KR20110139270A - Ｎｅｉｌ3 펩티드 및 이를 포함하는 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HLA항원에 결합하고 CTL(cytotoxic T lymphocyte , CTL)을 유도하는 서열번호 45 유래의 분리된 펩티드 또는 단편을 제공한다. 상기 펩티드는 한개, 두 개, 또는 복수의 아미노산 서열이 삽입 결실, 또는 추가된 상기 언급된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 펩티드들을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 펩티드들은 암의 진단 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

Description

ＮＥＩＬ3 펩티드 및 이를 포함하는 백신{NEIL3 PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME}
본 출원은 2009년 3월 18일에 출원된 미국 가출원 제 61/210,512호에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 생물과학 분야, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 암 백신, 및 종양의 치료 및 예방을 위한 약물로 매우 효과적인 신규한 펩티드에 관한 것이다.
CD8 양성 CTLs는 주조직적합성복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 I 분자에 존재하는 종양관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)에서 유래한 에피톱 펩티드(epitope peptide)를 인지한 후, 종양세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. TAA의 첫 번째 예로 흑색종 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리의 발견 이후, 다른 많은 TAA가 면역학적 접근을 통해 발견되었고(NPL 1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9), 상기 TAA 중 일부는 현재 면역치료의 표적으로서 임상 개발 과정에 있다.
강력하고 특이적인 항종양 면역반응을 유도하는 새로운 TAA를 동정함으로써, 다양한 종류의 암에서 펩티드 백신 전략의 임상적인 응용의 무궁한 발전이 보장된다(NPL 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1999 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4: Butterfield LH et al, Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5: Vissers JL et al, Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6: Van der Burg SH et al, J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7: Tanaka F et al, Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8: Fujie T et al, Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9: Kikuchi M et al, Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10: Oiso M et al, Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). 현재까지, 이러한 종양관련 항원 유래 펩티드를 이용한 몇몇의 임상 실험이 보고되고 있다. 유감스럽게도, 지금까지의 이러한 종양 백신 실험에서 낮은 반응률만이 관찰될 수 있었다(NPL 11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).
TAA의 사용이, 치료적으로 가동된 면역 선택의 결과로써 TAA의 결실, 돌연변이, 또는 하향조절에서 기인한 암 세포의 잘-기재된 면역 회피의 위험성을 최소화할 수 있기 때문에 알맞은 TAA는 면역치료의 타겟으로서 암세포의 증식 및 생존에 불가결하다.
한편, Nei endonuclease VIII-like 3(NEIL3)는 박테리아 Fpg/Nei 과에 상동적인 DNA 글리코실화효소(glycosylases)의 부류에 속하는 일원으로서 분리되었다(NPL 14/Bandaru et al., DNA Repair (Amst). 2002 Jul 17;1(7):517-29). 글리코실화효소는 활성 산소(reactive oxygen species)로 잘린 염기 및 리아제(lyase) 반응과 관련되어 잘린 DNA 가닥에 의해 염기 절단 회복(base excision repair) 단계에서 첫 단계를 개시한다. NEIL3는 DNA 회복 메카니즘(repair mechanism)에서 역할을 할 수 있으나, NEIL3와 발암현상의 관계는 밝혀지지 않았다.
Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 Bandaru et al., DNA Repair (Amst). 2002 Jul 17;1(7):517-29
[도 1] 도 1은 NEIL3 유래 펩티드로 유도된 CTL에 대한 IFN-gamma ELISPOT 분석의 결과를 보여주는 사진을 나타낸다. NEIL3-A2-9-585(서열번호 3)으로 자극된 8번 웰의 CTL(a), NEIL3-A2-9-127(서열번호 4)로 자극된 2번 웰의 CTL(b), NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)로 자극된 4번 및 5번 웰의 CTL(c), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6)로 자극된 3번 웰의 CTL(d), NEIL3-A2-9-271(서열번호 11)로 자극된 1번 웰의 CTL(e), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)로 자극된 3번 웰의 CTL(f), NEIL3-A2-10-340(서열번호 17)로 자극된 1번 웰의 CTL(g), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21)로 자극된 2번 및 3번 웰의 CTL(h), NEIL3-A2-10-378(서열번호 22)로 자극된 6번 웰의 CTL(i) 및 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(HLA-A0206를 위한)로 자극된 9번, 10번, 12번 및 13번 웰의 CTL(j)은 각각 대조군에 비하여 강력한 IFN-gamma 생산을 보였다. 이러한 도의 웰 위의 사각형은 상응하는 웰의 세포가 CTL 세포주를 수립하기 위해 증식된 것을 나타낸다. 도에서, "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타내며, "-"는 어떠한 펩티드로도 자극하지 않은 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타낸다.
[도 2a] 도 2a는 NEIL3-A2-585(서열번호 3)(a), NEIL3-A2-9-127(서열번호 4)(b), NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(c)(d), 및 NEIL3-A2-9-71(서열번호 6)(e)로 자극되고 IFN-gamma ELISA 분석으로 검출된 CTL 세포주의 IFN-gamma 생산을 보여주는 선 그래프를 나타낸다. 도 2a는 대조군에 비해 강력한 IFN-gamma 생산을 보여주는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주를 증명한다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로 자극하지 않은 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타낸다.
[도 2b] 도 2b는 NEIL3-A2-9-271(서열번호 11)(f), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)(g), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21)(h)(i) 및 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(HLA-A0206를 위한)(j)(k)로 자극되고 IFN-gamma ELISA 분석으로 검출된 CTL 세포주의 IFN-gamma 생산을 보여주는 선 그래프를 나타낸다. 도 2b는 대조군에 비해 강력한 IFN-gamma 생산을 보여주는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주를 증명한다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로 자극하지 않은 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(a), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6)(b), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)(c), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21)(d) 및 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(e)(HLA-A0206를 위한)로 자극한 CTL 세포주 유래 제한된 희석으로 수립한 CTL 클론(clones)의 IFN-gamma 생산을 보여준다. 이는 대조군에 비해 강력한 IFN-gamma 생산을 보여주는 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(a), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6)(b), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)(c), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21)(d) 및 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(e)(HLA-A0206를 위한)로 자극되어 수립된 CTL 클론을 나타낸다. 도면에서, "+"는 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(a), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6)(b), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)(c), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21)(d) 및 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(HLA-A0206를 위한)(e)로 자극한 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타내며, "-"는 어떠한 펩티드로 자극하지 않은 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타낸다.
[도 4a] 도 4a은 외생적으로 NEIL3 및 HLA-A*0201 또는 HLA-A*0206을 발현하는 표적 세포에 대해 특이적 CTL 활성을 보여주는 선 그래프를 나타낸다. HLA-A*0201, HLA-A*0206 또는 전장의 NEIL3 유전자로 형질전환된 COS7 세포는 대조군으로 제조되었다. NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(a), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6)(b), 및 NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)(c)로 수립된 CTL 세포주는 NEIL3 및 HLA-A*0201(검정 마름모꼴) 모두를 형질전환한 COS7 세포에 대해 특이적 CTL 활성을 보였다. 한편, HLA(삼각형) 또는 NEIL3(원형) 중 어느 것인가를 발현하는 표적 세포에 대한 유의적인 특이적 CTL 활성은 확인되지 않았다.
[도 4b] 도 4b는 외생적으로 NEIL3 및 HLA-A*0201 또는 HLA-A*0206을 발현하는 표적 세포에 대해 특이적 CTL 활성을 보여주는 선 그래프를 나타낸다. HLA-A*0201, HLA-A*0206 또는 전장의 NEIL3 유전자로 형질전환된 COS7 세포는 대조군으로 제조되었다. NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)(a)(HLA-A0206을 위한)로 수립된 CTL 세포주는 NEIL3 및 HLA-A*0201(검정 마름모꼴) 모두를 형질전환한 COS7 세포에 대해 특이적 CTL 활성을 보였다. 한편, HLA(삼각형) 또는 NEIL3(원형) 중 어느 것인가를 발현하는 표적 세포에 대한 유의적인 특이적 CTL 활성은 확인되지 않았다.
[도 5] 도 5는 간암에서 NEIL3의 발현을 보여주는 사진을 나타낸다. A는 임상적 간암 조직에서 반정량적 RT-PCR로 측정된 NEIL3의 발현을 보여준다. B는 HCC 세포주에서 반정량적 RT-PCR로 측정된 NEIL3의 발현을 보여준다.
[도 6] 도 6은 NEIL3 유래 펩티드로 유도된 CTL에 대한 IFN-gamma ELISPOT 분석의 결과를 보여주는 사진을 나타낸다. NEIL3-A24-9-545(서열번호 24)로 자극된 7번 웰의 CTL(a), NEIL3-A24-9-362(서열번호 33)로 자극된 6번 웰의 CTL(b), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35)로 자극된 2번 및 8번 웰의 CTL(c), NEIL3-A24-10-544(서열번호 41)로 자극된 8번 웰의 CTL(d), NEIL3-A24-10-87(서열번호 43)로 자극된 1번 및 4번 웰의 CTL(e)은 각각 대조군에 비하여 강력한 IFN-gamma 생산을 보였다. 이러한 도의 웰 위의 사각형은 상응하는 웰의 세포가 CTL 세포주를 수립하기 위해 증식된 것을 나타낸다. 한편, 음성 데이타의 전형적인 예로서, NEIL3-A24-9-364(서열번호 25)로 자극된 CTL(f)에서의 펩티드로 자극된 표적 세포에 대한 IFN-gamma 특이적 생산이 발견되지 않았다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로 자극하지 않은 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타낸다.
[도 7] 도 7은 NEIL3-A24-9-545(서열번호 24)(a), NEIL3-A24-9-362(서열번호 33)(b), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35)(c), NEIL3-A24-10-544(서열번호 41)(d), NEIL3-A24-10-87(서열번호 43)(e)로 자극되고 IFN-gamma ELISA 분석으로 검출된 CTL 세포주의 IFN-gamma 생산을 보여주는 선 그래프를 나타낸다. 도 7은 대조군에 비해 강력한 IFN-gamma 생산을 보여주는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주를 증명한다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로 자극하지 않은 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타낸다.
[도 8] 도 8은 NEIL3-A24-9-545(서열번호 24)(a), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35)(b) 및 NEIL3-A24-10-544(서열번호 41)(c)로 자극한 CTL 세포주 유래 제한된 희석으로 수립한 CTL 클론(clones)의 IFN-gamma 생산을 보여주는 선 그래프를 나타낸다. 이는 대조군에 비해 강력한 IFN-gamma 생산을 보여주는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 클론을 나타낸다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로 자극하지 않은 표적 세포에 대한 IFN-gamma 생산을 나타낸다.
[도 9] 도 9는 외생적으로 NEIL3 및 HLA-A*2402를 발현하는 표적 세포에 대해 특이적 CTL 활성을 보여주는 선 그래프를 나타낸다. HLA-A*2402 또는 전장의 NEIL3 유전자로 형질전환된 COS7 세포는 대조군으로 제조되었다. NEIL3-A24-9-545(서열번호 24) 로 수립된 CTL 세포주는 NEIL3 및 HLA-A*2402(검정 마름모꼴) 모두를 형질전환한 COS7 세포에 대해 특이적 CTL 활성을 보였다. 한편, HLA-A*2402(삼각형) 또는 NEIL3(원형) 중 어느 것인가를 발현하는 표적 세포에 대한 유의적인 특이적 CTL 활성은 확인되지 않았다.
