe allgemeine Reinigungsprotokoll umzusetzen.
Es ist z. B. anerkannt, dass eine Kationen austauschende Säulenchromatogaphie,
die unter Verwendung einer HPLC-Apparatur durchgeführt wird,
im Allgemeinen zu einer höheren
Reinheit führt,
als wenn dieselbe Technik in einem Niedrigdruckchromatogaphiesystem
eingesetzt wird. Verfahren, die einen niedrigeren Grad in der relativen
Reinheit bieten, können
Vorteile in Bezug auf die Gesamtgewinnung des Proteinprodukts oder
in Bezug auf die Erhaltung der Aktivität des exprimierten Proteins
haben.
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Es
ist auch bekannt, dass das Wanderverhalten eines Polypeptids unter
verschiedenen Bedingungen, manchmal in signifikantem Maße, im SDS/PAGE-System
variieren kann (Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425,
1997). Aus diesem Grund ist es auch einzusehen, dass das scheinbare
Molekulargewicht in gereinigten oder teilweise gereinigten Expressionsprodukten
unter verschiedenen Elektrophoresebedingungen variieren kann.
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3. Antikörperherstellung
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Für einige
Ausführungsformen
wird es wünschenswert
sein, Antikörper
zu produzieren, die mit hoher Spezifität an das Polypeptidprodukt
der isolierten Nukleinsäure
der SEQ ID Nr: 1 binden. Methoden zur Herstellung und Charakterisierung
von Antikörpern
sind im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
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Verfahren
zur Herstellung polykloner Antikörper
sind im Stand der Technik wohl bekannt. In Kürze, zur Herstellung von polyklonen
Antikörpern
wird ein Tier mit einer immunogenen Zusammensetzung immunisiert und
das Antiserum von dem immunisierten Tier gesammelt. Eine Vielzahl
von Tierarten kann für
die Produktion von Antiserum eingesetzt werden. Typischerweise handelt
es sich bei dem Tier, das zur Produktion eines Anti-Antiserums eingesetzt
wird, um einen Hasen, eine Maus, eine Ratte, einen Hamster, ein
Meerschweinchen oder eine Ziege. Wegen der verhältnismäßig großen Blutmenge der Hasen ist
die bevorzugte Wahl zur Produktion von polyklonalen Antikörpern.
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Es
ist im Stand der Technik bekannt, dass eine vorgegebene Zusammensetzung
in ihrer Immunogenität
variieren kann. Aus diesem Grund ist es oft nötig, das Immunsystem des Wirtes
zu stimulieren, was durch das Koppeln eines peptidischen oder polypeptidischen
Immunogens an einen Träger
erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind
das Keyhole Limpet Hämocyanin
(KLH) und das bovine Serumalbumin (BSA). Andere Albumine wie Ovalbumin,
Mäuseserumalbumin
oder Hasenserumalbumin können
ebenso als Träger
verwendet werden. Mittel, um ein Polypeptid an ein Trägerprotein
zu koppeln, sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen Glutaraldehyd,
M-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester,
Carbodiimid und Bis-biazotized Benzidin ein.
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Es
ist außerdem
im Stand der Technik bekannt, dass die Immunogenität von bestimmten
immunogenen Zusammensetzungen durch die Verwendung von unspezifischen
Stimulatoren der Immunantwort, bekannt als Adjuvantien, verstärkt werden
kann. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien schließen das
komplette Freund's
Adjuvans (ein unspezifischer Stimulator der Immunantwort, der abgetötetes Mycobakterium
tuberculosis enthält),
inkomplette Freund's
Adjuvans und Aluminiumhydroxyd-Adjuvans ein.
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Die
Menge der immunogenen Zusammensetzung, die zur Herstellung eines
polyklonalen Antikörpers verwendet
wird, variiert in Abhängigkeit
von der Art des Immunogens sowie in Abhängigkeit des Tieres, welches
für die
Immunisierung eingesetzt wird. Eine Vielzahl von Applikationsrouten
kann für
das Immunogen verwendet werden (subkutan, intramuskulär, intradermal,
intravenös
und intraperitoneal). Die Bildung von polyklonalen Antikörpern kann
anhand von Blutproben des immunisierten Tieres, die zu verschiedenen
Zeitpunkten nach der Immunisierung gesammelt wurden, überwacht
werden. Eine zweite Wiederholungsinjektion kann auch verabreicht
werden. Der Wechsel zwischen Wiederholungsinjektion und Titerbestimmung
wird wiederholt, bis der geeignete Titer erreicht ist. Sobald ein
gewünschtes
Maß an
Immunogenität
erreicht ist, kann das immunisierte Tier ausgeblutet werden und
das Serum isoliert und aufbewahrt werden und/oder das Tier kann zur
Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MAbs) eingesetzt werden.
Zur Gewinnung von polyklonalen Hasen-Antikörpern kann das Tier über die
Ohrvene oder alternativ über
eine Herzpunktur ausgeblutet werden. Man lässt das gewonnene Blut stocken
und zentrifugiert es dann, um Serumbestandteile von den ganzen Zellen
und Blutgerinnseln abzutrennen. Das Serum kann für zahlreiche Anwendungen eingesetzt
werden oder es kann die gewünschte
Antikörperfraktion
mit wohlbekannten Verfahren wie der Affinitätschromatographie unter Verwendung
eines anderen Antikörpers
oder eines Peptides, da an eine Feststoffmatrix gebunden ist, aufgereinigt
werden.
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Monoklonale
Antikörper
(MAbs) können
ebenso mittels wohlbekannter Techniken, wie sie beispielhaft in
U.S. Patent Nr. 4,196,265 erläutert
sind, hergestellt werden. Typischerweise beinhaltet dieses Verfahren
die Immunisierung eines geeigneten Tieres mit einer ausgewählten immunogenen
Zusammensetzung, z. B. einem gereinigten oder teilweise gereinigten
exprimierten Protein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung
wird in einer Art und Weise verabreicht, die wirksam die antikörperproduzierenden
Zellen stimuliert.
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Das
Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Antikörper (MAbs) bedient sich anfangs
grundsätzlich derselben
Verfahrensschritte wie das zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern. Nager
wie Mäuse
und Ratten sind die bevorzugten Tiere. Es können jedoch auch Hasen-, Schaf-
oder Froschzellen verwendet werden. Die Verwendung von Ratten weist
gewisse Vorteile auf (Goding, 1986, Seiten 60 – 61), dennoch sind Mäuse bevorzugt
und insbesondere BALB/c-Mäuse
sind bevorzugt, da sie am häufigsten
eingesetzt werden und normalerweise einen höheren Prozentsatz an stabilen
Fusionen liefern.
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Den
Tieren wird wie oben beschrieben ein Antigen injiziert. Das Antigen
kann, falls nötig,
an ein Trägermolekül wie das
Keyhole Limpet Hämocyanin
gekoppelt sein. Das Antigen würde
typischerweise mit einem Adjuvans, Freund's komplettes oder inkomplettes Adjuvans
gemischt werden. Wiederholungsinjektionen mit demselben Antigen
würden
in annähernden
Zweiwochenintervallen durchgeführt
werden.
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Im
Anschluss an die Immunisierung werden somatische Zellen mit dem
Potential zur Bildung von Antikörpern,
insbesondere B-Lymphozyten (B-Zellen), für die Verwendung in einem Protokoll
zu Herstellung von MAb ausgewählt.
Solche Zellen können
durch die Biopsie der Milz, der Mandeln oder von Lymphknoten oder aus
peripheren Blutproben gewonnen werden. Milzzellen und periphere
Blutzellen werden bevorzugt. Die zuerst genannten werden bevorzugt
aus dem Grund, dass sie eine reichhaltige Quelle für antikörperproduzierende
Zellen sind, die in einem sich teilenden Plasmablastenstadium sind.
Die zuletzt genannten werden bevorzugt, da periphere Blutzellen
leicht zugänglich
sind. Oft wird eine Batterie von Tieren immunisiert und die Milz des
Tieres mit dem höchsten
Antikörpertiter
wird entfernt und die Lymphozyten der Milz durch Homogenisierung
der Milz mit einer Spritze gewonnen. Typischerweise enthält die Milz
einer immunisierten Maus annäherungsweise
5 × 107 bis 2 × 108 Lymphozyten.
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Die
antikörperproduzierenden
B-Lymphozyten des immunisierten Tieres werden dann mit Zellen einer immortalisierten
Myelomzelllinie fusioniert, wobei normalerweise die Myelomzelllinie
aus derselben Art wie das immunisierte Tier stammt. Myelomzelllinien,
die zur Bildung in hybridom-bildenden Fusionsverfahren eingesetzt
werden, sind vorzugsweise keine antikörperproduzierenden Zellen,
zeigen eine hohe Fusionseffizienz und zeigen einen Enzymmangel,
der es ihnen unmöglich
macht, in bestimmten Selektionsmedien zu wachsen, außer das
Wachstum wird durch die erwünschte
Fusion von Zellen (Hybridome) ermöglicht.
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Es
ist möglich,
irgendeine der dem Fachmann bekannten Myelomzellen zu verwenden
(Goding, Seiten 65-66, 1986, Campbell, Seiten 75-83, 1984). Beispielsweise
können
für den
Fall, dass das immunisierte Tier eine Maus ist, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653,
NS1/1.Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und
S194/5XX0 Bul eingesetzt werden. Sofern Ratten verwendet werden,
können
R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 eingesetzt werden; und
die Zellen U-266, GMI500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 können alle
in Verbindung mit menschlichen Zellfusionen eingesetzt werden.
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Eine
bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1 Myelomzelllinie (ebenso
bekannt unter P3-NS-1-Ag4-1), die von NIGMX Human Genetic Mutant
Cell Repository auf Anfrage nach der Zelllinie mit der Zugriffsnummer
GM3573 bezogen werden kann. Eine andere Mausmyelomzelllinie, die
eingesetzt werden kann, ist die 8-Azaguanin resistente murine, nicht
produzierende Myelom Zelllinie SP2/0.
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Die
Verfahren zur Herstellung von Hybriden der antikörperproduzierenden Milz oder
Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen normalerweise das Mischen
der somatischen Zellen mit den Myelomzellen in einem 2:1-Verhältnis, wobei
das Verhältnis
zwischen etwa 20:1 bis etwa 1:1 variieren kann und das ganze in Anwesenheit
eines Agents oder von Agenzien (chemischen oder elektrischen), die
eine Membranfusion fördern,
durchgeführt
wird. Von Kohler und Milstein (1975, 1976) wurden auch Fusionsverfahren
beschrieben, die das Sendaivirus einsetzen, sowie solche, die Polyethylenglycol
(PEG), wie z. B. 37 % (v/v) PEG einsetzen, wurden von Gefter et
al. (1977) beschrieben. Auch der Einsatz von elektrisch induzierten
Fusionsverfahren ist geeignet (Goding, Seite 71-74, 196).
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Fusionsverfahren
liefern gewöhnlich
nur in einer sehr geringen Ausbeute lebensfähige Hybride, etwa 1 × 106 bis 1 × 108. Das jedoch bedeutet kein Problem, da die
lebensfähigen
fusionierten Hybride von den elterlichen, unfusionierten Zellen
( insbesondere von unfusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise
unbegrenzt teilen würden)
durch das Kultivieren in einem Selektionsmedium abgetrennt werden.
Das Selektionsmedium enthält
für gewöhnlich ein
Agens, das die de novo Synthese von Nukleotiden in dem Gewebekulturmedium
unterbindet. Beispielhafte und bevorzugte Agenzien sind Aminopterin,
Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren
die de novo Synthese sowohl von Purinen als auch Pyrimidinen, wobei
Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Sofern Aminopterin oder
Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und
Tymidin als Nukleotidquellen (HAT Medium) ergänzt. Sofern Azaserin verwendet wird,
wird das Medium mit Hypoxanthin ergänzt.
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Das
bevorzugte Selektionsmedium ist das HAT-Medium. Im HAT-Medium überleben
nur solche Zellen, die in der Lage sind, Nukleotide auf alternativen
Wegen zu generieren. Den Melanomzellen fehlt das Schlüsselenzym
eines Herstellungsweges, nämlich
z. B. Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT), und so können sie
nicht überleben.
Die B-Zellen können
diesen Weg beschreiten, sie haben jedoch eine begrenzte Lebensdauer
in Kultur und sterben gewöhnlich
innerhalb von 2 Wochen. Folglich sind die einzigen Zellen, die in
dem Selektionsmedium überleben,
solche, die Hybride aus Myeloma- und B-Zellen geformt haben.
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Eine
derartige Kultivierung der Zellen stellt eine Population von Hybridomen
bereit, aus denen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Üblicherweise
wird die Auswahl der Hybridome mittels einer Kultivierung der Zellen
nach Einzelzellverdünnung
in Mikrotiterplatten und einem anschließenden Test mit der individuellen
klonalen Überstände (nach
etwa zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität durchgeführt. Das
Assay sollte sensibel, einfach und schnell, wie Radioimmunoassays,
Ezymimmunoassays, Zytotoxizitätsassays,
Plaqueassays, Dot-Immunobinding-Assays und ähnliche sein.
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Die
ausgewählten
Hybridomas würden
dann seriell verdünnt
und zu individuellen, antikörperproduzierenden
Zelllinien hochgezogen werden, wobei die Klone dann unbegrenzt vermehrt
werden können,
um monoklonale Antikörper
MAbs bereitzustellen. Die Zelllinien können auch auf zwei grundsätzlichen
Weisen zur MAb-Herstellung eingesetzt werden. Eine Probe der Hybridome
kann z. B. in ein histokompatibles Tier derjenigen Art, die auch
zur Gewinnung der somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion verwendet wurde,
injiziert werden (oft in die Bauchhöhle). Das injizierte Tier entwickelt
Tumore, die spezifische monoklonale Antikörper sekretieren, welche von
den fusionierten Zellhybriden produziert werden. Die Körperflüssigkeiten
des Tieres, wie das Serum oder die Bauchwasserflüssigkeit, können dann angezapft werden,
um MAbs in hohen Konzentrationen bereitzustellen. Die einzelnen
Zelllinien können
auch in vitro kultiviert werden, wobei die MAbs auf natürliche Weise
in das Kulturmedium abgegeben werden, aus welchem sie dann in hohen
Konzentrationen gewonnen werden können. MAbs, die auf eine der
beiden Methoden erzeugt wurden, können, sofern es erwünscht ist,
unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen
chromatographischen Verfahren wie HPLC oder Affinitätschromatographie
weiter gereinigt werden.
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Große Mengen
des monoklonalen Antikörpers
können
auch durch die Vervielfältigung
von Hybridomazellen in vivo erhalten werden. Hierzu werden Zellklone
in ein Säugetier,
welches mit den elterlichen Zellen histokompatibel ist, z. B. syngenische
Mäuse,
injiziert, um das Wachstum eines antikörperproduzierenden Tumors anzuregen.
Wahlweise werden die Tiere mit einem Hydrokarbon, besonders Öle wie etwa
Pristan (Tetramethylpentadekan) vor der Injektion vorbereitet.
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Fragmente
der monoklonalen Antikörper
können
aus den wie oben beschrieben produzierten monoklonalen Antikörpern durch
Verfahren, welche einen enzymatischen Verdau mit Pepsin oder Papain
und/oder die Aufspaltung von Disulfidbrücken mittels chemischer Reduktion
einschließen,
erhalten werden. Alternativ können
die monoklonalen Antikörperstücke, die
in der vorliegenden Erfindung umfasst sind, unter Verwendung von
automatisierten Peptidsynthetisiern synthetisiert werden.
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Monoklonale
Konjugate werden mit im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt,
wobei die monoklonalen Antikörper,
die wie oben beschrieben erzeugt wurden, z. B. mit einem Enzym in
der Anwesenheit eines Kopplungsagens wie Glutaraldehyd oder Periodat
zur Reaktion gebracht werden. Konjugate mit fluoreszierenden Markern
werden in Anwesenheit dieser Kopplungsreagenzien durch die Reaktion
mit Isothiocyanat hergestellt. Konjugate mit Metallchelaten werden
auf ähnliche
Art und Weise hergestellt. Andere Bestandteile, an welche Antikörper konjugiert
werden können,
schließen
Radionuklide wie 3H, 125L, 131I32P, 35S, 14C, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, und 99mTc ein. Radioaktiv markierte monoklonale
Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung werden nach wohlbekannten Verfahren des Standes der Technik
hergestellt. So können
z. B. monoklonale Antikörper
durch den Kontakt mit Natrium oder Kaliumjodid und einem chemischen
Oxidationsmittel wie Natriumhypochlorit oder einem enzymatischen
Oxidationsmittel wie Lactoperoxidase, jodiert werden. Monoklonale
Antikörper
können
gemäß der Erfindung
mit Technetium-99 über ein Liganden Austauschverfahren,
z. B. durch die Reduktion von Pertechnat mit Zinnlösung, durch
das Chelatieren des reduzierten Technetium an einer Sephadexsäule und
das Aufbringen des Antikörpers
auf diese Säule
oder durch direkte Markierungsverfahren, z. B. durch Inkubieren
von Pertechnat, einem reduzierenden Agens wie SNCl2, einer Pufferlösung wie
Natrium-Kalium-Phthalat-Lösung
und dem Antikörper,
markiert werden.
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Es
wird vom Fachmann anerkannt, dass monoklonale und polyklonale Antikörper, die
spezifisch für
ein Protein sind, das vorzugsweise in metastasierenden oder nicht
metastasierenden menschlichen Prostatakrebs exprimiert wird, in
einer Vielzahl von Anwendungen nützlich
sein kann. Dies kann die Bereitstellung von diagnostischen Kits
zum Nachweis oder der Diagnose von menschlichem Prostatakrebs umfassen.
Eine alternative Verwendung wäre
die Verbindung solcher Antikörper
mit therapeutischen Agenzien wie z. B. chemotherapeutischen Agenzien,
und einer nachfolgenden Verabreichung an Patienten mit Prostatakrebs,
wobei die Prostatakrebszellen so spezifisch zur Zerstörung angesteuert
würden.
Dem Fachmann ist bewusst, dass derartige Verwendungen im Bereich
der vorliegenden Erfindung liegen.
-
D. Immun-Nachweis-Assays
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1. Immunodetektionsverfahren
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Immunodetektionsverfahren
schließen
Verfahren ein, die die Bindung, die Aufreinigung, das Entfernen,
das Quantifizieren oder allgemein den Nachweis von biologischen
Bestandteilen einbeziehen. Die im Rahmen der Erfindung kodierten
Proteine und Peptide können
eingesetzt werden, um Antikörper,
die mit diesen reagieren, nachzuweisen, oder in anders gearteten
Ansätzen
können
Antikörper
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, die dazu eingesetzt
werden können,
die kodierten Proteine oder Peptide nachzuweisen. Die einzelnen
Schritte der verschiedenen geeigneten Immunodetektionsverfahren wurden
in der wissenschaftlichen Literatur, wie z. B. bei Nakamura et al.
(1957), beschreiben.
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Im
allgemeinen beinhalten immunabhängige
Untersuchungen zum Bindungsverhalten (Immunobinding method) das
Beschaffen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie ein Protein,
Peptid oder einen Antikörper
enthält,
sowie das in Kontakt bringen der Probe mit einem Antikörper oder
Protein oder Peptid gemäß der vorliegenden
Erfindung unter Umgebungsbedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen
effektive ermöglichen.
-
Solche
immunabhängigen
Bindungsuntersuchungen schließen
Verfahren zum Nachweis oder der Quantifizierung der Menge der reaktiven
Bestandteile in der Probe ein, wobei die Verfahren den Nachweis
oder die Quantifizierung von jeglichen Immunkomplexen, die während der
Bindungsphase entstanden sind, erfordern. Für die Erfindung würde man
eine Probe entnehmen, von der vermutet wird, dass sie ein Protein,
ein Peptid oder einen entsprechenden Antikörper, der als Prostataerkrankungsmarker
dienen kann, enthält,
sowie dass man die Probe mit einem Antikörper oder kodiertem Protein
oder Peptid je nach Fall in Kontakt bringt und anschließend die
Menge der unter bestimmten Bedingungen gebildeten Immunkomplexe
nachweist oder quantifiziert.
-
In
Bezug auf den Antigennachweis kann die biologische Probe, die zu
analysieren ist, eine beliebige Probe sein, von der vermutet wird,
dass sie ein prostatakrebsspezifisches Antigen enthält. Eine
solche Probe kann ein Gewebeschnitt oder eine Einzelprobe der Prostata
oder des Lymphknoten, ein homogenisiertes Gewebeextrakt, eine isolierte
Zelle, eine Zellmembranzubereitung, eine abgetrennte oder gereinigte
Form einer der oben erwähnten,
proteinenthaltenden Zusammensetzungen oder jede andere biologische
Flüssigkeit,
die in Kontakt mit Prostatagewebe kommt, einschließlich Blut,
Lymphe oder auch Samenflüssigkeit,
sein.
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Das
in Kontakt bringen der ausgewählten
biologischen Proben mit dem Protein, Peptid oder Antikörper unter
Umgebungsbedingungen und für
einen Zeitraum, der effektiv und ausreichend zur Bildung von Immunkomplexen
ist (primäre
Immunkomplexe), ist im allgemeinen eine einfache Zugabe der Zusammensetzungen zu
der Probe und ein Inkubieren der Mischung für einen Zeitraum, der lang
genug ist, damit die Antikörper
Immunkomplexe mit einem anwesenden Antigen bilden, d. h. an es binden,
können.
Nach dieser Inkubationszeit werden die Proben-Antikörperzusammensetzungen
wie ein Gewebeschnitt, eine ELISA-Platte, ein Dot-Blot oder ein
Western-Blot normalerweise gewaschen, um unspezifisch gebundene
Antikörper
zu entfernen und somit nur den Nachweis von solchen Antikörpern, die
spezifisch in dem primären
Immunkomplex gebunden sind, zu erlauben.
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Der
Nachweis einer Immunkomplexbildung ist im Stand der Technik wohl
bekannt und kann über
die Anwendung von zahlreichen Verfahren erreicht werden. Diese Verfahren
basieren normalerweise auf dem Nachweis von Labeln oder Markern,
wie jeglichen radioaktiven, fluoreszierenden, biologischen oder
enzymatischen Anhänge
oder Labeln, die standardmäßig im Stand
der Technik eingesetzt werden. Die U.S. Patente, die solche Label
betreffen, schließen
die Nummern 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149
und 4,366,241 ein. Selbstverständlich
sind mit der Verwendung eines zweiten bindenden Ligandens, wie einem
zweiten Antikörper
oder einem Biotin-/Avidin-Liganden
zusätzliche
Vorteile verbunden. Dies ist im Stand der Technik bekannt.
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Das
kodierte (encoded) Protein, Peptid oder ein korrespondierender Antikörper, die
im Nachweis eingesetzt werden, können
selbst mit einem nachweisbaren Label markiert sein, wobei man dann
einfach das Label nachweisen würde
und darüber
die Menge der primären
Immunkomplexe in der Zusammensetzung bestimmen könnte.
-
Alternativ
hierzu kann der erste zugegebene Bestandteil, der in dem primären Immunkomplex
gebunden wird, durch den Einsatz eines zweiten Bindungsliganden,
der eine Bindungsaffinität
zu dem kodierten Protein, Peptid oder dem korrespondierenden Antikörper hat,
nachgewiesen werden. In diesen Fällen
kann der zweite Bindungsligand mit einem nachweisbaren Label markiert
sein. Der zweite Bindungsligand ist oft selbst ein Antikörper, weswegen
er „sekundärer" Antikörper genannt
wird. Die primären
Immunkomplexe werden mit dem markierten, sekundären Bindungsliganden oder Antikörper unter
Umgebungsbedingungen und für
eine Zeitspanne, die effektiv und ausreichend ist, um die Bildung
von sekundären
Immunkomplexen zu erlauben, in Kontakt gebracht. Die sekundären Immunkomplexe
werden dann gewöhnlich
gewaschen, um unspezifisch gebundene markierte sekundäre Antikörper oder
Liganden zu entfernen und dann die übrigen Markierungen der sekundären Immunkomplexe
nachzuweisen.
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Weitere
Verfahren schließen
den Nachweis der primären
Immunkomplexe in einem aus zwei Schritten bestehenden Ansatz ein.
Ein zweiter Bindungsligand wie ein Antikörper, der eine Bindungsaffinität zu dem
kodierten Protein, Peptid oder korrespondierenden Antikörper hat,
wird eingesetzt, um einen sekundären
Immunkomplex wie oben beschrieben zu bilden. Nach dem Waschen wird
der sekundäre
Immunkomplex mit einem dritten bindenden Ligand oder Antikörper, der
Bindungsaffinität
zu dem zweiten Antikörper
zeigt, unter Umgebungsbedingungen und für eine Zeitspanne, die effektiv
und ausreichend ist, um die Bildung eines Immunkomplexes (tertiäre Immunkomplexe)
zu erlauben, in Kontakt gebracht. Der dritte Ligand oder Antikörper ist
mit einem nachweisbaren Label markiert, wodurch der Nachweis der
tertiären
Immunkomplexe, die damit gebildet wurden, ermöglicht wird. Ein solches System
ermöglicht
eine Signalverstärkung,
sofern dies erwünscht
ist.
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Immundetektionsverfahren
sind offensichtlich zur Diagnose von Zuständen wie Prostatakrebs oder
benigner Prostatahyperplasie geeignet. Hierbei wird eine biologische
oder klinische Probe, von der vermutet wurde, dass sie entweder
das kodierte Protein oder Peptid oder einen korrespondierenden Antikörper enthält, verwendet.
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In
der klinischen Diagnose oder bei der Überwachung von Patienten mit
Prostatakrebs bedeutet der Nachweis eines Antigens, welches von
einer Nukleinsäure
für einen
Prostatakrebsmarker kodiert wird, oder der Anstieg der Menge eines
solchen Antigens im Vergleich zu der Menge in entsprechenden biologischen Proben
eines gesunden Patienten, dass der Patient Prostatakrebs hat. Diese
diagnostischen Verfahren beruhen zum Teil darauf, dass durch die
vorliegende Erfindung gezeigt wurde, dass die Nukleinsäuren für die Prostatakrebsmarker
in Proben mit Prostatakrebsgewebe überexprimiert sind (siehe die
Beispiele weiter unten). Als ein Zwischenergebnis kann hieraus abgeleitet
werden, dass wenigstens einige dieser Marker erhöhte Mengen des kodierten Proteins
produzieren, welches dann ebenfalls als Prostatakrebsmarker verwendet
werden kann.
