JP2005525826A - 肺腫瘍に関連したマーカー分子 - Google Patents

Abstract

本発明は、肺癌に関連する核酸およびポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、核酸およびその転写されたポリペプチドに関し、その発現は、肺癌に関連して著しく変化される。本発明は、本明細書中に開示される遺伝子の差示的にスプライシングされる一連の転写産物に関し、この転写産物は、気道の腫瘍に関連する。さらに、本発明は、肺腫瘍等の細胞増殖性傷害の早期診断、疾患経過の予後、およびモニタリングの方法と、治療方法と、ワクチン接種とを、提供する。

Description

本発明は、肺癌に関連する核酸およびポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、核酸およびその転写されるポリペプチドに関し、その発現は、肺癌に関連して著しく変化される。本発明は、本明細書中に開示される遺伝子の選択的にスプライシングされる一連の転写産物に関し、この転写産物は、気道の腫瘍に関連する。さらに、本発明は、肺腫瘍等の細胞増殖性疾患の早期診断、予後診断、および疾患の経過のモニタリングする方法と、治療方法と、ワクチン接種とを提供する。

先進国では、癌による死亡率は過去１０年間で減少した。癌が原因の死亡率での減少の１つの例外は、肺癌である。肺癌全般は、依然として発病率の増加を示す世界で数少ない癌の１つである。肺癌は、男性および女性両方で癌死の主な原因である。さらに、今日に至るまで、肺癌での生存率は低く、肺癌分野での科学的かつ医療的な取り組みにもかかわらず、生存率は殆ど増加しなかった。

他の大部分の腫瘍と同様に肺腫瘍では、初期治療に伴う患者の転帰と疾患が診断された段階との間に強い相関関係がある。そのため、癌が検出されるのが早いほど、患者が生存する確率が増える。したがって、早期段階で腫瘍を検出するための高感度な試験法が必要とされる。

腫瘍の早期診断に対する最も期待の高い方法は、腫瘍細胞に特有の分子マーカーに関連するものである。

肺癌は、極めて異質な疾患である。細胞増殖の複数の調節因子が癌の発生に関与している可能性がある。細胞周期の調節因子は、突然変異して形質転換状態になる癌遺伝子と呼ばれるポジティブな調節因子か、または腫瘍抑制遺伝子と呼ばれるネガティブな調節因子のどちらかの可能性がある。細胞周期の調節に関与することで知られている因子の数および癌の成長の潜在的な候補の数は、既知のもので１００を超え、依然増加している。
細胞の癌性状態の発生に関与している分子を、癌細胞と正常組織との識別に用いることができる。したがって、癌細胞に特有の分子を検出することによって、癌組織を検出することができる。これは、多数の分子が癌の原因に潜在的に関与しているので複雑になっている。

腫瘍の改良された診断としては、癌、特に肺癌の診断に使用する新規のマーカー分子が必要とされており、このマーカー分子により特異的な早期検出が可能になり、早期段階で疾患を治療する機会が与えられる。

本発明は、肺癌に関連する核酸およびポリペプチドを提供する。本発明によれば、これらの分子を分子マーカーとして使用してもよく、早期段階でも、肺腫瘍等の細胞増殖性疾患を広範に検出することが可能になる。

したがって、本発明は、肺腫瘍に関連して発現が著しく変化し、細胞増殖の異常に関連する疾患の予後診断および診断を向上させることが可能なポリペプチドおよび核酸を提供する。さらに、本明細書中に開示される核酸は、遺伝子の選択的スプライシングから生じる転写産物を含み、腫瘍組織で発見される可能性があるので、正常組織では発生しない。

本発明の別の態様では、本明細書中に開示される核酸および／またはポリペプチドは、肺腫瘍等の細胞増殖性疾患の治療および／またはワクチン接種のため、単独で、または他の分子と組み合わせて用いてもよい。

本発明のさらに別の態様は、単独で用いるか、あるいは１つ以上の他の治療因子もしくは診断因子および／または担体またはアジュバント物質と組み合わせて用いる本明細書中に開示されるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物である。
本発明は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを検出するための診断用キットまたは調査用キット等のキット、あるいは本明細書中に開示されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはその組み合わせを含むキットも提供する。

本発明に至る実験の過程で、肺腫瘍に関連して発現する遺伝子を同定した。本発明はさらに、試料中での、本明細書中図１〜１１に提示するマーカー遺伝子から転写されるポリペプチドの発現と同様に核酸の発現レベルにより、肺腫瘍等の細胞増殖性疾患を診断および選別して、疾患の経過の予測および初期治療後の疾患の経過観察が可能になるという本発明者らの発見（実施例１〜６で示す）に基づく。

本発明は、したがって、肺癌に関連する新規の核酸およびポリペプチドを提供する。

１つの態様では、本発明の方法は、肺腫瘍等の細胞増殖性疾患の早期検出と、微少な後遺症の診断過程での汎発性の腫瘍細胞の検出とに特に有用である。
本発明の別の態様では、本明細書中に開示される核酸またはポリペプチドを、腫瘍切除、生検材料等の試料での細胞の異常性増殖に関連する疾患の診断過程で用いてもよい。この態様では、本発明は、分子特性にしたがって疾患の治療方策を築くことを可能にする方法を提供する。本発明では、該ポリペプチドおよび／または核酸のレベルを、予後診断、モニタリング、腫瘍治療論の方策の設計のために、分子マーカーとして用いることができる。

本発明のさらに別の態様は、本発明の遺伝子の発現の活性化因子およびインヒビターの同定方法と同様に、本発明の核酸およびポリペプチドに結合する分子の同定方法を提供する。また、増殖性疾患の治療用の薬物候補を同定する方法も提供する。

本発明は、図１〜１１で示す配列により特定される腫瘍に関連する核酸およびポリペプチドを提供する。

本発明で用いるマーカー分子は、核酸およびポリヌクレオチドを含んでよい。核酸のレベルに応じて、マーカー分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡまたはｈｎＲＮＡのようなＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡでもよい。本発明の１つの好適な実施形態では、特定の選択的スプライシング事象により生じる核酸は、マーカー分子でもよい。

本発明で用いられるように、発現は、例えば、タンパク質の発現を含んでよい。したがって、ＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのレベルは、本発明に従った発現であると理解されてもよい。

化合物の発現は、発現のレベルが３０パーセント以上異なる場合、本発明にしたがって著しく変化したと言える。発現の変化は、例えば、該化合物の上昇した発現または減少した発現を含んでよい。変化させた発現の別の態様は、化合物が非野生型状況下で発現されるような変化であってもよい。これは、例えば、発現が天然に抑制される状況で化合物が発現されること、または化合物の発現を天然に誘起する状況で発現されないこと含んでよい。

本明細書中で用いられる発現の変化はまた、遺伝子の転写パターンでの変化を含んでもよい。例えば、転写パターンの変化は、遺伝子の選択的スプライシングを含んでよい。転写パターンでの変化は、変化した転写産物から翻訳されるポリペプチドに影響する可能性があり、また非翻訳領域に限定される可能性がある。遺伝子の転写パターンの変化は、転写産物中の新規のエキソンの使用、転写産物中のエキソンの欠失、または細胞中の異なるスプライシング改変体の割合の変形を含んでよい。したがって、本明細書中で用いられる遺伝子の転写パターンの変化は、制御組織に発生する野生型の核酸と比べて、核酸配列の付加的伸長を含むｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等のような核酸の産生を含んでよい。また、選択的スプライシングパターンにより産生される核酸は、野生型のポリヌクレオチドに存在する核酸配列の伸長を失っている核酸を産生する可能性がある。付加的伸長の存在は、単一の転写産物中の元の配列伸長の不在と同時に起る可能性がある。本発明の文脈中用いられるように、遺伝子発現の変化は、遺伝子のスプライシング改変体の発現レベルでの変化も含んでもよい。これは、野生型組織には存在しない改変体の発現と同様に、特定のスプライシング改変体の増加または減少した発現を含んでよく、または野生型組織に存在するスプライシング改変体の発現の不在を含んでよい。１つの実施例では、スプライシング改変体の発現の変化は、該組織中の異なるスプライシング改変体の割合の変化を含んでよい。

本発明の文脈中に用いられるように、核酸は、好ましくはポリヌクレオチドまたはそのフラグメントである。好適なポリヌクレオチドは、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含み、好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４５個の連続したヌクレオチドを含み、これらは同一であるか、配列相同性を共有しているか、または本明細書に開示される増殖性疾患に関連するポリペプチドに対して、同一もしくは相同のポリペプチドをコードする。本発明の核酸は、該ポリヌクレオチドのいずれに相補的であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖（センスまたはアンチセンス）または二重鎖分子を含んでもよく、さらにＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）またはＲＮＡであってよい。ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ（イントロンを含まない）と同様に、ｈｎＲＮＡ（イントロンを含む）を含む。本発明では、ポリヌクレオチドは、支持体原料または検出マーカー分子等の任意の他の分子に結合してもよく、必須ではないが、付加的なコードまたは非コード配列を含んでもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、ネイティブな配列またはその改変体であってもよい。改変体は、それぞれのネイティブなタンパク質に対して、コードされるポリペプチドの免疫原性が減じることのないように１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含んでよい。改変体は、本発明の方法に用いられるネイティブな核酸分子に対して、好ましくは７０パーセント、さらに好ましくは少なくとも８０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性を示す。配列類似性を測定する方法は、当業者に既知である。

配列類似性を検出する１つの例は、ＤＫＦＺ ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のＨＵＳＡＲサーバーで入手可能なＦａｓｔＡおよび／またはＢｌａｓｔＮというバイオインフォマティクス・ソフトウエアを用いて実行できる。

さらに、本発明の核酸は、ストリンジェントな条件下で、本明細書で開示される配列に特異的なプローブにハイブリダイズする全てのポリヌクレオチドである。ハイブリダイゼーション反応に適用されるストリンジェントな条件は、通常の当業者には既知であり、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９年）に記載されているように適用してもよい。

本発明は、核酸配列内で、上述のような配列相同性のパーセントン値は示さないが、遺伝子コードの縮重により、開示される核酸によりネイティブでコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。このような核酸は、開示される配列中に存在するコドンを、縮重コドンによって変化させ、合成核酸を調製することにより発生させることが可能である。

本発明のヌクレオチド配列を、既知の組換えＤＮＡ技術を用いて様々な他の核酸配列に結合させてもよい。配列は、例えば、プラスミド、ファージミド、ラムダ・ファージ派生物、およびコスミド等の様々なクローニングベクターのいずれへもクローニングすることが可能である。さらに、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシーケンシングベクター等のベクターは、本明細書で開示される配列に結合することが可能である。本発明の核酸にクローニングできる対象の配列は、例えば、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターを含む非コード配列および調節配列である。

好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞に侵入し、その細胞で発現され得るように形成することが可能である。この形成は、治療用途に特に有用である。標的細胞での核酸配列の発現は、当業者に既知の任意の方法により達成できる。核酸は、例えば、宿主細胞で発現しやすい因子に結合させてもよい。このような因子は、ＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−、メタロチオネインＩ−、もしくは多角体プロモーター、またはＣＭＶ−もしくはＳＶ４０−エンハンサー等のプロモーターまたはエンハンサーをそれぞれ含んでよい。発現のための可能方法としては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、またはポックスウイルスを含むウイルスベクターにポリヌクレオチドを組み込むことである。哺乳類宿主細胞での核酸の発現用途のウイルスベクターは、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＸ、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４等を含んでよい。これらの技術は、当業者に既知である。

治療用途での投薬のための他の形成としては、例えば巨大分子複合体、ミクロスフェア、ビーズ、ミセル、リポソームのようなコロイド分散系が挙げられる。

一般に、従来の分子生物学的方法によって、異なる突然変異体を本発明の核酸分子に導入することが可能である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上掲）。その結果、改変可能な生物学的特性を有する本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドまたはそれに関連するポリペプチドが合成される。１つの可能性として、欠失突然変異体の産生があり、その中で、核酸分子は、コードＤＮＡ配列の５’末端または３’末端からの連続的な欠失により産生され、それに応じて短縮されるポリペプチドの合成を導く。別の可能性としては、アミノ酸配列の改変が例えば増殖特異的特性に影響する位置での単一の点突然変異の誘導がある。この方法により、例えば、 改変されたＫｍ値を持つムテイン、あるいは例えばアロステリックな調節または共有結合の改変に関して細胞に通常存在する調節機構に支配されなくなったムテインを産生することができる。該ムテインは、本発明の肺腫瘍に関連するマーカーの治療上有用なアンタゴニストとしても大いに役に立つであろう。

遺伝子工学による原核細胞での操作としては、本発明の核酸分子または該分子の部分を、ＤＮＡ配列の組換えによる突然変異生成または配列の改変を可能にするプラスミドに導入することができる。 従来の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲）により、塩基を置換することができ、さらに天然または合成配列を付加することができる。ＤＮＡフラグメントを互いに結合させるために、アダプターまたはリンカーをそのフラグメントに付加することができる。さらに、好適な切断部位を設ける操作または余分なＤＮＡもしくは切断部位を除去する操作を実行することができる。挿入、欠失、または置換が可能な場合、インビトロでの突然変異生成、プライマー修復、制限、またはライゲーションが実行できる。解析方法としては、一般に、配列解析、制限解析、および他の生化学的または分子生物学的方法を用いる。

本発明の核酸分子の様々な改変体にコードされるポリペプチドは、細胞増殖および分化での調節活性、分子量、免疫反応性、コンフォメーション、または電気泳動移動度、クロマトグラフィーでの挙動、沈降係数、可溶性、分光学的特性、安定性、ｐＨ最適条件、温度最適条件の様な物理学的特性等の特定の共通特性を示す。

本発明はさらに、本発明の肺腫瘍に関連する核酸分子を含むベクターに関する。このベクターは、好ましくは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子工学分野で一般に用いられる他のベクターである。本発明に使用する好適なベクターとしては、限定されないが、哺乳類細胞での発現用にＴ７をベースとした二重発現ベクター（原核生物および真核生物で発現）および昆虫細胞での発現用にバキュロウイルス由来ベクターが挙げられる。好ましくは、本発明の核酸分子は、原核細胞および／または真核細胞中で転写および翻訳可能なｍＲＮＡの合成を確実にする本発明の組換えベクター中の調節因子に操作自在に結合される。転写されるヌクレオチド配列は、Ｔ７、メタロチオネインＩ、または多角体プロモーター等のプロモーターに操作可能に結合することができる。

さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子またはベクターを一過性にまたは安定に含む組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、インビトロでの組換えＤＮＡを取り込むことができ、必要に応じて、本発明の核酸分子にコードされるポリペプチドを合成することができる生体として理解される。好ましくは、これらの細胞は、例えば哺乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞、または酵母細胞のような原核細胞または真核細胞である。本発明の宿主細胞は、好ましくは、導入される本発明の核酸分子が形質転換細胞に対して異種である（すなわち、これらの細胞で天然に発生することがない）か、相当する天然に発生する配列とは異なるゲノムの位置に局在するかのどちらかであるという事実により特定される。

