JP2002538074A

JP2002538074A - Ｎｙ−ｅｓｏ−１のアミノ酸配列に対応し、かつｍｈｃクラスｉ分子及びｍｈｃクラスｉｉ分子に結合する単離ペプチドおよびその利用方法

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Publication number: JP2002538074A
Application number: JP2000544341A
Authority: JP
Inventors: ストッカート，エリザベス; イェーガー，エルケ; チェン，ヤオ‐ツェン; スキャンラン，マシュー; アレクサンダー，クヌート; オールド，ロイド，ジェイ; グア，アリ; リッター，ゲルト; ドレイフホウト，ヤン
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2002-11-12
Anticipated expiration: 2019-03-24
Also published as: US7115729B2; CN1303300A; EP1071443A1; EP1071443A4; AU3370699A; DE69931482D1; US20040158044A1; KR20010074487A; WO1999053938A1; DE69931482T2; CA2325605C; JP3995884B2; AU754961B2; KR100483480B1; EP1071443B1; ATE326981T1; CA2325605A1; CN100378121C; US6723832B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドに関する。これらのペプチドは、様々な治療及び診断の状況下に於いて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本出願は、１９９６年１０月３日に出願され、現在では米国特許第号である出願番号第０８／７２５，１８２号の一部継続出願である、
１９９７年９月１５日出願の出願番号第０８／９３７，２６３号の一部継続出願
である、１９９８年４月１７日出願の出願番号第０９／０６２，４２２号の一部
継続出願である。これら出願の全てが本明細書において参考文献として援用され
る。

【０００２】発明の分野本発明は、癌に関連する抗原に由来するＨＬＡ結合ペプチドに関する。これら
のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。

【０００３】背景及び従来技術感染症、癌、自己免疫疾患等の多くの病理的状態が、或る種の分子の不適切な
発現によって特徴付けられることが明確に確立されている。従って、これらの分
子は、特定の病理状態又は異常状態についての「マーカー」として機能する。診
断用「標的」即ち、これらの異常状態を診断するために同定されるべき物質とし
てのそれらを利用する以外に、これらの分子は、診断および／又は治療薬を作り
出すために使用可能な試薬として作用する。これの非限定的な一具体例は、特定
のマーカーに対して特異的な抗体を産生するための癌マーカーの使用である。さ
らに別の非限定的な具体例は、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞を産生するた
めのＭＨＣ分子と複合化するペプチドの使用である。

【０００４】当然ながら、このような物質の調製には、これらを産生するために使用される
試薬供給源が予め要求される。細胞からの精製は、それを実施する確実な方法か
ら程遠い１つの面倒な方法である。別の好適な方法は、特定のマーカーをコード
する核酸分子の単離であり、次いで、この単離されたコードされた分子を使用し
て所望の分子を発現させる。

【０００５】今日まで、たとえばヒトの腫瘍においてこのような抗原を検出するために二つ
のストラテジーが使用されてきた。これらは、それぞれ遺伝学的アプローチおよ
び生化学的アプローチと称される。遺伝学的アプローチは、たとえば、本明細書
において参考文献として援用されるデ・プレーン（ｄｅＰｌａｅｎ）等，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７５（１９８８）によって例示される
。このアプローチでは、腫瘍から得られたｃＤＮＡライブラリーの数百プールの
プラスミドを、ＣＯＳ細胞等のレシピエント細胞に、又は、その特定の抗原の発
現についてテストされた腫瘍細胞系の抗原陰性改変体にトランスフェクトする。
たとえば、本明細書において参考文献として援用されるオー・マンデルボイム（
Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ）等，Ｎａｔｕｒｅ３６９：６９（１９９４）によ
って例示される前記生化学的アプローチは、腫瘍細胞のＭＨＣ−クラスＩ分子に
結合したペプチドの酸溶出に次ぐ逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に
基づくものである。抗原性ペプチドは、抗原提示が損なわれた変異細胞系の未提
示（ｅｍｐｔｙ）ＭＨＣ−クラスＩ分子にそれらが結合した後に同定され、次い
で細胞傷害性Ｔ−リンパ球との特異的な反応を誘発する。これらの反応には、Ｍ
ＴＴアッセイ、又は⁵¹Ｃｒ放出アッセイによって測定可能である、ＣＴＬ増殖の
誘発、ＴＮＦ放出、及び標的細胞の溶解が含まれる。

【０００６】抗原の分子的規定に対するこれら二つのアプローチには以下の欠点がある：第
一に、それらは極めて面倒で、時間を費やし、コスト高であり、そして；第二に
、それらは事前に規定された特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞系（ＣＴＬｓ）の
樹立に依存する。

【０００７】抗原の同定及び分子的規定に対してのこれら二つの公知のアプローチに固有の
問題点は、これらの方法は、共に、ヒトの腫瘍におけるごく小数の新規な抗原を
規定することにしか成功していないという事実によって最も顕著に示される。た
とえば、ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｅｎ）等，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）；ブリチャード（Ｂｒｉ
ｃｈａｒｄ）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５（１９９３）；
クーリ（Ｃｏｕｌｉｅ）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−４２（１９９
４）；カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ９１：３１１５−３５１９（１９９４）を参照のこと。

【０００８】更に、記載された方法論は、考慮下にあるタイプの癌の、樹立されて恒久的な
細胞系が入手可能であることに依存している。たとえば、エットゲン（Ｏｅｔｔ
ｇｅｎ）等，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１
０：６０７−６３７（１９９０）によって示されているように、特定の癌からの
細胞系の樹立は極めて困難である。また、いくつかの上皮細胞タイプの癌は、イ
ンビトロにおいてＣＴＬに対してたいした影響を受けず、慣習的な分析が不可能
であることが周知である。これらの問題が、関連抗原を同定するための別の方法
を開発することを当該分野に促してきた。

【０００９】一つの重要な方法が、本明細書において参考文献として援用されるサヒン（Ｓ
ａｈｉｎ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１８１
０−１１９１３（１９９５）により記載されている。更に、米国特許第５，６９
８，３９６号及び１９９６年１月３日に出願された出願番号第０８／４７９，３
２８号もまた参照のこと。これら三つの文献すべてが本明細書において参考文献
として援用される。要約すると、この方法は、原核生物ホスト中に於いてｃＤＮ
Ａライブラリーを発現させるものである（これらのライブラリーは、腫瘍サンプ
ルから得られる）。次に、高力価の体液応答を惹起する抗原を同定するべく、発
現したライブラリーを、吸収され、そして希釈された血清によって免疫スクリー
ニングする。この方法論は、ＳＥＲＥＸ法（組換え発現クローニングによる抗原
の血清学的同定）として既知である。この方法論は、過去に同定された腫瘍関連
抗原の発現を確認するため、及び、新規な抗原を検出するために使用されてきた
。上述で参照される特許出願およびサヒン（Ｓａｈｉｎ）等，ならびに、クルー
（Ｃｒｅｗ）等，ＥＭＢＯＪ１４４：２３３３−２３４０（１９９５）（前出
）を参照のこと。

【００１０】このＳＥＲＥＸ方法論は食道癌サンプルに適用されており、抗原が今回同定さ
れ、そのコード化核酸分子が単離され、そしてクローニングされた。これは複数
の特許出願における課題であり、これらの一部は本明細書において参考文献とし
て援用される。その抗原および分離体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄｆｏｒｍｓ）は、
癌患者の血清中における抗体に対して反応することが見出された。又、この分子
由来のペプチドがＨＭＣ分子と結合し、細胞溶解性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞
両方との応答を誘発することも見出された。本発明のこれらの特徴は、以下の開
示において見られる。

【００１１】好適実施例の詳細な説明例１全ＲＮＡを、周知の方法を使用して、ウェルのスナップ凍結標本の食道の分化
したａｑｕａｍｏｓ細胞癌から浸解させて抽出した。そのような方法の一例とし
ては、たとえば、チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ），Ｊ．Ａｎａｌｙ
ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）を参照のこと。この
ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを次に、製造業者の指
示に従って、λＺＡＰファージベクター中にトランスフェクトさせた。このλＺ
ＡＰライブラリーを、次に、Ｅ．ｃｏｌｉにトランスフェクトさせて、１．６ｘ
１０⁶の一次単離株を得た。

【００１２】次に、本明細書において参考文献として援用されるサヒン（Ｓａｈｉｎ）等，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１８１０−１１８１３
（１９９５）のＳＥＲＥＸ方法論を使用した。要約すると、自己血清を、食道癌
細胞由来のｃＤＮＡクローンを含まないλＺＡＰファージをトランスフェクトさ
せたＥ．Ｃｏｌｉ溶解物とこの血清を組み合わせることにより、自己血清からＥ
．Ｃｏｌｉについて内因性である分子に対する抗体を除去した。

【００１３】次いで、この除去済み血清を希釈し、そしてファージプラークを含有するニト
ロセルロース膜と混合させた。前記プラークを、室温で一晩インキュベートした
。次に洗浄し、フィルターをアルカリフォスファターゼと共役させた結合ヤギ抗
ヒトＦＣλ二次抗体とインキュベートさせて、次いで反応性ファージプラークを
、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスファターゼおよびニトロブル
ーテトラゾリウムとインキュベーションすることにより可視化させた。全部で１
３の陽性クローンを見出した。

【００１４】例２同定後、前記反応性クローンを、希釈クローニングを介してモノクローナルに
サブクローン化させ、次いでヒト血清を使用してテストした。これらのクローン
を、次いで精製し、インビトロで切除し、次いで製造業者の指示を使用して、ｐ
ＢＫ−ＣＭＶプラスミドに変換させた。次に、インサートされたＤＮＡを、Ｅｃ
ｏＲＩ−ＸｂａＩ制限マッピングを使用して異なるインサートを判定するために
評価した。約５００〜約１．３キロベース対のサイズの範囲の８つの異なるイン
サートを同定した。これらのクローンを、ＡＢＩＰＲＩＳＭ自動シーケンサー
を使用して配列決定した。

