DE69635526T2

DE69635526T2 - Biomarker und ziele für die diagnose, prognose und handhabung von prostatkrebs

Info

Publication number: DE69635526T2
Application number: DE69635526T
Authority: DE
Inventors: Robert Veltri; S. Mark O'hara; Gang An; David Ralph
Original assignee: Urocor Inc
Current assignee: Dianon Systems Inc
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1996-07-31
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2016-08-01
Also published as: AU712403B2; AU6642996A; DE69635526D1; ATE311450T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich grundsätzlich auf Nukleinsäuren, die als Proben zur Diagnostik von Krebs geeignet sind, sowie auf Verfahren, die hiermit in Verbindung stehen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Kits und Verfahren, die geeignet sind, Krankheiten der Prostata durch Messungen von Genprodukten zu diagnostizieren, identifizieren, sowie deren Verlauf zu überwachen.
Das Prostatakarzinom (PCA) ist die zweithäufigste krebskorrelierte Todesursache von Männern in den Vereinigten Staaten (Boring, 1993). Die zunehmende Häufigkeit von Prostatakrebs im Verlauf der letzten Dekade führte dazu, dass Prostatakrebs der am meisten verbreitete Krebs von allen ist (Carter und Coffey, 1990). Obwohl Prostatakrebs der am häufigsten vorkommende Krebs in Männern in den Vereinigten Staaten ist (annähernd 200.000 neudiagnostizierte Fälle/Jahr), ist nur wenig über die molekularen Veränderungen, die zu seiner Entstehung und dem Fortschreiten führen, bekannt (Boring et al., 1993). Nach Schätzungen der American Cancer Society steigt die Zahl von Todesfällen aufgrund von PCA mit über 8 % jährlich.
Eine ungewöhnliche Begleiterscheinung ist es, dass die meisten Prostatatumore keine lebensbedrohlichen Zustände darstellen. Beweise aus Autopsien belegen, dass 11 Millionen amerikanische Männer Prostatakrebs haben (Dbom, 1983). Diese Zahlen stimmen mit der Tatsache überein, dass das Prostatakarzinom einen in die Länge gezogenen normalen Verlauf zeigt, bei dem verhältnismäßig wenige Tumoren während der Lebenszeit des Patienten bis zur klinischen Bedeutung fortschreiten. Sofern der Krebs gut ausdifferenziert, auf das Organ beschränkt und fokal ist, wenn er entdeckt wird, führt eine Behandlung von älteren Patienten nicht zu einer Verlängerung der Lebenserwartung.
Für die relativ wenigen Prostatakarzinomen, die natürlich weiter wachsen ist es unglücklicherweise wahrscheinlich, dass sie zu dem Zeitpunkt, an dem sie klinisch nachgewiesen werden, bereits metastasiert sind. Die Überlebensrate von Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs ist ziemlich niedrig. Zwischen diesen beiden Extremen finden sich Patienten mit Prostatatumoren, die metastasieren werden, es aber bislang noch nicht getan haben. Für diese Patienten führt eine chirurgische Entfernung der Prostata zur Heilung und verlängert deren Lebenserwartung. Aus diesem Grund ist es entscheidend, zu bestimmen, in welche Gruppe neu diagnostizierte Patienten fallen, um eine optimale Behandlung und damit das Überleben des Patienten zu gewährleisten.
Obwohl bereits klinische und pathologische Zustandsuntersuchungen und histologische Bewertungssysteme (z. B. Gleason) eingesetzt wurden, um eine Prognose für eine Patientengruppe bereitzustellen, wobei die Prognose auf dem Grad der Tumordifferenzierung oder dem Typ der Granulamuster basierte (Carter und Coffey, 1989; Diamond et al., 1982), sind diese Systeme nicht in der Lage, den Verlauf des Krebses vorherzusagen. Es wurden auch die Verwendung von computerbasierten Bildanalysen von histologischen Schnitten einer primären Läsion, auf deren „nuclear roundness" als Hilfe im Management der einzelnen Patienten vorgeschlagen (Diamond et al., 1982), jedoch ist diese Methode nur eingeschränkt nutzbar, um den Verlauf der Krankheit zu untersuchen.
Vor kurzem durchgeführte Studien, konnten verschiedene, wiederholt auftretende genetische Veränderungen im Prostatakrebs identifizieren, mit eingeschlossen: 1.) den Verlust von Allelen (insbesondere der Verlust der Chromosomen 8p und 16q) (Bova et al., 1993; Macoska et al., 1994; Carter et. al., 1990); 2.) eine generalisierte DNA-Hypermethylierung (Isaacs et al., 1994); 3.) Punktmutationen oder Deletionen des Retinoblastomgenes (Rb) und des p53 Genes (Bookstein et al., 1990a; Bookstein et al., 1990b; Isaacs et al., 1991); 4.) Veränderungen im Expressionsmuster von einzelnen Zell-Zelladhäsionsmolekülen (z. B. E-cadherin/alpha-Catenin) (Carter et al., 1990; Morton et al., 1993; Umbas et al., 1992) sowie Aneuploidie und Aneusomie von Chromosomen, insbesondere der Chromosomen 7 und 8, die mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) nachgewiesen wurden (Macoska et al., 1994; Visakorpi et al., 1994; Takahashi et al., 1994; Alcaraz et al., 1994).
Es konnte gezeigt werden, dass die Analyse des DNA-Gehaltes/Ploidie unter Verwendung von Durchflusszytometrie und FISH geeignet ist, um die Aggressivität von Prostatakrebs vorherzusagen (Pearsons et al., 1993; Macoska et al., 1994; Visakorpi et al., 1994; Takahashi et al., 1994; Alcaraz et al., 1994; Pearsons et al., 1993). Diese Methoden sind jedoch teuer, zeitintensiv und die zuletzt genannte Technologie erfordert die Bereitstellung von zentromerspezifischen Proben zur Analyse.
Es wurde auch berichtet, dass spezifische Kernmatrixproteine mit Prostatakrebs in Verbindung stehen (Partin et al., 1993). Diese Proteinmarker können jedoch ganz offensichtlich nicht zwischen gutartiger Prostatahyperplasie und Prostatakrebs zu unterscheiden (Partin et al., 1993). Leider haben Marker, die nicht zwischen gutartigen und bösartigen Prostatatumoren unterscheiden können, einen sehr geringen Wert.
Es ist ferner bekannt, dass die Transformation und das Tumorwachstum mit einer Veränderung im Grad der Boten-RNA-Spezien assoziiert ist (Slamon et al., 1984; Sager et al., 1993; Mok et al., 1994; Watson et al., 1994). Kürzlich wurde eine Abwandlung der PCR-Analyse, bekannt als RNA-Fingerprinting, verwendet, um unterschiedlich exprimierte Boten-RNA in Gebärmutter- oder Brustkrebskarzinomen zu identifizieren (Liang et al., 1992; Sager et al., 1993; Mok et al., 1994; Watson et al., 1994). Hierzu wurden zufällige Primer verwendet, um einen „Fingerabdruck" der gesamten zellulären DNA zu erzeugen, anschließend wurden die amplifizierten Fragmente mittels hochauflösender Gelelektrophorese aufgetrennt, so dass es möglich war, RNA-Spezien zu identifizieren, die in Krebszellen entweder hochreguliert oder herunterreguliert waren. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten die Anwesenheit von mehreren Markern, die potentiell für die Diagnose von Brust- oder Gebärmutterkrebs geeignet wären, einschließlich des α6-Integrin (Sager et al., 1993), des DEST001 und DEST002 (Watson et al., 1994) und des LF4.0 (Mok et al., 1994).
Es bleiben dennoch Lücken im Stand der Technik bezogen auf die Identifizierung von Genen, die mit dem Fortschreiten von Prostatakrebs in Verbindung stehen und die zur Entwicklung von diagnostischen Verfahren führen, um den Krankheitsverlauf zu überwachen. Die Identifizierung von Genen, die bei Prostatakrebs differentiell exprimiert sind, wäre daher von besonderer Bedeutung für die Entwicklung eines schnellen, kostengünstigen Verfahrens zur Diagnose von Prostatakrebs.
Die vorliegende Erfindung richtet sich an die Mängel im Stand der Technik, RNA-Spezien, die in menschlichen Prostataerkrankungen differentiell exprimiert sind, zu identifizieren und zu charakterisieren. Sie soll ferner Verfahren zur Identifizierung solcher RNA-Spezien bereitstellen. Solche RNA-Spezien und die korrespondierenden kodierten Proteinspezien sind zum Beispiel als Marker für Prostataerkrankungen und als Zielmoleküle für ein therapeutisches Eingreifen bei Prostataerkrankungen geeignet. Die offenbarten Verfahren können auch auf andere Gewebe angewandt werden, um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren, die als Marker für verschiedene physiologische Zustände dieses Gewebes dienen.
Die identifizierten Marker einer Prostataerkrankung können im Weiteren dazu verwendet werden, spezifische Oligonukleotidproben und Primer zu designen. Sofern solche Proben und Primer in Verbindung mit Nukleinsäurehybridisierung und Amplifikationsverfahren eingesetzt werden, erlauben sie eine schnelle Analyse einer Prostatabiopsie, Serumproben usw. Dies kann Ärzte darin unterstützen, Prostataerkrankungen zu diagnostizieren und einen optimalen Behandlungsverlauf für Personen mit Prostatatumoren in verschiedenen Stadien der Malignität zu bestimmen. Dieselben Proben und Primer können auch für eine in situ Hybridisierung oder in situ PCR-Nachweise und die Diagnose von Prostatakrebs eingesetzt werden.
Die identifizierten Marker der Prostataerkrankungen können auch eingesetzt werden, um die gesamte Länge von Gensequenzen, einschließlich der regulatorischen Elemente für die Genexpression aus genomischen humanen DNA-Bibliotheken zu identifizieren und zu isolieren. Die cDNA-Sequenzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, werden zunächst als Hybridisierungsproben eingesetzt, um genomische, humane DNA-Bibliotheken mit Standardverfahren zu durchsuchen. Sobald partielle genomische Klone identifiziert wurden, werden die Gene in ihrer Gesamtlänge über das so genannte „chromosomal walking" (ebenso bekannt unter „überlappende Hybridisierung") isoliert. Siehe z. B. Chinault & Carbon „Overlap Hybridization Screening: Isolation and Characterization of Overlapping DNA Fragments Surrounding the LEU2 Gene on Yeast Chromosome III." Gene 5: 111-126, 1979. Sich nicht wiederholende Sequenzen am oder nahe des Endes eines partiellen genomischen Klons werden dann als Hybridisierungsproben für ein weiteres Screening der genomischen Bibliothek verwendet, um schlussendlich die gesamte Gensequenz des Krebsmarkers der von Interesse ist, zu isolieren. Es ist dem Fachmann bewusst, dass vollständige Gensequenzen unter Verwendung von kurzen exprimierten Sequenzstücken (ESTs), die nachfolgende beschrieben sind, sowie unter Verwendung von derzeit verfügbaren Verfahren (Sambrook et al., 1989; Chinault & Carbon, 1979) erhältlich sind.
Die identifizierten Marker können auch dazu verwendet werden, cDNA-Sequenzen zu identifizieren und zu isolieren. Beim Umsetzen dieses Verfahrens werden die EST-Sequenzen, die in der vorliegenden Offenbarung identifiziert wurden, als Hybridisierungsproben eingesetzt, um menschliche cDNA-Bibliotheken mit Standardverfahren zu screenen. Vorzugsweise wird eine menschliche cDNA-Bibliothek von hoher Qualität, die kommerziell oder anders erhältlich ist, eingesetzt. Die Bibliothek wird z. B. auf Agaroseplatten, die Nährstoffe, Antibiotika und andere gängige Inhaltsstoffe enthalten, ausplattiert. Einzelne Kolonien werden auf Nylon- oder Nitrozellulosemembranen transferiert und die EST-Proben werden mit den komplementären Sequenzen auf den Membranen hybridisiert. Die Hybridisierung wird mittels radioaktiver oder enzymgekoppelter Anhänge, die mit der Hybridisierung assoziieren, nachgewiesen. Positive Kolonien werden vermehrt und sequenziert, z. B. mit der Dideoxynukleotidsequenzierung oder ähnlichen Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Vergleiche der geklonten cDNA-Sequenzen mit bekannten menschlichen oder tierischen cDNA- oder genomischen Sequenzen werden mit Hilfe von Computerprogrammen und dem Fachmann wohl bekannten Datenbanken durchgeführt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein Nukleinsäuresegment und einzelne Nukleinsäuren, wie sie in Anspruch 1 bis 4 definiert sind, bereitgestellt. Die einzelnen Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung sind Teil eines Expressionsvektors und werden in Form von kodierten Proteinen oder Peptiden exprimiert. Solche Proteine oder Peptide können in bestimmten Ausführungsformen als Antigene zur Anregung einer monoklonalen oder polyklonalen Antikörperproduktion eingesetzt werden.
Es werden außerdem Oligonukleotidhybridisierungsproben und Primer bereitgestellt, die mit spezifischen Markern der Prostataerkrankung hybridisieren. Diese Proben und Primer schließen die Sequenz, die als SEQ ID Nr: 1 bezeichnet ist, mit ein. Die Verfügbarkeit von Proben und Primern, die spezifisch für solche einzigartigen Marker sind, bildet die Grundlage für die diagnostischen Kits, die zur Unterscheidung zwischen BPH, einem organdefinierten Prostatakrebs und einem Prostatatumor mit fortschreitendem Metastasierungspotential geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Kits, die zum Nachweis von Prostatazellen in biologischen Proben, wie sie in den Ansprüchen 9, 10 und 11 definiert sind, geeignet sind. So ein Kit kann ein oder mehrere Primerpaare zu Amplifizierung von Nukleinsäuren, die den Prostatamarkergenen entsprechen, umfassen. Das Kit kann außerdem Proben von Gesamt-mRNA, die von Gewebe aus verschiedenen physiologischen Stadien, wie normal, BPH, abgegrenzter Tumor und progressiv metastasierender Tumor abgeleitet sind und die z. B. als Kontrollen verwendet werden können. Das Kit kann außerdem Puffer, Nukleotidbasen und andere Zusammensetzungen, die in einer Hybridisierung und/oder Amplifizierungsreaktion eingesetzt werden, enthalten. Jede Lösung oder Zusammensetzung kann in einem Röhrchen oder einer Flasche aufbewahrt sein und alle Röhrchen können in einer abgeschlossenen Box zur kommerziellen Nutzung enthalten sein. Ein weiteres Kit der vorliegenden Erfindung umfasst Oligonukleotidproben, die mit hoher Affinität zu Markern der Prostataerkrankung in einer Northern Blot Assay binden, sowie Behälter für jede dieser Proben. Ein weiteres Kit zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe umfasst Antikörper, die spezifisch für die Proteine sind, die von den Nukleinsäuremarkern der Prostataerkrankung kodiert werden. Die Erfindung umfasst weiterhin eine isolierte Nukleinsäure, die zwischen 14 und 100 Basen lang ist und entweder identisch zu oder komplementär zu einem Teil mit derselben Länge ist, der innerhalb der Sequenz mit dem SEQ ID Nr: 1, wie sie in Anspruch 3 definiert ist, liegt.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Proteine und Peptide mit Aminosäuresequenzen, die durch die vorweg genannten isolierten Nukleinsäuresegmente, wie sie in den Ansprüchen 5 und 6 definiert sind, kodiert werden. Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren, wie es in den Ansprüchen 7 und 8 definiert ist, zum Nachweis von Prostatakrebszellen in biologischen Proben unter Verwendung von Hybridisierungsprimern und -proben, die derart gestaltet wurden, dass sie spezifisch mit Prostatakrebsmarkern hybridisieren. Dieses Verfahren umfasst weiterhin den Schritt, die Menge der Nukleinsäureamplifikationsprodukte, die gebildet wurden, zu messen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG:
1: Die normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 25 (SEQ ID Nr: 1) zeigt, dass diese in Prostatakrebs und gutartigen Prostatawucherungen im Vergleich zu normalem Prostatagewebe überexprimiert ist. Die Werte sind besonders hoch bei metastasierendem Prostatakrebs. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
2: Die normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 27 (SEQ ID Nr: 2) zeigt, dass sie in Prostatakrebs verglichen mit normaler oder benigner Prostata erhöht ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
3: Eine normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 28 (SEQ ID Nr: 3) zeigt, dass diese im Prostatakrebs, besonders im metastasierenden Prostatakrebs vergliche mit normalem oder benignem Prostatagewebe erhöht ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
4: Eine normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 31 (SEQ ID Nr: 4) zeigt, dass diese im gutartigen (benignen) und malignen Prostatagewebe im Vergleich zu normalem Prostatagewebe überexprimiert ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
5: Eine normierte quantitative RT-PCR einer Sequenz des menschlichen Fribronektingenes (SEQ ID Nr: 7) zeigt, dass diese im BPH und Prostatakrebs verglichen mit normalem Prostatagewebe herunterreguliert ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
6: Eine normierte quantitative RT-PCR der UC Bande # 33 (SEQ ID Nr: 5) zeigt, dass diese im Prostatakrebs verglichen mit normalem oder benignem Prostatagewebe überexprimiert ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lyrnphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
7: Eine quantitative RT-PCR von TGF-β1 zeigt, dass dies im Prostatakrebs verglichen mit benigner Prostatahyperplasie überexprimiert ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Biopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
8: Eine quantitative RT-PCR des Zyklin A (SEQ ID Nr: 8) zeigt, dass dieses im Prostatakrebs verglichen mit normalem Prostatagewebe und benigner Prostatahyperplasie überexprimiert ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
9: Dargestellt sind Oligonukleotide, die in RT-PCR-Untersuchungen des Her2/neu und eines verkürzten Her2/neu eingesetzt werden. Die Bindungsstellen der PCR-Primer sind mit P1 (Neu5'), P2 (Neu3') und P5 (NeuT3') markiert. Die verkürzte Form des Her2/neu enthält die P1-Bindungsstelle. Die Regionen, die kodierende Sequenzen innerhalb des Her2/neu enthalten, sind: ECD (extrazelluläre Domain), MD (Membrandomän) und ICD (intrazelluläre Domain).
10: Eine normierte quantitative RT-PCR des Transkriptes, welche die Gesamtlänge des Her2/neu enthält, zeigt, dass dieses im Prostatakrebs verglichen mit normalem Prostatagewebe und benigner Prostatahyperplasie überexprimiert ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Nadelbiopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
11: Eine normierte quantitative RT-PCR des verkürzten Transkriptes des Her2/neu (SEQ ID Nr: 9) zeigt, dass dieses im Prostatakrebs verglichen mit normalem Prostatagewebe und benigner Prostatahyperplasie überexprimiert ist. N = normale Prostata, B = benigne Prostatahyperplasie (BPH), NB = perkutane Biopsie des Prostatakrebses, T = primärer Prostatakrebs, LM = metastasierender Lymphknoten des Prostatakrebses, NC = Negativkontrolle.
12: Dargestellt ist die Amplifikation der β-Aktin cDNA aus 25 cDNAs, die aus verschiedenen Prostatageweben synthetisiert wurden. Physiologisch betrachtet sind diese Gewebe entweder normale Prostatas, Prostatadrüsen mit BPH oder Prostatatumoren, wie sie in Tabelle 4 beschrieben sind. Die bildliche Darstellung umfasst außerdem einen Molekulargewichtsmarker, der als „Leiter" zu erkennen ist und drei isolierte Banden, die PCR-Produkte aus Pools von (links nach rechts) normalem, BPH- und Prostatakrebsgewebe darstellen.
13: Dargestellt ist die Amplifikation eines cDNA-Fragmentes, welches von dem UC42 mRNA der verschiedenen, in Tabelle 4 beschriebenen individuellen Prostatakazinome abstammt. Wenig oder kaum detektierbare Expression dieser mRNA kann in einem Pool von normalem Prostatagewebe oder einem Pool von Prostatadrüsen mit BPH gezeigt werden. Starke Signale bei 7 von 10 untersuchten Karzinomen deuten auf eine hochsignifikante Induktion dieses Genes in vielen Prostatatumoren hin. Die normierten Daten sind gaphisch dargestellt.
14: Dargestellt ist die Amplifikation eines cDNA-Fragmentes, das von Hek (UC205) mRNA aus den verschiedenen Prostatakarzinomen abgeleitet ist, wie in Tabelle 4 beschrieben ist. Viele, jedoch nicht alle Prostatadrüsen mit BPH weisen einen erhöhten Grad an Hek-Expression auf, als es im Pool von normalem Drüsengewebe zu sehen ist. Die Untersuchung eines Gels weist außerdem darauf hin, dass sich einige der PCRs nicht in de linearen Phase ihrer Amplifikationskurven befinden. Die Daten wurden auf dem IS 1000 festgehalten und normiert, wie in Tabelle 4 beschrieben.
15: Dargestellt ist eine β-Aktin Normierung der gepoolten cDNAs. Pools von cDNAs, die entweder aus normalem Prostatagewebe (N), Prostatadrüsen mit BPH (B) oder Prostatatumoren (C) synthetisiert wurden, wurden als Templates für die β-Aktin cDNA-Amplifikation eingesetzt. Es wurden vier identische Ansätze von PCRs vorbereitet. Diese wurden nach unterschiedlichen Anzahlen der PCR-Zyklen abgestoppt und untersucht. Die Daten der 22 Zyklen wurden numerisch mittels IS1000 festgehalten und dazu verwendet bereinigte Statistiken zu erhalten. Eine normalisierte Statistik wurde erhalten, indem die durchschnittliche Intensität der drei aufgetragenen Banden einzeln durch den jeweiligen Wert der Einzelbanden geteilt wurde. Diese bereinigte Statistiken wurde dann dazu verwendet, die Daten, die von der Hek (UC205) mRNA erhalten wurden, zu normieren. Die Hek mRNA ist in BPH und Prostatakrebspoolen häufiger vorhanden, als in dem Pool des normalen Prostatagewebes. Bei 34 und 37 Zyklen waren die PCRs für die BPH- und Krebspoole in der linearen Phase ihrer Amplifikationskurven. Die Daten wurden auf die β-Aktin Daten normiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Früherkennung, Diagnose, Prognose und Behandlung von Prostataerkrankungen wie Prostatakrebs oder benigner Prostatahyperplasie (BPH). Es werden Marker der Prostataerkrankung in Form von Nukleinsäuresequenzen, die aus menschlichen Prostatatumoren oder Prostatakrebszelllinien isoliert wurden, offenbart. Diese Marker sind Indikatoren über die malignen Veränderungen des Prostatagewebes und haben einen diagnostischen Wert bezüglich einer potentiellen Metastasierung von malignen Prostatatumoren.
In der vorliegenden Erfindung sind alle Ausführungsbeispiele auf die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr: 1, die hierin offenbart wird, begründet. Alle anderen Sequenzen und ihre Anwendungen, auf die hierin Bezug genommen wird, sind nicht Teil der Erfindung. Es ist für den Fachmann erkennbar, dass die offenbarte Nukleinsäuresequenz für eine Vielzahl von Anwendungen im Nachweis von Prostatakrebs, der Diagnose, der Prognose und der Behandlung Verwendung findet. Beispiele für solche Anwendungen umfassen die Amplifikation von Markern der Prostataerkrankung unter Verwendung von spezifischen Primern, der Nachweis von Markern der Prostataerkrankungen durch die Hybridisierung mit Oligonukleotidproben, die Aufnahme der isolierten Nukleinsäuren in Vektoren, die Expression der RNA, Peptide oder Polypeptide von diesen Vektoren, die Entwicklung von immunologischen Reagenzien, die den durch den Marker kodierten Produkten entsprechen und die therapeutische Behandlung von Prostatakrebs unter Verwendung von Antikörpern, Anti-Sense-Nukleinsäuren oder anderen Hemmstoffen, die spezifisch für die identifizierten Prostatakrebsmarker sind.
A. Nukleinsäuren
Wie hierin beschrieben, sind Marker der Prostataerkrankungen mittels RNA-Fingerprinting oder quantitativer RT-PCR identifiziert worden. Dies umfasst sowohl bislang unbekannte Genprodukte, die Nukleinsäureprodukte des α6-Integrin Genes, des PAP-Genes, des Fibronektingenes und des Zyklin A-Genes sowie des verkürzten Nukleinsäureproduktes des Her2/neu-Genes. Die drei zuletzt genannten Genprodukte wurden auch in anderen Krebsformen identifiziert, jedoch stellt die vorliegende Erfindung den ersten Bericht über deren Überexpression im Prostatakrebs dar.
Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr: 1 der vorliegenden Erfindung findet Verwendung als Hybridisierungsprobe und Amplifikationsprimer. Diese Nukleinsäure kann z. B. in der diagnostischen Evaluierung von Gewebeproben, oder zur Klonierung von cDNAs mit der kompletten Länge oder genomischen Klonen hiervon eingesetzt werden. In besonderen Ausführungsformen bestehen diese Proben und Primer aus Oligonukleotidfragmenten. Solche Fragmente sollten ausreichend lang sein, um spezifische Hybridisierungen in einer RNA oder DNA aus der Gewebeprobe zu erlauben. Die Sequenzen sind typischerweise 10 bis 20 Nukleotide lang, können aber auch länger sein. Längere Sequenzen, z. B. 40, 50, 100, 500 und auch bis zur vollständigen Länge sind von besonderen Ausführungsbeispielen bevorzugt.
Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können kontinuierliche Abfolgen von 10, 15, 17, 20, 30, 40, 50, 60, 75 oder 100 oder 500 Nukleotiden aus der Sequenz SEQ ID Nr: 1 sein. Moleküle, die zu den oben erwähnten Sequenzen komplementär sind und unter hochstrigenten Bedingungen an diese Sequenzen binden, werden ebenso berücksichtigt. Diese Proben sind in einer Vielzahl von Hybridisierungsausführungsformen einsetzbar, wie der Southern und Norther Blot-Technologie. In einigen Fällen ist zu berücksichtigen, dass Proben verwendet werden, die unter Umständen mit einer Vielzahl von Zielsequenzen hybridisieren, ohne dass dadurch ihre Fähigkeit einer effizienten Krebsdiagnose beeinträchtigt wird.
Zahlreiche Proben und Primer können aus der offenbarten Nukleotidsequenz konstruiert werden. Primer können beliebiger Länge sein, sind jedoch typischerweise 10 bis 20 Basen lang.
Die Verwendung von Hybridisierungsproben, die zwischen 14 und 100 Nukleotiden lang sind, erlauben die Bildung eines Duplexmoleküles, das sowohl stabil wie selektiv ist. Es werden im Allgemeinen Moleküle, die komplementäre Sequenzen über einen Bereich von mehr als 20 Basen Länge aufweisen, bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrides zu erhöhen und die Qualität und den Grad der im einzelnen erhaltenen Hybridmoleküle zu verbessern. Es ist grundsätzlich zu bevorzugen, Nukleinsäuremoleküle im Bereich von 20 bis 30 Nukleotiden Länge oder noch länger zu konstruieren. Solche Fragmente können z. B. durch eine direkte Synthese des Fragmentes mittels chemischer Mittel hergestellt werden oder durch das Einbringen der ausgewählten Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Produktion.
Demgemäß können die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung wegen ihrer Fähigkeiten selektive Duplexmoleküle mit komplementären Bereichen aus Genen oder RNAs zu bilden, eingesetzt werden oder sie können als Primer zur Amplifikation von DNA oder RNA aus Gewebe bereitgestellt werden. Abhängig von der anvisierten Verwendung werden sinnvollerweise verschiedene Bedingungen der Hybridisierung eingesetzt, um unterschiedliche Abstufungen der Selektivität der Probe bezogen auf die Zielsequenz zu erreichen.
Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, wird man typischerweise relativ stringente Bedingungen zur Bildung von Hybriden einsetzen, z. B. wird man einen relativ niedrigen Salzgehalt und/oder hohe Temperaturen wählen, nämlich z. B. 0,02 M bis 0,10 M NaCl bei Temperaturen von 50° C bis 70° C. Derart hoch stringente Bedingungen erlauben wenig wenn überhaupt irgendwelche Fehlpaarungen zwischen der Probe und dem Template- oder Zielstrang und sind insbesondere geeignet zur Isolierung spezifischer Gene oder dem Nachweis spezifischer RNA-Transkripte geeignet. Es ist allgemein bekannt, dass Hybridisierungsbedingungen noch stringenter gemacht werden können durch die Zugabe von zunehmenden Mengen an Formamid.
Für einige Anwendungen, z. B. den Austausch von Aminosäuren durch zielgerichtete Mutagenese, ist es anerkannt, dass niedrigere stringente Bedingungen erforderlich sind. Unter solchen Bedingungen kann eine Hybridisierung erfolgen, obwohl die Sequenzen der Probe und des Zielstranges nicht perfekt komplementär sind, sondern an einer oder mehreren Positionen Fehlpaarungen auftreten. Hybridisierungsbedingungen können weniger stringent gemacht werden durch zunehmende Salzkonzentration und abnehmende Temperatur. Mittelmäßig stringente Bedingungen können z. B. durch 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von etwa 37° C bis etwa 55° C erreicht werden, während niedrig stringente Bedingungen bei etwa 0,15 M bis 0,9 M Salz und einem Temperaturbereich von etwa 20° C bis etwa 55° C gegeben sind. Hybridisierungsbedingungen können folglich leicht verändert werden und folglich ist das Verfahren der Wahl in Abhängigkeit von dem erwünschten Resultat.
Die nachfolgenden Codon-Aufstellungen können in einem zielgerichteten Mutageneseplan eingesetzt werden, um Nukleinsäuren zu generieren, die die gleiche oder eine leicht veränderte Aminosäuresequenz der anfangs gegebenen Nukleinsäure kodieren:
Tabelle 5
Gemäß anderer Ausführungsbeispiele kann die Hybridisierung bei Bedingungen von z. B. 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 MM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, bei Temperaturen zwischen annähernd 20° C bis 37° C erreicht werden. Weitere eingesetzte Hybridisierungsbedingungen können annähernd 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 μM MgCl₂, bei Temperaturen im Bereich von annähernd 40° C bis 72° C einschließen.
In besonderen Ausführungsformen kann es vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit geeigneten Mitteln wie einem Label zur Bestimmung der Hybridisierung einzusetzen. Eine Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind im Stand der Technik bekannt und schließen fluoreszierende, radioaktive, enzymatische oder andere Liganden wie Avidin/Biotin, die nachgewiesen werden können, mit ein. In bevorzugten Ausführungsbeispielen kann es wünschenswert sein, ein fluoreszierendes Label oder ein Enzym Tag wie Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase einzusetzen, anstatt radioaktive oder auf andere Weise die Umwelt belastende Reagenzien zu verwenden. Im Fall von Enzym Tags sind colorimetrische Indikatorsubstanzen bekannt, die eingesetzt werden können, um ein für das menschliche Auge sichtbares oder spektrophotometrisch messbares Detektionsmittel bereitzustellen, um die spezifische Hybridisierung mit den komplementäre Nukleinsäure enthaltenden Proben zu identifizieren.
Es ist grundsätzlich angestrebt, dass die Hybridisierungsproben, die hierin beschrieben sind, sowohl als Reagenz in Hybridisierungslösungen wie auch in PCRs zum Nachweis der Expression der korrespondierenden Gene geeignet sind als auch in Ausführungsformen, die eine feste Phase einsetzen. In Ausführungsformen, die eine feste Phase einsetzen, ist die zu testende DNA (oder RNA) an eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder sonst wie aufgebracht. Diese fixierte Einzelstrangnukleinsäure wird dann in einer Hybridisierung mit ausgewählten Proben und unter gewünschten Bedingungen eingesetzt. Die ausgewählten Bedingungen sind abhängig von den Umständen, insbesondere sind sie abhängig von den erforderlichen Kriterien (z. B. dem G+C-Gehalt, dem Typ der Zielnukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungsprobe usw.). Im Anschluss an einen Waschschritt der hybridisierten Oberfläche, um nicht spezifisch gebundene Probenmoleküle zu entfernen, wird die Hybridisierung mit Hilfe von Labeln nachgewiesen und ggf. quantifiziert.
Es ist offensichtlich, dass die Erfindung nicht auf die speziell hierin offenbarten Proben beschränkt ist und es ist insbesondere beabsichtigt, dass hierin auch Nukleinsäuresequenzen eingeschlossen sind, die mit den offenbarten Sequenzen hybridisieren oder funktionelle Sequenzanaloga dieser Sequenzen sind. Es kann z. B. eine Teilsequenz eingesetzt werden, um ein strukturell verwandtes Gen oder die gesamte genomische Länge oder den cDNA-Klon, von welchem sie abstammt, zu identifizieren. Dem Fachmann sind die Verfahren zur Herstellung von cDNA- oder genomischen Bibliotheken, die als Ziele für die oben beschriebenen Proben eingesetzt werden können (Sambrook et al., 1989) wohl bekannt.
Bei Anwendungen, in welchen die Nukleinsäuresegmente der vorliegenden Erfindung in einem Vektor, wie einem Plasmid, Cosmiden oder Viren inkorporiert werden, können diese Segmente mit anderen DNA-Sequenzen wie Promotoren, Polyadenalierungssignalen, Restriktionsenzymschnittstellen, multiplen Klonierungsstellen oder anderen kodierenden Segmenten oder ähnlichem kombiniert sein, so dass die Gesamtlänge erheblich variieren kann. Es muss berücksichtigt werden, dass ein Nukleinsäurefragment von nahezu jeder Länge verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Handhabung bei der Herstellung und der Verwendung des beabsichtigten rekombinanten DNA-Protokolls limitiert wird.
