JP2002538074A - Ny−eso−1のアミノ酸配列に対応し、かつmhcクラスi分子及びmhcクラスii分子に結合する単離ペプチドおよびその利用方法 - Google Patents

Ny−eso−1のアミノ酸配列に対応し、かつmhcクラスi分子及びmhcクラスii分子に結合する単離ペプチドおよびその利用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、MHCクラスI分子及びMHCクラスII分子に結合するペプチドに関する。これらのペプチドは、様々な治療及び診断の状況下に於いて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 関連出願 本出願は、1996年10月3日に出願され、現在では米国特許第 である出願番号第08/725,182号の一部継続出願である、
1997年9月15日出願の出願番号第08/937,263号の一部継続出願
である、1998年4月17日出願の出願番号第09/062,422号の一部
継続出願である。これら出願の全てが本明細書において参考文献として援用され
る。
【0002】 発明の分野 本発明は、癌に関連する抗原に由来するHLA結合ペプチドに関する。これら
のペプチドは、MHCクラスI分子及びMHCクラスII分子に結合する。
【0003】 背景及び従来技術 感染症、癌、自己免疫疾患等の多くの病理的状態が、或る種の分子の不適切な
発現によって特徴付けられることが明確に確立されている。従って、これらの分
子は、特定の病理状態又は異常状態についての「マーカー」として機能する。診
断用「標的」即ち、これらの異常状態を診断するために同定されるべき物質とし
てのそれらを利用する以外に、これらの分子は、診断および/又は治療薬を作り
出すために使用可能な試薬として作用する。これの非限定的な一具体例は、特定
のマーカーに対して特異的な抗体を産生するための癌マーカーの使用である。さ
らに別の非限定的な具体例は、異常細胞に対する細胞溶解性T細胞を産生するた
めのMHC分子と複合化するペプチドの使用である。
【0004】 当然ながら、このような物質の調製には、これらを産生するために使用される
試薬供給源が予め要求される。細胞からの精製は、それを実施する確実な方法か
ら程遠い1つの面倒な方法である。別の好適な方法は、特定のマーカーをコード
する核酸分子の単離であり、次いで、この単離されたコードされた分子を使用し
て所望の分子を発現させる。
【0005】 今日まで、たとえばヒトの腫瘍においてこのような抗原を検出するために二つ
のストラテジーが使用されてきた。これらは、それぞれ遺伝学的アプローチおよ
び生化学的アプローチと称される。遺伝学的アプローチは、たとえば、本明細書
において参考文献として援用されるデ・プレーン(dePlaen)等,Pro
c.Natl.Sci.USA85:2275(1988)によって例示される
。このアプローチでは、腫瘍から得られたcDNAライブラリーの数百プールの
プラスミドを、COS細胞等のレシピエント細胞に、又は、その特定の抗原の発
現についてテストされた腫瘍細胞系の抗原陰性改変体にトランスフェクトする。
たとえば、本明細書において参考文献として援用されるオー・マンデルボイム(
O.Mandelboim)等,Nature 369:69(1994)によ
って例示される前記生化学的アプローチは、腫瘍細胞のMHC−クラスI分子に
結合したペプチドの酸溶出に次ぐ逆相高速液体クロマトグラフィ(HPLC)に
基づくものである。抗原性ペプチドは、抗原提示が損なわれた変異細胞系の未提
示(empty)MHC−クラスI分子にそれらが結合した後に同定され、次い
で細胞傷害性T−リンパ球との特異的な反応を誘発する。これらの反応には、M
TTアッセイ、又は51Cr放出アッセイによって測定可能である、CTL増殖の
誘発、TNF放出、及び標的細胞の溶解が含まれる。
【0006】 抗原の分子的規定に対するこれら二つのアプローチには以下の欠点がある:第
一に、それらは極めて面倒で、時間を費やし、コスト高であり、そして;第二に
、それらは事前に規定された特異性を有する細胞傷害性T細胞系(CTLs)の
樹立に依存する。
【0007】 抗原の同定及び分子的規定に対してのこれら二つの公知のアプローチに固有の
問題点は、これらの方法は、共に、ヒトの腫瘍におけるごく小数の新規な抗原を
規定することにしか成功していないという事実によって最も顕著に示される。た
とえば、ファン・デア・ブルッゲン(van der Brugen)等,Sc
ience 254:1643−1647(1991);ブリチャード(Bri
chard)等,J.Exp.Med.178:489−495(1993);
クーリ(Coulie)等,J.Exp.Med.180:35−42(199
4);カワカミ(Kawakami)等,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA91:3115−3519(1994)を参照のこと。
【0008】 更に、記載された方法論は、考慮下にあるタイプの癌の、樹立されて恒久的な
細胞系が入手可能であることに依存している。たとえば、エットゲン(Oett
gen)等,Immunol.Allerg.Clin.North.Am.1
0:607−637(1990)によって示されているように、特定の癌からの
細胞系の樹立は極めて困難である。また、いくつかの上皮細胞タイプの癌は、イ
ンビトロにおいてCTLに対してたいした影響を受けず、慣習的な分析が不可能
であることが周知である。これらの問題が、関連抗原を同定するための別の方法
を開発することを当該分野に促してきた。
【0009】 一つの重要な方法が、本明細書において参考文献として援用されるサヒン(S
ahin)等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:1181
0−11913(1995)により記載されている。更に、米国特許第5,69
8,396号及び1996年1月3日に出願された出願番号第08/479,3
28号もまた参照のこと。これら三つの文献すべてが本明細書において参考文献
として援用される。要約すると、この方法は、原核生物ホスト中に於いてcDN
Aライブラリーを発現させるものである(これらのライブラリーは、腫瘍サンプ
ルから得られる)。次に、高力価の体液応答を惹起する抗原を同定するべく、発
現したライブラリーを、吸収され、そして希釈された血清によって免疫スクリー
ニングする。この方法論は、SEREX法(組換え発現クローニングによる抗原
の血清学的同定)として既知である。この方法論は、過去に同定された腫瘍関連
抗原の発現を確認するため、及び、新規な抗原を検出するために使用されてきた
。上述で参照される特許出願およびサヒン(Sahin)等,ならびに、クルー
(Crew)等,EMBO J144:2333−2340(1995)(前出
)を参照のこと。
【0010】 このSEREX方法論は食道癌サンプルに適用されており、抗原が今回同定さ
れ、そのコード化核酸分子が単離され、そしてクローニングされた。これは複数
の特許出願における課題であり、これらの一部は本明細書において参考文献とし
て援用される。その抗原および分離体(truncated forms)は、
癌患者の血清中における抗体に対して反応することが見出された。又、この分子
由来のペプチドがHMC分子と結合し、細胞溶解性T細胞およびヘルパーT細胞
両方との応答を誘発することも見出された。本発明のこれらの特徴は、以下の開
示において見られる。
【0011】 好適実施例の詳細な説明 例1 全RNAを、周知の方法を使用して、ウェルのスナップ凍結標本の食道の分化
したaquamos細胞癌から浸解させて抽出した。そのような方法の一例とし
ては、たとえば、チョムジンスキー(Chomzynski),J.Analy
t.Biochem.162:156−159(1987)を参照のこと。この
RNAを使用して、cDNAライブラリーを作成し、これを次に、製造業者の指
示に従って、λZAPファージベクター中にトランスフェクトさせた。このλZ
APライブラリーを、次に、E.coliにトランスフェクトさせて、1.6x
106の一次単離株を得た。
【0012】 次に、本明細書において参考文献として援用されるサヒン(Sahin)等,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:11810−11813
(1995)のSEREX方法論を使用した。要約すると、自己血清を、食道癌
細胞由来のcDNAクローンを含まないλZAPファージをトランスフェクトさ
せたE.Coli溶解物とこの血清を組み合わせることにより、自己血清からE
.Coliについて内因性である分子に対する抗体を除去した。
【0013】 次いで、この除去済み血清を希釈し、そしてファージプラークを含有するニト
ロセルロース膜と混合させた。前記プラークを、室温で一晩インキュベートした
。次に洗浄し、フィルターをアルカリフォスファターゼと共役させた結合ヤギ抗
ヒトFCλ二次抗体とインキュベートさせて、次いで反応性ファージプラークを
、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォスファターゼおよびニトロブル
ーテトラゾリウムとインキュベーションすることにより可視化させた。全部で1
3の陽性クローンを見出した。
【0014】 例2 同定後、前記反応性クローンを、希釈クローニングを介してモノクローナルに
サブクローン化させ、次いでヒト血清を使用してテストした。これらのクローン
を、次いで精製し、インビトロで切除し、次いで製造業者の指示を使用して、p
BK−CMVプラスミドに変換させた。次に、インサートされたDNAを、Ec
oRI−XbaI制限マッピングを使用して異なるインサートを判定するために
評価した。約500〜約1.3キロベース対のサイズの範囲の8つの異なるイン
サートを同定した。これらのクローンを、ABI PRISM自動シーケンサー
を使用して配列決定した。