【００１５】表１にその結果を示す。一つの遺伝子は、４つのオーバラップするクローンに
よって示し、第２のものは３つのオーバラップするクローンによって示し、そし
て残りの６つのものは一つのクローンのみによって示した。

【００１６】相同性検索によって、ＮＹ−ＥＳＯ−２，３，５，７と称されるクローンが既
知であることが示された。エリセット（Ｅｌｉｓｅｔ）等，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１６：５３３−５４０（１）９３）；スプリッツ（Ｓｐｒｉ
ｔｚ）等，Ｎｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：１０３７３−１０３９１（１９
８７）；ラビッツ（Ｒａｂｂｉｔｓ）等，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｓ４：
１７５−１８０（１９９３）；クロザット（Ｃｒｏｚａｔ）等，Ｎａｔｕｒｅ３
６３：６４０−６４４（１９９３）；ＧｅｎＢａｎｋＨ１８３６８及びＤ２５
６０６を参照のこと。これらクローンの内の二つ（ＮＹ−ＥＳＯ−３およびＮＹ
−ＥＳＯ−６）は、様々な正常であるヒト組織中において発現されることが既に
示されている。系統制限の証拠はまだ見つかっていない。ＮＹ−ＥＳＯ−６（ｃ
ＤＮＡ）は、ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子の３‘未翻訳領域であると考えられる。本明
細書では報告されない実験に於いて、ＮＹ−ＥＳＯ−６の配列決定とサザンブロ
ッティング分析によって、癌の転座又は点変異の証拠は示されなかった。これら
のクローンの内の４つ、即ち、ＮＹ−ＥＳＯ−１，４，５及び８は、調べられた
データベース中の配列に対する強い相同性を示さなかったので、それ以上は調べ
られなかった。

【００１７】

【表１】

【００１８】例３ＮＹ−ＥＳＯ１，４，５及び８クローンのｍＲＮＡ発現を評価するために研究
を行った。これを行うために、３００−４００塩基対のｃＤＮＡセグメントを増
幅し、かつ、プライマー融解温度を６５−７０℃の範囲とするように、各配列に
対する特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。次に、市販の材料と
標準プロトコールとを使用して逆転写ＰＣＲを行った。様々な正常細胞タイプ及
び腫瘍細胞タイプをテストした。クローンＮＹ−ＥＳＯ−４及びＮＹ−ＥＳＯ−
８は遍在しており、それ以上は研究しなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−５は、本来の腫
瘍および正常食道組織中において高レベルの発現を示し、それが分化マーカーで
あったことを示唆した。

【００１９】ＮＹ−ＥＳＯ−１は、精巣において腫瘍ｍＲＮＡとして発現するが、正常な結
腸、腎臓、肝臓又は脳組織中では発現しないことが判った。この発現パターンは
、他の腫瘍拒絶抗原前駆体と一致している。

【００２０】例４上述したＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＮＹ−ＥＳＯ１に関して、遥かに完全に揃
っている正常組織及び腫瘍組織について行った。表２，３及び４にこれらの結果
を示す。要約すると、ＮＹ−ＥＳＯ１は、正常な精巣及び卵巣細胞中で高度に発
現することが判った。少量のＲＴ−ＰＣＲ産生物が正常な子宮筋層中において見
出されたが、子宮内膜では見出されず、その陽性の提示は一貫していなかった。
正常な食道及び皮膚を含む、種々の細胞タイプの扁平上皮もまた陰性であった。

【００２１】関連しない細胞系の腫瘍をテストした時、１１の黒肉腫細胞系の内、２つが強
い発現を示し、６７の黒肉腫標本の内１６と、３３の胸部癌標本の内の６つと、
４の膀胱癌の内の４つが強い発現を示した。その他の腫瘍タイプではまばらに発
現があった。

【００２２】

【表２】

【００２３】

【表３】

【００２４】

【表４】

【００２５】癌患者の血清中における抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体の存在がＥＬＩＳＡによって
測定可能であるか否かを確認するために更に別枠の実験を行った。

【００２６】詳述すると、濃度１ｕｇ／ｍｌのコーティング緩衝溶液（１５ｍＭＮａ₂Ｃ
Ｏ₃，３０ｍＭＮａＨＣＯ₃，ｐＨ９．６，０．０２％ＮａＮ₃）中の組換え
ＮＹ−ＥＳＯ−１を、マイクロウェルプレート（各ウェルにつき１０ｕｌの溶液
）に吸着させ、その後、４℃で一晩保存した。これらのプレートを、燐酸緩衝化
生理食塩水で洗浄し、１０ｕｌ／ウェルの２％ウシ血清アルブミン／燐酸緩衝化
生理食塩水でブロックした。洗浄後、２％ウシ血清アルブミン中の１０ｕｌ／ウ
ェルの希釈血清を前記ウェルに添加した。室温で２時間のインキュベーション後
、プレートを洗浄し、１０ｕｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカリ燐酸共役
体を、１：１５００の希釈率で添加した。この溶液を室温で１時間インキュベー
トし、その後、洗浄し、前記アルカリフォスファターゼについての基質の溶液を
添加した（１０ｕｌ／ウェル）。室温で２５分間後、ウェルを、蛍光プレートリ
ーダーで読み取った。それらの結果を下記の表に示す。

【００２７】Ｅｓｏ１＋／テスト総数％癌患者：黒肉腫１２／１２７９．４卵巣癌４／３２１２．５肺癌１／２４４．０乳癌２／２６７．７献血者０／７００

【００２８】腫瘍に於けるＮＹ−ＥＳＯ−１のｍＲＮＡの発現と、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパ
ク質に対する免疫応答との間に相関性が存在するか否かを調べるために、６２の
黒肉腫患者からのデータを比較した。その血清がＮＹ−ＥＳＯ１に対して反応性
である（即ち、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を有している）患者はすべて、Ｎ
Ｙ−ＥＳＯ−陽性腫瘍も有していたのに対して、ＮＹ−ＥＳＯ−１陰性腫瘍を有
する患者であり、一方で、その血清中にＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を示した
ものはいなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性患者は、ある比率でその抗体を欠如し
ていた。黒肉腫の内、約２０−４０％がＮＹ−ＥＳＯ−１を発現し、そしてＮＹ
−ＥＳＯ−１陽性腫瘍を有する患者のみが抗体を有していたことから、それらの
データは、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性腫瘍を有する患者は高い確率で、そのタンパク
質に対する抗体を産生することを示唆し、従って、診断に於いて有用な広範囲な
アッセイと処理に対する応答性を示唆するものである。

【００２９】例５次に、ＮＹ−ＥＳＯ−１転写物のサイズを調べ、組織発現パターンを確認する
ためにノザンブロッティング分析を行った。オースベル（Ａｕｓｂｅｌ）等，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５）の方法を使用した。具
体的には、各レーンにつき、２０ｕｇの全ＲＮＡを、ホルムアミドおよびホルム
アルデヒドを含有する緩衝液に溶解させ、６５℃に加熱し、その後、３％ホルム
アルデヒドで１．２％アガロースゲルにおいて分離させ、ニトロセルロース紙へ
移した。次に、³²Ｐ標識化プローブを使用してハイブリダイゼーションを行い、
その後、高いストリンジェントで洗浄した。最終洗浄を、０．１×ＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳで６０℃で１５分間行った。

【００３０】精巣および前述のアッセイに於いてＮＹ−ＥＳＯ−１に対し陽性であった黒肉
腫細胞系（ＳＫ−ＭＥＬ−１９）由来のＲＮＡは、約０．８〜０．９ｋｂのＲＮ
Ａ転写物を示した。食道肉腫標本は、０．４−０．９ｋｂの範囲中でスミアを示
し、部分的な減少を反映している。テストした別の組織又は細胞系由来のＲＮＡ
は転写体を示さなかった。

【００３１】完全な転写物をコードするｃＤＮＡを得るために、プラークハイブリダイゼー
ションと、ハイブリダイゼーションプローブとして本来のｃＤＮＡクローンとを
使用して、前記食道ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングした。３×１０⁵
のクローンをスクリーニングした時、６つの陽性を見出した。三つの最も長いク
ローンを配列決定した。オープンリーディングフレームの分析は、これら三つの
すべてが、全コード化領域と、可変サイズの５‘未翻訳領域とを含むことを示し
た。長さが７５５塩基対（ポリＡを除く）の最も長いクローンは、５４３ベース
対のコード化領域と、５’末端の５３の未翻訳塩基と、３‘末端の１５１の未翻
訳ベース対とを有している。配列識別番号１を参照のこと（図３も参照）。

【００３２】この長いＯＲＦは、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の推定配列が１８０のアミノ
酸であることを示した。この一つの免疫陽性クローンは、これらの内の１７３を
コードする配列を含んでいた。推定分子量は１７，９９５ダルトンである。

【００３３】分析は、Ｎ−末端部中にグリシン残基が多く存在する（最初の８０の内の３０
と、残りの１００の内の４）ことを示している。親水性分析によって、疎水性配
列と親水性配列とが交互に出現し、長いＣ−末端疎水性テール部で終結し（アミ
ノ酸１５２−１７２）、その後、短い親水性のテール部が続く、前記分子のＮ末
端半分中に親水性抗原性配列が存在することが示された。このパターンは膜貫通
ドメインであることを示唆する。複数の潜在的なＮ−ミリストリル化部位と、３
つの燐酸化部位が存在するが、Ｎ−グリコシル化部位の証拠は存在しない。