本発明のさらに別の実施形態は、本発明の肺腫瘍に関連するマーカーの生物学的特性を示すとともに本発明の核酸分子にコードされるポリペプチドと、これを産生する方法とに関し、これにより、例えば、本発明の宿主細胞は、ポリペプチドの合成を可能にする条件下で培養され、続いてポリペプチドは、培養された細胞および／または培養液から単離される。組換え的に産生されるポリペプチドの単離および精製は、例えば本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質に向けられる抗体を用いて、調製用クロマトグラフィー、親和性分離および免疫学的分離を含む従来の手段により実行してもよい。または、例えばＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７;３１−４０（１９８８年）に記載されるワンステップ方法により、実質的に精製することもできる。しかし、これらのポリペプチドは、組換え的に産生されたポリペプチドを含むのみならず、単離された天然に発生するポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、またはこれらの方法を組み合わせて産生されたポリペプチドをも含む。このようなポリペプチドまたは関連するポリペプチドを調製する手段は、この技術で十分に理解されている。これらのポリペプチドは、好ましくは、実質的に精製された形態である。

本発明のポリペプチドの産生は、例えば、細胞を含まないインビトロの転写および／または翻訳系で実行可能である。このような系は、通常の当業者に既知である。１つの例としては、Ｒｏｃｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのＲａｐｉｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにより提供されるインビトロ翻訳系を含んでよい。
本発明に用いられるように、ポリペプチドは、本明細書中に開示される本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質の免疫原性部分を少なくとも含む。ポリペプチドは、任意の長さでよい。上記に使用される免疫原性部分とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞表面抗原受容体に認識されるタンパク質の一部分である。免疫原性部分は、肺腫瘍に関連するタンパク質の少なくとも１０個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基を含む。本発明の好適な実施形態では、例えば膜貫通ドメインまたはＮ末端リーダー配列のようなタンパク質の特定のドメインは欠失されている。本発明の免疫原性部分は、ネイティブな完全長タンパク質と同様またはほぼ同様の強度で、抗血清のまたは特異的な抗体と反応する。

免疫原性部分は、一般に、この技術で周知の技術を用いて同定される。可能な技術としては、例えば、抗原特異的抗体、抗血清、および／またはＴ細胞系もしくはクローンと反応する能力に対するポリペプチドのスクリーニングがある。

本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドは、ネイティブなタンパク質の改変体も含む。このような改変体は、置換、欠失、付加、および／または挿入等の１つ以上の変化の点でネイティブなタンパク質とは異なる。本発明の改変体の免疫反応性は、ネイティブなタンパク質と比べて、実質的に減少されない。本発明の好適な実施形態では、免疫反応性は、５０パーセント以下で減少される。より好適な実施形態では、免疫反応性は、ネイティブなポリペプチドと比べて、２０パーセント以下で減少される。

好適な実施形態では、改変体は、例えばＮ末端リーダー配列、膜貫通ドメイン、または小Ｎ末端および／もしくはＣ末端配列のような１つ以上の部分で欠損している。改変体は、本発明で開示されるポリペプチドに対して、７０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントの同一性を示す。

本発明の改変体は、好ましくは、保存性置換体であるので、変化されるアミノ酸は、同様の特性を有するアミノ酸と置換される。関係する特性は、アミノ酸残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質を含んでよい。本明細書中で開示される改変体は、付加的な末端リーダー配列、リンカー、またはより簡易もしくは良好な方法でポリペプチドの合成、精製、安定を可能にする配列を含んでもよい。
本発明のポリペプチドは、本明細書中に開示される本発明の肺腫瘍に関連するマーカーの核酸配列にコードされるアミノ酸配列を含む融合またはキメラポリペプチドであるポリペプチドも含んでよい。ポリペプチドは、任意の好適なアミノ酸配列に融合されることが可能である。このような配列は、例えば、抗原フラグメント、受容体、酵素、毒素、キレートエピトープを含んでよい。本発明の好適な実施形態では、開示されるポリペプチドに融合されるアミノ酸配列は、ｈｉｓタグまたはｍｙｃタグ等のポリペプチドの精製または回収に有用なタグである。互いに融合させるアミノ酸配列は、特定の用途に好適な任意のリンカーもしくはスペーサー配列により、直接結合させること可能であり、または分離されることが可能である。

本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離される。これは、分子がその元の環境から取り出されることを意味する。天然環境で共生している物質のいくつかまたは全てから分離される場合、天然に発生するタンパク質は単離される。ポリヌクレオチドは、例えば、ベクターにクローニングされる場合に単離される。

さらに本発明は、本明細書中に開示される肺腫瘍に関連するタンパク質に特異的に結合する抗体および抗原結合フラグメント等の結合因子を提供する。
用語「結合因子」とは、抗原結合オリゴペプチド、核酸、糖質、有機化合物等を含むオリゴペプチド、抗体、ペプチド類似分子のような様々な物質を包含する。本発明の抗体は、好ましくは、基本的に異なるエピトープ特異性を有するプールされるモノクローナル抗体からなる抗体と、特異なモノクローナル抗体の調製とに関連する。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、本発明のポリペプチドのフラグメントを含む抗原から作製される（例えば、Ｋoｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５年）、４９５を参照せよ）。本明細書で用いられるように、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、タンパク質に特異的に結合できる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂおよびｆ（ａｂ’）２フラグメント）とともにインタクトな分子を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを持たず、インタクトな抗体よりも循環からより迅速に消滅し、より少ない非特異的組織結合を有してもよい（Ｗａｈｌら、Ｊ.Ｎｕｃｌ.Ｍｅｄ.２４:３１６−３２５（１９８３年））。したがって、ＦＡＢまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物と同様に、このようなフラグメントが好適である。さらに、本発明の抗体は、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体を含む。

本発明の結合因子を、例えば、本明細書中に開示される本発明の肺腫瘍に関連するマーカーポリペプチドの活性を阻害するために用いることも可能である。この観点から、用語「結合因子」は、新規の肺腫瘍に関連する核酸から転写されるポリペプチドに特異的に結合し、この結果該ポリペプチドの活性を阻害する因子に関連する。このような結合因子は、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等）、ポリペプチド（抗体、受容体、抗原フラグメント、オリゴペプチド）、糖質、脂質、または有機化合物もしくは無機化合物（金属−イオン、硫黄化合物、ボラン、ケイ酸、還元因子、酸化因子）を含んでもよい。結合因子は、好ましくは、生物学的活性に不可欠なエピトープに結合することによってポリペプチドと相互作用するとよい。相互作用は、可逆性または付加逆性でもよい。結合は、ポリペプチドに非共有結合または共有結合さえもすることが可能である。さらに、結合因子は、本発明のポリペプチドの生物学的活性を変化または減少させるポリペプチドに対する変化を誘導する可能性がある。
例えば診断方法のような特定の用途としては、本発明の抗体または結合因子は、例えば放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、または酵素で検出可能に標識できる。さらに、分子間相互作用の検出に好適な任意の方法を用いてよい。

抗体または抗原結合因子は、本明細書に開示されるタンパク質と検出可能なレベルで反応し、他のタンパク質と特異的に反応しない場合、特異的に反応すると言える。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体でもよい。特異的に結合できる他の分子としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、ＲＮＡ分子、またはポリペプチドのような抗体の抗原結合フラグメントでもよい。本発明では、結合因子を、単独で、または組み合わせて用いてもよい。組み合わせることによって、より高度な感受性が達成できる。

本発明の方法に有用な抗体は、さらに、治療因子または他のポリペプチドに対する結合部位を含んでよく、あるいは該治療因子またはポリペプチドに結合してもよい。治療因子は、薬物、毒素、放射性核種、およびその派生物を含んでよい。この因子は、例えばリンカーまたは担体群によって、結合因子に直接または間接的に結合してもよい。リンカー群は、例えば、結合因子と、治療因子または他の因子との間の結合反応を可能にするために機能することができる。また、リンカーは、融合分子の異なる部位間のスペーサーとして作用することができる。リンカーは、該条件下で結合している因子を放出するように特定の状況で切断可能にすることができる。治療因子は、担体群に直接、またはリンカー群を介して共有結合で結合することが可能である。この因子は、担体に非共有結合で結合することも可能である。本発明に用いることができる担体としては、例えば、アルブミン、ポリペプチド、多糖、またはリポソームがある。
本発明に用いられる抗体は、１つ以上の因子に結合してもよい。１つの抗体に結合する複数の因子は、同様の種の全てでもよく、または１つの抗体に結合する複数の異なる因子でもよい。
本発明は、本発明の核酸分子またはベクターを含むトランスジェニックマウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル、ウサギ、ブタ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、およびシビレエイ等の魚のようなトランスジェニック非ヒト動物にも関し、好ましくは該核酸分子またはベクターの存在により本発明の肺腫瘍に関連するマーカーポリペプチド（または関連するポリペプチド）の発現を導くように、好ましくは該核酸分子またはベクターは、該非ヒト動物のゲノムに安定に組み込まれてもよく、あるいは非ヒト動物内で、一過性で発現されてもよい。該動物は、本発明の肺腫瘍に関連するマーカーポリペプチドの１つもしくは複数の形態またはその突然変異形態をコードする同一または異なる核酸分子の１つまたは複数のコピーを有してもよい。この動物は、細胞増殖および分化の調節に対する調査モデルとしての実用性を含む多数の実用性を有しているので、肺腫瘍等の細胞増殖性疾患の増殖に関与する本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質の欠損または機能停止が原因の疾患に対する療法、治療等の開発で、新規の有益な動物を提供する。したがって、本発明では、非ヒト動物は、好ましくは、マウスまたはラットのような実験動物である。
好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物はさらに、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドをコードする対応の遺伝子の少なくとも１つの不活性化される野生型対立遺伝子を含む。この実施形態により、例えば、細胞増殖および分化の調節に関連する疾患の臨床徴候の初期に、本発明の肺腫瘍に関連するマーカーポリペプチドの様々な突然変異形態の相互作用を研究することが可能になる。トランスジェニック動物に関して論じる前に本明細書中に記載された全ての応用は、２つまたは３つ以上の導入遺伝子を保持する動物にも適用する。トランスジェニック動物の発達および／または一生の特定の段階で、本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質の発現または機能を不活性化することもまた望まれているであろう。これは、例えば、ｍＲＮＡをコードする本発明の肺腫瘍に関連するマーカーをコードするＲＮＡ転写産物に対して向けられるアンチセンスまたはリボザイム等の発現を促進する組織特異的、成長および／または細胞調節性、および／または誘導性プロモーターを用いて達成できる（上掲）。好適な誘導性系としては、例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.８９ ＵＳＡ（１９９２年）、５５４７−５５５１）およびＧｏｓｓｅｎら（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ.１２（１９９４年）、５８−６２）により記載されるように、例えばテトラサイクリンに調節される遺伝子発現がある。同様に、突然変異の本発明の肺腫瘍に関連するタンパク質の発現は、このような調節因子により制御されることが可能である。

さらに、本発明は、本発明の核酸分子またはその部分（好ましくは安定にそのゲノムに組みまれる、または一過性で導入される）を含むトランスジェニック哺乳類細胞にも関し、この核酸分子またはその部分の転写および／または発現は、本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質の合成の低減に至る。好適な実施形態では、低減は、アンチセンス、センス、リボザイム、共抑制、および／または優性突然変異作用により達成される。「アンチセンス」および「アンチセンスヌクレオチド」とは、天然に発生する遺伝子産物の発現を遮断するＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを意味する。別の好適な実施形態では、本発明の肺腫瘍に関連するマーカーポリペプチドをコードするネイティブな核酸配列は、例えば組換えにより該核酸配列の改変体によって変化または置換されてもよく、これにより本発明の肺腫瘍に関連するマーカー遺伝子は機能しなくなる。したがって、本発明の肺腫瘍に関連するマーカーポリペプチド活性を持たない生体を、ノックアウト実験によって生産することが可能である。
本発明の核酸分子の提供により、上述のように本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質を低減したレベルで有ることにより細胞増殖および分化の調節に欠損があるトランスジェニック非ヒト動物生産の可能性が切り開かれる。これを達成するための技術は、当業者に周知である。これは、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムの発現を含み、その分子は、アンチセンスおよびリボザイムの機能を組み合わせ、ならびに／またはその分子は、共抑制作用を提示する。細胞中での本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質量の低減に対してアンチセンス手法を用いる際、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は、好ましくは、形質転換に用いられる動物種に対して相同の起源を持つ。しかし、本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質をコードする内在的に発生する核酸分子に対して高い程度の相同性を示す核酸分子を用いることも可能である。この場合、相同性は、好ましくは８０パーセント以上、特に９０パーセント以上、さらに好ましくは９５パーセント以上である。トランスジェニック哺乳類細胞での本発明のポリペプチドの合成の低減により、内在性タンパク質の分解等に変化が生じる。このような細胞を含むトランスジェニック動物では、これにより様々な生理的、発生的、および／または形態的に変化させることができる。

したがって、本発明は、上記のトランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物にも関する。これは、例えば、野生型の動物に比べて、外来性ＤＮＡの安定性または一過性存在が原因で細胞増殖および／または分化の調節に欠損を示す可能性があり、これにより以下の特徴の少なくとも１つを生じる。すなわち、（ａ）本発明の肺腫瘍に関連するマーカーをコードする内在性遺伝子の破壊、（ｂ）本発明の核酸分子を含む転写産物に対する少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡおよび／またはリボザイムの発現、（ｃ）本発明の核酸分子のセンスおよび／または非翻訳可能ｍＲＮＡの発現、（ｄ）本発明の抗体の発現、（ｅ）本発明の調節配列の機能性または非機能性コピーの組み込み、または（ｆ）本発明の組換えＤＮＡ分子またはベクターの組み込みである。

本発明のトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはトランスジェニックマウスの生産方法は、当業者に周知である。このような方法は、例えば、細菌細胞、胚細胞、幹細胞、卵、またはこれら由来の細胞への本発明の核酸分子またはベクターの導入を含む。非ヒト動物は、本明細書に記載される本発明のスクリーニング方法にしたがって用いることができ、非トランスジェニック健常動物でもよく、または疾患を有していてもよい。この疾患は、好ましくは本発明の肺腫瘍に関連するマーカータンパク質中の少なくとも１つの突然変異が原因の疾患である。このようなトランスジェニック動物は、上記の本発明の肺腫瘍に関連するマーカーポリペプチドの突然変異形態に関係する薬物の薬理学的研究等に非常に適している。トランスジェニック胚の生産およびそのスクリーニングを、例えばＡ.Ｌ.Ｊｏｙｎｅｒ Ｅｄ．、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３年）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載されているように実行することができる。胚の胚膜のＤＮＡを、例えば、核酸に基づいて、適当なプローブを用いたサザンブロット、増幅技術（例えばＰＣＲ）等を用いて解析することができる（上掲）。

本発明の別の態様は、異常性細胞増殖に関連する疾患の治療に用いる医薬組成物である。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および結合因子（特に、抗体）を、医薬または免疫原性組成物に組み込んでもよい。

医薬組成物は、当業者に既知の任意の好適な方法で投与することが可能である。投与は、例えば皮内、筋肉内、静脈内、もしくは皮下注射のような注射、例えば吸引による鼻腔内投与、または経口投与を含んでよい。治療の医薬的効果を確実にする好適な投与量は、当業者に既知であるように、患者の年齢、性別、体重等のパラメーターに応じて選択されるべきである。

