CN105061580A - 多肽和药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种多肽、含有多肽的药物组合物及其应用。本发明的药物组合物能够用于有效地治疗癌症、增生性疾病以及细菌感染等。
Description
本申请为申请日为2007年10月3日、申请号为2007800447140、名称为“ATAP肽、编码ATAP肽的核酸以及相关的应用方法”的中国发明专利申请的分案申请。
相关申请的引用
根据35U.S.C.§119(e),本申请要求于2006年10月3日提交的美国临时申请第60/848,971号的优先权,出于各种目的将其全部内容以引用方式结合于本文。
通过引用并入
按照37C.F.R.§1.52(e)(5),包含在文件名上的序列信息:ATAP_Ma_2007PCT_SEQList_ST25.txt;大小31KB;创建于:2007年10月3日;应用PatentIn-3.4、和Checker4.4.0,其全部内容以引用方式结合于本文。在所附提交的纸件形式序列表和计算机可读形式序列表中的数据并不包含新内容,并且得到了优先权申请美国临时专利申请第60/848,971号的完全支持。
关于联邦资助研究的声明
由于以下资助,美国政府对本发明享有一定的权利:RO1-AG015556、RO1-CA95739、以及RO1-HL69000,这些资助由美国国立卫生研究院(NIH)授予JianjieMa博士。
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种多肽、含有多肽的药物组合物及其应用。。
背景技术
尾锚定(tail-anchored,TA)蛋白质,包括Bcl-2家族成员,特征性地在羧基(C)末端通过单疏水节段(singlehydrophobicsegment)束缚于磷脂双层,其中分子的大部分位于胞质溶胶中。Bcl-2是哺乳动物基因家族和它们产生的蛋白质的原型。Bcl-2相关蛋白的生物功能不可避免地与它们的特定的亚细胞定位相关联;细胞质、内质网(ER)膜或线粒体外膜(MOM)。研究表明Bcl-2家族成员可调节线粒体外膜透化作用(MOMP)并且可以促凋亡(例如,Bax、BAD、Bak、Bok、Bcl-Xs、Bik、Bim、Bid、Egl-1、以及Diva等等)或抗凋亡(例如,Bcl-2proper、Bcl-xL、Mcl-1、CED-9、A1、Bcl-w、以及Bfl-1等等)。
Bcl-2家族成员和若干病症有关,包括:癌症,例如黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、和肺癌;神经性障碍,例如精神分裂症;以及免疫紊乱。癌症和增生包括各种非常复杂的疾病;然而,它们均具有一个共同的特点,即所有细胞是高度增殖的并且能够持续分裂,且不进行终末分化。这就证实了在这些以及其他的相关病症的病因中对于减少凋亡的作用。
虽然目前的几种癌症疗法可促进癌细胞死亡和抑制癌细胞生长,但这些中的许多疗法对于癌症患者是高度毒性的并且它们的给药导致许多使人不愉快的和不堪忍受的副作用。此外,许多目前可应用的癌症疗法表明仅对特定病因的癌症或增生有效。因此,非常期望这样的治疗,即可以在大量的癌细胞类型和起源的范围内促进癌细胞死亡,并且对于患者在很大程度上是无毒性的。
近来,我们证明了抗凋亡Bfl-1在氨基酸147-175处包含独特的两亲性尾锚定肽(ATAP)。如本文所述,Bfl-1ATAP包含带电荷的氨基酸,其线性连接于(liningto)α-螺旋的一侧。在人基因组中,同源ATAP序列存在于另一种肿瘤抑制基因中,即人子宫颈癌抑制基因-1(HCCS-1)。在HCCS1的N端的另外的线粒体靶向信号(MTS)有助于其线粒体靶向和凋亡功能。
我们的实验结果表明,ATAP肽能够调节凋亡级联反应。因此,ATAP肽可以适合用于高效治疗剂以治疗多种疾病,包括细菌感染、癌症以及增生。
发明内容
本发明涉及用于在靶细胞中诱导凋亡的组合物和方法。具体而言,本发明涉及令人意外的和意想不到的发现,即在原核细胞中以及在真核细胞中两亲性尾锚定肽(ATAP)是细胞凋亡的强效刺激剂。在真核细胞中ATAP能够特异性地靶向线粒体并诱导凋亡。ATAP的凋亡诱导活性表明,这些肽可以用作研究和诊断工具以及用于治疗各种疾病和病症的治疗剂。此外,同样惊人和意想不到的是,本发明的ATAP肽表现出强杀菌活性。因此,本发明的ATAP核酸和多肽也可以用于治疗一系列细菌感染。如在本文中所使用的,“凋亡”用于泛指细胞死亡,真核以及原核细胞(死亡)。
在某些方面,本发明包括ATAP核酸、包含ATAP核酸的核酸载体、宿主细胞、ATAP抗体、重组ATAP肽和蛋白质、假肽(pseudopeptide)、融合蛋白、化学化合物、以及用于生产和应用它们的方法。
一方面,本发明涉及包含通式(I):bXaXbuunnunnanXGbnXann(X)1-6nn(X)0-2b(I)的ATAP肽的组合物。其中,n=非极性(疏水)氨基酸;X=任何一种氨基酸;u=极性、不带电荷的氨基酸;b=碱性氨基酸;a=酸性氨基酸。在某些实施方式中,本发明包括核酸,其包含编码化学式I的ATAP的区域。在另外的实施方式中,本发明包括多肽,其由肽合成仪合成,其中该多肽包含化学式I的ATAP。
在其他的某些方面,本发明涉及用于在靶细胞中诱导凋亡的组合物和方法。在某些示例性实施方式中,本发明包括,通过例如体内、体外(invitro)、或离体回输(exvivo)的方法给予有效量的用于在细胞中诱导凋亡的本发明的治疗性组合物。本文还描述了用于治疗与细胞高度增殖有关的疾病或病症(例如,癌症或增生;细菌感染;或免疫紊乱)的方法,该方法包括给予对其需要的受试者治疗有效量的编码ATAP的核酸、或ATAP本身以及药用载体。
以上仅通过举例方式给出一般的应用领域,并不是要用来限制本发明披露内容和所附权利要求的范围。根据本发明的权利要求、说明书、以及实施例,本领域中的普通技术人员将理解本发明的另外的目的和优点,并且其显然包括在本发明的范围内。
附图说明
图1.两亲性尾锚定肽(ATAP)在Bfl1和HCCS1中是保守的(参见SEQIDNO.2、3、以及52)。(A)分别在人染色体15q24.3和15q25.1上的BCL2A1(BFL-1;SEQIDNO.1)和HCCS1(SEQIDNO.54)基因的示意性基因组结构。黑棒表示外显子,而红棒表示BCL2A1和HCCS1基因的保守性外显子-3。(B)来自BCL2A1和HCCS1基因的外显子-3序列的比对。相同的序列以灰色阴影表示而单碱基间隙(basegap)以黑色阴影表示。终止密码子为黄色。(C)Bfl1和HCCS1的TA区的一级序列比较。水平红棒表示Bfl1和HCCS1的ATAP序列。绿线表示预测的α-螺旋区。蓝线表示HCCS1的线粒体靶向信号(MTS)。(D)Bfl1和HCCS1的ATAP序列的螺旋轮示图。(E)来自人抗凋亡Bcl2家族蛋白和A1、人Bfl1的小鼠同源物、以及ATAP序列(参见SEQIDNO.2-7)的TA区的氨基酸序列比对。F-G:HEK293细胞的FLAG-TA诱导的半胱天冬酶(半胱天冬蛋白酶,caspase)依赖性细胞死亡的瞬时表达。在没有或有50μM泛半胱天冬酶(泛半胱天冬蛋白酶,pan-caspase)抑制剂,OPH的情况下,用1.0μg指定的表达质粒和0.1μg的pCMV-β-gal共转染细胞。共转染24小时以后,用碘化丙啶(PI)对细胞染色并在荧光显微镜下进行观测(F)。通过相对于用FLAG模拟品(mock)和pCMV-β-gal报告质粒转染的对照细胞的β-半乳糖苷酶活性来测量细胞活力(cellviability)(G)。H:使用针对FLAG标签表位的抗体通过蛋白质印迹法来确定FLAG-标签蛋白和TA肽的相对表达水平。
图2.ATAP-诱导的凋亡与Bax和Bak活性无关。(A)HEK293细胞的Flag-ATAP诱导的半胱天冬酶依赖性细胞死亡的瞬时表达。在没有或有50μMOPH的情况下,用1μg模拟品或Flag-ATAP表达质粒并用0.1μg的pCMV-β-gal共转染细胞。通过相对于用模拟质粒和pCMV-β-gal报告质粒转染的对照细胞的β-半乳糖苷酶活性来测量细胞活力(左边)。使用针对Flag标签表位的抗体通过蛋白质印迹法来确定Flag-ATAP肽的相对表达水平(右边)。(B,C)以半胱天冬酶依赖性方式,GFP-ATAP-诱导的凋亡核形态和亚G1群体的瞬时表达。在转染后24小时,固定GFP-ATAP-转染的HeLa细胞,用DAPI染色并在荧光显微镜下进行观测(B)。用指定的表达质粒瞬时转染HEK293细胞。在转染后18小时,收集细胞、固定、然后用PI染色。然后通过流式细胞术分析GFP-阳性细胞的DNA含量(C)。(D)各种癌细胞中GFP-ATAP诱导的急性细胞死亡的瞬时表达,这些癌细胞包括HEK293、HeLa、半胱天冬酶-3缺陷型MCF-7细胞以及BMKD3细胞,其源自敲除Bax和Bak基因的新生小鼠的肾脏。转染后24小时,通过PI排除(PIexclusion)测量细胞存活。图中示出获自HEK293细胞的典型图像。(E)通过PI-阴性细胞与总GFP-阳性细胞的比率来确定存活细胞的百分比。对来自三个不同领域的约300个细胞进行评分。数据表示为平均值±s.e.,棒,10μm。
图3.ATAP的促凋亡活性要求两亲性。(A)GFP-ATAP构建体(SEQIDNO.45-51)的示意性图示,其中点突变被引入ATAP的疏水富集(hydrophobicrich,HR)区。(B)在转染后24小时,在用1μg的GFP-ATAP突变构建体转染的HEK293细胞中通过PI排除测量细胞存活。(C)Flag-mHR3肽显示出降低的促凋亡活性。用0.1μg的pCMV-β-gal报告质粒和1μg的Flag-ATAP或Flag-mHR3表达质粒共转染HEK293细胞。在共转染后24小时,通过β-半乳糖苷酶活性来测量细胞活力(左边)。使用针对Flag标签表位的抗体通过蛋白质印迹法来确定Flag-标签肽的相对表达水平(右边)。(D)在HCCS1的凋亡功能中涉及ATAP的两亲特性。用0.1μg的pCMV-β-gal报告质粒和1.0μg的HCCS1-GFP或HCCS1-GFP(E46Q/E53Q)(包含对应于Bfl1ATAP的mHR3突变)共转染HEK293细胞。共转染后24小时,通过β-半乳糖苷酶活性来测量细胞活力。数据表示为平均值±s.e.。
图4.ATAP的促凋亡活性涉及靶向线粒体。(A)GFP-ATAP构建体(参见SEQIDNO.38-44)的示意性表示,其中点突变被引入ATAP的侧翼区(flankingregion)。(B)在转染后24小时,在用1μgGFP-ATAP突变构建体转染的HEK293细胞中,通过PI排除来测量细胞存活。(C)融合于GFP的ATAP突变体的亚细胞定位。用0.5μg指定的质粒转染HeLa细胞。在有50μMOPH的情况下进行细胞培养,以防止快速细胞死亡。转染后18小时,在包含50nMMitoTracker的培养基中孵育细胞两小时,然后利用4%多聚甲醛进行固定。利用共聚焦显微镜术来观测GFP融合蛋白的定位。棒,10μm。(D)GFPATAP突变体对凋亡的细胞效果。用指定的质粒瞬时转染HEK293细胞,其中指定的质粒表达融合于GFP的ATAP突变体。转染后18小时,富集细胞、固定、然后用PI染色。然后通过流式细胞术分析GFP-阳性细胞的DNA含量(上图)。通过在2%琼脂糖凝胶上的电泳还分析了DNA片段(下图)。SM,100bp的阶梯尺寸(laddersize)标记。(E)GFP-ATAP和GFP-ATAP突变体对HEK293细胞的时间过程的影响(time-courseeffect)。在用1μgGFP-ATAP突变构建体转染的HEK293细胞中,通过PI排除来测量细胞存活。
图5.MTS和ATAP均与HCCS1诱导的线粒体靶向凋亡有关。(A)HCCS-1的GFP融合蛋白及其缺失突变体的示意性图示。(B)GFP融合蛋白的亚细胞定位。用0.5μg指定的质粒转染HeLa细胞。在有50μMOPH的情况下,进行细胞培养。转染后18小时,在包含50nMMitoTracker的培养基中孵育细胞两小时,然后利用4%多聚甲醛加以固定。利用共焦显微镜术观测GFP融合蛋白的定位。棒,10μm。(C)在转染后24小时,在用1μgGFP融合构建体转染的HEK293细胞中,通过PI排除来测量细胞存活。
图6.在平面脂双层中,ATAP诱导线粒体膜电位的损失并干扰膜通透性。(A)GFP-ATAP对线粒体膜电位的影响。利用MitoTrackerRed(CM-H2TMRos)染料观测线粒体外膜电位。用GFP-ATAP、GFP-mHR7或GFP-TAxL转染HeLa细胞并在有50μMOPH的情况下进行培养。转染后24小时,在包含50nMMitoTracker的培养基中孵育细胞两小时,然后在荧光显微镜下进行观测。棒,10μm。(B)用来自三个不同的域(或场,field)中的约300个GFP阳性细胞量化绿色(GFP)和红色(MitoTracker)双阳性细胞。数据表示为平均值±s.e.。(C)ATAP对细胞色素c释放的影响。左图,用1μg的pEGFP(泳道1)、pEGFP-ATAP(泳道2)或pEGFPmHR7(泳道3)转染HEK293细胞。通过蛋白质印迹法使用抗细胞色素c抗体分析20μg线粒体游离细胞溶胶蛋白。右图,用合成的ATAP和mHR7肽(100μM)孵育分离自BMK-D3细胞的线粒体膜。ATAP诱导细胞色素c释放进入上清(S),而细胞色素c保留在用mHR7和DMSO(作为对照)处理的制剂中的沉淀物(P)中。(D)合成ATAP和mHR7肽对平面脂双层的膜通透性的影响。将肽(11.1μM)加入一边的室(cischamber)中。通过记录200mMKCl(这边)和50mMNaCl(另一边)的溶液来测量在相应保持电位的电流轨迹(Currenttraces)。对于ATAP,数据表示n=5,以及对于mHR7,数据表示n>35。
图7.说明TA的促凋亡活性的示意图。源自Bfl-1的TA结构域可以借助于特定的胞内运输机制通过靶向线粒体外膜(MOM)来诱导凋亡。在尾锚定(TA)序列中部,带电荷残基的存在给予跨膜节段两亲螺旋特点,并可能与线粒体膜电位的干扰有关。(TC=易位复合体)。
具体实施方式
如本文所描述的,ATAP肽和多肽能够诱导细胞凋亡,因此,ATAP基因表达、多肽合成、活性或蛋白质-蛋白质相互作用代表一种新的治疗性干预,用于疾病和病症相关的功能失常的细胞增殖和细菌感染。
在某些方面,本文的描述涉及PCT/KR2004/001324(WO2004/110474)、Yangetal.,J.Cell.Biochem.,94:1234-1247(2005)、以及Koetal.,J.CellSci.,Aug.15;120(16):2912-23的主题,出于各种目的将其全部内容以引用方式结合于本文。
本发明提供了新的多核苷酸以及由其编码的包含两亲性尾锚定肽ATAP的多肽。核酸序列在本文中统称为“ATAP核酸”或“ATAP多核苷酸”而相应的编码多肽可互换地称作“ATAP多肽”、“ATAP肽”、“ATAP蛋白质”、“包含ATAP的多肽”或“包含ATAP的蛋白质”。除非另有说明,“ATAP”意指本文中教导或提示的任何一种新的核酸或肽序列。“ATAP结合蛋白”、以及“ATAP受体”蛋白是指这样的肽或蛋白质,其包含对两亲性尾锚定肽(ATAP)的结合位点,其中两亲性尾锚定肽包括其结构域、融合蛋白、嵌合体、或片段。
如在本文中所使用的,“ATAP受体基因”或“ATAP受体结构基因”包括ATAP受体基因的5’UTR、3’UTR、启动子序列、增强子序列、内含子和外显子DNA、以及ATAP受体基因mRNA或cDNA序列。
包括Bcl-2家族成员的尾锚定(TA)蛋白质通过在羧基(C)末端的单疏水节段特征性地束缚于磷脂双层,其中分子的大部分位于胞质溶液中。因为Bcl-2蛋白的凋亡功能与它们靶向ER或MOM相关联,因此理解构成它们的亚细胞分布基础的分子机制是目前凋亡研究的主要工作重点。
Bfl-1是人抗凋亡Bcl-2家族蛋白,其保护细胞免于各种凋亡刺激,其包括TNF死亡受体的激活作用、化疗药物的治疗、以及Bax或Bid的过度表达。如本文所述,Bfl-1是双功能的,因为EGFP融合于Bfl-1的氨基(N)末端可将Bfl-1的抗凋亡特性转化成强效促凋亡分子,其靶向线粒体依赖性凋亡途径。然而,在本描述之前,导致Bfl-1的双功能能力的分子机制并不知道。
线粒体外膜(MOM)靶向尾锚定(TA)区经常包含一个短疏水结构域,该疏水结构域在两端临近由若干带正电荷的氨基酸。Bfl-1靶向于MOM似乎涉及TA结构域,因为在C末端17个氨基酸的缺失引起Bfl-1远离线粒体的错误靶向。此外,Bfl-1S,Bfl-1的一种可替换剪接变体,具有不同的C端结构域,定位于细胞核。因为Bfl-1TA结构域在疏水节段内包含三个带电荷残基,其可作为稳定插入膜环境的屏障,所以广泛认为Bfl-1的羧基末端不可能起真正的TA的作用。
本文提供的描述和实施例证明了源自Bfl-1的TA结构域的短肽(即ATAP)的惊人和意想不到的MOM靶向和强效促凋亡活性(参见图1)。带正电荷的赖氨酸残基(K147和K151)导致ATAP靶向于MOM,并且ATAP的促凋亡活性似乎需要TA的两亲性。因此,一方面,这种短肽可以用作有用的探针,说明构成线粒体依赖性凋亡途径起始的基础分子事件。另一方面,ATAP肽还可以用作潜在的治疗剂,用于治疗增生性病症,例如,癌症。
如上所述,抗凋亡Bcl-2成员在其C端包含特征性TA基序,包括疏水的TMS(18或19个氨基酸)和两个旁侧区(FR-1和FR-2)(包含保守的赖氨酸残基)。不同于其他成员,来自Bfl-1的TA包含在TMS中部的带电荷残基,其产生独特的两亲结构。一种类似的ATAP序列可以形成在另一种基因中,HCCS1,其通常与bcl2基因家族无关。
HCCS1,一种最近鉴定的肿瘤抑制基因,其细胞功能还有待确定(Kim等,2002)。HCCS1的基因组序列紧靠第15号染色体上的Bfl1的基因组序列而定位。除ATAP之外,HCCS1还包含在N端的新的MTS。因为缺少MTS的HCCS1可以靶向线粒体并诱导半胱天冬酶依赖性细胞死亡,因此表明ATAP有助于HCCS1的固有线粒体靶向性。除线粒体靶向之外,我们还观测到,ATAP的促凋亡活性随Bfl1和HCCS1中相应带电荷残基的突变而发生平行变化。我们的结果表明,ATAP的促凋亡功能在Bfl1和HCCS1中是保守的。
因此,一方面,本发明涉及包含通式I的ATAP肽的组合物:bXaXbuunnunnanXGbnXann(X)1-6nn(X)0-2b(I)。
其中,n=非极性(疏水)氨基酸;X=任何一种氨基酸;u=极性、不带电荷的氨基酸;b=碱性氨基酸;以及a=酸性氨基酸。
另一方面,本发明涉及包含通式(II)的ATAP肽的组合物:(K/R)n(E/D)(P)(K/R)SGW(M/L)(S/T)FL(E/D)nTG(K/R)I(X)(E/D)ML(X)1-6LL(X)0-2(K/R)(II)。其中n、X,、u、b、以及a如上文所定义。
如在本文中所使用的,碱性氨基酸包括:组氨酸、精氨酸、以及赖氨酸;酸性氨基酸包括:天冬氨酸、以及谷氨酸;非极性(疏水)氨基酸包括:苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、色氨酸、脯氨酸、以及缬氨酸;极性、不带电荷氨基酸包括:半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸、以及苏氨酸。
在这里,我们证明了ATAP肽呈现强效促凋亡活性,其来自两个保守的功能基序,一个基序允许靶向线粒体膜而另一个基序提供对肽的两亲性。ATAP可以诱导线粒体通透性转换并用作凋亡的强效刺激剂。虽然所有抗凋亡Bcl2成员在其C端包含TA特征性基序,但Bfl1和HCCS1的ATAP是独特的,因为它们在疏水富集区的中部包含三个带电荷残基,因此具有两亲特性。29个氨基酸的ATAP足以将报告分子(EGFP)定位在线粒体上。我们的结果揭示了侧翼区(旁侧区,flankingregion)内的三个碱性氨基酸决定靶向线粒体的特异性。mFR4突变体(K147L/K151L)仅部分地定位于线粒体并且主要存在于细胞质中。此外,在FR-1和FR-2内三个赖氨酸残基的突变导致来自线粒体的TA的完全错误定位(接头-mFR-7)。
先前,Bfl1的ATAP已被排除作为真正的TA,这是基于:带电荷残基的存在作为肽穿透和分配到脂双层膜的屏障(CoryandAdams,2002;Grossetal.,1999)。在这里,我们证明了,ATAP足以将报告分子(GFP)定位在线粒体。我们的结果进一步揭示了,在FR-1和FR-2区(图1)内的三个碱性残基,例如,赖氨酸或精氨酸,对于靶向线粒体是关键的。在所有已知尾锚定蛋白质(包括抗凋亡Bcl-2家族蛋白)中,来自Bfl-1和HCCS-1的TMS的两亲性是独特的。有趣的是,在Bfl1旁侧区内没有碱性残基的情况下,包含相邻于TA的N端的碱性残基的外侧序列(externalsequence)也可以起用于线粒体靶向的假旁侧区(pseudo-flankingregion)的作用。这说明在ATAP的N端的碱性残基的位置对有效的线粒体靶向来说是必需的。
