DE60128368T2

DE60128368T2 - Diagnose und behandlung von prostatakrebs

Info

Publication number: DE60128368T2
Application number: DE60128368T
Authority: DE
Inventors: Mustafa Bilgin Djamgoz; Scott Paton Fraser; James Kenneth Diss
Original assignee: Imperial Innovations Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 2000-09-02
Filing date: 2001-09-03
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2021-09-04
Also published as: CY1107715T1; GB0021617D0; ES2288979T3; JP2004507254A; WO2002018637A2; EP1313882B1; US20060166194A1; EP1313882A2; US7759078B2; DE60128368D1; ATE361993T1; WO2002018637A3; US20080145859A1; AU2001282364A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient Krebs hat und ob der Krebs wahrscheinlich metastasiert; und sie betrifft Verfahren zur Behandlung von Krebs, insbesondere von Prostatakrebs.
Krebs ist eine ernste Erkrankung und eine der Haupttodesursachen. Zwar ist es in den letzten Jahren zu Fortschritten bezüglich der Diagnose und der Behandlung verschiedener Krebsarten gekommen, aber es besteht immer noch ein Bedarf an Verbesserungen der Diagnose und der Behandlung.
Krebs ist eine genetische Erkrankung, und in den meisten Fällen sind Mutationen in einem oder mehreren Gen(en) beteiligt. Man geht davon aus, dass es im menschlichen Genom ungefähr 60 000 Gene gibt, aber nur für eine Handvoll dieser Gene wurde gezeigt, dass sie am Krebs beteiligt sind. Es wird zwar angenommen, dass für viel mehr Gene, als man bis jetzt identifiziert hat, gefunden werden wird, dass sie am Krebs beteiligt sind, aber Fortschritte auf diesem Gebiet sind trotz der Verfügbarkeit molekularer Analysetechniken nur langsam erfolgt. Das könnte auf der unterschiedlichen Struktur und Funktion von Genen beruhen, die bis heute identifiziert wurden, was nahelegt, dass Krebsgene in vielen Formen auftreten können und viele unterschiedliche Funktionen ausüben können.
Das Prostatakarzinom ist in vielen Ländern zu einer sehr bedeutenden Erkrankung geworden, und es ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Männern in der westlichen Welt, wobei die Häufigkeit mit dem Alter signifikant zunimmt. Während der letzten 20 Jahre haben sich die Mortalitätsraten verdoppelt, und es ist jetzt die zweithäufigste Todesursache durch Krebs bei Männern in der westlichen Welt (Wingo et al. (1995) Cancer J. Clin. 45, 8-30, Mortality Statistics: Cause England and Wales, OPCS DH2 19, 1993, Her Majesty's Stationery Office). Die Prävalenz des Prostatakrebses ist in den letzten 10 Jahren um 28 % gestiegen, und diese Erkrankung macht jetzt 12 % aller Krebsfälle bei Männern in England und Wales aus (Cancer Statistics: Registrations England and Wales, OPCS MBI Nr. 22, 1994, Her Majesty's Stationery Office, Foster et al. (1999) Br. J. Urol. 83, 171-194). Für das Jahr 2018 wird erwartet, dass es die häufigste Todesursache sein wird, und das 50 % der männlichen Population unter ihm leiden werden (80 % im Alter von 80 Jahren). Hinweise aus jüngerer Zeit legen nahe, dass der Prostatakrebs auch unter jüngeren Männern zunimmt (Br. J. Cancer (1999) 79, 13-17). Diese Zunahmen und die Todesfälle vieler bekannter Persönlichkeiten durch Prostatakrebs in jüngerer Zeit haben bewirkt, dass die Aufmerksamkeit auf die Notwendigkeit gelenkt wurde, sich verstärkt um diesen Krebs zu kümmern. Es wurde behauptet, dass die bessere Verfügbarkeit von Vorsorgeuntersuchungen die Sterblichkeit durch Prostatakrebs einschränken könnte.
Die Vorsorge bezüglich Prostatakrebs besteht derzeit aus einer rektalen Untersuchung und der Bestimmung der Spiegel des prostataspezifischen Antigens (PSA). Diesen Verfahren fehlt es an Spezifität, da die digitale rektale Untersuchung stark vom jeweiligen Untersucher abhängt (Smith & Catalona (1995) Urology 45, 70-74). Die Bestimmung des prostataspezifischen Antigens (PSA) im Serum, das von den Epithelzellen der Acini und der Gänge der Prostata synthetisiert und als normaler Bestandteil der Samenflüssigkeit sekretiert wird, stellt derzeit den am häufigsten eingesetzten diagnostischen Marker des Krebses dar (z. B. Gao et al. (1997) The Prostate 31, 264-281). Die Messungen des PSA können jedoch zu inkonsistenten Informationen führen, so dass einige Patienten mit Prostatakrebs niedrige PSA-Spiegel haben, während die PSA-Spiegel beim Vorliegen einer nichtmalignen Prostataerkrankung erhöht sein können, zum Beispiel bei der benignen Prostatahyperplasie (BPH), der Prostataentzündung und anderen Erkrankungen (z. B. Mandelson et al. (1995) Annu. Rev. Public Health 16, 283-306, Flood et al. (1996) J. Gen. Int. Med. 11, 342-349, Morgan et al. (1996) The Prostate 57, 58-63, Chan & Sulmasy (1998) Am. J. Med. 108, 226-274). Das vergleichsweise schlechte Abschneiden des PSA als diagnostischer Test wurde für 366 Männer gezeigt, die Prostatakrebs entwickelten, während sie Teilnehmer der Physicians Health Study waren, einer prospektiven Studie an über 22 000 Männern. Die PSA-Spiegel wurden im Serum bestimmt, das zu Beginn der Studie eingelagert wurde, und erhöhte Spiegel wurden bei lediglich 47 % der Männer gefunden, die in den folgenden vier Jahren einen Prostatakrebs entwickelten (Gann et al. (1995) JAMA 273, 289-294).
Die derzeitigen Vorsorgeverfahren sind demnach unbefriedigend. Es gibt kein zuverlässiges Verfahren für die Diagnose des Krebses oder die Vorhersage oder Verhinderung seiner möglichen metastatischen Ausbreitung, die die Hauptursache für den Tod der meisten Patienten ist.
Grimes et al. (1995) FEBS Lett. 369, 290-294 beschreiben die differenzielle Expression der spannungsaktivierten Na⁺-Ströme in zwei Prostatatumorzelllinien, und sie diskutieren ihren Beitrag zur Invasivität in vitro. Die untersuchten Zelllinien waren Rattenzelllinien, und es liegen keine Hinweise vor, welche speziellen der Na⁺-Kanäle beteiligt sein könnten.
Laniado et al. (1997) Am. J. Pathol. 150, 1213-1221 beschreiben die Expression und funktionelle Analyse der spannungsaktivierten Na⁺-Kanäle in humanen Prostatakrebszelllinien, und sie diskutieren ihren Beitrag zur Invasion in vitro. Es liegen keine Hinweise vor, welche speziellen der Na⁺-Kanäle beteiligt sein könnten.
Smith et al. (1998) FEBS Lett. 423, 19-24 schlagen vor, dass die Expression des Na⁺-Kanal-Proteins die Invasivität von Prostatakrebszelllinien der Ratte und des Menschen erhöht.
Grimes & Djamgoz (1998) J. Cell. Physiol. 175, 50-58 beschreiben die elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung des spannungsgesteuerten Na⁺-Stroms, der in der hochmetastatischen Mat-LyLu-Zelllinie eines Prostatakrebses der Ratte exprimiert wird.
Dawes et al. (1995) Visual Neuroscience 12, 1001-1005 beschreiben die Identifizierung von Subtypen des Na⁺-Kanals, die in kultivierten Zellen des Pigmentepithels der Retina induziert werden.
Übersichtsarbeiten über die Na⁺-Kanäle finden sich zum Beispiel bei Black & Waxman (1996) Develop. Neurosci. 18, 139-152, Fozzard & Hanck (1996) Physiol. Rev. 76, 887-926, Bullman (1997) Hum. Mol. Genet. 6, 1679-1685, Cannon (1999) und Marban et al. (1998) J. Physiol. 508, 647-657. Für einige Na⁺-Kanäle und andere Ionenkanäle ist gut bekannt, dass sie von bestimmten genetischen Defekten betroffen sein können, wie bei Bullman (1997) Hum. Mol. Genet. 6, 1679-1685, Burgess et al. (1995) Nature Genet. 10, 461-465 und Cannon (1998) Mol. Neurology (J.B. Martin, Hrsg.), Scientific American Inc., New York, beschrieben wird. Derzeit wird jedoch keine Na⁺-Kanal-Sequenz für diagnostische Zwecke eingesetzt.
Somit ist es, obwohl frühere Arbeiten basierend auf der Arbeit an Zelllinien eine gewisse generelle Rolle spannungsgesteuerter Na⁺-Kanälen (voltage-gated Na⁺ channels, VGSCs) beim Prostatakrebs und seiner Metastasierung nahegelegt haben, bis jetzt nicht möglich gewesen, diese Informationen wirksam auszunützen, da die Beteiligung von VGSCs am Prostatakrebs in vivo nicht demonstriert worden ist und die am Prostatakrebs des Menschen beteiligte(n) VGSC-Form(en) nicht identifiziert worden ist bzw. sind.
Wir haben nun überraschenderweise gefunden, dass die VGSC-Expression mit der pathologischen Progression korreliert und dass der VGSC, der mit Krebs des Menschen assoziiert ist, insbesondere mit dem Prostatakrebs und seinen Metastasen, hNe-Na (auch bezeichnet als Na_v1.7) ist. Wie oben festgestellt wurde, handelt es sich dabei um einen bekannten VGSC (auch wenn bisher nicht bekannt war, dass er mit menschlichem Krebs oder menschlichen Krebszelllinien, insbesondere mit dem menschlichen Prostatakrebs, assoziiert ist), und eine Aminosäuresequenz des Proteins und die cDNA der codierenden mRNA sind berichtet worden (Klugbauer et al. (1995) EMBO J. 14, 1084-1090). hNe-Na (Mensch) und PN1 (Ratte) entsprechen dem SCN9A-Gen, wie in Beispiel 1 diskutiert wird. Kürzlich wurde eine neue VGSC-Nomenklatur eingeführt (Goldin et al. (2000) Neuron 28(2), 365-368). In diesem System sind hNe-Na und PN1 die Orthologen des Menschen bzw. der Ratte von Na_V1.7.
Die chromosomale Lokation von hNe-Na ist noch nicht bestimmt worden. Das Maus-Äquivalent wurde jedoch in dem Cluster der spannungsgesteuerten Na⁺-Kanäle auf dem Chromosom 2 der Maus lokalisiert (Beckers et al. (1997) Genomics 36, 202-205). Dieses Cluster liegt auch auf dem Chromosom 2 des Menschen vor, wo auch hNe-Na vorliegen könnte (Malo et al. (1994) Cytogen. Cell. Genet. 67, 178-186, Malo et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2975-2979, George et al. (1994) Genomics 19, 395-397). Die Intron/Exon-Organisation des hNe-Na-Gens (des humanen SCN9A) ist noch nicht bestimmt worden, aber man konnte auf sie von anderen bekannten, konservierten Intronpositionen der VGSC rückschließen (Loughey et al. (1989) Cell 58, 1143-1154, George et al. (1993) Genomics 15, 598-606, Wang et al. (1996) Genomics 34, 9-16 und Sonslova et al. (1997) Genomics 41, 201-209).
Die Na⁺-Kanäle vom Gehirn-Typ (Rattenhirn I-III (Noda et al. (1986) Nature 322, 826-828, Kayano et al. (1988) FEBS Lett. 228, 187-194), die am stärksten dem hNe-Na ähneln, unterscheiden sich über die gesamte Sequenz um 20 % (humanes Skelett 30 %, Herz 34 % Unterschied). Allerdings (i) wird, wenn ein Sequenzvergleich innerhalb spezifischer struktureller/funktioneller Domänen durchgeführt wird, diese Homologie stark vermindert (z. B. ist das erste Drittel des zytoplasmatischen Linkerbereichs DII-DIII nur zu 45 % homolog mit dem ähnlichsten Kanal (RBII/HBII); (ii) hNe-Na enthält Bereiche, die ausreichend unterschiedlich sind (z. B. die Reste 446-460: EYTSIRRSRIMGLSE), sodass spezifische Antikörper hergestellt werden können (siehe zum Beispiel Toledo-Aral et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1527-1532).
Es ist ein Ziel der Erfindung, Verfahren bereitzustellen, die für das Erstellen von Diagnosen und Prognosen für Krebs, speziell Prostatakrebs, und zur Unterstützung des Klinikers bei der Handhabung von Krebs, insbesondere des Prostatakrebses, nützlich sind. Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Beurteilung des metastatischen Potenzials von Krebs, insbesondere des Prostatakrebses bereitzustellen.
Zu weiteren Zielen der Erfindung gehören die Bereitstellung von Verfahren zur Behandlung von Krebs, insbesondere von Prostatakrebs, und Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die selektiv den VGSC, der mit dem menschlichen Krebs, insbesondere dem Prostatakrebs, assoziiert ist, hemmen, da diese Verbindungen nützlich für die Behandlung von Krebs sein könnten.
Ein erster Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Anfälligkeit eines menschlichen Patienten für Prostatakrebs bereit, das den Schritt der Bestimmung, ob eine Nukleinsäure und/oder Protein des Patienten enthaltende Probe eine Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehenden spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na enthält, umfasst, wobei eine solche Menge als die im Vergleich zu bekannten nicht-kanzerösen oder nicht-metastatischen Prostatazellen bei bekannten kanzerösen oder metastatischen Prostatazellen vorhandene erhöhte Menge definiert ist.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs bei einem menschlichen Patienten bereit, das den Schritt der Bestimmung, ob eine Nukleinsäure und/oder Protein des Patienten enthaltende Probe eine Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehenden spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na enthält, umfasst, wobei eine solche Menge als die im Vergleich zu bekannten nicht-kanzerösen oder nicht-metastatischen Prostatazellen bei bekannten kanzerösen oder metastatischen Prostatazellen vorhandene erhöhte Menge definiert ist.
Es dürfte klar sein, dass die Bestimmung, ob die Probe eine Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehenden VGSC hNe-Na enthält, als solche eine Krebsdiagnose darstellen könnte oder vom Kliniker als Unterstützung bei der Erstellung einer Diagnose verwendet werden könnte.
Zum Beispiel ist es bezüglich des Prostatakrebses nützlich, wenn der Kliniker eine histopathologische Untersuchung des Biopsiegewebes durchführt oder die Plasmaspiegel des PSA bestimmt oder eine externe digitale Untersuchung durchführt oder eine bildgebende Darstellung durchführt. Kürzlich wurde auch die Möglichkeit der Heranziehung der IGF-I-Spiegel im Blut vorgeschlagen (Chan et al. (1998) Science 279, 563-566). Es dürfte klar sein, dass der Kliniker diese und andere Faktoren gerne in Betracht ziehen und den Spiegel des besagten VGSC berücksichtigen wird, ehe er eine Diagnose stellt.
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Vorhersage der relativen Aussichten bezüglich des Verlaufs eines Prostatakrebses bei einem menschlichen Patienten bereit, das den Schritt der Bestimmung, ob eine Nukleinsäure und/oder Protein des Patienten enthaltende Probe eine Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehenden spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na enthält, umfasst, wobei eine solche Menge als die im Vergleich zu bekannten nicht-kanzerösen oder nicht-metastatischen Prostatazellen bei bekannten kanzerösen oder metastatischen Prostatazellen vorhandene erhöhte Menge definiert ist.
Somit könnte das Verfahren des dritten Aspektes der Erfindung nützlich für eine Prognose oder die Unterstützung einer Prognose sein. Das Verfahren könnte zusätzlich zu bekannten Prognoseverfahren, wie einer histopathologischen Untersuchung des Biopsiegewebes oder der Messung oder der Plasmaspiegel des PSA, einer externen digitalen Untersuchung oder einer bildgebenden Darstellung eingesetzt werden.
Es dürfte klar sein, dass die Bestimmung des Spiegels des besagten VGSC in der Probe für den Kliniker nützlich bei der Ermittlung sein wird, wie er den Krebs des Patienten handhaben soll. Zum Beispiel kann der Kliniker, da erhöhte Spiegel des besagten VGSC mit dem metastatischen Potenzial assoziiert sind, insbesondere bei einem Prostatakrebs, und mit einer Unempfindlichkeit gegenüber Androgenen assoziiert sein können, die Information bezüglich der Spiegel des besagten VGSC zur Erleichterung der Entscheidungsfindung bezüglich der Behandlung des Patienten einsetzen. Somit könnte, wenn der Spiegel des besagten VGSC ein geringes metastatisches Potenzial des besagten Prostatakrebses anzeigt, ein unnötiger radikalchirurgischer Eingriff vermieden werden. Ähnlich könnte, wenn der Spiegel des besagten VGSC ein hohes metastatisches Potenzial des besagten Prostatakrebses anzeigt, ein radikalchirurgischer Eingriff (d. h. eine Prostatektomie) die bevorzugte Behandlung darstellen.
Aus dem oben Gesagten und aus den folgenden Beispielen dürfte klar sein, dass die Bestimmung der Spiegel des besagten VGSC diagnostisch für die Vorhersage ausgenützt werden könnte, ob ein bestimmter Krebs, insbesondere ein Prostatakrebs, metastasieren wird, da angenommen wird, dass die Expression des besagten VGSC mit der möglichen zukünftigen Ausbreitung eines Tumors korreliert.
Es wird auch besonders bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Vorhersage, ob ein bestimmter Prostatakrebs metastasieren wird, eingesetzt wird.
Der Spiegel des besagten VGSC, der Krebs oder ein metastatisches Potenzial anzeigt, könnte als der erhöhte Spiegel definiert werden, von dem bekannt ist, dass er in kanzerösen oder metastatischen Prostatazellen im Vergleich zu bekannten nicht-kanzerösen oder nicht-metastatischen Prostatazellen vorliegt. Der Spiegel des Proteins des besagten VGSC könnte zum Beispiel in kanzerösen Zellen oder metastatischen Zellen wenigstens 1 1/2-fach höher sein, oder er könnte wenigstens 2-fach oder 3-fach höher sein. Die quantitative Analyse mittels einer Mikrodensitometrie immunhistochemisch aufgearbeiteter Gewebeschnitte hat gezeigt, dass die VGSC-Expression in kanzerösen Bereichen der Prostatagänge dreimal höher ist als in dem entsprechenden gutartigen Bereich (siehe Beispiel 3). Von dem eingesetzten Antikörper wird angenommen, dass er mit allen VGSC-Formen reagiert, aber unsere Befunde im Beispiel 1 zeigen, dass der Na⁺-Kanal hNe-Na wahrscheinlich in humanen Prostatakrebszellen die vorherrschende Form ist, und es scheint deshalb wahrscheinlich, dass es hauptsächlich der Na⁺-Kanal hNe-Na ist, der erkannt wird. Der Spiegel der für den besagten VGSC codierenden mRNA könnte zum Beispiel in kanzerösen Zellen oder metastatischen Zellen wenigstens 1 1/2-fach höher sein, oder er könnte wenigstens 2-fach oder 3-fach höher sein oder wenigstens 10-, 50-, 100-, 500- oder 1000-fach höher sein. Messungen mittels semiquantitativer PCR zeigen, dass der Spiegel der mRNA in den hochmetastatischen Zelllinien ungefähr 1000-fach höher ist als in den geringmetastatischen Zelllinien, wie in den Beispielen beschrieben wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird bestimmt, ob der Spiegel einer Nukleinsäure, insbesondere der mRNA, des besagten VGSC ein Spiegel ist, der mit Krebs assoziiert ist. Vorzugsweise enthält die Probe eine Nukleinsäure, wie mRNA, und der Spiegel des besagten VGSC wird gemessen, indem die besagte Nukleinsäure mit einer Nukleinsäure in Kontakt gebracht wird, die selektiv mit der Nukleinsäure des besagten VGSC hybridisiert.
Mit „selektiv hybridisieren" ist gemeint, dass die Nukleinsäure eine ausreichende Ähnlichkeit bezüglich ihrer Nukleotidsequenz mit derjenigen der besagten humanen Nukleinsäure aufweist, so dass sie mit ihr unter mäßig- oder hochstringenten hybridisieren kann. Wie in diesem Gebiet gut bekannt ist, hängt die Stringenz der Nukleinsäurehybridisierung von Faktoren wie der Länge der Nukleinsäure, über die die Hybridisierung erfolgt, dem Ausmaß der Übereinstimmung der hybridisierenden Sequenzen und von Faktoren wie der Temperatur, der Ionenstärke und dem CG- oder AT-Gehalt der Sequenz ab. Somit ist jede beliebige Nukleinsäure, die imstande ist, wie besagt selektiv zu hybridisieren, für die Durchführung der Erfindung nützlich.
Zu Nukleinsäuren, die selektiv mit der besagten humanen DNA oder cDNA hybridisieren können, gehören Nukleinsäuren, die eine > 95%ige Sequenzübereinstimmung aufweisen, vorzugsweise diejenigen mit einer > 98%igen und bevorzugter diejenigen mit einer > 99%igen Sequenzübereinstimmung bezüglich wenigstens eines Teils der Nukleinsäure mit der besagten humanen DNA oder cDNA. Wie gut bekannt ist, enthalten humane Gene gewöhnlich Introns, sodass zum Beispiel eine mRNA oder cDNA, die von einem Gen in der besagten humanen DNA stammt, nicht über ihre gesamte Länge vollständig mit der gesamten humanen DNA übereinstimmt, aber sie wäre trotzdem eine Nukleinsäure, die imstande ist, selektiv mit der besagten humanen DNA zu hybridisieren. Somit schließt die Erfindung spezifisch Nukleinsäuren ein, die mit der besagten VGSC-mRNA oder -cDNA hybridisieren, die aber möglicherweise nicht mit einem der besagten VGSC-Gene hybridisieren. Zum Beispiel kann es sein, dass Nukleinsäuren, die die Intron-Exon-Grenzen des besagten VGSC-Gens umfassen, nicht in der Lage sind, selektiv mit der besagten VGSC-cDNA zu hybridisieren.
Typische moderat oder hoch stringente Hybridisierungsbedingungen, die zu einer selektiven Hybridisierung führen, sind in diesem Gebiet bekannt, zum Beispiel diejenigen, die in Molecular Cloning, a laboratory manual, 2. Auflage, Sambrook et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA beschrieben werden, wobei diese Literaturstelle hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird.
Ein Beispiel für eine typische Hybridisierungslösung, wenn die Nukleinsäure auf einer Nylonmembran immobilisiert ist und die Nukleinsäuresonde eine Länge von ≥ 500 Basen oder Basenpaaren hat, sieht folgendermaßen aus:
6 × SSC (Natriumcitratsalinelösung)
0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS)
100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachsspermien-DNA
Die Hybridisierung wird bei 68 °C durchgeführt. Die Nylonmembran mit der immobilisierten Nukleinsäure kann bei 68 °C in 1 × SSC oder, für hohe Stringenz, bei 68 °C in 0,1 × SSC gewaschen werden.
20 × SSC kann folgendermaßen hergestellt werden: Löse 175,3 g NaCl und 88,2 g Na⁺-Citrat in 800 ml H₂O. Stelle den pH mit ein paar Tropfen einer 10-N-NaOH-Lösung auf 7,0 ein. Stelle das Volumen mit H₂O auf 1 Liter ein. Teile in Aliquots auf. Sterilisiere durch Autoklavieren.
Ein Beispiel für eine typische Hybridisierungslösung, wenn eine Nukleinsäure auf einer Nylonmembran immobilisiert ist und die Sonde ein Oligonukleotid von 15 bis 15 Basen ist, sieht folgendermaßen aus:
3,0 M Trimethylammoniumchlorid (TMACI)
0,01 M Na⁺-Phosphat (pH 6,8)
1 mM EDTA (pH 7,6)
0,5 % SDS
100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachsspermien-DNA
0,1 % entfettete Trockenmilch
Die optimale Hybridisierungstemperatur wird üblicherweise so gewählt, dass sie 5 °C unter der T_i für die gegebene Kettenlänge liegt. T_i ist die irreversible Schmelztemperatur des zwischen der Sonde und ihrer Targetsequenz gebildeten Hybrids. Jacobs et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 4637 diskutieren die Bestimmung der T_i. Die empfohlene Hybridisierungstemperatur für 17-mers in 3 M TMACI liegt bei 48–50 °C; für 19-mers liegt sie bei 55–57 °C und für 20-mers bei 58–66 °C.
In dem Begriff „Nukleinsäure, die selektiv hybridisiert" sind auch Nukleinsäuren eingeschlossen, die DNA von der besagten VGSC-mRNA DNA mittels eines beliebigen der gut bekannten Amplifizierungssysteme wie derjenigen, die detaillierter unten beschrieben werden, insbesondere der Polymerase-Kettenreakton (PCR), amplifizieren. Zu geeigneten Bedingungen für die PCR-Amplifizierung gehört die Amplifizierung in einem geeigneten 1-x-Amplifizierungspuffer.
Der 10-x-Amplifizierungspuffer besteht aus 5 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei Raumtemperatur), 15 mM MgCl₂ und 0,1 % Gelatine.
Es wird ein geeignetes Denaturierungsmittel oder -verfahren (wie ein Erhitzen auf 95 °C) zur Trennung der Stränge der doppelsträngigen DNA eingesetzt.
Geeigneterweise erfolgt der Hybridisierungsteil der Amplifizierung zwischen 37 °C und 60 °C, vorzugsweise bei 50 °C.
Auch wenn die Nukleinsäure, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, RNA oder DNA sein kann, so wird doch DNA bevorzugt. Auch wenn die Nukleinsäure, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann, so wird eine einzelsträngige Nukleinsäure unter bestimmten Bedingungen, wie in Reaktionen zur Nukleinsäureamplifizierung, bevorzugt.
Die Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, kann jede beliebige geeignete Größe haben. Für bestimmte Zwecke bezüglich einer Diagnose, einer Verwendung als Sonde und zur Amplifizierung wird es jedoch bevorzugt, dass die Nukleinsäure weniger als 10 000, bevorzugter weniger als 1000, noch bevorzugter 10 bis 100 und sogar noch bevorzugter 15 bis 30 Basenpaare (wenn die Nukleinsäure doppelsträngig ist) oder Basen (wenn die Nukleinsäure einsträngig ist) hat. Wie genauer weiter unten beschrieben werden wird, werden einsträngige DNA-Primer, die für den Einsatz in der Polymerasekettenreaktion geeignet sind, besonders bevorzugt.
Die Nukleinsäure für den Einsatz in den erfindungsgemäßen Verfahren ist eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, mit den mRNAs der besagten VGSCs zu hybridisieren. Fragmente der Gene der besagten VGSCs und cDNAs, die von der mRNA, die von den Genen der besagten VGSCs codiert wird, sind ebenfalls bevorzugte Nukleinsäuren für den Einsatz in den erfindungsgemäßen Verfahren.
Es wird besonders bevorzugt, dass die Nukleinsäure für den Einsatz in den erfindungsgemäßen Verfahren ein Oligonukleotidprimer ist, der dazu eingesetzt werden kann, einen Teil der Nukleinsäure der besagten VGSCs, insbesondere eine VGSC-mRNA, zu amplifizieren.
Die mRNA des hNe-NA ähnelt anderen VGSC-mRNAs, unterscheidet sich aber von ihnen. Nukleinsäuren für den Einsatz in der Erfindung können mit mehr als einer, z. B. allen, im Wesentlichen allen oder mit einer bestimmten Untergruppe der mRNAs der VGSCs hybridisieren. Das wird weiter in den Beispielen 1 und 2 diskutiert. So kann die Nukleinsäure für den Einsatz in der Erfindung mit einem Teil der VGSC-mRNAs hybridisieren, der für einen Abschnitt des VGSC-Polypeptids codiert, der innerhalb der VGSCs konserviert ist, z. B. die gleiche Aminosäuresequenz in allen, im Wesentlichen allen oder einer Untergruppe der VGSCs aufweist. Bevorzugte Nukleinsäuren für den Einsatz in der Erfindung sind diejenigen, die selektiv mit der hNe-Na-mRNA hybridisieren und nicht mit anderen VGSC-mRNAs hybridisieren. Derartige selektiv hybridisierende Nukleinsäuren können leicht erhalten werden, z. B. durch die Bezugnahme darauf, ob sie mit der mRNA des besagten VGSC und nicht mit anderen VGSC-mRNAs hybridisieren oder nicht.
Es können Verfahren und Nukleinsäuren, wie sie z. B. im Beispiel 1 beschrieben werden, eingesetzt werden. Insbesondere kann eine semiquantitative PCR-Technik, wie sie z. B. im Beispiel 1 beschrieben wird, eingesetzt werden.
Die Verfahren sind für Krebstypen geeignet, aber es wird bevorzugt, dass es sich bei dem Krebs um Prostatakrebs handelt.
Es wird bevorzugt, dass die Nukleinsäure aus einer Probe des Gewebes stammt, für das ein Krebsverdacht besteht oder in dem Krebs gefunden werden könnte oder tatsächlich gefunden wurde. Zum Beispiel wird es, wenn es sich bei dem Gewebe, für das ein Krebsverdacht besteht oder in dem Krebs gefunden werden könnte oder tatsächlich gefunden wurde, um die Prostata handelt, bevorzugt, dass die Probe, die die Nukleinsäure enthält, aus der Prostata des Patienten stammt. Prostataproben können durch eine chirurgische Exzision, eine Laproskopie mit Biopsie, eine Endoskopie mit Biopsie und eine bildgesteuerte Biopsie erhalten werden. Das Bild kann mittels Ultraschall oder Technetium-99-markierten Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die selektiv an die Prostata binden oder dort akkumulieren, generiert werden.
Auch wenn jede beliebige Probe, die vom Patienten stammende Nukleinsäure enthält, für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, wird bevorzugt, dass die Probe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Prostatagewebe, dem Blut, dem Urin oder dem Samen besteht. Prostatagewebe kann mittels chirurgischer Standardverfahren von einem Patienten gewonnen werden. Aus der Prostata stammende Zellen finden sich in geringer Zahl im Urin und im Blut. Zwar wird es bevorzugt, dass die Probe, die die Nukleinsäure des Patienten enthält, eine Zelle des Patienten, wie eine Prostatazelle, ist oder direkt aus dieser stammt, so ist auch eine Probe, die indirekt von einem Patienten stammt, wie eine in Kultur gezüchtete Zelle, ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen. Genauso kann, wenn die vom Patienten stammende Nukleinsäure auch physisch in der Prostata gewesen sein kann, sie alternativ von einer Nukleinsäure kopiert worden sein, die physisch im Patienten gewesen war. Das Tumorgewebe kann dem Primärtumor oder Metastasen entnommen werden, und insbesondere kann es den Rändern des Tumors entnommen werden.
Es dürfte klar sein, dass die obengenannten Verfahren für das präsymptomatische Screening eines Patienten eingesetzt werden können, der zu einer Risikogruppe für die Entstehung von Krebs gehört. Zum Beispiel können Männer, die älter als ungefähr 60 Jahre sind, ein größeres Prostatakrebsrisiko haben als Männer, die jünger als 35 Jahre sind. Ähnlich können die Verfahren für die pathologische Klassifizierung von Tumoren wie Prostatatumoren eingesetzt werden.
Es wird bevorzugt, dass, wenn das Blut, der Samen, der Lymphkreislauf oder der Urin die Quelle der Probe ist, die die vom Patienten stammende Nukleinsäure enthält, die Probe mit aus der Prostata stammenden Zellen oder aus der Prostata stammendem Gewebe angereichert ist. Die Anreicherung mit Prostatazellen kann, zum Beispiel, mittels Verfahren der Zellsortierung, wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) unter Verwendung eines prostataspezifischen Antikörpers, wie eines, der gegen das prostataspezifische Antigen (PSA) gerichtet ist, erreicht werden. Alternativ kann die Anreicherung mittels magnetischer Kügelchen oder eines anderen festen Trägers, z. B. einer Säule, die mit einem prostataspezifischen Antikörper, z. B. einem Anti-PSA-Antikörper, beschichtet ist, erreicht werden. Zu den Quellen für die besagte Probe gehören auch Biopsiematerial und Tumorproben, auch einschließlich fixierter, in Paraffin eingebetteter Proben, sowie frisches oder gefrorenes Gewebe.
Zweckmäßigerweise umfasst de Nukleinsäure, die imstande ist, selektiv mit der besagten humanen DNA zu hybridisieren, und die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, ferner eine nachweisbare Markierung.
Der Begriff „nachweisbare Markierung" schließt jede zweckmäßige radioaktive Markierung ein, wie ³²P, ³³P oder ³⁵S, die mittels gut bekannter Verfahren leicht in ein Nukleinsäuremolekül inkorporiert werden kann, und jede beliebige zweckmäßige fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung, die leicht in ein Nukleinsäuremolekül inkorporiert werden kann, ist ebenfalls eingeschlossen. Außerdem schließt der Begriff „nachweisbare Markierung" auch eine Gruppe ein, die aufgrund ihrer Bindung an eine andere Gruppe nachgewiesen werden kann (wie Biotin, das durch die Bindung an Streptavidin nachgewiesen werden kann), sowie eine Gruppe, wie ein Enzym, die aufgrund ihrer Fähigkeit nachgewiesen werden kann, eine farblose Verbindung in eine gefärbte Verbindung umzuwandeln oder umgekehrt. (Zum Beispiel kann die alkalische Phosphatase das farblose o-Nitrophenylphosphat in das farbige o-Nitrophenol umwandeln). Zweckmäßigerweise kann die Nukleinsäuresonde eine bestimmte Position in einem fixierten Assay besetzen, und ob die Nukleinsäure mit der besagten VGSC-Nukleinsäure hybridisiert, kann über den Bezug auf die Position der Hybridisierung im fixierten Assay bestimmt werden.
Es werden Primer, die für den Einsatz in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geeignet sind (Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491), bevorzugt. Geeignete PCR-Primer können die folgenden Eigenschaften aufweisen:
Es ist gut bekannt, dass die Sequenz am 5'-Ende des Oligonukleotids nicht mit der Zielsequenz, die amplifiziert werden soll, übereinstimmen muss.
Es ist üblich, dass die PCR-Primer nicht irgendwelche mit sich selbst komplementären Strukturen enthalten, die länger als 2 Basen sind, insbesondere an ihren 3'-Enden, da dieses Merkmal die Bildung eines artifiziellen Produktes, das als „Primerdimer" bezeichnet wird, fördern kann. Wenn die 3'-Enden der beiden Primer hybridisieren, bilden sie einen „primed template"-Komplex, und die Primerverlängerung führt zu einem kurzen Duplexprodukt, das als „Primerdimer" bezeichnet wird.
Interne Sekundärstrukturen sollten in Primern vermieden werden. Für die symmetrische PCR wird häufig ein G+C-Gehalt von 40–60 % für beide Primer empfohlen, wobei keine langen Abschnitte aus einer der Basen vorliegen. Die klassischen Schmelztemperaturberechnungen, die im Zusammenhang mit der Hybridisierung von DNA-Sonden durchgeführt werden, sagen oft vorher, dass ein gegebener Primer bei einer spezifischen Temperatur hybridisieren sollte, oder dass die Verlängerungstemperatur von 72 °C das Hybrid aus Primer und Matrize vorzeitig dissoziieren wird. In der Praxis sind die Hybride im PCR-Prozess wirksamer, als generell durch einfache Berechnungen der T_m vorhergesagt wird.
Die optimalen Hybridisierungstemperaturen können empirisch bestimmt werden, und sie können höher als vorhergesagt sein. Die Taq-DNA-Polymerase zeigt Aktivität im Bereich von 37–55 °C, und so kommt es während des Hybridisierungsschrittes zu einer Primerverlängerung, und das Hybrid wird stabilisiert. Die Konzentrationen der Primer sind bei der herkömmlichen (symmetrischen) PCR gleich und liegen typischerweise m Bereich von 0,1 bis 1 μM.
Es kann jedes beliebige der Protokolle zur Nukleinsäureamplifizierung eingesetzt werden, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion, der QB-Replicase- und der Ligase-Kettenreaktion. Es kann auch eine NASBA (nucleic acid sequence based amplification), die auch als 3SR bezeichnet wird, eingesetzt werden, wie es bei Compton (1991) Nature 350, 91-92 und AIDS (1993), Band 7 (Suppl. 2), S108 beschrieben wird, oder es kann eine SDA (strand displacement amplification) eingesetzt werden, wie es bei Walker et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696, beschrieben wird. Die Polymerase-Kettenreaktion wird aufgrund ihrer Einfachheit besonders bevorzugt.
Wenn ein Paar geeigneter erfindungsgemäßer Nukleinsäuren in einer PCR eingesetzt wird, ist es zweckmäßig, das Produkt durch eine Gelelektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid nachzuweisen. Als eine Alternative zum Nachweis des Produktes der DNA-Amplifikation mittels Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung der DNA ist es zweckmäßig, ein markiertes Oligonukleotid zu verwenden, das imstande ist, mit der amplifizierten DNA als Sonde zu hybridisieren. Wenn die Amplifizierung mittels einer PCR erfolgt, hybridisiert die Oligonukleotidsonde mit der zwischen den Primern liegenden Sequenz, wie sie durch die beiden Primer definiert wird. Die Oligonukleotidsonde hat vorzugsweise eine Länge zwischen 10 und 50 Nukleotiden, bevorzugter zwischen 15 und 30 Nukleotiden. Die Sonde kann mit einem Radionuklid wie ³²P, ³³P und ³⁵S mittels Standardtechniken markiert werden, oder sie kann mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden. Wenn die Oligonukleotidsonde fluoreszenzmarkiert ist, kann das amplifizierte DNA-Produkt in Lösung nachgewiesen werden (siehe zum Beispiel Balaguer et al. (1991) „Quantification of DNA sequences obtained by polymerase chain reaction using a bioluminescence adsorbent", Anal. Biochem. 195, 105-110 und Dilesare et al. (1993) „A high-sensitivity electrochemiluminescence-based detection system for automated PCR product quantitation", Bio Techniques 15, 152-157.