医薬組成物は、該化合物および生理学的に許容できる担体を含む。本発明の医薬組成物に用いられる担体の種類は、投与形態によって変わるであろう。皮下注射等の非経口投与としては、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂質、ろう、および／または緩衝液を含む。経口投与としては、上記担体のいずれか、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、および／もしくは炭酸マグネシウム等の固体担体を用いてもよい。生分解性ミクロスフェア（例えばポリ乳酸グリコール酸）も、本発明の医薬組成物用担体として用いることができる。好適な生分解性ミクロスフェアは、例えば米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号に開示されている。

医薬組成物またはワクチンは、例えば、本発明の１つ以上のポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでよい。ＤＮＡを、インサイチュでポリペプチドが生成されるように投与してもよい。好適な発現系は、当業者に既知である。本発明の別の実施形態では、核酸は、例えば、アンチセンスコンストラクトでもよい。医薬組成物は、例えばアデノウイルスベクター系のようなウイルスまたは他の発現系を含む哺乳類またはヒト宿主系で発現可能な核酸分子を含んでもよい。

核酸を裸核酸として投与してもよい。この場合、生分解性ビーズ上に核酸をコーティングするような核酸の取り込みを向上する適当な物理的送達系を用いてもよく、これは効率的に細胞内に輸送される。裸核酸の投与は、例えば、宿主または宿主細胞内での一過性発現の用途に対し有用であるだろう。

また、医薬組成物は、１つ以上のポリペプチドを含んでよい。医薬組成物に組み込まれるポリペプチドは、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドであってもよい。任意で、ポリペプチドは、例えば酵素、抗体、調節因子（サイクリン、サイクリン依存性キナーゼもしくはＣＫＩ等）、または毒素のような１つ以上の他の既知のポリペプチドと組み合わせて投与されてもよい。

本発明の肺腫瘍に関連するタンパク質の免疫原性部分を含む本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントを、免疫原性組成物に用いてもよく、ポリペプチドは、例えば、腫瘍細胞に対する患者自身の免疫応答を促進する。患者は、疾患に罹っているか、または検出可能な疾患からは免れている可能性がある。したがって、本明細書で開示される化合物を用いて、癌の治療または癌の発達の阻害が可能である。化合物は、原発性腫瘍の外科的除去のような従来の腫瘍治療、放射性療法処置による治療、従来の化学療法、またはそれぞれの癌もしくはその前駆体に対する任意の他の治療形態の以前または以後に投与されてよい。

ワクチン等の免疫原性組成物は、１つ以上のポリヌクレオチドおよび非特異的免疫応答エンハンサーを含んでよく、非特異的免疫応答エンハンサーは、外因性抗原に対する免疫応答を誘発または向上することができる。任意の好適な免疫応答エンハンサーを本発明のワクチンで用いてもよい。例えば、アジュバントを含むことも可能である。大分部のアジュバントは、水酸化アルミニウムまたは石油のような急速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質と、リピドＡ、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、または結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような免疫応答の非特異的刺激因子とを含む。このようなアジュバントは、例えばＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ＡｄｊｕｖａｎｔおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．）ならびにＭｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ｉｎｃ．、 Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）として市販されている。

薬学的組成物およびワクチンは、上述のような融合タンパク質に組み込まれる（すなわち複数のエピトープを含む単一のポリペプチド）か、または異なるポリペプチド内に存在する腫瘍抗原の他のエピトープを含んでもよい。

本発明の文脈中に用いられるように、異常性細胞増殖により特定される疾患は、例えば、良性腫瘍および悪性腫瘍、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、または異形成病変のような新生物を含んでよい。腫瘍は、頭頸部腫瘍、気道腫瘍、胃腸管腫瘍、泌尿器系腫瘍、生殖器系腫瘍、内分泌系腫瘍、中枢および末梢神経系腫瘍、皮膚およびその付属器官の腫瘍、柔部組織および骨の腫瘍、リンパ球新生系および造血系腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、肛門性器癌等を含んでよい。

本発明の１つの好適な実施形態では、疾患は肺腫瘍である。本発明の肺腫瘍は、正常制御細胞または組織の増殖特性と比較して、細胞または組織の異常性増殖特性により特定される気道の症状を含む。細胞または組織の増殖は、例えば、異常に促進されているか、また異常に調節されている可能性がある。上記に用いられるように異常性調節は、天然に発生する増殖調節作用に対する細胞または組織の非野生型応答の存在または不在の任意の形態を含んでよい。細胞または組織の増殖での異常は、例えば、新生物性または過形成性であってもよい。本発明の１つの好適な実施形態では、肺腫瘍は、癌または気道の前癌症状である。

本発明の方法の試料は、細胞、組織、または体液を含むことが可能な任意の試料である。さらに、検出されるマーカー分子を潜在的に含む任意の試料は、本発明の試料であってもよい。このような試料は、例えば、血液、血漿、血清、塗末標本、洗浄物（ｗａｓｈ）、喀痰、細胞試料および組織試料、またはバイオプシーである。

本発明の文脈中に用いられるように、バイオプシーは、例えば、腫瘍の制限試料、内視鏡手段によって調製される組織試料、またはニードルバイオプシーを含んでよい。さらに、検出されるマーカー分子を潜在的に含む任意の試料は、本発明の試料であってもよい。

本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルの検出方法は、試料中の非常に少量の特異的な分子を検出するのに適した任意の方法である。本発明の検出反応は、例えば、核酸レベルに関してまたはポリペプチドレベルに関しての検出であってもよい。検出は、細胞全体でまたは細胞ライセートでのポリペプチドまたは核酸のレベルの検出か、あるいは異なる細胞下領域でのポリペプチドまたは核酸のレベルの検出のどちらかであってもよい。化合物の細胞下分布を測定する方法は、当業者に既知である。本発明の１つの実施形態では、マーカー分子の検出は、特定のスプライシングバリアントの検出を含んでよい。本発明の別の実施形態では、検出方法は、試料中の核酸分子のメチル化の検出を含んでよい。

本発明の検出反応に適用可能なフォーマットとしては、ウエスタンブロット、サザンブロット、ノーザンブロット等のブロッティング技術でもよい。ブロッティング技術は、通常の当業者に既知であり、例えば、エレクトロブロット、セミドライブロット、バキュームブロット、またはドットブロットとして実行してよい。さらに、分子を検出するための免疫学的方法が適用可能であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、またはラテラルフローアッセイ等の免疫沈降検定法または免疫検定法である。

核酸のメチル化を検出する方法は、当業者に既知であり、例えば、重亜硫酸ナトリウム、過マンガン酸塩、またはヒドラジン等を用いた核酸の化学的前処理と、例えば増幅反応の過程での特異的制限エンドヌクレアーゼまたは特異的プローブによる改変のそれ以後の検出とを用いる方法を含んでよい。メチル化の検出はさらに、メチル化特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて実行してもよい。

本発明の１つの好適な実施形態では、マーカー分子のレベルの検出を、試料中に存在するマーカー分子またはそのフラグメントをコードする核酸のレベルを検出することにより実行する。核酸分子の検出手段は当業者に既知である。核酸の検出方法は、例えば、相補的な核酸プローブ、核酸に対して結合特異性を有するタンパク質、または該核酸に特異的に認識および結合する任意の他の要素に対する検出される分子の結合反応により実行する。この方法は、例えば染色反応を検出する過程で、直接インサイチュで実行するのと同様にインビトロで実行することができる。本発明の方法で実行される核酸のレベルに関して試料中のマーカー分子を検出する別の方法は、核酸の増幅反応であり、例えばＰＣＲ、ＬＣＲ、またはＮＡＳＢＡのような定量的方法で実行できる。

本発明の別の好適な実施形態では、マーカー分子のレベルの検出を、タンパク質の発現レベルを測定することによって実行する。タンパク質レベルに関するマーカー分子の測定は、例えば、マーカー分子の検出に特異的な結合因子を含む反応中で実行してもよい。このような結合因子は、例えば、微小の抗原結合エピトープ等を含む抗体および抗原結合フラグメント、ニ機能性ハイブリッド抗体、ペプチド模倣物を含んでよい。結合因子は、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフローアッセイ、ラテックス凝集、イムノクロマトグラフィー・ストリップ、または免疫沈降などの多数の異なる検出技術で用いてもよい。一般に、結合因子に基づく検出は、例えば免疫細胞化学的染色反応の過程で、直接インサイチュでの実行と同様に、インビトロで実行してもよい。生化学的、化学的、物理的、または物理化学的方法等の生物試料溶液中の特定のポリペプチド量を測定するのに好適な任意の他の方法を、本発明にしたがって用いることができる。

本発明の１つの好適な実施形態では、マーカーのレベルは、非腫瘍試験試料と比較して著しく上昇される。この場合、マーカーは試料中で過剰に発現される。本発明の別の好適な実施形態では、マーカーのレベルは、非腫瘍試験試料と比較して低下される。第３の実施形態では、対照試料とは異なり、試験試料中でマーカーの検出可能な発現が全くない。さらに別の実施形態では、非野生型マーカー分子のレベルが検出可能である。非野生型マーカー分子は、細胞増殖性疾患に冒されない野生型組織中で機能的な構造または配列から、配列または構造中で離れる任意のマーカー分子を含んでよい。野生型配列または構造は、正常細胞または組織中最も多数を占めて存在する配列または構造である。本発明の１つの好適な実施形態では、マーカー遺伝子の特定のスプライシングバリアントのレベルは、野生型組織と比較して、試験試料中で変化される。これにより、スプライシングバリアント、新規のスプライシングバリアント、新ペプチドのレベルの変化、異なる遺伝子スプライシングバリアントの割合の変化が生じる。

本発明の分子マーカーのレベルの検出は、組み合わせたマーカーの同時検出と同様に、異なる反応混合物中での単一マーカー分子のレベルの検出であってもよい。組み合わせは、本明細書中に開示される分子マーカーと、腫瘍の検出に有用なさらに付加したマーカー分子とを含んでよい。

検出は、溶液中で実行してもよく、また固相に固定される試薬を用いて実行してもよい。
１つ以上の分子マーカーの検出は、単一の反応混合物または２つ以上の異なる反応混合物中で実行してもよい。複数のマーカー分子に対する検出反応は、例えば、マルチウエル反応ベッセル中で同時に実行してもよい。本明細書に開示される肺腫瘍に特有のマーカーは、このような分子を特異的に認識する試薬を用いて検出可能である。同時に１つ以上のさらに別のマーカーを、それらを特異的に認識する試薬を用いて検出することが可能である。各単一マーカーに対する検出反応は、初めのマーカー分子を認識する検出因子、また好ましくは他の分子を認識するために用いられる分子を認識する検出因子を用いる１つ以上の反応を含んでよい。このような反応は、例えば、第１および第２およびさらに別の抗体の使用を含んでよい。検出反応はさらに、肺腫瘍に関連する本発明のポリペプチドのレベルを示すレポーター反応を含んでよい。レポーター反応は、例えば、有色化合物の産生反応、生物発光反応、蛍光反応、一般的な放射線放出反応であってもよい。

１つの好適な実施形態では、マーカー遺伝子産物を発現する組織の検出を、分子画像法の形態で実行する。各方法は、通常の当業者に既知である。本発明の文脈中で用いられる画像法は、例えば、インビボ画像化に好適なＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴおよび他の方法を含んでよい。

１つの実施形態では、この方法は、マーカー分子による分子画像法の過程で検出可能な分子に対する不活性化合物または標識化合物の酵素保存に基づいてもよい。別の実施形態では、分子画像法は、インビボでマーカー分子に特異的に結合する放射性同位体、金属イオン等のインビボ分子画像化に好適な標識を保持する化合物の使用に基づいてもよい。

本発明の好適な実施形態では、このような化合物は、非毒性化合物であり、各マーカー遺伝子を過剰に発現する腫瘍組織に蓄積された標識の検出を実行可能にするタイムスパンで、ヒト等の生体の循環から排出されてもよい。本発明の別の好適な実施形態では、化合物を分子画像化するために用い、そのため循環からの除去は分子画像反応を実行するのに関与しない。これは、例えば循環分子等により産生される低バックグラウンドが原因である。分子画像法に使用される化合物は、例えば診断上有用な他の物質、治療上有用な物質、キャリア物質等のような任意の他の好適な物質を付加的に含む組成物中で薬理学的に許容できる形態で投与される。

本発明で開示されるマーカー分子を、肺腫瘍等の細胞増殖性疾患での診断、疾患経過のモニタリング、および予後に用いることができる。

本明細書で用いられる本発明の遺伝子発現に関連する疾患の診断は、例えば、異常性増殖に冒された細胞または組織の検出を含んでよい。１つの好適な実施形態では、診断は、生体または試料中の疾患の第１の検出を意味する。本発明によれば、腫瘍等の疾患の診断方法は、疾患初期の早期段階で該疾患を検出するために、予防態様として通常のスクリーニング試験に適用可能である。別の好適な実施形態では、診断方法を用いて、初期治療後に腫瘍の微少の後遺症を測定することが可能である。この観点から、本発明の方法を適用して、肺腫瘍に特有な本発明のマーカー分子の異常性発現を示す身体試料中の細胞を測定することが可能である。したがって、冒された細胞の拡散を体液中で検出することが可能である。

本発明の１つの実施形態では、本明細書に開示される方法を、転移を検出および同定するために用いてもよい。この方法は、本明細書で開示される検出方法による身体組織または器官への転移の検出に適用してもよく、また転移は予後および疾患経過の予測についての診断となりうる。

疾患経過のモニタリングは、異なる時間点でのマーカー分子レベルの測定、異なる時間点でのレベルの比較、および対象として含んだ時間の期間にわたる疾患の進行に関する診断の評価を含んでよい。したがって、モニタリングによって、特定の患者に対して、予後の評価および／または適当な治療の設計が可能になるだろう。

本発明に係る肺腫瘍等の細胞増殖性疾患の疾患経過の予後は、１つ以上のマーカー分子の発現レベルを測定すること、データベース中のそれ以後の研究から得たデータとこのレベルを比較すること、およびこの比較から疾患経過を予測することを含んでよい。好適な実施形態では、この方法は、１組のマーカー分子の発現の検出を含んでよく、これと異なるレベルは、疾患経過の異なる段階を特定する可能性がある。本発明のさらに別の実施形態では、マーカーの組み合わせのレベルの組み合わせは、その後の疾患経過の予後に対して指標となる可能性があり、適当な治療の設計に対する基礎を築くことが可能である。

本発明はさらに、調査または診断方法等で使用するキットを提供する。このようなキットは、科学的アッセイまたは診断アッセイを実行するための２つ以上の構成要素を含んでよい。構成要素は、化合物、試薬、コンテナ、および／または装置であってもよい。１つの構成要素としては、肺腫瘍に関連するポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントでもよい。さらに、キットは、診断アッセイを実行するために必要な試薬、緩衝液、またはこの技術で既知の他のものを含んでよい。また、調査キットまたは診断キットは、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのヌクレオチドプローブまたはプライマーを含んでよい。このようなキットは、この技術で既知の適当な追加試薬または緩衝液を含むべきである。