位于疏水富集(HR)结构域内的带电荷残基对ATAP的促凋亡活性来说是必需的。不受限于任何特定理论,本发明的发明人提出,这些带电荷的氨基酸(在Bfl1ATAP中的E159、K163以及E166;以及在HCCS1ATAP中的E46、K50、以及E53)与寡聚化有关,并且也许与干扰线粒体膜完整性的水相孔道(aqueouspore)的形成有关(参见图1和图7)。此外,本发明的发明人假定,带电荷残基(例如,E159、K163以及E166),其面向α-螺旋的一侧,可参与水相离子传导孔道的形成,因此,干扰线粒体通透性转换。这得到我们以下发现的支持:ATAP肽可以改变重建脂双层的离子通透性。我们具有广泛的数据表明,Bfl-1ATAP本身可能导致强效促凋亡活性,因为在生化、细胞生物和成像分析中,用FLAG-TA和EGFP-TA观测到类似效应。
利用脂双层重建系统,我们证明了,合成野生型ATAP肽对脂双层膜的阳离子通透性产生显著影响,而突变体mHR7肽可以结合于线粒体膜但对细胞没有毒性,并不影响脂双层膜的传导性。在离体系统中ATAP介导的通透性变化并不呈现依据成孔通道可预期的典型的稳定的传导特性。ATAP可以与预先存在的通道相互作用或调节预先存在的通道以改变线粒体膜通透性,或潜在地Bfl1或HCCS1蛋白的其他结构域可以有助于体内观测到的膜通透性的改变。
已知触发线粒体凋亡的两种一般类型的肽目前正在进行作为潜在癌症治疗剂的临床试验。一种类型是两亲性肽,其包含高含量的衍生自抗菌肽的碱性残基(Chenetal.,2001;Ellerbyetal.,1999;Maietal.,2001)。这些肽靶向线粒体是依靠肽中带正电荷的残基与带负电荷的线粒体膜脂之间的静电相互作用。在靶向线粒体膜以后,这些肽破坏线粒体功能并通过脂膜变形或在线粒体膜中形成孔而引起细胞色素c释放。这种机制可以类似于它们在带负电荷的细菌膜上的抗微生物功能(ShaiandOren,2001)。然而,因为这些肽的细胞毒活性取决于肽的高细胞内浓度(由于靶向线粒体的效率低),所以必须最大化它们靶向癌细胞的特异性以实现有效的临床应用。
其他类型的肽是那些源自仅BH3促凋亡Bcl2家族蛋白如Bad和Bid(Letaietal.,2002;Schimmeretal.,2001;Walenskyetal.,2004)的肽。Bid的BH3肽可以直接结合于促凋亡Bax和Bak以激活它们,从而诱导凋亡,或可以结合于抗凋亡Bcl2和Bcl-xL以防止它们抑制Bax和Bak(Letaietal.,2002)。最近的研究表明,源自Bid的稳定BH3肽可以特异性地诱导若干白血病细胞的凋亡,这突出了它们的治疗潜力(Walenskyetal.,2004)。然而,促凋亡蛋白的下调和/或抗凋亡蛋白的上调经常向癌细胞提供对于凋亡疗法的抗性机制。
因为全长Bfl1和HCCS1具有相反的功能,一种是抗凋亡而另一种是促凋亡,所以引起关注的是,在各种组织中观测它们的表达水平。可获得的mRNA微阵列数据和EST表达谱的分析揭示了在检查的19种组织的16种组织中BCL2A1和HCCS1的表达是互斥的,这提示在细胞增殖和再生中它们可能具有互补的组织特异性功能。有趣的是,发现仅淋巴结和肾脏包含Bfl1和HCCS1的高水平转录物。该结果提示,Bfl1可能与作为促凋亡因子的HCCS1共有类似的生物功能,以根据在淋巴结和肾脏的细胞状态来实现凋亡的动态调节。为了支持此假设,Kucharczak等(Kucharczaketal.,2005)发现,在FL5.12pro-B细胞系(祖B细胞系)中,响应TNFα的刺激并通过蛋白水解转化(proteolyticturnover),Bfl1可以被转化成促凋亡因子,这表明发生在淋巴结中的B细胞选择过程中可以涉及Bfl1的促凋亡活性。
为了试图检查HCCS1的肿瘤抑制剂功能,我们使用RT-PCR来检查HCCS1在正常人组织(包括肺、乳腺以及子宫颈)、以及在各种已成熟建立的癌细胞系中的表达水平。为了区分HCCS1和BCL2A1转录物,我们使用对于HCCS1和BCL2A1的外显子1区特异的引物对。在正常肺、乳腺以及子宫颈组织中,检测到丰富的HCCS1产物,而BCL2A1产物则显著缺乏,其与微阵列数据一致,这表明这些组织包含丰富水平的HCCS1而不是Bfl1。有趣的是,在6个乳腺癌细胞系中有两个,例如MDA-MB231和MDA-MB435,检测到HCCS1的非常低的表达水平,这表明HCCS1在肿瘤发生中可能的作用。引人注意的是,HeLa-子宫颈癌细胞系-也呈现降低的HCCS1的表达。HCCS1的下调是否直接与癌细胞的发育有关、HCCS1的靶向改变是否在其促凋亡功能中发挥作用,需要进一步加以检测。
我们的结果表明,ATAP还可以作为强效抗生素。当达到高水平的表达时,在大肠杆菌中ATAP的表达导致细胞溶解。这表明,ATAP的两亲能力不仅可以破坏MOM的渗透性,而且还可以在具有类似脂质组成的细菌膜中产生类似效应。通常,由于膜组成的差异,真核细胞质膜将不会受到这些类型肽的影响。因此,ATAP作为抗菌剂具有有益的应用,其可以用来治疗整个身体的各种细菌感染。另外,因为这似乎是膜通透性的物理破坏,所以这种抗生效应将较少可能导致抗生素抗性,抗生素抗性可能常常由于使用靶向代谢途径的抗生素而导致。
ATAP肽可以用作治疗癌症、增生、以及细菌感染的强效剂。ATAP与阳离子抗菌肽的区别在于主动和特异性地靶向线粒体膜(在真核细胞中)。ATAP不同于BH3肽,这是由于它与线粒体膜直接相互作用,不需要Bcl2家族蛋白的参与。抗凋亡Bcl-xL不能阻断ATAP诱导的凋亡,因此ATAP的促凋亡功能不需要Bax或Bak的促凋亡活性。因此,ATAP具有潜力来克服癌细胞对通过Bcl2家族蛋白的表达水平改变所产生的凋亡刺激的抗性。本文中我们描述了新的策略来开发使用ATAP序列的癌症治疗剂,其中ATAP序列可以特异性地靶向线粒体以破坏线粒体膜完整性。
因此,用于治疗增生性病症或细菌感染的新方式采用了ATAP及其促凋亡突变体。虽然不受限于任何特定理论,但数据支持在破坏线粒体膜电位以及诱导凋亡中ATAP的直接作用(至少在真核细胞中)。该模型得到两个关键证据的支持。首先,虽然在Bfl-1TMS中部的两个带负电荷的残基(E159和E166)对于Bfl-1TA的促凋亡活性是重要的,但具有带正电荷残基(E159K/E166K)的mHR5也具有与野生型TA相当的强效促凋亡活性(图3和图5)。这意味着对于Bfl-1TA的促凋亡活性起关键作用的是TMS的两亲性,而不是E159和E166残基与其他分子间氨基酸残基的特定的电荷相互作用。其次,在我们试图产生细菌表达重组TA时,我们使用了两种细菌TA表达载体。在两种情况下,我们均观测到Bfl-1TA肽的表达对于大肠杆菌细胞生长是有毒性的(数据未示出)。因为来自革兰氏阴性菌如大肠杆菌的膜包含高含量的非常像线粒体膜的带负电荷的脂质,所以TA的毒性作用可能来自对脂膜的直接作用。这些结果一起表明这样的可能性,即在靶向MOM以后ATAP肽可以直接损伤MOM的脂质结构。
本发明的ATAP与源自目前已知的抗菌肽的阳离子两亲肽的区别在于主动和特异性地靶向MOM。此外,ATAP与BH3肽的区别在于它对MOM的直接毒性作用,其并不需要与Bcl-2家族蛋白的相互作用。抗凋亡Bcl-xL和Bfl-1不能阻断由Bfl-1TA诱导的凋亡并且ATAP促凋亡活性并不需要Bax或Bak的促凋亡活性(图2)。
因此,ATAP具有克服癌细胞对通过调节Bcl-2家族蛋白的水平所产生的凋亡刺激的抗性的潜力,并且还具有克服细菌对目前已知类型的抗生素(例如,糖苷类、孢菌素类(sporins)、糖肽类、大环内酯类、磺胺类等)的耐药性问题的潜力。因此,本发明提供了一种新方法来开发使用了促凋亡ATAP肽的癌症治疗肽,其中促凋亡ATAP肽可以特异性地靶向线粒体并破坏线粒体膜完整性。此外,包含多肽的ATAP可以单独或与现有的抗菌剂联合用作抗菌药。
在某些实施方式中,本发明的包含ATAP肽的多肽组合物总长度为约25个氨基酸至约300个氨基酸。在一种优选实施方式中,本发明的包含ATAP肽的多肽组合物总长度为约26至约100、90、80、70、60、50、40、或30个氨基酸。
另一方面,本发明提供了一种分离的ATAP核酸分子,该ATAP核酸分子编码ATAP多肽,其包括一种核酸序列,该核酸序列与在SEQIDNO:37或59中所披露的核酸具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的同一性。在某些实施方式中,分离的ATAP核酸分子将在严格条件下杂交于一核酸序列,该核酸序列互补于包括ATAP核酸序列的蛋白质编码序列的核酸分子。本发明还包括一种分离的核酸,其编码ATAP多肽、或其片段、同系物、类似物、融合蛋白、假肽、拟肽或衍生物。例如,该核酸可以编码与来自Bfl-1或HCCS1的ATAP区具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同一性的多肽。在某些实施方式中,本发明的多肽包括SEQIDNO:36、38-51、53中的至少一种肽或它们的组合。
本发明考虑的核酸可以是,例如,基因组DNA片段或cDNA分子,其包含与来自Bfl-1或HCCS1的ATAP区(SEQIDNO.37和59)具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同一性的核酸序列。在某些实施方式中,本发明的核酸包括SEQIDNO:37和59中的至少一种的多核苷酸。
本发明还包括寡核苷酸,例如,包含ATAP核酸(例如,SEQIDNO:37或59)的至少6个连续核苷酸的寡核苷酸、或所述寡核苷酸的互补体(complement)。
本发明还包括基本上纯化的ATAP多肽,例如,通式I的ATAP肽:
bXaXbuunnunnanXGbnXann(X)1-6nn(X)0-2b(I)。
其中,n=非极性(疏水)氨基酸;X=任何一种氨基酸;u=极性、不带电荷的氨基酸;b=碱性氨基酸;以及a=酸性氨基酸。
在另外的实施方式中,本发明包括SEQIDNO:36、38-51、53的ATAP肽或它们的组合。在某些实施方式中,ATAP多肽包括一种氨基酸序列,其基本上与人Bfl-1或HCCS1ATAP多肽的氨基酸序列相同。
本发明的抗体的特征还在于免疫选择性地结合于ATAP多肽、或其片段、同族物、类似物、假肽、拟肽或衍生物。
另一方面,本发明包括药物组合物,该药物组合物包括治疗或预防有效量的治疗用核酸、多肽、以及药用载体。治疗剂可以是,例如,ATAP核酸,例如,肽核酸、cDNA、或RNA,如抑制性小RNA(smallinhibitoryRNA);ATAP多肽;或对于ATAP多肽特异的抗体。另一方面,本发明包括在一个或多个容器中的治疗或预防有效量的上述药物组合物。
另一方面,本发明包括在允许表达由DNA编码的ATAP多肽的条件下通过培养包含内源性或外源表达ATAP核酸的细胞以产生多肽的方法。如果需要的话,然后可以回收ATAP多肽。
另外一方面,本发明包括通过培养细胞来产生多肽的方法,其中细胞包含位于内源性、外源性、或异源性启动子上游或下游的外源性ATAP核酸。在某些实施方式中,通过同源重组、链断裂或错配修复机制,将外源性启动子引入宿主细胞的基因组。在某些实施方式中,外源性ATAP基因的表达在组织特异性或可化学诱导的启动子的控制下进行。
另一方面,本发明包括编码ATAP的核酸,其中核酸除编码ATAP的多核苷酸之外还包含这样的多核苷酸部分,其编码ATAP抑制剂多肽以致该抑制剂能够掩蔽ATAP的细胞毒性作用直到需要的时刻。在一个示例性实施方式中,可以通过蛋白酶切割位点将抑制性多肽连接于ATAP。在细胞暴露于特定刺激以后,蛋白酶被激活,从而从ATAP多肽释放抑制性多肽,然后“游离”ATAP多肽能够在细胞中诱导凋亡。在另一实施方式中,ATAP抑制剂是一种化学部分,如小分子,其可以类似地自ATAP多肽被酶促切割,以使ATAP可以诱导凋亡。
另一方面,本发明包括检测样品中ATAP多肽存在的方法。在该方法中,将样品与一种化合物接触,该化合物在允许多肽和化合物之间形成复合物的条件下选择性地结合于多肽。检测上述复合物(如果存在的话),从而鉴定样品中的ATAP多肽。
本发明还包括基于ATAP核酸、多肽或ATAP融合多肽它们的表达来鉴定特异性细胞或组织类型的方法。
在另外的实施方式中,本发明包括融合蛋白(其包含“标记/标签”或指示部分(indicatorportion)和ATAP部分)以及对其进行编码的核酸。在某些方面,标记/标签或指示部分可以是适合于纯化目的的肽,例如,FLAG标签、6xHis标签等等。在其他方面,标签肽包括适合于提供信号的肽,如抗体表位或荧光肽。其他方面包括ATAP与适合于介导激活作用、亚细胞定位或移位穿过细胞膜的肽的融合,例如,来自HIV病毒的TAT融合蛋白。
本发明还包括一种方法,该方法用于通过使样品接触ATAP核酸探针或引物来检测样品中ATAP核酸分子的存在,以及检测核酸探针或引物是否结合于样品中的ATAP核酸分子。
另一方面,本发明提供了一种用于调节ATAP多肽活性的方法,其中通过使包含ATAP多肽的细胞样品接触足够量的结合于ATAP多肽的化合物,以调节所述多肽的活性。如本文进一步描述的,上述化合物可以是,例如,小分子,如核酸、肽、多肽、拟肽、碳水化合物、脂质或其他有机(含碳)或无机分子。
本发明还包括在制备用于治疗或预防病症或综合征的药剂中将ATAP用作治疗剂的应用,其中上述病症或综合征包括,例如,心血管病、心肌病、动脉粥样硬化、高血压、先天性心脏缺陷、主动脉狭窄、房间隔缺损(ASD)、房室(A-V)管缺损、动脉导管、肺动脉瓣狭窄、主动脉瓣下狭窄、室间隔缺损(VSD)、瓣膜病、高凝、血友病、溃疡、伤口、损伤、切口、磨损症、氧化损伤、与年龄有关的组织变性、手术相关损伤、烧伤、肌肉无力、肌萎缩、结缔组织病、特发性血小板减少性紫癜、心力衰竭、由心力衰竭和高血压引起的继发性病理特征、低血压、心绞痛、心肌梗死、结节性硬化、硬皮病、移植、自身免疫病、红斑狼疮、病毒/细菌/寄生性感染、多发性硬化、自身免疫病、变态反应、免疫缺陷、移植物抗宿主病、哮喘、气肿、ARDS、免疫应答的炎症和调节、病毒性发病机制、衰老相关疾病、Th1炎性疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、AIDS、伤口修复、心肌梗死、心力衰竭、肌营养不良、褥疮、糖尿病性溃疡、氧化损伤、以及组织损伤如鼻窦炎或粘膜炎、皱纹、湿疹或皮炎、皮肤干燥、肥胖症、糖尿病、内分泌病、厌食症、贪食症、肾动脉狭窄、间质性肾炎、肾小球肾炎、多囊肾病、系统性、肾小管性酸中毒、IgA肾病、肾脏病、高钙血症、莱-尼综合征、希-林(VHL)综合征、创伤、再生(体外和体内)、希尔施普龙病、克罗恩病、阑尾炎、子宫内膜异位症、喉炎、银屑病、光化性角化病、痤疮、毛发生长/损失、秃发(allopecia)、色素沉着症、重症肌无力、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、其他贮积症、过氧化物酶病如泽尔韦格综合征、婴儿雷夫叙姆病、肢根软骨发育不良(肢根的点状软骨发育不良,)、以及高哌啶酸血症、骨质疏松、肌肉疾病、尿潴留、奥尔布赖特遗传性骨营养不良、溃疡、阿尔茨海默病、卒中、帕金森病、亨廷顿病、大脑性瘫痪、癫痫、莱-尼综合征、多发性硬化、毛细血管扩张性共济失调、行为障碍、成瘾性、焦虑、疼痛、神经保护、卒中、无晶状体、神经变性病、神经紊乱、发育缺陷、与GRK2在脑中以及在调节趋化因子受体中的作用有关的病症、脑脊髓炎、焦虑、精神分裂症、躁狂抑郁症、谵妄、痴呆、重症精神发育迟缓和运动障碍、日勒德拉图雷特综合征、脑白质营养不良、癌症、乳腺癌、CNS癌、结肠癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、以及子宫颈癌、瘤形成如BPH、腺癌、淋巴瘤、子宫癌、良性前列腺肥大、生育力、生长和发育/分化相关功能的控制例如但不限于成熟、哺乳期和青春期、生殖功能障碍、和/或其他类似的病理特征和病症。
在某些实施方式中,本发明的治疗性组合物包含,例如,ATAP核酸;结合ATAP编码核酸的核酸;ATAP多肽、基于其的肽类似物、假肽或拟肽;ATAP或ATAP蛋白质-蛋白质相互作用的小分子调节物;或ATAP特异性抗体或其生物活性衍生物或片段。如本文所述,ATAP介导细胞凋亡的诱导。因此,靶向这些核酸、多肽、以及它们的同系物的表达和/或活性将为各种急性和慢性疾病和病症(例如,那些与增生性功能不良有关的疾病和病症)的新疗法创造条件。
本发明包括用于治疗或改善与细胞增殖有关的疾病和/或病症的方法,该方法包括将有效量的本发明的组合物给予对其需要的受试者。在某些实施方式中,本发明包括用于治疗任何类型的癌症的方法,该方法包括将有效量的本发明的治疗性组合物给予对其有需要的受试者。在本文描述的任何实施方式中,本发明的治疗性组合物可以包含ATAP编码核酸、ATAP多肽、融合蛋白、假肽等等以及药用载体。
在本发明的任何方面,本发明的治疗性组合物可以是任何药用形式并通过任何药用途径给予,例如,可以通过口服给药(一天给药一次或单次给药)给予治疗性组合物,用于治疗由于心肌梗死、硬化性病变引起的肌肉损伤、或由于体育相关活动引起的肌肉撕裂,以促进受损肌肉组织的再生和修复。上述药用载体和赋形剂以及给予方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
本发明的多肽可以用作免疫原以产生特异于本发明的抗体,以及可以用作疫苗。它们还可以用来筛选潜在的激动剂和拮抗剂化合物。此外,编码ATAP的cDNA可以用于基因治疗,并且当给予对其需要的受试者时,ATAP是有用的。作为非限制性实例,本发明的组合物对于治疗患有上文披露的疾病和病症和/或其他类似的病理特征和病症的患者是有效的。此外,本发明涉及核酸(包括干扰核酸)、以及编码ATAP相互作用蛋白的多肽。
本发明进一步包括用于筛选病症或综合征的调节物的方法,其中上述病症或综合征包括,例如,上文披露的疾病和病症和/或其他类似的病理特征和病症。上述方法包括使试验化合物接触ATAP多肽并确定试验化合物是否结合于所述ATAP多肽。试验化合物与ATAP多肽的结合是指试验化合物对上述病症或综合征的活动、潜伏状态(latency)或易感性(predispodition)的调节。
本发明还包括用于筛选Bfl-1或HSSC1活性的调节物的方法,该方法包括提供小分子化合物库并筛选与ATAP的结合情况。化合物与ATAP多肽结合暗示是Bfl-1或HSSC1活性的潜在调节物。在其他方面,本发明包括用于评估上述化合物的治疗潜力的方法,该方法包括将ATAP结合分子给予试验受试者,例如,细胞或未受损动物,以及相对于对照,测量在试验受试者中化合物诱导或抑制凋亡的活性或能力。接着,比较在试验动物和对照动物中的活性。相对于对照动物,在试验动物中的活性变化表明试验化合物是病症或综合征的调节物。
又一方面,本发明包括一种方法,该方法用于确定在受试者(例如,人受试者)体内包含ATAP的多肽、核酸、或两者的类型或水平的变化与疾病的存在或易感性(predisposition)的关系。该方法包括在来自受试者的试样中确定ATAP多肽的序列并比较试样和对照或参比序列中的基因型或单元型(haplotype)。和对照样品相比,试样中ATAP多肽的基因型改变表明在受试者中存在疾病或对疾病的易感性。优选地,易感性包括,例如,上文披露的疾病和病症和/或其他类似的病理特征和病症。此外,本发明的新的多肽的表达水平可以用于筛查各种病症以及确定特定病症的阶段(stage)的方法中。
另一方面,本发明包括在哺乳动物中用于治疗或预防与病症有关的病理状态的方法,该方法以足以减轻或预防病理状态的量将ATAP多肽、ATAP核酸、或ATAP特异性抗体给予受试者(例如,人受试者)。在优选的实施方式中,该病症包括,例如,上文披露的疾病和病症和/或其他类似的病理特征和病症。
又一方面,通过本技术领域中若干常用技术的任何一种,本发明可以用于鉴定包含ATAP的多肽的细胞受体和下游效应物(effector)的方法中。这些技术包括但不限于双杂交系统、亲和纯化法、与抗体或其他特异性相互作用分子的共沉淀。
除非另有限定,本文所用的所有技术和科学术语具有和本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。然而在实施或试验本发明时可以使用与本文所述类似或等效的方法和材料,下文描述了适宜的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、以及其他参考文献的全部内容以引用方式结合于本文。在冲突的情况下,以本说明书(包括定义)为准。此外,材料、方法、以及实施例仅是说明性的而不是限制性的。