PCR-Produkte können auch mittels einer Sonde nachgewiesen werden, die ein Paar aus einem Fluorophor und einem Quencher aufweisen könnte oder an einem festen Träger befestigt sein könnte oder ein Biotin-Tag aufweisen könnte, oder sie könnten mittels einer Kombination aus einer Capturesonde und einer Detektorsonde nachgewiesen werden.
Paare aus einem Fluorophor und einem Quencher sind besonders für quantitative Bestimmungen von PCR-Reaktionen (z. B. RT-PCR) geeignet. Eine Fluoreszenzpolarisation unter Verwendung einer geeigneten Sonde kann ebenfalls zum Nachweis von PCR-Produkten eingesetzt werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Spiegel des Proteins des besagten VGSC gemessen. Vorzugsweise wird der Spiegel des besagten Proteins gemessen, indem das Protein mit einem Molekül in Kontakt gebracht wird, das selektiv das VGSC hNe-Na bindet.
Die vom Patienten gewonnene Probe, die das Protein enthält, ist zweckmäßigerweise eine Gewebeprobe.
Die vom Patienten gewonnene Probe, die das Protein enthält, ist zweckmäßigerweise eine Gewebeprobe, für die ein Krebsverdacht besteht oder in der Krebs gefunden werden könnte oder tatsächlich gefunden wurde. Diese Verfahren können für jeden beliebigen Krebstyp eingesetzt werden, aber sie sind besonders für den Prostatakrebs geeignet. Verfahren zur Gewinnung geeigneter Proben werden in Bezug auf frühere Verfahren beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verfahren, die den Nachweis des Proteins des besagten VGSC beinhalten, sind besonders bezüglich historischer Proben wie solcher, die in Paraffin eingebettete Schnitte von Tumorproben enthalten, nützlich.
Der Spiegel des Proteins des besagten VGSC kann in einer Probe auf jede beliebige geeignete Weise bestimmt werden. Das Beispiel 2 beschreibt den Nachweis des VGSC-Proteins, einschließlich des Proteins des VGSC hNe-Na, in Gewebeschnitten der menschlichen Prostata.
Es wird besonders bevorzugt, dass das Molekül, das selektiv an den VGSC hNe-Na bindet, ein Antikörper ist.
Antikörper, die selektiv an VGSCs oder an eine bestimmte Form oder an bestimmte Formen des VGSC binden, können zum Beispiel unter Verwendung von Peptiden hergestellt werden, die in allen oder in bestimmten VGSCs konserviert sind, oder die die Unterschiede zwischen einer Form der VGSC und den anderen Formen einschließen.
Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein. Geeignete monoklonale Antikörper können mittels bekannter Techniken hergestellt werden, zum Beispiel derjenigen, die in „Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) und in „Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J.G.R. Hurrell (CRC Press, 1982) offenbart werden, wobei beide Literaturstellen mit der entsprechenden Quellenangabe hier aufgenommen werden.
Der Spiegel des besagten VGSC, der Krebs oder das metastatische Potenzial anzeigt, kann als der erhöhte Spiegel definiert werden, der in bekannten kanzerösen oder metastatischen Prostatazellen im Vergleich zu nicht-kanzerösen oder nicht-metastatischen Prostatazellen vorliegt. Der Spiegel kann in kanzerösen oder metastatischen Zellen zum Beispiel wenigstens 1 1/2-fach höher sein, oder er kann wenigstens 2-fach oder 3-fach höher sein.
Mit „der relativen Menge des Proteins des besagten VGSC" ist die Menge des Proteins des besagten VGSC pro Masseneinheit der Gewebeprobe oder pro Zahleneinheit der Probenzellen im Vergleich zur Menge des Proteins des besagten VGSC pro Masseneinheit von bekannterweise normalem Gewebe oder pro Zahleneinheit der normalen Zellen gemeint. Die relative Menge kann unter Verwendung jeder beliebigen geeigneten Methode zur Proteinquantifizierung bestimmt werden. Insbesondere wird bevorzugt, dass Antikörper eingesetzt werden und dass die Menge des Proteins des besagten VGSC mittels Verfahren bestimmt wird, zu denen ein quantitatives Western-Blotting, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) oder eine quantitative Immunhistochemie gehören.
Weitere Techniken zur Gewinnung und Reinigung von Antikörpern sind auf diesem Gebiet gut bekannt, und beliebige derartige Techniken können gewählt werden, um die Präparationen zu erhalten, die für die in dieser Erfindung beanspruchten Verfahren nützlich sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Antikörper die Proteine der besagten VGSCs aus der Lösung immunpräzipitieren sowie mit den Proteinen der besagten VGSCs in Western-Blots oder Immunoblots oder auf Polyacrylamid-Gelen reagieren. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper die Proteine der besagten VGSCs in Paraffinschnitten oder Gefrierschnitten mithilfe immunzytochemischer Techniken nachweisen.
Zu bevorzugten Ausführungsformen bezüglich der Verfahren zum Nachweis des Proteins des besagten VGSC gehören Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), Radioimmunoassays (RIA), immunradiometrische Assays (IRMA) und immunenzymatische Assays (IEMA), einschließlich von Sandwich-Assays unter Verwendung monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper. Exemplarische Sandwich-Assays werden von David et al. in den US-Patenten Nr. 4 376 110 und 4 486 530 , die hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen werden, beschrieben.
Es dürfte klar sein, dass andere antikörperartige Moleküle in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, einschließlich zum Beispiel von Antikörperfragmenten oder -derivaten, die noch ihre antigenbindenden Stellen enthalten, von synthetischen antikörperartigen Molekülen wie einkettigen Fv-Fragmenten (ScFv) und Domänen-Antikörpern (dAbs) sowie anderen Molekülen mit antikörperartigen, antigenbindenden Motiven.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird der Spiegel des VGSC hNe-Na über die selektive Messung seiner Aktivität in der Probe bestimmt. Die Aktivität eines VGSC, zumindest des VGSC hNe-Na, in einer Probe kann durch das Dissoziieren einer Biopsie in Einzelzellen und das Bestimmen in Kultur (i) der Wirkung von Na⁺-Kanalblockern auf ihre Beweglichkeit und (ii) das Nachweisen der Aktivität des Na⁺-Kanals über elektrophysiologische Messungen bestimmt werden.
Zu bevorzugten diagnostischen Verfahren der Erfindung gehören Verfahren, die im weiten Sinne als „invasive" Verfahren und „nichtinvasive" Verfahren beschrieben werden können. Zu invasiven Verfahren gehören zum Beispiel das Entnehmen einer Biopsie für den Nachweis der Expression des Na⁺-Kanals durch, zum Beispiel, (a) die immunhistochemische Anwendung eines sequenzspezifischen Antikörpers, (b) eine In-situ-PCR mit Gewebeschnitten oder (c) die Reverse-Transcription (RT)-PCR von Epithelzellen nach ihrer Isolierung aus der Biopsie. Zu nichtinvasiven Verfahren gehören das Gewinnen von aus der Prostata stammenden Zellen aus dem Urin, dem Ejakulat oder dem Blut, die über ihre Affinität für PSA abgetrennt werden können und mittels PCR auf die Expression des Na⁺-Kanals getestet werden können.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung einer Substanz, die zur Bestimmung der Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na in einer Probe verwendet werden kann, bei der Herstellung eines Reagens zur Diagnose von Prostatakrebs bereit, wobei die Substanz eine Nukleinsäure ist, die selektiv mit der Nukleinsäure des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na hybridisiert, oder ein Molekül ist, das sich selektiv an das Protein des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na bindet, wobei das Molekül ein Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon oder ein antikörperartiges Molekül ist.
Die Substanzen, wie sie definiert wurden, sind somit in einem Verfahren zur Diagnose von Krebs nützlich.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst ein Kit aus Teilen, das für die Diagnose von Prostatakrebs nützlich ist, und das eine Substanz enthält, die zur Bestimmung der Menge des Proteins oder der Nukleinsäure des VGSC hNe-Na in einer Probe verwendet werden kann. Die Substanz kann eine Nukleinsäure sein, die selektiv mit der Nukleinsäure des VGSC hNe-Na hybridisiert, oder die Substanz kann ein Molekül sein, das selektiv an das Protein des VGSC hNe-Na bindet, oder die Substanz kann eine Substanz sein, die für die selektive Bestimmung der Aktivität des VGSC hNe-Na nützlich ist. Das Kit umfasst auch ein Mittel zur Abtrennung von Prostataepithelzellen aus einer Probe, wobei das Mittel einen prostataspezifischen Antikörper nutzt.
Vorzugsweise umfasst das Kit ferner eine Kontrollprobe, die Nukleinsäure oder Protein des VGSC hNe-Na enthält, wobei die Kontrollprobe eine Negativkontrolle sein kann (die eine Menge des Proteins oder der Nukleinsäure des VGSC enthält, die nicht mit Krebs oder einem hohen metastatischen Potenzial für Krebs assoziiert ist), oder sie kann eine Positivkontrolle sein (die eine Menge des Proteins oder der Nukleinsäure des VGSC enthält, die mit Krebs oder einem hohen metastatischen Potenzial für Krebs assoziiert ist). Das Kit kann sowohl Negativ- als auch Positivkontrollen enthalten. Das Kit kann nützlicherweise Kontrollen für das Protein oder die Nukleinsäure des VGSC hNe-Na enthalten, die unterschiedlichen Mengen entsprechen, sodass eine Kalibrierungskurve erstellt werden kann.
Das Kit umfasst ferner ein Mittel zur Abtrennung von Prostataepithelzellen aus der Probe für die Durchführung des besagten VGSC-Assays. Vorzugsweise schließt das Mittel zur Abtrennung von Prostataepithelzellen mit Anti-PSA-Antikörper beschichtete Mikrokügelchen oder Säulen ein.
Wir stellen auch ein Verfahren zur Krebsbehandlung bereit, das den Schritt des Verabreichens eines Mittels, das selektiv die Funktion des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na verhindert, an den Patienten umfasst.
Wie Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein dürfte, schließt der Begriff „verhindert" eine teilweise Verhinderung der Funktion, d. h. eine Verminderung der Funktion, ein. Somit kann die Wirkung des Mittels als eine Verminderung, vorzugsweise eine deutliche Verminderung, der beobachteten Funktion in Erscheinung treten.
Unter einem „Mittel, das selektiv die Funktion des VGSC hNe-Na verhindert", verstehen wir auch Mittel, die (a) die Expression der besagten VGSCs hemmen oder (b) die Aktivität der besagten VGSCs hemmen.
Zu Mitteln, die die Funktion der VGSC hNe-Na verhindern, können Antagonisten des epidermal growth factor (EGF) (wobei der Antagonist ein mit EGF oder seinem Rezeptor (EGFR) reagierender Antikörper sein kann) und Antagonisten anderer Wachstumsfaktoren (zum Beispiel des nerve growth factor) und Hormone (einschließlich von Androgenen) (wobei der Antagonist einem Antikörper ähnlich sein kann) gehören. So kann ein Inhibitor der EGF-Rezeptorkinase oder ein Antikörper gegen den EGF-Rezeptor die Funktion des VGSC (bei dem es sich vorwiegend um hNe-Na) handelt in einer Prostatakrebszelllinie hemmen, wie im Beispiel 4 diskutiert wird. Diese Mittel können als Mittel fungieren, die die Expression der VGSCs hNe-Na verhindern.
Zu den EGF-Antagonisten können monoklonale Antikörper gehören (zum Beispiel Cetuximab [IMC-C225]), die gegen die extrazelluläre Bindungsdomäne des EGF-Rezeptors gerichtet sind, Trastuzumab (ein monoklonaler Antikörper, der an den HER2-Rezeptor (humanen EGF-Rezeptor 2) bindet), sowie ein Inhibitor der EGF-Rezeptorkinase, zum Beispiel OSI-774, PD182905, PKI-166, CI-1033 oder ZD1839.
Zu Mitteln, die die Expression der besagten VGSCs verhindern, gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Antisenseagenzien und Ribozyme.
Antisense-Nukleinsäuren sind einsträngige Nukleinsäuren, die eine komplementäre Nukleinsäuresequenz spezifisch binden können. Durch das Binden der entsprechenden Zielsequenz wird ein RNA-RNA-, ein DNA-DNA- oder ein RNA-DNA-Duplex gebildet. Diese Nukleinsäuren werden häufig als „Antisense" bezeichnet, da sie komplementär zum Sense-Strang oder codierenden Strang des Gens sind. Kürzlich hat sich die Bildung einer Dreifachhelix, bei der das Oligonukleotid an einen DNA-Doppelstrang gebunden ist, als möglich erwiesen. Es wurde gefunden, dass Oligonukleotide Sequenzen in der großen Kerbe der DNA-Doppelhelix erkennen konnten. Dadurch wurde eine Dreifachhelix gebildet. Das legt nahe, dass es möglich ist, sequenzspezifische Moleküle zu synthetisieren, die spezifisch doppelsträngige DNA über eine Erkennung der wasserstoffbrückenbildenden Stellen in der großen Kerbe binden.
Durch das Binden der Zielnukleinsäure können die obigen Oligonukleotide die Funktion der Zielnukleinsäure hemmen. Das könnte zum Beispiel ein Ergebnis der Blockierung der Transkription, der Prozessierung, der Anfügung von Poly(A), der Replikation, der Translation oder der Förderung hemmender Mechanismen der Zellen, wie der Förderung des RNA-Abbaus, sein.
Antisenseoligonukleotide werden im Labor hergestellt und dann in Zellen eingeführt, zum Beispiel über eine Mikroinjektion oder über die Aufnahme aus dem Zellkulturmedium in die Zellen, oder sie werden in Zellen nach einer Transfektion mit Plasmiden oder Retroviren oder anderen Vektoren, die ein Antisense-Gen tragen, exprimiert. Für Antisenseoligonukleotide wurde zuerst entdeckt, dass sie in der Zellkultur die Replikation oder Expression des Rous-Sarkomvirus, des vesikulären Stomatitisvirus, des Herpes-Simplex-Virus vom Typ 1, des Simianvirus und des Grippevirus hemmen. Seitdem ist die Hemmung der Translation der mRNA durch Antisenseoligonukleotide extensiv in zellfreien Systemen untersucht worden, zu denen Kaninchen-Retikulozytenlysate und Weizenkeimextrakte gehören. Die Hemmung von Virusfunktionen durch Antisenseoligonukleotide wurde in vitro unter Verwendung von Oligonukleotiden gezeigt, die komplementär zur RNA des AIDS-HIV-Retrovirus waren (Goodchild, J., 1988, „Inhibition of Human Immundeficiency Virus Replication by Antisense Oligodeoxynucleotides", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(15) 5507-11). Die Studie von Goodchild zeigte, dass die Oligonukleotide, die am wirksamsten waren, komplementär zum Poly(A)-Signal waren. Ebenfalls wirksam waren diejenigen, die das 5'-Ende der RNA zum Ziel hatten, insbesondere die Cap-Region und die 51-untranslatierte Region in unmittelbarer Nähe der Primerbindungsstelle und an der Primerbindungsstelle. Der Cap-Bereich, die 5'-untranslatierte Region und das Poly(A)-Signal liegen in der Sequenz, die an den Enden der Retrovirus-RNA (R-Region) wiederholt wird, und die zu diesen Regionen komplementären Oligonukleotide könnten zweimal an die RNA binden.
Oligonukleotide können von zellulären endogenen Nukleasen abgebaut oder inaktiviert werden. Um diesem Problem zu begegnen ist es möglich, modifizierte Oligonukleotide einzusetzen, zum Beispiel solche, die veränderte Verknüpfungen zwischen den Nukleotiden aufweisen, wobei die natürlich vorkommenden Phosphodiesterbindungen durch eine andere Bindung ersetzt sind. Zum Beispiel zeigten Agrawal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 eine erhöhte Hemmung des HIV-1 in der Gewebekultur bei Verwendung von Oligonukleotidphosphoramidaten und -phosphorthioaten. Sarin et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451 zeigten eine erhöhte Hemmung des HIV-1 bei Verwendung von Oligonukleotidmethylphosphonaten. Agrawal et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794 zeigten eine Hemmung der HIV-1-Replikation sowohl in frisch infizierten als auch in chronisch infizierten Zellkulturen bei Verwendung von Nukleotidsequenz-spezifischen Oligonukleotidphosphorthioaten. Leither et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 berichten über die Hemmung der Replikation des Grippevirus in der Zellkultur durch Oligonukleotidphosphorthioate.
Für Oligonukleotide mit künstlichen Verknüpfungen wurde gezeigt, dass sie gegenüber einem Abbau in vivo resistent sind. Zum Beispiel berichten Shaw et al. (1991) in Nucleic Acids Res. 19, 747-750, dass ansonsten unmodifizierte Oligonukleotide resistenter gegen Nukleasen in vivo werden, wenn sie am 3'-Ende durch bestimmte Capping-Strukturen blockiert werden, und dass Oligonukleotidphosphorthioate ohne Caps in vivo nicht abgebaut werden.
Eine detaillierte Beschreibung des H-Phosphonatansatzes für die Synthese von Oligonukleosidphosphorthioaten findet sich bei Agrawal und Tang (1990) Tetrahedron Letters 31, 7541-7544, wobei der Inhalt dieser Arbeit hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird. Die Synthesen von Oligonukleosidmethylphosphonaten, Phosphordithioaten, Phosphoramidaten, Phosphatestern, verbrückten Phosphoramidaten und verbrückten Phosphorthioaten sind in diesem Gebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Agrawal und Goodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539, Nielsen et al. (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911, Jager et al. (1988) Biochemistry 27, 7237, Uznanski et al. (1987) Tetrahedron Letters 28, 3401, Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta 71, 1517, Crosstick und Vyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693, Agrawal et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405, wobei der Inhalt dieser Arbeiten hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird. Weitere Methoden zur Synthese oder Produktion sind ebenfalls möglich. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonukleotid eine Desoxyribonukleinsäure (DNA), auch wenn Ribonukleinsäure (RNA)-Sequenzen ebenfalls synthetisiert und eingesetzt werden können.
Die für die bereitgestellten Verfahren nützlichen Oligonukleotide sind vorzugsweise so konstruiert, dass sie einem Abbau durch endogene nukleolytische Enzyme widerstehen. Ein In-vivo-Abbau von Oligonukleotiden erzeugt Oligonukleotidabbauprodukte verminderter Länge. Solche Abbauprodukte werden wahrscheinlich unspezifisch hybridisieren und im Vergleich zu ihren Gegenstücken mit der vollen Länge mit geringerer Wahrscheinlichkeit wirksam sein. Deshalb ist es wünschenswert, Oligonukleotide zu verwenden, die gegenüber einem Abbau im Körper widerstandsfähig sind und die in der Lage sind, die Zielzellen zu erreichen. Die vorliegenden Oligonukleotide können resistenter gegen einen Abbau in vivo gemacht werden, indem die nativen Phosphordiesterbindungen durch eine oder mehrere interne künstliche Verknüpfung(en) zwischen den Nukleotiden ersetzt werden, zum Beispiel indem das Phosphat in der Bindung durch Schwefel ersetzt wird. Beispiele für Verknüpfungen, die eingesetzt werden können, sind Phosphorthioate, Methylphosphonate, Sulfon, Sulfat, Ketyl, Phosphordithioate, verschiedene Phosphoramidate, Phosphatester, verbrückte Phosphorthioate und verbrückte Phosphoramidate. Derartige Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung, da andere Internukleotidverknüpfungen in diesem Gebiet bekannt sind. Siehe zum Beispiel Cohen (1990) Trends in Biotechnology. Die Synthese von Oligonukleotiden, bei denen eine oder mehrere dieser Verknüpfungen die Phosphodiester-Internukleotidverknüpfungen ersetzt bzw. ersetzen, ist in diesem Gebiet gut bekannt, einschließlich der Synthesewege zur Erzeugung von Oligonukleotiden mit gemischten Internukleotidverknüpfungen.
Oligonukleotide können gegenüber einer Verlängerung durch endogene Enzyme durch ein „Capping" oder die Inkorporation ähnlicher Gruppen an den 5'- oder 3'-terminalen Nukleotiden resistent gemacht werden. Ein Reagens für ein Capping ist kommerziell als Amino-Link II^TM von Applied BioSystems Inc., Foster City, Kalifornien, erhältlich. Methoden zum Capping werden zum Beispiel bei Shaw et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750 und Agrawal et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (17) 7595-7599 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Arbeiten hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird.
Ein weiteres Verfahren zur Erzeugung von Oligonukleotiden, die resistent gegen einen Nukleaseangriff sind, besteht darin, dass sie sich „selbst stabilisieren", wie von Tang et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735 beschrieben wurde. Von-selbst-stabilisierte Oligonukleotide haben an ihren 3'-Enden Haarnadel-Schleifenstrukturen und zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber einem Abbau durch die Schlangengift-Phosphodiesterase, die DNA-Polymerase I und fötales Kälberserum. Der selbst-stabilisierte Bereich des Oligonukleotids stört die Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäuren nicht, und pharmakokinetische Studien und Stabilitätsstudien an Mäusen haben eine erhöhte In-vivo-Persistenz selbst-stabilisierter Oligonukleotide im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken gezeigt.
Gemäß dem bereitgestellten Verfahren kann die inhärente Bindungsspezifität von Antisenseoligonukleotiden, die charakteristisch für die Basenpaarung ist, durch das Begrenzen der Verfügbarkeit der Antisense-Verbindung auf ihren vorgesehenen Locus in vivo verstärkt werden, was es ermöglicht, niedrigere Dosierungen einzusetzen und systemische Wirkungen zu minimieren. Somit können Oligonukleotide lokal eingesetzt werden, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Die Konzentration der Oligonukleotide am gewünschten Locus ist viel höher, als wenn die Oligonukleotide systemisch verabreicht werden, und die therapeutische Wirkung kann unter Einsatz einer signifikant geringeren Gesamtmenge erzielt werden. Die hohe lokale Konzentration der Oligonukleotide verstärkt das Eindringen in die Zielzellen und blockiert auf effektive Weise die Translation der Zielnukleinsäuresequenzen.
Die Oligonukleotide können der betreffenden Stelle mittels jedes beliebigen Verfahrens, das für die lokal begrenzte Verabreichung eines Arzneimittels geeignet ist, zugeführt werden. Zum Beispiel kann eine Lösung der Oligonukleotide direkt in die Stelle injiziert werden oder über eine Infusion mittels einer Infusionspumpe zugeführt werden. Die Oligonukleotide können auch in eine implantierbare Vorrichtung inkorporiert werden, die, wenn sie an die gewünschte Stelle verbracht wird, es den Oligonukleotiden ermöglicht, in die umgebende Stelle abgegeben zu werden.
Die Oligonukleotide können über ein Hydrogelmaterial verabreicht werden. Das Hydrogel ist nicht entzündungsfördernd und biologisch abbaubar. Es sind mittlerweile viele derartige Materialien bekannt, einschließlich derjenigen, die aus natürlichen und synthetischen Polymeren hergestellt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform nützt das Verfahren ein Hydrogel aus, das unterhalb der Körpertemperatur flüssig ist, aber bei Körpertemperatur oder in der Nähe der Körpertemperatur geliert, wodurch ein halbfestes Hydrogel, das seine Form beibehält, gebildet wird. Bevorzugte Hydrogele sind Polymere aus sich wiederholenden Einheiten aus Ethylenoxid und Propylenoxid. Die Eigenschaften des Polymers hängen vom Molekulargewicht des Polymers und den relativen prozentualen Anteilen des Polyethylenoxids und des Polypropylenoxids im Polymer ab. Bevorzugte Hydrogele enthalten ungefähr 10 Gew.-% bis ungefähr 80 Gew.-% Ethylenoxid und ungefähr 20 Gew.-% bis ungefähr 90 Gew.-% Propylenoxid. Ein besonders bevorzugtes Hydrogel enthält ungefähr 70 % Polyethylenoxid und 30 % Polypropylenoxid. Hydrogele, die verwendet werden können, können zum Beispiel von BASF Corp., Parsippany, New Jersey, unter dem Handelsnamen Pluronic^® bezogen werden.
Bei dieser Ausführungsform wird das Hydrogel abgekühlt, bis es flüssig ist, und die Oligonukleotide werden in einer Konzentration von ungefähr 1 mg Oligonukleotid pro Gramm Hydrogel der Flüssigkeit zugemischt. Die resultierende Mischung wird dann auf die Oberfläche, die behandelt werden soll, aufgetragen, zum Beispiel durch ein Sprühen oder Aufmalen während eines chirurgischen Eingriffes oder unter Einsatz eines Katheters oder endoskopischer Verfahren. Wenn sich das Polymer erwärmt wird es unter Bildung eines Gels fest, und die Oligonukleotide diffundieren innerhalb eines Zeitraums, der durch die genaue Zusammensetzung des Gels definiert wird, aus dem Gel in die umgebenden Zellen.
Die Oligonukleotide können für die Verabreichung mittels anderer Verfahren unter Einsatz anderer Implantate formuliert sein, die kommerziell verfügbar sind oder in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben werden, einschließlich von Liposomen, Mikrokapseln und implantierbaren Vorrichtungen. Zum Beispiel können Implantate, die aus biologisch abbaubaren Materialien wie Polyanhydriden, Polyorthoestern, Polymilchsäure und Polyglykolsäure und Copolymeren von diesen, Collagen und Protein-Polymeren oder nicht-biologisch abbaubaren Materialien wie Ethylenvinylacetat (EVAc), Polyvinylacetat, Ethylenvinylalkohol und Derivaten von diesen bestehen, für die lokale Zuführung der Oligonukleotide eingesetzt werden. Die Oligonukleotide können in das Material inkorporiert werden, wenn es polymerisiert oder fest wird, und zwar mittels Schmelz- oder Lösemittelverdampfungstechniken, oder sie können mechanisch mit dem Material gemischt werden. Bei einer Ausführungsform werden die Oligonukleotide Beschichtungen für implantierbare Vorrichtungen, wie Dextran-beschichteten Kieselgelkügelchen, Stents oder Kathetern, beigemischt oder auf diese aufgetragen. Es können auch polymere Nanopartikel und biologisch abbaubare Arzneimittelträger eingesetzt werden (Mader (1998) Radiol. Oncol. 32, 89-94).
Die Dosis der Oligonukleotide hängt von der Größe der Oligonukleotide und dem Zweck, zu dem sie verabreicht werden, ab. Im Allgemeinen wird der Bereich auf der Basis der zu behandelnden Gewebeoberfläche berechnet. Die effektive Dosis des Oligonukleotids hängt auf gewisse Weise von der Länge und der chemischen Zusammensetzung des Oligonukleotids ab, liegt aber generell im Bereich von ungefähr 30 bis 3000 μg pro Quadratzentimeter Gewebeoberfläche.
Die Oligonukleotide können für eine systemische Verabreichung an den Patienten sowohl für therapeutische als auch für prophylaktische Zwecke gedacht sein. Die Oligonukleotide können auf jede beliebige wirksame Weise verabreicht werden, zum Beispiel parenteral (z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär) oder oral, nasal oder auf eine andere Weise, die es den Oligonukleotiden ermöglicht, den Blutstrom des Patienten zu erreichen und in ihm zu zirkulieren. Systemisch verabreichte Oligonukleotide werden vorzugsweise zusätzlich zu lokal verabreichten Oligonukleotiden gegeben, sind aber auch ohne eine lokale Verabreichung nützlich. Eine Dosis im Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 Gramm pro Verabreichung an einen erwachsenen Menschen ist im Allgemeinen für diesen Zweck wirksam.
Es dürfte klar sein, dass es erwünscht sein kann, die Antisenseoligonukleotide der Prostata gezielt zuzuführen. Das kann erreicht werden, indem die Antisenseoligonukleotide der Prostata verabreicht werden, oder es kann erreicht werden, indem Antisenseoligonukleotide eingesetzt werden, die mit einem Molekül assoziiert sind, das selektiv das Antisenseoligonukleotid in die Prostata lenkt. Zum Beispiel kann das Antisenseoligonukleotid mit einem Antikörper oder einem antikörperartigen Molekül assoziiert sein, das selektiv ein prostataspezifisches Antigen wie PSA bindet. Unter „assoziiert mit" verstehen wir, dass das Antisenseoligonukleotid und die auf die Prostata abzielende Einheit so assoziiert sind, dass die auf die Prostata abzielende Einheit imstande ist, das Antisenseoligonukleotid zu den Prostatazellen zu lenken.
Es dürfte klar sein, dass Antisenseagenzien auch größere Moleküle einschließen, zum Beispiel von ungefähr 100 bis mehrere hundert Basen, die an die mRNA oder Gene der besagten VGSCs binden und die Expression der mRNA oder der Gene der besagten VGSCs im Wesentlichen hemmen und die Expression des Proteins des besagten VGSC im Wesentlichen hemmen. Somit wird die Expression eines Antisensemoleküls, das im Wesentlichen komplementär zur mRNA des besagten VGSC ist, als Teil des bereitgestellten Verfahrens angesehen.
Somit werden bei diesem Ansatz synthetische Oligonukleotide mit einer Antisensesequenz gegen spezifische Regionen der (i) hNe-Na-Kanäle oder (ii) der VGSCs generell zur Blockierung der Kanalaktivität verabreicht. Details der jeweiligen synthetischen Oligonukleotide sind im Beispiel 2 angegeben. Es erscheint bemerkenswert, dass die Antisenseoligonukleotid-Technologie bereits zur Manipulation von Kaliumkanälen in vitro (Roy et al. (1996) Glia 18, 174-188) und von VGSC in vitro (Biochem. Biophys. Res. Comm. (1997) 234, 235-241) und zur Blockade neuropathischer Schmerzen (Lai et al. (1999) „Blockade of neuropathic pain by antisense targeting of tetrodotoxin-resistant sodium channels in sensory neurons", Methods in Enzymol. 314, 201-213) eingesetzt wurde.
Ein weiteres Verfahren zur Blockade der Aktivität des besagten VGSC ist die dominant-negative Suppression. Bei dieser Technik unterdrückt oder eliminiert das Produkt eines mutierten VGSC-Gens die Aktivität des entsprechenden Produktes des normalen Gens, wenn die beiden coexprimiert werden. Im Falle der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle (VGPCs), die 4 Alpha-Untereinheiten umfassen, wurde ein derartiger Ansatz, der ein stark verkürztes Genprodukt einsetzte, erfolgreich zur Unterdrückung einer funktionellen Expression von VGPCs in vitro (Tu et al. (1995) Biophys. J. 68, 147-156) und in vivo (London et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2926-2931) eingesetzt. Die verkürzte Untereinheit ist imstande, an andere VGPC-Untereinheiten zu binden, aber sie enthält nicht die Reste, die für die Funktion des Kanals erforderlich sind. Somit wird die Aktivität des „kombinierten" VGPC blockiert. Es sind verschiedene natürlich vorkommende, alternativ gespleißte Kanaluntereinheiten nachgewiesen worden, die zur Unterdrückung der VGPC-Aktivität über einen ähnlichen Mechanismus in vivo fungieren könnten (Baumann et al. (1987) EMBO J. 6, 3419-3429, Kamb et al. (1988) Neuron 1, 421-430 und Pongs et al. (1988) EMBO J. 7, 1087-1096). Wir glauben, dass der VGSC auf ähnliche Weise über eine Störung der Bildung eines funktionellen Kanals unterdrückt werden könnte. Zwar bestehen die VGSCs aus einer einzigen Alpha-Untereinheit (die vier funktionelle Domänen umfasst), aber jüngere Studien haben die spezifische Expression (während der Entwicklung des Menschen, der Maus und des Fisches) von verkürzten VGSC-Proteinen gezeigt, die nur zwei Domänen besitzen und auf dominant-negative Weise zur Steuerung der VGSC-Aktivität eingesetzt werden könnten (Plummer et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 24008-24015 und Oh & Waxman (1998) NeuroReport 9, 1267-1271).
Die größeren Moleküle können von einem beliebigen geeigneten genetischen Konstrukt exprimiert werden, wie es unten beschrieben wird, und dem Patienten verabreicht werden. Typischerweise umfasst das genetische Konstrukt, das das Antisensemolekül exprimiert, wenigstens einen Teil der cDNA oder des Gens des besagten VGSC, der funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist, der das Antisensemolekül in der Zelle, vorzugsweise der Prostatazelle, die kanzerös ist oder es werden kann, exprimieren kann.
Das genetische Konstrukt kann zwar DNA oder RNA sein, aber es wird bevorzugt, dass es DNA ist.
Vorzugsweise ist das genetische Konstrukt an eine Verabreichung an eine humane Zelle angepasst.
Vorrichtungen und Verfahren zur Einführung eines genetischen Konstrukts in eine Zelle im Körper eines Tiers sind in diesem Gebiet bekannt. Zum Beispiel können die hier bereitgestellten Konstrukte in die Tumorzellen mittels beliebiger zweckmäßiger Verfahren eingeführt werden, zum Beispiel Verfahren mit Retroviren, sodass das Konstrukt in das Genom der Tumorzelle eingefügt wird. Zum Beispiel werden bei Kuriyama et al. (1991) Cell Struc. and Func. 16, 503-510 gereinigte Retroviren verabreicht. Retroviren stellen ein potenzielles Mittel für das selektive Infizieren von Krebszellen dar, da sie sich nur in das Genom sich teilender Zellen integrieren können. Die meisten normalen Zellen, die Tumoren umgeben, liegen in einem ruhenden, nicht zur Aufnahme fähigen Stadium des Zellzyklus vor oder teilen sich zumindest viel weniger schnell als die Tumorzellen. Retrovirale DNA-Konstrukte, die für die besagten Antisenseagenzien codieren, können mittels Verfahren, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Für die Erzeugung aktiver Retroviren aus einem derartigen Konstrukt ist es üblich, eine ecotrope psi2-Verpackungszelllinie zu verwenden, die in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS) kultiviert wird. Die Transfektion der Zelllinie erfolgt zweckmäßigerweise über eine Calciumphosphat-Copräzipitation, und stabile Transformanten werden durch die Zugabe von G418 in einer Endkonzentration von 1 mg/ml selektiert (in der Annahme, dass das retrovirale Konstrukt ein neo^R-Gen enthält). Unabhängige Kolonien werden isoliert und vermehrt, und der Kulturüberstand wird abgenommen, durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und bei –70 °C gelagert. Für die Einführung des Retrovirus in die Tumorzellen ist es zweckmäßig, retroviralen Überstand, dem 10 μg/ml Polybren zugesetzt wurde, direkt zu injizieren. Für Tumoren mit einer Größe von über 10 mm im Durchmesser ist es passend, zwischen 0,1 ml und 1 ml retroviralen Überstand zu injizieren, vorzugsweise 0,5 ml.
Alternativ werden, wie es bei Culver et al. (1992) Science 256, 1550-1552 beschrieben wird, Retroviren-produzierende Zellen in den Tumor injiziert. Die so eingeführten Retrovirus-produzierenden Zellen sind genetisch so manipuliert, dass sie retrovirale Vektorpartikel produzieren, sodass eine kontinuierliche Erzeugung des Vektors im Inneren der Tumormasse in situ erfolgt. Somit können proliferierende Tumorzellen erfolgreich in vivo transduziert werden, wenn sie mit Zellen, die retrovirale Vektoren produzieren, gemischt werden.
Gegen definierte Ziele gerichtete Retroviren sind ebenfalls für den Einsatz in der Erfindung verfügbar. Zum Beispiel können Sequenzen, die spezifische Bindungsaffinitäten bewirken, gentechnologisch in bereits vorhandene virale env-Gene eingeführt werden (siehe Miller & Vile (1995) FASER. J. 9, 190-199 bezüglich einer Übersicht über diesen Vektor und andere zielgerichtete Vektoren für die Gentherapie).
Andere Verfahren beinhalten die einfache Einführung des Konstrukts in die Zelle für die Expression in dieser, und zwar entweder für eine begrenzte Zeit oder, nach der Integration in das Genom, für eine längere Zeit. Ein Beispiel für den letzteren Ansatz stellen (vorzugsweise auf Tumorzellen abzielende) Liposomen dar (Nässander et al. (1992) Cancer Res. 52, 646-653).