DNA-Segmente, die ein spezifisches Gen kodieren, können in rekombinante Wirtszellen eingebracht werden und für die Expression eines spezifischen strukturellen oder regulatorischen Proteins verwendet werden. Alternativ können durch die Anwendung von gentechnischen Verfahren, Teilbereiche oder Derivate der ausgewählten Gene eingesetzt werden. Es besteht auch die Möglichkeit, stromaufwärts (eng. upstream) gelegene Bereiche, die regulatorische Regionen wie Promotorregionen enthalten, zu isolieren und nachfolgend zur Expression von ausgewählten Genen einzusetzen.
In dem Fall, in dem Expressionsprodukte erzeugt werden sollen, ist es möglich, dass die Nukleinsäuresequenzen variieren, während sie die Fähigkeit behalten, dasselbe Produkt zu kodieren. Es wird Bezug genommen auf die oben erwähnte Kodierungstabelle, die es dem Fachmann erlaubt, eine beliebige Nukleinsäure, die für ein Produkt einer vorgegebenen Nukleinsäure kodiert, zu verändern.
B. Kodierte Proteine
Sobald die gesamte Kodierungssequenz eines mit einem Marker assoziierten Genes bestimmt worden ist, kann das Gen in ein geeignetes Expressionssystem inseriert werden. Das Gen kann in einer beliebigen Zahl von verschiedenen rekombinanten DNA-Expressionssystemen exprimiert werden, um eine große Ausbeute an Polypeptidprodukten zu erzeugen, die dann gereinigt werden können und dazu eingesetzt werden können, um aus Tieren mittels Impfung Antisera zu generieren, die in weiterführenden Studien eingesetzt werden können.
Beispiele für Expressionssysteme, die dem Fachmann wohl bekannt sind, schließen Bakterien wie E. coli, Hefen wie Pichia pastoris, Baculoviren und Säugetierexpressionssysteme wie in COS oder CHO-Zellen ein. Es kann ein vollständiges Gen exprimiert werden oder alternativ Fragmente des Genes, die Teile des Polypeptides kodieren, erzeugt werden.
In bestimmten, breiten Anwendungen der Erfindung wurde die Gensequenz, die das Polypeptid kodiert, daraufhin analysiert, ob vermeintliche Transmembransequenzen nachzuweisen sind. Solche Sequenzen sind typischerweise äußerst hydrophob und können leicht unter Verwendung von Standardsoftware für die Sequenzanalyse, wie MacVector (IBI, New Haven, CT), nachgewiesen werden. Die Anwesenheit von Transmembransequenzen ist oft schädlich, wenn ein rekombinantes Protein einem Expressionssystem synthetisiert werden soll, insbesondere bei E. coli, da sie zur Bildung von unlöslichen Aggregaten führen, welche schwierig in die native Konformation des Proteins zu überführen sind. Die Deletion von Transmembransequenzen verändert normalerweise die Konformation der übrigen Proteinstruktur nicht signifikant.
Außerdem sind Transmembransequenzen, die schon per Definition in der Membran eingebettet sind, nicht erreichbar. Antikörper gegen solche Sequenzen können sich daher in in vivo oder in situ Untersuchungen als nicht geeignet erweisen. Die Deletion von transmembrankodierenden Sequenzen aus Genen, die für eine Expression verwendet werden sollen, kann mittels Standardtechniken erfolgen. Es können z. B. zufällig platzierte Restrektionsenzymschnittstellen verwendet werden, um ein gewünschtes DNA-Fragment auszuschneiden oder es kann eine PCR-Amplifizieruung verwendet werden, um nur einen gewünschten Teil des Genes zu amplifizieren.
Computerisierte Sequenzanalysen können eingesetzt werden, um den Bereich der vorherbestimmbaren, hauptsächlichen antigenbestimmenden Epitope eines Polypeptides zu bestimmen. Software, die in der Lage ist, eine solche Analyse auszuführen, kann kommerziell erworben werden, z. B. MacVector (IBI, New Haven, CT). Die Software verwendet typischerweise Standardalogarithmen wie den Kyte/Doolittle oder den Hopp/Woods-Ansatz zur Lokalisierung hydrophiler Sequenzen, die an der Oberfläche eines Proteins gefunden werden können und daher wahrscheinlich als Antigendeterminante agieren.
Sobald diese Analyse durchgeführt ist, können Polypeptide erzeugt werden, die wenigstens die wesentlichen Merkmale der Antigendeterminanten enthalten und die zur Erzeugung von Antisera gegen das Polypeptid verwendet werden können. Minigene oder fusionierte Gene, die diese Determinanten kodieren, können konstruiert werden und in Expressionsvektoren unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. unter Verwendung der PCR-Klonierungsverfahren, inseriert werden.
Das Gen oder Genfragment, welches ein Polypeptid kodiert, kann in einen Expressionsvektor unter Verwendung von Standardsubklonierungsverfahren inseriert werden. Es kann ein E. coli Expressionsvektor eingesetzt werden, der das rekombinante Polypeptid als Fusionsprotein produziert, wodurch eine schnelle Affinitätsreinigung des Proteins ermöglicht wird. Beispiele für solche Fusionsproteinexpressionssysteme sind das Glutation S-Transferasesystem (Pharmacia, Piscalaway, NJ), das Maltose bindende Proteinsystem (NEB, Beverley, MA), das FLAG-System (IBI, New Haven, CT) und das 6 × His-System (Qiagen, Chatsworth, CA).
Einige dieser Systeme erzeugen rekombinante Polypeptide, die nur wenige zusätzliche Aminosäuren umfassen, für die es unwahrscheinlich ist, dass sie die antigenen Fähigkeiten des rekombinanten Polypeptids beeinträchtigen. So fügen z.B. sowohl das FLAG-System als auch das 6 × His-System nur kurze Frequenzen hinzu, von denen es bekannt ist, dass sie nur wenig immunogen sind und die die Faltung des Polypeptids in eine native Konformation nicht negativ beeinflussen. Andere Fusionssysteme sind derart konstruiert, dass sie Fusionsprodukte erzeugen, wobei der Fusionspartner leicht von dem erwünschten Polypeptid abzutrennen ist. In einem Ausführungsbeispiel ist der Fusionspartner mit dem rekombinanten Polypeptid über eine Peptidsequenz, die eine spezifische Erkennungssequenz für eine Protease enthält, verbunden. Beispiele für geeignete Sequenzen sind solche, die von der Tabakmosaikvirus-Protease (Life Technologies, Gaithersburg, MD) oder von dem Faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA) erkannt werden.
Das verwendete Expressionssystem kann auch durch den Bakulovirus Polyhedronpromoter angetrieben werden. Das Gen, welches das Polypeptid kodiert, kann unter Verwendung von Standardverfahren derart verändert werden, dass es für das Klonieren in den Bakulovirusvektor geeignet ist. Ein Bakulovirusvektor ist der pBlueBac Vektor (Invitrogen, Sorrento, CA). Der Vektor, der das Gen für das Polypeptid trägt, wird in Spodoptera frugiperda Zellen (Sf9) unter Verwendung eines Standardprotokolls transfiziert und die Zellen werden kultiviert und anschließend verarbeitet, um das rekombinante Antigen zu erhalten. Siehe Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station; U.S. Patent-Nr. 4,215,051.
Als eine Alternative zu den rekombinanten Polypeptiden können synthetische Peptide, die den Antigendeterminanten entsprechen, erzeugt werden. Solche Peptide sind wenigstens sechs Aminosäurereste lang und können bis zu etwa 35 Reste enthalten, was in etwa auch die oberen Grenze der automatischen Peptidsynthese-Maschinen ist, wie etwa derer, die von Applied Biosystems bezogen werden können (Foster City, CA). Die Verwendung solcher kleinen Peptide zur Impfung erfordert normalerweise die Konjugierung der Peptide mit einem immunogenen Trägerprotein, wie Hepatitis B Oberflächenantigen, Keyhole Limpet Hämocyanin oder bovinem Serumalbumin. Die Verfahren, um diese Koppelung durchzuführen, sind wohl bekannt im Stand der Technik.
Es können ferner Aminosäuresequenzvarianten des Polypeptids erzeugt werden. Diese können z. B. seltene Sequenzvarianten des Polypeptids, die aufgrund natürlich Variation innerhalb einer Population auftreten, sein oder sie können als Homologe in anderen Spezies gefunden werden. Es kann sich auch um Sequenzen handeln, die nicht natürlich auftreten, die aber der natürlichen Sequenz ausreichend ähnlich sind, so dass ihre Funktion und das Auslösen einer Immunreaktion, welche mit den natürlichen Formen des Polypeptids kreuzreagiert, ähnlich ist. Solche Sequenzvarianten können unter Verwendung von Standardverfahren der gezielten Mutagenese, wie sie hierin auch für das Entfernen von Transmembransequenzen beschrieben wurde, hergestellt werden.
Aminosäuresequenzvarianten des Polypeptids können auch Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten sein. Bei Deletionsvarianten fehlen ein oder mehrere Reste des nativen Proteins, wobei die fehlenden Reste nicht essentiell für die Funktion oder Immunogenität sind. Solche Varianten sind beispielhaft mit dem Fehlen der Transmembransequenzen dargestellt. Ein anderer häufiger Typ von Deletionsvarianten sind solche, denen eine Signalsequenz fehlt, die für die Sekretion verantwortlich ist, oder solche, denen eine Signalsequenz fehlt, die dafür verantwortlich ist, dass ein Protein an einem bestimmten Teil einer Zelle bindet. Ein Beispiel für die zuletzt genannte Sequenz ist die SH2-Domain, die eine Proteinbindung an den Phosphotyrosinrest induziert.
Substitutionsvarianten enthalten typischerweise eine alternative Aminosäure an einer oder mehreren Stellen innerhalb des Proteins und können derart konstruiert sein, die eine oder mehrere Eigenschaften des Polypeptids, wie die Stabilität gegenüber einer proteolytischen Spaltung, zu verändern. Substitutionen sind vorzugsweise konservierend, was bedeutet, dass eine Aminosäure durch eine Aminosäure von ähnlicher Größe oder Ladung ersetzt wird. Konservierende Substitutionen sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen z. B. den Austausch von Alanin gegen Serin, Arginin gegen Lysin, Asparagin gegen Glutamin oder Histidin, Aspartat gegen Glutamat, Zystein gegen Serin, Glutamin gegen Asparagin, Glutamat gegen Aspartat, Glycin gegen Prolin, Histidin gegen Asparagin oder Glutamin, Isoleucin gegen Leucin oder Valin, Leucin gegen Valin oder Isoleucin, Lysin gegen Argin, Glutamin oder Glutamat, Methionin gegen Leucin oder Isoleucin, Phenylalanin gegen Lycosin, Leucin oder Methionin, Serin gegen Threonin, Threonin gegen Serin, Tryptophan gegen Tyrosin, Tyrosin gegen gegen Tryptophan oder Phenylalanine und Valin gegen Isoleucin oder Leucin ein.
Insertionsvarianten schließen solche Fusionsproteine mit ein, die z. B. eine schnelle Aufreinigung des Polypeptids erlauben. Insertionsvarianten schließen außerdem Hybridproteine ein, die Sequenzen aus anderen Proteinen oder Polypeptiden tragen, die homolog zu dem Polypeptid sind. Es kann z.B. eine Insertionsvariante Teile einer Aminosäuresequenz des Polypeptids einer Spezies gemeinsam mit einem Anteil des homologen Polypeptids einer anderen Spezies einschließen. Weitere Insertionsvarianten schließen solche ein, in welche zusätzliche Aminosäuren innerhalb der kodierenden Sequenz des Peptides eingeführt wurden. Hierbei handelt es sich normalerweise um kleinere Einfügungen als bei den oben beschriebenen Fusionsproteinen, und sie werden eingeführt, um z. B. eine Proteasenschnittstelle zu zerstören.
Die hauptsächlichen immunogenen Determinanten des Polypeptids können über einen empirischen Ansatz identifiziert werden, bei welchem Teile des Gens, die das Polypeptid kodieren, in einem rekombinanten Wirt exprimiert werden und die hierbei entstehenden Proteine auf ihre Fähigkeit, eine Immunantwort auszulösen, getestet werden. Es kann z.B. eine PCR verwendet werden, um eine Vielzahl von Peptiden zu erzeugen, denen zunehmend länger werdende Fragmente des C-terminalen Endes des Proteines fehlen. Die immunoprotektive Aktivität dieser Peptide hilft dann, solche Fragmente oder Domänen des Polypeptids zu identifizieren, die für diese Aktivität erforderlich sind. Weitere Untersuchungen, bei denen nur eine geringe Anzahl von Aminosäuren bei jedem Schritt entfernt werden, erlauben dann die Lokalisierung der immunogenen Determinanten des Polypeptids.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden ist die Verwendung von nachahmenden Peptiden (eng. peptide mimetics). Solche nachahmende Peptide sind Peptide, die Moleküle enthalten, die Elemente einer sekundären Proteinstruktur nachahmen. Siehe z. B. Johnson et al., „Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York (1993). Der Grund, nachgeahmte Peptide einzusetzen, ist, dass das Peptidrückgrad eines Proteins in erster Linie besteht, um die Orientierung der Aminosäureseitenketten derart zu erweitern, dass molekulare Interaktion wie die mit Antikörpern und Antigenen ermöglicht werden. Von einem nachgeahmten Peptid wird erwartet, dass es molekulare Interaktionen in ähnlicher Weise wie das natürliche Molekül ermöglicht.
Erfolgreiche Anwendungen des Konzeptes der nachahmenden Peptide haben sich daher auf das Nachahmen von β-Faltblättern innerhalb eines Proteins konzentriert, die als hoch immunogen bekannt sind. Gleichermaßen können β-Faltblattstrukturen innerhalb eines Polypeptides mittels computerbasierter Algorithmen wie sie hierin besprochen wurden, vorhergesagt werden. Sobald die Bestandteile der Aminosäuren des Faltblattes bestimmt sind, können nachahmende Peptide hergestellt werden, die eine ähnliche räumliche Orientierung der wesentlichen Elemente der Aminosäureseitenketten erreichen.
C. Herstellung von Antikörpern, die spezifisch für die kodierten Proteine sind
1. Expression des Proteins von klonierten cDNAs
Die cDNA, wie sie in SEQ ID Nr: 1 dargelegt ist, kann als Peptid oder Protein exprimiert werden. Die Veränderung von DNA-Segmenten zur Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen kann unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren zur rekombinanten Expression durchgeführt werden. Nach hiesiger Auffassung kann nahezu jedes Expressionssystems zur Expression der beanspruchten Proteinsequenzen verwendet werden.
Sowohl cDNA wie genomische Sequenzen sind für eine eukaryontische Expression geeignet, da die Wirtszelle normalerweise das genomische Transkript bearbeitet, um eine funktionelle mRNA zur Übersetzung in ein Protein bereitzustellen. Darüber hinaus ist es möglich, Teilsequenzen zur Herstellung von Antikörpern gegen bestimmte Teile eines Genproduktes zu verwenden, auch wenn die Gesamtsequenz des entsprechenden Genproduktes unbekannt bleibt. Es stehen Computerprogramme zur Verfügung, die bei der Auswahl von Bereichen, die eine potentiell immunologische Bedeutung haben, unterstützen. Eine Software, die beispielsweise in der Lage ist, eine solche Analyse auszuführen, ist MacVector (IBI, New Haven, CT) und bereits kommerziell erhältlich. Die Software verwendet typischerweise Standardalogarithmen wie das Kyte/Doolittle oder Hopp/Woods Verfahren zur Lokalisierung hydrophiler Sequenzen, die typischerweise auf der Oberfläche von Proteinen gefunden werden und daher mit hoher Wahrscheinlichkeit als immunogene Determinanten agieren.
Die hierin verwendeten Begriffe „gentechnisch veränderte" und „rekombinante" Zellen sollen sich auf eine Zelle beziehen, in welche ein exogenes DNA-Segment oder Gen, wie eine cDNA oder ein Gen, von Menschenhand eingefügt wurde. Auf diese Art und Weise sind gentechnisch veränderte Zellen von natürlich auftretenden Zellen unterscheidbar, welche keine rekombinant eingeführten exogenen DNA-Segmente oder Gene enthalten. Rekombinante Zellen umfassen solche, die eine eingefügte cDNA oder genomische Gensequenz haben und auch solche, die Gene tragen, die in der Nähe eines heterologen Promotors liegen, der natürlicherweise nicht mit diesem bestimmten eingeführten Gen verbunden ist.
Um ein rekombinant kodiertes Protein oder Peptid zu exprimieren, unabhängig, ob es eine mutierte oder Wildtypform ist, würde man einen Expressionsvektor herstellen, der die beanspruchte isolierte Nukleinsäure unter der Kontrolle eines oder mehrerer operativ verbundener Promotoren enthält. Um eine kodierende Sequenz „unter die Kontrolle" eines Promotors zu bringen, würde das 5' Ende in der Transkriptionsinitiationsstelle des transkriptionellen Leserahmens, der grundsätzlich zwischen etwa 1 und etwa 50 Nukleotiden „downstream" (d.h. 3') des gewählten Promotors liegt, positionieren. Der „upstream" Promotor stimuliert die Transkription der DNA und sorgt für die Expression des kodierten rekombinanten Proteins. Dies ist die Bedeutung von „rekombinanter Expression" in diesem Zusammenhang.
Zahlreiche Standardverfahren sind verfügbar, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die geeignete Nukleinsäuren und transkriptionelle/translationelle Kontrollsequenzen enthalten, um eine Protein- oder Peptidexpression in einer Vielzahl von Wirtsexpressionssystemen zu ermöglichen. Die Zelltypen, welche für die Expression zur Verfügung stehen, schließen Bakterien wie E. coli und B. subtilis, der mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA transformiert ist, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA Expressionsvektoren ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Ausgewählte Beispiele der prokaryotischen Wirte sind E. coli Stamm RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC Nr. 31537) sowie E. coli W3110 (F-, Lambda-, Prototroph, ATCC Nr. 273325), Bazilli wie Bacillus subtilis und andere Enterobakteriaceae wie Salmonella typhimorium, Serratia marcesenses und verschiedene Pseudomonas-Spezien.
Im Allgemeinen enthalten Plasmidvektoren ein Replikon und Kontrolsequenzen, die aus Spezies stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind und in Verbindung mit diesem Wirt verwendet werden. Der Vektor trägt normalerweise eine Replikationsstelle sowie eine Markersequenzen, die eine phenotypische Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. So ist E. coli z.B. oft mit pBR322 transformiert, einem Plasmid, das aus einer E. coli Spezies stammt. Das Plasmid pBR322 enthält Gene für Ampizillin- und Tetracyclineresistenzen und ermöglicht daher eine leichte Identifikation transformierter Zellen. Das pBR Plasmid oder andere mikrobische Plasmide oder Phagen müssen außerdem einen Promotor enthalten, oder sollten derart verändert werden, dass sie einen Promotor enthalten, welcher in den mikrobiellen Organismus zur Expression eines eigenen Proteines verwendet werden kann.
Darüber hinaus enthalten Phagenvektoren ein Replikon und Kontrollsequenzen, die mit dem Wirtsmikroorganismus kompatibel sind und als transformierende Vektoren in Verbindung mit diesem Wirt eingesetzt werden können. Z. B. kann der Phage Lambda GEM^TM -11 zur Herstellung eines rekombinanten Phagenvektors verwendet werden, der zur Transformierung einer Wirtszelle wie dem E. coli LE392 eingesetzt werden kann.
Weitere verwendbare Vektoren schließen die pIN Vektoren (Inouye et al., 1985) und pGEX Vektoren ein, die zur Herstellung von löslichen Fusionsproteinen mit Glutation S-Transferase (GST) zur späteren Aufreinigung und Abtrennungen oder Spaltungen geeignet sind. Weitere geeignete Fusionsproteine sind solche mit β-Galactosidase, Ubiquitin oder ähnlichem.
Promotoren, die am häufigsten in rekombinanten DNA-Konstrukten eingesetzt werden, schließen die β-Lactamase (Penicillinase), Laktose und Tryptophan (trp) Promotorsysteme mit ein. Obwohl dies die am häufigsten verwendeten sind, sind auch andere mikrobielle Promotoren beschrieben und eingesetzt worden und es wurden Details bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen publiziert, so dass der Fachmann in der Lage ist, sie funktionell mit einem Plasmidvektor zu ligieren.
Zur Expression in Saccharomyces wird üblicherweise das Plasmid YRp7 eingesetzt (Stinchcomb et al., 1979, Kingsman et al., 1979, Tschemper et al., 1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1 Gen enthält, das einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestrang, dem die Fähigkeit, auf Tryptophan zu wachsen, fehlt. Dies ist z. B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-I (Jones, 1977). Die Anwesenheit der trp1-Läsion als Eigenschaft des Hefewirtszellgenoms ist eine wirkungsvolle Methode zum Nachweis der Transformation durch das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen die Promotoren für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968, Holland et al., 1978) wie die Endolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Hexokinase, Pyrovatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die Terminationssequenzen, die mit diesen Genen assoziiert sind, in den Expressionsvektor 3' von der Sequenz, die zu exprimieren ist, einligiert, um für eine Polyadenylierung der mRNA und eine Termination zu sorgen.
Weitere geeignete Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der Transkriptionskontrolle über Wachstumsbedingungen haben, schließen die Promotorregionen der Alkoholdehydrogenase 2, des Isocytochrom C, der sauren Phosphatase, den abbauenden Enzymen, die mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziiert werden und die im vorangegangenen erwähnten Glyceraldehy-3-Phosphatatdehydrogenase sowie Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind, ein.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können auch Zellkulturen, die von vielzelligen Organismen abgeleitet sind, als Wirtszellen verwendet werden. Grundsätzlich ist jede Zellkultur einsetzbar, egal ob sie von einem Vertebraten oder Invertebraten abstammt. Neben den Säugerzellen sind auch Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Expressionsvirusvektoren infiziert sind (z. B. Bakulovirus) und Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Expressionsvektorviren infiziert sind (z. B. Cauliflower Mosaik Virus, DaMV; Tabak Mosaik Virus, TMV) oder die mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti Plasmid) transformiert sind, wobei eine oder mehrere Kodierungssequenzen in dem Vektor enthalten sind, eingeschlossen.
In einem geeigneten Insektensystem ist z. B. das Autograph californica nuclear polyhidrosis Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda Zellen. Die isolierten Nukleinsäuresequenzen werden in nichtessentielle Bereiche (z. B. das Polyhedringen) des Virus einkloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV Promotors (z. B. den Polyhedrinpromoter) gestellt. Eine erfolgreiche Insertion der Kodierungssequenz führt zu einer Inaktivierung des Polyhedringens und zur Bildung eines nicht ummantelten rekombinanten Virus (d. h. dem Virus fehlt der proteinhaltige Überzug, der durch das Polyhedringen kodiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda Zellen zu infizieren, in welchen die inserierten Gene exprimiert werden (z. B. U.S. Patent-Nr. 4,215,051 (Smith)).
Beispiele für geeignete Säugerwirtszelllinien sind VERO und HeLa Zellen, chinesische Hamster Ovar-Zelllinien (CHO), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN und MDCK Zelllinien. Zusätzlich können Wirtszelllinien gewählt werden, die die Expression von inserierten Sequenzen modulieren oder verändern und die Genprodukte in einer bestimmten gewünschten Art und Weise prozessieren. Solche Modifizierungen (z. B. Glycosylierung) und Prozessierungen (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten können wichtig für die Funktion des kodierten Proteins sein.
Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Bearbeitung und Abänderung von Proteinen. Es können daher geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteines sicherzustellen. Expressionsvektoren, die in Säugerzellen verwendet werden, schließen normalerweise einen Replikationsstartpunkt (nach Bedarf), einen Promotor, der vor dem zu Exprimierenden lokalisiert ist, sowie einige notwendige Ribosomenbindestellen, RNA Splicestellen, Polyadenylierungssignale und transkriptionale Terminatorsequenzen ein. Der Replikationsstartpunkt kann entweder durch die Konstruktion eines Vektors, der einen exogenen Startpunkt enthält, wie er eventuell von einem SV40 oder anderem Virus abgeleitet werden kann (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) oder kann durch eine aus der Wirtszelle stammenden chromosomalen Replikationsfunktion bereitgestellt werden. Sofern der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert, ist der zuletzt genannte oft ausreichend.
Die Promotoren können aus dem Genom von Säugerzellen stammen (z. B. Metallothioninpromotoren) oder von Säugerviren abstammen (z. B. der Adenovirus Late Promotor; der Vaccinia Virus 7.5K Promotor). Weiterhin ist es möglich und kann wünschenswert sein, Promotoren oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit den gewünschten Gensequenzen assoziiert sind, vorausgesetzt, dass diese Kontrollsequenzen mit dem Wirtszellsystem kompatibel sind.
Eine Vielzahl von viral basierten Expressionssystemen kann verwendet werden, so z. B. die weit verbreiteten Promotoren, die von Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten von Simianvirus 40 (SV40) abstammen. Die frühen und späten Promotoren des SV40 Virus sind insbesondere geeignet, da beide leicht aus dem Virus als Fragment, das gleichzeitig den SV40 viralen Replikationsstartpunkt enthält, zu gewinnen sind. Es können auch kleinere oder größere SV40-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die ungefähr 250 bp Sequenz von der Hind III Restriktionsschnittstelle mit zur Bgl I Restriktionsschnittstelle, auf der der virale Replikationsstartpunkt lokalisiert ist, umfassen.
In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor eingesetzt wird, kann die kodierende Sequenz an einen Adenovirus transkriptions-/translationskontrollierenden Komplex ligiert werden, z. B. den späten Promotor und die dreiteilige Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in ein Adenovirusgenom inseriert werden unter Verwendung in vitro oder in vivo Rekombination. Die Insertion in einen nichtessentiellen Bereich des viralen Genoms (z. B. die Region E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, das lebensfähig ist und in der Lage ist, Proteine in einer infizierten Wirtszelle zu exprimieren.
Es können auch spezifische Initiationssignale für eine effiziente Translation der beanspruchten isolierten Nukleinsäurekodierungssequenz erforderlich sein. Solche Signale schließen das ATG Initiationskodon und nachfolgende Sequenzen ein. Exogene Translationskontrollsignale, eingeschlossen das ATG Initiationskodon, können ebenfalls benötigt werden. Dem Fachmann ist dies jedoch bewusst und er ist auch in der Lage, die notwendigen Signale bereitzustellen. So ist es z. B. wohl bekannt, dass das Initationskodon mit dem Leserahmen in der gewünschten Kodierungssequenz „in-frame" (oder in derselben Phase) sein muss, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Solche exogenen Translationskontrollsignale und Initiationskodons können vielerlei Ursprung haben und z. B. natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Die Expressionseffizienz kann durch das Einbeziehen von geeigneten Transkriptionsverstärkerelementen oder Transkriptionsterminatoren (Bittner et al., 1987) erhöht werden.
In eukaryontischen Expressionssystemen ist es ebenfalls üblicherweise gewünscht, in die Transkriptionseinheit ein geeignetes Polyadenylierungssignal (z. B. 5'-AATAAA-3') einzubeziehen, sofern ein solches nicht in dem zu klonierenden Segment enthalten ist. Typischerweise wird die Poly-A-Stelle etwa 30 bis 2.000 Nukleotide stromabwärts (downstream) der Terminationsstelle des Proteines platziert, wobei die Position vor der Transkriptionstermination lokalisiert ist.
Für eine über einen langen Zeitraum andauernde und ertragreiche Produktion des rekombinanten Proteines ist eine stabile Expression zu bevorzugen. Es können beispielsweise Zelllinien etabliert werden, die Konstrukte, welche Proteine kodieren, stabil exprimieren. Anstatt Expressionsvektoren, die virale Replikationsstartpunkte enthalten, zu verwenden, können Wirtszellen mit Vektoren transformiert werden, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (z. B. Promotor-, Enhancersequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylationssigneale usw.) und einem selektierbaren Marker kontrolliert werden. Nach dem Einführen der Fremd-DIVA wird den gentechnisch veränderten Zellen erlaubt, für ein bis zwei Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen, bevor sie auf ein Selektionsmedium umgestellt werden. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid überträgt eine Resistenz gegenüber der Selektion und erlaubt es dadurch, Zellen, welche das Plasmid stabil in ihre Chromosomen integriert haben, in Form von Foci zu wachsen. Diese können anschließend kloniert werden und zu Zelllinien expandiert werden.
Es können eine Vielzahl von Selektionsthemen eingesetzt werden, welche das Herpes Simplexvirus Thymidinkinase- (Wigler et al., 1977), das Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase- (Szybalska et al., 1962) und das Adeninphosphoribosyltransferasegen (Lowy et al., 1980), in entsprechenden tk-, hgprt- oder aprt-Zellen einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Es kann außerdem eine Stoffwechselresistenz als Basis für eine Selektion auf DHFR, welches eine Resistenz gegen Methotrexat vermittelt (Wigler et al., 1980, O'Hare et al., 1981); GPT, welches eine Resistenz gegen Mycophenolsäure überträgt (Mulligan et al., 1981); NEO, welches eine Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 überträgt (Colberre-Garapin et al., 1981) und HYGRO, welches eine Resistenz gegen Hygromycin überträgt (Santerre et al., 1984), verwendet werden.
Es ist außerdem zu überlegen; dass die isolierte Nukleinsäure der Erfindung überexprimiert sein kann, d. h. in einem erhöhten Maße verglichen mit der natürlichen Expression in der menschlichen Prostatazelle oder auch in Bezug zur Expression von anderen Proteinen in der rekombinanten Wirtszelle exprimiert sein kann. Eine solche Überexpression kann durch eine Vielzahl von Verfahren einschließlich einer radioaktiven Markierung und/oder einer Proteinaufreinigung abgeschätzt werden. Es sind jedoch einfache und direkte Verfahren bevorzugt, z. B. solche, die ein SDS/PAGE, Proteinfärbung oder Western Blot Analyse, gefolgt von quantitativen Analysen wie densitometrischen Bestimmungen der Ergebnisse im Gel oder Blot einschließen. Eine spezifische Erhöhung der Menge des rekombinanten Proteines oder Peptides im Vergleich zu der Menge in der natürlichen menschlichen Prostatazelle weist auf eine Überexpression hin, ebenso wie die relative Häufigkeit des spezifischen Proteins im Verhältnis zu anderen Proteinen, die durch die Wirtszelle produziert werden und z. B. in einem Gel sichtbar sind.
2. Aufreinigung von exprimierten Proteinen
Der Begriff „gereinigtes Protein oder Peptid", wie er hierin verwendet wird, soll sich auf eine Zusammensetzung beziehen, die von anderen Komponenten abtrennbar ist, wobei das Protein oder Peptid bis zu jedem Reinheitsgrad im Verhältnis zu der natürlich gewinnbaren Form aufgereinigt werden kann, d. h. in diesem Fall im Verhältnis zu dessen Reinheit innerhalb eines Prostatazellextraktes. Ein gereinigtes Protein oder Peptid bezieht sich daher auch auf ein Protein oder Peptid, welches frei von der Umgebung ist, in welcher es normalerweise auftritt.
Generell bezieht sich „gereinigt" auf eine Protein- oder Peptidzusammensetzung, die einer Fraktionierung unterworfen wurde, um verschiedene andere Komponenten abzutrennen, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen ihre ausdrückliche biologische Aktivität behält. Wenn der Begriff „im Wesentlichen gereinigt" verwendet wird, bezieht sich dies auf eine Zusammensetzung, in welcher das Protein oder Peptid die Hauptkomponente der Zusammensetzung bildet, so dass nahezu 50 % oder mehr Protein die Zusammensetzung bilden.
Zahlreiche Verfahren zur Bestimmung des Reinheitsgrades der Proteine oder Peptide sind dem Fachmann im Stand der Technik bekannt. Diese schließen z. B. die Bestimmung der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion ein oder schließen die Bestimmung der Anzahl der Polypeptide innerhalb einer Fraktion mittels SDS/PAGE-Analyse ein. Ein bevorzugtes Verfahren zur Bewertung der Reinheit einer Fraktion berechnet die spezifische Aktivität der Fraktion, um sie mit der spezifischen Aktivität des Ausgangsextraktes zu vergleichen und dabei den Grad der Reinheit zu berechnen, welcher hierin durch die „-fache Reinheitsnummer" angegeben wird. Die tatsächlichen Einheiten, die verwendet werden, um die Aktivitätsmenge darzustellen, sind selbstverständlich abhängig von der speziellen Assay-Technik, die gewählt wurde, um im Anschluss an die Reinigung zu erfolgen, sowie davon ob oder ob nicht das exprimierte Protein oder Peptid eine nachweisbare Aktivität zeigt.
Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren, die zur Proteinreinigung geeignet sind, im Stand der Technik bekannt. Diese schließen z. B. die Fällung mit Ammoniumsulfat, PEG, Antikörpern oder ähnlichem oder durch Hitzedenaturierung gefolgt von einer Zentrifugation, chromographischen Schritten wie Ionenaustausch, Gelfiltration, reverse Phase, Hydroxylapatit und Affinitätschromatographie; isoelektrische Fokussierung; Gelelektrophorese und Kombinationen dieser und weiterer Verfahren ein. Wie es allgemein im Stand der Technik bekannt ist, ist davon auszugehen, dass die Reihenfolge beim Durchführen der verschiedenen Aufreinigungsschritte verändert werden kann oder das bestimmte Schritte übergangen werden können und das Verfahren dennoch eine geeignete Methode zur Herstellung von im wesentlichen gereinigten Proteinen oder Peptiden darstellt.
