ES2304398T3

ES2304398T3 - Antigeno de tumores.

Info

Publication number: ES2304398T3
Application number: ES01984425T
Authority: ES
Inventors: Kyogo Itoh
Original assignee: Green Peptide Co Ltd
Current assignee: Green Peptide Co Ltd
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2001-07-30
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2021-07-30
Also published as: EP1306431B1; US7524930B2; US7148326B2; US20070031431A1; ATE389668T1; US20070031433A1; DE60133287T2; US7427660B2; JP4900884B2; US20070066804A1; US7404270B2; EP1306431A4; DE60133287D1; US7432354B2; US20070031432A1; US7408037B2; CA2417570A1; CA2417570C; US20070071767A1; AU2002227498A1

Abstract

Un péptido constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido de SEQ ID Nº: 1 a SEQ ID Nº: 44.

Description

Antígeno de tumores.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un antígeno de tumores, y más particularmente a se refiere a un péptido reconocido por linfocitos T citotóxicos específicos de tumores, un polinucleótido que codifica el péptido de y un polinucleótido de hebra complementario a él, un vector recombinante que comprende el polinucleótido, un transformante que comprende el vector recombinante, un anticuerpo contra el péptido, un compuesto que tiene cualquier interacción con el péptido o el polinucleótido, un inductor de linfocito T citotóxico que consta del péptido, y una composición farmacéutica que comprende el mismo, y procedimiento para producir el polipéptido, un procedimiento para seleccionar un compuesto que tiene cualquier interacción con el péptido o el polinucleótido, un procedimiento para inducir linfocitos T citotóxicos usando el péptido, un procedimiento para medir el péptido o el polinucleótido que codifica el péptido, y un kit de reactivo usado para el procedimiento de medición.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune, particularmente linfocitos T citotóxicos (que de aquí en adelante se pueden abreviar como CTL) juegan un papel importante en la exclusión de cáncer in vivo. La infiltración de linfocitos T citotóxicos que muestran una actividad citotóxica contra las células tumorales se han detectado en el sitio del tumor de un paciente de cáncer (Arch. Surg., 126: 200 - 205, 1990). Una molécula Diana (antígeno de tumores) de los linfocitos T citotóxicos específicos de tumores se descubrió primero en un melanoma. Un antígeno de tumores generado en una célula tumoral se degrada en la célula en un péptido (péptido de antígeno de tumores) constituido por 8 a 11 aminoácidos, que se une a una molécula de antígeno de leucocitos humanos (HLA) que es el antígeno de complejo de histocompatibilidad principal que se va a mostrar sobre la superficie de la célula tumoral. Los linfocitos T citotóxicos reconocen un complejo constituido por HLA y el péptido de antígeno de tumores, y un daño de la célula tumoral. En otras palabras, los linfocitos T citotóxicos reconocen el péptido de antígenos de tumores de una manera restringida de HLA.

HLA es un antígeno de membrana de la célula, y se expresa sobre casi todas las células eucarióticas. HLA se clasifica principalmente en el antígeno de clase I y antígeno de clase II. El HLA reconocidos por los linfocitos T citotóxicos conjuntamente con un péptido de antígeno pertenece a los antígenos de clase I. Los antígenos de clase I de HLA se clasifican adicionalmente en HLA-A, HLA-B, HLA-C, y así sucesivamente. Se reseñó que HLA tiene polimorfismo genético. El alelo HLA-A2, que es uno de los polimorfismos de la sub-región HLA-A, se encuentra en aproximadamente 23% de los negros africanos, aproximadamente 53% de los chinos, aproximadamente 40% de los japoneses, aproximadamente 49% de los caucasianos del norte, y aproximadamente 38% de los caucasianos del sur.

Como se usa en el presente documento, un antígeno de tumores significa una proteína, un polipéptido, o un péptido, que constituye parte de la célula tumoral y es capaz de inducir linfocitos T citotóxicos específicos de tumores. Un péptido de antígeno de tumores significa un péptido que se genera como resultado de la degradación del antígeno de tumores en una célula tumoral y puede inducir o activar linfocitos T citotóxicos específicos de tumores tras expresarse sobre la superficie celular mediante la unión de una molécula de HLA. Además el sitio de la secuencia de aminoácidos que es capaz de inducir linfocitos T citotóxicos específicos de tumores que está presente en un antígeno de tumores se llama un epítope de antígeno de tumores (determinante de antígeno de tumores).

En los años recientes, muchos genes que codifican antígenos de tumores que se pueden reconocer por linfocitos T citotóxicos se han identificado a partir de ADNc de células tumorales humanas (Science 254: 1643 - 1647, 1991; J. Exp. Med. 183: 1185 - 1192, 1996; J. Immunol. 163: 4994 - 5004, 1999). Algunos de estos genes están implicados en la proliferación celular y transformación maligna que incluye HER/neu (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92: 432 - 436, 1995) cdk mutante (Science, 269: 1281 - 1284, 1995) CASP-8 mutante (J. Exp. Med., 186: 785 - 793, 1997) y así sucesivamente.

Por otra parte, una molécula tal como un gen de antígeno de rechazo de tumores y un receptor de antígeno de células T (TCR), que están implicados en la inmunidad específica, se han identificado en melanoma, cáncer de esófago, y otros cánceres en los 10 años pasados, y una inmunoterapia específica de cáncer avanzado se ha estudiado usando el péptido.

Ahora, en Europa y en los Estados Unidos, se ha desarrollado terapia de vacuna de cáncer en el que los linfocitos T citotóxicos se activan mediante una administración de un antígeno de tumores en un paciente de cáncer. Se han reseñado los resultados de un ensayo clínico de un antígeno de tumores específico de melanoma. Por ejemplo, la administración de un péptido gp-100 de antígeno de melanoma por vía subcutánea a pacientes de melanoma junto con la administración de interleuquina-2 (IL-2) por vía intravenosa proporcionó una regresión de tumores en el 42% de los pacientes (Nature Medicine, 4: 321, 1998). De esta forma, utilizando un antígeno de tumores como una vacuna, se puede lograr un tratamiento eficaz contra cáncer.

Sin embargo, casi todos los antígenos de tumores identificados se derivan de melanoma. Los antígenos de tumores derivados de cánceres de epitelio y adenocarcinomas, tal como cáncer de páncreas, que se produce a altas velocidades de incidencia, se han reseñado para tal inmunoterapia específica solamente en unas pocas publicaciones. El cáncer de páncreas es una de las causas mayores de muerte por cáncer en el mundo y provoca aproximadamente 27.000 muertes al año en los Estados Unidos y aproximadamente 50.000 muertes en Europa. Los muchos factores que provocan estos grandes números de muertes son la carencia de un procedimiento terapéutico eficaz, y dificultar de diagnosis, y la actividad de este cáncer. Solamente entre 1 y 4% de pacientes de cáncer de páncreas superan la enfermedad, y la incidencia sustancialmente iguala la tasa de muerte. Por lo tanto, es necesario un nuevo planteamiento de terapia, por ejemplo, desarrollo de inmunoterapia específica.

Además, en vista de la diversidad de cáncer, un antígeno de tumores idéntico no se debería expresar en el mismo grado en todas las células cancerosas. Naturalmente, la terapia de vacuna de cáncer mediante la activación de de los linfocitos T citotóxicos que usan un tipo de antígeno de tumores tiene un efecto terapéutico sobre el cáncer que tiene el antígeno de tumores. Sin embargo, con el fin de inducir y activar los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno tumoral y obtener un alto efecto terapéutico que corresponde a la diversidad de cáncer, es importante descubrir y usar muchos antígenos de tumores novedosos de acuerdo con la diversidad de cáncer.

Descripción de la invención

Una realización de la presente invención es un péptido constituido por una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº: 1 a SEQ ID Nº: 44 en el listado de secuencias.

La presente invención describe un polipéptido constituido por una secuencia de aminoácidos s de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº: 45 a SEQ ID Nº: 53.

Una realización de la presente invención es un medicamento que comprende uno o más de los péptidos seleccionados entre los péptidos, que constan de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº:1 a SEQ ID Nº:44 en el listado de secuencias.

Una realización de la presente invención es una vacuna contra el cáncer que comprende uno o más de los péptidos seleccionados entre los péptidos, que consta de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº:1 a SEQ ID Nº: 44 en el listado de secuencias.

Una realización de la presente invención es una vacuna contra el cáncer que comprende uno o más de los péptidos seleccionados entre los péptidos, que constan de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº: 1 a SEQ ID Nº: 4 4 en el listado de secuencias, centrada en el tratamiento de cáncer de páncreas, cáncer de colon, o cáncer de estómago.

Una realización de la presente invención es un inductor de linfocitos T citotóxicos que comprende uno o más de los péptidos seleccionados entre los péptidos, que consta de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº:1 a SEQ ID Nº:44 en el listado de secuencias.

Una realización de la presente invención es un procedimiento para inducir linfocitos T citotóxicos que usan uno o más de los péptidos seleccionados entre los péptidos, que constan de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº:1 a SEQ ID Nº:44 en el listado de secuencias.

Una realización de la presente invención es un polipéptido que codifica un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº:1 a SEQ ID Nº:44 en el listado de secuencias, o su hebra complementaria.

La presente invención describe un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº:54 a SEQ ID Nº: 62 en el listado de secuencias, o su hebra complementaria.

La presente invención describes un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las de SEQ ID Nº:54 a SEQ ID Nº:62 en el listado de secuencias, o su hebra complementaria, en la que un polipéptido codificado por el polinucleótido induce linfocitos T citotóxicos y/o se reconoce por los linfocitos T citotóxicos.

Una realización de la presente invención es un polinucleótido que se hibrida al polinucleótido o su hebra complementaria en condiciones rigurosas. Una realización de la presente invención es un vector recombinante que comprende el polinucleótido o su hebra complementaria o el polinucleótido que se hibrida al polinucleótido o su hebra complementaria en condiciones rigurosas.

Una realización de la presente invención es un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido o su hebra complementaria o el polinucleótido que se hibrida al polinucleótido o su hebra complementaria en condiciones rigurosas.

Una realización de la presente invención es un transformante transformado con el vector recombinante o el vector de expresión recombinante, que comprende el polinucleótido o su hebra complementaria o el polinucleótido que se hibrida al polinucleótido o su hebra complementaria en condiciones rigurosas.

Una realización de la presente invención es un procedimiento que produce el polipéptido, que comprende el cultivo del transformante transformado con el vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido o su hebra complementaria o el polinucleótido que se hibrida al polinucleótido o su hebra complementaria en condiciones rigurosas.

Una realización de la presente invención es un anticuerpo que inmunológicamente reconoce el péptido.

Una realización de la presente invención es un procedimiento para la selección de un compuesto que potencia al menos el reconocimiento del péptido por linfocitos T citotóxicos restringidos de HLA-A2, interactuando con el péptido y/o HLA-A2 para potenciar, y/o el compuesto que potencia la expresión del polinucleótido o su hebra complementaria interactuando, con el mismo, en el que el procedimiento usa al menos uno seleccionado entre un grupo constituido por el péptido, el polinucleótido o su hebra complementaria, el vector recombinante o el vector de expresión recombinante, el transformante, y el anticuerpo.

Una realización de la presente invención es un compuesto obtenido por el procedimiento para seleccionar un compuesto que potencia al menos el reconocimiento del péptido por linfocitos T citotóxicos restringidos de HLA-A2, interactuando con el péptido y/o HLA-A2 para potenciar, y/o el compuesto que potencia la expresión del polinucleótido o su hebra complementaria que interactúa con el mismo, en la que el procedimiento usa al menos uno seleccionado entre un grupo constituido por el péptido, el polinucleótido o su hebra complementaria, el vector recombinante, el vector de expresión recombinante, el transformante, y el anticuerpo.

Una realización de la presente invención es un compuesto que potencia el reconocimiento de al menos uno de los péptidos por los linfocitos T citotóxicos restringidos de HLA-A, o el compuesto que potencia la expresión del polinucleótido o su hebra complementaria mediante la interactuación con el mismo.

Una realización de la presente invención es una composición farmacéutica usada para tratamiento de cáncer, que comprende al menos una seleccionada entre el grupo constituido por el péptido, el polinucleótido o su hebra complementaria, el vector recombinante o el vector de expresión recombinante, el transformante, el anticuerpo, y el compuesto.

Una realización de la presente invención es el uso de medicamento, la vacuna contra el cáncer, el inductor de los linfocitos T citotóxicos, o la composición farmacéutica para la enfermedad de cáncer.

Una realización de la presente invención es un procedimiento para medir de manera cuantitativa o de manera cualitativa el péptido, o el polinucleótido.