【0015】 表1にその結果を示す。一つの遺伝子は、4つのオーバラップするクローンに
よって示し、第2のものは3つのオーバラップするクローンによって示し、そし
て残りの6つのものは一つのクローンのみによって示した。
【0016】 相同性検索によって、NY−ESO−2,3,5,7と称されるクローンが既
知であることが示された。エリセット(Eliset)等,J.Endocri
n.Invest.16:533−540(1)93);スプリッツ(Spri
tz)等,Ncl.Acids Res.15:10373−10391(19
87);ラビッツ(Rabbits)等,Nature Genetis 4:
175−180(1993);クロザット(Crozat)等,Nature3
63:640−644(1993);GenBank H18368及びD25
606を参照のこと。これらクローンの内の二つ(NY−ESO−3およびNY
−ESO−6)は、様々な正常であるヒト組織中において発現されることが既に
示されている。系統制限の証拠はまだ見つかっていない。NY−ESO−6(c
DNA)は、FUS/TLS遺伝子の3‘未翻訳領域であると考えられる。本明
細書では報告されない実験に於いて、NY−ESO−6の配列決定とサザンブロ
ッティング分析によって、癌の転座又は点変異の証拠は示されなかった。これら
のクローンの内の4つ、即ち、NY−ESO−1,4,5及び8は、調べられた
データベース中の配列に対する強い相同性を示さなかったので、それ以上は調べ
られなかった。
【0017】
【表1】
【0018】 例3 NY−ESO1,4,5及び8クローンのmRNA発現を評価するために研究
を行った。これを行うために、300−400塩基対のcDNAセグメントを増
幅し、かつ、プライマー融解温度を65−70℃の範囲とするように、各配列に
対する特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。次に、市販の材料と
標準プロトコールとを使用して逆転写PCRを行った。様々な正常細胞タイプ及
び腫瘍細胞タイプをテストした。クローンNY−ESO−4及びNY−ESO−
8は遍在しており、それ以上は研究しなかった。NY−ESO−5は、本来の腫
瘍および正常食道組織中において高レベルの発現を示し、それが分化マーカーで
あったことを示唆した。
【0019】 NY−ESO−1は、精巣において腫瘍mRNAとして発現するが、正常な結
腸、腎臓、肝臓又は脳組織中では発現しないことが判った。この発現パターンは
、他の腫瘍拒絶抗原前駆体と一致している。
【0020】 例4 上述したRT−PCRアッセイを、NY−ESO1に関して、遥かに完全に揃
っている正常組織及び腫瘍組織について行った。表2,3及び4にこれらの結果
を示す。要約すると、NY−ESO1は、正常な精巣及び卵巣細胞中で高度に発
現することが判った。少量のRT−PCR産生物が正常な子宮筋層中において見
出されたが、子宮内膜では見出されず、その陽性の提示は一貫していなかった。
正常な食道及び皮膚を含む、種々の細胞タイプの扁平上皮もまた陰性であった。
【0021】 関連しない細胞系の腫瘍をテストした時、11の黒肉腫細胞系の内、2つが強
い発現を示し、67の黒肉腫標本の内16と、33の胸部癌標本の内の6つと、
4の膀胱癌の内の4つが強い発現を示した。その他の腫瘍タイプではまばらに発
現があった。
【0022】
【表2】
【0023】
【表3】
【0024】
【表4】
【0025】 癌患者の血清中における抗NY−ESO−1抗体の存在がELISAによって
測定可能であるか否かを確認するために更に別枠の実験を行った。
【0026】 詳述すると、濃度1ug/mlのコーティング緩衝溶液(15mM Na2
3,30mM NaHCO3,pH9.6,0.02% NaN3)中の組換え
NY−ESO−1を、マイクロウェルプレート(各ウェルにつき10ulの溶液
)に吸着させ、その後、4℃で一晩保存した。これらのプレートを、燐酸緩衝化
生理食塩水で洗浄し、10ul/ウェルの2%ウシ血清アルブミン/燐酸緩衝化
生理食塩水でブロックした。洗浄後、2%ウシ血清アルブミン中の10ul/ウ
ェルの希釈血清を前記ウェルに添加した。室温で2時間のインキュベーション後
、プレートを洗浄し、10ul/ウェルのヤギ抗ヒトIgG−アルカリ燐酸共役
体を、1:1500の希釈率で添加した。この溶液を室温で1時間インキュベー
トし、その後、洗浄し、前記アルカリフォスファターゼについての基質の溶液を
添加した(10ul/ウェル)。室温で25分間後、ウェルを、蛍光プレートリ
ーダーで読み取った。それらの結果を下記の表に示す。
【0027】 Eso1+/テスト総数 % 癌患者: 黒肉腫 12/127 9.4 卵巣癌 4/32 12.5 肺癌 1/24 4.0 乳癌 2/26 7.7 献血者 0/70 0
【0028】 腫瘍に於けるNY−ESO−1のmRNAの発現と、NY−ESO−1タンパ
ク質に対する免疫応答との間に相関性が存在するか否かを調べるために、62の
黒肉腫患者からのデータを比較した。その血清がNY−ESO1に対して反応性
である(即ち、NY−ESO−1に対する抗体を有している)患者はすべて、N
Y−ESO−陽性腫瘍も有していたのに対して、NY−ESO−1陰性腫瘍を有
する患者であり、一方で、その血清中にNY−ESO−1に対する抗体を示した
ものはいなかった。NY−ESO−1陽性患者は、ある比率でその抗体を欠如し
ていた。黒肉腫の内、約20−40%がNY−ESO−1を発現し、そしてNY
−ESO−1陽性腫瘍を有する患者のみが抗体を有していたことから、それらの
データは、NY−ESO−1陽性腫瘍を有する患者は高い確率で、そのタンパク
質に対する抗体を産生することを示唆し、従って、診断に於いて有用な広範囲な
アッセイと処理に対する応答性を示唆するものである。
【0029】 例5 次に、NY−ESO−1転写物のサイズを調べ、組織発現パターンを確認する
ためにノザンブロッティング分析を行った。オースベル(Ausbel)等,C
urrent Protocols In Molecular Biolog
y (John Wiley & Sons,1995)の方法を使用した。具
体的には、各レーンにつき、20ugの全RNAを、ホルムアミドおよびホルム
アルデヒドを含有する緩衝液に溶解させ、65℃に加熱し、その後、3%ホルム
アルデヒドで1.2%アガロースゲルにおいて分離させ、ニトロセルロース紙へ
移した。次に、32P標識化プローブを使用してハイブリダイゼーションを行い、
その後、高いストリンジェントで洗浄した。最終洗浄を、0.1×SSC、0.
1% SDSで60℃で15分間行った。
【0030】 精巣および前述のアッセイに於いてNY−ESO−1に対し陽性であった黒肉
腫細胞系(SK−MEL−19)由来のRNAは、約0.8〜0.9kbのRN
A転写物を示した。食道肉腫標本は、0.4−0.9kbの範囲中でスミアを示
し、部分的な減少を反映している。テストした別の組織又は細胞系由来のRNA
は転写体を示さなかった。
【0031】 完全な転写物をコードするcDNAを得るために、プラークハイブリダイゼー
ションと、ハイブリダイゼーションプローブとして本来のcDNAクローンとを
使用して、前記食道cDNAライブラリーを再スクリーニングした。3×105
のクローンをスクリーニングした時、6つの陽性を見出した。三つの最も長いク
ローンを配列決定した。オープンリーディングフレームの分析は、これら三つの
すべてが、全コード化領域と、可変サイズの5‘未翻訳領域とを含むことを示し
た。長さが755塩基対(ポリAを除く)の最も長いクローンは、543ベース
対のコード化領域と、5’末端の53の未翻訳塩基と、3‘末端の151の未翻
訳ベース対とを有している。配列識別番号1を参照のこと(図3も参照)。
【0032】 この長いORFは、NY−ESO−1タンパク質の推定配列が180のアミノ
酸であることを示した。この一つの免疫陽性クローンは、これらの内の173を
コードする配列を含んでいた。推定分子量は17,995ダルトンである。
【0033】 分析は、N−末端部中にグリシン残基が多く存在する(最初の80の内の30
と、残りの100の内の4)ことを示している。親水性分析によって、疎水性配
列と親水性配列とが交互に出現し、長いC−末端疎水性テール部で終結し(アミ
ノ酸152−172)、その後、短い親水性のテール部が続く、前記分子のN末
端半分中に親水性抗原性配列が存在することが示された。このパターンは膜貫通
ドメインであることを示唆する。複数の潜在的なN−ミリストリル化部位と、3
つの燐酸化部位が存在するが、N−グリコシル化部位の証拠は存在しない。
【0034】 例6 黒肉腫細胞系「NW−MEL−38」は、1995年、悪性黒肉腫を患う患者
から樹立された。その被験者から、血清サンプル、末梢血液リンパ球、及び腫瘍
サンプルが採取され、本明細書に記載される研究が行われるまで凍結された。こ
の患者に於ける抗腫瘍T細胞応答を評価することを見越して、この患者のHLA
型は、HLA−A1及びHLA−A2であると判定された。
【0035】 この患者由来の黒肉腫が、NY−ESO−1を発現するか否かを決定するため
に、標準方法を使用して腫瘍サンプルと細胞系NW−MEL−38との両方から
全RNAを単離した。次に、再び標準方法を使用して、2マイクログラムの前記
全RNAをcDNA合成に供した。
【0036】 次に、前記cDNAを下記のプライマーを使用してRT−PCR実験に使用し
た。
【0037】 5‘−CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG
G’−3‘(配列識別番号2)、及び CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG
−3‘(配列識別番号3)。
【0038】 これらのプライマーは、ヌクレオチド271〜599に渡る配列識別番号1のセ
グメントを増幅するはずである。
【0039】 60℃のアニーリング温度を使用して、増幅を35サイクルに渡って実施した
。そのPCR生成物を臭化エチジウム染色によって、1.5%アガロースゲルに