如在本文中所使用的,术语“ATAP拮抗剂”或“ATAP的拮抗剂”一般用来指能够直接或间接抑制ATAP表达、翻译、和/或活性的制剂。此外,如在本文中所使用的,“ATAP受体”一般涉及能够结合于ATAP蛋白质的任何一种蛋白质或其片段。
某些方面,调节ATAP活性是通过以下方式完成的,例如,使用或调节ATAP结合伴侣(partner),即,结合于ATAP并中和它的生物学活性的因子,如中和抗ATAP、ATAP受体、ATAP受体片段、以及ATAP受体类似物;使用ATAP受体拮抗剂,如抗体、假肽、肽类似物或拟肽,其结合并破坏ATAP-受体相互作用;使用小分子,其抑制ATAP活性或分子间相互作用、或改变ATAP的正常构型、或抑制有效的(productive)ATAP/ATAP-受体结合;或使用衍生自ATAP基因和/或ATAP受体基因的核苷酸序列,包括编码、非编码、和/或调节序列,以防止或减少ATAP的表达通过例如反义、核酶、和/或三股螺旋方式。
另一方面,本发明提供了一种试剂盒,该试剂盒包括合适的容器、本发明的ATAP核酸或多肽、及其使用说明。
另一方面,本发明涉及一种用于诊断或监测病症或疾病或进展的方法,该方法包括通过检测ATAP区或ATAP受体基因或蛋白质或两者的表达水平来检测Bfl-1或HCCS1的ATAP部分中核苷酸多态性的存在。已确定,多态性与疾病严重性相关。(参见,Zhongetal.,NucleicAcidsRes.2005Aug2;33(13):e121;Donnetal.,ArthritisRheum.2004May;50(5):1604-10;出于各种目的将上述的全部文献以引用方式结合于本文)
普通技术人员将理解根据本发明的方法,ATAP、以及与疾病有关的ATAP受体基因多态性可以用作诊断标签,并且可以出现在任何先前提及的核酸区。用于鉴定和监测多态性的技术在本领域中是已知的并且在授权给Wohlgemuth的美国专利第6,905,827号中已有详细描述,出于各种目的将其全部内容以引用方式结合于本文。
本发明的某些方面包括用一种或多种DNA分子来检测基因表达或多态性的方法,其中所述一种或多种DNA分子具有一种核苷酸序列,其检测对应于在序列表中所描述的寡核苷酸的基因的表达。在一种形式中,寡核苷酸检测差异表达基因的表达。基因表达系统可以是候选文库、诊断剂、诊断寡核苷酸组合(set)或诊断探针组合。DNA分子可以是基因组DNA、RNA、蛋白核酸(PNA)、cDNA或合成寡核苷酸。按照本文教导的步骤,可以鉴定对于分析基因表达或多态性有意义的序列。这样的序列可以是疾病状态的预兆。
本发明的诊断寡核苷酸
如在本文中所使用的,术语"核酸分子"旨在包括DNA分子(例如,cDNA或基因组DNA),RNA分子(例如,mRNA),利用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物,以及它们的衍生物、片段和同系物。核酸分子可以是单链或双链,但优选由双链DNA组成。
在某些方面,本发明涉及诊断寡核苷酸和诊断寡核苷酸组合,对于寡核苷酸序列来说,在个体的健康状态和RNA或蛋白产物(对应于该核苷酸序列)的个体表达之间存在相关性。在某些情况下,对于这样的检测仅需要一种寡核苷酸。诊断寡核苷酸组合的成员可以通过能够检测RNA或蛋白产物的表达或多态性的任何方式加以鉴定,上述方式包括但不限于差异表达筛选、PCR、RT-PCR、SAGE分析、高通量测序、微阵列、液体或其他阵列、基于蛋白质的方法(例如,蛋白质印迹法、蛋白质组学、质谱法、以及本文描述的其他方法)、以及数据挖掘方法(如本文进一步描述的)。
在本发明的范围内,可以按照众所周知的分子生物学技术对核酸和/或蛋白质进行操作。许多上述方法的详细方案描述在,例如,Ausubeletal.CurrentProtocolsinMolecularBiology(supplementedthrough2000)JohnWiley&Sons,NewYork("Ausubel");Sambrooketal.MolecularCloning-ALaboratoryManual(2ndEd.),Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989("Sambrook"),andBergerandKimmelGuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymologyvolume152AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.("Berger")。
基因分型
除了表达谱和临床资料的相关性或结合表达谱和临床资料的相关性,经常需要使表达模式与受试者在一个或多个基因座的基因型相关或使表达谱和基因座数据均与临床资料相关。所选择的基因座可以是,例如,对应于候选文库的一个或多个成员的染色体基因座、用于标签基因座的多态等位基因、或已知或假定与疾病(或疾病标准)有关的可替换的疾病相关基因座(不影响候选文库)。当然应当明了,在基因座处的(多态)等位基因与疾病(或与对疾病的易感性)有关的情况下,等位基因的存在本身可以是疾病标准(diseasecriterion)。
许多众所周知的方法可以用来评估个体的基因型,除了许多其他有用的方法之外,上述方法还包括DNA分析(southernanalysis)、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、聚合酶链反应(PCR)、扩增片段长度多态性(AFLP)分析、单链构象多态性(SSCP)分析、单核苷酸多态性(SNP)分析(例如,借助于PCR、Taqman或分子标记(molecularbeacon))。许多上述方法容易适合于高通量和/或自动化(或半自动化)样品制备和分析方法。大多数可以用借助于简单程序回收自相同样品(产生用于表达谱的材料)的核酸样品进行。在例如Sambrook、以及Ausubel(上文)中描述了典型的技术。
本发明的核酸分子的特征还在于,例如酶促核酸分子、反义核酸分子、诱物(decoys)、双链RNA、三链寡核苷酸、和/或适体(aptamer),以及用来调节例如编码ATAP区或ATAP受体结合蛋白或ATAP受体蛋白的基因的基因表达的方法。具体而言,本发明的特征在于基于核酸的分子以及用来调节Bfl-1蛋白、HCCS1蛋白或ATAP受体蛋白的表达的方法。
本文参照在序列表中提供的典型的ATAP核酸描述了各个方面和实施方式。然而,上述各个方面和实施方式还涉及这样的基因,其编码ATAP蛋白质、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体基因的同系物、直系同源物(orthologs)、以及旁系同源物(paralogs),并且包括所有亚型(或同种型,isoforms)、剪接变体、以及多态性。利用针对ATAP蛋白质、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体基因所描述的方法,可以对那些另外的基因进行靶位点方面的分析。因此,如本文所述,可以实施其他基因的抑制和这种抑制的效应。
"下调"是指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质的RNA或等效RNA的水平、或一种或多种蛋白质的活性,如ATAP核酸、以及ATAP受体基因,被降低到低于在不存在本发明的核酸分子时所观测到的水平。在一种实施方式中,酶促核酸分子的抑制或下调优选低于无酶促活性或酶促活性衰减分子存在的情况下所观测到的水平,其中无酶促活性或酶促活性衰减分子能够结合于在靶RNA上的相同位点,但不能切割上述RNA。在另一种实施方式中,反义寡核苷酸的抑制或下调优选低于例如包含错义序列或包含错配的寡核苷酸存在的情况下所观测到的水平。在另一种实施方式中,利用靶向ATAP区、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体基因的RNA分子并使用本发明的核酸分子对Bfl-1或HCCS1的抑制或下调,在核酸分子存在的情况下,其大于不存在核酸分子的情况。
"上调"是指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质亚单位的RNA或等效RNA的水平、或一种或多种蛋白质亚单位(如ATAP蛋白质、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体基因)的活性高于不存在本发明的核酸分子的情况下所观测到的水平。可以增加,例如,基因的表达,如ATAP蛋白质、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体基因,以治疗、预防、改善、或调节由缺少或低水平基因表达所引起或加剧的病理状态。在一种实施方式中,本发明涉及通过上调ATAP蛋白质、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体基因的表达、释放、和/或活性来治疗或预防过度增生性病症的方法。
"调节"是指基因的表达、编码一种或多种蛋白质的RNA或等效RNA的水平、或一种或多种蛋白质的活性被上调或下调,以致上述表达、水平、或活性高于或低于不存在本发明的核酸分子的情况下所观测到的情况。
"基因"是指编码RNA的核酸,例如,包括但不限于编码多肽的节段的核酸序列。
"互补性"是指通过传统的沃森-克里克或其他非传统类型核酸与另一种RNA序列形成一个或多个氢键的能力。
"RNA"是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。"核糖核苷酸"或"2'-OH"是指在D-呋喃核糖部分的2'位具有羟基基团的核苷酸。
"核苷酸"是指在与磷酸化糖(phosphorylatedsugar)形成的N-糖苷键中的杂环含氮碱基。在本技术领域认为核苷酸包括天然碱基(标准)、以及本技术领域熟知的修饰碱基。这样的碱基通常位于核苷酸糖部分的1'位。核苷酸通常包含碱基、糖、以及磷酸基团。核苷酸在糖、磷酸和/或碱基部分可以是未修饰的或修饰的(还可互换地称作核苷酸类似物、修饰核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸以及其他核苷酸;参见例如,Usman和McSwiggen,上文;Eckstein等,InternationalPCTPublicationNo.WO92/07065;Usman等,InternationalPCTPublicationNo.WO93/15187;Uhlman&Peyman,上文,所有这些以引用方式结合于本文)。有本技术领域已知的修饰核酸碱基的若干实例,如由Limbachetal.,1994,NucleicAcidsRes.22,2183所总结的。可以被引入核酸中的化学修饰的和其他天然的核酸碱基的一些非限制性实例包括,例如,肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮(pyridin-4-one)、吡啶-2-酮(pyridin-2-one)、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如,5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如,核糖胸核苷)、5-卤代尿苷(例如,5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如,6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、wybutosine、wybutoxosine、4-乙酰氨酸(acetyltidine)、5-(羧基羟甲基)尿苷、5'-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、5-甲氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷(5-methylcarbonyhnethyluridine)、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-羟基乙酸(uridine-5-oxyaceticacid)、2-硫代胞苷、苏氨酸衍生物等(Burginetal.,1996,Biochemistry,35,14090;Uhlman&Peyman,上文)。
在这方面,"修饰碱基"是指不同于在1'位的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶的核苷酸碱基或它们的等效物(equivalents);这样的碱基可以用在任何位置,例如,在酶促核酸分子的催化核心内和/或在核酸分子的底物结合区。
如在本文中所使用的,"核酸分子"是指具有核苷酸的分子。核酸可以是单链、双链、或多链并且可以包含修饰或未修饰核苷酸或非核苷酸或它们的各种混合物和组合。
ATAP蛋白质、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体基因的"等效"或"相关"RNA旨在包括那些天然存在的RNA分子,其具有与包含ATAP的蛋白质、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体基因的同源性(部分或完全),编码各种生物体中与ATAP蛋白质、ATAP结合蛋白、以及ATAP受体蛋白具有类似功能的蛋白质,上述生物体包括人、啮齿类动物、灵长类、兔、猪、原生动物、真菌、植物、以及其他微生物和寄生物。等效RNA序列除编码区之外还包括如5'-非翻译区、3'-非翻译区、内含子、内含子-外显子接合区域等。"同源性"是指两种或更多种核酸分子的核苷酸序列是部分或完全相同的。在某些实施方式中,同源核酸与ATAP编码核酸,例如,SEQIDNO.37或59、ATAP结合蛋白、和/或ATAP受体基因具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%的同源性。
"载体"是指任何一种基于核酸的用来递送所期望核酸的技术,例如,细菌质粒、病毒核酸、HAC、BAC等。
本发明的核酸分子,单独地、或结合或与其他药物组合,可以用来治疗上述疾病或病症。例如,如对本领域技术人员来说显而易见的是,在适合于治疗的条件下,单独地或结合一种或多种药物,可以治疗受试者,或可以治疗其他适当的细胞。
如在本文中所使用的,"细胞"是在通常的生物意义上加以使用,并且并不指整个多细胞生物体。细胞可以是,例如,在体内、在体外或离体回输,例如,在细胞培养中,或存在于多细胞生物体中,多细胞生物包括,例如,鸟、植物以及哺乳动物如人、母牛、羊、类人猿、猴、猪、狗、以及猫。细胞可以是原核细胞(例如,细菌细胞)或真核细胞(例如,哺乳动物或植物细胞)。
可以直接加入本发明的核酸,或可以用阳离子脂质复合本发明的核酸,将本发明的核酸包装在脂质体内,或将本发明的核酸递送到靶细胞或组织中。在将它们加入或没有加入生物多聚体中的情况下,可以在体外、离体回输或在体内,通过注射或输液泵,将核酸或核酸复合物局部地给予有关的组织。
利用本技术领域已知的方法合成寡核苷酸(例如,反义,GeneBlocs),如在Caruthersetal.,1992,MethodsinEnzymology211,3-19;Thompsonetal.,InternationalPCTPublicationNo.WO99/54459;Wincottetal.,1995,NucleicAcidsRes.23,2677-2684;Wincottetal.,1997,MethodsMol.Bio.,74,59;Brennanetal.,1998,BiotechnolBioeng.,61,33-45;以及Brennan,美国专利第6,001,311号中所描述的。所有这些参考文献以引用方式结合于本文。在一个非限制性实施例中,用394AppliedBiosystems,Inc.的合成仪进行小规模的合成。可替换地,可以分段地合成本发明的核酸分子并在合成后连接在一起,例如通过连接反应(Mooreetal.,1992,Science256,9923;Draperetal.,InternationalPCTpublicationNo.WO93/23569;Shabarovaetal.,1991,NucleicAcidsResearch19,4247;Bellonetal.,1997,Nucleosides&Nucleotides,16,951;Bellonetal.,1997,BioconjugateChem.8,204)。
可以广泛地修饰本发明的核酸分子,以通过用耐核酸酶基团,例如,2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟基、2'-O-甲基、2'-H的修饰来增强稳定性(综述,参见UsmanandCedergren,1992,TIBS17,34;Usmanetal.,1994,NucleicAcidsSymp.Ser.31,163)。
虽然用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、和/或5'-甲基磷酸酯键对寡核苷酸的核苷酸间键进行的化学修饰可以改善稳定性,但这些修饰中的许多修饰可以引起一定的毒性。因此当设计核酸分子时,应使这些核苷酸间键的量降低到最小程度。这些键浓度的降低可降低毒性,导致这些分子效力增加和特异性提高。
提供了具有化学修饰的核酸分子,其可以保持或增强活性。并且这样的核酸通常比未修饰核酸更耐核酸酶。核酸分子优选耐核酸酶以用作有效的细胞内治疗剂。RNA和DNA的化学合成的改进(Wincottetal.,1995NucleicAcidsRes.23,2677;Caruthersetal.,1992,MethodsinEnzymology211,3-19,(以引用方式结合于本文)已扩大了通过引入核苷酸修饰来修饰核酸分子从而增强它们的核酸酶稳定性的能力(如上所述)。本发明的基于核酸的分子的应用,通过提供组合疗法(或联合治疗,combinationtherapies)的可能性(例如,靶向不同基因的多种反义或酶促核酸分子、耦合于已知小分子抑制剂的核酸分子、或用分子和/或其他化学或生物分子的组合进行的间歇治疗),可以导致对疾病进展的更好治疗。用核酸分子对受试者进行治疗还可以包括不同类型的核酸分子的组合应用。
核酸分子的给予。用于递送核酸分子的方法描述于Akhtaretal.,1992,TrendsCellBio.,2,139以及DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,ed.Akhtar,1995,其以引用方式结合于本文。Sullivan等,PCTWO94/02595,进一步描述了用于递送酶促RNA分子的一般方法。这些方法可以用于递送几乎任何核酸分子。可以通过本领域技术人员已知的各种方法将核酸分子给予细胞,上述方法包括但不限于,囊封(encapsulation)在脂质体中,通过离子导入,或通过加入其他载体中,如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊、以及生物粘附微球体。可替换地,可以通过直接注射或通过使用输液泵来局部给予核酸/载体组合。递送的其他途径包括但不限于口服(片剂或丸剂形式)和/或鞘内递送(Gold,1997,Neuroscience,76,1153-1158)。其他方式包括使用各种运输和载体系统,例如,通过使用轭合物(conjugate)和生物可降解的聚合物。关于药物递送方法(包括CNS递送)的综述,参见Hoetal.,1999,Curr.Opin.Mol.Ther.,1,336-343和Jain,DrugDeliverySystems:TechnologiesandCommercialOpportunities,DecisionResources,1998以及Groothuisetal.,1997,J.NeuroVirol.,3,387-400。
本发明的分子可以用作药剂。这些药剂可以预防、抑制受试者疾病状态的发生,或治疗(减轻症状到一定程度,优选所有症状)受试者的疾病状态。
可以通过任何标准方式来给予本发明的带负电荷的多核苷酸(例如,RNA、DNA或蛋白质)并引入受试者,其中使用或不使用稳定剂、缓冲剂等,以形成药物组合物。当期望使用脂质体递送机制时,可以按照用于形成脂质体的标准步骤。还可以配制本发明的组合物并用作:用于口服的片剂、胶囊剂或酏剂;用于直肠给予的栓剂;无菌溶液;用于注射给予的混悬剂;以及本技术领域已知的其他组合物。
