JP2012520659A - Ｎｅｉｌ３ペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５由来の単離されたペプチドまたは断片を提供する。本ペプチドは、１個、２個、または数個のアミノ酸配列の置換、欠失、または付加を伴う上記のアミノ酸配列を含み得る。本発明はまた、これらのペプチドを含む薬学的組成物も提供する。本発明のペプチドは、がんを診断または治療するために用いることができる。

Description

本出願は、２００９年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／２１０，５１２号の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関連する。特に本発明は、がんワクチンとして極めて有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関連する。
ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を死滅させることが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、免疫学的アプローチによって発見されており（非特許文献１／Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80；非特許文献２／Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9)、このＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんにおけるペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床的適用が保証される（非特許文献３／Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55；非特許文献４／Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42；非特許文献５／Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9；非特許文献６／van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14；非特許文献７／Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8；非特許文献８／Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72；非特許文献９／Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66；非特許文献１０／Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94）。これまでに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながらこれまでのところ、これらのがんワクチン試験では低い客観的奏功率しか観察できていない（非特許文献１１／Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80；非特許文献１２／Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42；非特許文献１３／Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15）。
免疫療法の標的としての、好適なＴＡＡは、がん細胞の増殖および生存に不可欠であり、そのわけは、そのようなＴＡＡを用いることで、治療によって誘発される免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、変異、または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳説されているリスクが、最小限に抑えられ得るためである。
その一方で、ＮｅｉエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様３（Nei endonuclease VIII-like 3: ＮＥＩＬ３）は、細菌Ｆｐｇ／Ｎｅｉファミリーと相同であるＤＮＡグリコシラーゼのクラスに属するメンバーとして単離されている（非特許文献１４／Bandaru et al., DNA Repair (Amst). 2002 Jul 17;1(7):517-29）。これらのグリコシラーゼは、活性酸素種によって損傷を受けた塩基を切断し、関連リアーゼ反応を介してＤＮＡ鎖切断を導入することにより、塩基除去修復の第１段階を開始する。ＮＥＩＬ３はＤＮＡ修復機構において役割を果たす可能性があるが、発がんとのその関連性は解明されていない。
Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 Bandaru et al., DNA Repair (Amst). 2002 Jul 17;1(7):517-29
本発明は、免疫療法に適用可能な標的の発見に少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは概して免疫系によって「自己」として認識され、したがって免疫原性がない場合が多いため、適切な標的を発見することは極めて重要である。上記したように、ＮＥＩＬ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８２４８（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）の遺伝子によってコードされるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などのがんにおいて上方制御されると同定された。したがって、ＮＥＩＬ３は癌／腫瘍免疫療法の標的候補である。
本発明は、ＮＥＩＬ３に特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する、ＮＥＩＬ３の遺伝子産物の特異的エピトープペプチドの同定に少なくとも一部基づいている。以下に詳述するように、健常ドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＮＥＩＬ３由来のＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合する候補ペプチドを用いて刺激した。次に、各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４陽性またはＨＬＡ−Ａ２陽性の標的細胞に対する特異的細胞傷害性を有するＣＴＬ株を樹立した。これらの結果から、これらのペプチドが、ＮＥＩＬ３を発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープペプチドであることが実証される。さらに、ＮＥＩＬ３は免疫原性が強く、そのエピトープは癌／腫瘍免疫療法の有効な標的であることが示された。
したがって、本発明は、ＮＥＩＬ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）またはその免疫学的活性断片からなる、ＨＬＡ抗原に結合する単離されたペプチドを提供する。これらのペプチドはＣＴＬ誘導能を有すると予測され、かつ、ＣＴＬをエクスビボで誘導するため、または膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、子宮内膜症、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、ＳＣＬＣ、およびＡＭＬなどのがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与するために用いることができる。好ましくは、これらのペプチドはノナペプチドまたはデカペプチドであり、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ配列からなるペプチドは、強力なＣＴＬ誘導能を示した。
本発明のペプチドは、改変されたペプチドが元のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたペプチドを含む。
さらに本発明は、本発明の任意のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、本発明のペプチドと同様に、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導もしくは調製するために、またはがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与するために、用いることができる。
対象に投与した場合、本発明のペプチドはＡＰＣの表面上に提示され、その後、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導する。したがって、本発明の１つの局面によると、ＣＴＬを誘導するための、本発明の任意のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物または物質も提供される。さらに、任意のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物または物質を、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬなどのがんを治療および／もしくは予防するために、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。したがって、本発明はまた、本発明の任意のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための、薬学的な組成物または物質も提供する。本発明の薬学的な組成物または物質は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに、またはそれに加えて、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを、有効成分として含んでもよい。
本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、対象由来のＡＰＣを本ペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することによって、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面上に提示するＡＰＣを誘導することができる。そのようなＡＰＣは標的ペプチドに対する高いＣＴＬ誘導能を有し、がん免疫療法において有用である。したがって、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法、および該方法によって得られるＡＰＣを包含する。
本発明はまた、ＣＤ８陽性細胞を、本発明のペプチドをその表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームと共培養する段階、または本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法も提供する。本発明の方法によって得られ得るＣＴＬは、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬなどのがんを治療および／または予防するために有用であり得る。したがって、本発明は、本発明の方法によって得られるＣＴＬを包含する。
さらに本発明は、ＮＥＩＬ３ポリペプチドもしくはその免疫学的活性断片、ＮＥＩＬ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＮＥＩＬ３ポリペプチドを提示するエキソソームもしくはＡＰＣを含む組成物または物質を投与する段階を含む、がんに対する免疫応答を誘導するための方法を提供する。
本発明はまた、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬなどの癌を含むがこれらに限定されないがんを診断する方法も提供する。
本発明は、癌などの、ＮＥＩＬ３過剰発現に関連する任意の疾患に適用することができ、例示的な癌には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれる。
図１は、ＮＥＩＬ３由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す写真を示す。ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−５８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃８中のＣＴＬ（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−１２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で刺激した＃２中のＣＴＬ（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）で刺激した＃４および５中のＣＴＬ（ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃３中のＣＴＬ（ｄ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−２７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）で刺激した＃１中のＣＴＬ（ｅ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃３中のＣＴＬ（ｆ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）で刺激した＃１中のＣＴＬ（ｇ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）で刺激した＃２および３中のＣＴＬ（ｈ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激した＃６中のＣＴＬ（ｉ）、ならびに（ＨＬＡ−Ａ０２０６に対する）ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）で刺激した＃９、１０、１２、および１３中のＣＴＬ（ｊ）は、それぞれ対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの写真のウェル上の四角は、対応するウェルから細胞を増殖させてＣＴＬ株を樹立したことを示す。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。 図２−１は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって検出された、ＮＥＩＬ３−Ａ２−５８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−１２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ｃ）（ｄ）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（ｅ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す、折れ線グラフを示す。これにより、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証された。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。 図２−２は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって検出された、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−２７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）（ｆ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（ｇ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）（ｈ）（ｉ）、および（ＨＬＡ−Ａ０２０に対する）ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ｊ）（ｋ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す折れ線グラフを示す。これにより、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証された。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。 図３は、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）（ｄ）、および（ＨＬＡ−Ａ０２０６に対する）ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ｅ）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈により樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す。これにより、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）（ｄ）、および（ＨＬＡ−Ａ０２０６のための）ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ｅ）による刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証された。図中、「＋」は、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）（ｄ）、および（ＨＬＡ−Ａ０２０６に対する）ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ｅ）をパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。 図４は、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフを示す。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、または全長ＮＥＩＬ３遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（ｂ）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（ｃ）を用いて樹立されたＣＴＬクローンは、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ（三角）またはＮＥＩＬ３（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。 図４は、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフを示す。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、または全長ＮＥＩＬ３遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。（ＨＬＡ−Ａ０２０６に対する）ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ｄ）を用いて樹立されたＣＴＬクローンは、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ（三角）またはＮＥＩＬ３（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。 図５は、肝癌におけるＮＥＩＬ３の発現を示す写真を示す。パートＡは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた臨床肝癌組織におけるＮＥＩＬ３の発現を示す。パートＢは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べたＨＣＣ細胞株におけるＮＥＩＬ３の発現を示す。 図６は、ＮＥＩＬ３由来のペプチドで誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す写真を示す。ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）で刺激したウェル番号＃７（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）で刺激した＃６（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）で刺激した＃２および＃８（ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）で刺激した＃８（ｄ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）で刺激した＃１および＃４（ｅ）中のＣＴＬは、それぞれ対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの写真のウェル上の四角は、対応するウェルから細胞を増殖させてＣＴＬ株を樹立したことを示す。対照的に、陰性データの典型的な例として、ペプチドパルスした標的細胞に対する、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）で刺激したＣＴＬからの特異的なＩＦＮ−γ産生は示されなかった（ｆ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。 図７は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって検出された、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）（ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）（ｄ）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）（ｅ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す折れ線グラフを示す。これにより、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証された。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。 図８は、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）（ｂ）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）（ｃ）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈により樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す折れ線グラフを示す。これにより、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証された。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。 図９は、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的なＣＴＬ活性を示す折れ線グラフを示す。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２または全長ＮＥＩＬ３遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を用いて樹立されたＣＴＬクローンは、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。対照的に、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２（三角）またはＮＥＩＬ３（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および／または最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、同様に理解されるべきである。
Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に他に具体的に指示がない限り「少なくとも１つ」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であり得るかまたは対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であり得るアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーとに適用される。
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のどちらでもあり得る。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、１つまたは複数の修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、これらは、一般に受け入れられている１文字コードにより参照されるアミノ酸と同様である。
特記しない限り、「がん」という用語はＮＥＩＬ３遺伝子を過剰発現しているがんを指し、その例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれるが、これらに限定されない。
特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識すること、およびそのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。
特記しない限り、「ＨＬＡ−Ａ２４」という用語は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２などのサブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２４型を指す。
特記しない限り、本明細書で使用する「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６などのサブタイプを指す。
特記しない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の物質の組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
ＩＩ．ペプチド
ＮＥＩＬ３由来のペプチドが、ＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＮＥＩＬ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）由来のペプチドを解析して、それらが、一般的に見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２４またはＡ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを決定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996;Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995;Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。
ＮＥＩＬ３由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性の情報を用いて同定した。候補ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２３からなる群より選択されるペプチドである。
さらに、これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬを樹立することに成功した：
ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−５８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−１２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−２７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および
ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）。
ＮＥＩＬ３由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２４に対するこれらの結合親和性に基づいて同定した。該候補ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４〜４３からなる群より選択されるペプチドである。
さらに、これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬを樹立することに成功した：
ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、
ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、および
ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）。
樹立されたこれらのＣＴＬは、それぞれのペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これらの結果から、ＮＥＩＬ３がＣＴＬによって認識される抗原であること、および試験された該ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のＮＥＩＬ３のエピトープペプチドであることが実証される。
ＮＥＩＬ３遺伝子は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬなどのがん細胞では過剰発現するが、大部分の正常臓器では発現しないため、これはがん免疫療法のための優れた標的である。したがって本発明は、ＣＴＬによって認識されるＮＥＩＬ３由来のエピトープのノナペプチド（アミノ酸残基９個からなるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個からなるペプチド）を提供する。あるいは、本発明は、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する単離されたペプチドであって、該ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５のアミノ酸配列からなるか、またはその免疫学的活性断片である、ペプチドを提供する。より具体的にはいくつかの態様において、本発明は、ノナペプチドおよびデカペプチドの好ましい例に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
一般的に、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75およびNielsen M et al., Protein Sci., 2003; 12:1007-17に記載されているソフトウェアプログラムなどの、例えばインターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラムを用いて、種々のペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性をインシリコで算出することができる。例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75、Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81、Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424、Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003、Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17、およびNielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796に記載されているようにＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができ、これらは例えば、Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220で概説されている。結合親和性を決定するための方法は、例えばJournal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190；Protein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって、そのようなソフトウェアプログラムを使用して、ＨＬＡ抗原との高い結合親和性を有するＮＥＩＬ３由来の断片を選択することができる。したがって本発明は、そのような公知のプログラムによってＨＬＡ抗原と結合すると判定されうるＮＥＩＬ３由来の任意の断片からなるペプチドを包含する。さらにそのようなペプチドは、全長ＮＥＩＬ３からなるペプチドを含んでもよい。
本発明のペプチドには、ペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって本発明は、ＮＥＩＬ３由来のペプチドを含む、ＨＬＡ抗原に対する結合親和性を有するペプチドを包含する。例えばそのようなペプチドは、約４０アミノ酸未満であり、約２０アミノ酸未満である場合が多く、通常は約１５アミノ酸未満である。
一般的に、あるペプチド中の１個または複数のアミノ酸の改変は、該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえあることが知られている。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列に対する１個、２個、または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加によって改変されたアミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物学的活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500;Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、本発明の１つの態様によると、本発明のＣＴＬ誘導能を有するペプチドは、１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドで構成されうる。
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらすことを認識するであろう；したがってこれは「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族基含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、互いに対する保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれに限定されず、ペプチドがＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＮＥＩＬ３の多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（付加または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば３個、またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、２０％もしくはそれ未満、例えば１５％もしくはそれ未満、例えば１０％、または１〜５％である。
さらに、高い結合親和性を達成するようにアミノ酸残基を置換または付加することによって、ペプチドを置換または負荷してもよい。がん免疫療法において用いる場合、本発明のペプチドは、ＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示される。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であるため（J Immunol 1994, 152: 3913;Immunogenetics 1995, 41: 178;J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。
例えば、高いＨＬＡ−Ａ２結合親和性を示すペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されており、バリンまたはロイシンで置換されたＣ末端アミノ酸を有するペプチドもまた、好ましく使用することができる。したがって、アミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはアミノ酸配列のＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。
一方、高いＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を有するペプチドでは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはトリプトファンで置換されており、かつＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、またはメチオニンで置換されている。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されている、かつ／またはＣ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、３３、３５、４１、および４３のアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。
末端アミノ酸においてのみならず、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究により、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元のものと同等のまたはより優れた機能を有し得ることが実証されている（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
さらに、１個、２個、または数個のアミノ酸が、本ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端へと付加されてもよい。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に包含される。
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことができる。相同性検索から、対象ペプチドに対して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドさえも存在しないことが明らかになった場合には、前記副作用のいかなる危険も伴わずに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるために、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、指標としての高い結合親和性の存在に従って選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の存在についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合にＣＴＬを誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、かつペプチドによる刺激後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応システムとして、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、検討してもよい。
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を試験した結果、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３によって示されるアミノ酸配列からなるペプチドより選択されるノナペプチドまたはデカペプチドが、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示した。したがって、これらのペプチドは本発明の例示的態様である。
さらに、相同性解析の結果から、これらのペプチドが、任意の他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意な相同性を有していないことが示された。このため、免疫療法に用いた場合の未知または望ましくない免疫応答の可能性は低くなる。したがって、この局面からもまた、これらのペプチドはがん患者においてＮＥＩＬ３に対する免疫を誘発するのに使用される。よって、本発明のペプチドは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
上記の本発明のペプチドの改変に加えて、本発明のペプチドは、それらがＣＴＬ誘導能を保持する限り、他のペプチドに連結させることもできる。他のペプチドの例には、本発明のペプチド、または他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。ペプチド間のリンカーは、例えばＡＡＹ（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315）、またはＫ（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715）など、当技術分野で周知である。
例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを介する免疫応答を増大させるために、ＮＥＩＬ３でない腫瘍関連抗原ペプチドを実質的に同時に使用することもできる。がん細胞が２種以上の腫瘍関連遺伝子を発現できることは、十分に証明されている。特定の対象が付加的な腫瘍関連遺伝子を発現しているかどうかを判定すること、ならびに次に、本発明によるＮＥＩＬ３組成物またはワクチン中に、そのような遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含めることは、当業者の日常的な実験法の範囲内である。
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの例は当業者に公知であり（例えば、Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995を参照されたい）、本明細書に開示したものと同様の様式で本発明において用いることができる。当業者は、１つもしくは複数のＮＥＩＬ３ペプチドおよび１つもしくは複数の非ＮＥＩＬ３ペプチドを含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を、分子生物学の標準的な手順に従って調製することができる。