Es gibt keine allgemeinen Anfordernisse, dass das Protein oder Peptid immer im höchstmöglichen Reinheitsgrad bereitgestellt werden muss. Tatsächlich ist zu berücksichtigen, dass weniger vollständig gereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen nützlich sind. Eine teilweise Aufreinigung kann erreicht werden durch den Einsatz von weniger Aufreinigungsschritten in Kombination oder durch die Verwendung von verschiedenen Alternativen, dasselbe allgemeine Reinigungsprotokoll umzusetzen. Es ist z. B. anerkannt, dass eine Kationen austauschende Säulenchromatogaphie, die unter Verwendung einer HPLC-Apparatur durchgeführt wird, im Allgemeinen zu einer höheren Reinheit führt, als wenn dieselbe Technik in einem Niedrigdruckchromatogaphiesystem eingesetzt wird. Verfahren, die einen niedrigeren Grad in der relativen Reinheit bieten, können Vorteile in Bezug auf die Gesamtgewinnung des Proteinprodukts oder in Bezug auf die Erhaltung der Aktivität des exprimierten Proteins haben.
Es ist auch bekannt, dass das Wanderverhalten eines Polypeptids unter verschiedenen Bedingungen, manchmal in signifikantem Maße, im SDS/PAGE-System variieren kann (Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1997). Aus diesem Grund ist es auch einzusehen, dass das scheinbare Molekulargewicht in gereinigten oder teilweise gereinigten Expressionsprodukten unter verschiedenen Elektrophoresebedingungen variieren kann.
3. Antikörperherstellung
Für einige Ausführungsformen wird es wünschenswert sein, Antikörper zu produzieren, die mit hoher Spezifität an das Polypeptidprodukt der isolierten Nukleinsäure der SEQ ID Nr: 1 binden. Methoden zur Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Verfahren zur Herstellung polykloner Antikörper sind im Stand der Technik wohl bekannt. In Kürze, zur Herstellung von polyklonen Antikörpern wird ein Tier mit einer immunogenen Zusammensetzung immunisiert und das Antiserum von dem immunisierten Tier gesammelt. Eine Vielzahl von Tierarten kann für die Produktion von Antiserum eingesetzt werden. Typischerweise handelt es sich bei dem Tier, das zur Produktion eines Anti-Antiserums eingesetzt wird, um einen Hasen, eine Maus, eine Ratte, einen Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Wegen der verhältnismäßig großen Blutmenge der Hasen ist die bevorzugte Wahl zur Produktion von polyklonalen Antikörpern.
Es ist im Stand der Technik bekannt, dass eine vorgegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren kann. Aus diesem Grund ist es oft nötig, das Immunsystem des Wirtes zu stimulieren, was durch das Koppeln eines peptidischen oder polypeptidischen Immunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind das Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) und das bovine Serumalbumin (BSA). Andere Albumine wie Ovalbumin, Mäuseserumalbumin oder Hasenserumalbumin können ebenso als Träger verwendet werden. Mittel, um ein Polypeptid an ein Trägerprotein zu koppeln, sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen Glutaraldehyd, M-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und Bis-biazotized Benzidin ein.
Es ist außerdem im Stand der Technik bekannt, dass die Immunogenität von bestimmten immunogenen Zusammensetzungen durch die Verwendung von unspezifischen Stimulatoren der Immunantwort, bekannt als Adjuvantien, verstärkt werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien schließen das komplette Freund's Adjuvans (ein unspezifischer Stimulator der Immunantwort, der abgetötetes Mycobakterium tuberculosis enthält), inkomplette Freund's Adjuvans und Aluminiumhydroxyd-Adjuvans ein.
Die Menge der immunogenen Zusammensetzung, die zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von der Art des Immunogens sowie in Abhängigkeit des Tieres, welches für die Immunisierung eingesetzt wird. Eine Vielzahl von Applikationsrouten kann für das Immunogen verwendet werden (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Bildung von polyklonalen Antikörpern kann anhand von Blutproben des immunisierten Tieres, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung gesammelt wurden, überwacht werden. Eine zweite Wiederholungsinjektion kann auch verabreicht werden. Der Wechsel zwischen Wiederholungsinjektion und Titerbestimmung wird wiederholt, bis der geeignete Titer erreicht ist. Sobald ein gewünschtes Maß an Immunogenität erreicht ist, kann das immunisierte Tier ausgeblutet werden und das Serum isoliert und aufbewahrt werden und/oder das Tier kann zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MAbs) eingesetzt werden. Zur Gewinnung von polyklonalen Hasen-Antikörpern kann das Tier über die Ohrvene oder alternativ über eine Herzpunktur ausgeblutet werden. Man lässt das gewonnene Blut stocken und zentrifugiert es dann, um Serumbestandteile von den ganzen Zellen und Blutgerinnseln abzutrennen. Das Serum kann für zahlreiche Anwendungen eingesetzt werden oder es kann die gewünschte Antikörperfraktion mit wohlbekannten Verfahren wie der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines anderen Antikörpers oder eines Peptides, da an eine Feststoffmatrix gebunden ist, aufgereinigt werden.
Monoklonale Antikörper (MAbs) können ebenso mittels wohlbekannter Techniken, wie sie beispielhaft in U.S. Patent Nr. 4,196,265 erläutert sind, hergestellt werden. Typischerweise beinhaltet dieses Verfahren die Immunisierung eines geeigneten Tieres mit einer ausgewählten immunogenen Zusammensetzung, z. B. einem gereinigten oder teilweise gereinigten exprimierten Protein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung wird in einer Art und Weise verabreicht, die wirksam die antikörperproduzierenden Zellen stimuliert.
Das Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Antikörper (MAbs) bedient sich anfangs grundsätzlich derselben Verfahrensschritte wie das zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern. Nager wie Mäuse und Ratten sind die bevorzugten Tiere. Es können jedoch auch Hasen-, Schaf- oder Froschzellen verwendet werden. Die Verwendung von Ratten weist gewisse Vorteile auf (Goding, 1986, Seiten 60 – 61), dennoch sind Mäuse bevorzugt und insbesondere BALB/c-Mäuse sind bevorzugt, da sie am häufigsten eingesetzt werden und normalerweise einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen liefern.
Den Tieren wird wie oben beschrieben ein Antigen injiziert. Das Antigen kann, falls nötig, an ein Trägermolekül wie das Keyhole Limpet Hämocyanin gekoppelt sein. Das Antigen würde typischerweise mit einem Adjuvans, Freund's komplettes oder inkomplettes Adjuvans gemischt werden. Wiederholungsinjektionen mit demselben Antigen würden in annähernden Zweiwochenintervallen durchgeführt werden.
Im Anschluss an die Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zur Bildung von Antikörpern, insbesondere B-Lymphozyten (B-Zellen), für die Verwendung in einem Protokoll zu Herstellung von MAb ausgewählt. Solche Zellen können durch die Biopsie der Milz, der Mandeln oder von Lymphknoten oder aus peripheren Blutproben gewonnen werden. Milzzellen und periphere Blutzellen werden bevorzugt. Die zuerst genannten werden bevorzugt aus dem Grund, dass sie eine reichhaltige Quelle für antikörperproduzierende Zellen sind, die in einem sich teilenden Plasmablastenstadium sind. Die zuletzt genannten werden bevorzugt, da periphere Blutzellen leicht zugänglich sind. Oft wird eine Batterie von Tieren immunisiert und die Milz des Tieres mit dem höchsten Antikörpertiter wird entfernt und die Lymphozyten der Milz durch Homogenisierung der Milz mit einer Spritze gewonnen. Typischerweise enthält die Milz einer immunisierten Maus annäherungsweise 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphozyten.
Die antikörperproduzierenden B-Lymphozyten des immunisierten Tieres werden dann mit Zellen einer immortalisierten Myelomzelllinie fusioniert, wobei normalerweise die Myelomzelllinie aus derselben Art wie das immunisierte Tier stammt. Myelomzelllinien, die zur Bildung in hybridom-bildenden Fusionsverfahren eingesetzt werden, sind vorzugsweise keine antikörperproduzierenden Zellen, zeigen eine hohe Fusionseffizienz und zeigen einen Enzymmangel, der es ihnen unmöglich macht, in bestimmten Selektionsmedien zu wachsen, außer das Wachstum wird durch die erwünschte Fusion von Zellen (Hybridome) ermöglicht.
Es ist möglich, irgendeine der dem Fachmann bekannten Myelomzellen zu verwenden (Goding, Seiten 65-66, 1986, Campbell, Seiten 75-83, 1984). Beispielsweise können für den Fall, dass das immunisierte Tier eine Maus ist, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul eingesetzt werden. Sofern Ratten verwendet werden, können R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 eingesetzt werden; und die Zellen U-266, GMI500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 können alle in Verbindung mit menschlichen Zellfusionen eingesetzt werden.
Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1 Myelomzelllinie (ebenso bekannt unter P3-NS-1-Ag4-1), die von NIGMX Human Genetic Mutant Cell Repository auf Anfrage nach der Zelllinie mit der Zugriffsnummer GM3573 bezogen werden kann. Eine andere Mausmyelomzelllinie, die eingesetzt werden kann, ist die 8-Azaguanin resistente murine, nicht produzierende Myelom Zelllinie SP2/0.
Die Verfahren zur Herstellung von Hybriden der antikörperproduzierenden Milz oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen normalerweise das Mischen der somatischen Zellen mit den Myelomzellen in einem 2:1-Verhältnis, wobei das Verhältnis zwischen etwa 20:1 bis etwa 1:1 variieren kann und das ganze in Anwesenheit eines Agents oder von Agenzien (chemischen oder elektrischen), die eine Membranfusion fördern, durchgeführt wird. Von Kohler und Milstein (1975, 1976) wurden auch Fusionsverfahren beschrieben, die das Sendaivirus einsetzen, sowie solche, die Polyethylenglycol (PEG), wie z. B. 37 % (v/v) PEG einsetzen, wurden von Gefter et al. (1977) beschrieben. Auch der Einsatz von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist geeignet (Goding, Seite 71-74, 196).
Fusionsverfahren liefern gewöhnlich nur in einer sehr geringen Ausbeute lebensfähige Hybride, etwa 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁸. Das jedoch bedeutet kein Problem, da die lebensfähigen fusionierten Hybride von den elterlichen, unfusionierten Zellen ( insbesondere von unfusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unbegrenzt teilen würden) durch das Kultivieren in einem Selektionsmedium abgetrennt werden. Das Selektionsmedium enthält für gewöhnlich ein Agens, das die de novo Synthese von Nukleotiden in dem Gewebekulturmedium unterbindet. Beispielhafte und bevorzugte Agenzien sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de novo Synthese sowohl von Purinen als auch Pyrimidinen, wobei Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Sofern Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und Tymidin als Nukleotidquellen (HAT Medium) ergänzt. Sofern Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin ergänzt.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist das HAT-Medium. Im HAT-Medium überleben nur solche Zellen, die in der Lage sind, Nukleotide auf alternativen Wegen zu generieren. Den Melanomzellen fehlt das Schlüsselenzym eines Herstellungsweges, nämlich z. B. Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT), und so können sie nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Weg beschreiten, sie haben jedoch eine begrenzte Lebensdauer in Kultur und sterben gewöhnlich innerhalb von 2 Wochen. Folglich sind die einzigen Zellen, die in dem Selektionsmedium überleben, solche, die Hybride aus Myeloma- und B-Zellen geformt haben.
Eine derartige Kultivierung der Zellen stellt eine Population von Hybridomen bereit, aus denen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Üblicherweise wird die Auswahl der Hybridome mittels einer Kultivierung der Zellen nach Einzelzellverdünnung in Mikrotiterplatten und einem anschließenden Test mit der individuellen klonalen Überstände (nach etwa zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität durchgeführt. Das Assay sollte sensibel, einfach und schnell, wie Radioimmunoassays, Ezymimmunoassays, Zytotoxizitätsassays, Plaqueassays, Dot-Immunobinding-Assays und ähnliche sein.
Die ausgewählten Hybridomas würden dann seriell verdünnt und zu individuellen, antikörperproduzierenden Zelllinien hochgezogen werden, wobei die Klone dann unbegrenzt vermehrt werden können, um monoklonale Antikörper MAbs bereitzustellen. Die Zelllinien können auch auf zwei grundsätzlichen Weisen zur MAb-Herstellung eingesetzt werden. Eine Probe der Hybridome kann z. B. in ein histokompatibles Tier derjenigen Art, die auch zur Gewinnung der somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion verwendet wurde, injiziert werden (oft in die Bauchhöhle). Das injizierte Tier entwickelt Tumore, die spezifische monoklonale Antikörper sekretieren, welche von den fusionierten Zellhybriden produziert werden. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie das Serum oder die Bauchwasserflüssigkeit, können dann angezapft werden, um MAbs in hohen Konzentrationen bereitzustellen. Die einzelnen Zelllinien können auch in vitro kultiviert werden, wobei die MAbs auf natürliche Weise in das Kulturmedium abgegeben werden, aus welchem sie dann in hohen Konzentrationen gewonnen werden können. MAbs, die auf eine der beiden Methoden erzeugt wurden, können, sofern es erwünscht ist, unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren wie HPLC oder Affinitätschromatographie weiter gereinigt werden.
Große Mengen des monoklonalen Antikörpers können auch durch die Vervielfältigung von Hybridomazellen in vivo erhalten werden. Hierzu werden Zellklone in ein Säugetier, welches mit den elterlichen Zellen histokompatibel ist, z. B. syngenische Mäuse, injiziert, um das Wachstum eines antikörperproduzierenden Tumors anzuregen. Wahlweise werden die Tiere mit einem Hydrokarbon, besonders Öle wie etwa Pristan (Tetramethylpentadekan) vor der Injektion vorbereitet.
Fragmente der monoklonalen Antikörper können aus den wie oben beschrieben produzierten monoklonalen Antikörpern durch Verfahren, welche einen enzymatischen Verdau mit Pepsin oder Papain und/oder die Aufspaltung von Disulfidbrücken mittels chemischer Reduktion einschließen, erhalten werden. Alternativ können die monoklonalen Antikörperstücke, die in der vorliegenden Erfindung umfasst sind, unter Verwendung von automatisierten Peptidsynthetisiern synthetisiert werden.
Monoklonale Konjugate werden mit im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt, wobei die monoklonalen Antikörper, die wie oben beschrieben erzeugt wurden, z. B. mit einem Enzym in der Anwesenheit eines Kopplungsagens wie Glutaraldehyd oder Periodat zur Reaktion gebracht werden. Konjugate mit fluoreszierenden Markern werden in Anwesenheit dieser Kopplungsreagenzien durch die Reaktion mit Isothiocyanat hergestellt. Konjugate mit Metallchelaten werden auf ähnliche Art und Weise hergestellt. Andere Bestandteile, an welche Antikörper konjugiert werden können, schließen Radionuklide wie ³H, ¹²⁵L, ¹³¹I³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, und ^99mTc ein. Radioaktiv markierte monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung werden nach wohlbekannten Verfahren des Standes der Technik hergestellt. So können z. B. monoklonale Antikörper durch den Kontakt mit Natrium oder Kaliumjodid und einem chemischen Oxidationsmittel wie Natriumhypochlorit oder einem enzymatischen Oxidationsmittel wie Lactoperoxidase, jodiert werden. Monoklonale Antikörper können gemäß der Erfindung mit Technetium-⁹⁹ über ein Liganden Austauschverfahren, z. B. durch die Reduktion von Pertechnat mit Zinnlösung, durch das Chelatieren des reduzierten Technetium an einer Sephadexsäule und das Aufbringen des Antikörpers auf diese Säule oder durch direkte Markierungsverfahren, z. B. durch Inkubieren von Pertechnat, einem reduzierenden Agens wie SNCl2, einer Pufferlösung wie Natrium-Kalium-Phthalat-Lösung und dem Antikörper, markiert werden.
Es wird vom Fachmann anerkannt, dass monoklonale und polyklonale Antikörper, die spezifisch für ein Protein sind, das vorzugsweise in metastasierenden oder nicht metastasierenden menschlichen Prostatakrebs exprimiert wird, in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich sein kann. Dies kann die Bereitstellung von diagnostischen Kits zum Nachweis oder der Diagnose von menschlichem Prostatakrebs umfassen. Eine alternative Verwendung wäre die Verbindung solcher Antikörper mit therapeutischen Agenzien wie z. B. chemotherapeutischen Agenzien, und einer nachfolgenden Verabreichung an Patienten mit Prostatakrebs, wobei die Prostatakrebszellen so spezifisch zur Zerstörung angesteuert würden. Dem Fachmann ist bewusst, dass derartige Verwendungen im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen.
D. Immun-Nachweis-Assays
1. Immunodetektionsverfahren
Immunodetektionsverfahren schließen Verfahren ein, die die Bindung, die Aufreinigung, das Entfernen, das Quantifizieren oder allgemein den Nachweis von biologischen Bestandteilen einbeziehen. Die im Rahmen der Erfindung kodierten Proteine und Peptide können eingesetzt werden, um Antikörper, die mit diesen reagieren, nachzuweisen, oder in anders gearteten Ansätzen können Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, die dazu eingesetzt werden können, die kodierten Proteine oder Peptide nachzuweisen. Die einzelnen Schritte der verschiedenen geeigneten Immunodetektionsverfahren wurden in der wissenschaftlichen Literatur, wie z. B. bei Nakamura et al. (1957), beschreiben.
Im allgemeinen beinhalten immunabhängige Untersuchungen zum Bindungsverhalten (Immunobinding method) das Beschaffen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie ein Protein, Peptid oder einen Antikörper enthält, sowie das in Kontakt bringen der Probe mit einem Antikörper oder Protein oder Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung unter Umgebungsbedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen effektive ermöglichen.
Solche immunabhängigen Bindungsuntersuchungen schließen Verfahren zum Nachweis oder der Quantifizierung der Menge der reaktiven Bestandteile in der Probe ein, wobei die Verfahren den Nachweis oder die Quantifizierung von jeglichen Immunkomplexen, die während der Bindungsphase entstanden sind, erfordern. Für die Erfindung würde man eine Probe entnehmen, von der vermutet wird, dass sie ein Protein, ein Peptid oder einen entsprechenden Antikörper, der als Prostataerkrankungsmarker dienen kann, enthält, sowie dass man die Probe mit einem Antikörper oder kodiertem Protein oder Peptid je nach Fall in Kontakt bringt und anschließend die Menge der unter bestimmten Bedingungen gebildeten Immunkomplexe nachweist oder quantifiziert.
In Bezug auf den Antigennachweis kann die biologische Probe, die zu analysieren ist, eine beliebige Probe sein, von der vermutet wird, dass sie ein prostatakrebsspezifisches Antigen enthält. Eine solche Probe kann ein Gewebeschnitt oder eine Einzelprobe der Prostata oder des Lymphknoten, ein homogenisiertes Gewebeextrakt, eine isolierte Zelle, eine Zellmembranzubereitung, eine abgetrennte oder gereinigte Form einer der oben erwähnten, proteinenthaltenden Zusammensetzungen oder jede andere biologische Flüssigkeit, die in Kontakt mit Prostatagewebe kommt, einschließlich Blut, Lymphe oder auch Samenflüssigkeit, sein.
Das in Kontakt bringen der ausgewählten biologischen Proben mit dem Protein, Peptid oder Antikörper unter Umgebungsbedingungen und für einen Zeitraum, der effektiv und ausreichend zur Bildung von Immunkomplexen ist (primäre Immunkomplexe), ist im allgemeinen eine einfache Zugabe der Zusammensetzungen zu der Probe und ein Inkubieren der Mischung für einen Zeitraum, der lang genug ist, damit die Antikörper Immunkomplexe mit einem anwesenden Antigen bilden, d. h. an es binden, können. Nach dieser Inkubationszeit werden die Proben-Antikörperzusammensetzungen wie ein Gewebeschnitt, eine ELISA-Platte, ein Dot-Blot oder ein Western-Blot normalerweise gewaschen, um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen und somit nur den Nachweis von solchen Antikörpern, die spezifisch in dem primären Immunkomplex gebunden sind, zu erlauben.
Der Nachweis einer Immunkomplexbildung ist im Stand der Technik wohl bekannt und kann über die Anwendung von zahlreichen Verfahren erreicht werden. Diese Verfahren basieren normalerweise auf dem Nachweis von Labeln oder Markern, wie jeglichen radioaktiven, fluoreszierenden, biologischen oder enzymatischen Anhänge oder Labeln, die standardmäßig im Stand der Technik eingesetzt werden. Die U.S. Patente, die solche Label betreffen, schließen die Nummern 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241 ein. Selbstverständlich sind mit der Verwendung eines zweiten bindenden Ligandens, wie einem zweiten Antikörper oder einem Biotin-/Avidin-Liganden zusätzliche Vorteile verbunden. Dies ist im Stand der Technik bekannt.
Das kodierte (encoded) Protein, Peptid oder ein korrespondierender Antikörper, die im Nachweis eingesetzt werden, können selbst mit einem nachweisbaren Label markiert sein, wobei man dann einfach das Label nachweisen würde und darüber die Menge der primären Immunkomplexe in der Zusammensetzung bestimmen könnte.
Alternativ hierzu kann der erste zugegebene Bestandteil, der in dem primären Immunkomplex gebunden wird, durch den Einsatz eines zweiten Bindungsliganden, der eine Bindungsaffinität zu dem kodierten Protein, Peptid oder dem korrespondierenden Antikörper hat, nachgewiesen werden. In diesen Fällen kann der zweite Bindungsligand mit einem nachweisbaren Label markiert sein. Der zweite Bindungsligand ist oft selbst ein Antikörper, weswegen er „sekundärer" Antikörper genannt wird. Die primären Immunkomplexe werden mit dem markierten, sekundären Bindungsliganden oder Antikörper unter Umgebungsbedingungen und für eine Zeitspanne, die effektiv und ausreichend ist, um die Bildung von sekundären Immunkomplexen zu erlauben, in Kontakt gebracht. Die sekundären Immunkomplexe werden dann gewöhnlich gewaschen, um unspezifisch gebundene markierte sekundäre Antikörper oder Liganden zu entfernen und dann die übrigen Markierungen der sekundären Immunkomplexe nachzuweisen.
Weitere Verfahren schließen den Nachweis der primären Immunkomplexe in einem aus zwei Schritten bestehenden Ansatz ein. Ein zweiter Bindungsligand wie ein Antikörper, der eine Bindungsaffinität zu dem kodierten Protein, Peptid oder korrespondierenden Antikörper hat, wird eingesetzt, um einen sekundären Immunkomplex wie oben beschrieben zu bilden. Nach dem Waschen wird der sekundäre Immunkomplex mit einem dritten bindenden Ligand oder Antikörper, der Bindungsaffinität zu dem zweiten Antikörper zeigt, unter Umgebungsbedingungen und für eine Zeitspanne, die effektiv und ausreichend ist, um die Bildung eines Immunkomplexes (tertiäre Immunkomplexe) zu erlauben, in Kontakt gebracht. Der dritte Ligand oder Antikörper ist mit einem nachweisbaren Label markiert, wodurch der Nachweis der tertiären Immunkomplexe, die damit gebildet wurden, ermöglicht wird. Ein solches System ermöglicht eine Signalverstärkung, sofern dies erwünscht ist.
Immundetektionsverfahren sind offensichtlich zur Diagnose von Zuständen wie Prostatakrebs oder benigner Prostatahyperplasie geeignet. Hierbei wird eine biologische oder klinische Probe, von der vermutet wurde, dass sie entweder das kodierte Protein oder Peptid oder einen korrespondierenden Antikörper enthält, verwendet.
In der klinischen Diagnose oder bei der Überwachung von Patienten mit Prostatakrebs bedeutet der Nachweis eines Antigens, welches von einer Nukleinsäure für einen Prostatakrebsmarker kodiert wird, oder der Anstieg der Menge eines solchen Antigens im Vergleich zu der Menge in entsprechenden biologischen Proben eines gesunden Patienten, dass der Patient Prostatakrebs hat. Diese diagnostischen Verfahren beruhen zum Teil darauf, dass durch die vorliegende Erfindung gezeigt wurde, dass die Nukleinsäuren für die Prostatakrebsmarker in Proben mit Prostatakrebsgewebe überexprimiert sind (siehe die Beispiele weiter unten). Als ein Zwischenergebnis kann hieraus abgeleitet werden, dass wenigstens einige dieser Marker erhöhte Mengen des kodierten Proteins produzieren, welches dann ebenfalls als Prostatakrebsmarker verwendet werden kann.
Der Fachmann ist vertraut mit der Unterscheidung zwischen einer signifikanten Expression eines Biomarkers, die einen positiven Nachweis darstellt, und niedrigen oder Hintergrundexpression eines Biomarkers. In der Tat werden die Expressionslevel des Hintergrunds oft dazu eingesetzt, einen Grenze zu bilden, die dazu verwendet wird, um darüber gelagerte Messwerte als signifikant oder positiv zu bewerten. Eine signifikante Expression kann durch große Menge Antigen im Gewebe oder in der Körperflüssigkeit dargestellt werden oder in einem alternativen Ansatz auch über einen hohen Anteil an Zellen, die ein positives Signal innerhalb eines Gewebes geben.
2. Immunhistochemie
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit sowohl frisch eingefrorenen und Formalin fixierten Paraffinschnitten zur Immunhistochemie (IHC) eingesetzt werden. Jedes im Stand der Technik beschriebene IHC-Verfahren kann eingesetzt werden, wie z. B. solche, die in „Diagnostic Immunopathology", 2. Auflage, editiert von Robert B. Colvin, Atul K. Bhan und Robert T. McCluskey, Raven Press, New York, 1995, und insbesondere Kapitel 31 dieser Referenz, welches mit Gynecological and Genitourinary Tumors überschrieben ist (Seiten 579-597), von Debra A. Bell, Robert H Young und Robert E. Scully, beschrieben sind.
3. ELISA
Wie bereits dargstellt, können die gemäß der Erfindung kodierten Proteine und Peptide als immunogene Substanzen z. B. in Verbindung mit einer Impfstoffentwicklung, bei der Immunhistochemie und in ELISA-Assays eingesetzt werden. Eine offensichtliche Einsatzmöglichkeit der kodierten Antigene und korrespondierenden Antikörpern ist ein Immunoassay zum Nachweis des Markerproteins für Prostataerkrankungen, welches in der Diagnose und bei der Verlaufsüberwachung benötigt wird.
Immunoassays sind in ihrer einfachsten und direktesten Form Bindungsassays. Ausgewählte und bevorzugte Immunoassays sind die verschiedenen Arten des Enzymimmunoassays (ELISA, enzyme linked immunosorband assay) und der Radioimmunoassays (RIA), die im Stand der Technik bekannt sind. Besonders geeignet ist der immunhistochemische Nachweis in Gewebeschnitten. Es muss jedoch verstanden werden, dass der Nachweis nicht auf solche Techniken beschränkt ist und ebenso Western Blot, Dot Blot, FACS-Analyse und ähnliches eingesetzt werden können.
In einem ELISA werden z. B. Antikörper, die das erfindungsgemäß kodierte Protein binden, auf ausgewählte Oberflächen, die eine Proteinaffinität aufweisen, wie z. B. die Vertiefungen einer Polystrenmikrotiterplatte, immobilisiert. Anschließend wird eine zu testende Zusammensetzung, beispielsweise eine klinische Probe, von der vermutet wird, dass sie Antigene des Prostataerkrankungsmarkers enthält, in die Vertiefung der Mikrotiterplatte zugegeben. Nach einem Bindungsschritt und einem Waschschritt, um unspezifisch gebundene Immunkomplexe zu entfernen, kann das gebundene Antigen nachgewiesen werden. Der Nachweis wird normalerweise durch Zugabe eines zweiten Antikörpers, der für das Zielprotein spezifisch ist, und der mit einem nachweisbaren Label markiert ist, geführt. Diese Form des ELISAs wird „Sandwich-ELISA" genannt. Der Nachweis kann auch über die Zugabe eines zweiten Antikörpers gefolgt von der Zugabe eines dritten Antikörpers, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper hat und der mit einem detektierbaren Label markiert ist, geführt werden.
In einem weiteren exemplarischen ELISA wird die Probe, von der angenommen wird, dass sie ein Markerantigen der Prostataerkrankung enthält, auf der Oberfläche einer Mikrotitervertiefung immobilisiert und anschließend mit den Antikörpern der Erfindung in Kontakt gebracht. Nach einem Bindungs- und einem Waschschritt zur Entfernung von unspezifisch gebundenen Immunkomplexen wird das gebundene Antigen nachgewiesen. Da die anfangs eingesetzten Antikörper mit einem detektierbaren Label markiert sind, können die Immunkomplexe direkt nachgewiesen werden. Die Immunkomplexe können auch durch die Verwendung eines zweiten Antikörpers, der Bindungsaffinität zu dem ersten Antikörper hat und der mit einem detektierbaren Label markiert ist, nachgewiesen werden.
Im anderen ELISA-Typ, in welchem die Proteine und Peptide immobilisiert werden, erfolgt der Nachweis durch Antikörper-Competition. In einem solchen ELISA werden markierte Antikörper in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten zugegeben, um eine Bindung mit dem Proteinmarker der Prostataerkrankung zu erlauben und über das Label anschließend nachzuweisen. Die Menge des Markerantigens in einer unbekannten Probe wird dann durch das Mischen der Probe mit markierten Antikörpern vor und während der Inkubation in der beschichteten Vertiefung bestimmt. Die Anwesenheit von Markerantigen in einer Probe führt zu einer Abnahme der verfügbaren Antikörpermenge, die an die Oberfläche des beschichteten Reaktionsgefäßes binden kann und verringert damit das schlussendliche Signal. Dieses Verfahren ist geeignet, um Antikörper in einer unbekannten Probe nachzuweisen, wobei die unmarkierten Antikörper an die antigen-beschichtete Oberfläche des Bodengefäßes binden und so die Menge des verfügbaren Antigenes, welches die markierten Antikörper bindet, reduziert wird.
Unabhängig von dem gewählten Typ haben ELISAs bestimmte Merkmale gemeinsam, wie die Beschichtung, die Inkubation oder Bindung, das Waschen, um unspezifisch gebundene Bestandteile zu entfernen und den Nachweis der gebundenen Immunkomplexe zu führen. Diese sind im Nachfolgenden beschrieben:
Bei der Beschichtung einer Platte mit entweder Antigen oder Antikörper inkubiert man die Vertiefungen der Platte üblicherweise über Nacht oder für eine bestimmte Dauer mit einer Lösung, die Antigen oder Antikörper enthält. Die Vertiefungen der Platte werden dann gewaschen, um unvollständig absorbiertes Material zu entfernen. Die noch verfügbaren Oberflächen der Reaktionsgefäße werden dann mit unspezifischem Protein, welches unter Berücksichtigung der zu testenden Antisera immunologisch neutral ist, beschichtet. Solche unspezifischen Proteine schließen bovines Serumalbumin (BSA), Kasein und Milchpulverlösungen ein. Die Beschichtung blockiert unspezifische Adsorbtionsstellen der Oberfläche und reduziert damit den Hintergrund, der durch unspezifische Bindung des Antiserums an die Oberfläche verursacht würde.
Es ist wahrscheinlich bei ELISAs üblicher, ein zweites oder drittes Nachweismittel einzusetzen, als ein direktes Nachweisverfahren durchzuführen, so dass nach der Bindung des Proteins oder Antikörpers an die Gefäßoberfläche, nach dem Beschichten dieser mit nichtreaktivem Material, um den Hintergrund zu reduzieren und nach dem Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, diese immobilisierte Oberfläche mit einer Kontrollprobe für menschlichen Prostatakrebs und/oder einer klinischen oder biologischen Probe, die zu testen sind, unter Bedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen (Antigen/Antikörper) ermöglichen, in Kontakt gebracht wird. Der Nachweis der Immunkomplexe erfordert dann einen markierten sekundären Bindungsliganden oder Antikörper oder einen sekundären Bindungsliganden oder Antikörper in Verbindung mit einem markierten tertiären Antikörper oder dritten Bindungsliganden.
Mit der Formulierung „unter Bedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen (Antigen/Antikörper) effektive erlauben", versteht man Bedingungen, die vorzugsweise eine Verdünnung der Antigene und Antikörper mit einer Lösung wie BSA, bovinem Gamma-Globulin (BGG) und phosphatgepufferter Saline (PBS)/Tween einschließen. Die zugesetzten Agenzien helfen auch, den unspezifischen Hintergrund zu verringern.
Die „geeigneten" Bedingungen bedeuten außerdem, dass die Inkubation bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, um eine wirksame Bindung zu ermöglichen, durchgeführt wird. Inkubationsschritte finden typischerweise für einen Zeitraum von etwa ein bis zwei bis vier Stunden und vorzugsweise bei Temperaturen in der Größenordnung von 25°-27° C oder auch über Nacht bei etwa 4° C statt.
Im Anschluss an den Inkubationsschritt in einem ELISA werden die reaktionsfähigen Oberflächen gewaschen, um unkomplexiertes Material zu entfernen. Ein bevorzugtes Waschverfahren schließt das Waschen mit Lösungen wie PBS/Tween oder Boratpuffer ein. Im Anschluss an die Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der zu testenden Probe und dem ursprünglich gebundenen Material sowie den nachfolgenden Waschschritten können auch da Auftreten von minimalen Mengen der Immunkomplexe nachgewiesen werden. Zur Bereitstellung eines Nachweismittels werden sekundäre oder tertiäre Antikörper mit einem assoziierten Label, welches den Nachweis ermöglicht, bereitgestellt. Vorzugsweise wird dieses Label ein Enzym sein, das eine Farbveränderung während der Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat bewirkt. Daher ist es z. B. wünschenswert, den ersten oder zweiten Immunkomplex mit einer Urease, Glucoseoxidase, alkalischer Phosphatase oder einem Wasserstoffperoxidase-konjugierten Antikörper für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die die Bildung weiterer Immunkomplexe begünstigen, zu inkubieren (z. B. Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer PBS-enthaltenden Lösung wie PBS-Tween).