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Der
Fachmann ist vertraut mit der Unterscheidung zwischen einer signifikanten
Expression eines Biomarkers, die einen positiven Nachweis darstellt,
und niedrigen oder Hintergrundexpression eines Biomarkers. In der
Tat werden die Expressionslevel des Hintergrunds oft dazu eingesetzt,
einen Grenze zu bilden, die dazu verwendet wird, um darüber gelagerte
Messwerte als signifikant oder positiv zu bewerten. Eine signifikante
Expression kann durch große
Menge Antigen im Gewebe oder in der Körperflüssigkeit dargestellt werden
oder in einem alternativen Ansatz auch über einen hohen Anteil an Zellen,
die ein positives Signal innerhalb eines Gewebes geben.
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2. Immunhistochemie
-
Die
Antikörper
der vorliegenden Erfindung können
in Verbindung mit sowohl frisch eingefrorenen und Formalin fixierten
Paraffinschnitten zur Immunhistochemie (IHC) eingesetzt werden.
Jedes im Stand der Technik beschriebene IHC-Verfahren kann eingesetzt
werden, wie z. B. solche, die in „Diagnostic Immunopathology", 2. Auflage, editiert
von Robert B. Colvin, Atul K. Bhan und Robert T. McCluskey, Raven
Press, New York, 1995, und insbesondere Kapitel 31 dieser Referenz,
welches mit Gynecological and Genitourinary Tumors überschrieben
ist (Seiten 579-597), von Debra A. Bell, Robert H Young und Robert
E. Scully, beschrieben sind.
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3. ELISA
-
Wie
bereits dargstellt, können
die gemäß der Erfindung
kodierten Proteine und Peptide als immunogene Substanzen z. B. in
Verbindung mit einer Impfstoffentwicklung, bei der Immunhistochemie
und in ELISA-Assays eingesetzt werden. Eine offensichtliche Einsatzmöglichkeit
der kodierten Antigene und korrespondierenden Antikörpern ist
ein Immunoassay zum Nachweis des Markerproteins für Prostataerkrankungen,
welches in der Diagnose und bei der Verlaufsüberwachung benötigt wird.
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Immunoassays
sind in ihrer einfachsten und direktesten Form Bindungsassays. Ausgewählte und
bevorzugte Immunoassays sind die verschiedenen Arten des Enzymimmunoassays
(ELISA, enzyme linked immunosorband assay) und der Radioimmunoassays
(RIA), die im Stand der Technik bekannt sind. Besonders geeignet
ist der immunhistochemische Nachweis in Gewebeschnitten. Es muss
jedoch verstanden werden, dass der Nachweis nicht auf solche Techniken
beschränkt
ist und ebenso Western Blot, Dot Blot, FACS-Analyse und ähnliches
eingesetzt werden können.
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In
einem ELISA werden z. B. Antikörper,
die das erfindungsgemäß kodierte
Protein binden, auf ausgewählte
Oberflächen,
die eine Proteinaffinität
aufweisen, wie z. B. die Vertiefungen einer Polystrenmikrotiterplatte,
immobilisiert. Anschließend
wird eine zu testende Zusammensetzung, beispielsweise eine klinische Probe,
von der vermutet wird, dass sie Antigene des Prostataerkrankungsmarkers
enthält,
in die Vertiefung der Mikrotiterplatte zugegeben. Nach einem Bindungsschritt
und einem Waschschritt, um unspezifisch gebundene Immunkomplexe
zu entfernen, kann das gebundene Antigen nachgewiesen werden. Der
Nachweis wird normalerweise durch Zugabe eines zweiten Antikörpers, der
für das
Zielprotein spezifisch ist, und der mit einem nachweisbaren Label
markiert ist, geführt.
Diese Form des ELISAs wird „Sandwich-ELISA" genannt. Der Nachweis
kann auch über
die Zugabe eines zweiten Antikörpers
gefolgt von der Zugabe eines dritten Antikörpers, der eine Bindungsaffinität für den zweiten
Antikörper
hat und der mit einem detektierbaren Label markiert ist, geführt werden.
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In
einem weiteren exemplarischen ELISA wird die Probe, von der angenommen
wird, dass sie ein Markerantigen der Prostataerkrankung enthält, auf
der Oberfläche
einer Mikrotitervertiefung immobilisiert und anschließend mit
den Antikörpern
der Erfindung in Kontakt gebracht. Nach einem Bindungs- und einem
Waschschritt zur Entfernung von unspezifisch gebundenen Immunkomplexen
wird das gebundene Antigen nachgewiesen. Da die anfangs eingesetzten
Antikörper
mit einem detektierbaren Label markiert sind, können die Immunkomplexe direkt
nachgewiesen werden. Die Immunkomplexe können auch durch die Verwendung
eines zweiten Antikörpers,
der Bindungsaffinität
zu dem ersten Antikörper
hat und der mit einem detektierbaren Label markiert ist, nachgewiesen
werden.
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Im
anderen ELISA-Typ, in welchem die Proteine und Peptide immobilisiert
werden, erfolgt der Nachweis durch Antikörper-Competition. In einem
solchen ELISA werden markierte Antikörper in die Vertiefungen der
Mikrotiterplatten zugegeben, um eine Bindung mit dem Proteinmarker
der Prostataerkrankung zu erlauben und über das Label anschließend nachzuweisen.
Die Menge des Markerantigens in einer unbekannten Probe wird dann
durch das Mischen der Probe mit markierten Antikörpern vor und während der
Inkubation in der beschichteten Vertiefung bestimmt. Die Anwesenheit
von Markerantigen in einer Probe führt zu einer Abnahme der verfügbaren Antikörpermenge,
die an die Oberfläche
des beschichteten Reaktionsgefäßes binden
kann und verringert damit das schlussendliche Signal. Dieses Verfahren
ist geeignet, um Antikörper
in einer unbekannten Probe nachzuweisen, wobei die unmarkierten
Antikörper
an die antigen-beschichtete Oberfläche des Bodengefäßes binden
und so die Menge des verfügbaren
Antigenes, welches die markierten Antikörper bindet, reduziert wird.
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Unabhängig von
dem gewählten
Typ haben ELISAs bestimmte Merkmale gemeinsam, wie die Beschichtung,
die Inkubation oder Bindung, das Waschen, um unspezifisch gebundene
Bestandteile zu entfernen und den Nachweis der gebundenen Immunkomplexe
zu führen.
Diese sind im Nachfolgenden beschrieben:
Bei der Beschichtung
einer Platte mit entweder Antigen oder Antikörper inkubiert man die Vertiefungen
der Platte üblicherweise über Nacht
oder für
eine bestimmte Dauer mit einer Lösung,
die Antigen oder Antikörper enthält. Die
Vertiefungen der Platte werden dann gewaschen, um unvollständig absorbiertes
Material zu entfernen. Die noch verfügbaren Oberflächen der
Reaktionsgefäße werden
dann mit unspezifischem Protein, welches unter Berücksichtigung
der zu testenden Antisera immunologisch neutral ist, beschichtet.
Solche unspezifischen Proteine schließen bovines Serumalbumin (BSA),
Kasein und Milchpulverlösungen
ein. Die Beschichtung blockiert unspezifische Adsorbtionsstellen
der Oberfläche
und reduziert damit den Hintergrund, der durch unspezifische Bindung
des Antiserums an die Oberfläche
verursacht würde.
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Es
ist wahrscheinlich bei ELISAs üblicher,
ein zweites oder drittes Nachweismittel einzusetzen, als ein direktes
Nachweisverfahren durchzuführen,
so dass nach der Bindung des Proteins oder Antikörpers an die Gefäßoberfläche, nach
dem Beschichten dieser mit nichtreaktivem Material, um den Hintergrund
zu reduzieren und nach dem Waschen, um ungebundenes Material zu
entfernen, diese immobilisierte Oberfläche mit einer Kontrollprobe
für menschlichen
Prostatakrebs und/oder einer klinischen oder biologischen Probe,
die zu testen sind, unter Bedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen (Antigen/Antikörper) ermöglichen,
in Kontakt gebracht wird. Der Nachweis der Immunkomplexe erfordert
dann einen markierten sekundären
Bindungsliganden oder Antikörper
oder einen sekundären
Bindungsliganden oder Antikörper
in Verbindung mit einem markierten tertiären Antikörper oder dritten Bindungsliganden.
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Mit
der Formulierung „unter
Bedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen (Antigen/Antikörper) effektive
erlauben", versteht
man Bedingungen, die vorzugsweise eine Verdünnung der Antigene und Antikörper mit
einer Lösung
wie BSA, bovinem Gamma-Globulin (BGG) und phosphatgepufferter Saline
(PBS)/Tween einschließen.
Die zugesetzten Agenzien helfen auch, den unspezifischen Hintergrund
zu verringern.
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Die „geeigneten" Bedingungen bedeuten
außerdem,
dass die Inkubation bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreichend
ist, um eine wirksame Bindung zu ermöglichen, durchgeführt wird.
Inkubationsschritte finden typischerweise für einen Zeitraum von etwa ein
bis zwei bis vier Stunden und vorzugsweise bei Temperaturen in der
Größenordnung
von 25°-27° C oder auch über Nacht
bei etwa 4° C
statt.
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Im
Anschluss an den Inkubationsschritt in einem ELISA werden die reaktionsfähigen Oberflächen gewaschen,
um unkomplexiertes Material zu entfernen. Ein bevorzugtes Waschverfahren
schließt
das Waschen mit Lösungen
wie PBS/Tween oder Boratpuffer ein. Im Anschluss an die Bildung
von spezifischen Immunkomplexen zwischen der zu testenden Probe
und dem ursprünglich
gebundenen Material sowie den nachfolgenden Waschschritten können auch
da Auftreten von minimalen Mengen der Immunkomplexe nachgewiesen werden.
Zur Bereitstellung eines Nachweismittels werden sekundäre oder
tertiäre
Antikörper
mit einem assoziierten Label, welches den Nachweis ermöglicht,
bereitgestellt. Vorzugsweise wird dieses Label ein Enzym sein, das
eine Farbveränderung
während
der Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat bewirkt. Daher
ist es z. B. wünschenswert,
den ersten oder zweiten Immunkomplex mit einer Urease, Glucoseoxidase, alkalischer
Phosphatase oder einem Wasserstoffperoxidase-konjugierten Antikörper für einen
Zeitraum und unter Bedingungen, die die Bildung weiterer Immunkomplexe
begünstigen,
zu inkubieren (z. B. Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur
in einer PBS-enthaltenden Lösung
wie PBS-Tween).
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Nach
der Inkubation mit dem markierten Antikörper und im Anschluss an den
Waschschritt, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die Menge
des Labels quantifiziert. Hierzu wird z. B. mit einem chromogenen
Substrat wie Harnstoff und Bromkresolpurpur oder 2,2'-Azido-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure) [ABTS]
und H2O2 für den Fall,
dass es sich bei dem Enzymlabel um eine Peroxidase handelt, inkubiert.
Die Quantifizierung wird dann über
die Messung der Farbentwicklung z. B. unter Verwendung einer Spektrophotometers
im sichtbaren Bereich ermöglicht.
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4. Verwendung
von Antikörpern
für ein
Radioimage
-
Die
Antikörper
werden dazu eingesetzt, die Expression des kodierten Markerproteins
zu quantifizieren und zu lokalisieren. Der Antikörper wird dazu z. B. in einer
Reihe von Verfahren markiert und eingesetzt, um die Dichte der Zellen,
die das kodierte Protein produzieren, sichtbar zu machen.
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Eine
weitere Anwendung ist ein bildgebendes in vivo Verfahren eines pathologischen
Prostatazustandes, unter Verwendung der oben beschriebenen monoklonalen
Antikörper.
Dieses Verfahren beinhaltet insbesondere die Verabreichung an einen
Patienten von einer für
die Bildgebung ausreichenden Menge eines nachweisbar markierten
Prostatakrebsspezifischen monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes
davon und eines pharmakologisch wirksamen Trägers. Das Verfahren enthält weiter
den Nachweis der Bindung des markierten monoklonalen Antikörpers an
das erkrankte Gewebe. Der Begriff „bildgebendes in vivo Verfahren" bezieht sich auf
jedes Verfahren, welches den Nachweis von markieren monoklonalen
Antikörpern
der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon, die spezifisch
an ein erkranktes Gewebe, welches im Körper des Patienten lokalisiert
ist, binden, erlaubt. Ein „Patient" ist ein Säuger, vorzugsweise
ein Mensch. Eine „für die Bildgebung
ausreichende Menge" bedeutet,
die Menge des nachweisbar markierten monoklonalen Antikörpers oder
eines Fragments desselben, die verabreicht wurde und ausreichend
ist, um den Nachweis der Bindung des monoklonalen Antikörpers oder
eines Fragmentes desselben an das erkrankte Gewebe zu ermöglichen.
-
Ein
zu berücksichtigender
Gesichtspunkt bei der Auswahl eines Radionuklides für eine in
vivo Diagnose ist es, dass die Halbwertzeit des Nuklides lang genug
ist, so dass es auch nach dem Zeitraum für die maximale Aufnahme durch
das Zielobjekt noch nachgewiesen werden kann, und kurz genug ist,
so dass die schädliche
Strahlenbelastung für
den Wirt wie auch die Hintergrundbelastung minimiert wird. Idealerweise
fehlt einem Radionuklid, das für
in vivo Bildgebung eingesetzt wird, eine partikuläre Emission,
wobei es jedoch eine große
Zahl an Photonen in einem 140-2000 keV Bereich produziert, die mit
herkömmlichen
Gamma-Kameras nachgewiesen werden können.
-
Ein
Radionuklid kann entweder direkt oder indirekt unter Verwendung
einer intermediären
funktionellen Gruppe an einen Antikörper gebunden werden. Intermediäre funktionelle
Gruppen, die oft zur Bindung von Radioisotopen, die als Metallionen
vorliegen, an Antikörper
eingesetzt werden, sind Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)
und Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA). Beispiele für
Metallionen, die für
die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, sind 99mTc, 123I, 131I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga, 125I, 68Ga, 72As, 89Zr und 201Tl.
-
Der
monoklonale Antikörper
oder ein Fragment desselben kann durch mehrere im Stand der Technik bekannte
Verfahren markiert werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung
kann ebenso paramagnetische Isotope für den Einsatz eines in vivo
Nachweises verwenden. Elemente, die besonders geeignet für eine durch
Kernspintomographiebildgebende Untersuchungen (Magnetic Resonance
Imaging, MRI) sind, schließen 127Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr und 56Fe ein.
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Die
Verabreichung von markierten Antikörpern kann lokal oder systemisch
sowie intravenös,
intraarteriell, über
die Rückenmarksflüssigkeit
oder ähnliches
erfolgen. Die Verabreichung kann auch intradermal oder intrakavitar
erfolgen in Abhängigkeit
von der zu untersuchenden Körperstelle.
Nachdem genügend
Zeit vergangen ist, so dass der monoklonale Antikörper oder
ein Fragment desselben an das erkrankte Gewebe binden konnte, beispielsweise
30 Minuten bis 48 Stunden, wird die Region des zu untersuchenden
Patienten unter Verwendung von üblichen
bildgebenden Verfahren, wie MRI, SPECT, planarer Szintigraphie oder
sich entwickelnder Abbildungstechniken untersucht werden. Der exakte
Ablauf variiert notwendigerweise in Abhängigkeit von spezifischen Faktoren
des Patienten, wie oben schon bemerkt, und hängt auch von der zu untersuchenden
Körperstelle,
den Verfahren der Verabreichung und dem Typ des Markers ab. Das
Festlegen eines bestimmten Ablaufes stellt eine Routinetätigkeit
für den
Fachmann dar. Die Verteilung der gebundenen radioaktiven Isotope
und ihre Zu- oder Abnahme im Verlauf der Zeit wird dann überwacht
und aufgezeichnet. Im Vergleich mit Ergebnissen, die aus Untersuchungen
mit klinisch gesunden Individuen stammen, kann das Vorliegen und
das Ausmaß von
erkranktem Gewebe bestimmt werden.
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Es
ist offensichtlich für
den Fachmann, dass ähnliche
Ansätze
eingesetzt werden können,
um die Bildung des kodierten Markerproteins für eine Prostataerkrankung im
menschlichen Patienten mittels Radioimage nachzuweisen. Die vorliegende
Erfindung stellt Verfahren für
eine in vivo Diagnostik von Prostatakrebs im Patienten bereit. Diese
Verfahren beinhalten gewöhnlich
das Verabreichen einer effektiven Menge eines prostatakrebsspezifischen
Antikörpers
an den Patienten, wobei der Antikörper an einen Marker gekoppelt
ist, wie z. B. einem radioaktiven Isotop oder kernspinaktivem Molekül, welches
durch nicht inversive Verfahren nachweisbar ist. Dem Antikörper/Markerkonjugat
wird ausreichend Zeit gegeben, um in Kontakt mit reaktiven Antigenen
zu kommen, welche im Gewebe des Patienten vorliegen und anschließend wird
der Patient einer Nachweisvorrichtung zur Identifizierung des nachweisbaren
Markers ausgesetzt.
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5. Kits
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Immunodetektionskits für die Verwendung
in den oben beschriebenen Immunodetektionsverfahren. Nachdem die
kodierten Proteine oder Peptide dazu eingesetzt werden können, Antikörper nachzuweisen,
und die korrespondierenden Antikörper
dazu eingesetzt werden können,
die kodierten (encoded) Proteine oder Peptide nachzuweisen, können einer
oder beide dieser Komponenten in einem Kit vorliegen. Der Immunodetektionskit
wird daher, in geeigneten Behältnissen,
ein kodiertes Protein oder Peptid oder einen ersten Antikörper, der
an das kodierte Protein oder Peptid bindet, und ein Immunodetektionsreagenz
beinhaltet.
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In
bestimmten Ausführungsformen
kann das kodierte Protein oder Peptid oder der erste Antikörper, der
an das kodierte Protein oder Peptid bindet, an einen festen Träger gebunden
sein, wie eine Säulenmatrix oder
die Reaktionsfläche
einer Mikrotiterplatte.
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Die
Immunodetektionsreagenzien des Kits können in jeder beliebigen Form
vorliegen, einschließlich solcher
nachweisbarer Marker, die mit dem gegebenen Antikörper oder Antigen
assoziiert oder verbunden sind, sowie solcher nachweisbarer Marker,
die mit einem sekundären
Bindungsliganden assoziiert sind oder an jenen angelagert sind.
Beispielhafte sekundäre
Liganden sind z.B. solche sekundären
Antikörper,
die eine Bindungsaffinität
für den
ersten Antikörper
oder das Antigen haben und solche sekundären Antikörper, die eine Bindungsaffinität für menschliche
Antikörper
haben.
-
Weitere
geeignete Immunodetektionsreagenzien zur Verwendung in dem vorliegenden
Kit schließen zwei
Komponentenreagenzien ein, die einen zweiten Antikörper, der
eine Bindungsaffinität
für einen
ersten Antikörper
oder das Antigen hat, zusammen mit einem dritten Antikörper, der
eine Bindungsaffinität
für den
zweiten Antikörper
hat, wobei der dritte Antikörper
mit einem nachweisbaren Marker verknüpft ist.
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Kits
können
außerdem
geeignete Proben des kodierten Proteines oder Polypeptidantigenes
entweder markiert oder unmarkiert enthalten, welches zur Erzeugung
einer Standardkurve für
das Nachweisassay verwendet werden kann.
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Die
Kits können
Antikörper/Markerkonjugate
enthalten, die entweder in vollständig konjugierte Form vorliegen,
in Form von Zwischenprodukten vorliegen oder als separate Einheiten,
die durch den Verwender des Kits konjugiert werden müssen, vorliegen.
Die Komponenten des Kits können
entweder in wässrigen
Medien oder lyophilizierter Form verpackt werden.
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Ein
Behältnis
bedeutet, dass die Kits grundsätzlich
wenigstens ein Röhrchen,
eine Teströhre,
Flasche, Spritze oder ein sonstiges Behältnis beinhalten, in welches
der Antikörper
oder das Antigen gelagert werden können und vorzugsweise in geeigneter
Menge bereitgestellt werden. Im Fall, dass ein zweiter oder dritter
Bindungsligand oder eine weitere Komponente bereitgestellt werden,
wird der Kit normalerweise einen zweiten, dritten oder entsprechend
zusätzlichen
Behälter,
in welchem dieser Ligand oder diese Komponente aufbewahrt wird,
beinhalten. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden typischerweise
Vorrichtungen zur Aufnahme des Antikörpers, des Antigens und jeder
weiteren Reagenz in einer abgeschlossenen Form zum Verkauf beinhalten.
Solche Behältnisse
können
gespritzte oder spritzgeformte Plastikbehälter, in welchen die gewünschten
Röhrchen
gehalten werden, einschließen.
-
E. Nachweis und Quantifikation
der RNA-Arten
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Identifikation von
Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe durch die Amplifikation
und den Nachweis von Nukleinsäuren,
die Prostatakrebszellmarkern entsprechen. Die biologische Probe
kann jedes Gewebe oder jede Flüssigkeit
sein, in welcher Prostatakrebszellen anwesend sein können, eingeschlossen
Knochenmarksproben, Knochenmarksbiopsien, Lymphknotenaspirate, Lymphknotenbiopsien,
Milzgeweben, Feinnadel Punktierungen, Hautbiopsien oder Gewebebiopsien
von Organen. Weitere Proben können
Körperflüssigkeiten
sein, wobei die Körperflüssigkeit
peripheres Blut, Lymphflüssigkeit,
Ascite, serumhaltige Flüssigkeit,
Pleuralergüsse,
Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränenflüssigkeit,
Stuhl oder Urin sein kann.
-
Die
Nukleinsäure,
die als Vorlage oder Template (eng. template) zur Amplifikation
eingesetzt wird, wurde aus Zellen isoliert, die in den biologischen
Proben enthalten sind. Diese wurden gemäß Standardmethoden isoliert
(Sambrook et al., 1989). Die Nukleinsäure kann als genomische DNA
oder als fraktionierte oder Gesamtzelluläre-RNA vorliegen. Sofern RNA
eingesetzt wird, ist es wünschenswert,
die RNA in eine komplementäre
cDNA umzuschreiben. Gemäß einer
Ausführungsform
handelt es sich bei der RNA um Gesamtzelluläre-RNA und diese wird direkt
als Template für
die Amplifikation eingesetzt.
-
Primerpaare,
die selektiv an die Nukleinsäure,
die den prostatakrebsspezifischen Markern entsprechen, binden, werden
mit der isolierten Nukleinsäure
unter Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung erlauben,
in Kontakt gebracht. Sobald sie hybridisiert sind, wird der Nukleinsäure/Primerkomplex
mit einem oder mehreren Enzymen, die eine templateabhängige Nukleinsäuresynthese
ermöglichen,
in Kontakt gebracht. Mehrere Runden der Amplifikation, die auch
als „Zyklen" bezeichnet werden,
werden durchgeführt,
bis eine ausreichende Menge des Amplifikationsproduktes erzeugt
wurde.
-
Im
nächsten
Schritt wird das Amplifikationsprodukt nachgewiesen. In bestimmten
Anwendungen kann der Nachweis mittels visueller Mittel erfolgen.
Alternativ kann der Nachweis eine indirekte Identifikation des Produktes über eine
Chemilumineszenz, eine radioaktive Szintigraphie von inkorperierten
radioaktiven Markern oder fluoreszierenden Markern einschließen oder
er kann über
ein System, welches elektrische oder thermische Impulssignale verarbeitet
(Affymax Technology; Bellus, 1994) erfolgen.
-
Im
Anschluss an den Nachweis kann man die Ergebnisse, die in einem
vorgegebenen Patienten erfasst wurden, mit einer statistisch signifikanten
Referenzgruppe von normalen Patienten und Prostatakrebspatienten
vergleichen. Auf diese Weise ist es möglich, die Menge des nachgewiesenen
Markers mit den verschiedenen klinischen Zuständen zu korrelieren.
-
1. Primer
-
Der
Begriff Primer, wie er hierin verwendet wird, schließt jede
Nukleinsäure,
die in der Lage ist, die Neusynthese von Nukleinsäure in einem
templateabhängigen
Verfahren zu starten order zu primen (eng. priming), ein. Typischerweise
sind Primeroligonukleotide in einer Länge von 10 bis 20 Basenpaaren.
Es können jedoch
auch längere
Sequenzen verwendet werden. Primer können als Doppelstrang oder
Einzelstrang vorliegen, obwohl die Einzelstrangform bevorzugt ist.
-
2. Templateabhängige Amplifikationsverfahren
-
Eine
Reihe von templateabhängigen
Amplifikationsverfahren, um eine Markersequenz innerhalb eines Templates
zu amplifizieren, sind verfügbar.
Das am besten bekannte Amplifikationsverfahren ist die Polymerasekettenreaktion
(im nachfolgenden PCR), welche ausführlich in den U.S. Patent-Nummern
4,683,195; 4,683,202 und 4,800,159 sowie in Innis et al., 1990,
beschrieben sind.
-
In
Kürze,
bei einer PCR werden zwei Primersequenzen hergestellt, die komplementär zu einem
Bereich auf den gegensätzlich
komplementären
Strängen
der Markersequenz sind. Es wird ein Überschuss an Desoxynukleosidtriphosphaten
zu der Reaktionsmischung zusammen mit einer DNA-Polymerase, z. B.
Taq Polymerase zugegeben. Wenn die Markersequenz in der Probe vorliegt,
werden die Primer an den Marker binden und die Polymerase wird die
Primersequenz entlang der Markersequenz durch das Zufügen von
Nukleotiden verlängern.
Durch das Anheben oder Absenken der Temperatur der Reaktionsmischung
werden die verlängerten
Primer von der Markersequenz dissoziiert, um Reaktionsprodukte zu
bilden. Weiter überschüssige Primer
werden an die Marker und die Reaktionsprodukte binden und der Ablauf
wiederholt sich.
-
Eine
reverse Transkriptase-PCR-Amplifikation kann durchgeführt werden,
um die Menge von amplifizierter mRNA zu quantifizieren. Verfahren,
um RNA in cDNA revers zu transkribieren, sind weithin bekannt und in
Sambrook et al., 1989, beschrieben. Alternative Verfahren zur reversen
Transkription verwenden thermostabile DNA-Polymerasen. Solche Verfahren
sind in WO 90/07641, eingereicht am 21. Dezember 1990, beschrieben.
Polymerase Kettenreaktionsverfahren sind im Stand der Technik weit
verbreitet. Ein besonders bevorzugtes Verfahren der RT-PCR wird
nachfolgend in Beispiel 1 beschrieben.