したがって、そのような「ポリトープ」は、様々な配置で（例えば、連鎖状に、重複して）共に連結され得る、２つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性もしくは免疫応答刺激性のペプチドの群である。ポリトープ（または該ポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫化プロトコールで例えば動物に投与して、免疫応答の促進、増強、および／または誘発におけるポリトープの有効性を試験することができる。
ペプチドを直接的にまたは隣接配列の使用を介して一緒に連結してポリトープを形成することができ、またワクチンとしてのポリトープの使用は当技術分野において周知である（例えば、Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995；Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997；Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996；Tarn et al., J Exp. Med. 171(l):299-306, 1990を参照されたい）。様々な数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免疫応答の増大における有効性について試験することができる。
また本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質にさらに連結させてもよい。そのような物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれ得る。本ペプチドは、修飾によって本明細書に記載のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）が付与されるかまたはポリペプチドが安定化されるように、これらの種類の修飾を実施することができる。
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野で公知であり、この概念を本発明のポリペプチドに用いることもできる。ポリペプチドの安定性は、多数の方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
さらに、上記したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、または付加した改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元と比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
ｂ：該ペプチドの活性を決定する段階、および
ｃ：元と比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、活性には、ＭＨＣ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬの誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「ＮＥＩＬ３ペプチド」または「ＮＥＩＬ３ポリペプチド」とも記載され得る。
ＩＩＩ．ＮＥＩＬ３ペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成により、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または任意の他の化学物質を実質的に含まないペプチドを単離、すなわち精製または単離することができる。
本発明のペプチドは、本明細書に記載したペプチドの生物学的活性が修飾によって損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の修飾には、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、合成に関して採用され得る従来のペプチド合成法には、以下が含まれる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）ペプチド合成, 丸善, 1975；
（ｉｖ）ペプチド合成の基礎と実験, 丸善, 1985；
（ｖ）医薬品の開発（続 第１４巻）ペプチド合成, 広川書店, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
あるいは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）を用いて、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、最初に、発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に入れて形質転換する。そのようなベクターおよび宿主細胞も、本発明によって提供される。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳システムを用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明は、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらは、天然ＮＥＩＬ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ_０１８２４８（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一な核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸の可能性のあるあらゆるサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、公開した各配列において非明示的に記載されている。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの誘導体から構成され得る。当技術分野において周知の通り、ＤＮＡ分子は塩基、例えば天然の塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどから構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。非天然の塩基もまたポリヌクレオチドに含まれることを、当業者は認識するであろう。
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
組換え技法および化学合成技法の両方を用いて、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクター内に挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311;Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されているような固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することができる。
Ｖ．エキソソーム
本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成される複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞をさらに提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いることによって調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、ワクチンとして接種することができる。
前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人については、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ*２４０２、ＨＬＡ−Ａ*０２０１、およびＨＬＡ−Ａ*０２０６が適していることが多い。日本人および白人の間で高発現しているＡ２４型またはＡ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、Ａ*２４０２、Ａ*０２０１、およびＡ*０２０６などのサブタイプが有用である。典型的には、臨床では、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型があらかじめ調べられ、これにより、この抗原に対して高レベルの結合親和性を有するかまたは抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの、適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能を示すペプチドを取得するために、天然のＮＥＩＬ３の部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加を行うことができる。
本発明のエキソソームに対してＡ２型ＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、および２２のいずれか１つの配列を含むペプチドが使用される。
代替的に、本発明のエキソソームに対してＡ２４型ＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、３３、３５、４１、４３、および６１のいずれか１つの配列を有するペプチドが使用される。
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドにより形成される複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来していてもよく、かつ、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
前記ＡＰＣは、特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
例えば、本発明のＡＰＣは、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
対象におけるがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は、以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。段階ｂによって得られたＡＰＣは、がん、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬを治療および／または予防するためのワクチンであってもよい。
本発明の１つの局面によると、ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語において、高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導しない可能性のあるペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって、調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。例として、特に制限されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム法などの、当技術分野において従来より実施される様々な方法を含む導入方法を、使用することができる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13；J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を経て部分ペプチドが提示される。
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強させ、かつしたがって、ペプチドと同様にワクチンとして用いられ得る。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること；または（２）対象由来のＡＰＣおよびＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）こと；または（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と本ペプチドとの複合体をその表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させること；または（４）本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入することによって、得ることができる。そのようなＡＰＣまたはエキソソームは上記の方法によって調製することができ、（４）の方法は下記「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において記載する。
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ、単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、がん細胞などの、ＮＥＩＬ３を内因的に発現する細胞、またはＮＥＩＬ３遺伝子をトランスフェクトされた細胞であってよく、かつ、本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを用いる方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＮＥＩＬ３を提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１つまたは複数のペプチドを用いて誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＴＣＲを解析するためにはＰＣＲ法が好ましい。解析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（５'−ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、および３'側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（５'−ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（５'−ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（５'−ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）であり得るが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、ＮＥＩＬ３ペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＮＥＩＬ３ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介することができる。
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする、既製の組成物を提供する。
特異的ＴＣＲとは、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識することができ、Ｔ細胞の表面上に該ＴＣＲが提示される場合に、標的細胞に対するＴ細胞特異的活性をもたらすることができる受容体である。上記複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いたＨＬＡ多量体染色解析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、細胞表面上にＴＣＲを発現しているＴ細胞が細胞をＴＣＲによって認識すること、およびシグナルが細胞内で伝達されることを確認することができる。Ｔ細胞表面上に上記の複合体が存在する場合に該複合体がＴ細胞の細胞傷害活性をもたらし得るという確認もまた、公知の方法によって行うことができる。好ましい方法には、例えば、クロム放出アッセイなどの、ＨＬＡ陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の決定が含まれる。
また本発明は、ＨＬＡ−Ａ２との関連で例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、および２２のＮＥＩＬ３ペプチドに、同じくＨＬＡ−Ａ２４との関連で例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、３３、３５、４１、および４３のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を形質導入することによって調製されるＣＴＬを提供する。
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつインビトロで周知の培養法によって増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＣＴＬは、治療または防御を必要としている患者におけるがんの治療または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
ＩＸ．薬学的な物質または組成物
予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の行為を含む。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベルで」行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした行為を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させること、血管形成を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含む。
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的除去、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍の退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を軽減する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療を構成し、および／または予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減または安定した疾患を含む。
ＮＥＩＬ３の発現は、正常組織と比較して、がん、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを、がんの治療および／もしくは予防のために、ならびに／または術後のその再発の予防のために用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの１種または複数種を有効成分として含む、がんを治療および／もしくは予防するための、ならびに／または術後のその再発を予防するための薬学的な物質または組成物を提供する。あるいは、薬学的な物質または組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述のＣＴＬもまた、本発明の薬学的な物質または組成物の有効成分として用いることができる。
本発明の薬学的な物質または組成物は、ワクチンとして使用される。本発明において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
本発明の薬剤または組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんを治療および／もしくは予防するために、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドをその表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療または予防において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドをその表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質を製造するための方法または工程であって、有効成分として以下の中より選択される有効成分と共に、薬学的にまたは生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドをその表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドをその表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３のアミノ酸配列を含むペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープペプチドまたはその候補であることが判明した。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的な物質または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与に特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的な物質または組成物にも当てはまる。
本発明の薬学的な物質または組成物によって治療されるがんは限定されず、ＮＥＩＬ３が関与する（例えば、過剰発現する）任意のがん、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれる。
本発明の薬学的な物質または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、これに限定されない。