おいて可視化させた。
【0040】 その結果は、前記腫瘍と細胞系との両方が配列識別番号1を発現したことを示
した。これらの細胞系および腫瘍サンプルを後の実験に使用した。
【0041】 例7 次に、上述した前記単離cDNA分子を使用して組換えタンパク質を作製した
。具体的には、前記cDNAを、標準的方法を使用してPCR増幅し、次に、H
isタグを含む市販のプラスミドベクター、即ちpQE9にクローニングした。
ここでは詳述しない作業に於いては、第2のベクターであるpQE9Kも使用し
た。これは、アンピシリン耐性ではなくカナマイシン耐性がpQE9Kに付与さ
れている点でPQE9とは異なる。
【0042】 前記プラスミドベクターで、E.coli株XL1−Blueを形質転換し、
陽性の形質転換体を制限マッピング及びDNA配列決定によって同定した。組換
えタンパク質の生成をイソプロピルβ−D−チオガラクトシドを使用して誘導さ
せ、タンパク質を周知の手順に従って、Ni2+イオンクロマトグラフィーカラム
で精製した。次に、15%SDS−PAGEと銀染色により分析したところ、こ
のタンパク質は、約22キロダルトンの分子量のタンパク質であると同定された
。このことは、その配列から予想されるタンパク質のサイズと一致している。他
の二つの形態の組換えタンパク質もまた同定された。これらは、配列認識番号1
において報告された、アミノ酸10−180およびアミノ酸10−121から成
る。それらは、上述のように実施されたSDS−PAGEによって、約14kD
および20kDの分子量をそれぞれ有する。
【0043】 NY−ESO−1をバキュロウイルス中で発現させるためにさらなるセットの
実験を行った。詳述すると、NY−ESO−1のcDNAインサートを、Bam
HIとHindIIIでの開裂によって、前記pQE9ベクターから分離させた
。このインサートを、次に、予め同じ酵素によって開裂させた市販のバキュロウ
イルスベクターにサブクローニングした。標準的方法を使用して陽性クローンを
判定し、これらをレシピエントSf9細胞へトランスフェクトさせた。次に、組
換えウイルスを使用して、10%ウシ胎仔血清を添加した標準媒体(IPL−4
1)を使用して昆虫細胞を感染させた。この作業の感染多重度は20であった。
組換えタンパク質の発現を前述したように判定した。このベクターにおいて生成
された組換えタンパク質はHisタグを有することから、前述と同様に、Ni2+ アフィニティカラムで精製した。前記タンパク質は、10−180アミノ酸から
成り、SDS−PAGEにより、20kDの分子量を有している。
【0044】 次に、別の真核生物トランスフェクト細胞を作製した。これを行うために、前
記NY−ESO−1をコードする配列を上述のpQE9ベクターから単離し、次
に、真核発現ベクターであるpcDNA3.1のBamHI−HindIII部
位にクローニングした。次に、150ngの前述したプラスミドと、150ng
の、HLA−A2.1のcDNA又は、HAL−A1のcDNAのいずれかを含
有したプラスミドpcDNA 1Ampに細胞サンプルを接触させることによっ
て、このベクターをCOS−7細胞にトランスフェクトさせた。周知であるDE
AE−デキストランクロロキン法を使用した。次に、それらの細胞を37℃で4
8時間インキュベートし、その後、それらをCTL刺激アッセイでテストした。
具体的には、そのアッセイは、本明細書において参考文献として援用されるトラ
ヴァーサリ(Traversari)等,Immunogenetics 35
:145−148(1992)に従った。簡単に説明すると、100%ヒト血清
を添加した100ulのRPMI中の2500のCTL(NW38−IVS−1
、後述の例9を参照のこと)を、COS−7トランスフェクタントを含有するマ
イクロウェルに添加した(20,000細胞/ウェル)。24時間後、50ul
の上清を各ウェルから収集し、そしてTNF−αのレベルを標準的アッセイによ
り測定した。即ち、WEHI164クローンの13の細胞に対する細胞傷害性に
ついて、MTTを使用してテストした。陽性の細胞を、以下の例に記載されるよ
うにウエスタンブロット分析に使用した。
【0045】 使用したCTLは、本明細書において参考文献として援用されるクヌート(K
nuth)等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3511
−3515(1984)に従って調製されたCTL NW38−IVS−1であ
った。具体的には、前記被験者から採取された105の自己由来NW38 ME
L−1腫瘍細胞と、106の末梢血液リンパ球とを組み合わせた混合リンパ球T
細胞培養物を作成した。サイトカインであるIL−2を添加し、この混合培養物
を、1週間37℃でインキュベートした。腫瘍細胞を除去し、5x105の腫瘍
細胞の新たなアリコートをIL−2と一緒に添加した。このプロセスを、51Cr
標識化NW−MEL−38細胞に対してテストした場合において強力な応答が見
出されるまで、毎週繰り返した。応答性T細胞を収集し、後の実験で使用するま
で凍結させた。
【0046】 例8 次に、上述した血清サンプル、更に、上述した細胞系であるNW−MEL−3
8から採取された細胞溶解物、および前述したCOS−7トランスフェクタント
(前述)、ならびに精製組換えタンパク質(これもまた前述)を使用して、ウエ
スタンブロット分析を行った。血清サンプルを、患者の治療の様々な時点で採取
した。その結果において相違はなかった。
【0047】 これらのアッセイに於いて、1ugの組換えNY−ESO−1タンパク質、又
はいずれかのタイプの5ulの細胞溶解物をSDSで希釈して5分間煮沸し、1
5%のSDSゲルで電気泳動した。ニトロセルロース(0.45um)上で一晩
ブロッティングし、3%のBSAによりブロッキングした後に、そのブロット物
を血清とインキュベートさせて1:10,000と1:100,000とに希釈
し、或いは、陽性コントロールとして、NY−ESO−1に対するモノクローナ
ル抗体と、1:50に希釈した。前記モノクローナル抗体は、本明細書において
参考文献として援用され、以下に詳述するチェン(Chen)等,Proc.n
atl.Acad.Sci.USA5915−5919(1996)に従って作
成した。BALB/Cマウスを、2−3週間の間隔で組換えNY−ESO−1タ
ンパク質による5回の皮下注射によって免疫した。前記免疫処方物は、アジュバ
ント中に50ugの組換えタンパク質を含有していた。第1回目の注射は完全フ
ロイントアジュバントを使用し、以降は不完全フロイントアジュバントを使用し
た。前記免疫化されたマウスから脾臓細胞を採取し、マウス黒肉腫細胞系SP2
/0と融合させてハイブリドーマを作製した。代表的なハイブリドーマであるE
978をmAbsの作成に使用した。
【0048】 ハイブリドーマを一旦作成すると、それらをクローン化し、その上清をマイク
ロタイタープレート上で標準固相ELISAを使用して組換えタンパク質をスク
リーニングした。アッセイは、本明細書において参考文献として援用されるディ
ッポルド(Dippold)等,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A77:6114−6118(1980)に従った。組換えNY−ESO−1を
使用して一連の陰性コントロールも実施した。上述のE.coliによって生成
された組換えタンパク質に結合された血清抗体を、1:10,000希釈率でア
ルカリフォスファターゼで標識化したヤギ抗ヒトIgGを使用して可視化し、次
いでNBT−ホスファートで可視化した。未トランスフェクトCOS−7細胞も
コントロールとして使用した。健常な個人由来の血清もコントロールとして使用
した。
【0049】 1:100,000もの低い血清希釈物に於いて組換えタンパク質に対する強
い反応が見られ、NW−MEL−38の溶解物に対する反応もまた見出された。
未トランスフェクトCOS−7細胞に対する反応は無く、健常な個人由来の血清
も反応性を示さなかった。
【0050】 例9 4つの形態のNY−SO−1は、上述したもの、即ち、coli中で配列
識別番号1によって生成された形態と、アミノ酸10−180から成る形態と、
アミノ酸10−121から成る形態と、アミノ酸10−180から成る、上述し
たバキュロウイルス系中で発現された形態のものである。各形態を前述のプロト
コルに従って、ELISAに使用した。全ての形態のタンパク質は、様々な患者
から採取された抗体、又は前述したマウスモノクローナル抗体に対して同様に反
応性であることが見出された。
【0051】 例10 上述したCOS−7トランスフェクタントのテスト、及びこの例において記載
されるアッセイに於いて、細胞溶解性T細胞系である「NW38−IVS−1」
を使用した。この「CTL」は、前記腫瘍細胞系であるNW−MEL−38を使
用して、上述の末梢血液リンパ球のインビトロ刺激によって作成された。これは
標準的方法を使用して行われた。
【0052】 前記CTLを、NY−ESO−1陽性及びHLA−A2陽性である二つの異種
性の細胞系(SK−MEL−37及びMZ−MEL−18)と、MHCクラスI
陰性の細胞系(SK−MEL−19)と、HLA−A2陽性ではあるが、NY−
ESO−1陰性である細胞系(NE−MEL−145)、更に、コントロール細
胞系であるK562及び自己由来のフィトヘマグルチニン刺激芽細胞(blas
ts)と共に、NW−MEL−38(これは、HLA−A1,A2陽性で、NY
−ESO−1陽性であった)との、細胞傷害性アッセイに使用した。種々のエフ
ェクター/標的比率を使用して、51Cr標識化標的細胞の溶解が測定されたパラ
メータであった。図5にこれを示す。
【0053】 その結果は、CTL NW38−IVS−1が、自己由来細胞系NW MEL
−38と、HLA−A2及びESO−1陽性である前記異系細胞系の両方を溶解
することを示した。従って、前記CTLは、異系物質に対して反応性であった。
図6を参照のこと。