발명의 개요
본 발명은 어느 정도는, 면역치료의 적절한 표적의 발견에 대한 부분에 기초한다. TAA는 일반적으로 면역계에 대한 "자기"로 인지되어 종종 면역원성이 없기 때문에 적절한 표적의 발견은 중요하다. 상기 언급한 바와 같이 NEIL3(GenBank Accession No. NM_018248(예를 들어, 서열번호 44)의 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 45)는 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 암종(cholangiocellular carcinoma), 결장암(colorectal cancer), 자궁내막증(endometriosis), 식도암(esophagus cancer), 간암(liver cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal cancer), 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia (AML)), 및 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia (CML))과 같은 암조직에서 과발현하는 것으로 확인되었다. 따라서 NEIL3는 암/종양 면역치료의 후보 표적이다.
본 발명은 NEIL3에 특이적인 CTLs을 유도하는 능력을 가지는 NEIL3유전자 산물의 특이적 에피톱 단백질의 확인에 대한 최소한의 부분에 기초한다. 아래 기재한 것과 같이, 자극된 건강한 공여자로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 NEIL3 유래 후보 단백질에 결합하는 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201로 자극되었다. 그런 다음, 각 후보 펩티드에 의해 자극된 HLA-A24 또는 HLA-A2 양성 표적 세포에 대해 특이적 세포독성을 갖는 CTL 세포주가 확립되었다. 이러한 결과는 이러한 펩티드가 NEIL3를 발현하는 세포에 대해 강력하고 특이적 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 또는 HLA-A2에 제한적인 에피톱 펩티드임을 증명한다. 더 나아가, NEIL3는 강한 면역성을 가지며 그것의 에피톱는 암/종양 면역치료에 효과적인 표적임을 나타낸다.
따라서 본 발명은 NEIL3(서열번호 45)에서 유래 분리된 HLA 항원에 결합하는 펩티드 또는 이의 면역학적 활성 단편을 제공한다. 본 발명의 펩티드는 CTL 유도성을 갖는 것으로 예상되고, 체외에서 CTL을 유도하는데 사용하거나 또는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 자궁내막증, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, SCLC 및 AML과 같은 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개체에 투여된다. 바람직하게는, 상기 펩티드들은 일반적으로 노나펩티드(nonapeptides) 또는 데카펩티드(decapeptides)이며, 더욱 바람직하게는, 서열번호 1 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다. 특히, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드들은 강한 CTL 유도성을 보인다.
본 발명의 펩티드들은 원래의 CTL 유도성을 유지하는 한 이 중, 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산이 제거 또는 첨가되는 것을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 펩티드 중 어느 것을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 제공한다. 본 발명의 펩티드뿐만 아니라 이러한 폴리뉴클레오티드는 CTL 유도성이 있는 APC를 유도 또는 준비하기 위해 사용되거나 또는 암 및 본 발명의 펩티드에 대한 면역반응을 유도하기 위해, 개체에 투여된다.
개체에 투여하였을 경우, 본 발명의 펩티드는 APCs의 표면에 제시되고, 그 후 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도한다. 따라서, 본 발명의 하나의 측면에 따르면, CTL을 유도하기 위한 본 발명의 임의의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 또는 물질들 또한 제공된다. 또한, 상기 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 조성물 또는 물질들은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML과 같은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발 예방에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 예방하기 위한, 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 약학적 조성물 또는 물질들 또한 제공한다. 본 약학적 조성물 또는 물질은 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 활성 구성요소로서 대신 또는 추가하는 펩티드 중 어느 것을 제시하는, APCs 또는 엑소솜을 유효 성분으로서 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 펩티드에 개체 유래 APCs를 접촉함으로써 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APCs로 도입함으로써, 본 발명의 상기 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 HLA항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체는 그것의 표면에 제시하는 APCs를 유도할 수 있다. 이러한 APCs는 표적 펩티드에 대하여 높은 CTL 유도성을 가지며, 암 면역치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 APCs 및 CTL유도성으로 APCs를 유도하는 방법을 제공하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 CD8 양성 세포와 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜을 공배양하는 단계 또는 본 발명의 펩티드에 결합하는 T 세포 수용체 아단위(subunit) 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 CTL을 유도하는 방법을 제공한다. 본 방법에 의해 획득할 수 있는 CTL은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML과 같은 암의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 상기 방법에 의해 획득가능한 CTL을 포함한다.
또한, 본 발명은 NEIL3 폴리펩타이드 또는 이의 면역학적 활성 단편, 또는 NEIL3 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 NEIL3 폴리펩타이드를 발현하는 엑소솜 또는 APCs를 포함하는 조성물 또는 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 암의 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML을 포함하는 예시적인 암들과 같은, NEIL3 과발현과 관련된 질환에 적용될 수 있다.
본 문서에 기재된 것들에 유사하거나 같은 어떤 방법 및 재료들이 본 발명의 실시태양의 수행 또는 시험에서 이용될 수 있지만, 바람직한 방법, 기구 및 재료를 하기에 기재하였다. 그러나, 본 재료 및 방법이 기재되기 이전에, 본 발명은 명세서에 기재된 특정 사이즈, 모양, 부피, 재료, 방법, 프로토콜 등에 한정되지 않으며, 이들은 통상적인 실험 및/또는 최적화에 부합하여 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어는 특정한 버전 또는 내용을 기술하기 위한 목적이나, 오직 첨부된 청구항으로 제한되는 본 발명의 범위로 제한하려는 의도는 아니다.
I.정의
본 발명에서 사용되는 용어 "a", "an", 및 "the"는 따로 명시되지 않는 한, "적어도 1개"를 의미한다.
본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 1개 또는 그 이상의 아미노산 잔기(들)로 된 아미노산 중합체가 변형된 잔기(들), 또는 천연 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 아미노산에 대응하는 인공 화학 모방체와 같은 비천연 잔기(들)에 적용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 합성 아미노산, 및 천연 아미노산과 마찬가지로 기능하는 아미노산 모방체(mimetic) 및 아미노산 유사체(analog)를 의미한다. 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산일 수 있다. 천연 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되는 아미노산 및 세포에서 번역 후 변형된 아미노산[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), gamma-카복시글루탐산(γ-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]이다. 상기 용어 "아미노산 유사체"는 천연 아미노산과 같은 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 α탄소)를 가지고 있지만, 1개 또는 그 이상의 변형된 R기(들) 또는 변형된 골격을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. 상기 용어 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조이지만, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 상징 또는 1문자 상징에 의해 불린다.
본 발명에서 사용된 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 아미노산과 마찬가지로, 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 불린다.
별도로 명시되지 않는 한, "암"은 NEIL3 유전자가 과발현하는 암을 나타내고, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML을 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 "세포독성 T 림프구", "세포독성 T 세포" 및 "CTL"은 호환되어 쓰이며 따로 명시되지 않는 한, 비자기 세포(예를 들면 종양/암 세포, 바이러스에 감염된 세포)를 인식하고 이러한 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 림프구의 하위집단(sub-group)을 나타낸다.
별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 "HLA-A24"는 HLA-A*2402와 같은 아형(subtype)을 포함하는 HLA-A24형을 나타낸다.
별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 용어 "HLA-A2"는 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206과 같은 아형(subtype)을 대표하여 나타낸다.
별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 용어 "키트(kit)"는, 약품 및 다른 재료들의 조합을 참조하여 사용된다. 사용되는 키트는 마이크로어레이, 칩, 마커, 및 기타 등등이 고려될 수 있다. 상기 용어 "키트"는 특정 약품 및/또는 재료의 조합으로 제한하려는 의도는 아니다.
별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
II . 펩티드
NEIL3 유래 펩티드가 CTLs에 의해 인식되는 항원으로서 역할을 한다는 것을 증명하기 위하여, NEIL3(서열번호 45)유래 펩티드가 보통 HLA 대립유전자에 보여지는 HLA-A24 또는 A2에 의해 제한되는 항원 에피톱인가를 확인하기 위하여 NEIL3 유래 펩티드를 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155:4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994).
HLA-A2에 결합하는 NEIL3 유래 펩티드 후보를 HLA-A02에 대한 그들의 결합 친화성 정보를 이용하여 동정하였다. 후보 펩티드는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군에서 선택되었다.
또한, 이러한 펩티드들fh 자극된(담지된) 수지상 세포(dendritic cells, DCs)에 의한 시험관 내 T 세포의 자극 후, 하기 각각의 펩티드를 이용하여 CTL을 성공적으로 수립하였다;
NEIL3-A2-9-585 (서열번호 3),
NEIL3-A2-9-127 (서열번호 4),
NEIL3-A2-9-416 (서열번호 5),
NEIL3-A2-9-71 (서열번호 6),
NEIL3-A2-9-271 (서열번호 11),
NEIL3-A2-10-198 (서열번호 15),
NEIL3-A2-10-340 (서열번호 17),
NEIL3-A2-10-590 (서열번호 21), 및
NEIL3-A2-10-378 (서열번호 22).
NEIL3 유래 HLA-A24 결합 펩티드 후보는 그들의 HLA-A24 결합 친화성을 이용하여 동정하였다. 후보 펩티드는 서열번호 24 내지 43으로 이루어진 군에서 선택되었다.
또한, 이러한 펩티드들로 자극된(담지된) 수지상 세포(dendritic cells, DCs)에 의한 시험관 내 T 세포의 자극 후, 하기 각각의 펩티드를 이용하여 CTL을 성공적으로 수립하였다;
NEIL3-A24-9-545 (서열번호 24),
NEIL3-A24-9-362 (서열번호 33),
NEIL3-A24-10-320 (서열번호 35),
NEIL3-A24-10-544 (서열번호 41), 및
NEIL3-A24-10-87 (서열번호 43).
이러한 수립된 CTL은 각각의 펩티드에 의해 자극받은 표적 세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 보인다. 본 발명의 이러한 결과는 NEIL3가 CTL에 의해 인식되는 항원이며, 상기 펩티드들은 HLA-A24 또는 HLA-A2에 제한되는 NEIL3의 에피톱 펩티드임을 나타낸다.