Immunliposomen (Antikörper-gesteuerte Liposomen) sind besonders nützlich für das Ansteuern von Tumorzelltypen, die ein Zelloberflächenprotein exprimieren, gegen das Antikörper verfügbar sind. Zum Beispiel können die Immunliposomen mit Hilfe von Antikörpern, die an das besagte VGSC binden, gesteuert werden, wie weiter unten diskutiert wird. Zur Präparation von Immunliposomen wird MPB-PE (N-[4-(p-Maleimidophenyl)butyryl]-phosphatidylethanolamin) gemäß dem Verfahren von Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288 synthetisiert. MPB-PE wird in die liposomalen Doppelschichten inkorporiert, um eine kovalente Kopplung des Antikörpers, oder eines Fragments von diesem, an die Oberfläche der Liposomen zu ermöglichen. Das Liposom wird zweckmäßigerweise mit der DNA oder einem anderen erfindungsgemäßen genetischen Konstrukt für die Zuführung zu den Zielzellen beladen, zum Beispiel durch das Herstellen der besagten Liposomen in einer Lösung der DNA oder des anderen genetischen Konstrukts, woran sich das Pressen durch Polycarbonat-Membranfilter mit Porengrößen von 0,6 μm und dann 0,2 μm mit einem Stickstoffdruck von bis zu 0,8 MPa anschließt. Nach der Extrusion wird das eingeschlossene DNA-Konstrukt über eine 45-minütige Ultrazentrifugation bei 80 000 × g vom freien DNA-Konstrukt abgetrennt. Frisch hergestellte MPB-PE-Liposomen in entgastem Puffer werden mit frisch hergestelltem Antikörper (oder einem Fragment von diesem) gemischt, und die Kopplungsreaktionen werden in einer Stickstoffatmosphäre unter dauerndem Überkopfmischen über Nacht bei 4 °C durchgeführt. Die Immunliposomen werden über eine 45-minütige Ultrazentrifugation bei 80 000 × g von nicht-konjugierten Antikörpern abgetrennt. Die Immunliposomen können intraperitoneal oder direkt in den Tumor injiziert werden.
Zu weiteren Verfahren für die Zufuhr gehören Adenoviren, die über eine Antikörper-Polylysin-Brücke externe DNA tragen (siehe Curiel, Prog. Med. Virol. 40, 1-18), und Transferrin-Polykation-Konjugate als Träger (Wagner et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414). Beim Ersten dieser Verfahren wird ein Polykation-Antikörper-Komplex mit dem hier bereitgestellten DNA-Konstrukt oder anderen genetischen Konstrukt gebildet, wobei der Antikörper spezifisch für entweder das Wildtyp-Adenovirus oder eine Adenovirusvariante ist, in die ein neues Epitop eingeführt wurde, das den Antikörper bindet. Die Polykation-Gruppe bindet die DNA über elektrostatische Wechselwirkungen mit dem Phosphatrückgrat. Das Adenovirus wird, da es unveränderte Faser- und Pentonproteine enthält, in die Zelle internalisiert und trägt das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt mit sich in die Zelle. Es wird bevorzugt, dass das Polykation Polylysin ist.
Die DNA kann auch über ein Adenovirus zugeführt werden, wobei sie im Inneren des Adenoviruspartikels vorliegt, zum Beispiel wie es unten beschrieben wird.
Beim Zweiten dieser Verfahren wird ein hocheffizientes System zur Zuführung von Nukleinsäuren, das eine Rezeptor-vermittelte Endozytose für die Einführung von DNA-Makromolekülen in Zellen einsetzt, verwendet. Das wird dadurch erreicht, dass das Eisentransportprotein Transferrin mit Polykationen konjugiert wird, die Nukleinsäuren binden. Humanes Transferrin oder das Hühnerhomologe Conalbumin oder Kombinationen von diesen werden kovalent an über eine Disulfid-Verknüpfung an das kleine DNA-bindende Protein Protamin oder an Polylysine unterschiedlicher Größe geknüpft. Diese modifizierten Transferrin-Moleküle behalten ihre Fähigkeit zur Bindung ihres zugehörigen Rezeptors bei und vermitteln einen wirksamen Eisentransport in die Zelle. Die Transferrin-Polykation-Moleküle bilden unabhängig von der Größe der Nukleinsäure (von kurzen Oligonukleotiden bis zu einer DNA von 21 Kilobasenpaaren) elektrophoretisch stabile Komplexe mit den hier bereitgestellten DNA-Konstrukten oder anderen genetischen Konstrukten. Wenn den Tumorzellen Komplexe aus Transferrin und dem Polykation und den hier bereitgestellten DNA-Konstrukten oder anderen genetischen Konstrukten zugeführt werden, wird eine hohe Expression des Konstrukts in den Zellen erwartet.
Eine hocheffiziente Rezeptor-vermittelte Zuführung der hier bereitgestellten DNA-Konstrukte oder anderen erfindungsgemäßen genetischen Konstrukte mittels der Endosomenzerstörenden Aktivität defekter oder chemisch inaktivierter Adenoviruspartikel, die mittels der Verfahren von Cotten et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6094-6098 erzeugt wurden, kann ebenfalls eingesetzt werden. Dieser Ansatz beruht anscheinend auf der Tatsache, dass Adenoviren so verändert werden, dass sie die Freisetzung ihrer DNA aus einem Endosom ohne eine Passage durch das Lysosom zulassen, und in Gegenwart von zum Beispiel Transferrin, das mit dem hier bereitgestellten DNA-Konstrukt oder anderen genetischen Konstrukt verknüpft ist, wird das Konstrukt von der Zelle über den gleichen Weg wie das Adenoviruspartikel aufgenommen.
Dieser Ansatz hat die Vorteile, dass es nicht erforderlich ist, komplexe retrovirale Konstrukte zu verwenden; es erfolgt keine permanente Modifikation des Genoms, wie sie bei einer Retrovirusinfektion vorliegt; und das zielgerichtete Expressionssystem ist mit einem zielgerichteten Zufuhrsystem gekoppelt, wodurch die Toxizität für andere Zelltypen vermindert wird.
Es kann erwünscht sein, einen Tumor lokal für einen bestimmten Zeitraum mit dem geeigneten Zuführungsvehikel, das das genetische Konstrukt umfasst, zu perfundieren. Zusätzlich oder alternativ kann das Zuführungsvehikel oder genetische Konstrukt direkt in zugängliche Tumoren injiziert werden.
Es sollte klar sein, dass „nackte DNA" und mit kationischen und neutralen Lipiden komplexierte DNA ebenfalls für das Einführen der erfindungsgemäßen DNA in Zellen des Patienten, der behandelt werden soll, nützlich sein kann. Nichtvirale Ansätze einer Gentherapie werden bei Ledley (1995) Human Gene Therapy 6, 1129-1144 beschrieben.
Alternative Systeme für eine zielgerichtete Zuführung sind ebenfalls bekannt, wie das in WO 94/10323 beschriebene System aus einem modifizierten Adenovirus, bei dem die DNA typischerweise im Inneren des Adenovirus-Partikels oder Adenovirus-artigen Partikels enthalten ist. Michael et al. (1995) Gene Therapy 2, 660-668 beschreiben eine Modifikation des Adenovirus zur Anfügung einer zellselektiven Gruppe an ein Faserprotein. Mutierte Adenoviren, die selektiv in p53-defizienten humanen Tumorzellen replizieren, wie diejenigen, die bei Bischoff et al. (1996) Science 274, 373-376 beschrieben werden, sind ebenfalls für das Einbringen des hier bereitgestellten genetischen Konstrukts in eine Zelle nützlich. Somit dürfte klar sein, dass wir ein Virus oder ein virusartiges Partikel bereitstellen, das ein genetisches Konstrukt, wies hier offenbart wird, umfasst. Zu anderen geeigneten Viren oder virusartigen Partikeln gehören das HSV, das AAV, das Vaccinia- und das Parvovirus.
Das Mittel, das die Funktion des VGSC hNe-Na selektiv verhindert, kann ein Ribozym sein, das in der Lage ist, zielgerichtet die RNA oder DNA des VGSC zu spalten. Ein Gen, das das besagte Ribozym exprimiert, kann auf im Wesentlichen die gleiche Weise und unter Einsatz im Wesentlichen der gleichen Träger, wie es für die Antisensemoleküle beschrieben wurde, verabreicht werden.
Ribozyme, die durch die Genome der hier offenbarten Viren und virusartigen Partikel codiert werden können, werden beschrieben bei Cech und Herschlag, „Site-specific cleavage of single stranded DNA", US 5 180 818 , Altman et al., „Cleavage of targeted RNA by RNAse P", US 5 168 053 , Cantin et al., „Ribozyme cleavage of HIV-1 RNA", US 5 149 796 , Cech et al., „RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods", US 5 116 742 , Been et al., „RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endonucleases and methods", US 5 093 246 und Been et al., „RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods; cleaves single-stranded RNA at specific site by transesterification", US 4 987 071 , wobei diese Literaturstellen hier alle mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen werden.
Es dürfte klar sein, dass es erwünscht sein kann, dass das Antisensemolekül oder Ribozym von einem für Prostatazellen spezifischen Promotorelement exprimiert wird. Das prostataspezifische Antigen (PSA) ist einer der Hauptproteinbestandteile des Sekrets der menschlichen Prostata. Es ist ein nützlicher Marker für den Nachweis und das Überwachen des Prostatakrebses geworden. Das für das PSA codierende Gen und sein Promotorbereich, der die prostataspezifische Expression des PSA steuert, sind beschrieben worden (Lundwall (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 161, 1151-1159, Riegman et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 159, 95-102, Brawer (1991) Acta Oncol. 30, 161-168). Somit ist der Promotor sinnvollerweise der PSA-Promotor.
Die hier bereitgestellten genetischen Konstrukte können mittels Verfahren hergestellt werden, die in diesem Gebiet gut bekannt sind.
Verschiedene Verfahren sind für die funktionsfähige Verknüpfung von DNA mit Vektoren über komplementäre kohäsive Enden entwickelt worden. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymerabschnitte zu dem DNA-Abschnitt, der in die Vektor-DNA eingefügt werden soll, gegeben werden. Der Vektor und der DNA-Abschnitt werden dann über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären homopolymeren Schwänzen unter Bildung rekombinanter DNA-Moleküle miteinander verbunden.
Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsstelle(n) enthalten, stellen ein alternatives Verfahren zur Verknüpfung des DNA-Abschnitts mit Vektoren bereit. Der durch einen Restriktionsverdau mit einer Endonuklease wie zuvor beschrieben erzeugte DNA-Abschnitt wird mit der DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4 oder der DNA-Polymerase I von E. coli behandelt, Enzymen, die überstehende, 3'-einsträngige Enden mittels ihrer 3'-5'-Exonukleaseaktivitäten entfernen und ausgesparte 3'-Enden mit ihren Polymeraseaktivitäten auffüllen.
Die Kombination dieser Aktivitäten erzeugt somit DNA-Abschnitte mit stumpfen Enden. Die Abschnitte mit den stumpfen Enden werden dann mit einem großen molaren Überschuss von Linkermolekülen in Gegenwart eines Enzyms, wie der DNA-Ligase des Bakteriophagen T4, inkubiert, das in der Lage ist, die Ligation von DNA-Molekülen mit stumpfen Enden zu katalysieren. Somit sind die Produkte der Reaktion DNA-Abschnitte, die polymere Linkersequenzen an ihren Enden tragen. Diese DNA-Abschnitte werden dann mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und in einen Expressionsvektor ligiert, der mit einem Enzym gespalten wurde, das Enden erzeugt, die mit denen des DNA-Abschnitts kompatibel sind.
Synthetische Linker enthalten verschiedene Restriktionsendonukleasestellen und können kommerziell von verschiedenen Quellen bezogen werden, zu denen International Biotechnologies Inc., New Haven, Connecticut, USA, gehört.
Eine erwünschte Art der Modifizierung der für das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden DNA ist der Einsatz der Polymerasekettenreaktion, wie es von Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491, offenbart wurde.
Bei diesem Verfahren wird die DNA, die enzymatisch amplifiziert werden soll, mit zwei spezifischen Primern flankiert, die selbst in die amplifizierte DNA inkorporiert werden. Die besagten spezifischen Primer können Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen enthalten, die für eine Klonierung in Expressionsvektoren mittels in diesem Gebiet bekannter Verfahren eingesetzt werden können.
Wir stellen auch eine mit einem genetischen Konstrukt (vorzugsweise einem DNA-Konstrukt) der vorliegenden Erfindung transformierte Wirtszelle bereit. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakterienzellen sind bevorzugte prokaryotische Wirtszellen, und typischerweise handelt es sich um einen E.-coli-Stamm, wie die E.-coli-Stämme DH5, die von Bethesda Research Laborstories Inc., Bethesda, Maryland, USA bezogen werden können, und RR1, der von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA (ATCC Nr. 31343) bezogen werden kann. Zu bevorzugten eukaryotischen Wirtszellen gehören Hefe- und Säugerzellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie diejenigen einer Fibroblasten-Zelllinie der Maus, der Ratte, des Affen oder des Menschen. Zu Hefe-Wirtszellen gehören YPH499, YPH500 und YPH501, die alle von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA bezogen werden können. Zu bevorzugten Säugetier-Wirtszellen gehören Chinese hamster ovary (CHO)-Zellen, die von der ATCC als CCL61 bezogen werden können, die NIH Swiss mouse embryo-Zellen NIH/3T3, die von der ATCC als CRL 1658 bezogen werden können, und die von Affennierenzellen abstammenden COS-1-Zellen, die von der ATCC als CRL 1650 bezogen werden können.
Die Transformation geeigneter Zellwirte mit einem hier bereitgestellten DNA-Konstrukt wird mittels gut bekannter Verfahren durchgeführt, die typischerweise vom verwendeten Vektortyp abhängig sind. Bezüglich der Transformation prokaryotischer Wirtszellen siehe zum Beispiel Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 und Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York. Die Transformation von Hefezellen wird bei Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben. Das Verfahren von Beggs (1978) Nature 275, 104-109 ist ebenfalls nützlich. Bezüglich Wirbeltierzellen können Reagenzien, die für die Transfektion derartiger Zellen nützlich sind, zum Beispiel Calciumphosphat und DEAE-Dextran oder Liposomenformulierungen, von Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA, bezogen werden.
Die Elektroporation ist ebenfalls für die Transformation von Zellen nützlich, und sie ist auf diesem Gebiet für das Transformieren von Hefezellen, Bakterienzellen und Wirbeltierzellen gut bekannt.
Beispielsweise können viele Bakterienspezies mittels der bei Luchansky et al. (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646 beschriebenen Verfahren transformiert werden, wobei diese Literaturstelle hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird. Die größte Zahl an Transformanten wird regelmäßig nach der Elektroporation der in 2,5 × PEB suspendierten Mischung aus DNA und Zellen unter Einsatz von 6250 V pro cm bei 25 μFD erhalten.
Verfahren zur Transformation von Hefe durch eine Elektroporation werden bei Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182 offenbart.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt, wie es hier offenbart wird, enthalten, können mittels gut bekannter Techniken identifiziert werden. Zum Beispiel kann man Zellen, die aus der Einführung eines Expressionskonstrukts, wie es hier offenbart wird, resultieren, zur Erzeugung des Moleküls, wie es hier definiert wird, wachsen lassen. Man kann die Zellen ernten und lysieren und ihren DNA-Gehalt mittels eines Verfahrens wie desjenigen, das von Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 oder Bereut et al. (1985) Biotech. 3, 208 beschrieben wird, auf das Vorliegen der DNA analysieren. Alternativ kann das Vorliegen des Moleküls, zum Beispiel eines Proteins, im Überstand mit Hilfe von Antikörpern nachgewiesen werden, wie es unten beschrieben wird.
Zusätzlich zu direkten Tests auf das Vorliegen der rekombinanten DNA kann eine erfolgreiche Transformation mittels gut bekannter immunologischer Verfahren bestätigt werden, wenn die rekombinante DNA in der Lage ist, die Expression des Proteins zu steuern. Zum Beispiel produzieren Zellen, die erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, Proteine, die eine geeignete Antigenität zeigen. Proben der Zellen, von denen vermutet wird, dass sie transformiert wurden, werden geerntet und mittels geeigneter Antikörper bezüglich des Proteins analysiert.
Somit stellen wir zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst eine Kultur dieser Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur abstammt, in einem Nährmedium bereit.
Wenn das genetische Konstrukt ein DNA-Konstrukt in Form eines Plasmids ist, kann es gereinigt werden. Das hier bereitgestellte DNA-Konstrukt wird mittels gut bekannter Verfahren aus der Wirtszelle gereinigt.
Beispielsweise kann eine Plasmidvektor-DNA in großem Maßstab aus geklärten Lysaten als Bande in einem CsCl-Gradienten gemäß den Verfahren von Clewell & Helinski (1970) Biochemistry 9, 4428-4440 und Clewell (1972) J. Bacteriol. 110, 667-676, präpariert werden. Die auf diese Weise extrahierte Plasmid-DNA kann über eine Dialyse gegen sterilen, pyrogenfreien Puffer durch Visking-Schlauche oder über eine Größenausschluss-Chromatographie vom CsCl befreit werden.
Alternativ kann die Plasmid-DNA aus geklärten Lysaten mittels einer Ionenaustausch-Chromatographie, zum Beispiel der bei Qiagen erhältlichen, gereinigt werden. Es kann auch eine Hydroxylapatit-Säulenchromatographie eingesetzt werden.
Wir stellen auch die Verwendung eines Mittels, das selektiv die Funktion des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na verhindert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs bereit.
Wir stellen auch ein genetisches Konstrukt bereit, das eine Nukleinsäure umfasst, die für ein Molekül codiert, das in der Lage ist, die Funktion des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na, der in einer Zelle exprimiert wird, zu verhindern.
Wie oben angemerkt wurde, kann das genetische Konstrukt RNA oder DNA sein. Das Molekül, das in der Lage ist, die Funktion des VGSC hNe-Na zu verhindern, ist zweckmäßigerweise ein Antisensemolekül oder ein Ribozym, wie oben offenbart wurde.
Die genetischen Konstrukte sind an eine Zuführung in eine menschliche Zelle adaptiert, insbesondere eine Zelle, die kanzerös ist oder in der es zum Krebs kommen kann, und ganz besonders ist das genetische Konstrukt an die Zuführung in eine Prostatazelle adaptiert. Zu den genetischen Konstrukten dieser Offenbarung gehören die oben beschriebenen viralen und nichtviralen Zuführungssysteme.
Zweckmäßigerweise wird das Molekül, wie ein Ribozym oder ein Antisensemolekül, das in der Lage ist, die Funktion eines VGSC, zum Beispiel des VGSC hNe-Na, zu verhindern, selektiv in einer Krebszelle exprimiert. Zum Beispiel kann die Expression des besagten Moleküls durch das genetische Konstrukt über einen für eine Krebszelle oder ein Gewebe selektiven Promotor erfolgen, der im Falle von Prostatakrebs der PSA-Promotor oder ein beliebiger anderer prostataspezifischer Promotor sein kann.
Wir stellen auch die genetischen Konstrukte für den Einsatz in der Medizin bereit. So werden die genetischen Konstrukte für den Einsatz in der Medizin verpackt und präsentiert.
Wir stellen auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein hier bereitgestelltes genetisches Konstrukt und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Die Träger müssen „annehmbar" in dem Sinne sein, dass sie mit dem hier bereitgestellten genetischen Konstrukt kompatibel sind und dessen Empfänger nicht schädigen. Typischerweise werden die Träger Wasser oder Saline sein, die steril und pyrogenfrei sind.
Die hier bereitgestellten genetischen Konstrukte schließen, um Missverständnissen vorzubeugen, spezifisch Viren und virusartige Partikel ein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die selektiv den spannungsgesteuerten Na⁺-Kanal hNe-Na hemmt, wobei das Verfahren umfasst (a) das Inkontaktbringen einer Testverbindung mit den besagten spannungsgesteuerten Na⁺-Kanälen und das Bestimmen, ob die besagte Verbindung hemmend wirkt, (b) das Inkontaktbringen der Testverbindung mit anderen spannungsgesteuerten Na⁺-Kanälen und das Bestimmen, ob die besagte Verbindung hemmend wirkt, und (c) das Auswählen einer Verbindung, die in (a) nennenswert hemmend wirkt, aber in (b) nicht nennenswert hemmend wirkt.
Typischerweise werden verschiedene Verbindungen, zu denen pharmakologische Agenzien mit bekannten Wirkungen auf Na⁺-Kanäle (zum Beispiel Verbindungen mit ähnlichen Wirkungen wie Tetrodotoxin) oder physiologische Agenzien (zum Beispiel Wachstumsfaktoren oder Hormone, zum Beispiel der epidermale Wachstumsfaktor oder Androgene) gehören, in verschiedenen Assays auf ihre Wirksamkeit gescreent. Zu geeigneten Assay-Formaten gehören elektrophysiologische Messungen an Zellen in Langzeitkultur in Form von Zelllinien und an Kurzzeitkulturen von Zellen, die aus Biopsien gewonnen wurden (siehe zum Beispiel Grimes & Djamgoz (1998) J. Cell. Physiol. 175, 50-58), elektrophysiologische Messungen an Oozyten, die nach einer Injektion von cDNAs rekombinant das besagte VGSC funktionell exprimieren (siehe zum Beispiel Fraser et al. (1993) in Electrophysiology, A practical approach (D. Willis, Hrsg.) IRL-Press) und In-vitro-Assays auf eine Invasion (Boyden-Kammer) (siehe zum Beispiel Grimes et al. (1995) FEBS Lett. 369, 290-294 und Smith et al. (1998) FEBS Lett. 423, 19-24). Zu geeigneten Assays können auch Messungen der Wirkungen auf die Sekretion von PSA durch Krebszelllinien gehören, wie es zum Beispiel bei Abdul & Hoosein (2001) Anticancer Res. 21, 2045-2048 beschrieben wird.
Wir stellen auch Verfahren bereit, bei denen die Behandlung auf Krebszellen abzielt, und zwar durch ein Targeting auf Zellen, die den besagten VGSC exprimieren, wie oben bezüglich des Targeting genetischer Konstrukte auf solche Zellen angemerkt wurde. Zum Beispiel können Antikörper gegen den besagten VGSC (VGSC-AKs), die mit einem Farbstoff konjugiert sind, in vivo auf die Prostatadrüse angewandt werden (z. B. Yasmuch et al. (1993) „Antibody targeted photolysis", Critical Review Revue Ther. Drug Carrier System 10, 197-252, Pogrebniak et al. (1993) „Targetted phototherapy with sensitizer-monoclonal antibody conjugate and light", Surgical Oncology 2, 31-42). Die Drüse wird dann lokal mit einer Licht/Laser-Wellenlänge bestrahlt, die dem Absorptionsmaximum des „befestigten" Farbstoffs entspricht. Die Absorption der Lichtenergie durch den Farbstoff führt zu einer lokalen Erwärmung und zum Zelltod. Auf diese Weise werden nur die markierten (d. h. metastatischen) Zellen beseitigt. Es können VGSC-AKs, die mit den folgenden Farbstoffen markiert sind, verwendet werden: Fluorescein (Pelegrin et al. (1991) „Antibody fluorescein conjugates for photoimmunodiagnosis of human colon-carcinoma in nude mice", Cancer 67, 2529-2537), Rhodamin (Haghighat et al. (1992) "Laser-dyes for experimental phototherapy of human cancer – comparison of 3 rhodamines", Laryngoscope 102, 81-87), Cyanine (Folli et al. (1994) "Antibody-indocyanin conjugates for immunophotodetection of human squamous-cell carcinoma in nude mice", Cancer Research 54, 2643-2649, Lipshutz et al. (1994) „Evaluation of 4 new carbocyanine dyes for photodynamic therapy with lasers", Laryngoscope 104, 996-1002, Haddad et al. (1998) „In vitro and in vivo effects of photodynamic therapy an murine malignant melanoma", Annals of Surgical Oncology 5, 241-247).
Somit stellen wir auch eine Verbindung bereit, die eine Gruppe umfasst, die selektiv das Protein des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na und eine weitere Gruppe bindet.
Unter „eine Gruppe, die selektiv das Protein des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na bindet, verstehen wir jede beliebige geeignete derartige Gruppe, die den besagten VGSC bindet, die aber nicht wesentlich an andere Moleküle bindet, zum Beispiel andere VGSCs. Die Verbindung mit der bindenden Gruppe ist eine, die bei der Anwendung vorzugsweise in der Lage ist, zu Bereichen mit kanzerösen Zellen, insbesondere metastatischen Krebszellen, zu gelangen, die aber im Wesentlichen nicht in anderen Bereichen, wo keine kanzerösen Zellen vorliegen, anzutreffen ist.
Vorzugsweise ist die bindende Gruppe in der Lage, den besagten VGSC mit hoher Affinität zu binden. Zum Beispiel liegt die Bindungskonstante für die Bindung der bindenden Gruppe an den besagten VGSC vorzugsweise zwischen 10^–7 und 10^–15 M. Typischerweise ist die bindende Gruppe ein Anti-hNe-Na-Antikörper. Solche Antikörper und Verfahren zur Gewinnung geeigneter Antikörper werden oben diskutiert.
Die weitere Gruppe kann jede beliebige weitere Gruppe sein, die eine nützliche Eigenschaft bezüglich der Behandlung oder der bildgebenden Darstellung oder der Diagnose von Krebs bereitstellt. Insbesondere ist die weitere Gruppe eine, die nützlich für die Abtötung oder bildgebende Darstellung von Krebszellen, insbesondere metastatischer Krebszellen, ist. Vorzugsweise ist die weitere Gruppe eine, die in der Lage ist, die Krebszellen abzutöten, auf die die Verbindung abzielt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die weitere Gruppe direkt oder indirekt zytotoxisch. Insbesondere ist die weitere Gruppe vorzugsweise direkt oder indirekt toxisch für Krebszellen, speziell für metastatische Krebszellen.
In dem Begriff „direkt zytotoxisch" soll die Bedeutung enthalten sein, dass die Gruppe eine ist, die von sich aus zytotoxisch ist. In „indirekt zytotoxisch" soll die Bedeutung enthalten sein, dass die Gruppe eine ist, die, obwohl sie selbst nicht zytotoxisch ist, zu Zytotoxizität führen kann, zum Beispiel über ihre Wirkung auf ein weiteres Molekül oder eine weitere Wirkung auf dieses.
Bei einer Ausführungsform ist die zytotoxische Gruppe ein zytotoxisches chemotherapeutisches Mittel. Zytotoxische Chemotherapeutika sind in diesem Gebiet gut bekannt.
Zu zytotoxischen chemotherapeutischen Mitteln, wie Mitteln gegen Krebs, gehören Alkylierungsmittel einschließlich von Stickstofflosts wie Mechlorethamin (NH₂), Cyclophosphamid, Ifosfamid, Melphalan (L-Sarcolysin) und Chlorambucil, Ethylenimine und Methylmelamine wie Hexamethylmelamin und Thiotepa, Alkylsulfonate wie Busulfan, Nitrosoharnstoffe wie Carmustin (BCNU), Lomustin (CCNU), Semustin (Methyl-CCNU) und Streptozocin (Streptozotocin), und Triazene wie Decarbazin (DTIC, Dimethyltriazenoimidazolcarboxamid), Antimetaboliten einschließlich von Folsäureanalogen wie Methotrexat (Amethopterin), Pyrimidinanaloge wie Fluoruracil (5-Fluoruracil, 5-FU), Floxuridin (Fluordesoxyuridin, FUdR) und Cytarabin (Cytosinarabinosid), und Purinanaloge und verwandte Inhibitoren wie Mercaptopurin (6-Mercaptopurin, 6-MP), Thioguanin (6-Thioguanin, TG) und Pentostatin (2'-Desoxycoformycin). Zu natürlichen Produkten gehören Vincaalkaloide wie Vinblastin (VLB) und Vincristin, Epipodophyllotoxine wie Etoposid und Teniposid, Antibiotika wie Dactinomycin (Actinomycin D), Daunorubicin (Daunomycin, Rubidomycin), Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin (Mithramycin) und Mitomycin (Mitomycin C), Enzyme wie L-Asparaginase und Modifikatoren biologischer Reaktionen wie Interferonalphenome. Zu sonstigen Mitteln gehören Platin-Koordinationskomplexe wie Cisplatin (cis-DDP) und Carboplatin, Anthracendione wie Mitoxantron und Anthracyclin, substituierte Harnstoffe wie Hydroxyharnstoff, Methylhydrazinderivate wie Procarbazin (N-Methylhydrazin, MIH) und Adrenolytika wie Mitotan (o,p'-DDD) und Aminoglutethimid, Taxol und Analoge/Derivate und Hormonagonisten/antagonisten wie Flutamid und Tamoxifen.
Verschiedene dieser Mittel wurden bereits früher an Antikörpern oder anderen Mitteln für eine gezielte Verabreichung befestigt, und somit können die hier bereitgestellten Verbindungen, die diese Agenzien umfassen, leicht von Fachleuten auf diesem Gebiet hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Carbodiimid-Konjugation (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159, wird hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen) zur Konjugation verschiedener Mittel, einschließlich von Doxorubicin, mit Antikörpern oder Peptiden eingesetzt werden.
Carbodiimide umfassen eine Gruppe von Verbindungen mit der generellen Formel R-N=C=N-R', wobei R und R' aliphatisch oder aromatisch sein können, und sie werden zur Synthese von Peptidbindungen eingesetzt. Das präparative Verfahren ist einfach, relativ schnell und wird unter milden Bedingungen durchgeführt. Carbodiimidverbindungen greifen Carboxygruppen an und wandeln sie in Stellen um, die mit freien Aminogruppen reagieren.
Das wasserlösliche Carbodiimid 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) ist besonders nützlich für das Konjugieren einer funktionellen Gruppe mit einer bindenden Gruppe und kann zur Konjugation von Doxorubicin mit Tumor-bindenden Peptiden eingesetzt werden. Die Konjugation von Doxorubicin mit einer bindenden Gruppe erfordert das Vorhandensein einer Aminogruppe, die vom Doxorubicin bereitgestellt wird, und einer Carboxygruppe, die von der bindenden Gruppe, zum Beispiel einem Antikörper oder Peptid, bereitgestellt wird.
Zusätzlich zur Verwendung von Carbodiimiden für die direkte Bildung von Peptidbindungen kann EDC auch zur Herstellung von aktiven Estern, wie des N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Esters, eingesetzt werden. Der NHS-Ester, der nur an Aminogruppen bindet, kann dann zur Induktion der Bildung einer Amidbindung mit der einzigen Aminogruppe des Doxorubicins eingesetzt werden. Die gemeinsame Verwendung von EDC und NHS wird üblicherweise zur Konjugation eingesetzt, um die Ausbeute des Konjugats zu erhöhen (Bauminger & Wilchek, oben, 1980).
Es können auch andere Verfahren für das Konjugieren einer funktionellen Gruppe mit einem Antikörper eingesetzt werden. Zum Beispiel kann eine Oxidation mit Natriumperiodat gefolgt von einer reduktiven Alkylierung geeigneter Reaktionspartner eingesetzt werden, wie auch eine Vernetzung mit Glutaraldehyd. Es ist allerdings bekannt, dass unabhängig von dem Verfahren, das zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen Konjugats gewählt wird, bestimmt werden muss, dass der Antikörper seine Fähigkeit zur Findung des Ziels beibehält und dass die funktionelle Gruppe ihre relevante Funktion beibehält.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist die zytotoxische Gruppe eine zytotoxische Peptid- oder Polypeptidgruppe, worunter wir jede beliebige Gruppe verstehen, die zum Zelltod führt. Zytotoxische Peptid- und Polypeptidgruppen sind in diesem Gebiet gut bekannt, und zu ihnen gehören zum Beispiel Ricin, Abrin, das Exotoxin von Pseudomonas, der Gewebefaktor und dergleichen. Methoden zu ihrer Verknüpfung mit Antikörpern sind ebenfalls in diesem Gebiet bekannt. Die Verwendung von Ricin als zytotoxisches Mittel wird bei Burrows & Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8996-9000 beschrieben, wobei diese Literaturstelle hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird, und die Verwendung des Gewebefaktors, der zu einer lokalisierten Blutgerinnung und zum Infarkt eines Tumors führt, wurde bei Ran et al. (1998) Cancer Res. 58, 4646-4653 und Huang et al. (1997) Science 275, 547-550 beschrieben. Tsai et al. (1995) Dis. Colon Rectum 38, 1067-1074 beschreiben die Konjugation der A-Kette von Abrin mit einem monoklonalen Antikörper, und das Ganze wird hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen. Weitere Ribosomen-inaktivierende Proteine werden als zytotoxische Mittel in WO 96/06641 beschrieben. Das Exotoxin von Pseudomonas kann ebenfalls als die zytotoxische Polypeptidgruppe eingesetzt werden (siehe zum Beispiel Aiello et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10457-10461, wird hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen).
Bestimmte Zytokine, wie TNFα und IL-2, können ebenfalls als zytotoxische Mittel nützlich sein.
Bestimmte radioaktive Atome können ebenfalls zytotoxisch sein, wenn sie in ausreichenden Dosen zugeführt werden. So kann die zytotoxische Gruppe ein radioaktives Atom umfassen, das bei der Anwendung dem Zielort eine ausreichende Menge Radioaktivität zuführt, sodass sie zytotoxisch wirkt. Zu geeigneten radioaktiven Atomen gehören Phosphor-32, Iod-125, Iod-131, Indium-111, Rhenium-186, Rhenium-188 oder Yttrium-90 oder jedes beliebige andere Isotop, das genügend Energie emittiert, um die benachbarten Zellen, Organellen oder Nukleinsäuren zu zerstören. Vorzugsweise werden die Isotopen und die Dichte der radioaktiven Atome in der hier bereitgestellten Verbindung so gewählt, dass eine Dosis von über 4000 cGy (vorzugsweise wenigstens 6000, 8000 oder 10 000 cGy) dem Zielort und, vorzugsweise, den Zellen am Zielort und deren Organellen, insbesondere dem Zellkern, zugeführt wird.
Das radioaktive Atom kann auf bekannte Weise an der bindenden Gruppe befestigt werden. Zum Beispiel kann EDTA oder ein anderer Chelatbildner an der bindenden Gruppe befestigt und zur Befestigung von ¹¹¹In oder ⁹⁰Y eingesetzt werden. Tyrosinreste können mit ¹²⁵I oder ¹³¹I markiert werden.
Die zytotoxische Gruppe kann ein geeignetes indirekt zytotoxisches Polypeptid sein. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das indirekt zytotoxische Polypeptid ein Polypeptid, das Enzymaktivität aufweist und ein relativ untoxisches Prodrug in ein zytotoxisches Arzneimittel umwandeln kann. Wenn die Targeting-Gruppe ein Antikörper ist, wird dieser Systemtyp häufig als ADEPT (Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy) bezeichnet. Für das System ist es erforderlich, dass die Targeting-Gruppe den enzymatischen Teil an die gewünschte Stelle im Körper des Patienten bringt (d. h. zu der Stelle, die den besagten VGSC exprimiert, wie zum Beispiel metastatische Krebszellen), und dass nach einer gewissen Zeit, die es dem Enzym ermöglicht, die Stelle zu lokalisieren, ein Prodrug verabreicht wird, das ein Substrat des Enzyms ist, wobei das Endprodukt der Katalyse eine zytotoxische Verbindung ist. Das Ziel dieses Ansatzes ist es, die Konzentration des Arzneimittels an der gewünschten Stelle zu maximieren und die Konzentration des Arzneimittels in normalen Geweben zu minimieren (siehe Senter, P.D. et al. (1988) „Anti-tumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842-4846, Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56, 531-2 und Bagshawe, K.D. et al. (1988) „A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites", Br. J. Cancer 58, 700-703).
Eindeutig kann jede beliebige genannte VGSC-bindende Gruppe anstelle eines Anti-hNe-Na-Antikörpers in diesem Typ eines Systems einer gelenkten Enzym-Prodrug-Therapie eingesetzt werden.
Das Enzym und das Prodrug des Systems unter Verwendung eines auf ein besagtes VGSC abzielenden Enzyms, wie sie hier beschrieben werden, können beliebige der bereits früher beschriebenen sein. Die zytotoxische Substanz kann ein beliebiges der existierenden Mittel gegen Krebs sein, wie ein Alkylierungsmittel, ein Mittel, das in die DNA interkaliert, ein Mittel, das ein beliebiges Schlüsselenzym, wie die Dihydrofolatreduktase, die Thymidinsynthetase, die Ribonukleotidreduktase, Nukleosidkinasen oder die Topoisomerase, hemmt, oder ein Mittel, das zum Zelltod führt, indem es mit einem beliebigen anderen Bestandteil der Zelle in Wechselwirkung tritt. Etoposid ist ein Beispiel für einen Topoisomerasehemmer.