本发明还包括所述化合物的药用剂型。这些剂型包括上述化合物的盐,例如,酸加成盐,例如,盐酸、氢溴酸、乙酸、以及苯磺酸的盐。
药物组合物或剂型是指具有适合于给予(例如,系统给予)细胞或受试者(优选人)的形式的组合物或剂型。"系统给予"是指体内系统吸收或积聚血流中并随后分布于整个身体的药物。适宜的形式部分地取决于进入使用或途径,例如口服、透过皮肤、或通过注射。上述形式不应阻止组合物或剂型达到靶细胞(即,带负电荷的聚合物期望被递送到的细胞)。例如,注入血流的药物组合物应是可溶的。其他因素在本技术领域是已知的,并且包括一些要考虑的问题如毒性和形式,其会阻止组合物或剂型发挥其效应。
导致系统吸收的给予途径包括但不限于:静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内以及肌内途径。研究表明,药物进入循环的速率是关于分子量或大小的函数。包含本发明的化合物的脂质体或其他药物载体的使用可以潜在地定位药物,例如,在某些组织类型中,如网状内皮系统(RES)组织。可以促进药物与细胞(如,淋巴细胞和巨噬细胞)表面结合的脂质体剂型也是有用的。
药用剂型是指这样的组合物或剂型,其便于将本发明的核酸分子有效分布于最适合于它们的所期望发挥活性的物理位置(或身体位置,physicallocation)。适用于包含本发明的核酸分子的剂型的试剂的非限制性实例包括:PEG结合的核酸,磷脂结合的核酸,包含亲脂部分的核酸,硫代磷酸酯,P-糖蛋白抑制剂(如PluronicP85),其可以增强药物进入各种组织,例如CNS(Jolliet-Riant和Tillement,1999,Fundam.Clin.Pharmacol.,13,16-26);生物可降解的聚合物,如聚丙交酯-乙交酯共聚物微球体,用于植入以后的缓释递送(Emerich,DFetal,1999,CellTransplant,8,47-58)Alkermes,Inc.Cambridge,Mass.;以及加载的纳米颗粒,如那些由聚氰基丙烯酸丁酯构成的纳米颗粒,其可以递送药物穿过血脑屏障并且可以改变神经元摄取机制(ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry,23,941-949,1999)。递送方法(包括CNS递送核酸分子)的其他非限制性实例包括在Boadoetal.,1998,J.Pharm.Sci.,87,1308-1315;Tyleretal,1999,FEBSLett.,421,280-284;Pardridgeetal.,1995,PNASUSA.,92,5592-5596;Boado,1995,Adv.DrugDeliveryRev.,15,73-107;Aldrian-Herradaetal.,1998,NucleicAcidsRes.,26,4910-4916;以及Tyleretal.,1999,PNASUSA.,96,7053-7058中所描述的材料。所有这些参考文献以引用方式结合于本文。
本发明的特征还在于使用包含表面修饰脂质体的组合物,其中表面修饰脂质体包含聚乙二醇脂质(PEG修饰的、或长循环脂质体或隐形脂质体(stealthliposome))。本发明的核酸分子还可以包含各种分子量的共价结合的PEG分子。这些剂型提供了一种方法来增加药物在靶组织中的积聚。这种类型的药物载体可阻止单核吞噬细胞系统(MPS或RES)的调理作用和消除,从而可以获得更长的血液循环时间并增强组织暴露于胶囊化药物(Lasicetal.Chem.Rev.1995,95,2601-2627;Ishiwataetal.,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。和阳离子脂质体相比,长循环脂质体还可以在更大程度上保护药物免于核酸酶降解,这基于它们避免积聚在代谢攻击性MPS组织如肝和脾中的能力。所有这些参考文献以引用方式结合于本文。
本发明还包括为贮藏或给予所制备的组合物,其包含药物有效量的在药用载体或稀释剂中的所期望的化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域中是众所周知的,并且描述于,例如,Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中,其以引用方式结合于本文。可以提供,例如,防腐剂、稳定剂、染料以及增香剂。上述防腐剂包括苯甲酸钠、山梨酸以及对羟基苯甲酸的酯。此外,可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
药物有效剂量或药物有效量是为预防、抑制疾病状态的发生、或治疗(减轻症状至一定程度,优选所有症状)疾病状态所需要的剂量。药物有效剂量取决于疾病类型、所用的组合物、给予途径、被治疗的哺乳动物类型、所考虑的特定哺乳动物的物理特性、同时给药的药物(concurrentmedication)、以及本领域技术人员将明白的其他因素。通常,给予0.1mg/kg至1000mg/kg体重/天的活性成分量,其取决于带负电荷聚合物的效能。
可以以给药单位剂型来口服、局部、肠胃外、通过吸入或喷雾或直肠给予上述剂型,其中给药单位剂型包含常规的无毒性药用载体、佐剂以及赋形剂。如在本文中所使用的,术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如,静脉内)、肌内、或鞘内注射或输注技术等。此外,提供了一种药物剂型,其包含本发明的核酸分子和药用载体。可以存在一种或多种本发明的核酸分子,其连合一种或多种无毒性药用载体和/或稀释剂和/或佐剂,以及如果需要连合其他活性成分。本发明的药物组合物可以具有适用于口服的形式,例如,作为片剂、含片、锭剂、含水或油性混悬剂、可分散的散剂或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。
用于口服的组合物可以按照在制备药物组合物的领域中已知的任何方法加以制备并且这样的组合物可以包含一种或多种这样的甜味剂、增香剂、着色剂或防腐剂,以提供药物上较好的和可口的制剂。片剂包含与适合于制备片剂的无毒性药用赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如,惰性稀释剂,如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;造粒和崩解剂,例如,玉米淀粉、或海藻酸;粘合剂,例如淀粉、明胶或阿拉伯胶;以及润滑剂,例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未涂覆的或可以通过已知技术对它们进行涂覆(coat)。在某些情况下,可以通过已知技术来制备上述涂层以延迟在肠胃道中的崩解和吸收,从而提供在较长时期内的持续作用。例如,可以采用时间延迟材料如甘油单硬脂酸或甘油二硬脂酸。
口服剂型还可以制作成为硬胶囊,其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如,碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合,或提供为软胶囊,其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
含水混悬剂包含与适合于制备含水混悬剂的赋形剂混合的活性材料。上述赋形剂是悬浮剂,例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶以及阿拉伯树胶;分散或润湿剂可以是天然产生的磷脂,例如,卵磷脂、或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物,例如聚氧乙烯硬脂酸酯,或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物,例如十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol),或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酯,或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物,例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。含水混悬剂还可以包含一种或多种防腐剂,例如对羟基苯甲酸乙酯、或对羟基苯甲酸正丙酯,一种或多种着色剂,一种或多种增香剂,以及一种或多种甜味剂,如蔗糖或糖精。
可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中来配制油性混悬剂。油性混悬剂可以包含增稠剂,例如蜂蜡、硬石蜡(或固体石蜡)或十六醇。可以加入甜味剂和增香剂以提供可口的口服制剂。可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来保存这些组合物。
通过加入水、适合于制备含水混悬剂的可分散的散剂和颗粒剂提供与分散或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。适宜的分散或润湿剂或悬浮剂通过上文已提及的那些来举例说明。还可以存在另外的赋形剂,例如甜味剂、增香剂以及着色剂。
本发明的药物组合物还可以具有水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或它们的混合物。适宜的乳化剂可以是天然产生的树胶,例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶,天然产生的磷脂,例如大豆、卵磷脂、以及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯,例如山梨糖醇酐单油酸酯,以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物,例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和增香剂。
糖浆和酏剂可以配制有甜味剂,例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。这样的剂型还可以包含缓和剂、防腐剂、增香剂以及着色剂。药物组合物可以具有无菌可注射含水或含油混悬剂的形式。这种混悬剂可以按照已知的技术方法并利用上文已提及的那些适宜的分散或润湿剂以及悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒性肠胃外用(parentallyacceptable)稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂,例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受的赋形剂和溶剂中,可以采用水、林格氏液以及等渗氯化钠溶液。此外,无菌的固定油常规地用作溶剂或悬浮介质。为此,可以采用任何温和的固定油,其包括合成单甘油酯或甘油二酯。此外,脂肪酸如油酸可用于制备可注射物。
还可以以栓剂的形式给予本发明的核酸分子,例如,用于直肠给予药物或经由导管直接给予膀胱本身。可以通过混合药物与适宜的非刺激性赋形剂来制备这些组合物,其中非刺激性赋形剂在通常温度下是固体但在直肠温度下是液体,因而将在直肠中融化以释放药物。这样的材料包括可可脂和聚乙二醇。
可以在无菌介质中肠外给予本发明的核酸分子。药物,取决于所使用的赋形剂和浓度,可以被悬浮或溶解在赋形剂中。有利地,佐剂如局部麻醉剂、防腐剂以及缓冲剂可以被溶解在赋形剂中。
可以结合于载体材料以产生单给药型的活性成分的量依赖于被治疗的宿主和特定的给药方式而变化。给药单位形式通常包含约1mg至约1000mg的活性成分。
应当理解,用于任何特定患者或受试者的具体剂量水平取决于各种因素,其包括所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合、以及经受治疗的特定疾病的严重性。
为了给予非人动物,还可以将组合物加入动物饲料或饮用水中。可以方便地配制动物饲料和饮用水组合物,以致动物与其饮食一起摄取治疗适量的组合物。还可以方便地将组合物提供为预混合料,用于加入饲料或饮用水。
还可以连同其他治疗性化合物将组合物给予受试者以增加总治疗效果。使用多种化合物来治疗一种适应症可以增加有益效果同时减少副作用的存在。
可替换地,某些本发明的核酸分子可以从真核启动子在细胞内表达(例如,IzantandWeintraub,1985,Science,229,345;McGarryandLindquist,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA83,399;Scanlonetal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,10591-5;Kashani-Sabetetal.,1992,AntisenseRes.Dev.,2,3-15;Dropulicetal.,1992,J.Virol.,66,1432-41;Weerasingheetal.,1991,J.Virol.,65,5531-4;Ojwangetal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10802-6;Chenetal.,1992,NucleicAcidsRes.,20,4581-9;Sarveretal.,1990Science,247,1222-1225;Thompsonetal,1995,NucleicAcidsRes.,23,2259;Goodetal.,1997,GeneTherapy,4,45;所有这些参考文献的全部内容以引用方式结合于本文)。本领域技术人员应当理解通过适当的DNA/RNA载体,任何核酸都可以在真核细胞中表达。
一方面,本发明的表达性载体的特征在于,该载体包含编码至少一种本发明的核酸分子的核酸序列。编码本发明的核酸分子的核酸序列,以允许表达该核酸分子的方式可操作地连接。
核酸分子序列的转录由用于真核RNA聚合酶I(polI)、RNA聚合酶II(polII)、或RNA聚合酶III(polIII)的启动子驱动。来自polII或polIII启动子的转录物以高水平表达在所有细胞中;在给定细胞类型中给定polII启动子的水平取决于附近存在的基因调节序列(增强子、沉默子等)的特性。还使用原核RNA聚合酶启动子,只要原核RNA聚合酶表达在适当的细胞中(Elroy-SteinandMoss,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,6743-7;GaoandHuang1993,NucleicAcidsRes.,21,2867-72;Lieberetal.,1993,MethodsEnzymol.,217,47-66;Zhouetal.,1990,Mol.Cell.Biol.,10,4529-37)。所有这些参考文献以引用方式结合于本文。若干研究者已证明,核酸分子,如从上述启动子表达的核酶,可以在哺乳动物细胞中起作用(例如,Kashani-Sabetetal.,1992,AntisenseRes.Dev.,2,3-15;Ojwangetal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10802-6;Chenetal,1992,NucleicAcidsRes.,20,4581-9;Yuetal.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,6340-4;L'Huillieretal.,1992,EMBOJ.,11,4411-8;Lisziewiczetal.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,90,8000-4;Thompsonetal.,1995,NucleicAcidsRes.,23,2259;Sullenger&Cech,1993,Science,262,1566)。
另一方面,本发明的表达性载体的特征在于,该载体包含以允许表达核酸分子的方式编码至少一种本发明的核酸分子的核酸序列。在一种实施方式中,上述表达性载体包含:a)转录起始区;b)转录终止区;c)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列;并且其中所述序列以允许表达和/或递送所述核酸分子的方式可操作地连接于所述起始区和所述终止区。
本发明的另一目的是提供一种试剂盒,该试剂盒包括适宜的容器、放置在其中的本发明的药用形式的治疗剂、以及其使用说明。
在另一种实施方式中,本发明的分离的核酸分子包括一种核酸分子,其是编码本发明的ATAP、ATAP结合蛋白、和/或ATAP受体的核苷酸序列的互补体。如在本文中所使用的,术语"互补的"是指核酸分子的核苷酸单位之间的沃森-克里克或Hoogsteen碱基配对,而术语"结合"是指两种多肽或化合物或有关多肽或化合物或它们的混合物之间的物理或化学相互作用。结合包括离子相互作用、非离子相互作用、范德华力相互作用、疏水性相互作用等。物理相互作用可以是直接的或间接的。
如在本文中所使用的,"片段"被定义为至少6个(连续)核酸或至少4个(连续)氨基酸的序列,其长度足以在核酸的情况下允许特异性杂交或在氨基酸的情况下允许表位的特异性识别,并且最多是小于全长序列的某个部分。
术语“宿主细胞”包括这样的细胞,其可以用来携带异源性核酸、或表达由异源性核酸编码的肽或蛋白质。宿主细胞可以包含在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因、在天然形式的细胞(其中通过人工方式基因被修饰和再引入细胞)中发现的基因、或内源于细胞(其被人工修饰但没有将核酸移出细胞而)的核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。细菌培养所必须的一般生长条件可在如BERGEY'SMANUALOFSYSTEMATICBACTERIOLOGY,Vol.1,N.R.Krieg,ed.,WilliamsandWilkins,Baltimore/London(1984)中找到。“宿主细胞”还可以是这样的一种宿主细胞,其中内源性基因或启动子或两者已被修饰以产生本发明的复合物的一种或多种多肽成分。
"衍生物"是由天然化合物直接地、通过修饰、或通过部分取代而形成的组合物。"类似物"是具有类似于但不相同于天然化合物的结构的核酸序列或氨基酸序列。
本发明的核酸或蛋白质的衍生物或类似物包括但不限于,包含基本上同源于本发明的核酸或蛋白质区域的分子,在各种实施方式中,相对于相同大小的核酸或氨基酸序列或当与对比序列比较时(其中通过本技术领域已知的计算机同源性程序进行序列比对),达到至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%的同一性(其中优选同一性为80-95%),或其编码核酸是能够在严格、中等严格、或低严格条件下杂交于编码本发明的蛋白质的序列的互补体。参见例如,Ausubel,etal.,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.,1993。核酸衍生物和修饰包括通过基因替换、位点特异性突变、缺失、插入、重组、修复、重组(shuffling)、内切核酸酶消化、PCR、亚克隆、以及相关技术获得的那些。
“同系物”可以是天然产生的,或通过人工合成一种或多种具有相关序列的核酸、或通过修饰一种或多种核酸以产生相关核酸而产生的。当核酸天然或人工地衍生自共同祖先序列时,则核酸是同源的(例如,直系同源物或旁系同源物)。如果没有特意描述两种核酸之间的同源性,则可以通过两种或更多种序列之间的核酸比较来推导同源性。如果序列表现一定程序的序列相似性,例如,在一级氨基酸结构水平大于约30%,则可以断定它们共享共同的祖先。对本发明来说,如果核酸序列足够类似以允许在低严格条件下进行重组和/或杂交,则基因是同源的。
如在本文中所使用的,“杂交”是指在低、中、高严格条件下,分子仅结合双链(duplexing)、或杂交于特定核苷酸序列,包括当序列存在于复杂混合物(例如,总细胞)DNA或RNA中时。