상기 NEIL3 유전자는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML과 같은 암세포에서 과발현하고 대부분의 정상 기관에서 발현하지 않기 때문에, 면역치료에 적절한 표적이다. 따라서, 본 발명은 NEIL3 유래의 CTL-인식하는 에피톱의 노나펩티드(nonapeptides)(아홉 개의 아미노산으로 구성된 펩티드)와 데카펩티드(decapeptides)(열 개의 아미노산으로 구성된 펩티드)를 제공한다. 또는, 본 발명은 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(CTLs)를 유도하는, 서열번호 45의 아미노산 서열 또는 그의 면역학적 활성 단편으로 구성된 펩티드에서 분리된 펩티드들을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명은 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
일반적으로, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1,152(1):163-75 및 Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17에 기재되어 있는 것과 같이, 인터넷상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램을 이용하여 컴퓨터 상(in silico)에서 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화성을 산출할 수 있다. 예를 들면, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1):163-75, Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6):1872-81, 및 Larsen MV et al ., BMC Bioinformatics . 2007 Oct 31; 8: 424, 예를 들어, Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220에 요약되어 있는, Buus S et al ., Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17, 및 Nielsen M et al., PLoS ONE 2007; 2: e796에 기재되어 있는 것에 따라, HLA 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성을 결정하는 방법은, 예를 들면, Journal of Immunological Methods, 1995, 185:181-190; Protein Science, 2000, 9:1838-1846에 기재되어 있다. 따라서, 이러한 소프트웨어 프로그램을 이용하여 HLA 항원과 높은 결합 친화성을 가진 NEIL3 유래 단편이 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 공지된 프로그램으로, HLA항원과 결합함으로써 결정되는, NEIL3로부터 유래한 어떤 단편으로 구성되는 펩티드를 포함한다. 또한, 그러한 펩티드는 NEIL3의 전장으로 구성된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 펩티드는 상기 펩티드가 CTL 유도성을 유지하는 한, 부가적 아미노산 잔기를 인접시킬 수 있다. 상기 부가적인 아미노산 잔기는 원래 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한, 어떤 유형의 아미노산으로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 HLA 항원에 결합 친화성을 갖고, NEIL3에서 유래한 펩티드를 포함하는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 이러한 펩티드들은 약 40 아미노산 미만, 흔히 20 아미노산 미만, 보통 약 15 아미노산 미만이다.
일반적으로, 어떠한 펩티드 중의 한 개 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 미치지 않거나, 어떠한 경우에는 원래 단백질의 원하는 기능을 촉진한다고 알려져 있다. 실제로, 변형된 펩티드(즉, 원래의 참조 서열에 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 첨가됨으로써 변형된 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)가 원래의 펩티드의 생물 활성을 유지한다는 것이 알려져 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13). 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 CTL 유도성을 가지는 본 발명의 펩티드는 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산이 첨가, 결실 및/또는 치환된, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43에서 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드로 구성될 수 있다.
당업자는 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산이 변한 아미노산 서열에 대한 개개의 첨가 , 결실 또는 치환이 원래 아미노산 측쇄(side-chain)의 특성을 보존하는 결과를 야기할 것을 알고 있다; 따라서 그것은 "보존적 치환(conservative substitution)" 또는 "보존적 변형(conservative modification)"이라고 나타내며, 단백질의 변화는 유사 기능을 갖는 단백질이 되는 결과를 낳는다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 아미노산 측쇄의 특성의 예로는 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공통적 특징을 가지는 측쇄가 있다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 수산기를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기를 포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족을 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 또한, 하기 8개 군은 서로 보존적 치환될 수 있는 아미노산을 포함한다:
(1) 알라닌(A), 글리신(G);
(2) 아스파라긴산(D), 글루탐산(E);
(3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
(4) 아르기닌(R), 리신(K);
(5) 이소 류신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
(6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
(7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
(8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조)
이러한 보존적으로 변형된 펩티드 또한 본 발명의 펩티드로 간주한다. 그러나, 본 발명의 상기 펩티드는 그들에 한정되지 않고, 상기 펩티드가 CTL 유도성을 가지는 한, 비-보존적인 변형도 포함할 수 있다. 또한, 상기 변형된 펩티드는 NEIL3의 다형성 변종, 종간 상동체(homologue) 대립 유전자의 CTL 유도 가능한 펩티드를 제외하지 않는다.
필요한 CTL 유도성을 계속 유지하기 위하여 소수의(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 복수) 또는 낮은 비율의 아미노산을 변형(삽입, 또는 치환)할 수 있다. 본 발명에서, 상기 용어 "복수"는 다섯 개 또는 그 이하, 예를 들면 세 개 또는 그 이하를 의미한다. 변형되는 아미노산의 비율은 예를 들어, 20% 또는 그 이하, 15% 또는 그 이하, 예를 들어, 10% 또는 1 내지 5%일 것이다.
또한, 상기 펩티드는 더욱 높은 결합 친화성을 얻기 위해서 이러한 아미노산 잔기가 치환 또는 첨가될 수 있다. 암 면역치료에 사용했을 경우, 본 발명의 펩티드는 HLA 항원과 복합체로서 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시된다. 자연적으로 드러난 펩티드와 더불어, HLA 항원에 결합함으로써 드러난 펩티드 서열의 규칙성은 이미 공지되었으므로(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; J Immunol 1994, 155:4307), 이와 같은 규칙성에 근거한 변형을 본 발명의 면역원성 펩티드에 도입될 것이다.
예를 들면, 높은 HLA-A24 결합 친화성을 보이는 펩티드들은 루신 또는 메티오닌으로 치환된 N-말단으로부터 2번째 아미노산을 갖으며, 또한, C-말단의 펩티드의 아미노산이 발린 또는 루신으로 치환된 펩티드들은 유용하게 사용된다. 따라서, N-말단으로부터 2번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환, 및/또는 C-말단 아미노산이 발린 또는 루신으로 치환된 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21 및 22의 아미노산 서열을 가진 펩티드는 본 발명에 포함된다.
한편, 높은 HLA-24 결합 친화성을 갖는 펩티드는 N-말단으로부터 2번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환되고, C-말단의 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소루신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된다. 따라서, N-말단으로부터 2번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환, 및/또는 C-말단이 페닐알라닌, 루신, 이소루신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환되는 서열번호 24, 33, 35, 41 및 43의 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 본 발명에 포함된다.
치환은 말단의 아미노산에서 뿐만 아니라 펩티드의 잠재적인 TCR 인식 부위에서도 실시할 수 있다. 몇 개의 연구에서, 예를 들면 CAP1, p53(264-272), Her-2/neu(369-377) 또는 gp100(209-217) 펩티드 중의 아미노산 치환이 원래의 기능과 동일하거나 더욱 뛰어난 것일 수 있음을 증명하고 있다(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).
또한, 본 발명의 펩티드의 N 및/또는 C-말단에 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산을 첨가할 수 있다. 높은 HLA 항원 결합 친화성을 가지며, CTL 유도성을 유지하고 있는 이러한 변형된 펩티드 또한 본 발명에 포함된다.
그러나, 펩티드 서열이 서로 다른 기능을 가지는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 한 부분과 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역장애 또는 특정 물질에 대한 알레르기 증상 등의 부작용이 유발될 가능성이 있다. 따라서, 상기 펩티드 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 상황을 피하기 위해서, 사용가능한 데이타베이스를 이용하여 상동성 검색을 실시할 수 있다. 목표 펩티드와 한 개 또는 두 개의 아미노산 차이가 있는 펩티드마저도 존재하지 않는다는 것이 상동성 검색에서 드러날 경우, 어떠한 부작용의 위험 없이 HLA 항원과 결합 친화성, 및/또는 CTL 수송 능력을 증강시키기 위해, 상기 목표 펩티드를 변형시킬 수 있다.
상기와 같이, HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드는 매우 효과적일 것이라고 기대되지만, 높은 결합 친화성의 존재에 따라 지표로서 선택된 후보 펩티드는 CTL 유도성의 존재에 대해 한층 더 검토된다. 본 발명에서, 상기 용어 "CTL 유도성"은 APCs 상에 제시될 경우에 CTL을 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 또한, "CTL 유도성"은 펩티드의 CTL 활성화, CTL 증식 유도, CTL에 의한 표적 세포의 용해 촉진, 및 CTL의 IFN-gamma 생산을 증가시키는 능력을 포함한다.
CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원을 보유하는 APCs(예를 들면, B-림프구, 마크로파지(macrophage) 및 수지상 세포(DCs)), 또는 더욱 구체적으로는 인간 말초 혈액 단핵 백혈구(human peripheral blood mononuclear leukocytes) 유래 DCs를 유도하고, 펩티드를 사용하여 자극, CD8 양성 세포와 혼합한 후, 그 후에 표적 세포에 대한 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-gamma를 측정하여 수행할 수 있다. 반응계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(예를 들면, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8):764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on MHC(HLA) class II restricted T (H) response에 기재된 것)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 표적 세포를 51Cr 등으로 방사 표지할 수 있고, 상기 표적 세포로부터 방출된 방사능으로부터 세포독성 활성을 산출할 수 있다. 다른 방법으로, 고정화된 펩티드를 가진 항원제시세포(APCs)의 존재하에 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-gamma를 측정하고, 항-IFN-gamma 단일클론 항체를 사용한 배지에서 저해 영역을 가시화함으로써, 측정할 수 있다.
상기와 같이, 상기 펩티드의 CTL 유도성을 검사한 결과, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43에 의해 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드로부터 선택되는 노나펩티드 또는 데카펩티드는, HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성뿐만 아니라 특히 높은 CTL 유도성을 보였다. 따라서, 이러한 펩티드는 본 발명의 실시태양으로서 예시된다.
또한, 상동성 분석의 결과는 이러한 펩티드들이 어떠한 다른 알려진 인간 유전자 산물 유래 펩티드와 현저한 상동성을 갖지 않음을 보인다. 이것은 면역치료에 사용하였을 때, 알려지지 않거나 또는 원하지 않은 면역반응의 가능성을 낮춘다. 따라서, 또한 측면으로부터 역시, 이러한 펩티드들은 NEIL3에 대한 암 환자의 면역성을 제거하는데 쓰인다. 따라서, 본 발명의 펩티드들은, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드가 바람직하다.
상기와 같이, 펩티드의 변형과 더불어, 본 발명의 펩티드는 그들이 CTL 유도성을 유지하고 있는 한, 다른 펩티드에 결합될 수 있다. 예시적인 물질에는 본 발명의 펩티드 또는 다른 TAAs 유래 CTL 유도가능한 펩티드가 포함된다. 상기 펩티드들 사이의 링커(linker)는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는 K(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715).
예를 들어, HLA class I 및/또는 class II를 통한 면역 반응을 증가시키기 위하여, 비-NEIL3 종양 관련 항원 펩티드 또한 대체로 동시에 사용될 수 있다. 암세포가 하나 이상의 종양 관련 유전자를 발현시킬 수 있음이 잘 확립되어 있다. 특정한 개체가 추가적으로 종양 관련 유전자를 발현하는지 결정하기 위한, 그런 다음 본 발명에 따른 NEIL3 조성물의 유전자의 발현 물질 유래의 HLA class I 및/또는 class II와 결합하는 펩티드 또는 백신을 포함하기 위한 당업계에서 일상적인 실험 범위 내의 보통의 기술이다.
HLA class I 및 HLA class II 결합 펩티드의 예는 당업계에서 보통의 기술중에 하나로 잘 알려져 있으며(예를 들어, see Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995), 본 발명에서 비슷한 방식으로 사용될 수 있음을 밝혔다. 당업계의 보통의 기술은 하나 또는 그 이상의 NEIL3 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 비-NEIL3 펩티드, 또는 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(nucleic acid)을 포함하는 폴리펩티드를 분자 생물학의 정석에 따라 준비할 수 있다.
따라서, 이러한 "폴리톱(polytopes)"은 다양한 배열로 합쳐질 수 있는 둘 또는 그 이상의 잠재적 면역성 또는 면역 반응 자극 펩티드로 이루어진 군을 말한다. 상기 폴리톱(또는 폴리톱을 암호화하는 핵산)은 면역 반응의 자극, 향상 및/또는 유발 유효성을 시험하기 위하여, 표준 면역화 프로토콜에 따라, 예를 들어, 동물에게 투여될 수 있다.