本発明にもとづくキットは、
（ａ）分子マーカー分子を検出するための試薬と、
（ｂ）緩衝液、検出マーカー、キャリア物質等、検出反応を実行するために一般に用いられる試薬および緩衝液と、
（ｄ）ポジティブコントロール反応を実行するためのマーカー試料とを含む。

マーカーを検出するための試薬は、マーカー分子と結合可能な任意の因子を含む。このような試薬は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、糖タンパク質、プロテオグリカン、多糖、または脂質を含んでよい。

ポジティブコントロールを実行するための試料は、例えば、溶液または塩等の適用可能な形態の核酸、適用可能な形態のペプチド、組織断片試料、または肺腫瘍に関連する分子を発現する陽性細胞を含んでよい。

本発明の好適な実施形態では、マーカー分子の検出は、ポリペプチドのレベルに基づいて実行する。この実施形態では、結合因子は、例えば、マーカー分子に特異的な抗体またはそのフラグメントでもよい。

試験キットの別の実施形態では、マーカー分子の検出は、核酸レベルに基づいて実行する。本発明のこの実施形態では、検出用試薬は、例えば、該マーカー分子核酸に相補的な核酸プローブまたはプライマーでもよい。

本発明の別の態様は、治療および／またはワクチン接種の方法を提供することである。本発明に従えば、細胞増殖性疾患の治療は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを用いて実行することができる。治療は、例えば、免疫療法または体細胞遺伝子治療でもよい。

本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、本発明にしたがって、細胞増殖性疾患に対するワクチン接種に用いてもよい。本発明のワクチン接種には、免疫原性化合物に対する免疫応答を促進して、その結果該免疫原性化合物に対して個体を免疫化する用途のために、該免疫原性化合物を該個体に投与することを含んでよい。免疫応答の促進は、細胞障害性Ｔ細胞の促進と同様に、該化合物に対する抗体の産生の誘導を含んでよい。ワクチン接種用途として、本発明のポリペプチド、核酸、および結合因子を生理学的に許容できる形態で投与してもよい。 個体に投与される組成物は、１つ以上の抗原性化合物、生理学的に許容できるキャリア物質もしくは緩衝溶液、免疫促進剤、および／またはアジュバントを含んでよい。アジュバントは、例えば、フロイントの不完全アジュバントもしくはフロイントの完全アジュバントまたは当業者に既知の他のアジュバントを含んでよい。

組成物は、静脈内、皮下、筋肉内等の任意の適用可能な方法で投与することが可能である。組成物の投与量は、ワクチン接種の特定の症例および用途に依存する。これは、年齢、体重、性別等の治療される個体によるパラメーターに適用されなければならない。さらに、誘発される免疫応答の種類を考慮に入れなければならない。一般に、１００μｇ〜１ｇの本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸を含む１０^６〜１０^１２ＭＯＩの組換え核酸を、インサイチュで発現されることが可能な形態で、個体が受ける場合が好適である。

ワクチン接種用途に対する個体は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドおよび／ポリヌクレオチドを含むとともに細胞増殖性疾患に冒される可能性のある任意の生体でよい。

個体のワクチン接種は、例えば、細胞増殖性疾患に関連するマーカー分子の変化された非野生型配列または構造の場合に有利である。

本明細書に開示されるポリペプチドを、癌の治療のために養子免疫療法で使用してもよい。養子免疫療法は、広くは、能動免疫療法または受動免疫療法のどちらかに分類されるであろう。能動免疫療法では、治療は、内在性宿主免疫系のインビボの促進に依存し、免疫応答を改変する因子（例えば、腫瘍ワクチン、細菌性アジュバント、および／またはサイトカイン）を投与することで腫瘍に対して反応する。

受動免疫療法では、治療は、直接または間接に抗腫瘍作用を仲介することができるとともに必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存しない確立された腫瘍免疫反応性を用いた生物試薬の送達（例えばエフェクター細胞または抗体）を含む。エフェクター細胞の例としては、開示される抗原を発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍湿潤リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、リンパ球活性化キラー細胞）、Ｂ細胞、または抗原提示細胞（例えば樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書に開示されるポリペプチドを用いて、受動免疫療法に関して、抗体または抗イディオタイプ抗体を生成してもよい（米国特許第４，９１８，１６４号記載）。

養子免疫療法のための適当数のＴ細胞を産生する主流の方法は、インビトロで免疫Ｔ細胞を増殖させることである。インビボでの抗原認識の保持を用いて単一の抗原特異的Ｔ細胞を数十億数まで増殖させるための培養条件は、この技術で周知である。このようなインビトロ培養条件では、多くの場合はＩＬ−２等のサイトカインおよび非分裂性フィーダー細胞の存在下で、抗原を用いた断続的な促進を通常利用する。上述のように、本明細書に記載される免疫反応性ポリペプチドを用いて、免疫療法に十分な数の細胞を生成するために抗原特異的Ｔ細胞培養物を迅速に増殖させてもよい。具体的には、樹状細胞、マクロファージ、またはＢ細胞のような抗原提示細胞を、この技術に周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスするか、または核酸配列でトランスフェクションしてもよい。例えば、抗原提示細胞を核酸配列でトランスフェクションすることが可能であり、該配列は、発現の増加に適当なプロモーター領域を含み、組換えウイルスまたは他の発現系の部分として発現されることができる。治療に効果的な培養されるＴ細胞としては、この培養Ｔ細胞が増殖し、広範囲に分布して、インビボで長期間生存することが可能でなければならない。ＩＬ−２を添加した抗原で刺激を繰り返すことにより、培養Ｔ細胞が誘導されてインビボで増殖するとともに相当数が長期間生存できることが研究により証明された（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒ， Ｍら、“Ｔｈｅｒａｐｙ Ｗｉｔｈ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ，” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１５７：１７７、１９９７年を参照せよ）。

本明細書に開示されるポリペプチドを利用して、腫瘍反応性Ｔ細胞を生成および／または単離してもよく、これは、その後、患者に投与されることができる。１つの技術では、抗原特異的Ｔ細胞系は、開示されるポリペプチドの免疫原性部分に対応する短ペプチドを用いたインビボ免疫化により生成してもよい。得られた抗原特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬクローンを患者から単離して、標準の組織培養技術を用いて増殖させ、患者に戻すことが可能である。

また、本発明のポリペプチドの免疫原性部分に対応するペプチドを用いて、選択的ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激および自己由来Ｔ細胞の増殖により腫瘍反応性Ｔ細胞サブセットを生成し、抗原特異的Ｔ細胞を提供することも可能である。この抗原特異的Ｔ細胞を、その後、例えばＣｈａｎｇら（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２２（３），２１３，１９９６年）によって記載されるように、患者に移送してもよい。セルプロ社（ＣｅｌｌＰｒｏ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）のセプレート（ＣＥＰＲＡＴＥ）^ＴＭシステム等の市販の細胞分離システムを用いて、Ｔ細胞等の免疫系の細胞を患者の末梢血から単離してもよい（米国特許第５，２４０，８５６号、米国特許第５，２１５，９２６号、ＷＯ ８９／０６２８０、ＷＯ ９１／１６１１６、およびＷＯ ９２／０７２４３を参照せよ）。分離した細胞を、ミクロスフェア等の送達手段内に含有される１つ以上の免疫反応性ポリペプチドで刺激して、抗原特異的Ｔ細胞を提供する。その後、抗原特異的Ｔ細胞の集まりを、標準技術を用いて増殖させ、この細胞を患者に再投与する。

別の実施形態では、養子免疫療法で使用するために、ポリペプチドに特異的なＴ細胞および／または抗体受容体をクローニング、増殖、および他のベクターまたはエフェクター細胞に移入できる。

さらに別の実施形態では、共通遺伝子型または自己由来型の樹状細胞を、本明細書に開示されるポリペプチドの少なくとも１つの免疫原性部分に対応するペプチドを用いてパルスしてもよい。得られた抗原特異的樹状細胞を患者に移入するか、またこれを用いてＴ細胞を刺激し、抗原特異的Ｔ細胞を提供し、その後この抗原特異的Ｔ細胞を患者に投与してもよい。抗原特異的Ｔ細胞を生成するようにペプチドでパルスした樹上細胞の使用と、マウスモデル中の腫瘍を除去するための該抗原特異的Ｔ細胞のその後の使用とは、Ｃｈｅｅｖｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１５７：１７７、１９９７年）により実施されてきた。

また、開示される核酸を発現するベクターを、患者から採取した幹細胞に導入して、自己由来移植として同患者に戻すためにｉｎ ｖｉｔｒｏでクローン的に増殖させてもよい。

本発明のモノクローナル抗体を、腫瘍を収縮または除去するために、治療用化合物として用いてもよい。抗体は、それ自体で（例えば、転移を阻害するために）、または１つ以上の治療用因子と結合させて用いてもよい。これに関する好適な因子としては、放射性核種、分化誘導物質、薬物、毒素、およびその派生物が挙げられる。好適な放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが挙げられる。好適な薬物として、メトトレキセートとピリミジンおよびプリン類似物とが挙げられる。好適な分化誘導物質としては、ホルボール、エステル、および酪酸が挙げられる。好適な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。

本発明の１つの実施形態では、異常性細胞増殖により特定される障害の治療は、アンチセンス構築物またはリボザイムの投与を含んでよい。リボザイムまたはアンチセンス構築物の投与方法は、当業者に既知である。投与は、裸核酸の投与として、またはｉｎ ｓｉｔｕでの関連する活性産物の発現に好適な核酸の投与として行ってもよい。

本発明の別の実施形態では、障害の治療は、本発明の肺腫瘍に関連する分子に向けられる結合因子の投与を含んでよい。このような結合因子は、例えば、毒素、酵素、放射性同位体等の他の化合物と結合してもよい。

本発明の別の実施形態では、本発明の肺腫瘍に関連する分子の異常性発現に関連する障害の治療は、本発明の肺腫瘍に関連する分子のアンタゴニストまたはアゴニストの投与、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの結合パートナーの投与、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチド発現の阻害因子またはエンハンサーの投与または本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの活性を測定することを含むアッセイによって同定可能な薬物の投与を含んでよい。このような物質の同定方法は当業者に公知である。

本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチド（または関連するポリペプチド）および／またはポリヌクレオチドの結合パートナーの同定方法の例には、
（ａ）本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを、スクリーニングされる化合物と接触させるステップと、
（ｂ）化合物がポリペプチドの活性に作用するかどうかを測定するステップとを含んでよい。

本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを用いて、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドに結合するタンパク質もしくは他の化合物、または本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドが結合するタンパク質もしくは他の化合物をスクリーニングしてもよい。本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドおよび分子の結合により、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドもしくは結合される分子の活性を、活性化（アゴニスト）、増加、阻害（アンタゴニスト）、または減少することが可能である。このような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）、または小分子が挙げられる。

好ましくは、分子は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの天然のリガンド（例えばリガンドのフラグメント）、天然物質、リガンド、または構造もしくは機能性擬態に非常に関連している（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）（１９９１年）；Ｃｈａｐｔｅｒ ５を参照せよ）。同様に、分子は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドが結合する天然の受容体、または少なくとも本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチド（例えば活性部位）により結合可能な受容体のフラグメントにかなり関連させることができる。どちらの場合でも、既知の技術を用いて、分子を合理的に設計することができる。

好ましくは、このような分子のスクリーニングは、分泌タンパク質としてまたは細胞膜上で、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを発現する適当な細胞を産生することを含む。好適な細胞としては、哺乳類、酵母、ショウジョバエ、または大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）から得た細胞が挙げられる。その後、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを発現する細胞（または発現されるポリペプチドを含む細胞膜）を、好ましくは、分子を潜在的に含む試験化合物に接触させ、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの結合、活性促進、または活性阻害をモニタリングする。

アッセイにより、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドへの候補化合物の結合を簡易に試験することができ、結合は、標識により、または標識した拮抗因子を用いた拮抗を含むアッセイで検出される。さらに、アッセイにより、候補化合物が本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドに結合することにより生成されるシグナルを生じるかどうかを試験することが可能である。

また、細胞を含まない調製物、固相に固定したポリペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物混合物を用いて、アッセイを実行できる。アッセイには、候補化合物を、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを含む溶液と混和するステップと、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチド／分子活性または結合を測定するステップと、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチド／分子活性または結合を標準と比較するステップとを簡便に含んでよい。

好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイにより、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、試料（例えば生物学的試料）中の本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドレベルまたは活性を測定できる。本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドに直接もしくは間接に結合することによって、または基質に対して本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドと拮抗することによって、抗体は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドレベルまたは活性を測定することができる。診断用または予後用マーカーとして、上記アッセイの全てを用いることができる。これらのアッセイを用いて発見された分子を用いて、本発明の肺腫瘍に関連する分子を活性化または阻害することによって、疾患を治療すること、または患者に特定の成果をもたらす（例えば、上皮腫瘍の除去または腫瘍増殖の進行の停止）ことができる。さらに、アッセイにより、好ましく操作された細胞または組織から、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの産生を阻害または向上する可能性のある因子を発見することができる。

そのため、本発明は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を含み、
（ａ）本発明のポリペプチド（本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチド）に対する候補結合化合物をインキュベートするステップと、
（ｂ）結合が起きたかどうかを測定するステップとを含む。

さらに、本発明は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの活性化因子／アゴニストまたは阻害因子／アンタゴニストを同定する方法を含み、
（ａ）本発明のポリペプチドとして候補化合物をインキュベートするステップと、
（ｂ）生物活性を検定するステップと、
（ｃ）本発明のポリペプチドの生物活性が変化されたかどうかを測定するステップとを含む。

別の実施形態では、本発明は、異常性細胞増殖により特定される障害の治療用の薬物候補を同定および入手する方法に関し、
（ａ）細胞増殖の変化される調節および変化される細胞分化に応じて検出可能なシグナルを提示できる化合物の存在下で、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現する細胞を、タンパク質分解を可能にする条件下でスクリーニングされる該薬物候補に接触させるステップと、
（ｂ）タンパク質分解から生成されたシグナルの有無またはシグナルの増加を検出するステップとを含み、このシグナルの有無は、推定上の薬物の示唆となる。

動物、単離した細胞、または単離した細胞系を用いる実験を使用して、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチド作用に依存する細胞または組織の増殖性挙動を検査してもよい。同様の方法を、細胞分化の研究のために利用することが可能である。

薬物候補は、単一の化合物または複数の化合物でもよい。本発明の方法中の用語「複数の化合物」とは、同一であるかまたは同一でない複数の物質として理解される。

このような化合物または複数の化合物は、化学的に合成されるか、または微生物学的に産生されてもよく、および／または例えば植物、動物、微生物から得られる細胞抽出物等の試料に含まれてもよい。さらに、該化合物（または複数の化合物）は、当該分野で公知のものでよいが、これまでは本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを抑制または活性化できることが知られていない。反応混合物は、細胞を含まない抽出物でもよく、あるいは細胞または組織培養物を含んでもよい。本発明の方法に好適な機構は、当業者に公知であり、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９４年）および付随する実施例に一般に記載されている。複数の化合物は、例えば、反応混合物、培養液に添加されてもよく、細胞に注入されてもよく、またはトランスジェニック動物に適用してもよい。本発明の方法に利用可能な細胞または組織は、好ましくは、本明細書の実施形態で先述した本発明の宿主細胞、哺乳類細胞、または非ヒトトランスジェニック動物である。