必要であれば、本発明の薬学的な物質または組成物は、例えば本発明のペプチドのいずれかといった有効成分の抗腫瘍効果をその他の治療物質が阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症の物質または組成物、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬自体の中の他の治療物質に加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的な物質または組成物と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的な物質または組成物の量は、例えば、使用される薬理学的な物質または組成物の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。
本明細書において特に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な物質または組成物は、当該製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的な他の組成物も含み得ることが理解されるべきである。
本発明の１つの態様において、本発明の薬学的な物質または組成物を、例えばがんのような治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的な物質または組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、物質または組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
上記の容器に加えて、本発明の薬学的な物質または組成物を含むキットは、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、使用のための指示書と共に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および添付文書を含む、商業上および使用者の立場から見て望ましい他の材料をさらに含み得る。
必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的な組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する指示書が添付され得る。
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な物質または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な物質もしくは組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく適宜含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な物質または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な物質または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種またはそれ以上を含む組み合わせで調製することができる。ペプチドはカクテル中に存在してもよく、または標準的な技法を用いて互いにコンジュゲートしてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または、リンカー（例えばリジンリンカー：K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715）として1つまたは複数のアミノ酸を有しうる単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を対象から取り出し、次にこれを本発明のペプチドにより刺激して、本発明のペプチドのいずれかをそれらの細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再び投与して、対象においてＣＴＬを誘導し、その結果、腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増大させることができる。
有効成分として本発明のペプチドのいずれかを含む、がんの治療および／または予防のための薬学的な物質または組成物は、細胞性免疫が効率的に誘導されるようにアジュバントを含み得るか、あるいは、他の有効成分と共に投与され得、かつ顆粒内への製剤化によって投与され得る。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強させる化合物を指す。適用可能なアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。例示的なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、水中油型乳剤等が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤が好都合に用いられ得る。
本発明の別の態様において、本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。
いくつかの態様において、本発明の薬学的な物質または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る物質または組成物として同定された。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与すること、リポソーム中に取り込ませること、またはアジュバント中に乳化させることができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を、適切なペプチドに共有結合させて、ＣＴＬを刺激するために用いることができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。本発明のペプチドの用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０.００１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、例えば０.００１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、例えば０.１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日から数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適切に選択することができる。
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な物質または組成物
本発明の薬学的な物質または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドをコードする核酸を発現可能な形態で含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合に抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現され得ることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノム中への安定的な組み込みが達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい。また例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５,５８０,８５９号；第５,５８９,４６６号；第５,８０４,５６６号；第５,７３９,１１８号；第５,７３６,５２４号；第５,６７９,６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０も参照されたい）。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５,９２２,６８７号を参照されたい）。
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主内に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４,７２２,８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71;Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806;Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
ポリヌクレオチドの患者への送達は、直接的であってもよいし（この場合、ポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露する）、または間接的であってもよい（この場合、まずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する）。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505;Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95;Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96;Mulligan, Science 1993, 260: 926-32;Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217;Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993;およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が用いられる。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換した細胞の用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０.００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０.００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０.１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適切に選択することができる。
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
ＡＰＣおよびＣＴＬを調製または誘導するために、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いることができる。ＣＴＬを誘導するために、本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いることもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、任意の他の化合物がそれらのＣＴＬ誘導能を阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な物質または組成物のいずれかをＣＴＬを誘導するために用いることができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを、以下に説明されるように、ＡＰＣを誘導するために用いることもできる。
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いた、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階、および
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階。
前記ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。好ましくはＤＣが、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有するので、使用可能である。本発明の任意のペプチドを、単独で、または本発明の他のペプチドと共に用いることができる。
一方、本発明のペプチドを対象に投与する場合、該ペプチドとＡＰＣをインビボで接触させ、その結果、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって本発明は、本発明のペプチドを対象に投与することを含む。同様に、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与する場合、本発明のペプチドはインビボで発現してＡＰＣと接触し、その結果、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与することも含み得る。「発現可能な形態」とは、上記「ＩＸ．薬学的な物質または組成物、（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な物質または組成物」の章に記載されている。
さらに本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することを含み得る。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階、および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階ｂは、上記「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に記述した通りに行うことができる。
あるいは、本発明は、ＮＥＩＬ３に対するＣＴＬ活性を特異的に誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法であって、以下の段階の１つを含み得る方法を提供する：
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
（２）ＣＴＬを誘導する方法
さらに本発明は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またはＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導するための方法を提供する。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＴＬを誘導するための方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導するための方法は、以下からなる群より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階；ならびに
ｂ）本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性細胞に導入する段階。
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与した場合、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む。
あるいは、エクスビボで使用することによってＣＴＬを誘導することもでき、かつ、ＣＴＬ誘導後、活性化したＣＴＬを対象に戻すことができる。例えば、該方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階；および
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣは、上記「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に記述した通りに、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、これに限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面上に効率的に提示する任意のＡＰＣを本方法に用いることができる。
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面上に提示するエキソソームを共培養する段階を含むことができる。そのようなエキソソームは、上記「Ｖ．エキソソーム」の章に記述した方法によって調製することができる。
さらに、本発明のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することができる。そのような形質導入は、上記「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に記述した通りに行うことができる。
加えて、本発明は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含む方法である、ＣＴＬを誘導する薬学的な物質または組成物を製造するための方法または工程を提供する。
（３）免疫応答を誘導する方法
さらに本発明は、ＮＥＩＬ３に関連する疾患に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患にはがん、例えば、これらに限定されるわけではないが膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれる。
本方法は、本発明のペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む物質または組成物を投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与も意図し得る。詳細については、「ＩＸ．薬学的な物質または組成物」の項目、特にワクチンとしての本発明の薬学的な物質または組成物の使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するための本発明の方法に用いることができるエキソソームおよびＡＰＣは、上記「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項目において詳述されている。
本発明はまた、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含み得る方法である、免疫応答を誘導する薬学的な物質または組成物を製造するための方法または工程を提供する。
あるいは、本発明の方法は、以下を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する段階を含み得る：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドをその表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
本発明において、ＮＥＩＬ３を過剰発現するがんをこれらの有効成分を用いて治療することができる。がんには、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれるが、これらに限定されない。したがって、有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する前に、治療すべき細胞または組織におけるＮＥＩＬ３の発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して増強されているかどうかを確認することが好ましい。したがって１つの態様において、本発明は、以下の段階を含み得る、ＮＥＩＬ３を（過剰）発現するがんを治療するための方法を提供する：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から得られた細胞または組織において、ＮＥＩＬ３の発現レベルを決定する段階；
ｉｉ）ＮＥＩＬ３の発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＮＥＩＬ３を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
あるいは、本発明はまた、ＮＥＩＬ３を過剰発現するがんを有する対象への投与において用いるための、上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のＮＥＩＬ３ポリペプチドで治療すべき対象を、同定するための方法を提供し、該方法は、対象由来の細胞または組織におけるＮＥＩＬ３の発現レベルを決定する段階を含んでよく、ここで、該レベルが、該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、対象が、本発明のＮＥＩＬ３ポリペプチドで治療され得るがんを有し得ることが示される。本発明のがんを治療する方法を、以下により詳細に説明する。
本発明との関連において、がん性ではないことが既知である生物学的試料から決定された対照レベルは、「正常対照レベル」と称される。一方、がん性の生物学的試料から対照レベルが決定された場合、これは「がん性対照レベル」と称される。
本発明の方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、および雌ウシが含まれるが、これらに限定されない。
本発明に従って、対象から得られたがん細胞またはがん組織におけるＮＥＩＬ３の発現レベルを決定することができる。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで決定することができる。例えば、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）により、プローブを用いて定量してもよい。検出は、チップまたはアレイなどの上で実施してもよい。アレイの使用は、ＮＥＩＬ３の発現レベルを検出するのに好ましい可能性がある。当業者は、ＮＥＩＬ３の配列情報を使用して、このようなプローブを調製することができる。例えば、ＮＥＩＬ３のｃＤＮＡをプローブとして用いてもよい。必要であれば、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識でプローブを標識することができ、ハイブリダイズした標識の強度として、遺伝子の発現レベルを検出することができる。