Una realización de la presente invención es un kit de reactivos usado en el procedimiento para medir de manera cuantitativa o de manera cualitativa el péptido, o el polinucleótido, en el que el kit comprende al menos uno seleccionado entre el grupo constituido por el péptido, el polinucleótido o su hebra, y el anticuerpo.

Una realización de la presente invención es el uso de un kit de reactivos para un ensayo de de la enfermedad de cáncer, en el que el kit se usa para medir de manera cuantitativa o de manera cualitativa el péptido, o el polinucleótido, comprende al menos uno seleccionado entre un grupo constituido por el péptido, el polinucleótido o su hebra complementaria, y el anticuerpo.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra que OK-CTLp (HLA-A0207/A3101) lisa las células tumorales de una manera restringida de HLA-A2.

La Fig. 2 ilustra que el reconocimiento de la línea celular de adenocarcinoma de páncreas Panc-1 por OK-CTLp y la producción de interferón como resultado del mismo es un episodio restringido de HLA-A2.

La Fig. 3 ilustra que OK-CTLp reconoce las células COS7, en la que cada uno de los clones de ADNc 1 a 6 ((A) en la figura) y el clon 7 de ADNc 7 ((B) en la figura), obtenida de la línea celular de adenocarcinoma de páncreas humano Panc-1, se coexpresó con HLA-A2, de una manera restringida de HLA-A2.

La Fig. 4 ilustra que los clones de ADNc 1 a 6, obtenida de la línea celular de adenocarcinoma de páncreas humano Panc-1, se reconocen por OK-CTLp de una manera dependiente de la dosis. En la figura, (A), (B), (C), (D), (E), y (F) cada una muestra que OK-CTLp reconoce las células COS7, en la que cada uno de los clones de ADNc 1 a 6, que tiene una alta homología con UBE2V, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, ppMAPkkk, y 2-5 OAS3, respectivamente, se coexpresó con HLA-A2, de una manera restringida de HLAA2. El símbolo -\blacksquare- muestra la cantidad de interferón \gamma producida por OK-CTLp, cuando el gen HLAA0207 se coexpresa con cada uno de los antígenos de tumores en las células diana, -\lozenge- muestra la cantidad de interferón \gamma producida por OK-CTLp, cuando el gen HLA-A2402 se coexpresa con cada uno de los genes de antígenos de tumores en las células diana

La Fig. 5 ilustra que el clon OK-CTLp u OK-CTL reconoce cinco péptidos derivados de un producto génico del gen 1 de antígenos de tumores que se obtiene a partir de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano, que tiene alta homología con UBE2V.

La Fig. 6 ilustra que el clon OK-CTLp o OK-CTL reconoce cuatro péptidos derivados de un producto génico del gen 2 de antígeno de tumores que se obtiene a partir de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano, que tiene alta homología con HNRPL.

La Fig. 7 ilustra que el clon OK-CTLp o OK-CTL reconoce cuatro péptidos derivados de un producto génico del gen 3 de antígeno de tumores que se obtiene a partir de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano, que tiene alta homología con WHSC2.

La Fig. 8 ilustra que el clon OK-CTLp o OK-CTL reconoce dos péptidos derivados de un producto génico del gen 4 de antígeno de tumores que se obtiene a partir de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano, que tiene alta homología con EIF4EBP1.

La Fig. 9 ilustra que OK-CTLp o OK-CTL reconoce tres péptidos derivados de un producto génico del gen 5 de antígeno de tumores que se obtiene a partir de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano, que tiene alta homología con ppMAPkkk.

La Fig. 10 ilustra que el clon OK-CTLp o OK-CTL reconoce un péptido derivado de un producto génico del gen 3 de antígeno de tumores que se obtiene a partir de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano, que tiene alta homología con 2-5 OAS3.

La Fig. 11 ilustra péptidos representativos que muestran que los péptidos del antígeno de tumores péptidos, que se derivan de productos génicos del antígeno de tumores obtenidos a partir de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano, se reconocen por el clon OK-CTL de una manera dependiente de la dosis. Cada uno de (A), (B), (C), (D), (E), y (F) en esta figura muestra que OKCTLp reconoce los péptidos que se derivan de productos génicos de los genes de antígeno de tumores 1 a 6, que tiene alta homología con UBE2V, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, ppMAPkkk, y 2-5 OAS3, respectivamente.

La Fig. 12 ilustra que los tres péptidos derivados de un producto génico del gen 1 de antígeno de tumores que tiene alta homología con UBE2V puede inducir CTL que muestran citotoxicidad contra la célula tumoral HLA-A2+ de células de mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer. El símbolo -\blacksquare- muestra línea celular Panc-1
de adenocarcinoma de páncreas humano (HLAA0201/1101), -\blacklozenge- muestra la línea celular de adenocarcinoma de colon humano SW620 (HLA-A0201/2402), -\medcirc- muestra la línea celular adenocarcinoma de pulmón RERF-LC-MS de HLAA2 (HLA-A1101/1101), -\Delta- muestra una célula B autóloga transformada de EBV (HLA-A0207/3101), -\square- y muestra un blasto PHA de célula T autóloga (HLA-A0207/3101). Estos símbolos también se usan de la misma manera en las Figs. 13 a 17 descritas a continuación.

La Fig. 13 ilustra que dos péptidos derivados de un producto génico del gen 2 del antígeno de tumores que tienen alta homología con HNRPL pueden inducir CTL que muestran citotoxicidad contra la célula tumoral de HLA-A2+, a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer.

La Fig. 14 ilustra que dos péptidos derivados de un producto génico del gen 3 de antígeno de tumores que tiene alta homología con WHSC2 puede inducir CTL que muestran citotoxicidad contra célula tumoral de HLA-A2+, a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer.

La Fig. 15 ilustra que dos péptidos derivados de un producto génico del gen 4 de antígeno de tumores que tiene alta homología con EIF4EBP1 puede inducir CTL que muestran citotoxicidad contra célula tumoral e HLA-A2+, a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer.

La Fig. 16 ilustra que un péptido derivado de un producto génico del gen 5 del antígeno de tumores que tiene alta homología con ppMAPkkk puede inducir CTL que muestran citotoxicidad contra célula tumoral de HLA-A2+, a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer.

La Fig. 17 ilustra un péptido derivado de un producto génico del gen 6 de antígeno de tumores que tiene alta homología con 2-5 OAS3 puede inducir CTL que muestran citotoxicidad contra célula tumoral de HLA-A2+, a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer.

La Fig. 18 ilustra que los péptidos de antígeno de tumores pueden inducir CTL, que muestra actividad citotóxica de una manera restringida de HLA-A2 y de una manera dependiente de la dosis, a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer. (A), (B), (C), (D), y (E) en esta figura cada una muestra que los péptidos derivados de los productos génicos de los genes 1 a 5 de antígeno de tumores, que tienen alta homología con UBE2V, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, y ppMAPkkk, respectivamente, induce CTL que reconocen el péptido de una manera restringida de HLA-A2, a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer. El símbolo -\blacksquare- muestra células T2 en la que el péptido de antígeno de tumores se realiza para expresar y -\lozenge- muestra células T de blastos de PHA.

La Fig. 19 ilustra que los productos génicos de de los genes del antígeno de tumores KM-PA-2 ((A) en la figura) y KM-PA-4 ((B) en la figura), que se obtuvieron a partir de la línea celular CFPAC-1 de adenocarcinoma de páncreas humano, se reconocen por OK-CTLp de una manera restringida de HLA-A2.

La Fig. 20 muestra que los péptidos derivados de los genes del antígeno de tumores KM-PA-2 y KM-PA-4, respectivamente, que se obtuvieron a partir de la línea celular humano CFPAC-1 de adenocarcinoma de páncreas (A y B en la figura, respectivamente), puede inducir CTL a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente de cáncer, que muestra citotoxicidad contra las células T2 que se han pulsado con el péptido que corresponde al péptido usado para estimular las PBMC (lado izquierdo de las figuras de A y B en la figura), y una Panc-1 de la célula tumoral HLA-A2+ (lado derecho de A y B en la figura).

La Fig. 21 muestra que CTL, que se indujo a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente de cáncer por el péptido derivado del gen KM-PA-2 del antígeno de tumores obtenido a partir de la línea celular CFPAC-1
de adenocarcinoma de páncreas humano, lisa las células tumorales de una manera restringida de HLA-A2.

Modo mejor para llevar a cabo la invención

Con el fin de identificar un gen de antígeno de rechazo de tumores y un antígeno de tumores codificado por el gen, que se puede usar para para< la inmunoterapia específica de un cáncer de páncreas, se han establecido linfocitos T citotóxicos específicos de tumores restringidos de HLA-A2 en la presente invención qu7e se activan mediante reconocimiento de HLA-A2 y un péptido de antígeno de tumores (de aquí en adelante, esta célula se puede llamar OK-CTLp) de un paciente de cáncer de colon, y genes que codifican antígenos de tumores, que se pueden reconocer por estos linfocitos T citotóxicos específicos de tumores (CTL), se han aislado/identificado a partir de una genoteca de ADNc de la célula Panc-1 que como la línea celular de adenocarcinoma de páncreas humano que usa el procedimiento de clonación de la expresión de los genes. En la presente invención, también se han identificado los genes, que se pueden reconocer por CTL de la misma forma que se ha descrito anteriormente, de los genes identificados como los que codifican el antígeno de tumores mediante el procedimiento SEREX (análisis sexológico de genotecas de expresión de ADNc) (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92: 11910 - 11813, 1995). Además, basándose en el antígeno de tumores codificado por el gen obtenido, se ha encontrado un péptido que tiene el epítope de antígeno de tumores en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, a polipéptido significa un péptido de cadena larga de péptidos arbitrarios que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico o por un enlace peptídico modificado. Por ejemplo, se incluye una proteína en la definición de polipéptido en el presente documento. Además, un péptido de cadena corta a veces llamado un oligopéptido o un oligómero se llama simplemente un péptido en el presente documento.

"Reconocer" en el presente documento significa que un sujeto distingue un objeto de otros y lo reconoce, por ejemplo, se une al objeto conocido Particularmente, en la presente invención, CTL que reconocen las células tumoraleso los péptidos de antígeno de tumores significa que CTL se une mediante un receptor de células T a los péptidos de antígeno de tumores que se presentan por HLA.

"Activar" en el presente documento significa que potencia o lo hace que funcione además una cosa o un estado, que tiene una actividad o una acción. Particularmente, en la presente invención, la activación de CTL significa que CTL reconocen un antígeno que se está presentando por HLA para producir IFN-\gamma o CTL muestran citotoxicidad contra las células diana reconocidas por CTL.

"Inducir" en el presente documento significa que genera una actividad o una acción de de una cosa o un estado que están en una fase que solamente tiene la actividad o acción. Particularmente, en la presente invención, la inducción de CTL específicos de antígeno significa que hace CTL, que específicamente reconoce un cierto antígeno diferencia y/o prolifera in vitro o in vivo. Además, el inductor de linfocitos T citotóxicos en la presente invención significa un medicamento que cambia el estado, donde los linfocitos T positivos de CD8 -que específicamente reconocen un cierto antígeno está ausente o presente en un grado muy bajo, al estado, donde los linfocitos T citotóxicos que reconocen el antígeno está presente en un grado alto.

Aislamiento e identificación del gen de antígeno de tumores, antígeno de tumores, y péptido de antígeno de tumores

En la presente invención, OK-CTLp que era el linfocito T citotóxico restringido de HLA-A2 -descrito anteriormente se usó como una célula efectora y antígenos de tumores capaces de activar esta célula se aislaron e identificaron mediante el uso del procedimiento de clonación de expresión de genes. En otras palabras, el ADNc de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano y ADNc de HLA-A0207 se cotransfectaron en células COS-7, y entre las células en las que los genes transfectados se expresaron, las células que potencian la producción de IFN-\gamma a partir de OK-CTLp se seleccionaron, y por lo tanto, se identificó el gen que codifica el antígeno de tumores capaz de activación de CTL. El procedimiento se presentará en más detalle en los ejemplos descritos en el presente documento. Como resultado, se obtuvieron siete clones de ADNc que se reconocieron por OK-CTLp de una manera restringida de HLA-A2.