１つの化合物または複数の化合物を含む試料が本発明の方法で同定される場合、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを抑制または活性化できる化合物を含むとして同定された元の試料から化合物を単離することが可能である。また、例えば元の試料が複数の異なる化合物から構成されている場合、元の試料を細分して、試料毎の異なる物質の数を減らすとともに、元の試料を細分したものを用いて本方法を繰り返すことができる。試料の複雑性によって、上記ステップを複数回実行することができ、好ましくは、本発明の方法にしたがって同定された試料が、限られた数または１つのみの物質のみを含むまで実行する。好ましくは、該試料は、同様の化学的および／物理的特性の物質を含み、最も好ましくは、該物質は同一である。

巨大ライブラリーを産生およびスクリーニングして、標的に対して特異的親和性を有する化合物を同定するための複数の方法が当業者に公知である。このような方法は、ファージ提示法を含み、この方法では、ランダム化されたペプチドがファージから提示され、固定される受容体に対してアフィニティークロマトグラフィーによりスクリーニングされる（例えば、ＷＯ ９１／１７２７１、ＷＯ ９２／０１０４７、ＵＳ−Ａ−５，２２３，４０９号を参照せよ）。別の手法では、フォトリソグラフィーを用いて、チップに固定したポリマーの組み合わせライブラリーを合成する（例えばＵＳ−Ａ−５，１４３，８５４、ＷＯ ９０／１５０７０およびＷＯ ９２／１００９２を参照せよ）。固定したポリマーを標識した受容体と接触させ、標識に対してスキャンして、受容体に結合しているポリマーを同定する。本発明のポリペプチドの結合リガンドと、可能性のある阻害因子および活性因子を同定するために用いることができる連続したセルロース膜支持体上のペプチドライブラリーの合成およびスクリーニングは、例えばＫｒａｍｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８７（１９９８年）、２５−３９に記載されている。この方法は、例えば、本発明のポリペプチド中の結合部位および認識モチーフを測定するために用いることもできる。同様の方法では、ＤｎａＫシャペロンの基質特異性が測定され、ヒトインターロイキン−６とその受容体との間の接触部位が測定された（Ｒｕｄｉｇｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．１６（１９９７年），１５０１−１５０７およびＷｅｉｅｒｇｒａｂｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７９（１９９６年），１２２−１２６をそれぞれ参照せよ）。さらに、上記の方法は、本発明のポリペプチド由来の結合スーパートープ（ｓｕｐｅｒｔｏｐｅ）を構築するために用いることができる。抗ｐ２４（ＨＩＶ−１）モノクローナル抗体のペプチド抗原に対して、同様の手法が成功して記載された（Ｋｒａｍｅｒ，Ｃｅｌｌ ９１（１９９７年），７９９−８０９を参照せよ）。クラスター化されたアミノ酸ペプチドライブラリーを用いたペプチド・抗体相互作用のフィンガープリント解析への一般的な道筋がＫｒａｍｅｒ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１９９５年），４５９−４６５に記載されている。さらに、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドのアンタゴニストを、Ｄｏｒｉｎｇ，Ｍｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（１９９４年），１０５９−１０６７に記載の方法にしたがって、本発明のポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体から生じさせて同定することができる。

より最近では、所望の特性、特にポリペプチドまたはその細胞受容体にアゴナイズする能力、結合する能力、またはアンタゴナイズする能力を有する化合物に対して複合体のライブラリーをスクリーニングするための別の方法がＷＯ ９８／２５１４６に記載された。このようなライブラリー中の複合体は、試験下での化合物、化合物合成の少なくとも１つのステップを記録するタグ、およびレポーター分子による改変を受けやすいテザーを含む。テザーの改変を用いて、複合体が所望の特性を有する化合物を含むことを示す。タグが読み込まれて、このような化合物の合成時に少なくとも１つのステップを明らかにすることができる。本発明のポリペプチドまたは該分子をコードする核酸分子と相互作用する化合物を同定するための他の方法としては、例えば、フィルター結合アッセイ、または例えばＢｌＡｃｏｒｅ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる相互作用の「リアルタイム」測定と同様に、ファージ提示系を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニングがある。

本発明にしたがってこれらの方法を全て用いて、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドまたは関連するポリペプチドの活性化因子／アゴニストおよび阻害因子／アンタゴニストを同定することができる。

このような活性化因子または阻害因子の基本構造に対する様々なソースは、利用されることができ、かつ例えば本発明のポリペプチドの擬態類似物を含むことができる。本発明のポリペプチドの擬態類似物または生物学的に活性なそのフラグメントを、例えば、立体異性体、すなわちＤ−アミノ酸を用いた生物活性に不可欠であると考えられるアミノ酸の置換によって生成できる（例えば、Ｔｓｕｋｉｄａ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０（１９９７年），３５３４−３５４１を参照せよ）。さらに、生物学的に活性な類似物の設計用にフラグメントを用いる場合、擬態前駆体構成要素をペプチドに組み込んで、元のポリペプチド部分の除去の際に消去された可能性のある少なくともいくつかのコンフォーメーション特性を再構築する（例えば、Ｎａｃｈｍａｎ，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．５７（１９９５年），３５９−３７０を参照せよ）。さらに、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを用いて、天然のポリペプチドと同程度効果的に基質、結合パートナーまたは本発明のポリペプチドの受容体にリガンドとして結合するか、あるいはリガンドとして機能できる合成化学ペプチド類似体を同定することができる（例えば、Ｅｎｇｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９（１９９７），２２８４−２２９２を参照せよ）。例えば、本発明のポリペプチドの構造モチーフの折り畳みシミュレーションおよびコンピューター再設計は、適当なコンピュータープログラムを用いて実行できる（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２５ （１９９６年），２８６−２９９；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１（１９９５年），６７５−６７９）。タンパク質折り畳みのコンピューターモデル化は、詳細なペプチドおよびタンパク質モデルのコンフォメーションおよびエネルギー解析のために用いることができる（Ｍｏｎｇｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７（１９９５年），９９５−１０１２；Ｒｅｎｏｕｆ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６（１９９５年），３７−４５）。具体的には、相補的なペプチド配列に関するコンピューターアシスタントサーチによって、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドおよび可能性のあるその受容体、そのリガンド、または相互作用する他のタンパク質の相互作用部位の同定するために、適当なプログラムを用いることができる（Ｆａｓｓｉｎａ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ５（１９９４年），１１４−１２０）。さらに、タンパク質およびペプチドを設計するための好適なコンピューターシステムは、例えば、Ｂｅｒｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２（１９９４年），１０３３−１０３６；Ｗｏｄａｋ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５０１（１９８７年），１−１３；Ｐａｂｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５（１９８６年），５９８７−５９９１中の先行技術に記載されている。上記コンピューター解析により得られた結果は、例えば本発明のタンパク質またはそのフラグメントのペプチド類似体の調製のために用いることができる。タンパク質の天然のアミノ酸配列に類似しているこのような擬似ペプチドは、非常に効率的に親タンパク質を模倣することが可能である（Ｂｅｎｋｉｒａｎｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６年），３３２１８−３３２２４）。例えば、本発明のタンパク質またはそのフラグメントへの、簡便に利用できるアキラルなアミノ酸残基の組み込みによって、脂肪族鎖のポリメチレンユニットによるアミド結合の置換が生じ、その結果、ペプチド類似体を構築するのに都合よい方策が提供される（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３９（１９９６年），７６９−７７７）。他のシステムでの小ペプチドホルモンの高活性ペプチド類似体は、先行技術に記載されている（Ｚｈａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２４（１９９６年），３２７−３３１）。連続するアミドのアルキル化を介したペプチド類似体組み合わせライブラリーの合成によって、さらにその結合特性および免疫学的特性に関して得られた化合物を試験することによって、本発明のタンパク質の適当なペプチド類似体を同定することもできる。ペプチド類似体組み合わせライブラリーの生成および使用方法は、例えばＯｓｔｒｅｓｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６７（１９９６年）、２２０−２３４およびＤｏｒｎｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６年），７０９−７１５中の先行技術に記載されている。さらに、本発明のポリペプチドの三次元構造および／または結晶学的構造は、本発明のポリペプチドの生物活性のペプチド類似阻害因子の設計のために用いることができる（Ｒｏｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５ （１９９６年），１２９３３−１２９４４；Ｒｕｔｅｎｂｅｒ， Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６年），１５４５−１５５８）。

ネイティブな生物学的ポリペプチドの活性を模倣する低分子量合成分子の構造に基づく設計および合成はさらに、例えばＤｏｗｄ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８年），１９０−１９５；Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７年），４３５−４４１；Ｍｏｏｒｅ，Ｐｒｏｃ．Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ．４０（１９９７年），１１５−１１９；Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｐｒｏｃ．Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ．４０（１９９７年），１２１−１２５；Ｍｕｋｈｉｊａ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（１９９８年），４３３−４３８に記載されている。

例えば、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドまたは関連するポリペプチドに対する基質またはリガンドとして作用できる小有機化合物の類似体を設計、合成、および評価することが可能であることも当業者には周知である。例えば、ハパロシンのＤ−グルコース類似体は、細胞障害性で多剤耐性補助に関連するタンパク質をアンタゴナイズする際、ハパロシンと同様の効率性を示すということが記載されている（Ｄｉｎｈ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１（１９９８年），９８１−９８７を参照せよ）。

本発明の核酸分子は、活性因子および阻害因子に対する標的としての役割も果たすことができる。活性因子は、例えば、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドをコードする遺伝子のｍＲＮＡに結合するタンパク質を含んでよく、これにより、例えばＴａｔタンパク質がＨＩＶ−ＲＮＡに作用するのと同様の方法で、ｍＲＮＡのネイティブなコンフォメーションを安定させ、転写および／または翻訳を促進する。さらに、定義されたまたは未定義の標的ＲＮＡ分子の構造を模倣するＲＮＡフラグメント等の核酸分子を同定する方法が文献に記載されており、この標的ＲＮＡ分子に化合物が細胞内部で結合し、細胞増殖の遅延または細胞死を生じる（例えばＷＯ ９８／１８９４７および本明細書で参照している参考文献を参照せよ）。これらの核酸分子は、製薬および／または農業対象の未知の化合物を同定するため、あるいは疾患の治療に用いる未知のＲＮＡ標的を同定するために用いることができる。これらの方法および組成物は、新規の抗生物質、静菌剤、またはその改変をスクリーニングする際に用いることができ、また核酸分子にコードされるタンパク質の発現レベルを変化させるのに有用な化合物を同定するために用いることができる。また、例えば、結合部位を模倣するＲＮＡフラグメントのコンフォメーション構造を合理的な薬物設計で利用して、公知の抗生物質を改変し、より強力に標的に結合させることができる。１つのこのような方法論としては、核磁気共鳴（ＮＭＲ）があり、薬物およびＲＮＡコンフォメーション構造を同定するのに有用である。なお、他の方法としては、例えば、ＷＯ ９５／３５３６７およびＵＳ−Ａ−５，３２２，９３３に記載されている薬物設計方法があり、ＲＮＡフラグメントの結晶構造を推論することができ、コンピュータープログラムを用いて抗生物質として作用できる新規の結合化合物を設計する。

いくつかの遺伝子変化により、タンパク質コンフォメーションの変化された状態が導かれる。例えば、いくつかの突然変異の本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドは、それらのタンパク質分解能を低くする三次構造を持つ可能性がある。突然変異タンパク質の正常のまたは調節されたコンフォメーションの修復は、非常に困難であるが、これら分子の欠損を修正する最も優れたかつ特異な手段である。薬理学的操作はしたがって、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの野生型コンフォメーションの修復を意図してもよい。したがって、本発明の核酸分子およびコードされるポリペプチドを用いて、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドまたは関連するポリペプチドの野生型機能を活性化できる分子の設計および／または同定をしてもよい。

本発明の方法にしたがって試験および同定することができる化合物は、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリーのような発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小有機化合物、ホルモン、ペプチド類似体、ＰＮＡ等であってもよい（Ｍｉｌｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １（１９９５年），８７９−８８０；Ｈｕｐｐ， Ｃｅｌｌ ８３（１９９５年），２３７−２４５；Ｇｉｂｂｓ，Ｃｅｌｌ ７９（１９９４年），１９３−１９８および参考文献、上掲）。さらに、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの推定上の調節因子をコードする遺伝子および／または本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチド上流もしくは下流でその作用を示す遺伝子を、例えば、当該分野で公知である遺伝子標的ベクター等を利用した挿入突然変異生成を用いて、同定することが可能である。このような化合物は、公知の阻害因子または活性化因子の機能性派生物または類似体であってもよい。このような有用な化合物は、例えば、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子の調節配列に結合するトランス作用因子であることも可能である。トランス作用因子の同定は、当該分野で標準の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上掲、およびＡｕｓｕｂｅｌ、上掲）。タンパク質がタンパク質自体または調節配列に結合したかどうかを測定するために、標準的なネイティブゲルシフトアッセイを実行することができる。タンパク質または調節配列に結合するトランス作用因子を同定するために、タンパク質または調節配列を、標準的なタンパク質精製法で親和性試薬として、または発現ライブラリーのスクリーニング用プローブとして用いることができる。上述の本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードする核酸分子の同定は、例えば、いわゆる酵母の「ツーハイブリッド系」を用いて、Ｓｃｏｆｉｅｌｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４（１９９６年），２０６３−２０６５）に記載のように達成することもできる。この系では、本発明の核酸分子にコードされるポリペプチドまたはその小部分は、ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合する。この融合ポリペプチドを発現し、かつＧＡＬ４の転写因子に認識される適当なプロモーターに促進されるｌａｃＺレポーター遺伝子を含む酵母株は、活性化ドメインに融合される植物タンパク質またはそのペプチドを発現するであろうｃＤＮＡライブラリーで形質転換される。したがって、ｃＤＮＡの１つにコードされるペプチドと、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドのペプチドを含む融合ペプチドとが相互作用できる場合、複合体は、レポーター遺伝子の発現を導くことができる。この方法では、本発明の核酸分子およびコードされるペプチドを用いて、本発明の肺腫瘍に関連するタンパク質と相互作用するペプチドおよびタンパク質を同定することができる。本発明の肺腫瘍に関連するタンパク質の結合の阻害因子を同定するために、この系および同様の系がその後さらに利用されることは、当業者には明白である。