Nach der Inkubation mit dem markierten Antikörper und im Anschluss an den Waschschritt, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die Menge des Labels quantifiziert. Hierzu wird z. B. mit einem chromogenen Substrat wie Harnstoff und Bromkresolpurpur oder 2,2'-Azido-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure) [ABTS] und H₂O₂ für den Fall, dass es sich bei dem Enzymlabel um eine Peroxidase handelt, inkubiert. Die Quantifizierung wird dann über die Messung der Farbentwicklung z. B. unter Verwendung einer Spektrophotometers im sichtbaren Bereich ermöglicht.
4. Verwendung von Antikörpern für ein Radioimage
Die Antikörper werden dazu eingesetzt, die Expression des kodierten Markerproteins zu quantifizieren und zu lokalisieren. Der Antikörper wird dazu z. B. in einer Reihe von Verfahren markiert und eingesetzt, um die Dichte der Zellen, die das kodierte Protein produzieren, sichtbar zu machen.
Eine weitere Anwendung ist ein bildgebendes in vivo Verfahren eines pathologischen Prostatazustandes, unter Verwendung der oben beschriebenen monoklonalen Antikörper. Dieses Verfahren beinhaltet insbesondere die Verabreichung an einen Patienten von einer für die Bildgebung ausreichenden Menge eines nachweisbar markierten Prostatakrebsspezifischen monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon und eines pharmakologisch wirksamen Trägers. Das Verfahren enthält weiter den Nachweis der Bindung des markierten monoklonalen Antikörpers an das erkrankte Gewebe. Der Begriff „bildgebendes in vivo Verfahren" bezieht sich auf jedes Verfahren, welches den Nachweis von markieren monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon, die spezifisch an ein erkranktes Gewebe, welches im Körper des Patienten lokalisiert ist, binden, erlaubt. Ein „Patient" ist ein Säuger, vorzugsweise ein Mensch. Eine „für die Bildgebung ausreichende Menge" bedeutet, die Menge des nachweisbar markierten monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments desselben, die verabreicht wurde und ausreichend ist, um den Nachweis der Bindung des monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes desselben an das erkrankte Gewebe zu ermöglichen.
Ein zu berücksichtigender Gesichtspunkt bei der Auswahl eines Radionuklides für eine in vivo Diagnose ist es, dass die Halbwertzeit des Nuklides lang genug ist, so dass es auch nach dem Zeitraum für die maximale Aufnahme durch das Zielobjekt noch nachgewiesen werden kann, und kurz genug ist, so dass die schädliche Strahlenbelastung für den Wirt wie auch die Hintergrundbelastung minimiert wird. Idealerweise fehlt einem Radionuklid, das für in vivo Bildgebung eingesetzt wird, eine partikuläre Emission, wobei es jedoch eine große Zahl an Photonen in einem 140-2000 keV Bereich produziert, die mit herkömmlichen Gamma-Kameras nachgewiesen werden können.
Ein Radionuklid kann entweder direkt oder indirekt unter Verwendung einer intermediären funktionellen Gruppe an einen Antikörper gebunden werden. Intermediäre funktionelle Gruppen, die oft zur Bindung von Radioisotopen, die als Metallionen vorliegen, an Antikörper eingesetzt werden, sind Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Beispiele für Metallionen, die für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, sind ^99mTc, ¹²³I, ¹³¹I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ¹²⁵I, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr und ²⁰¹Tl.
Der monoklonale Antikörper oder ein Fragment desselben kann durch mehrere im Stand der Technik bekannte Verfahren markiert werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ebenso paramagnetische Isotope für den Einsatz eines in vivo Nachweises verwenden. Elemente, die besonders geeignet für eine durch Kernspintomographiebildgebende Untersuchungen (Magnetic Resonance Imaging, MRI) sind, schließen ¹²⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe ein.
Die Verabreichung von markierten Antikörpern kann lokal oder systemisch sowie intravenös, intraarteriell, über die Rückenmarksflüssigkeit oder ähnliches erfolgen. Die Verabreichung kann auch intradermal oder intrakavitar erfolgen in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Körperstelle. Nachdem genügend Zeit vergangen ist, so dass der monoklonale Antikörper oder ein Fragment desselben an das erkrankte Gewebe binden konnte, beispielsweise 30 Minuten bis 48 Stunden, wird die Region des zu untersuchenden Patienten unter Verwendung von üblichen bildgebenden Verfahren, wie MRI, SPECT, planarer Szintigraphie oder sich entwickelnder Abbildungstechniken untersucht werden. Der exakte Ablauf variiert notwendigerweise in Abhängigkeit von spezifischen Faktoren des Patienten, wie oben schon bemerkt, und hängt auch von der zu untersuchenden Körperstelle, den Verfahren der Verabreichung und dem Typ des Markers ab. Das Festlegen eines bestimmten Ablaufes stellt eine Routinetätigkeit für den Fachmann dar. Die Verteilung der gebundenen radioaktiven Isotope und ihre Zu- oder Abnahme im Verlauf der Zeit wird dann überwacht und aufgezeichnet. Im Vergleich mit Ergebnissen, die aus Untersuchungen mit klinisch gesunden Individuen stammen, kann das Vorliegen und das Ausmaß von erkranktem Gewebe bestimmt werden.
Es ist offensichtlich für den Fachmann, dass ähnliche Ansätze eingesetzt werden können, um die Bildung des kodierten Markerproteins für eine Prostataerkrankung im menschlichen Patienten mittels Radioimage nachzuweisen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für eine in vivo Diagnostik von Prostatakrebs im Patienten bereit. Diese Verfahren beinhalten gewöhnlich das Verabreichen einer effektiven Menge eines prostatakrebsspezifischen Antikörpers an den Patienten, wobei der Antikörper an einen Marker gekoppelt ist, wie z. B. einem radioaktiven Isotop oder kernspinaktivem Molekül, welches durch nicht inversive Verfahren nachweisbar ist. Dem Antikörper/Markerkonjugat wird ausreichend Zeit gegeben, um in Kontakt mit reaktiven Antigenen zu kommen, welche im Gewebe des Patienten vorliegen und anschließend wird der Patient einer Nachweisvorrichtung zur Identifizierung des nachweisbaren Markers ausgesetzt.
5. Kits
Die vorliegende Erfindung betrifft Immunodetektionskits für die Verwendung in den oben beschriebenen Immunodetektionsverfahren. Nachdem die kodierten Proteine oder Peptide dazu eingesetzt werden können, Antikörper nachzuweisen, und die korrespondierenden Antikörper dazu eingesetzt werden können, die kodierten (encoded) Proteine oder Peptide nachzuweisen, können einer oder beide dieser Komponenten in einem Kit vorliegen. Der Immunodetektionskit wird daher, in geeigneten Behältnissen, ein kodiertes Protein oder Peptid oder einen ersten Antikörper, der an das kodierte Protein oder Peptid bindet, und ein Immunodetektionsreagenz beinhaltet.
In bestimmten Ausführungsformen kann das kodierte Protein oder Peptid oder der erste Antikörper, der an das kodierte Protein oder Peptid bindet, an einen festen Träger gebunden sein, wie eine Säulenmatrix oder die Reaktionsfläche einer Mikrotiterplatte.
Die Immunodetektionsreagenzien des Kits können in jeder beliebigen Form vorliegen, einschließlich solcher nachweisbarer Marker, die mit dem gegebenen Antikörper oder Antigen assoziiert oder verbunden sind, sowie solcher nachweisbarer Marker, die mit einem sekundären Bindungsliganden assoziiert sind oder an jenen angelagert sind. Beispielhafte sekundäre Liganden sind z.B. solche sekundären Antikörper, die eine Bindungsaffinität für den ersten Antikörper oder das Antigen haben und solche sekundären Antikörper, die eine Bindungsaffinität für menschliche Antikörper haben.
Weitere geeignete Immunodetektionsreagenzien zur Verwendung in dem vorliegenden Kit schließen zwei Komponentenreagenzien ein, die einen zweiten Antikörper, der eine Bindungsaffinität für einen ersten Antikörper oder das Antigen hat, zusammen mit einem dritten Antikörper, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper hat, wobei der dritte Antikörper mit einem nachweisbaren Marker verknüpft ist.
Kits können außerdem geeignete Proben des kodierten Proteines oder Polypeptidantigenes entweder markiert oder unmarkiert enthalten, welches zur Erzeugung einer Standardkurve für das Nachweisassay verwendet werden kann.
Die Kits können Antikörper/Markerkonjugate enthalten, die entweder in vollständig konjugierte Form vorliegen, in Form von Zwischenprodukten vorliegen oder als separate Einheiten, die durch den Verwender des Kits konjugiert werden müssen, vorliegen. Die Komponenten des Kits können entweder in wässrigen Medien oder lyophilizierter Form verpackt werden.
Ein Behältnis bedeutet, dass die Kits grundsätzlich wenigstens ein Röhrchen, eine Teströhre, Flasche, Spritze oder ein sonstiges Behältnis beinhalten, in welches der Antikörper oder das Antigen gelagert werden können und vorzugsweise in geeigneter Menge bereitgestellt werden. Im Fall, dass ein zweiter oder dritter Bindungsligand oder eine weitere Komponente bereitgestellt werden, wird der Kit normalerweise einen zweiten, dritten oder entsprechend zusätzlichen Behälter, in welchem dieser Ligand oder diese Komponente aufbewahrt wird, beinhalten. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden typischerweise Vorrichtungen zur Aufnahme des Antikörpers, des Antigens und jeder weiteren Reagenz in einer abgeschlossenen Form zum Verkauf beinhalten. Solche Behältnisse können gespritzte oder spritzgeformte Plastikbehälter, in welchen die gewünschten Röhrchen gehalten werden, einschließen.
E. Nachweis und Quantifikation der RNA-Arten
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Identifikation von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe durch die Amplifikation und den Nachweis von Nukleinsäuren, die Prostatakrebszellmarkern entsprechen. Die biologische Probe kann jedes Gewebe oder jede Flüssigkeit sein, in welcher Prostatakrebszellen anwesend sein können, eingeschlossen Knochenmarksproben, Knochenmarksbiopsien, Lymphknotenaspirate, Lymphknotenbiopsien, Milzgeweben, Feinnadel Punktierungen, Hautbiopsien oder Gewebebiopsien von Organen. Weitere Proben können Körperflüssigkeiten sein, wobei die Körperflüssigkeit peripheres Blut, Lymphflüssigkeit, Ascite, serumhaltige Flüssigkeit, Pleuralergüsse, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Stuhl oder Urin sein kann.
Die Nukleinsäure, die als Vorlage oder Template (eng. template) zur Amplifikation eingesetzt wird, wurde aus Zellen isoliert, die in den biologischen Proben enthalten sind. Diese wurden gemäß Standardmethoden isoliert (Sambrook et al., 1989). Die Nukleinsäure kann als genomische DNA oder als fraktionierte oder Gesamtzelluläre-RNA vorliegen. Sofern RNA eingesetzt wird, ist es wünschenswert, die RNA in eine komplementäre cDNA umzuschreiben. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der RNA um Gesamtzelluläre-RNA und diese wird direkt als Template für die Amplifikation eingesetzt.
Primerpaare, die selektiv an die Nukleinsäure, die den prostatakrebsspezifischen Markern entsprechen, binden, werden mit der isolierten Nukleinsäure unter Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung erlauben, in Kontakt gebracht. Sobald sie hybridisiert sind, wird der Nukleinsäure/Primerkomplex mit einem oder mehreren Enzymen, die eine templateabhängige Nukleinsäuresynthese ermöglichen, in Kontakt gebracht. Mehrere Runden der Amplifikation, die auch als „Zyklen" bezeichnet werden, werden durchgeführt, bis eine ausreichende Menge des Amplifikationsproduktes erzeugt wurde.
Im nächsten Schritt wird das Amplifikationsprodukt nachgewiesen. In bestimmten Anwendungen kann der Nachweis mittels visueller Mittel erfolgen. Alternativ kann der Nachweis eine indirekte Identifikation des Produktes über eine Chemilumineszenz, eine radioaktive Szintigraphie von inkorperierten radioaktiven Markern oder fluoreszierenden Markern einschließen oder er kann über ein System, welches elektrische oder thermische Impulssignale verarbeitet (Affymax Technology; Bellus, 1994) erfolgen.
Im Anschluss an den Nachweis kann man die Ergebnisse, die in einem vorgegebenen Patienten erfasst wurden, mit einer statistisch signifikanten Referenzgruppe von normalen Patienten und Prostatakrebspatienten vergleichen. Auf diese Weise ist es möglich, die Menge des nachgewiesenen Markers mit den verschiedenen klinischen Zuständen zu korrelieren.
1. Primer
Der Begriff Primer, wie er hierin verwendet wird, schließt jede Nukleinsäure, die in der Lage ist, die Neusynthese von Nukleinsäure in einem templateabhängigen Verfahren zu starten order zu primen (eng. priming), ein. Typischerweise sind Primeroligonukleotide in einer Länge von 10 bis 20 Basenpaaren. Es können jedoch auch längere Sequenzen verwendet werden. Primer können als Doppelstrang oder Einzelstrang vorliegen, obwohl die Einzelstrangform bevorzugt ist.
2. Templateabhängige Amplifikationsverfahren
Eine Reihe von templateabhängigen Amplifikationsverfahren, um eine Markersequenz innerhalb eines Templates zu amplifizieren, sind verfügbar. Das am besten bekannte Amplifikationsverfahren ist die Polymerasekettenreaktion (im nachfolgenden PCR), welche ausführlich in den U.S. Patent-Nummern 4,683,195; 4,683,202 und 4,800,159 sowie in Innis et al., 1990, beschrieben sind.
In Kürze, bei einer PCR werden zwei Primersequenzen hergestellt, die komplementär zu einem Bereich auf den gegensätzlich komplementären Strängen der Markersequenz sind. Es wird ein Überschuss an Desoxynukleosidtriphosphaten zu der Reaktionsmischung zusammen mit einer DNA-Polymerase, z. B. Taq Polymerase zugegeben. Wenn die Markersequenz in der Probe vorliegt, werden die Primer an den Marker binden und die Polymerase wird die Primersequenz entlang der Markersequenz durch das Zufügen von Nukleotiden verlängern. Durch das Anheben oder Absenken der Temperatur der Reaktionsmischung werden die verlängerten Primer von der Markersequenz dissoziiert, um Reaktionsprodukte zu bilden. Weiter überschüssige Primer werden an die Marker und die Reaktionsprodukte binden und der Ablauf wiederholt sich.
Eine reverse Transkriptase-PCR-Amplifikation kann durchgeführt werden, um die Menge von amplifizierter mRNA zu quantifizieren. Verfahren, um RNA in cDNA revers zu transkribieren, sind weithin bekannt und in Sambrook et al., 1989, beschrieben. Alternative Verfahren zur reversen Transkription verwenden thermostabile DNA-Polymerasen. Solche Verfahren sind in WO 90/07641, eingereicht am 21. Dezember 1990, beschrieben. Polymerase Kettenreaktionsverfahren sind im Stand der Technik weit verbreitet. Ein besonders bevorzugtes Verfahren der RT-PCR wird nachfolgend in Beispiel 1 beschrieben.
Ein weiteres Ampflifikationsverfahren ist das Ligase-Kettenreaktionsverfahren („LCR"), welches in der europäischen Anmeldung Nr. 320 308 offenbart ist. Bei LCR werden zwei komplementäre Probenpaare vorbereitet. In Anwesenheit der Zielsequenz binden die einzelnen Paare gegensätzlich komplementäre Stränge der Zielsequenz, so dass sie aneinander angrenzen. In Gegenwart einer Ligase werden die zwei Probenpaare zu einer Einheit verbunden. Durch Temperaturzyklen wie bei der PCR werden die ligierten Einheiten von der Zielsequenz dissoziiert und dienen als neue Zielsequenzen zur Ligierung von überschüssigen Probenpaaren. Das U.S. Patent 4,883,750 beschreibt ein Verfahren ähnlich dem der LCR zur Bindung von Probenpaaren an Zielsequenzen.
Eine Qbeta-Replikase, wie sie in der PCT Anmeldung Nr. PCT/US87/00880 beschrieben ist, kann ebenso als eine noch weitere Amplifikationsmethode eingesetzt werden. In diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz, die eine komplementäre Region zu der Zielsequenz hat, in Anwesenheit einer RNA-Polymerase zu der Probe gegeben. Die Polymerase wird die replikative Sequenz kopieren, so dass diese dann nachgewiesen werden kann.
Ein isothermisches Amplifikationsverfahren, in welchem Restriktionsendonukleasen und Ligasen eingesetzt werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen, die in einem Strang der Restriktionsschnittstelle 5'-[alpha-thio]-Triphosphatnukleotide enthalten, zu erreichen, kann ebenso für die Vervielfältigung (Amplifikation) der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden (Walker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89; 392-396 (1992)).
Ein weiteres Verfahren, eine isothermische Amplifikation der Nukleinsäuren durchzuführen, ist die Strang Displacement Amplification (SDA), welche mehrere Runden eines Strangdisplacement und einer Synthese, d.h. Nicktranslation, involviert. Ein ähnliches Verfahren, genannt Repair Chain Reaction (RCR, „Reparaturkettenreaktion"), umfasst die Anlagerung mehrerer Proben innerhalb der Region, die zur Amplifikation ausgesucht wurde, mit einer nachfolgenden Reparaturreaktion, in welcher lediglich zwei der vier Basen vorliegen. Die anderen beiden Basen können als biotinylierte Derivate zum leichten Nachweis zugegeben werden. Ein ähnlicher Ansatz ist auch in der SDA gewählt. Ausgewählte spezifische Sequenzen können auch durch die Verwendung einer zyklischen Probenreaktion (CPR) nachgewiesen werden. Bei der CPR wird eine Probe, die am 3'- und 5'-Ende Sequenzen von unspezifischer DNA hat und im Mittelbereich die Sequenz einer spezifischen DNA umfasst, an eine DNA hybridisiert, die in der Probe vorliegt. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt, und die Produkte, die nach dem Verdau freigesetzt werden, als unterschiedliche Produkte identifiziert. Die Originalvorlage wird an eine weitere, im Kreislauf vorliegende Probe angelagert und die Reaktion wird wiederholt.
Noch ein weiteres Amplifikationsverfahren ist in der GB Anmeldung Nr. 2 202 328 und der PCT Anmeldung Nr. PCT/US89/01025 beschrieben. In der zuerst genannten Anmeldung werden „modifizierte" Primer in einer PCR-ähnlichen, von Template und Enzymen abhängigen Synthese eingesetzt. Die Primer werden durch die Markierung mit einer eingelagerten Einheit (z. B. Biotin) und/oder einer Nachweiseinheit (z. B. ein Enzym) markiert. In der an zweiter Stelle genannten Anmeldung wird ein Überschuss an markierten Proben zu der Untersuchungsprobe zugegeben. Bei Anwesenheit der Zielsequenz bindet die Probe und wird katalytisch gespalten. Nach diesem Spalten wird die Zielsequenz wieder freigesetzt, um erneut an eine im Überschuss vorliegende Probe zu binden. Die Spaltung der markierten Probe weist auf die Anwesenheit der Zielsequenz hin.
Ein weiteres Nukleinsäureamplifikationsverfahren ist das transkriptionsbasierte Amplifikationssystem (TAS), einschließlich dem nukleinsäurebasiertem Amplifikationssystem (NASBA) und 3 SR (Kwoh et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989); Gingeras et al., PT Application WO 88/10315). Bei der NASBA kann die Nukleinsäure durch eine standardmäßige Pheno/Chloroformextraktion zur Amplifikation bereitgestellt werden. Sie kann auch durch eine Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, die Behandlung mit Lysispuffern und Minispinsäulen zur Isolation von DNA und RNA oder einer Guanidiniumchloridextraktion von RNA bereitgestellt werden. Bei dieser Amplifikationstechnik bindet ein Primer, der zielsequenzspezifische Sequenzen hat. Während der anschließenden Polymerisation werden Hybride aus DNA/RNA mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut durch Hitze denaturiert werden. In jeder Runde wird durch Hinzufügung eines zweiten zielsequenzspezifischen Primers und nachfolgender Polymerisation aus der einzelsträngigen DNA eine doppelsträngige. Die Doppelstrang-DNA-Moleküle werden dann vielfach durch eine Polymerase, wie die T7- oder SP6-Polymerase transkribiert. In einem isothermischen zyklischen Reaktionsverlauf werden die RNAs in doppelsträngige DNA revers transkribiert und dann erneut von einer Polymerase wie T7 oder SP6 transkribiert. Die entstehenden Produkte sind, egal ob verkürzt oder vollständig, spezifische Zielsequenzen.
Davey et al., Europäische Anmeldung Nr. 329 822, offenbar einen Amplifikationsvorgang, der eine zyklische Synthese von Einzelstrang-RNA („ssRNA"), ssDNA und Doppelstrang-DNA („dsDNA") beinhaltet, die dann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann. Die ssRNA ist eine erste Vorlage für ein erstes Primeroligonukleotid, welches durch reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann aus den entstandenen DNA:RNA Duplexen durch die Wirkung einer Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die spezifisch RNA aus Duplexen mit DNA oder RNA angreift) entfernt. Die dabei entstandene ssDNA ist die zweite Vorlage für einen zweiten Primer, der auch die Sequenz eines RNA-Polymerasepromoters (beispielhaft dem T7 RNA-Polymerase) 5' zu den homologen Bereichen mit der Vorlage umfasst. Dieser Primer wird dann durch eine DNA-Polymerase verlängert (z. B. durch das große „Klenow"-Fragment der E. coli DNA Polymerase n, was zu einem Doppelstrang-DNA (dsDNA) Molekül führt, welches zwischen den Primern eine zu der ursprünglichen RNA identische Sequenz hat und zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz hat. Diese Promotorsequenz kann dann verwendet werden, um durch eine geeignete RNA-Polymerase zahlreiche RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann im Zyklus wieder verwendet werden, um dadurch zu einer sehr schnellen Amplifikation zu führen. Durch eine geeignete Auswahl an Enzymen kann diese Amplifikation im isothermischen Bereich und ohne durch die Zugabe von Enzym zu jedem Zyklus durchgeführt werden. Da der Prozess zyklisch abläuft, kann die Startsequenz entweder als DNA oder als RNA ausgewählt werden.
Miller et al., PCT Anmeldung WO 89/06700, offenbart ein Nukleinsäureamplifikationsprinzip, das auf der Hybridisierung einer Promotor/Primersequenz an einen ausgewählten DNA Einzelstrang („ssDNA") basiert und eine nachfolgende Transkription von zahlreichen RNA-Kopien dieser Sequenz umfasst. Dieses Prinzip ist nicht zyklisch, d. h. es werden keine neuen Vorlagen aus den entstandenen RNA-Transkripten produziert. Weitere Amplifikationsverfahren schließen „race" und „one-sided PCR" ein (Frohmann, M.A., in: PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, N. Y. (1990) und Ohara et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86: 5673-5677 (1989)).
Verfahren, die auf der Ligation von zwei oder mehreren Oligonukleotiden in Anwesenheit der Nukleinsäure basieren, haben die Sequenz des entstehenden „Dioligonukleotides", wobei die Amplifikation des Dioligonukleotides auch in einem Amplifikationsschritt der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann (Wu et al., Genomics 4: 560 (1989)).
3. Separationsverfahren
Im Anschluss an die Amplifikation kann es wünschenswert sein, die Amplifikationsprodukte von den Vorlagen und überschüssigen Primern abzutrennen, um zu bestimmen, ob spezifische Amplifikation erfolgt ist. Amplifikationsprodukte werden durch Agarose, Agarose-Acrylamid oder Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren abgetrennt (siehe Sambrook et al., 1989).
Alternativ können chromatographische Techniken eingesetzt werden, um eine Abtrennung zu bewirken. Es gibt eine Vielzahl von Chromatographien, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Absorptions-, Partitions-, Ionenaustausch- und Molekularsiebchromatographie, so wie zahlreiche Spezialtechniken, die Chromatographien wie Säulen-, Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie (Freifelder, 1982) einsetzen.
4. Identifikationsverfahren
Amplifikationsprodukte müssen visualisiert werden, um die Amplifikation der Markersequenzen zu bestätigen. Ein typisches Visualisierungsverfahren schließt das Färben eines Geles mit Ethidiumbromid und die Visualisierung unter UV-Licht ein. Alternativ können die Amplifikationsprodukte, sofern sie mit radioaktiv markierte oder fluorometrisch markierte Nukleotide inkorporiert haben, im Anschluss an die Auftrennung auf einem Röntgenfilm exponiert werden oder unter einem geeigneten anregenden Spektrum visualisiert werden.
Visualisierung kann indirekt erreicht werden. So können im Anschluss an die Auftrennung der Amplifikationsprodukte eine markierte Nukleinsäureprobe mit den amplifizierten Sequenzen in Kontakt gebracht werden. Die Probe ist vorzugsweise mit einem Chromophor konjugiert, kann aber auch radioaktiv markiert sein. In einer anderen Anwendung ist die Probe an einen Bindungspartner konjugiert, wie einen Antikörper oder ein Biotin, wobei das Gegenstück zu dem Bindungspaar eine nachweisbare Einheit trägt.
Der Nachweis kann durch Southern Blot und Hybridisierung mit einer markierten Probe erfolgen. Die Techniken, die im Southern Blot zusammengefasst sind, sind dem Fachmann wohl bekannt und können in vielen Standardwerken zu molekularbiologischen Protokollen nachgelesen werden (siehe Sambrook et al., 19989). In Kürze, es werden die Amplifikationsprodukte mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Gel wird dann mit einer Membran wie Nitrozellulose in Kontakt gebracht, um einen Transfer der Nukleinsäure und eine nichtkovalente Bindung zu ermöglichen. Nachfolgend wird die Membran mit einer chromophor-konjugierten Probe, die in der Lage ist, mit der amplifizierten Zielsequenz zu hybridisieren, inkubiert. Der Nachweis erfolgt durch das Exponieren der Membran auf einem Röntgenfilm oder einem Ionen emittierenden Nachweisgerät.
Ein Beispiel für das Vorangegangene ist im U.S.-Patent Nr. 5,279,721 beschrieben, welches ein Gerät und Verfahren zur automatisierten Elektrophorese und dem Transfer von Nukleinsäuren offenbart. Das Gerät erlaubt eine Elektrophorese und das Blotten ohne einen externen Eingriff auf das Gel und ist ideal geeignet, um das Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung auszuführen.
5. Kit-Bestandteile
Alle wesentlichen Materialien und Reagenzien, die für den Nachweis der Prostataerkrankungsmarker in einer biologischen Probe erforderlich sind, können in einem Kit zusammengefasst werden. Das Kit umfasst im Allgemeinen ein vorab ausgewähltes Paar von Primern für einen oder mehrere spezifische Marker. Beispielsweise kann ein Kit Primer einschließen, die RNA-Marker in normalem Gewebe, BPH-Gewebe, abgegrenztem Tumorgewebe oder metastasierend wachsendem Tumorgewebe oder einer beliebigen Kombination aus diesen nachzuweisen. Des Weiteren können geeignete Enzyme zur Amplifikation der Nukleinsäuren einschließlich verschiedener Polymerasen (RT, Taq, etc.), Desoxynukleotide und Puffer, um die notwendigen Reaktionsgemische für die Amplifikation bereitzustellen, beinhaltet sein. Bevorzugte Kits können auch Primer zum Nachweis einer Kontroll-, nicht differentiell exprimierten RNA, wie beispielsweise β-Aktin enthalten.
Die Kits werden gewöhnlich in geeigneter Form, verschiedene Behälter für jedes der individuellen Reagenzien und Enzyme sowie für jedes markerspezifische Primerpaar enthalten. Bevorzugte Primerpaare zur Amplifikation der Nukleinsäuren sind derart ausgewählt, dass sie die SEQ ID Nr: 1 amplifizieren.
Ein weiteres Kit wird eine Hybridisierungsprobe umfassen, die spezifisch für differentiell exprimierte Marker ist. Die Proben sind derart gestaltet, dass sie an eine Sequenz oder das Komplementär einer Sequenz, hierin bezeichnet als SEQ ID Nr: 1, hybridisieren. Solche Kits umfassen im Allgemeinen verschiedene Behälter für die individuellen Reagenzien und Enzyme sowie für jeden Marker eine spezifische Hybridisierungsprobe in einer geeigneten, dicht verschließbaren Form.
F. Verwendung von RNA-Fingerprinting, um Marker der Prostataerkrankung zu identifizieren
RNA-Fingerprinting ist eine Methode, in welcher RNAs, die aus verschiedenen Geweben, Zelltypen oder Behandlungsgruppen isoliert worden sind, gleichzeitig getestet werden können, um solche RNAs zu identifizieren, deren relative Häufigkeit variiert. Es wurden zwei Formen dieser Technologie simultan entwickelt und 1992 als RNA-Fingerprinting durch Differential Display beschreiben (Liang und Pardee, 1992; Welsh et al., 1992). (Siehe auch Liang und Pardee, U.S.-Patent 5,262,311.) Beide Techniken wurden in den nachfolgend beschriebenen Untersuchungen eingesetzt. Einige der hierin beschriebenen Untersuchungen wurden auf ähnliche Art und Weise gemäß Donahue et al., J. Biol. Chem. 269; 8604-8609, 1994, durchgeführt.
Alle Arten des RNA-Fingerprintings mittels PCR sind theoretisch ähnlich, jedoch unterscheiden sie sich im Design und der Anwendung der Primer. Der auffälligste Unterschied zwischen Differential Display und anderen Methoden des RNA-Fingerprintings ist es, dass das Differential Display Ankerprimer verwendet, die an den Poly-A-Schwanz der mRNAs hybridisieren. Eine Konsequenz hieraus ist, dass die PCR-Produkte, die mit Differential Display amplifiziert wurden, in Richtung 3'nichttranslatierter Bereich der mRNAs unausgewogen sind.
Die Grundtechnik des Differential Displays wurde im Detail beschrieben (Liang und Pardee, 1992). Hierzu wird die Gesamt -Zell-RNA für eine erste reverse Transkription mit einem verankernden Primer, der aus Oligo dT besteht, geprimed. Der Oligo dT-Primer wird unter Verwendung einer reversen Transkriptase, z. B. Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) reverse Transkriptase, verlängert. Die Synthese des zweiten Stranges wird durch zufällig ausgewählte Oligonukleotide, unter wenig stringenten Bedingungen eingesetzt, gestartet. Sobald eine doppelsträngige cDNA synthetisiert wurde, wird die Amplifikation gemäß Standard-PCR-Verfahren durchgeführt, wobei dieselben Primer verwendet werden. Die entstandenen DNA-Fingerprints werden mittels Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung oder Autoradiographie analysiert. Ein Vergleich der Fingerprints, die von den RNAs aus verschiedenen Zellen stammen und bei denen die gleichen Oligonukleotidprimer verwendet wurden, erlaubt die Identifizierung von mRNAs, die differenziell exprimiert werden.
Das RNA Fingerprint-Verfahren hat sich bereits als hilfreich in der Identifizierung von Genen, die bei Krebs differenziell exprimiert sind, erwiesen (Liang et al., 1992, Wong et al., 1993, Sager et al., 1993, Mok et al., 1994, Watson et al., 1994, Chen et al., 1995, An et al., 1995). Das RNA Fingerprint-Verfahren wird eingesetzt, um Gene zu identifizieren, die im Prostatakrebs differenziell exprimiert sind. Für diese Untersuchungen wurden RNAs verwendet, die aus Tumorgewebe und aus Tumoren abstammenden Zelllinien isoliert wurden, die sich wie Tumorzellen mit unterschiedlich metastasierendem Potential verhalten.
Das zugrunde liegende Konzept dieser Untersuchungen basierte darauf, dass Gene, die in Zellen mit unterschiedlichem metastasierenden Potential differenziell exprimiert sind, als Indikatoren des metastasierenden Potential verwendet werden können. Da diese Metastasierung eine Voraussetzung ist für die Progression des Prostatakrebses zu einer lebensbedrohenden pathologischen Form, können Indikatoren des metastasierenden Potentials auch Indikatoren für ein pathologisches Potential sein.
G. Konzept und theoretische Überlegungen zur relativen quantitativen RT-PCR
Eine reverse Transkription (RT) von RNA zu cDNA und eine nachfolgende relative quantitative PCR (RT-PCR) kann eingesetzt werden, um die relative Konzentration von spezifischen mRNA-Arten in einer Reihe von Gesamt-Zell-RNAs, die aus normalem, benignem und kanzerösem Prostatagewebe isoliert wurden, zu bestimmen. Durch die Feststellung, dass die Konzentration von spezifischen mRNA-Spezies variiert, wird gezeigt, dass das Gen, welches die spezifische mRNA-Spezies kodiert, differentiell exprimiert ist. Diese Technik kann dazu eingesetzt werden, um zu bestätigen, dass mRNA-Transkripte, von denen eine differenzielle Regulation mittels RNA Fingerprinting gezeigt wurde, im Verlauf des Prostatakrebses differentiell exprimiert sind.
Bei einer PCR erhöht sich die Zahl der Moleküle der amplifizierten Ziel-DNA um einen Faktor von annähernd 2 bei jedem Zyklus der Reaktion so lange, bis einige Reagenzien limitiert werden. Im Anschluss daran wird die Amplifikationsrate zunehmend vermindert, bis es zu keiner weiteren Zunahme der amplifizierten Zielsequenz zwischen den Zyklen kommt. Wenn man die Zyklenzahl auf der X-Achse gegen die logarithmische Konzentration der amplifizierten Ziel-DNA auf der Y-Achse aufträgt, kann man beobachten, dass sich eine Kurve von charakteristischer Form durch das Verbinden der aufgetragenen Punkte ergibt. Zu Beginn des ersten Zyklus ist die Steigung der Linie positiv und konstant. Dieser Bereich ist der lineare Teil der Kurve. Nachdem einige Reagenzien limitiert werden, beginnt die Steigung der Kurve abzunehmen und schließlich gegen 0 zu laufen. An diesem Punkt wird die Konzentration der amplifizierten Ziel-DNA asymptotisch gegenüber einiger der festgelegten Werte. Man nennt dies das Plateau der Kurve.