Zu Prodrug-Systemen, über die berichtet wurde, gehören ein Phenol-Lost-Prodrug, das von einer β-Glucuronidase von E. coli aktiviert wird (Wang et al., 1992 und Roffler et al., 1991), ein Doxorubicin-Prodrug, das von einer β-Glucuronidase des Menschen aktiviert wird (Bosslet et al., 1994), weitere Doxorubicin-Prodrugs, die von einer α-Galactosidase der Kaffeebohne aktiviert werden (Azoulay et al., 1995), Daunorubicin-Prodrugs, die von einer α-D-Galactosidase der Kaffeebohne aktiviert werden (Gesson et al., 1994), ein 5-Fluoruridin-Prodrug, das von einer β-D-Galactosidase von E. coli aktiviert wird (Abraham et al., 1994), und Methotrexat-Prodrugs (z. B. Methotrexat-Alanin), die von der Carboxypeptidase A aktiviert werden (Kuefner et al., 1990, Vitols et al., 1992 und Vitols et al., 1995). Diese und andere sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Enzym	Prodrug
Carboxypeptidase G2	Derivate von L-Glutaminsäure- und Benzoesäure-Losts, Anilin-Losts, Phenol-Losts und Phenylendiamin-Losts, fluorierte Derivate von diesen
Alkalische Phosphatase	Etoposidphosphat Mitomycinphosphat
Beta-Glucuronidase	p-Hydroxyanilin-Lost-glucuronid Epirubicinglucuronid
Penicillin-V-amidase	Adriamycin-N-phenoxyacetyl
Penicillin-G-amidase	N-(4'-Hydroxyphenylacetyl)palytoxin Doxorubicin und Melphalan
Beta-Lactamase	Stickstoff-Lost-cephalosoporin-p-phenylendiamin, Doxorubicin-Derivate, Vinblastinderivat-cephalosporin, Cephalosphorin-Lost, ein Taxol-Derivat
Beta-Glucosidase	Cyanophenylmethyl-beta-D-glucopyranosiduronsäure
Nitroreduktase	5-(Azaridin-1-yl)-2,4-dinitrobenzamid
Cytosindesaminase	5-Fluorcytosin
Carboxypeptidase A	Methotrexat-alanin