トランス作用因子が同定されると、例えば本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドへのその結合の調節および発現の調節が、本発明のタンパク質へのトランス作用因子の結合に対する阻害因子のスクリーニングで開始して追跡され得る。その後、例えば発現ベクター中でトランス作用因子（またはその阻害因子）またはそれをコードする遺伝子を適用することによって、本発明の肺腫瘍に関連するタンパク質の活性化または抑制を動物中で達成することが可能である。さらに、トランス作用因子の活性形態が二量体である場合、その活性を阻害するために、トランス作用因子の優勢のネガティブな突然変異体が作られる可能性がある。さらに、トランス作用因子の同定の際、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの制御に関与する遺伝子の活性に至る経路（シグナル転換）または抑制に至る経路で、他の構成要素がその後同定され得る。その後、動物中のタンパク質分解の代謝を調節するためのさらなる薬物および方法を開発するために、このような構成要素の活性の調節を追跡することができる。したがって、本発明は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドまたは本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの活性化因子もしくは阻害因子の同定のための、上記に定義したようなツーハイブリッド系の使用にも関する。

上記の方法により単離される化合物は、類似化合物の開発用のリード化合物としても機能する。類似体は、リード化合物と実質的に同様の方法で、基調となる官能基が本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドまたは可能性のあるその受容体に提示されるのを可能にする安定した電子配置および分子コンフォメーションを有するべきである。特に、類似化合物は、結合領域に同等の空間的電子特性を有してはいるが、一般に約２ｋＤ未満、好ましくは１ｋＤ未満の分子量を有する、リード化合物より小さい分子であり得る。類似化合物の同定は、自己無撞着の場（ＳＣＦ）解析、配置間相互作用（ＣＩ）解析、および通常形態の力学的解析等の技術の使用を介して実行できる。これらの技術を達成するために、コンピュータプログラムが利用できる。すなわち、例えばＲｅｉｎ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年）である。化学派生物および類似物の調製方法は、当業者に周知であり、例えばＢｅｉｌｓｔｅｉｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｉｎｃ．， １７５ Ｆｉｆｔｈ Ａｖｅｎｕｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １００１０ Ｕ．Ｓ．Ａ．およびＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡに記載されている。さらに、該派生物および類似物は、この技術に既知である方法にしたがって、その作用を試験できる（上掲）。さらに、ペプチド類似体および／または適当な派生物および類似体のコンピューター補助の設計を、例えば上述の方法にしたがって用いることができる。

本発明の上記方法の好適な実施形態では、該細胞は、本発明の細胞、または本発明の方法により得られる細胞であり、あるいは上記トランスジェニック非ヒト動物に含まれる。

上記の化合物が同定および入手されると、この化合物は、治療的に許容できる形態で好適に提供される。

本発明は、癌等の異常性細胞増殖により特定される疾患の検出および治療方法を提供する。１つの態様では、本発明は、生物学的試料中での、本発明の肺腫瘍に関連する遺伝子の発現の有無および／またはレベルの測定に基づいて、癌等の異常性細胞増殖により特定される疾患の検出方法を提供する。第２の態様では、本発明は、本発明の肺腫瘍に関連する遺伝産物を治療上活性な因子として利用することによって、癌等の異常性細胞増殖により特定される疾患の治療方法を提供する。本発明は、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの活性の調節に基づく治療方法も提供する。本発明の１つの態様では、患者試料中での本発明の肺腫瘍に関連する遺伝子産物の検出に基づいて合理的に腫瘍を管理する方法と、該遺伝子産物の検出された過剰発現と相関する治療を特定の目的に合わせる（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）方法とを提供する。さらに、本発明は、本発明の肺腫瘍に関連する遺伝子の過剰発現の有無および／またはレベルの検出に関与する反応を実行するための調査または診断試験キットを提供する。最後に、本発明は、本発明の疾患治療に適用可能な医薬組成物に関する。

以下の実施例は、例示のみを目的として示し、ここに開示された本発明の範囲の限定を意図したものではない。

実施例１： 結腸癌、胃癌、肺小細胞癌、および肺腺癌を含む腫瘍試料における、ＬＵＭＡ１発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
テストされた肺腺癌の６０％で、ＬＵＭＡ１転写産物のアップレギュレーションが検出されたが、結腸癌、胃癌、および小細胞肺癌の試料では、アップレギュレーションが全く見られなかった。

１．１． 理論的基礎
製造元のマニュアルに従い、ＰＣＲ生成物の指数増殖に伴うシグナルの増大が検出され始める閾値サイクル数から、定量的な値を得た（ＰＥバイオシステムズ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の分析ソフトウェアを使用）。

各リアルタイムＰＣＲに、オリゴｄＴプライマーでプライミングされた全ＲＮＡによるｃＤＮＡ ６．２５ｎｇを加えた。内在性ＲＮＡコントロールとして、ヒト・ベータアクチン（ＡＣＴＢ）をコードするベータアクチン遺伝子（ＡＣＴＢアクチン、プライマーＡｃｔｉｎ１−ＣＣＴＡＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＴＣＴＣ、プライマーＡｃｔｉｎ２−ＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧ）の転写を定量化した。

対照遺伝子ＡＣＴＢと比較して、標的（ｔａｒｇｅｔ）遺伝子発現をＮ倍の差異として表す最終結果を「Ｎｔａｒｇｅｔ」と称し、以下の通りに算出した。すなわち、
Ｎ_{ｔａｒｇｅｔ}＝２^（ΔＣｔ _{ｓａｍｐｌｅ} ^−ΔＣｔ _{ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ} ^）
ただし、試料（ｓａｍｐｌｅ）と対照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）のΔＣｔ値は、ＡＣＴＢ遺伝子の平均Ｃｔ値から、ＷＴ１遺伝子の平均Ｃｔ値を引くことによって算出される。

ＷＴ１用プライマーおよびＡＣＴＢ遺伝子用プライマーは、コンピュータプログラムであるプライマー（ＰＲＩＭＥＲ）（ＨＵＳＡＲプログラムパッケージ、ＤＫＦＺ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびプライマーエクスプレス（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ））の助けをかりて選択した。ＬＵＭＡ１遺伝子増幅用に、以下のヌクレオチド配列をもつプライマーを用いた。すなわち、ＬＵＭＡ１−Ａ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＴＴＡＴＡＴＣおよびＬＵＭＡ１−Ｂ：ＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣ； ＬＵＭＡ１−Ｃ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＴＡＣＴＣＣＣおよびＬＵＭＡ１−Ｄ：ＣＡＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＧＧである。

１．２． ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡは、組織標本からＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、抽出した。

１．３． ｃＤＮＡ合成
１μｇの全ＲＮＡを、１μｌのＤＮＡｓｅ Ｉ Ａｍｐ Ｇｒａｄｅ（１Ｕｎｉｔ／μｌ；インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と、２μｌのＤＮアーゼ反応緩衝液（１０×；インビトロゲン）とを含む最終容積２０μｌ中で、２５℃、１５分間、ＤＮアーゼＩ消化した。２μｌのＥＤＴＡ（２５ｍＭ；インビトロゲン）を加え、６５℃で、１０分間、インキュベーションすることによって、反応を停止した。逆転写は、１０倍ＲＴ緩衝液 ４μｌ、５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌ、４０Ｕ／μｌ ＲＮＡｓｉｎ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）） １μｌ、０．５μｇ／ｍｌ オリゴｄＴプライマー ４μｌ、および４Ｕ／μｌ Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）２μｌを含む最終容積４０μｌ中で、３７℃で、２時間、行った。逆転写酵素は、９３℃で、５分間加熱し、４℃で、５分間冷却することによって、不活性化した。

１．４． ＰＣＲ増幅
すべてのＰＣＲ反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＰＣＲは、ＳＹＢＲＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。熱サイクルコンディションは、９５℃で１０分間の初期変性ステップを含み、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間を４０サイクル行うことを含んだ。実験は、各データポイントに関し、２回繰り返しておこなった。

図１６〜２０に示されるように、肺腺癌におけるＬＵＭＡ１転写産物の発現増強が検出された。ＬＵＭＡ１転写産物の増幅用に、以下のプライマーを用いた。すなわち、ＬＵＭＡ１−Ａ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＴＴＡＴＡＴＣ、およびＬＵＭＡ１−Ｂ：ＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣである。プライマーＬＵＭＡ１−Ａ、およびプライマーＬＵＭＡ１−Ｂを用いたＰＣＲにより、エキソン７の全長を含むスプライス改変体が増幅される。一方、プライマーＬＵＭＡ１−Ｃ（ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＴＡＣＴＣＣＣ）、およびプライマーＬＵＭＡ１−Ｄ（ＣＡＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＧＧ）によっては、エキソン７の一部のみを表すスプライス改変体が増幅される。これらのプライマーの組合せを用いて、両スプライス改変体のアップレギュレーションをリアルタイムＰＣＲ実験で観測した。腫瘍１、および対応する正常試料１のリアルタイム増幅を、図１６に示す（プライマーＬＵＭＡ１−Ａ、およびＬＵＭＡ１−Ｂ）。閾値サイクル差３が観測されたが、ＡＣＴＢ遺伝子用の対照プライマーでは、違いが全く検出されなかった（結果は不図示）。これはある個体の肺腺癌でのＬＵＭＡ１転写産物が８倍に過剰発現されていることを示す。別の個体では、正常組織と、肺腺癌組織との違いは全く観測されなかった（図１４）。さらに別の一個体では、腫瘍組織で１３倍の過剰発現がみられた（図１５）。より多くの個体が、正常組織におけるＬＵＭＡ１転写産物の欠如と、腫瘍組織における強いアップレギュレーションによって特徴付けられた（４０００倍より強く）（図１６および１７）。

図２３に示されるエキソン７の分析された２つの異なる改変体に関し、上述のリアルタイムＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、ゲル電気泳働で分析した。

実施例２：選択的にスプライシングされたＬＵＭＡ１転写産物のクローニング
ＬＵＭＡ１転写産物に特異的なプライマーを使用し、肺腺癌、結腸癌、および胎児脳由来のランダムプライミングされたヒトｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。

フォワードプライマー：
ＬＵＭＡ１−Ｃ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＴＡＣＴＣＣＣ； ＬＵＭＡ１−Ｅ：ＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＡＧ； ＬＵＭＡ１−Ｆ：ＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＣ。

リバースプライマー；
ＬＵＭＡ１−Ｇ：ＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＧＡＡ； ＬＵＭＡ１−Ｈ：ＡＧＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧ。

プライマーは、以下の組合せで増幅に用いた。

すなわち、ＬＵＭＡ１−Ｃ ＋ ＬＵＭＡ１−Ｈ； ＬＵＭＡ１−Ｅ ＋ ＬＵＭＡ１−Ｇ； ＬＵＭＡ１−Ｅ ＋ ＬＵＭＡ１−Ｈ； ＬＵＭＡ１−Ｆ ＋ ＬＵＭＡ１−Ｇ； ＬＵＭＡ１−Ｆ ＋ ＬＵＭＡ１−Ｈである。

以下のＰＣＲコンディションを用いて、選択的スプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）をおこなったＬＵＭＡ１転写産物を増幅した。

すなわち、９５℃１分、ならびに（９５℃３０秒、６０℃１分、および６８℃３．５分）を３４サイクルである。

Ｔａｑアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。

１μｌ ｄＮＴＰ（２０ｍＭ）、０．５μｌ ５０×Ｔａｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２．５μｌ １０倍緩衝液、３μｌ ｃＤＮＡ（１００ｎｇ）、１．５μｌ（Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒｗａｒｄ、１０μｍ）、１．５μｌ（Ｐｒｉｍｅｒ ｒｅｖｅｒｓｅ、１０μｍ）、１５μｌ Ｈ_２Ｏ）。

ＰＣＲ産物は、直接配列決定するか、まず、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後配列決定した。配列分析およびデータベース検索は、ＨＵＳＡＲプログラムパッケージ（ＤＫＦＺ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を用いて行った。クローニングしたＰＣＲ産物の配列分析により、ＬＵＭＡ１転写産物の大規模なスプライシングが実証された。エキソン３の欠失によって特徴付けられた１つの転写産物が、同定された。別の転写産物は、エキソン３および４を失っていた。加えて、ある転写産物は、エキソン３、４、および５がスプライシングにより除去されたものとしてクローニングされた。エキソン３、４、５、またはその組合せがスプライシングにより除去されても、リーディングフレームは変らず、コードされているＬＵＭＡ１タンパク質アイソフォームの内部欠失となる。これらのスプライス改変体とは対照的に、エキソン７における異なるスプライシングはフレームシフトとなる。転写産物に完全なエキソン７が存在している場合、オープンリーディングフレームは、転写産物のほぼ３’末端に達する。得られた転写産物中で、スプライシングによりエキソン７の最初の部分が除去される場合、フレームシフトが生じ、コードされたタンパク質は、カルボキシ末端のより短いものとなる。エキソン７の両スプライス改編体が肺腺癌でアップレギュレートされていることを示した（図１３〜１７； 図１８〜１９）。

（実施例３：ＬＵＭＡ１の全長クローニング）
ＬＵＭＡ１の全長クローニングＲＡＣＥ：Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）
ＬＵＭＡ１ ｃＤＮＡの５’末端を増幅するため、ＳＭＡＲＴ^ＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、全長クローニングを行った。

ＰＣＲ反応液を以下の通りに調製した：１μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μｌ ５０×Ｔａｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、５μｌ １０倍緩衝液、２．５μｌ ｃＤＮＡ、胎盤（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１μｇ／μｌ）、５μｌ ユニバーサルプライマーミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１０×）、１μｌ 遺伝子特異的プライマー（リバース）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、３４．５μｌ Ｈ_２Ｏ。

ユニバーサル・プライマーミックス（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ）：ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ（０、４μｍ）、ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（０．２μｍ）。

ＬＵＭＡ１遺伝子特異的プライマー（リバース）：ＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＡＣＣＴＧＡ。

ＰＣＲ反応により明確なバンドが得られなかったので、ネスト化ＰＣＲを行った。

５μｌの第一のＰＣＲ産物を２４５μｌのトリシンＥＤＴＡ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１０ｍＭ トリシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に希釈した。

ＰＣＲ反応液を以下の通りに調製した。すなわち、１μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μｌ ５０×Ｔａｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、５μｌ １０倍緩衝液、５μｌの希釈された一次ＰＣＲ産物、１μｌネスト化ユニバーサルプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１０×）、１μｌ ネスト化遺伝子特異的プライマー（リバース）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１０μｍ）、３６μｌＨ_２０である。

ネスト化ユニバーサルプライマー：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ。

ＬＵＭＡ１ネスト化遺伝子特異的プライマー（リバース）：ＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣ。

全長転写産物を生成するため、以下のＰＣＲコンディションを用いた。すなわち、
（９４℃３０秒、７２℃３分）を５サイクル、
（９４℃３０秒、７０℃３０秒、７２℃３分）を５サイクル、および
（９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃３分）を２７サイクル
である。

ＲＡＣＥ産物を、アガロースゲル電気泳動法で検出した。バンドは、高純度ＰＣＲ産物精製キット（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ゲル精製した。ＤＮＡバンドを、エタノール滅菌したメスを用いて、アガロースゲル（１％）から切り出し、アガロースゲル切片をチューブに入れ、液体窒素中に２分間移した。ゲル切片を、無菌フィルター微量遠心チューブに入れ、１０分間、１３ ００ｒｐｍで遠心分離した。バインディング緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を、フロースルー１００μｌあたり５００μｌ加え、新しい無菌フィルター微量遠心チューブに入れた。１３ ００ｒｐｍで１分間の遠心分離。試料を、５００μｌの洗浄用緩衝液で２回洗浄し、１３ ００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーは廃棄した。５０μｌの溶出用緩衝液を、フィルターチューブの上側リザーバに加えた。１３ ００ｒｐｍで１分間の遠心分離。微量遠心チューブに精製されたＤＮＡが含まれていた。