【0054】 例11 患者NW38はHLA−A1陽性及びHLA−A2陽性であったので、どちら
のMHC分子が提示分子であるかを判定するために実験を行った。
【0055】 COS−7細胞における上述と同じ実験を行った。但し、これらの実験では、
HAL−A1cDNA又はHLA−A2cDNAの両方ではなく、いずれか一方
により形質転換された共形質転換の別々の群が得られることに留意した。これら
の結果は、CTL NW38−IVS−1は、NY−ESO−1およびNLA−
A2のみとを含むCOS−7トランスフェクタントを溶解したことを示す。図6
を参照のこと。この作業によって前記CTLの特異性もまた確認された。なぜな
ら、例9に記載したNY−ESO−1陰性細胞、HLA−A2陽性細胞は、HL
A−A2分子によって提示されるペプチドにプロセッシングされることが既知の
他の分子に対し陽性であったからである。
【0056】 例12 前記提示MHC分子がHAL−A2であると同定された後、このモチーフを満
たす全てのペプチドを同定するために、本明細書において参考文献として援用さ
れるダマロ(D‘Amaro)等,Human Immunol.43:13−
18(1995)及びドレイフホウト(Drijfhout)等,Human
Immunol.43:1−12(1995)によって示されるモデルを使用し
て、NY−ESO−1に対するアミノ酸配列のスクリーニングを行った。それに
よって推定されるアミノ酸配列の全てに対応するペプチドを、標準的技術を使用
して合成し、次に、それらを、本明細書において参考文献として援用されるクヌ
ート(Knuth)等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:
3511−3515(1984)に従って、細胞傷害性アッセイに使用した。具
体的には、細胞系であるCEMX721.174.T2(以降「T2」)を使用
した。なぜなら、これは、抗原をMHC複合化ペプチドにプロセッシングせず、
従って、本明細書に記載されるタイプの実験に理想的であるからである。T2細
胞のサンプルを標準的方法を使用して100uCiのNa(51Cr)O4で標識
化し、3回洗浄し、その後、10ug/mlのペプチドおよび2.5ug/ml
のβ2−ミクログロブリンとインキュベートさせた。インキュベーションを、室
温で1時間行った。次に、応答細胞(100ulのCTL NW38−IVS−
1の懸濁物)を、90:1のエフェクター/標的率で添加し、5%のCO2を含
む37℃の水飽和雰囲気中で4時間インキュベートした。その後、プレートを、
200×gで5分間遠心分離し、100ulの上清を除去して放射能を測定した
51Cr放出の比率を、既知であるストラテジーに従って測定した。ペプチドS
LLMWITQCFL(配列識別番号4)、SLLMWITQC(配列識別番号
5)及びQLSLLMWIT(配列識別番号6)がCTLの三つの最良の刺激物
質であることが見出された。これに匹敵する結果が、前述したように、細胞系N
W−MEL−38およびSK−MEL−37およびMZ−MEL−19を標的と
して使用した場合において見出された。
【0057】 例13 配列識別番号1によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、HLA結
合モチーフに対応するペプチド配列について分析した。これは、本明細書におい
て参考文献として援用されるパーカー(Parker)等,J.Immunol
.142:163(1994)に教示されているアルゴリズムを使用して行われ
た。下記の表に於いて、前記アミノ酸配列と、それが結合すると推定されるHL
A分子と、配列識別番号1中の位置が示されている。得られた複合体は、細胞溶
解性T細胞応答を誘発させるはずである。これは、本明細書において参考文献と
して援用されるファン・デア・ブルッゲン(van der Bruggen)
等,J.Eur.Immunol.24:3038−3043(1994)によ
って教示されている下記の方法を使用して当業者により測定することが可能であ
ろう。
【0058】
【表5】
【0059】 例14 別の関連するペプチドを更に同定するためにさらなる実験を行った。これらの
実験に於いて、安定腫瘍細胞系、即ち、MZ−MEL−19を使用した。この細
胞系は、本明細書において参考文献として援用されるイェーガー(Jaeger
)等,J.Exp.Med187:265−269(1998)によって記載さ
れている方法を使用して、MZ19と称される患者から樹立されていたものであ
る。細胞溶解性T細胞系、即ち、MZ2−MEL 19−IVS−1もまた、M
Z−MEL−19と、上述の例7と、更に、前出のイェーガー(Jaeger)
等の記載される方法を使用して樹立された。このCTLは、前記自己由来細胞系
をHLA−A2規制的様式に溶解した。これは標準的な方法を使用して測定され
た。前出のダマロ(D‘Amaro)等によって記載されたモデルを使用して、
ESO−1中のHLA−A2結合モチーフを満たすすべての配列を同定した。こ
の方法によって26のペプチドを同定した。標準方法を使用して全てを合成し、
精製し、そして完全性をテストした。次に、これらのペプチドを合成し、下記の
実験でテストした。MZ19−IVS−1を、例12に記載のT2細胞と共に使
用した。配列識別番号4と5のペプチドがHLA−A2分子に結合し、CTL
MZ19−IVS−1によって認識され、CTL MZ19−IVS−1は前記
細胞を溶解した。このCTLもまた、HLA−A2および下記のデカペプチドの
複合体を認識した。
【0060】 LLMWITQCFL (配列識別番号7)、これは、配列識別番号1の156−167の部位において
見出される。
【0061】 例15 CD4+ヘルパーT細胞が、MHCクラスII分子とペプチドからなる複合体
を認識するか否かを調べるためにさらなる実験を構成した。
【0062】 腫瘍細胞系MZ−MEL−19は、HLA−DR53陽性であるとして既に分
類されている。従って、NY−ESO−1を、HLA−DR53の結合モチーフ
を教示している、本明細書において参考文献として援用されるフタキ(Futa
ki)等,Immunogenetics 42:299−301(1995)
を使用してスクリーニングした。全部で28のペプチドが、理論的にはHLA−
DR53および抗原提示細胞のみに結合するとされた。
【0063】 末梢血液リンパ球(「PBL」)を、HLA−DR53陽性として型分類され
ていた、転移性黒肉腫を有する2人の患者から単離した。
【0064】 この型分類は、標準的な市販される試薬を使用して行われた。一人の患者は、
HLA−DRB1(対立遺伝子1501−05,1601−1603,1605
及び0701)、HLA DRB4*(対立遺伝子(0101−0103)及び
DBR5*(対立遺伝子0101)に対して陽性であると分類し、一方で第2の
患者は、HLA−DRB1*(対立遺伝子1401,1407,1408及び0
901)、HLA−DRB3*(対立遺伝子0201−0203)及びDRB4
*(対立遺伝子0101−0103)に対して陽性であると分類した。HLA−
DRB4*の全ての対立遺伝子を、本明細書において参考文献として援用される
ボドマー(Bodmer)等,Human Immunol 34:4−18(
1992)に従って、HLA−DR53と称する。
【0065】 前記PBLを、CD4+及びCD8+ Tリンパ球を除去するために適切な抗
体でコーティングされた磁気ビードで処理した。残りの細胞を、4x106細胞
/ウェルの割合で24ウェルプレートに播種し、ウェルのプラスチックに24時
間付着させた。付着していない任意の数の細胞を除去し、残りの細胞を抗原提示
細胞として使用した。これらの細胞を、5ug/mlの抗癌マインターフェロン
抗体で、一晩4℃で予めコーティングしておいた96ウェルの平底ニトロセルロ
ースプレート中で、GM−CSF(1000U/ml)とIL−4(1000U
/ml)によって刺激した。細胞を3.5x105細胞/ウェルの割合で播種し
た。
【0066】 次に、前記細胞に,4ug/ウェルのテストペプチド、又は、コントロールと
して2ug/ウェルの前記完全NY−ESO−1タンパク質をパルス供給(pu
lsed)した。
【0067】 次に、CD4+T細胞を、10%ヒト血清、L−アスパラギン(50mg/l
)、L−アルギニン(242mg/l)及びL−グルタミン(300mg/l)
を、2.5ng/mlのIL−2と共に添加して100ulの最終容量としたR
PMI1640培地に(1x105)細胞/ウェルの割合で添加した。
【0068】 この混合物を、水飽和雰囲気中で37℃で48時間インキュベートした。その
後、プレートを、0.05%のTween20/PBS溶液で6回洗浄し、次に
、ビオチン処理抗インターフェロンγ抗体を0.5ug/mlで添加した。前記
抗体を、37℃で2時間インキュベートし、その後、プレートを標準試薬で1時
間展開させた。基質である3−エチル−9−アミノカルバゾールを添加して、次
いで5分間インキュベートし、陽性は赤色スポットで示された。赤色のスポット
/ウェルは、ペプチドとHLA−DR53からなる複合体、又はHLA−DR5
3と組換えNY−ESO−1からプロセッシングされたペプチドからなる複合体
を認識したCD4+Tリンパ球の出現頻度の指標である。コントロールとして、
試薬のみ(即ち、CD4+細胞のみ)および前記(細胞)系のみを使用してアッ
セイを行った。
【0069】 下記のペプチドが、CD4+Tリンパ球を感作して、γインターフェロンを放
出させることが見出された。
【0070】 AADHRQLQLSISSCLQQL VLLKEFTVSGNILTIRLT PLPVPGVLLKEFTVSGNI (配列識別番号8−10)。
【0071】 これらの三つのペプチドは、Ala又はSerの三つの下流側残基の手前の、
Tyr,Phe,Trp,又はLeuの固定残基であり、前出のフタキ(Fut
aki)等によって記載されたHLA−DR53に結合するためのモチーフを満
たす。
【0072】 HLA−DR53に結合するさらなるペプチドを見出した。