Die Konzentration der Ziel-DNA im linearen Teil der PCR ist direkt proportional zur Ausgangskonzentration der Vorlage, bevor die PCR begonnen wurde. Durch die Bestimmung der Konzentration des PCR-Produktes der Ziel-DNA in einer PCR-Reaktion, die dieselbe Anzahl an Zyklen durchlaufen hat und in ihrem linearen Bereich ist, ist es möglich, die relative Konzentration der spezifischen Zielsequenz in der ursprünglichen DNA-Mischung zu bestimmen. Sofern die DNA-Mischungen cDNAs sind, die aus RNAs synthetisiert wurden, welche aus verschiedenen Geweben oder Zellen isoliert wurden, kann die relative Häufigkeit der spezifischen mRNA, aus welcher die Zielsequenz abgeleitet wurde, für bestimmte Gewebe oder Zellen bestimmt werden. Diese direkte Proportionalität zwischen der Konzentration des PCR-Produktes und der relativen mRNA-Menge ist nur für den linearen Bereich der PCR-Reaktion gegeben.
Die endgültige Konzentration der Ziel-DNA in der Plateauphase der Kurve wird durch die Verfügbarkeit der Reagenzien im Reaktionsmix bestimmt und ist unabhängig von der ursprünglich eingesetzten Konzentration der Ziel-DNA. Aus diesem Grund muss die einzige Bedingung, die erfüllt sein muss, bevor die relative Menge einer mRNA-Spezies mittels RT-PCR für eine Reihe von RNA-Populationen bestimmt werden kann, diejenige sein, dass die Konzentrationen der amplifizierten PCR-Produkte aus PCR-Reaktionen, die sich im linearen Bereich ihrer Kurven befinden, durch Probenentnahme bestimmt werden.
Eine zweite Bedingung, die vorliegen muss, um mit einer RT-PCR-Untersuchung die relative Menge einer bestimmten RNA-Spezies erfolgreich bestimmen zu können ist, dass die Menge der amplifizierbaren DNAs gegen einen unabhängigen Standard normalisiert werden muss. Es ist das Ziel, mit einer RT-PCR-Untersuchung die Menge einer bestimmten RNA-Art im Verhältnis zur durchschnittlichen Menge aller mRNA-Arten in der Probe zu bestimmen. In der nachfolgend beschriebenen Untersuchung werden die mRNAs für β-Akin, Asparaginsynthetase und Lipocortin II als externe und interne Standards verwendet, mit denen die relative Menge der anderen mRNAs verglichen wird.
Die meisten Protokolle zur kompetitiven PCR verwenden interne PCR-Standards, die nahezu so häufig wie die Zielsequenz vorliegen. Dies ist ein wirksamer Ansatz, sofern die Produkte der PCR-Amplifizierung während der linearen Phasen gewonnen werden. In dem Fall, dass die Produkte entnommen werden, wenn die Reaktion sich der Plateauphase annähert, zeigt sich, dass die weniger häufig vorliegenden Produkte relativ überrepräsentiert werden. Vergleiche zur relativen Häufigkeit, die für zahlreiche verschiedene DNA-Proben durchgeführt wurden, z. B. bei der Untersuchung von RNA-Proben zur differentiellen Expression, können derart verzerrt werden, dass Unterschiede in der relativen Menge der RNAs geringer erscheinen als sie tatsächlich sind. Sofern der interne Standard sehr viel häufiger als die Zielsequenz in der Probe vorliegt, ist dies kein signifikantes Problem. Falls der interne Standard häufiger als die Zielsequenz vorliegt, kann ein direkter linearer Vergleich zwischen den RNA-Proben gemacht werden.
Die oben geführte Diskussion beschreibt die theoretischen Überlegungen für ein RT-PCR-Assay mit klinischem Material. Die mit klinischen Proben verbundenen Probleme sind, dass solche Proben in unterschiedlichen Mengen vorliegen (dies macht eine Normalisierung problematisch) und dass solche oft in verschiedener Qualität vorliegen (dies erfordert eine Co-Amplifikation einer verlässlichen internen Kontrolle, die vorzugsweise größer als die Zielsequenz ist). Diese beiden Probleme können mit einer RT-PCR bewältigt werden, wenn diese als relative, quantitative RT-PCR mit einem internen Standard, wobei der interne Standard ein amplifizierbares cDNA-Fragment ist, welches größer als das Ziel-cDNA-Fragment ist und wobei die Menge der mRNA, die den internen Standard kodiert, etwa 5-100fach höher als die der mRNA, welche die Zielsequenz kodiert, ist. Dieses Assay misst die relative Menge, nicht die absolute Menge der entsprechenden mRNA-Spezies.
Weitere Untersuchungen, die nachfolgend beschrieben sind, verwenden eine etwas konventionellere relative quantitative RT-PCR mit einem externen Standard-Protokoll. Diese Assays entnehmen die PCR-Produkte in der linearen Phase der Amplifikationskurven. Die Zahl der PCR-Zyklen, die optimal zur Probenentnahme ist, muss für jedes Ziel-cDNA-Fragment empirisch bestimmt werden. Zusätzlich müssen die reversen Transkriptaseprodukte der einzelnen RNA-Populationen, die aus den verschiedenen Gewebeproben isoliert wurden, sorgfältig normiert werden, um gleiche Konzentrationen der zu amplifizierenden cDNAs zu gewährleisten. Dies ist äußerst wichtig, da dieses Assay die absolute mRNA-Menge misst. Die absolute mRNA-Menge kann als Maß für eine differentielle Expression eines Genes nur dann eingesetzt werden, wenn die Proben normiert sind. Obwohl die empirische Bestimmung der linearen Phase der Amplifikationskurve und die Normierung der cDNA-Präparationen mühsam und zeitaufwendig sind, ist das resultierende RT-PCR-Assay denen, die von einer relativen quantitativen RT-PCR mit internem Standard abgeleitet sind, überlegen.
Ein Grund hierfür ist es, dass in Assays ohne internen Standard/Kompetitor alle Reagenzien zur Erzeugung eines einzigen PCR-Produktes im linearen Bereich der Amplifikationskurve umgesetzt werden und sich somit die Sensitivität des Assays erhöht. Ein anderer Grund ist es, dass bei nur einem PCR-Produkt der Nachweis des Produktes in einem elektrophoretischen Gel oder einer anderen Darstellungsmethode weniger komplex ist, weniger Hintergrund hat und leichter zu interpretieren ist.
H. Diagnose und Prognose für menschlichen Krebs
Die vorliegende Erfindung erlaubt die Diagnose und eine Prognose für menschlichen Prostatakrebs durch das Screenen nach Markernukleinsäuren. Auf dem Gebiet der Krebsdiagnose und -prognose herrscht immer noch große Unsicherheit. Es wurden eine Reihe von Markern vorgeschlagen, die mit der Metastasierung und Bösartigkeit korreliert sind. Diese werden im Allgemeinen als zytologische Protein- oder Nukleinsäuremarker klassifiziert.
Zytologische Marker schließen auch Zustände wie „Abrundung des Zellkerns (nuclear roundedness)" (Diamond et al., 1982) und Zellploidie ein. Proteinmarker schließen das prostataspezifische Antigen (PSA) und CA125 ein. Nukleinsäuremarker schließen ferner die Amplifikation von Her2/neu, einer Punktmutation in den p52- oder ras-Genen sowie eine Veränderung in der Größe von Triplet Repeat Segmenten von bestimmten Chromosomen ein.
Zu all diesen Markern sind gewisse Nachteile beschrieben, die mit Falsch-Positiven oder Falsch-Negativen assoziiert sind. Ein falsch-positives Ergebnis bedeutet, dass in einem Individuum, das keinen malignen Krebs hat, die Anwesenheit eines „Krebsmarkers" aufgezeigt wird. Beispielsweise werden erhöhte Serum-PSA-Spiegel mit Prostatakarzinom assoziiert. Dies tritt jedoch auch in einigen Individuen auf, die keinen maligne, keine benigne Hyperplasie der Prostata haben. Ein falsch-negatives Ergebnis bedeutet, dass in einem Individuum, das tatsächlich Krebs hat, der Nachweis der Anwesenheit eines spezifischen Markers fehlschlägt. Die Häufigkeit für falsch-negative Ergebnisse variiert bei jedem Marker und häufig auch bei Gewebetypen. So wurde z. B. für ras-Punktrnutationen berichtet, dass sie sich in einem Bereich zwischen 95 % bei Krebs der Bauchspeicheldrüse und einem Minimalwert von 0 % in einigen gynäkologischen Krebsformen bewegen.
Zusätzliche Probleme treten auf, wenn ein Marker nur innerhalb der transformierten Zellen selbst vorliegt. Ras-Punktmutationen können nur in den mutierten Zellen nachgewiesen werden und sind offensichtlich im Serum oder Urin des Patienten mit ras-aktivierten Karzinomen nicht vorhanden. Dies bedeutet, dass man, um den malignen Tumor nachzuweisen, eine Probe des Tumors selbst oder davon mutastasierten Zellen nehmen muss. Da es eine Aufgabe des Krebsnachweises ist, den Tumor, bevor er metastasiert, zu identifizieren und zu behandeln, müsste man den Tumor identifizieren und eine Probe entnehmen, bevor die Anwesenheit eines Krebsmarkers nachgewiesen werden könnte.
Schließlich treten auch spezielle Probleme mit Markern auf, die in normalen Zellen anwesend sind, jedoch in Krebszellen fehlen. Die meisten Tumorproben werden eine gemischte Population aus sowohl normalen wie transformierten Zellen enthalten. Wenn man nach Markern sucht, die in normalen Zellen anwesend sind, jedoch in reduzierten Mengen in transformierten Zellen auftreten, wird das Hintergrundsignal der normalen Zelle in der Probe die Anwesenheit der transformierten Zellen maskieren.
Ein idealer Krebsmarker wäre einer, der in malignem Krebs anwesend ist und in benignen Tumoren oder normalen Zellen entweder fehlt oder nur in signifikant niedrigeren Mengen existent ist. Da weiterhin jeder einzelne Marker typischerweise nur in einem Teil der malignen Zellen anwesend ist, ist es besser, eine Reihe von solchen Markern für jeden Krebstyp zu haben. Die vorliegende Erfindung macht es sich daher zur Aufgabe, mehrere neue Nukleinsäuremarker, die in malignem Prostatakarzinom in einem deutlich höheren Maße als in benignem oder normalem Prostatagewebe exprimiert sind, zu identifizieren.
Es kann vorweggenommen werden, dass bei klinischen Anwendungen menschliche Gewebeproben auf die Anwesenheit der Marker für Prostataerkrankungen, die hierin identifiziert werden, untersucht werden. Zu untersuchende Proben können aus Nadelbiopsien, chirurgischen Resektionsproben, Lymphknotengewebe oder Serum bestehen. In einigen Ausführungsformen werden die Nukleinsäuren aus diesen Proben extrahiert und amplifiziert wie es vorangehend beschrieben wurde. Einige Anwendungen würden Kits verwenden, die eine Vorauswahl von Primerpaaren oder Hybridisierungsproben enthalten. Die amplifizierten Nukleinsäuren würden, wie es vorangehend beschrieben wurde, z. B. mittels Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung oder Southern-Blot oder eines Festphasennachweises auf die Marker untersucht werden. Diese Verfahren sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die nachgewiesenen Mengen des ausgewählten Markers würden mit statistisch gültigen Gruppen von metastasierenden, nicht metastasierenden malignen, benignen oder normalen Prostataproben verglichen werden. Die Diagnose und Prognose für einen individuellen Patienten würde über den Vergleich mit solchen Gruppen ermittelt werden.
Ein Ausführungsbeispiel des Verfahrens der vorliegenden Erfindung setzt eine RT-PCR-Technik zum Nachweis von zirkulierenden Prostatakrebszellen ein (d. h. solchen, die bereits metastasieren), wobei Proben und Primer mit der Sequenz SEQ ID Nr: 1 eingesetzt werden. Ähnliche Techniken wurden in der PCT-Anmeldung Nr. WO 94/10343 beschrieben.
Metastasierende Prostatakrebszellen werden in haematopoetischen Proben durch die Amplifikation von prostatakrebsspezifischen Nukleinsäuresequenzen nachgewiesen.
Proben, die aus dem Blut oder Lymphknoten entnommen wurden, werden wie im Nachfolgenden beschrieben behandelt, um die gesamte Zell-RNA zu reinigen. Die isolierte RNA wird dann revers transkribiert unter Verwendung einer reversen Transkriptase und Primern, die ausgewählt wurden, um unter hochstringenten Bedingungen an die Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID Nr: 1 zu binden. Im Anschluss an die reverse Transkription werden die resultierenden cDNAs unter Verwendung von Standard-PCR-Techniken (nachfolgend beschrieben) und einer thermostabilen DNA-Polymerase amplifiziert.
Die Anwesenheit der Amplifikationsproduktes, die der Nukleinsäure des Prostatakrebsmarkers entspricht, kann durch mehrere alternative Mittel nachgewiesen werden. Gemäß eines Ausführungsbeispiels kann die Amplifikation mittels Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen werden. Alternativ kann das Amplifikationsprodukt im Anschluss an einen gelelektrophoretischen Schritt mittels standardmäßiger Southern Blot-Techniken, unter Verwendung von Hybridisierungsproben, die ausgewählt wurden, um spezifisch an die Nukleinsäuresequenz einen Prostatakrebsmarker zu binden, nachgewiesen werden. Die Hybridisierung der Probe kann im Anschluss mittels standardmäßiger Markierungsmittel, z. B. durch inkorporiertes [³²P]-Nukleotid und anschließender Autoradiographie nachgewiesen werden. Das Amplifikationsprodukt kann alternativ auch unter Verwendung eines Festphasennachweissystems, wie es oben beschrieben wurde, nachgewiesen werden, wobei eine Prostatakrebsmarker spezifische Hybridisierungsprobe und geeignete Markierungsmittel eingesetzt werden. Die Anwesenheit von Nukleinsäuren für Prostatakrebsmarker in Proben aus Blut oder Lymphknoten kann als Hinweis auf einen Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs betrachtet werden.
I. Gezielte Hemmung von Prostatakrebsmarkern
Grundsätzlich können die Prostatakrebsmarker, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, als Ziele für einen therapeutischen Ansatz bei Prostatakrebs dienen. Eines der identifizierten Gene, Zyklin A, wurde bereits als Ziel für eine Reihe von Agenzien beschrieben, die das Wachstum von Tumorzellen durch ein Vorantreiben einer Differenzierung oder einer Zellteilungshemmung verhindern. Es wurde z. B. berichtet, dass L-Tyrosin zu einer erhöhten Melanogenese führt und die replikative Alterung in der B16 Melanomzelllinie, die mit einer Abnahme der Zyklin A-Aktivität korreliert, bewirkt (Rieber & Rieber, 1994). Suramin ist ein Antitumoragens, das die Expression von Zyklin A in der DU-145 Prostatakrebszelllinie reduziert (Qiao et al., 1994). Rapamycin hemmt die Zellproliferation in der YAC-1 T Zelllymphomlinie und hemmt außerdem die mRNA-Produktion von Zyklin A (Dumont et al., 1994). Es ist nicht eindeutig, ob diese Inhibitoren direkt auf Zyklin A wirken oder irgendwo oberhalb des Signaltransduktions/Phosphorylierungskaskadewegs angreifen. Dennoch sollten Zyklin A-Inhibitoren die Zellproliferation hemmen und zu einer Abnahme des Tumorwachstums führen. Solche Inhibitoren können sich daher als therapeutische Agenzien für die Behandlung von Prostatakrebs nützlich erweisen.
Inhibitoren können aber auch potentiell aus einem bislang unbekannten Prostatakrebsmarker, der im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, entwickelt werden. Dies wird durch die Tatsache erschwert, dass bislang keine spezifische Funktion für die meisten der Genprodukte aufgefunden wurde und keine Daten über deren dreidimensionale Struktur verfügbar ist.
In einigen Fällen könnte die Proteinfunktion ausgehend von den primären Sequenzdaten extrapoliert werden, vorausgesetzt, dass Sequenzhomologien zwischen dem unbekannten Protein und einem Protein ähnlicher Sequenz und bekannter Funktion existieren. Proteine tendieren dazu, in großen Familien mit relativ ähnlichen Sequenzen und Funktionen aufzutreten. So haben z. B. eine Reihe von Serinproteasen wie Trypsin und Chymotrypsin erhebliche Sequenzhomologien und eine relativ ähnliche dimensionale Struktur. Weitere allgemeine Gruppen von homologen Proteinen schließen die verschiedenen Klassen von Transkriptionsfaktoren, Membranrezeptorproteinen, Tyrosinkinasen, GTP-bindenen Proteinen usw. ein. Die vermeintliche Aminosäuresequenz, die durch die Prostatakrebsmarkernukleinsäure der vorliegenden Erfindung kodiert wird, kann auf Sequenzhomologien gegen die Proteinsequenzdatenbanken der National Biomedical Research Fundation überprüft werden. Homologieüberprüfungen gehören zum Standardrepertoire des Fachmanns.
Man kann sogar dreidimensionale Strukturen aus den primären Sequenzdaten der kodierten Proteine ableiten. Wiederum gilt, sofern Homologien zwischen den kodierten Aminosäuresequenzen und anderen Proteinen mit bekannter Struktur bestehen, kann ein Modell für die Struktur des kodierten Proteins gestaltet werden, welches auf der Struktur des bekannten Proteins basiert. Ein Beispiel für diese Art der Vorgehensweise wurde von Ribas de Pouplana und Fothergill-Gilmmore berichtet (Biochemistry 33: 7047-7055, 1994). Diese Autoren entwickelten ein detailliertes dreidimensionales Modell für die Struktur der Drosophila-Alkoholdehydrogenase, welches teilweise auf Sequenzhomologien mit der bekannten Struktur der 3-α, 20-β-Hydroxysteroiddehydrogenase basierte. Sobald ein dreidimensionales Modell zur Verfügung steht, können unter Verwendung von Standard-Computermodeling-techniken Inhibitoren konstruiert werden. Dieses Gebiet wurde kürzlich von Sun und Cohen zusammengefasst (Gene 137: 127-132, 1993).
Antisense-Konstrukte
Der Begriff „Antisense" soll sich auf Polynukleotidmoleküle beziehen, die zu einem Teil des RNA-Markers für die Prostataerkrankung, wie sie hierin beschrieben wurde, komplementär sind. „Komplementäre" Polynukleotide sind solche, die eine Basenpaarung gemäß den Standardregeln der Komplementarität von Watson-Crick erlauben. Dies bedeutet, dass das größere Purin sich mit dem kleineren Pyrimidin paart, um Guaninpaarungen mit Cytosin (G:C) und Adenin mit Thymin (A:T) im Fall von DNA zu ermöglichen bzw. Adenin mit Uracil (A:U) im Fall von RNA zu paaren. Das Einfügen von weniger häufig auftretenden Basen wie Inosin, 5-Methylcytosin, 6-Mehyladenin, Hypoxanthin und anderer in die hybridisierenden Sequenzen stört die Paarung nicht.
Antisense-Polynukleotide, wenn sie in eine Zielzelle eingeführt werden, binden spezifisch an ihr Zielnukleotid und stören bei der Transkription, der RNA-Prozessierung, dem Transport, der Translation und/oder der Stabilität. Antisense-RNA-Konstrukte oder DNA, die eine solche Antisense-RNA kodiert, können eingesetzt werden, um die Gentranskription oder Translation oder beides innerhalb einer Wirtszelle sowohl in vitro wie in vivo zu hemmen, wobei beim in vivo-Schritt in einem Wirtstier einschließlich einem menschlichen Objekt vorgegangen wird.
Die intrazelluläre Konzentration der monovalenten Kationen beträgt in etwa 160 ml (10 mM Na⁺; 150 mM K⁺). Die intrazelluläre Konzentration der divalenten Kationen ist annähernd 20 mM (18 mM Mg⁺; 2 mM Ca⁺⁺). Die intrazelluläre Proteinkonzentration, die helfen würde, das Volumen der Hybridisierung zu verringern und dabei die wirksame Konzentration der Nukleinsäurearten herabzusetzen, ist 150 mg/ml. Konstrukte können in vitro unter den Bedingungen untersucht werden, welche in vivo-Bedingungen nachahmen.
Antisense-Konstrukte können gestaltet werden, um an den Promotor oder andere Kontrollregionen, Exons, Introns oder auch die Grenze zwischen Exons und Introns in einem Gen zu binden. Es kann berücksichtigt werden, dass das wirksamste Antisense-Konstrukt der vorliegenden Erfindung Regionen einschließt, die komplementär zum mRNA-Startpunkt sind oder solche Sequenzen, die hierin als Prostataerkrankungsmarker identifiziert wurden. Solche Konstrukte können verhältnismäßig leicht getestet werden, indem die Konstrukte in vitro zur Bestimmung, welche Menge des Zielproteins betroffen ist, zu untersuchen. Auf ähnliche Art und Weise kann auch schädliche unspezifische Hemmung der Proteinsynthese über die Bestimmung der Zielzelllebensfähigkeit in vitro gemessen werden.
Der hierin verwendete Begriff „komplementär" oder „Antisense" bedeutet Polynukleotide, die im Wesentlichen komplementär über ihre gesamte Länge sind und nur wenige Basen mit unterschiedlichen Paarungen haben. So werden z.B. Sequenzen aus fünfzehn Basenlänge als komplementär bezeichnet, wenn die komplementären Nukleotide dreizehn oder vierzehn aus fünfzehn haben. Selbstverständlich sind Sequenzen, die „vollständig komplementär" sind, solche Sequenzen, die über ihre gesamte Länge vollständig komplementär sind und keine Fehlpaarungen haben.
Andere Sequenzen mit einem niedrigeren Grad der Homologie sind ebenso zu berücksichtigen. Beispielsweise könnte ein Antisense-Konstrukt, welches eine begrenzte Region von hoher Homologie aufweist, jedoch auch nicht-homologe Regionen (z. B. ein Ribozym) enthält, gestaltet werden. Solche Moleküle würden, obwohl sie weniger als 50 % Homologie hätten, an die Zielsequenz unter geeigneten Bedingungen binden.
Wie oben bereits dargelegt, und obwohl die Antisense-Sequenzen eventuell vollständige cDNA-Kopien sind oder große Teile derselben, können sie auch kürzere Fragmente oder „Oligonukleotide", die hierin als Polynukleotide mit 50 oder weniger Basen definiert sind, sein. Obwohl kurze Oligomere (8-20) leichter herzustellen sind und die in vivo-Zugänglichkeit verbessern, sind zahlreiche weitere Faktoren in der Bestimmung der Spezifität der Basenpaarung involviert. Beispielsweise erhöht sich sowohl die Bindungsaffinität wie auch die Sequenzspezifität eines Oligonukleotides bezogen auf sein komplementäres Target, sofern seine Länge zunimmt. Es ist vorgesehen, dass Oligonukleotide aus 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder 100 Basenpaaren eingesetzt werden. Obwohl sowohl die ganze wie auch Teile der Gensequenz eingesetzt werden können im Zusammenhang mit der einer Antisense-Konstruktion, sollte statistisch betrachtet jede Sequenz einer Länge von 14 Basen nur einmal im menschlichen Genom vorkommen und daher ausreichen, um eine einzigartige Targetsequenz festzulegen.
Man könnte sich wünschen, Antisense-Konstrukte zu verwenden, die weitere Elemente, z. B. solche, die C-5 Propynpyrimidine einschließen. Oligonukleotide, die C-5 Propynanalogas des Uridins und Cytidins enthalten, stellten bereits ihre hohe Affinität, RNA zu binden, und ihre Fähigkeit starke Antisense-Inhibitoren der Genexpression zu sein, unter Beweis (Wagner et al., 1993).
Als eine Alternative zur Bereitstellung zielgerichteter Antisense-Moleküle können zielgerichtete Ribozyme eingesetzt werden. Der Begriff „Ribozym" bezieht auf ein RNA-basiertes Enzym, welches in der Lage ist, spezifische Basensequenzen sowohl in der DNA wie in der RNA anzusteuern und zu spalten. Ribozyme können entweder direkt auf Zellen einwirken, in Form von RNA-Oligonukleotiden, die Ribozymsequenzen beinhalten, oder als Expressionsvektoren, welche die gewünschten ribozymalen RNAs kodieren, in Zellen eingeführt werden. Ribozyme können in gleicher Weise, wie es für Antisense-Polynukleotide beschrieben wurde, eingesetzt und angewandt werden. Ribozymsequenzen können auch in derselben Weise, wie es für Antisense-Polynukleotide beschrieben wurde, verändert werden. Beispielsweise kann man non-Watson-Crick-Basen einführen oder gemischte RNA/DNA Oligonukleotide herstellen oder die Phosphodiesterrückgrade modifizieren oder die 2'-Hydroxy in der Ribosezuckergruppe der RNA modifizieren.
Eine weitere Alternative besteht darin, die Antisense-Oligo- und Polynukleotide über die Transkription von einem Expressionskonstrukt, das Nukleinsäuren trägt, welche die Oligo- oder Polynukleotide kodieren, als RNA bereitzustellen. In dieser Anmeldung bedeutet der Begriff „Expressionskonstrukt" jede Art eines genetischen Konstruktes, welches eine Nukleinsäure enthält, die ein Antisense-Produkt kodiert, wobei ein Teil oder die ganze Nukleinsäuresequenz transkribiert werden kann. Typische Expressionsvektoren schließen bakterielle Plasmide oder Phagen, wie beliebige der pUC- oder BluescriptT^M-Plasmidserien sowie die nachfolgend weiter besprochenen viralen Vektoren ein, die für die Verwendung in eukaryotischen Zellen angepasst sind.
Die Nukleinsäure kodiert ein Antisense-Oligo- oder Polynukleotid unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors. Ein „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die von der Synthesemaschinerie der Zelle oder einer eingeführten Synthesemaschinerie erkannt wird und welche für die Initiierung der spezifischen Gentranskription erforderlich ist. Der Satz „unter transkriptioneller Kontrolle" bedeutet, dass der Promotor an der korrekten Stelle und in der korrekten Orientierung in Bezug auf die Nukleinsäure ist, um die Initiation der RNA-Polymerase zu kontrollieren.
Der Begriff Promotor wird hierin verwendet, um auf eine Gruppe von transkriptionellen Kontrollmodulen Bezug zu nehmen, die um die Initiationsstelle der RNA-Polymerase II herum angeordnet sind. Viele der Erkenntnisse darüber, wie Promotoren organisiert sind, stammen von Analysen mehrerer viraler Promotoren, eingeschlossen solcher für die HSV-Thymidinkinase (tk) und SV40 frühen Transkriptionseinheiten. Solche Studien, die durch jüngere Arbeit vervollständigt wurde, zeigten, dass Promotoren aus einzelnen funktionellen Modulen zusammengesetzt sind, wobei jedes aus annähernd 7-20 bp DNA besteht und ein oder mehrere Erkennungsstellen für Transkriptionsaktivatoren oder Repressorproteine enthält.
Mindestens ein Modul eines jeden Promotors funktioniert, um die Startstelle der RNA-Synthese zu positionieren. Das am besten bekannte Beispiel hierfür ist die TATA-Box, auch wenn einigen Promotoren eine TATA-Box fehlt, wie z. B. dem Promotor für das Gen der terminalen Desoxynukleotidyltransferase von Säugern und dem Promotor für die späten Gene des SV40. In solchen TATA-Box-freien Promotoren überlagert ein einzelnes Element die Startstelle und hilft, die Stelle der Initiation festzulegen.
Weitere Promotorelemente regulieren die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation. Typischerweise sind solche in dem Bereich 30-110 bp stromaufwärts von der Startstelle lokalisiert. Trotzdem wurde für eine Reihe von Promotoren kürzlich gezeigt, dass sie auch funktionelle Elemente stromabwärts der Startstelle enthalten. Der Abstand zwischen Promotorelementen ist häufig flexibel, so dass die Promotorfunktion erhalten bleibt, falls Elemente umgekehrt werden oder relativ zueinander bewegt werden. Bei dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen Promotorelementen auf 50 bp ansteigen, bevor die Aktivität abzunehmen beginnt. In Abhängigkeit des Promotors scheint es, dass individuelle Elemente entweder kooperativ oder unabhängig voneinander arbeiten; um die Transkription zu aktivieren.
Der tatsächliche Promotor, der eingesetzt wird, um die Expression der Nukleinsäure, welche die hemmenden Peptide kodiert, zu kontrollieren, ist vermutlich nicht entscheidend, solange er in der Lage ist, die Peptide in der Zielzelle zu expremieren. Daher wird es bevorzugt, sofern eine menschliche Zelle angesteuert werden soll, die Nukleinsäure, welche die hemmenden Peptide kodiert, in der Nähe oder unter die Kontrolle eines Promotors zu stellen, der in der menschlichen Zelle aktiv ist. Allgemein gesprochen könnte ein solcher Promotor entweder einen menschlichen oder einen viralen Promotor einschließen.
Die Promotoren des „immediate early"-Genes des menschlichen Zytomegalovirus (CMV), des SV40 early-Genes und des Long Terminal Repeats des Rous sarcoma-Virus können eingesetzt werden, um eine hohe Expression von verschiedenen Proteinen zu erhalten. Die Verwendung von anderen viralen oder Säugerzell- oder Bakteriolphagenpromotoren, über die im Stand der Technik bekannt ist, dass sie eine Expression der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung erreichen, ist ebenso vorgesehen, vorausgesetzt, dass das Maß der Expression für den gewählten Zweck ausreichend ist.
Durch den Einsatz eines Promotors mit bekannten Eigenschaften, kann das Maß und das Muster der Expression eines Antisense-Oligo- oder Polynukleotides optimiert werden. Weiterhin kann die Wahl eines Promotors, der in Abhängigkeit eines spezifischen physiologischen Signals reguliert ist, die induzierbare Expression eines hemmenden Proteins erlauben. Zum Beispiel führt eine Nukleinsäure, die unter der Kontrolle des menschlichen PAI-1 Promotors steht, zu einer durch Tumornekrosefaktor induzierbaren Expression. Zusätzlich kann jede Promotor-/Enhancerkombination (wie durch die Eukaryotische Promotordatenbank EPDB) dazu eingesetzt werden, die Expression einer Nukleinsäure entsprechend der vorliegenden Erfindung anzutreiben. Die Verwendung eines T3, T7 oder SP6 zytoplasmatischen Expressionssystems ist eine weitere mögliche Ausführungsform. Eukaryotische Zellen können die zytoplasmatische Transkription von bestimmten bakteriellen Promotoren unterstützen, sofern die geeignete bakterielle Polymerase entweder als Teil des Transportkomplexes oder als zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt vorliegt.
Das Einführen einer Nukleinsäure in eine Zelle kann in vitro oder in vivo durch den Einschluss eines Markers in das Expressionskonstrukt bestimmt werden. Der Marker sollte zu einer erkennbaren Veränderung der transfektierten Zelle führen, um eine leichte Bestimmung der Expression zu erlauben. Es können Enzyme wie die Herpes Simplex Virus Thymidinkinase (tk) (eukaryontisch) oder die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) (prokaryontisch) eingesetzt werden.
Man kann außerdem ein Polyadenylierungssignal einführen, um eine angemessene Polyadenylierung des Transkriptes zu bewirken. Die Art des Polyadenylierungssignals ist vermutlich nicht entscheidend für einen erfolgreichen Einsatz und jede solche Sequenz sollte einsetzbar sein. Beispielsweise kann das SV40, β-Globin oder Adenovirus Polyadenylierungssignal eingesetzt werden. Es ist auch zu berücksichtigen, dass ein Element der Expressionskassette ein Terminator ist. Diese Elemente können dazu dienen, die Transkriptmenge zu erhöhen und ein Durchlesen von einer Kasette in eine andere Sequenz minimieren.
Liposomale Formulierung
Die Antisense-Oligo- oder Polynukleotide und/oder Expressionsvektoren können in einem Liposom gebunden sein. Liposomen sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipiddoppelmembran und einen inneren wässrigen Mediumanteil gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen haben viele Lipidschichten, die durch wässrige Medien getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Übermaß an wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten durchlaufen eine Selbstanordnung, bevor sich geschlossene Strukturen bilden oder Wasser umschließen und gelöste Substanzen zwischen den Lipiddoppelschichten aufgelöst werden (Ghosh und Bachhawat, 1991). Ebenso sind kationische Lipid-Nukleinsäurekomplexe wie Lipofektamin-Nukleinsäurekomplexe zu erwägen.
Die Liposomen können mit einem hämaglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert werden. Hierfür wurde gezeigt, dass dies eine Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Eintritt der Liposomen-verkapselten DNA in die Zelle fördert (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen können die Liposomen in Verbindung mit nuklearen, nichthistonhaltigen chromosomalen Proteinen (HMG-1) komplexiert oder eingesetzt werden (Kato et al., 1991). Die Liposomen können in Verbindung mit sowohl HVJ und HMG-1 komplexiert oder eingesetzt werden. Sofern solche Expressionsvektoren erfolgreich für die Übertragung und Expression eines Polynukleotides in vitro und in vivo eingesetzt wurden, sind sie auch für eine Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Im Falle, dass ein bakterieller Promotor in einem DNA-Konstrukt eingesetzt ist, ist es außerdem wünschenswert, in dem Liposom eine geeignete bakterielle Polymerase einzuschließen.