(Diese Tabelle ist eine bearbeitete Form derjenigen aus Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230, aus der die vollständigen Literaturstellen für diese verschiedenen Systeme erhalten werden können. Das Taxol-Derivat wird bei Rodrigues, M.L. et al. (1995) Chemistry & Biology 2, 223) beschrieben).
Zu geeigneten Enzymen zur Bildung eines Teils des enzymatischen Abschnittes gehören Exopeptidasen, wie die Carboxypeptidasen G, G1 und G2 (für glutamylierte Lost-Prodrugs), die Carboxypeptidasen A und B (für Prodrugs auf MTX-Basis) und Aminopeptidasen (für 2-α-Aminocyl-MTC-Prodrugs), Endopeptidasen, wie z. B. Thrombolysin (für Thrombin-Prodrugs), Hydrolasen, wie Phosphatasen (z. B. die alkalische Phosphatase) oder Sulfatasen (z. B. Arylsulfatasen) (für phosphorylierte oder sulfatierte Prodrugs), Amidasen, wie Penicillinamidasen und die Arylacylamidase, Lactamasen, wie β-Lactamasen, Glycosidasen, wie die β-Glucuronidase (für β-Glucuronidanthracycline), die α-Galactosidase (für Amygdalin) und die β-Galactosidase (für β-Galactoseanthracyclin), Desaminasen, wie die Cytosindesaminase (für 5FC), Kinasen, wie die Urokinase und die Thymidinkinase (für Gancyclovir), Reduktasen, wie die Nitroreduktase (für CB1954 und Analoge), die Azoreduktase (für Azobenzol-Losts) und die DT-Diaphorase (für CB1954), Oxidasen, wie die Glucoseoxidase (für Glucose), die Xanthinoxidase (für Xanthin) und die Lactoperoxidase, DL-Racemasen, katalytische Antikörper und Cyclodextrine.
Das Prodrug ist im Vergleich zum zytotoxischen Arzneimittel relativ untoxisch. Typischerweise weist es weniger als 10 % der Toxizität, vorzugsweise weniger als 1 % der Toxizität auf, wie sie mit einem geeigneten In-vitro-Zytotoxizitätstest bestimmt wird.
Es erscheint wahrscheinlich, dass die Gruppe, die imstande ist, ein Prodrug in ein zytotoxisches Arzneimittel umzuwandeln, vom Rest der Verbindung isoliert aktiv sein wird, aber es ist erforderlich, dass sie nur dann aktiv ist, wenn (a) sie mit dem Rest der Verbindung kombiniert ist und (b) die Verbindung an Zielzellen befestigt ist, sich in deren unmittelbarer Nachbarschaft befindet oder von den Zielzellen internalisiert wurde.
Wenn jede Gruppe der Verbindung ein Polypeptid ist, können die beiden Teile mittels eines beliebigen herkömmlichen Verfahrens zur Verknüpfung von Polypeptiden miteinander verknüpft werden, wie denjenigen, die generell bei O'Sullivan et al. (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108 beschrieben werden. Zum Beispiel kann die Gruppe, die an das besagte VGSC bindet, reich an Thiolgruppen sein und die weitere Gruppe mit einem bifunktionellen Mittel umgesetzt werden, das imstande ist, mit diesen Thiolgruppen zu reagieren, zum Beispiel dem N-Hydroxysuccinimidester der Iodessigsäure (NHIA) oder N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP). Amid- und Thioetherbindungen, die zum Beispiel mit dem m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester erhalten werden, sind in vivo generell stabiler als Disulfidbindungen.
Alternativ kann die Verbindung mittels gentechnologischer Verfahren als eine Fusionsverbindung erzeugt werden, wobei ein DNA-Abschnitt bestimmte Regionen aufweist, die für die beiden Gruppen der erfindungsgemäßen Verbindung codieren, die entweder aneinandergrenzen oder durch einen Abschnitt getrennt sind, der für ein Linkerpeptid codiert, das die gewünschten Eigenschaften der Verbindung nicht zerstört. Man kann sich vorstellen, dass die beiden Abschnitte der Verbindung teilweise oder vollständig überlappen.
Die DNA wird dann zur Erzeugung eines Polypeptids, das die erfindungsgemäße Verbindung umfasst, in einem geeigneten Wirt exprimiert.
Die zytotoxische Gruppe kann ein Radiosensitizer sein. Zu Radiosensitizern gehören Fluorpyrimidine, Thymidinanaloge, Hydroxyharnstoff, Gemcitabin, Fludarabin, Nicotinamid, halogenierte Pyrimidine, 3-Aminobenzamid, 3-Aminobenzodiamid, Etanixadol, Pimonidazol und Misonidazol (siehe zum Beispiel McGinn et al. (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88, 1193-11203, 1193-11203, Shewach & Lawrence (1996) Invest. New Drugs 14, 257-263, Horsman (1995) Acta Oncol. 34, 571-587, Shenoy & Singh (1992) Clin. Invest. 10, 533-551, Mitchell et al. (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836, Iliakis & Kurtzman (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241, Brown (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993, Brown (1985) Cancer 55, 2222-2228).
Es kann auch die Einführung von Genen in Zellen diese strahlenempfindlich machen, zum Beispiel die Einführung des Gens von p53 oder von Cyclin D (Lang et al. (1998) J. Neurosurg. 89, 125-132, Coco Martin et al. (1999) Cancer Res. 59, 1134-1140).
Die weitere Gruppe kann eine sein, die bei Bestrahlung zytotoxisch wird oder eine zytotoxische Gruppe freisetzt. Zum Beispiel setzt das Bor-10-Isotop, wenn es auf geeignete Weise bestrahlt wird, α-Teilchen frei, die zytotoxisch sind (siehe zum Beispiel US 4 348 376 an Goldenberg, Primus et al. (1996) Bioconjug. Chem. 7, 532-535).
Ähnlich kann die zytotoxische Gruppe eine sein, die für eine photodynamische Therapie nützlich ist, wie Photofrin (siehe zum Beispiel Dougherty et al. (1998) J. Natl. Cancer Inst. 90, 889-905).
Die weitere Gruppe kann ein Nukleinsäuremolekül umfassen, das direkt oder indirekt zytotoxisch ist. Zum Beispiel kann das Nukleinsäuremolekül ein Antisenseoligonukleotid sein, das, nachdem es zur Zielstelle gelangt ist, imstande ist, in die Zellen einzudringen und ihren Tod zu bewirken. Das Oligonukleotid kann somit eines sein, das die Expression eines essenziellen Gens verhindert, oder eines, das zu einer Veränderung der Genexpression, die Apoptose verursacht, führt.
Beispiele für geeignete Oligonukleotide sind die gegen bcl-2 (Ziegler et al. (1997) J. Natl. Cancer Inst. 89, 1027-1036) und gegen die DNA-Polymerase α und die Topoisomerase IIα gerichteten (Lee et al. (1996) Anticancer Res. 16, 1805-1811).
Peptidnukleinsäuren können anstelle herkömmlicher Nukleinsäuren nützlich sein (siehe Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8, 113-118).
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der Antikörper in einem Zuführvehikel für die Abgabe der Nukleinsäure an das Ziel enthalten sein, z. B. einer Nukleinsäure, wie sie hier diskutiert wird. Das Zuführvehikel kann jedes geeignete Zuführvehikel sein. Es kann zum Beispiel ein Liposom sein, das die Nukleinsäure enthält, oder es kann ein Virus oder ein virusartiges Teilchen sein, das imstande ist, die Nukleinsäure abzugeben. In diesen Fällen liegt der Antikörper, der selektiv an den besagten VGSC bindet, typischerweise auf der Oberfläche des Zuführvehikels vor. Zum Beispiel kann die Gruppe, die selektiv an den besagten VGSC bindet, zum Beispiel ein geeignetes Antikörperfragment, auf der äußeren Oberfläche eines Liposoms vorliegen, und die Nukleinsäure, die zugeführt werden soll, kann im Inneren des Liposoms vorliegen. Als weiteres Beispiel wird ein viraler Vektor, wie ein retroviraler oder adenoviraler Vektor, so konstruiert, dass die Gruppe, die selektiv an den besagten VGSC bindet, an der Oberfläche des Viruspartikels befestigt oder in ihr lokalisiert ist, was es dem Viruspartikel ermöglicht, zielgerichtet der gewünschten Stelle zugeführt zu werden. Systeme für eine zielgerichtete Zuführung sind ebenfalls bekannt, zum Beispiel das oben diskutierte modifizierte Adenovirussystem.
Es können Immunliposomen (Antikörper-gesteuerte Liposomen) verwendet werden, bei denen die Einheit, die selektiv an den besagten VGSC bindet, ein Antikörper ist. Die Präparation von Immunliposomen wird oben beschrieben.
Die dem Zielort zugeführte Nukleinsäure kann jede geeignete DNA sein, die direkt oder indirekt zur Zytotoxizität führt. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure für ein Ribozym codieren, das für die Zelle zytotoxisch ist, oder sie kann für ein Enzym codieren, das in der Lage ist, ein im Wesentlichen untoxisches Prodrug in ein zytotoxisches Arzneimittel zu überführen. (Dieses letztere System wird manchmal als GDEPT, Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy, bezeichnet.)
Ribozyme, die durch die Nukleinsäure, die dem Zielort zugeführt werden soll, codiert werden können, werden in den oben zitierten Literaturstellen beschrieben. Zu geeigneten Targets für Ribozyme gehören Transkriptionsfaktoren wie c-fos und c-myc und bcl-2. Durai et al. (1997) Anticancer Res. 17, 3307-3312 beschreiben ein Hammerhead-Ribozym gegen bcl-2.
EP 0 415 731 beschreibt das GDEPT-System. Für das GDEPT-System gelten ähnliche Überlegungen bezüglich der Wahl des Enzyms und des Prodrug wie beim oben beschriebenen ADEPT-System.
Die dem Zielort zugeführte Nukleinsäure kann für ein direkt zytotoxisches Polypeptid codieren.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die weitere, in der hier bereitgestellten Verbindung enthaltene Gruppe eine leicht nachweisbare Gruppe.
Mit dem Begriff „leicht nachweisbare Gruppe" meinen wir, dass die Gruppe eine ist, die, wenn sie nach der Verabreichung der Verbindung an einen Patienten am Zielort lokalisiert ist, nachgewiesen werden kann, typischerweise auf nichtinvasive Weise von außerhalb des Körpers, wodurch der Zielort lokalisiert werden kann. Somit sind die Verbindungen für die bildgebende Darstellung und die Diagnose nützlich.
Typischerweise ist die leicht nachweisbare Gruppe ein radioaktives Atom oder umfasst ein radioaktives Atom, das für eine bildgebende Darstellung nützlich ist. Zu geeigneten radioaktiven Atomen gehören Technetium-99m oder Iod-123 für szintigraphische Untersuchungen. Zu weiteren leicht nachweisbaren Gruppen gehören zum Beispiel Spinlabels für ein Magnetresonanz-Imaging (MRI), wie wiederum Iod-123, Iod-131, Indium-111, Fluor-19, Kohlenstoff-13, Stickstoff-15, Sauerstoff-17, Gadolinium, Mangan oder Eisen. Es ist klar, dass die Verbindung ausreichende Mengen der geeigneten Isotope enthalten muss, wenn das Molekül leicht nachweisbar sein soll.
Die radioaktiven oder anderen Markierungen können mittels bekannter Verfahren in die Verbindung inkorporiert werden. Wenn zum Beispiel die bindende Gruppe ein Polypeptid ist, dann kann es biologisch synthetisiert werden, oder er kann über eine chemische Aminosäuresynthese unter Verwendung geeigneter Aminosäurevorläufer, die zum Beispiel Fluor-19 anstelle von Wasserstoff enthalten, synthetisiert werden. Markierungen wie ^99mTc, ¹²³I, ¹⁸⁶Rh, ¹⁸⁸Rh und ¹¹¹In können zum Beispiel über Cysteinreste in der bindenden Gruppe angebracht werden. Yttrium-90 kann über einen Lysinrest angebracht werden. Das IODOGEN-Verfahren (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) kann zur Inkorporation von Iod-123 eingesetzt werden. Eine Literaturstelle („Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J.-F. Chatal, CRC Press, 1989) beschreibt detailliert andere Verfahren.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die weitere Gruppe imstande, selektiv an eine direkt oder indirekt zytotoxische Gruppe oder an eine leicht nachweisbare Gruppe zu binden. Somit kann bei dieser Ausführungsform die weitere Gruppe eine beliebige Gruppe sein, die an eine weitere Verbindung oder Komponente bindet, die zytotoxisch oder leicht nachweisbar ist.
Die weitere Gruppe kann deshalb ein Antikörper sein, der selektiv an die weitere Verbindung oder Komponente bindet, oder sie kann eine andere bindende Gruppe sein, wie Streptavidin oder Biotin oder dergleichen. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Molekültypen, die hier offenbart werden; andere derartige Moleküle dürften für Fachleute auf der Basis des hier Gesagten offensichtlich sein.
Ein bispezifischer Antikörper, bei dem eine Bindungsstelle die Gruppe umfasst, die selektiv an den besagten VGSC bindet, und die zweite Bindungsstelle eine Gruppe umfasst, die zum Beispiel ein Enzym bindet, das imstande ist, ein im Wesentlichen untoxisches Prodrug in ein zytotoxisches Arzneimittel zu überführen.
Die Verbindung kann ein Antikörper sein, der selektiv an den besagten VGSC bindet und an den Biotin gebunden ist. Avidin oder Streptavidin, das mit einer leicht nachweisbaren Markierung markiert worden ist, kann zusammen mit dem Biotin-markierten Antikörper in einem zweiphasigen System zur bildgebenden Darstellung eingesetzt werden, wobei der Biotin-markierte Antikörper zunächst zum Zielort im Patienten gebracht wird und dann dem Patienten das markierte Avidin oder Streptavidin verabreicht wird. Systeme aus bispezifischen Antikörpern und Biotin/Streptavidin (Avidin) werden in einer Übersichtsarbeit von Rosebrough (1996) Q J Nucl. Med. 40, 234-251 dargestellt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Gruppe, die selektiv an den besagten VGSC bindet, und die weitere Gruppe Polypeptide, die fusioniert sind.
Wir stellen auch ein Nukleinsäuremolekül bereit, das für eine hier offenbarte Verbindung codiert.
Wir stellen auch eine Verbindung für den Einsatz in der Medizin bereit. Typischerweise ist die Verbindung verpackt und wird als ein Medikament oder ein Mittel für die bildgebende Darstellung oder als ein diagnostisches Mittel für den Einsatz an einem Patienten präsentiert.
Wir stellen auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine hier offenbarte Verbindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Typischerweise sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Formulierungen für eine parenterale Verabreichung gedacht, insbesondere für eine intravenöse Verabreichung.
Zu Formulierungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, gehören wässrige und nichtwässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, bakteriostatische Mittel und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers machen, sowie wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel enthalten können.
Wir stellen auch die Verwendung einer hier offenbarten Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Diagnose eines menschlichen Patienten mit Krebs oder mit dem Risiko einer Krebsentstehung bereit.
Wir stellen auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bereit, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge einer hier offenbarten Verbindung an den menschlichen Patienten umfasst, wobei die weitere Gruppe der Verbindung eine ist, die entweder direkt oder indirekt von therapeutischem Nutzen für den Patienten ist.
Wir stellen auch ein Verfahren zur bildgebenden Darstellung von Krebs bereit (das nützlich zur Bestimmung der Anfälligkeit eines menschlichen Patienten für Krebs oder für das Diagnostizieren von Krebs bei einem menschlichen Patienten oder das Vorhersagen der relativen Aussichten eines bestimmten klinischen Verlaufs eines Krebses nützlich sein könnte) bei einem menschlichen Patienten bereit, das das Verabreichen einer wirksamen Menge einer hier offenbarten Verbindung an den Patienten umfasst, wobei die weitere Gruppe der Verbindung eine ist, die eine leicht nachweisbare Gruppe umfasst.
Es dürfte klar sein, dass der zeitliche Ablauf der Verabreichung in Abhängigkeit von der jeweiligen Verbindung, die in der Behandlung, der bildgebenden Darstellung oder der Diagnose eingesetzt wird, unterschiedlich sein kann, und dass die Zahl der weiteren Komponenten, die in den hier offenbarten therapeutischen Systemen eingesetzt werden, unterschiedlich sein kann.
Zum Beispiel kann es in dem Falle, dass die Verbindung eine leicht nachweisbare Gruppe oder eine direkt zytotoxische Gruppe umfasst, sein, dass nur die Verbindung, in einer geeigneten Formulierung, dem Patienten verabreicht. Natürlich können andere Mittel, wie Immunsuppressiva und dergleichen, verabreicht werden.
Bezüglich der Verbindungen, die nachweisbar markiert sind, erfolgt die bildgebende Darstellung, sobald die Verbindung an der Targetstelle angekommen ist.
Wenn die Verbindung jedoch eine ist, die eine weitere Komponente benötigt, um für die Behandlung, die bildgebende Darstellung oder die Diagnose nützlich zu sein, kann man die Verbindung verabreichen, warten, bis sie die Zielstelle erreicht hat und danach zu einem geeigneten Zeitpunkt die weitere Komponente verabreichen.
Zum Beispiel wird bezüglich der obigen ADEPT- und ADEPT-artigen Systeme die Verbindung mit der bindenden Gruppe und der Enzymgruppe verabreicht, und sie erreicht dann die Zielstelle. Sobald das erfolgt ist, wird das Prodrug verabreicht.
Ähnlich kann zum Beispiel im Hinblick auf die Verbindungen, bei denen die in der Verbindung enthaltene weitere Gruppe eine ist, die eine weitere Komponente bindet, zunächst die Verbindung verabreichen, man lässt sie an der Zielstelle ankommen, und anschließend wird die weitere Komponente verabreicht.
So wird bei einer Ausführungsform dem Patienten ein Biotin-markierter Anti-hNe-Na-Antikörper verabreicht, und nach einer geeigneten Zeit wird ein nachweisbar markiertes Streptavidin verabreicht. Nachdem das Streptavidin an den Stellen angekommen ist, an die der Antikörper gebunden hat (d. h. den Zielstellen), wird die bildgebende Darstellung durchgeführt.
Es wird angenommen, dass die hier offenbarten Verbindungen, bei denen die weitere Gruppe eine leicht nachweisbare Gruppe ist, für die Bestimmung des metastatischen Status der Krebszellen nützlich sein können. Das könnte ein wichtiger Faktor sein, der die Art und das Ergebnis einer zukünftigen Therapie beeinflusst.
Wir stellen auch ein Kit aus Teilen (oder ein therapeutisches System) bereit, das umfasst (1) eine hier offenbarte Verbindung, wobei die weitere Gruppe eine zytotoxische Gruppe ist, die in der Lage ist, ein relativ untoxisches Prodrug in ein zytotoxisches Arzneimittel zu überführen, und (2) ein relativ untoxisches Prodrug. Das Kit aus Teilen kann jede bzw. jedes beliebige der hier offenbarten Verbindungen und geeigneten Prodrugs, wie sie her beschrieben werden umfassen.
Wir stellen auch ein Kit aus Teilen (oder ein therapeutisches System) bereit, das umfasst (1) eine hier offenbarte Verbindung, wobei die weitere Gruppe in der Lage ist, selektiv an eine direkt oder indirekt zytotoxische Gruppe oder an eine leicht nachweisbare Gruppe zu binden, und (2) eine beliebige einer direkt oder indirekt zytotoxischen Gruppe oder einer leicht nachweisbaren Gruppe, an die die weitere Gruppe der Verbindung binden kann.
Zum Beispiel kann ein Kit aus Teilen einen mit Biotin markierten Anti-hNe-Na-Antikörper und ein mit einer leicht nachweisbaren Markierung, wie sie oben definiert wurde, markiertes Streptavidin enthalten.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf das folgende, nichteinschränkende Beispiel und die Figuren beschrieben.
1 Polynomische Anpassungen dritten Grades an die Daten der PN1-VGSCα-Bildanalyse. Es sind die Anpassungen an die drei mit dem ersten MAT-LyLu-Extrakt durchgeführten Wiederholungen gezeigt. Die Masse des PCR-Produkts (in Nanogramm) ist gegen die Zahl der PCR-Zyklen aufgetragen. Das obere Insert zeigt die Gelbilder, aus denen die Daten stammen. Repräsentative Zahlen der PCR-Zyklen für bestimmte Banden sind über den Gelen angegeben.
2 Details der in den Prostatakrebszellen gefundenen Spleißvarianten von VGSCα. Es sind die aus spezifischen PCR-Tests bestimmten Spleißvarianten der Produkte des (a) SCN2A-, (b) SCN3A-, (c) SCN8A- und (d) SCN9A-Gens, die in Zelllinien der Ratte (RB2 und PN1) und des Menschen (HB2, HB3, hNa6 und hNe-Na) gefunden wurden, gezeigt. Typische SQT-PCR-Gelbilder sind links dargestellt; idealisierte Banden, die jedes PCR-Produkt repräsentieren, sind an der Seite dargestellt. Eine schematische Darstellung der einem jeden Produkt entsprechenden Strukturmerkmale ist rechts gezeigt, und es ist die Produktgröße (in Nukleotiden) angegeben. Die Lage der Intronpositionen (unterschiedlich schattierte Bereiche stehen für unterschiedliche Exons) und die Positionen der PCR-Primer (Pfeile) bezüglich der normalen Domänenstruktur der VGSCαs sind ebenfalls gezeigt. Repräsentative Zahlen der PCR-Zyklen für bestimmte Banden sind über den Gelen angegeben. N und A bezeichnen neonatale bzw. adulte alternativ gespleißte Exons. Δ bezeichnet Produkte, bei denen beide alternativ gespleißten Exons fehlen.
3 SQT-PCR-Gelbilder für die VGSCαs der Ratte. Es sind die SQT-PCRs für (a) PN1, (b) SCL-11, (c) RB1, (d) rSkM1, (e) RB2 und (f) NaN/SNS2 und (g) die rCytb₅R-Kontrolle gezeigt. Repräsentative Zahlen für die PCR-Zyklen für bestimmte Banden sind über den Gelen angegeben. In jeder Abbildung stammte der obere Kasten von MAT-LyLu-Zellextrakten und der untere Kasten von AT-2-Extrakten.
4 SQT-PCR-Gelbilder für die humanen VGSCαs. Es sind die SQT-PCRs für (a) hNe-Na, (b) hNa6, (c) HB2 und (d) HB3 und (e) die hCytb₅R-Kontrolle sowie die (f) neonatalen und die (g) adulten Spleißvarianten hNa6 gezeigt. Repräsentative Zahlen für die PCR-Zyklen für bestimmte Banden sind über den Gelen angegeben. In jeder Abbildung stammte der obere Kasten aus PC-3-Zellextrakten und der untere Kasten aus LNCaP-Zellextrakten.
5 Vorgeschlagene Expressionsniveaus der verschiedenen „funktionellen VGSCα"-mRNAs in den stark (weiße Säulen) und schwach (schwarze Säulen) metastatischen Prostatakrebszelllinien. In jedem Falle bezeichnet die vertikale Achse das ungefähre Expressionsniveau bezüglich der Spiegel an funktionellem VGSCα in dem stark metastatischen Gegenstück (MAT-LyLu und PC-3 für Rattenzellen bzw. humane Zellen). Die Expressionsniveaus wurden aus degenerierten Screens unter Verwendung von RB1 (Ratte) und hCytb₅R (Mensch) als Standards bestimmt. Die relative Häufigkeit der mRNAs der funktionellen VGSCα könnte für VGSCαs, die in multiplen Spleißformen exprimiert werden (vor allem HB2, von dem ein hoher Anteil in der ΔHB2-Form vorhanden ist), leicht überschätzt sein.
6 Schnitte der humanen Prostata in unterschiedlichen pathologischen Stadien, immunhistochemisch gefärbt mit einem VGSC-Antikörper. A. Benigne Prostatahyperplasie. B. Low-Grade-PIN. I, Lumen, s, Stroms. C. High-Grade-PIN. D. Maligner Tumor in situ – InsM. E. Invasive Krebszellen – InvCs (es sind verschiedene, mit Pfeilen bezeichnet Beispiele gezeigt). Immunhistochemische Verfahren wurden auf klinische Proben angewendet, die in 10 % Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet worden waren. Es wurden Schnitte von 10 verschiedenen Patienten unterschiedlichen Alters und mit unterschiedlichen Gleason-Gradings eingesetzt. Die Schnitte wurden, nachdem sie zur Freilegung der Antigene im Mikrowellenofen behandelt worden waren, mit einem Na⁺-Kanal-Antikörper (Upstate BioTechnology Inc.) behandelt, bei dem es sich um einen Peptid-Antikörper handelt, der jeden Typ des Wirbeltier-VGSC erkennt (England et al. (1991) Brain Res. 548, 334-337). Die Schnitte wurden zunächst mit diesem Antikörper (2 μg/ml) bei 4 °C über Nacht behandelt. Zum Nachweis des Signals wurden ein biotinylierter sekundärer Antikörper, ein Avidin-Biotin-Komplex und Diaminobenzidin als Chromogen eingesetzt. Für das Blocking der sekundären Bindungsstellen wurde Serum des Wirtes des sekundären Antikörpers eingesetzt. Es wurden zwei unterschiedlichen Typen von Negativkontrollen mitgeführt: (1) der primäre Antikörper wurde weggelassen, (2) der primäre Antikörper wurde mit dem immunisierenden Peptid präadsorbiert. In beiden Fällen wurde keine VGSC-Färbung gesehen. Für die quantitative Analyse wurden die Bilder mit einer 3-Farben-codierten Digitalkamera (Pixera Corporation, Los Gatos, Kalifornien, USA) aufgenommen, wobei ein Nikon-Mikroskop und ein Apple-Mac-Computer eingesetzt wurden. Messungen der optischen Dichte erfolgten mittels eines Bildanalyseprogrammes (OPTIMAS, Version 5.2 (Stemmer, Deutschland)). Der Maßstabsbalken entspricht 13,5 μm.
7 Ausrichtung der Aminosäuresequenzen der YJ1/YJ2C-Region der Wirbeltier-VGSCαs. Die Ausrichtung wurde mittels der MEGALIGN-Software von Lasergene durchgeführt. Alle Sequenzen wurden mittels des Clustal-Verfahrens (PAM 20 Weight Table) ausgerichtet. Konservierte Reste sind in Kästchen und schattiert dargestellt. Die Zugangsnummern der Sequenzen sind die Folgenden: PN1 (GB: U79568); Schwann-Zelle, Kaninchen (GB: U35238); hNe-Na (PIR: S54771); Aal (GB: X01119); SKM1, Pferd (GB: U25990); hSkM1 (GB: M81758); rSkM1 (GB: M26643); mNav2.3, Maus (PIR: A55138); SCL-11 (GB: Y09164); hNav2.1 (GB: M91556); RB1 (SW: PO4774); HB1 (GB: 571446); RB3 (SW: P08104); HB3 (GB: S69887); RB2 (PIR: B25019); HB2 (GB: M94055); SCN8a, Maus (GB: U26707); rNa6 (GB: L39018); Pufferfisch (GB: D37977); SNS, Maus (GB: Y09108); SNS/PN3, Ratte (GB: X92184); Herz, Mensch (PIR: A38195); Herz, Ratte (SW: P15389); NaN (GB: AP059030).
8 Vorhergesagte Topografie der Spleißvarianten von (A) hNa6 und (B) PN1, hNe-Na und IIB2, die in Prostatakrebszelllinien der Ratte und des Menschen exprimiert werden, wie anhand von PCRs mit spezifischen Primern bestimmt wurde. Dunkle Säulen
bezeichnen konservierte Intronpositionen in den VGSCα-Genen. Adaptiert von Oh & Waxman (1998).
9(A) Aufzeichnungen der Ströme der Ratten-Prostatakrebszelllinie MAT-LyLu, die durch das Depolarisieren der Membran von einem Haltepotenzial von –100 mV auf 0 mV nach einer 24-stündigen Inkubation in 0 % FKS 100 ng/ml EGF und 1 μM AG1478 hervorgerufen wurden. Die Expression der spannungsgesteuerten Na⁺-Kanäle war in Gegenwart von EGF hochreguliert. (B) Histogramme, die die mittlere maximale Na⁺-Stromdichte ± Standardfehler nach einer 24-stündigen Inkubation in 0 % FKS, 100 ng/ml EGF, 1 μM AG1478 mit einem EGF-Rezeptor-Antikörper (1 μg/ml) zeigen. Die statistische Signifikanz ist als ** = p < 0,01 bzw. *** = p < 0,001 angegeben.
Beispiel 1: Expressionsprofile der Gene der α-Untereinheit des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals in Prostatakrebszelllinien der Ratte und des Menschen: überwiegende Expression des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals vom PN1/hNe-Na-Typ und seiner Untereinheit in hochmetastatischen Prostatakrebszelllinien der Ratte und des Menschen
Spannungsgesteuerte Na⁺-Kanäle (VGSCs) steuern eine Vielzahl zellulärer Aktivitäten, und ihre Fehlfunktion wurde mit verschiedenen pathophysiologischen Zuständen, einschließlich der Metastasierung des Prostatakrebses, in Verbindung gebracht. Zwar können VGSCs als Anordnungen aus mehreren Untereinheiten vorkommen, aber die α-Untereinheiten (VGSCαs) allein können funktionelle Kanäle codieren. Wir haben zwei neue Reverse Transcription Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)-Verfahren, ein Screening mit degenerierten Primern und eine neuartige semiquantitative PCR-Technik entwickelt. Diese ermöglichten eine detaillierte qualitative und quantitative Untersuchung der Expression der VGSCα-mRNAs in Prostatakrebszellen der Ratte (MAT-LyLu/AT-2) und des Menschen (PC-3/LNCaP) mit deutlich unterschiedlichem metastatischem Potenzial, und sie führten zu hochkonsistenten Ergebnissen. Nur für die stark metastatischen Zellen (MAT-LyLu und PC-3) war zuvor gezeigt worden, dass sie funktionelle VGSC-Aktivität aufweisen. PCR-Screens auf VGSCα mit degenerierten Primern identifizierten acht verschiedene VGSCα-Gene: SCN1A-4A, SCN7A-9A und SCN11A. PCRs mit spezifischen Primern demonstrierten, dass die meisten VGSCαs als multiple Spleißvarianten exprimiert wurden, die sowohl für funktionelle als auch für nicht-funktionelle (stark verkürzte) Proteine codieren würden. Die Ergebnisse der semiquantitativen PCR (SQT-PCR) waren mit einem in schwach metastatischen Zellen (AT-2/LNCaP) vorliegenden basalen Spiegel der Expression der VGSCα-mRNA konsistent, die in Zellen mit stärkerem metastatischem Potenzial (MAT-LyLu/PC-3) stark erhöht war. Die starke Zunahme der Expression spezifisch des SCN9a-Gens (auch als PN1/hNe-Na bezeichnet) war sowohl in Rattenzellen als auch in humanen Zellen größtenteils für diese Erhöhung der VGSCα-mRNA-Spiegel verantwortlich. Somit ist es sehr wahrscheinlich, dass SCN9A die Hauptquelle für das nachgewiesene funktionelle VGSC ist.