【００３４】例６黒肉腫細胞系「ＮＷ−ＭＥＬ−３８」は、１９９５年、悪性黒肉腫を患う患者
から樹立された。その被験者から、血清サンプル、末梢血液リンパ球、及び腫瘍
サンプルが採取され、本明細書に記載される研究が行われるまで凍結された。こ
の患者に於ける抗腫瘍Ｔ細胞応答を評価することを見越して、この患者のＨＬＡ
型は、ＨＬＡ−Ａ１及びＨＬＡ−Ａ２であると判定された。

【００３５】この患者由来の黒肉腫が、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するか否かを決定するため
に、標準方法を使用して腫瘍サンプルと細胞系ＮＷ−ＭＥＬ−３８との両方から
全ＲＮＡを単離した。次に、再び標準方法を使用して、２マイクログラムの前記
全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成に供した。

【００３６】次に、前記ｃＤＮＡを下記のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ実験に使用し
た。

【００３７】５‘−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＧ
Ｇ’−３‘（配列識別番号２）、及びＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧ
−３‘（配列識別番号３）。

【００３８】これらのプライマーは、ヌクレオチド２７１〜５９９に渡る配列識別番号１のセ
グメントを増幅するはずである。

【００３９】６０℃のアニーリング温度を使用して、増幅を３５サイクルに渡って実施した
。そのＰＣＲ生成物を臭化エチジウム染色によって、１．５％アガロースゲルに
おいて可視化させた。

【００４０】その結果は、前記腫瘍と細胞系との両方が配列識別番号１を発現したことを示
した。これらの細胞系および腫瘍サンプルを後の実験に使用した。

【００４１】例７次に、上述した前記単離ｃＤＮＡ分子を使用して組換えタンパク質を作製した
。具体的には、前記ｃＤＮＡを、標準的方法を使用してＰＣＲ増幅し、次に、Ｈ
ｉｓタグを含む市販のプラスミドベクター、即ちｐＱＥ９にクローニングした。
ここでは詳述しない作業に於いては、第２のベクターであるｐＱＥ９Ｋも使用し
た。これは、アンピシリン耐性ではなくカナマイシン耐性がｐＱＥ９Ｋに付与さ
れている点でＰＱＥ９とは異なる。

【００４２】前記プラスミドベクターで、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換し、
陽性の形質転換体を制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によって同定した。組換
えタンパク質の生成をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを使用して誘導さ
せ、タンパク質を周知の手順に従って、Ｎｉ²⁺イオンクロマトグラフィーカラム
で精製した。次に、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色により分析したところ、こ
のタンパク質は、約２２キロダルトンの分子量のタンパク質であると同定された
。このことは、その配列から予想されるタンパク質のサイズと一致している。他
の二つの形態の組換えタンパク質もまた同定された。これらは、配列認識番号１
において報告された、アミノ酸１０−１８０およびアミノ酸１０−１２１から成
る。それらは、上述のように実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、約１４ｋＤ
および２０ｋＤの分子量をそれぞれ有する。

【００４３】ＮＹ−ＥＳＯ−１をバキュロウイルス中で発現させるためにさらなるセットの
実験を行った。詳述すると、ＮＹ−ＥＳＯ−１のｃＤＮＡインサートを、Ｂａｍ
ＨＩとＨｉｎｄＩＩＩでの開裂によって、前記ｐＱＥ９ベクターから分離させた
。このインサートを、次に、予め同じ酵素によって開裂させた市販のバキュロウ
イルスベクターにサブクローニングした。標準的方法を使用して陽性クローンを
判定し、これらをレシピエントＳｆ９細胞へトランスフェクトさせた。次に、組
換えウイルスを使用して、１０％ウシ胎仔血清を添加した標準媒体（ＩＰＬ−４
１）を使用して昆虫細胞を感染させた。この作業の感染多重度は２０であった。
組換えタンパク質の発現を前述したように判定した。このベクターにおいて生成
された組換えタンパク質はＨｉｓタグを有することから、前述と同様に、Ｎｉ²⁺ アフィニティカラムで精製した。前記タンパク質は、１０−１８０アミノ酸から
成り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２０ｋＤの分子量を有している。

【００４４】次に、別の真核生物トランスフェクト細胞を作製した。これを行うために、前
記ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする配列を上述のｐＱＥ９ベクターから単離し、次
に、真核発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部
位にクローニングした。次に、１５０ｎｇの前述したプラスミドと、１５０ｎｇ
の、ＨＬＡ−Ａ２．１のｃＤＮＡ又は、ＨＡＬ−Ａ１のｃＤＮＡのいずれかを含
有したプラスミドｐｃＤＮＡ１Ａｍｐに細胞サンプルを接触させることによっ
て、このベクターをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトさせた。周知であるＤＥ
ＡＥ−デキストランクロロキン法を使用した。次に、それらの細胞を３７℃で４
８時間インキュベートし、その後、それらをＣＴＬ刺激アッセイでテストした。
具体的には、そのアッセイは、本明細書において参考文献として援用されるトラ
ヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）等，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５
：１４５−１４８（１９９２）に従った。簡単に説明すると、１００％ヒト血清
を添加した１００ｕｌのＲＰＭＩ中の２５００のＣＴＬ（ＮＷ３８−ＩＶＳ−１
、後述の例９を参照のこと）を、ＣＯＳ−７トランスフェクタントを含有するマ
イクロウェルに添加した（２０，０００細胞／ウェル）。２４時間後、５０ｕｌ
の上清を各ウェルから収集し、そしてＴＮＦ−αのレベルを標準的アッセイによ
り測定した。即ち、ＷＥＨＩ１６４クローンの１３の細胞に対する細胞傷害性に
ついて、ＭＴＴを使用してテストした。陽性の細胞を、以下の例に記載されるよ
うにウエスタンブロット分析に使用した。

【００４５】使用したＣＴＬは、本明細書において参考文献として援用されるクヌート（Ｋ
ｎｕｔｈ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５１１
−３５１５（１９８４）に従って調製されたＣＴＬＮＷ３８−ＩＶＳ−１であ
った。具体的には、前記被験者から採取された１０⁵の自己由来ＮＷ３８ＭＥ
Ｌ−１腫瘍細胞と、１０⁶の末梢血液リンパ球とを組み合わせた混合リンパ球Ｔ
細胞培養物を作成した。サイトカインであるＩＬ−２を添加し、この混合培養物
を、１週間３７℃でインキュベートした。腫瘍細胞を除去し、５ｘ１０⁵の腫瘍
細胞の新たなアリコートをＩＬ−２と一緒に添加した。このプロセスを、⁵¹Ｃｒ
標識化ＮＷ−ＭＥＬ−３８細胞に対してテストした場合において強力な応答が見
出されるまで、毎週繰り返した。応答性Ｔ細胞を収集し、後の実験で使用するま
で凍結させた。

【００４６】例８次に、上述した血清サンプル、更に、上述した細胞系であるＮＷ−ＭＥＬ−３
８から採取された細胞溶解物、および前述したＣＯＳ−７トランスフェクタント
（前述）、ならびに精製組換えタンパク質（これもまた前述）を使用して、ウエ
スタンブロット分析を行った。血清サンプルを、患者の治療の様々な時点で採取
した。その結果において相違はなかった。

【００４７】これらのアッセイに於いて、１ｕｇの組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質、又
はいずれかのタイプの５ｕｌの細胞溶解物をＳＤＳで希釈して５分間煮沸し、１
５％のＳＤＳゲルで電気泳動した。ニトロセルロース（０．４５ｕｍ）上で一晩
ブロッティングし、３％のＢＳＡによりブロッキングした後に、そのブロット物
を血清とインキュベートさせて１：１０，０００と１：１００，０００とに希釈
し、或いは、陽性コントロールとして、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するモノクローナ
ル抗体と、１：５０に希釈した。前記モノクローナル抗体は、本明細書において
参考文献として援用され、以下に詳述するチェン（Ｃｈｅｎ）等，Ｐｒｏｃ．ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５９１５−５９１９（１９９６）に従って作
成した。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、２−３週間の間隔で組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タ
ンパク質による５回の皮下注射によって免疫した。前記免疫処方物は、アジュバ
ント中に５０ｕｇの組換えタンパク質を含有していた。第１回目の注射は完全フ
ロイントアジュバントを使用し、以降は不完全フロイントアジュバントを使用し
た。前記免疫化されたマウスから脾臓細胞を採取し、マウス黒肉腫細胞系ＳＰ２
／０と融合させてハイブリドーマを作製した。代表的なハイブリドーマであるＥ
９７８をｍＡｂｓの作成に使用した。

【００４８】ハイブリドーマを一旦作成すると、それらをクローン化し、その上清をマイク
ロタイタープレート上で標準固相ＥＬＩＳＡを使用して組換えタンパク質をスク
リーニングした。アッセイは、本明細書において参考文献として援用されるディ
ッポルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７７：６１１４−６１１８（１９８０）に従った。組換えＮＹ−ＥＳＯ−１を
使用して一連の陰性コントロールも実施した。上述のＥ．ｃｏｌｉによって生成
された組換えタンパク質に結合された血清抗体を、１：１０，０００希釈率でア
ルカリフォスファターゼで標識化したヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して可視化し、次
いでＮＢＴ−ホスファートで可視化した。未トランスフェクトＣＯＳ−７細胞も
コントロールとして使用した。健常な個人由来の血清もコントロールとして使用
した。