상기 펩티드들은 직접 또는 측면 서열을 이용하여 폴리톱을 형성하기 위해 합쳐질 수 있으며, 폴리톱의 백신으로의 이용은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들면, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996; Tarn et al., J Exp. Med. 171(l):299-306, 1990). CTLs에 의해 인식되고 면역 반응의 효율을 증가시키기 위하여, 여러가지의 에피톱 및 여러 에피톱의 조합을 포함한 폴리톱은 준비되고 시험될 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 펩티드는 원래의 CTL 유도성을 유지하는 한, 더 나아가 다른 물질과 연결될 수 있다. 이러한 물질들은 펩티드, 지방, 당 및 당쇄, 아세틸 족, 본연의 및 합성된 폴리머 등이 포함될 수 있다. 상기 펩티드는 여기에 기재된 펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한, 글리코실화(glycosylation), 측쇄 산화(side chain oxidation), 또는 인산화(phosphorylation)와 같은 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 종류는 추가적 기능(예를 들어, 표적화 기능, 및 전달 기능)의 부여 또는 폴리펩티드의 안정화를 위하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 당업계에서 생체내의(in vivo) 폴리펩티드의 안정성을 증가시키기 위한, D-아미노산, 아미노산 모사 또는 인공적인 아미노산의 도입이 잘 알려져 있으며, 또한, 이 개념은 본 발명의 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 안정성은 여러 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 인간 혈장 및 혈청과 같은, 펩티다아제 및 여러 생물학적 매체는 안정성을 시험하기 위해 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).
또한, 상기 언급한 바와 같이, 하나, 둘 또는 여러 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 변형된 펩티드 중에, 원래의 펩티드와 같거나 높은 활성을 갖는 것이 스크리닝 또는 선택될 수 있다. 또한, 본 발명은, 따라서, 원래의 펩티드와 같거나 높은 활성을 갖는 변형된 펩티드를 스크리닝 또는 선택하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은;
a: 본 발명의 펩티드의 최소한 하나의 아미노산 잔기를 치환, 결실 또는 첨가하는 단계,
b: 상기 펩티드의 활성을 측정하는 단계, 및
c: 원래의 펩티드의 활성과 같거나 높은 펩티드를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 활성은 MHC 결합 활성, APC 또는 CTL 유도성 및 세포독성 활성을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 본 발명의 펩티드는 " NEIL3 펩티드(들)" 또는 " NEIL3 폴리펩티드(들)"로 기재될 수 있다.
III . NEIL3 펩티드의 제조
본 발명의 펩티드는 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 상기 펩티드는 재조합형 DNA 기술 또는 화학 합성에 의해 합성적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로, 또는 두 개 또는 이상의 펩티드를 포함하는 더 긴 폴리펩티드로 합성할 수 있다. 상기 펩티드는 분리될 수 있는데, 즉, 자연에 존재하는 다른 숙주세포 단백질 및 이의 단편, 또는 다른 어떠한 화학물질을 실질적으로 포함하지 않도록 정제 또는 분리될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 여기에 기재된 펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한, 글리코실화(glycosylation), 측쇄 산화(side chain oxidation), 또는 인산화(phosphorylation)와 같은 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키기 위한, D-아미노산 또는 다른 아미노산 모사의 체내화를 포함한 다른 변형이 이용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열을 기반으로 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 합성에 적용될 수 있는 일반적인 펩티드 합성 방법은;
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Proteins, Vol 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis(일본어),Maruzen Co., 1975;
(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co., 1985;
(v) Development of Pharmaceuticals(제 2판)(일본어), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
(vi) WO99/67288; 및
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118을 포함한다.
또는, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 잘 알려진 유전자 공학 방법을 사용해서 얻을 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(Wu et al. 판) 1983, 101:347-62). 예를 들면, 우선, 목표 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 형태(예를 들면, 프로모터 서열에 해당하는 조절 서열의 아래부분(downstream))로 포함하여 적절한 벡터를 제조하고 적절한 숙주 세포에 형질전환한다. 그 다음에, 상기 숙주 세포를 원하는 펩티드를 제작하기 위해 배양한다. 또한 상기 펩티드는 시험관 내(in vitro) 번역 시스템을 사용하여 시험관 내에서 제조될 수도 있다.
Ⅳ. 폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 상기 언급한 펩티드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들은 자연에 존재하는 NEIL3 유전자(GenBank Accession No. NM_018248(예를 들어, 서열번호 44))및 그에서 유래한 폴리뉴클레오티드 및 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열로부터 유래한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서, 상기 용어"보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴로 인하여, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 모든 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCU및 GCG은 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌의 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩티드의 변경없이, 상기 코돈은 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이(silent variations)"라 하고, 보존적으로 변형된 변종의 한 종류이다. 펩티드를 암호화하는 본 발명의 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종도 나타낸다. 당업자는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 공개된 각 서열에서 암시적으로 기재되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 이들의 유도체로 구성될 수 있다. 당업계에 잘 알려진바와 같이, DNA는 A, T, C 및 G 등의 자연 염기로 적절하게 구성되고, T는 RNA에서는 U로 대체된다. 당업자는 폴리뉴클레오티드에 포함된 비자연적 염기들도 인지할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 개재 아미노산 서열의 유무를 불문하고 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 상기 개재 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들면, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대한 어떠한 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합형 폴리뉴클레오티드일 수 있고 또는 마커 유전자등을 가지는 발현 벡터(플라스미드)일 수도 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 폴리머라제 (polymerase)및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조할 수 있다.
재조합 기술 및 화학 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 반응능(competent) 세포에 형질전환되어 발현하는 적절한 벡터 내에 삽입하여 제작할 수 있다. 또는, PCR 기술 또는 적절한 숙주에서의 발현을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). 또는, Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재되어 있는 것과 같이, 고체상 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
Ⅴ. 엑소솜( Exosomes )
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜이라는 세포내 소낭을 제공한다. 엑소솜은 예를 들면, 일본 특허출원 제 11-510507호 및 WO99/03499에 설명된 방법을 사용하여 제조할 수 있고, 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 얻어진 APCs를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 상기 엑소솜은 본 발명의 상기 펩티드와 마찬가지로 백신으로써 접종할 수 있다.
복합체에 포함된 HLA 항원의 형태는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원의 형태와 일치해야 한다. 예를 들면, 일본인에 대하여, HLA-A24 및 HLA-A2, 특히, HLA-A*2402 및 HLA-A*0206이 대개 적절하다. 일본인과 백인에게서 높게 발현되는 A24 형태 또는 A2 형태의 사용은 효과적인 결과를 얻기 위해 도움이 되며, HLA-A*2402, A*0201 및 HLA-A*0206과 같은 아류형이 사용된다. 일반적으로, 임상에서는, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 형태는 미리 검사되고 있어, 특정 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화성을 갖거나, 항원제시에 의한 CTL 유도성을 가지는 펩티드를 적절하게 선택하는 것이 가능하게 된다. 또한, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 보여주는 펩티드를 얻기 위하여, 자연에 존재하는 NEIL3 펩티드 일부의 아미노산 서열을 바탕으로 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 또는 첨가가 실시될 수 있다.
본 발명의 상기 엑소솜에 대하여 A2 형태의 HLA 항원을 사용시, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21 및 22의 서열을 포함하는 펩티드가 사용된다.
한편, A-24 형태의 HLA 항원을 사용시, 서열번호 24, 33, 35, 41, 43 및 61중 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드가 사용된다.
Ⅵ. 항원제시세포( antigen - presenting cells , APCs )
또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드로 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 APCs를 제공한다. 본 발명의 펩티드를 접촉시키는 것에 의해, 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현 가능한 형태로 도입함으로써 얻을 수 있는 APCs는 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 유래할 수 있고, 그 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 다른 약물과 조합하여 투여할 수 있다.
상기 APCs는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않고, 림프구에 의해 인식되기 위하여, 세포 표면에 단백질성 항원을 제시하는 것이 알려져 있는 수지상세포(DC), 랑게르한스(Wrangel Hans) 세포, 마크로파지(macrophage), B세포 및 활성화 T 세포를 포함한다. 수지상세포는 강력한 CTL 유도 활성을 가지는 APCs 중 하나이므로, 수지상세포는 본 발명의 APCs로서 사용할 수 있다.
예를 들면, 말초혈액단핵세포로부터 수지상세포를 유도하고, 그런 다음 그것들을 시험관 내, 생체 내 또는 체외에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)시켜 APCs를 얻을 수 있다. 본 발명의 펩티드를 개체에 투여하면, 본 발명의 펩티드가 제시된 APCs가 개체의 체내에서 유도된다. 따라서 본 발명의 APCs는 본 발명의 펩티드를 개체에 주입한 후 개체에서 수집할 수 있다. 또는, 본 발명의 상기 APCs는 본 발명의 상기 펩티드가 주입된 개체로부터 수집한 APCs와 접촉함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 상기 APCs는 개체의 암에 대한 면역반응을 유도하기 위해 단독 또는 본 발명의 상기 펩티드, 엑소솜 또는 본 발명의 CTL을 포함하는 다른 약품과의 조합으로 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 체외 투여는 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 첫번째 개체로부터 APCs 수집하는 단계,
b: 단계 a의 APCs와 상기 펩티드의 접촉하는 단계, 및
c; 단계 b의 APCs를 두번째 개체에 투여하는 단계.
첫번째 개체와 두번째 개체는 같은 개체일 수 있고, 또는 다른 개체일 수 있다. 단계 b에서 얻어진 상기 APCs는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML과 같은 암 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, APCs는 높은 수준의 CTL 유도성을 가지고 있다. "높은 수준의 CTL 유도성"이라는 용어에 있어서, 상기 높은 수준은 펩티드와 접촉시키지 않는 APCs 또는 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉시킨 APCs의 CTL 유도성 수준과 비교한 CTL 유도성 수준이다. 높은 수준의 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 이러한 APCs는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 유전자를 시험관 내에서 APCs에 도입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 도입 유전자는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. 도입 방법으로는, 특별한 제한 없이, 본 기술분야에서 일반적으로 실시되는 다양한 방법, 예를 들면, 리포펙션(lipofection), 전기천공법 (electroporation), 또는 인산칼슘법 등의 방법이 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; 특허공보 제 2000-509281호에 기재된 것에 따라 실시할 수 있다. 유전자를 APCs로 도입함으로써, 상기 유전자는 세포 안에서 전사 및 번역을 겪고, 이렇게 얻어진 단백질은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 의해 처리되고, 제시 경로를 거쳐 본 펩티드 일부가 제시된다.
Ⅶ. 세포독성 T 세포( Cytotoxic T lymphocytes , CTLs )
본 발명의 임의의 펩티드에 대해 유도된 CTL은 생체 내에서 종양 관련 내피를 표적으로 하는 면역반응을 증강하고 그로 인하여 상기 펩티드와 같이 백신으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 임의의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화된 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다.
이러한 CTL은 (1)본 발명의 펩티드를 개체에 투여하거나 (2)본 발명의 펩티드와 함께 시험관 내에서 개체 유래 APCs, 및 CD8 양성 T 세포, 또는 말초혈액단핵림프구 접촉(자극) 또는 (3) CD8 양성 T 세포 또는 말초혈액단핵림프구와 시험관 내에서 그것의 표면에 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 APCs 또는 엑소솜의 접촉 또는 (4) 상기 CTL에 본 발명의 펩티드에 결합하는 T 세포 수용체 아단위(subnit)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자의 도입으로 얻어질 수 있다. 이러한 APCs 및 엑소솜은 상기 기재한 (4)의 방법 및 상세내용으로 준비될 수 있으며, (4)의 방법은 아래 "VIII. T 세포 수용체 (TCR)" 부분에서 상세히 기재된다.