-
Ein
weiteres Ampflifikationsverfahren ist das Ligase-Kettenreaktionsverfahren
(„LCR"), welches in der europäischen Anmeldung
Nr. 320 308 offenbart ist. Bei LCR werden zwei komplementäre Probenpaare
vorbereitet. In Anwesenheit der Zielsequenz binden die einzelnen
Paare gegensätzlich
komplementäre
Stränge
der Zielsequenz, so dass sie aneinander angrenzen. In Gegenwart
einer Ligase werden die zwei Probenpaare zu einer Einheit verbunden.
Durch Temperaturzyklen wie bei der PCR werden die ligierten Einheiten
von der Zielsequenz dissoziiert und dienen als neue Zielsequenzen
zur Ligierung von überschüssigen Probenpaaren.
Das U.S. Patent 4,883,750 beschreibt ein Verfahren ähnlich dem
der LCR zur Bindung von Probenpaaren an Zielsequenzen.
-
Eine
Qbeta-Replikase, wie sie in der PCT Anmeldung Nr. PCT/US87/00880
beschrieben ist, kann ebenso als eine noch weitere Amplifikationsmethode
eingesetzt werden. In diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz,
die eine komplementäre
Region zu der Zielsequenz hat, in Anwesenheit einer RNA-Polymerase
zu der Probe gegeben. Die Polymerase wird die replikative Sequenz
kopieren, so dass diese dann nachgewiesen werden kann.
-
Ein
isothermisches Amplifikationsverfahren, in welchem Restriktionsendonukleasen
und Ligasen eingesetzt werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen, die
in einem Strang der Restriktionsschnittstelle 5'-[alpha-thio]-Triphosphatnukleotide
enthalten, zu erreichen, kann ebenso für die Vervielfältigung
(Amplifikation) der Nukleinsäuren
der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden (Walker et al., Proc.
Nat'l Acad. Sci.
USA 89; 392-396 (1992)).
-
Ein
weiteres Verfahren, eine isothermische Amplifikation der Nukleinsäuren durchzuführen, ist
die Strang Displacement Amplification (SDA), welche mehrere Runden
eines Strangdisplacement und einer Synthese, d.h. Nicktranslation,
involviert. Ein ähnliches
Verfahren, genannt Repair Chain Reaction (RCR, „Reparaturkettenreaktion"), umfasst die Anlagerung
mehrerer Proben innerhalb der Region, die zur Amplifikation ausgesucht
wurde, mit einer nachfolgenden Reparaturreaktion, in welcher lediglich
zwei der vier Basen vorliegen. Die anderen beiden Basen können als
biotinylierte Derivate zum leichten Nachweis zugegeben werden. Ein ähnlicher
Ansatz ist auch in der SDA gewählt.
Ausgewählte
spezifische Sequenzen können
auch durch die Verwendung einer zyklischen Probenreaktion (CPR)
nachgewiesen werden. Bei der CPR wird eine Probe, die am 3'- und 5'-Ende Sequenzen von
unspezifischer DNA hat und im Mittelbereich die Sequenz einer spezifischen
DNA umfasst, an eine DNA hybridisiert, die in der Probe vorliegt.
Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt,
und die Produkte, die nach dem Verdau freigesetzt werden, als unterschiedliche Produkte
identifiziert. Die Originalvorlage wird an eine weitere, im Kreislauf
vorliegende Probe angelagert und die Reaktion wird wiederholt.
-
Noch
ein weiteres Amplifikationsverfahren ist in der GB Anmeldung Nr.
2 202 328 und der PCT Anmeldung Nr. PCT/US89/01025 beschrieben.
In der zuerst genannten Anmeldung werden „modifizierte" Primer in einer
PCR-ähnlichen,
von Template und Enzymen abhängigen
Synthese eingesetzt. Die Primer werden durch die Markierung mit
einer eingelagerten Einheit (z. B. Biotin) und/oder einer Nachweiseinheit
(z. B. ein Enzym) markiert. In der an zweiter Stelle genannten Anmeldung
wird ein Überschuss
an markierten Proben zu der Untersuchungsprobe zugegeben. Bei Anwesenheit
der Zielsequenz bindet die Probe und wird katalytisch gespalten.
Nach diesem Spalten wird die Zielsequenz wieder freigesetzt, um
erneut an eine im Überschuss
vorliegende Probe zu binden. Die Spaltung der markierten Probe weist
auf die Anwesenheit der Zielsequenz hin.
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Ein
weiteres Nukleinsäureamplifikationsverfahren
ist das transkriptionsbasierte Amplifikationssystem (TAS), einschließlich dem
nukleinsäurebasiertem
Amplifikationssystem (NASBA) und 3 SR (Kwoh et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
86, 1173 (1989); Gingeras et al., PT Application WO 88/10315). Bei
der NASBA kann die Nukleinsäure
durch eine standardmäßige Pheno/Chloroformextraktion
zur Amplifikation bereitgestellt werden. Sie kann auch durch eine
Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, die Behandlung mit Lysispuffern
und Minispinsäulen
zur Isolation von DNA und RNA oder einer Guanidiniumchloridextraktion
von RNA bereitgestellt werden. Bei dieser Amplifikationstechnik
bindet ein Primer, der zielsequenzspezifische Sequenzen hat. Während der
anschließenden
Polymerisation werden Hybride aus DNA/RNA mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut
durch Hitze denaturiert werden. In jeder Runde wird durch Hinzufügung eines
zweiten zielsequenzspezifischen Primers und nachfolgender Polymerisation
aus der einzelsträngigen DNA
eine doppelsträngige.
Die Doppelstrang-DNA-Moleküle
werden dann vielfach durch eine Polymerase, wie die T7- oder SP6-Polymerase
transkribiert. In einem isothermischen zyklischen Reaktionsverlauf
werden die RNAs in doppelsträngige
DNA revers transkribiert und dann erneut von einer Polymerase wie
T7 oder SP6 transkribiert. Die entstehenden Produkte sind, egal
ob verkürzt
oder vollständig,
spezifische Zielsequenzen.
-
Davey
et al., Europäische
Anmeldung Nr. 329 822, offenbar einen Amplifikationsvorgang, der
eine zyklische Synthese von Einzelstrang-RNA („ssRNA"), ssDNA und Doppelstrang-DNA („dsDNA") beinhaltet, die dann
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann. Die ssRNA
ist eine erste Vorlage für
ein erstes Primeroligonukleotid, welches durch reverse Transkriptase
(RNA-abhängige
DNA-Polymerase)
verlängert
wird. Die RNA wird dann aus den entstandenen DNA:RNA Duplexen durch
die Wirkung einer Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die spezifisch
RNA aus Duplexen mit DNA oder RNA angreift) entfernt. Die dabei
entstandene ssDNA ist die zweite Vorlage für einen zweiten Primer, der
auch die Sequenz eines RNA-Polymerasepromoters
(beispielhaft dem T7 RNA-Polymerase) 5' zu den homologen Bereichen mit der
Vorlage umfasst. Dieser Primer wird dann durch eine DNA-Polymerase
verlängert
(z. B. durch das große „Klenow"-Fragment der E.
coli DNA Polymerase n, was zu einem Doppelstrang-DNA (dsDNA) Molekül führt, welches
zwischen den Primern eine zu der ursprünglichen RNA identische Sequenz
hat und zusätzlich
an einem Ende eine Promotorsequenz hat. Diese Promotorsequenz kann
dann verwendet werden, um durch eine geeignete RNA-Polymerase zahlreiche
RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann im Zyklus wieder
verwendet werden, um dadurch zu einer sehr schnellen Amplifikation
zu führen.
Durch eine geeignete Auswahl an Enzymen kann diese Amplifikation
im isothermischen Bereich und ohne durch die Zugabe von Enzym zu
jedem Zyklus durchgeführt
werden. Da der Prozess zyklisch abläuft, kann die Startsequenz
entweder als DNA oder als RNA ausgewählt werden.
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Miller
et al., PCT Anmeldung WO 89/06700, offenbart ein Nukleinsäureamplifikationsprinzip,
das auf der Hybridisierung einer Promotor/Primersequenz an einen
ausgewählten
DNA Einzelstrang („ssDNA") basiert und eine
nachfolgende Transkription von zahlreichen RNA-Kopien dieser Sequenz
umfasst. Dieses Prinzip ist nicht zyklisch, d. h. es werden keine
neuen Vorlagen aus den entstandenen RNA-Transkripten produziert.
Weitere Amplifikationsverfahren schließen „race" und „one-sided PCR" ein (Frohmann, M.A.,
in: PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic
Press, N. Y. (1990) und Ohara et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86: 5673-5677 (1989)).
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Verfahren,
die auf der Ligation von zwei oder mehreren Oligonukleotiden in
Anwesenheit der Nukleinsäure
basieren, haben die Sequenz des entstehenden „Dioligonukleotides", wobei die Amplifikation
des Dioligonukleotides auch in einem Amplifikationsschritt der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden kann (Wu et al., Genomics 4: 560 (1989)).
-
3. Separationsverfahren
-
Im
Anschluss an die Amplifikation kann es wünschenswert sein, die Amplifikationsprodukte
von den Vorlagen und überschüssigen Primern
abzutrennen, um zu bestimmen, ob spezifische Amplifikation erfolgt
ist. Amplifikationsprodukte werden durch Agarose, Agarose-Acrylamid
oder Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren
abgetrennt (siehe Sambrook et al., 1989).
-
Alternativ
können
chromatographische Techniken eingesetzt werden, um eine Abtrennung
zu bewirken. Es gibt eine Vielzahl von Chromatographien, die im
Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Absorptions-,
Partitions-, Ionenaustausch- und Molekularsiebchromatographie, so
wie zahlreiche Spezialtechniken, die Chromatographien wie Säulen-, Papier-,
Dünnschicht-
und Gaschromatographie (Freifelder, 1982) einsetzen.
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4. Identifikationsverfahren
-
Amplifikationsprodukte
müssen
visualisiert werden, um die Amplifikation der Markersequenzen zu
bestätigen.
Ein typisches Visualisierungsverfahren schließt das Färben eines Geles mit Ethidiumbromid
und die Visualisierung unter UV-Licht ein. Alternativ können die
Amplifikationsprodukte, sofern sie mit radioaktiv markierte oder
fluorometrisch markierte Nukleotide inkorporiert haben, im Anschluss
an die Auftrennung auf einem Röntgenfilm
exponiert werden oder unter einem geeigneten anregenden Spektrum
visualisiert werden.
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Visualisierung
kann indirekt erreicht werden. So können im Anschluss an die Auftrennung
der Amplifikationsprodukte eine markierte Nukleinsäureprobe
mit den amplifizierten Sequenzen in Kontakt gebracht werden. Die
Probe ist vorzugsweise mit einem Chromophor konjugiert, kann aber
auch radioaktiv markiert sein. In einer anderen Anwendung ist die
Probe an einen Bindungspartner konjugiert, wie einen Antikörper oder
ein Biotin, wobei das Gegenstück
zu dem Bindungspaar eine nachweisbare Einheit trägt.
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Der
Nachweis kann durch Southern Blot und Hybridisierung mit einer markierten
Probe erfolgen. Die Techniken, die im Southern Blot zusammengefasst
sind, sind dem Fachmann wohl bekannt und können in vielen Standardwerken
zu molekularbiologischen Protokollen nachgelesen werden (siehe Sambrook
et al., 19989). In Kürze,
es werden die Amplifikationsprodukte mittels Gelelektrophorese aufgetrennt.
Das Gel wird dann mit einer Membran wie Nitrozellulose in Kontakt
gebracht, um einen Transfer der Nukleinsäure und eine nichtkovalente
Bindung zu ermöglichen.
Nachfolgend wird die Membran mit einer chromophor-konjugierten Probe,
die in der Lage ist, mit der amplifizierten Zielsequenz zu hybridisieren,
inkubiert. Der Nachweis erfolgt durch das Exponieren der Membran
auf einem Röntgenfilm
oder einem Ionen emittierenden Nachweisgerät.
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Ein
Beispiel für
das Vorangegangene ist im U.S.-Patent Nr. 5,279,721 beschrieben,
welches ein Gerät und
Verfahren zur automatisierten Elektrophorese und dem Transfer von
Nukleinsäuren
offenbart. Das Gerät erlaubt
eine Elektrophorese und das Blotten ohne einen externen Eingriff
auf das Gel und ist ideal geeignet, um das Verfahren entsprechend
der vorliegenden Erfindung auszuführen.
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5. Kit-Bestandteile
-
Alle
wesentlichen Materialien und Reagenzien, die für den Nachweis der Prostataerkrankungsmarker in
einer biologischen Probe erforderlich sind, können in einem Kit zusammengefasst
werden. Das Kit umfasst im Allgemeinen ein vorab ausgewähltes Paar
von Primern für
einen oder mehrere spezifische Marker. Beispielsweise kann ein Kit
Primer einschließen,
die RNA-Marker in normalem Gewebe, BPH-Gewebe, abgegrenztem Tumorgewebe
oder metastasierend wachsendem Tumorgewebe oder einer beliebigen
Kombination aus diesen nachzuweisen. Des Weiteren können geeignete
Enzyme zur Amplifikation der Nukleinsäuren einschließlich verschiedener
Polymerasen (RT, Taq, etc.), Desoxynukleotide und Puffer, um die
notwendigen Reaktionsgemische für
die Amplifikation bereitzustellen, beinhaltet sein. Bevorzugte Kits
können
auch Primer zum Nachweis einer Kontroll-, nicht differentiell exprimierten
RNA, wie beispielsweise β-Aktin enthalten.
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Die
Kits werden gewöhnlich
in geeigneter Form, verschiedene Behälter für jedes der individuellen Reagenzien
und Enzyme sowie für
jedes markerspezifische Primerpaar enthalten. Bevorzugte Primerpaare
zur Amplifikation der Nukleinsäuren
sind derart ausgewählt,
dass sie die SEQ ID Nr: 1 amplifizieren.
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Ein
weiteres Kit wird eine Hybridisierungsprobe umfassen, die spezifisch
für differentiell
exprimierte Marker ist. Die Proben sind derart gestaltet, dass sie
an eine Sequenz oder das Komplementär einer Sequenz, hierin bezeichnet
als SEQ ID Nr: 1, hybridisieren. Solche Kits umfassen im Allgemeinen
verschiedene Behälter für die individuellen
Reagenzien und Enzyme sowie für
jeden Marker eine spezifische Hybridisierungsprobe in einer geeigneten,
dicht verschließbaren
Form.
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F. Verwendung von RNA-Fingerprinting,
um Marker der Prostataerkrankung zu identifizieren
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RNA-Fingerprinting
ist eine Methode, in welcher RNAs, die aus verschiedenen Geweben,
Zelltypen oder Behandlungsgruppen isoliert worden sind, gleichzeitig
getestet werden können,
um solche RNAs zu identifizieren, deren relative Häufigkeit
variiert. Es wurden zwei Formen dieser Technologie simultan entwickelt
und 1992 als RNA-Fingerprinting durch Differential Display beschreiben
(Liang und Pardee, 1992; Welsh et al., 1992). (Siehe auch Liang
und Pardee, U.S.-Patent 5,262,311.) Beide Techniken wurden in den
nachfolgend beschriebenen Untersuchungen eingesetzt. Einige der
hierin beschriebenen Untersuchungen wurden auf ähnliche Art und Weise gemäß Donahue
et al., J. Biol. Chem. 269; 8604-8609, 1994, durchgeführt.
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Alle
Arten des RNA-Fingerprintings mittels PCR sind theoretisch ähnlich,
jedoch unterscheiden sie sich im Design und der Anwendung der Primer.
Der auffälligste
Unterschied zwischen Differential Display und anderen Methoden des
RNA-Fingerprintings
ist es, dass das Differential Display Ankerprimer verwendet, die an
den Poly-A-Schwanz der mRNAs hybridisieren. Eine Konsequenz hieraus
ist, dass die PCR-Produkte,
die mit Differential Display amplifiziert wurden, in Richtung 3'nichttranslatierter
Bereich der mRNAs unausgewogen sind.
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Die
Grundtechnik des Differential Displays wurde im Detail beschrieben
(Liang und Pardee, 1992). Hierzu wird die Gesamt -Zell-RNA für eine erste
reverse Transkription mit einem verankernden Primer, der aus Oligo
dT besteht, geprimed. Der Oligo dT-Primer wird unter Verwendung
einer reversen Transkriptase, z. B. Moloney Murine Leukemia Virus
(MMLV) reverse Transkriptase, verlängert. Die Synthese des zweiten
Stranges wird durch zufällig
ausgewählte
Oligonukleotide, unter wenig stringenten Bedingungen eingesetzt,
gestartet. Sobald eine doppelsträngige
cDNA synthetisiert wurde, wird die Amplifikation gemäß Standard-PCR-Verfahren
durchgeführt,
wobei dieselben Primer verwendet werden. Die entstandenen DNA-Fingerprints
werden mittels Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung oder
Autoradiographie analysiert. Ein Vergleich der Fingerprints, die
von den RNAs aus verschiedenen Zellen stammen und bei denen die gleichen
Oligonukleotidprimer verwendet wurden, erlaubt die Identifizierung
von mRNAs, die differenziell exprimiert werden.
-
Das
RNA Fingerprint-Verfahren hat sich bereits als hilfreich in der
Identifizierung von Genen, die bei Krebs differenziell exprimiert
sind, erwiesen (Liang et al., 1992, Wong et al., 1993, Sager et
al., 1993, Mok et al., 1994, Watson et al., 1994, Chen et al., 1995,
An et al., 1995). Das RNA Fingerprint-Verfahren wird eingesetzt,
um Gene zu identifizieren, die im Prostatakrebs differenziell exprimiert
sind. Für
diese Untersuchungen wurden RNAs verwendet, die aus Tumorgewebe
und aus Tumoren abstammenden Zelllinien isoliert wurden, die sich
wie Tumorzellen mit unterschiedlich metastasierendem Potential verhalten.
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Das
zugrunde liegende Konzept dieser Untersuchungen basierte darauf,
dass Gene, die in Zellen mit unterschiedlichem metastasierenden
Potential differenziell exprimiert sind, als Indikatoren des metastasierenden
Potential verwendet werden können.
Da diese Metastasierung eine Voraussetzung ist für die Progression des Prostatakrebses
zu einer lebensbedrohenden pathologischen Form, können Indikatoren
des metastasierenden Potentials auch Indikatoren für ein pathologisches
Potential sein.
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G. Konzept und theoretische Überlegungen
zur relativen quantitativen RT-PCR
-
Eine
reverse Transkription (RT) von RNA zu cDNA und eine nachfolgende
relative quantitative PCR (RT-PCR) kann eingesetzt werden, um die
relative Konzentration von spezifischen mRNA-Arten in einer Reihe von
Gesamt-Zell-RNAs, die aus normalem, benignem und kanzerösem Prostatagewebe
isoliert wurden, zu bestimmen. Durch die Feststellung, dass die
Konzentration von spezifischen mRNA-Spezies variiert, wird gezeigt,
dass das Gen, welches die spezifische mRNA-Spezies kodiert, differentiell
exprimiert ist. Diese Technik kann dazu eingesetzt werden, um zu
bestätigen,
dass mRNA-Transkripte,
von denen eine differenzielle Regulation mittels RNA Fingerprinting
gezeigt wurde, im Verlauf des Prostatakrebses differentiell exprimiert
sind.
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Bei
einer PCR erhöht
sich die Zahl der Moleküle
der amplifizierten Ziel-DNA um einen Faktor von annähernd 2
bei jedem Zyklus der Reaktion so lange, bis einige Reagenzien limitiert
werden. Im Anschluss daran wird die Amplifikationsrate zunehmend
vermindert, bis es zu keiner weiteren Zunahme der amplifizierten
Zielsequenz zwischen den Zyklen kommt. Wenn man die Zyklenzahl auf
der X-Achse gegen die logarithmische Konzentration der amplifizierten
Ziel-DNA auf der Y-Achse aufträgt,
kann man beobachten, dass sich eine Kurve von charakteristischer
Form durch das Verbinden der aufgetragenen Punkte ergibt. Zu Beginn
des ersten Zyklus ist die Steigung der Linie positiv und konstant.
Dieser Bereich ist der lineare Teil der Kurve. Nachdem einige Reagenzien
limitiert werden, beginnt die Steigung der Kurve abzunehmen und
schließlich
gegen 0 zu laufen. An diesem Punkt wird die Konzentration der amplifizierten
Ziel-DNA asymptotisch gegenüber
einiger der festgelegten Werte. Man nennt dies das Plateau der Kurve.
-
Die
Konzentration der Ziel-DNA im linearen Teil der PCR ist direkt proportional
zur Ausgangskonzentration der Vorlage, bevor die PCR begonnen wurde.
Durch die Bestimmung der Konzentration des PCR-Produktes der Ziel-DNA
in einer PCR-Reaktion, die dieselbe Anzahl an Zyklen durchlaufen
hat und in ihrem linearen Bereich ist, ist es möglich, die relative Konzentration
der spezifischen Zielsequenz in der ursprünglichen DNA-Mischung zu bestimmen.
Sofern die DNA-Mischungen cDNAs sind, die aus RNAs synthetisiert
wurden, welche aus verschiedenen Geweben oder Zellen isoliert wurden,
kann die relative Häufigkeit
der spezifischen mRNA, aus welcher die Zielsequenz abgeleitet wurde,
für bestimmte
Gewebe oder Zellen bestimmt werden. Diese direkte Proportionalität zwischen
der Konzentration des PCR-Produktes und der relativen mRNA-Menge ist
nur für
den linearen Bereich der PCR-Reaktion gegeben.
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Die
endgültige
Konzentration der Ziel-DNA in der Plateauphase der Kurve wird durch
die Verfügbarkeit der
Reagenzien im Reaktionsmix bestimmt und ist unabhängig von
der ursprünglich
eingesetzten Konzentration der Ziel-DNA. Aus diesem Grund muss die
einzige Bedingung, die erfüllt
sein muss, bevor die relative Menge einer mRNA-Spezies mittels RT-PCR
für eine
Reihe von RNA-Populationen bestimmt werden kann, diejenige sein,
dass die Konzentrationen der amplifizierten PCR-Produkte aus PCR-Reaktionen,
die sich im linearen Bereich ihrer Kurven befinden, durch Probenentnahme
bestimmt werden.
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Eine
zweite Bedingung, die vorliegen muss, um mit einer RT-PCR-Untersuchung
die relative Menge einer bestimmten RNA-Spezies erfolgreich bestimmen
zu können
ist, dass die Menge der amplifizierbaren DNAs gegen einen unabhängigen Standard
normalisiert werden muss. Es ist das Ziel, mit einer RT-PCR-Untersuchung
die Menge einer bestimmten RNA-Art im Verhältnis zur durchschnittlichen
Menge aller mRNA-Arten in der Probe zu bestimmen. In der nachfolgend
beschriebenen Untersuchung werden die mRNAs für β-Akin, Asparaginsynthetase und
Lipocortin II als externe und interne Standards verwendet, mit denen
die relative Menge der anderen mRNAs verglichen wird.
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Die
meisten Protokolle zur kompetitiven PCR verwenden interne PCR-Standards,
die nahezu so häufig
wie die Zielsequenz vorliegen. Dies ist ein wirksamer Ansatz, sofern
die Produkte der PCR-Amplifizierung während der linearen Phasen gewonnen
werden. In dem Fall, dass die Produkte entnommen werden, wenn die
Reaktion sich der Plateauphase annähert, zeigt sich, dass die
weniger häufig
vorliegenden Produkte relativ überrepräsentiert
werden. Vergleiche zur relativen Häufigkeit, die für zahlreiche
verschiedene DNA-Proben durchgeführt
wurden, z. B. bei der Untersuchung von RNA-Proben zur differentiellen Expression,
können
derart verzerrt werden, dass Unterschiede in der relativen Menge
der RNAs geringer erscheinen als sie tatsächlich sind. Sofern der interne
Standard sehr viel häufiger
als die Zielsequenz in der Probe vorliegt, ist dies kein signifikantes
Problem. Falls der interne Standard häufiger als die Zielsequenz
vorliegt, kann ein direkter linearer Vergleich zwischen den RNA-Proben
gemacht werden.
-
Die
oben geführte
Diskussion beschreibt die theoretischen Überlegungen für ein RT-PCR-Assay mit klinischem
Material. Die mit klinischen Proben verbundenen Probleme sind, dass
solche Proben in unterschiedlichen Mengen vorliegen (dies macht
eine Normalisierung problematisch) und dass solche oft in verschiedener
Qualität
vorliegen (dies erfordert eine Co-Amplifikation einer verlässlichen
internen Kontrolle, die vorzugsweise größer als die Zielsequenz ist).
Diese beiden Probleme können
mit einer RT-PCR
bewältigt
werden, wenn diese als relative, quantitative RT-PCR mit einem internen
Standard, wobei der interne Standard ein amplifizierbares cDNA-Fragment
ist, welches größer als
das Ziel-cDNA-Fragment ist und wobei die Menge der mRNA, die den
internen Standard kodiert, etwa 5-100fach höher als die der mRNA, welche
die Zielsequenz kodiert, ist. Dieses Assay misst die relative Menge,
nicht die absolute Menge der entsprechenden mRNA-Spezies.
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Weitere
Untersuchungen, die nachfolgend beschrieben sind, verwenden eine
etwas konventionellere relative quantitative RT-PCR mit einem externen
Standard-Protokoll. Diese Assays entnehmen die PCR-Produkte in der
linearen Phase der Amplifikationskurven. Die Zahl der PCR-Zyklen,
die optimal zur Probenentnahme ist, muss für jedes Ziel-cDNA-Fragment
empirisch bestimmt werden. Zusätzlich
müssen
die reversen Transkriptaseprodukte der einzelnen RNA-Populationen,
die aus den verschiedenen Gewebeproben isoliert wurden, sorgfältig normiert
werden, um gleiche Konzentrationen der zu amplifizierenden cDNAs
zu gewährleisten. Dies
ist äußerst wichtig,
da dieses Assay die absolute mRNA-Menge misst. Die absolute mRNA-Menge
kann als Maß für eine differentielle
Expression eines Genes nur dann eingesetzt werden, wenn die Proben
normiert sind. Obwohl die empirische Bestimmung der linearen Phase
der Amplifikationskurve und die Normierung der cDNA-Präparationen
mühsam
und zeitaufwendig sind, ist das resultierende RT-PCR-Assay denen,
die von einer relativen quantitativen RT-PCR mit internem Standard
abgeleitet sind, überlegen.