¹Abkürzungen: VGSCs, spannungsgesteuerte Na⁺-Kanäle; VGSCα, α-Untereinheit des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals; VGSCβ, β-Untereinheit des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals; DRG, Dorsalwurzelganglion; RT-PCR, Reverse Transcription-Polymerasekettenreaktion; S, Transmembransegment; D, Transmembrandomäne; ID, Zwischendomäne; TTX, Tetrodotoxin; sscDNA, einsträngige cDNA; R6, Random-Hexamer-Primer; nt, Nukleotide; SQT- PCR, semiquantitative Polymerasekettenreaktion; TBE, Trizma-Borat-EDTA-Puffer; Cytb₅R, NADH-Cytochrom-b5-Reduktase; NGF, nerve growth factor.

Hintergrund
Die spannungsgesteuerten Na⁺-Kanäle (VGSCs)¹ sind große, durch die Membran reichende Glykoproteine, die aus einer großen (≅ 240 kDa) α-Untereinheit (VGSCα) mit vier Transmembrandomänen und bis zu zwei verschiedenen β-Untereinheiten (VGSCβs) bestehen (1). Die Expression von VGSCα allein reicht für die Bildung eines funktionellen Kanals aus (2). Die VGSCβ(s) haben verschiedene unterstützende Funktionen, wie die Verbesserung der Verfügbarkeit eines funktionellen Kanals (3), die Modulierung der Kanalkinetik (4, 5) und vielleicht sogar die Veränderung der pharmakologischen Eigenschaften (6).
Die VGSCαs in höheren Wirbeltieren stellen eine Familie von wenigstens 11 verschiedenen Genen dar (7), die als SCN1A bis SCN11A bezeichnet werden. Ihre Produkte sind aus verschiedenen erregbaren Zelltypen kloniert worden. Wenigstens zwei Unterfamilien von VGSCα-Genen sind basierend auf den Sequenzdaten beschrieben worden: Na_v1 und Na_v2 (8). Es wird generell angenommen, auch wenn es noch nicht experimentell bestätigt worden ist, dass diese Unterfamilien VGSCαs mit deutlich unterschiedlichem elektrophysiologischen Eigenschaften repräsentieren (9). Tatsächlich impliziert das Fehlen der Konservierung grundlegender VGSCα-Sequenzen in den VGSCαs des Na_v2, dass sie möglicherweise nicht einmal spannungsgeregelt oder selektiv für Na⁺ sind (9, 10). Die Existenz einer dritten Unterfamilie, Na_v3, wurde kürzlich nach der Klonierung einer cDNA (NaN/SNS2) aus Zellen des Dorsalwurzelgangions (DRG) der Ratte vorgeschlagen. Zwar zeigt NaN/SNS2 weniger als 50 % Sequenzhomologie mit anderen VGSCαs, aber seine abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt alle charakteristischen Sequenzen der VGSCαs von Na_v1 (11).
Verschiedene Studien, die RT-PCR- und In-situ-Hybridisierungsverfahren einsetzten, haben die gleichzeitige Expression multipler VGSCαs in unterschiedlichen Zelltypen dokumentiert (12-14). Für bestimmte VGSCαs wurde gefunden, dass sie in unterschiedlichen Mengen exprimiert werden, wobei die Expression unter dynamischer Kontrolle steht (z. B. während der Entwicklung oder bei einer Verletzung). Zum Beispiel wurden in DRG-Zellen adulter Ratten mRNAs wenigstens acht verschiedener VGSCαs gefunden, und zwar mit einem breiten Bereich an Expressionsniveaus: mRNAs von RB1, Na6, NaN/SNS2 und SCL-11 wurden in sehr hoher Menge exprimiert, von PN1 und SNS/PN3 in mittleren Mengen und von RB2 und RB3 in sehr geringen Mengen (11, 15, 16). Nach einer Verletzung von Axonen waren die mRNAs von SNS und NaN/SNS2 dramatisch herunterreguliert, während die Expression von RB1, RB2 und RB3 hochreguliert war (17, 18).
Die VGSCα-Gene können als verschiedene alternativ gespleißte Isoformen vorkommen, deren Expression ebenfalls unter dynamischer Kontrolle steht. Für das alternative Spleißen der für das dritte Segment (S3) der ersten Transmembrandomäne (D1) codierenden Exons wurde für SCN2A und SCN3A gefunden, dass sie entwicklungsabhängig reguliert sind (19, 20), was zu „neonatalen" und „adulten" Formen führt. Diese codieren für Proteine, die sich nur um eine Aminosäure unterscheiden, die am äußersten extrazellulären Ende von S3 gelegen ist. Die Auswirkung dieser Veränderung auf die Funktion von VGSCα ist derzeit unklar. Ähnliche alternativ gespleißte Exons kommen an der entsprechenden Position in SCN8A und SCN9A vor (21, 22), aber nicht in SCN4A, SCN5A, SCN10A und SCN11A (23–26). Bisher wurden für SCN1A oder SCN7A keine Hinweise auf ein derartiges alternatives Spleißen gefunden. Ein alternative Spleißen erfolgt auch in anderen Bereichen der VGSCα, insbesondere im Zwischendomänen (ID)-Bereich 1–2 und D3.
Die strikte Regulation der Expression multipler VGSCα-Gene und Spleißprodukte innerhalb des verfügbaren VGSCα-mRNA-Pools in verschiedenen Gewebetypen und während der Entwicklung oder nach einer Verletzung (z. B. 17, 18, 27) legt nahe, dass unterschiedliche VGSCα-Genprodukte und ihre Isoformen wahrscheinlich signifikant unterschiedliche funktionelle Rollen haben, die derzeit größtenteils unbekannt sind.
Die funktionellen Rollen der VGSCs hat man am besten für das Zentralnervensystem verstanden, wo die VGSC-Aktivität nicht nur die grundlegende Impulserzeugung und -leitung steuert, sondern auch das gerichtete Wachstum und die Musterbildung, einschließlich der zielspezifischen Axonwanderung und der regionalen synaptischen Verbindungen (28–30). VGSCs sind auch mit verschiedenen Erbkrankheiten erregbarer Gewebe in Verbindung gebracht worden (7, 31) sowie mit komplizierteren pathologischen Störungen einschließlich chronischer Schmerzsyndrome (32), der Epilepsie (33), des ischämischen Infarkts (34) und der Alzheimer-Krankheit (35). Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass die VGSC-Expression auch mit einem stark metastatischen Potenzial in Prostatakrebsmodellen der Ratte (MAT-LyLu) und des Menschen (PC-3) assoziiert ist (36–38). Tatsächlich kann die Expression funktioneller VGSCs eine direkte, positive Wirkung auf den Prozess der Metastasierung haben. Dementsprechend reduzierte die Blockade von VGS-Strömen in diesen stark metastatischen Zelllinien über die Verabreichung von Tetrodotoxin (TTX) das invasive Potenzial der Zellen signifikant (~30 %). Die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften des Stromes in der Ratte stimmten damit überein, dass die Kanäle vom neuronalen TTX-empfindlichen (Na_v1)-Typ sind (39). Die Expression des SCN4A-Gens wurde sowohl in stark als auch in schwach metastatischen Zelllinien des Menschen und der Ratte gefunden (40). Die pharmakologischen Eigenschaften der VGS-Strome in den MAT-LyLu-Rattenzellen stimmten jedoch nicht mit den für VGSCα berichteten überein. Das könnte resultieren aus (1) den zahlreichen Unterschieden, die für die Primärsequenzen von rSkM1 für MAT-LyLu und AT-2 ermittelt wurden; (2) Unterschieden bezüglich posttranslationaler Mechanismen (z. B. einer Assoziation mit zusätzlichen Untereinheiten, des Ausmaßes der Glycosylierung/Phosphorylierung des Kanals) in diesen Zellen oder (3) dem Vorhandensein anderer VGSCαs in den MAT-LyLu-Zellen, die die aufgezeichneten VGS-Ströme erzeugen.
In der vorliegenden Untersuchung haben wir unsere Arbeiten auf die Bestimmung der Expression der mRNAs anderer VGSCαs in den stark (MAT-LyLu und PC-3) und schwach (AT-2 und LNCaP) metastatischen Prostatakrebszellen mittels eines vergleichenden quantitativen RT-PCR-Ansatzes erweitert.
Experimentelle Verfahren
Zellkulturen Die Zelllinien MAT-LyLu, AT-2, LNCaP und PC-3 wurden wie früher beschrieben kultiviert und geerntet (36, 37).
RNA-Extraktion Diese wurde wie in (41) beschrieben oder wie unten beschrieben durchgeführt. Die Zellen wurden, um das Ganze kurz zusammenzufassen, in einer Lösung („A") mittels eines IKA-Homogenisators so homogenisiert, dass 1 ml der Lösung pro 0,1 g Gewebe eingesetzt wurde. Die Lösung A enthielt 4 M Guanidiniumthiocyanat, 25 mM Na⁺-Citrat (pH 7,0), 0,5 % Sarcosyl und 0,72 % (Vol./Vol.) β-Mercaptoethanol. Die folgenden Zusätze wurden dann zugegeben, und das Ganze wurde 10 Sekunden kräftig geschüttelt: 2 M Na⁺-Acetat, pH 4,0 (10 % des Volumens der Lösung A), Phenol (gleiches Volumen wie die Lösung A) und Chloroform (20 % des Volumens der Lösung A). Es wurde 20 min bei 4 °C und 10 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit Isopropanol ausgefällt. Dann wurden die Proben wie zuvor zentrifugiert, und das Pellet wurde in ungefähr 30 % des Ausgangsvolumens der Lösung A resuspendiert. Es wurde eine zweite Isopropanolfällung durchgeführt, und das Pellet wurde mit 75 % Ethanol gewaschen und in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert.
Für jede der Rattenzelllinien wurden drei verschiedene RNA-Extrakte aus drei verschiedenen Zell-Batches erhalten (bezeichnet als MLL.1, MLL.2, MLL.3, AT.1, AT.2, AT.4), und für die humanen Zelllinien wurden zwei Extrakte aus den beiden unterschiedlichen Zell-Batches erhalten (bezeichnet als PC.1, PC.2, LN.1, LN.2).
VGSCα-Screening mit degenerierten Primern Es wurde eine PCR-Strategie, die zur Amplifizierung aller bekannter VGSCα in der Lage ist, zur Amplifizierung und anschließenden Identifizierung aller in den Prostatakrebszelllinien exprimierten VGSCαs über eine Klonierung und Sequenzierung eingesetzt. Spezifische VGSCα-Primer wurden nach den anfänglichen Sequenzierungsergebnissen eingesetzt, um ein schnelles PCR-Screening der zahlreichen VGSCα-Klone, die von jeder Zelllinie gewonnen wurden, zu ermöglichen.
Es wurde, um das Ganze kurz zusammenzufassen, die DNA durch einen Verdau mit DNase I aus den Extrakten entfernt, und 5 μg der Gesamt-RNA wurden als Matrize für die Synthese der einsträngigen cDNA (sscDNA) eingesetzt (Superscript II, GIBCO BRL). Die Synthese der sscDNA wurde mit einen Mix von Random-Hexameren (R6) in einen Endvolumen von 20 μl geprimt. Die VGSCα-cDNA wurde dann aus dem R6-sscDNA-Pool mittels PCR (Taq-DNA-Polymerase, Amersham Pharmacia) unter Verwendung degenerierter PCR-Primer (YJ1 und YJ2C) amplifiziert, die zuvor zur Amplifizierung sowohl der Na_v1- als auch der Na_v2-VGSCαs aus Pigmentepithelzellen der Retina adulter Ratten (42) sowie neuer VGSCαs aus einem Protochordaten-Blattschlauch eingesetzt worden waren (43). Die PCR-Reaktionen wurden mit 4 μl der R6-sscDNA-Matrize unter Verwendung von 200 μM eines jeden dNTP, 1 Einheit Taq, 1 × Taq-Puffer und 1 μM eines jeden Primers in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt. Die Amplifizierung erfolgte über (i) eine initiale Denaturierung bei 94 °C für 5 min, (ii) die Zugabe von 1 U Enzym, (iii) 33–35 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 1 min, ein Hybridisieren bei 40 °C für 1 min und eine Elongation bei 72 °C für 1 min und (iv) eine Elongation bei 72 °C für 10 min. Bei dieser PCR und allen anderen durchgeführten PCRs wurden auch Reaktionen ohne zugesetzte sscDNA durchgeführt, um bezüglich einer Kreuzkontamination durch andere DNA-Quellen zu kontrollieren.
Die PCR-Produkte wurden über eine Elektrophorese analysiert und vor der Ligation in den Vektor pGEM-T (pGEM-T Easy Vektor System, Promega) über ein Gel gereinigt. Die PCR-Produkte wurden dann zur Transformation von E. coli (pMosBlue, Amersham) eingesetzt. Die Plasmid-DNA wurde aus den Bakterienkulturen mit Hilfe einer modifizierten Version der Vistra- Labstation-625-Miniprep-Prozedur (Vistra DNA Systems, Amersham) gewonnen. Für jeden der zehn RNA-Extrakte wurden fünfzig Klone mit „Inserts" über eine Gelelektrophorese positiv selektiert. Nach der DNA-Sequenzierung einer Untergruppe von ungefähr 10 Klonen aus jedem Screen, die mittels des „Thermo Sequenase fluorescent cycle sequencing kit" von Amersham und der automatischen Sequenzierapparatur Vistra DNA 725 (Amersham International) durchgeführt wurde, wurden spezifische PCR-Primer für die am häufigsten vorkommenden VGSCαs, die in den Screens gefunden wurden, entworfen und in Verbindung mit den universellen Vektorprimern eingesetzt, was ein schnelles Screening von Klonen mittels PCR ermöglichte, ohne dass extensive Sequenzierungsarbeiten erforderlich waren. Die Primer entsprachen den Nukleotiden (nt) 4118–4137, 3406–3425, 4441–4460, 4066–4085, 4139–4158, 4265–4284 und 4325–4344 für die VGSCαs PN1 (58 °C), SCL-11 (50°), RB1 (46 °C), rSkM1 (64 °C), hNe-Na (54 °C), HB2 (56 °C) bzw. hNa6 (54 °C) (Nummerierung nach GenBank, die für die Hybridisierung eingesetzte Temperatur ist in Klammern angegeben). Diese Primer wurden mit sequenzierten Klonen getestet, um zu bestätigen, dass sie nur zu spezifischen Produkten führten. Klone, die keine positiven Test bezüglich dieser VGSCα ergaben, wurden über eine Sequenzierung identifiziert. Es wurden die Mittelwerte der prozentualen Anteile der Klone, die ein bestimmtes VGSCα (von den 50 Klonen in jedem Screen) repräsentierten, gebildet. Die Daten sind als die Mittelwerte ± Standardfehler angegeben.
VGSCα-spezifische PCR-Tests Der Bereich zwischen den beiden degenerierten Primern enthält keine konservierten Intronstellen in den untersuchten VGSCα-Genen (22–25). Deshalb wurden PCRs über die Stellen der konservierten Introns der VGSCα-Gene hinweg durchgeführt, um zu bestätigen, dass die in den Screens gefundenen VGSCαs nicht von kontaminierender genomischer DNA amplifiziert worden waren. Außerdem wurde für mehrere VGSCαs, die in den Screens mit den degenerierten Primern gefunden wurden (insbesondere SCN2A, SCN3A, SCN8A und SCN9A), gefunden, dass sie in zahlreichen Spleißformen vorkommen. Deshalb wurden spezifische 20-mer Primer entworfen, um Produkte zu amplifizieren, die die konservierten Introns zwischen D1:S2 und D1:S5/S6 umfassten, was die Identifizierung der exprimierten Spleißform(en) von SCN2A (Ratte und Mensch), SCN3A (Mensch) und SCN9A (Ratte und Mensch) ermöglichte und eine Kontrolle bezüglich einer Kontamination durch genomische DNA darstellte. Die Primer für hNa6 (SCN8A) und Nan/SNS2 (SCN11A) wurden dagegen für D3 entworfen, wo ein dem für D1:S3 ähnliches alternatives Spleißen im VGSCα hNa6 erfolgt (22, 44). Die in den Reaktionen amplifizierten Nukleotide entsprachen 424–847, 376–879, 684–1160, 632–1129, 870–1347, 3353–3674, 474–862, 3855– 4370, 512–1024, 493–897 für PN1 (60 °C), SCL-11 (58 °C), RB1 (58 °C), RB2 (59 °C), rSkM1 (58 °C), NaN/SNS2 (58 °C), hNe-Na (59 °C), nNa6 (60 °C), HB2 (58 °C) bzw. HB3 (60 °C).
Die Reaktionen wurden wie oben durchgeführt, wobei 2,5 μl des R6-sscDNA-Mix und 0,5 μM eines jeden Primers und 30–35 Zyklen eingesetzt wurden. Die PCRs wurden mit Extrakten sowohl stark als auch schwach metastatischer Zelllinien durchgeführt, unabhängig davon, ob diese VGSCαs zuvor in den Screens gefunden worden waren. Die beobachteten Produkte wurden kloniert und sequenziert, und dann wurde eine Konsensussequenz für jeden VGSCα in jeder Zelllinie erzeugt (wobei wenigstens drei Klone, die alle aus verschiedenen RNA-Extrakten stammten, verwendet wurden). Für RB2, HB2, HB3, PN1 und hNe-Na wurden wenigstens vier Klone aus jedem Zelllinienextrakt für die der PCR-Produkte von 498 nt, 513 nt, 405 nt 424 nt bzw. 389 nt sequenziert (dargestellt in 2).
Semiquantitative PCRs (SQT-PCRs) Acht mit DNase behandelte RNA-Extrakte (zwei Extrakte für jede Zelllinie) wurden zur Erzeugung von drei Gruppen von R6-sscDNAs für jeden Extrakt eingesetzt. 2,4 μl dieser R6-sscDNAs wurden dann als Matrize für VGSCα-spezifische PCRs (durchgeführt wie oben) in einem Endvolumen von 60 μl eingesetzt. Um einen direkten Vergleich der mit stark und schwach metastatischen Zelllinien erhaltenen Ergebnisse zu ermöglichen, wurden alle vergleichbaren R6-sscDNA- und PCR-Reaktionen gleichzeitig durchgeführt.
Ein Ansatz einer kinetischen Beobachtung (45, Hoof et al. (1991) Anal.Biochem. 196, 161-169, Wiesner et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 183, 553-559) wurde so übernommen, dass ein Aliquot von 5 μl aus der Reaktionsmischung von 60 μl über 11 Zyklen am Ende eines jeden Amplifizierungszyklus entnommen wurde, während die Reaktionsansätze bei 72 °C gehalten wurden. Der Amplifizierungszyklus, bei dem die Aliquots erstmals entnommen wurden, unterschied sich in Abhängigkeit vom untersuchten VGSCα. Diese Aliquots wurden dann elektrophoretisch (0,8 % Agarosegele) zusammen mit DNA-Markern bekannter Konzentration aufgetrennt. Die Gele wurden 15 Minuten nachgefärbt (TEE-Puffer mit 0,8 μg/ml Ethidiumbromid), und es wurde ein digitales Bild erstellt (Advanced Gel Documentation System GDS 7500, Ultra-Violet Products, Cambridge, GB). Die Gesamtmasse des Produkts (Nanogramm) in jedem Aliquot wurde über eine Bildanalyse bestimmt (1D Image Analysis Software, Kodak Digital Science, New York). Es wurden für jede PCR-Reaktion zwei charakteristische Stadien quantifiziert:

(1) Die Schwellenzahl für die PCR-Zyklen (CN_t), bei der ein bestimmtes PCR-Produkt gerade mit der Bildanalyse-Software (Standardeinstellungen) nachgewiesen werden konnte.
(2) Die Zahl der PCR-Zyklen, bei der die exponentielle Phase der Reaktion aufhörte (CN_e).

Die Akkumulation des Reaktionsprodukts mit zunehmender Zahl an PCR-Zyklen folgt einer sigmoidalen Kurve (45). Die beiden Extreme dieser Kurve waren jedoch unbekannt oder für die SQT-PCR-Daten nicht bestimmt (d. h. die anfängliche Masse der cDNA bei null Zyklen war unbekannt, und die letztendliche Masse des Produktes am Ende der PCR wurde nicht bestimmt). Somit konnte keine sigmoidale Kurve an die Daten angepasst werden. Stattdessen wurde eine polynomische Gleichung dritten Grades, die ebenfalls nur einen möglichen Wendepunkt hat (der hier dem Ende der exponentiellen Phase der PCR entspricht), zur Angleichung an eine sigmoidale Kurve verwendet. Die Kurvenanpassung erfolgte mittels STATISTICA (SoftStat. Inc., Tulsa, Oklahoma), und dann wurde die zweite Ableitung berechnet, wodurch CN_e erhalten wurde. Dieses Verfahren konnte erfolgreich durchgeführt werden, wobei die für CN_e berechneten Werte in die experimentell erhaltenen Datenpunkte fielen (1). Die Daten sind als Mittelwerte und Standardfehler für jede Zelllinie ausgedrückt (drei Wiederholungen mit zwei Extrakten für jeden VGSCα). Die Werte für CN_t und CN_e wurden direkt für den Vergleich des Expressionsniveaus eines jeden VGSCα in den stark und schwach metastatischen Zelllinien herangezogen.
Die NADH-Cytochrom-b5-Reduktase (Cytb₅R), die in sehr ähnlichen Mengen in normalen, kanzerösen und stark metastatischen Zellen aus zahlreichen Gewebetypen (46, 47) exprimiert wird, war in den Screens mit degenerierten Primern sowohl der Ratte als auch des Menschen als eine Hauptkomponente der gefundenen unspezifischen Produkte vorhanden (der „nicht-VGSCα"-Klone). Deshalb wurde sie als Kontrollamplikon in den SQT-PCRs eingesetzt. 20-mer-Primer der Cytb₅R amplifizierten die Nukleotide 385–809 und 299–790 der Homologen der Ratte bzw. des Menschen (Hybridisierungstemperatur für beide 60 °C).
Die spezifischen PCRs für PN1, hNe-Na, RB2, HB2, hNa6 und HB3 erzeugten aufgrund eines alternativen Spleißens multiple VGSCα-Produkte, was die Bestimmung der Expressionsniveaus der VGSCαs schwieriger machte. Um jeweils nur ein Produkt für diese VGSCαs zu erhalten, wurden andere PCRs unter Verwendung neuer 20-mer-Primer durchgeführt, die die Nukleotide 20–345, 172–544, 5941–6308, 3827–4344, 5914–6270, 1594–1875 für PN1 (60 °C), RB2 (60 °C), hNe-Na (56 °C), nNa6 (60 °C), HB2 (58 °C) bzw. HB3 (59 °C) amplifizierten. Die Produkte hNe-Na, hNa6, HB2 und HB3 erstreckten sich nicht über konservierte Intronstellen, und deshalb wurden zur Kontrolle PCR-Reaktionen durchgeführt, bei denen die sscDNA-Matrize durch ein Aliquot einer Reverse-Transcription-Reaktion ersetzt wurde, bei der keine reverse Transkriptase zugesetzt worden war. Alle Produkte wurden kloniert und sequenziert.
Zwei zusätzliche 20-mer-Primer („neonatal", nt 500–519, GenBank-Nummerierung, und „adult", nt 3996–4015) wurden zur Bestimmung der relativen Expressionsniveaus der neonatalen und der adulten Spleißform von hNa6 in den Prostatakrebszellen eingesetzt. Die Reaktionen wurden mit lediglich einem RNA-Extrakt der PC-3- und LNCaP-Zellen zusammen mit dem 3'-hNa6-spezifischen Primer, der für die spezifischen PCR-Tests auf VGSCα eingesetzt worden war, durchgeführt („neonatal", Hybridisierungstemperatur 58 °C; „adulte" PCR, 57 °C).
Nukleotidnummern der GenBank-Sequenzen Die Nummerierung der Nukleotide erfolgte gemäß den Zugangsnummern U79568, Y03639, X03638, X03639, Y17153, AF059030, X82835, AB027567, AF050730, M94055, AF035685, D00636, Y09501 für PN1, SCL-11, RB1, RB2, rSkM1, NaN/SNS2, hNe-Na, hNa6 „neonatal", HB2, HB3, rCytb₅R bzw. hCytb₅R.
Ergebnisse
VGSCα-Screening mit degenerierten Primern Die kombinierten Ergebnisse der PCR- und Sequenzierungs-Screens der Miniprep-Klone sind für die verschiedenen Zelllinien in der Tabelle 1 gezeigt. Acht verschiedene VGSCα-Typen, die Produkte der SCN1A-4A-, SCN7A-9A- und SCN11A-Gene repräsentierten, wurden in den Screens gefunden. Von diesen wurden sechs verschiedene VGSCαs in der Ratte und vier im Menschen gefunden. Die Homologen von zwei VGSCαs, die in den menschlichen Screens gefunden wurden, waren auch in den Rattenzellen vorhanden (das von SCN9A stammende PN1 und das von SCN2A stammende RB2). Alle gefundenen VGSCαs stimmten im amplifizierten Bereich mit der jeweiligen veröffentlichten Sequenz überein (eingegrenzt durch die degenerierten Primer).
TABELLE I Zusammenfassung der Ergebnisse des VGSCα-Screens mit degenerierten Primern

Die Ergebnisse sind als der prozentuale Anteil der getesteten Klone gezeigt (n = 50 in jedem Fall). Jeder Screen ist das Ergebnis von 2–3 Extrakten aus einer jeden Zelllinie. Die Fehlerangaben bezeichnen Standardfehler. Gedankenstriche (-) bezeichnen das Fehlen von Klonen mit der jeweiligen VGSCα-Identität in den durchgeführten Screens

VGSCα-Gen	Gen-Produkt	Rattenzelllinien		Menschliche Zelllinien
VGSCα-Gen	Gen-Produkt	MAT-LyLu	AT-2	PC-3	LNCaP
SCN1A	RB1/HB1	5,3 ± 0,7	34,0 ± 13,3	–	–
SCN2A	RB2/HB2	–	1,3 ± 0,7	11,0 ± 5,0	11,0 ± 7,0
SCN3A	RB3/HB3	–	–	1,0 ± 1,0	1,0 ± 1,0
SCN4A	rSkM1/hSkM1	–	34,0 ± 12,0	–	–
SCN7A	SCL-11/hNa_v2,1	55,3 ± 7,3	10,7 ± 7,7	–	–
SCN8A	rNaCh6/hNa6	–	–	41,0 ± 5,0	47,0 ± 15,0
SCN9A	PN1/hNe-Na	37,3 ± 8,7	–	45,0 ± 3,0	–
SCN11A	NaN/	–	8,0 ± 2,0	–	–
Nicht-VGSCα		2,0 ± 1,2	12,0 ± 2,0	2,0 ± 2,0	41,0 ± 7,0