精製されたＤＮＡを、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後、配列決定した。配列分析およびデータベース検索を、ＨＵＳＡＲプログラムパッケージ（ＤＫＦＺ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を用いて行った。クローニングしたＰＣＲ産物の配列分析により、１２の新しいエキソン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）と、エキソン１の新しい部分（エキソンＭ）と、エキソン８（エキソンＴ）の５’側延長部分とを同定した。

追加のＬＵＭＡ１エキソンを、ＲＡＣＥ実験によって同定した。ＬＵＭＡ１エキソンの位置を、ゲノムクローンＡＬ３５９７１１（ＶＥＲＳＩＯＮ ＡＬ３５９７１１．１８ ＧＩ：１３２３４９４０／第６染色体、クローンＲＰ１１−４２５Ｄ１０の完全配列からのヒトＤＮＡ配列）（寄託番号ａｌ３５９７１１）に関して示す。

塩基対（ｂｐ）
エキソンＡ １６７４２−１６８９８
エキソンＢ １７９６７−１８１３２
エキソンＣ ２２６７１−２２８０９
（このエキソンは差次的にスプライシングされている。）
エキソンＤ ２８３９９−２８５５２
エキソンＥ ３０４２２−３２０９４
エキソンＦ ３６５０３−３６７３２
エキソンＧ ３７７２０−３７８５８
エキソンＨ ３９２８８−３９４０８
エキソンＩ ４６１４３−４６２９０
（差次的にスプライシングされて、胎児の肺に存在している。）
エキソンＪ ５１４４３−５１５５２
エキソンＫ ５８８０８−５８９５７
エキソンＬ ５９８３６−５９８８９
エキソンＭ エキソン１ ６０８８８−６１０５５
エキソンＮ エキソン２ ６３３４２−６３４９４
エキソンＯ エキソン３ ６３７３９（６３７４２）−６３８７３
（ｂｐ６３７４２はこのエキソンの代替的開始点、このエキソンは差次的にスプライシングされている。）
エキソンＰ エキソン４ ６４８３９−６４９９１
（このエキソンは差次的にスプライシングされている。）
エキソンＱ エキソン５ ６６４２７−６６６３６
（このエキソンは差次的にスプライシングされている。）
エキソンＲ エキソン６ ７０８６７−７０９８７
エキソンＳ エキソン７ ７５２２７（７５２７９）−７５３５４
（ｂｐ７５２７９はこのエキソンの代替的開始点。両方のエキソン改変体は特異的にスプライシングされている。エキソンの代替的開始により、フレームシフトがおこる。完全なエキソンがスプライシングにより、除去される可能性がある。）
エキソンＴ エキソン８ ７６５３７（７７２８７）−７７４１０
（ｂｐ７７２８７はこのエキソンの代替的開始点。エキソンの代替的開始により、フレームシフトがおこる。代替的（ａｒｔ ｏｆ）エキソンにより、フレームシフトがおこる。）
（実施例４：抗体の産生）
ＬＵＭＡ１ペプチドを用い、これらのポリペプチドに対するモノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体を産生した。ＬＵＭＡエキソン２について、以下のペプチドを免疫化のために用いてポリクロナール抗体を産生する。すなわち、（Ｃ Ｅ Ｌ Ｉ Ｇ Ｅ Ｖ Ｒ Ｔ Ｅ Ｇ Ｉ Ｄ Ｎ Ｍ Ｋ Ｄ Ｌ Ｋ）である。モノクローナル抗体の産生用には、ＬＵＭＡエキソン７ｂ（長い改変体）によってコードされたペプチド配列（Ｒ Ｆ Ｌ Ｋ Ｔ Ｎ Ｌ Ｋ Ｇ Ｓ Ｋ Ｉ Ｔ Ｒ Ｃ）を用いた。

（Ａ．ポリクローナル抗体の産生：）
ポリクローナル抗体をアフィニティクロマトグラフィによって精製し、その後、患者試料中のそれぞれのポリペプチドの検出用に使用した。手順は以下の通りに行った。すなわち、
完全フロイントアジュバンド中のＫＬＨと結合させた１００μｇのＬＵＭＡ１ペプチドを用いてＮＺＷ（ニュージランドホワイト種）ラビットを免疫し（一次（ｇｒｏｕｎｄ）免疫）、不完全フロイントアジュバンド中の同量のタンパク質を用い、２週間ごとに、４回ブースト（ｂｏｏｓｔ）する。

２回目のブーストの１週間後に、血液を取り、固定抗原上でＥＬＩＳＡ分析する。

最後のブーストの１週間後に、動物から全採血する。凝血後、最終血液を１０分間、４０００×ｇで遠心する。このステップで得られた上清を、再び１５分間、１６６００×ｇで遠心する。この上清が生のＬＵＭＡ１抗血清である。

この抗血清を２ステップで精製する。ステップ１は、従来のプロテインＡクロマトグラフィーである。ステップ２で、ステップ１のＩｇ分画を、セファロースに固定された抗原上のアフィニティクロマトグラフィによって精製する。ステップ２の溶出液が精製ＬＵＭＡ１抗血清である。

ペプチドＥＬＩＳＡによって、精製抗血清を、固定抗原上で１／１０００〜１／１０００ ０００のいくつかの希釈率でテストする。これにより、特異的抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗ウサギ二次試薬によって検出し、それに続き比色分析反応（例えば、ＴＭＢ）で、検出する。

第２のアプローチでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびニトロセルロースへのトラスファーの後、固定抗原を用いたウェスタンブロットによって精製抗血清を評価する。

最終評価ステップでは、抗血清を組織アレイ上で免疫組織学（ＩＨＣ）によってテストする。ウェスタンブロット分析およびＩＨＣにおいて、結合抗体の可視化は、比色分析反応を触媒するＨＲＰに結合した抗ウサギ二次試薬を用いて行う。

（Ｂ．モノクローナル抗体）
ＬＵＭＡエキソン７ｂ（長い改変体）によってコードされるペプチド配列（Ｒ Ｆ Ｌ Ｋ Ｔ Ｎ Ｌ Ｋ Ｇ Ｓ Ｋ Ｉ Ｔ Ｒ Ｃ）に対するモノクローナル抗体は、Ｈａｒｌｏｗ、およびＬａｎｅによる「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第１版、１９８８年）の記載のように生成した。

（実施例６：ＬＵＭＡ１発現の免疫組織学的検出）
ホルマリン固定してパラフィン包埋した肺の組織試料切片を、ＬＵＭＡ１に対して特異的な抗体を用いることによって免疫細胞化学的に染色した。

切片は、キシレンおよび段階的なエタノールのインキュベーションを通して再水和し、純水（Ａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔ）に移した。抗原回復を１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて行った。したがって、スライドを水浴で９５℃、４０分間、加熱した。スライドを、２０分間、室温まで冷却し、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に移した。

内在性ペルオキシダーゼを不活性化するため、試料を３％Ｈ_２Ｏ_２で、２０分間、室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳ ／ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５〜１０分間洗う。

その後、エキソン２（図２４）、およびエキソン７（図２５、２６）にそれぞれ特異的な一次抗体（２μｇ／ｍｌ）と共に、スライドを、１時間、室温でインキュベートした。その後、スライドを洗浄用緩衝液でリンスし、新たな緩衝液槽中に５分間静置した。その後、スライドを、二次抗体（ヤギ抗ウサギ抗体（１：５００）、またはヤギ抗マウス抗体（１：５００））と共に、室温で、１時間インキュベートした。洗浄を、５分間、３回行った。スライドを、２００μｌの基質−色素源（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）溶液（ＤＡＢ）で１０分間、覆った。その後、スライドは、前と同様に洗浄し、ヘマトキシリン槽中で、２分間、対比染色した。残留ヘマトキシリンを蒸留水でリンスし、標本をマウントし、水性封入剤と共にカバーグラスで覆った。

スライド検鏡により、腫瘍細胞が、エキソン７にコードされた配列に対するモノクローナルＬＵＭＡ１抗体による特異的な免疫反応性を示すことを明らかにする。腫瘍細胞では、可視的な特異染色が細胞質に見られる。

記載された方法による、末梢静脈血、骨髄、およびリンパ球の免疫化学的分析によって、コントロールの正常個体から得られた試料に、ＬＵＭＡ１に対する免疫反応性がないことを明らかにした。このことは、ＬＵＭＡ１に対する抗体による特異的な免疫化学的染色によって、これらの試料において、ＬＵＭＡ１による免疫反応性をもつ散在性腫瘍細胞が同定されるかもしれないことを示す。

（ＬＵＭＡ１エキソン７に対するモノクローナル抗体を用いた肺腫瘍組織および対応する正常組織の免疫組織化学的分析の概要）

Ｔ＝腫瘍 悪性腫瘍
Ｎ＝正常 正常な肺で陽性
１４症例の肺腫瘍を、ＬＵＭＡエキソン７タンパク質イソ型の発現に関して分析した。８症例の腫瘍で、陽性の染色が見られる。対応する正常組織では染色が見られない。いくつかの肺腫瘍の結合組織において、炎症細胞の染色が検出された。これらの結果は、ＬＵＭＡ１エキソン７の配列に特異的な試薬で染色することにより、生物試料中の腫瘍細胞を同定することが可能となることを示している。タンパク質レベルで得られた結果は、リアルタイムＰＣＲ法で得られた結果との相関する。両方の実験で、ＬＵＭＡ１エキソン７の配列（ＲＮＡ配列およびタンパク質配列）が腫瘍細胞で特異的にアップレギュレートされているのがわかった。エキソン７の配列とは対照的に、ＬＵＭＡのエキソン２は、腫瘍細胞中、ＲＮＡレベルにおいても、タンパク質レベルにおいてもアップレギュレーションを示さない。このことは、特異的なＬＵＭＡ１スプライス改変体、およびそれがコードしているタンパク質改変体のみが腫瘍特異的であることを明確に示す。

ヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体１およびコードされるＬＵＭＡ１タンパク質アイソフォーム１。 ヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体２。エキソン７の選択的なスプライシングにより、エキソン７部分の欠失を生じ、スプライス改変体の３’配列中のフレームシフトを導入する。ｍＲＮＡ改変体１と比べて、改変体２中のコードされるタンパク質は、ｍＲＮＡ改変体１中のものより短い。フレームシフトにより、異なるカルボキシ末端配列を有するタンパク質アイソフォームが生じる。さらに、全エキソンがスプライシングされ得る（図示せず）。 ヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体３。この改変体は、３ｂｐ欠失および異なるポリアデニル化部位により特定され、より短い３’配列を生じる。 ヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体４。この改変体はエキソン３の欠失により特定される。 ヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体５。この改変体は、エキソン３およびエキソン４の欠失により特定される。 ヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体６。この改変体は、エキソン３、４、および５の欠失により特定される。 タンパク質１をコードするヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体７。タンパク質１は、ｍＲＮＡの５’末端に位置するＯＲＦによりコードされる。 図７−１の続き。 図７−２の続き。 図７−３の続き。 図７−４の続き。 タンパク質２をコードするヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体８。タンパク質２は、塩基対２２４２で開始するＯＲＦによりコードされる。オープンリーディングフレームは、ｂｐ２８６３〜６５で終止コドンにより停止される。この終止コドンは、タンパク質３をコードするｍＲＮＡ改変体９中には存在しない（図９参照）。 図８−１の続き。 図８−２の続き。 図８−３の続き。 タンパク質３をコードするヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体９。タンパク質３のＮ末端部分は、タンパク質２中に存在する。ｂｐ２８６３〜６５での終止コドンの不在により、オープンリーディングフレームは、ｂｐ４２９０まで伸長する。 図９−１の続き。 図９−２の続き。 図９−３の続き。 図９−４の続き。 図９−５の続き。 図９−６の続き。 タンパク質４をコードするヒトＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ改変体１０。タンパク質４は、ｂｐ２８６３〜６５での５’終止コドンの存在により、ｂｐ２８６６で開始するＯＲＦにコードされる。エキソンを５’末端へ伸長し、フレームシフトを生じさせるエキソン８（エキソンＴ）での選択的なスプライシングのために、タンパク質３（図９）およびタンパク質４は、図１に図示したタンパク質と比べて、異なるｃ末端を保持する。 図１０−１の続き。 図１０−２の続き。 図１０−３の続き。 図１０−４の続き。 図１０−５の続き。 図１０−６の続き。 ヒトＬＵＭＡ１遺伝子のゲノム配列。ＬＵＭＡ１エキソン配列は、赤字または赤紫字で示されており、下線が引かれている。ゲノム配列は、ＬＵＭＡ１エキソン１からエキソン８を保持する。２つの異なるスプライスアクセプター部位がエキソン３で検出可能であり、（＞）で示される付加的コドンを生じる。エキソン３、またはエキソン３および４、またはエキソン３、４、および５は、選択的にスプライシングされる。さらに、エキソン７部分の選択的なスプライシングが検出された。エキソン３、エキソン３および４、ならびにエキソン３、４、および５の欠失により、内部のＬＵＭＡ１アミノ酸配列のフレーム内欠失が生じる一方、エキソン７部分の選択的なスプライシングはフレームシフトを生成する。このフレームシフトにより、異なるカルボキシ末端のＬＵＭＡ１タンパク質アイソフォームが生じる。エキソン７の２つのスプライスアクセプター部位は、（＞）で示されている。さらに、ＬＵＭＡ１遺伝子の２つの異なるポリアデニル化部位が示されている。 図１１−１の続き。 図１１−２の続き。 図１１−３の続き。 図１１−４の続き。 図１１−５の続き。 図１１−６の続き。 図１１−７の続き。 図１１−８の続き。 図１１−９の続き。 図１１−１０の続き。 図１１−１１の続き。 図１１−１２の続き。 図１１−１３の続き。 マウスＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡ配列。 図１２−１の続き。 ヒトおよびマウスＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列比較。全コード配列にわたって、発展の間の強度の配列保存が検出可能である。 図１３−１の続き。 ヒトおよびマウスＬＵＭＡ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列比較。ヒトおよびマウスＬＵＭＡ１で同一の配列ブロックは青で囲まれている。 図１４−１の続き。 ヒトおよびマウスＬＵＭＡ１タンパク質のアミノ酸配列比較。ヒトおよびマウスＬＵＭＡ１で同一の配列遮断は青で囲まれている。高度に保存されるペプチド配列が存在し、発展の間の高度に保存される機能を示す。 リアルタイムＰＣＲ技術（ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ ７７００）を用いた肺腺癌中のＬＵＭＡ１の発現の検出。ＬＵＭＡ１遺伝子の増幅のため、以下のプライマーを用いた。すなわち、ＬＵＭＡ１−Ａ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＴＴＡＴＡＴＣおよびＬＵＭＡ１−Ｂ：ＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣである。解析のため、対応する腫瘍および正常試料を用いた。 リアルタイムＰＣＲ技術（ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ ７７００）を用いた肺腺癌中のＬＵＭＡ１の発現の検出。ＬＵＭＡ１遺伝子の増幅のため、以下のプライマーを用いた。すなわち、ＬＵＭＡ１−Ａ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＴＴＡＴＡＴＣおよびＬＵＭＡ１−Ｂ：ＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣである。解析のため、対応する腫瘍および正常試料を用いた。 リアルタイムＰＣＲ技術（ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ ７７００）を用いた肺腺癌中のＬＵＭＡ１の発現の検出。ＬＵＭＡ１遺伝子の増幅のため、以下のプライマーを用いた。すなわち、ＬＵＭＡ１−Ａ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＴＴＡＴＡＴＣおよびＬＵＭＡ１−Ｂ：ＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣである。解析のため、対応する腫瘍および正常試料を用いた。 リアルタイムＰＣＲ技術（ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ ７７００）を用いた肺腺癌中のＬＵＭＡ１の発現の検出。ＬＵＭＡ１遺伝子の増幅のため、以下のプライマーを用いた。すなわち、ＬＵＭＡ１−Ａ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＴＴＡＴＡＴＣおよびＬＵＭＡ１−Ｂ：ＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣである。解析のため、対応する腫瘍および正常試料を用いた。 リアルタイムＰＣＲ技術（ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ ７７００）を用いた肺腺癌中のＬＵＭＡ１の発現の検出。ＬＵＭＡ１遺伝子の増幅のため、以下のプライマーを用いた。すなわち、ＬＵＭＡ１−Ａ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＴＴＡＴＡＴＣおよびＬＵＭＡ１−Ｂ：ＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣである。解析のため、対応する腫瘍および正常試料を用いた。 肺腺癌および対応する正常組織中のＬＵＭＡ１転写産物の増幅の終点ＰＣＲのゲル電気泳動。対応する正常試料と比べて、腫瘍Ｔ１およびＴ３では、ＬＵＭＡ１の向上された発現が見られ、腫瘍Ｔ４およびＴ５では、ＬＵＭＡ１の強度の過剰発現が見られた。アガロースゲル上で解析したＰＣＲ産物は、図１６〜２０で示したリアルタイムＰＣＲ反応から由来した。 肺腺癌および対応する正常組織中のＬＵＭＡ１転写産物の増幅の終点ＰＣＲのゲル電気泳動。正常試料Ｎ１、Ｎ３、およびＮ４では、ＬＵＭＡ１転写産物は検出されなかった一方で、肺腺癌Ｔ１およびＴ３では、ＬＵＭＡ１転写産物の発現が検出された。Ｔ４では、増幅は可視ではなかった。Ｔ２およびＴ５では、向上された発現が検出された。ＬＵＭＡ１遺伝子の増幅のために、以下のプライマーを用いた。すなわち、ＬＵＭＡ１−Ｃ：ＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＴＡＣＴＣＣＣおよびＬＵＭＡ１−Ｄ：ＣＡＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＧＧである。 正常組織中の２つの異なるＬＵＭＡ１エキソン７（エキソンＳ）転写産物の増幅の終点ＰＣＲのゲル電気泳動。エキソン７の長い改変体の発現に対して、１１個の正常組織試料を試験した。精巣および肝臓のみで、このエキソン７スプライス改変体の発現が検出された。さらに、精巣、肝臓、および胃で、短いエキソン７スプライス改変体の発現を観測できた。ＮＴＣ＝鋳型対照群なし。 ＬＵＭＡエキソン２に対する１次抗体を用いた肺腺癌（Ｂ）および対応する正常組織（Ａ）の免疫組織化学的解析。癌腫組織および対応する正常肺組織で、エキソン２のタンパク質配列に対するポリクローナル抗体を用いて細胞質染色が検出された。正常および腫瘍間の染色パターンに相違は認められなかった。 ＬＵＭＡエキソン７に対するモノクローナル１次抗体を用いた肺腺癌（Ｂ）および対応する正常組織（Ａ）の免疫組織化学的解析。提供試料の癌腫で、ｌｕｍａエキソン７（長い転写産物）タンパク質アイソフォームの強度の過剰発現が検出可能である。腫瘍細胞は、細胞質染色パターンを示す。対応する正常肺組織では、エキソン７特異的モノクローナル抗体を用いて、染色は検出されなかった。 ＬＵＭＡエキソン７に対するモノクローナル抗体を用いた肺カルチノイド（Ａ）および扁平上皮癌（Ｂ）の免疫組織化学的解析。カルチノイド（Ａ）および扁平上皮癌（Ｂ）では、ＬＵＭＡエキソン７（長い転写産物）タンパク質アイソフォームの強度の過剰発現が検出された。腫瘍細胞は、細胞質染色パターンを示す。