【0073】 これらのペプチドは以下のものである: GAASGLNGCCRCGARGPE SRLLEFYLAMPFATPMEA TVSGNILTIRLTAADHRQ (配列識別番号11−13)。
【0074】 上記例は、食道癌関連抗原をコードする核酸分子の単離を記載するものである
。本明細書において、「関連」という用語を使用する理由は、その関連する分子
が、その抗原を発現する、食道癌、黒肉腫、乳癌、前立腺癌及び肺癌等のその他
の癌により発現されることが明らかであるからである。
【0075】 本発明は、記載した抗原をコードし、かつストリンジェントな条件下で基準配
列である配列識別番号1にハイブリダイズする核酸分子に関する。本明細書にお
いて使用される、「ストリンジェントな条件」とは、米国特許第5,342,7
74号に詳述されているような条件、即ち、65℃で18時間のハイブリダイゼ
ーション、次いで2xSSC、0.1%SDSでの1時間の洗浄を4回、次いで
0.2xCCSでの最終洗浄であり、より好ましくは、0.1xSSC、0.1
%SDSで30分間での最終洗浄であり、更に、同レベルのストリンジェンシー
を提供する更なる条件、ならびによりストリンジェントな条件についていう。
【0076】 本発明の一部はまた発現ベクターであり、これはプロモーターに作動可能連結
(すなわち、作動可能に連結された)様式である本発明の核酸分子を組み込んだ
ものである。このようなベクターの構築は、当業者に周知に範囲にあり、目的の
分子をコードする真核細胞系、又は原核細胞株を生成するための細胞の形質転換
又はトランスフェクションもまた同様である。この様式において使用され得る宿
主細胞の具体例は、COS細胞、CHO細胞、酵母細胞、昆虫細胞(たとえば、
Spodoptera frugiperda)、NIH3T3細胞等である。
E.coli等の原核細胞及びその他の細菌もまた使用され得る。
【0077】 本発明の一部はまた、本来のペプチド形態および翻訳後修飾形態の両者の本明
細書において記載される抗原、ならびに配列認識番号1によりコードされるタン
パク質の、少なくとも10−121アミノ酸であり、そして10−180より少
ないアミノ酸を含むタンパク質である。前記分子は、任意の翻訳後修飾無しで、
抗原的となりうるのに十分な大きさであり、したがって、前駆体および翻訳後修
飾形態との両方で、アジュバント(又はアジュバント無し)と組み合わせされて
免疫原として有用である。これらのタンパク質は、前述したように、血清や血液
等のサンプル中に抗体が存在するか否かを判定するのに使用することができる。
この抗原を使用して生成された抗体もまた、ポリクローナル抗体とモノクローナ
ル抗体との両方のものを含めて、本発明の一部を構成するものであり、そして前
記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもまた同様である。これらは後
述するように、全分子または部分として治療用又は診断用に使用することが可能
である。Fab,F(ab)2‘等の反応性フラグメント、及びその他のフラグ
メント、更に、キメラであるヒト化抗体、組換え産生抗体等もまた本発明の一部
を構成する。特に好適であるのは、完全な抗体であるが相補性決定領域である「
CDRS」がヒトであるがCDRがマウスであるキメラである。
【0078】 開示から明らかなように、本発明のタンパク質及び核酸分子を診断用に使用す
ることが可能である。本明細書に記載のSEREX方法論は、疾病関連抗原に対
する免疫反応を前提としている。従って、例えば、被験者の血清のような体液サ
ンプルのテスト経るように、それ自身の抗体との反応性についてアッセイするこ
とができる。反応性は、その疾病の存在の可能性の指標と見なされ、従って、当
業者に周知であり、かつ本明細書において詳述する必要のない標準核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイによって抗原の発現をアッセイすることもまた可能であ
り得る。標準免疫アッセイを使用して、被験者の分子に対する抗体をアッセイす
ることも可能であろう。
【0079】 配列識別番号1の分析は、その中に5‘非コード化領域及び3’非コード化領
域がその内部に示されていることを示すであろう。本発明は、少なくともそのコ
ード化セグメント、即ち、ヌクレオチド54−593を含み、かつ、配列識別番
号1のヌクレオチド1−53および/又は594−747のいずれか又は全部を
含みうるような単離核酸分子に関する。
【0080】 更に分析すると、前述したように、前記分子は、細胞溶解性T細胞による溶解
を誘発するペプチドにプロセッシングされることが明らかとなる。例7は、いか
にこのタイプのモチーフ分析をHLA−A2分子に関して行うことが可能である
かを示した。種々のMHC分子又はHLA分子のモチーフに関して多大な研究が
行われており、それをここで適用することが可能である。従って、本発明の更に
別の態様は、患者の腫瘍細胞の表面上でHLA分子に結合し得る1つ以上のペプ
チドが、その患者に対して、MHC分子/HLA分子に結合し、T細胞による溶
解を誘発させるのに十分な量が投与される治療法に関する。HLA−A2分子に
ついて前述された例示は、使用され得るこの投与の唯一のタイプではない。上述
したような他のHLA分子についての組み合わせのように、いかなる組み合わせ
のペプチドもまた使用可能である。単体で、又は組み合わせで使用可能であるこ
れらペプチド、及び完全なタンパク質又はその免疫反応性部分を、経静脈、皮内
、皮下、経口、直腸、及び経皮投与等の任意の種類の標準投与方法でそれを必要
とする被験者に投与することができる。標準製薬キャリア、例えばサポニン等の
アジュバント、GM−CSF及びインターロイキン等もまた使用することができ
る。更に、これらのペプチド及びタンパク質を、列挙された材料とワクチンに処
方され得、樹状細胞、又は関連するMHC/ペプチド複合体を提示するその他の
細胞も同様である。これらのペプチドはまた、本明細書において参考文献として
援用されるダンバー(Dunbar)等,Curr.Biol.8:413−4
16(1998)に記載されているもののような、4つのペプチド/MHC/ビ
オチン複合体が、ストレプトアビジン又はアビジン分子に付着しているHLA/
ペプチドの多重結合複合体を形成するために利用可能である。そのような複合体
は、T細胞前駆物質の同定および/又は刺激に使用することが可能である。
【0081】 同様に、本発明は、NY−ESO−1をコードする前記核酸分子が、アデノウ
イルスベースのベクターのようなベクターに組み込まれ、それを、ヒト細胞のよ
うな真核細胞にトランスフェクト可能とする治療法も意図している。同様に、前
記1つ以上のペプチドをコードする核酸分子をこれらのベクターに組み込み、次
いでそれらを核酸ベースの治療法の主要な構成部分としてもよい。
【0082】 これらのアッセイのいずれもまた、進行/緩解研究にも使用可能である。前記
タンパク質のレベル、その発現等をモニタし、前述した方法のいずれか又は全部
を使用するだけで、NY−ESO−1の発現を含む異常性の経過をモニタするこ
とができる。
【0083】 これらの方法は、治療用レジメの有効性を追跡するのに使用可能であることが
明らかであろう。その本質は、前述したアッセイのいずれかを使用して、NY−
ESO−1タンパク質のベースライン値を採り、所与の治療剤を投与し、次いで
ESO−1のレベルの変化を、その養生レジメの有効性の指標として観察して、
その後のタンパク質のレベルをモニターできるということである。
【0084】 前述したように、本発明は、とりわけ、NY−ESO分子に対する「統合され
た」免疫応答の認識に関する。この一つの派生的利用法は、癌治療の経過をモニ
ターする能力である。本発明の一部を構成するこの方法に於いて、その治療を必
要とする被験者は、本明細書に記載のタイプのワクチン接種を受ける。そのよう
なワクチン接種によって、たとえば、その細胞上にHLA/ペプチド複合体を提
示する細胞に対するT細胞応答を生じる。この応答はまた、恐らくは、T細胞に
よる細胞の溶解による抗体誘発性タンパク質放出を生じる抗体反応も含む。従っ
て、免疫応答をモニタすることによって、ワクチンの効果をモニタすることがで
きる。前述したように、抗体力価又はT細胞係数値をワクチンによる改善の指標
として採ることができ、又、その逆も可能である。従って、本発明の更に別の態
様は、そのワクチン自身又は、ワクチンがその一部分である巨大分子に対して特
異的である被験者における抗体レベルを決定することによって、その投与後のワ
クチンの有効性をモニタする方法に関する。
【0085】 ワクチンの効果はまた、そのワクチンを接種した被験者のT細胞反応をモニタ
ーすることによっても決定することができる。これらのインビトロ刺激T細胞の
前駆物質発生頻度を測定するために、多くのアッセイを使用することが可能であ
る。それらのアッセイとしては、クロム放出アッセイ、TNF放出アッセイ、I
FNγ放出アッセイ、ELISPOTアッセイ等を含むがこれらに限定されない
。前駆T細胞発生頻度の変化は、測定され得、そしてワクチンの有効性と関連付
けられ得る。使用されるその他の方法は、MHC/ペプチドの多重結合複合体の
使用を含む。そのような複合体の一例は、本明細書において参考文献として援用
されるダンバー(Dunbar)等,Curr.Biol.8:413−416
(1998)のHLA/ペプチド−ビオチン−ストレプトアビジン四量体の系で
ある。
【0086】 癌等の疾病状態に関与するNY−ESO−1の同定はまた、上述した方法の他
に多くの治療アプローチを示唆している。上述した実験は、タンパク質の発現に
応答して抗体が産生されることを確証するものである。従って、本発明の更なる
実施例は、NY−ESO−1タンパク質の変異又は異常レベルによって特徴付け
られる状態を、ヒト化抗体、抗体フラグメント等の抗体の投与を介して治療する
ことに関する。これらは、適切な細胞増殖抑制性(cystostatic)又
は細胞溶解性試薬によってタグ付加又は標識化することができる。