【００４９】１：１００，０００もの低い血清希釈物に於いて組換えタンパク質に対する強
い反応が見られ、ＮＷ−ＭＥＬ−３８の溶解物に対する反応もまた見出された。
未トランスフェクトＣＯＳ−７細胞に対する反応は無く、健常な個人由来の血清
も反応性を示さなかった。

【００５０】例９４つの形態のＮＹ−ＳＯ−１は、上述したもの、即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ中で配列
識別番号１によって生成された形態と、アミノ酸１０−１８０から成る形態と、
アミノ酸１０−１２１から成る形態と、アミノ酸１０−１８０から成る、上述し
たバキュロウイルス系中で発現された形態のものである。各形態を前述のプロト
コルに従って、ＥＬＩＳＡに使用した。全ての形態のタンパク質は、様々な患者
から採取された抗体、又は前述したマウスモノクローナル抗体に対して同様に反
応性であることが見出された。

【００５１】例１０上述したＣＯＳ−７トランスフェクタントのテスト、及びこの例において記載
されるアッセイに於いて、細胞溶解性Ｔ細胞系である「ＮＷ３８−ＩＶＳ−１」
を使用した。この「ＣＴＬ」は、前記腫瘍細胞系であるＮＷ−ＭＥＬ−３８を使
用して、上述の末梢血液リンパ球のインビトロ刺激によって作成された。これは
標準的方法を使用して行われた。

【００５２】前記ＣＴＬを、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性及びＨＬＡ−Ａ２陽性である二つの異種
性の細胞系（ＳＫ−ＭＥＬ−３７及びＭＺ−ＭＥＬ−１８）と、ＭＨＣクラスＩ
陰性の細胞系（ＳＫ−ＭＥＬ−１９）と、ＨＬＡ−Ａ２陽性ではあるが、ＮＹ−
ＥＳＯ−１陰性である細胞系（ＮＥ−ＭＥＬ−１４５）、更に、コントロール細
胞系であるＫ５６２及び自己由来のフィトヘマグルチニン刺激芽細胞（ｂｌａｓ
ｔｓ）と共に、ＮＷ−ＭＥＬ−３８（これは、ＨＬＡ−Ａ１，Ａ２陽性で、ＮＹ
−ＥＳＯ−１陽性であった）との、細胞傷害性アッセイに使用した。種々のエフ
ェクター／標的比率を使用して、⁵¹Ｃｒ標識化標的細胞の溶解が測定されたパラ
メータであった。図５にこれを示す。

【００５３】その結果は、ＣＴＬＮＷ３８−ＩＶＳ−１が、自己由来細胞系ＮＷＭＥＬ
−３８と、ＨＬＡ−Ａ２及びＥＳＯ−１陽性である前記異系細胞系の両方を溶解
することを示した。従って、前記ＣＴＬは、異系物質に対して反応性であった。
図６を参照のこと。

【００５４】例１１患者ＮＷ３８はＨＬＡ−Ａ１陽性及びＨＬＡ−Ａ２陽性であったので、どちら
のＭＨＣ分子が提示分子であるかを判定するために実験を行った。

【００５５】ＣＯＳ−７細胞における上述と同じ実験を行った。但し、これらの実験では、
ＨＡＬ−Ａ１ｃＤＮＡ又はＨＬＡ−Ａ２ｃＤＮＡの両方ではなく、いずれか一方
により形質転換された共形質転換の別々の群が得られることに留意した。これら
の結果は、ＣＴＬＮＷ３８−ＩＶＳ−１は、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＮＬＡ−
Ａ２のみとを含むＣＯＳ−７トランスフェクタントを溶解したことを示す。図６
を参照のこと。この作業によって前記ＣＴＬの特異性もまた確認された。なぜな
ら、例９に記載したＮＹ−ＥＳＯ−１陰性細胞、ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞は、ＨＬ
Ａ−Ａ２分子によって提示されるペプチドにプロセッシングされることが既知の
他の分子に対し陽性であったからである。

【００５６】例１２前記提示ＭＨＣ分子がＨＡＬ−Ａ２であると同定された後、このモチーフを満
たす全てのペプチドを同定するために、本明細書において参考文献として援用さ
れるダマロ（Ｄ‘Ａｍａｒｏ）等，ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｌ．４３：１３−
１８（１９９５）及びドレイフホウト（Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ）等，Ｈｕｍａｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１−１２（１９９５）によって示されるモデルを使用し
て、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するアミノ酸配列のスクリーニングを行った。それに
よって推定されるアミノ酸配列の全てに対応するペプチドを、標準的技術を使用
して合成し、次に、それらを、本明細書において参考文献として援用されるクヌ
ート（Ｋｎｕｔｈ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：
３５１１−３５１５（１９８４）に従って、細胞傷害性アッセイに使用した。具
体的には、細胞系であるＣＥＭＸ７２１．１７４．Ｔ２（以降「Ｔ２」）を使用
した。なぜなら、これは、抗原をＭＨＣ複合化ペプチドにプロセッシングせず、
従って、本明細書に記載されるタイプの実験に理想的であるからである。Ｔ２細
胞のサンプルを標準的方法を使用して１００ｕＣｉのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄で標識
化し、３回洗浄し、その後、１０ｕｇ／ｍｌのペプチドおよび２．５ｕｇ／ｍｌ
のβ２−ミクログロブリンとインキュベートさせた。インキュベーションを、室
温で１時間行った。次に、応答細胞（１００ｕｌのＣＴＬＮＷ３８−ＩＶＳ−
１の懸濁物）を、９０：１のエフェクター／標的率で添加し、５％のＣＯ₂を含
む３７℃の水飽和雰囲気中で４時間インキュベートした。その後、プレートを、
２００×ｇで５分間遠心分離し、１００ｕｌの上清を除去して放射能を測定した
。⁵¹Ｃｒ放出の比率を、既知であるストラテジーに従って測定した。ペプチドＳ
ＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列識別番号４）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列識別番号
５）及びＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列識別番号６）がＣＴＬの三つの最良の刺激物
質であることが見出された。これに匹敵する結果が、前述したように、細胞系Ｎ
Ｗ−ＭＥＬ−３８およびＳＫ−ＭＥＬ−３７およびＭＺ−ＭＥＬ−１９を標的と
して使用した場合において見出された。

【００５７】例１３配列識別番号１によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、ＨＬＡ結
合モチーフに対応するペプチド配列について分析した。これは、本明細書におい
て参考文献として援用されるパーカー（Ｐａｒｋｅｒ）等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４２：１６３（１９９４）に教示されているアルゴリズムを使用して行われ
た。下記の表に於いて、前記アミノ酸配列と、それが結合すると推定されるＨＬ
Ａ分子と、配列識別番号１中の位置が示されている。得られた複合体は、細胞溶
解性Ｔ細胞応答を誘発させるはずである。これは、本明細書において参考文献と
して援用されるファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）
等，Ｊ．Ｅｕｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：３０３８−３０４３（１９９４）によ
って教示されている下記の方法を使用して当業者により測定することが可能であ
ろう。

【００５８】

【表５】

【００５９】例１４別の関連するペプチドを更に同定するためにさらなる実験を行った。これらの
実験に於いて、安定腫瘍細胞系、即ち、ＭＺ−ＭＥＬ−１９を使用した。この細
胞系は、本明細書において参考文献として援用されるイェーガー（Ｊａｅｇｅｒ
）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１８７：２６５−２６９（１９９８）によって記載さ
れている方法を使用して、ＭＺ１９と称される患者から樹立されていたものであ
る。細胞溶解性Ｔ細胞系、即ち、ＭＺ２−ＭＥＬ１９−ＩＶＳ−１もまた、Ｍ
Ｚ−ＭＥＬ−１９と、上述の例７と、更に、前出のイェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）
等の記載される方法を使用して樹立された。このＣＴＬは、前記自己由来細胞系
をＨＬＡ−Ａ２規制的様式に溶解した。これは標準的な方法を使用して測定され
た。前出のダマロ（Ｄ‘Ａｍａｒｏ）等によって記載されたモデルを使用して、
ＥＳＯ−１中のＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを満たすすべての配列を同定した。こ
の方法によって２６のペプチドを同定した。標準方法を使用して全てを合成し、
精製し、そして完全性をテストした。次に、これらのペプチドを合成し、下記の
実験でテストした。ＭＺ１９−ＩＶＳ−１を、例１２に記載のＴ２細胞と共に使
用した。配列識別番号４と５のペプチドがＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、ＣＴＬ
ＭＺ１９−ＩＶＳ−１によって認識され、ＣＴＬＭＺ１９−ＩＶＳ−１は前記
細胞を溶解した。このＣＴＬもまた、ＨＬＡ−Ａ２および下記のデカペプチドの
複合体を認識した。

【００６０】ＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列識別番号７）、これは、配列識別番号１の１５６−１６７の部位において
見出される。

【００６１】例１５ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドからなる複合体
を認識するか否かを調べるためにさらなる実験を構成した。

【００６２】腫瘍細胞系ＭＺ−ＭＥＬ−１９は、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性であるとして既に分
類されている。従って、ＮＹ−ＥＳＯ−１を、ＨＬＡ−ＤＲ５３の結合モチーフ
を教示している、本明細書において参考文献として援用されるフタキ（Ｆｕｔａ
ｋｉ）等，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４２：２９９−３０１（１９９５）
を使用してスクリーニングした。全部で２８のペプチドが、理論的にはＨＬＡ−
ＤＲ５３および抗原提示細胞のみに結合するとされた。

【００６３】末梢血液リンパ球（「ＰＢＬ」）を、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性として型分類され
ていた、転移性黒肉腫を有する２人の患者から単離した。