さらに、ＮＥＩＬ３（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）の転写産物は、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを用いて定量することができる。このようなプライマーを、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
具体的には、本発明の方法のために用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件の下で、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡにハイブリダイズする。本明細書において使用する場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、平衡時に、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．０ Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０ Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合は少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの脱安定化物質を添加することによって達成してもよい。
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＮＥＩＬ３タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）またはその免疫学的な断片の量を決定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を決定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体は、モノクローナルであってもよく、またはポリクローナルであってもよい。さらに、抗体の任意の断片または改変体（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）も、その断片または改変抗体がＮＥＩＬ３タンパク質への結合能を保持している限り、検出のために用いることができる。本発明のペプチドおよびその断片に対するそのような抗体も、本発明によって提供される。タンパク質を検出するためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明においては、任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
ＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＮＥＩＬ３タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析により、染色強度を測定してもよい。すなわちこの測定では、強い染色により、タンパク質の存在／レベルの上昇が示され、それと同時にＮＥＩＬ３遺伝子の高い発現レベルが示される。
がん細胞における標的遺伝子、例えばＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞におけるレベル）よりも例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇しているか、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に上昇している場合に、上昇していると決定することができる。
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象から予め回収し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に決定することができる。加えて、治療すべきがんを有する臓器の非がん性領域から得られた正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が既知である対象由来の試料中のＮＥＩＬ３遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、予め試験された細胞由来の発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の１つの局面に従って、生物学的試料中のＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較してもよい。対象由来の生物学的試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を、標準値として用いることができる。
ＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、対象は、治療すべきがんを有すると診断され得る。
より具体的には、本発明は、（ｉ）対象が、治療すべきがんを有することが疑われるかどうかを診断する、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法であって、以下の段階を含み得る方法を提供する：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織におけるＮＥＩＬ３の発現レベルを決定する段階；
ｂ）ＮＥＩＬ３の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＮＥＩＬ３の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を、治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において、対象が、治療すべきがんを有すると診断された場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
あるいは、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織におけるＮＥＩＬ３の発現レベルを決定する段階；
ｂ）ＮＥＩＬ３の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＮＥＩＬ３の発現レベルががん性対照レベルと比較して類似しているか、または同等である場合に、該対象を、治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において、対象が、治療すべきがんを有すると診断された場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
本発明はまた、本発明のＮＥＩＬ３ポリペプチドで治療され得るがんに罹患しているかまたは罹患していると疑われる対象を診断または決定するための診断キットを提供し、該キットはまた、がん免疫療法の有効性または適用性を評価および／またはモニターするのにも有用であり得る。好ましくは、がんには、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、キットは好ましくは、対象由来の細胞におけるＮＥＩＬ３遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含むことができ、試薬は以下の群より選択され得る：
（ａ）ＮＥＩＬ３遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＮＥＩＬ３タンパク質またはその免疫学的な断片を検出するための試薬；および
（ｃ）ＮＥＩＬ３タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
ＮＥＩＬ３遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬には、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡに特異的に結合するかまたはＮＥＩＬ３のｍＲＮＡを同定する核酸が含まれ得る。これらの種類のオリゴヌクレオチドの例は、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブである。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要であれば、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることができる。
一方、ＮＥＩＬ３タンパク質またはその免疫学的な断片を検出するのに適した試薬には、ＮＥＩＬ３タンパク質またはその免疫学的な断片に対する抗体が含まれ得る。抗体は、モノクローナルであってもよく、またはポリクローナルであってもよい。さらに、抗体の任意の断片または改変体（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）も、その断片または改変抗体がＮＥＩＬ３タンパク質またはその免疫学的な断片への結合能を保持している限り、試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明においては、任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結または間接標識技術により、抗体をシグナル生成分子で標識することができる。標識、および抗体を標識してそれらの標的に対する抗体の結合を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために使用することができる。さらに、ＮＥＩＬ３タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることができる。
キットは、前述の試薬のうち２つ以上を含有していてもよい。例えば、がんに罹患していないまたはがんに罹患している対象から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含んでもよい。これらの試薬等は、ラベルを有する容器中に保持され得る。適切な容器には、瓶、バイアル、および試験管が含まれ得る。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
本発明の１つの態様において、試薬がＮＥＩＬ３のｍＲＮＡに対するプローブである場合、少なくとも１つの検出部位が形成されるよう、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックスの上に固定化することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、各々が１つの核酸（プローブ）を含有している複数の部位を含んでいてもよい。テストストリップはまた、陰性対照および／または陽性対照のための部位を含んでいてもよい。あるいは、対照部位は、テストストリップとは別のストリップ上に配置されてもよい。任意で、異なる検出部位は、固定化された核酸を、異なる量含有していてもよく、すなわち、第１の検出部位ではより多い量を含有し、以降の部位ではより少ない量を含有していてもよい。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを示す部位の数により、試料中に存在するＮＥＩＬ３のｍＲＮＡの量の定量的な指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、テストストリップの幅にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットは、陽性対照試料またはＮＥＩＬ３標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＮＥＩＬ３陽性試料を回収し、次にそれらのＮＥＩＬ３レベルをアッセイすることによって調製することができる。あるいは、精製ＮＥＩＬ３タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＮＥＩＬ３を発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＮＥＩＬ３標準試料を形成してもよい。本発明において、精製ＮＥＩＬ３は組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＮＥＩＬ３レベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
１つの態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片を特異的に認識できるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
本発明のタンパク質の部分ペプチドの例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸からなるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のタンパク質およびペプチドを調製するための方法は、上記の通りである。
抗ＮＥＩＬ３抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗ＮＥＩＬ３抗体の量との差を測定することにより、がんの診断法を行うことができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＮＥＩＬ３）に対する抗体を含み、この抗ＮＥＩＬ３抗体の量が、正常対照中の抗ＮＥＩＬ３抗体の量と比較したレベルにおけるカットオフ値よりも高いと判定される場合に、対象ががんに罹患していることが疑われる。
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合するＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出するための方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんのより早期の検出、再発、および／または転移が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または該医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子および本発明のペプチドのオリゴマー複合体、例えば四量体を調製することができる。複合体を用いて、例えばがんに罹患していると疑われる対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することにより、診断を行うことができる。
本発明はさらに、本明細書に記載するようなペプチドエピトープを使用することによる、対象の免疫応答を評価するための方法または診断用薬剤を提供する。本発明の１つの態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いることができる。評価すべき免疫応答は、免疫原を免疫コンピテント細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導され得る。いくつかの態様では、ペプチドエピトープを認識しかつこれに結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る任意の物質または組成物を、試薬として使用することができる。ペプチド試薬を必ずしも免疫原として用いる必要はない。そのような解析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカインの染色、およびインターフェロン放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法などの比較的最近の技術進歩が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させるべき免疫コンピテント細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174 : 94-96, 1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ群の頻度を測定してもよい。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、後述のように作製することができる。
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。該複合体において、重鎖のカルボキシ末端を、予めタンパク質を操作して作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンからなる四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンによって、抗原特異的細胞を染色するために四量体を使用することができる。次いで、該細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような解析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997、およびPenna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体からの患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬの存在について解析することができる。ＰＢＭＣを培養し、該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞群を例えばＣＴＬ活性について解析することができる。
本ペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いることもできる。免疫原をワクチン接種した患者から採取されたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて解析することができる。該患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を、解析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドはまた、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい）、これは、がんを診断、検出、またはモニターするための試薬として使用され得る。そのような抗体には、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体が含まれ得る。
あるいは、本発明はまたいくつかの使用法も提供し、その一部が本明細書に記載される。例えば、本発明は、ＮＥＩＬ３免疫原性ポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出するための方法を提供する。これらの方法は、生物学的試料中のＮＥＩＬ３ ＨＬＡ結合ペプチド、またはＮＥＩＬ３ ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現を測定する段階を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識しかつこれに特異的に結合する抗体であってよい。腫瘍生検標本などの生物学的試料中のＮＥＩＬ３の発現は、ＮＥＩＬ３プライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、ＮＥＩＬ３増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示はＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
好ましくは、本診断法は、対象から単離された生物学的試料をＮＥＩＬ３ ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な剤と接触させて、生物学的試料中のＮＥＩＬ３ ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触」とは、生物学的試料を、剤と生物学的試料中に存在するＮＥＩＬ３ ＨＬＡ結合ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように該剤に十分に近接させて、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で配置することを意味する。一般的に、剤と生物学的試料を接触させるための条件は、生物学的試料中の分子とその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための例示的な条件は、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．に対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生物学的試料は、本発明においてインビボまたはインビトロで位置し得る。例えば、生物学的試料はインビボの組織であってよく、ＮＥＩＬ３免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生物学的試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検標本、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生物学的試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療されるべき対象から採取された腫瘍細胞を含む試料であってよい。