【0087】 T細胞を投与することもまた可能である。尚、T細胞は、樹状細胞、リンパ球
等の免疫反応性細胞、またはその他の免疫反応性細胞を使用して、インビトロで
顕在化し、その後、治療中の被験者に再潅流させることが可能であることも留意
のこと。
【0088】 尚、T細胞および/又は抗体の作成は、好ましくは非増殖性に処理され、前述
したエピトープ等の、応答のために関連T細胞又はB細胞を提示する細胞を投与
することによってもまた達成することができることに留意のこと。
【0089】 前記治療アプローチはまた、好ましくは長さが10〜100ヌクレオチドのア
ンチセンス分子が、「ニート(neat)」に、又はリポソーム等のキャリア中
で被験者に対して投与されて細胞中への導入を容易にし、次いでタンパク質の発
現を抑制するアンチセンス治療法もまた含むものとすることができる。そのよう
なアンチセンス配列はまた、ウイルスベクター(たとえば、ワクシニア)、既知
のBCGワクチン派生物等のバクテリア構築物などに組み込むことも可能である
【0090】 下記のコア配列を有し、 LLMWIT(配列識別番号14) 第1のL残基に対して、好ましくはセリンである、少なくとも一つの残基末端を
有し、最大三つの残基を有することが可能であり、セリンが、Lに連結されて−
SL−を形成し、C末端の0−4に追加されるアミノ酸が、前述したように、H
LA−A2分子に結合し、これによってCTL反応を誘発させるするものとして
定義される、ノナマー、デカマー、又はウンデカマーもまた本発明の一部を構成
する。これらのペプチドは、HLA−A2陽性であり、かつNY−ESO−1を
発現する患者への投与によって治療用として、或いは診断用、即ち、HLA−A
2陽性細胞が存在するか否か、又は関連するCTLが存在するか否かを調べるた
めなどに使用することができる。
【0091】 HAL−A2分子は、MHCクラスI分子であり、ペプチドとクラスI分子か
らなる複合体に応答するT細胞は、一般に、CD8+細胞である。別のサブセッ
トのT細胞であるCD4+細胞は、MHC−クラスII分子とペプチドからなる
複合体に反応し、自己由来の培養樹状細胞によって提示される組換えNY−ES
O−1に対するMHC−クラスII制限CD4+T細胞が、黒肉腫患者において
検出された。具体的には、本明細書には記載しない結果に於いて、CD4+T細
胞が、周知の技術を使用して、PBL又は血清サンプル由来の他の細胞から分離
された。次いで、それらをNY−ESO−1タンパク質をパルス処理された樹状
細胞と混合した。CD4+T細胞の増殖が観察され、本明細書で議論された別の
一面をもたらした。従って、本発明の更に別の態様は、これらのCD4+T細胞
と、MHC−クラスII分子に結合するペプチドと、それらの治療に於ける利用
とに関する。
【0092】 配列識別番号14の前記コア配列によって規定されるペプチドの具体例は、配
列識別番号7によって規定されるペプチドである。このペプチドは、示されてい
るように、HLA−A2分子に結合する。従って、それは、HLA−A2に対す
る「マーカー」であり、かつ前述したように、CTLの増殖を刺激するペプチド
/MHC複合体の成分でもある。
【0093】 前記例が示すように、ESO1は又、MHCクラスII分子、特にHLA−D
R53と複合化するペプチドにもプロセッシングされる。これらの分子は、Fu
takiら.,前出によって記載されたモチーフ、即ち、Tyr,Phe,Tr
p又はLeu、それに続く、Ala又はSerの三つのアミノ酸を満たすもので
ある。これらのペプチドは、少なくとも18アミノ酸長でなければならず、好ま
しくは、25アミノ酸長以下である。好ましくは、それらは、配列識別番号8,
9,10,11,12及び13等のように、18のアミノ酸から成る。これらの
ペプチドは、HLA−DR53陽性細胞を同定するために作用する。更に、配列
識別番号8,9及び10等のペプチドの場合においては、前記例で示したように
、これらはヘルパーT細胞の増殖を刺激するために使用することが可能である。
MHCクラスI制限ペプチドの上述した適用例の全ては、これらのクラスII制
限ペプチドに適用可能である。更に、免疫応答の性質は、MHC−クラスII/
ペプチド複合体と比較して、MHC−クラスI/ペプチド複合体では異なること
から、免疫組成物等として、これら両方のタイプのペプチドを組み合わせて、組
み合わされた免疫応答(combined immune response)
を発生させてもよい。このように、記載したすべての適用例は、クラスI制限ペ
プチドのみで、クラスII制限ペプチドのみで、又はこれらを組み合わせて使用
することができる。
【0094】 本発明のその他の特徴及び用途は、当業者にとって明白であり、ここでは記載
する必要がない。
【0095】 ここに使用した用語及び表現は、限定の用語ではなく記載の用語であり、これ
らの用語及び表現を使用するに当たって図示及び記載した特徴又はその一部のい
かなる均等物も除外する意図は無く、本発明の範囲内に於いて様々な改変が可能
であると理解される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 様々な組織タイプ中での、NY−ESO−1抗原のRNAの発現パターンを図示
している
【図2】 精巣と細胞系SK−MEL−18中には見つかったが、その他様々な細胞及び組
織サンプル中には見つからなかった、NY−ESO−1mRNAのノーザンブロ
ット分析を図示している
【図3】 NY−ESO−1の推定アミノ酸配列の推定修飾部位を図示している
【図4】 アミノ酸末端中の親水性ドメインと、カルボキシル末端の近傍の長い疎水性スト
レッチとを示す、NY−ESO−1の親水性プロットである
【図5】 HLA−2陽性、NY−ESO−1陽性、これら両方に対して陽性、又はこれら
のいずれに対しても陽性でない、様々な細胞を使用したCTL溶解研究の結果を
示している
【図6】 HLA−A2が配列識別番号1誘導ペプチドの提示のための提示分子であること
を証明するデータを示している
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 37/04 C07H 21/04 4C084 C07H 21/04 C07K 14/00 4C085 C07K 14/00 16/00 4H045 16/00 16/46 16/46 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/08 5/10 G01N 33/50 Z 15/09 ZNA C12R 1:91 C12P 21/08 A61K 37/02 G01N 33/50 C12N 5/00 A //(C12P 21/08 15/00 ZNAA C12R 1:91) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),AU,CA,C N,JP,KR,NZ,ZA (72)発明者 ストッカート,エリザベス アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021 ニューヨーク ヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者 イェーガー,エルケ ドイツ連邦共和国 デー‐60488 フラン クフルト・アム・マイン シュタインバッ ハー・ホール 2‐28 (72)発明者 チェン,ヤオ‐ツェン アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021 ニューヨーク 68ス・ストリート イース ト 525 (72)発明者 スキャンラン,マシュー アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021 ニューヨーク ヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者 アレクサンダー,クヌート ドイツ連邦共和国 デー‐60488 フラン クフルト・アム・マイン シュタインバッ ハー・ホール 2‐28 (72)発明者 オールド,ロイド,ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10105 ニューヨーク サード・アベニュー 605 (72)発明者 グア,アリ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021 ニューヨーク ヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者 リッター,ゲルト アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021 ニューヨーク ヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者 ドレイフホウト,ヤン オランダ 2300 ライデン (無番地) ユニバーシティ・ホスピタル ディパート メント・オブ・イミュノヘマトロジー・ア ンド・ブラッド・バンク Fターム(参考) 2G045 AA26 AA34 AA35 AA40 CA18 CB01 CB02 DA36 DA78 FB01 FB03 FB07 FB08 4B024 AA01 BA44 CA04 CA07 CA11 DA02 DA06 EA03 EA04 GA11 HA01 HA15 4B064 AG01 AG27 CA01 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA87X AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 4C057 BB02 BB05 DD01 MM04 4C084 AA02 BA44 CA18 DA02 NA14 ZB212 ZB261 ZB262 4C085 AA13 AA14 AA16 BB01 CC02 DD62 EE06 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA17 BA18 BA41 CA40 DA76 EA28 FA72 FA74