본 발명의 CTL은 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 개체로부터 유래할 수 있고, 그 자체, 또는 조절 효과의 목적을 위한 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하여 다른 약물과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 얻어진 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드, 예를 들어, 유도를 위해 사용한 것과 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 암세포와 같은 NEIL3를 내생적으로 발현하는 세포, 또는 NEIL3 유전자가 형질전환된 세포이고; 본 발명의 펩티드에 의한 자극에 의해 세포 표면에 상기 펩티드를 제시하는 세포도 활성화된 CTL 공격의 표적이 될 수 있다.
Ⅷ. T 세포 수용체(T cell receptor , TCR )
또한, 본 발명은 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)의 아단위(subunit)를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 상기 TCR 아단위(subunit)는 NEIL3를 제시하는 종양세포에 대한 특이성을 T 세포에 부여하는 TCR 형성 능력을 가진다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 한 개 또는 그 이상의 펩티드로 유도된 CTL의 TCR 아단위로서 α 측쇄 및 β 측쇄의 핵산을 동정할 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288, 2003). 예를 들면, PCR 방법은 TCR을 분석하는데 바람직하다. 상기 분석을 위한 PCR 프라이머는, 예를 들어, 5' 측(side) 프라이머로서 5'-R 프라이머(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3')(서열번호 48) 및 TCR 알파 사슬(alpha chain) C 부위에 특이적인 3-TRa-C 프라이머(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3')(서열번호 449), TCR 베타 사슬(beta chain) C1 부위에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3')(서열번호 50) 또는 3' 측(side) 프라이머로서 TCR 베타 사슬 C2 부위에 특이적인 3-TRbeta-C2 프라이머(5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3')(서열번호 51)일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. TCR 유도체는 NEIL3를 제시하는 표적 세포에 높은 결합력으로 결합할 수 있고, 상기 NEIL3 펩티드를 제시하는 표적 세포의 효과적인 사멸을 생체 내 또는 시험관 내에서 선택적으로 매개할 수 있다.
TCR 아단위를 암호화하는 핵산은 적절한 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터와 같은 적합한 벡터에 삽입할 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 핵산 또는 이를 포함하는 벡터는 T 세포, 예를 들면, 환자 유래의 T 세포 내에 유용하게 도입될 수 있다. 유용하게는, 본 발명은 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유 동물의 T 세포)의 빠른 변경에 의해, 뛰어난 암 세포 사멸 특성을 갖는 변경된 T 세포를 빠르고 쉽게 제작하는 것을 가능하게 하는 즉시 사용 가능한(off-the-shelf) 조성물을 제공한다.
상기 특이적인 TCR은 특이적으로 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체를 특이적으로 인지하고, 상기 TCR이 상기 T 세포 표면에 있을 때, 상기 표적 세포에 대한 T 세포 특이적 활성을 제공할 수 있는 수용체이다. 상기 복합체의 특이적 인식은 어떠한 알려진 방법에 의해 확인될 수 있으며, 바람직한 방법은, 예를 들어, HLA 분자 및 본 발명의 펩티드를 이용하는 HLA 멀티머(multimer) 염색법(staining analysis)과 ELISPOT 분석을 포함한다. ELISPOT분석을 수행함으로써, 세포 표면에 TCR을 발현하는 상기 T 세포가 TCR로 세포를 인식하고, 상기 신호가 세포 내부적으로 전환된다.
또한, 상기-언급된 복합체가 T 세포의 표면에 존재할 때 T 세포 독성 활성을 줄 수 있는지의 확인은 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 방법은, 예를 들어, HLA 양성 표적 세포에 대한 독성 활성의 측정을 이용하는 크로미움(chromium) 분비 분석을 포함한다.
또한, 본 발명은 예를 들어, HLA-A2 에 포함된 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21 및 22의 NEIL3 펩티드 및 또한 HLA-A24에 포함된 24, 33, 35, 41 및 43의 NEIL3 펩티드에 결합하는 TCR 아단위 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질전환하여 제조한 CTL을 제공한다.
상기 형질전환된 CTL은 생체 내에서 암세포로 홈밍(homing)할 수 있으며, 잘 알려진 시험관내 배양 방법으로 증식시킬 수 있다(예를 들면, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). 본 발명의 상기 CTL은 치료나 보호를 필요로 하는 환자의 암의 치료 또는 예방에 유용한 면역학적 조성물을 구성하는데 쓰일 수 있다(WO2006/031221).
IX . 약학적 물질 또는 조성물
예방 및 방지는 질환 유래의 사망률 또는 발병률의 부담을 감소하는 어떠한 활동을 포함한다. 예방 및 방지는 "1차, 2차 및 3차 예방 단계 ”를 일으킬 수 있다. 1차 예방 및 방지는 질환의 발달을 피하는 한편, 2차 및 3차 수준의 예방 및 방지는 질환의 진행 및 증상의 위험성의 예방과 방지 및 기능을 회복시키고 질환-관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 발생한 질환의 부정적인 영향을 감소하는 활동을 포함한다. 또는, 예방 및 방지는 광범위한 특정한 질환의 고통을 완화를 위한 예방적 치료, 예를 들면 종양의 전이와 증식을 감소하는것, 혈관형성을 감소하는 것을 포함한다.
암의 예방에 대한 치료 및/또는 그것의 수술 후 재발의 방지는 다음 단계 중 어떤 것을, 예를 들어 암 세포의 수술적 제거, 암의 세포의 성장 저해, 종양의 퇴화 또는 회귀, 암의 발생의 차도 및 억제의 유도, 종양 회귀 및 전이의 저해 또는 감소를 포함한다. 효과적인 암의 치료 및/또는 예방은 사망자수를 감소시키며, 암을 가지고 있는 개개인의 예후를 향상시키고, 혈중 종양 마커의 수준을 감소시키고, 암과 수반되는 증상을 완화시킨다. 예를 들면, 증상의 개선 또는 감소는 효과적으로 치료된 것으로 여겨지며 및/또는 상기 방지는 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정한 질환을 포함한다.
NEIL3 발현은 정상조직에 비해 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML을 포함하는 암에서 특이적으로 증가되어 있기 때문에, 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발에 대한 예방에 쓰일 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하는 약학적 물질 또는 조성물을 제공하며, 이는 하나 또는 다수의 펩티드, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드는 상기 엑소솜 또는 약학적 물질 또는 조성물로서 사용되는 APCs와 같은 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 추가로, 상기 언급한 본 발명의 임의의 펩티드를 표적으로 하는 세포독성 T 세포는 또한 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물의 유효 성분으로서 사용될 수 있다.
본 약학적 물질 또는 조성물은 백신으로 사용된다. 본 발명에서, 용어 "백신"(또한 면역성의 조성물로 나타내는)은 동물에게 접종시 항-종양 면역력을 유도하는 기능을 가진 물질을 나타낸다.
본 발명의 상기 약학적 약제 또는 조성물은 인간 또는 이에 한정하지 않으나, 마우스(mouse), 랫(rat), 기니아-피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지, 특이적으로 상업적으로 중요한 동물 또는 가축을 포함하는 어떠한 다른 포유동물을 포함하는 개체에서 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 그것의 수술 후 재발 방지에 쓰일 수 있다.
다른 실시태양에서, 또한 본 발명은 암 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 물질을 제조하는데 있어서, 하기 선택되는 유효 성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또한, 본 발명은 추가적으로 암 또는 종양의 치료 또는 예방에 사용을 위한 하기로부터 선택되는 유효성분을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또한, 본 발명은 추가적으로 암 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 유효성분으로서 하기로부터 선택되는 약학적으로 또는 생리활성적으로 허용가능한 유효 성분이 있는 운반체를 제형화하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜;및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 종양 또는 암을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 물질 제조 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 하기로부터 선택되는 유효성분이 있는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 운반체를 혼합하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜;및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
본 발명에 따르면, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드들은 HLA-A24 또는 HLA-A2 에 제한된 에피톱 펩티드인 것이 알려졌다. 따라서, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43의 아미노산 서열을 갖는 이러한 펩티드들의 어느 것을 포함하는 상기 약학적 물질 또는 조성물은 특이적으로 HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 개체에 투여에 대해 적합하다. 마찬가지로 이러한 펩티드들 중 어떤 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 물질 또는 조성물에 적용한다(예를 들면, 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드).
본 발명의 약학적 물질 또는 조성물에 의해 치료된 암은 한정되지 않으나, NEIL3가 관련된 , 예를 들어, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML과 같은 암을 포함한다.
상기 약학적 물질 또는 조성물은 상기 기재한 유효 성분에 더하여, 암 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력이 있는 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드들을 제시하는 다른 세포를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 암세포에 대해 CTL을 유도하는 능력을 가지는 다른 펩티드들도 암 특이적 항원(예를 들어, 확인된 TAA들)에 의해 증폭되나 이에 한정하지 않는다.
상기 물질은, 예를 들면 본 발명의 펩티드들 중 어느 하나, 유효 성분의 항 종양 효과를 저해하지 않는 한, 필요하다면 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 유효 성분으로서 다른 치료적 물질을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 물질 또는 조성물은, 항염증 조성물, 진통효과, 화학요법제 및 기타 같은 종류의 것을 포함할 수 있다. 그것의 약물 안에 다른 치료적 물질 또는 조성물에 더하여, 본 발명의 약물은 역시 하나 또는 그 이상의 다른 조성물과 단계적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약물 및 약학적 물질 및 조성물의 양은, 예를 들면, 쓰이는 약학적 물질 및 조성물의 유형, 치료되는 질환, 투여의 일정과 방법에 달려있다.
본 명세서에서 특히 언급한 성분에 더하여, 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 논의가 되고 있는 형태의 제형을 갖는 종래의 다른 물질 또는 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 상기 약학적 물질 또는 조성물은, 예를 들어 암과 같은, 질환의 병리학 조건을 치료하는데, 유용한 물질을 포함하는 제품 및 키트에 포함될 수 있다. 상기 제품은 라벨이 있는 상기 약학적 물질 또는 조성물 중 어느 하나의 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이알 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 병 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 상기 용기의 라벨은 상기 질환의 한 개 또는 그 이상의 조건의 치료 또는 예방에 쓰이는 물질 또는 조성물인 것을 나타내야 한다. 또한 라벨은 투여 지시 및 기타의 것에 대해 나타낼 수 있다.
상기 기재한 용기에 더하여, 또한 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물을 포함한 키트는 선택적으로 약학적으로 허용할 수 있는 희석액을 보관하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 또한 이것은 상업적 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질, 다른 버퍼, 희석액, 필터, 니들, 주사기 및 사용설명서를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효 성분이 포함된 한 개 또는 그 이상의 구성 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 용기 장치에 존재할 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 블리스터 포장같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치는 투여에 대한 지시에 의해 동반될 수 있다.
(1)상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 물질 또는 조성물.