【００６４】この型分類は、標準的な市販される試薬を使用して行われた。一人の患者は、
ＨＬＡ−ＤＲＢ１（対立遺伝子１５０１−０５，１６０１−１６０３，１６０５
及び０７０１）、ＨＬＡＤＲＢ４＊（対立遺伝子（０１０１−０１０３）及び
ＤＢＲ５＊（対立遺伝子０１０１）に対して陽性であると分類し、一方で第２の
患者は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊（対立遺伝子１４０１，１４０７，１４０８及び０
９０１）、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊（対立遺伝子０２０１−０２０３）及びＤＲＢ４
＊（対立遺伝子０１０１−０１０３）に対して陽性であると分類した。ＨＬＡ−
ＤＲＢ４＊の全ての対立遺伝子を、本明細書において参考文献として援用される
ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）等，ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｌ３４：４−１８（
１９９２）に従って、ＨＬＡ−ＤＲ５３と称する。

【００６５】前記ＰＢＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球を除去するために適切な抗
体でコーティングされた磁気ビードで処理した。残りの細胞を、４ｘ１０⁶細胞
／ウェルの割合で２４ウェルプレートに播種し、ウェルのプラスチックに２４時
間付着させた。付着していない任意の数の細胞を除去し、残りの細胞を抗原提示
細胞として使用した。これらの細胞を、５ｕｇ／ｍｌの抗癌マインターフェロン
抗体で、一晩４℃で予めコーティングしておいた９６ウェルの平底ニトロセルロ
ースプレート中で、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）とＩＬ−４（１０００Ｕ
／ｍｌ）によって刺激した。細胞を３．５ｘ１０⁵細胞／ウェルの割合で播種し
た。

【００６６】次に、前記細胞に，４ｕｇ／ウェルのテストペプチド、又は、コントロールと
して２ｕｇ／ウェルの前記完全ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質をパルス供給（ｐｕ
ｌｓｅｄ）した。

【００６７】次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ヒト血清、Ｌ−アスパラギン（５０ｍｇ／ｌ
）、Ｌ−アルギニン（２４２ｍｇ／ｌ）及びＬ−グルタミン（３００ｍｇ／ｌ）
を、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２と共に添加して１００ｕｌの最終容量としたＲ
ＰＭＩ１６４０培地に（１ｘ１０⁵）細胞／ウェルの割合で添加した。

【００６８】この混合物を、水飽和雰囲気中で３７℃で４８時間インキュベートした。その
後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で６回洗浄し、次に
、ビオチン処理抗インターフェロンγ抗体を０．５ｕｇ／ｍｌで添加した。前記
抗体を、３７℃で２時間インキュベートし、その後、プレートを標準試薬で１時
間展開させた。基質である３−エチル−９−アミノカルバゾールを添加して、次
いで５分間インキュベートし、陽性は赤色スポットで示された。赤色のスポット
／ウェルは、ペプチドとＨＬＡ−ＤＲ５３からなる複合体、又はＨＬＡ−ＤＲ５
３と組換えＮＹ−ＥＳＯ−１からプロセッシングされたペプチドからなる複合体
を認識したＣＤ４＋Ｔリンパ球の出現頻度の指標である。コントロールとして、
試薬のみ（即ち、ＣＤ４＋細胞のみ）および前記（細胞）系のみを使用してアッ
セイを行った。

【００６９】下記のペプチドが、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を感作して、γインターフェロンを放
出させることが見出された。

【００７０】ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩ（配列識別番号８−１０）。

【００７１】これらの三つのペプチドは、Ａｌａ又はＳｅｒの三つの下流側残基の手前の、
Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，又はＬｅｕの固定残基であり、前出のフタキ（Ｆｕｔ
ａｋｉ）等によって記載されたＨＬＡ−ＤＲ５３に結合するためのモチーフを満
たす。

【００７２】ＨＬＡ−ＤＲ５３に結合するさらなるペプチドを見出した。

【００７３】これらのペプチドは以下のものである：ＧＡＡＳＧＬＮＧＣＣＲＣＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲＱ（配列識別番号１１−１３）。

【００７４】上記例は、食道癌関連抗原をコードする核酸分子の単離を記載するものである
。本明細書において、「関連」という用語を使用する理由は、その関連する分子
が、その抗原を発現する、食道癌、黒肉腫、乳癌、前立腺癌及び肺癌等のその他
の癌により発現されることが明らかであるからである。

【００７５】本発明は、記載した抗原をコードし、かつストリンジェントな条件下で基準配
列である配列識別番号１にハイブリダイズする核酸分子に関する。本明細書にお
いて使用される、「ストリンジェントな条件」とは、米国特許第５，３４２，７
７４号に詳述されているような条件、即ち、６５℃で１８時間のハイブリダイゼ
ーション、次いで２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１時間の洗浄を４回、次いで
０．２ｘＣＣＳでの最終洗浄であり、より好ましくは、０．１ｘＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで３０分間での最終洗浄であり、更に、同レベルのストリンジェンシー
を提供する更なる条件、ならびによりストリンジェントな条件についていう。

【００７６】本発明の一部はまた発現ベクターであり、これはプロモーターに作動可能連結
（すなわち、作動可能に連結された）様式である本発明の核酸分子を組み込んだ
ものである。このようなベクターの構築は、当業者に周知に範囲にあり、目的の
分子をコードする真核細胞系、又は原核細胞株を生成するための細胞の形質転換
又はトランスフェクションもまた同様である。この様式において使用され得る宿
主細胞の具体例は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、昆虫細胞（たとえば、
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等である。
Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞及びその他の細菌もまた使用され得る。

【００７７】本発明の一部はまた、本来のペプチド形態および翻訳後修飾形態の両者の本明
細書において記載される抗原、ならびに配列認識番号１によりコードされるタン
パク質の、少なくとも１０−１２１アミノ酸であり、そして１０−１８０より少
ないアミノ酸を含むタンパク質である。前記分子は、任意の翻訳後修飾無しで、
抗原的となりうるのに十分な大きさであり、したがって、前駆体および翻訳後修
飾形態との両方で、アジュバント（又はアジュバント無し）と組み合わせされて
免疫原として有用である。これらのタンパク質は、前述したように、血清や血液
等のサンプル中に抗体が存在するか否かを判定するのに使用することができる。
この抗原を使用して生成された抗体もまた、ポリクローナル抗体とモノクローナ
ル抗体との両方のものを含めて、本発明の一部を構成するものであり、そして前
記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもまた同様である。これらは後
述するように、全分子または部分として治療用又は診断用に使用することが可能
である。Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ）₂‘等の反応性フラグメント、及びその他のフラグ
メント、更に、キメラであるヒト化抗体、組換え産生抗体等もまた本発明の一部
を構成する。特に好適であるのは、完全な抗体であるが相補性決定領域である「
ＣＤＲＳ」がヒトであるがＣＤＲがマウスであるキメラである。

【００７８】開示から明らかなように、本発明のタンパク質及び核酸分子を診断用に使用す
ることが可能である。本明細書に記載のＳＥＲＥＸ方法論は、疾病関連抗原に対
する免疫反応を前提としている。従って、例えば、被験者の血清のような体液サ
ンプルのテスト経るように、それ自身の抗体との反応性についてアッセイするこ
とができる。反応性は、その疾病の存在の可能性の指標と見なされ、従って、当
業者に周知であり、かつ本明細書において詳述する必要のない標準核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイによって抗原の発現をアッセイすることもまた可能であ
り得る。標準免疫アッセイを使用して、被験者の分子に対する抗体をアッセイす
ることも可能であろう。

【００７９】配列識別番号１の分析は、その中に５‘非コード化領域及び３’非コード化領
域がその内部に示されていることを示すであろう。本発明は、少なくともそのコ
ード化セグメント、即ち、ヌクレオチド５４−５９３を含み、かつ、配列識別番
号１のヌクレオチド１−５３および／又は５９４−７４７のいずれか又は全部を
含みうるような単離核酸分子に関する。

【００８０】更に分析すると、前述したように、前記分子は、細胞溶解性Ｔ細胞による溶解
を誘発するペプチドにプロセッシングされることが明らかとなる。例７は、いか
にこのタイプのモチーフ分析をＨＬＡ−Ａ２分子に関して行うことが可能である
かを示した。種々のＭＨＣ分子又はＨＬＡ分子のモチーフに関して多大な研究が
行われており、それをここで適用することが可能である。従って、本発明の更に
別の態様は、患者の腫瘍細胞の表面上でＨＬＡ分子に結合し得る１つ以上のペプ
チドが、その患者に対して、ＭＨＣ分子／ＨＬＡ分子に結合し、Ｔ細胞による溶
解を誘発させるのに十分な量が投与される治療法に関する。ＨＬＡ−Ａ２分子に
ついて前述された例示は、使用され得るこの投与の唯一のタイプではない。上述
したような他のＨＬＡ分子についての組み合わせのように、いかなる組み合わせ
のペプチドもまた使用可能である。単体で、又は組み合わせで使用可能であるこ
れらペプチド、及び完全なタンパク質又はその免疫反応性部分を、経静脈、皮内
、皮下、経口、直腸、及び経皮投与等の任意の種類の標準投与方法でそれを必要
とする被験者に投与することができる。標準製薬キャリア、例えばサポニン等の
アジュバント、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターロイキン等もまた使用することができ
る。更に、これらのペプチド及びタンパク質を、列挙された材料とワクチンに処
方され得、樹状細胞、又は関連するＭＨＣ／ペプチド複合体を提示するその他の
細胞も同様である。これらのペプチドはまた、本明細書において参考文献として
援用されるダンバー（Ｄｕｎｂａｒ）等，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３−４
１６（１９９８）に記載されているもののような、４つのペプチド／ＭＨＣ／ビ
オチン複合体が、ストレプトアビジン又はアビジン分子に付着しているＨＬＡ／
ペプチドの多重結合複合体を形成するために利用可能である。そのような複合体
は、Ｔ細胞前駆物質の同定および／又は刺激に使用することが可能である。