Además, dos genes, KM-PA-2 y KM-PA-4, que codifican los antígenos de tumores capaces de activar CTL de una manera restringida de HLAA2 se encontraron de la misma manera que se ha descrito anteriormente a partir de los genes que codifican el antígenos de tumores, se detectaron a partir de una genoteca de ADNc de la línea celular de adenocarcinoma de páncreas humano CFPAC-1 que usa el procedimiento SEREX y ya se reseñaron (Biochim. Biophys. Res. Commun., 281: 936 - 944, 2001). El procedimiento SEREX es un procedimiento que se puede aplicar a la detección de de un antígeno de tumores. Sin embargo, entre 1500 o más tipos de antígenos de tumores detectados mediante este procedimiento, los que se identifican como antígenos de tumores capaces de inducir tanto inmunidad mediada por células como inmunidad humoral son solamente MAGE-1, tirosinasa, y NY-ESO-1. De este modo, el antígeno de tumores identificado por el procedimiento SEREX no puede siempre activar CTL. La presente invención reveló primero que los genes de antígeno de tumores descritos anteriormente, KM-PA-2 y KM-PA-4, puede activar CTL de una manera restringida de HLA-A2.

Los siete clones de ADNc descritos anteriormente, que se obtuvieron a partir de la célula Panc-1, contenía un marco abierto de lectura completo (ORF). La secuencia de bases de nucleótidos de estos genes se determinó mediante el procedimiento de Sanger (procedimiento de terminador de cadena) para estimar la secuencia de aminoácidos en base a la secuencia de bases de nucleótidos. Cuando se lleva a cabo una investigación de homología para estas secuencias de bases de nucleótidos y se dedujeron las secuencias de aminoácidos en una base de datos existente tal como GenBank, se encontró que estos genes eran los ADNc cuyas secuencias de bases de nucleótidos son novedosas, que funcionan como un antígeno de tumores. Con relación al clon 3 entre los 7 clones entre los clones de ADNc (clones 1 a 7) obtenidos, la secuencia de un clon inicial, que se obtuvo mediante el procedimiento de clonación de la expresión del gen descrito anteriormente, y tiene alta homología con la de un gen de la proteína del candidato 2 del síndrome de Wolf - Hirschhorn (WHSC2), era de 25 pares de bases más corto en la región 5'- terminal que la de WHSC2, de manera que se obtuvo ADNc de longitud completa a partir de la genoteca de ADNc de la célula de Panc-1 mediante un procedimiento de hibridación de una colonia estándar usando el clon marcado con ^{32}P como una sonda. En el presente documento de aquí en adelante, los genes de la célula de Panc-1, a partir de la cual se derivaron los clones descritos anteriormente 1 a 7, se llamarán gen 1 a 7, respectivamente. También, los polipéptidos que constan de una secuencia de aminoácidos codificada por cada gen se llaman ocasionalmente en el presente documento producto génico 1 a 7. La secuencia de aminoácidos deducida codificada por cada uno de estos genes se muestran como la SEQ ID Nº: 45 a SEQ ID Nº: 51 en el listado de secuencias, respectivamente, y las secuencias de bases de nucleótidos de los mismos se muestran como las SEQ ID Nº:54 a SEQ ID Nº:60 en el listado de secuencias, respectivamente. Los genes 1 a 6 descritos anteriormente y el gen 7 se registraron en el Banco de Datos de ADN de Japón (DDBJ) del Instituto de Investigación Nacional de Genética el 12 de junio de 2000 y 2 de agosto de 2000, respectivamente
(Tabla 1).

Para KM-PA-2 y KM- PA-4, los genes homólogos se han reseñado como se muestra en la Tabla 1 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 281: 936 - 944, 2001). Las secuencias de bases de nucleótidos de KM-PA-2 y KM-PA-4 se muestran como las SEQ ID Nº: 52 y SEQ ID Nº: 53 en el listado de secuencias, respectivamente, y la secuencia deducida de aminoácidos se muestran como las SEQ ID Nº:61 y SEQ ID Nº:62 en el listado de secuencias, respectivamente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

2

3

La secuencia de bases de nucleótidos del gen 1 tiene una alta homología con la de la variante con el gen Kua de la enzima conjugada a ubiquitina (UBE 2V) registrada en el GenBank (nº de acceso AF155120). La longitud del aminoácido (aa) codificado por el gen 1 era ligeramente más larga que la codificada por el gen UBE2V (3 aa en las posiciones 109 a 111). La función de UBE2V no se ha reseñado hasta ahora.

La secuencia de bases de nucleótidos del gen 2 tiene una alta homología con la del gen de la ribonucleoproteína nuclear heterogénea L (HNRPL) (nº de acceso NM_001533). Sin embargo, la longitud de los aminoácidos deducida era< ligeramente más larga que la del gen de HNRPL en las posiciones N- terminal 1 a 31. El producto génico de HNRPL es un complejo de ribonucleoproteína nuclear heterogéneo y proporciona un sustrato para los episodios de procesamiento que el ARNm experimenta en el citoplasma.

La secuencia de bases de nucleótidos del gen 3 tiene alta homología con la del gen de las proteínas del candidato 2 del síndrome de Wolf- Hirschhorn (WHSC2) registrada en GenBank (nº de acceso AK001304). El gen WHSC2 parece que tiene algunas funciones en el fenotipo de WHS, un síndrome de malformación múltiple caracterizado por defectos mentales y de desarrollo que se producen por una supresión parcial del brazo corto del cromosoma 4.

La secuencia de bases de nucleótidos del gen 4 tiene una alta homología con la del gen de la proteína 1 de unión a eIF-4E (EIF4EBP1, nº de acceso NM_004095). El producto del gen EIF4EBP1 se conoce como un factor de inicio de la traducción que inicia la fosforilación dependiente de insulina de 4E-BP1, haciéndolo disponible para formar un complejo de unión a cap activo.

La secuencia de bases de nucleótidos del gen 5 tiene homología con la del gen gen de la proteína quinasa quinasa quinasa (ppMAPkkk, nº de acceso .AJ242724) registrado en el GenBank. La secuencia de aminoácidos deducida codificada por el gen 5 es 230 aa más larga el N-terminal y 258 aa más en el C-terminal cuando se compara la del gen ppMAPkkk registrado (su función no se ha reseñado todavía).

La secuencia de bases de nucleótidos del gen 6 consta de 6707 pares de bases y tiene homología con la del gen de la 3 de 2', 5'-oligoadenilato sintasa (gen 2-5 OAS3, nº de acceso NM_006187) con un total de diferencias de 13-aa en las posiciones 18, 159, 249, 287, 288, 316, 393 a 398, y 984. 2-5 OAS3 se conoce como la proteína inducida de IFN que juega un papel importante en la protección inmune contra la infección por microorganismos.

La secuencia de bases de nucleótidos del gen 7 tiene homología con las posiciones 3701 a 4463 del gen del factor de especificidad escisión humano y poli Adenilation (CPSF, nº de acceso U37012) y la secuencia de aminoácidos es aproximadamente 1226 aa más corta.

La secuencia de bases de nucleótidos del gen KM-PA-2 tiene una alta homología con la de KIAA0124 y los homólogos humanos de bloque de ratón de la proliferación 1 (Bop1). La base de nucleótidos en la posición 1466 del gen KIAA0124 es guanina (G) y de este modo, el resto de aminoácidos de la posición 465 es histidina (H). Por el contrario, en el gen KM-PA-2, son adenina (A) y arginina (R), respectivamente.

La secuencia de bases de nucleótidos del gen KM-PA-4 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen son idénticas a las de la proteína de tipo coactosina (CLP).

Con el fin de obtener péptidos de antígeno de tumores a partir de los 9 genes descritos anteriormente que codifican un antígeno de tumores, se diseñaron y se sintetizaron los péptidos basándose en la secuencia de aminoácidos codificada por los genes descritos anteriormente. Para el gen 7, el gen se consideró como parte de de un gen que consistía de una secuencia de bases más larga, de manera que los péptidos, que se derivaron de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen (CPSF) homólogo al gen 7, donde también se diseñaron y se sintetizaron. Se ha conocido que un péptido de antígeno de tumores capaz de unirse a HLA-A2 tiene un motivo (una secuencia específica) en su secuencia. Después, al principio, el péptido que tiene un motivo de unión a HLA-A2 (una secuencia específica) se investigó en la bibliografía (J. Immunol., 152:163, 1994; Immunogenetics, 41: 178, 1994), y el péptidos de 9-meros a 11-meros, que eran diferentes entre sí y adecuado al motivo obtenido, se diseñaron y se sintetizaron basándose en la secuencia de aminoácidos codificada por los genes descritos anteriormente. El reconocimiento de cada péptido por CTL, se midió usando OK-CTLp o varios tipos de clones de OK- CTL obtenidos mediante la clonación de OK-CTLp mediante el procedimiento de dilución limitante usando la producción de IFN-\gamma a partir de estos CTL como un indicador. Los clones de OK-CTL son las células que reconocen uno cualquiera de los genes 1 a 7 descritos anteriormente. Por otra parte, OK- CTLp reconoce cualquiera de los genes 1 a 7. Los resultados revelan que OK- CTLp es una población de células que reconoce diversos tipos de antígenos de tumores. Por lo tanto, cuando los clones de OK-CTL se usaron para ensayar el péptido por su capacidad de activar CTL, se usó un clon que reconoce el producto del gen que codifica el mismo péptido como el que se va a ensayar. Cuarenta y cuatro péptidos (SEQ ID Nº:1 a SEQ ID Nº:44 en el listado de secuencias; Tabla 2 y Tabla 3) entre los sintetizados se reconocieron por los clones OK-CTLp o OK-CTL y potenciaron la producción de IFN-\gamma a partir de CTL. Entre estos péptidos, P1 a P5, P6 a P9, P10 a P13, P14 y P15, P16 a P18, y P19 son los péptidos constituidos por una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen 1, gen 2, gen 3, gen 4, gen 5, y el gen 6, respectivamente, y codificada también por los genes UBE2V, HNRPL, WHSC2, EIF4-EBP1, ppMAPkkk, y 2-5 OAS3 que tienen alta homología con cada uno de los genes. Por otra parte, P25, P26, P27, P28, P30, y P31 son los péptidos constituidos por una secuencia parcial de las secuencias de aminoácidos codificada por el gen 7 y el gen CPSF que tiene alta homología con el gen 7. P20, P21, P22, P23, P24, P29, y P32 consta de una secuencia parcial de de la secuencia de aminoácidos específica para CPSF.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

4

5

TABLA 3

6

Estos péptidos de antígeno de tumores péptidos se presentan sobre una superficie celular por HLA-A2 y se reconocen por el receptor de las células T (TCR) expresado sobre el clon OK-CTL específico de péptido. Los péptidos derivados del gen 1 y UBE2V, gen 2 y HNRPL, o gen 6 y 2-5 OAS3 se reconocen por el clon OK-CTL que expresa TCR-V\beta 8.1, TCR-V\beta 3.2, o TCR-V\beta14. Además, los Péptidos derivados del gen 3 y WHSC2, gen 4 y EIF4EBP1, o gen 5 y ppMAPkkk se reconocen por el clon OK-CTL que expresa TCR-V\beta13, TCR-V\beta8.1, o TCR-V\beta18, respectivamente.

Dos de cada uno de los clones de OK-CTL que reconocen los péptidos derivados del gen1 y UBE2V, gene2 y HNRPL, y gen 6 y 2-5 OAS3 eran TCR expresadas que poseen diferentes regiones 3 determinantes de complementariedad regiones (CDR 3; un elemento responsable de la unión a epítopes antigénicos sobre un encaje de las moléculas de clase I HLA), respectivamente. El clon OK-CTL que reconoce los péptidos derivados del gen 3 y WHSC2, gen 4 y EIF4EBP1, y gen 5 y ppMAPkkk también expresaban TCR que posee los las diferentes CDR3, respectivamente.

Además, los 44 péptidos descritos anteriormente reconocidos por OK-CTLp cada uno inducían CTL específicos de tumor restringido de HLA-A2 in vitro a partir de células mononucleares de sangre periférica (que, en el presente documento a continuación, se puede abreviar a PBMC) con las células autólogas derivadas de un paciente de cáncer de colon a partir del que se obtuvo OK-CTLp, y/o a partir de pacientes de cáncer PBMC de HLA- A0201+ (cáncer de páncreas, cáncer de colon, y cáncer de estómago). Los CTL descritos anteriormente inducidos a partir de las células mononucleares de sangre periférica de los pacientes de cáncer de células tumorales HLA-A2+ lisadas de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, no se observó ninguna lisis en la célula tumoral RERF-LC-MS de HLA-A2-, y células EBV-B antólogas de HLA-A+ células T de HLA-A+ estimuladas por PHA, ambas de las cuales se derivan de las células normales. Además, los CTL descritos anteriormente mostraron citotoxicidad de una manera dependiente de la dosis contra las células T2 que se pulsaron con el mismo péptido como el que se usa para estimulación.