-
Ein
Grund hierfür
ist es, dass in Assays ohne internen Standard/Kompetitor alle Reagenzien
zur Erzeugung eines einzigen PCR-Produktes im linearen Bereich der
Amplifikationskurve umgesetzt werden und sich somit die Sensitivität des Assays
erhöht.
Ein anderer Grund ist es, dass bei nur einem PCR-Produkt der Nachweis
des Produktes in einem elektrophoretischen Gel oder einer anderen
Darstellungsmethode weniger komplex ist, weniger Hintergrund hat
und leichter zu interpretieren ist.
-
H. Diagnose
und Prognose für
menschlichen Krebs
-
Die
vorliegende Erfindung erlaubt die Diagnose und eine Prognose für menschlichen
Prostatakrebs durch das Screenen nach Markernukleinsäuren. Auf
dem Gebiet der Krebsdiagnose und -prognose herrscht immer noch große Unsicherheit.
Es wurden eine Reihe von Markern vorgeschlagen, die mit der Metastasierung
und Bösartigkeit
korreliert sind. Diese werden im Allgemeinen als zytologische Protein-
oder Nukleinsäuremarker
klassifiziert.
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Zytologische
Marker schließen
auch Zustände
wie „Abrundung
des Zellkerns (nuclear roundedness)" (Diamond et al., 1982) und Zellploidie
ein. Proteinmarker schließen
das prostataspezifische Antigen (PSA) und CA125 ein. Nukleinsäuremarker
schließen
ferner die Amplifikation von Her2/neu, einer Punktmutation in den p52-
oder ras-Genen sowie eine Veränderung
in der Größe von Triplet
Repeat Segmenten von bestimmten Chromosomen ein.
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Zu
all diesen Markern sind gewisse Nachteile beschrieben, die mit Falsch-Positiven
oder Falsch-Negativen assoziiert sind. Ein falsch-positives Ergebnis
bedeutet, dass in einem Individuum, das keinen malignen Krebs hat,
die Anwesenheit eines „Krebsmarkers" aufgezeigt wird.
Beispielsweise werden erhöhte
Serum-PSA-Spiegel mit Prostatakarzinom assoziiert. Dies tritt jedoch
auch in einigen Individuen auf, die keinen maligne, keine benigne
Hyperplasie der Prostata haben. Ein falsch-negatives Ergebnis bedeutet,
dass in einem Individuum, das tatsächlich Krebs hat, der Nachweis
der Anwesenheit eines spezifischen Markers fehlschlägt. Die
Häufigkeit
für falsch-negative
Ergebnisse variiert bei jedem Marker und häufig auch bei Gewebetypen.
So wurde z. B. für
ras-Punktrnutationen
berichtet, dass sie sich in einem Bereich zwischen 95 % bei Krebs
der Bauchspeicheldrüse
und einem Minimalwert von 0 % in einigen gynäkologischen Krebsformen bewegen.
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Zusätzliche
Probleme treten auf, wenn ein Marker nur innerhalb der transformierten
Zellen selbst vorliegt. Ras-Punktmutationen können nur in den mutierten Zellen
nachgewiesen werden und sind offensichtlich im Serum oder Urin des
Patienten mit ras-aktivierten Karzinomen nicht vorhanden. Dies bedeutet,
dass man, um den malignen Tumor nachzuweisen, eine Probe des Tumors
selbst oder davon mutastasierten Zellen nehmen muss. Da es eine
Aufgabe des Krebsnachweises ist, den Tumor, bevor er metastasiert,
zu identifizieren und zu behandeln, müsste man den Tumor identifizieren
und eine Probe entnehmen, bevor die Anwesenheit eines Krebsmarkers
nachgewiesen werden könnte.
-
Schließlich treten
auch spezielle Probleme mit Markern auf, die in normalen Zellen
anwesend sind, jedoch in Krebszellen fehlen. Die meisten Tumorproben
werden eine gemischte Population aus sowohl normalen wie transformierten
Zellen enthalten. Wenn man nach Markern sucht, die in normalen Zellen
anwesend sind, jedoch in reduzierten Mengen in transformierten Zellen
auftreten, wird das Hintergrundsignal der normalen Zelle in der
Probe die Anwesenheit der transformierten Zellen maskieren.
-
Ein
idealer Krebsmarker wäre
einer, der in malignem Krebs anwesend ist und in benignen Tumoren oder
normalen Zellen entweder fehlt oder nur in signifikant niedrigeren
Mengen existent ist. Da weiterhin jeder einzelne Marker typischerweise
nur in einem Teil der malignen Zellen anwesend ist, ist es besser,
eine Reihe von solchen Markern für
jeden Krebstyp zu haben. Die vorliegende Erfindung macht es sich
daher zur Aufgabe, mehrere neue Nukleinsäuremarker, die in malignem
Prostatakarzinom in einem deutlich höheren Maße als in benignem oder normalem
Prostatagewebe exprimiert sind, zu identifizieren.
-
Es
kann vorweggenommen werden, dass bei klinischen Anwendungen menschliche
Gewebeproben auf die Anwesenheit der Marker für Prostataerkrankungen, die
hierin identifiziert werden, untersucht werden. Zu untersuchende
Proben können
aus Nadelbiopsien, chirurgischen Resektionsproben, Lymphknotengewebe oder
Serum bestehen. In einigen Ausführungsformen
werden die Nukleinsäuren
aus diesen Proben extrahiert und amplifiziert wie es vorangehend
beschrieben wurde. Einige Anwendungen würden Kits verwenden, die eine
Vorauswahl von Primerpaaren oder Hybridisierungsproben enthalten.
Die amplifizierten Nukleinsäuren würden, wie
es vorangehend beschrieben wurde, z. B. mittels Gelelektrophorese
und Ethidiumbromidfärbung oder
Southern-Blot oder eines Festphasennachweises auf die Marker untersucht
werden. Diese Verfahren sind im Stand der Technik wohl bekannt.
Die nachgewiesenen Mengen des ausgewählten Markers würden mit statistisch
gültigen
Gruppen von metastasierenden, nicht metastasierenden malignen, benignen
oder normalen Prostataproben verglichen werden. Die Diagnose und
Prognose für
einen individuellen Patienten würde über den
Vergleich mit solchen Gruppen ermittelt werden.
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Ein
Ausführungsbeispiel
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung setzt eine RT-PCR-Technik zum Nachweis
von zirkulierenden Prostatakrebszellen ein (d. h. solchen, die bereits
metastasieren), wobei Proben und Primer mit der Sequenz SEQ ID Nr:
1 eingesetzt werden. Ähnliche
Techniken wurden in der PCT-Anmeldung Nr. WO 94/10343 beschrieben.
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Metastasierende
Prostatakrebszellen werden in haematopoetischen Proben durch die
Amplifikation von prostatakrebsspezifischen Nukleinsäuresequenzen
nachgewiesen.
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Proben,
die aus dem Blut oder Lymphknoten entnommen wurden, werden wie im
Nachfolgenden beschrieben behandelt, um die gesamte Zell-RNA zu
reinigen. Die isolierte RNA wird dann revers transkribiert unter
Verwendung einer reversen Transkriptase und Primern, die ausgewählt wurden,
um unter hochstringenten Bedingungen an die Nukleinsäuresequenz
mit der SEQ ID Nr: 1 zu binden. Im Anschluss an die reverse Transkription
werden die resultierenden cDNAs unter Verwendung von Standard-PCR-Techniken (nachfolgend
beschrieben) und einer thermostabilen DNA-Polymerase amplifiziert.
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Die
Anwesenheit der Amplifikationsproduktes, die der Nukleinsäure des
Prostatakrebsmarkers entspricht, kann durch mehrere alternative
Mittel nachgewiesen werden. Gemäß eines
Ausführungsbeispiels kann
die Amplifikation mittels Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen
werden. Alternativ kann das Amplifikationsprodukt im Anschluss an
einen gelelektrophoretischen Schritt mittels standardmäßiger Southern
Blot-Techniken, unter Verwendung von Hybridisierungsproben, die
ausgewählt
wurden, um spezifisch an die Nukleinsäuresequenz einen Prostatakrebsmarker
zu binden, nachgewiesen werden. Die Hybridisierung der Probe kann
im Anschluss mittels standardmäßiger Markierungsmittel,
z. B. durch inkorporiertes [32P]-Nukleotid und anschließender Autoradiographie
nachgewiesen werden. Das Amplifikationsprodukt kann alternativ auch
unter Verwendung eines Festphasennachweissystems, wie es oben beschrieben
wurde, nachgewiesen werden, wobei eine Prostatakrebsmarker spezifische
Hybridisierungsprobe und geeignete Markierungsmittel eingesetzt
werden. Die Anwesenheit von Nukleinsäuren für Prostatakrebsmarker in Proben
aus Blut oder Lymphknoten kann als Hinweis auf einen Patienten mit
metastasierendem Prostatakrebs betrachtet werden.
-
I. Gezielte Hemmung von
Prostatakrebsmarkern
-
Grundsätzlich können die
Prostatakrebsmarker, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziert
wurden, als Ziele für
einen therapeutischen Ansatz bei Prostatakrebs dienen. Eines der
identifizierten Gene, Zyklin A, wurde bereits als Ziel für eine Reihe
von Agenzien beschrieben, die das Wachstum von Tumorzellen durch
ein Vorantreiben einer Differenzierung oder einer Zellteilungshemmung
verhindern. Es wurde z. B. berichtet, dass L-Tyrosin zu einer erhöhten Melanogenese
führt und
die replikative Alterung in der B16 Melanomzelllinie, die mit einer
Abnahme der Zyklin A-Aktivität
korreliert, bewirkt (Rieber & Rieber,
1994). Suramin ist ein Antitumoragens, das die Expression von Zyklin
A in der DU-145 Prostatakrebszelllinie reduziert (Qiao et al., 1994).
Rapamycin hemmt die Zellproliferation in der YAC-1 T Zelllymphomlinie
und hemmt außerdem die
mRNA-Produktion von Zyklin A (Dumont et al., 1994). Es ist nicht
eindeutig, ob diese Inhibitoren direkt auf Zyklin A wirken oder
irgendwo oberhalb des Signaltransduktions/Phosphorylierungskaskadewegs
angreifen. Dennoch sollten Zyklin A-Inhibitoren die Zellproliferation hemmen
und zu einer Abnahme des Tumorwachstums führen. Solche Inhibitoren können sich
daher als therapeutische Agenzien für die Behandlung von Prostatakrebs
nützlich
erweisen.
-
Inhibitoren
können
aber auch potentiell aus einem bislang unbekannten Prostatakrebsmarker,
der im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, entwickelt
werden. Dies wird durch die Tatsache erschwert, dass bislang keine
spezifische Funktion für
die meisten der Genprodukte aufgefunden wurde und keine Daten über deren
dreidimensionale Struktur verfügbar
ist.
-
In
einigen Fällen
könnte
die Proteinfunktion ausgehend von den primären Sequenzdaten extrapoliert werden,
vorausgesetzt, dass Sequenzhomologien zwischen dem unbekannten Protein
und einem Protein ähnlicher
Sequenz und bekannter Funktion existieren. Proteine tendieren dazu,
in großen
Familien mit relativ ähnlichen
Sequenzen und Funktionen aufzutreten. So haben z. B. eine Reihe
von Serinproteasen wie Trypsin und Chymotrypsin erhebliche Sequenzhomologien
und eine relativ ähnliche
dimensionale Struktur. Weitere allgemeine Gruppen von homologen
Proteinen schließen
die verschiedenen Klassen von Transkriptionsfaktoren, Membranrezeptorproteinen,
Tyrosinkinasen, GTP-bindenen Proteinen usw. ein. Die vermeintliche
Aminosäuresequenz,
die durch die Prostatakrebsmarkernukleinsäure der vorliegenden Erfindung
kodiert wird, kann auf Sequenzhomologien gegen die Proteinsequenzdatenbanken
der National Biomedical Research Fundation überprüft werden. Homologieüberprüfungen gehören zum
Standardrepertoire des Fachmanns.
-
Man
kann sogar dreidimensionale Strukturen aus den primären Sequenzdaten
der kodierten Proteine ableiten. Wiederum gilt, sofern Homologien
zwischen den kodierten Aminosäuresequenzen
und anderen Proteinen mit bekannter Struktur bestehen, kann ein
Modell für
die Struktur des kodierten Proteins gestaltet werden, welches auf
der Struktur des bekannten Proteins basiert. Ein Beispiel für diese
Art der Vorgehensweise wurde von Ribas de Pouplana und Fothergill-Gilmmore
berichtet (Biochemistry 33: 7047-7055, 1994). Diese Autoren entwickelten
ein detailliertes dreidimensionales Modell für die Struktur der Drosophila-Alkoholdehydrogenase,
welches teilweise auf Sequenzhomologien mit der bekannten Struktur
der 3-α,
20-β-Hydroxysteroiddehydrogenase
basierte. Sobald ein dreidimensionales Modell zur Verfügung steht,
können
unter Verwendung von Standard-Computermodeling-techniken Inhibitoren
konstruiert werden. Dieses Gebiet wurde kürzlich von Sun und Cohen zusammengefasst
(Gene 137: 127-132, 1993).
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Antisense-Konstrukte
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Der
Begriff „Antisense" soll sich auf Polynukleotidmoleküle beziehen,
die zu einem Teil des RNA-Markers für die Prostataerkrankung, wie
sie hierin beschrieben wurde, komplementär sind. „Komplementäre" Polynukleotide sind
solche, die eine Basenpaarung gemäß den Standardregeln der Komplementarität von Watson-Crick
erlauben. Dies bedeutet, dass das größere Purin sich mit dem kleineren
Pyrimidin paart, um Guaninpaarungen mit Cytosin (G:C) und Adenin
mit Thymin (A:T) im Fall von DNA zu ermöglichen bzw. Adenin mit Uracil
(A:U) im Fall von RNA zu paaren. Das Einfügen von weniger häufig auftretenden
Basen wie Inosin, 5-Methylcytosin, 6-Mehyladenin, Hypoxanthin und
anderer in die hybridisierenden Sequenzen stört die Paarung nicht.
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Antisense-Polynukleotide,
wenn sie in eine Zielzelle eingeführt werden, binden spezifisch
an ihr Zielnukleotid und stören
bei der Transkription, der RNA-Prozessierung, dem Transport, der
Translation und/oder der Stabilität. Antisense-RNA-Konstrukte
oder DNA, die eine solche Antisense-RNA kodiert, können eingesetzt
werden, um die Gentranskription oder Translation oder beides innerhalb
einer Wirtszelle sowohl in vitro wie in vivo zu hemmen, wobei beim
in vivo-Schritt in einem Wirtstier einschließlich einem menschlichen Objekt vorgegangen
wird.
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Die
intrazelluläre
Konzentration der monovalenten Kationen beträgt in etwa 160 ml (10 mM Na+; 150 mM K+). Die
intrazelluläre
Konzentration der divalenten Kationen ist annähernd 20 mM (18 mM Mg+; 2 mM Ca++). Die
intrazelluläre
Proteinkonzentration, die helfen würde, das Volumen der Hybridisierung
zu verringern und dabei die wirksame Konzentration der Nukleinsäurearten
herabzusetzen, ist 150 mg/ml. Konstrukte können in vitro unter den Bedingungen
untersucht werden, welche in vivo-Bedingungen nachahmen.
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Antisense-Konstrukte
können
gestaltet werden, um an den Promotor oder andere Kontrollregionen, Exons,
Introns oder auch die Grenze zwischen Exons und Introns in einem
Gen zu binden. Es kann berücksichtigt
werden, dass das wirksamste Antisense-Konstrukt der vorliegenden Erfindung
Regionen einschließt, die
komplementär
zum mRNA-Startpunkt sind oder solche Sequenzen, die hierin als Prostataerkrankungsmarker
identifiziert wurden. Solche Konstrukte können verhältnismäßig leicht getestet werden,
indem die Konstrukte in vitro zur Bestimmung, welche Menge des Zielproteins
betroffen ist, zu untersuchen. Auf ähnliche Art und Weise kann
auch schädliche
unspezifische Hemmung der Proteinsynthese über die Bestimmung der Zielzelllebensfähigkeit
in vitro gemessen werden.
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Der
hierin verwendete Begriff „komplementär" oder „Antisense" bedeutet Polynukleotide,
die im Wesentlichen komplementär über ihre
gesamte Länge
sind und nur wenige Basen mit unterschiedlichen Paarungen haben.
So werden z.B. Sequenzen aus fünfzehn
Basenlänge
als komplementär
bezeichnet, wenn die komplementären
Nukleotide dreizehn oder vierzehn aus fünfzehn haben. Selbstverständlich sind
Sequenzen, die „vollständig komplementär" sind, solche Sequenzen,
die über
ihre gesamte Länge
vollständig
komplementär
sind und keine Fehlpaarungen haben.
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Andere
Sequenzen mit einem niedrigeren Grad der Homologie sind ebenso zu
berücksichtigen.
Beispielsweise könnte
ein Antisense-Konstrukt, welches eine begrenzte Region von hoher
Homologie aufweist, jedoch auch nicht-homologe Regionen (z. B. ein
Ribozym) enthält,
gestaltet werden. Solche Moleküle
würden, obwohl
sie weniger als 50 % Homologie hätten,
an die Zielsequenz unter geeigneten Bedingungen binden.
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Wie
oben bereits dargelegt, und obwohl die Antisense-Sequenzen eventuell
vollständige
cDNA-Kopien sind oder große
Teile derselben, können
sie auch kürzere
Fragmente oder „Oligonukleotide", die hierin als Polynukleotide
mit 50 oder weniger Basen definiert sind, sein. Obwohl kurze Oligomere
(8-20) leichter herzustellen sind und die in vivo-Zugänglichkeit
verbessern, sind zahlreiche weitere Faktoren in der Bestimmung der Spezifität der Basenpaarung
involviert. Beispielsweise erhöht
sich sowohl die Bindungsaffinität
wie auch die Sequenzspezifität
eines Oligonukleotides bezogen auf sein komplementäres Target,
sofern seine Länge
zunimmt. Es ist vorgesehen, dass Oligonukleotide aus 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder
100 Basenpaaren eingesetzt werden. Obwohl sowohl die ganze wie auch
Teile der Gensequenz eingesetzt werden können im Zusammenhang mit der
einer Antisense-Konstruktion,
sollte statistisch betrachtet jede Sequenz einer Länge von
14 Basen nur einmal im menschlichen Genom vorkommen und daher ausreichen,
um eine einzigartige Targetsequenz festzulegen.
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Man
könnte
sich wünschen,
Antisense-Konstrukte zu verwenden, die weitere Elemente, z. B. solche, die
C-5 Propynpyrimidine einschließen.
Oligonukleotide, die C-5 Propynanalogas des Uridins und Cytidins
enthalten, stellten bereits ihre hohe Affinität, RNA zu binden, und ihre
Fähigkeit
starke Antisense-Inhibitoren der Genexpression zu sein, unter Beweis
(Wagner et al., 1993).
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Als
eine Alternative zur Bereitstellung zielgerichteter Antisense-Moleküle können zielgerichtete
Ribozyme eingesetzt werden. Der Begriff „Ribozym" bezieht auf ein RNA-basiertes Enzym, welches in der Lage
ist, spezifische Basensequenzen sowohl in der DNA wie in der RNA
anzusteuern und zu spalten. Ribozyme können entweder direkt auf Zellen
einwirken, in Form von RNA-Oligonukleotiden, die Ribozymsequenzen
beinhalten, oder als Expressionsvektoren, welche die gewünschten
ribozymalen RNAs kodieren, in Zellen eingeführt werden. Ribozyme können in
gleicher Weise, wie es für
Antisense-Polynukleotide
beschrieben wurde, eingesetzt und angewandt werden. Ribozymsequenzen
können
auch in derselben Weise, wie es für Antisense-Polynukleotide
beschrieben wurde, verändert
werden. Beispielsweise kann man non-Watson-Crick-Basen einführen oder
gemischte RNA/DNA Oligonukleotide herstellen oder die Phosphodiesterrückgrade
modifizieren oder die 2'-Hydroxy
in der Ribosezuckergruppe der RNA modifizieren.
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Eine
weitere Alternative besteht darin, die Antisense-Oligo- und Polynukleotide über die
Transkription von einem Expressionskonstrukt, das Nukleinsäuren trägt, welche
die Oligo- oder
Polynukleotide kodieren, als RNA bereitzustellen. In dieser Anmeldung
bedeutet der Begriff „Expressionskonstrukt" jede Art eines genetischen
Konstruktes, welches eine Nukleinsäure enthält, die ein Antisense-Produkt
kodiert, wobei ein Teil oder die ganze Nukleinsäuresequenz transkribiert werden
kann. Typische Expressionsvektoren schließen bakterielle Plasmide oder
Phagen, wie beliebige der pUC- oder BluescriptTM-Plasmidserien sowie
die nachfolgend weiter besprochenen viralen Vektoren ein, die für die Verwendung
in eukaryotischen Zellen angepasst sind.
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Die
Nukleinsäure
kodiert ein Antisense-Oligo- oder Polynukleotid unter der transkriptionellen
Kontrolle eines Promotors. Ein „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die von
der Synthesemaschinerie der Zelle oder einer eingeführten Synthesemaschinerie
erkannt wird und welche für
die Initiierung der spezifischen Gentranskription erforderlich ist.
Der Satz „unter
transkriptioneller Kontrolle" bedeutet,
dass der Promotor an der korrekten Stelle und in der korrekten Orientierung
in Bezug auf die Nukleinsäure
ist, um die Initiation der RNA-Polymerase zu kontrollieren.
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Der
Begriff Promotor wird hierin verwendet, um auf eine Gruppe von transkriptionellen
Kontrollmodulen Bezug zu nehmen, die um die Initiationsstelle der
RNA-Polymerase II herum angeordnet sind. Viele der Erkenntnisse
darüber,
wie Promotoren organisiert sind, stammen von Analysen mehrerer viraler
Promotoren, eingeschlossen solcher für die HSV-Thymidinkinase (tk) und SV40 frühen Transkriptionseinheiten.
Solche Studien, die durch jüngere
Arbeit vervollständigt
wurde, zeigten, dass Promotoren aus einzelnen funktionellen Modulen
zusammengesetzt sind, wobei jedes aus annähernd 7-20 bp DNA besteht und
ein oder mehrere Erkennungsstellen für Transkriptionsaktivatoren
oder Repressorproteine enthält.
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Mindestens
ein Modul eines jeden Promotors funktioniert, um die Startstelle
der RNA-Synthese
zu positionieren. Das am besten bekannte Beispiel hierfür ist die
TATA-Box, auch wenn einigen Promotoren eine TATA-Box fehlt, wie
z. B. dem Promotor für
das Gen der terminalen Desoxynukleotidyltransferase von Säugern und
dem Promotor für
die späten
Gene des SV40. In solchen TATA-Box-freien Promotoren überlagert
ein einzelnes Element die Startstelle und hilft, die Stelle der
Initiation festzulegen.
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Weitere
Promotorelemente regulieren die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation.
Typischerweise sind solche in dem Bereich 30-110 bp stromaufwärts von
der Startstelle lokalisiert. Trotzdem wurde für eine Reihe von Promotoren
kürzlich
gezeigt, dass sie auch funktionelle Elemente stromabwärts der
Startstelle enthalten. Der Abstand zwischen Promotorelementen ist
häufig
flexibel, so dass die Promotorfunktion erhalten bleibt, falls Elemente
umgekehrt werden oder relativ zueinander bewegt werden. Bei dem
tk-Promotor kann der Abstand zwischen Promotorelementen auf 50 bp
ansteigen, bevor die Aktivität
abzunehmen beginnt. In Abhängigkeit des
Promotors scheint es, dass individuelle Elemente entweder kooperativ
oder unabhängig
voneinander arbeiten; um die Transkription zu aktivieren.
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Der
tatsächliche
Promotor, der eingesetzt wird, um die Expression der Nukleinsäure, welche
die hemmenden Peptide kodiert, zu kontrollieren, ist vermutlich
nicht entscheidend, solange er in der Lage ist, die Peptide in der
Zielzelle zu expremieren. Daher wird es bevorzugt, sofern eine menschliche
Zelle angesteuert werden soll, die Nukleinsäure, welche die hemmenden Peptide
kodiert, in der Nähe
oder unter die Kontrolle eines Promotors zu stellen, der in der
menschlichen Zelle aktiv ist. Allgemein gesprochen könnte ein
solcher Promotor entweder einen menschlichen oder einen viralen
Promotor einschließen.
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Die
Promotoren des „immediate
early"-Genes des
menschlichen Zytomegalovirus (CMV), des SV40 early-Genes und des
Long Terminal Repeats des Rous sarcoma-Virus können eingesetzt werden, um
eine hohe Expression von verschiedenen Proteinen zu erhalten. Die
Verwendung von anderen viralen oder Säugerzell- oder Bakteriolphagenpromotoren, über die
im Stand der Technik bekannt ist, dass sie eine Expression der Peptide
gemäß der vorliegenden
Erfindung erreichen, ist ebenso vorgesehen, vorausgesetzt, dass
das Maß der
Expression für
den gewählten
Zweck ausreichend ist.
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Durch
den Einsatz eines Promotors mit bekannten Eigenschaften, kann das
Maß und
das Muster der Expression eines Antisense-Oligo- oder Polynukleotides
optimiert werden. Weiterhin kann die Wahl eines Promotors, der in
Abhängigkeit
eines spezifischen physiologischen Signals reguliert ist, die induzierbare
Expression eines hemmenden Proteins erlauben. Zum Beispiel führt eine
Nukleinsäure,
die unter der Kontrolle des menschlichen PAI-1 Promotors steht,
zu einer durch Tumornekrosefaktor induzierbaren Expression. Zusätzlich kann
jede Promotor-/Enhancerkombination (wie durch die Eukaryotische
Promotordatenbank EPDB) dazu eingesetzt werden, die Expression einer
Nukleinsäure
entsprechend der vorliegenden Erfindung anzutreiben. Die Verwendung eines
T3, T7 oder SP6 zytoplasmatischen Expressionssystems ist eine weitere
mögliche
Ausführungsform.
Eukaryotische Zellen können
die zytoplasmatische Transkription von bestimmten bakteriellen Promotoren
unterstützen,
sofern die geeignete bakterielle Polymerase entweder als Teil des
Transportkomplexes oder als zusätzliches
genetisches Expressionskonstrukt vorliegt.
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Das
Einführen
einer Nukleinsäure
in eine Zelle kann in vitro oder in vivo durch den Einschluss eines Markers
in das Expressionskonstrukt bestimmt werden. Der Marker sollte zu
einer erkennbaren Veränderung der
transfektierten Zelle führen,
um eine leichte Bestimmung der Expression zu erlauben. Es können Enzyme wie
die Herpes Simplex Virus Thymidinkinase (tk) (eukaryontisch) oder
die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) (prokaryontisch) eingesetzt
werden.