„Liposom" ist ein generischer Begriff, der eine Vielzahl von einzel- und multilamellaren Lipidvehikeln umfasst, die durch die Bildung einer geschlossenen Lipiddoppelschicht geformt werden. Zur Herstellung von Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung werden Phospholipide eingesetzt, die eine positive Nettoladung, eine negative Nettoladung tragen können oder neutral sein können. Dicetylphosphat kann eingesetzt werden, um eine negative Ladung auf die Liposomen zu übertragen und Sterylamin kann eingesetzt werden, um eine positive Ladung auf die Liposomen zu übertragen.
Für einen Einsatz geeignete Lipide können aus kommerziellen Quellen erhalten werden. Beispielsweise kann Dimyristylphophatidylcholine („DMPC") von Sigma Chemical Co. bezogen werden; Dicetylphosphat („DCP") kann von K & K Laboratories (Plainview, NY bezogen werden; Cholesterol („Chol") kann von Calbiochem-Behring bezogen werden; Dimyristylphosphatidylglycerol („DMPG") und andere Lipide können von Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.) bezogen werden. Stocklösungen der Lipide in Chloroform, Chloroform/Methanol oder t-Butanol können bei etwa –20°C aufbewahrt werden. Vorzugsweise wird Chloroform als das einzige Lösungsmittel eingesetzt, da es leichter als Methanol verdampft werden kann.
Phospholipide aus natürlichen Quellen wie Ei oder Sojabohnenphosphatidylcholin, aus dem Hirn gewonnene Phosphatiditsäure, aus dem Hirn oder Pflanzen gewonnenen Phosphatidylinositol, aus dem Herz gewonnenes Kardiolipin und aus Pflanzen oder Bakterien gewonnenes Phosphatidylethanolamin werden vorzugsweise nicht als primäre Phosphatide eingesetzt, d. h. 50 % oder mehr der Phosphatidgesamtzusammensetzung ausmachen, da dies in instabilen und leckenden Liposomen resultieren würde.
Liposomen können auf verschiedene Weisen hergestellt werden. Die Größe der Liposomen variiert in Abhängigkeit des Syntheseverfahrens. Ein Liposom, welches in einer wässrigen Lösung suspendiert ist, hat im Allgemeinen die Form eines sphärischen Vesikels, mit einer oder mehreren konzentrischen Schichten aus Lipiddoppelschichtmolekülen. Jede Schicht besteht aus einer parallelen Anordnung von Molekülen, die durch die Formel XY repräsentiert werden, wobei X eine hydrophile Einheit und Y eine hydrophobe Einheit ist. In wässriger Lösung richten sich die konzentrischen Schichten derart aus, dass die hydrophilen Einheiten dazu tendieren, mit der wässrigen Farbe in Kontakt zu bleiben und die hydrophoben Regionen zu einer Selbstassoziierung tendieren. Z. B. werden, sofern wässrige Phasen sowohl mit und ohne Liposom vorliegen, die Lipidmoleküle eine Doppelschicht bilden, bekannt als Lamelle, mit der Anordnung XY-YX.
Liposomen können gemäß bekannter Laborverfahren hergestellt werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden Liposomen durch die Mischung von liposomalen Lipiden in einem Lösungsmittel im Container, z. B. einer birnenförmigen Flasche aus Glas, hergestellt. Der Behälter sollte ein zehnmal größeres Volumen haben als das Volumen der erwarteten Liposomensuspension ist. Unter Verwendung eines Rotationsevaporators wird das Lösungsmittel bei ungefähr 40°C und negativem Druck entfernt. Das Lösungsmittel ist normalerweise innerhalb von etwa 5 Minuten bis zu 2 Stunden entfernt, in Abhängigkeit des gewünschten Volumens der Liposomen. Die Zusammensetzung kann dann in einem Desiccator unter Vakuum weiter getrocknet werden. Die getrockneten Lipide müssen im Allgemeinen nach etwa einer Woche entsorgt werden, da sie im Laufe der Zeit eine Tendenz zum Verderben haben.
Getrocknete Lipide können bei etwa 25-50 mM Phospholipid in sterilem, pyrogenfreiem Wasser durch Schütteln hydriert werden, bis die ganze Lipidschicht resuspendiert ist. Die wässrigen Liposomen können dann in Aliquots aufgeteilt werden, jedes in ein Röhrchen gegeben werden, lyophilisiert und unter Vakuum versiegelt werden.
Alternativ können Liposomen auch gemäß bekannter Laborverfahren hergestellt werden: Dem Verfahren von Bangham et al. (1965), dem Verfahren von Gregoriadis, wie es in DRUG CARRIERS INBIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed. (1979), Seiten 287- 341 beschrieben ist, dem Verfahren nach Deamer und Uster (1983), und dem Reverse-Phase Evaporationsverfahren, wie bei Szoka und Papahadjopoulo (1978). Die voran genannten Verfahren unterscheiden sich in ihrer jeweiligen Fähigkeit, wässrige Materialien einzuschließen sowie in ihren jeweiligen wässriger Raum-zu-Lipid Verhältnissen.
Die getrockeneten Lipide oder lyophilisierten Liposomen, die hergestellt wurden wie oben beschrieben, können in Nukleinsäurelösungen wiederhergestellt werden und mit einem passenden Lösungsmittel, z. B. DPBS, auf eine geeignete Konzentration verdünnt werden. Die Lösung wird dann in einem Vortexmixer heftig geschüttelt. Nicht eingeschlossene Nukleinsäure wird durch Zentrifugation bei 29.000 × g abgetrennt und die Liposomen im Pellet gewaschen. Die gewaschenen Liposomen werden bei geeigneter Gesamtphospholipidkonzentration, z. B. etwa 50-200 mM, resuspendiert. Die Menge der eingeschlossenen Nukleinsäure kann gemäß Standardverfahren bestimmt werden. Nach der Bestimmung der Menge der Nukleinsäure, die in den Liposomenzubereitungen eingeschlossen sind, können die Liposomen auf geeignete Konzentrationen verdünnt werden und bei 4°C bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt werden.
Das Lipid Dioleoylphosphaltidylchoin wird eingesetzt. Nukleaseresistente Oligonukleotide werden mit Lipiden in Anwesenheit eines Überschusses an t-Butanol vermischt. Die Mischung wurde gevortexed, bevor sie in einem Aceton/Trockeneisbad gefroren wurde. Die gefrorene Mischung wurde lyophylisiert und mit Hepes-gepufferter Saline (1 mM Hepes, 10 mM NaCl, pH 7,5) über Nacht hydriert, und anschließend wurden die Liposomen für 10 bis 15 Minuten im Ultraschallbad beschallt. Die Größe der liposomalen Oligonukleotide bewegt sich typischerweise zwischen 200 – 300 nm Durchmesser, wie sie durch das Submikron Particle Sizer Autodilute Model 370 (Nicomp, Sante Barbara, CA) bestimmt wurden.
Alternative Transportsysteme
Adenoviren:
Menschliche Adenoviren sind doppelsträngige DNA-Tumorviren mit einer Genomgröße von nahezu 36 kB (Tooz, 1981). Adenoviren wurden weigehend als Modell für die eukaryotische Genexpression untersucht und charakterisiert, wodurch sie zu einem attraktiven System für die Entwicklung von Adenoviren als Gentransfersystem wurden. Diese Gruppe von Viren ist leicht zu vermehren und zu manipulieren und sie zeigen in vitro und in vivo ein breites Wirtsspektrum. In lytisch infizierten Zellen sind Adenoviren in der Lage, die Wirtsproteinsynthese abzuschalten, die zelluläre Maschinerie zur Synthese großer Mengen an viralen Proteinen einzusetzen und massenhaft Virus zu produzieren.
Die E1-Region des Genoms schließt E1A und E1B ein, die Proteine kodieren, die für die Transkriptionsregulation des viralen Genoms sowie einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die E2-Expression, einschließlich E2A und E2B, erlaubt die Synthese der viralen replikativen Mechanismen, z. B. DNA-bindende Proteine, DNA-Polymerase und ein terminales Protein, welches die Replikation anstößt. Die E3-Genprodukte verhindern eine Zytolyse durch zytoxische T-Zellen und Tumornekrosefaktor und scheinen für die virale Verbreitung wichtig zu sein. Wirkungen, die mit dem E4-Protein verbunden werden, schließen die DNA-Replikation, die späte Genexpression und die Wirtszellabschaltung ein. Die späten Genprodukte schließen die meisten der Virionkapsidproteine ein und diese werden nur exprimiert, nachdem die meisten der Abläufe zur Verarbeitung eines einzelnen primären Transkriptes des Major Late Promotors erfolgt ist. Der Major Late Promotor (MLP) zeigt eine hohe Effizienz während der späten Phase der Infektion (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991).
Da nur ein geringer Anteil des viralen Genomes in cis erforderlich zu sein scheint (Tooze, 1981), bieten Adenovirus-abgeleitete Vektoren ein hervorragendes Potential zur Ersetzung von großen DNA-Fragmenten, sofern sie in Verbindung mit Zelllinien wie 293-Zellen eingesetzt werden. Ad5-transformierte menschliche embryonale Nierenzelllinien (Graham et al., 1977) wurden entwickelt, um essentielle virale Proteine in trans bereitzustellen.
Die besonderen Vorteile des Adenovirussystems beim Transport fremder Proteine in eine Zelle beinhalten (i) die Fähigkeit, relativ große Stücke der viralen DNA durch fremde DNA zu ersetzen; (ii) die strukturelle Stabilität der rekombinanten Adenoviren; (iii) die Sicherheit der adenoviralen Verabreichung an Menschen; und (iv) die Abwesenheit jeglicher bekannter Assoziationen einer Adenovirusinfektion mit Krebs oder bösartigen Tumoren; (v) die Fähigkeit, hohe Titer des rekombinanten Viruses zu erzeugen; und (vi) die hohe Infektiosität des Adenovirus.
Weitere Vorteile des adenoviralen Vektors gegenüber Retroviren beinhaltet das höhere Maß der Genexpression. Zusätzlich ist die Adenovirusreplikation unabhängig von einer Wirtsgenreplikation anders wie bei retroviralen Sequenzen. Da die adenoviralen transformierenden Gene in der E1-Region leicht entfernt werden können und trotzdem effiziente Expressionsvektoren bereitgestellt werden, können onkologische Risiken von Adenovektoren vernachlässigt werden können (Grunhaus & Horwitz, 1992).
Im Allgemeinen basiert ein adenovirales Gentransversystem auf rekombinant veränderten Adenoviren, die replikationsinkompetent gemacht wurden durch die Deletion eines Teiles ihres Genoms, wie E1, und die dennoch ihre Infektionskompetenz behalten. Sequenzen, die relativ große fremde Proteine kodeiren, können exprimiert werden, sofern zusätzliche Deletionen im adenoviralen Genom gemacht werden. Beispielsweise können Adenoviren, aus denen sowohl E1- und E3-Regionen entfernt wurden, bis zu 10 kb fremder DNA aufnehmen und sie können zu hohen Titern in 293-Zellen herangezogen werden (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991). Eine überraschend anhaltende Expression des Transgens im Anschluss an eine adenovirale Infektion wurde bereits beschrieben.
Andere virale Vektoren als Expressionskonstrukte.
Andere virale Vektoren können als Expressionskonstrukte in der vorliegenden Verwendung eingesetzt werden. ES können Vektoren eingesetzt werden, die von Viren wie Vacciniavirus (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988) und adeno-assoziierten Virus (AAV) (Ridgeway 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Hermonat und Muzycska, 1984) und Herpesviren abgeleitet sind. Sie bieten mehrere attraktive Eigenschaften für verschiedene Säugerzellen (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
Durch die kürzliche Entdeckung von defekten Hepatitis-B-Viren wurde neue Einsicht in die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener viraler Sequenzen gewonnen. In vitro-Untersuchungen zeigen, dass das Virus die Fähigkeit zur helferabhängigen Verpackung und reversen Transkription trotz einer Deletion von bis zu 80 % seines Genomes beibehalten hatte (Horwich et al., 1990). Dies wies darauf hin, dass ein großer Teil des Genoms durch fremdes genetisches Material ersetzt werden könnte. Der Hepatotropismus sowie die Persistenz (Integration) sind besonders attraktive Eigenschaften für den lebergerichteten Gentransfer. Chang et al. führte kürzlich das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) Gen in das Hepatits-B-Virusgenom der Enten an den Platz der Polymerase, Oberflächen- und vor oberflächenkodierenden Sequenzen ein. Dieses wurde mit einem Wildtypvirus in eine vom Vogel abstammende Hepatomzelllinie kotranfiziert. Das Kulturmedium, welches hohe Titer des rekombinanten Virus enthielt, wurde verwendet, um primäre Entenkükenhepatozyten zu infizieren. Eine stabile CAT-Genexpression konnte für wenigstens 24 Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden (Chang et al., 1991).
Nichtvirale Verfahren.
In der vorliegenden Erfindung werden auch einige nicht-virale Verfahren zum Transfer von Expressionsvektoren in kultivierte Säugerzellen berücksichtigt. Dies schließt eine Kalziumphosphatpräzipitation (Graham und Van Der Eb, 1973; Chen und Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Lipofektamin-DNA-Komplexe und Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu 1988) ein. Einige dieser Techniken können erfolgreich für eine in vivo oder ex vivo Verwendung angepasst werden.
Das Expressionskonstrukt kann auch einfach aus einem nackten rekombinanten Vektor bestehen. Die Übertragung des Konstruktes kann auf jede Art, wie sie oben beschrieben ist, die physikalisch oder chemisch die Zellmembran durchdringt, durchgeführt werden. Z. B. injizierte Dubensky et al. (1984) erfolgreich Polyomavirus-DNA in Form eines CaPO₄-Präzipitates in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen, um eine aktive virale Replikation und akute Infektion zu zeigen. Benvenisty und Neshif (1986) zeigten außerdem, dass eine direkte intraperitonale Injektion eines CaPO₄-präzipitierten Plasmids in der Expression der transfizierten Gene resultiert. Es ist angestrebt, dass die DNA, die ein Antisense-Prostatamarkerkonstrukt kodiert, auf ähnliche Weise auch in vivo übertragen werden kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Applikationsrouten
In den Fällen, in denen Liposomen, die Antisense-Oligo- oder Polynukleotide oder Expressionsvektoren enthalten, für klinische Anwendungen in Frage kommen, ist es unerlässlich, den Liposomenkomplex als pharmazeutische Zusammensetzung, die für die vorgesehene Anwendung geeignet ist, bereitzustellen. Grundsätzlich wird das die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bedingen, die im wesentlichen frei von Pyrogenen ist sowie von anderen Unreinheiten, die schädlich für Mensch und Tier sein können. Es wird außerdem grundsätzlich wünschenswert sein, geeignete Puffer einzusetzen, um den Komplex stabil zu halten und eine Aufnahme durch die Zielzellen zu erlauben.
Wässrige Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge der Antisense-Expressionsvektoren, die in Liposomen eingeschlossen sind wie oben besprochen, und sind weiterhin in pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder wässrigen Medien verteilt. Solche Zusammensetzungen werden auch als Inocula bezeichnet. Die Sätze „pharmazeutisch oder pharmakologisch anwendbar" beziehen sich auf Zusammensetzungen, die keine abstoßende, allergische oder andere unpassende Reaktion auslösen, sofern sie einem Tier oder einem Menschen wie vorgesehen verabreicht werden.
Der hierin verwendete Begriff „pharmazeutisch annehmbarer Träger" schließt jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien oder Ähnliches ein. Der Einsatz solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen im Stand der Technik bekannt. Ausgenommen den Fall, dass ein konventionelles Medium oder Agens mit der aktiven Subtanz inkompatibel ist, wird deren Verwendung in der therapeutischen Zusammensetzung berücksichtigt. Zusätzliche aktive Bestandteile können ebenso in der Zusammensetzung inkorporiert sein.
Lösungen der therapeutischen Zusammensetzungen können in Wasser mit oberflächenaktiven Stoffen wie Hydroxypropylzellulose entsprechend gemischt ist, hergestellt werden. Dispersionen können auch in Glycerol, flüssigem Polyethylenglykolen, Mischungen daraus und in Öl hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Lager- und Verwendungsbedingungen enthalten solche Zusammensetzungen Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die therapeutische Zusammensetzung wird Vorteilhafterweise in Form einer injizierbaren Zusammensetzung entweder als flüssige Lösung oder Suspension verabreicht; eine feste Form, die zur Lösung in oder einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet ist, kann ebenso hergestellt werden. Solche Zubereitungen können emulgiert werden. Eine typische Zusammensetzung für einen solchen Zweck enthält einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Z. B. kann die Zusammensetzung 10 mg, 25 mg, 50 mg oder bis zu etwa 100 mg des menschlichen Serumalbumins pro ml phosphatgepufferter Saline enthalten. Andere pharmazeutisch annehmbare Träger beinhalten wässrige Lösungen, nicht-toxische Arzneistoffträger und schließlich Salze, Konservierungsmittel, Puffer oder ähnliches.
Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger beinhalten Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Salzlösungen, parenterale Vehikel wie Natriumchlorid, Ringer's Dextrose etc. Intravenöse Träger schließen Flüssigkeits- und Nährstoffergänzer ein. Konservierungsmittel schließen antimikrobielle Agenzien, Antioxidantien, chelatierende Agenzien und inerte Gase ein. Der pH und die exakte Konzentration der verschiedenen Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung werden gemäß wohlbekannten Parametern eingestellt.
Eine wirksame Menge der therapeutischen Zusammensetzung bestimmt sich nach dem angestrebten Ziel. Der Begriff „unit dose" oder „Dosierung" bezieht sich auf physikalisch festgelegte Einheiten, geeignet für die Verwendung in einem Patienten, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der therapeutischen Zusammensetzung, die derart berechnet ist, dass sie eine erwünschte Antwort erzeugt, wie oben beschrieben, in Verbindung mit ihrer Verabreichung, d. h. einer geeigneten Route und Behandlungsablauf beinhaltet. Die zu verabreichende Menge sowohl gemäß der Zahl der Behandlungen und Einheitsdosen hängt von dem gewünschten Schutz ab.
Die genaue Menge der therapeutischen Zusammensetzung hängt außerdem von der Beurteilung des Fachmannes und den Besonderheiten eines jeden Einzelperson ab. Faktoren, welche die Dosis beeinflussen, schließen physikalische und klinische Zustände des Patienten, die Applikationsroute und die Stärke, Stabilität und Toxizität der speziellen therapeutischen Substanz mit ein. Für die vorliegende Anmeldung wird angestrebt, dass die Menge der therapeutischen Zusammensetzung, die in einer Einheitsdosis umfasst ist, sich zwischen 5-30 mg des Polynukleotides bewegt.
Die nachfolgenden Beispiele wurden eingefügt, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Es sollte für den Fachmann erkennbar sein, dass die nachfolgenden Beispiele, die offenbart sind, Techniken repräsentieren, von denen durch die Erfinder gezeigt wurde, dass sie in der Anwendung der Erfindung gut funktionieren und es kann daher angenommen werden, dass sie die bevorzugten Umsetzungen für die Praxis darstellen. Dennoch sollte der Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung akzeptieren, dass zahlreiche Veränderungen gemacht werden können, ohne sich vom Schutzbereich der Erfindung, wie er in den nachfolgend angehängten Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.
J. Material und Methoden
1. Anwendung der RNA Fingerprint Technik für das Auffinden von Biomarkern für Prostatakarzinome
RNA Fingerprint (in Anlehnung an Liang und Pardee, 1992; Welsh et al, 1992; Liang und Pardee, 1993) wurde für Nukleinsäuren verwendet, die aus primären humanen Prostatakarzinomen oder aus von Prostatatumor abgeleiteten Zelllinien mit unterschiedlichem Metastasierungspotential isoliert worden waren. Bei den in diesen Studien untersuchten Prostatakarzinom-Zelllinien handelte es sich um LnCaP, PC-3(pf), PC-3(mf) und DU-145. Diese Zelllinien unterscheiden sich in ihrem Potential Metastasen auszubilden. LnCaP ist nur schwach metastasierend, während die anderen drei Zelllinien sehr agressiv und stark metastasierend sind. Die primären humanen Prostatatumoren waren von unterschiedlichem Metastasierungsgrad.
Die Zelllinien wurden in RPMI-Medium (GIBCO-BRL, Inc.) vermehrt, welches mit 10% fötalem Minderserum, 5 Einheiten/ml Penicillin G, 5μg/ml Streptomycin und Fungizone gemäß den Angaben des Anbieters angereichert war. Alle Antibiotika wurden von GIBCO-BRL, Inc. bezogen. Die Zellen wurden in der späten Log-Phase der Wachstumskurve geerntet. Die Isolierung der RNA erfolgte durch die Guanidinium-Thiocyanat Methode (Chomczynski und Sacchi, 1987). Die RNA wurde auch aus festen Prostatatumoren mit der Guanidinium-Thiocyanat Methode (Chomczynski und Sacchi, 1987) isoliert, nachdem die Tumoren in flüssigem Stickstoff eingefroren und zu Pulver zermalen waren.
Nach der RNA Isolierung wurden die Nukleinsäuren mit Ethanol präzipitiert. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugation pelletiert und wieder in Wasser aufgelöst. Die aufgelösten Nukleinsäuren wurden anschließend mit RNase-freier Dnase I (Boehringer Mannheim, Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut, gefolgt von einer organischen Extraktion mit einem Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol Gemisch (25:24:1) und einer erneuten Präzipitation mit Ethanol.
Die mit DNase I behandelte RNA wurde dann durch Zentrifugation pelletiert und wieder in Wasser aufgelöst. Die Reinheit und Konzentration der RNA in Lösung wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei den Wellenlängen 260 nm und 280 nm (Sambrook et aL, 1989) abgeschätzt. Eine kleine Teilprobe der RNA wurde durch eine Gelelektrophorese in einem 3% igen Gel mit MOPS Puffer ((Sambrook et al., 1989) aufgetrennt, um die Abschätzung der Konzentration zu bestätigen und um festzustellen, ob die ribosomalen RNAs intakt waren. Diese RNA, die in Zukunft als Gesamtzelluläre-RNA bezeichnet wird, wurde für die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen verwendet.
2. Methoden, die in dem Differential Display-Verfahren verwendet wurden
Es wurden zwei Arten von RNA Fingerprint Untersuchungen mit der Gesamtzelluläre-RNA durchgeführt. Die erste Art dieser Untersuchungen folgte dem Differential Display-Protokoll von Liang und Pardee (1992) abgesehen von der Abänderung durch die Verwendung von 5'-biotinylierten Primern für den nicht-radioaktiven Nachweis von PCR Produkten.
In diesen Untersuchungen wurden 0.2 μg Gesamtzelluläre-RNA mit einem Ankerprimer bestehend aus Oligo dT, gefolgt von zwei willkürlich gewählten Nukleotiden, für die reverse Transkription vorbereitet. Die in diesen Studien verwendeten Ankerprimer wurden durch eine Biotinylierung am 5'-Ende weiter modifiziert.
Die reverse Transkription wurde mit 200 Einheiten einer MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transkriptase (GIBCO/BRL) im Beisein von 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10mM DTT, 500 pM dNTP, 1 pM biotinyliertem Ankerprimer und 1 U/μl RNase Inhibitor, durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend bei 37° C für 50 Minuten. Nach der reversen Transkription wurde das Enzym durch ein Erhitzen auf 65° C für 10 Minuten, denaturiert.
Ein Zehntel der erhaltenen reversen Transkriptions Reaktion wurde dann in einer PCR unter Verwendung des gleichen Ankerprimers, wie er in dem reverse Transkriptaseschritt verwendet wurde und einem zweiten Oligonukleotid mit einer willkürlich gewählten Sequenz, amplifiziert. Das PCR Reaktionsgemisch enthielt 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50mM KCl, 20 pM dNTP, 1.5 pM MgCl₂, 200 nM willkürliches Decamer, 1 μM biotinylierter Ankerprimer und 1 Einheit Taq DNA Polymerase (Boehringer Mannheim) in einem 40 μl Volumen. Die Amplifikation wurde in einem Thermo Cycler (MJ Research) durchgeführt, mit 30 Zyklen, einer Denaturierung bei 94° C für 30 Sec, einem Annealing bei 40° C für 2 Min und einer Extension bei 72° C für 30 Sec.
Die PCR-Produkte wurden dann auf einem 6% TBE-Harnstoff Sequenziergel (Sambrook et al., 1989) aufgetrennt und durch eine Chemilumineszenzreaktion, unter Verwendung des Seq-Light^TM Nachweissystems (Tropix, Inc.) aufgespürt. Differentiell auftretende PCR Produkte wurden aus dem Gel ausgeschnitten, mit den gleichen Primern wie in der ursprünglichen Amplifikation erneut amplifiziert und unter Verwedung der TA Klonierungsstrategie kloniert (Invitrogen, Inc. und Promega, Inc.).
3. Methoden, die für die RNA Fingerprint-Technik verwendet wurden
Die zweite Art der durchgeführten RNA Fingerprint-Untersuchungen war dem Protokoll von Welsh et al. (1992) sehr ähnlich. Dieser Ansatz verwendete eine Abwandlung des oben erwähnten, durch Verwendung von Agarosegelen und einem nicht-radioaktiven Aufspüren von Banden durch eine Ethidium-Bromid-Färbung (An et al., 1995). Die Gesamtzelluläre-RNAs wurden wie beschrieben (Chomczynski & Sacchi, 1987) aus gefrorenen Prostata-Gewebeproben oder kultivierten Zellen isoliert. Zehn Mikrogramm Gesamtzelluläre-RNA wurden mit 5 Einheiten RNAse-freier DNAse I (GIBCO/BRL) behandelt, in 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂ und 20 Einheiten RNAse Inhibitor (Boehringer Mannheim). Nach einer Extraktion mit Phenol/Chloroform und einer Präzipitation mit Ethanol wurden die RNAs in DEPC-behandeltem Wasser wieder aufgelöst.
Zwei μg der jeweiligen Gesamtzellulären-RNA wurden unter Verwendung von zufällig ausgewählten Hexamer-Primern und einer MMLV reversen Transkriptase (GIBCOBRL) in cDNA revers transkribiert. Die PCR wurde unter Verwendung von einem oder zwei willkürlich ausgewählten Oligonukleotid-Primern (10-12mere) durchgeführt. Die PCR Bedingungen waren: 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 50 pM dNTPs, 0.2 pM Primer, 1 Einheit Taq DNA Polymerase (GIBCO/BRL) in einem Endvolumen von 20 μl. Die Amplifikationsgrößen umfaßten 35 Rreaktionszyklen mit 30 Sec Denaturierung bei 94° C, 90 Sec Annealing bei 40° C und 60 Sec Extension bei 72° C. Eine abschließende Extension wurde für 15 Min bei 72° C durchgeführt. Die erhaltenen PCR Produkte wurden durch Elektrophorese in 2% igen Agarosegelen mit TBE Puffer (Sambrook et al., 1989) nach Größe aufgetrennt und in Fingerprints zerlegt. Die Fingerprints wurden durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Eine erneute Amplifikation wurde nicht durchgeführt.
Differentiell auftretende PCR Produkte, die möglicherweise differentiell exprimierte Gene darstellen, wurden mit einer Rasierklinge aus dem Gel ausgeschnitten, mit dem Geneclean Kit (Bio 101, Inc.) von der Agarose befreit, in Wasser eluiert und mit Hilfe der TA Klonierungsstrategie (Invitrogen, Inc., and Promega, Inc.) direkt in Plasmidvektoren kloniert. Diese Produkte wurden nicht nach dem anfänglichen PCR Fingerprint-Protokoll erneut amplifiziert.
4. Bestätigung der differentiellen Expression durch Relative Quantitative RT-PCR: Protokolle für die RT-PCR
a. Reverse Transkription
Fünf μg der Gesamtzelluläre-RNA aus jeder Gewebeprobe wurden in cDNA revers transkribiert. Die reverse Transkription wurde mit 400 Einheiten einer MMLV Reverse Transkriptase (GIBCO/BRL) in der Gegenwart von 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 500 pM dNTP, 50 ng zufällig ausgewählte Hexamere pro Mikrogramm an RNA und 1 U/μl RNase Inhibitor. Das Volumen der Reaktion betrug 60 μl. Das Reaktionsgemisch wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend bei 37° C für 50 Minuten. Nach der reversen Transkription wurde das Enzym durch ein Erhitzen auf 65° C für 10 Minuten, denaturiert. Nach der Hitzedenaturierung wurden die Proben mit Wasser auf ein Endvolumen von 300 μl verdünnt.
Es wurde RT-PCR verwendet, um die mRNAs auf differentielle Expression hin zu untersuchen. Die Sequenzen der Olignokleotide, die verwendet wurden, um die Amplifikation der unterschiedlichen cDNA Fragmente zu regeln, sind in Tabelle 2 dargestellt.
b. Relative Quantitative RT-PCR mit internem Standard
Die Konzentration der orginalen Gesamtzelluläre-RNAs wurde durch Messung der OD_260/280 (Sambrook et al., 1989) ermittelt und durch Untersuchung der ribosomalen RNAs auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel bestätigt. Es ist erforderlich, dass alle quantitativen PCR-Reaktionen nach Abschluss der reversen Transkiption auf gleiche Mengen an amplifizierbarer cDNA normalisiert werden. Ein Lösungsansatz dafür ist die Steuerung der PCR-Reaktion in die Plateauphase. Dieser Ansatz wurde in einigen der Untersuchungen verwendet, da er schnell und effizient ist. Es wurde Lipocortin II als interner Standard oder als Kompetitor verwendet. Die PCRs wurden wie folgt aufgesetzt: Reagenzien: 200 pM von jedem dNTP, 200 nM von jedem Oligonukleotide-Primer, 1 × PCR Puffer (Boehringer Mannheim einschließlich 1.5 mM MgCl₂), 3 μl verdünnte cDNA und 2.5 Einheiten der Taq DNA Polymerase I/100 μl Reaktionsvolumen.
Zyklus-Parameter: 30 Zyklen mit 94° C für 1 Min, 55° C für 1 Min und 72° C für 2 Min. Die Thermocycler waren entweder der MJ Research Thermocycler oder der Stratagene Robocycler.
c. Relative quantitative RT-PCR mit einem externen Standard
Es gibt drei mögliche Schwierigkeiten mit der oben beschriebenen relativen quantitativen RT-PCR Strategie. Erstens, der interne Standard muss bei dieser Strategie in etwa 4-10 mal häufiger vorhanden sein als das Zielmolekül um die Proben zu normalisieren. Zweitens, da die meisten PCR-Produkte den häufger vorhandenen internen Standard als Template verwenden, ist die Sensitivität des Assays unter dem Optimum. Drittens, der interne Standard muss wirklich gleich bleibend sein. Das Ergebnis ist, dass die oben beschriebene Strategie schnell, praktisch und auf Proben mit unterschiedlicher Qualität anwendbar ist, aber es fehlt ihr die Sensitivität für geringfügige Veränderungen in der Häufigkeit. Um diese Probleme zu bewältigen wurde eine Normalisierung mit β-Actin und Asparagin Synthetase mRNAs als externe Standards durchgeführt. Diese PCR Reaktionen wurden mit einer genügenden Anzahl von Zyklen durchgeführt, um die Produkte im linearen Bereich ihrer Amplifikationskurve zu halten. Für jede der Studien wurden Fotonegative der PCR Produkte in den mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen angefertigt. Diese Negative wurden gescannt und mit einem BioRad Densitometer quantifiziert. Die quantifizierten Daten wurden anschließend, durch den Vergleich der quatifizierten Daten aus jeder Studie mit denen aus einer ähnlichen Untersuchung mit einem aus β-Actin mRNA amplifizierten cDNA Fragment erhaltenen, auf die Unterschiede in den Ausgangskonzentrationen der amplifizierbaren cDNAs, normalisiert.
Die auf β-Actin normalisierten quantifizierten Daten wurden in Balkendiagramm-Darstellungen konvertiert.
K. Beispieie
Beispiel 1:
Relative quantitative Reverse Transkriptase – Polymerase Chain Reaction – Eine Methode um neue Gene (ESTs) als diagnostische Biomarker zu beurteilen
Die reverse Transkriptions – Polymerase chain reaction (RT-PCR) Protokolle, die im folgenden Beispiel beschrieben sind, wurden als Hilfsmittel zur Bestimmung der relativen Häufigkeit von mRNA Spezies, die in verschiedenen Geweben, Organen und Zellen exprimiert sind, entwickelt. Die verwendeten Protokolle mussten dem Bediürfnis entsprechend robust, reproduzierbar, verhältnismäßig quantitativ, sensitiv, konservativ im Verbrauch von Resourcen, schnell und mit einer hohen Durchsatzrate, sein. Die relative quantitative RT-PCR besitzt die technischen Eigenschaften, die in Theorie auf all diese Kriterien zutreffen. In der Praxis gibt es sechs wichtige Hürden um einen auf RT-PCR basierenden Assay, der die relative Häufigkeit von mRNA Spezies vergleicht, zu realisieren. Das nachstehend beschriebene Protokoll geht auf jede der sechs Hürden ein und hat die Durchführung der RT-PCR für diese Anwendung ermöglicht. Obwohl das vorliegende Beispiel auf die Identifikation und die Bestätigung einer differentiellen Expression in verschiedenen physiologischen Stadien einer Prostatadrüse bezogen ist, können die nachfolgend beschriebenen Methoden für jeden anderen Typ von Gewebe angewandt werden, um eine sensitive Methode zur Identifikation differentieller Expression zu Verfügung zu stellen.