En base al examen descrito anteriormente, se obtuvieron 44 péptidos de antígeno de tumor capaces de de activación de OK-CTLp Posteriormente, se encontró que estos péptidos podrían inducir CTLs específica de tumor restringida de HLA-A2 de PBMC derivadas de pacientes de cáncer de páncreas, cáncer de colon, y/o cáncer de estómago. Además, se reveló que tanto la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas y la línea celular SW620 de adenocarcinoma de colon se reconocieron por CTLp y por CTLs inducidas a partir de PBMC mediante el péptido descrito anteriormente. Este resultado sugiere que el cáncer de páncreas y cáncer de colon tienen un epítope de antígeno de tumores reconocidos por CTLs.

Polipéptido y péptido

Un polipéptido descrito en la presente invención es un polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos cada una de las cuales está codificada por los genes 1 a 7 descritos anteriormente anteriores obtenidos a partir de la línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas o gen KM-PA-2 o KM-PA-4 obtenido a partir de la línea celular CFPAC-1 de adenocarcinoma de páncreas, y preferiblemente, a polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos descrita en cualquiera de de las de las SEQ ID Nº:45 a SEQ ID Nº:53 en el listado de secuencias. Estos polipéptidos se pueden usar para inducir y/o activar CTL como un antígeno de tumor. Además estos polipéptidos se pueden usar como un material para especificar un epítope de antígeno de tumores para obtener un péptido de antígeno de tumores.

Un péptido de acuerdo con la presente invención se puede obtener mediante el diseño de péptidos, por ejemplo, que son adecuados para el motivo restringido de HLA-A2, basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido descrito anteriormente, para seleccionar los reconocidos por CTL, por ejemplo, que activan y/o inducen CTL, a partir de los péptidos diseñados. Un péptido de acuerdo con la presente invención puede ser el péptido que tiene una propiedad de un epítope de antígeno de tumores presentado en la superficie de la célula que presenta antígeno que se une a HLA-A2 y reconocido por CTL. El péptido consta de restos de aminoácidos de al menos aproximadamente 5 o más, preferiblemente aproximadamente 7 o más, y más preferiblemente 9 a 10. Particularmente preferiblemente, el péptido es uno que consta de una secuencia de aminoácidos descrita por una cualquiera de de las de SEQ ID Nº:1 a SEQ ID Nº:44 en el listado de secuencias. Estos péptidos se pueden usar como un péptido de antígeno de tumores para activar y/o inducir los linfocitos T citotóxicos específicos de tumores restringidos de HLA-A2.

Para activar y/o inducir CTL, uno de los polipéptido o péptido descrito anteriormente se puede usar o se pueden usar en combinación de dos o más. Como se ha descrito anteriormente, CTL es una población que consta de células plurales que reconocen diversos antígenos, de manera que se recomiende usar estos péptidos preferiblemente en combinación con dos o más.

Un péptido, que tiene uno o varios aminoácido (s) con una mutación tal como supresión, sustitución, adición, o inserción introducido (s) en un péptido especificado como antes y se reconoce por al menos los CTL restringidos de HLA-A2, también se incluye dentro del alcance de la presente invención. Un medio para introducir mutaciones tales como una supresión, sustitución, adición, o inserción se conoce bien y, por ejemplo, la técnica de Ulmer (Science, 219: 666, 1983) se puede introducir. Cuando se introduce tal mutación, en vista o prevención de un cambio de las propiedades fundamentales (tales como las propiedades físicas, actividad, o actividad inmunológica) del péptido, se puede llevar cabo la substitución mutua entre, por ejemplo, aminoácidos que tienen propiedades similares (aminoácidos polares, aminoácidos no polares, aminoácidos hidrófobos, aminoácidos hidrófilos, aminoácidos cargados positivamente, aminoácidos aromáticos, y así sucesivamente). Además, se puede realizar alguna modificación sobre estos péptidos hasta tal grado que no exista ningún cambio notable en su función, tal como la modificación del grupo amino o grupo carboxilo constitutivo.

Polinucleótido

Un polinucleótido descrito en la presente invención es un polinucleótido constituido por la secuencia de base de nucleótidos en cualquiera de las de SEQ ID Nº: 54 a SEQ ID Nº: 62 en el listado de secuencias, que son las secuencias de base de nucleótidos de los genes 1 a 7 o gen KM-PA-2 o KM-PA-4 obtenido a partir de línea celular Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas humano o línea celular CFPAC-1 de adenocarcinoma de páncreas humano como se ha descrito anteriormente, o su hebra complementaria. El polinucleótido también puede ser un polinucleótido que codifica cada uno de los péptidos constituidos por la secuencia de aminoácidos descrita en cualquiera de las de la SEQ ID Nº: 1 a SEQ ID Nº: 44 En el listado de secuencias, o su hebra complementaria. Un polinucleótido descrito en la presente invención es además un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos descrita en cualquiera de las de SEQ ID Nº: 45 a SEQ ID Nº: 53 en el listado de secuencias, o su hebra complementaria. Además, el polinucleótido descrito anteriormente puede constar de una secuencia de bases de nucleótidos de al menos 15 o más, preferiblemente 21 a 30 o más nucleótidos, en la que la secuencia de bases de nucleótidos corresponde a una región que codifica un epítope de antígeno de tumores en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos descritos en la presente invención, o su hebra complementaria. La selección de un polinucleótido útil y determinación de su secuencia de bases de nucleótidos son posibles, por ejemplo, empleando los sistemas de expresión de proteínas bien conocidos para confirmar la capacidad de la proteína expresada para inducir y/o activar CTL.

Además, un polinucleótido que se hibrida al polinucleótido descrito anteriormente en condiciones rigurosas se incluye en el alcance de la presente invención. En el caso donde la molécula de polinucleótidos es una molécula de ADN, "una molécula de ADN que se hibrida a una molécula de ADN en condiciones rigurosas" se puede obtener, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)". "Hibridar en condiciones rigurosas" en el presente documento significa que una señal de de hibridación positiva se observa todavía incluso en la condición en la que, por ejemplo, la incubación se lleva a cabo en usa solución que contiene 6 X SSC, 0,5% de SDS, y 50% de formamida a 42ºC y después, se lleva a cabo el lavado en una solución que contiene 0,1 X SSC y 0,5% de SDS a 68ºC.

El polinucleótido descrito anteriormente puede inducir y/o activar los CTL restringidos de HLA-A2, cuando se expresa en las células que tienen HLA- A2. En este caso, el polinucleótido descrito anteriormente tiene una estructura poli (A) en su terminal 3'. El número de poli (A) no tienen una influencia en el sitio que codifica el aminoácido que actúa como un antígeno de tumores, de manera que el número de poli (A), del polinucleótido no esté limitado.

Todos los polinucleótidos descritos anteriormente proporcionan información genética útil para producir un péptido de acuerdo con la presente invención o también se puede utilizar como un reactivo y un patrón de ácido nucleico.

Vector recombinante

Un vector recombinante se puede obtener mediante la inserción del polinucleótido descrito anteriormente en un vector de ADN adecuado. El vector de ADN usado se selecciona apropiadamente de acuerdo con el tipo de huésped y el propósito de uso. El vector de ADN puede ser uno de origen natural que existe y también puede ser uno que carece una parte de una parte de su ADN diferente del necesario para replicación. Por ejemplo, los vectores se pueden ejemplificar como los derivados de un cromosoma, un episoma, y un virus, por ejemplo, los vectores derivados de un plásmido bacteriano, derivados de un bacteriófago, derivado de un transposón, derivado de un epitoma enzimático, derivado de un elemento de inserción, y derivado de un elemento cromosómico de enzima, por ejemplo, los vectores derivados de un virus tal como baculovirus, papovavirus, SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la sífilis de aves, virus de la pseudorrabia, y retrovirus, y los vectores preparados mediante combinación de ellos, por ejemplo, los vectores derivados del elemento genético del plásmido y el bacteriófago, por ejemplo, un cósmido y un fagémido. Además, un vector de expresión y un vector de clonación etc., se puede usar de acuerdo con el propósito deseado.

El vector recombinante, que comprende los elementos constitucionales de la secuencia de ADN deseada y una secuencia de ADN que posee información relativa a la replicación y regulación, tal como un promotor, un sitio de unión a ribosoma, un terminador, una secuencia de señal, un potenciador, y así sucesivamente, se pueden preparar mediante su combinación usando procedimientos bien conocidos. Como un procedimiento para la inserción del polinucleótido de acuerdo con la presente invención en el vector de ADN descrito anteriormente, se pueden emplear procedimientos bien conocidos. Por ejemplo, se puede usar un procedimiento, en el que se elige una enzima de restricción apropiada para tratar un ADN que los escinda a un sitio especifico, y después, el ADN se mezcla con el ADN usado como un vector tratado de la misma manera, seguido de la ligación con una ligasa. Un vector recombinante deseado también se puede obtener mediante ligación de un engarce adecuado al polinucleótido deseado seguido de la inserción de la molécula resultante en un sitio de multiclonación de un vector adecuado para un propósito.

Transformante

El vector de ADN en el que el polinucleótido descrito anteriormente también se insertado se puede usar para obtener un transformante mediante la transformación de un huésped bien conocido tal como Escherichia coli, levadura, Bacillus subtillis, una célula de insecto, o una célula de mamífero inmediatamente mediante procedimientos bien conocidos. En el caso de llevar a cabo la transformación, un sistema más preferible se ejemplifica mediante el procedimiento para integrar el gen en un cromosoma, en vista de lograr la estabilidad del gen. Sin embargo, un sistema de replicación autónoma que usa un plásmido se puede usar de manera conveniente. La introducción del vector de ADN en la célula huésped se puede llevar a cabo mediante procedimientos convencionales tales como los descritos en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (ed. by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NewYork, 1989). Concretamente se puede usar transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, carga por legrado, introducción balística o infección.

Producción de péptido

Usando un vector de expresión tal como un vector de ADN para la transducción del transformante descrito anteriormente, se puede proporcionar un péptido de acuerdo con la presente invención. Un transformante, transformado con un vector de expresión de ADN que comprende el polinucleótido descrito anteriormente, se cultiva en condiciones de cultivo bien conocidas adecuadas para cada huésped. El cultivo se puede llevar a cabo usando indicadores, tales como una función de un péptido de acuerdo con la presente invención se expresa en mediante el transformante, particularmente al menos la actividad para inducir y/o activar CTL, o el péptido o la cantidad del péptido producido en el huésped o fuera del huésped. El subcultivo o el cultivo del lote también se puede llevar a cabo usando una cantidad del transformante en el cultivo como un indicador.

Un péptido de acuerdo con la presente invención se puede producir mediante un procedimiento general conocido en la química de péptidos. Por ejemplo, se ejemplifican "Péptido Synthesis (Maruzen) 1975" y "Péptido Synthesis, Interscience, New York, 1996". Sin embargo, se puede usar cualquier procedimiento ampliamente conocido.

Un péptido de acuerdo con la presente invención se puede purificar y recoger mediante un procedimiento, tal como cromatografía por filtración en gel, una cromatografía de columna de iones, una cromatografía de afinidad, y similares, en combinación, o mediante medios de fraccionamiento en la base de una diferencia de solubilidad usando sulfato de amonio, alcohol, y similares, usando una capacidad de activación de CTL del péptido como un indicador. Más preferiblemente se usa un procedimiento, en el que los péptidos se adsorben de manera específica mediante el uso de anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales, que se preparan contra el polipéptido o los péptidos basándose en la información de las secuencias de aminoácidos.

Anticuerpo

Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención se prepara mediante el uso del péptido descrito anteriormente como antígeno. Un antígeno puede ser el propio péptido descrito anteriormente, o su fragmento que se compone de al menos 5, más preferiblemente al menos 8 a 10 aminoácidos. Con el fin de preparar el anticuerpo específico para el péptido descrito anteriormente. La secuencia de aminoácidos no es necesariamente homóloga con la secuencia de aminoácidos del péptido, pero es preferiblemente un sitio expuesto al exterior de una estructura estéreo del péptido. En tal caso, es suficiente que la secuencia de aminoácidos del sitio expuesto esté consecutiva al sitio expuesto, incluso puede ser discreta en su estructura primaria. El anticuerpo no se limita mientras que se una o reconozca el péptido de manera inmunológica. La presencia o ausencia de la unión o el reconocimiento se puede determinar mediante procedimientos bien conocidos de reacción de unión antígeno - anticuerpo.