본 발명의 펩티드들은 약학적 물질 또는 조성물로 직접적으로 투여될 수 있으며, 또는 필요하다면, 종래의 제조 방법에 의해 제조되기도 한다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드들에 더하여, 운반체, 부형약 및 이러한 것이 특이적 제한 없이 포함될 수 있다. 이러한 운반체들은 멸균된 물, 생리학적 살린, 포스패이트 버퍼, 배양 유액 등이다. 또한, 상기 약학적 물질 또는 조성물은 필요하다면, 안정제, 현탁액, 보존료, 계면활성제등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드들은 생체 내에서 CTL을 유도하기 위해, 본 발명의 펩티드들 중 두 개 또는 그 이상을 포함하는 조합으로 준비될 수 있다. 상기 펩티드들은 혼합제의 형태를 가질 수 있고, 또는 표준 기술을 이용하여 각각 다른 것이 접합될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드들은 화학적으로 연결되거나, 링커로서 하나 또는 여러개의 아미노산을 가질 수 있는 단독 융합 폴리펩티드 서열로서 발현될 수 있다(예를 들어, Lysine linker: K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715). 상기 조합의 펩티드들은 같거나 다를 수 있다. 본 발명의 펩티드들을 투여함으로써, 펩티드들은 APCs에 HLA 항원에 의해 높은 밀도로 제시되며, 그 후에 제시된 펩티드 및 HLA 항원으로 구성된 복합체에 대해 특이적으로 반응하는 CTL은 유도된다. 또는, 본 발명의 어떤 상기 펩티드를 그들의 세포 표면에 제시하는 APCs를 수득하기 위해, APCs(예를 들면, DCs)는 개체에서 제거되고, 본 발명의 펩티드에 의해 자극된다. 이 APCs는 개체에서 CTLs를 유도하기 위하여 개체에 투여되고, 그 결과로서, 종양-관련 내피에 대한 침해성이 증가할 수 있다.
본 발명의 어떤 펩티드를 활성 구성요소로서 포함하는 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방에 대한 상기 약학적 물질 또는 조성물은 보조약을 포함할 수 있어서 세포 면역을 효과적으로 구축하고, 또는 다른 유효 성분과 함께 투여되고, 및 그래뉼 제형으로 투여될 수 있다. 보조약은 면역학적으로 활성이 있는 단백질과 함께 (또는 연속적으로)투여하였을 때, 단백질에 대해 면역반응을 증가시키는 어떠한 화합물, 물질 또는 조성물을 나타낸다. 적용될 수 있는 보조약은 문헌에 기재되어 있는 것들을 포함한다(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). 보조약의 예는 알루미늄 포스패이트(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), 알럼(alum), 콜레라 톡신(cholera toxin), 살모넬라 톡신(salmonella toxin), 불완전 프로인트 보조약(Incomplete Freund's adjuvant, IFA), 완전 프로인트 보조약(Complete Freund's adjuvant, CFA), 이스코메트릭스(ISCOMatrix), GM-CSF, CpG, O/W 에멀전(emulsion), 등등을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다.
또한, 리포좀 제형, 미세한 마이크로미터 지름의 비드가 결합된 펩티드가 있는 그래뉼 제형 및 리피드가 결합되는 펩티드 제형이 편리하게 쓰일 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 또한 본 발명의 펩티드들은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. 염의 바람직한 예는 알카리 메탈이 있는 염, 메탈이 있는 염, 유기 염기가 있는 염, 유기산이 있는 염 및 무기산이 있는 염을 포함한다.
몇몇의 실시태양에서, 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 CTL을 준비하는 구성요소를 포함한다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체 내에서 CTL을 준비시킬 수 있는 물질 또는 조성물로 확인되었다. 예를 들면, 팔미트 산 잔기(palmitic acid residues)는 라이신 잔기의 엡실론-아미노(epsilon-amino) 및 알파-아미노(alpha-amino) 그룹에 붙여질 수 있으며, 그 후에 본 발명의 펩티드들과 연결될 수 있다. 지질화 펩티드들은 리포좀으로 도입 또는 보조약 안에 유화되어 마이셀 또는 입자 안에 직접적으로 투여될 수 있다. CTL 반응을 준비시키는 지질의 또 다른 예로, 적절한 펩티드들에 공유적으로 붙일 때, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지단백질이 CTL을 준비하는 것에 사용될 수 있다(참조, 예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).
투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소적 투여일 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 등등에 알맞게 적용될 수 있으며, 보통 0.001 mg 내지1,000 mg, 예를 들면, 0.001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 10 mg이며, 며칠에서 몇 달에 한 번 투여될 수 있다.
(2)폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 물질 또는 조성물
또한, 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에서 공개된 펩티드(들)를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 용어 "발현할 수 있는 형태”는 세포 안으로 상기 폴리뉴클레오티드가 도입되었을 때, 생체내에서 폴리뉴클레오티드가 항 종양 면역을 유도하는 폴리펩티드로 발현될 것임을 의미한다. 예시된 실시태양에서, 관심 있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현에 대해 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 세포의 유전체로 안정한 삽입을 향상시키기 위해 준비될 수 있다(참조, 예를 들어, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors. 또한, 참조, 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; U.S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720). DNA-기반의 전달 기술의 예로서 “네이키드 DNA(naked DNA)”, 용이한 전달(부피바카인(bupivacaine), 폴리머, 펩티드-매개), 양이온 지질 복합체 및 입자-매개("유전자 총”)또는 압력-매개 전달을 포함한다(참조, 예를 들어, U.S. Patent No. 5,922,687).
또한, 본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 세균 벡터로 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예로 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은 백시니아 바이러스의 사용, 예를 들어, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터를 포함한다. 숙주에 도입하였을 때, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 면역성 펩티드를 발현하고, 그렇게 함으로써 면역 반응을 유도한다. 면역법 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은, 예를 들어, U.S. Patent No. 4,722,848에 기재되어 있다. 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재되어 있다. 치료상의 투여 또는 면역법에 대한 유용한 다양한 다른 벡터들, 예를 들어, 아데노 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이럴 벡터, 살모넬라 타이피 벡터, 독성이 없는 탄저균 독소 벡터, 기타 같은 종류의 것이 분명할 것이다. (참조, 예를 들어, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85).
환자에 폴리뉴클레오티드의 전달은 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 환자가 직접적으로 노출되는 경우 또는 세포가 시험관 내에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 첫 번째로 형질 전환된 후, 세포가 환자에 이식되는 경우 중 어느 것이 될 수 있다. 이 두 가지 방법이 각각 생체 내 및 체외 유전자 치료법으로 알려져 있다.
유전자 치료의 상기 방법의 일반적인 리뷰는 (참조 Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215)를 참조한다. 또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 재조합 DNA의 일반적으로 당업계에 알려진 방법은 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; and Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재되어 있다.
투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소적 투여일 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 적절한 담체에 포함된 상기 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 등등에 알맞게 적용될 수 있으며, 그리고 보통 0.001 mg 내지1000 mg, 예를 들면, 0.001 mg 내지 1000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 10 mg이며, 몇 일에서 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 용량을 적절히 선택할 수 있다.
X.펩티드, 엑소솜 , APCs 및 CTL 을 이용하는 방법
본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 APCs와 CTL을 준비 또는 유도하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소솜 및 APCs는 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APCs는 화합물이 그들의 CTL 유도성을 저해하지 않는 한 어떠한 다른 화합물의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기에 언급한 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물 중 어떤 것은 CTL을 유도하는데 사용될 수 있으며, 그것에 더하여, 또한 이러한 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것은 아래 기재된 것과 같이 APCs를 유도하는데 사용될 수 있다.
(1) 항원제시세포(antigen-presenting cells, APCs) 유도 방법
본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 높은 CTL유도성이 있는 APCs를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 시험관 내, 체 외 또는 생체 내에서 본 발명의 펩티드를 APCs와 접촉하는 하기 단계를 포함한다. 예를 들어, 체외에서 펩티드와 APCs를 접촉하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계; 및
b: 펩티드와 단계 a의 APCs를 접촉하는 단계.
APCs는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않으며, 림프구에 의해 인식되기 위해서 단백질성의 항원을 그들의 세포 표면에 발현하는 것으로 알려져 있는 수지상세포, 랑게르한스 세포, 대식세포, B 세포 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 바람직하게는, DCs는 APCs들 사이에서 그들이 가진 제일 강한 CTL 유도성 때문에 쓰일 수 있다. 본 발명 중 어떤 펩티드는 단독으로서 또는 본 발명의 다른 펩티드들과 함께 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 펩티드들이 개체에 투여될 때, APCs는 생체 내에서 상기 펩티드들과 접촉되고, 결과적으로, 높은 CTL 유도성을 가진 APCs는 개체의 몸에서 유도된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 상기 펩티드들을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드들이 발현할 수 있는 형태로 개체에 투여될 때, 본 발명의 상기 펩티드들은 발현되고 생체 내에서 APCs와 접촉되고, 결과적으로, 상기 높은 CTL 유도성을 가진 APCs는 개체의 몸에서 유도된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드를 개체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. “발현할 수 있는 형태”는 상기 부분 "IX. 약학적 물질 또는 조성물, (2) 유효 성분으로 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 물질 또는 조성물"에서 정의된다.
또한, 본 발명은, CTL 유도성이 있는 APCs를 유도하기 위해 APCs 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다.
a: 개체로부터 APCs의 수집; 및
b: 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 도입.
단계 b는 상기 부분 "VI. 항원 제시 세포"에 기재한 것과 같이 수행될 수 있다.
또는, 본 발명은 NEIL3에 대한 CTL 활성을 특별히 유도하는 항원-제시 세포(APC)를 준비하기 위한 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 생체 외에서, 탈체 또는 생체 내에서 본 발명의 펩티드와 APC가 접촉하는 단계; 및
(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입하는 단계.
(2) CTL 유도 방법
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 엑소솜 또는, APCs를 이용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 복합체를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 아단위(subunit)를 형성함으로써 가능하다.
바람직하게, CTL을 유도하기 위한 상기 방법은, 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 한 단계를 포함할 수 있다:
a) CD8 양성 T 세포를 그것의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 APCs 및/또는 엑소솜과 접촉시키는 단계; 및
b) 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원폴리펩티드 복합체를 인식하는 TCR 아단위를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 세포로 도입하는 단계.
본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APCs 또는 엑소솜이 개체로 투여될 때, CTL은 개체의 몸에서 유도되고, 표적하는 암세포에 대한 면역 반응의 강도는 향상된다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APCs 또는 엑소솜을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
또는, CTL은 그들을 이용해 체외에서도 유도될 수 있고, CTL 유도 후에, 활성화된 CTL은 개체에 되돌려 질 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;
b: 단계 a의 APCs와 상기 펩티드가 접촉하는 단계; 및
c: CD8-양성 세포와 단계 b)의 APCs와 공배양하는 단계.
상기 단계 c에서 CD8-양성 세포와 공배양된 APCs는 상기 "VI. APCs" 부분에서 기재한 것과 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 APCs에 형질전환함으로써 준비될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 펩티드 및 HLA항원의 복합체를 그것의 표면에 효과적으로 제시하는 어떤 APCs는 본 방법을 위해 사용될 수 있다.