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法により、診断を行うことができる（例えば、Altman, J. D. et al., 1996, Science 274 : 94；Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330）。細胞内リンホカインの染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ法またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法もまた提供されている。多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法はいずれも、より慣習的なアッセイ法より少なくとも１０倍高感度であるようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177；Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859；Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413）。五量体（例えば、ＵＳ ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（例えば、ＷＯ０２／０７２６３１）、およびＳｔｒｅｐｔａｍｅｒ（例えば、Nature medicine 6. 631-637 (2002)）を使用することもできる。
ＸＩ．抗体
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドでないものには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断アッセイおよび予後診断アッセイ、ならびに画像化手法において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＮＥＩＬ３がやはりがん患者において発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および／または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）は、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬなどの、ＮＥＩＬ３の発現が関与する癌の治療において治療的に使用され得る。
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むＮＥＩＬ３タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）またはその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイ法も提供する。そのようなアッセイ法は、必要に応じて、ＮＥＩＬ３タンパク質またはその断片を認識しかつそれに結合できる１つまたは複数の抗ＮＥＩＬ３抗体を含み得る。本発明において、ＮＥＩＬ３ポリペプチドに結合する抗ＮＥＩＬ３抗体は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験で確認することができる。すなわち、解析すべき抗体と全長ＮＥＩＬ３ポリペプチドとの間の結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３のアミノ酸配列からなる任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体が該断片に特異的に結合することが示される。本発明において、そのような免疫学的アッセイ法は、様々な型の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）等を非限定的に含む、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイ法には、Ｔ細胞免疫原性アッセイ法（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイ法もまた含まれ得る。加えて、ＮＥＩＬ３を発現するがんを検出し得る免疫学的画像化法もまた本発明によって提供され、これには本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が非限定的に含まれる。そのようなアッセイ法は、ＮＥＩＬ３を発現するがん、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬなどの検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に使用され得る。
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体も提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、これには、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫化することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されるヒト化抗体が含まれる。
抗体を得るために抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチドまたはアミノ酸配列から得ることができる。
本発明によれば、免疫抗原として用いるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片を含み得る。
本明細書では、抗体を、ＮＥＩＬ３ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、２２、２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるＮＥＩＬ３の断片ペプチドを認識し得る。オリゴペプチドを合成するための方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製することができる。本発明において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９マーまたは１０マー）を担体と結合または連結させてもよい。担体としてキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合するための方法もまた、当技術分野において周知である。
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入してもよく、これを次に、本明細書に記載するように宿主細胞を形質転換するために用いる。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外側または内側から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
任意の哺乳動物を抗原で免疫化することができるが、細胞融合に用いる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用することができる。齧歯目の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）のサル（旧世界サル）が含まれる。
動物を抗原で免疫化する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫化するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈して懸濁することができる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化させた後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化に適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫化した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から採血し、任意の従来法によって血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体にはポリクローナル抗体を含む血清が含まれ、ポリクローナル抗体を含む画分を血清から単離することもできる。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドしか認識しない画分から、例えば本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて調製することができ、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製する。
モノクローナル抗体を調製するために、抗原で免疫化した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記の通りに血清中の所望の抗体レベルの上昇について確認して、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させるべきもう一方の親細胞には、好ましくは例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは、薬物により融合細胞を選択するための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、公知の方法、例えば、Milstein et al. （Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って融合させることができる。
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）を死滅させるのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫化する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチド発現細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫化することもできる。その後、免疫化したリンパ球を、無限に分裂可能なＵ２６６などのヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより、精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
あるいは、抗体を産生する免疫細胞、例えば免疫化したリンパ球をがん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入し、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドの１つまたは複数に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、または、Ｈ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入して、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
あるいは、本発明の抗体を、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または、非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含むヒト化抗体として、得ることができる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換された、キメラ抗体である。
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域を含む、完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロ法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を伴う（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1992)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することができる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
上記のように得られた抗体を、均一になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動を適切に選択しかつ組み合わせて使用することにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
アフィニティークロマトグラフィー以外の例示的なクロマトグラフィーには、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドをプレートに添加し、次に、抗体産生細胞の培養上清または精製抗体などの所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識しかつアルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端断片またはＮ末端断片などのペプチドの断片を抗原として用いてもよい。本発明による抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して本発明の抗体を曝露し、該抗体と該ペプチドによって形成された免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法は本発明のペプチドの検出または測定を可能にする。
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、該方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中で本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡを維持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用され得る。
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」、および形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを用いて本発明のタンパク質を産生する場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させるべき発現ベクターは、大腸菌内で増幅するための上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989);FASEB J 6: 2422-7 (1989)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１であることが好ましい）を、上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。分泌させるべきペプチドを大腸菌のペリプラズムに指向させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、該ベクターは、このような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
ＸＩＩＩ．がんを診断するための方法
本発明はまた、がんを診断する方法も提供する。ＮＥＩＬ３の発現がいくつかの種類のがん細胞において特異的に上昇することが、見出された（表１および図５）。したがって、本明細書において同定された遺伝子、ならびにそれらの転写産物および翻訳産物は、がんのマーカーとしての診断的有用性を有しており、生物学的試料（例えば、細胞試料）中のＮＥＩＬ３の発現を測定することによってがんを診断することができる。具体的には、本発明は、対象におけるＮＥＩＬ３の発現レベルを測定することによりがんを診断するための方法を提供する。本発明の方法によって診断することのできるがんには、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれるが、これらに限定されない。さらに、肺腺癌および肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含むＮＳＣＬＣもまた、本発明により診断または検出することができる。
本発明に従って、対象の状態を調べるための中間結果が提供され得る。医師、看護師、または他の医療関係者が、該対象が疾患に罹患していると診断するのを補助するために、そのような中間結果を付加的な情報と組み合わせてもよい。あるいは、本発明を用いて対象由来の組織中の癌性細胞を検出し、該対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。
具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［１０］を提供する：
［１］以下の段階を含む、がんを診断するための方法：
（ａ）生物学的試料中のＮＥＩＬ３のアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較して、検出された発現レベルの上昇を、疾患の存在と相関させる段階。
［２］前記発現レベルが前記正常対照レベルより少なくとも１０％高い、［１］記載の方法。
［３］以下の中より選択される方法によって前記発現レベルを検出する、［１］記載の方法：
（ａ）ＮＥＩＬ３の配列を含むｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＮＥＩＬ３のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、および
（ｃ）ＮＥＩＬ３のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出すること。
［４］前記がんが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬの群より選択される、［１］記載の方法。
［５］前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより、前記発現レベルを測定する、［３］記載の方法。
［６］遺伝子によってコードされる前記タンパク質に対する抗体の結合を、該遺伝子の前記発現レベルとして検出することにより、前記発現レベルを測定する、［３］記載の方法。
［７］前記生物学的試料が生検標本、痰、血液、胸水、または尿を含む、［１］記載の方法。
［８］前記対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、［１］記載の方法。
［９］前記対象由来の生物学的試料ががん細胞を含む、［１］記載の方法。
［１０］前記対象由来の生物学的試料が癌性上皮細胞を含む、［１］記載の方法。
代替的に本発明は、対象由来の組織試料中のがん細胞を検出または同定するための方法を提供し、該方法は、対象由来の生物学的試料中のＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルを測定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることにより該組織中のがん細胞の存在または疑いが示される。
そのような結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患していると診断する際に、医師、看護師、または他の医療関係者を補助することができる。換言すれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するために有用な情報を医師に提供し得る。例えば、対象から採取された組織中のがん細胞の存在に関する疑いがある場合には、本発明に従って、ＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、公知の腫瘍マーカーの血中レベル、および該対象の臨床経過等を含む疾患の様々な局面を考慮することにより、臨床決定に至ることができる。
例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬのいくつかの周知の診断的な血中マーカーは、以下の通りである：
膀胱癌；ＳＣＣ、ＴＰＡ、またはＩＡＰ
乳癌；ＢＣＡ２２５、ＴＰＡ、ＣＥＡ、ＩＡＰ、またはＣＡ１５−３
子宮頸癌；ＳＣＣ、ＴＰＡ、またはＣＡ１２５
胆管細胞癌；ＣＡ１９−９、またはＣＥＡ
結腸直腸癌；ＣＥＡ
子宮内膜症；ＣＡ１２５
食道癌；ＣＥＡ、ＤＵＰＡＮ−２、ＩＡＰ、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＬＸ、または Ｓｐａｎ−１
肝癌；ＡＦＰ、またはＩＣＤＨ
ＮＳＣＬＣ；ＣＥＡ
骨肉腫；ＡＬＰ
膵癌；ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、またはＣＥＡ
前立腺癌；ＰＳＡ、またはＰＡＰ
腎細胞癌；ＩＡＰ
ＳＣＬＣ；ＰｒｏＧＲＰまたはＮＳＥ
ＡＭＬ；ＴＫ活性
ＣＭＬ；ＴＫ活性
すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間結果として役立つ。
別の態様において、本発明は、がんの診断マーカーを検出するための方法を提供し、該方法は、これらに限定されないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬの診断マーカーとして、対象由来の生物学的試料中のＮＥＩＬ３遺伝子の発現を検出する段階を含む。
がんを診断する方法を以下により詳細に説明する。
本発明の方法によって診断すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
診断を行うために、診断すべき対象から生物学的試料を採取することが好ましい。目的であるＮＥＩＬ３の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生体材料を、測定のための生物学的試料として使用することができる。生物学的試料には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくは癌性上皮細胞、または癌性であると疑われる組織に由来する上皮細胞を含む、細胞群を含む。さらに、必要に応じて、得られた身体組織および体液から細胞を精製した後、生物学的試料として用いてもよい。