Con el fin de producir un anticuerpo, se puede emplear un procedimiento bien conocido para la producción de anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se obtiene mediante la administración del péptido de acuerdo con la presente invención a un animal en presencia o ausencia de de un adyuvante con o sin unión tal como a un vehículo de manera que induzca la inmunidad humoral y/o inmunidad mediada por célula. Se puede usar cualquier vehículo mientras que no sea dañino para el huésped. Por ejemplo, celulosa, un aminoácido polimerizado, albúmina, y similares se ejemplifican, pero no se limitan a ellos. Como animal usado para la inmunización, un ratón, rata, conejo, cabra, caballo, y así sucesivamente, se usa preferiblemente.

Se puede obtener un anticuerpo policlonal a partir de suero de un animal sometido a los medios inmunológicos descritos anteriormente mediante un procedimiento bien conocido para la recogida de anticuerpos. Un medio preferible se ejemplifica en mediante cromatografía inmunológica.

Se puede producir un anticuerpo monoclonal mediante la recogida de de las células que producen anticuerpos (por ejemplo, un linfocito derivado de un nódulo de bazo o linfático) de un animal sometido a los medios inmunológicos descritos anteriormente, seguido de la introducción de un medio de transformación bien conocido con una célula de proliferación permanentemente (por ejemplo, cepa de mieloma tal como células P3/X63 - Ag8). Por ejemplo, las células que producen anticuerpo -se condensan con las células proliferadoras permanentes mediante un procedimiento bien conocido para hibridomas. Después, los hibridomas se someten a clonación, después de seleccionar los que producen el anticuerpo específicamente el polipéptido o péptido descrito anteriormente para recoger el anticuerpo a partir de una solución de cultivo del hibridoma.

El anticuerpo policlonal o el anticuerpo monoclonal así obtenido, que reconoce y se une al péptido descrito anteriormente, se puede utilizar como un anticuerpo para purificación, un reactivo, un marcador de etiquetado y así sucesivamente.

Selección y compuesto obtenido por selección

El péptido descrito anteriormente, el polinucleótido que codifica el mismo y su hebra complementaria, la célula transformada basada en la información concerniente a la secuencia de aminoácidos y secuencia de base de nucleótidos, o el anticuerpo que reconoce de manera inmunológica el mismo proporcionan medios eficaces para seleccionar una sustancia capaz de inducir y/o activar CTL, cuando se usan de manera sola o en combinación entre sí. El procedimiento de selección se puede construir utilizando un sistema de selección bien conocido. Por ejemplo, como se muestran en los ejemplos en el presente documento, usando un sistema en el que la activación de CTL por las células que presentan antígeno que se pulsan con el péptido de antígeno de rumores, se mide en base a la cantidad de la producción de IFN-\gamma a partir de CTL. La adición de una sustancia de ensayo al sistema permite que se seleccione la sustancia que induce y/o activa CTL y la sustancia que potencia la inducción y/o la activación. Este sistema describe un procedimiento de selección, pero el procedimiento de selección de acuerdo con la presente invención no se limita a ello.

Un compuesto obtenido mediante el procedimiento de selección descrito anteriormente es también parte de la presente invención. El compuesto puede ser un compuesto que potencia el reconocimiento del péptido por los CTL mediante una interacción con el péptido de acuerdo con la presente invención, y/o HLA-A2. Además, puede ser un compuesto que potencie la expresión del polipéptido de acuerdo con la presente invención mediante una interacción con el polinucleótido. El compuesto así seleccionado se puede usar en una composición farmacéutica mediante la selección de las que tienen tanto utilidad biológica como baja toxicidad.

Composición farmacéutica

El péptido de acuerdo con la presente invención se puede usar para activar y/o inducir los linfocitos T citotóxicos específicos de tumor restringidos de HLA- A2, como un antígeno de tumores o un péptido de antígeno de tumores. En otras palabras, el procedimiento para inducir CTL, que se caracteriza porque se usa el polipéptido o péptido, y un inductor de CTL que comprende el polipéptido o péptido se incluyen en el alcance de la presente invención.

El péptido de acuerdo con la presente invención, el polinucleótido que codifica el péptido y su hebra complementaria, el vector recombinante preparado basándose en al información de sus secuencias de aminoácidos y secuencias de bases de nucleótidos, la célula transformada con el vector recombinantes, o el anticuerpo que reconoce de manera inmunológica el péptido, el compuesto que potencia el reconocimiento del péptido por CTL mediante la interacción con el péptido, y/o HLA-A2, o el compuesto que potencia la expresión del polinucleótido mediante interacción con el mismo s puede usar una composición farmacéutica que comprende al menos una de sus especies, cuando se usan solos o en combinación entre sí.

Concretamente, por ejemplo, el medicamento constituido por el péptido de acuerdo con la presente invención, y la composición farmacéutica que comprende el péptido de acuerdo con la presente invención se puede usar como una vacuna llamada anticáncer. En tal caso, con el fin de activar la inmunidad mediada por células, el péptido de acuerdo con la presente invención se puede usar en la presencia de o ausencia de un adyuvante con o sin unión tal como un vehículo. Se puede usar cualquier vehículo mientras no sea dañina para el cuerpo humano. Por ejemplo, celulosa, un aminoácido polimerizado, o albúmina se ejemplifica, pero el vehículo no se limita a ellos. Una forma de dosificación se elige apropiadamente entre aquellas para las que se aplican los medios bien conocidos para preparar un polipéptido o un péptido. Su cantidad a administrar depende de un grado de reconocimiento del péptido por CTL, y es generalmente 0,01 mg a 100 mg/día/cuerpo humano de adulto, preferiblemente 0,1 mg a 10 mg/día/cuerpo humano de adulto como una cantidad de sustancia activa. Tal cantidad se administra una vez cada varios días o cada varios meses.

Como alternativa, una acción eficaz de una vacuna anticáncer también se puede obtener mediante la recogida de una fracción de células mononucleares a partir de la sangre periférica de un paciente, y cultivar la fracción con un péptido de acuerdo con la presente invención, seguido de la devolución de la fracción de células mononucleares, donde los CTL se inducen y/o activan, de nuevo en la sangre del paciente. Las condiciones de cultivo, tal como la concentración de células mononucleares y la concentración del polipéptido o el péptido de acuerdo con la presente invención cuando se cultivan, se pueden determinar fácilmente. Además, una sustancia, tal como interleuquina 2
(IL-2) que tiene una capacidad de inducir el crecimiento de linfocitos se puede añadir al cultivo.

En el caso de usar el péptido de acuerdo con la presente invención como una vacuna anticáncer, que usa incluso solamente un péptido es eficaz como una vacuna anticáncer. Sin embargo, tipos plurales del péptido descrito anteriormente se puede usar en combinación. Los CTL del paciente de cáncer en la población de células que reconocen diversos antígenos de tumores, de manera que el uso de tipos plurales de péptidos como una vacuna anticáncer puede dar lugar a a un efecto mayor que usa solamente un tipo.

El medicamento descrito anteriormente, inductor de los linfocitos T citotóxicos, vacuna anticáncer y composición farmacéutica son útiles para el tratamiento de una enfermedad de cáncer tal como un cáncer de páncreas, cáncer de colon, o cáncer de estómago.

Además, el polinucleótido que codifica el péptido de acuerdo con la presente invención y su hebra complementaria son también útiles para la terapia génica de una enfermedad de cáncer tal como cáncer de páncreas, cáncer de colon, o cáncer de estómago.

Un procedimiento en el que estos polinucleótidos están presentes en un vector e introducidos directamente in vivo, y un procedimiento en el que las células recogidas de un donante seguido de la introducción de los polinucleótidos presentes en un vector in vitro, se pueden utilizar ambos. Retrovirus, adenovirus, y virus de vaccinia ejemplifican los vectores, y se prefieren los relacionados con retrovirus. Es innecesario decir, que estos virus muestran deficiencia para la replicación. La cantidad de su administración puede depender del grado de reconocimiento por CTL del péptido codificado por el polinucleótido. En general, ya que un contenido de de ADN que codifica el péptido de antígeno de tumores de acuerdo con la presente invención, la cantidad varía entre los intervalos de 0,1 mg a 100 mg/día/cuerpo humano de adulto, preferiblemente 1 mg a 50 mg/día/cuerpo humano de adulto. Esta cantidad se administra una vez cada varios días o cada varios meses.

Procedimiento de medición para diagnosis y reactivo

El péptido de acuerdo con la presente invención, el polinucleótido que codifica el péptido y su hebra complementaria, y el anticuerpo que reconoce de manera inmunológica el péptido se puede usar de manera independientemente para un marcador de diagnóstico y un reactivo, etc. La presente invención también proporciona un kit de reactivos que comprende uno o más recipientes en los que una o más de sus especies están presentes. Para su preparación, es suficiente usar un medio bien conocido para su preparación de acuerdo con cada péptido, polinucleótido, o anticuerpo.

Medios de diagnóstico para una enfermedad relacionada con con la expresión o actividad del péptido de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando la interacción o reactividad con el polinucleótido que codifica el péptido, mediante la determinación de la cantidad existente de la correspondiente molécula de ácido nucleico, y/o determinación de una distribución del péptido en el cuerpo vivo de un individuo, y/o determinar una presencia del péptido, y la cantidad existente en una muestra derivada del cuerpo del individuo; la medición se lleva a cabo de manera cuantitativa o cualitativa para el péptido de acuerdo con la presente invención o el polinucleótido que codifica el mismo como el marcador de diagnóstico. Como un procedimiento para la medición de manera cuantitativa o cualitativa del péptido o el ácido nucleico que codifica el mismo, que están presentes en la muestra, se puede utilizar un procedimiento bien conocido. El radioinmunoensayo, ensayo de unión competitivo, análisis de transferencia de Western, ELISA, y similares ejemplifican tal procedimiento. Además, la molécula de ácido nucleico se puede detectar y cuantificar a nivel de ARN mediante el uso, por ejemplo, de amplificación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), RT-PCR, protección de ARNasa, procedimiento de transferencia de Northern, y otros procedimientos de hibridación.

La muestra sometida a medición se ejemplifica mediante las células derivadas de un cuerpo humano del individuo presente en por ejemplo, sangre, orina, saliva, fluido raquídeo, biopsia de tejidos, o material de autopsia, y similares. La molécula de ácido nucleico sometida a medición se obtiene a partir de cada muestra descrita anteriormente mediante un procedimiento bien conocido para la preparación de ácido nucleico. Para la molécula de ácido nucleico, se puede usar directamente ADN genómico para detección, o se puede amplificar de manera enzimática mediante el uso de otro cualquier procedimiento de amplificación antes del análisis. Se puede usar de manera similar ARN o ADNc. En comparación con un genotipo normal, una supresión o inserción se puede detectar de acuerdo con un cambio de tamaño de un producto de amplificación. La hibridación del ADN amplificado con el ADN marcado que codifica el polipéptido descrito anteriormente puede identificar mutaciones puntuales.

La detección de de, reducción de, e incremento en el polipéptido de acuerdo con la presente invención y el ADN que codifica el polipéptido mediante el procedimiento de medición descrito anteriormente, le hace posible para diagnosticar enfermedades, a las que está asociado el polipéptido, tales como cáncer de páncreas, cáncer de colon, o cáncer de estómago.

Ejemplos

La presente invención se ilustrará más concretamente con los siguientes ejemplos, pero no se limitan a ellos.

Ejemplo 1 Establecimiento de CTL restringidos de HLA-A2

La línea de linfocitos T citotóxicos específicos de tumores restringidos de HLA-A2 se estableció a partir de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de un paciente de tumor de colon (HLA-A0207/3101, HLA-B46/51, HLA-Cw1) (Int. J. CANCER, 81: 459 - 466, 1999; J. Immunol., 163: 4994 - 5004, 1999). Específicamente, TIL obtenidos a partir de paciente de tumor de colon se cultivaron durante un largo período de hasta 50 días o más mediante la adición de 100 U/ml de interleuquina 2 (IL-2). humana recombinante. Cada 7 días, una porción de TIL activados por
IL-2 se recogió y se cultivó conjuntamente con diversos tipos de células tumorales o células normales para ensayar su actividad de CTL mediante la medición de IFN-\gamma producida por y mediante la medición de ^{51}Cr liberado a partir de células cancerosas (J. Immunol., 163: 4994 - 5004, 1999). IFN-\gamma se midió mediante un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). El día 58 después del comienzo del cultivo, se obtuvo OK-CTLp, que es una de las sublíneas que muestran actividad de CTL específicos de tumor restringidos de HLA-A2. OK-CTLp obtenida es una población de células en la que el 80% de las células tienen un fenotipo de CD3^{+}CD4^{-}CD8^{+} y el 20% de las células tiene un fenotipo de CD34CD4^{+}CDB^{-}. El uso OK-CTLp como una célula efectora y su cultivo conjuntamente con diversos tipos de células que se usan como una célula diana, tal como una célula tumoral, la citotoxicidad para la célula diana y activación de OKCTLp se midieron usando el ensayo de liberación de ^{51}Cr mediante el uso de la producción de IFN-\gamma como indicador, respectivamente. Los resultados se presentan cada uno en las Fig. 1 y Fig. 2.