이러한 APCs 대신에, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 엑소솜도 역시 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명은 그것의 표면에 HLA항원 복합체와 본 발명의 펩티드를 제시하는 엑소솜을 공-배양하는 단계를 포함한다. 이러한 엑소솜은 상기 "V. 엑소솜" 부분에서 기재한 방법에 의해 준비될 수 있다.
또한, CTL은 본 발명의 펩티드에 결합하는 TCR 아단위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 CD8-양성 세포에 도입함으로써 유도될 수 있다. 이러한 형질 도입은 상기 "VIII. T세포 수용체 (TCR)" 부분에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 CTL을 유도하는 약학적 물질 또는 조성물은 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체를 혼합 또는 제조하는 단계를 포함한다.
(3)면역반응을 유도하는 방법
또한, 본 발명은 NEIL3에 관련된 질환에 대해 면역반응 유도 방법을 제공한다. 적합한 질환은, 예를 들어, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법은 본 발명의 펩티드들 중 어느 것 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 물질 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 역시 본 발명의 펩티드들 중 어느 것을 제시하는 엑소솜 또는 APCs의 투여를 고려할 수 있다. 상세하게는, "IX. 약학적 물질 또는 조성물"의 항목을 참조하고, 특히 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물이 백신으로 사용된 것을 기재한 부분을 참조하라. 또한, 상기 엑소솜과 APCs는 "V. 엑소솜", "VI. APCs(APCs)" 및 "X. 펩티드, 엑소솜, APCs 및 CTL을 사용한 방법"의(1) 및 (2)의 항목 하에 세부항목에 기재된 면역 반응을 유도하는 방법에 대해 적용될 수 있다.
또한 본 발명은 면역반응을 유도하는 약학적 물질 또는 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체를 혼합 또는 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
또는, 본 발명의 방법은 하기를 포함하는, 백신 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 또는
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
본 발명에서, NEIL3가 과발현되는 암은 이러한 유효 성분으로 치료될 수 있다. 상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 따라서, 유효 성분을 포함한 약학적 조성물 또는 백신의 투여에 앞서, 치료되기 위한 세포 또는 조직에서 NEIL3의 발현 수준이 같은 기관의 정상 세포에 비해 증가 되었는지 확인하는 것이 바람직하다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 하기 단계를 포함할 수 있는 NEIL3를 (과)발현하는 암을 치료하는 방법을 제공한다:
i) 치료되기 위한 암이 있는 개체로부터 얻어지는 세포 또는 조직에서 NEIL3의 발현 수준을 확인하는 단계;
ii) 정상 대조군과 상기 NEIL3의 발현 수준을 비교하는 단계; 및
iii) (a) 내지 (d)로 구성된 상기 기재된 군으로부터 적어도 한 가지 선택되는 구성요소를 정상 대조군에 비해 NEIL3가 과발현되는 암이 있는 개체에 투여하는 단계.
또는, 본 발명은 또한, NEIL3가 과발현하는 암이 있는 개체로 투여하는데 이용하기 위하여, 상기 기재된 (a) 내지 (d) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 한 가지 구성요소를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물을 제공한다. 다시 말해서, 본 발명은 또한 본 발명의 NEIL3 폴리펩티드가 처리되는 개체를 확인하는 방법을 제공하며, 이 방법은 개체 유래 세포 또는 조직에서 NEIL3의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함할 수 있고, 본 발명에 있어서, 정상 대조군에 비해 발현 수준의 증가한 것은 그 개체가 본 발명의 NEIL3 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암을 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 본 발명의 암 치료 방법은 하기에 더욱 자세히 기재될 것이다.
본 발명의 맥락에서, 암이 아닌 것으로 알려진 생물학적 시료 유래에 의해 확인된 대조군 수준은 “정상 대조군 수준”으로 나타낸다. 한편에, 만약 대조군 수준이 암의 생물학적 시료로부터 확인되면, “암 대조군 수준”으로 나타낸다.
본 발명의 방법에 의해 치료되는 개체는 포유류인 것이 바람직하다. 적절한 포유류는, 예를 들어, 인간, 영장류(non-human primate), 쥐(mouse), 랫(rat), 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따르면, 개체로부터 얻어진 세포 또는 조직에서 NEIL3의 발현 수준이 결정된다. 상기 발현 수준은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 전사(핵산) 산물 수준에서 결정될 수 있다. 예를 들면, NEIL3의 mRNA는 혼성화 방법으로 탐침을 이용하여 정량될 수 있다(예를 들어, Northern hybridization). 탐지는 칩, 어레이 또는 그런 것으로 수행될 수 있다. 어레이의 사용이 NEIL3의 발현 수준을 탐지하는데 바람직할 것이다. 당업자들은 이러한 NEIL3의 서열정보를 이용하여 탐침을 제조할 수 있다. 예를 들면, NEIL3의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광 물질 및 동위원소와 같은, 적절한 표지로 표지될 수 있으며, 유전자의 발현 수준은 혼성화된 표지의 강도로 탐지될 수 있다.
또한, NEIL3(예를 들어, 서열번호 45)의 전사 산물은 증폭-기반 탐지 방법에 의해 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다(예를 들면, RT-PCR). 이러한 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 기반으로 제조될 수 있다.
특히, 상기 제시된 방법에 대해 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한 상태, 적절하게 엄격한 상태 또는 낮게 엄격한 상태 하에서 NEIL3의 mRNA와 혼성화된다. 본 명세서에 사용되었던, 상기 용어 “엄격한(혼성화) 조건”은 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화하는 조건을 나타내지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경하에서 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적 혼성화는 짧은 서열에 비해 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열 융해점(Thermal melting point, Tm)보다 약 5 ℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은 (정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 50%의 상기 탐침이 상보적으로 상기 표적 서열에 동등하게 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열이 일반적으로 과다하게 존재하므로, Tm에서 상기 탐침의 50%는 동등하게 점유된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 염 약 1.0 M 소듐 이온 미만인 농도일 수 있으며, 일반적으로, pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M 소듐 이온 (또는 다른 염들) 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 약 30 ℃이고, (예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드) 긴 탐침 또는 프라이머에 대해서는 적어도 약 60 ℃이다. 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정화 물질의 첨가로 얻을 수 있다.
또는, 번역 산물은 본 발명의 진단을 위해 탐지될 수 있다. 예를 들면, NEIL3 단백질(서열번호 45)의 양 또는 그것의 면역학적 단편들은 결정될 수 있다. 번역 산물로서 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 단백질을 인식하는 특이적 항체를 사용한 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 또한, 상기 단편 또는 변형된 항체가 NEIL3 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 카이메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등등)은 탐지를 위해 쓰일 수 있다. 또한, 본 발명에 의하여, 본 발명의 펩티드 및 그것의 단편에 대한 이러한 항체가 제공된다. 단백질의 탐지를 위해 이러한 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 본 발명에서 이러한 항체 및 그들의 등가물을 준비하는 것에 적용될 수 있다.
NEIL3 유전자 발현 수준을 탐지하기 위한 다른 방법은 그것의 번역 산물에 기초하기 때문에, 염색의 강도는 NEIL3 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직학적 분석을 통해 측정될 수 있다. 다시 말해서, 이러한 측정에서, 강한 염색은 증가된 단백질의 존재 수준 및, 동시에, NEIL3 유전자의 높은 발현수준을 나타낸다.
암세포에서의 표적 유전자, 예를 들어, NEIL3 유전자의 발현 수준은, 예를 들어, 10%, 25%, 또는 50% 또는 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2.0배 이상, 5.0배 이상, 10.0배 이상 또는 그 이상과 같이, 상기 표적 유전자의 상기 대조군 수준으로부터 수준이 증가된 것에 따라 확인될 수 있다(예를 들면, 정상 세포의 상기 수준).
상기 대조군 수준은 질환 상태(암에 걸린 또는 암에 걸리지 않은)라고 알려진 개체로부터 이전에 수집되고 저장된 샘플을 이용함으로써 상기 암세포와 동시에 확인될 수 있다. 또한, 치료되기 위한 암을 가지는 조직의 암이 없는 부분에서 얻어진 정상 세포는 정상 대조군으로 사용될 수 있다. 또는, 상기 대조군 수준은 이전에 질환 상태에 있다고 알려진 개체 유래 샘플에서 확인된 NEIL3 유전자의 발현 수준을 분석함으로써 얻어진 상기 결과를 기반으로 하는 통계학적인 방법으로 확인될 수 있다. 또한, 이전에 시험된 세포의 발현 패턴 데이타베이스로부터 대조군 수준은 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 측면에 따르면, 생물체의 샘플 안의 NEIL3 유전자의 발현 수준은 대조군 수준과 복수로 비교될 수 있으며, 복수 표준 시료로부터 결정될 수 있다. 개체 유래 생물체의 시료와 유사한 조직 형태로부터 유래된 참조 시료로부터 대조군을 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태로 알려져 있는 군의 NEIL3 유전자의 발현 수준의 기준치를 이용하는 것이 바람직하다. 기준치는 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D. 의 범위는 기준치로 쓰일 수 있다.
NEIL3 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준에 비해 증가되었을 때, 또는 암 대조군 수준에 유사하거나/동등할 때, 개체는 치료되기 위한 암이 있는 것으로 진단될 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 하기의 단계를 포함할 수 있는 (i) 치료되기 위한 암이 있을 것으로 의심되는 개체를 진단, 및/또는 (ii) 암 치료에 대한 개체를 선택 방법을 제공한다:
a) 치료되기 위한 암이 있다고 의심되는 개체로부터 얻어지는 세포 또는 조직에서 NEIL3의 발현 수준을 측정하는 단계;
b) 정상 대조군 수준과 NEIL3 발현 수준의 비교하는 단계;
c) 만약 NEIL3의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가되었다면, 치료되기 위한 암을 가지는 개체로 진단하는 단계 ; 및
d) 만약 개체가 단계 c)에서 치료될 암을 가지고 있다고 진단되었다면, 암 치료에 대한 개체로 선택하는 단계.
또는, 이러한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a) 치료되기 위한 암이 있다고 의심되는 개체로부터 얻어진 세포 또는 암 조직에서 NEIL3의 발현 수준을 측정하는 단계;
b) 암 대조군 수준과 NEIL3의 발현 수준 비교하는 단계;
c) 만약 NEIL3의 발현 수준이 암 대조군 수준과 유사하거나 또는 동등하다면, 치료되기 위한 암을 가진 개체로 진단하는 단계;및
d) 만약 단계 c)에서 치료될 암을 가진 것으로 진단되었다면, 암 치료에 대한 개체로 선택하는 단계.
또한, 본 발명은 본 발명의 NEIL3 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암으로 고통받는 개체 또는 고통받을 거라고 의심되는 개체를 진단 또는 확인하기 위한, 암 면역치료의 효율 또는 적용범위를 평가 및/또는 모니터링하는데 사용할 수 있는 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML을 포함하지만 이에 한정하지 않는다. 더욱 구체적으로, 상기 키트는 바람직하게 개체 유래 암 세포 안의 NEIL3유전자의 발현을 탐지하기 위한 적어도 한 가지 시약을 포함할 수 있으며, 이러한 시약은 하기의 군으로부터 선택될 수 있다:
(a) NEIL3 유전자의 mRNA 탐지를 위한 시약;
(b) NEIL3 단백질 또는 그것의 면역학적 단편의 탐지를 위한 시약; 및
(c) NEIL3 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 시약.