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Man
kann außerdem
ein Polyadenylierungssignal einführen,
um eine angemessene Polyadenylierung des Transkriptes zu bewirken.
Die Art des Polyadenylierungssignals ist vermutlich nicht entscheidend
für einen erfolgreichen
Einsatz und jede solche Sequenz sollte einsetzbar sein. Beispielsweise
kann das SV40, β-Globin oder
Adenovirus Polyadenylierungssignal eingesetzt werden. Es ist auch
zu berücksichtigen,
dass ein Element der Expressionskassette ein Terminator ist. Diese
Elemente können
dazu dienen, die Transkriptmenge zu erhöhen und ein Durchlesen von
einer Kasette in eine andere Sequenz minimieren.
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Liposomale
Formulierung
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Die
Antisense-Oligo- oder Polynukleotide und/oder Expressionsvektoren
können
in einem Liposom gebunden sein. Liposomen sind vesikuläre Strukturen,
die durch eine Phospholipiddoppelmembran und einen inneren wässrigen
Mediumanteil gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen haben
viele Lipidschichten, die durch wässrige Medien getrennt sind.
Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Übermaß an wässriger
Lösung
suspendiert werden. Die Lipidkomponenten durchlaufen eine Selbstanordnung,
bevor sich geschlossene Strukturen bilden oder Wasser umschließen und
gelöste
Substanzen zwischen den Lipiddoppelschichten aufgelöst werden
(Ghosh und Bachhawat, 1991). Ebenso sind kationische Lipid-Nukleinsäurekomplexe
wie Lipofektamin-Nukleinsäurekomplexe
zu erwägen.
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Die
Liposomen können
mit einem hämaglutinierenden
Virus (HVJ) komplexiert werden. Hierfür wurde gezeigt, dass dies
eine Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Eintritt der
Liposomen-verkapselten DNA in die Zelle fördert (Kaneda et al., 1989).
In anderen Ausführungsformen
können
die Liposomen in Verbindung mit nuklearen, nichthistonhaltigen chromosomalen
Proteinen (HMG-1) komplexiert oder eingesetzt werden (Kato et al.,
1991). Die Liposomen können
in Verbindung mit sowohl HVJ und HMG-1 komplexiert oder eingesetzt
werden. Sofern solche Expressionsvektoren erfolgreich für die Übertragung
und Expression eines Polynukleotides in vitro und in vivo eingesetzt
wurden, sind sie auch für
eine Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Im Falle,
dass ein bakterieller Promotor in einem DNA-Konstrukt eingesetzt
ist, ist es außerdem
wünschenswert,
in dem Liposom eine geeignete bakterielle Polymerase einzuschließen.
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„Liposom" ist ein generischer
Begriff, der eine Vielzahl von einzel- und multilamellaren Lipidvehikeln umfasst,
die durch die Bildung einer geschlossenen Lipiddoppelschicht geformt
werden. Zur Herstellung von Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung
werden Phospholipide eingesetzt, die eine positive Nettoladung,
eine negative Nettoladung tragen können oder neutral sein können. Dicetylphosphat
kann eingesetzt werden, um eine negative Ladung auf die Liposomen
zu übertragen
und Sterylamin kann eingesetzt werden, um eine positive Ladung auf
die Liposomen zu übertragen.
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Für einen
Einsatz geeignete Lipide können
aus kommerziellen Quellen erhalten werden. Beispielsweise kann Dimyristylphophatidylcholine
(„DMPC") von Sigma Chemical
Co. bezogen werden; Dicetylphosphat („DCP") kann von K & K Laboratories (Plainview, NY bezogen
werden; Cholesterol („Chol") kann von Calbiochem-Behring
bezogen werden; Dimyristylphosphatidylglycerol („DMPG") und andere Lipide können von Avanti
Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.) bezogen werden. Stocklösungen der
Lipide in Chloroform, Chloroform/Methanol oder t-Butanol können bei
etwa –20°C aufbewahrt
werden. Vorzugsweise wird Chloroform als das einzige Lösungsmittel
eingesetzt, da es leichter als Methanol verdampft werden kann.
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Phospholipide
aus natürlichen
Quellen wie Ei oder Sojabohnenphosphatidylcholin, aus dem Hirn gewonnene
Phosphatiditsäure,
aus dem Hirn oder Pflanzen gewonnenen Phosphatidylinositol, aus
dem Herz gewonnenes Kardiolipin und aus Pflanzen oder Bakterien
gewonnenes Phosphatidylethanolamin werden vorzugsweise nicht als
primäre Phosphatide
eingesetzt, d. h. 50 % oder mehr der Phosphatidgesamtzusammensetzung
ausmachen, da dies in instabilen und leckenden Liposomen resultieren
würde.
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Liposomen
können
auf verschiedene Weisen hergestellt werden. Die Größe der Liposomen
variiert in Abhängigkeit
des Syntheseverfahrens. Ein Liposom, welches in einer wässrigen
Lösung
suspendiert ist, hat im Allgemeinen die Form eines sphärischen
Vesikels, mit einer oder mehreren konzentrischen Schichten aus Lipiddoppelschichtmolekülen. Jede
Schicht besteht aus einer parallelen Anordnung von Molekülen, die
durch die Formel XY repräsentiert
werden, wobei X eine hydrophile Einheit und Y eine hydrophobe Einheit
ist. In wässriger
Lösung
richten sich die konzentrischen Schichten derart aus, dass die hydrophilen
Einheiten dazu tendieren, mit der wässrigen Farbe in Kontakt zu
bleiben und die hydrophoben Regionen zu einer Selbstassoziierung
tendieren. Z. B. werden, sofern wässrige Phasen sowohl mit und
ohne Liposom vorliegen, die Lipidmoleküle eine Doppelschicht bilden,
bekannt als Lamelle, mit der Anordnung XY-YX.
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Liposomen
können
gemäß bekannter
Laborverfahren hergestellt werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
werden Liposomen durch die Mischung von liposomalen Lipiden in einem
Lösungsmittel
im Container, z. B. einer birnenförmigen Flasche aus Glas, hergestellt.
Der Behälter
sollte ein zehnmal größeres Volumen
haben als das Volumen der erwarteten Liposomensuspension ist. Unter
Verwendung eines Rotationsevaporators wird das Lösungsmittel bei ungefähr 40°C und negativem
Druck entfernt. Das Lösungsmittel ist
normalerweise innerhalb von etwa 5 Minuten bis zu 2 Stunden entfernt,
in Abhängigkeit
des gewünschten Volumens
der Liposomen. Die Zusammensetzung kann dann in einem Desiccator
unter Vakuum weiter getrocknet werden. Die getrockneten Lipide müssen im
Allgemeinen nach etwa einer Woche entsorgt werden, da sie im Laufe
der Zeit eine Tendenz zum Verderben haben.
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Getrocknete
Lipide können
bei etwa 25-50 mM Phospholipid in sterilem, pyrogenfreiem Wasser
durch Schütteln
hydriert werden, bis die ganze Lipidschicht resuspendiert ist. Die
wässrigen
Liposomen können
dann in Aliquots aufgeteilt werden, jedes in ein Röhrchen gegeben
werden, lyophilisiert und unter Vakuum versiegelt werden.
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Alternativ
können
Liposomen auch gemäß bekannter
Laborverfahren hergestellt werden: Dem Verfahren von Bangham et
al. (1965), dem Verfahren von Gregoriadis, wie es in DRUG CARRIERS
INBIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed. (1979), Seiten 287- 341 beschrieben ist,
dem Verfahren nach Deamer und Uster (1983), und dem Reverse-Phase Evaporationsverfahren,
wie bei Szoka und Papahadjopoulo (1978). Die voran genannten Verfahren
unterscheiden sich in ihrer jeweiligen Fähigkeit, wässrige Materialien einzuschließen sowie
in ihren jeweiligen wässriger
Raum-zu-Lipid Verhältnissen.
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Die
getrockeneten Lipide oder lyophilisierten Liposomen, die hergestellt
wurden wie oben beschrieben, können
in Nukleinsäurelösungen wiederhergestellt
werden und mit einem passenden Lösungsmittel,
z. B. DPBS, auf eine geeignete Konzentration verdünnt werden.
Die Lösung
wird dann in einem Vortexmixer heftig geschüttelt. Nicht eingeschlossene
Nukleinsäure
wird durch Zentrifugation bei 29.000 × g abgetrennt und die Liposomen
im Pellet gewaschen. Die gewaschenen Liposomen werden bei geeigneter
Gesamtphospholipidkonzentration, z. B. etwa 50-200 mM, resuspendiert.
Die Menge der eingeschlossenen Nukleinsäure kann gemäß Standardverfahren
bestimmt werden. Nach der Bestimmung der Menge der Nukleinsäure, die
in den Liposomenzubereitungen eingeschlossen sind, können die
Liposomen auf geeignete Konzentrationen verdünnt werden und bei 4°C bis zu
ihrer Verwendung aufbewahrt werden.
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Das
Lipid Dioleoylphosphaltidylchoin wird eingesetzt. Nukleaseresistente
Oligonukleotide werden mit Lipiden in Anwesenheit eines Überschusses
an t-Butanol vermischt. Die Mischung wurde gevortexed, bevor sie
in einem Aceton/Trockeneisbad gefroren wurde. Die gefrorene Mischung
wurde lyophylisiert und mit Hepes-gepufferter Saline (1 mM Hepes,
10 mM NaCl, pH 7,5) über
Nacht hydriert, und anschließend
wurden die Liposomen für
10 bis 15 Minuten im Ultraschallbad beschallt. Die Größe der liposomalen
Oligonukleotide bewegt sich typischerweise zwischen 200 – 300 nm
Durchmesser, wie sie durch das Submikron Particle Sizer Autodilute
Model 370 (Nicomp, Sante Barbara, CA) bestimmt wurden.
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Alternative Transportsysteme
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Adenoviren:
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Menschliche
Adenoviren sind doppelsträngige
DNA-Tumorviren mit einer Genomgröße von nahezu
36 kB (Tooz, 1981). Adenoviren wurden weigehend als Modell für die eukaryotische
Genexpression untersucht und charakterisiert, wodurch sie zu einem attraktiven
System für
die Entwicklung von Adenoviren als Gentransfersystem wurden. Diese
Gruppe von Viren ist leicht zu vermehren und zu manipulieren und
sie zeigen in vitro und in vivo ein breites Wirtsspektrum. In lytisch
infizierten Zellen sind Adenoviren in der Lage, die Wirtsproteinsynthese
abzuschalten, die zelluläre
Maschinerie zur Synthese großer
Mengen an viralen Proteinen einzusetzen und massenhaft Virus zu
produzieren.
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Die
E1-Region des Genoms schließt
E1A und E1B ein, die Proteine kodieren, die für die Transkriptionsregulation
des viralen Genoms sowie einiger zellulärer Gene verantwortlich sind.
Die E2-Expression, einschließlich
E2A und E2B, erlaubt die Synthese der viralen replikativen Mechanismen,
z. B. DNA-bindende Proteine, DNA-Polymerase und ein terminales Protein,
welches die Replikation anstößt. Die
E3-Genprodukte verhindern eine Zytolyse durch zytoxische T-Zellen
und Tumornekrosefaktor und scheinen für die virale Verbreitung wichtig
zu sein. Wirkungen, die mit dem E4-Protein verbunden werden, schließen die
DNA-Replikation, die späte
Genexpression und die Wirtszellabschaltung ein. Die späten Genprodukte
schließen
die meisten der Virionkapsidproteine ein und diese werden nur exprimiert,
nachdem die meisten der Abläufe
zur Verarbeitung eines einzelnen primären Transkriptes des Major
Late Promotors erfolgt ist. Der Major Late Promotor (MLP) zeigt
eine hohe Effizienz während
der späten
Phase der Infektion (Stratford-Perricaudet
und Perricaudet, 1991).
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Da
nur ein geringer Anteil des viralen Genomes in cis erforderlich
zu sein scheint (Tooze, 1981), bieten Adenovirus-abgeleitete Vektoren
ein hervorragendes Potential zur Ersetzung von großen DNA-Fragmenten, sofern
sie in Verbindung mit Zelllinien wie 293-Zellen eingesetzt werden.
Ad5-transformierte menschliche embryonale Nierenzelllinien (Graham
et al., 1977) wurden entwickelt, um essentielle virale Proteine
in trans bereitzustellen.
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Die
besonderen Vorteile des Adenovirussystems beim Transport fremder
Proteine in eine Zelle beinhalten (i) die Fähigkeit, relativ große Stücke der
viralen DNA durch fremde DNA zu ersetzen; (ii) die strukturelle Stabilität der rekombinanten
Adenoviren; (iii) die Sicherheit der adenoviralen Verabreichung
an Menschen; und (iv) die Abwesenheit jeglicher bekannter Assoziationen
einer Adenovirusinfektion mit Krebs oder bösartigen Tumoren; (v) die Fähigkeit,
hohe Titer des rekombinanten Viruses zu erzeugen; und (vi) die hohe
Infektiosität des
Adenovirus.
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Weitere
Vorteile des adenoviralen Vektors gegenüber Retroviren beinhaltet das
höhere
Maß der
Genexpression. Zusätzlich
ist die Adenovirusreplikation unabhängig von einer Wirtsgenreplikation
anders wie bei retroviralen Sequenzen. Da die adenoviralen transformierenden
Gene in der E1-Region leicht entfernt werden können und trotzdem effiziente
Expressionsvektoren bereitgestellt werden, können onkologische Risiken von Adenovektoren
vernachlässigt
werden können
(Grunhaus & Horwitz,
1992).
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Im
Allgemeinen basiert ein adenovirales Gentransversystem auf rekombinant
veränderten
Adenoviren, die replikationsinkompetent gemacht wurden durch die
Deletion eines Teiles ihres Genoms, wie E1, und die dennoch ihre
Infektionskompetenz behalten. Sequenzen, die relativ große fremde
Proteine kodeiren, können
exprimiert werden, sofern zusätzliche
Deletionen im adenoviralen Genom gemacht werden. Beispielsweise
können
Adenoviren, aus denen sowohl E1- und E3-Regionen entfernt wurden,
bis zu 10 kb fremder DNA aufnehmen und sie können zu hohen Titern in 293-Zellen
herangezogen werden (Stratford-Perricaudet
und Perricaudet, 1991). Eine überraschend
anhaltende Expression des Transgens im Anschluss an eine adenovirale
Infektion wurde bereits beschrieben.
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Andere virale Vektoren
als Expressionskonstrukte.
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Andere
virale Vektoren können
als Expressionskonstrukte in der vorliegenden Verwendung eingesetzt werden.
ES können
Vektoren eingesetzt werden, die von Viren wie Vacciniavirus (Ridgeway,
1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988) und adeno-assoziierten
Virus (AAV) (Ridgeway 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Hermonat
und Muzycska, 1984) und Herpesviren abgeleitet sind. Sie bieten
mehrere attraktive Eigenschaften für verschiedene Säugerzellen
(Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar
et al., 1988; Horwich et al., 1990).
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Durch
die kürzliche
Entdeckung von defekten Hepatitis-B-Viren wurde neue Einsicht in
die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener viraler Sequenzen
gewonnen. In vitro-Untersuchungen
zeigen, dass das Virus die Fähigkeit
zur helferabhängigen
Verpackung und reversen Transkription trotz einer Deletion von bis
zu 80 % seines Genomes beibehalten hatte (Horwich et al., 1990).
Dies wies darauf hin, dass ein großer Teil des Genoms durch fremdes
genetisches Material ersetzt werden könnte. Der Hepatotropismus sowie
die Persistenz (Integration) sind besonders attraktive Eigenschaften
für den lebergerichteten
Gentransfer. Chang et al. führte
kürzlich
das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) Gen in das Hepatits-B-Virusgenom
der Enten an den Platz der Polymerase, Oberflächen- und vor oberflächenkodierenden
Sequenzen ein. Dieses wurde mit einem Wildtypvirus in eine vom Vogel
abstammende Hepatomzelllinie kotranfiziert. Das Kulturmedium, welches
hohe Titer des rekombinanten Virus enthielt, wurde verwendet, um
primäre
Entenkükenhepatozyten
zu infizieren. Eine stabile CAT-Genexpression
konnte für
wenigstens 24 Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden (Chang
et al., 1991).
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Nichtvirale Verfahren.
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In
der vorliegenden Erfindung werden auch einige nicht-virale Verfahren
zum Transfer von Expressionsvektoren in kultivierte Säugerzellen
berücksichtigt.
Dies schließt
eine Kalziumphosphatpräzipitation
(Graham und Van Der Eb, 1973; Chen und Okayama, 1987; Rippe et al.,
1990), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Lipofektamin-DNA-Komplexe und
Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu 1988)
ein. Einige dieser Techniken können
erfolgreich für
eine in vivo oder ex vivo Verwendung angepasst werden.
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Das
Expressionskonstrukt kann auch einfach aus einem nackten rekombinanten
Vektor bestehen. Die Übertragung
des Konstruktes kann auf jede Art, wie sie oben beschrieben ist,
die physikalisch oder chemisch die Zellmembran durchdringt, durchgeführt werden.
Z. B. injizierte Dubensky et al. (1984) erfolgreich Polyomavirus-DNA
in Form eines CaPO4-Präzipitates
in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen, um
eine aktive virale Replikation und akute Infektion zu zeigen. Benvenisty
und Neshif (1986) zeigten außerdem,
dass eine direkte intraperitonale Injektion eines CaPO4-präzipitierten
Plasmids in der Expression der transfizierten Gene resultiert. Es
ist angestrebt, dass die DNA, die ein Antisense-Prostatamarkerkonstrukt
kodiert, auf ähnliche
Weise auch in vivo übertragen
werden kann.
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Pharmazeutische Zusammensetzungen
und Applikationsrouten
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In
den Fällen,
in denen Liposomen, die Antisense-Oligo- oder Polynukleotide oder
Expressionsvektoren enthalten, für
klinische Anwendungen in Frage kommen, ist es unerlässlich,
den Liposomenkomplex als pharmazeutische Zusammensetzung, die für die vorgesehene
Anwendung geeignet ist, bereitzustellen. Grundsätzlich wird das die Zubereitung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung bedingen, die im wesentlichen
frei von Pyrogenen ist sowie von anderen Unreinheiten, die schädlich für Mensch
und Tier sein können. Es
wird außerdem
grundsätzlich
wünschenswert
sein, geeignete Puffer einzusetzen, um den Komplex stabil zu halten
und eine Aufnahme durch die Zielzellen zu erlauben.
-
Wässrige Zusammensetzungen
enthalten eine wirksame Menge der Antisense-Expressionsvektoren, die in Liposomen
eingeschlossen sind wie oben besprochen, und sind weiterhin in pharmazeutisch
annehmbaren Trägern
oder wässrigen
Medien verteilt. Solche Zusammensetzungen werden auch als Inocula
bezeichnet. Die Sätze „pharmazeutisch
oder pharmakologisch anwendbar" beziehen
sich auf Zusammensetzungen, die keine abstoßende, allergische oder andere
unpassende Reaktion auslösen,
sofern sie einem Tier oder einem Menschen wie vorgesehen verabreicht
werden.
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Der
hierin verwendete Begriff „pharmazeutisch
annehmbarer Träger" schließt jedes
und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische
Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien oder Ähnliches
ein. Der Einsatz solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen
im Stand der Technik bekannt. Ausgenommen den Fall, dass ein konventionelles
Medium oder Agens mit der aktiven Subtanz inkompatibel ist, wird
deren Verwendung in der therapeutischen Zusammensetzung berücksichtigt.
Zusätzliche
aktive Bestandteile können
ebenso in der Zusammensetzung inkorporiert sein.
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Lösungen der
therapeutischen Zusammensetzungen können in Wasser mit oberflächenaktiven
Stoffen wie Hydroxypropylzellulose entsprechend gemischt ist, hergestellt
werden. Dispersionen können
auch in Glycerol, flüssigem
Polyethylenglykolen, Mischungen daraus und in Öl hergestellt werden. Unter
gewöhnlichen Lager-
und Verwendungsbedingungen enthalten solche Zusammensetzungen Konservierungsmittel,
um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
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Die
therapeutische Zusammensetzung wird Vorteilhafterweise in Form einer
injizierbaren Zusammensetzung entweder als flüssige Lösung oder Suspension verabreicht;
eine feste Form, die zur Lösung
in oder einer Flüssigkeit
vor der Injektion geeignet ist, kann ebenso hergestellt werden.
Solche Zubereitungen können emulgiert
werden. Eine typische Zusammensetzung für einen solchen Zweck enthält einen
pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Z. B. kann die Zusammensetzung 10 mg, 25 mg, 50 mg oder bis zu etwa
100 mg des menschlichen Serumalbumins pro ml phosphatgepufferter
Saline enthalten. Andere pharmazeutisch annehmbare Träger beinhalten
wässrige
Lösungen,
nicht-toxische Arzneistoffträger
und schließlich
Salze, Konservierungsmittel, Puffer oder ähnliches.
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Beispiele
für nicht
wässrige
Lösungsmittel
sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl und injizierbare organische
Ester wie Ethyloleat. Wässrige
Träger
beinhalten Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Salzlösungen,
parenterale Vehikel wie Natriumchlorid, Ringer's Dextrose etc. Intravenöse Träger schließen Flüssigkeits-
und Nährstoffergänzer ein.
Konservierungsmittel schließen
antimikrobielle Agenzien, Antioxidantien, chelatierende Agenzien
und inerte Gase ein. Der pH und die exakte Konzentration der verschiedenen
Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung werden gemäß wohlbekannten
Parametern eingestellt.
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Eine
wirksame Menge der therapeutischen Zusammensetzung bestimmt sich
nach dem angestrebten Ziel. Der Begriff „unit dose" oder „Dosierung" bezieht sich auf physikalisch festgelegte
Einheiten, geeignet für die
Verwendung in einem Patienten, wobei jede Einheit eine vorbestimmte
Menge der therapeutischen Zusammensetzung, die derart berechnet
ist, dass sie eine erwünschte
Antwort erzeugt, wie oben beschrieben, in Verbindung mit ihrer Verabreichung,
d. h. einer geeigneten Route und Behandlungsablauf beinhaltet. Die
zu verabreichende Menge sowohl gemäß der Zahl der Behandlungen
und Einheitsdosen hängt
von dem gewünschten
Schutz ab.
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Die
genaue Menge der therapeutischen Zusammensetzung hängt außerdem von
der Beurteilung des Fachmannes und den Besonderheiten eines jeden
Einzelperson ab. Faktoren, welche die Dosis beeinflussen, schließen physikalische
und klinische Zustände
des Patienten, die Applikationsroute und die Stärke, Stabilität und Toxizität der speziellen
therapeutischen Substanz mit ein. Für die vorliegende Anmeldung
wird angestrebt, dass die Menge der therapeutischen Zusammensetzung,
die in einer Einheitsdosis umfasst ist, sich zwischen 5-30 mg des
Polynukleotides bewegt.
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Die
nachfolgenden Beispiele wurden eingefügt, um bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung zu zeigen. Es sollte für den Fachmann erkennbar sein,
dass die nachfolgenden Beispiele, die offenbart sind, Techniken
repräsentieren,
von denen durch die Erfinder gezeigt wurde, dass sie in der Anwendung
der Erfindung gut funktionieren und es kann daher angenommen werden,
dass sie die bevorzugten Umsetzungen für die Praxis darstellen. Dennoch
sollte der Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung akzeptieren,
dass zahlreiche Veränderungen
gemacht werden können,
ohne sich vom Schutzbereich der Erfindung, wie er in den nachfolgend
angehängten
Ansprüchen
definiert ist, abzuweichen.
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J. Material und Methoden
-
1. Anwendung
der RNA Fingerprint Technik für
das Auffinden von Biomarkern für
Prostatakarzinome
-
RNA
Fingerprint (in Anlehnung an Liang und Pardee, 1992; Welsh et al,
1992; Liang und Pardee, 1993) wurde für Nukleinsäuren verwendet, die aus primären humanen
Prostatakarzinomen oder aus von Prostatatumor abgeleiteten Zelllinien
mit unterschiedlichem Metastasierungspotential isoliert worden waren.
Bei den in diesen Studien untersuchten Prostatakarzinom-Zelllinien
handelte es sich um LnCaP, PC-3(pf), PC-3(mf) und DU-145. Diese
Zelllinien unterscheiden sich in ihrem Potential Metastasen auszubilden.
LnCaP ist nur schwach metastasierend, während die anderen drei Zelllinien
sehr agressiv und stark metastasierend sind. Die primären humanen
Prostatatumoren waren von unterschiedlichem Metastasierungsgrad.
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Die
Zelllinien wurden in RPMI-Medium (GIBCO-BRL, Inc.) vermehrt, welches
mit 10% fötalem
Minderserum, 5 Einheiten/ml Penicillin G, 5μg/ml Streptomycin und Fungizone
gemäß den Angaben
des Anbieters angereichert war. Alle Antibiotika wurden von GIBCO-BRL, Inc. bezogen.
Die Zellen wurden in der späten Log-Phase
der Wachstumskurve geerntet. Die Isolierung der RNA erfolgte durch
die Guanidinium-Thiocyanat Methode (Chomczynski und Sacchi, 1987).
Die RNA wurde auch aus festen Prostatatumoren mit der Guanidinium-Thiocyanat
Methode (Chomczynski und Sacchi, 1987) isoliert, nachdem die Tumoren
in flüssigem Stickstoff
eingefroren und zu Pulver zermalen waren.
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Nach
der RNA Isolierung wurden die Nukleinsäuren mit Ethanol präzipitiert.
Die Präzipitate
wurden durch Zentrifugation pelletiert und wieder in Wasser aufgelöst. Die
aufgelösten
Nukleinsäuren
wurden anschließend
mit RNase-freier Dnase I (Boehringer Mannheim, Inc.) gemäß den Anweisungen
des Herstellers verdaut, gefolgt von einer organischen Extraktion
mit einem Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol Gemisch (25:24:1) und
einer erneuten Präzipitation
mit Ethanol.
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Die
mit DNase I behandelte RNA wurde dann durch Zentrifugation pelletiert
und wieder in Wasser aufgelöst.
Die Reinheit und Konzentration der RNA in Lösung wurde durch Bestimmung
der optischen Dichte bei den Wellenlängen 260 nm und 280 nm (Sambrook
et aL, 1989) abgeschätzt.