【００８１】同様に、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする前記核酸分子が、アデノウ
イルスベースのベクターのようなベクターに組み込まれ、それを、ヒト細胞のよ
うな真核細胞にトランスフェクト可能とする治療法も意図している。同様に、前
記１つ以上のペプチドをコードする核酸分子をこれらのベクターに組み込み、次
いでそれらを核酸ベースの治療法の主要な構成部分としてもよい。

【００８２】これらのアッセイのいずれもまた、進行／緩解研究にも使用可能である。前記
タンパク質のレベル、その発現等をモニタし、前述した方法のいずれか又は全部
を使用するだけで、ＮＹ−ＥＳＯ−１の発現を含む異常性の経過をモニタするこ
とができる。

【００８３】これらの方法は、治療用レジメの有効性を追跡するのに使用可能であることが
明らかであろう。その本質は、前述したアッセイのいずれかを使用して、ＮＹ−
ＥＳＯ−１タンパク質のベースライン値を採り、所与の治療剤を投与し、次いで
ＥＳＯ−１のレベルの変化を、その養生レジメの有効性の指標として観察して、
その後のタンパク質のレベルをモニターできるということである。

【００８４】前述したように、本発明は、とりわけ、ＮＹ−ＥＳＯ分子に対する「統合され
た」免疫応答の認識に関する。この一つの派生的利用法は、癌治療の経過をモニ
ターする能力である。本発明の一部を構成するこの方法に於いて、その治療を必
要とする被験者は、本明細書に記載のタイプのワクチン接種を受ける。そのよう
なワクチン接種によって、たとえば、その細胞上にＨＬＡ／ペプチド複合体を提
示する細胞に対するＴ細胞応答を生じる。この応答はまた、恐らくは、Ｔ細胞に
よる細胞の溶解による抗体誘発性タンパク質放出を生じる抗体反応も含む。従っ
て、免疫応答をモニタすることによって、ワクチンの効果をモニタすることがで
きる。前述したように、抗体力価又はＴ細胞係数値をワクチンによる改善の指標
として採ることができ、又、その逆も可能である。従って、本発明の更に別の態
様は、そのワクチン自身又は、ワクチンがその一部分である巨大分子に対して特
異的である被験者における抗体レベルを決定することによって、その投与後のワ
クチンの有効性をモニタする方法に関する。

【００８５】ワクチンの効果はまた、そのワクチンを接種した被験者のＴ細胞反応をモニタ
ーすることによっても決定することができる。これらのインビトロ刺激Ｔ細胞の
前駆物質発生頻度を測定するために、多くのアッセイを使用することが可能であ
る。それらのアッセイとしては、クロム放出アッセイ、ＴＮＦ放出アッセイ、Ｉ
ＦＮγ放出アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ等を含むがこれらに限定されない
。前駆Ｔ細胞発生頻度の変化は、測定され得、そしてワクチンの有効性と関連付
けられ得る。使用されるその他の方法は、ＭＨＣ／ペプチドの多重結合複合体の
使用を含む。そのような複合体の一例は、本明細書において参考文献として援用
されるダンバー（Ｄｕｎｂａｒ）等，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３−４１６
（１９９８）のＨＬＡ／ペプチド−ビオチン−ストレプトアビジン四量体の系で
ある。

【００８６】癌等の疾病状態に関与するＮＹ−ＥＳＯ−１の同定はまた、上述した方法の他
に多くの治療アプローチを示唆している。上述した実験は、タンパク質の発現に
応答して抗体が産生されることを確証するものである。従って、本発明の更なる
実施例は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の変異又は異常レベルによって特徴付け
られる状態を、ヒト化抗体、抗体フラグメント等の抗体の投与を介して治療する
ことに関する。これらは、適切な細胞増殖抑制性（ｃｙｓｔｏｓｔａｔｉｃ）又
は細胞溶解性試薬によってタグ付加又は標識化することができる。

【００８７】Ｔ細胞を投与することもまた可能である。尚、Ｔ細胞は、樹状細胞、リンパ球
等の免疫反応性細胞、またはその他の免疫反応性細胞を使用して、インビトロで
顕在化し、その後、治療中の被験者に再潅流させることが可能であることも留意
のこと。

【００８８】尚、Ｔ細胞および／又は抗体の作成は、好ましくは非増殖性に処理され、前述
したエピトープ等の、応答のために関連Ｔ細胞又はＢ細胞を提示する細胞を投与
することによってもまた達成することができることに留意のこと。

【００８９】前記治療アプローチはまた、好ましくは長さが１０〜１００ヌクレオチドのア
ンチセンス分子が、「ニート（ｎｅａｔ）」に、又はリポソーム等のキャリア中
で被験者に対して投与されて細胞中への導入を容易にし、次いでタンパク質の発
現を抑制するアンチセンス治療法もまた含むものとすることができる。そのよう
なアンチセンス配列はまた、ウイルスベクター（たとえば、ワクシニア）、既知
のＢＣＧワクチン派生物等のバクテリア構築物などに組み込むことも可能である
。

【００９０】下記のコア配列を有し、ＬＬＭＷＩＴ（配列識別番号１４）第１のＬ残基に対して、好ましくはセリンである、少なくとも一つの残基末端を
有し、最大三つの残基を有することが可能であり、セリンが、Ｌに連結されて−
ＳＬ−を形成し、Ｃ末端の０−４に追加されるアミノ酸が、前述したように、Ｈ
ＬＡ−Ａ２分子に結合し、これによってＣＴＬ反応を誘発させるするものとして
定義される、ノナマー、デカマー、又はウンデカマーもまた本発明の一部を構成
する。これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり、かつＮＹ−ＥＳＯ−１を
発現する患者への投与によって治療用として、或いは診断用、即ち、ＨＬＡ−Ａ
２陽性細胞が存在するか否か、又は関連するＣＴＬが存在するか否かを調べるた
めなどに使用することができる。

【００９１】ＨＡＬ−Ａ２分子は、ＭＨＣクラスＩ分子であり、ペプチドとクラスＩ分子か
らなる複合体に応答するＴ細胞は、一般に、ＣＤ８⁺細胞である。別のサブセッ
トのＴ細胞であるＣＤ４⁺細胞は、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子とペプチドからなる
複合体に反応し、自己由来の培養樹状細胞によって提示される組換えＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１に対するＭＨＣ−クラスＩＩ制限ＣＤ４⁺Ｔ細胞が、黒肉腫患者において
検出された。具体的には、本明細書には記載しない結果に於いて、ＣＤ４⁺Ｔ細
胞が、周知の技術を使用して、ＰＢＬ又は血清サンプル由来の他の細胞から分離
された。次いで、それらをＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質をパルス処理された樹状
細胞と混合した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖が観察され、本明細書で議論された別の
一面をもたらした。従って、本発明の更に別の態様は、これらのＣＤ４⁺Ｔ細胞
と、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子に結合するペプチドと、それらの治療に於ける利用
とに関する。

【００９２】配列識別番号１４の前記コア配列によって規定されるペプチドの具体例は、配
列識別番号７によって規定されるペプチドである。このペプチドは、示されてい
るように、ＨＬＡ−Ａ２分子に結合する。従って、それは、ＨＬＡ−Ａ２に対す
る「マーカー」であり、かつ前述したように、ＣＴＬの増殖を刺激するペプチド
／ＭＨＣ複合体の成分でもある。

【００９３】前記例が示すように、ＥＳＯ１は又、ＭＨＣクラスＩＩ分子、特にＨＬＡ−Ｄ
Ｒ５３と複合化するペプチドにもプロセッシングされる。これらの分子は、Ｆｕ
ｔａｋｉら．，前出によって記載されたモチーフ、即ち、Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｔｒ
ｐ又はＬｅｕ、それに続く、Ａｌａ又はＳｅｒの三つのアミノ酸を満たすもので
ある。これらのペプチドは、少なくとも１８アミノ酸長でなければならず、好ま
しくは、２５アミノ酸長以下である。好ましくは、それらは、配列識別番号８，
９，１０，１１，１２及び１３等のように、１８のアミノ酸から成る。これらの
ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性細胞を同定するために作用する。更に、配列
識別番号８，９及び１０等のペプチドの場合においては、前記例で示したように
、これらはヘルパーＴ細胞の増殖を刺激するために使用することが可能である。
ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドの上述した適用例の全ては、これらのクラスＩＩ制
限ペプチドに適用可能である。更に、免疫応答の性質は、ＭＨＣ−クラスＩＩ／
ペプチド複合体と比較して、ＭＨＣ−クラスＩ／ペプチド複合体では異なること
から、免疫組成物等として、これら両方のタイプのペプチドを組み合わせて、組
み合わされた免疫応答（ｃｏｍｂｉｎｅｄｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）
を発生させてもよい。このように、記載したすべての適用例は、クラスＩ制限ペ
プチドのみで、クラスＩＩ制限ペプチドのみで、又はこれらを組み合わせて使用
することができる。

【００９４】本発明のその他の特徴及び用途は、当業者にとって明白であり、ここでは記載
する必要がない。

【００９５】ここに使用した用語及び表現は、限定の用語ではなく記載の用語であり、これ
らの用語及び表現を使用するに当たって図示及び記載した特徴又はその一部のい
かなる均等物も除外する意図は無く、本発明の範囲内に於いて様々な改変が可能
であると理解される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】様々な組織タイプ中での、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原のＲＮＡの発現パターンを図示
している