本発明に従って、対象由来の生物学的試料中のＮＥＩＬ３の発現レベルを測定する。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。アレイの使用は、ＮＥＩＬ３を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながん特異的遺伝子）の発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、ＮＥＩＬ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８２４８）の配列情報を使用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＮＥＩＬ３のｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識で標識してもよく、該遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを用いてＮＥＩＬ３の転写産物を定量してもよい。そのようなプライマーもまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、実施例で使用するプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および４７）を、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出に使用することができるが、本発明はこれらに限定されない。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下で、中程度にストリンジェントな条件下で、または低ストリンジェントな条件下で、ＮＥＩＬ３のｍＲＮＡとハイブリダイズする。
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＮＥＩＬ３タンパク質の量を測定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を、該断片がＮＥＩＬ３タンパク質への結合能を保持する限り、検出に用いることもできる。タンパク質検出のためにこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびその等価物を調製することができる。
ＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＮＥＩＬ３タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析により、染色強度を観察してもよい。すなわち、強い染色が観察されることは、該タンパク質の存在の増加を示し、かつ同時にＮＥＩＬ３遺伝子の高い発現レベルを示す。
さらに、診断の精度を向上させるために、ＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルに加えて、その他のがん関連遺伝子、例えばがんにおいて差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルを測定することもできる。
生物学的試料中のＮＥＩＬ３遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルよりも例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇しているか、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇している場合に、上昇していると見なすことができる。
対照レベルは、疾患状態（癌性または非癌性）が既知である対象／対照群から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。あるいは、対照レベルは、疾患状態が既知の対象由来の試料中で予め測定されたＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースであってよい。さらに、本発明の１つの局面に従って、生物学的試料中のＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定されたる複数の対照レベルと比較することもできる。患者由来の生物学的試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値 ＋／− ２ Ｓ．Ｄ．または平均値 ＋／− ３ Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
ＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、または癌性対照レベルと類似している場合、対象を、がんに罹患しているかまたはがんの発症リスクを有すると診断することができる。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることにより、対象ががんに罹患しているかまたはがんの発症リスクを有することが示される。
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルの間の差を、細胞の癌性状態または非癌性状態次第でその発現レベルが相違しないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
本発明を実施または試験する際には、本明細書に記載したのと類似するかまたは同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載する。本明細書において言及した出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定を意図するものではない。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これは、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
材料および方法
細胞株
Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ヒトＢリンパ芽球様細胞株、ＣＯＳ７、およびアフリカミドリザル腎細胞株はＡＴＣＣから購入し、ＰＳＣＣＡ０９２２（ＨＬＡ−＊Ａ０２０６）は財団法人ヒューマンサイエンス振興財団から購入した。ＴＩＳＩ、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性Ｂリンパ芽球様細胞株は、ＩＨＷＧ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から購入した。
ＮＥＩＬ３由来のペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合するＮＥＩＬ３由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒのペプチドを、結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind）（Parker et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75)、Kuzushima et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)）を用いて予測した。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に結合するＮＥＩＬ３由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒのペプチドを、「ＮｅｔＭＨＣ３．０」結合予測サーバ（www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）（Buus et al.(Tissue Antigens., 62:378-84, 2003）、Nielsen et al.(Protein Sci., 12:1007-17, 2003、Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004)）を用いて予測した。これらのペプチドは、標準的な固相合成法に従ってＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ*０２０１陽性またはＨＬＡ−Ａ*０２０６陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非働化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１，０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１，０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球を濃縮させた群を培養した。培養７日後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３時間、３７℃にて、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製した細胞は、その細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドをパルスしたこれらのＤＣを、Ｘ線照射（２０Ｇｙ）によって不活化し、ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し；各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで補充した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴ２細胞またはＰＳＣＣＡ０９２２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
ＣＴＬ増殖手順
Riddellら(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44;Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、ＭＭＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）において０．３個、１個、および３個のＣＴＬ／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個の細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の最終濃度に到達するように培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
プラスミドのトランスフェクション
標的遺伝子、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物をベクターにクローニングした。製造業者の推奨手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子陰性かつＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４に陰性の細胞株であるＣＯＳ７にプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をｖｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個の細胞／ウェル）として使用した。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
製造業者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にポリｄＴ１２−１８プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、全ＲＮＡの１０μｇアリコートを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡとした。各一本鎖ｃＤＮＡ調製物を、１２μｌ容量のＰＣＲ緩衝液（ＴＡＫＡＲＡ）中で行う標準的なＲＴ−ＰＣＲ実験によるその後のＰＣＲ増幅のために希釈した。増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において、９４℃で４分間の変性に続き、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で６０秒を２８サイクル行って進行させた。プライマー配列は以下の通りであった：ＮＥＩＬ３に関して：フォワード、５'−ＴＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）およびリバース、５'−ＧＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＡＣＡＡＧＡＧＡＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）。
結果
がんにおけるＮＥＩＬ３発現の増強
ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて様々ながんから得られた包括的遺伝子発現プロファイルデータから、ＮＥＩＬ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８２４８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）発現が上昇していることが明らかになった。ＮＥＩＬ３発現は、対応する正常組織と比較して、ＡＭＬ ２０例中４例、膀胱癌６例中５例、乳癌１１例中１０例、子宮頸癌８例中８例、胆管細胞癌１例中１例、ＣＭＬ １２例中１２例、結腸直腸癌６例中３例、子宮内膜症１例中１例、食道癌８例中４例、肝癌１０例中６例、ＮＳＣＬＣ ７例中７例、骨肉腫１６例中１６例、膵癌１例中１例、前立腺癌１０例中１０例、腎癌２例中２例、ＳＣＬＣ １２例中１２例、および軟部組織腫瘍１２例中１２例において確かに上昇していた（表１）。
（表１）対応する正常組織と比較して癌性組織においてＮＥＩＬ３の上方制御が認められた症例の比率
Figure 2012520659
（実験例１）
ＮＥＩＬ３由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの予測
表２は、ＮＥＩＬ３のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２結合能を有する全２３種のペプチドを選択して、エピトープペプチドを決定するために調べた（表２）。
（表２）ＮＥＩＬ３に由来するＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド
Figure 2012520659
開始位置とは、ＮＥＩＬ３のＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」から導かれる。
ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１または０２０６拘束性のＮＥＩＬ３由来の予測ペプチドによるＣＴＬの誘導、およびＮＥＩＬ３由来ペプチドで刺激したＣＴＬ株の樹立
ＮＥＩＬ３由来の上記ペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１ａ〜ｊ）。それにより、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−５８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃８（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−１２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で刺激した＃２（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）で刺激した＃４および５（ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃３（ｄ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−２７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）で刺激した＃１（ｅ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃３（ｆ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）で刺激した＃１（ｇ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）で刺激した＃２および３（ｈ）、ならびにＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激した＃６（ｉ）が、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが示された。加えて、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）で刺激したウェル番号＃９、１０、１２、および１３（ｊ）が、ペプチドパルスしたＡ０２０６陽性ＰＳＣＣＡ０９２２細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。さらに、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−５８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激した陽性ウェル番号＃８、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−１２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で刺激した＃２、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）で刺激した＃４および５、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃３、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−２７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）で刺激した＃１、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃３、ならびにＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）で刺激した＃２および３中の細胞を拡大してＣＴＬ株を樹立し、かつ、Ａ０２０６に対するＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）で刺激した＃１０および１２も同様に拡大してＣＴＬ株を樹立した。これらＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ａ〜ｋ）。それにより、すべてのＣＴＬ株が、ペプチドパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが示された。一方、表２に示した他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があるものの、それらのペプチドによる刺激によってＣＴＬ株を樹立することはできなかった（データは示さず）。結果として、これにより、ＮＥＩＬ３由来の７種のペプチドが、強力なＣＴＬ株を誘導し得るペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
ＮＥＩＬ３特異的ペプチドに対するＣＴＬクローンの樹立
「材料および方法」に記載した通りに、ＣＴＬ株から限界希釈によりＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で刺激したＣＴＬクローンから強力なＩＦＮ−γ産生が測定された。
ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１またはＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０６を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株を、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子を内因的に発現する標的細胞を認識するそれらの能力について試験した。全長ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子の遺伝子の双方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子とを外因的に発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株をエフェクター細胞として用いて試験した。全長のＮＥＩＬ３遺伝子、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子、またはＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図４において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で刺激したＣＴＬは、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で刺激したＣＴＬはまた、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対しても強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対する有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがってこれらのデータにより、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）は天然でＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子と共に標的細胞上に発現され、ＣＴＬによって認識され、かつＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）もまた、天然でＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子と共に標的細胞上に発現され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。これらの結果から、ＮＥＩＬ３に由来するこれらのペプチドは、ＮＥＩＬ３を発現する腫瘍を有する患者に対してがんワクチンを適用するのに利用可能であり得ることが示された。