Der Großteil der Kandidatengene, die mit dieser Methode untersucht wurden, sind unvollständige cDNA Fragmente die durch RNA Fingerprint – Methodik identifiziert wurden. Dies erforderte die Entwicklung eines relativ quantitativen Ansatzes um die differentielle Expression der mRNAs, von welchen die unvollständigen cDNA Fragmente stammten, unabhängig voneinander zu bestätigen. Die hauptsächliche Zielsetzung des beschriebenen Screening Protokolls ist die Beurteilung von Veränderungen in der relativen Häufigkeit der mRNA.
Das in der vorliegenden Offenbarung beschriebene Programm zum Aufspüren von Genen konzentriert sich auf die Untersuchung von humanem Gewebe und die Bestätigung muss mit dem gleichen biologischen Material erfolgen. Der Zugriff auf humanes Gewebe für die RNA Isolierung ist eingeschränkt. Diese Einschränkung ist besonders problematisch bei Northern Blots, dem üblichen Hilfsmittel, um differentielle Genexpression zu ermitteln. Northern Blots verbrauchen üblicherweise etwa 20 μg RNA pro Gewebe und pro identifiziertes Gen. Das bedeutet, dass für jede normal große verfügbare Gewebeprobe, nur 1-5 Northern Blots durchgeführt werden können, bevor die RNA einer Gewebeprobe vollständig aufgebraucht ist. Es ist klar, dass Northern Blots für eine erste Bestätigung von entdeckten Genen ernsthaft beschränkt sind und dass sie äußerst wertvolles biologisches Material zum Aufspüren von Genen und zur Charakterisierung verbrauchen.
Wegen den Einschränkungen der Menge an verfügbarem Gewebe und wegen dem Bedarf an hohem Durchsatz und der schnellen Wendung von Ergebnissen, wurde ein zwei-stufiges Protokoll entwickelt, technologisch fußend auf der reversen Transkription von RNA in cDNA, gefolgt von einer Amplifikation von spezifischen cDNA Sequenzen durch Polymerase Chain Reaction (PCR). Diese Verbindung von Techniken wird häufig auch als RT-PCR bezeichnet.
Ein Vorteil der RT-PCR ist es, dass sie relative geringe Mengen an RNA verbraucht. Mit 20 μg RNA pro untersuchter Probe, einer Menge die für die Durchführung eines einzelnen Norther Blot Experimentes erforderlich ist, können 50-200 RT-PCT Assays mit bis zu 4 Datenpunkten pro Assay, durchgeführt werden. Ein weiterer Vorteil ist eine hohe Durchsatzrate, wobei acht voneinander unabhängige Experimente, die acht unterschiedliche mRNAs untersuchen, gleichzeitig in einer einzelnen PCR-Maschine mit 96 Vertiefungen, durchgeführt werden können. Eine einzelne Person, die mit dieser Technik vertraut ist, kann deshalb acht Gene pro Tag ohne sichtlichen Zeitdruck untersuchen und auswerten. Zum Vergleich, auch wenn RNA in ausreichender Qualität und Quantität zur Verfügung stünde, um diese Anzahl von Northers Blots durchzuführen, würde eine in der Durchführung von Northern Blots ähnlich erfahrene Person arg bedrängt sein, um acht Gene in der Woche zu untersuchen und auszuwerten.
Zusätzlich zur niedrigen Durchsatzrate von Northern Blots, würden acht Northern Blots pro Woche auch noch etwa 400 μCi an ³²P pro Woche verbrauchen. Obwohl in den Händen einer Fachkraft nicht gefährlich, ist ³²P sicherlich unbequem in der Handhabung. Die RT-PCR vermeidet den Einsatz von radioaktiven Materialien.
Ein weiterer Vorteil der RT-PCR gegenüber den Northern-Blots als technologische Grundlage für die Auswertung der relativen Expression von RNA Spezies ist, dass die RT-PCR weit weniger sensitiv auf Unterschiede in der Qualität der zu untersuchenden RNA reagiert. Die hierin beschriebenen menschlichen Gewebe wurden den Patienten zum Zwecke der Behandlung entfernt und wurden nur zufällig für weitere Untersuchungen aufgehoben. Da es sich bei RNA um ein sehr instabiles Molekül handelt, wird erwartet, dass sie zumindest teilweise degradiert ist. Da die RNA in einem Northern Blot im Gel über die Größe aufgetrennt wird, erscheint teilweise degradierte RNA eher als Schmier, statt als einzelne Banden. Im Gegensatz dazu, amplifiziert die RT-PCR nur einen Abschnitt oder eine Domäne eines RNA Moleküls und solange dieser Abschnitt intakt ist, spielen die Größe oder der Grad der Degradation keine Rolle. In Folge dessen ergeben RNAs, die identisch sind, ausser dass sie sich im Ausmaß der Degradierung unterscheiden, in einem Northern Blot sehr viel variablere Signale, als in einer RT-PCR. Sind die Proben von unterschiedlicher Qualität, ein häufiger Fall bei humanen Studien, ist die relative Sensitivität der Techniken im Vergleich mit der Schwankung in der Probenqualität eine wichtige Abwägung.
In der Praxis dieser Methode wird die Gesamtzelluläre-RNA zunächst unter Verwendung von reverser Transkriptase und durch primen mit willkürlichen Hexameren erst in cDNA konvertiert. Dieses Protokoll ergab ein Gemisch an cDNAs, zu dem jede RNA entsprechend ihrem relativen Anteil in der orginalen Gesamtzellulären-RNA beigetragen hat. Wenn sich zwei RNA Spezies in ihrer ursprünglichen relativen Häufigkeit in der Gesamtzellulären-RNA, um das zehnfache unterscheiden, dann werden sich auch die cDNAs, die aus diesen beiden RNAs entstehen, um das zehnfache in ihrer relativen Häufigkeit in dem erhaltenen Gemisch an cDNAs unterscheiden.
Eine weitere Überlegung ist das relative Ausmaß der zielgerichteten Amplifikation einer cDNA durch PCR. In Theorie ist die Menge eines, durch PCR synthetisierten, amplifizierten Produktes gleich M(E^C). Wobei es sich bei M um die Menge der anvisierten Ziel-cDNA Moleküle vor Beginn der PCR handelt und bei C um die Anzahl der durchgeführten PCR-Zyklen. E ist die Effizienz eines Amplifikationsfaktors. Dieser Faktor ist komplex und variiert zwischen 1 und 2. Die wichtige Überlegung in diesem Assay ist, dass E über den größten Bereich der PCR Amplifikation annähernd konstant und annähernd gleich 2 bleibt. In PCR Reaktionen, die in allen Bereichen gleich sind, mit der Ausnahme, dass die als Matrizen verwendeten cDNAs von unterschiedlichen Gesamtzellulären-RNAs stammen, wird E in jeder Reaktion den gleichen Wert haben. Besitzt die vorgegebene cDNA eine Anfangsmenge von M₁ in der einen PCR Reaktion und eine Menge M₂ in einer anderen PCR Reaktion und wenn E den gleichen Wert in jeder der Reaktionen hat, dann beträgt nach C PCR-Zyklen die Menge des in der ersten Reaktion amplifizierten Zielmoleküls M₁ (E^C) und die Masse des in der zweiten Reaktion amplifizierten Zielmoleküls M₂ (E^C). Das Verhältnis dieser beiden Mengen wird durch die PCR Reaktion nicht verändert. Es beträgt M₁/M₂ = [M₁ (E^C)/M₂ (E^C)]. Demzufolge kommt es zu einer Erhaltung der relativen Proportionalität der amplifizierten Produkte während der PCR.
Da sowohl die reverse Transkription als auch die PCR derart durchgeführt werden können, dass die Proportionalität erhalten bleibt, ist es möglich, die relative Häufigkeit einer mRNA Spezies in einer oder mehreren Gesamtzellulären-RNA Populationen, durch zunächst Konvertierung der RNA in eine cDNA und anschließend einer Amplifizierung eines von der spezifischen mRNA erhaltenen cDNA Fragmentes durch PCR, zu vergleichen. Das Verhältnis der amplifizierten Mengen der Ziel-cDNAs dem Verhältnis der mRNAs in den originalen Gesamtzellulären-RNA Populationen sehr nahe oder identisch.
Die sechs bedeutendsten Herausforderungen und Hürden die zu überwinden, um RT-PCR am besten für die Quantifizierung der relativen Häufigkeit der RNA einzusetzen, sind:

1.) Die Degradierung der RNA während der Präparation muss minimal gehalten werden.
2.) Genomische DNA muss entfernt werden.
3.) Die RNA muss frei von Kontaminationen sein, die möglicherweise die reverse Transkription beeinflussen.
4.) Die Effizienz der RT ist variable. Die cDNAs, nicht die RNA, müssen auf gleiche Mengen amplifizierbarer cDNA normalisiert werden.
5.) Ein eingeschränkter linearer Bereich erfordert mehrfache Sammelpunkte in jeder Amplifikationskurve.
6.) Es besteht eine Röhrchen-zu-Röhrchen-Variabilität in der PCR.

Die Entwicklung von Techniken zur Überwindung dieser Hürden war erforderlich, um eine sensitive und genaue Methode für die RT-PCR zu Verfügung zu stellen, die auf jeden Gewebetyp oder physiologischen Status angewendet werden kann.
Die ersten drei Hürden für eine erfolgreiche RT-PCR beziehen sich alle auf die Qualität der in diesem Assay verwendeten RNA. Die in diesem Abschnitt beschriebenen Protokolle befassen sich mit den ersten beiden Hürden, wie sie im letzen Abschnitt beschrieben wurden. Dies sind die Erfordernisse, dass eine Degradierung der RNA während der Präparation minimal sein muss und dass genomische DNA aus der RNA entfernt werden muss.
Zwei bevorzugte Methoden für die RNA Isolierung sind die Guanidinium Thiocyanat Methode und Kits für die RNA Isolierung, die von Qiagen (Chatworth, CA) hergestellt werden, wobei die Kits der Einfachheit halber am meisten bevorzugt werden. Vier Protokolle werden mit der RNA, die nach einer der beiden Methoden (oder einer beliebigen Methode) isoliert wurde, durchgeführt, bevor die RNA in der RT-PCR eingesetzt wird.
Das erste dieser vier Protokolle ist der Verdau der RNAs mit DNase I, um die genomische DNA zu entfernen, die zusammen mit der Gesamtzellulären-RNA isoliert wurde. Vor dem DNase I-Verdau ist die RNA teilweise in Suspension mit 70% Ethanol. Ungefähr 50 μg der RNA (bestimmt durch OD_260/280) wird der Suspension entnommen und präzipitiert. Diese RNA wird in DEPC-behandeltem sterilem Wasser resuspendiert. Dazu werden 10×DNase I-Puffer (200 mM Tris-HCl; pH 8.4; 20 mM MgCl₂, 500 mM KCl), 10 Einheiten RNase-Inhibitor (GIBCO-BRL Cat #15518-012) und 20 Einheiten DNase I (GIBO-BRL Cat #18068-015) gegeben. Das Volumen wird durch zusätzliches DEPC-behandeltes Wasser auf 50 ml angepasst. Die Reaktion wird bei 37° C für 30 Minuten inkubiert. Nach dem DNase I-Verdau werden die RNAs mit den organischen Lösungsmitteln Phenol und Chloroform extrahiert gefolgt von einer Präzipitation mit Ethanol. Dies stellt die zweite Ethanolpräzipitation der isolierten RNA dar. Empirische Beobachtungen weisen darauf hin, dass diese wiederholte Präzipitation die Leistung der RNA in der nachfolgenden RT-Reaktion verbessert. Die Reaktion wird für 30 min bei 37°C inkubiert.
Nach dem DNase I-Verdau wird eine Teilmenge der RNA-Suspension in Alkohol entnommen und in drei Teile geteilt. Unterschiedliche Verfahren werden für jede der Drittelmengen angewandt.
Diese drei Verfahren sind: (1). Eine OD_260/280 -Messung wird nach Standardprotokoll durchgeführt und wird verwendet, um die Menge der RNA abzuschätzen und deren voraussichtliche Qualität. (2). Eine Teilmenge wird auf ein Agarosegel ausgebracht und die RNA wird mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Beobachtung, dass sowohl die 28S als auch die 18S RNAs als diskrete Banden zu sehen sind und dass es einen kleine Markierung oberhalb des Punktes an dem die 28S rRNA läuft, gibt, weist darauf hin, dass die RNA weitgehend intakt ist. Während es nicht kritisch für den Verlauf des Assays ist, dass die zu untersuchenden RNAs völlig frei von partiellen Degradierungen sind, ist es wichtig festzustellen, dass die RNA nicht so weit degradiert ist, als dass sie eine erhebliche Auswirkung auf das Aussehen der 28S rRNA hat. (3). Die Gesamtzellulären-RNAs werden einem auf PCR basierenden Test unterzogen, der bestätigt, dass die Behandlung mit DNase I die kontaminierende genomische DNA tatsächlich vollständig verdaut hat. Es ist sehr wichtig den vollständigen Verdau der genomischen DANN zu bestätigen, da die genomische DNA in PCR-Reaktionen als Matrize agieren kann und so zu falsch-positiven Signalen in dem unten beschriebenen relativen quantitativen RT-PCR Assay führt. Der Assay für die kontaminierende genomische DNA verwendet genspezifische Oligonukleotide, die ein 145 Nukleotide langes Intron (Intron #3) im Gen das für das Prostataspezifische Antigen (PSA) kodiert, flankieren. Dies ist ein Einzelkopie-Gen ohne Pseudogene. Es ist ein Mitglied der Kallikrein-Genfamilie von Serinproteasen, aber die in diesem Assay verwendeten Oligonukleotide sind spezifisch für PSA. Die Sequenzen dieser Oligonukleotide lauten:
5'CGCCTCAGGCTGGOGCAGCATT 3' (SEQ ID Nr.: 79)
und
5'ACAGTGGAAGAGTCTCATTCGAGAT 3' (SEQ ID Nr.: SO).
In den Assay für die kontaminierende genomische DNA, werden 500 ng bis 1.0 μg der jeweils mit DNase I behandelten RNAs als Matrizen in einer Standard-PCR (35-40 Zyklen, bei Bedingungen wie sie unten beschrieben sind) eingesetzt, in der die oben beschriebenen Oligonukletiode als Primer verwendet werden. Humane genomische DNA wird als geeignete Positivkontrolle eingesetzt. Diese DNA kann von einem kommerziellen Händler erworben werden. Ein positives Signal in diesem Assay ist die Amplifikation eines 242 Nukleotide langen, für genomische DNA spezifischen, PCR Produktes aus der untersuchten RNA Probe und auf einem Ethidiumbromid gefärbten Elektrophoresegel sichtbar gemacht. Wie in dem Assay angedeutet, sollte es keinen Hinweis auf genomische DNA in den für den unten beschriebenen RT-PCR Assay verwendeten RNAs geben. Ein Nachweis von kontaminierender genomischer DNA führte zu einem erneuten Verdau der RNA mit DNase I und einer neuen Bewertung der mit DNase I behandelten RNA durch Bestimmung des OD_260/280 Verhältnisses, der Beurteilung auf einem Eletrophoresegel und einem erneuten Test auf Kontamination mit genomischer DNA unter Verwendung des beschriebenen PCR Assay.
Die Standardbedingungen für eine PCR (wie im letzten Paragraph erwähnt) sind:
1 × GIBCO-BRL PCR Reaktions-Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl]
1.5 mM MgCl₂
200 μM von jedem der vier dNTPs
200 nM von jedem Oligonukleotide Primer
Matrize in angemessener Konzentration
2.5 Einheiten der Taq Polymerase pro 100 μl Reaktionsvolumen.
Unter Verwendung dieser Bedingungen werden 35-40 Zyklen der PCR durchgeführt, mit:
94° C für 45 Sec
55°-60° C für 45 Sec
72° C für 1:00 Minute.
Die im oberen Abschnitt beschriebenen Protokolle erlauben die Isolierung von Gesamtzellulärer-RNA die zwei der sechs Hürden für eine erfolgreiche RT-PCR überwindet, das heißt, die RNA ist in akzeptabler Weise intakt und frei von kontaminierender genomischer DNA.
Die reverse Transkriptasen, auch als RNA abhängige DNA Polymerase bezeichnet, wie sie gegenwärtig in molekularbiologischen Protokollen verwendet werden, sind bekanntermaßen weniger prozessiv als andere allgemein verwendete Nukleinsäure-Polymerasen. Es wurde beobachtet, dass nicht nur die Effizienz der Konvertierung von RNA in cDNA verhältnismäßig ineffizient ist, sondern auch eine Schwankung um das Mehrfache in der Effizienz der cDNA-Synthese unter Reaktionen auftritt, die RNAs als Matrizen verwenden, die ansonsten nicht voneinander zu unterscheiden sind.
Die ansonsten nicht unterscheidbar erscheinen. Die Ursachen für diese Variation sind nicht gut charakterisiert, aber empirisch gesehen wurde beobachtet, dass sich die Effizienz mancher reverser Transkriptionsreaktionen (RT) durch wiederholte organische Extraktionen und Ethanolpräzipitationen verbessern kann. Das deutet darauf hin, dass ein Teil der Schwankung in der RT durch Kontaminationen in den RNA Matrizen auftritt. In diesem Fall kann die oben beschriebene Behandlung mit DNase I die Effizienz der RT unterstützen, wenn die RNA einem weiteren Zyklus der Extraktion mit Phenol und Chloroform, sowie einer Präzipitation mit Ethanol unterworfen wird.
Eine Kontamination der RNA-Matrize mit Inhibitoren für die RT ist eine wichtige Hürde für eine erfolgreiche RT, die teilweise bewältigt werden kann, indem die RNA sorgfältig präpariert und wiederholt organisch extrahiert und mit Ethanol präzipitiert wird.
Die reversen Transkriptionsreaktionen werden unter Verwendung des von GIBCO-BRL LifeTechnologies (Gaithersburg, MD) hergestellten Superscript^TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthese K durchgeführt Bei Superscript^TM handelt es sich um die klonierte Form einer M-MLV reversen Transkriptase, deren Rnase H Aktivität entfernt wurde, um die Prozessivität zu erhöhen. In dem vorliegenden Beispiel wurden die veröffentlichten Protokolle des Herstellers für die Synthese cDNA, mit willkürlichen Hexameren geprimt, verwendet. Die cDNA Synthese kann auch mit einer Mischung aus willkürlichen Hexameren (oder anderen kleinen Oligonukletioden mit zufälliger Sequenz) und Oligo dT geprimt werden. Die Zugabe von Oligo dT erhöht die Effizienz der Konvertierung von RNA in cDNA nahe am Poly-A-Schwanz gelegen. Als Matrize werden 5 oder 10 Mikrogramm RNA verwendet (abhängig von der Verfügbarkeit). Nachdem die RT-Reaktion gemäß dem Protokoll, das von GIBCO-BRL angeboten wird, fertig ist, wird die RT-Reaktion mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 μl verdünnt.
Auch mit der am besten präparierten RNA und am stärkten prozessiven Enzym kann es zu signifikanten Schwankungen in der Effizienz der RT kommen. Diese Schwankung wäre ausreichend groß, damit die cDNA, die in unterschiedlichen RTs hergestellt wurde, nicht verlässlich miteinander verglichen werden kann. Um diese mögliche Schwankung zu überwinden, können cDNA Populationen, die in unterschiedlichen RT-Reaktionen hergestellt wurden, dahingehend normalisiert werden, dass sie gleiche Mengen an amplifizierbarer cDNA enthalten, die aus mRNAs synthetisiert wurde, von denen bekannt ist, dass sie in den physiologischen Stadien die untersucht werden, nicht variieren. In den vorliegenden Beispielen wurden die cDNAs, die aus den Gesamtzellulären-RNAs hergestellt wurden, auf gleiche Konzentrationen an amplifizierbarer β-Actin cDNA, bereinigt.
Ein μl von jeder verdünnten RT-Reaktion wurde einer PCR mit β-Actin- spezifischen Olignukleotid-Primern unterworfen. Die Primer sind so gestaltet, dass sie Introns überschreiten, was die Unterscheidung zwischen cDNA und genomischer DNA erlaubt.
Diese β-Actin-spezifischen Oligonukleotide haben die folgende Sequenz:
5' CGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATC 3' (SEQ ID Nr.: 81)
und
5' GAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAG 3' (SEQ ID Nr.: 82)
Die PCR wird unter Standardbedingungen, wie vorher beschrieben, mit entweder 19 oder 20 Zyklen durchgeführt. Das erhaltene PCR-Produkt hat eine Länge von 415 Nukleotiden. Das Produkt wird mit PCR unter Verwendung von Agarose-Gelelekrophorese und einer nachfolgenden Ethidiumbromid-Färbung untersucht. Das amplifizierte cDNA-Fragment wird dann durch Anstrahlen mit UV-Licht auf einem Transilluminator sichtbar gemacht. Ein Weisslicht-Bild des angestrahlten Gels wird mit einem IS-1000 Digital Imaging System, hergestellt von Alpha Innotech Corporation, festgehalten. Das festgehaltene Bild wird mit der vom Hersteller zu Verfügung gestellten Software, entweder Version 2.0 oder 2.01, ausgewertet, um die relativen Mengen der amplifizierten β-Actin cDNA in jeder RT-Reaktion zu bestimmen.
Um die verschiedenen cDNAs zu normalisieren, wird den am meisten konzentrierten cDNAs Wasser zugegeben, wie es mit dem im vorangegangenen Paragraphen beschriebenen Assay bestimmt wurde. Eine PCR wird mit 1 μl der neu verdünnten und angepassten cDNA unter Verwendung der β-Actin Oligonukleotide als Primer, wiederholt. Die Anzahl der PCR-Zyklen muss auf 21 oder 22 Zyklen erhöht werden, um die verminderte Konzentration der neu verdünnten cDNAs auszugleichen. Mit dieser empirischen Methode, können die cDNAs durch Verdünnung so angepasst werden, dass sie in etwa gleiche Mengen an amplifizierbarer cDNA enthalten. Gelegentlich muss dieser Prozess wiederholt werden, um annehmbare abschließende Normalisierung zu erhalten. Durch das Teilen der mittleren optischen Dichte aller beobachteter Banden durch die einer bestimmten Bande, kann eine Normalisierungsstatistik erstellt werden, die noch genauere Vergleiche der relativen Häufigkeit von RNAs, die in dem normalisierten Panel von cDNAs untersucht werden, erlaubt. Ein repräsentatives Gel ist in 12 gezeigt. Eine Auswertung der Daten ist in Tabelle 4 gezeigt.
Sobald die Normalisierungsstatistiken erhalten werden, kann die PCR mit verschiedenen genspezifischen Oligonukleotiden als Primer durchgeführt werden, um die relative Häufigkeit von anderen mRNAs, wie sie als cDNAs in dem normalisierten Panel von verdünnten RT-Reaktionen repräsentiert werden, zu ermitteln. In 13 sind die Daten von PCR-Produkten gezeigt, die von denselben RT-PCR Reaktionen amplifiziert wurden, wie sie in 12 beschrieben sind. In dieser Studie wird die Häufigkeit von zuvor nicht beschriebenen mRNA Spezies gezeigt. Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, dass diese mRNA in normaler Prostata oder Drüsen mit BPH nicht maßgeblich exprimiert wird. Es ist aus diesen Daten klar ersichtlich, dass dieses bislang nicht beschriebene Gen, genannt UC42 (SEQ ID Nr.: 18), weder in der durchschnittlichen normalen Prostata noch in Drüsen mit BPH maßgeblich exprimiert wird. Zwischen den untersuchten Tumoren, zeigten die meisten eine sehr starke Expression von UC42. Das cDNA-Fragment von UC42 ist kein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Intensitäten der Banden, die durch die PCR-Amplifikation der UC42 cDNA erhalten wurden, sind dann mit dem IS 1000 image analysis System gemessen worden. Die Daten sind in Tabelle 4 gezeigt. Die relative Intensität der UC42-Banden wurde dann durch Multiplikation der Intensitätsmengen mit der erhaltenen Normailisierungsstatistik auf die β-Actin Expression normalisiert, wie in Tabelle 4 gezeigt. Diese normalisierten Werte repräsentieren die relative Häufigkeit von UC42 mRNA in den überprüften Geweben. Die erhaltenen, normalisierten Werte sind in 13 graphisch dargestellt.
UC42 ist ein Beispiel für differentielle Expression mit einem hohen Mass an Induktion in den meisten Prostatakarzinomen, relative zu normalen Prostatas und solchen mit BPH. Die meisten mRNA Spezies sind nicht so differnziert exprimiert wie UC42. Ein Beispiel dafür ist die mRNA, die für den Transmembran-Tyrosinkinase-Rezeptor Hek kodiert, die in BPH im Vergleich zu normalen Prostatas deutlich nach oben reguliert ist.
In einer Untersuchung der relativen Häufigkeitsgrade von Hek mRNA, die nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, wurden die normalen und die Tumorproben zusammengefasst untersucht. Niedrige Expressionsgrade wurden im Pool der normalen Prostatagewebe beobachtet, verglichen mit denen die in BPH beobachtet wurden.
Durch die Normalisierung dieser Werte auf den β-Actin Standard mit Hilfe der Normalisierungsstatistiken ist es möglich, die Unterschiede in der relativen Häufigkeit von Hek mRNA zu quantifizieren. Diese normalisierten Daten sind in dem in 14 gezeigten Balkendiagramm graphisch dargestellt. Ähnlich zu den Beobachtungen die für UC42 gemacht wurden, zeigen die meisten, aber nicht alle der BPH-Proben, verglichen mit einem Pool an normalen Prostatas, eine erhöhte Häufigkeit von Hek mRNA. Im Durchschnitt war die Häufigkeit der beobachteten Hek mRNA in den BPH-Proben um das 2.9 fache höher als in einer durchschnittlichen normalen Prostata, die durch einen Pool von normalen Drüsen vertreten war.
Während diese Beobachtungen mit vielen ähnlichen Studien, die eine Hek-Expression unter Verwendung von anderen Gewebeproben und cDNAs untersucht haben, übereinstimmen, weichen sie von den Beobachtungen, die im nächsten Abschnitt beschrieben sind, ab. Dabei wird ein RT-PCR Assay diskutiert, der zusammengefasste cDNAs verwendet und dem es eher möglich ist, Daten aus dem linearen Anteil der Amplifikationskurven von PCR-Reaktionen, zu erfassen. Es war ziemlich offensichtlich von den Daten, die in der Hek-Studie erhalten wurden, dass sich zumindest einige der RT-PCR Reaktionen zum Zeitpunkt der Datenerfassung nicht im linearen Abschnitt ihrer Amplifikationskurven befanden. Dies wurde aus der Beobachtung geschlossen, dass die Intensität der Banden der BPH9 von der bei 35 Zyklen entnommenen Probe bis zur Probenentnahme nach 40 Zyklen etwas abnahm. In geringfügigerem Ausmaß traf dies auch auf andere Proben zu. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass die PCR den linearen Abschnitt der Amplifikationskurven verlassen hatte. Während diese Beobachtung den qualitativen Wert dieses Experiments einschränkt, wird das Vermögen dieses Assays die qualitativen Unterschiede in der mRNA Häufigkeit zu bestimmen, nicht notwendigerweise eingeschränkt. Der durch Beobachtung der PCRs nach dem linearen Abschnitt der PCR hervorgerufene Fehler, geht in die Richtung, die Unterschiede in der mRNA Häufigkeit zu unterschätzen. Es ist immer noch zulässig zu folgern, dass Hek in vielen Prostatadrüsen mit BPH nach oben reguliert ist, auch wenn die absolute Zunahme in der Häufigkeit nicht bestimmt werden kann. Durch das Betrachten von Personen ist es möglich Fragen zu untersuchen, welcher Anteil von Personen in einer bestimmten physiologischen Klasse, z.B. Personen mit BPH, auf ähnliche Weise die untersuchte mRNA regulieren. Um die quantitativen Unterschiede in der mRNA Expression zu bestimmen, ist es erforderlich, dass die Daten im linearen Anteil der entsprechenden PCR-Amplifikationskurve gesammelt werden. Dieser Anforderung wird das in folgenden Parapraphen beschriebene Assay gerecht.
Die beiden letzen Hürden für eine RT-PCR werden in den folgenden Abschnitten, unter Einbezug der Verwendung von cDNA-Pools als Matrizen für die RT-PCR, behandelt. In der Praxis werden üblicherweise die Protokolle, die zusammengefasste Matrizen verwenden, vor dem oben beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Es gibt zwei zusätzliche Hürden für die relative mRNA Quantifizierung durch RT-PCR, die eine Interpretation von Ergebnissen, die mit dieser Methode erzielt wurden, regelmäßig beeinträchtigt. Die erste erfordert die Quantifizierung der Amplifikationsprodukte während sich die PCR noch in dem linearen Abschnitt des Zyklus befindet, in dem sich „E" wie eine Konstante verhält und annähernd gleich zwei ist. Im linearen Abschnitt der Amplifikationskurve ist der Logarithmus der Menge des amplifizierten Produktes direkt proportional zur Anzahl der Zyklen. Am Ende des PCR-Zyklus ist „E" nicht konstant. Später in der PCR nimmt „E" mit jedem zusätzlichen Zyklus ab, bis es durch zusätzliche Zyklen zu keiner weiteren Zunahme der Menge an PCR-Produkt mehr kommt. Der wichtigste Grund für die Abnahme der Effizienz bei hohen PCR-Zykluszahlen kann sein, dass die Konzentration der PCR-Produkte hoch genug wird, so dass sich zwei Stränge des Produktes mit einer höheren Effizienz aneinander lagern, als die mit der sich die Oligonukleotid-Primer an die einzelnen Produktstränge anlagern. Diese Konkurrenz unter den PCR-Produktsträngen führt zu einer Abnahme der Effizienz einer PCR. Der Teil einer PCR, bei dem die Effizienz der Amplifikation abnimmt, wird als „Plateau"-Phase der Amplifikationskurve bezeichnet. Wenn „E" aufhört sich wie eine Konstante zu verhalten und sich die PCR in Richtung der Plateau-Phase bewegt, dann geht die Konservierung der relativen Proportionalität während der PCR amplifizierter Produkte verloren. Diese verursacht einen Fehler in der Abschätzung der Unterschiede einer relativen Häufigkeit von mRNA Spezies, wie sie in unterschiedlichen Gesamtzellulären-RNAs vorkommen. Der Fehler geht immer in die gleiche Richtung, in dem er Unterschiede in der relativen mRNA Häufigkeit als geringer erscheinen lässt, als sie tatsächlich sind. In extremen Fällen, wenn alle PCRs die Plateau-Phase erreicht haben, wird dieser Effekt differentiell exprimierte mRNAs so erscheinen lassen, als wären sie überhaupt nicht differentiell exprimiert.
Um diese Art von Fehler zu kontrollieren, ist es wichtig, dass die PCR-Produkte im linearen Bereich der Amplifikationskurve quantifiziert werden. Dies ist technisch schwierig durchzuführen, da die gegenwärtig verwendeten Hilfsmittel zur DNA-Quantifizierung nur dann empfindlich genug für die Quantifizierung von PCR-Produkten sind, wenn sie sich Konzentrationen annähern, bei denen die PCR-Produkte anfangen, mit den Primern bei der Anlagerung zu konkurrieren. Das bedeutet, die PCR-Produkte können nur am äußersten Ende des linearen Bereichs der Amplifikationskurve erfasst werden. Vorherzusagen, bei welcher Zyklusnummer die PCR-Produkte quantifiziert werden sollen, ist technisch schwierig.
Für die Praxis bedeutet das, es ist erforderlich Proben der PCR-Produkte zu verschiedenen Zykluszahlen zu entnehmen, von denen angenommen wird, dass sie sich über den idealen Nachweisbereich erstrecken, in dem die Produkte häufig genug vorkommen um nachgewiesen zu werden, aber sich immer noch im linearen Bereich der Amplifikationskurve befinden. Es ist unpraktisch dies in einer Studie mit einer großen Anzahl an Proben durchzuführen, da die Zahl der verschiedenen PCR-Reaktionen und/oder Anzahl der verschiedenen Elektrophoresegele die zu fahren sind, verbietend umfangreich wird.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein zwei-stufiger Ansatz entwickelt, um die Häufigkeit der mRNA unter Verwendung von RT-PCR relativ zu quantifizieren. In der ersten Stufe werden cDNA-Pools untersucht, die durch das Vereinen gleicher Mengen an normalisierter cDNA hergestellt wurden, um festzustellen, wie die mRNA Häufigkeit in Personen mit einem bestimmten physiologischen Status variiert. Dies vermindert die Anzahl der zu vergleichenden Proben auf eine sehr geringe Anzahl, etwa zwei bis vier. In den hierin beschriebenen Studien werden drei Pools untersucht Diese Pools stamme von normalen Prostatas, solchen mit BPH und einer Reihe von Prostatatumoren. Jeder der Pools kann eine große Anzahl an Personen enthalten. Obwohl dieser Ansatz nicht Abweichungen zwischen Personen unterscheidet, ist er leicht in der Lage, breite Muster an differentieller Expression zu erkennen. Der große Vorteil einer Untersuchung von zusammengefasster cDNA ist, dass sie das gleichzeitige Ansetzen von vielen doppelten PCR-Reaktionen erlaubt.