Die degenerierten Primer wurden so entworfen, dass alle der möglichen cDNA-Kombinationen amplifiziert wurden, die für Sequenzmotive aus zwei Aminosäuren codieren können, die in allen bis jetzt klonierten und sequenzierten Na_v1-VGSCαs perfekt konserviert sind (YJ1 = FWLIFSIM, YJ2C = QVATFKGW), und sie liefern Produkte von 225–237 Basenpaaren. Es erschien deshalb wahrscheinlich (wenigstens für Na_v1-Kanäle), dass der Anteil der Klone, die einen jeden VGSCα-Typ repräsentieren, ungefähr den tatsächlichen Anteil des VGSCα im zellulären VGSCα-mRNA-Pool widerspiegelt.
Die Sequenz zwischen den hochkonservierten Primer-bindenden Bereichen unterscheidet sich in allen VGSCαs sehr stark, was eine Unterscheidung zwischen VGSCα-Typen durch eine DNA-Sequenzierung oder eine PCR (unter Verwendung VGSCα-spezifischer Primer, die nur Produkte eines VGSCα-Typs amplifizieren) ermöglicht.
Für die Produkte eines einzigen VGSCα-Gens vom Na_v1-Typ, SCN9A (PN1/hNe-Na), wurde gefunden, dass sie in den Screens aller stark metastatischen Extrakte (sowohl von Ratten als auch vom Menschen) in großer Menge vorlagen: 37,3 ± 8,7 % und 45,0 ± 3,0 % für die MAT- LyLu- bzw. PC-3-Zellen. Im Gegensatz dazu wurden keine Produkte des SCN9A-Gens in den Screens gefunden, die mit den entsprechenden schwach metastatischen Zellen durchgeführt wurden. SCL-11 war ebenfalls in den Screens der MAT-LyLu-Zellen (55,3 ± 7,3 %) häufiger als in denen der AT-2-Zellen (10,7 ± 7,7 %).
Es wurden zahlreiche Nicht-VGSCα-Klone identifiziert. Wie es einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein dürfte, wurden die Klone als Nicht-VGSCα klassifiziert, wenn sie mit bekannten DNA-Sequenzeinträgen in GenBank, die nicht für VGSCαs codieren, übereinstimmten, oder wenn sie bisher unveröffentlichte cDNAs repräsentierten, die keine Sequenzen mit konservierten VGSCα-Sequenzmotiven in dem durch den degenerierten Primer definierten Bereich besaßen. Der prozentuale Anteil von Klonen mit einer Nicht-VGSCα-Identität war in den schwach metastatischen Zellen höher als in den stark metastatischen Gegenstücken (sowohl der Ratte als auch des Menschen). Weiterhin waren in den Screens die Gesamtmengen beim Menschen größer als bei der Ratte. hCytb₅R war das Nicht-VGSCα, das in den Screens der menschlichen Zellen am häufigsten gefunden wurde (100 % der Nicht-VGSCα-Klone in PC-3 und 61 % in LNCaP).
VGSCα-spezifische PCR-Tests Diese ergaben Produkte für alle der in den degenerierten Screens gefundenen VGSCαs (SCN1A, SCN7A und SCN9A für von MAT-LyLu stammende sscDNAs, SCN1A, SCN2A, SCN4A, SCN7A und SCN11A für von AT-2 stammende sscDNAs), was anzeigte, dass tatsächlich alle als mRNA-Transkripte exprimiert wurden (und nicht von genomischer DNA stammten). Außerdem wurde für VGSCαs, die nur in den AT-2-Screens gefunden worden waren, gefunden, dass sie in den MAT-LyLu-Zellen exprimiert wurden (RB2 (SCN2A), rSkM1 (SCN4A) und NaN (SCN11A)). VGSCαs (SCN9A), die nur in den Screens der am stärksten metastatischen Zellen (MAT-LyLu und PC-3) gefunden worden waren, wurden in einigen oder allen Extrakten der schwach metastatischen Zellen exprimiert (PN1 wurde in einem der drei AT-2-Extrakte nachgewiesen, hNe-Na in beiden LNCaP-Extrakten).
Eine Sequenzanalyse zeigte, dass verschiedene Spleißformen von SCN2A, SCN3A, SCN8A und SCN9A sowohl in stark als auch in schwach metastatischen Zellen exprimiert wurden (2). Diese Spleißformen bestanden sowohl aus neonatalen als auch adulten Formen für SCN2A, SCN3A und SCN8A, aber nur aus der neonatalen Form für SCN9A (10 und 12 Klone sequenziert für Rattenzellen bzw. menschliche Zellen). Interessanterweise lagen für SCN2A und SCN3A die neonatalen Formen offenbar in größerer Menge vor als die adulten Formen, und zwar sowohl in stark als auch in schwach metastatischen humanen Zelllinien (8 Klone gegenüber 1 Klon für beide VGSCαs). Im Gegensatz dazu lag die adulte Form von SCN2A sowohl in MAT-LyLu- als auch in AT-2-Zellen in größerer Menge vor (13 Klone gegenüber 2 Klonen).
Verkürzte Spleißformen (bezeichnet als Δ), bei denen ganze Exons aufgrund des Herausspleißens sowohl adulter als auch neonataler Exons aus dem mRNA-Transkript fehlten, wurden für SCN2A (in den AT-2-Zellen), SCN8A und SCN9A ebenfalls amplifiziert und sequenziert (2). ΔSCN9A fand sich nur in den stark metastatischen Zellen (Ratte und Mensch). Im Hinblick auf den veröffentlichten offenen Leserahmen würden die Transkripte für SCN2A, SCN3A und SCN9A für VGSCα-Proteine codieren, die an D1:S3 verkürzt sind. Im Gegensatz dazu würde ΔhNa6 (von SCN8A) für ein VGSCα-Protein codieren, bei dem nur die Hälfte von D3:S3 und das gesamte D3:S4 fehlt, wie früher beschrieben wurde (48). Außerdem wurde eine Spleißform von RB2 (SCN2A) sequenziert (aus AT-2-Extrakten), die sowohl neonatale als auch adulte Exons enthielt, und die ein partiell gespleißtes RB2-Transkript repräsentierte. Das würde in ein RB2-Protein translatiert werden, das unmittelbar nach dem neonatalen D1:S3 verkürzt ist (2).
Vier der VGSCαs (SCL-11, RB2, HB3 und hNa6) unterschieden sich in den klonierten Bereichen leicht von den jeweils veröffentlichten Sequenzen. Eine partielle Sequenzanalyse zeigte auch, dass sich hNe-Na (in PC-3- und LNCaP-Zellen) in einem Teil der 3'-nicht-codierenden Region von der entsprechenden GenBank-Sequenz unterschied. Diese Veränderungen sind in der Tabelle II umrissen. Es wird erwartet, dass auch andere Veränderungen vorhanden sein könnten, insbesondere in den nicht-codierenden Bereichen.
Tabelle II: Nukleotid (Nt)-Unterschiede zwischen den partiell sequenzierten VGSCαs und den GenBank-Sequenzen

Es sind die Veränderungen der abgeleiteten Aminosäuren und das relative Ausmaß der Konservierung veränderter Reste in anderen VGSCαs gezeigt.

Nt-Unterschied	Nt-Position	Aminosäureveränderungen	VGSCα-Region	Sequenzkonservierung
rSCN2A-1	775 (A nach G)	Asn nach Asp (Asn 189)	D1:S3	Asp in allen VGSCαs
rSCN2A-2	918 (T nach C)	keine (Thr 236)	D1:S4/S5	–
hSCN3A-1	578 (T nach C)	Val nach Ala (Val 175)	D1:S2	Ala in allen VGSCαs
rSCN7A-1	427 (C nach T)	keine (Asn 139)	D1:S1	–
rSCN7A-2	462 (- nach T)	Cys nach Leu (Cys 151)	D1:S2	Leu in allen Na_v2s
rSCN7A-3	469 (A nach -)	keine (Gly 153)	D1:S2	–
rSCN7A-4	481 (C nach T)	keine (Phe 157)	D:S2	–
rSCN7A-5	490 (G nach T)	keine (Leu 160)	D1:S2	–
rSCN7A-6	661 (C nach T)	keine (Ile 217)	D1:S4	–
rSCN7A-7	842 (G nach A)	Ser nach Asn (Ser 281)	D1:S5/S6	Asn in allen Na_v2s
hSCN8A-N1	493 (C nach A)	keine (nach STOP)	D3:S3	–
hSCN8A-N2	511 (N nach A)	keine (nach STOP)	D3:S3	–
hSCN9A-1	6230 (G nach -)	keine (nach STOP)	–	–
hSCN9A-2	6231 (A nach -)	keine (nach STOP)	–	–
hSCN9A-3	6232 (T nach -)	keine (nach STOP)	–	–
hSCN9A-4	6233 (T nach -)	keine (nach STOP)	–	–

SQT-PCRs Typische Elektrophorese-Ergebnisse sind in den 3 und 4 für VGSCαs der Ratte bzw. des Menschen gezeigt. Unter der Annahme, dass die mit RNA-Extrakten stark und schwach metastatischer Zellen durchgeführten PCR-Reaktionen ähnlich effizient abliefen, spiegeln Unterschiede der berechneten CN_t- und CN_e-Werte (abgeleitet aus den Gelbildern) tatsächliche Unterschiede der Expressionsniveaus wider. In Übereinstimmung mit dieser Annahme zeigte das Kontrollamplikon (Cytb₅R) nur einen geringen oder keinen Unterschied in den Extrakten der Rattenzellen (CN_t = 18,3 ± 0,2 gegenüber 17,3 ± 0,4, CN_e = 23,1 ± 0,4 gegenüber 22,1 ± 0,2) oder der menschlichen Zellen (CN_t = 19,2 ± 0,3 gegenüber 19,5 ± 0,4, CN_e = 23,5 ± 0,2 gegenüber 23,4 ± 0,3).
Weiter ist es mittels der abgeleiteten CN_t- und CN_e-Werte möglich, angenäherte absolute Unterschiede der Expressionsniveaus der VGSCαs zu berechnen (unter der Annahme einer 80%igen PCR-Effizienz (Bishop et al. (1997) Immunol. Cell Biol. 75, 142-147)), wie in der Tabelle III (a und b) gezeigt ist.
In MAT-LyLu-Zellen benötigten im Vergleich zu den AT-2-Zellen nur zwei VGSCαs (PN1 und SCL-11) eine deutlich geringere Amplifizierung, um nachweisbare Produkte zu ergeben und CN_e zu erreichen, was ein höheres Expressionsniveau in MAT-LyLu-Zellen anzeigte. Wichtig ist, dass der auffälligste Unterschied für PN1 gesehen wurde: CN_t = 25,2 ± 0,5, CN_e = 29,2 ± 0,4 (3a). Tatsächlich wurde PN1 nie in den beiden extensiv untersuchten Extrakten der AT-2-Zellen gefunden, sogar nach 45 Zyklen. Ein offenbar niedriger Spiegel von PN1 war in einem dritten AT-2-Extrakt vorhanden (CN_t = 35,7 ± 0,3).
Ein anderer VGSCα (RB2) zeigte einen bemerkenswerten zellabhängigen Unterschied im Amplifizierungsprofil (3e). Die Ergebnisse zeigten jedoch insgesamt niedrige Expressionsniveaus: CN_t = 35,4 ± 0,4 (MAT-LyLu) gegenüber 29,8 ± 0,8 (AT-2). Geringe zellabhängige Unterschiede wurden auch für rSkM1 (3d) und NaN/SNS2 (3f) gesehen, wobei das offenbar höhere Expressionsniveau wiederum in den schwach metastatischen Zellen vorlag. Ein VGSCα, RB1, zeigte keinen offensichtlichen Unterschied der Expressionsniveaus zwischen den beiden Zelllinien (3c).
Beim Vergleich von PC-3- mit LNCaP-Extrakten lag der auffälligste zellabhängige Unterschied für hNe-Na vor (4a), das Orthologe von PN1: CN_t = 25,7 ± 0,8 (PC-3) gegenüber 37,7 ± 0,3 (LNCaP). Es gab auch Unterschiede bezüglich der Expressionsniveaus von hNa6, HB2 und HB3 in den beiden Zelllinien (CN_t = 22,6 ± 0,5 gegenüber 26,8 ± 0,2, 26,8 ± 0,5 gegenüber 30,7 ± 0,5 bzw. 34,0 ± 0,7 gegenüber 39,7 ± 0,9), wobei wieder eine größere Menge in den PC-3-Zellen vorlag, aber diese Mengen waren viel geringer als die des hNe-Na.
Die Ergebnisse der SQT-PCR-Amplifizierung der neonatalen (hNa6N) und adulten (hNa6A) Isoformen von hNa6 (4f und 4g) zeigten, dass beide Formen in den stark metastatischen Zellen in größerer Mengen als in den schwach metastatischen Zellen exprimiert wurden: CN_t = 25,3 ± 0,3 gegenüber 28,0 ± 0, CN_e = 28,1 ± 0,2 gegenüber 31,8 ± 0,3 für die neonatale Form bzw. CN_t = 36,7 ± 0,3 gegenüber > 45,0 für die adulte Form. Diese CN_t-Werte legen auch nahe, dass in beiden Zelllinien die neonatale Form in viel größerer Menge als die adulte Form exprimiert wurde.
Anfängliche SQT-PCRs für SCN2A, SCN3A, SCN8A und SCN9A, die multiple Produkte ergaben, sind in der 2 gezeigt. Deshalb sind die ermittelten relativen Expressionsniveaus der VGSCαs scn2A, scn3A, scn8a und scn9A aus verschiedenen Formen dieser VGSCαs zusammengesetzt. SQT-PCRs mit multiplen Produkten stimmten generell mit den Ergebnissen der SQT-PCRs mit einem Produkt überein. Wichtig ist, dass zum Beispiel die VGSCα-Expressionsniveaus in den PC-3-Zellen größer waren als in LNCaP-Zellen. Die neonatalen/adulten Isoformen waren offenbar konsistent die dominant exprimierten Spleißvarianten von RB2, HB3, PN1 und hNe-Na, wobei ihre Produkte bei geringeren Zyklenzahlen sichtbar wurden als die anderen Isoformen. Für HB2 wurden jedoch die Δ-Formen und die neonatalen/adulten Isoformen offenbar in ähnlichen Mengen exprimiert (2a). Im Gegensatz dazu wurde die Expression von hNa6 offenbar in LNCaP-Zellen von der neonatalen Form und in PC-3-Zellen von den neonatalen und Δ-Formen dominiert (2c).
Diskussion
In dieser Untersuchung haben wir neuartige RT-PCR-Verfahren zu Untersuchung der Expression multipler VGSCα-Gene in Prostatakrebszelllinien entwickelt und gezeigt, (i) dass multiple VGSCαs und ihre Spleißvarianten sowohl in stark als auch in schwach metastatischen Prostatakrebszelllinien, die von der Ratte und dem Menschen stammen, exprimiert wurden, (ii) dass der Gesamtspiegel der VGSCα-Expression in stark metastatischen Zellen beträchtlich höher war als in schwach metastatischen Zellen und (iii) dass die Expression eines bestimmten funktionellen VGSCα-Typs – des Produktes von SCN9A (PN1/hNe-Na) – vorherrschte und in den stark metastatischen Zellen sowohl der Rattenmodelle als auch der menschlichen Modelle des Prostatakrebses stark hochreguliert war.
Die eingesetzten Zelllinien wurden für die Studie wegen ihrer sehr unterschiedlichen metastatischen Eigenschaften ausgewählt. Die AT-2-Zellen der Ratte sind schwach metastatisch, wenn sie subkutan in Copenhagen-Ratten injiziert werden (weniger als 10 % der Tiere entwickeln Lungen- und Lymphknotenmetastasen (Isaacs et al. (1986) Prostate 9, 261-281). Im Gegensatz dazu sind MAT-LyLu-Zellen stark metastatisch (mehr als 80 % der Tiere entwickeln Lungen- und Lymphknotenmetastasen (Isaacs et al. (1986)). Ähnlich metastasierten humane PC-3-Zellen leicht, wenn sie subkutan in athymische Nacktmäuse injiziert wurden, und sie führten zu axillären Lymphknotenmetastasen bei 56 % der Tiere (Shevrin et al. (1989) Prostate 15, 187-194, Waters et al. (1995) Prostate 26, 227-234), während LNCaP-Zellen in athymischen Mäusen nicht metastasierten (Lee et al. (1993) Cancer Metastasis Rev. 12, 21-28). Weiterhin führten metastatische PC-3-Zellvarianten bei einer orthotopischen Injektion in die Prostata von Nacktmäusen als Empfänger bei 90 % der Tiere zu Lymphknotenmetastasen, während die LNCaP-Zellen auch tumorigen waren, aber keine erkennbaren Lymphknotenmetastasen verursachten (Stephenson et al. (1992) J. Natl. Cancer Inst. 84, 951-957).
Methodische Aspekte Die PCR-Screening-Technik mit degenerierten Primern ermöglichte zunächst der Bestimmung der in diesen Zellen exprimierten VGSCαs. Andere Techniken, einschließlich einer Technik aus einer degenerierten PCR und einem Restriktionsenzymverdau (Fjell, J. et al. (1997) Mol. Brain Res. 50, 197-204) und eines Northern-Blottings unter Verwendung gemeinsamer VGSCα-Sonden (Beckh, S. (1990) FEBS Letts. 262, 317-322) sind ganz ähnlich zur Untersuchung der VGSCα-Expression eingesetzt worden. Im Gegensatz zu solchen Verfahren liefern degenerierte Screens auch quantitative Informationen. Da unsere degenerierten PCR-Primer für zwei hochkonservierte Bereiche aller veröffentlichten VGSCαs (in D3:S5 und D3:S5/S6) entworfen worden waren, ist es wahrscheinlich, dass alle VGSCαs der Na_v1-Unterfamilie mit im Wesentlichen gleicher Effizienz amplifiziert wurden, d. h. die relativen Anteile der VGSCαs in den Screens spiegeln im Großen und Ganzen ihre relative Häufigkeiten in der zellulären mRNA wider. Das wird durch die SQT-PCR-Daten gestützt, die gut mit den Ergebnissen des Screenings übereinstimmten, insbesondere wenn die abgeschätzten Unterschiede der Expressionsniveaus der VGSCαs in stark und schwach metastatischen Zellen verglichen werden (Tabelle IIIa und IIIb). Somit lagen, auch wenn die Screening-Ergebnisse und die SQT-PCR-Ergebnisse nicht direkt zur Bestimmung der absoluten Spiegel der VGSCα-Expression herangezogen werden können, Informationen bezüglich der relativen Spiegel der VGSCα-mRNA in Form der prozentualen Anteile der Klone eines jeden Typs in den Screens vor.
Es ist wichtig, dass der auffälligste Unterschied für SCN9A vorlag, der in den stark metastatischen Zellen wenigstens 1000-fach stärker exprimiert war. SCN9A war auch der vorherrschende VGSCα in den stark metastatischen Zelllinien und machte ungefähr 80 % der mRNA-Population der „funktionellen VGSCα" in den MAT-LyLu- und PC-3-Zellen aus.
Die Eignung der PCR für eine quantitative Analyse wird durch den Verlust der Quantifizierung in einem bestimmten Amplifizierungsstadium, jenseits dessen die Reaktion aufhört, exponentiell zu amplifizieren und schließlich ein Plateau erreicht, eingeschränkt (Morrison, C. & Gannon, F. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1219, 493-498). Dementsprechend erfordern die meisten der üblicherweise verwendeten „quantitativen" PCR-Techniken (dargestellt in einem Übersichtsartikel von Morrison & Gannon (1994)) die Beachtung dieses Einsetzens der nicht-exponentiellen Amplifizierung. Dieser Punkt konnte mit dem in der vorliegenden Studie eingeführten neuartigen Verfahren zur Analyse von SQT-PCR-Daten leicht bestimmt werden. Eine Polynomanalyse dritten Grades der Daten wurde basierend auf der Beobachtung der Kinetiken auf eine einfache, zeitsparende SQT-PCR-Technik angewandt, um das Stadium der PCR (repräsentiert durch die Zyklenzahl CN_e) zu bestimmen, an dem die exponentielle Amplifizierung aufhörte. CN_e konnte dann als ein Referenzwert für den leichten direkten Vergleich der Spiegel der VGSCα-mRNAs in unterschiedlichen Zelllinien verwendet werden, auf ähnliche Weise wie CN_t-Vergleiche. CN_e ist wahrscheinlich jedoch ein zuverlässigerer Parameter als CN_t, da (1) er aus mehreren Datenpunkten stammt und nicht der einzigen CN_t-Ablesung und (2) er ein kontinuierlicher, und nicht ein diskreter, Wert ist und somit genauer ist.
Man kann die Schlussfolgerung ziehen, dass unsere neuartigen degenerierten Screening- und SQT-PCR-Techniken ein konsistentes quantitatives Profil der VGSCα-Expression in diesen Zellen erzeugte. Das Ausmaß der Zuverlässigkeit dieser Analyse wurde ferner durch die Robustheit der Cytb₅R-Kontrolldaten unterstützt, die mit den verschiedenen Zelllinien erhalten wurden. Beide Verfahren, insbesondere in Kombination, repräsentieren somit leistungsstarke neue Werkzeuge für die schnelle, zuverlässige, qualitative/quantitative Analyse der Expression der VGSCα-mRNA, die besonders nützlich sind, wenn Zellen unterschiedlichen Phänotyps oder der gleiche Zelltyp unter verschiedenen Bedingungen verglichen werden bzw. wird.
Tabelle III Berechnete Unterschiede der Expressionsniveaus aller VGSCαs zwischen stark und schwach metastatischen (a) Rattenzelllinien und (b) menschlichen Zelllinien
Die Unterschiede sind für die CN_t-Werte, die CN_e-Werte (aus der SQT-PCR) und die Screeningdaten gezeigt und als Multiplikationsfaktoren ausgedrückt. Positive und negative Werte bezeichnen höhere und niedrigere Expressionsniveaus in den stark metastatischen Zellen im Vergleich zu den schwach metastatischen Zellen. Die CN_t- und CN_e-Unterschiede wurden unter der Annahme einer 80%igen PCR-Effizienz für jeden Fall (ähnlich der in Bishop et al. (1997) Immunol. Cell Biol. 75, 142-147 berichteten) nach der folgenden Gleichung berechnet: 1,8^{[MAT-LyLu-Wert-AT-2-Wert]} (45). Die Unterschiede in degenerierten Screens wurden unter der Annahme eines äquivalenten Expressionsspiegels der gewählten Standards (RB1 für die Ratten-Screens und hCytb₅R für die humanen Screens), die als „std" bezeichnet sind, in den stark und schwach metastatischen Zellen berechnet. „NB" zeigt an, dass der Unterschied nicht bestimmt werden konnte.

* Das war der minimale Expressionsunterschied zwischen stark und schwach metastatischen Zellen, bestimmt aus SQT-PCR-Daten, die mit dem dritten AT-2-Zellextrakt gewonnen wurden.

VGSCα-Gen	Genprodukt	CN_t	CN_e	Screen
SCN1A	RB1	– 1,5	+ 1,4	std (1)
SCN2A	RB2	– 26,9	– 18,9	– 40
SCN4A	rSkM1	– 3,1	– 3,4	– 4
SCN7A	SCL-11	+ 13,3	+ 13,3	+ 30
SCN9A	PN1	+ 100 000*	NB	NB
SCN11A	NaN	– 3,2	– 2,4	– 3
rCytb₅R	rCytb₅R	– 1,8	– 1,8	1

VGSCα	Gen	CN_t	CN_e	Screen
SCN2A	HB2	+ 9,9	NB	+ 13
SCN3A	HB3	+ 28,5	NB	+ 13
SCN8A	hNa6	+ 11,8	+ 18,9	+ 11
SCN9A	hNe-Na	+ ~1150	NB	NB
hCytb₅R	hCytb₅R	+ 1,2	+ 1,2	std (1)