Eine kleine Teilprobe der RNA wurde durch eine Gelelektrophorese
in einem 3% igen Gel mit MOPS Puffer ((Sambrook et al., 1989) aufgetrennt,
um die Abschätzung
der Konzentration zu bestätigen
und um festzustellen, ob die ribosomalen RNAs intakt waren. Diese
RNA, die in Zukunft als Gesamtzelluläre-RNA bezeichnet wird, wurde
für die
nachfolgend beschriebenen Untersuchungen verwendet.
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2. Methoden, die in dem
Differential Display-Verfahren verwendet wurden
-
Es
wurden zwei Arten von RNA Fingerprint Untersuchungen mit der Gesamtzelluläre-RNA durchgeführt. Die
erste Art dieser Untersuchungen folgte dem Differential Display-Protokoll von Liang
und Pardee (1992) abgesehen von der Abänderung durch die Verwendung
von 5'-biotinylierten
Primern für
den nicht-radioaktiven Nachweis von PCR Produkten.
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In
diesen Untersuchungen wurden 0.2 μg
Gesamtzelluläre-RNA
mit einem Ankerprimer bestehend aus Oligo dT, gefolgt von zwei willkürlich gewählten Nukleotiden,
für die
reverse Transkription vorbereitet. Die in diesen Studien verwendeten
Ankerprimer wurden durch eine Biotinylierung am 5'-Ende weiter modifiziert.
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Die
reverse Transkription wurde mit 200 Einheiten einer MMLV (Moloney
Murine Leukemia Virus) Reverse Transkriptase (GIBCO/BRL) im Beisein
von 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10mM DTT, 500
pM dNTP, 1 pM biotinyliertem Ankerprimer und 1 U/μl RNase Inhibitor,
durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde für
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend bei
37° C für 50 Minuten.
Nach der reversen Transkription wurde das Enzym durch ein Erhitzen
auf 65° C
für 10
Minuten, denaturiert.
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Ein
Zehntel der erhaltenen reversen Transkriptions Reaktion wurde dann
in einer PCR unter Verwendung des gleichen Ankerprimers, wie er
in dem reverse Transkriptaseschritt verwendet wurde und einem zweiten
Oligonukleotid mit einer willkürlich
gewählten
Sequenz, amplifiziert. Das PCR Reaktionsgemisch enthielt 10 mM Tris-HCl
(pH 8.3), 50mM KCl, 20 pM dNTP, 1.5 pM MgCl2,
200 nM willkürliches
Decamer, 1 μM
biotinylierter Ankerprimer und 1 Einheit Taq DNA Polymerase (Boehringer
Mannheim) in einem 40 μl
Volumen. Die Amplifikation wurde in einem Thermo Cycler (MJ Research)
durchgeführt,
mit 30 Zyklen, einer Denaturierung bei 94° C für 30 Sec, einem Annealing bei
40° C für 2 Min
und einer Extension bei 72° C
für 30
Sec.
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Die
PCR-Produkte wurden dann auf einem 6% TBE-Harnstoff Sequenziergel
(Sambrook et al., 1989) aufgetrennt und durch eine Chemilumineszenzreaktion,
unter Verwendung des Seq-LightTM Nachweissystems (Tropix,
Inc.) aufgespürt.
Differentiell auftretende PCR Produkte wurden aus dem Gel ausgeschnitten,
mit den gleichen Primern wie in der ursprünglichen Amplifikation erneut
amplifiziert und unter Verwedung der TA Klonierungsstrategie kloniert
(Invitrogen, Inc. und Promega, Inc.).
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3. Methoden, die für die RNA
Fingerprint-Technik verwendet wurden
-
Die
zweite Art der durchgeführten
RNA Fingerprint-Untersuchungen war dem Protokoll von Welsh et al.
(1992) sehr ähnlich.
Dieser Ansatz verwendete eine Abwandlung des oben erwähnten, durch
Verwendung von Agarosegelen und einem nicht-radioaktiven Aufspüren von
Banden durch eine Ethidium-Bromid-Färbung (An et al., 1995). Die
Gesamtzelluläre-RNAs
wurden wie beschrieben (Chomczynski & Sacchi, 1987) aus gefrorenen Prostata-Gewebeproben
oder kultivierten Zellen isoliert. Zehn Mikrogramm Gesamtzelluläre-RNA wurden
mit 5 Einheiten RNAse-freier DNAse I (GIBCO/BRL) behandelt, in 20
mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 und
20 Einheiten RNAse Inhibitor (Boehringer Mannheim). Nach einer Extraktion
mit Phenol/Chloroform und einer Präzipitation mit Ethanol wurden
die RNAs in DEPC-behandeltem Wasser wieder aufgelöst.
-
Zwei μg der jeweiligen
Gesamtzellulären-RNA
wurden unter Verwendung von zufällig
ausgewählten Hexamer-Primern
und einer MMLV reversen Transkriptase (GIBCOBRL) in cDNA revers
transkribiert. Die PCR wurde unter Verwendung von einem oder zwei
willkürlich
ausgewählten
Oligonukleotid-Primern (10-12mere) durchgeführt. Die PCR Bedingungen waren:
10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50mM KCl, 1.5 mM MgCl2,
50 pM dNTPs, 0.2 pM Primer, 1 Einheit Taq DNA Polymerase (GIBCO/BRL)
in einem Endvolumen von 20 μl.
Die Amplifikationsgrößen umfaßten 35
Rreaktionszyklen mit 30 Sec Denaturierung bei 94° C, 90 Sec Annealing bei 40° C und 60
Sec Extension bei 72° C.
Eine abschließende
Extension wurde für
15 Min bei 72° C
durchgeführt. Die
erhaltenen PCR Produkte wurden durch Elektrophorese in 2% igen Agarosegelen
mit TBE Puffer (Sambrook et al., 1989) nach Größe aufgetrennt und in Fingerprints
zerlegt. Die Fingerprints wurden durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar
gemacht. Eine erneute Amplifikation wurde nicht durchgeführt.
-
Differentiell
auftretende PCR Produkte, die möglicherweise
differentiell exprimierte Gene darstellen, wurden mit einer Rasierklinge
aus dem Gel ausgeschnitten, mit dem Geneclean Kit (Bio 101, Inc.)
von der Agarose befreit, in Wasser eluiert und mit Hilfe der TA
Klonierungsstrategie (Invitrogen, Inc., and Promega, Inc.) direkt
in Plasmidvektoren kloniert. Diese Produkte wurden nicht nach dem
anfänglichen
PCR Fingerprint-Protokoll erneut amplifiziert.
-
4. Bestätigung der
differentiellen Expression durch Relative Quantitative RT-PCR: Protokolle
für die
RT-PCR
-
a. Reverse Transkription
-
Fünf μg der Gesamtzelluläre-RNA aus
jeder Gewebeprobe wurden in cDNA revers transkribiert. Die reverse
Transkription wurde mit 400 Einheiten einer MMLV Reverse Transkriptase
(GIBCO/BRL) in der Gegenwart von 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl,
3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 500 pM dNTP, 50 ng
zufällig
ausgewählte
Hexamere pro Mikrogramm an RNA und 1 U/μl RNase Inhibitor. Das Volumen
der Reaktion betrug 60 μl.
Das Reaktionsgemisch wurde für
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend bei
37° C für 50 Minuten.
Nach der reversen Transkription wurde das Enzym durch ein Erhitzen
auf 65° C
für 10
Minuten, denaturiert. Nach der Hitzedenaturierung wurden die Proben
mit Wasser auf ein Endvolumen von 300 μl verdünnt.
-
Es
wurde RT-PCR verwendet, um die mRNAs auf differentielle Expression
hin zu untersuchen. Die Sequenzen der Olignokleotide, die verwendet
wurden, um die Amplifikation der unterschiedlichen cDNA Fragmente
zu regeln, sind in Tabelle 2 dargestellt.
-
b. Relative Quantitative
RT-PCR mit internem Standard
-
Die
Konzentration der orginalen Gesamtzelluläre-RNAs wurde durch Messung
der OD260/280 (Sambrook et al., 1989) ermittelt
und durch Untersuchung der ribosomalen RNAs auf einem mit Ethidiumbromid
gefärbten
Agarosegel bestätigt.
Es ist erforderlich, dass alle quantitativen PCR-Reaktionen nach
Abschluss der reversen Transkiption auf gleiche Mengen an amplifizierbarer
cDNA normalisiert werden. Ein Lösungsansatz dafür ist die
Steuerung der PCR-Reaktion in die Plateauphase. Dieser Ansatz wurde
in einigen der Untersuchungen verwendet, da er schnell und effizient
ist. Es wurde Lipocortin II als interner Standard oder als Kompetitor
verwendet. Die PCRs wurden wie folgt aufgesetzt: Reagenzien: 200
pM von jedem dNTP, 200 nM von jedem Oligonukleotide-Primer, 1 × PCR Puffer
(Boehringer Mannheim einschließlich
1.5 mM MgCl2), 3 μl verdünnte cDNA und 2.5 Einheiten
der Taq DNA Polymerase I/100 μl
Reaktionsvolumen.
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Zyklus-Parameter:
30 Zyklen mit 94° C
für 1 Min,
55° C für 1 Min
und 72° C
für 2 Min.
Die Thermocycler waren entweder der MJ Research Thermocycler oder
der Stratagene Robocycler.
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c. Relative quantitative
RT-PCR mit einem externen Standard
-
Es
gibt drei mögliche
Schwierigkeiten mit der oben beschriebenen relativen quantitativen
RT-PCR Strategie. Erstens, der interne Standard muss bei dieser
Strategie in etwa 4-10 mal häufiger
vorhanden sein als das Zielmolekül
um die Proben zu normalisieren. Zweitens, da die meisten PCR-Produkte
den häufger
vorhandenen internen Standard als Template verwenden, ist die Sensitivität des Assays
unter dem Optimum. Drittens, der interne Standard muss wirklich
gleich bleibend sein. Das Ergebnis ist, dass die oben beschriebene Strategie
schnell, praktisch und auf Proben mit unterschiedlicher Qualität anwendbar
ist, aber es fehlt ihr die Sensitivität für geringfügige Veränderungen in der Häufigkeit.
Um diese Probleme zu bewältigen
wurde eine Normalisierung mit β-Actin
und Asparagin Synthetase mRNAs als externe Standards durchgeführt. Diese
PCR Reaktionen wurden mit einer genügenden Anzahl von Zyklen durchgeführt, um
die Produkte im linearen Bereich ihrer Amplifikationskurve zu halten.
Für jede
der Studien wurden Fotonegative der PCR Produkte in den mit Ethidiumbromid
gefärbten
Gelen angefertigt. Diese Negative wurden gescannt und mit einem
BioRad Densitometer quantifiziert. Die quantifizierten Daten wurden
anschließend,
durch den Vergleich der quatifizierten Daten aus jeder Studie mit
denen aus einer ähnlichen
Untersuchung mit einem aus β-Actin
mRNA amplifizierten cDNA Fragment erhaltenen, auf die Unterschiede
in den Ausgangskonzentrationen der amplifizierbaren cDNAs, normalisiert.
-
Die
auf β-Actin
normalisierten quantifizierten Daten wurden in Balkendiagramm-Darstellungen konvertiert.
-
K. Beispieie
-
Beispiel 1:
-
Relative quantitative
Reverse Transkriptase – Polymerase
Chain Reaction – Eine
Methode um neue Gene (ESTs) als diagnostische Biomarker zu beurteilen
-
Die
reverse Transkriptions – Polymerase
chain reaction (RT-PCR) Protokolle, die im folgenden Beispiel beschrieben
sind, wurden als Hilfsmittel zur Bestimmung der relativen Häufigkeit
von mRNA Spezies, die in verschiedenen Geweben, Organen und Zellen
exprimiert sind, entwickelt. Die verwendeten Protokolle mussten
dem Bediürfnis
entsprechend robust, reproduzierbar, verhältnismäßig quantitativ, sensitiv,
konservativ im Verbrauch von Resourcen, schnell und mit einer hohen
Durchsatzrate, sein. Die relative quantitative RT-PCR besitzt die
technischen Eigenschaften, die in Theorie auf all diese Kriterien
zutreffen. In der Praxis gibt es sechs wichtige Hürden um
einen auf RT-PCR basierenden Assay, der die relative Häufigkeit
von mRNA Spezies vergleicht, zu realisieren. Das nachstehend beschriebene
Protokoll geht auf jede der sechs Hürden ein und hat die Durchführung der
RT-PCR für
diese Anwendung ermöglicht.
Obwohl das vorliegende Beispiel auf die Identifikation und die Bestätigung einer
differentiellen Expression in verschiedenen physiologischen Stadien
einer Prostatadrüse
bezogen ist, können
die nachfolgend beschriebenen Methoden für jeden anderen Typ von Gewebe
angewandt werden, um eine sensitive Methode zur Identifikation differentieller
Expression zu Verfügung zu
stellen.
-
Der
Großteil
der Kandidatengene, die mit dieser Methode untersucht wurden, sind
unvollständige cDNA
Fragmente die durch RNA Fingerprint – Methodik identifiziert wurden.
Dies erforderte die Entwicklung eines relativ quantitativen Ansatzes
um die differentielle Expression der mRNAs, von welchen die unvollständigen cDNA
Fragmente stammten, unabhängig
voneinander zu bestätigen.
Die hauptsächliche
Zielsetzung des beschriebenen Screening Protokolls ist die Beurteilung
von Veränderungen
in der relativen Häufigkeit
der mRNA.
-
Das
in der vorliegenden Offenbarung beschriebene Programm zum Aufspüren von
Genen konzentriert sich auf die Untersuchung von humanem Gewebe
und die Bestätigung
muss mit dem gleichen biologischen Material erfolgen. Der Zugriff
auf humanes Gewebe für
die RNA Isolierung ist eingeschränkt.
Diese Einschränkung
ist besonders problematisch bei Northern Blots, dem üblichen
Hilfsmittel, um differentielle Genexpression zu ermitteln. Northern
Blots verbrauchen üblicherweise
etwa 20 μg
RNA pro Gewebe und pro identifiziertes Gen. Das bedeutet, dass für jede normal
große
verfügbare
Gewebeprobe, nur 1-5 Northern Blots durchgeführt werden können, bevor
die RNA einer Gewebeprobe vollständig
aufgebraucht ist. Es ist klar, dass Northern Blots für eine erste
Bestätigung
von entdeckten Genen ernsthaft beschränkt sind und dass sie äußerst wertvolles
biologisches Material zum Aufspüren
von Genen und zur Charakterisierung verbrauchen.
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Wegen
den Einschränkungen
der Menge an verfügbarem
Gewebe und wegen dem Bedarf an hohem Durchsatz und der schnellen
Wendung von Ergebnissen, wurde ein zwei-stufiges Protokoll entwickelt,
technologisch fußend
auf der reversen Transkription von RNA in cDNA, gefolgt von einer
Amplifikation von spezifischen cDNA Sequenzen durch Polymerase Chain
Reaction (PCR). Diese Verbindung von Techniken wird häufig auch
als RT-PCR bezeichnet.
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Ein
Vorteil der RT-PCR ist es, dass sie relative geringe Mengen an RNA
verbraucht. Mit 20 μg
RNA pro untersuchter Probe, einer Menge die für die Durchführung eines
einzelnen Norther Blot Experimentes erforderlich ist, können 50-200
RT-PCT Assays mit bis zu 4 Datenpunkten pro Assay, durchgeführt werden.
Ein weiterer Vorteil ist eine hohe Durchsatzrate, wobei acht voneinander
unabhängige
Experimente, die acht unterschiedliche mRNAs untersuchen, gleichzeitig
in einer einzelnen PCR-Maschine mit 96 Vertiefungen, durchgeführt werden
können.
Eine einzelne Person, die mit dieser Technik vertraut ist, kann
deshalb acht Gene pro Tag ohne sichtlichen Zeitdruck untersuchen
und auswerten. Zum Vergleich, auch wenn RNA in ausreichender Qualität und Quantität zur Verfügung stünde, um
diese Anzahl von Northers Blots durchzuführen, würde eine in der Durchführung von
Northern Blots ähnlich
erfahrene Person arg bedrängt
sein, um acht Gene in der Woche zu untersuchen und auszuwerten.
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Zusätzlich zur
niedrigen Durchsatzrate von Northern Blots, würden acht Northern Blots pro
Woche auch noch etwa 400 μCi
an 32P pro Woche verbrauchen. Obwohl in
den Händen
einer Fachkraft nicht gefährlich,
ist 32P sicherlich unbequem in der Handhabung.
Die RT-PCR vermeidet den Einsatz von radioaktiven Materialien.
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Ein
weiterer Vorteil der RT-PCR gegenüber den Northern-Blots als
technologische Grundlage für
die Auswertung der relativen Expression von RNA Spezies ist, dass
die RT-PCR weit
weniger sensitiv auf Unterschiede in der Qualität der zu untersuchenden RNA
reagiert. Die hierin beschriebenen menschlichen Gewebe wurden den
Patienten zum Zwecke der Behandlung entfernt und wurden nur zufällig für weitere
Untersuchungen aufgehoben. Da es sich bei RNA um ein sehr instabiles
Molekül
handelt, wird erwartet, dass sie zumindest teilweise degradiert
ist. Da die RNA in einem Northern Blot im Gel über die Größe aufgetrennt wird, erscheint teilweise
degradierte RNA eher als Schmier, statt als einzelne Banden. Im
Gegensatz dazu, amplifiziert die RT-PCR nur einen Abschnitt oder
eine Domäne
eines RNA Moleküls
und solange dieser Abschnitt intakt ist, spielen die Größe oder
der Grad der Degradation keine Rolle. In Folge dessen ergeben RNAs,
die identisch sind, ausser dass sie sich im Ausmaß der Degradierung
unterscheiden, in einem Northern Blot sehr viel variablere Signale,
als in einer RT-PCR. Sind die Proben von unterschiedlicher Qualität, ein häufiger Fall
bei humanen Studien, ist die relative Sensitivität der Techniken im Vergleich
mit der Schwankung in der Probenqualität eine wichtige Abwägung.
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In
der Praxis dieser Methode wird die Gesamtzelluläre-RNA zunächst unter Verwendung von reverser Transkriptase
und durch primen mit willkürlichen
Hexameren erst in cDNA konvertiert. Dieses Protokoll ergab ein Gemisch
an cDNAs, zu dem jede RNA entsprechend ihrem relativen Anteil in
der orginalen Gesamtzellulären-RNA
beigetragen hat. Wenn sich zwei RNA Spezies in ihrer ursprünglichen
relativen Häufigkeit
in der Gesamtzellulären-RNA,
um das zehnfache unterscheiden, dann werden sich auch die cDNAs,
die aus diesen beiden RNAs entstehen, um das zehnfache in ihrer
relativen Häufigkeit
in dem erhaltenen Gemisch an cDNAs unterscheiden.
-
Eine
weitere Überlegung
ist das relative Ausmaß der
zielgerichteten Amplifikation einer cDNA durch PCR. In Theorie ist
die Menge eines, durch PCR synthetisierten, amplifizierten Produktes
gleich M(EC). Wobei es sich bei M um die
Menge der anvisierten Ziel-cDNA Moleküle vor Beginn der PCR handelt
und bei C um die Anzahl der durchgeführten PCR-Zyklen. E ist die
Effizienz eines Amplifikationsfaktors. Dieser Faktor ist komplex
und variiert zwischen 1 und 2. Die wichtige Überlegung in diesem Assay ist,
dass E über
den größten Bereich
der PCR Amplifikation annähernd
konstant und annähernd
gleich 2 bleibt. In PCR Reaktionen, die in allen Bereichen gleich
sind, mit der Ausnahme, dass die als Matrizen verwendeten cDNAs
von unterschiedlichen Gesamtzellulären-RNAs stammen, wird E in
jeder Reaktion den gleichen Wert haben. Besitzt die vorgegebene cDNA
eine Anfangsmenge von M1 in der einen PCR
Reaktion und eine Menge M2 in einer anderen
PCR Reaktion und wenn E den gleichen Wert in jeder der Reaktionen
hat, dann beträgt
nach C PCR-Zyklen die Menge des in der ersten Reaktion amplifizierten
Zielmoleküls
M1 (EC) und die
Masse des in der zweiten Reaktion amplifizierten Zielmoleküls M2 (EC). Das Verhältnis dieser
beiden Mengen wird durch die PCR Reaktion nicht verändert. Es
beträgt
M1/M2 = [M1 (EC)/M2 (EC)]. Demzufolge kommt es zu einer Erhaltung
der relativen Proportionalität
der amplifizierten Produkte während
der PCR.
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Da
sowohl die reverse Transkription als auch die PCR derart durchgeführt werden
können, dass
die Proportionalität
erhalten bleibt, ist es möglich,
die relative Häufigkeit
einer mRNA Spezies in einer oder mehreren Gesamtzellulären-RNA
Populationen, durch zunächst
Konvertierung der RNA in eine cDNA und anschließend einer Amplifizierung eines
von der spezifischen mRNA erhaltenen cDNA Fragmentes durch PCR, zu
vergleichen. Das Verhältnis
der amplifizierten Mengen der Ziel-cDNAs dem Verhältnis der
mRNAs in den originalen Gesamtzellulären-RNA Populationen sehr nahe
oder identisch.
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Die
sechs bedeutendsten Herausforderungen und Hürden die zu überwinden,
um RT-PCR am besten für
die Quantifizierung der relativen Häufigkeit der RNA einzusetzen,
sind:
- 1.) Die Degradierung der RNA während der
Präparation
muss minimal gehalten werden.
- 2.) Genomische DNA muss entfernt werden.
- 3.) Die RNA muss frei von Kontaminationen sein, die möglicherweise
die reverse Transkription beeinflussen.
- 4.) Die Effizienz der RT ist variable. Die cDNAs, nicht die
RNA, müssen
auf gleiche Mengen amplifizierbarer cDNA normalisiert werden.
- 5.) Ein eingeschränkter
linearer Bereich erfordert mehrfache Sammelpunkte in jeder Amplifikationskurve.
- 6.) Es besteht eine Röhrchen-zu-Röhrchen-Variabilität in der
PCR.
-
Die
Entwicklung von Techniken zur Überwindung
dieser Hürden
war erforderlich, um eine sensitive und genaue Methode für die RT-PCR
zu Verfügung
zu stellen, die auf jeden Gewebetyp oder physiologischen Status
angewendet werden kann.
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Die
ersten drei Hürden
für eine
erfolgreiche RT-PCR beziehen sich alle auf die Qualität der in
diesem Assay verwendeten RNA. Die in diesem Abschnitt beschriebenen
Protokolle befassen sich mit den ersten beiden Hürden, wie sie im letzen Abschnitt
beschrieben wurden. Dies sind die Erfordernisse, dass eine Degradierung
der RNA während
der Präparation
minimal sein muss und dass genomische DNA aus der RNA entfernt werden
muss.
-
Zwei
bevorzugte Methoden für
die RNA Isolierung sind die Guanidinium Thiocyanat Methode und Kits für die RNA
Isolierung, die von Qiagen (Chatworth, CA) hergestellt werden, wobei
die Kits der Einfachheit halber am meisten bevorzugt werden. Vier
Protokolle werden mit der RNA, die nach einer der beiden Methoden (oder
einer beliebigen Methode) isoliert wurde, durchgeführt, bevor
die RNA in der RT-PCR eingesetzt wird.
-
Das
erste dieser vier Protokolle ist der Verdau der RNAs mit DNase I,
um die genomische DNA zu entfernen, die zusammen mit der Gesamtzellulären-RNA
isoliert wurde. Vor dem DNase I-Verdau ist die RNA teilweise in
Suspension mit 70% Ethanol. Ungefähr 50 μg der RNA (bestimmt durch OD260/280) wird der Suspension entnommen und
präzipitiert.
Diese RNA wird in DEPC-behandeltem sterilem Wasser resuspendiert.
Dazu werden 10×DNase
I-Puffer (200 mM Tris-HCl; pH 8.4; 20 mM MgCl2,
500 mM KCl), 10 Einheiten RNase-Inhibitor (GIBCO-BRL Cat #15518-012)
und 20 Einheiten DNase I (GIBO-BRL Cat #18068-015) gegeben. Das
Volumen wird durch zusätzliches
DEPC-behandeltes Wasser auf 50 ml angepasst. Die Reaktion wird bei
37° C für 30 Minuten
inkubiert. Nach dem DNase I-Verdau werden die RNAs mit den organischen
Lösungsmitteln
Phenol und Chloroform extrahiert gefolgt von einer Präzipitation
mit Ethanol. Dies stellt die zweite Ethanolpräzipitation der isolierten RNA
dar. Empirische Beobachtungen weisen darauf hin, dass diese wiederholte
Präzipitation
die Leistung der RNA in der nachfolgenden RT-Reaktion verbessert. Die Reaktion wird
für 30
min bei 37°C inkubiert.
-
Nach
dem DNase I-Verdau wird eine Teilmenge der RNA-Suspension in Alkohol
entnommen und in drei Teile geteilt. Unterschiedliche Verfahren
werden für
jede der Drittelmengen angewandt.
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Diese
drei Verfahren sind: (1). Eine OD260/280 -Messung
wird nach Standardprotokoll durchgeführt und wird verwendet, um
die Menge der RNA abzuschätzen
und deren voraussichtliche Qualität. (2). Eine Teilmenge wird
auf ein Agarosegel ausgebracht und die RNA wird mit Ethidiumbromid
angefärbt.
Die Beobachtung, dass sowohl die 28S als auch die 18S RNAs als diskrete
Banden zu sehen sind und dass es einen kleine Markierung oberhalb
des Punktes an dem die 28S rRNA läuft, gibt, weist darauf hin,
dass die RNA weitgehend intakt ist. Während es nicht kritisch für den Verlauf
des Assays ist, dass die zu untersuchenden RNAs völlig frei von
partiellen Degradierungen sind, ist es wichtig festzustellen, dass
die RNA nicht so weit degradiert ist, als dass sie eine erhebliche Auswirkung
auf das Aussehen der 28S rRNA hat. (3). Die Gesamtzellulären-RNAs werden
einem auf PCR basierenden Test unterzogen, der bestätigt, dass
die Behandlung mit DNase I die kontaminierende genomische DNA tatsächlich vollständig verdaut
hat. Es ist sehr wichtig den vollständigen Verdau der genomischen
DANN zu bestätigen,
da die genomische DNA in PCR-Reaktionen als Matrize agieren kann
und so zu falsch-positiven Signalen in dem unten beschriebenen relativen
quantitativen RT-PCR Assay führt.