OK-CTLp obtenida, como se muestra en las Figs. 1 y 2, reconocían célula de adenocarcinoma de páncreas HLA-A0201^{+}Panc-1, célula de adenocarcinoma de colon SW620, célula de carcinoma de células escamosas de esófago HLA-A0206^{+}KE3 (SCC) y célula SCC oral de HLAA0207^{+} CA9-22 para producir IFN-\gamma y representar suficiente citotoxicidad. Sin embargo, no se mostró citotoxicidad contra células tumorales de HLA-A2, tales como célula de adenocarcinoma de pulmón QG56, célula de adenocarcinoma de pulmón RERF-LC-MC, y célula de adenocarcinoma de colon COLO320, y célula B transformada de virus de Epstein-Barr autóloga (EBV-B) y células T de blastoides (PHA) de fitohemaglutinina autólogas ambas derivadas de las células normales. Además, OK-CTLp lisaban todas las células tumorales HLAA2^{+} ensayadas (célula de cáncer de mama R27, célula de carcinoma hepatocelular primario HAK-2, célula de melanoma SK-MEL-5, y célula de astrocitoma SF126, que son HLA-A0201^{+}, y célula de adenocarcinoma de pulmón HLA-A0206^{+} PC9, y célula de adenocarcinoma de pulmón 1-87 y célula SCC cervical OMC-4, que son HLA-A0207^{+}). la actividad de se inhibió mediante un anticuerpo monoclonal (mAb) de clase I anti - HLA, un mAb anti- CD8 o un mAb anti-HLA-A2, pero no se inhibe por otros mAbs (Fig. 2). Este resultado reveló que OK-CTLp reconoce las células tumorales descritas anteriormente de una manera restringida de HLA-A2 y muestra citotoxicidad.

Mientras tanto, se ha descrito el genotipo de los alelos de clase I de HLA de las células tumorales descritas anteriormente (J. Immunol., 163: 4994 - 5004, 1999). El serotipo de la clase I de HLA de los pacientes descritos anteriormente se determinó mediante la aplicación de un procedimiento convencional que usa las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Además, el subtipo HLA-A2 se determinó mediante un procedimiento de sonda de oligonucleótidos específico de secuencia y secuenciación directa de ADN. El fenotipo de OK-CTLp se analizó mediante análisis de inmunofluorescencia directa, usando mAb anti-CD3, mAb anti-CD4, o mAb anti-CD8 (preparados por Nichirei) o mAb anti-TCR\alpha\beta (WT31, Becton Dickinson), que se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Además, los anticuerpos usados para analizar la restricción de HLA-A2 y especificidad de OK-CTLp eran mAb anti- HLA de clase I (W6/32, IgG2a), mAb anti-HLA-A2 (BB7.2, IgG 2b), mAb anti- CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a), mAb anti-HLA de clase II (H-DR-1, IgG2A), y mAb anti- CD4 (Nu-Th/i, IgGl). Anti-CD13 mAb (MCS-2, IgG2a) y Anti-CD14 mAb (JML- H14, IgGl) se usaron como un mAb de control de emparejamiento de isotipo.

Ejemplo 2 Aislamiento e identificación del clon de ADNc que codifica antígeno de tumores

Un gen que codifica el antígeno de tumores de la célula tumoral Panc-1 reconocida por OK-CTLp se aisló e identificó de acuerdo con el procedimiento de de clonación de expresión de genes bien conocido (J. Immunol., 163: 4994 - 5004, 1999). Específicamente, poli (A)+ ARN de las células tumorales Panc-1 se convirtieron en ADNc, y se ligaron con un adaptador SalI de manera que se insertaba en en el vector de expresión pCMV-SPORT-2 (Invitrogen Corp.) los ADNc de HLA-A0207, HLA-A2402, o HLA-A2601 se obtuvieron mediante reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) y se clonaron en el vector de expresión de eucariotas pCR3 (Invitrogen Corp.).

200 ng de la combinación de ADN de plásmido descrito anteriormente o clones de la genoteca de ADNc de células Panc-1 se mezcló con 200 ng del ADNc de HLA-A0207 en 100 \mul de Opti-MEM (Invitrogen Corp.) durante 30 min. 50 \mul de esta mezcla se añadieron a células COS-7 (5 X 10^{3}) y se incubaron durante 6 h en una placa de microcultivo de tipo de fondo en U de 96 pocillos (Nunc Corp.) para la transducción conjunta. Después el medio de cultivo RPMI-1640 que contenía 10% de FCS se añadió y se llevó a cabo el cultivo durante 2 días, seguido de la adición de OK-CTLp (5 X10^{4}) a cada pocillo. Después de un período adicional de 18 h, 100 ml del sobrenadante se recogieron y se midió la producción de IFN-\gamma después mediante ELISA. En este caso, el uso de células COS-7 a las que el gen no se había transfectado como una diana, la producción de IFN-\gamma por OK-CTLp se examinó y el valor de IFN-\gamma producido se sustrajo como un fondo a partir del de cada medida. Como resultado, se obtuvieron siete clones, que potenciaron la producción de IFN- \gamma mediante OK-CTLp mediante el reconocimiento de OK-CTLp.

La secuencia de nucleótidos de los siete clones de ADNc obtenidos se determinaron mediante el procedimiento de secuenciación de didesoxinucleótidos usando un kit de secuenciación de ADN (Perkin Elmer Corp.) y usando un secuenciador ABI PRISM^{TM}377DNA (Perkin Elmer Corp). Además, la secuencia de aminoácidos codificada por cada clon se dedujo de la secuencia de bases de nucleótidos. También, se llevó a cabo una investigación de homología de la secuencia de bases de nucleótidos de estos clones mediante el acceso del GenBank. Los resultados se presentan en la Tabla 1 descrita anteriormente. Con relación al clon 3 entre los siete clones de ADNc (clones 1 a 7) obtenidos, la secuencia del clon inicial, que se obtuvo mediante el procedimiento de clonación de la expresión del gen descrito anteriormente, era de 25 pares de bases más corto en la región 5'-terminal que la de WHSC2 que muestra alta homología, de manera que el ADNc de longitud completa se obtuvo a partir de la genoteca de ADNc de la célula Panc-1 mediante un procedimiento de hibridación de colonia estándar que usa el clon marcado con ^{32}P como una
sonda.

Como se muestra en las Figs. 3 (A) y 3 (B), los clones 1 a 7 se reconocieron cada uno por OK-CTLp para potenciar la producción de IFN-\gamma de OK-CTLp. Sin embargo, OK-CTLp no reconoció las células COS-7 para las que el ADNc de HLA-A0207 y el clon de ADNc usado como control negativo se cotransfectaron, o las células COS-7 para las que uno cualquiera de los clones de ADNc 1 a 7 y el ADNc de HLAA2402 o HLA-A2601 se cotransfectaron, y no mostraron la producción de IFN-\gamma. Cuando se cotransfectaron diversas concentraciones de clones de ADNc 1 a 6 en las células COS-7 conjuntamente con 100 ng de ADNc de HLA-A0207 o ADNc de HLA-A2402, la producción de IFN-\gamma por OK-CTL se observó de una manera dependiente de la dosis ((A) a (F) de Fig. 4).

La expresión del ARNm de estos genes se examinó mediante análisis de transferencia de Northern. Se observó el mismo patrón de expresión excepto para el gen 5. Estos genes se expresan de manera común en las células tumorales y las células normales. Sin embargo, los niveles de expresión en las células tumorales tales como célula Panc-1, célula SW620, y célula CA9-22 eran significativamente mayores que los de en células normales, tales como la célula t estimulada por PHA y una célula B transformada por el virus de Epstein-Barr (EBV-B). La expresión de ARNm del gen 5 se detectó de manera escueta en estas condiciones experimentales. La razón puede ser que la expresión del gen 5 es raro como se prueba por el hecho que la hibridación de la colonia que usa el clon 5 marcado con ^{32}P proporciona solamente 3 clones de una genoteca de ADNc de aproximadamente 1 X 10^{6}.

Ejemplo 3 Estabilización del clon OK-CTL

Ya que los CTL activados mediante reconocimiento del antígeno de tumores es una población de células que reconocen tipos plurales de antígenos tumorales, la OK-CTLp descrita anteriormente se sometió a clonación mediante cultivo de dilución limitante (0,3, 0,5, 1, 2, y 4 células/pocillo) para obtener un clon de OK-CTL (J. Immunol., 163: 4994 - 5004, 1999). Estos clones son los que tienen actividad de CTL seleccionados mediante su cultivo conjuntamente con las células COS-7 en las que 100 ng/pocillo de uno cualquiera de los siete clones de ADNc descritos anteriormente y 100 ng/pocillo de ADNc de HLA- A0207 se cotransfectaron, o con las células tumorales, en una relación de células de 1:1, y midiendo la producción de la producción de IFN-\gamma. Específicamente, trescientos clones de CTL se obtuvieron a partir de la línea precursora de OK-CTLp mediante un cultivo de dilución limitante. Ochenta clones de CTL entre ellos tenían actividad de CTL específicos de tumores restringidos de HLA-A2 y expresaron el fenotipo de CD3^{+} CD4- CD8^{+} y TCR \alpha\beta^{+}. Entre ellos, los clones 2, 3, 1, 3, 2, y 4 CTL mostraron reactividad para las células COS-7 que expresan el clon 1, el clon 2, el clon 3, el clon 4, el clon 5, y el clon 6, respectivamente. En otras palabras, se reveló que el antígeno de tumores reconocido por CTL se diferencia de acuerdo con los clones de CTL. La Tabla 4 muestra los datos de quince clones típicos de CTL. Esto sugiere que OK-CTLp, es decir, CTL derivado del paciente de cáncer, es una población de células que reconocen los tipos plurales de antígenos de tumores.

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TABLA 4

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Ejemplo 4 Preparación de péptido de antígeno de tumores y su actividad inductora de CTL

Con el fin de obtener el antígeno de tumores péptido derivado de los siete genes de antígeno de tumores, que se obtuvieron en el Ejemplo 2 y pueden inducir CTL de una manera restringida de HLA-A2, un péptido que tiene un motivo de unión de HLA-A2 (una secuencia específica) se investigó en la bibliografía (J. Immunol., 152: 163, 1994; Immunogenetics, 41: 178, 1994), y péptidos de 9 mer a 11 mer, que se diferencian entre sí y se adecuan al motivo obtenido, se diseñó y se sintetizó basándose en la secuencia de aminoácidos codificada por los descritos anteriormente 1 a 7 y la secuencia de aminoácidos de UBE2V, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, ppMAPkkk, 2-5 OAS3, y CPSF que tienen alta homología con estos genes. La pureza de los péptidos obtenidos era cada una 70% o más.

La actividad de unión del péptido a la molécula de HLA-A0201 se ensayó usando una cepa mutante de células T2 (Cancer Res., 54: 1071 - 1076, 1994). La célula T2 expresa la molécula HLA-A2 sobre una superficie celular sin unión a un péptido, debido a la deficiencia de de TAP. Específicamente, el péptido sintetizado (10 pM) y las células T2 se incubaron a 26ºC durante 3 h y, posteriormente, se incubaron en 5% de CO_{2} y 95% de aire a 37ºC durante 3 h. De este modo, se obtuvieron las células T2, sobre cuya superficie el péptido se presentó por HLA-A2. Se incubaron las células conjuntamente con mAb anti- HLA-A2 (BB7.2) seguido de la tinción con immunoglobulina (Ig) anti-ratón F(ab')_{2} unida a ficoeritrina R (DAKO Corp.). Después, el patrón de expresión se analizó mediante el empleo de FACScan (Beckman Dickinson Corp.), que dio como resultado la confirmación de que las moléculas HLA-A0201 con el péptido se expresaron en la superficie celular.