此外,普通技术人员会理解“保守突变”还包括核酸的取代、缺失或添加,其会改变、添加或删除编码序列中的单氨基酸或少量氨基酸,其中核酸改变导致化学上类似的氨基酸的取代。可以彼此保守取代的氨基酸包括:碱性的:精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);酸性的:天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);亲水的:甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I);疏水的:苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫的:甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)。此外,差别在于保守变异的序列通常是同源的。
可用于实施本发明的分子生物技术(包括诱变、PCR、克隆等)的描述包括:BergerandKimmel,GUIDETOMOLECULARCLONINGTECHNIQUES,METHODSINENZYMOLOGY,volume152,AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.(Berger);Sambrooketal.,MOLECULARCLONING--ALABORATORYMANUAL(2ndEd.),Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989;和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,F.M.Ausubeletal.,eds.,CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.合资(或合作);Berger、Sambrook、Ausubel、以及Mullis等,美国专利第4,683,202号(1987);PCRPROTOCOLSAGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS(Innisetal.eds),AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.(1990)(Innis);Arnheim&Levinson(Oct.1,1990)。
在又一实施方式中,利用哺乳动物表达载体,在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。关于用于原核和真核细胞的适宜的表达系统参见,例如,Chapters16and17ofSambrook,etal.,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989。
多核苷酸可以是DNA分子、cDNA分子、基因组DNA分子、或RNA分子。作为DNA或RNA的多核苷酸可以包括一种序列,其中T(胸苷)还可以是U(尿嘧啶)。如果在多核苷酸的某个位置的核苷酸能够与在反向平行DNA或RNA链中的相同位置的核苷酸形成沃森-克里克配对,那么多核苷酸和DNA或RNA分子在上述位置处是彼此互补的。当在每个分子中足够数目的对应位置被能够彼此杂交的核苷酸占据以实现所期望的过程时,则多核苷酸和DNA或RNA分子是基本上彼此互补的。
可以通过如本领域技术人员熟知的常规技术用重组DNA来转化宿主细胞。"转化"是指在加入新DNA(即,对于细胞来说是外源的DNA)以后在细胞中诱导的永久或瞬时基因变化。
在另一实施方式中,重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如,应用组织特异性调节元件来表达核酸)。组织特异性调节元件在本技术领域中是已知的。适宜的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异的;Pinkert,etal.,1987.GenesDev.1:268-277)、淋巴特异性启动子(CalameandEaton,1988.Adv.Immunol.43:235-275)、尤其是T细胞受体的启动子(WinotoandBaltimore,1989.EMBOJ.8:729-733)和免疫球蛋白(Banerji,etal.,1983.Cell33:729-740;QueenandBaltimore,1983.Cell33:741-748)、神经元特异性启动子(例如,神经丝启动子;ByrneandRuddle,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)、胰特异性启动子(Edlund,etal.,1985.Science230:912-916)、以及乳腺特异性启动子(例如,乳清启动子;美国专利第4,873,316号以及欧洲申请公开第264,166号)。还包括发育调节启动子(developmentally-regulatedpromoter),例如,小鼠hox(murinehox)启动子(KesselandGruss,1990.Science249:374-379)以及甲胎蛋白启动子(CampesandTilghman,1989.GenesDev.3:537-546)。
在任何实施方式中,编码ATAP、ATAP结合蛋白、和/或ATAP受体的核酸可以呈现为:一种或多种裸DNA;位于适当的表达载体中并附加游离地(episomally)保持的一种或多种核酸;加入宿主细胞的基因组中的一种或多种核酸;编码复合物的组分的内源性基因的修饰形式;与一种或多种调节核酸序列结合的一种或多种核酸;或它们的混合物。核酸可以可选地在5’端、3’端、或在ORF内的任何位置包含连接肽(linkerpeptide)或融合蛋白组分,例如,His-Tag、FLAG-Tag、荧光蛋白、GST、TAT、抗体部分、信号肽等。
在一优选实施方式中,本发明的核酸包含编码ATAP受体的可溶(即,细胞外)部分的多核苷酸。利用本领域普通技术人员熟知的标准分子生物和遗传方法,可以实施本文描述的任何实施方式。
在宿主是原核细胞如大肠杆菌的情况下,能够摄取DNA的感受态细胞可以由这样的细胞制备,其在指数生长期以后被收集随后通过本技术领域熟知的方法用CaCl2法加以处理。可替换地,可以使用MgCl2、RbCl、脂质体、或脂质体-蛋白质复合物。还可以在形成宿主细胞的原生质体以后或通过电穿孔来进行转化。这些实例并不是限制本发明;存在许多技术来转染宿主细胞,其是本领域技术人员熟知的并且其应当考虑在本发明的范围内。
当宿主是真核宿主时,上述用DNA进行的转染方法包括磷酸钙共沉淀,常规机械方法如微注射、电穿孔、嵌入包裹在脂质体、或病毒载体中的质粒,以及可以使用本技术领域已知的其他转染方法。真核细胞可以是酵母细胞(例如,酿酒酵母)或可以是哺乳动物细胞,其包括人细胞。为了长期、高产量生产重组蛋白,稳定表达是优选的。
多肽
在其他实施方式中,本发明涉及经分离的核酸分子,其编码ATAP、ATAP结合蛋白、和/或ATAP受体多肽、抗体多肽、或它们的生物活性部分。可以例如按照标准方法利用肽合成仪,或通过在细胞或细胞提取物中分开表达每种多肽,然后分离和纯化多肽,来形成复合物的多肽。
抗体
如在本文中所使用的,术语"抗体"是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分,即,包含抗原结合位点的分子,其中抗原结合位点特异性地结合抗原(与抗原进行免疫反应),抗体包含至少一个并且优选两个重(H)链可变区(本文中缩写为VH)、以及至少一个并且优选两个轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。上述抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab、Fab'和F(ab')2片段,以及Fab表达文库。VH和VL区可以进一步被细分为高变异区(regionofhypervariability),称作"互补决定区"("CDR"),其散在分布有更保守的区,称作"框架区"(FR)。框架区和CDR的范围已被精确限定(参见,Kabat,E.A.,etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242,以及Chothia,C.etal.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,其以引用方式结合于本文)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端排列至羧基末端其以以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。通常,获自人类的抗体分子涉及以下任何类型:IgG、IgM、IgA、IgE以及IgD,其彼此间的差异在于分子中存在的重链的特性。某些类型还具有亚类,如IgG1、IgG2等。此外,在人类中,轻链可以是κ链或λ链。本文所指的抗体包括人抗体种类的所有上述类、亚类以及类型。
抗体可以制备自完整多肽或片段,其包括可用作免疫剂的感兴趣的肽。优选的抗原多肽片段是ATAP、ATAP结合蛋白、或ATAP受体蛋白的15-100个连续氨基酸。在一种实施方式中,肽位于多肽的非跨膜结构域,例如,位于细胞外或胞内结构域。一种典型的抗体或抗体片段结合于可以从细胞外基质接近的表位并改变蛋白质的功能。在某些实施方式中,本发明包括这样的抗体,其可以识别ATAP、ATAP结合蛋白、和/或ATAP受体蛋白、它们的变体、部分和/或组合的一个或多个表位并且对于所述表位是特异的。在可替换的实施方式中,本发明的抗体可以靶向并干扰ATAP/ATAP受体相互作用以抑制信号传送。
单克隆抗体的制备在本技术领域是熟知的;参见例如,Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,第726页(ColdSpringHarborPub.1988)。可以通过用包含抗原的组合物注射小鼠或兔来获得单克隆抗体,并通过下述方法来证实抗体产物的存在:除去血清样品,除去脾以获得B淋巴细胞,融合淋巴细胞与骨髓瘤细胞以产生杂交瘤,克隆杂交瘤,选择对抗原产生抗体的阳性克隆,以及从杂交瘤培养物分离抗体。通过本技术领域熟知的技术可以从杂交瘤培养物分离和纯化单克隆抗体。
在其他实施方式中,可以重组产生抗体,例如,通过噬菌体展示或通过组合的方法(combinatorialmethod)产生。噬菌体展示和组合方法可以用来分离重组抗体,其结合于ATAP、ATAP结合蛋白、和/或ATAP受体蛋白或它们的片段(如在例如,Ladner等,美国专利第5,223,409号;Fuchsetal.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hayetal.(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;Clacksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)PNAS89:3576-3580中所描述的)。
还可以利用携带人免疫球蛋白基因而不是小鼠系统的转基因小鼠来产生人单克隆抗体。来自这些转基因小鼠(用感兴趣的抗原加以免疫)的脾细胞用来产生杂交瘤,其分泌对于来自人蛋白的表位具有特异亲和力的人mAb(参见,例如,Woodetal.InternationalApplicationWO91/00906;Lonberg,N.etal.1994Nature368:856-859;Green,L.L.etal.1994NatureGenet.7:13-21;Morrison,S.L.etal.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。
本发明的复合物的成分或复合物本身的对治疗有用抗体可以衍生自"人源化"单克隆抗体。通过将小鼠互补决定区从小鼠免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区转移到人可变结构域,然后将人残基引入小鼠对应部分的框架区,来产生人源化单克隆抗体。使用衍生自人源化单克隆抗体的抗体成分可以避免与小鼠恒定区的免疫原性有关的潜在问题。用于产生人源化单克隆抗体的技术可以在Jonesetal.,Nature321:522,1986以及Singeretal.,J.Immunol.150:2844,1993中找到。抗体还可以源于分离自组合免疫球蛋白文库的人抗体片段;参见,例如,Barbasetal.,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2,119,1991。此外,通过剪接来自小鼠抗体分子的具有适当抗原特异性的基因连同来自具有适当生物特异性的人抗体分子的基因,可以获得嵌合抗体;参见,例如,Takedaetal.,Nature314:544-546,1985。嵌合抗体是一种抗体,其中不同部分衍生自不同的动物物种。
抗-个体基因型技术可以用来产生模拟表位的单克隆抗体。对于第一单克隆抗体构成的抗独特型单克隆抗体将具有在高可变区中的结合结构域,其是由第一单克隆抗体结合的表位的"图像"。可替换地,用于产生单链抗体的技术可以用来产生单链抗体。通过氨基酸桥来连接Fv区的重和轻链片段以形成单链抗体,从而产生单链多肽。通过本技术领域熟知的技术可以产生识别特异性表位例如细胞外表位的抗体片段。这样的片段包括通过蛋白水解消化而产生的Fab片段、以及通过还原二硫桥键所产生的Fab片段。当用于免疫疗法时,单克隆抗体、其片段、或两者可以是未标记的或标记有治疗剂。通过本技术领域熟知的技术,这些制剂可以直接或间接地耦合于单克隆抗体,并且包括这样的制剂如药物、放射性同位素、凝集素以及毒素。
用于给予单克隆抗体的剂量范围足够大以产生所期望的效应,而且将随年龄、病症、体重、性别、待治疗的病症的时期和程度而变化,并且可以由本领域技术人员容易地确定。剂量可以是约0.1mg/kg至约2000mg/kg。可以以静脉内、腹膜内、肌内、和/或皮下方式给予单克隆抗体。
在本发明的某些实施方式中,由抗原肽包含的至少一个表位是ATAP、ATAP结合蛋白、和/或ATAP受体的一个区,其位于蛋白质的表面上,例如,亲水区。蛋白质序列的疏水性分析将表明多肽的哪些区是特别亲水的,因而可能编码可用于靶向抗体产生的表面残基。作为一种用于靶向抗体产生的方式,可以通过本技术领域熟知的任何方法来产生显示亲水性区和疏水性区的亲水性图,上述方法包括,例如,KyteDoolittle或HoppWoods法,每种方法借助于或不借助于傅里叶变换。参见,例如,HoppandWoods,1981,Proc.Nat.Acad.Sci.USA78:3824-3828;KyteandDoolittle1982,J.Mol.Biol.157:105-142,上述每个文献的全部内容以引用方式结合于本文。本文还提供了对于抗原蛋白内的一个或多个结构域具有特异性的抗体、或其衍生物、片段、类似物或同系物。本发明的蛋白质、或其衍生物、片段、类似物、同系物或直系同源物,在产生免疫特异性地结合这些蛋白成分的抗体时,可以用作免疫原。
人抗体
完全人抗体基本上涉及这样的抗体分子,其中轻链和重链的整个序列(包括CDR)产生于人基因。在本文中这样的抗体称作"人抗体"、或"完全人抗体"。可以通过三源杂交瘤技术(triomatechnique)、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor,etal.,1983ImmunolToday4:72)以及可产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole,etal.,1985In:MONOCLONALANRIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)来制备人单克隆抗体。人单克隆抗体可以用于实施本发明并且可以通过利用人杂交瘤(参见Cote,etal.,1983.ProcNatlAcadSciUSA80:2026-2030)或通过用埃巴病毒体外转化人B细胞(参见Cole,etal.,1985In:MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)加以制备。
此外,还可以利用另外的技术,包括噬菌体展示文库来制备人抗体(HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。类似地,可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来制备人抗体,该转基因动物例如为,其中内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全灭活的小鼠。在刺激以后,观测到人抗体产生,其在所有方面非常地类似于在人类中观测到的情况,包括基因重排、组装(assembly)、以及抗体性能(antibodyrepertoire)。例如,在美国专利号5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016,以及在Marksetal.(Bio/Technology,10:779-783(1992));Lonbergetal.(Nature,368:856-859(1994));Morrison(Nature,368:812-13(1994));Fishwildetal,(NatureBiotechnology,14:845-51(1996));Neuberger(NatureBiotechnology,14:826(1996));以及LonbergandHuszar(Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995))中描述了这种方式。
另外可以利用转基因非人动物来制备人抗体,其中转基因非人动物被修饰以便在响应抗原的刺激时产生完全人抗体而不是动物的内源性抗体。在非人宿主中编码免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的内源性基因已被灭活(incapacitated),并且将编码人免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的活性基因座插入宿主的基因组。例如,利用包含必要的人DNA节段的酵母人工染色体引入人基因。然后通过杂交繁育包含比完全互补体(fullcomplement)更少修饰的中间转基因动物来获得提供所有所期望的修饰的动物作为子代。这样的非人动物的优选实施方式是小鼠,并且称作XenomouseTM,如在PCT公开WO96/33735和WO96/34096中所披露的。
Fab片段和单链抗体
根据本发明,技术可以适合于生产对本发明的抗原蛋白具有特异性的单链抗体(参见例如,美国专利第4,946,778号)。此外,方法可以适合于构建Fab表达文库(参见例如,Huse,etal.,Science246:1275-1281(1989))以允许快速和有效鉴定对于蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同系物具有所期望的特异性的单克隆Fab片段。可以通过本技术领域已知的技术来制备包含针对蛋白抗原的独特型的抗体片段,其包括但不限于:(i)通过胃蛋白酶消化抗体分子所制备的F(ab')2片段;(ii)通过还原F(ab')2片段的二硫桥键所产生的Fab片段;(iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子所产生的Fab片段;以及(iv)Fv片段。
双特异性抗体
双特异性抗体是单克隆的、优选人或人源化抗体,其对于至少两种不同的抗原具有结合特异性。在这种情况下,结合特异性之一是本发明的抗原蛋白。第二结合靶是任何一种其他抗原,并且有利地是细胞表面蛋白或受体或受体亚单位。用于制备双特异性抗体的方法在本技术领域是已知的。通常,双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达,其中上述两种重链具有不同的特异性(MilsteinandCuello,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些杂交瘤(四体杂交瘤)会产生10种不同抗体分子的潜在混合物,其中仅一种具有正确的双特异性结构。在1993年5月13日公开的WO93/08829以及Trauneckeretal.,EMBOJ.,10:3655-3659(1991)中披露了类似的方法。