Claims (94)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 MHC−クラスIIのHLA−DR53分子に結合し、少な
    くとも18アミノ酸を含み、そして25より少ないアミノ酸を含む単離ポリペプ
    チドであって、該ポリペプチドは、少なくとも一つのHLA−DR53結合モチ
    ーフを有し、該モチーフは、4アミノ酸から成り、その第1のアミノ酸はTyr
    ,Phe,Trp又はLeuであり、その第4のアミノ酸はAla又はSerで
    ある、単離ポリペプチド。
  2. 【請求項2】 請求項1の単離ペプチドであつて、前記ペプチドは、該ペプ
    チドとHLA−DR53分子との複合体に対して特異的なCD4+細胞の認識と
    増殖とを刺激する、単離ポリペプチド。
  3. 【請求項3】 請求項1の単離ペプチドであって、18のアミノ酸から成る
    、単離ペプチド。
  4. 【請求項4】 請求項1の単離ペプチドであって、配列識別番号8,9,1
    0,11,12及び13から成る群から選択される、単離ポリペプチド。
  5. 【請求項5】 請求項4の単離ペプチドであって、配列識別番号8,9及び
    10から成る群から選択される、単離ペプチド。
  6. 【請求項6】 MHCクラスII分子HLA−DR53と配列識別番号8,
    9又は10との複合体に対して特異的な単離細胞溶解性T細胞。
  7. 【請求項7】 MHCクラスII分子であるHLA−DR53と請求項1の
    ポリペプチドから成る単離複合体。
  8. 【請求項8】 請求項6の単離複合体であって、前記ペプチドは配列識別番
    号8,9,10,11,12又は13である単離複合体。
  9. 【請求項9】 請求項1の単離ポリペプチドと、少なくとも一つのアジュバ
    ントを含む組成物。
  10. 【請求項10】 請求項9の組成物であって、前記ポリペプチドが、配列識
    別番号8,9又は10である組成物。
  11. 【請求項11】 請求項1の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列から成る単離核酸分子。
  12. 【請求項12】 請求項11の単離核酸分子であって、前記単離ポリペプチ
    ドは、配列識別番号8,9,10,11,12又は13である単離核酸分子。
  13. 【請求項13】 請求項11の単離核酸分子を含み、プロモーターに作動可
    能に連結された発現ベクター。
  14. 【請求項14】 配列識別番号8,9及び10により規定されるポリペプチ
    ドからなる少なくとも二つの混合物を含む組成物。
  15. 【請求項15】 請求項14の組成物であって、アジュバントを更に含む組
    成物。
  16. 【請求項16】 発現用キットであって、以下のそれぞれ別々になった部分
    を有する発現用キット: (i)請求項1の単離ペプチドをコードする単離核酸分子;及び (ii)HCA−DR53分子をコードする単離核酸分子。
  17. 【請求項17】 請求項11の単離核酸分子を含む組換え細胞。
  18. 【請求項18】 請求項13の発現ベクターを含む組換え細胞。
  19. 【請求項19】 ヘルパーT細胞の増殖を刺激する方法であって、T細胞含
    有サンプルを、MHC−クラスII分子であるHLA−DR53と請求項5のペ
    プチドからなる複合体を認識するヘルパーT細胞の増殖を刺激するために十分な
    量の前記複合体と接触させる工程を含む方法。
  20. 【請求項20】 請求項19の方法であって、前記複合体は細胞の表面上に
    ある方法。
  21. 【請求項21】 請求項20の方法であって、前記細胞が投与される被験者
    に対して自己由来性の細胞である方法。
  22. 【請求項22】 請求項20の方法であって、前記細胞は非増殖性である方
    法。
  23. 【請求項23】 請求項20の方法であって、前記細胞は組換え細胞である
    方法。
  24. 【請求項24】 請求項19の方法であって、前記複合体は自由形態である
    方法。
  25. 【請求項25】 ヘルパーT細胞の増殖を刺激する方法であって、請求項5
    からなる少なくとも一つのペプチドを、前記ペプチドとHLA−DR53からな
    る複合体を形成し、そしてそれに対して特異的であるヘルパーT細胞の増殖を刺
    激するに十分な所定量を、HLA−DR53陽性である被験者に投与する工程を
    含む方法。
  26. 【請求項26】 請求項25の方法であって、前記少なくとも一つのペプチ
    ドを局所的に投与する工程を含む方法。
  27. 【請求項27】 請求項25の方法であって、前記少なくとも一つのペプチ
    ドを、少なくとも一つのアジュバントを含む組成物の形態として投与する工程を
    含む方法。
  28. 【請求項28】 被験者においてヘルパーT細胞の増殖を刺激する方法であ
    って、前記被験者に対して所定量のポリペプチドまたはペプチドを投与する工程
    を含み、前記ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列は、配列認識番号8、
    9または10からなる少なくとも1つのアミノ酸配列を含み、該被験者のMHC
    クラスII分子により提示される少なくとも1つのペプチドにプロセッシングさ
    れるのに十分な量であり、MHC−クラスII分子および少なくとも1つのペプ
    チドからなる複合体に対して特異的であるヘルパーT細胞の増殖を刺激するため
    に十分な量の前記複合体を形成するために十分な量のペプチドおよびポリペプチ
    ドを投与する工程を含む、方法。
  29. 【請求項29】 請求項28の方法であって、前記被験者はHLA−DR5
    3陽性である方法。
  30. 【請求項30】 請求項28の方法であって、前記タンパク質は、配列識別
    番号1によってコードされるタンパク質である方法。
  31. 【請求項31】 請求項28の方法であって、前記ポリペプチドは、配列識
    別番号8,9又は10の複数のコピーを含む方法。
  32. 【請求項32】 被験者においてヘルパーT細胞の増殖を刺激する方法であ
    って、前記被験者に対して、(i)NY−ESO−1をコードする核酸配列、お
    よび(ii)NY−ESO−1由来のペプチドを提示するMHCクラスII分子
    をコードする核酸配列をトランスフェクトした所定量の細胞を投与する工程を含
    み、前記ペプチドは、癌状態に関連する細胞によって、前記癌状態を軽減するの
    に十分に提示される方法。
  33. 【請求項33】 請求項32の方法であって、前記細胞を非増殖性に処理す
    る工程を更に含む方法。
  34. 【請求項34】 被験者においてヘルパーT細胞の増殖を刺激する方法であ
    って、前記被験者に対して、非増殖性細胞表面上で発現された、MHC−クラス
    II分子とESO−1由来ペプチドからなる非共役結合複合体から実質的に構成
    される試薬の一定量を投与する工程を有する方法。
  35. 【請求項35】 癌状態を患う被験者を治療する方法であって、前記被験者
    に対して、前記状態に関連する癌細胞で発現されたESO−1由来ペプチドに特
    異的に結合する抗体を投与する工程を含み、前記抗体は、前記癌状態を治療する
    ために適切な量で抗癌剤と組み合わされる方法。
  36. 【請求項36】 被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
    求項9の組成物を前記被験者において前記癌状態の発生を予防するために適切な
    量で投与する工程を含む方法。
  37. 【請求項37】 被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
    求項10の組成物を前記被験者において前記癌状態の発生を予防するために適切
    な量で投与する工程を含む方法。
  38. 【請求項38】 被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
    求項14の組成物を、前記被験者における前記癌状態の発生を予防するために適
    切な量で投与する工程を含む方法。
  39. 【請求項39】 被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
    求項13の発現ベクターを前記被験者における前記癌状態の発生を予防するため
    に適切な量で投与する工程を含む方法。
  40. 【請求項40】 被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
    求項15の組成物を前記被験者における前記癌状態の発生を予防するために適切
    な量で投与する工程を含む方法。
  41. 【請求項41】 被験者における癌状態の発生を予防する方法であって、請
    求項17の組換え細胞を前記被験者内の前記癌状態の発生を予防するために適切
    な量で投与する工程を含む方法。
  42. 【請求項42】 被験者において癌をスクリーニングする方法であって、前
    記被験者から採取されたサンプルを、(i)MHC−クラスII分子と配列識別
    番号1によってコードされるタンパク質由来のペプチドからなる複合体、又は(
    ii)前記複合体に対して特異的であるヘルパーT細胞についてアッセイする工
    程を含み、(i)又は(ii)の存在は、前記被験者が癌である可能性を示す方
    法。
  43. 【請求項43】 請求項42の方法であって、前記ペプチドは、配列識別番
    号8,9又は10によって規定されるペプチドである方法。