Con el fin de ensayar para determinar el reconocimiento de un péptido por CTL, las células T2 pulsadas previamente con cada péptido (10 \muM) como una célula diana (T), y el clon OK-CTLp o OK-CTL clone se usó como una célula efectora (E). La célula diana y la célula efectora se incubaron durante 18 horas, se recogió el sobrenadante, seguido de la medición de IFN-\gamma contenida en el sobrenadante mediante un ELISA. En el caso en el que se usó OK-CTLp como el efector, se estableció una relación de E/T a 10:1. En el caso en que se usó el clon OK-CTL, se estableció a 2:1 para llevar a cabo el ensayo. Por otra parte, en el caso en el que se usó el clon OK-CTL para ensayar la capacidad de activación de CTL del péptido, el clon se usó para que reconociera el producto génico que codifica el péptido que se está examinando. Usando la producción de IFN-\gamma del clon OK-CTLp o OK-CTL contra las células T2, que no se habían pulsado con el péptido, como un fondo, se realizó la sustracción de cada valor de medición. Los resultados se muestran en las Figs. 5 a 10. Las Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7, Fig. 8, Fig. 9, y Fig. 10 cada una muestra el resultado de del péptido derivado del gen 1 y UBE2V, gen 2 y HNRPL, gene3 y WHSC2, gen 4 y EIF4EBP1, y gen 5 y ppMAPkkk, y gen 6 y 2-5 OAS3.

Además, las diversas concentraciones de cada péptido se usaron para la incubación conjunta con las células T2 para examinar la capacidad de activación del clon de CTL, dando como resultado el hallazgo de que el clon CTL puede estar activado por cada péptido de una manera dependiente de la dosis. Los ejemplos representativos de los péptidos derivados del gen 1 y UBE2V, gen 2 y HNRPL, gen 3 y WHSC2, gen 4 y EIF4EBP1, gen 5 y ppMAPkkk, y gen 6 y 2-5 OAS3 se presentaron en (A), (B), (C), (D), (E) y (F) de la Fig. 11, respectivamente. Por otra parte, la Tabla 5 muestra los péptidos derivados del gen 7 y CPSF. En la Tabla 5, el péptido derivado de EBV y el péptido derivado del virus de la gripe son controles positivos, que pueden activar CTL.

Como resultado de estos experimentos, se reveló que los péptidos mostrados en la tabla 2 descritos anteriormente activan el clon OK-CTLp y/o OK-CTL para producir IFN-\gamma.

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TABLA 5

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Ejemplo 5 Inducción de CTL a partir de células mononucleares de sangre periférica derivadas de paciente de cáncer por un péptido

Entre los péptidos que eran capaces de potenciar la producción de IFN- \gamma a partir del clon de OK-CTLp o OK-CTL en el Ejemplo 4, los de P1 a P19 se examinaron por su capacidad de inducir CTL a partir de células mononucleares de sangre periférica derivadas de un paciente de cáncer. El procedimiento para inducir CTL por un péptido era de acuerdo con el procedimiento bien conocido (J. Exp. Med., 187: 277 - 288, 1998; Cancer Res., 59: 4056 - 4063, 1999). Específicamente, células mononucleares de sangre periférica autólogas (PBMC) derivadas de un paciente de cáncer, a partir de las que se obtuvo OK- CTLp, se incubaron conjuntamente con el péptido (10 \muM). Se volvieron a estimular las células el día 10 y 14 después del comienzo del cultivo, usando PBMC antólogas como una célula que presenta antígeno (APC) que se pulsaron con 10 \muM del mismo péptido durante 2 h y se expuso a irradiación (30 gray). El día 21 después del comienzo del cultivo, las células se recogieron para ensayar el fenotipo de superficie. Además, se examinaron las células para el reconocimiento de diversas células diana, usando la producción de IFN-\gamma medida por ELISA cuando se cultivaron conjuntamente con las células diana como un indicador. Como células diana se usaron, célula SW620, célula CA9- 22, y célula Panc-1, que son las células tumorales HLA-A2+. El resultado se mostró en la Tabla 6.

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TABLA 6

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Las PBMC estimuladas in vitro usando P1, P3, P5, P6, P8, P9, P10, P11, P13, P14, P15, P17, o P18 entre los 19 péptidos reconocían las células SW620, células CA9-22 y células Panc-1, que son las células tumorales HLA- A2^{+}, producían IFN-\gamma en una cantidad significativa. Sin embargo, las PBMC apenas reconocían la célula tumoral HLA-A2^{-}. Por otra parte, P2, P4, P7, P12, y P16 también inducían CTL que reconocían una cualquiera de las células tumorales HLA-A2^{+}. PBMC estimuladas por P19 reconocían no solamente las células tumorales que expresan HLA-A2,
pero también las células tumorales que expresan otros tipos de HLA. La producción de IFN-\gamma a partir de estos CTL se inhibió mediante mAb de clase I anti-HLA, mAb anti-CD8, o mAb anti-HLA-A2, y no se inhibían por otros mAbs. Además, cuando las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon a partir de sangre de dos pacientes HLA-A0201^{+} (un paciente de cáncer de colon y un paciente de cáncer de páncreas) para examinar la inducción de CTL por los péptidos, se obtuvo el mismo resultado que antes. En otras palabras, se encontró que los péptidos descritos anteriormente pueden inducir CTL restringidos de HLA-A2 a partir de las células mononucleares de sangre periférica del paciente.

La afinidad de unión de los péptidos a la molécula de HLA-A0201 se expresó como yna intensidad de fluorescencia media relativa (MFI) de la molécula de HLA-A2. El MFI de controles positivos y negativos eran 898 y 490, respectivamente. Se puede suponer que la afinidad de unión de un péptido a la molécula HLA-A0201 no tiene correlación con la inducción de CTL por el péptido.

Además, la capacidad de activar CTL de estos 19 péptidos se examinó directamente en un ensayo de liberación de ^{51}Cr que usa toxicidad a las células diana como un indicador. Específicamente, las PBMC descritas anteriormente, en las que se indujo CTL, se volvió a cultivar adicionalmente para proliferar en la presencia de APC antólogas, IL-2, y un péptido correspondiente. Aproximadamente el día 21 a 28 después del comienzo del cultivo de nuevo, PBMC se recogió y se ensayó su toxicidad de nuevo midiendo IFN-\gamma y mediante un ensayo de liberación de ^{51}Cr 6-h. Los resultados se mostraron en las figuras Figs. 12 a 17. PBMC del paciente de cáncer, que se estimuló mediante estos péptidos, lisaban las células tumorales HLA-A2^{+}. Sin embargo, las células EBV-B autólogas y las células T estimuladas por PHA, ambas se derivaban de células normales que expresaban HLA-A2, y la célula tumoral RERF-LC-MS de HLA-A2, no se lisaron. Sin embargo, PBMC estimuladas por péptidos P14, P15, y P17 también mostraron citotoxicidad por las células EBV-B autólogas. Además, PBMC estimuladas por P19 mostraron alta toxicidad para las células EBV-B autólogas. Además, PBMC estimuladas por estos péptidos mostraron citotoxicidad par alas células T2, que se pulsaron con el mismo péptido que el usado para estimulación de PBMC, de una manera dependiente de la dosis. Los ejemplos típicos se muestran en (A) a (E) de la Fig. 18. A partir de esto descrito anteriormente, se encontró que los péptidos descritos anteriormente pueden inducir CTL, que muestra citotoxicidad de HLA-A2, a partir de las células mononucleares de sangre periférica del paciente de cáncer.

Ejemplo 6 Inducción de CTL a partir de célula mononuclear de sangre periférica del paciente por péptido

Para los seis péptidos (P21, P22, P24, P26, P30, y P32) con una pureza de 95% o mayor entre los péptidos de P20 a P32 derivados del gen 7 y CPSF entre el péptido de antígeno de tumores obtenido en el Ejemplo 4, la actividad de inducir CTL in vitro a partir de las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se examinó usando la producción de IFN-\gamma como un indicador. PBMC usadas preparadas a partir de cada sangre periférica de dieciséis pacientes de cáncer HLA-A2 positivo (4 pacientes con cáncer de páncreas, siete pacientes con cáncer de estómago, y 5 pacientes con cáncer de colon) y seis individuos sanos. Específicamente, 1X10^{5} de PBMC se añadió a cada pocillo de de placa de microcultivo de tipo de fondo en U de 96 pocillos (Nunc Corp.) y se incubaron conjuntamente con 10 \muM de cada uno de los péptidos descritos anteriormente en 200 \mul de medio de cultivo. El medio de cultivo constaba de 45% de RPMI-1640, 45% de AIM-V (Invitrogen Corp.), 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100U/ml de interleuquina-2 humana, y 0,1 \muM MEM de solución de aminoácidos no esenciales (Invitrogen Corp.). El día 4 y día 7 después del comienzo del cultivo, se retiró la mitad del medio de cultivo y se reemplazó con la composición descrita anteriormente que comprende cada péptido correspondiente. El día 10 después del comienzo del cultivo, se recogieron las células y se lavaron, seguido de la reacción con las células T2, que se pulsaron con cada péptido correspondiente, para medir la cantidad de IFN-\gamma producida.

Mientras tanto, las células cultivadas anteriormente durante 10 días después de la estimulación por el péptido se cultivaron durante 10 días adicionales. La citotoxicidad de las células obtenidas contra la célula de adenocarcinoma de páncreas Panc-1 (HLA-A2) se midió mediante el ensayo de liberación de ^{51}Cr- de 6 h en una relación E/T de 10:1. Los resultados obtenidos se presentan como % de lisis específica (tabla 7). Conjuntamente con esta etapa, la citotoxicidad contra la célula tumoral SSTW-9 como la célula tumoral HLA-A2 - se midió para usar como un fondo que se sustrajo del resultado descrito anteriormente.

Como resultado, la inducción de CTL restringidos de HLA-A2 a partir de PBMC por P21, P22, P23, P26, P30, y P32, que era específico para cada péptido, se observó en pacientes de 31% (5/16), 38% (6/16), 25% (4/6), 31% (5/16), 44% (7/16), y 7% (1/16) de los dieciséis pacientes descritos anteriormente, respectivamente. Por otra parte, la inducción de CTL by P21 y P22 a partir de las PBMC de individuos sanos se encontró en 50% (3/6) y 33% (2/6), respectivamente. Sin embargo, los otros péptidos no inducían CTL a partir de las PBMC de individuos sanos (Tabla 7). Los CTL descritos anteriormente inducidos a partir de PBMC de los pacientes de cáncer mediante el uso del péptido mostraron citotoxicidad contra la célula de adenocarcinoma de páncreas Panc-1, y también la célula de adenocarcinoma de colon SW620 (HLA-A2/A24) y célula de adenocarcinoma de estómago KWS (HLA-A2), ambas son las células tumorales HLA-A2^{+}. Sin embargo, la lisis no se observó en al célula de adenocarcinoma de estómago SSTW9 (HLA-A24), que es la célula tumoral de HLA-A2, o las células T blastoides de PHA - o las células B transformadas de EBV-B, ambas expresan HLA-A2 y no son las células tumorales. El reconocimiento de la célula tumoral por los CTL descritos anteriormente se inhibían por mAb de clase I anti-HLA, mAb anti-CD8, o mAb anti-HLA -A2, y no de inhibían por otros mAb.

TABLA 7

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Ejemplo 7 Aislamiento e identificación de ADNc que codifica antígeno de tumores

A partir de los genes que codifican los antígenos de tumores (Biochim. Biophys. Res. Commun., 281: 936 - 944, 2001), que se detectaron por el procedimiento SEREX (análisis sexológico de Genotecas de Expresión de ADNc Recombinante) (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92: 11910 - 11813, 1995) y ya reseñado, dos genes de antígeno de tumores, KM-PA-2 y KM-PA-4, que pueden activar CTL restringidos de HLA-A2, se encontraron mediante el uso del mismo procedimiento que el del Ejemplo 2. Específicamente, los clones de ADNc que codifica cada uno KM-PA-2, KM-PA-4, KM-PA-5, KM-PA-14, KM-PA- 15, o KM-PA-18 se empaquetaron en el vector pBluescript, y se digirieron mediante EcoRI y XhoI para insertar en pCMV-SPORT2. Estos ADNcs en diversas concentraciones se expresaron cada uno en las células COS-7 conjuntamente con HLA-A0207 o HLA-A2402. El uso de las células de COS-7 como una célula diana, se realizó la incubación conjuntamente con OK-CTLp. Como resultado, las células de COS-7, a las que se cotransfectaron KM-PA-2 o KM-PA-4 con HLA-A0207, inducía la producción de IFN-y a partir de OK-CTLp, de una manera dependiente de la dosis del gen ((A) y (B) de Fig. 19). El procedimiento SEREX es un procedimiento para la detección del antígeno de tumores. Sin embargo, entre 1500 o más tipos de antígenos de tumores detectados mediante este procedimiento, los identificados como antígenos de tumores capaces inducir tanto la inmunidad mediada por células como inmunidad humoral son solamente MAGE-1, tirosinasa, y NY-ESO-1. Por lo tanto, incluso un gen identificado mediante el procedimiento SEREX por codificar el antígeno de tumores no puede siempre activar CTL. Se encontró primero que los genes de antígeno de tumores destritos anteriormente, KM-PA- 2 y KM-PA-4, pueden activar CTL de una manera restringida de HLA-A2.