可以将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域融合于免疫球蛋白恒定结构域序列。关于产生双特异性抗体的详情可参见,例如,Sureshetal.,MethodsinEnzymology,121:210(1986)以及Brennanetal.,Science229:81(1985)。
另外,可以从大肠杆菌直接回收Fab'片段并进行化学耦合以形成双特异性抗体。Shalabyetal.,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab')2分子的生产。每种Fab'片段分别分泌自大肠杆菌并经受体外定向化学耦合以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合于过度表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞,并且触发针对人乳腺肿瘤靶的人毒性淋巴细胞的裂解活性。
已描述了直接从重组细胞培养物来制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如,已利用亮氨酸拉链来生产双特异性抗体。Kostelnyetal.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。由Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)描述的"双体分子(双价分子,diabody)"技术已提供一种可替换的机制来制备双特异性抗体片段。还报告了通过利用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一种方法。参见,Gruberetal.,J.Immunol.152:5368(1994)。可以考虑具有两个以上化合价的抗体。例如,可以制备三特异性抗体。Tuttetal.,J.Immunol.147:60(1991)。双特异性抗体还可以用来将细胞毒剂引向表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂的臂,如EOTUBE、DPTA、DOTA、或TETA。
异源偶联抗体(heteroconjugateantibody)
异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体组成。例如,已提出这样的抗体将免疫系统细胞靶向不希望有的细胞(美国专利第4,676,980号),以及用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373、EP03089)。考虑可以利用合成蛋白质化学中的已知方法(包括那些涉及交联剂的方法)来体外制备抗体。例如,可以利用二硫键交换反应或通过形成硫酯键来构建免疫毒素。用于此用途的适宜试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁基亚氨(或2-亚氨基硫杂环戊烷,methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及例如在美国专利第4,676,980号中所披露的那些试剂。
免疫偶联物(immunoconjugate)
本发明还涉及免疫偶联物,其包含结合于化学剂、或放射性同位素的抗体(即,放射性偶联物)的抗体。利用各种双功能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸酯(SPDP)、2-亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-甲苯二异氰酸酯)、以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯),来制备抗体和细胞毒剂的偶联物。如在Vitettaetal.,Science,238:1098(1987)中所描述的,例如,可以制备蓖麻毒素蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种典型的螯合剂,用于将放射性核苷酸共轭于抗体。参见WO94/11026。
免疫脂质体
本文披露的抗体还可以配制成免疫脂质体。通过本技术领域已知的方法来制备包含抗体的脂质体,如在Epsteinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985);Hwangetal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA,77:4030(1980);以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号中所描述的。美国专利第5,013,556号披露了具有延长的循环时间的脂质体。
通过反相蒸发法使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇、以及聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组成,可以产生特别有用的脂质体。通过规定孔径的过滤器挤压脂质体以产生具有所期望直径的脂质体。如在Martinetal.,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所描述的,可以借助于二硫键交换反应,将本发明的抗体的Fab'片段结合于脂质体。
本发明的抗体的治疗有效量一般是指为达到治疗目标所需要的量。如上所述,这可以是抗体和其靶抗原之间的结合相互作用,其在某些情况下干扰靶起作用,而在其他情况下则促进生理应答。此外需要给予的量将取决于抗体对于其特异性抗原的结合亲和力,并且还将取决于给予的抗体从所给予其他受试者的自由容积排出的速率。本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见范围可以是,通过非限制性实例,约0.1mg/kg体重至约500mg/kg体重。通常的用药频率可以是,例如,每天两次至每周一次。
可以以药物组合物的形式给予特异性地结合本发明的蛋白质的抗体、以及通过本文披露的筛选测定所鉴定的其他分子,来治疗各种病症。在制备上述组合物时所涉及的原则和要考虑的问题、以及成分选择的指导可以参见,例如,Remington:TheScienceAndPracticeOfPharmacy19thed.(AlfonsoR.Gennaro,etal.,editors)MackPub.Co.,Easton,Pa.:1995;DrugAbsorptionEnhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,AndTrends,HarwoodAcademicPublishers,Langhorne,Pa.,1994;以及PeptideAndProteinDrugDelivery(AdvancesInParenteralSciences,Vol.4),1991,M.Dekker,NewYork。还可以将活性成分包封在微胶囊(例如,通过凝聚技术或通过界面聚合而制得,例如,羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中,分别在胶体给药系统(例如,脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米颗粒、以及纳米胶囊)中或粗乳状液中。用于体内给药的剂型必须是无菌的。这可以容易地通过无菌滤膜的过滤来实现。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜实例包括包含抗体的固体疏水聚合物的半透基质,该基质具有成形物品的形式,例如,薄膜、或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如,聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(可注射的微球体,由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成)、以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能够释放分子100天以上,但某些水凝胶只能释放蛋白质较短的时间。
ELISA测定
用于检测分析蛋白的制剂是能够结合于分析蛋白的抗体,优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体,或更优选为单克隆抗体。可以使用完整的抗体、或其片段(例如,Fab或F(ab)2)。相对于探针或抗体来说,术语"标记的"旨在包括通过将可检测物质耦联(即,物理连接)于探针或抗体所获得的探针或抗体的直接标记,以及通过与被直接标记的另一种试剂的反应性获得探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括利用荧光标记二抗和借助于生物素的DNA探针的末端标记来检测一抗以致它可以用荧光标记的抗生蛋白链菌素加以检测。术语"生物样品"旨在包括分离自受试者的组织、细胞和生物流体,以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。因此,应用术语"生物样品"包括血液和血液的部分或组分,其包括血清、血浆、或淋巴液。即,本发明的检测方法可以用来体外以及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质、或基因组DNA。例如,用于检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测分析蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、以及免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。例如在"ELISA:TheoryandPractice:MethodsinMolecularBiology",Vol.42,J.R.Crowther(Ed.)HumanPress,Totowa,N.J.,1995;"Immunoassay",E.DiamandisandT.Christopoulus,AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.,1996;以及"PracticeandThoryofEnzymeImmunoassays",P.Tijssen,ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,1985中描述了用于进行免疫测定的程序。此外,用于检测分析蛋白质的体内技术包括将标记的抗分析蛋白质的抗体引入受试者。例如,抗体可以标记有放射性标记,其在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术,腔内或透过皮肤地,单独或连同效应细胞而加以检测。
用于给予本发明的治疗剂的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬剂、以及乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇,聚乙二醇,植物油如橄榄油,以及可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬剂,其包括盐水和缓冲介质。赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏静脉内赋形剂,其包括流体和营养补充物(replenisher)、电解质补充物等。可以加入防腐剂和其他添加剂如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。
本发明的化合物、核酸分子、多肽、以及抗体(本文中还称作"活性化合物"),以及其衍生物、片段、类似物和同系物可以被加入适合于给予的药物组合物。这样的组合物通常包含核酸分子、蛋白质、或抗体以及药用载体。如在本文中所使用的,"药用载体"旨在包括任何和所有与药物给予相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。适宜的载体描述在最近的版本的Remington'sPharmaceuticalSciences-本领域的标准参考教科书中,其以引用方式结合于本文。这样的载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏液(finger’ssolution)、葡萄糖溶液、以及5%人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水载体如不挥发性油。上述用于药物活性物质的介质和制剂的使用是本技术领域熟知的。除非任何常规的介质或制剂与活性化合物不相容,否则可以考虑其用于组合物中。还可以将辅助性活性化合物加入组合物。
将本发明的药物组合物配制成与其所期望的给予途径相容。给予途径的实例包括肠胃外,例如,静脉内、皮内、皮下、口服(例如,吸入)、透过皮肤(即,局部)、透粘膜、腹腔内、以及直肠给予。用于肠胃外、皮内、或皮下使用的溶液或混悬剂可以包括以下组分:无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA);缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐;以及用于调节张力的制剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱,如盐酸或氢氧化钠,来调节pH。可以将肠胃外制剂装入安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶(由玻璃或塑料制成)。
适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中水溶性的)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体(dispersion)的无菌散剂。对于静脉内给予,适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorTM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在所有情况下,组合物必须是无菌的并且应当是流体可达到容易注射的程度。它在制备和贮藏条件下必须是稳定的,并且必须防止它受到微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质,其包含例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇、以及液体聚乙二醇等)、以及它们的适宜混合物。例如,通过使用涂层如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需要的颗粒大小以及通过使用表面活性剂,可以保持适当的流动性。可以通过各种抗菌和抗真菌剂,例如,对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等,来防止微生物的作用。在许多情况下,优选在组合物中包括等渗剂,例如,糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的制剂,例如,单硬脂酸铝和明胶,来延长可注射组合物的吸收。
可以通过将所需量的活性化合物(例如,本发明的治疗性复合物)加入包含上述一种或多种成分的适当溶剂中,当需要时,接着过滤除菌,来制备无菌可注射溶液。通常,通过将活性化合物加入无菌赋形剂来制备分散体,其中无菌载体包含基本的分散介质和需要的其他来自上述的成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌散剂的情况下,制备方法是真空干燥和冰冻干燥,其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所期望的成分。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们装入明胶胶囊或压制成片剂。对口服治疗性给予来说,活性化合物可以结合于辅药(excipient)并以片剂、含片(troche)或胶囊剂的形式加以使用。还可以利用流体载体来制备口服组合物,用作漱口剂,其中在流体载体中的化合物是口服使用和发出哗哗声并且被吐出或咽下。可以包括药物相容粘合剂、和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、含片等可以包含任何以下成分、或类似特性的化合物:粘合剂如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶;辅药如淀粉或乳糖;崩解剂如海藻酸、Primogel、或玉米淀粉;润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes;助流剂如胶态二氧化硅;甜味剂如蔗糖或糖精;或增香剂如欧薄荷、水杨酸甲酯、或橙香料。
为了口服给予,药物组合物可以采用通过常规方式并借助于药用辅药,如粘合剂(例如,预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);填充剂(例如,乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙);润滑剂(例如,硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅);崩解剂(例如,马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠);或润湿剂(例如,月桂硫酸钠)制成例如片剂或胶囊剂的形式。可以用本技术领域熟知的方法来涂覆片剂。用于口服给予的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆剂、或混悬剂的形式,或它们可以制成干产品,使用前与水或其他适宜载体混合。可以通过常规方式并借助于药用添加剂,如悬浮剂(例如,山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪);乳化剂(例如,卵磷脂或阿拉伯胶);非水载体(例如,杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油);以及防腐剂(例如,对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸),来制备上述液体制剂。在适当的情况下,这些制剂还可以包含缓冲盐、增香剂、着色剂、以及甜味剂。
可以适当地配制用于口服给予的制剂以控释活性化合物。为了口含给予,组合物可以采用用常规方式配制的片剂或锭剂的形式。为了通过吸入给予,可以以来自加压包(pressurizedpacks)或喷雾器的喷雾剂的形式方便地递送供根据本发明使用的化合物,其中借助于使用适宜的推进剂,例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适宜气体。在加压气雾剂的情况下,可以通过提供阀门来确定剂量单位以递送计量的用量。供吸入器或吹入器之用的例如明胶的胶囊剂和药筒可以被配制成包含化合物和适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。化合物可以被配制成用于肠胃外注射给予,例如,通过弹丸注射或连续输注。可以以例如在安瓿或在多剂量容器中的单位剂量形式来提供注射用剂型,其中加入有防腐剂。组合物可以采用这样的形式如在油性或含水赋形剂中的混悬剂、溶液、或乳剂,并且可以包含配制剂如悬浮剂、稳定剂、和/或分散剂。可替换地,使用前,活性成分可以具有粉末形式,用于与适宜赋形剂(例如,无菌无热源水)混合。还可以将化合物配制在直肠用组合物中,如栓剂或滞留型灌肠剂,例如,包含常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。除上述剂型以外,还可以将化合物配制成长效仓储制剂(微球制剂,depotpreparation)。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来给予这样的长效剂型。因此,例如,可以用适宜的聚合或疏水材料(例如作为在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂来配制化合物,或化合物可以被配制成微溶衍生物,例如,配制成微溶盐。