Der Assay für
die kontaminierende genomische DNA verwendet genspezifische Oligonukleotide,
die ein 145 Nukleotide langes Intron (Intron #3) im Gen das für das Prostataspezifische
Antigen (PSA) kodiert, flankieren. Dies ist ein Einzelkopie-Gen
ohne Pseudogene. Es ist ein Mitglied der Kallikrein-Genfamilie von
Serinproteasen, aber die in diesem Assay verwendeten Oligonukleotide
sind spezifisch für
PSA. Die Sequenzen dieser Oligonukleotide lauten:
5'CGCCTCAGGCTGGOGCAGCATT
3' (SEQ ID Nr.:
79)
und
5'ACAGTGGAAGAGTCTCATTCGAGAT
3' (SEQ ID Nr.:
SO).
-
In
den Assay für
die kontaminierende genomische DNA, werden 500 ng bis 1.0 μg der jeweils
mit DNase I behandelten RNAs als Matrizen in einer Standard-PCR
(35-40 Zyklen, bei Bedingungen wie sie unten beschrieben sind) eingesetzt,
in der die oben beschriebenen Oligonukletiode als Primer verwendet
werden. Humane genomische DNA wird als geeignete Positivkontrolle
eingesetzt. Diese DNA kann von einem kommerziellen Händler erworben
werden. Ein positives Signal in diesem Assay ist die Amplifikation
eines 242 Nukleotide langen, für
genomische DNA spezifischen, PCR Produktes aus der untersuchten
RNA Probe und auf einem Ethidiumbromid gefärbten Elektrophoresegel sichtbar
gemacht. Wie in dem Assay angedeutet, sollte es keinen Hinweis auf
genomische DNA in den für
den unten beschriebenen RT-PCR Assay verwendeten RNAs geben. Ein
Nachweis von kontaminierender genomischer DNA führte zu einem erneuten Verdau
der RNA mit DNase I und einer neuen Bewertung der mit DNase I behandelten
RNA durch Bestimmung des OD260/280 Verhältnisses, der
Beurteilung auf einem Eletrophoresegel und einem erneuten Test auf
Kontamination mit genomischer DNA unter Verwendung des beschriebenen
PCR Assay.
-
Die
Standardbedingungen für
eine PCR (wie im letzten Paragraph erwähnt) sind:
1 × GIBCO-BRL
PCR Reaktions-Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl]
1.5
mM MgCl2
200 μM von jedem der vier dNTPs
200
nM von jedem Oligonukleotide Primer
Matrize in angemessener
Konzentration
2.5 Einheiten der Taq Polymerase pro 100 μl Reaktionsvolumen.
-
Unter
Verwendung dieser Bedingungen werden 35-40 Zyklen der PCR durchgeführt, mit:
94° C für 45 Sec
55°-60° C für 45 Sec
72° C für 1:00 Minute.
-
Die
im oberen Abschnitt beschriebenen Protokolle erlauben die Isolierung
von Gesamtzellulärer-RNA die
zwei der sechs Hürden
für eine
erfolgreiche RT-PCR überwindet,
das heißt,
die RNA ist in akzeptabler Weise intakt und frei von kontaminierender
genomischer DNA.
-
Die
reverse Transkriptasen, auch als RNA abhängige DNA Polymerase bezeichnet,
wie sie gegenwärtig
in molekularbiologischen Protokollen verwendet werden, sind bekanntermaßen weniger
prozessiv als andere allgemein verwendete Nukleinsäure-Polymerasen. Es wurde
beobachtet, dass nicht nur die Effizienz der Konvertierung von RNA
in cDNA verhältnismäßig ineffizient
ist, sondern auch eine Schwankung um das Mehrfache in der Effizienz
der cDNA-Synthese unter Reaktionen auftritt, die RNAs als Matrizen
verwenden, die ansonsten nicht voneinander zu unterscheiden sind.
-
Die
ansonsten nicht unterscheidbar erscheinen. Die Ursachen für diese
Variation sind nicht gut charakterisiert, aber empirisch gesehen
wurde beobachtet, dass sich die Effizienz mancher reverser Transkriptionsreaktionen
(RT) durch wiederholte organische Extraktionen und Ethanolpräzipitationen
verbessern kann. Das deutet darauf hin, dass ein Teil der Schwankung
in der RT durch Kontaminationen in den RNA Matrizen auftritt. In diesem
Fall kann die oben beschriebene Behandlung mit DNase I die Effizienz
der RT unterstützen, wenn
die RNA einem weiteren Zyklus der Extraktion mit Phenol und Chloroform,
sowie einer Präzipitation
mit Ethanol unterworfen wird.
-
Eine
Kontamination der RNA-Matrize mit Inhibitoren für die RT ist eine wichtige
Hürde für eine erfolgreiche
RT, die teilweise bewältigt
werden kann, indem die RNA sorgfältig
präpariert
und wiederholt organisch extrahiert und mit Ethanol präzipitiert
wird.
-
Die
reversen Transkriptionsreaktionen werden unter Verwendung des von
GIBCO-BRL LifeTechnologies (Gaithersburg, MD) hergestellten SuperscriptTM Preamplification System for First Strand
cDNA Synthese K durchgeführt
Bei SuperscriptTM handelt es sich um die
klonierte Form einer M-MLV reversen Transkriptase, deren Rnase H
Aktivität
entfernt wurde, um die Prozessivität zu erhöhen. In dem vorliegenden Beispiel
wurden die veröffentlichten
Protokolle des Herstellers für
die Synthese cDNA, mit willkürlichen
Hexameren geprimt, verwendet. Die cDNA Synthese kann auch mit einer
Mischung aus willkürlichen
Hexameren (oder anderen kleinen Oligonukletioden mit zufälliger Sequenz)
und Oligo dT geprimt werden. Die Zugabe von Oligo dT erhöht die Effizienz
der Konvertierung von RNA in cDNA nahe am Poly-A-Schwanz gelegen.
Als Matrize werden 5 oder 10 Mikrogramm RNA verwendet (abhängig von
der Verfügbarkeit).
Nachdem die RT-Reaktion gemäß dem Protokoll,
das von GIBCO-BRL angeboten wird, fertig ist, wird die RT-Reaktion
mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 μl verdünnt.
-
Auch
mit der am besten präparierten
RNA und am stärkten
prozessiven Enzym kann es zu signifikanten Schwankungen in der Effizienz
der RT kommen. Diese Schwankung wäre ausreichend groß, damit
die cDNA, die in unterschiedlichen RTs hergestellt wurde, nicht
verlässlich
miteinander verglichen werden kann. Um diese mögliche Schwankung zu überwinden,
können
cDNA Populationen, die in unterschiedlichen RT-Reaktionen hergestellt
wurden, dahingehend normalisiert werden, dass sie gleiche Mengen
an amplifizierbarer cDNA enthalten, die aus mRNAs synthetisiert
wurde, von denen bekannt ist, dass sie in den physiologischen Stadien die
untersucht werden, nicht variieren. In den vorliegenden Beispielen
wurden die cDNAs, die aus den Gesamtzellulären-RNAs hergestellt wurden,
auf gleiche Konzentrationen an amplifizierbarer β-Actin cDNA, bereinigt.
-
Ein μl von jeder
verdünnten
RT-Reaktion wurde einer PCR mit β-Actin-
spezifischen Olignukleotid-Primern unterworfen. Die Primer sind
so gestaltet, dass sie Introns überschreiten,
was die Unterscheidung zwischen cDNA und genomischer DNA erlaubt.
-
Diese β-Actin-spezifischen
Oligonukleotide haben die folgende Sequenz:
5' CGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATC
3' (SEQ ID Nr.:
81)
und
5' GAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAG
3' (SEQ ID Nr.:
82)
-
Die
PCR wird unter Standardbedingungen, wie vorher beschrieben, mit
entweder 19 oder 20 Zyklen durchgeführt. Das erhaltene PCR-Produkt
hat eine Länge
von 415 Nukleotiden. Das Produkt wird mit PCR unter Verwendung von
Agarose-Gelelekrophorese und einer nachfolgenden Ethidiumbromid-Färbung untersucht.
Das amplifizierte cDNA-Fragment wird dann durch Anstrahlen mit UV-Licht
auf einem Transilluminator sichtbar gemacht. Ein Weisslicht-Bild
des angestrahlten Gels wird mit einem IS-1000 Digital Imaging System, hergestellt
von Alpha Innotech Corporation, festgehalten. Das festgehaltene
Bild wird mit der vom Hersteller zu Verfügung gestellten Software, entweder
Version 2.0 oder 2.01, ausgewertet, um die relativen Mengen der amplifizierten β-Actin cDNA
in jeder RT-Reaktion
zu bestimmen.
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Um
die verschiedenen cDNAs zu normalisieren, wird den am meisten konzentrierten
cDNAs Wasser zugegeben, wie es mit dem im vorangegangenen Paragraphen
beschriebenen Assay bestimmt wurde. Eine PCR wird mit 1 μl der neu
verdünnten
und angepassten cDNA unter Verwendung der β-Actin Oligonukleotide als Primer,
wiederholt. Die Anzahl der PCR-Zyklen muss auf 21 oder 22 Zyklen
erhöht
werden, um die verminderte Konzentration der neu verdünnten cDNAs
auszugleichen. Mit dieser empirischen Methode, können die cDNAs durch Verdünnung so
angepasst werden, dass sie in etwa gleiche Mengen an amplifizierbarer
cDNA enthalten. Gelegentlich muss dieser Prozess wiederholt werden,
um annehmbare abschließende
Normalisierung zu erhalten. Durch das Teilen der mittleren optischen
Dichte aller beobachteter Banden durch die einer bestimmten Bande,
kann eine Normalisierungsstatistik erstellt werden, die noch genauere Vergleiche
der relativen Häufigkeit
von RNAs, die in dem normalisierten Panel von cDNAs untersucht werden,
erlaubt. Ein repräsentatives
Gel ist in 12 gezeigt. Eine Auswertung
der Daten ist in Tabelle 4 gezeigt.
-
Sobald
die Normalisierungsstatistiken erhalten werden, kann die PCR mit
verschiedenen genspezifischen Oligonukleotiden als Primer durchgeführt werden,
um die relative Häufigkeit
von anderen mRNAs, wie sie als cDNAs in dem normalisierten Panel
von verdünnten
RT-Reaktionen repräsentiert
werden, zu ermitteln. In 13 sind
die Daten von PCR-Produkten gezeigt, die von denselben RT-PCR Reaktionen
amplifiziert wurden, wie sie in 12 beschrieben
sind. In dieser Studie wird die Häufigkeit von zuvor nicht beschriebenen mRNA
Spezies gezeigt. Aus früheren
Untersuchungen ist bekannt, dass diese mRNA in normaler Prostata oder
Drüsen
mit BPH nicht maßgeblich
exprimiert wird. Es ist aus diesen Daten klar ersichtlich, dass
dieses bislang nicht beschriebene Gen, genannt UC42 (SEQ ID Nr.:
18), weder in der durchschnittlichen normalen Prostata noch in Drüsen mit
BPH maßgeblich
exprimiert wird. Zwischen den untersuchten Tumoren, zeigten die
meisten eine sehr starke Expression von UC42. Das cDNA-Fragment
von UC42 ist kein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Intensitäten der
Banden, die durch die PCR-Amplifikation der UC42 cDNA erhalten wurden,
sind dann mit dem IS 1000 image analysis System gemessen worden.
Die Daten sind in Tabelle 4 gezeigt. Die relative Intensität der UC42-Banden
wurde dann durch Multiplikation der Intensitätsmengen mit der erhaltenen
Normailisierungsstatistik auf die β-Actin Expression normalisiert,
wie in Tabelle 4 gezeigt. Diese normalisierten Werte repräsentieren
die relative Häufigkeit
von UC42 mRNA in den überprüften Geweben.
Die erhaltenen, normalisierten Werte sind in 13 graphisch
dargestellt.
-
UC42
ist ein Beispiel für
differentielle Expression mit einem hohen Mass an Induktion in den
meisten Prostatakarzinomen, relative zu normalen Prostatas und solchen
mit BPH. Die meisten mRNA Spezies sind nicht so differnziert exprimiert
wie UC42. Ein Beispiel dafür
ist die mRNA, die für
den Transmembran-Tyrosinkinase-Rezeptor Hek kodiert, die in BPH
im Vergleich zu normalen Prostatas deutlich nach oben reguliert
ist.
-
In
einer Untersuchung der relativen Häufigkeitsgrade von Hek mRNA,
die nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, wurden die normalen
und die Tumorproben zusammengefasst untersucht. Niedrige Expressionsgrade
wurden im Pool der normalen Prostatagewebe beobachtet, verglichen
mit denen die in BPH beobachtet wurden.
-
Durch
die Normalisierung dieser Werte auf den β-Actin Standard mit Hilfe der
Normalisierungsstatistiken ist es möglich, die Unterschiede in
der relativen Häufigkeit
von Hek mRNA zu quantifizieren. Diese normalisierten Daten sind
in dem in 14 gezeigten Balkendiagramm
graphisch dargestellt. Ähnlich
zu den Beobachtungen die für
UC42 gemacht wurden, zeigen die meisten, aber nicht alle der BPH-Proben,
verglichen mit einem Pool an normalen Prostatas, eine erhöhte Häufigkeit
von Hek mRNA. Im Durchschnitt war die Häufigkeit der beobachteten Hek
mRNA in den BPH-Proben um das 2.9 fache höher als in einer durchschnittlichen
normalen Prostata, die durch einen Pool von normalen Drüsen vertreten
war.
-
Während diese
Beobachtungen mit vielen ähnlichen
Studien, die eine Hek-Expression unter Verwendung von anderen Gewebeproben
und cDNAs untersucht haben, übereinstimmen,
weichen sie von den Beobachtungen, die im nächsten Abschnitt beschrieben
sind, ab. Dabei wird ein RT-PCR Assay diskutiert, der zusammengefasste
cDNAs verwendet und dem es eher möglich ist, Daten aus dem linearen
Anteil der Amplifikationskurven von PCR-Reaktionen, zu erfassen.
Es war ziemlich offensichtlich von den Daten, die in der Hek-Studie
erhalten wurden, dass sich zumindest einige der RT-PCR Reaktionen zum
Zeitpunkt der Datenerfassung nicht im linearen Abschnitt ihrer Amplifikationskurven
befanden. Dies wurde aus der Beobachtung geschlossen, dass die Intensität der Banden
der BPH9 von der bei 35 Zyklen entnommenen Probe bis zur Probenentnahme
nach 40 Zyklen etwas abnahm. In geringfügigerem Ausmaß traf dies
auch auf andere Proben zu. Dies ist ein starker Hinweis darauf,
dass die PCR den linearen Abschnitt der Amplifikationskurven verlassen
hatte. Während
diese Beobachtung den qualitativen Wert dieses Experiments einschränkt, wird
das Vermögen
dieses Assays die qualitativen Unterschiede in der mRNA Häufigkeit
zu bestimmen, nicht notwendigerweise eingeschränkt. Der durch Beobachtung
der PCRs nach dem linearen Abschnitt der PCR hervorgerufene Fehler,
geht in die Richtung, die Unterschiede in der mRNA Häufigkeit
zu unterschätzen.
Es ist immer noch zulässig
zu folgern, dass Hek in vielen Prostatadrüsen mit BPH nach oben reguliert
ist, auch wenn die absolute Zunahme in der Häufigkeit nicht bestimmt werden
kann. Durch das Betrachten von Personen ist es möglich Fragen zu untersuchen,
welcher Anteil von Personen in einer bestimmten physiologischen
Klasse, z.B. Personen mit BPH, auf ähnliche Weise die untersuchte
mRNA regulieren. Um die quantitativen Unterschiede in der mRNA Expression
zu bestimmen, ist es erforderlich, dass die Daten im linearen Anteil
der entsprechenden PCR-Amplifikationskurve gesammelt werden. Dieser
Anforderung wird das in folgenden Parapraphen beschriebene Assay
gerecht.
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Die
beiden letzen Hürden
für eine
RT-PCR werden in den folgenden Abschnitten, unter Einbezug der Verwendung
von cDNA-Pools als Matrizen für
die RT-PCR, behandelt. In der Praxis werden üblicherweise die Protokolle,
die zusammengefasste Matrizen verwenden, vor dem oben beschriebenen
Protokoll durchgeführt.
-
Es
gibt zwei zusätzliche
Hürden
für die
relative mRNA Quantifizierung durch RT-PCR, die eine Interpretation
von Ergebnissen, die mit dieser Methode erzielt wurden, regelmäßig beeinträchtigt.
Die erste erfordert die Quantifizierung der Amplifikationsprodukte
während
sich die PCR noch in dem linearen Abschnitt des Zyklus befindet,
in dem sich „E" wie eine Konstante
verhält
und annähernd
gleich zwei ist. Im linearen Abschnitt der Amplifikationskurve ist
der Logarithmus der Menge des amplifizierten Produktes direkt proportional
zur Anzahl der Zyklen. Am Ende des PCR-Zyklus ist „E" nicht konstant.
Später
in der PCR nimmt „E" mit jedem zusätzlichen
Zyklus ab, bis es durch zusätzliche
Zyklen zu keiner weiteren Zunahme der Menge an PCR-Produkt mehr
kommt. Der wichtigste Grund für
die Abnahme der Effizienz bei hohen PCR-Zykluszahlen kann sein, dass
die Konzentration der PCR-Produkte hoch genug wird, so dass sich
zwei Stränge
des Produktes mit einer höheren
Effizienz aneinander lagern, als die mit der sich die Oligonukleotid-Primer
an die einzelnen Produktstränge
anlagern. Diese Konkurrenz unter den PCR-Produktsträngen führt zu einer
Abnahme der Effizienz einer PCR. Der Teil einer PCR, bei dem die
Effizienz der Amplifikation abnimmt, wird als „Plateau"-Phase der Amplifikationskurve bezeichnet.
Wenn „E" aufhört sich
wie eine Konstante zu verhalten und sich die PCR in Richtung der
Plateau-Phase bewegt, dann geht die Konservierung der relativen
Proportionalität
während
der PCR amplifizierter Produkte verloren. Diese verursacht einen
Fehler in der Abschätzung
der Unterschiede einer relativen Häufigkeit von mRNA Spezies,
wie sie in unterschiedlichen Gesamtzellulären-RNAs vorkommen. Der Fehler
geht immer in die gleiche Richtung, in dem er Unterschiede in der
relativen mRNA Häufigkeit
als geringer erscheinen lässt,
als sie tatsächlich
sind. In extremen Fällen,
wenn alle PCRs die Plateau-Phase erreicht haben, wird dieser Effekt
differentiell exprimierte mRNAs so erscheinen lassen, als wären sie überhaupt nicht
differentiell exprimiert.
-
Um
diese Art von Fehler zu kontrollieren, ist es wichtig, dass die
PCR-Produkte im linearen Bereich der Amplifikationskurve quantifiziert
werden. Dies ist technisch schwierig durchzuführen, da die gegenwärtig verwendeten
Hilfsmittel zur DNA-Quantifizierung
nur dann empfindlich genug für
die Quantifizierung von PCR-Produkten sind, wenn sie sich Konzentrationen
annähern,
bei denen die PCR-Produkte anfangen, mit den Primern bei der Anlagerung
zu konkurrieren. Das bedeutet, die PCR-Produkte können nur
am äußersten Ende
des linearen Bereichs der Amplifikationskurve erfasst werden. Vorherzusagen,
bei welcher Zyklusnummer die PCR-Produkte quantifiziert werden sollen,
ist technisch schwierig.
-
Für die Praxis
bedeutet das, es ist erforderlich Proben der PCR-Produkte zu verschiedenen
Zykluszahlen zu entnehmen, von denen angenommen wird, dass sie sich über den
idealen Nachweisbereich erstrecken, in dem die Produkte häufig genug
vorkommen um nachgewiesen zu werden, aber sich immer noch im linearen
Bereich der Amplifikationskurve befinden. Es ist unpraktisch dies
in einer Studie mit einer großen
Anzahl an Proben durchzuführen,
da die Zahl der verschiedenen PCR-Reaktionen und/oder Anzahl der
verschiedenen Elektrophoresegele die zu fahren sind, verbietend
umfangreich wird.
-
Um
diese Einschränkungen
zu überwinden,
wurde ein zwei-stufiger Ansatz entwickelt, um die Häufigkeit
der mRNA unter Verwendung von RT-PCR relativ zu quantifizieren.
In der ersten Stufe werden cDNA-Pools untersucht, die durch das
Vereinen gleicher Mengen an normalisierter cDNA hergestellt wurden,
um festzustellen, wie die mRNA Häufigkeit
in Personen mit einem bestimmten physiologischen Status variiert. Dies
vermindert die Anzahl der zu vergleichenden Proben auf eine sehr
geringe Anzahl, etwa zwei bis vier. In den hierin beschriebenen
Studien werden drei Pools untersucht Diese Pools stamme von normalen
Prostatas, solchen mit BPH und einer Reihe von Prostatatumoren.
Jeder der Pools kann eine große
Anzahl an Personen enthalten. Obwohl dieser Ansatz nicht Abweichungen
zwischen Personen unterscheidet, ist er leicht in der Lage, breite
Muster an differentieller Expression zu erkennen. Der große Vorteil
einer Untersuchung von zusammengefasster cDNA ist, dass sie das
gleichzeitige Ansetzen von vielen doppelten PCR-Reaktionen erlaubt.
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Die
einzelnen Duplikate können
bei unterschiedlichen Zykluszahlen der PCR geerntet und untersucht werden.
In den nachfolgend beschriebenen Studien wurde vier PCR-Reaktionen
in Duplikaten angesetzt. Ein Duplikat wurde bei 31, 34, 37 und 40
PCR-Zyklen gesammelt. Gelegentlich wurden PCR-Reaktionen auch bei 28
Zyklen gesammelt. Die Untersuchung der PCRs bei verschiedenen Zyklusnummern,
ergab die folgenden Vorteile. Es ist sehr wahrscheinlich, dass sich
wenigstens eine der RT-PCRs im idealen Bereich der Amplifikationskurve
befindet, um verlässlich
mRNA Häufigkeiten
zu vergleichen. Außerdem
ist die optimale Anzahl an Zyklen bekannt, so dass Studien mit einer
vielen umfangreicheren Probengröße , wie
etwa die oben beschriebenen Studien mit UC42 und Hek, mit einer
höheren
Wahrscheinlichkeit gelingen. Dies ist die zweite Stufe eines zweistufigen
Ansatzes, der durchgeführt
wurde, um unter Verwendung von RT-PCR die Häufigkeitsgrade von mRNA relativ
zu quantifizieren. Die Durchführung
der RT-PCR mit zusammengefassten Proben erlaubt eine deutlich effizientere
Anwendung der RT-PCR vergleichen zu den Proben von Einzelpersonen.
-
Ein
weiterer Vorteil, auch unten beschrieben, ist, dass die Schwankung
von Röhrchen
zu Röhrchen
in der PCR vernachlässigt
und kontrolliert werden kann, da die meisten Studien durch die Duplikate
mehrere Datenpunkte liefern.
-
Ähnlich wie
das vorher beschriebene Protokoll, das Einzelpersonen einschließt, ist
der erste Schritt in diesem Protokoll die Normalisierung der zusammengefassten
Proben, dass sie gleiche Mengen an amplifizierbarer cDNA enthalten.
Dies wird mit Oligonukleotiden gemacht, die eine Amplifikation von β-Actin steuern.
In diesem Beispiel wird die PCR-Amplifikation
eines cDNA-Fragmentes, das aus der β-Actin cDNA von Pools aus normaler
Prostata, Drüsen
mit BPH und Prostatakarzinomen erhalten wurde, durchgeführt. Diese
Studie wurde mit vier identischen PCR-Reaktion angesetzt. Die Produkte
dieser PCRs wurden nach 22, 25, 28 und 31 PCR-Zyklen gesammelt und
elektrophoretisch aufgetrennt. Die Quantifizierung der Banden mit
dem IS 1000 System ergab, dass sich die PCRs bei 22, 25 und 28 Zyklen
immer noch im linearen Bereich ihrer Amplifikationskurve befanden,
aber dass sie die Linearität
bei 31 Zyklen verlassen hatten. Das weiß man deshalb, da die Verhältnisse
der Bandenintensitäten
für die
Daten aus den Zyklen 22, 25 und 28 konstant und intern gleich bleibend
sind, sich aber die Verhältnisse
bei 31 Zyklen verzerren. Diese Quantifizierung erlaubt auch die
Ableitung von Normalisierungsstatistiken für diese drei Pools relativ
zueinander, in genau der gleichen Art und Weise, wie es zuvor für Einzelpersonen
gemacht wurde (Tabelle 4).
-
Diese
Studie wird dann unter Verwendung von spezifischen Primern für ein Gen,
anders als β-Actin, wiederholt.
Aus Zwecken des Vergleiches, waren die untersuchten mRNAs die gleichen
wie zuvor gezeigt, UC42 und Hek, von denen keine Teil der vorliegenden
Erfindung ist. Wie es zuvor für
die Proben von den Einzelpersonen durchgeführt wurde, sind die Intensitäten der
entsprechenden Banden mit einem IS 1000 quantifiziert und auf die β-Actin Signale
normalisiert worden. Wie durch die PCR gezeigt, wird UC42 häufig in
Prostatatumoren exprimiert. Dieses Fragment erreichte sogar nach
31 PCR-Zyklen die stationäre
Phase. UC42 ist deshalb in normalen Prostatas und solchen mit BPH
nahezu transkriptionell stumm, wird aber häufig „eingeschaltet" in vielen Prostatatumoren.
Dies wird durch ein fehlendes Signal einer UC42 mRNA, sowohl im
normalen Gewebe als auch BPH, zu jeder Zykluszahl bis hoch zu 40,
gezeigt. UC42 ist im Prostatatumor deutlich differentiell exprimiert
und damit ein glaubhafter Kandidat als informativer Biomarker für diese
Erkrankung.
-
Für Hek verdienen
diese Daten mehr Deutung. Obwohl das von Hek abgeleitete PCR-Produkt nach 34 PCR-Zyklen
zu beobachten war, war das Hek PCR-Produkt nicht annähernd so
häufig
wie UC42. Bei 40 Zyklen war das von Hek abgeleitete PCR-Produkt
in den PCRs, die entweder zusammengefasste BPH-Proben oder Prostatatumor-Proben
als Matrizen enthielten. Die Hek Bande die aus einem Pool von normalen
Prostatas stammt, ist kaum wahrnehmbar. Es ist klar, dass Hek häufiger in
BPH und Prostatatumoren als in normalen Drüsen exprimiert wird. Die zuvor
beschriebene Quantifizierung und Normalisierung dieser Daten wurde durchgeführt und
ist in dem Balkendiagramm in 15 gezeigt.