抗原ペプチドの相同性解析
ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−５８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−１２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−２７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激したＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−５８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−１２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−２７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドに対する相同性を有するという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対する相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−５８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−１２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−９−２７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２−１０−３７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）の配列は固有のものであることが示され、したがって本発明者らの知る限りでは、これらの分子が何らかの非関連分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性は、ほとんどない。
結論として、ＮＥＩＬ３由来の新規ＨＬＡ−Ａ２エピトープペプチドが同定された。さらに、ＮＥＩＬ３のエピトープペプチドはがん免疫療法に適用可能であり得ることが実証された。
広範なヒトがんにおけるＮＥＩＬ３の発現上昇
その後の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析から、マイクロアレイ解析に供したＩＣＣ ８例のうち７例におけるＮＥＩＬ３発現の上昇が明らかになった（図５ａ）。
肝癌におけるこの遺伝子の発現パターンを確認するため、本発明者らは、臨床肝癌標本、および正常肝細胞を含む正常ヒト組織を用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。結果として本発明者らは、ＮＥＩＬ３が、正常肝細胞と比較して臨床肝癌標本（低分化病変）８例のうち７例において発現上昇を示し（図５ａ）、かつＨＣＣ細胞株５例中５例において過剰発現し、他の正常組織では発現しないこと（図５ｂ）を見出した。
（実験例２）
ＮＥＩＬ３由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの予測
表３ａおよび３ｂは、ＮＥＩＬ３の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する合計２１種のペプチドを選択して、エピトープペプチドを決定するために試験した。
（表３ａ）ＮＥＩＬ３に由来する９ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド
Figure 2012520659
（表３ｂ）ＮＥＩＬ３に由来する１０ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド
Figure 2012520659
開始位置は、ＮＥＩＬ３のＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアおよび解離定数［Ｋｄ（ｎＭ）］は、「ＢＩＭＡＳ」および「ＮｅｔＭＨＣ ３．０」から導き出している。
ＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２拘束性のＮＥＩＬ３由来予測ペプチドを用いたＣＴＬの誘導
ＮＥＩＬ３由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を決定した（図6ａ〜ｅ）。それにより、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）で刺激したウェル番号＃７（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）で刺激した＃６（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）で刺激した＃２および＃８ （ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）で刺激した＃８（ｄ）、ならびにＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）で刺激した＃１および＃４（ｅ）が、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが示された。一方、表３ａおよび３ｂに示した他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊２４０２との結合活性を有する可能性があったにもかかわらず、それらのペプチドを用いた刺激では特異的ＣＴＬ活性は測定されなかった。例えば、ペプチドをパルスした標的細胞に対する、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）で刺激したＣＴＬ応答の典型的な陰性データ（ｆ）。その結果、ＮＥＩＬ３由来の５種のペプチドが、強力なＣＴＬを誘導し得るペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
ＮＥＩＬ３由来ペプチドに対するＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの樹立
ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）で刺激したウェル番号＃７（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）で刺激した＃６（ｂ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）で刺激した＃８（ｃ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）で刺激した＃８（ｄ）、ならびにＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）で刺激した＃１（ｅ）中の、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出されるペプチド特異的なＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した（図７ａ〜ｅ）。それにより、すべてのＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが示された。さらに、ＣＴＬ株から限界希釈することによりＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。図８において、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（ａ）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）（ｂ）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）（ｃ）で刺激したＣＴＬクローンから強力なＩＦＮ−γ 産生が測定された。
ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
各ペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株およびＣＴＬクローンを、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を内因的に発現する標的細胞を認識する能力について試験した。全長ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を外因的に発現する標的細胞の特定のモデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株およびＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて試験した。全長ＮＥＩＬ３遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、対照として調製した。図９において、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）で刺激したＣＴＬは、ＮＥＩＬ３およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対する強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対する有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがってこれらのデータにより、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子と共に標的細胞上に天然に発現し、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。これらの結果から、ＮＥＩＬ３に由来するこのペプチドが、ＮＥＩＬ３を発現する腫瘍を有する患者に対してがんワクチンを適用するために利用可能であり得ることが示された。
抗原ペプチドの相同性解析
ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）で刺激したＣＴＬは、有意でかつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、クエリーとしてのこのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−５４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−９−３６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、ＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、およびＮＥＩＬ３−Ａ２４−１０−８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）の配列は固有のものであることが示され、したがって、本発明者らの知る限りでは、この分子が、ある非関連分子に対して意図しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどない。
結論として、ＮＥＩＬ３由来の新規なＨＬＡ−Ａ＊２４０２エピトープペプチドが同定された。さらに、ＮＥＩＬ３ががん免疫療法に適用可能であり得ることが実証された。
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得、多種多様ながんのタイプに対する適用性を有し得る、ＮＥＩＬ３由来の新規ＴＡＡを提供する。このようなＴＡＡは、がんの診断および治療において有用であり得る。

Claims (36)

  1. ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、単離されたペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド。
  2. ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、請求項１記載の単離されたペプチド。
  3. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載の単離されたペプチド。
  4. １個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加された、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１、２、および３のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
  5. 以下の特徴の一方または両方を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、１１、１５、１７、２１、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４記載の単離されたペプチド：
    （ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される；ならびに
    （ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。
  6. ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である、請求項１記載の単離されたペプチド。
  7. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または６記載の単離されたペプチド。
  8. １個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加された、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１、６、および７のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
  9. 以下の特徴の一方または両方を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、３３、３５、４１、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項８記載の単離されたペプチド：
    （ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択される；ならびに
    （ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択される。
  10. ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項１〜９のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  12. ＣＴＬを誘導するための組成物であって、請求項１〜１０のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項１１記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
  13. がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の防止のための薬学的組成物であって、請求項１〜１０のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項１１記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
  14. ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２であるＨＬＡ抗原を有する対象への投与が意図される、請求項１３記載の薬学的組成物。
  15. がんを治療することが意図される、請求項１３または１４記載の薬学的組成物。
  16. 以下からなる群より選択される１つの段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
    （ａ）ＡＰＣを請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
    （ｂ）請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
  17. 以下からなる群より選択される１つの段階を含む方法によって、ＣＴＬを誘導するための方法：
    （ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
    （ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
    （ｃ）請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階。
  18. ＨＬＡ抗原と請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
  19. 請求項１６記載の方法によって誘導される、請求項１８記載のＡＰＣ。
  20. 請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離されたＣＴＬ。
  21. 請求項１７記載の方法によって誘導される、請求項２０記載のＣＴＬ。
  22. 請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、対象に投与する段階を含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
  23. 請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドのいずれかおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示する、エキソソーム。
  24. 請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドのいずれかに対する抗体またはその断片。
  25. 請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
  26. 請求項２５記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
  27. 請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドのいずれか、請求項１１記載のヌクレオチド、または請求項２４記載の抗体を含む診断キット。
  28. 以下の段階を含む、がんを診断するための方法：
    （ａ）（ｉ）ＮＥＩＬ３の配列を含むｍＲＮＡを検出すること、
    （ｉｉ）ＮＥＩＬ３のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、および
    （ｉｉｉ）ＮＥＩＬ３のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出すること
    からなる群より選択される方法のいずれか１つにより、対象由来の生物学的試料中のＮＥＩＬ３遺伝子の発現レベルを測定する段階；ならびに
    （ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階（ａ）で測定された発現レベルの上昇を、がんの存在と相関させる段階。
  29. 段階（ａ）で測定された発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％高い、請求項２８記載の方法。
  30. がんが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬの群より選択される、請求項２８記載の方法。
  31. 段階（ａ）で測定される発現レベルを、前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定する、請求項２８記載の方法。
  32. 段階（ａ）で測定される発現レベルを、ＮＥＩＬ３のタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより測定する、請求項２８記載の方法。
  33. 対象由来の生物学的試料が生検標本、痰、血液、胸水、または尿を含む、請求項２８記載の方法。
  34. ＮＥＩＬ３遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２８記載の方法。
  35. ＮＥＩＬ３のアミノ酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５である、請求項２８記載の方法。
  36. ＮＥＩＬ３の転写産物または翻訳産物と結合する検出試薬を含む、キット。
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