为了通过吸入给予,可以以喷雾剂的形式递送化合物,其中喷雾剂来自加压容器或分配器(其包含适宜的推进剂,例如,气体如二氧化碳)或喷雾器。
还可以通过透粘膜(或经粘膜)或透过皮肤(或经皮肤)方式来进行系统给予。为了透粘膜或透过皮肤给予,可以在剂型中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本技术领域通常是已知的,并且包括,例如(用于透粘膜给予),去污剂、胆盐、以及夫西地酸衍生物。可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成透粘膜给予。为了透过皮肤给予,可以将活性化合物配制到软膏剂、药膏、凝胶剂、或乳膏剂中(如本技术领域通常已知的)。
在一种实施方式中,可以用将保护化合物以免从体内快速消除的载体来制备活性化合物,如控释剂型,其包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容聚合物,如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备上述剂型的方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这些材料还可以商业上获自AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc.。脂质体悬浮液(包括靶向感染细胞的脂质体,其具有相对于病毒抗原的单克隆抗体)也可以用作药用载体。这些脂质体悬浮液可以按照本领域技术人员已知的方法加以制备,例如,如在美国专利第4,522,811号中所描述的。
尤其有利的是,以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物,以便于给予并实现剂量的均匀性。如在本文中所使用的,剂量单位形式是指适合于作为单位剂量的物理上分离的单位,用于待治疗的受试者;每个单位包含预定量的活性化合物,用来连同所需要的药物载体而产生所期望的治疗效果。对本发明的剂量单位形式的技术要求(specification)受控于并依赖于活性化合物的独特的特性和要达到的特定的治疗效果、以及在复合这样的用于治疗个体的活性化合物的技术领域中所固有的限制。
可以将本发明的核酸分子插入载体并用作基因治疗载体。可以通过,例如,静脉注射、局部给予(参见例如,美国专利第5,328,470号)或通过立体定向注射(参见例如,Chen,etal.,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057)将基因治疗载体递送到受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受稀释剂中的基因治疗载体,或可以包含其中包埋有基因递送载体的缓释基质。可替换地,在可以从重组细胞完好地产生完整的基因递送载体的情况下,例如,反转录病毒载体,药物制剂可以包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。可以将药物组合物与给药说明书,包括在容器、包、或分配器中。
治疗有效剂量是指足以改善或延迟症状的治疗剂的量。可以在细胞培养或实验动物中,通过例如用于确定LD50(导致50%的群体死亡的剂量)和ED50(可有效治疗50%的群体的剂量)的标准制药程序来确定上述化合物的毒性和治疗效力。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数并且它可以表示为比率LD50/ED50。呈现较大治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用呈现毒性副作用的化合物,但应当小心设计这样的递送系统,其将上述化合物靶向受影响组织的部位以将对未感染细胞的潜在损伤降低到最小程度,从而降低副作用。获自细胞培养测定和动物研究的数据可以用于制定供人类之用的剂量范围。上述化合物的剂量优选在循环浓度的范围内,其中循环浓度包括ED50并具有很小或没有毒性。剂量可以在该范围内变化,其取决于所采用的剂型和所使用的给予途径。对于在本发明的方法中所使用的任何一种化合物,可以最初根据细胞培养测定来估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制一种剂量以达到这样的循环血浆浓度范围,其包括IC50(即,试验化合物的浓度,其达到症状的半最大抑制),如在细胞培养中确定的。上述信息可以用来更精确地确定在人类中的有用剂量。可以,例如,通过高效液相层析,来测量血浆水平。
根据本发明还披露了一种试剂盒或系统,其使用本文描述的任何一种方法、选择策略、材料、或成分。根据本发明披露内容的典型的试剂盒将可选地、另外包括用于实施方法或测定的说明书、包装材料、一个或多个包含试样的容器、装置或系统部件等。
根据本文的描述和优选实施方式的实施例,本发明的另外的目的和优点对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的,并且明显地包括在本发明的范围内。
实施例
在Bfl1和HCCS1中两亲尾锚定结构域是保守的。编码Bfl1(BCL2A1或BCL2-相关蛋白A1)的基因位于染色体15q24.3上并且包含三个外显子,其被转录到两个可变剪接变体,Bfl1(175a.a.)和Bfl1s(163a.a.)(Koetal.,2003b)中。Bfl1(a.a.147-175)的尾锚定(TA)结构域由外显子3编码。数据库检索揭示了,在位于15q25.1上的HCCS1(16.4kb)中BCL2A1的外显子3是保守的(图1A)。BCL2A1和HCCS1的基因组序列的序列对比表明,包括外显子3的BCL2A1的8.8kb片段和周围的非编码区在HCCS1中是高度保守的,这可能是由于12个保守的基因片段的复制所致。
HCCS1的基因组序列还包含三个外显子,其编码91个氨基酸(图1A)。HCCS1的外显子3的DNA序列与BCL2A1的DNA序列95%相同,并且分别开始于HCCS1的E28和Bfl1的E141,两者具有相同的阅读框(图1B)。HCCS1包含一段28个氨基酸的序列(E28至L55),其相同于Bfl1TA的一段序列,只是在L35处的保守性改变(图1C)。在HCCS1中在外显子3的3’端的碱基对缺失导致读框移位以及其后在HCCS1的C端处氨基酸序列的变化。
序列对比表明Bcl2蛋白家族所有抗凋亡成员的TA结构域的共同特点,其中疏水富集节段(HR)总是被N端旁侧区(FR-1)和C端旁侧区(FR-2)包围(图1E)。在FR-1和FR-2中的保守赖氨酸残基相当于TA肽的潜在MTS(参见下文),而在Bfl1(E159、K163以及E166)和HCCS1(E46、K50以及E53)的HR中的三个带电荷残基是独特的,因为它们在其他Bcl2家族蛋白中并不是保守的。
利用SOPMA(GeourjonandDeleage,1995)和Jpred(Cuffetal.,1998)程序进行的二级结构分析可以预测TA肽的α-螺旋结构(图1C)。在α-螺旋旋转图(α-helicalwheelplot)中氨基酸的序列对比揭示了来自Bfl1和HCCS1的TA肽的两亲特性,其中三个带电荷残基排列在α-螺旋的一侧(图1D)。因此,我们称这种结构域为两亲尾锚定肽(ATAP)。
为了研究TA对凋亡的影响,在HEK293细胞中瞬时表达FLAG-TA融合肽。转染后24小时,通过碘化丙啶(PI)染色来观测细胞死亡。虽然FLAG-标签全长Bfl-1(FLAG-Bfl-1)没有显示对细胞的毒性作用,但FLAG-TA显著诱导细胞死亡并且这种毒性被50μM的OPH(一种泛半胱天冬酶抑制剂)阻断(图1F)。利用β-半乳糖苷酶报告测定来量化FLAG-TA的细胞毒活性(Chittendenetal.,1995;Woodetal.,2000)。借助于包含FLAGBfl-1或Flag-TA的质粒连同包含β-半乳糖苷酶基因的质粒的共转染,细胞活力的丧失反映了β-半乳糖苷酶活性的降低。FLAG-TA的瞬时表达导致β-半乳糖苷酶活性降低68.1±3.9%(n=5),其被50μMOPH所抑制(图1G)。有趣的是,FLAG-Bcl-xL或FLAG-Bfl-1的表达导致增加的β-半乳糖苷酶活性(FLAG-Bcl-xL相对于对照为1.32±0.13倍(n=5);以及FLAG-Bfl-1相对于对照为1.11±0.06(n=5)),可能对应于Bcl-xL和Bfl-1的促存活活性。FLAG-标签蛋白的表达水平与它们的β-半乳糖苷酶活性相关(图1H)。值得注意地,通过用50μM的OPH进行处理会增加FLAG-TA的表达,这提示TA肽在经受凋亡的细胞中靶向蛋白水解降解、或靶向与TA的表达有关的细胞死亡。
ATAP诱导与Bax和Bak无关的凋亡。为了试验ATAP的细胞功能,将Flag-ATAP融合肽瞬时表达在HEK293细胞中以便于利用抗Flag抗体来检测重组蛋白(图2A)。转染后24小时,利用β-半乳糖苷酶报告测定来量化Flag-ATAP的细胞毒活性(Chittendenetal.,1995;WoodandNewcomb,2000)。借助于包含β-半乳糖苷酶基因和Flag-ATAPcDNA的质粒的共转染,β-半乳糖苷酶活性的降低反映了细胞活力的丧失。和用模拟质粒共转染的细胞相比,在用Flag-ATAP转染的细胞中观测到β-半乳糖苷酶活性降低68.1±3.9%(n=5),其可以通过加入50μMOPH(一种泛半胱天冬酶抑制剂)加以防止(图2A)。此外,在用OPH处理的细胞中观测到Flag-ATAP的表达升高,这提示,ATAP是细胞死亡的有效触发物或该肽在经受凋亡的细胞中靶向蛋白水解降解。
我们装配了GFP-ATAP融合构建体以可以对ATAP诱导的细胞死亡进行活细胞成像。如图2B所示,瞬时表达GFP-ATAP的细胞呈现凝聚和片段化染色质结构,这说明细胞死亡的凋亡特性。借助于加入OPH,可以防止GFP-ATAP诱导的染色质片段化。利用FACS测定来定量分析HEK293细胞中的GFP-ATAP诱导凋亡,其中亚G1细胞群体的提高用作经受凋亡细胞的指示(图2C)。很显然,GFP-ATAP的促凋亡活性类似于、或也许强于GFP-Bax(一种众所周知的促凋亡蛋白)的促凋亡活性(Panetal.,2001;Smailietal.,2001)(图2C)。作为对照,我们发现,包含Bcl-xLTA结构域(a.a.202-233)(其附着于GFP的C端)的GFP-TAxL的表达在HEK293细胞中并不显示任何毒性活性。
为了试验是否存在ATAP的任何一种细胞型依赖效应,将GFP-ATAP瞬时表达在具有不同遗传背景的细胞系中。除HEK293和HeLa细胞以外,我们还在MCF-7,一种半胱天冬酶-3缺陷人乳腺癌癌细胞系(Janickeetal.,1998),以及BMK-D3,衍生自bax–/–bak–/–小鼠的一种幼小鼠肾细胞系(Degenhardtetal.,2002)中试验了GFP-ATAP。利用碘化丙啶(PI)排除方法进行的细胞死亡分析揭示了,>90%的所有细胞类型在GFP-ATAP的瞬时表达以后经受凋亡(图2D、E)。因为在缺少Bax和Bak的BMK-D3细胞中观测到显著的凋亡(图2E和补充材料图S2),所以GFP-ATAP的促凋亡活性并不需要Bax和Bak的参与。此外,GFP-ATAP对MCF-7细胞的强促凋亡效应提示,ATAP可以通过不同于半胱天冬酶-3的半胱天冬酶起作用。
ATAP的两亲特性对于其促凋亡活性来说是必需的。因为在Bfl1和HCCS1的HR中的带电荷残基并不存在于其他Bcl2家族蛋白中,以及因为它们有助于ATAP的两亲特性,所以我们通过定位诱变试验了E159、K163以及E166对ATAP在Bfl1中的促凋亡功能的作用。为便于确定亚细胞定位,将各种ATAP突变体融合于GFP(图3A)。虽然单残基的突变对ATAP的凋亡活性几乎没有影响,但双突变,例如E159Q-E166Q(mHR3)或E159L-E166L(mHR4),则显著降低ATAP的促凋亡功能(图3B)。在mHR3中另外的突变(K163L)进一步降低了ATAP在mHR7中的毒性。有趣的是,包含E159K-E166K突变的mHR5构建体似乎并不影响ATAP的促凋亡活性(图3B),这提示,电荷守恒而不是电荷的极性与其促凋亡功能有关。利用β-半乳糖苷酶报告测定,我们发现,和Flag-ATAP构建体相比,Flag-mHR3(其中GFP序列被Flag序列取代)也呈现显著降低的细胞毒性作用。在转染后24小时,和来自GFP转染细胞的酶活性相比,在Flag-ATAP转染细胞中β-半乳糖苷酶活性为26.0±5.2%,而在FlagmHR3转染细胞中则为62.0±7.8%(n=5,P<0.001)(图3C)。
为了试验ATAP的两亲特性是否也与HCCS1的凋亡功能有关,将带电荷残基的相应突变引入全长HCCS1基因。如图3D所示,包含对应于Bfl1ATAP的mHR3的突变的HCCS1-GFP(E46Q/E53Q)呈现显著降低的细胞毒活性。在进一步的研究中,我们还试验了在缺少Bak和Bax的表达的BMK-D3细胞中以及在用Bcl-xL稳定转染的CHO细胞中ATAP和mHR7的影响(Panetal.,2000)(参见补充材料图S2)。在亲代CHO细胞(和过度表达Bcl-xL的CHO细胞相比)中、以及在BMK-wt细胞(和BMK-D3细胞相比)中观测到ATAP的类似细胞毒性作用,这表明,ATAP的促凋亡功能与Bax、Bak以及Bcl-xL无关。此外,虽然GFP-ATAP对CHO和BMK细胞系均显示出有效的细胞毒性作用,但GFPmHR7显示出很少细胞毒性。总的来说,这些结果说明,ATAP的促凋亡活性与肽的两亲性能紧密相关。
ATAP靶向线粒体通透性转换以诱导凋亡。共焦显微镜成像显示,在ATAP的E159、E166或K163处的突变并没有改变其胞内靶向性能。事实上,所有mHR1至mHR7突变体被定位到线粒体膜,类似于野生型GFP-ATAP,其是基于共定位模式,其中mRFP-Mito瞬时表达在HeLa细胞中(图4C)。来自其他研究者的先前研究已表明,位于TA结构域的N端或C端的带正电荷的残基与将TA肽靶向线粒体有关(Borgeseetal.,2003;Kaufmannetal.,2003)。我们发现,位于FR-1和FR-2中的保守赖氨酸残基在将ATAP靶向线粒体膜中具有关键作用(图4)。虽然单赖氨酸残基、K147L、K151L或K172L的突变似乎并没有改变ATAP的线粒体靶向性能,但K147L-K151L(mFR4)的双突变会引起GFP-ATAP的远离线粒体的错误靶向(mistargeting)(图4C)。mFR4突变体主要定位于细胞质并且经常形成胞质或核周凝集体,并且和其他mFR构建体相比具有显著降低的促凋亡活性(图4B)。
在经受凋亡的细胞中,染色体DNA的降解可以在包含比健康细胞更低DNA含量的亚G1细胞群中加以测量,或可以被检测为在琼脂糖凝胶上的约180bp的DNA梯状条带(DNAladder)。如图4D所示,表达GFP-ATAP和mHR5的HEK293细胞显示出显著更高百分率的亚G1细胞,并且比那些表达mFR4、mHR3、mHR4或mHR7的HEK293细胞具有更广泛的DNA梯形图案。这证实了由ATAP诱导的细胞死亡的凋亡特性。利用PI排除方法进一步测定了各种ATAP突变体对凋亡的时间相关效应(图4E)。用ATAP或mHR5转染HEK293细胞后48小时,多于95%的细胞是PI阳性的,而仅约38%的表达mHR3或mHR4的细胞是PI阳性的。在mHR7转染细胞的情况下,在48小时时间点仅19%的细胞是PI阳性的(图4E)。有趣的是,用mFR4转染的细胞在实验的后期阶段(例如,转染后多于36小时)呈现逐渐的细胞死亡。虽然mFR4的线粒体靶向似乎受到损害,但在线粒体处检测到部分蛋白质(图4C)。一种可能性是,mFR4的延迟的毒性作用来自分子在线粒体膜处的逐渐积聚。
针对mFR7突变体,发现一个特殊的例外,其中在FR-1和FR-2中的所有三个赖氨酸残基被诱变成亮氨酸。不同于mFR4,mFR7仍然保持其靶向线粒体并具有有效的促凋亡活性(图4B)。GFP-mFR7的一级氨基酸序列的分析鉴定了来自GFP的C端部分和pEGFP-C1质粒(其存在于ATAP序列的近侧)的多克隆位点(MCS)的其他带电荷残基。就电荷含量和定位而言,该外序列类似于Bcl-xL的FR-1区,其在Bfl1旁侧区内没有带正电荷残基的情况下可以作为MTS的替代物(参见补充材料图S3)。实际上,这些带正电荷残基的缺失会消除mFR7的线粒体靶向并因此消除其促凋亡功能。此外,将11个氨基酸接头序列(linkersequence)插入MCS同样会消除mFR7的线粒体靶向并降低其凋亡活性。这些结果与Kaufmann等的先前研究相一致(Kaufmannetal.,2003)JournalofCellScience120(16)并进一步提示,带电荷残基必须留在HR节段附近以将ATAP有效靶向到MOM。
总的说来,我们的资料提示,位于ATAP的N端旁侧区中的赖氨酸残基对ATAP靶向到线粒体来说是必需的,以及ATAP的促凋亡活性与它同线粒体的结合紧密相联。
MTS和ATAP均涉及由HCCS1诱导的凋亡。HCCS1的一级氨基酸结构包含一段18个氨基酸的序列(a.a.1-18),其邻近于ATAP序列,并且可以用作HCCS1的可替换MTS(参见图1C)。为了探查MTS和ATAP对HCCS1的凋亡功能的作用,我们用各种HCCS1缺失突变体产生了GFP融合构建体(图5A)。由于由ATAP产生的高水平毒性,所以在实验中在细胞培养基中必须包括50μMOPH,其中我们将各种GFP融合构建体的线粒体定位模式可视化。
如图5B所示,在HeLa细胞中,HCCS1-GFP、以及GFP-ATAP(HCCS1)呈现与mRFP-Mito的紧密共定位,这说明HCCS1特异性靶向线粒体膜。GFP附着于缺少MTS、GFP-HCCS1(ΔMTS)的HCCS1的N端,还揭示了特有的线粒体定位模式,这证实了我们的观测结果:HCCS1的ATAP结构域包含内在的MTS。有趣的是,GFP附着于缺少MTS的HCCS1的C端会引起HCCS1(ΔMTS)-GFP远离线粒体的错误靶向。这与早先的研究结果一致,其说明较大部分加入TA蛋白的C端会破坏它们的胞内靶向性能(Johnstonetal.,2002)。
MTS-GFP还呈现典型的线粒体定位模式,这表明HCCS1的MTS结构域具有线粒体靶向性能(图5B)。因此,HCCS1包含用于线粒体定位的双靶向信号,一个在N端(MTS)且一个在C端(ATAP)。利用PI排除方法进行的细胞活力分析表明,MTS-GFP在HeLa细胞中没有毒性作用,而HCCS1-GFP、GFP-HCCS1(ΔMTS)以及GFP-ATAP(HCCS1)均呈现有效的促凋亡活性,其可以通过OPH加以抑制。此外,HCCS1(ΔMTS)-GFP,其离开线粒体进行错靶向,显示出显著更低的细胞毒性(图3C)。这些结果进一步支持以下看法:ATAP导致HCCS1的促凋亡活性以及线粒体靶向是HCCS1的促凋亡功能所需要的。
在脂双层测定中,ATAP干扰膜通透性。广泛的研究已表明,在凋亡信号传送中,线粒体膜电位的丧失作为细胞色素c释放和半胱天冬酶激活作用的触发物而发挥作用(Petitetal.,1995;Zamzamietal.,1995)。为了确定线粒体膜电位的丧失是否与ATAP-诱导的凋亡直接相关,我们利用MitoTrackerRed(CM-H2TMRos)监测了HeLa细胞中的线粒体膜电位,其仅在具有完整的线粒体膜电位的细胞中靶向线粒体并通过氧化而产生荧光。在有50μMOPH的情况下,用GFP-ATAP、GFP-mHR7或GFP-TAxL转染HeLa细胞,以降低半胱天冬酶激活作用对线粒体完整性的下游效应(downstreameffect)。虽然用GFP-TAxL转染的大多数细胞是健康的并具有明亮的MitoTracker染色,但大多数GFP-ATAP转染细胞显示弥散(diffuse)和低强度MitoTracker染色(图6A)。平均来说,65.0±8.7%(n=5)的表达GFP-ATAP的HeLa细胞是MitoTracker阴性的,而仅19.0±9.3%的那些表达GFP-TAxL的HeLa细胞是MitoTracker阴性的(图6B)。然而,用GFP-mHR7转染的细胞显示增加的MitoTracker染色,其与用GFP-TAxL转染的细胞中的MitoTracker染色相当。用其他mHR和mFR突变构建体,获得类似的结果,JournalofCellScience120(16),其中MitoTracker标记的显色(或显影,development)与ATAP构建体的毒性作用的降低紧密相关(未示出)。这些结果表明,ATAP诱导凋亡可能涉及线粒体外膜透化作用的直接诱导。