  44. 【請求項44】 被験者において癌状態を診断する方法であって、前記被験
    者のサンプルを含む免疫反応性細胞を、請求項1のポリペプチドをコードする単
    離核酸分子でトランスフェクトされた細胞系と接触させる工程、および前記トラ
    ンスフェクト細胞と前記免疫反応性細胞との相互作用を判定する工程を含み、前
    記相互作用は前記癌状態の指標となる方法。
  45. 【請求項45】 請求項44の方法であって、前記免疫反応性細胞はヘルパ
    ーT細胞である方法。
  46. 【請求項46】 請求項44の方法であって、前記ポリペプチドは、配列識
    別番号8,9又は10によって規定される方法。
  47. 【請求項47】 癌状態の緩解、進行、又は発生を判定する方法であって、
    前記癌状態を伴う患者由来のサンプルの、(i)NY−ESO−1タンパク質由
    来ペプチドとMHC−クラスII分子からなる複合体、及び(ii)前記複合体
    に対して特異的なヘルパーT細胞から成る群から選択されるパラメーターについ
    てモニターする工程を含み、前記パラメータの量は前記癌状態の緩解、進行、又
    は発生の指標となる方法。
  48. 【請求項48】 請求項47の方法であって、前記サンプルは体液又は滲出
    液である方法。
  49. 【請求項49】 請求項47の方法であって、前記サンプルは組織である方
    法。
  50. 【請求項50】 請求項47の方法であって、前記サンプルを前記複合体に
    特異的に結合する抗体と接触させる工程を含む方法。
  51. 【請求項51】 請求項50の方法であって、前記抗体は放射性標識又は酵
    素で標識化されている方法。
  52. 【請求項52】 請求項50の方法であって、前記抗体はモノクローナル抗
    体である方法。
  53. 【請求項53】 癌状態を診断する方法であって、被験者から採取されたサ
    ンプルを、MHC−クラスII分子と複合体を形成するNY−ESO−1由来ペ
    プチドに対して特異的な細胞についてアッセイする工程を含む方法であって、前
    記免疫反応性細胞の存在が前記癌状態の指標となる方法。
  54. 【請求項54】 請求項53の方法であって、前記免疫反応性細胞はヘルパ
    ーT細胞である方法。
  55. 【請求項55】 配列識別番号7のアミノ酸配列のアミノ酸配列から成る単
    離ペプチド。
  56. 【請求項56】 請求項55の単離ペプチドおよびアジュバントを含む組成
    物。
  57. 【請求項57】 請求項55の単離ペプチド、および配列識別番号1によっ
    てコードされるタンパク質中に見出されるアミノ酸配列を含み、かつMHC分子
    と複合体を形成する少なくとも一つの他のペプチドを含む組成物。
  58. 【請求項58】 請求項57の組成物であって、前記MHC分子はクラスI
    分子である組成物。
  59. 【請求項59】 請求項57の組成物であって、前記MHC分子はクラスI
    I分子である組成物。
  60. 【請求項60】 請求項57の組成物であって、前記少なくとも一つの他の
    ペプチドは、配列識別番号4,5,6,7,8,9又は10によって規定される
    ペプチドである組成物。
  61. 【請求項61】 請求項55の単離ペプチドをコードするヌクレオチド配列
    から成る単離核酸分子。
  62. 【請求項62】 プロモータに作動可能に連結された、請求項61の単離核
    酸分子を含む発現ベクター。
  63. 【請求項63】 請求項55の単離ペプチドとHLA−A2分子からなる複
    合体。
  64. 【請求項64】 請求項61の単離核酸分子を含む組換え細胞。
  65. 【請求項65】 請求項62の発現ベクターを含む組換え細胞。
  66. 【請求項66】 その表面上に請求項63の複合体を発現する非増殖性細胞
  67. 【請求項67】 請求項66の非増殖細胞およびアジュバントを含む組成物
  68. 【請求項68】 細胞溶解性T細胞の増殖を刺激する方法であって、請求項
    55のペプチドとHLA−A2分子からなる複合体に対して特異的な細胞溶解性
    T細胞を、前記細胞溶解性T細胞の増殖を刺激するために適切な量を接触させる
    工程を含む方法。
  69. 【請求項69】 請求項68の方法であって、前記複合体は組成物の形態で
    投与される方法。
  70. 【請求項70】 請求項68の方法であって、前記複合体を非増殖性細胞に
    対してその表面上に提示する形態で投与する工程を含む方法。
  71. 【請求項71】 細胞溶解性T細胞の増殖を刺激する方法であって、細胞溶
    解性T細胞の増殖を誘発させるために、十分な数の請求項55のペプチドとHL
    A−A2分子からなる複合体を産生するために適切であるHLA−A2陽性細胞
    に対して所定量の前記ペプチドを投与する工程を含む方法。
  72. 【請求項72】 請求項71の方法であって、組成物中の前記ペプチドを投
    与する工程を含む方法であって、前記組成物はアジュバントを更に含む方法。
  73. 【請求項73】 請求項71の方法であって、前記組成物は、少なくとも一
    つの別のペプチドを含む方法。
  74. 【請求項74】 単離核酸分子によりコードされたタンパク質と結合する単
    離抗体または抗体の結合フラグメントであって、前記単離核酸分子の相補配列が
    ストリンジェントな条件下に於いて、配列識別番号1のヌクレオチド54−59
    3を含む核酸分子とハイブリダイズする、単離抗体または抗体の結合フラグメン
    ト。
  75. 【請求項75】 請求項74の単離抗体であって、前記抗体はモノクローナ
    ル抗体である単離抗体。
  76. 【請求項76】 請求項74の単離抗体であって、前記抗体は、キメラ抗体
    である単離抗体。
  77. 【請求項77】 請求項76の単離抗体であって、前記キメラ抗体は、マウ
    スCDR領域を有するヒト化抗体を含む単離抗体。
  78. 【請求項78】 請求項75のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
    マ細胞系。
  79. 【請求項79】 サンプル中の癌についてスクリーニングする方法であって
    、前記サンプルを、請求項74の単離抗体と接触させる工程と、前記抗体の標的
    に対する結合を判定する工程を癌状態の指標として含む方法。
  80. 【請求項80】 請求項79の方法であって、前記癌は、メラノーマ、胸部
    癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、甲状腺癌、膀胱癌、又はリンパ腫である方
    法。
  81. 【請求項81】 サンプル中の癌関連抗原に対する抗体の存在を判定する方
    法であって、前記サンプルを、配列識別番号1のヌクレオチド54−593を含
    む核酸分子によってコードされる単離タンパク質と接触させる工程と、抗体のそ
    れに対する結合を、前記サンプル中における癌関連抗原に対する抗体の判定とし
    て判定する工程を含む方法。
  82. 【請求項82】 癌状態の緩解、進行、又は発生を判定する方法であって、
    前記癌状態を伴う患者由来のサンプルの、(i)NY−ESO−1タンパク質及
    び(ii)NY−ESO−1タンパク質由来ペプチドから成る群から選択される
    パラメーターを、(i)又は(ii)に結合する抗体によってモニターする工程
    を含み、前記パラメータの量は、前記癌状態の緩解、進行、又は発生の指標とな
    る方法。
  83. 【請求項83】 請求項82の方法であって、前記サンプルは体液又は滲出
    液である方法。
  84. 【請求項84】 請求項82の方法であって、前記サンプルは組織である方
    法。
  85. 【請求項85】 請求項84の方法であって、前記抗体は、放射性標識又は
    酵素で標識化されている方法。
  86. 【請求項86】 請求項84の方法であって、前記抗体はモノクローナル抗
    体である方法。
  87. 【請求項87】 癌状態を患う被験者を治療する方法であって、前記被験者
    に対して前記癌状態に関連する癌細胞において発現されるNY−ESO−1タン
    パク質またはESO−1由来ペプチドに対して特異的に結合する抗体を投与する
    工程を含み、前記抗体は癌を治療するために適切な量で抗癌剤と結合されて該癌
    状態を治療する方法。
  88. 【請求項88】 癌状態を患う被験者を治療する方法であって、前記被験者
    に対してNY−ESO−1に特異的に結合する抗体を投与する工程を含み、前記
    抗体は抗癌剤と結合結合されて該癌状態を治療する方法。
  89. 【請求項89】 配列識別番号1で示されるヌクレオチド配列を有する単離
    核酸分子によってコードされるタンパク質の、少なくとも10−121アミノ酸
    、および10−180より少ないアミノ酸から成る単離タンパク質。
  90. 【請求項90】 請求項89の単離タンパク質であって、10−121アミ
    ノ酸から成る単離タンパク質。
  91. 【請求項91】 請求項89の単離タンパク質であって、10−180アミ
    ノ酸から成る単離タンパク質。
  92. 【請求項92】 請求項89の単離タンパク質であって、前記タンパク質が
    グリコシル化されている単離タンパク質。
  93. 【請求項93】 請求項89の単離タンパク質と、キャリアを含む免疫原性
    組成物。
  94. 【請求項94】 サンプル中の癌関連抗原に対する抗体の存在を判定する方
    法であって、前記サンプルを、請求項89の単離タンパク質と接触させる工程と
    、前記タンパク質に対する結合を前記サンプルにおける癌関連抗原に対する抗体
    の判定として判定する工程を含む方法。
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