Die Ergebnisse des Screens stimmten damit überein, da sich die Gesamtmenge der VGSCα-mRNAs in den stark und schwach metastatischen Zellen sehr stark unterschied. Die SQT-PCR-Daten legten nahe, dass die Expressionsniveaus von Cytb₅R in Zellen mit unterschiedlichem metastatischem Potenzial (sowohl der Ratte als auch des Menschen) sehr ähnlich waren. Dementsprechend zeigte die erhöhte Häufigkeit dieses Nicht-VGSCα-Klons in den degenerierten Screens der schwach metastatischen LNCaP- und AT-2-Zellen (Tabelle I) ein niedrigeres Verhältnis zwischen dem VGSCα-Target und dem Rauschen in diesen Zellen im Vergleich zu ihrem stark metastatischen Gegenstück an (und somit einen niedrigeren Spiegel der VGSCα-Expression).
Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen somit, dass ein basaler Expressionsspiegel der VGSCα-mRNA in den schwach metastatischen Zellen vorliegt, und dass dieser im stark metastatischen Phänotyp beträchtlich hochreguliert ist. Ein derartiger basaler Expressionsspiegel der VGSCα-mRNA in schwach metastatischen Zellen stimmt mit früheren Ergebnissen durchflusszytometrischer Messungen (38) überein, die eine geringe Menge des VGSCα-Proteins in LNCaP- und AT-2-Zellen zeigten, trotz des Fehlens elektrophysiologisch nachweisbarer VGS-Strome. Die Expression von VGSCαs in nicht-kanzerösen Prostataepithelzellen wurde in diesem Beispiel nicht untersucht. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um zu bestimmen, ob die basale VGSCα-Expression mit Neoplasien assoziiert ist oder ob sie für Epithelzellen der normalen Prostata charakteristisch ist.
Die Ergebnisse des Screenings und der SQT-PCR können nicht direkt zur Bestimmung der Absolutspiegel der VGSCα-Expression herangezogen werden. Die PCRs eines degenerierten Screens werden jedoch alle VGSCαs einer bestimmten Unterfamilie (z. B. Na_v1s) mit ungefähr der gleichen PCR-Effizienz amplifizieren, wodurch die Information über die relativen Expressionsspiegel der VGSCαs in der zellulären mRNA erhalten bleibt. Somit sollte es möglich sein, ihre relativen Häufigkeiten in den Screens zu vergleichen und diese Häufigkeiten mit den relativen Verhältnissen bestimmter VGSCαs in der mRNA der Zellen in Beziehung zu setzen. Die verfügbaren Daten sind mit den relativen Expressionsprofilen der VGSCαs, die in der 5 gezeigt sind, konsistent. Bei dieser Abschätzung machen die Produkte des SCN9A-Gens ungefähr 80 % der Population der mRNA der „funktionellen VGSCα" in den MAT-LyLu- und PC-3-Zellen aus.
Multiplizitat der VGSCα-Expression Zwar war das Ausmaß der Expression der VGSCα-mRNAs in den stark metastatischen MAT-LyLu-Zellen viel höher, und die meisten VGSCα-Typen wurden in stark metastatischen Zellen in größerer Menge als in schwach metastatischen Zellen exprimiert, aber für drei niedrig exprimierte VGSCα-Gene (SCN2A, SCN4A und SCN11A) wurde gefunden, dass sie in den schwach metastatischen AT-2-Zellen in geringfügig höherer Menge vorlagen. Das deutet stark darauf hin, dass diese VGSCαs normalerweise nicht zu den VGS-Strömen beitragen, die in den MAT-LyLu-Zellen nachgewiesen wurden, aber die physiologische Bedeutung, wenn es überhaupt eine gibt, und der Mechanismus bzw. die Mechanismen, die die Herunterregulierung der Expression steuern, müssen erst noch bestimmt werden. Im Gegensatz dazu waren in den menschlichen Zelllinien alle nachgewiesenen VGSCαs in den stark metastatischen PC-3-Zellen in größerer Menge exprimiert.
Die Expression multipler VGSCα ist kürzlich für adulte DRG-Zellen der Ratte (14), PC12-Zellen (49) und kultivierte Astrozyten des Rückenmarks (12) gezeigt worden. Die hier untersuchten Prostatakrebs-Epithelzelllinien repräsentieren noch einen weiteren Zelltyp, für den gezeigt wurde, dass eine gleichzeitige Expression multipler VGSCαs vorliegt. Für die meisten dieser Fälle wurde gefunden, dass ein breiter Bereich der Expressionsspiegel der VGSCα-mRNAs in den Zellen vorliegt. Derzeit ist die funktionelle Konsequenz oder sind die funktionellen Konsequenzen dieser multiplen Expression innerhalb eines Zelltyps unklar. Die VGSCα-Expression in diesen Zelltypen kann als Reaktion auf zahlreiche Stimuli, wie Wachstumsfaktoren und eine Axotomie (14, 17, 49), auf Subtyp-spezifische Weise dramatisch und schnell herauf- oder herunterreguliert werden. Das deutet stark darauf hin, dass unterschiedliche VGSCαs unterschiedliche Funktionen ausüben, deren relative Bedeutung sich unter unterschiedlichen Bedingungen schnell verändern kann. Eine Feinabstimmung der Expression könnte schnell erfolgen, um das Profil der VGSCα-Expression der Zelle an die erforderliche funktionelle Antwort anzupassen. Es erscheint sehr wahrscheinlich, dass derartige Veränderungen des funktionellen VGSC-Profils nur über die Regulation verschiedener VGSCαs, die bereits exprimiert werden, aber nicht über den langsameren Prozess des „Einschaltens" von VGSCα-Genen erreicht werden können. Somit könnte die Expression multipler VGSCα in geringer Menge die Zellen in die Lage versetzen, funktionellen Anforderungen, die als Folge dynamischer Veränderungen in ihrer Mikroumgebung notwendig werden, gerecht zu werden.
VGSCs sind in zahlreichen "nicht-erregbaren" Geweben, einschließlich epithelialer Typen wie des Retina-Pigment-, des Linsen- und des Kornea-Epithels, gefunden worden, wo ihre funktionelle Rolle in den meisten Fällen unbekannt ist (42, 50, 51). Eine funktionelle Rolle der VGSCs, an der keine Bildung von Aktionspotenzialen beteiligt ist, wurde für Astrozyten des Rückenmarks in vitro ermittelt (52). In diesen Zellen stellen die VGSCs statt dessen einen Rückkehrweg für Na⁺ bereit, wodurch die Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase aufrechterhalten wird. Zu weiteren Rollen für VGSCs in nichterregbaren Zellen könnte die Erzeugung abgestufter Potenziale gehören, die an der interzellulären Ca²⁺-Homöostase beteiligt sind, oder die Aktivierung verschiedener intrazellulärer Signalwege (52).
Hohe Expressionsspiegel „nicht-funktioneller VGSCαs" in Prostatakrebszellen Die Fähigkeit der in den MAT-LyLu- und PC-3-Zellen gefundenen SCN7A- und SCN8A-mRNA-Transkripte zur Erzeugung funktioneller VGSCs erscheint zweifelhaft. SCN7A codiert für ein Na_v2-VGSCα ohne nachgewiesene Fähigkeit zur Kanalbildung. Auch wenn für das SCN8A-Gen bekannt ist, dass es zur Bildung funktioneller VGSC-Proteine in der Lage ist, erscheint es fraglich, ob die in den humanen Prostatakrebszellen exprimierten spezifischen SCN8A-Genprodukte in diesen Zellen als funktionsfähige Kanäle fungieren können. hNa6N codiert für ein stark verkürztes VGSCα-Protein, das lediglich D1 und D2 aufweist (44). Diese Variante wurde in nicht-neuronalen und neonatalen Geweben gefunden, und es wurde vorgeschlagen, dass sie nicht in der Lage ist, funktionelle VGSCs zu bilden, sondern statt dessen als ein "storungssicherer" Mechanismus zur Verhinderung der Synthese des vollständigen adulten hNa5-VGSCα-Proteins dient (44). Tatsächlich wurde eine stark verkürzte α-Untereinheit eines spannungsgesteuerten K⁺-Kanals erfolgreich zur artifiziellen Unterdrückung endogener K⁺-Ströme in Zellen des Hypophysenvorderlappens der Ratte eingesetzt (53). Für die adulte Isoform von hNa6 wurde auch gefunden, dass sie sowohl in stark als auch in schwach metastatischen humanen Zellen in sehr geringer Menge exprimiert wird, aber es erscheint wahrscheinlich, dass das Vorliegen der neonatalen Isoform die funktionelle Expression von hNa6A verhindert. Die ΔhNa6-Variante, die das spannungsempfindliche S4-Segment in D3 verloren hat, ähnelt den in den spezifischen PCR-Tests gefundenen Spleißformen ΔhNe-Na, ΔPN1, ΔHB2 und ΔRB2. Diese Transkripte repräsentieren wahrscheinlich fehlgespleißte, nicht funktionsfähige Formen der VGSCα-Gene SCN8A, SCN9A und SCN2A (48). Das Vorkommen offenbar nicht-funktioneller VGSCαs könnte ein weiteres Mittel zu Regulation der effektiven VGSC-Expression in den Prostatakrebszellen darstellen.
Vorherrschende Expression von PN1/hNe-Na in stark metastatischen Zellen Die Ergebnisse der degenerierten Screens und der SQT-PCR zeigten übereinstimmend, dass PN1/hNe-Na die in stark metastatischen Zellen vorherrschend exprimierte VGSCα-Form war. Weiterhin zeigten Sequenzdaten, dass die meisten der SCN9A-Transkripte in der neonatalen Form vorlagen. Tatsächlich wurde die adulte Spleißform bis heute nur in sehr geringen Mengen in Schwann-Zellen des neugeborenen Kaninchens gefunden (21), und so ist es derzeit unklar, ob das alternative D1:S3-Spleißen des SCN9A-Gens entwicklungsabhängig reguliert ist. Es könnte bemerkenswert sein, dass alle VGSCαs außer RB2, für die gefunden wurde, dass sie in den Prostatakrebszellen an der Stelle D1:S3 alternativ gespleißt sind, auch hauptsächlich in der neonatalen Form exprimiert werden.
Die vorliegende Untersuchung liefert ein Beispiel für die Expression des SCN9A-Gens in Karzinomen, was anzeigt, dass die Hochregulierung der Expression des SCN9A-Gens ein generelles, mit Karzinomen assoziiertes Phänomen sein könnte. hNe-Na wurde ursprünglich aus der klonalen C-Zelllinie eines humanen Karzinoms der Schilddrüsenmedulla (hMTC-Zellen) kloniert und sequenziert, und es wurde gefunden, dass es in menschlichem C-Zell-Karzinomgewebe exprimiert wird (54). Der PN1-Klon wurde aus PC12-Zellen gewonnen, die von einem Phäochromozytom der Nebennierenmedulla der Ratte abstammen (49). Es gibt in diesen Studien keinen Hinweis auf eine Verbindung zwischen der Expression von hNe-Na oder PN1 und Karzinomen.
Die SCN9A-Produkte wurden bereits in hoher Menge im peripheren Nervensystem und, in viel geringeren Mengen, im Gehirn, im Rückenmark, in Schwann-Zellen, im Herzen und in der Nebenniere und der Schilddrüse gefunden (49, 54–56), insbesondere in neuroendokrinen Zellen (54, 55). Neuroendokrine Zellen kommen auch in der Prostata vor. Jüngere Studien legen nahe, dass ihre Proliferation und Differenzierung möglicherweise die Progression des Prostatakrebses vorhersagt (Cohen et al. (1994) Cancer 74, 1899-1903, Anthony di Sant'Agnese, P. (1998) Prostate Suppl. 8, 74-79, Bonkhoff, H. (1998) Prostate Suppl. 8, 18-22). Neuroendokrinen Zellen der Prostata fehlen nachweisbare nukleare Androgenrezeptoren (Bonkhoff H. et al. (1993) Virchows Arch. A. Pathol. Anat. 423, 291-294, Krijnen, J. et al. (1993) Histochemistry 100, 393-398), was nahelegt, dass sie androgenunempfindlich sind. Die neuroendokrine Unempfindlichkeit könnte eine Rolle bei den Mechanismen spielen, die für die Progression von Adenokarzinomen der Prostata zur Androgenunempfindlichkeit verantwortlich sind. Interessanterweise können Androgene die Aktivität von VGSCs hemmen (Tabb, J.S. et al. (1994) J. Neurosci. 14, 763-773), und sie könnten auch die VGSCα-mRNA-Expression erniedrigen, wie für andere Steroidhormone gefunden wurde (Rich, M.M., Kraner, S.D. und Barchi, R.L. (1999) Neurobiol. Dis. 6, 515-522). Somit könnte es sein, dass es mit dem Auftreten hoher Spiegel der VGSCα-mRNA-Expression in Prostataepithelzellen zu einer Androgenunempfindlichkeit kommt.
Soweit Vergleiche angestellt werden können, sind die elektrophysiologischen und die pharmakologischen Eigenschaften der VGSCs vom PN1- und hNe-Na-Typ sehr ähnlich denjenigen der VGS-Strome, die in den stark metastatischen Prostatakrebszellen der Ratte und des Menschen beobachtet wurden (36, 37, 39, 49, 54, 56). Das stimmt damit überein, dass spezifisch die SCN9A-Produkte die Quelle für die in diesen Zellen aufgezeichneten VGS-Ströme sind. Da für diesen VGSCα gezeigt wurde, dass er den Invasionsprozess potenziert (36–38), könnte man erwarten, dass er ein besonderes Muster der subzellulären Verteilung, eine Wechselwirkung mit dem Zytoskelett und/oder spezialisierte elektrophysiologische Eigenschaften zeigt, die diese Aktivität ermöglichen. Tatsächlich hat eine jüngere elektrophysiologische Untersuchung eine offenbar einzigartige Eigenschaft von hNe-Na beleuchtet, nämlich eine sehr langsame Geschwindigkeit der Inaktivierung des geschlossenen Zustands. Das ermöglicht die Erzeugung „ansteigender Ströme" als Reaktion auf langsame, aber allmählich zunehmende, unterschwellige Stimuli (Cummins et al. (1998) J. Neurosci. 18, 9607-9619). VGSCαs mit einer schnelleren Inaktivierung des geschlossenen Zustands sind unfähig, auf derartige Stimuli zu reagieren.
Das PN1-Protein zeigt auch eine spezifische subzelluläre Lokalisation in mit dem nerve growth factor (NGF) differenzierten PC12-Zellen und kultivierten DRG-Neuronen der Ratte, wobei es spezifisch in den Termini von Neuriten und an den vorderen Rändern von Wachstumskegeln vorhanden ist (49). NGF reguliert die Expression von PN1 in PC12-Zellen hoch, und daran schließt sich die morphologische Differenzierung von einer runden in eine hochverzweigte Form an, was eine Rolle dieses VGSCα bei der Ausprägung der Zellmorphologie zeigt (57). In Übereinstimmung damit hatte die Behandlung mit TTX die entgegengesetzte Wirkung auf die Morphologie der MAT-LyLu-Zellen und brachte sie dazu, ihre Fortsätze zurückzuziehen und kompakt zu werden (58).
Die Bestimmung der Produkte des SCN9A-Gens als spezifische Quelle für die Expression von funktionellem VGSC in stark metastatischen Prostatakrebszellen sowohl in Rattenmodellen als auch in menschlichen Modellen der Krankheit ermöglicht nun die Durchführung spezifischerer Experimente zur weiteren Aufklärung aller Aspekte des Metastasierungsmechanismus: (1) von Elementen stromaufwärts des SCN9A-Gens, die spezifisch die Zunahme der Expression dieses Gens bewirken, zum Beispiel Hormone, Wachstumsfaktoren und Transkriptionsfaktoren/Repressoren; (2) von stromabwärts liegenden Elementen, die es der SCN9A-Expression ermöglichen, die Invasion/Metastasierung zu potenzieren.
Mögliche Expression anderer VGSC-Untereinheiten in Prostatakrebszellen Die vorliegende Studie strebte lediglich an, die Expression der VGSCα-mRNA in den stark und schwach metastatischen Zellen zu charakterisieren, da VGSCαs allein für die Codierung funktioneller VGSCs ausreichen. Die für die Prostatazellen ermittelte Multiplizität der VGSC-Expression könnte durch die mögliche Expression sogar noch niedrigerer Transkriptmengen anderer VGSCαs und durch die Expression von VGSCβs weiter verkompliziert werden. Für die Produkte des SCN1A-, SCN2A-, SCN3A-, SCN4A- und des SCN8A-Gens wurde gefunden, dass sie alle mit einem oder mehreren VGSCβ(s) assoziieren, und so erscheint es wahrscheinlich, dass eine gewisse Expression von VGSCβ in diesen Zellen erfolgt. Es sieht jedoch so aus, dass die Produkte des SCN9A-Gens nicht mit VGSCβs assoziieren (54, 55), und so erscheint es unwahrscheinlich, dass diese zusätzlichen Untereinheiten einen signifikanten Beitrag zu dem Mechanismus oder den Mechanismen leisten, der bzw. die für das hohe Ausmaß der Expression von funktionellem VGSC in den metastatischen Zellen verantwortlich ist bzw. sind.
Es ist nicht sicher, dass alle VGSCα-Gene, für die gefunden wurde, dass sie in diesen Zellen exprimiert werden, tatsächlich in Proteine translatiert werden. Falls alle exprimierten VGSCα-Gene möglicherweise translatiert werden können, könnte eine derartige Multiplizität eine schnelle Hochregulation oder Herunterregulation des VGSCα ermöglichen (potenziell schneller als das „Anschalten" der Transkription von VGSCα-Genen), und zwar auf eine Subtyp-spezifische Weise als Reaktion der Zellen auf verschiedene Stimuli, wie Wachstumsfaktoren und eine Schädigung (Fjell et al. (1999) Molec. Brain Res. 67, 267-282, Dib-Hajj et al. (1996) PNAS 93, 14950-14954, Toledo-Aral et al. (1997) PNAS 94, 1527-1532). Das würde implizieren, dass unterschiedliche VGSCαs unterschiedliche Funktionen ausüben, deren relative Bedeutung sich unter verschiedenen Bedingungen schnell ändern kann. Somit könnte eine niedrige Expression multipler VGSCαs die Zellen in die Lage versetzen, funktionellen Anforderungen gerecht zu werden, die als Folge dynamischer Veränderungen in ihrer Mikroumgebung notwendig werden.
Schlussbemerkungen
Aus der vorliegenden Studie ergeben sich zwei generelle Schlussfolgerungen. Erstens etabliert die Charakterisierung der funktionell unterschiedlichen Expressionsprofile der VGSCα-mRNA diese Zellen nun als ein gutes Modell, in dem die Muster, die Regulation und die funktionellen Konsequenzen (i) der VGSC-Expression in nichterregbaren Zellen und (ii) des sich herauskristallisierenden Konzepts der Multiplizität der VGSC-Expression, d. h. der Expression multipler VGSC-Untereinheiten und multipler Spleißformen dieser Untereinheiten, in einem einzigen Zelltyp studiert werden können. Zweitens besteht, was den Prostatakrebs selbst betrifft, eine ernste Limitierung hinsichtlich der derzeitigen Handhabungsverfahren darin, dass die für den metastatischen Phänotyp verfügbaren Marker (wie das prostataspezifische Antigen) nicht zuverlässig sind (59, 60). Somit können klinisch bedeutsame Krebsarten nicht leicht von denjenigen unterschieden werden, die klinisch unerheblich sind und keine aggressive Behandlung erfordern (die mit einer hohen Erkrankungshäufigkeit der Patienten assoziiert ist). Die Identifizierung der Produkte des SCN9A-Gens als die vorherrschenden VGSCαs sowohl in Rattenmodellen als auch in menschlichen Modellen des Prostatakrebses hebt die Konservierung der VGSCα-Expression in stark metastatischen Prostatakrebszelllinien hervor. Somit unterstützt die vorliegende Untersuchung den potenziellen Wert dieser Ionenkanäle für die mögliche Diagnose und Therapie der Krankheit zusätzlich.
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Beispiel 2: Design von Antisenseoligonukleotiden zur Unterdrückung der VGSC-Expression des menschlichen Prostatakrebses
1. Ausrichtung aller derzeit bekannten VGSC-Typen zur Identifizierung potenzieller Stellen für das Design VGSC-Subtyp-spezifischer Antisenseoligonukleotide
Bei der obigen Ausrichtung wurde, wenn es möglich war, das humane VGSC-Äquivalent verwendet. Die Ausrichtung wurde über die Einführung von Sequenzlücken optimiert, die mit einem Strich bezeichnet sind, auch wenn Lücken in der wirklichen Sequenz oder irgendeinem Oligonukleotid-Design nicht tatsächlich vorliegen. Die am häufigsten vorkommenden Nukleotide sind in der Konsensus-Zeile („Cons") angegeben. Potenzielle Stellen für das Design von 20-mer Antisenseoligonukleotiden sind in den vier humanen VGSC-Typen, die sowohl in den degenerierten Screens als auch in den spezifischen PCR-Tests mit den PC-3- und LNCaP-Zelllinien gefunden wurden, in Großbuchstaben dargestellt und unterstrichen. Der am stärksten nichtkonservierte Bereich des durch den degenerierten Screen erzeugten Fragments wurde zur Generierung dieser Aufstellung eingesetzt.

Es wäre auch möglich, 20-mer-Antisenseoligos für den zytoplasmatischen 3/4-Linker (wo die VGSC-Sequenz in allen Typen hochkonserviert ist) zu entwerfen, die einzeln in der Lage sind, gleichzeitig eine Anzahl von VGSC-Typen stillzulegen. Zum Beispiel sind unten die gleichen Abschnitte von 20 Nukleotiden des 3/4-Linkers dreier VGSC-Typen ausgerichtet. In diesem Abschnitt sind die hNe-Na-Sequenz und die Sequenz „Menschliches Hirn 2" identisch, und die hSkM1-Sequenz unterscheidet sich nur an zwei Nukleotidpositionen. Deshalb ist es für diesen Bereich möglich, zwei Antisenseoligonukleotide zu konstruieren, die wenigstens drei der Kanäle ausknocken (möglicherweise vier, wenn die (menschliche) Na6-Sequenz für diesen Bereich bestätigt worden ist).
hNe-Naq TTATGACAGAAGAACAGAAG
Human-brain-2 TTATGACAGAAGAACAGAAG
hSkM1 TTATGACgGAgGAACAGAAG Tabelle 2 Ergebnisse der Screens mit degenerierten VGSCα-Primern für (a) die von der Ratte stammenden MAT-LyLu- und AT-2-Zelllinien und (b) die vom Menschen stammenden PC-3- und LNCaP-Zelllinien, ausgedrückt als Prozentsatz der getesteten Klone (a)

VGSCα-Gen	Genprodukt	MLL (1) n = 50	MLL (2) n = 50	MLL (3) n = 50	AT-2 (1) n = 50	AT-2 (3) n = 50	AT-2 (4) n = 50
SCN1A	RB1	6	6	4	12	58	32
SCN2A	RB2	0	0	0	2	2	0
SCN4A	rSkM 1	0	0	0	58	22	22
SCN7A	SCL-11	70	48	48	2	4	26
SCN9A	PN 1	20	44	48	0	0	0
SCN11A	NaN	0	0	0	12	6	6
Nicht-VGSCα	identifiziert	4	2	0	4	2	12
Nicht-VGSCα	unbekannt	0	0	0	10	6	2

(b)

VGSCα-Gen	Genprodukt	PC-3 (1) n = 50	PC-3 (2) n = 50	LNCaP (1) n = 50	LNCaP (2) n = 50
SCN2A	HB 2	6	6	4	18
SCN3A	HB 3	0	2	0	2
SCN8A	hNa6	46	50	62	32
SCN9A	hNe-Na	48	30	0	0
Nicht-VGSCα	identifiziert	0	12	22	40
Nicht-VGSCα	unbekannt	0	0	12	8

Tabelle 3 VGSCα-Spleißvarianten, die bis jetzt in den stark und schwach metastatischen Prostatakrebszelllinien gefunden wurden. Wenn adulte und neonatale Formen des VGSCα-Typs beschrieben wurden, ist die in den Prostatakrebszellen gefundene Form angegeben. Δ bezeichnet Spleißvarianten mit fehlenden Exons, die für das S4-Segment von D1 oder D3 codieren (siehe Abschnitt 4.3).

VGSCα-Typ	Stark metastatische Zellen	Schwach metastatische Zellen
PN1	volle Länge	noch zu bestimmen
SCL-11	volle Länge	noch zu bestimmen
RB1	adult	adult
RB2	noch zu bestimmen	noch zu bestimmen
rSkM1	volle Länge	volle Länge
NaN	noch zu bestimmen	noch zu bestimmen
hNe-Na	volle Länge ΔhNe-Na neonatal	volle Länge
hNa6	ΔnHa6 volle Länge	ΔnHa6 volle Länge
HB2	ΔHB2	ΔHB2
HB3	neonatal	adult

Beispiel 3: Die Expression des spannungsgesteuerten Na*-Kanals korreliert mit der pathologischen Progression des menschlichen Prostatakrebses
Frühere elektrophysiologische Untersuchungen haben gezeigt, dass funktionelle spannungsgesteuerte Na*-Kanäle (VGSCs) selektiv von hochmetastatischen Zelllinien des Prostatakrebses der Ratte (MAT-LyLu) und des Menschen (PC-3) exprimiert werden. Weiterhin reduzierte die Blockade dieser Kanäle mit Tetrodotoxin die Invasion dieser Zellen in vitro beträchtlich (Grimes et al. (1995) FEBS Letts. 369, 290-294, Laniado et al. (1997) Am. J. Pathol. 150, 1213-1221. Eine direkte, positive Korrelation zwischen der Invasivität und der Expression des Na⁺-Kanalproteins durch mehrere verschiedene Prostatakrebszelllinien der Ratte und des Menschen wurde danach von Smith et al. (1998) FEBS Letts. 423, 19-24 demonstriert. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die VGSC-Expression beim menschlichen Prostatakrebs in vivo erfolgt, und wenn dem so ist, ob die Expressionsspiegel mit dem metastatischen Profil der ihn ausmachenden malignen Epithelzellen in Beziehung stehen.
Die immunhistochemische Lokalisation des VGSC-Proteins in Gewebeschnitten der menschlichen Prostata, die Epithelgänge mit unterschiedlichem metastatischem Charakter, einschließlich von In-situ- und invasiven Krebszellen, enthält, ist in der 6 gezeigt. Eine starke inkrementelle Zunahme der Färbungsintensität wurde mit der Progression des pathologischen Charakters der Epithelzellen von normal zur invasiven Neoplasie beobachtet (6A bis E). Bei der benignen Prostatahyperplasie (BPH) war das Ausmaß der VGSC-Expression durch die sie ausmachenden Epithelzellen sehr niedrig und in erster Linie auf Basalzellen beschränkt (6A). Bei der intraepthelialen Low-Grade-Prostataneoplasie (Low-Grade-PIN) war das Gesamtausmaß der Expression erhöht, wobei die immunhistochemische Färbung der Basalzellen etwas intensiver erschien (66). Für die BPH und die Low-Grade-PIN zusammengenommen lag das Verhältnis der optischen Dichte apikal:basal bei 0,74 ± 0,05 (n = 450 Gänge, 30 Schnitte, 10 Patienten). Eine markante, schrittweise Zunahme der VGSC-Expression war mit dem Erscheinen einer High-Grade-PIN assoziiert, die anhand der charakteristischen Architektur und zytologischer Merkmale eines mehrschichtigen Aufbaus, einer schweren Dyskaryose und einer Vergrößerung der Nukleoli erkannt wurde (6C). Dieser Trend blieb sowohl in den Gängen als auch den Acini, die maligne Veränderungen in situ (InsM) enthielten, wo Basalzellen fehlten (6D), sowie bei invasiven Krebszellen (InvC) erhalten (6E). Die Expression des VGSC war besonders längs der apikalen Plasmamembranen der luminalen Epithelzellen im InsM-Stadium (6D) deutlich. Für InvC war die Färbung auch längs der Plasmamembranen der Zellen intensiv (6E). Für die Epithelzellen der High-Grade-PIN und der epithelialen InsM-Zellen zusammengenommen lag das optische Verhältnis apikal:basal der VGSC-Färbung bei 1,57 ± 0,19 (n = 750 Gänge, 30 Schnitte, 10 Patienten). Dieses Verhältnis lag erheblich höher, wenn es mit dem für Gänge der Low-Grade-PIN verglichen wurde (P < 0,01).
Es lässt sich somit die Schlussfolgerung ziehen, dass für das erhöhte Ausmaß der VGSC-Expression, für das wir zuvor nachgewiesen haben, dass es mit dem metastatischen Phänotyp von Prostatakrebszellen in vitro assoziiert ist, nun auch bestätigt wurde, dass es auch in vivo vorliegt. Somit scheint es, dass die Hochregulation der Expression von funktionellem VGSC als ein integraler Bestandteil eines erhöhten metastatischen Potenzials erfolgt. Die VGSC-Aktivität könnte zur Metastasierung beitragen, indem sie die zellulären Prozesse der Extension (Fraser et al. (1999) Cell Tissue Res. 295, 505-512), der Beweglichkeit (Fraser et al. (1998) J. Physiol. 513.P, 131P), der Invasivität (Grimes et al., 1995, Laniado et al., 1997, Smith et al., 1998) oder der intrazellulären Homöostase (Foster et al. (1999) Br. J. Urol. 83, 171-194) verstärkt. Die zytologische Polarität der Hochregulation der VGSC (apikal gegenüber basal) könnte wiederum eine gerichtete Invasion in angrenzende Gewebe ermöglichen. Die vorliegenden Beobachtungen übertragen zuvor in Modellsystemen aus klonal erzeugten Zelllinien in vitro gewonnene, fundamentale Informationen auf nicht-selektierte und nicht-klonale, primäre menschliche Gewebe. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die VGSC-Expression ein phänotypisches Erfordernis metastatischer Prostatakrebszellen sein könnte und somit einen wertvollen neuartigen Marker zur Identifizierung einer potenziell metastatischen Erkrankung zum Zeitpunkt der primären Gewebediagnose darstellen könnte.
Beispiel 4: Regulation der VGSC-Funktion in Prostatakrebszelllinien
Es wurde die funktionelle VGSC-Expression in Nagetier-MAT-LyLu-Zellen untersucht. Der epidermal growth factor (EGF) reguliert die Expression von funktionellem VGSC hoch. Wie in der 9 gezeigt ist, potenziert EGF die Expression von funktionellen VGSC. Diese Wirkung wird durch die gleichzeitige Verabreichung eines Inhibitors der EGF-Rezeptorkinase (AG1478, Calbiochem, San Diego, Kalifornien, USA) blockiert. Die Anwendung eines EGF-Rezeptor-Antikörpers (Oncogene, Cambridge, Massachusetts, USA) vermindert ebenfalls den basalen VGSC-Strom, was impliziert, dass das Phänomen endogen vorkommt.
Andere Wachstumsfaktoren (zum Beispiel der nerve growth factor) und Hormone (einschließlich von Androgenen) könnten ähnliche Wirkungen haben.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren, das zur Bestimmung der Anfälligkeit eines menschlichen Patienten für Prostatakrebs beiträgt und den Schritt der Bestimmung, ob eine Nukleinsäure und/oder Protein des Patienten enthaltende Probe eine Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehenden spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe/Na enthält, umfasst, wobei eine solche Menge als die im Vergleich zu bekannten nicht-kanzerösen oder nicht-metastatischen Prostatazellen bei bekannten kanzerösen oder metastatischen Prostatazellen vorhandene erhöhte Menge definiert ist.
Verfahren, das zur Diagnose von Prostatakrebs bei einem menschlichen Patienten beiträgt und den Schritt der Bestimmung, ob eine Nukleinsäure und/oder Protein des Patienten enthaltende Probe eine Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehenden spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe/Na enthält, umfasst, wobei eine solche Menge als die im Vergleich zu bekannten nicht-kanzerösen oder nicht-metastatischen Prostatazellen bei bekannten kanzerösen oder metastatischen Prostatazellen vorhandene erhöhte Menge definiert ist.
Verfahren, das zur Vorhersage der relativen Aussichten auf ein bestimmtes Ergebnis eines Prostatakrebses bei einem menschlichen Patienten beiträgt und den Schritt der Bestimmung, ob eine Nukleinsäure und/oder Protein des Patienten enthaltende Probe eine Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehenden spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe/Na enthält, umfasst, wobei eine solche Menge als die im Vergleich zu bekannten nicht-kanzerösen oder nicht-metastatischen Prostatazellen bei bekannten kanzerösen oder metastatischen Prostatazellen vorhandene erhöhte Menge definiert ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Krebs metastatisch ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem die Probe Nukleinsäure enthält und die Nukleinsäure des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na durch Kontaktieren der Nukleinsäure mit einer Nukleinsäure, die selektiv mit der Nukleinsäure des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na hybridisiert, gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Probe mRNA enthält und die Nukleinsäure selektiv mit der mRNA des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, bei dem die Nukleinsäure, die hybridisiert, nachweisbar markiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei dem die Nukleinsäure, die selektiv hybridisiert, einzelsträngig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, bei dem sich die Nukleinsäure, die selektiv hybridisiert, für die Verwendung in einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion eignet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Probe Protein enthält und die Menge des Proteins des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Proteinmenge durch Kontaktieren des Proteins mit einem Molekül, das sich selektiv an das Protein des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na bindet, gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das sich selektiv bindende Molekül ein Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon oder ein antikörperartiges Molekül ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem das sich selektiv bindende Molekül eine nachweisbare Markierung umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem die Probe eine Probe des Gewebes ist, in dem Krebs vermutet wird oder gefunden werden könnte oder gefunden worden ist, oder Zellen von diesem Gewebe enthält.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Gewebe Prostatagewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Probe Urin, Sperma, Blut oder Lymphe ist.
Verwendung einer Substanz, die zur Bestimmung der Menge der Nukleinsäure oder des Proteins des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na in einer Probe bei der Herstellung eines Reagens zur Diagnose von Prostatakrebs verwendet werden kann, wobei die Substanz eine Nukleinsäure ist, die selektiv mit der Nukleinsäure des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na hybridisiert, oder ein Molekül, das sich selektiv an das Protein des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na bindet, wobei das Molekül ein Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon oder ein antikörperartiges Molekül ist.
Verwendung einer Substanz nach Anspruch 17 bei einem Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs.
Verwendung einer Substanz nach Anspruch 17 zur Diagnose von Prostatakrebs.
Für die Diagnose von Prostatakrebs nützliches Kit, das eine Substanz, die zur Bestimmung der Menge des Proteins oder der Nukleinsäure des spannungsgesteuerten Na⁺-Kanals hNe-Na in einer Probe nach Anspruch 17 verwendet werden kann, sowie ein weiteres Mittel zur Abtrennung von Prostataepithelzellen von einer Probe umfasst, wobei das Mittel einen prostata-spezifischen Antikörper nutzt.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die für die Behandlung von Prostatakrebs nützlich sein könnte und den spannungsgesteuerten Na⁺-Kanal hNe-Na selektiv inhibiert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren einer Testverbindung mit dem spannungsgesteuerten Na⁺-Kanal hNe-Na und Bestimmung, ob die Verbindung inhibierend ist; (b) Kontaktieren der Testverbindung mit anderen spannungsgesteuerten Na⁺-Kanälen und Bestimmung, ob die Verbindung inhibierend ist; und (c) Auswahl einer Verbindung, die in (a) im Wesentlichen inhibierend ist, in (b) aber im Wesentlichen nicht inhibierend ist.