利用脂双层重建系统,我们证明了,合成野生型ATAP肽对脂双层膜的阳离子通透性产生显著影响,而突变体mHR7肽,其可以结合于线粒体膜并对细胞没有毒性,并不影响脂双层膜的传导性。在离体系统中ATAP介导的通透性变化并不显示可以从成孔通道所预期的典型的稳定的传导特性。ATAP可以与预先存在的通道相互作用或调节预先存在的通道以改变线粒体膜通透性,或潜在地Bfl1或HCCS1蛋白的其他结构域可以有助于在体内观测到的膜通透性的变化。
在线粒体凋亡途径的起始中细胞色素c释放是关键步骤。为了试验ATAP和mHR7对来自线粒体的细胞色素c释放的影响,我们进行两个互补试验。首先,利用GFP-ATAP在HEK293细胞中的瞬时表达,我们发现,在用GFP-ATAP转染的细胞中显著部分的细胞色素c被释放进入胞质溶胶,而GFP-mHR7并没有产生显著的细胞色素c释放(图6C,左边)。其次,利用来自BMK-D3细胞的分离的线粒体膜制品,我们发现,加入合成ATAP肽会诱导细胞色素c的释放,一种用mHR7肽没有观测到的效应(图6C,右边)。
作为ATAP对细胞膜的完整性的影响的直接试验,我们利用脂双层重建系统进行了电生理研究(Lametal.,1998;Maetal.,1988)。在大肠杆菌中ATAP的毒性作用(未示出)阻止纯化足够量的用于我们的功能研究的肽。因此,合成ATAP肽用于我们的双层重建测定。如图6D所示,加入野生型ATAP肽(11μM)会显著影响脂双层膜对单价阳离子的通透性。在包含200mMKCl(顺式)和50mMNaCl(反式)的记录溶液(recordingsolution)中,在0mV保持电位下测得从顺式到反式的外向电流,这提示,ATAP可影响脂双层膜的阳离子通透性(n=5)。虽然电流痕迹在不同水平波动而没有可限定的单位电导值,但在~–30mV下测得明显的电流反转电位,其接近于阳离子的能斯特电位。更高浓度(>22.2μM)的ATAP经常引起双层膜的不稳定性,并在加入肽以后的30分钟内发生脂双层的破裂(n>30)。因此,高浓度的ATAP可以影响脂双层膜的通透性,而没有形成稳定的孔结构。在平行实验中,我们发现,在11-44μM的浓度下,mHR7突变肽并不诱导膜传导性的任何明显变化(n=35,图6D)。此结果与细胞中瞬时表达的mHR7蛋白的降低的凋亡活性相一致。
示例性方法
线粒体膜电位的测定和共聚焦显微镜术。按照Pratt和Niu的程序(2003)测量线粒体膜电位。在培养基中温育瞬时转染的HeLa细胞两小时,其中培养基包含50nMMitoTrackerRedCM-H2Xros(MolecularProbes),其仅在具有完整线粒体膜电位的细胞中显现荧光。用荧光显微镜对活细胞进行观测和拍照。从至少200个GFP阳性细胞计数MitoTraker阳性细胞。为了观测EGFP融合蛋白的胞内定位,将固定的HeLa细胞用于共焦显微镜术。如上所述在LabTekII腔室载玻片(slide)上转染HeLa细胞并在有50μMOPH的情况下培养。转染后18小时,用50nMMitoTrackerRedCM-H2Xros染色细胞并用PBS洗涤,接着用4%甲醛固定。最后洗涤细胞,制作标本(mount)并用装备有63X物镜的共焦显微镜ZeissLSM510(CarlZeissMicroscopy,Jena,德国)加以分析。在室温下获取图像。
质粒构建
利用基于PCR的诱变和亚克隆来构建所有在此研究中使用的质粒(KoandMa,2005)。列出了用于亚克隆和诱变的引物序列。利用pBfl1-myc(Koetal.,2003b)作为模板来扩增编码ATAP的PCR产物,以及利用pEGFP-BclxL质粒(Koetal.,2003a)作为模板来扩增编码Bcl-xL(E202-K233)的TA的PCR产物。将PCR产物克隆(框内并在GFP序列后面)到在pEGFP-C1(Clontech)中的XhoI和EcoRI位点,以获得pGFP-ATAP和pGFP-TAxL质粒。包含HCCS1的全长cDNA的MGC克隆584619购自ATCC,并用作PCR模板来构建pHCCS1-GFP、pHCCS1(_MTS)-GFP、pMTS-GFP、pGFP-HCCS1(_MTS)以及pGFP-ATAP(HCCS1)。通过将PCR产物亚克隆到pEGFP-N1(Clontech)载体的BspE1和EcoRI位点来产生具有融合于3_端的GFP的质粒。为了产生pFLAG-ATAP和pFLAG-mHR3,用编码Flag表位的cDNA片段替换编码pGFP-TA和pGFP-mHR3质粒的GFP的cDNA片段。我们使用以下寡核苷酸,其包含在正义和反义引物(粗斜体)之间互补的(斜体)23个碱基的3_端。对两个重叠的寡核苷酸进行退火并亚克隆到pGFP-ATAP和pGFPmHR3的XhoI和EcoRI位点(粗体)。
为了构建Bfl-1FR突变体(参见本文),在PCR反应中使用了以下引物的各种组合并使用pBfl-1-myc作为模板。
为了构建Bfl-1FR突变体(参见本文),在PCR反应中使用了以下引物的各种组合并使用pBfl-1-myc作为模板。
用于PCR反应的引物组合是用于mFR1的K1L-F和TA-R;用于mFR2的K5L-F和TA-R、用于mFR3的TA-F和K26L-R、用于mFR4的K1,5L-F和TA-R;用于mFR5的K1L-F和K26L-R;用于mFR6的K5L-F和K26L-R;用于mFR7突变体的K1,5L-F和K26L-R。限制位点XhoI和EcoRI(粗体)用于将包含突变密码子(下划线)的PCR产物亚克隆到pEGFP-C1。
为了构建Bfl-1TMS突变体(参见本文)和pEGFP-TAxL(Bcl-xLC端的202-239个氨基酸),使用了以下合成寡核苷酸的各种组合。
寡核苷酸包含在正义和反义引物(粗斜体)之间互补的18个碱基的3’端。寡核苷酸的组合是用于mHR1的E13Q-F和sTA-R;用于mHR2的sTA-F和E20Q-R;用于mHR3的E13Q-F和E20Q-R;用于mHR4的E13L-F和E20L-R;用于mHR5的E13K-F和E20K-R;用于mHR6的K17L-F和K17L-R;以及用于mHR7突变体的KE2L-F和KE2L-R。TAxL-F和TAxL-R用于TAxL构建体。对两个重叠寡核苷酸进行退火,填补然后亚克隆到pEGFP-C1的XhoI和EcoRI位点。
为了产生pEGFP-TAΔFR-1,对以下合成寡核苷酸进行退火并亚克隆到pEGFP-C1的XhoI和EcoRI位点。
为了产生pGFP-接头-ATAP和pGFP-接头-ATAP,通过用编码GLPAQITFLSVPGSR的合成cDNA片段取代在pGFPATAP和ATAP突变质粒中的cDNA序列来产生包括pGFP-接头-mFR7的突变体。对以下合成寡核苷酸进行退火并亚克隆到pGFP-ATAP和ATAP突变构建体的BspEI和XhoI位点:
为了产生pFLAG-TA和pFLAG-mHR3,用编码FLAG表位的cDNA片段替换编码pEGFPTA和pEGFP-mHR3质粒的EGFP的cDNA片段。我们使用了两个以下寡核苷酸,其包含在正义和反义引物(粗斜体)之间互补的23个碱基的3’端。对两个重叠寡核苷酸进行退火,填补然后亚克隆到pEGFP-TA和pEGFPmHR3的XhoI和EcoRI位点。
为了构建表达载体mRFP-mito,利用pRSETB-mRFP(Campbelletal.,2002)作为模板来扩增mRFP(红色荧光蛋白单体)cDNA片段。将PCR产物亚克隆到pGFP-TAxL的NheI和BspEI位点以用mRFP替换GFP并产生pmRFP-mito。通过DNA测序证实所有构建体。
通过利用所描述的(KoandMa,2005)BsmBI进行诱变来获得pHCCS-1-GFP(E46Q/E53Q)。利用pHCCS-1-GFP作为PCR模板并利用以下引物进行PCR扩增:
将HCCS-1的突变cDNA片段亚克隆到pEGFP-N1载体的BspEI和EcoRI位点。
生物信息学分析
从GenBank数据库获得人Bfl1(GeneID597)和HCCS1(GeneID400410)的基因组序列,并利用BLAST程序进行同源性搜索。包含BCL2A1(Bfl1)和HCCS1的基因组位置分别是在染色体15q24.3区上从78,040至78,050kb的NM_004049、以及在染色体15q25.1区上从77,978至77,994kb的XM_375224。借助于AVID程序并利用100bp的窗口大小进行BCL2A1和HCCS1的基因组序列的序列比对。借助于CLUSTALW程序进行外显子序列和一级氨基酸序列的序列比对。利用SOPMA(GeourjonandDeleage,1995)和Jpred(Cuffetal.,1998)程序来预测二级结构。利用Targetpv1.1(Emanuelssonetal.,2000;Nielsenetal.,1997)来推导HCCS1的MTS。
在正常人组织和癌细胞系中Bfl1和HCCS1的mRNA表达。利用由NCBIUniGene服务器提供的可获得的微阵列数据和EST表达谱,初步分析了BCL2A1和HCCS1转录物在正常人组织中的分布。通过RT-PCR并利用购自Stratagene(LaJolla,CA)的人正常肺、乳腺以及子宫颈的总RNA,半定量评价了BCL2A1和HCCS1转录物。利用Tri试剂(Sigma)并按照制造商的说明书,分离了癌细胞系的总RNA。在20_lcDNA合成反应中使用1_gRNA,其中使用寡核苷酸(dT)18引物和莫洛尼小鼠白血病毒(MMLV)反转录酶(Promega,Madison,WI,美国)。cDNA混合物(2_l)用于PCR扩增。作为对照,扩增人_肌动蛋白cDNA以确定RNA的完整性和cDNA合成的效率。引物是用于Bfl1的5_-ACAAAATGTTGCGTTCTCAGTCCA-3_(正义,SEQIDNO.60)和5_-CGTTTTGCCTTATCCATTCTCC-3_2922JournalofCellScience120(16)(反义,SEQIDNO.61);用于HCCS1的5_-TTGCCACAAATGGTGTGCTCTA-3_(正义,SEQIDNO.62)和5_-TCCTGGTGCCATGATTTACTGT-3_(反义,SEQIDNO.63);用于_肌动蛋白的5_-GATCAGCAAGCAGGAGTATGAC-3_(正义,SEQIDNO.64)和5_-ATGGCAAGGGACTTCCTGTAAC-3_(反义,SEQIDNO.65)。这些引物分别扩增Bfl1、HCCS1以及_肌动蛋白的302、320以及352bp的PCR产物。
基因转染和细胞死亡的分析
在将表达质粒转染到HEK293、HeLa、MCF-7或BMKD3细胞以后,监测凋亡性细胞死亡。在35-mm孔中并在补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养2_105个细胞24小时。利用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)并借助于1_g指定的表达质粒来转染细胞,并进一步在没有或有50_M泛半胱天冬酶抑制剂,Q-VD-OPH(OPH,EnzymeSystemsProducts)的情况下加以培养。为了形态上估计凋亡性细胞死亡,将细胞以5_104个细胞/孔的密度平皿接种到LabTekII腔室载玻片(NalgenNuncInternational)上。转染后24小时,在用4%甲醛进行固定以前,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞。随后,用包含1_g/mlDAPI的Vectasheild封固液(VectorLaboratories)染色细胞并在Axiovert100倒置落射荧光显微镜(CarlZeiss)下进行可视化。具有波纹轮廓的细胞核和染色质凝聚被认为代表着凋亡性细胞死亡。还通过碘化丙啶(PI)排除来测量细胞死亡。在用GFP融合质粒转染以后,将总共1_g/mlPI(MolecularProbes)加入细胞培养基。在包含大约200个GFP阳性细胞的三个不同场,用荧光显微镜对细胞进行观测和拍照。GFP和PI双阳性细胞被计数为死细胞。通过-半乳糖苷酶报告测定并按照所描述的程序(Chittendenetal.,1995;WoodandNewcomb,2000)来定量分析细胞活力。简单地说,用1g试验质粒加上0.1g表达-半乳糖苷酶的pCMV(Sigma)质粒来共转染细胞。在转染后24小时,收集细胞并利用-半乳糖苷酶EnzymeAssaySystem(Promega)来测量-半乳糖苷酶活性。在每个实验中,一式三份地测试每种构建体,并且重复实验至少三次。细胞活力表示为相对于对照质粒的_-半乳糖苷酶活性。
DNA片段化测定和流式细胞术
为了通过琼脂糖凝胶电泳来分析DNA片段化,如所描述地(Essmannetal.,2003)制备细胞DNA。转染后24小时,在37℃下将35mm孔中的细胞溶解于包含0.25%NP-40和50_gRNA酶A的0.2ml裂解缓冲液(20mMTris-HCl、0.5mMEDTA、pH8.0)30分钟。在37℃下用0.2mg蛋白酶K处理每种溶胞产物30分钟,然后在25℃和10,000g下离心10分钟。在2%琼脂糖凝胶上对包含片段化DNA的上清进行分析。还可以在用PI进行DNA染色以后通过流式细胞术来确定DNA片段化。转染后24小时,用冷PBS洗涤细胞两次,随后重悬浮在包含50g/mlPI和20g/mlRNA酶A的PBS中。分析前,在室温下温育细胞~30分钟,并且避光。利用CoulterCytomicsFC500流式细胞仪(CoulterElectronics)分析DNA含量。线粒体膜电位的估计和共焦显微镜术。按照Pratt和Niu的程序(PrattandNiu,2003)测量线粒体膜电位。在培养基中温育瞬时转染的HeLa细胞两小时,其中培养基包含50nMMitoTrackerRed(CM-H2TMRos)(MolecularProbes),其在具有完整的线粒体膜电位的细胞中显现荧光。用荧光显微镜对活细胞进行观测和拍照。从至少200个GFP-阳性细胞计数MitoTracker阳性细胞。为了观测GFP融合蛋白的胞内定位,将固定的HeLa细胞用于共焦显微镜术。如上所述在LabTekII腔室载玻片上转染HeLa细胞并在有50_MOPH的情况下培养。转染后18小时,用50nMMitoTrackerRed(CM-H2TMRos)染色细胞并用PBS洗涤,接着用4%甲醛加以固定。最后洗涤细胞,制标本并用装备有63_物镜的共焦显微镜ZeissLSM510(CarlZeissMicroscopy,Jena,德国)进行分析。在室温下获取图像。
蛋白质印迹法
关于蛋白质印迹法,单克隆抗GFP抗体和抗羊辣根过氧化物酶(HRP)抗体购自SantaCruzBiotechnology。抗-肌动蛋白抗体购自Sigma。单克隆抗Flag9E10.2抗体购自Invitrogen。抗小鼠HRP抗体购自AmershamPharmacia。单克隆抗细胞色素c7H8.2C12抗体、单克隆抗Bcl-xL2H12抗体、单克隆抗Bax6A7抗体、多克隆抗Bak抗体分别购自BDBiosciences、Sigma、ZymedLaboratory以及UpstateBiotechnology。
关于免疫印迹分析,使20_g蛋白质经受SDS-PAGE并转移到PVDF膜上,其用5%脱脂奶加以阻断,用一抗探测并利用ECL化学发光试剂盒(AmershamPharmacia)加以可视化。
肽合成和脂双层实验
由Abgent(SanDiego,CA)合成了对应于Bfl1的C端的29单元(29-mer)ATAP肽(KFEPKSGWMTFLEVTGKICEMLSLLKQYC,SEQIDNO.36)以及其突变体mHR7(KFEP-KSGWMTFLQVTG-LICQMLSLLKQYC,SEQIDNO.51),纯度为99%,如通过HPLC和质谱法测得的。将这些肽溶解于DMSO以制得10mM原液。磷脂购自AvantiPolarLipids(Birmingham,AL)。如所述(Lametal.,1998;Maetal.,1988),进行电生理分析。用溶解在正癸烷中浓度为50mg/ml的牛脑磷酯酰乙醇胺和牛脑磷脂酰丝氨酸的1:1混合物并穿过直径为200_m的孔来形成脂双层膜。记录溶液包含:顺式,200mMKCl和10mMHEPES-Tris(pH7.4);反式,50mMNaCl、10mMHEPES-Tris(pH7.4)。将溶解在DMSO中的10mM肽的1l加入900l的顺式溶液并融合于双层。利用Axopatch200A放大器(AxonInstruments,福斯特城,加利福尼亚)测量电压控制和电流。用pClamp和TIPS软件进行数据分析。
测定从线粒体的细胞色素c释放
如先前描述的(Koetal.,2003a),制备没有线粒体的胞质溶胶。简单地说,转染后24小时,通过刮片来收集HEK293细胞,用冰冷的PBS洗涤两次,悬浮在100_l提取缓冲液(50mMPIPES-KOH、pH7.4、200mM甘露醇、70mM蔗糖、50mMKCl、5mMEGTA、2mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇以及蛋白酶抑制剂)中,然后在冰上温育30分钟。通过Dounce均一化作用来溶解细胞并在4℃和100,000g下离心匀浆液15分钟。收集上清,并利用单克隆抗细胞色素c抗体通过蛋白质印迹法来分析20g蛋白质。为了离体分析细胞色素c释放,利用线粒体分级分离试剂盒(ActiveMotif)并按照制造商的说明书,从BMK-D3细胞分离富含在线粒体中的重膜。在提取缓冲液中将分离的线粒体稀释至1mg/ml的浓度,然后在37℃下用合成ATAP或mHR7肽(100M)或DMSO(作为对照)温育1小时。然后在13,000g下离心反应混合物(reactions)10分钟并通过SDS-PAGE分析获得的沉淀物和上清。
应当明了,本文描述的详细实施例和实施方式是通过举例方式给出的,仅是说明性的,决不应认为其限制本发明。对于本领域技术人员来说,据此进行的各种改进或变化是显而易见的并且包括在本申请的精神和范围内,因而被认为是在所附权利要求的范围内。例如,可以变化成分的相对量以优化所期望的效应,可以加入另外的成分,和/或可以用类似的成分代替一种或多种所描述的成分。根据所附权利要求,与本发明的系统、方法、以及步骤有关的另外的优点和功能将是明显的。
Claims (10)
1.一种经分离的多肽、或它的类似物或衍生物,由26至50个氨基酸组成,该多肽包括SEQIDNO:36示出的氨基酸序列,其中,所述多肽形成两亲性螺旋结构,靶向线粒体外膜,通过破坏线粒体通透性诱发凋亡。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中,所述多肽是选自由SEQIDNO:36、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51以及53组成的组中的成员。
3.一种具有通式(I)的26至50个氨基酸的经分离的多肽:
bXaXbuunnunnanXGbnXann(X)1-6nn(X)0-2b(I)
其中:
n=非极性(疏水)氨基酸;
X=任何一种氨基酸;
u=极性、不带电荷氨基酸;
b=碱性氨基酸;以及
a=酸性氨基酸,其中所述多肽能够诱导细胞凋亡。
4.根据权利要求3所述的多肽,其中所述多肽具有通式(II):
(K/R)n(E/D)(P)(K/R)SGW(M/L)(S/T)FL(E/D)nTG(K/R)I(X)(E/D)
ML(X)1-6LL(X)0-2(K/R)(II)
其中,
n=非极性(疏水)氨基酸;以及
X=任何一种氨基酸。
5.根据权利要求3或4所述的多肽,其中,所述多肽包含SEQIDNO:36中示出的序列。
6.根据权利要求3或4所述的多肽,其中,所述多肽是选自由SEQIDNO:38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51以及53组成的组中的成员。
7.一种药物组合物,包含有效量的权利要求1-6中任意一项所述的多肽和药用载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物,其中,所述药物组合物包含至少一种选自由SEQIDNO:36、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51以及53组成的组中的多肽。
9.一种用于在细胞中诱导凋亡的体外方法,包括给予所述细胞一种组合物,所述组合物包含有效量的权利要求7或8所述的药物组合物。
10.根据权利要求7或8所述的药物组合物在制备用于治疗癌症、细菌感染和/或增生的药物中的应用。
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