Claims (46)

1. （ａ）図１〜１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と、
   （ｂ）図１〜１２で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と、
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）で特定される核酸分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも６５パーセントの同一性を 配列が示すポリペプチドをコードする核酸分子と、
   （ｄ）遺伝子コードの縮重により、（ａ）〜（ｃ）の核酸分子の配列とは配列が異なる核酸分子と、
   （ｅ）（ａ）〜（ｄ）の核酸分子のフラグメントまたは対立遺伝子改変体を表す核酸分子と、
   （ｆ）（ａ）〜（ｅ）の核酸から転写されるｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡと、
   （ｇ）図１１に提示される遺伝子の選択的スプライシング事象により生じるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡである核酸と、
   （ｈ）野生型アミノ酸配列と比べて、増加されたまたは減少された生物学的活性を有する、図１〜１２に示されるアミノ酸配列のフラグメントまたは改変体をコードする核酸と
   からなる群より選択される、肺腫瘍に関連する単離された核酸分子。
2. 請求項１の核酸分子を含む組換えベクター。
3. 原核生物および／または真核生物宿主細胞中で翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を可能にする調節因子に、前記核酸分子が作動可能に連結された、請求項２の組換えベクター。
4. 請求項２または３の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
5. 哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞、または酵母細胞である請求項４の組換え宿主細胞。
6. （ａ）請求項１の核酸分子によりコードされるポリペプチドと、
   （ｂ）図１〜１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに対して生成されて、該（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに特異的に結合する結合因子により認識されるポリペプチドと、
   （ｄ）ストリンジェントな条件下で請求項１記載の核酸にハイブリダイズする核酸配列にコードされる、（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドのフラグメントまたは改変体と、
   （ｅ）肺腫瘍に関連する野生のポリペプチドと比べて、増加されたまたは減少された生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドのフラグメントまたは改変体と
   からなる群より選択される、肺腫瘍に関連する単離されたポリペプチド分子。
7. （ａ）ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項４または５の組換え宿主細胞を培養する工程と、
   （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程と
   を包含する、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの生物学的特性を示すポリペプチドを作製する方法。
8. 細胞を含まないインビトロの転写および／または翻訳系で、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドを生産する方法。
9. 請求項７または８の方法により生産されるポリペプチド。
10. 請求項１または２記載のポリペプチドもしくは核酸またはそのフラグメントを含む、融合ポリペプチドまたはキメラ核酸。
11. 請求項１の核酸またはそのフラグメントに逆相補的または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡである核酸。
12. （ａ）抗体と、
    （ｂ）抗体のフラグメントと、
    （ｃ）免疫原結合エピトープを含むペプチド模倣化合物と、
    （ｄ）抗原に特異的に結合できるオリゴペプチドと
    からなる群より選択される、請求項６または９のポリペプチドを特異的に認識および結合する結合因子。
13. 検出可能に標識された、請求項１記載の核酸、請求項６、９、または１０記載のポリペプチド、あるいは請求項１２記載の結合因子。
14. 前記標識は、放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、ビオチンまたはジゴキシゲニンのような生物学的に関連する結合構造、あるいは酵素からなる群より選択される、請求項１３記載の核酸、ポリペプチド、または結合因子。
15. 増殖性傷害の検出および治療での使用のための、図１１に示される肺腫瘍に関連する遺伝子の、ネイティブまたは化学的に前処理されたゲノム核酸配列。
16. 請求項１の少なくとも１つのポリヌクレオチドあるいは請求項２または３の組換えベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物。
17. 対応する肺腫瘍に関連するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つの不活性化野生型対立遺伝子をさらに含む、請求項１６のトランスジェニック非ヒト動物。
18. マウスまたはラットである、請求項１６または１７のトランスジェニック非ヒト動物。
19. （ａ）請求項６、９、または１０のポリペプチドを、スクリーニングされるべき化合物に接触させる工程と、
    （ｂ）該化合物が該ポリペプチドの活性に作用したかどうか、または該ポリペプチドに対する該化合物の結合が生じたかどうかを決定する工程と
    を包含する、請求項６、９、または１０のポリペプチドに対する結合パートナーを同定する方法。
20. （ａ）請求項６、９、または１０のポリペプチドと共に候補化合物をインキュベートする工程と、
    （ｂ）生物学的活性を検定する工程と、
    （ｃ）該ポリペプチドの生物学的活性が変化されたかどうかを決定する工程と
    を包含する、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの活性化因子／アゴニストまたはインヒビター／アンタゴニストを同定する方法。
21. （ａ）タンパク質発現に対するインヴィヴォまたはインビトロ試験系を用いて候補化合物をインキュベートする工程、あるいは化合物を試験生物に投与する工程と、
    （ｂ）該試験系内または該生物内の、請求項６または９のポリペプチドのレベルを検出する工程と、
    （ｃ）該ポリペプチドのレベルが変化されたかどうかを決定する工程と
    を包含する、本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの発現の活性化因子またはインヒビターを同定する方法。
22. （ａ）タンパク質分解、細胞増殖、または細胞分化に応答して検出可能なシグナルを提供できる化合物の存在下で、請求項６または９のポリペプチドあるいは該ポリペプチド発現する細胞を、タンパク質分解、細胞増殖、または細胞分化の変化を可能にする条件下で、スクリーニングされるべき薬物候補と接触させる工程と、
    （ｂ）タンパク質分解、細胞増殖、または細胞分化から生成されるシグナルの有無またはシグナルの増加を検出する工程とを包含し、
    ここで、該シグナルの存在または増加が推定上の薬物の指標となる、細胞増殖性傷害の治療用の薬物候補を同定および入手する方法。
23. 前記細胞は、請求項１７または１８の１項に記載の、トランスジェニック非ヒト動物に含まれている請求項２２の方法。
24. 請求項１９〜２１の方法の１つにより入手可能な、請求項６または９のポリペプチドの活性化因子／アゴニストまたはインヒビター／アンタゴニスト、請求項６または９のポリペプチドの発現の活性化因子またはインヒビター、あるいは請求項６または８のポリペプチドの結合パートナー。
25. （ａ）個体からサンプルを入手する工程と、
    （ｂ）請求項１または６記載の核酸分子またはポリペプチドである１つ以上のマーカー分子のレベルを決定する工程と、
    （ｃ）該サンプル内の該核酸またはポリペプチドのレベルを、試験される疾患に冒されていない対応する試験サンプル内の内容物と比較する工程とを包含し、
    ここで、単一のマーカー分子または１組のマーカー分子の野生型レベルと比べての著しい変化を、該傷害または疾患経過の予後の指標とみなして、診断または疾患経過の予後を予測する、異常な細胞増殖に関連する傷害の診断および／または疾患経過の予後のための方法。
26. 前記サンプルは、核酸、ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを含む液体、細胞または細胞破片を含む液体、組織サンプル、細胞サンプル、あるいは生検材料である、請求項２５の方法。
27. 前記サンプルは、体液、血液、血漿、血清、痰、分泌物、細胞サンプルおよび／または組織サンプル、あるいは生検材料である、請求項２５または請求項２６の方法。
28. 前記疾患は、細胞増殖性傷害、癌、または前駆病変である、請求項２７記載の方法。
29. 前記癌は、頭頸部癌、気道癌、胃腸管癌、皮膚およびその付属器官の癌、中枢神経系および末梢神経系の癌、泌尿器系癌、生殖器系癌、内分泌系癌、柔組織および骨の癌、リンパ球産生系および造血系の癌、乳癌、結腸直腸癌、または肛門性器癌である、請求項２８記載の方法。
30. 前記マーカー分子の発現の検出は、検出されるべき該マーカー分子に特異的に結合する少なくとも１つのプローブを用いて実行される、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記プローブは検出可能に標識される、請求項３０記載の方法。
32. 前記標識は、放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、ビオチンまたはジゴキシゲニンのような生物学的に関連する結合構造、あるいは酵素からなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
33. 前記少なくとも１つのプローブは、抗体、抗体のフラグメント、抗原結合エピトープを含むペプチド模倣物、またはミニ抗体である、請求項３０〜３２記載の方法。
34. 前記検出は免疫細胞化学的検出手順を含む、請求項３３記載の方法。
35. 前記少なくとも１つのプローブは、前記マーカー分子の検出に用いられるマーカー核酸にハイブリダイズする核酸である、請求項３０〜３２記載の方法。
36. 前記検出反応は、核酸増幅反応を含む請求項３５記載の方法。
37. インサイチュ検出に用いられる、請求項３５〜３６記載の方法。
38. インビボまたはインビトロの分子画像化法の過程で用いられる、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 傷害の早期診断、最小残留疾患の診断、または予的スクリーニング試験の過程で実行される、請求項２４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
40. （ａ）ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの検出用試薬と、
    （ｂ）緩衝液、検出マーカー、キャリア物質などのような、検出反応を実行するために通常使用される試薬および緩衝液と
    を少なくとも含む、請求項２４〜３８のいずれか１項に記載の方法を実行するための試験キット。
41. 前記ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの前記検出用試薬は、該ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドに特異的に結合する因子である、請求項３９記載の試験キット。
42. 本発明の肺腫瘍に関連するポリペプチドの発現に関連する傷害を処置するために有用な医薬の製造のための、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の１つ以上の化合物および／または請求項６もしくは８のポリペプチドの活性化因子／アゴニストもしくはインヒビター／アンタゴニスト、請求項６もしくは８のポリペプチドの発現の活性化因子もしくはインヒビター、請求項６もしくは８のポリペプチドの結合パートナー、または請求項２１記載の方法により同定可能な薬物候補の使用。
43. 前記傷害は、良性および悪性の腫瘍、癌腫、または異形成症である、請求項４１記載の使用。
44. 前記腫瘍は、頭頸部癌、気道癌、胃腸管癌、皮膚およびその付属器官の癌、中枢神経系および末梢神経系の癌、泌尿器系癌、生殖器系癌、内分泌系癌、柔組織および骨の癌、リンパ球産生系および造血系の癌、乳癌、肛門性器癌、または結腸直腸癌である、請求項４２記載の使用。
45. 前記処置方法は、免疫療法、ワクチン接種療法、または遺伝子治療である、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の使用。
46. 異常な細胞増殖によって特徴付けられる傷害の処置に用いるための、請求項１〜１５記載の少なくとも１つの化合物、および／または請求項６もしくは８のポリペプチドの活性化因子／アゴニストもしくはインヒビター／アンタゴニスト、請求項６もしくは８のポリペプチドの発現の活性化因子もしくはインヒビター、請求項６もしくは８のポリペプチドの結合パートナー、または請求項２１記載の方法により同定可能な薬物候補を含む、薬学的組成物。

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