Die einzelnen Duplikate können bei unterschiedlichen Zykluszahlen der PCR geerntet und untersucht werden. In den nachfolgend beschriebenen Studien wurde vier PCR-Reaktionen in Duplikaten angesetzt. Ein Duplikat wurde bei 31, 34, 37 und 40 PCR-Zyklen gesammelt. Gelegentlich wurden PCR-Reaktionen auch bei 28 Zyklen gesammelt. Die Untersuchung der PCRs bei verschiedenen Zyklusnummern, ergab die folgenden Vorteile. Es ist sehr wahrscheinlich, dass sich wenigstens eine der RT-PCRs im idealen Bereich der Amplifikationskurve befindet, um verlässlich mRNA Häufigkeiten zu vergleichen. Außerdem ist die optimale Anzahl an Zyklen bekannt, so dass Studien mit einer vielen umfangreicheren Probengröße , wie etwa die oben beschriebenen Studien mit UC42 und Hek, mit einer höheren Wahrscheinlichkeit gelingen. Dies ist die zweite Stufe eines zweistufigen Ansatzes, der durchgeführt wurde, um unter Verwendung von RT-PCR die Häufigkeitsgrade von mRNA relativ zu quantifizieren. Die Durchführung der RT-PCR mit zusammengefassten Proben erlaubt eine deutlich effizientere Anwendung der RT-PCR vergleichen zu den Proben von Einzelpersonen.
Ein weiterer Vorteil, auch unten beschrieben, ist, dass die Schwankung von Röhrchen zu Röhrchen in der PCR vernachlässigt und kontrolliert werden kann, da die meisten Studien durch die Duplikate mehrere Datenpunkte liefern.
Ähnlich wie das vorher beschriebene Protokoll, das Einzelpersonen einschließt, ist der erste Schritt in diesem Protokoll die Normalisierung der zusammengefassten Proben, dass sie gleiche Mengen an amplifizierbarer cDNA enthalten. Dies wird mit Oligonukleotiden gemacht, die eine Amplifikation von β-Actin steuern. In diesem Beispiel wird die PCR-Amplifikation eines cDNA-Fragmentes, das aus der β-Actin cDNA von Pools aus normaler Prostata, Drüsen mit BPH und Prostatakarzinomen erhalten wurde, durchgeführt. Diese Studie wurde mit vier identischen PCR-Reaktion angesetzt. Die Produkte dieser PCRs wurden nach 22, 25, 28 und 31 PCR-Zyklen gesammelt und elektrophoretisch aufgetrennt. Die Quantifizierung der Banden mit dem IS 1000 System ergab, dass sich die PCRs bei 22, 25 und 28 Zyklen immer noch im linearen Bereich ihrer Amplifikationskurve befanden, aber dass sie die Linearität bei 31 Zyklen verlassen hatten. Das weiß man deshalb, da die Verhältnisse der Bandenintensitäten für die Daten aus den Zyklen 22, 25 und 28 konstant und intern gleich bleibend sind, sich aber die Verhältnisse bei 31 Zyklen verzerren. Diese Quantifizierung erlaubt auch die Ableitung von Normalisierungsstatistiken für diese drei Pools relativ zueinander, in genau der gleichen Art und Weise, wie es zuvor für Einzelpersonen gemacht wurde (Tabelle 4).
Diese Studie wird dann unter Verwendung von spezifischen Primern für ein Gen, anders als β-Actin, wiederholt. Aus Zwecken des Vergleiches, waren die untersuchten mRNAs die gleichen wie zuvor gezeigt, UC42 und Hek, von denen keine Teil der vorliegenden Erfindung ist. Wie es zuvor für die Proben von den Einzelpersonen durchgeführt wurde, sind die Intensitäten der entsprechenden Banden mit einem IS 1000 quantifiziert und auf die β-Actin Signale normalisiert worden. Wie durch die PCR gezeigt, wird UC42 häufig in Prostatatumoren exprimiert. Dieses Fragment erreichte sogar nach 31 PCR-Zyklen die stationäre Phase. UC42 ist deshalb in normalen Prostatas und solchen mit BPH nahezu transkriptionell stumm, wird aber häufig „eingeschaltet" in vielen Prostatatumoren. Dies wird durch ein fehlendes Signal einer UC42 mRNA, sowohl im normalen Gewebe als auch BPH, zu jeder Zykluszahl bis hoch zu 40, gezeigt. UC42 ist im Prostatatumor deutlich differentiell exprimiert und damit ein glaubhafter Kandidat als informativer Biomarker für diese Erkrankung.
Für Hek verdienen diese Daten mehr Deutung. Obwohl das von Hek abgeleitete PCR-Produkt nach 34 PCR-Zyklen zu beobachten war, war das Hek PCR-Produkt nicht annähernd so häufig wie UC42. Bei 40 Zyklen war das von Hek abgeleitete PCR-Produkt in den PCRs, die entweder zusammengefasste BPH-Proben oder Prostatatumor-Proben als Matrizen enthielten. Die Hek Bande die aus einem Pool von normalen Prostatas stammt, ist kaum wahrnehmbar. Es ist klar, dass Hek häufiger in BPH und Prostatatumoren als in normalen Drüsen exprimiert wird. Die zuvor beschriebene Quantifizierung und Normalisierung dieser Daten wurde durchgeführt und ist in dem Balkendiagramm in 15 gezeigt.
Die zentrale Frage die es bei der Auswertung der Daten zu beantworten galt, war, ob die PCRs im linearen Abschnitt ihrer Amplifikationskurven unersucht wurden. Ein Test dafür kann durch die Festestellung, ob sich die Proportionalität der PCR-Produkte mit dem Anstieg der Zykluszahlen der PCR erhalten geblieben ist, entwickelt werden. Bei 34 Zyklen wird das Hek Produkt mit 5.77 und 4.375 relativen Häufigkeitseinheiten entsprechend der zusammengefassten BPH-Proben und Tumorproben, wie in 15 gezeigt ist, wahrgenommen. Das Verhältnis dieser Werte beträgt 1.32. Vergleichbar betragen die Werte für BPH und Tumor bei 37 Zyklen 23.1 und 17.5. Das Verhältnis dieser Werte beträgt ebenfalls 1.32. Das ist ein starker Hinweis darauf, dass sich die PCRs im linearen Abschnitt ihrer Amplifikationskurven befanden, als diese Beobachtungen gemacht wurden (Dies ist eine bessere Erhaltung der Proportionalität als häufig beobachtet. In einigen Studien wurden Daten ausgenommen, wenn die Verhältnisse ähnlich; aber nicht gleich waren). Diese Erhaltung der Proportionalität geht bei 40 Zyklen verloren. Das Verhältnis der BPH und Tumorwerte war auf 1.85 angestiegen. Dies deutet darauf, dass sich die PCRs der Plateauphase ihrer Amplifikationsphase nähern. Ein weiterer Beweis, dass sich die Plateauphase nähert, kann direkt im relativen Anstieg der in diesen Studien beobachteten numerischen Daten, festgestellt werden. Von Zyklus 34 bis 37 der PCR nimmt die Menge der beobachteten PCR-Produkte in den BPH- und den Tumorreaktionen um das 4 fache zu. Ähnliche Berechnungen des Anstiegs der Signale zwischen dem 37. Und dem 40. Zyklus zeigen einen 3.1 fachen Anstieg in den BPH-Reaktionen und nur einen 2.2 fachen Anstieg für die Tumorreaktionen. In beiden Fällen nimmt „E" ab und die Reaktionen nähern sich ihrer Plateauphase.
Für Reaktionen die versuchten Hek cDNA aus einem Pool von normalen Prostatas zu amplifizieren, konnte erst nach 40 Zyklen eine Bande beobachtet werden. Da die BPH- und Tumorreaktionen ihre lineare Phase verlassen hatten, war eine direkte numerische Quantifizierung des Anstiegs der Häufigkeit zwischen normal, BPH und Tumor nicht möglich. Es ist jedoch zulässig zu folgern, dass Hek mRNA in Proben, die von BPH oder Prostatatumoren stammen, häufiger vorkommt als in normalen Prostatadrüsen. Es kann auch zutreffen, dass Hek in einer durchschnittlichen BPH-Probe häufiger vorkommt, als in einen durchschnittlichen Prostatatumor. Dies wurde in vielen Studien, einschließlich der hier gezeigten, beobachtet, jedoch ist der Unterschied in der relativen Expression von Hek zwischen BPH und Prostatatumoren wie auch hier gezeigt, immer gering. Es ist möglich, dass der höhere Expressionsgrad im Tumorpool relativ zu den normalen Prostatas durch eine Kontamination der Tumorproben mit BPH-Gewebe verursacht wird. Alternativ kann es auch durch eine höhere Hek-Expression in den Tumoren selbst sein. Eine Untersuchung von Gewebe durch in situ Hybridisierung oder immunhistochemische Methoden kann erforderlich sein, um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden.
Die letzte große Hürde für die Quantifizierung relativer mRNA Häufigkeit durch RT-PCR ist die Schwankung von Röhrchen zu Röhrchen in der PCR. Das kann sich aus vielen Faktoren ergeben, einschließlich ungleicher Erhitzung und Abkühlung im Thermocycler, Mängel der PCR-Röhrchen und Bedienungsfehler. Um die Quelle für diese Schwankung zu kontrollieren, wurde das digitale Thermoelement Modell #8402-00 von Cole-Parmer eingesetzt, um die in diesen Studien eingesetzten Thermocycler zu kalibrieren. Es wurden nur geringfügige Schwankungen in der Temperatur beobachtet.
Um drastisch zu zeigen, dass eine Röhrchen zu Röhrchen Schwankung in den oben beschriebenen Studien kein Faktor ist, wurden 24 doppelte PCRs für β-Actin unter Verwendung der gleichen cDNA als Matrize durchgeführt. Diese PCR-Röhrchen wurden über die Oberfläche eines Thermocyclers mit 96 Vertiefungen verteilt, einschließlich der Ecken des Blocks, wo man vermuten könnte, dass die Temperatur von den anderen Bereichen abweicht. Die Röhrchen wurden zu verschiedenen Zykluszahlen eingesammelt. Neun Röhrchen wurden bei 21 Zyklen eingesammelt. Neun Röhrchen wurden bei 24 Zyklen eingesammelt und sechs Röhrchen wurden bei 27 Zyklen eingesammelt. Die Quantifizierung der erhaltenen Banden mit dem IS 1000 System bestimmte, dass der Standardfehler des Durchschnittswertes der Häufigkeit eines PCR Produktes ± 13% betrug. Dies ist eine akzeptabel kleine Zahl, um als bedeutende Ursache für die Schwankung in einem RT-PCR Assay unberücksichtigt zu bleiben.
Das RT-PCR Protokoll, das die zusammengefassten cDNAs untersucht wird intern auf Röhrchen zu Röhrchen Variabilität kontrolliert, die möglicherweise aus einer beliebigen Quelle entsteht. Durch Untersuchung der Häufigkeit von PCR-Produkten bei mehreren verschiedenen Zykluszahlen, kann bestimmt werden, dass die Masse des PCR-Produktes angemessen mit der zunehmenden Zahl an PCR-Zyklen ansteigt. Dies zeigt nicht nur, dass die PCRs während der linearen Phase der PCR untersucht werden, wo die Daten am verlässlichsten sind, sondern es zeigt auch, dass jede Reaktion mit der gleichen Matrize mit den Daten der umgebenden Zyklusnummern übereinstimmt. Wäre das eine ungeklärte Ursache für eine Schwankung, würde die Erwartung, dass die PCR-Produktmasse angemessen mit der zunehmenden Zahl an PCR-Zyklen ansteigt, nicht erfüllt. Dies würde darauf hinweisen, dass die Schwankungen in den Ergebnissen Artefakte sind. Die interne Duplizierung und Übereinstimmung der Daten die von unterschiedlichen Zykluszahlen erhalten werden, kontrollieren die systemabhängige Schwankung von Röhrchen zu Röhrchen Ergebnissen.
Wie in den vorangegangenen Paragraphen beschrieben, bewältigt das RT-PCR Protokoll, das zusammengefasste cDNA Matrizen verwendet, diese beiden letzen Hürden für eine erfolgreiche relative quantitative RT-PCR. Diese Hürden sind die Erfordernis die PCR-Produkte zu untersuchen, während sich die Reaktionen in dem linearen Abschnitt ihrer Amplifikationskurven befinden und die Erfordernis die Schwankung von Röhrchen zu Röhrchen in der PCR zu kontrollieren. Das beschriebene Protokoll untersucht PCR-Produkte an drei bis vier verschiedenen Zykluszahlen. Dies stellt sicher, dass die PCRs in ihrem linearen Bereich quantifiziert werden und kontrolliert, wie in dem letzen Paragraphen beschrieben wurde, die möglichen Schwankung von Röhrchen zu Röhrchen.
Eine abschließende Frage ist, ob es sich bei β-Actin um einen geeigneten internen Standard für die mRNA Quantifizierung handelt. β-Actin wurde von vielen Forschern für die Normalisierung von mRNA Mengen verwendet. Andere haben argumentiert, dass β-Actin selbst differentiell reguliert ist und deshalb als interner Normalisierungsstandard ungeeignet ist. In den hierin beschriebenen Protokollen ist die differentielle Regulierung von β-Actin kein Bedenken. Mehr als fünfzig Gene wurden mit diesen Protokollen auf differentielle Expression untersucht. Weniger als die Hälfte waren tatsächlich differentiell exprimiert. Die andere Hälfte waren innerhalb eines Standardfehlers von 13% ähnlich wie β-Actin reguliert. Entweder sind all diese Gene koordiniert differentiell reguliert mit β-Actin, oder keines von denen ist differentiell reguliert. Die Möglichkeit, dass all diese Gene auf ähnliche Weise und mit β-Actin koordiniert differentiell reguliert werden, erscheint als höchst unwahrscheinlich. Diese Möglichkeit wurde nicht berücksichtigt.
β-Actin wurde von manchen als interner Standard in PCRs kritisiert, da eine große Zahl an β-Actin Pseudogenen in den Genomen von Säugetieren vorkommen. Dies ist keine Überlegung in den beschriebenen Assays, da für alle verwendeten RNAs mit einem sehr empfindlichen PCR-Assay gezeigt wurde, dass sie frei von kontaminierender genomischer DNA sind. Darüber hinaus ist die Zykluszahl der PCR, die erforderlich ist um β-Actin cDNA in den verdünnten RT-Reaktion aufzuspüren, in der Regel zwischen 19 und 22 Zyklen, ausreichend niedrig, um einen Beitrag einzuräumen, den genomische DNA möglicherweise bei der Häufigkeit von amplifizierbaren β-Actin Matrizen hat.
Tabelle 4: Numerische Rohdaten erfasst an einem IS1000 und Normierung durch den Vergleich mit β-Actin
Beispiel 2:
Identifikation von Markern für Prostataerkrankung durch RNA Fingerprint Technik
Die RNA Fingerprint Technik wurde dazu verwendet, um differentiell exprimierte RNA Arten, die aus primären, humanen Prostatakarzinomen oder in Kultur wachsenden humanen Prostatakarzinom Zelllinien isoliert wurden, wie vorangehend beschrieben, zu identifizieren. Etwa 400 Banden wurden in diesen Untersuchungen beobachtet. Eine Reihe davon schienen differentiell exprimiert und sie wurden wie vorangehend beschrieben kloniert.
Die Slot Blot Analysen von Gesamtzellulärer-RNA die mit Riboproben untersucht wurde, ergab, dass zehn der Klone differentiell exprimiert wurden. Diese zehn klonierten PCR Produkte wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt und UC Bande #4-2 (SEQ ID Nr.: 6), UC Bande #5-2 (A und B), UC Bande #7-1, UC Bande #8-1, UC Bande #25 (SEQ ID Nr.: 1), UC Bande #27 (SEQ ID Nr.: 2), UC Bande #28 (SEQ ID Nr.: 3), UC Bande #31 (SEQ ID Nr.: 4), UC Bande #32 (SEQ ID Nr.: 7) und UC Bande #33 (SEQ ID Nr.: 5), genannt. Die vorliegende Erfindung umfasst SEQ ID Nr.: 1 und nicht die anderen Produkte.
Frühere Studien wurden mit Gesamtzellulärer-RNA durchgeführt, die aus humanen Prostatakarzinom Zelllinien, in Zellkultur wachsend, isoliert wurde. Die in diesen Untersuchungen identifizierten Marker für eine Prostataerkrankung schließen die UC Bande #4-2, UC Bande #5-2 (A und B), UC Bande #7-1 und UC Bande #8-1 mit ein.
Riboproben aus diesen Klonen wurden als Proben gegen Northern Blots mit den aus der Zelllinie gewonnenen Gesamtzellulären-RNAs verwendet. Die UC Bande #8-1 war nur geringfügig differentiell exprimiert und wurde deshalb nicht in dem nachfolgend beschriebenen RT-PCR Assay untersucht.
Später wurden Untersuchungen mit Gesamtzellulärer-RNA aus humanen Prostatadrüsen und primären humanen Prostatakarzinomproben durchgeführt. Die in dieser Reihe von Studien entdeckten Marker für eine Prostataerkrankung umfassten die UC Bande #25 (SEQ ID Nr.: 1), UC Bande #28 (SEQ ID Nr.: 3), UC Bande #31 (SEQ ID Nr.: 4), UC Bande #32 (SEQ ID Nr.: 7) und UC Bande #33 (SEQ ID Nr.: 5). Die differentielle Expression dieser Genprodukte in humanen Prostatatumoren verglichen zu benignem und normalem Prostatagewebe wurde durch quantitative RT-PCR, wie nachfolgend beschrieben, bestätigt.
Die Bestimmung der DNA Sequenz zeigte, dass es sich bei der UC Bande #25 (SEQ ID Nr.: 1), der UC Bande #27 (SEQ ID Nr.: 2), der UC Bande #28 (SEQ ID Nr.: 3), der UC Bande #31 (SEQ ID Nr.: 4) und der UC Bande #33 (SEQ ID Nr.: 5) um bislang unbekannte Gene handelt. Die UC Bande #4-2 (SEQ ID Nr.: 6) stammt von der mRNA des α6-Integrin. Die UC Band #32 (SEQ ID Nr.: 7) stammt von der mRNA von Fibronektin. Die Ergebnisse der letzteren beiden Genprodukte sind insofern interessant, da für all diese Gene nachgewiesen wurde, dass sie in einigen Krebsarten differentiell exprimiert werden.
Von α6-Integrin ist bekannt, dass es in Prostatakrebs sowohl hochreguliert als auch unpassend auf der Zelloberfläche verteilt ist (Knox et al., 1994). Im Harn nachzuweisendes Fibronektin wurde als möglicher Biomarker für Prostatakrebs vorgeschlagen (Webb & Lin, 1980).
Die Expressionsgrade der UC Bande #5-2 (A und B), UC Bande #25, UC Bande #27, UC Bande #28, UC Bande #31, UC Bande #33, Fibronektin und Lipocortin II wurden mittels quantitativer RT-PCR in Proben aus normalen, benignen und malignen Prostatadrüsen untersucht. Die Ergebnisse für die UC Bande #25 (SEQ ID Nr.: 1), (1), UC Bande #27(SEQ ID Nr.: 2), (2), UC Bande #28 (SEQ ID Nr.: 3), (3), UC Bande #31 (SEQ ID Nr.: 4), (4), und UC Bande #33 (SEQ ID Nr.: 5), zeigen alle einen erhöhten Expresssionsgrad in Prostatakarzinomen (NB, T und LM) verglichen mit benignen (B) und normalen (N) Prostataproben.
Die Ergebnisse für die UC Bande #28 (3) und die UC Bande #33 (6) sind besonders auffällig. Diese Klone werden in einer normalen oder benignen Prostata nur zu einem sehr geringen Grad exprimiert und in einem signifikant höheren Masse in metastasierenden und nicht-metastasierenden Prostatakarzinomen. Als solche würden sie ausgezeichnete Marker für das Aufspüren von malignen Prostatatumoren in Biopsieproben, die eine Mischung von normalem, benignem und malignem Prostatagewebe enthalten, abgeben. Diese beiden Klone sind nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Die RT-PCR Analyse für Fibronektin (UC Bande #32, 5) ist ebenfalls interessant. Dieser Marker scheint nur in normalen Prostataproben exprimiert zu sein und ist nur in sehr geringem Masse sowohl in der benignen als auch der malignen Prostata vorhanden (5). Die verminderte Expression von Fibronektin in BPH ist ein neues Ergebnis.
Diese Beobachtung ist hinsichtlich eines früheren Berichts, Fibronektin sei ein möglicher Marker für Prostatakrebs, überraschend (Webb und Lin, 1980). Fachleute werden erkennen, dass der Verlust der Fibronektinexpression bei BPH von Nutzen ist für die Diagnose und das Erkennen dieses Zustandes in Patienten. Die mRNAs für die UC Bande #5-2 (A und B) und Lipocortin II, sind in den Tumoren nicht differentiell exprimiert, obwohl sie in den Zelllinien differentiell exprimiert sind.
Weitere RNA Fingerprint Untersuchungen wurden durchgeführt um Gene zu identifizieren, die in normalen Prostatadrüsen, Drüsen mit BPH, Prostatatumoren und Metastasen von Prostatatumoren auf Ebene der mRNA Transkription differentiell exprimiert sind. Die differentielle Expression wurde durch relative quantitative RT-PCR bestätigt. Die verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Diese Untersuchungen führten zur Entdeckung von weiteren Sequenzen, die differentiell reguliert werden. Diese Sequenzen, welche nicht Teil der vorliegenden Erfindung sind, werden hierin gekennzeichnet als UC38, SEQ ID Nr.: 10; UC40, SEQ ID Nr.: 11; UC41, SEQ ID Nr.: 12; UC42, SEQ ID Nr.: 18; UC43, SEQ ID Nr.: 19; UC45, UC46, UC47, stimmt mit der GenBank Zugangs-#M34840, saure Prostataphosphatase Nt 901-2095 überein; UC201, SEQ ID Nr.: 13; UC202, UC203, UC204 (stimmt mit GB#Z28521 und GB#D42055 überein), SEQ ID Nr.: 20; UC205 (Humhek, GB#H8394, sense Strang), SEQ ID Nr.: 14; UC206 (antisense Strang), UC207 (sense Strang), SEQ ID Nr.: 15; UC208 (sense Strang), UC209, SEQ ID Nr.: 16; UC210 (sense Strang), SEQ ID Nr.:17; UC211 (antisense Strang), SEQ ID Nr.: 21; UC212 (sense Strang), SEQ ID Nr.:22; und UC213 (sense Strang, stimmt mit GB# T07736 überein), SEQ ID Nr.:23. Von dem aufgeführten kommen UC38, UC41, UC42, UC47 und UC211 reichlich in Tumoren vor und sind mögliche Tumormarker. UC40, UC205 und UC207 sind reichlich in BPH vorhanden. UC43 ist reichlich vorhanden in normalen und BPH Drüsen und ist ein möglicher Tumorsuppressor. UC201 und UC210 sind reichlich vorhanden in einigen Tumoren und sind mögliche Progressionsmarker. UC212 ist reichlich in BPH vorhanden und vielleicht in einigen Tumoren. UC209 ist in einigen Tumoren nach unten reguliert und stellt einen möglichen Suppressor der Progression das und UC213 ist in Tumoren mach unten reguliert.
Nachweis von differentiell exprimierten RNA Spezies unter Verwendung von Primern spezifisch für TGF-^® und Cyclin A
Relative quantitative RT-PCR mit einem externen Standard hat sich als leistungsstarkes Hilfsmittel bei der Untersuchung von mRNAs nach differentieller Expression in Prostatakrebs erwiesen. Andere Gene wurden mit diesem Hilfsmittel auf differentielle Expression untersucht. Diese wurden ausgewählt weil bekannt war, dass sie in Folge einer Transformation nach oben reguliert sind oder weil angenommen werden kann, dass sie in Folge einer Transformation nach oben reguliert werden.
Die Ergebnisse dieser beiden Assays sind hierin mit eingeschlossen. Sie zeigen, dass beide, TGF-β (7) und Cyclin A (8), im Prostatakrebs nach oben reguliert sind im Vergleich zu normalen und benignen Drüsen. Diese beiden Gene sind kein Teil der vorliegenden Erfindung. Das Cyclin A Ergebnis ist von besonderem Interesse, da das Protein als positiver Regulator der Zellzyklus Progression bekannt ist. Es war gelegentlich gezeigt worden, dass es in einigen Krebsarten nach oben reguliert ist, aber dies ist die erste Beobachtung von Cyclin A, dass es in den meisten oder allen Tumoren mit einem einzelnen Organursprung (Prostata) hochreguliert ist. Die Sequenz von Cyclin A wurde als SEQ ID Nr.: 8 identifiziert.
Identifikation von Markern für eine Prostataerkrankung unter Verwendung von spezifischen Proben für eine verkürzte Form von Her2/neu
In den nachfolgend beschriebenen Studien wurde eine relative quantitative Form der RT-PCR durchgeführt. Die als Primer für die gesteuerte Amplifikation verschiedener cDNA Fragmente in der PCR verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
In Kürze, es wurden drei Oligonukleotidprimer entworfen, die in der Tabelle 3 als Neu5' SEQ ID Nr.: 44; Neu3', SEQ ID Nr.: 71; und NeuT3', SEQ ID Nr.: 72 gekennzeichnet wurden. Neu5' lagert sich an die Antisense-Sequenz sowohl der kompletten als auch der verkürzten Form der Her2/neu mRNAs an einer 5' eines wechselnden RNA-Prozessierungsortes- gelegenen Stelle an (siehe 9). Neu3' lagert sich an den Sense-Strang der kompletten Form der Her2/neu mRNA an einer direkt 3' der Transmembran-Domäne gelegenen Position an (9).
In einem RT-PCR Assay, das Neu5' und Neu3' als Primer verwendete, wurde mit der kompletten mRNA als Matrize ein Amplifikationsprodukt mit einer Länge von 350 Basenpaaren erzeugt. Unter Verwendung dieser Primer, kann aus der verkürzten mRNA kein cDNA Fragment erzeugt werden, da sich Neu3' nicht an diese mRNA oder dessen cDNA anlagert. Der dritte Oligonukleotidprimer NeuT3' lagert sich an den Sense Strang der 3' UTR der verkürzten Form der Her2/neu mRNA und cDNA an (9). In einem RT-PCR Assay, das Neu5' und NeuT3' als Primer verwendete, wurde unter Verwendung der verkürzten mRNA als Matrize ein 180 Basenpaar langes cDNA Fragment amplifiziert.
Dieses Primerpaar kann die Amplifikation eines Fragmentes der kompletten Her2/neu mRNA nicht steuern, da sich NeuT3' nicht an ein Transkript der vollständigen Länge anlagert.
Die Ergebnisse der relativen quantitativen RT-PCR zeigten deutlich, dass die relative Häufigkeit der Her2/neu mRNA in Prostatakarzinomen gesteigert ist, verglichen zu normaler Prostata oder benignen Prostatahyperplasien (10). Diese Werte wurden durch ein densitometrisches Scannen eines Photonegatives der mit Ethidiumbromid gefärbten Aufnahme eines Geles erbracht. Die densitometrischen Rohdaten des Scans wurden auf einen vergleichbaren Scan einer PCR Amplifikation von ^®-Actin aus der gleichen Matrize normalisiert. Einem Gen, vom dem nicht erwartet wird, dass sich die Expression in Abhängigkeit einer Transformation oder einer Tumorentwicklung verändert. Die Ergebnisse sind vollständig im Einklang mit der gesteigerten Häufigkeit von Her2/neu Protein in Prostatatumoren, wie sie vorangehend in dem Literaturüberblick beschrieben wurde.
Es wurde ebenso eine relative quantitative RT-PCR durchgeführt, die eine relative Häufigkeit der verkürzten Form einer Her2/neu mRNA (SEQ ID Nr.: 9) in verschiedenen Prostatageweben untersuchte. Dieser Assay war vergleichbar zu dem oben für das komplette Her2/neu Transkript gezeigten. Die Werte dieser Untersuchung, die auf ^®-Actin quantifiziert und normalisiert wurden, sind in 11 dargestellt.
Wie in 11 gezeigt, war die relative Häufigkeit dieses verkürzten Transkriptes in Prostatakarzinomen, verglichen mit normaler und benigner Prostata, signifikant erhöht. Wie in einem vorangegangenen Abschnitt besprochen, war diese verkürzte Form der Her2/neu mRNA vorher für Brusttumoren, Eierstockstumoren und Tumoren des Magens beschrieben worden. Dies ist der erste Bericht einer differentiellen Expression der verkürzten Form von Her2/neu als Biomarker für Prostatakrebs, obwohl es kein Teil der vorliegenden Erfindung ist. Wie bei Scott et al. (1993) beschrieben, kann die Expression dieser verkürzten Form von Her2/neu zu einem veränderten Verhalten von Krebszellen führen, welches sich nachteilig auf den Patienten auswirkt.
Tabelle 1: Gene, deren mRNA Häufigkeit sich in Prostatakarzinomen relative zu normalen und benignen Drüsen verändert
Tabelle 2: Oligonukleotide, die im relativen quantitativen RT-PCR Teil der Untersuchungen verwendet wurden.
Oligonukleotide, die zur Untersuchung der Genexpression verwendet wurden:
Kontrollen verwendet für die Bereinigung der relativen quantitativen RT-PCR:
Tabelle 3: Oligonukleotide, die für den Nachweis der verkürzten Her2/neu mRNA verwendet wurden.

NEUT3' 5' CCCCTTTTATAGTAAGAGCCCCAGA 3', SEQ ID Nr.: 44

Jede der hierin offenbarten Zusammensetzungen und Methoden kann angesichts der vorliegenden Offenbarung ohne übermäßiges Experimentieren hergestellt und durchgeführt werden. Obwohl die Zusammensetzungen und Methoden dieser Erfindung in Form von bevorzugten Ausführungsbeispielen beschrieben wurden, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass Veränderungen in der Zusammensetzung, den Methoden, in den Arbeitsschritten oder dem Ablauf von Arbeitsschritten herbeigeführt werden können, ohne sich vom Ziel der Erfindung, wie es durch die angehängten Ansprüche abgesteckt ist, zu entfernen.
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Wong et al., Int. J. Oncol., 3:13-17, 1993.
Wu et al., Genomics, 4:560, 1989.

SEUQENZ LISTE

Claims

Ein isoliertes Nukleinsäuresegment, welches eine Sequenz bestehend aus SEQ ID NR.: 1 hat.
Die isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei sie weiterhin als eine Nukleinsäure definiert wird, die eine Sequenz wie sie in SEQ ID NR.: 1 niedergelegt ist, hat.
Eine isolierte Nukleinsäure in einer Größe zwischen 14 und 100 Basen Länge, die mit einem Teil der Nukleinsäure oder ihrem Kompliment bestehend aus SEQ ID NR.: 1 identisch übereinstimmt.
Eine isolierte Nukleinsäure in einer Größe zwischen 14 und 100 Basen Länge, die unter hochstringenten Bedingungen von 0,02 M bis 0,10 M NaCl und Temperaturen von 50°C bis 70°C an eine Nukleinsäure, die eine Sequenz bestehend aus SEQ ID NR.: 1 hat, bindet.
Ein isoliertes Protein MIt einer Aminosäuresequenz, die durch die Nukleinsäure, welche eine Sequenz bestehend aus SEQ ID NR.: 1 hat, kodiert ist.
Ein isoliertes Peptid in einer Größe zwischen 10 und 50 Aminosäuren Länge mit einer Aminosäuresequenz, die in der Nukleinsäuresequenz bestehend aus SEQ ID NR.: 1 kodiert ist.
Ein Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebs oder Zellen einer gutartigen Prostatahyperplasie in einer biologischen Probe über den Nachweis einer Nukleinsäure als Prostatakrebs-Marker, wobei die Methode die folgenden Schritte umfasst: a) Aufbereiten der Nukleinsäure von besagter Probe; b) Vervielfältigen besagter Nukleinsäuren, um Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte zu erstellen; c) In Kontakt bringen besagter Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte mit einer Oligonukleotid Probe, die unter stringenten Bedingungen von 0,02 M bis 0,10 M NaCl und Temperaturen von 50°C bis 70°C an eine isolierte Nukleinsäure mit einer Sequenz bestehend aus SEQ ID Nr.: 1 hybridisiert; d) Nachweisen der Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte, die mit besagter Probe hybridisieren; und e) Quantifizieren der Menge der Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte, die mit besagter Probe hybridisieren.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Amplifikationsschritt ein Bereitstellen von Primern, die selektiv eine isolierte Nukleinsäure mit einer Sequenz bestehend aus SEQ ID Nr.: 1 amplifizieren, umfasst.
Ein Kit zur Verwendung in einem Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe umfassend: a) ein Primerpaar zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure mit einer Sequenz bestehend aus SEQ ID Nr.: 1 und b) Behältnisse für jeden der besagten Primer.
Ein Kit zur Verwendung im Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe umfassend: a) eine Oligonukleotid Probe, die unter hochstringenten Bedingungen von 0,02 M bis 0,10 M NaCl und Temperaturen von 50°C bis 70°C an eine isolierte Nukleinsäure mit einer Sequenz bestehend aus SEQ ID Nr.: 1 bindet; und b) ein Behältnis für besagte Probe.
Ein Kit zu Verwendung im Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe umfassend: a) einen Antikörper, der mit hoher Spezifität an ein Protein bindet, welches eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz bestehend aus SEQ ID NR.: 1 kodiert wird, hat und b) ein Behälter für besagten Antikörper.
Verwendung des Kits gemäß Anspruch 11 zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe.
Ein Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in biologischen Proben umfassend: a) Bereitstellen eines Peptides, welches durch eine isolierte Nukleinsäure bestehen aus SEQ ID NR.: 1 kodiert ist, b) Bereitstellen eines Antikörpers, der spezifisch an besagtes Peptid bindet; c) In Kontakt bringen einer menschlichen Gewebeprobe mit besagtem Antikörper; d) Abtrennen des Antikörpers, der an besagte Gewebeprobe gebunden ist, von ungebundenen Antikörpern; und e) der Nachweis von gebunden Antikörpern.