【図２】精巣と細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−１８中には見つかったが、その他様々な細胞及び組
織サンプル中には見つからなかった、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｍＲＮＡのノーザンブロ
ット分析を図示している

【図３】ＮＹ−ＥＳＯ−１の推定アミノ酸配列の推定修飾部位を図示している

【図４】アミノ酸末端中の親水性ドメインと、カルボキシル末端の近傍の長い疎水性スト
レッチとを示す、ＮＹ−ＥＳＯ−１の親水性プロットである

【図５】ＨＬＡ−２陽性、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性、これら両方に対して陽性、又はこれら
のいずれに対しても陽性でない、様々な細胞を使用したＣＴＬ溶解研究の結果を
示している

【図６】ＨＬＡ−Ａ２が配列識別番号１誘導ペプチドの提示のための提示分子であること
を証明するデータを示している

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 ４Ｃ０８４Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｋ 14/00 ４Ｃ０８５Ｃ０７Ｋ 14/00 16/00 ４Ｈ０４５ 16/00 16/46 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＺ，ＺＡ (72)発明者ストッカート，エリザベスアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者イェーガー，エルケドイツ連邦共和国デー‐60488 フランクフルト・アム・マインシュタインバッハー・ホール２‐28 (72)発明者チェン，ヤオ‐ツェンアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨーク 68ス・ストリートイースト 525 (72)発明者スキャンラン，マシューアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者アレクサンダー，クヌートドイツ連邦共和国デー‐60488 フランクフルト・アム・マインシュタインバッハー・ホール２‐28 (72)発明者オールド，ロイド，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークサード・アベニュー 605 (72)発明者グア，アリアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者リッター，ゲルトアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者ドレイフホウト，ヤンオランダ 2300 ライデン（無番地）ユニバーシティ・ホスピタルディパートメント・オブ・イミュノヘマトロジー・アンド・ブラッド・バンクＦターム(参考） 2G045 AA26 AA34 AA35 AA40 CA18 CB01 CB02 DA36 DA78 FB01 FB03 FB07 FB08 4B024 AA01 BA44 CA04 CA07 CA11 DA02 DA06 EA03 EA04 GA11 HA01 HA15 4B064 AG01 AG27 CA01 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA87X AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 4C057 BB02 BB05 DD01 MM04 4C084 AA02 BA44 CA18 DA02 NA14 ZB212 ZB261 ZB262 4C085 AA13 AA14 AA16 BB01 CC02 DD62 EE06 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA17 BA18 BA41 CA40 DA76 EA28 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＭＨＣ−クラスＩＩのＨＬＡ−ＤＲ５３分子に結合し、少な
くとも１８アミノ酸を含み、そして２５より少ないアミノ酸を含む単離ポリペプ
チドであって、該ポリペプチドは、少なくとも一つのＨＬＡ−ＤＲ５３結合モチ
ーフを有し、該モチーフは、４アミノ酸から成り、その第１のアミノ酸はＴｙｒ
，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ又はＬｅｕであり、その第４のアミノ酸はＡｌａ又はＳｅｒで
ある、単離ポリペプチド。
【請求項２】請求項１の単離ペプチドであつて、前記ペプチドは、該ペプ
チドとＨＬＡ−ＤＲ５３分子との複合体に対して特異的なＣＤ４⁺細胞の認識と
増殖とを刺激する、単離ポリペプチド。
【請求項３】請求項１の単離ペプチドであって、１８のアミノ酸から成る
、単離ペプチド。
【請求項４】請求項１の単離ペプチドであって、配列識別番号８，９，１
０，１１，１２及び１３から成る群から選択される、単離ポリペプチド。
【請求項５】請求項４の単離ペプチドであって、配列識別番号８，９及び
１０から成る群から選択される、単離ペプチド。
【請求項６】ＭＨＣクラスＩＩ分子ＨＬＡ−ＤＲ５３と配列識別番号８，
９又は１０との複合体に対して特異的な単離細胞溶解性Ｔ細胞。
【請求項７】ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ５３と請求項１の
ポリペプチドから成る単離複合体。
【請求項８】請求項６の単離複合体であって、前記ペプチドは配列識別番
号８，９，１０，１１，１２又は１３である単離複合体。
【請求項９】請求項１の単離ポリペプチドと、少なくとも一つのアジュバ
ントを含む組成物。
【請求項１０】請求項９の組成物であって、前記ポリペプチドが、配列識
別番号８，９又は１０である組成物。
【請求項１１】請求項１の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列から成る単離核酸分子。
【請求項１２】請求項１１の単離核酸分子であって、前記単離ポリペプチ
ドは、配列識別番号８，９，１０，１１，１２又は１３である単離核酸分子。
【請求項１３】請求項１１の単離核酸分子を含み、プロモーターに作動可
能に連結された発現ベクター。
【請求項１４】配列識別番号８，９及び１０により規定されるポリペプチ
ドからなる少なくとも二つの混合物を含む組成物。
【請求項１５】請求項１４の組成物であって、アジュバントを更に含む組
成物。
【請求項１６】発現用キットであって、以下のそれぞれ別々になった部分
を有する発現用キット：（ｉ）請求項１の単離ペプチドをコードする単離核酸分子；及び（ｉｉ）ＨＣＡ−ＤＲ５３分子をコードする単離核酸分子。
【請求項１７】請求項１１の単離核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項１８】請求項１３の発現ベクターを含む組換え細胞。
【請求項１９】ヘルパーＴ細胞の増殖を刺激する方法であって、Ｔ細胞含
有サンプルを、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ５３と請求項５のペ
プチドからなる複合体を認識するヘルパーＴ細胞の増殖を刺激するために十分な
量の前記複合体と接触させる工程を含む方法。
【請求項２０】請求項１９の方法であって、前記複合体は細胞の表面上に
ある方法。
【請求項２１】請求項２０の方法であって、前記細胞が投与される被験者
に対して自己由来性の細胞である方法。
【請求項２２】請求項２０の方法であって、前記細胞は非増殖性である方
法。
【請求項２３】請求項２０の方法であって、前記細胞は組換え細胞である
方法。
【請求項２４】請求項１９の方法であって、前記複合体は自由形態である
方法。
【請求項２５】ヘルパーＴ細胞の増殖を刺激する方法であって、請求項５
からなる少なくとも一つのペプチドを、前記ペプチドとＨＬＡ−ＤＲ５３からな
る複合体を形成し、そしてそれに対して特異的であるヘルパーＴ細胞の増殖を刺
激するに十分な所定量を、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性である被験者に投与する工程を
含む方法。
【請求項２６】請求項２５の方法であって、前記少なくとも一つのペプチ
ドを局所的に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】請求項２５の方法であって、前記少なくとも一つのペプチ
ドを、少なくとも一つのアジュバントを含む組成物の形態として投与する工程を
含む方法。
【請求項２８】被験者においてヘルパーＴ細胞の増殖を刺激する方法であ
って、前記被験者に対して所定量のポリペプチドまたはペプチドを投与する工程
を含み、前記ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列は、配列認識番号８、
９または１０からなる少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、該被験者のＭＨＣ
クラスＩＩ分子により提示される少なくとも１つのペプチドにプロセッシングさ
れるのに十分な量であり、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子および少なくとも１つのペプ
チドからなる複合体に対して特異的であるヘルパーＴ細胞の増殖を刺激するため
に十分な量の前記複合体を形成するために十分な量のペプチドおよびポリペプチ
ドを投与する工程を含む、方法。
【請求項２９】請求項２８の方法であって、前記被験者はＨＬＡ−ＤＲ５
３陽性である方法。
【請求項３０】請求項２８の方法であって、前記タンパク質は、配列識別
番号１によってコードされるタンパク質である方法。
【請求項３１】請求項２８の方法であって、前記ポリペプチドは、配列識
別番号８，９又は１０の複数のコピーを含む方法。
【請求項３２】被験者においてヘルパーＴ細胞の増殖を刺激する方法であ
って、前記被験者に対して、（ｉ）ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする核酸配列、お
よび（ｉｉ）ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子
をコードする核酸配列をトランスフェクトした所定量の細胞を投与する工程を含
み、前記ペプチドは、癌状態に関連する細胞によって、前記癌状態を軽減するの
に十分に提示される方法。
【請求項３３】請求項３２の方法であって、前記細胞を非増殖性に処理す
る工程を更に含む方法。
【請求項３４】被験者においてヘルパーＴ細胞の増殖を刺激する方法であ
って、前記被験者に対して、非増殖性細胞表面上で発現された、ＭＨＣ−クラス
ＩＩ分子とＥＳＯ−１由来ペプチドからなる非共役結合複合体から実質的に構成
される試薬の一定量を投与する工程を有する方法。
【請求項３５】癌状態を患う被験者を治療する方法であって、前記被験者
に対して、前記状態に関連する癌細胞で発現されたＥＳＯ−１由来ペプチドに特
異的に結合する抗体を投与する工程を含み、前記抗体は、前記癌状態を治療する