-
Die
zentrale Frage die es bei der Auswertung der Daten zu beantworten
galt, war, ob die PCRs im linearen Abschnitt ihrer Amplifikationskurven
unersucht wurden. Ein Test dafür
kann durch die Festestellung, ob sich die Proportionalität der PCR-Produkte
mit dem Anstieg der Zykluszahlen der PCR erhalten geblieben ist, entwickelt
werden. Bei 34 Zyklen wird das Hek Produkt mit 5.77 und 4.375 relativen
Häufigkeitseinheiten
entsprechend der zusammengefassten BPH-Proben und Tumorproben, wie
in 15 gezeigt ist, wahrgenommen. Das Verhältnis dieser
Werte beträgt
1.32. Vergleichbar betragen die Werte für BPH und Tumor bei 37 Zyklen
23.1 und 17.5. Das Verhältnis
dieser Werte beträgt
ebenfalls 1.32. Das ist ein starker Hinweis darauf, dass sich die
PCRs im linearen Abschnitt ihrer Amplifikationskurven befanden,
als diese Beobachtungen gemacht wurden (Dies ist eine bessere Erhaltung
der Proportionalität
als häufig
beobachtet. In einigen Studien wurden Daten ausgenommen, wenn die
Verhältnisse ähnlich;
aber nicht gleich waren). Diese Erhaltung der Proportionalität geht bei
40 Zyklen verloren. Das Verhältnis
der BPH und Tumorwerte war auf 1.85 angestiegen. Dies deutet darauf,
dass sich die PCRs der Plateauphase ihrer Amplifikationsphase nähern. Ein
weiterer Beweis, dass sich die Plateauphase nähert, kann direkt im relativen
Anstieg der in diesen Studien beobachteten numerischen Daten, festgestellt
werden. Von Zyklus 34 bis 37 der PCR nimmt die Menge der beobachteten PCR-Produkte
in den BPH- und den Tumorreaktionen um das 4 fache zu. Ähnliche
Berechnungen des Anstiegs der Signale zwischen dem 37. Und dem 40.
Zyklus zeigen einen 3.1 fachen Anstieg in den BPH-Reaktionen und
nur einen 2.2 fachen Anstieg für
die Tumorreaktionen. In beiden Fällen
nimmt „E" ab und die Reaktionen
nähern
sich ihrer Plateauphase.
-
Für Reaktionen
die versuchten Hek cDNA aus einem Pool von normalen Prostatas zu
amplifizieren, konnte erst nach 40 Zyklen eine Bande beobachtet
werden. Da die BPH- und
Tumorreaktionen ihre lineare Phase verlassen hatten, war eine direkte
numerische Quantifizierung des Anstiegs der Häufigkeit zwischen normal, BPH
und Tumor nicht möglich.
Es ist jedoch zulässig
zu folgern, dass Hek mRNA in Proben, die von BPH oder Prostatatumoren
stammen, häufiger
vorkommt als in normalen Prostatadrüsen. Es kann auch zutreffen,
dass Hek in einer durchschnittlichen BPH-Probe häufiger vorkommt, als in einen
durchschnittlichen Prostatatumor. Dies wurde in vielen Studien,
einschließlich
der hier gezeigten, beobachtet, jedoch ist der Unterschied in der
relativen Expression von Hek zwischen BPH und Prostatatumoren wie
auch hier gezeigt, immer gering. Es ist möglich, dass der höhere Expressionsgrad
im Tumorpool relativ zu den normalen Prostatas durch eine Kontamination
der Tumorproben mit BPH-Gewebe verursacht wird. Alternativ kann
es auch durch eine höhere
Hek-Expression in den Tumoren selbst sein. Eine Untersuchung von
Gewebe durch in situ Hybridisierung oder immunhistochemische Methoden
kann erforderlich sein, um zwischen diesen beiden Möglichkeiten
zu unterscheiden.
-
Die
letzte große
Hürde für die Quantifizierung
relativer mRNA Häufigkeit
durch RT-PCR ist die Schwankung von Röhrchen zu Röhrchen in der PCR. Das kann
sich aus vielen Faktoren ergeben, einschließlich ungleicher Erhitzung
und Abkühlung
im Thermocycler, Mängel
der PCR-Röhrchen
und Bedienungsfehler. Um die Quelle für diese Schwankung zu kontrollieren,
wurde das digitale Thermoelement Modell #8402-00 von Cole-Parmer
eingesetzt, um die in diesen Studien eingesetzten Thermocycler zu
kalibrieren. Es wurden nur geringfügige Schwankungen in der Temperatur
beobachtet.
-
Um
drastisch zu zeigen, dass eine Röhrchen
zu Röhrchen
Schwankung in den oben beschriebenen Studien kein Faktor ist, wurden
24 doppelte PCRs für β-Actin unter
Verwendung der gleichen cDNA als Matrize durchgeführt. Diese
PCR-Röhrchen
wurden über
die Oberfläche
eines Thermocyclers mit 96 Vertiefungen verteilt, einschließlich der
Ecken des Blocks, wo man vermuten könnte, dass die Temperatur von
den anderen Bereichen abweicht. Die Röhrchen wurden zu verschiedenen
Zykluszahlen eingesammelt. Neun Röhrchen wurden bei 21 Zyklen
eingesammelt. Neun Röhrchen
wurden bei 24 Zyklen eingesammelt und sechs Röhrchen wurden bei 27 Zyklen
eingesammelt. Die Quantifizierung der erhaltenen Banden mit dem
IS 1000 System bestimmte, dass der Standardfehler des Durchschnittswertes
der Häufigkeit
eines PCR Produktes ± 13%
betrug. Dies ist eine akzeptabel kleine Zahl, um als bedeutende
Ursache für
die Schwankung in einem RT-PCR Assay unberücksichtigt zu bleiben.
-
Das
RT-PCR Protokoll, das die zusammengefassten cDNAs untersucht wird
intern auf Röhrchen
zu Röhrchen
Variabilität
kontrolliert, die möglicherweise
aus einer beliebigen Quelle entsteht. Durch Untersuchung der Häufigkeit
von PCR-Produkten bei mehreren verschiedenen Zykluszahlen, kann
bestimmt werden, dass die Masse des PCR-Produktes angemessen mit
der zunehmenden Zahl an PCR-Zyklen ansteigt. Dies zeigt nicht nur,
dass die PCRs während
der linearen Phase der PCR untersucht werden, wo die Daten am verlässlichsten
sind, sondern es zeigt auch, dass jede Reaktion mit der gleichen
Matrize mit den Daten der umgebenden Zyklusnummern übereinstimmt.
Wäre das
eine ungeklärte
Ursache für
eine Schwankung, würde
die Erwartung, dass die PCR-Produktmasse angemessen mit der zunehmenden
Zahl an PCR-Zyklen ansteigt, nicht erfüllt. Dies würde darauf hinweisen, dass
die Schwankungen in den Ergebnissen Artefakte sind. Die interne
Duplizierung und Übereinstimmung
der Daten die von unterschiedlichen Zykluszahlen erhalten werden, kontrollieren
die systemabhängige
Schwankung von Röhrchen
zu Röhrchen
Ergebnissen.
-
Wie
in den vorangegangenen Paragraphen beschrieben, bewältigt das
RT-PCR Protokoll, das zusammengefasste cDNA Matrizen verwendet,
diese beiden letzen Hürden
für eine
erfolgreiche relative quantitative RT-PCR. Diese Hürden sind
die Erfordernis die PCR-Produkte
zu untersuchen, während
sich die Reaktionen in dem linearen Abschnitt ihrer Amplifikationskurven
befinden und die Erfordernis die Schwankung von Röhrchen zu
Röhrchen
in der PCR zu kontrollieren. Das beschriebene Protokoll untersucht
PCR-Produkte an
drei bis vier verschiedenen Zykluszahlen. Dies stellt sicher, dass
die PCRs in ihrem linearen Bereich quantifiziert werden und kontrolliert,
wie in dem letzen Paragraphen beschrieben wurde, die möglichen
Schwankung von Röhrchen
zu Röhrchen.
-
Eine
abschließende
Frage ist, ob es sich bei β-Actin
um einen geeigneten internen Standard für die mRNA Quantifizierung
handelt. β-Actin
wurde von vielen Forschern für
die Normalisierung von mRNA Mengen verwendet. Andere haben argumentiert,
dass β-Actin selbst differentiell
reguliert ist und deshalb als interner Normalisierungsstandard ungeeignet
ist. In den hierin beschriebenen Protokollen ist die differentielle
Regulierung von β-Actin
kein Bedenken. Mehr als fünfzig
Gene wurden mit diesen Protokollen auf differentielle Expression
untersucht. Weniger als die Hälfte
waren tatsächlich
differentiell exprimiert. Die andere Hälfte waren innerhalb eines
Standardfehlers von 13% ähnlich
wie β-Actin
reguliert. Entweder sind all diese Gene koordiniert differentiell
reguliert mit β-Actin, oder keines
von denen ist differentiell reguliert. Die Möglichkeit, dass all diese Gene
auf ähnliche
Weise und mit β-Actin
koordiniert differentiell reguliert werden, erscheint als höchst unwahrscheinlich.
Diese Möglichkeit
wurde nicht berücksichtigt.
-
β-Actin wurde
von manchen als interner Standard in PCRs kritisiert, da eine große Zahl
an β-Actin Pseudogenen
in den Genomen von Säugetieren
vorkommen. Dies ist keine Überlegung
in den beschriebenen Assays, da für alle verwendeten RNAs mit
einem sehr empfindlichen PCR-Assay gezeigt wurde, dass sie frei von
kontaminierender genomischer DNA sind. Darüber hinaus ist die Zykluszahl
der PCR, die erforderlich ist um β-Actin
cDNA in den verdünnten
RT-Reaktion aufzuspüren,
in der Regel zwischen 19 und 22 Zyklen, ausreichend niedrig, um
einen Beitrag einzuräumen,
den genomische DNA möglicherweise
bei der Häufigkeit
von amplifizierbaren β-Actin
Matrizen hat.
-
Tabelle
4: Numerische Rohdaten erfasst an einem IS1000 und Normierung durch
den Vergleich mit β-Actin
-
Beispiel 2:
-
Identifikation
von Markern für
Prostataerkrankung durch RNA Fingerprint Technik
-
Die
RNA Fingerprint Technik wurde dazu verwendet, um differentiell exprimierte
RNA Arten, die aus primären,
humanen Prostatakarzinomen oder in Kultur wachsenden humanen Prostatakarzinom
Zelllinien isoliert wurden, wie vorangehend beschrieben, zu identifizieren.
Etwa 400 Banden wurden in diesen Untersuchungen beobachtet. Eine
Reihe davon schienen differentiell exprimiert und sie wurden wie
vorangehend beschrieben kloniert.
-
Die
Slot Blot Analysen von Gesamtzellulärer-RNA die mit Riboproben
untersucht wurde, ergab, dass zehn der Klone differentiell exprimiert
wurden. Diese zehn klonierten PCR Produkte wurden für weitere
Untersuchungen ausgewählt
und UC Bande #4-2 (SEQ ID Nr.: 6), UC Bande #5-2 (A und B), UC Bande
#7-1, UC Bande #8-1, UC Bande #25 (SEQ ID Nr.: 1), UC Bande #27
(SEQ ID Nr.: 2), UC Bande #28 (SEQ ID Nr.: 3), UC Bande #31 (SEQ
ID Nr.: 4), UC Bande #32 (SEQ ID Nr.: 7) und UC Bande #33 (SEQ ID
Nr.: 5), genannt. Die vorliegende Erfindung umfasst SEQ ID Nr.:
1 und nicht die anderen Produkte.
-
Frühere Studien
wurden mit Gesamtzellulärer-RNA
durchgeführt,
die aus humanen Prostatakarzinom Zelllinien, in Zellkultur wachsend,
isoliert wurde. Die in diesen Untersuchungen identifizierten Marker
für eine Prostataerkrankung
schließen
die UC Bande #4-2, UC Bande #5-2 (A und B), UC Bande #7-1 und UC
Bande #8-1 mit ein.
-
Riboproben
aus diesen Klonen wurden als Proben gegen Northern Blots mit den
aus der Zelllinie gewonnenen Gesamtzellulären-RNAs verwendet. Die UC
Bande #8-1 war nur geringfügig
differentiell exprimiert und wurde deshalb nicht in dem nachfolgend
beschriebenen RT-PCR Assay untersucht.
-
Später wurden
Untersuchungen mit Gesamtzellulärer-RNA
aus humanen Prostatadrüsen
und primären
humanen Prostatakarzinomproben durchgeführt. Die in dieser Reihe von
Studien entdeckten Marker für eine
Prostataerkrankung umfassten die UC Bande #25 (SEQ ID Nr.: 1), UC
Bande #28 (SEQ ID Nr.: 3), UC Bande #31 (SEQ ID Nr.: 4), UC Bande
#32 (SEQ ID Nr.: 7) und UC Bande #33 (SEQ ID Nr.: 5). Die differentielle Expression
dieser Genprodukte in humanen Prostatatumoren verglichen zu benignem
und normalem Prostatagewebe wurde durch quantitative RT-PCR, wie
nachfolgend beschrieben, bestätigt.
-
Die
Bestimmung der DNA Sequenz zeigte, dass es sich bei der UC Bande
#25 (SEQ ID Nr.: 1), der UC Bande #27 (SEQ ID Nr.: 2), der UC Bande
#28 (SEQ ID Nr.: 3), der UC Bande #31 (SEQ ID Nr.: 4) und der UC
Bande #33 (SEQ ID Nr.: 5) um bislang unbekannte Gene handelt. Die
UC Bande #4-2 (SEQ ID Nr.: 6) stammt von der mRNA des α6-Integrin.
Die UC Band #32 (SEQ ID Nr.: 7) stammt von der mRNA von Fibronektin.
Die Ergebnisse der letzteren beiden Genprodukte sind insofern interessant,
da für
all diese Gene nachgewiesen wurde, dass sie in einigen Krebsarten
differentiell exprimiert werden.
-
Von α6-Integrin
ist bekannt, dass es in Prostatakrebs sowohl hochreguliert als auch
unpassend auf der Zelloberfläche
verteilt ist (Knox et al., 1994). Im Harn nachzuweisendes Fibronektin
wurde als möglicher
Biomarker für
Prostatakrebs vorgeschlagen (Webb & Lin, 1980).
-
Die
Expressionsgrade der UC Bande #5-2 (A und B), UC Bande #25, UC Bande
#27, UC Bande #28, UC Bande #31, UC Bande #33, Fibronektin und Lipocortin
II wurden mittels quantitativer RT-PCR in Proben aus normalen, benignen
und malignen Prostatadrüsen
untersucht. Die Ergebnisse für
die UC Bande #25 (SEQ ID Nr.: 1), (1), UC
Bande #27(SEQ ID Nr.: 2), (2), UC
Bande #28 (SEQ ID Nr.: 3), (3), UC
Bande #31 (SEQ ID Nr.: 4), (4), und
UC Bande #33 (SEQ ID Nr.: 5), zeigen alle einen erhöhten Expresssionsgrad in
Prostatakarzinomen (NB, T und LM) verglichen mit benignen (B) und
normalen (N) Prostataproben.
-
Die
Ergebnisse für
die UC Bande #28 (3) und die UC Bande #33 (6)
sind besonders auffällig. Diese
Klone werden in einer normalen oder benignen Prostata nur zu einem
sehr geringen Grad exprimiert und in einem signifikant höheren Masse
in metastasierenden und nicht-metastasierenden Prostatakarzinomen.
Als solche würden
sie ausgezeichnete Marker für
das Aufspüren
von malignen Prostatatumoren in Biopsieproben, die eine Mischung
von normalem, benignem und malignem Prostatagewebe enthalten, abgeben.
Diese beiden Klone sind nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
-
Die
RT-PCR Analyse für
Fibronektin (UC Bande #32, 5) ist
ebenfalls interessant. Dieser Marker scheint nur in normalen Prostataproben
exprimiert zu sein und ist nur in sehr geringem Masse sowohl in
der benignen als auch der malignen Prostata vorhanden (5).
Die verminderte Expression von Fibronektin in BPH ist ein neues
Ergebnis.
-
Diese
Beobachtung ist hinsichtlich eines früheren Berichts, Fibronektin
sei ein möglicher
Marker für Prostatakrebs, überraschend
(Webb und Lin, 1980). Fachleute werden erkennen, dass der Verlust
der Fibronektinexpression bei BPH von Nutzen ist für die Diagnose
und das Erkennen dieses Zustandes in Patienten. Die mRNAs für die UC
Bande #5-2 (A und B) und Lipocortin II, sind in den Tumoren nicht
differentiell exprimiert, obwohl sie in den Zelllinien differentiell
exprimiert sind.
-
Weitere
RNA Fingerprint Untersuchungen wurden durchgeführt um Gene zu identifizieren,
die in normalen Prostatadrüsen,
Drüsen
mit BPH, Prostatatumoren und Metastasen von Prostatatumoren auf
Ebene der mRNA Transkription differentiell exprimiert sind. Die
differentielle Expression wurde durch relative quantitative RT-PCR
bestätigt.
Die verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Diese
Untersuchungen führten
zur Entdeckung von weiteren Sequenzen, die differentiell reguliert
werden. Diese Sequenzen, welche nicht Teil der vorliegenden Erfindung
sind, werden hierin gekennzeichnet als UC38, SEQ ID Nr.: 10; UC40, SEQ
ID Nr.: 11; UC41, SEQ ID Nr.: 12; UC42, SEQ ID Nr.: 18; UC43, SEQ
ID Nr.: 19; UC45, UC46, UC47, stimmt mit der GenBank Zugangs-#M34840,
saure Prostataphosphatase Nt 901-2095 überein; UC201, SEQ ID Nr.:
13; UC202, UC203, UC204 (stimmt mit GB#Z28521 und GB#D42055 überein),
SEQ ID Nr.: 20; UC205 (Humhek, GB#H8394, sense Strang), SEQ ID Nr.:
14; UC206 (antisense Strang), UC207 (sense Strang), SEQ ID Nr.:
15; UC208 (sense Strang), UC209, SEQ ID Nr.: 16; UC210 (sense Strang),
SEQ ID Nr.:17; UC211 (antisense Strang), SEQ ID Nr.: 21; UC212 (sense
Strang), SEQ ID Nr.:22; und UC213 (sense Strang, stimmt mit GB#
T07736 überein),
SEQ ID Nr.:23. Von dem aufgeführten
kommen UC38, UC41, UC42, UC47 und UC211 reichlich in Tumoren vor
und sind mögliche
Tumormarker. UC40, UC205 und UC207 sind reichlich in BPH vorhanden.
UC43 ist reichlich vorhanden in normalen und BPH Drüsen und
ist ein möglicher
Tumorsuppressor. UC201 und UC210 sind reichlich vorhanden in einigen
Tumoren und sind mögliche
Progressionsmarker. UC212 ist reichlich in BPH vorhanden und vielleicht
in einigen Tumoren. UC209 ist in einigen Tumoren nach unten reguliert
und stellt einen möglichen
Suppressor der Progression das und UC213 ist in Tumoren mach unten
reguliert.
-
Nachweis von differentiell
exprimierten RNA Spezies unter Verwendung von Primern spezifisch
für TGF-® und Cyclin
A
-
Relative
quantitative RT-PCR mit einem externen Standard hat sich als leistungsstarkes
Hilfsmittel bei der Untersuchung von mRNAs nach differentieller
Expression in Prostatakrebs erwiesen. Andere Gene wurden mit diesem
Hilfsmittel auf differentielle Expression untersucht. Diese wurden
ausgewählt
weil bekannt war, dass sie in Folge einer Transformation nach oben
reguliert sind oder weil angenommen werden kann, dass sie in Folge
einer Transformation nach oben reguliert werden.
-
Die
Ergebnisse dieser beiden Assays sind hierin mit eingeschlossen.
Sie zeigen, dass beide, TGF-β (7)
und Cyclin A (8), im Prostatakrebs nach oben
reguliert sind im Vergleich zu normalen und benignen Drüsen. Diese
beiden Gene sind kein Teil der vorliegenden Erfindung. Das Cyclin
A Ergebnis ist von besonderem Interesse, da das Protein als positiver
Regulator der Zellzyklus Progression bekannt ist. Es war gelegentlich
gezeigt worden, dass es in einigen Krebsarten nach oben reguliert
ist, aber dies ist die erste Beobachtung von Cyclin A, dass es in
den meisten oder allen Tumoren mit einem einzelnen Organursprung
(Prostata) hochreguliert ist. Die Sequenz von Cyclin A wurde als
SEQ ID Nr.: 8 identifiziert.
-
Identifikation von Markern
für eine
Prostataerkrankung unter Verwendung von spezifischen Proben für eine verkürzte Form
von Her2/neu
-
In
den nachfolgend beschriebenen Studien wurde eine relative quantitative
Form der RT-PCR
durchgeführt.
Die als Primer für
die gesteuerte Amplifikation verschiedener cDNA Fragmente in der
PCR verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
-
In
Kürze,
es wurden drei Oligonukleotidprimer entworfen, die in der Tabelle
3 als Neu5' SEQ
ID Nr.: 44; Neu3',
SEQ ID Nr.: 71; und NeuT3',
SEQ ID Nr.: 72 gekennzeichnet wurden. Neu5' lagert sich an die Antisense-Sequenz
sowohl der kompletten als auch der verkürzten Form der Her2/neu mRNAs
an einer 5' eines wechselnden
RNA-Prozessierungsortes-
gelegenen Stelle an (siehe 9). Neu3' lagert sich an den
Sense-Strang der
kompletten Form der Her2/neu mRNA an einer direkt 3' der Transmembran-Domäne gelegenen Position
an (9).
-
In
einem RT-PCR Assay, das Neu5' und
Neu3' als Primer
verwendete, wurde mit der kompletten mRNA als Matrize ein Amplifikationsprodukt
mit einer Länge
von 350 Basenpaaren erzeugt. Unter Verwendung dieser Primer, kann
aus der verkürzten
mRNA kein cDNA Fragment erzeugt werden, da sich Neu3' nicht an diese mRNA
oder dessen cDNA anlagert. Der dritte Oligonukleotidprimer NeuT3' lagert sich an den
Sense Strang der 3' UTR
der verkürzten
Form der Her2/neu mRNA und cDNA an (9).
In einem RT-PCR Assay, das Neu5' und
NeuT3' als Primer
verwendete, wurde unter Verwendung der verkürzten mRNA als Matrize ein 180
Basenpaar langes cDNA Fragment amplifiziert.
-
Dieses
Primerpaar kann die Amplifikation eines Fragmentes der kompletten
Her2/neu mRNA nicht steuern, da sich NeuT3' nicht an ein Transkript der vollständigen Länge anlagert.
-
Die
Ergebnisse der relativen quantitativen RT-PCR zeigten deutlich,
dass die relative Häufigkeit
der Her2/neu mRNA in Prostatakarzinomen gesteigert ist, verglichen
zu normaler Prostata oder benignen Prostatahyperplasien (10). Diese Werte wurden durch ein densitometrisches
Scannen eines Photonegatives der mit Ethidiumbromid gefärbten Aufnahme
eines Geles erbracht. Die densitometrischen Rohdaten des Scans wurden
auf einen vergleichbaren Scan einer PCR Amplifikation von ®-Actin
aus der gleichen Matrize normalisiert. Einem Gen, vom dem nicht
erwartet wird, dass sich die Expression in Abhängigkeit einer Transformation oder
einer Tumorentwicklung verändert.
Die Ergebnisse sind vollständig
im Einklang mit der gesteigerten Häufigkeit von Her2/neu Protein
in Prostatatumoren, wie sie vorangehend in dem Literaturüberblick
beschrieben wurde.
-
Es
wurde ebenso eine relative quantitative RT-PCR durchgeführt, die
eine relative Häufigkeit
der verkürzten
Form einer Her2/neu mRNA (SEQ ID Nr.: 9) in verschiedenen Prostatageweben
untersuchte. Dieser Assay war vergleichbar zu dem oben für das komplette
Her2/neu Transkript gezeigten. Die Werte dieser Untersuchung, die
auf ®-Actin
quantifiziert und normalisiert wurden, sind in 11 dargestellt.
-
Wie
in 11 gezeigt, war die relative Häufigkeit dieses verkürzten Transkriptes
in Prostatakarzinomen, verglichen mit normaler und benigner Prostata,
signifikant erhöht.
Wie in einem vorangegangenen Abschnitt besprochen, war diese verkürzte Form
der Her2/neu mRNA vorher für
Brusttumoren, Eierstockstumoren und Tumoren des Magens beschrieben
worden. Dies ist der erste Bericht einer differentiellen Expression der verkürzten Form
von Her2/neu als Biomarker für
Prostatakrebs, obwohl es kein Teil der vorliegenden Erfindung ist.
Wie bei Scott et al. (1993) beschrieben, kann die Expression dieser
verkürzten
Form von Her2/neu zu einem veränderten
Verhalten von Krebszellen führen,
welches sich nachteilig auf den Patienten auswirkt.
-
Tabelle
1: Gene, deren mRNA Häufigkeit
sich in Prostatakarzinomen relative zu normalen und benignen Drüsen verändert
-
-
Tabelle 2: Oligonukleotide,
die im relativen quantitativen RT-PCR Teil der Untersuchungen verwendet
wurden.
-
Oligonukleotide,
die zur Untersuchung der Genexpression verwendet wurden:
-
-
-
-
-
Kontrollen
verwendet für
die Bereinigung der relativen quantitativen RT-PCR:
-
-
Tabelle 3: Oligonukleotide,
die für
den Nachweis der verkürzten
Her2/neu mRNA verwendet wurden.
-
- NEUT3'
5' CCCCTTTTATAGTAAGAGCCCCAGA
3', SEQ ID Nr.:
44
-
Jede
der hierin offenbarten Zusammensetzungen und Methoden kann angesichts
der vorliegenden Offenbarung ohne übermäßiges Experimentieren hergestellt
und durchgeführt
werden. Obwohl die Zusammensetzungen und Methoden dieser Erfindung
in Form von bevorzugten Ausführungsbeispielen
beschrieben wurden, ist es für
den Fachmann offensichtlich, dass Veränderungen in der Zusammensetzung,
den Methoden, in den Arbeitsschritten oder dem Ablauf von Arbeitsschritten
herbeigeführt
werden können,
ohne sich vom Ziel der Erfindung, wie es durch die angehängten Ansprüche abgesteckt
ist, zu entfernen.
-
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