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Ejemplo 8 Preparación de antígeno de tumores y actividad para inducir CTL a partir de PBMC de paciente de cáncer

Con el fin de obtener el péptido de antígeno de tumores derivado de los genes de antígeno de tumores, KM-PA-2 y KM-PA-4, que se obtiene a partir del Ejemplo 7, diferentes péptidos de 9 mer o 10 mer se diseñaron basándose en la secuencia de aminoácidos codificada por KM-PA-2 y KM-PA-4 y se sintetizaron mediante un procedimiento bien conocido de la misma manera que en el Ejemplo 4.

La capacidad del péptido sintetizado de inducir para inducir CTL a partir de las células mononucleares de sangre periférica del paciente de cáncer de colon, a partir del cual se obtuvo OK-CTLp, se examinó de la misma manera que en el Ejemplo 6. Como resultado, como se muestra en (A) y (B) de la Fig. 20, PBMC que se estimularon in vitro usando uno cualquiera de los péptidos P33 a P41 (SEQ ID Nº:33 a SEQ ID Nº:41) derivados de KM-PA-2 y péptidos P42 a P44 (SEQ ID Nº:42 to SEQ ID Nº:44) derivados de KM-PA-4, producían IFN-\gamma mediante el reconocimiento de las células T2 (la parte izquierda de la figura (A) y (B) de Fig. 20), que se pulsaron con el péptido que corresponde al usado para la estimulación de las PBMC, y la célula Panc-1 (parte derecha de la figura de (A) y (B) de la Fig. 20), que es la célula tumoral HLA-A2^{+}. Sin embargo, las PBMC apenas reaccionaron a la célula tumoral de HLA-A2. Como resultado, it se reveló que uno cualquiera de los doce péptidos descritos anteriormente puede inducir los CTL específicos de antígeno de PBMC del paciente de cáncer de una manera restringida de HLA-A2 y que los CTL inducidos pueden reconocer los péptidos descritos anteriormente para producir IFN-\gamma de una manera restringida de HLA-A2. Además, la citotoxicidad de estos CTL inducidos por los péptidos se confirmó directamente mediante el ensayo de liberación de ^{51}Cr de la misma manera que en el Ejemplo 6. La Fig. 21 muestra un ejemplo representativo del resultado. Como se muestra en la Fig. 21, los CTL inducidos a partir de PBMC del paciente de cáncer mediante P35, P39, o P40 lisaron las células de Panc-1 y las células YPK-3, que son células tumorales HLA-A2^{+}. Sin embargo, la célula tumoral PaCa-2 de HLA-A2^{-}, la línea celular OKAB2 de EBV-B, y las células T estimuladas por PHA, no se lisaron. En otras palabras, se reveló que los péptidos descritos anteriormente pueden inducir CTL que muestra citotoxicidad a partir de las células mononucleares de sangre periférica del paciente de cáncer de una manera restringida de HLA-A2. Además, CTL también se indujo mediante los péptidos descritos anteriormente a partir de PBMC obtenidas a partir del paciente de cáncer, tal como un paciente de cáncer de páncreas, además al paciente de cáncer de colon a partir del cual se obtuvo OK-CTLp.

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Ejemplo 9

Con el fin de determinar el fenotipo de TCR expresado en la superficie celular del clon de CTL que reconoce el péptido descrito anteriormente, se obtuvo ARN total a partir de cada uno de los clones 5 X 10^{6} de CTL, que se obtuvieron en el ejemplo 3, usando RNAzol^{TM}B (TEL-TEST Corp). Se preparó ADNc usando el sistema. SuperScript^{TM} Preamplification (Invitrogen Corp.) para la síntesis de la primera hebra de ADNc. El ADNc de una sola cadena se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando uno de uno de los 22 cebadores diferentes V\beta (V\beta1 a 20) y cebadores 3'C \beta. La PCR se realizó durante 35 ciclos, en la que 1 ciclo comprendía la desnaturalización a 94ºC durante 1 min, hibridación a 58ºC durante 2 min, y extensión a 72ºC durante 3 min. El producto de la PCR se insertó en el plásmido pCR2 seguido de la transformación en Escherichia coli usando el sistema de clonación de TA (Invitrogen Corp.), selección de colonias, y preparación de plásmido para la determinación de la secuencia
de ADNc.

Como resultado, cada dos clones de CTL que reaccionan con el péptido derivado de UBE2V y gen 1, el péptido derivado de HNRPL y el gen 2, y el péptido derivado de 2-5 OAS3 y el gen 6, expresaban TCR-V\beta 8.1, TCRV\beta 3.2, y TCR-V\beta 14, respectivamente. Además, los clones de CTL que reconocen el péptido derivado de WHSC2 y el gen 3, el péptido derivado de EIF4EBP1 y el gen 4, el péptido derivado de ppMAPkkk y el gen 5, expresaban TCRV\beta 13.1, TCR-V\beta 8.1, y TCR-V\beta 18, respectivamente (Tabla 8-1 y tabla 8-2).

Cada dos clones de CTL que reconocían el péptido derivado de UBE2V y el gen 1, el péptido derivado de HNRPL y el gen 2, y el péptido derivado de 2-5 OAS3 y gen 6, expresaban TCR que poseen diferentes regiones 3 determinantes de complementariedad (CDR3) (un elemento responsable de la unión a los epítopes antigénicos en el surco de las moléculas de clase I de HLA), respectivamente. Los clones de CTL que reconocían el péptido derivado de WHSC2 y el gen 3, el péptido derivado de EIF4EBP1 y el gen 4, el péptido derivado de ppMAPkkk y el gen 5, expresaban TCR que poseen diferentes CDR3, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de cada CDR3 es la que se muestra con un subrayado en la Tabla 8-2.

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TABLA 8-1

14

TABLA 8-2

15

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, se pueden inducir los linfocitos T citotóxicos restringidos de HLA-A2, que hacen posible lograr una inmunoterapia específica para cáncer de páncreas, cáncer de colon, y cáncer de estómago. Los alelos de HLA-A2 se encuentran en el 23% de negros africanos, 53% de chinos, 40% de japoneses, 49% de caucasianos del norte, y 38% de los caucasianos del sur. Por consiguiente, la presente invención puede prometer su gran contribución a la terapia de cáncer. Además la presente invención contribuye en gran medida a la investigación fundamental sobre la molécula relacionada para el reconocimiento por las células T de una célula de cáncer de páncreas, una célula de cáncer de colon, cáncer de estómago, y así sucesivamente.

<110> ITOH, Kyogo

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<120> Antígeno de tumores

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<130> GP01-1024

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<140>

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<141>

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<150> JP P2000-231814

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<151> 2000-07-31

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<160> 62

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido diseñado que tiene una capacidad de activar linfocitos T citotóxicos restringidos de HLA-A2

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<400> 1

17

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<210> 2

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 2

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<210> 3

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 3

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<210> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 4

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<210> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 5

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<210> 6

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<212> PRT

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<220>

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<400> 6

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<210> 7

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 7

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<210> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 8

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<210> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 9

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<210> 10

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<400> 10

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<210> 11

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 9

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<213> Secuencia artificial

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 14

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<210> 15

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<213> Secuencia artificial

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<400> 15

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<210> 16

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<400> 16

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<210> 17

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<400> 17

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<210> 18

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<400> 18

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<400> 20

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<400> 21

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<400> 31

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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48

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<210> 33

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

49

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<210> 34

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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\newpage

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50

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<210> 35

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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51

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<210> 36

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 36

52

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<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 37

53

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<210> 38

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 38

54

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<210> 39

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 39

55

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<210> 40

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 40

56

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<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 41

57

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<210> 42

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

58

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<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

59

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<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 44

60

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<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 589

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 46

63

64

65

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<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 549

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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67

68

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<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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69

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

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<211> 779

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

72

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1087

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

74

75

76

77

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 634

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

81

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1775

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1775)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2097

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2097)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2243

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2243)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 831

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (831)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6707

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6707)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

92

93

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 769

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (769)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2039

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2039)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1822

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1822)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

97

\newpage

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> ITOH, Kyogo

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Antígeno de tumores

\vskip0.400000\baselineskip

<130> GP01-1024

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP P2000-231814

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-07-31

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

109

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<210> 13

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<220>

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<220>

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<212> PRT

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<212> PRT

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<220>

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136

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<212> PRT

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<220>

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137

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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138

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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139

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip1.000000\baselineskip

142

143

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 589

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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144

145

146

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 549

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

147

148

149

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<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 779

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

151

152

153

154

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1087

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

155

156

157

158

159

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

160

161

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 634

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

162

163

164

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1775

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1775)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2097

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2097)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

168

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2243

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2243)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

169

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 831

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (831)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

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<211> 2404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

171

172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

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<211> 6707

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> sitio de poli A

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<222> (6707)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

173

174

175

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<210> 60

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<211> 769

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

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<222> (769)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

176

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<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2039

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio de poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2039)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

177

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<210> 62

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<211> 1822

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> sitio de poli A

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<222> (1822)

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<400> 62

178

Claims

1. Un péptido constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido de SEQ ID Nº: 1 a SEQ ID Nº: 44.

2. Una composición farmacéutica, que comprende el péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, que se selecciona entre un medicamento, una vacuna anticáncer, y un agente para inducir la proliferación, diferenciación y/o activación de linfocitos T citotóxicos.

4. La vacuna anticáncer de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha vacuna anticáncer es una vacuna anticáncer para el tratamiento de cáncer de páncreas, cáncer de colon, o cáncer de estómago.

5. Un procedimiento in-vitro para inducir la proliferación, diferenciación y/o activación de linfocitos T citotóxicos, que comprende el uso del péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha activación está de una manera restringida de HLA-A2.

7. A polinucleótido que codifica el péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o su hebra complementaria.

8. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido o su hebra complementaria de acuerdo con la reivindicación 7.

9. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el vector recombinante es un vector de expresión recombinante.

10. Una célula huésped, transformada con el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9, en la que la célula huésped expresa el polinucleótido comprendido en dicho vector, con la condición de que las células de las líneas germinales humanas y células de tronco embrionario germinal humanas están excluidas.

11. Un procedimiento para producir el péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10.

12. un anticuerpo obtenible a partir de un suero de un animal inmunizado con el péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo específicamente reconoce un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

13. Un procedimiento para seleccionar un compuesto que potencia el reconocimiento de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 mediante linfocitos T citotóxicos restringidos de HLA-A2, mediante interacción con dicho péptido y/o HLA-A2, en el que dicho procedimiento comprende

- poner en contacto dicho compuesto con al menos uno seleccionado entre el grupo constituido por el péptido de acuerdo con la reivindicación 1, el polinucleótido o su hebra complementaria de acuerdo con la reivindicación 7, el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9, la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, y

- medir un cambio en el reconocimiento de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 mediante linfocitos T citotóxicos restringidos de HLA-A2.

14. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en medicina.

15. El polinucleótido o su hebra complementaria de acuerdo con la reivindicación 7 para uso en medicina.

16. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 para uso en medicina.

17. la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 para uso en medicina.

18. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 para uso en medicina.

19. Uso del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 para la fabricación de un medicamento para tratar cáncer, en el que dicho cáncer se selecciona entre cáncer de páncreas, cáncer de colon, o cáncer de estómago.

20. Uso del polinucleótido o su hebra complementaria de acuerdo con la reivindicación 7 para la fabricación de un medicamento para tratar cáncer, en el que dicho cáncer se selecciona entre cáncer de páncreas, cáncer de colon, o cáncer de estómago.

21. Uso del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 para la fabricación de un medicamento para tratar cáncer, en el que dicho cáncer se selecciona entre cáncer de páncreas, cáncer de colon, o cáncer de estómago.

22. Un procedimiento in-vitro de diagnosis, que comprende la medición de manera cuantitativa o cualitativa del péptido de acuerdo con la reivindicación 1, o el polinucleótido o su hebra complementaria de acuerdo con la reivindicación 7 en un espécimen obtenido a partir de un sujeto que se va a diagnosticar.

23. Un kit de reactivos, que comprende al menos un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por el péptido de acuerdo con la reivindicación 1, el polinucleótido o su hebra complementaria de acuerdo con la reivindicación 7, y el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12.