ために適切な量で抗癌剤と組み合わされる方法。
【請求項３６】被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
求項９の組成物を前記被験者において前記癌状態の発生を予防するために適切な
量で投与する工程を含む方法。
【請求項３７】被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
求項１０の組成物を前記被験者において前記癌状態の発生を予防するために適切
な量で投与する工程を含む方法。
【請求項３８】被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
求項１４の組成物を、前記被験者における前記癌状態の発生を予防するために適
切な量で投与する工程を含む方法。
【請求項３９】被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
求項１３の発現ベクターを前記被験者における前記癌状態の発生を予防するため
に適切な量で投与する工程を含む方法。
【請求項４０】被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
求項１５の組成物を前記被験者における前記癌状態の発生を予防するために適切
な量で投与する工程を含む方法。
【請求項４１】被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
求項１７の組換え細胞を前記被験者内の前記癌状態の発生を予防するために適切
な量で投与する工程を含む方法。
【請求項４２】被験者において癌をスクリーニングする方法であって、前
記被験者から採取されたサンプルを、（ｉ）ＭＨＣ−クラスＩＩ分子と配列識別
番号１によってコードされるタンパク質由来のペプチドからなる複合体、又は（
ｉｉ）前記複合体に対して特異的であるヘルパーＴ細胞についてアッセイする工
程を含み、（ｉ）又は（ｉｉ）の存在は、前記被験者が癌である可能性を示す方
法。
【請求項４３】請求項４２の方法であって、前記ペプチドは、配列識別番
号８，９又は１０によって規定されるペプチドである方法。
【請求項４４】被験者において癌状態を診断する方法であって、前記被験
者のサンプルを含む免疫反応性細胞を、請求項１のポリペプチドをコードする単
離核酸分子でトランスフェクトされた細胞系と接触させる工程、および前記トラ
ンスフェクト細胞と前記免疫反応性細胞との相互作用を判定する工程を含み、前
記相互作用は前記癌状態の指標となる方法。
【請求項４５】請求項４４の方法であって、前記免疫反応性細胞はヘルパ
ーＴ細胞である方法。
【請求項４６】請求項４４の方法であって、前記ポリペプチドは、配列識
別番号８，９又は１０によって規定される方法。
【請求項４７】癌状態の緩解、進行、又は発生を判定する方法であって、
前記癌状態を伴う患者由来のサンプルの、（ｉ）ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質由
来ペプチドとＭＨＣ−クラスＩＩ分子からなる複合体、及び（ｉｉ）前記複合体
に対して特異的なヘルパーＴ細胞から成る群から選択されるパラメーターについ
てモニターする工程を含み、前記パラメータの量は前記癌状態の緩解、進行、又
は発生の指標となる方法。
【請求項４８】請求項４７の方法であって、前記サンプルは体液又は滲出
液である方法。
【請求項４９】請求項４７の方法であって、前記サンプルは組織である方
法。
【請求項５０】請求項４７の方法であって、前記サンプルを前記複合体に
特異的に結合する抗体と接触させる工程を含む方法。
【請求項５１】請求項５０の方法であって、前記抗体は放射性標識又は酵
素で標識化されている方法。
【請求項５２】請求項５０の方法であって、前記抗体はモノクローナル抗
体である方法。
【請求項５３】癌状態を診断する方法であって、被験者から採取されたサ
ンプルを、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子と複合体を形成するＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペ
プチドに対して特異的な細胞についてアッセイする工程を含む方法であって、前
記免疫反応性細胞の存在が前記癌状態の指標となる方法。
【請求項５４】請求項５３の方法であって、前記免疫反応性細胞はヘルパ
ーＴ細胞である方法。
【請求項５５】配列識別番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列から成る単
離ペプチド。
【請求項５６】請求項５５の単離ペプチドおよびアジュバントを含む組成
物。
【請求項５７】請求項５５の単離ペプチド、および配列識別番号１によっ
てコードされるタンパク質中に見出されるアミノ酸配列を含み、かつＭＨＣ分子
と複合体を形成する少なくとも一つの他のペプチドを含む組成物。
【請求項５８】請求項５７の組成物であって、前記ＭＨＣ分子はクラスＩ
分子である組成物。
【請求項５９】請求項５７の組成物であって、前記ＭＨＣ分子はクラスＩ
Ｉ分子である組成物。
【請求項６０】請求項５７の組成物であって、前記少なくとも一つの他の
ペプチドは、配列識別番号４，５，６，７，８，９又は１０によって規定される
ペプチドである組成物。
【請求項６１】請求項５５の単離ペプチドをコードするヌクレオチド配列
から成る単離核酸分子。
【請求項６２】プロモータに作動可能に連結された、請求項６１の単離核
酸分子を含む発現ベクター。
【請求項６３】請求項５５の単離ペプチドとＨＬＡ−Ａ２分子からなる複
合体。
【請求項６４】請求項６１の単離核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項６５】請求項６２の発現ベクターを含む組換え細胞。
【請求項６６】その表面上に請求項６３の複合体を発現する非増殖性細胞
。
【請求項６７】請求項６６の非増殖細胞およびアジュバントを含む組成物
。
【請求項６８】細胞溶解性Ｔ細胞の増殖を刺激する方法であって、請求項
５５のペプチドとＨＬＡ−Ａ２分子からなる複合体に対して特異的な細胞溶解性
Ｔ細胞を、前記細胞溶解性Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な量を接触させる
工程を含む方法。
【請求項６９】請求項６８の方法であって、前記複合体は組成物の形態で
投与される方法。
【請求項７０】請求項６８の方法であって、前記複合体を非増殖性細胞に
対してその表面上に提示する形態で投与する工程を含む方法。
【請求項７１】細胞溶解性Ｔ細胞の増殖を刺激する方法であって、細胞溶
解性Ｔ細胞の増殖を誘発させるために、十分な数の請求項５５のペプチドとＨＬ
Ａ−Ａ２分子からなる複合体を産生するために適切であるＨＬＡ−Ａ２陽性細胞
に対して所定量の前記ペプチドを投与する工程を含む方法。
【請求項７２】請求項７１の方法であって、組成物中の前記ペプチドを投
与する工程を含む方法であって、前記組成物はアジュバントを更に含む方法。
【請求項７３】請求項７１の方法であって、前記組成物は、少なくとも一
つの別のペプチドを含む方法。
【請求項７４】単離核酸分子によりコードされたタンパク質と結合する単
離抗体または抗体の結合フラグメントであって、前記単離核酸分子の相補配列が
ストリンジェントな条件下に於いて、配列識別番号１のヌクレオチド５４−５９
３を含む核酸分子とハイブリダイズする、単離抗体または抗体の結合フラグメン
ト。
【請求項７５】請求項７４の単離抗体であって、前記抗体はモノクローナ
ル抗体である単離抗体。
【請求項７６】請求項７４の単離抗体であって、前記抗体は、キメラ抗体
である単離抗体。
【請求項７７】請求項７６の単離抗体であって、前記キメラ抗体は、マウ
スＣＤＲ領域を有するヒト化抗体を含む単離抗体。
【請求項７８】請求項７５のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系。
【請求項７９】サンプル中の癌についてスクリーニングする方法であって
、前記サンプルを、請求項７４の単離抗体と接触させる工程と、前記抗体の標的
に対する結合を判定する工程を癌状態の指標として含む方法。
【請求項８０】請求項７９の方法であって、前記癌は、メラノーマ、胸部
癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、甲状腺癌、膀胱癌、又はリンパ腫である方
法。
【請求項８１】サンプル中の癌関連抗原に対する抗体の存在を判定する方
法であって、前記サンプルを、配列識別番号１のヌクレオチド５４−５９３を含
む核酸分子によってコードされる単離タンパク質と接触させる工程と、抗体のそ
れに対する結合を、前記サンプル中における癌関連抗原に対する抗体の判定とし
て判定する工程を含む方法。
【請求項８２】癌状態の緩解、進行、又は発生を判定する方法であって、
前記癌状態を伴う患者由来のサンプルの、（ｉ）ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質及
び（ｉｉ）ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質由来ペプチドから成る群から選択される
パラメーターを、（ｉ）又は（ｉｉ）に結合する抗体によってモニターする工程
を含み、前記パラメータの量は、前記癌状態の緩解、進行、又は発生の指標とな
る方法。
【請求項８３】請求項８２の方法であって、前記サンプルは体液又は滲出
液である方法。
【請求項８４】請求項８２の方法であって、前記サンプルは組織である方
法。
【請求項８５】請求項８４の方法であって、前記抗体は、放射性標識又は
酵素で標識化されている方法。
【請求項８６】請求項８４の方法であって、前記抗体はモノクローナル抗
体である方法。
【請求項８７】癌状態を患う被験者を治療する方法であって、前記被験者
に対して前記癌状態に関連する癌細胞において発現されるＮＹ−ＥＳＯ−１タン
パク質またはＥＳＯ−１由来ペプチドに対して特異的に結合する抗体を投与する
工程を含み、前記抗体は癌を治療するために適切な量で抗癌剤と結合されて該癌
状態を治療する方法。
【請求項８８】癌状態を患う被験者を治療する方法であって、前記被験者
に対してＮＹ−ＥＳＯ−１に特異的に結合する抗体を投与する工程を含み、前記
抗体は抗癌剤と結合結合されて該癌状態を治療する方法。
【請求項８９】配列識別番号１で示されるヌクレオチド配列を有する単離
核酸分子によってコードされるタンパク質の、少なくとも１０−１２１アミノ酸
、および１０−１８０より少ないアミノ酸から成る単離タンパク質。
【請求項９０】請求項８９の単離タンパク質であって、１０−１２１アミ
ノ酸から成る単離タンパク質。
【請求項９１】請求項８９の単離タンパク質であって、１０−１８０アミ
ノ酸から成る単離タンパク質。
【請求項９２】請求項８９の単離タンパク質であって、前記タンパク質が
グリコシル化されている単離タンパク質。
【請求項９３】請求項８９の単離タンパク質と、キャリアを含む免疫原性
組成物。
【請求項９４】サンプル中の癌関連抗原に対する抗体の存在を判定する方
法であって、前記サンプルを、請求項８９の単離タンパク質と接触させる工程と
、前記タンパク質に対する結合を前記サンプルにおける癌関連抗原に対する抗体
の判定として判定する工程を含む方法。