NEIL3유전자의 mRNA를 탐지하기 위한 적절한 시약은 특이적으로 결합 또는 NEIL3 mRNA를 확인하는 NEIL3 mRNA의 부분에 대한 상보적 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산을 포함한다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 NEIL3 mRNA에 특이적인 프라이머 및 탐침으로 증폭될 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 준비될 수 있다. 만약 필요하다면, NEIL3 mRNA를 탐지하기 위한 시약은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 또한, NEIL3 mRNA를 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트 안에 포함될 수 있다.
한편, NEIL3 단백질 또는 그것의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 적절한 시약은 NEIL3 단백질 또는 그것의 면역학적 단편에 대한 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다.
또한 단편 또는 변형된 항체가 NEIL3 단백질 또는 그것의 면역학적 단편에 결합하는 능력을 유지하는 한, 상기 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 카이메릭 항체,scFv, Fab, F(ab')2, Fv 등등)은 시약으로 사용될 수 있다. 단백질 탐지를 위한 이러한 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 이러한 항체 및 그것의 등가물을 준비하는 방법도 본 발명에서 적용될 수 있다. 또한, 항체는 직접적인 연결 또는 간접적인 표지 기술을 통해 신호 발생 분자로 표지될 수 있다. 표지 및 항체 표지에 대한 방법 및 그들의 표적으로 항체의 결합을 탐지하는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 표지 및 방법은 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, NEIL3 단백질을 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트 안에 포함될 수 있다.
상기 키트는 상기 언급한 시약의 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 암 또는 암으로부터의 고통이 없는 개체로부터 얻어진 조직 샘플은 유용한 대조 시약으로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 바람직한 상업적 및 사용자의 관점으로부터, 버퍼, 희석액, 필터, 바늘(needles), 주사기 및 사용설명서(예를 들어, 문서, 테잎, CD-ROM)를 포함하는 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 시약들 및 등등은 레이블과 함께 용기에 보관될 수 있다. 적절한 용기는 병(bottles), 바이알(vials), 및 테스트 튜브(test tube)가 포함될 수 있다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 이루어졌을 수 있다.
본 발명의 실시태양에서, NEIL3 mRNA에 대한 탐침이 시약일 때, 상기 시약은 탐지 부위가 적어도 한 개로 구성되는 다공성 스트립과 같은 고체 메트릭스에 고정화될 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 탐지는 각각의 구성하는 핵산(탐침)부위의 많은 수를 포함할 수 있다. 시험 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 또는, 대조군 부위는 시험 스트립으로부터 분리된 스트립에 위치할 수 있다. 선택적으로 다른 탐지 부위는 고정화된 핵산의 다른 양, 즉, 첫번째 탐지 부위의 높은 양 및 다음 부위 안의 적은 양을 포함할 수 있다. 시험 시료를 더했을 때, 탐지가능한 신호를 제시하는 부위의 수는 시료 안에 존재하는 NEIL3 mRNA의 양의 정량적 지표를 제공한다. 상기 탐지 부위는 어떠한 적절하게 탐지가능한 모양으로 구성될 수 있으며, 일반적으로 시험 스트립의 바 또는 닷 스패닝(dot spanning) 상기 너비 안에 있다.
또한, 본 발명의 키트는 양성 대조군 시료 또는 NEIL3 표준 시료를 포함한다. 상기 본 발명의 양성 대조군 시료는 NEIL3 양성 시료를 수집하고, 그 후에 그들의 NEIL3 수준을 분석함으로써 준비될 수 있다. 또는, 정제된 NEIL3 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 양성 시료 또는 NEIL3 표준 시료를 형성하기 위해 NEIL3를 발현하지 않는 세포에 더해질 수 있다. 본 발명에서, 정제된 NEIL3는 재조합 단백질일 수 있다. 상기 양성 대조군 샘플의 NEIL3 수준은, 예를 들면, 상기 컷 오프 수준(cut off value) 이상이다.
한 실시태양에서, 또한, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 그것의 단편을 특별히 인식할 수 있는 단백질 또는 그것의 단백질 일부를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 단백질의 펩티드 일부의 예는 최소 8개, 바람직하게 15개, 및 더욱 바람직하게 20개의 본 발명의 단백질의 아미노산 서열의 아미노산으로 연결되어 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 암은 본 발명의 단백질 또는 펩티드(폴리펩티드)를 사용하여 시료(예를 들어, 피, 조직)에서 항체로 감지하여 진단될 수 있다. 본 발명의 단백질 및 펩티드의 준비를 위한 방법은 상기에 기재된 것과 같다.
암을 진단하는 방법은 상기에 기재된 대로 항-NEIL3 항체의 양과 그에 상응하는 대조군 시료에서의 차이로 결정되는 것에 의해 수행될 수 있다. 만약 개체의 세포 또는 조직이 유전자의 발현 산물(NEIL3)에 대한 항체를 포함하고 항-NEIL3 항체의 양이 정상 대조군에 비하여 컷 오프 수준(cut off value)이 높은 것으로 결정되면, 개체는 암으로 인해 고통받을 거라고 의심된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 펩티드 및 거기에 결합하는 HLA 분자를 포함할 수 있다. 항원의 펩티드 및 HLA 분자를 이용하는 항원 특이적 CTLs을 감지하기 위한 방법은 이미 구축되었다(예를 들어, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6). 따라서, 본 발명의 펩티드의 조합 및 상기 HLA 분자는 종양 항원 특이적 CTLs을 감지하기 위한 감지 방법에 적용될 수 있고, 그렇게 함으로써, 암의 재발 및/또는 전이를 초기 감지할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드를 활성 성분으로서 포함하는 약제로 해당되는 개체의 선별, 또는 약제의 치료효과의 평가를 위해 쓰일 수 있다.
특히, 알려진 방법에 따르면(예를 들면, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6), 방사선 표지된 HLA 분자의 테트라머 같은 올리고머 복합체 및 본 발명의 펩티드는 준비되어 질 수 있다. 상기 복합체를 사용하여, 예를 들어, 암으로 인해 고통받을 것으로 의심되는 개체 유래의 말초혈 림프구에서의 항원-펩티드 특이적 CTLs의 정량화에 의해 진단은 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 개체의 면역 반응을 평가하기 위하여, 여기에 기재된 펩티드 에피톱을 사용한 방법 또는 진단 약제를 제공한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 여기에 기재된 HLA 제한 펩티드는 개체의 면역 반응을 평가 또는 예측하기 위하여 시약으로 사용될 수 있다. 상기 평가되기 위한 면역 반응은 항원과 면역 적격 세포가 생체 외 또는 생체 내에서 접촉되는 것에 의해 유도될 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, 펩티드 에피톱을 인식 및 결합하는 항원 특이적 CTLs의 결과물일 수 있는 어떤 물질 또는 조성물은 시약으로서 적용될 수 있다. 상기 펩티드 시약은 항원으로서 사용될 필요가 없을 것이다. 이러한 분석을 위해 사용되는 분석 시스템은 테트라머, 세포내의 림프구 염색 및 인터페론 방출 분석, 또는 ELISPOT 분석과 같은 비교적 최근의 기술적 발전을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 펩티드 시약과 접촉할 면역 적격 세포는 수지상 세포를 포함한 항원 제시 세포일 것이다.
예를 들어, 본 발명의 펩티드는 항원-특이적 CTLs의 제시 이후의 종양 세포 항원 또는 면역원에의 노출을 위한 말초혈 단핵 세포를 평가하기 위해 테트라머(tetramer) 염색 분석에 사용될 수 있다. HLA 테트라머(tetrameric) 복합체는 항원 특이적 CTLs를 직접적으로 보이게 하며(예를 들면, Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; 및 Altman et al, Science 174 : 94-96, 1996), 말초혈 단핵 세포의 시료 내의 항원-특이적 CTLs의 개체군의 빈도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 사용하는 테트라머 시약은 하기에 기재된 대로 만들어진다.
HLA 분자에 결합하는 펩티드는 테트라머 복합체를 만들기 위해 상응하는 HLA 중쇄 및 베타 2-마이크로글로불린의 존재하에 다시 접힌다. 복합체에서, 중쇄의 카르복실 말단은 이전에 단백질 내로 조작된 자리에 비오틴화되었다. 그런 다음, 테트라머 복합체 및 스트렙타아비딘으로 구성된 테트라머를 형성하기 위해 스트렙타아비딘은 상기 복합체에 첨가된다. 형광 표지된 스트렙타아비딘을 써서, 상기 테트라머는 항원 특이적 세포를 염색하기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음, 상기 세포는 예를 들어, 유세포분석기(flow cytometry)에 의해 식별될 수 있다. 이러한 분석은 진단 또는 예측 목적을 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 식별되는 세포는 치료상의 목적을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 면역 회상 반응(immune recall response)을 평가하기 위해 본 발명의 펩티드를 포함하는 시약을 제공한다(예를 들면, Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997 and Penna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991). 예를 들어, 치료되어야 할 암에 걸린 각각의 환자 유래의 PBMC 시료는 특별한 펩티드를 이용한 항원-특이적 CTLs의 제시를 위해 분석될 수 있다. 단핵 세포를 포함하는 혈액 시료는 본 발명의 펩티드로 PBMC의 양성 및 세포의 활성화시키는 것에 의해 평가될 수 있다. 적절한 양성 기간 이후, 확장된 세포수는, 예를 들어, CTL 활성을 위해 분석될 수 있다.
또한, 상기 펩티드는 백신의 효험을 평가하기 위한 약제로서 사용될 수 있다. 면역원으로 예방 접종된 환자에게서 얻어진 PBMCs는, 예를 들어, 상기 기재된 어느 하나의 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 상기 환자는 HLA 형이며, 상기 환자에 존재하는 대립유전자 특이적 분자를 인지하는 펩티드 에피톱 약제가 분석을 위해 선택된다. 백신의 면역원성은 PBMC 시료 안의 에피톱-특이적 CTLs의 존재에 의해 나타내어진다. 또한, 본 발명의 펩티드는 당업계에 잘 알려진 기술(예를 들면, CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; 및 Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)을 이용하여 암을 진단, 감지 또는 모니터하기 위한 약제로 사용될 수 있는 항체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체는 HLA 분자의 맥락에서 펩티드를 인식하는, 즉, 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 다수의 사용을 제공하고, 이들 중 일부는 여기에 기재되었다. 예를 들어, 본 발명은 NEIL3 면역성의 폴리펩티드의 발현에 의해 특징지어지는 장애를 진단 또는 감지하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 생물체의 시료 내의 NEIL3 HLA 결합 펩티드의 발현, 또는 NEIL3 HLA 결합 펩티드 및 HLA 클래스 Ⅰ 분자의 복합체 결정을 수반한다. 상기 펩티드의 발현 또는 펩티드 및 HLA 클래스 Ⅰ 분자의 복합체는 펩티드 또는 복합체의 결합 파트너로 분석함으로써 결정되거나 감지될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 펩티드 또는 복합체의 결합 파트너는 펩티드를 인식 및 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 또한, 종양 생검과 같은, 생물체의 시료에서의 NEIL3의 발현은 NEIL3 프라이머를 사용한 표준 PCR 증폭 프로토콜로 검사될 수 있다. 종양 발현의 예는 여기에 및 바람직한 조건의 더 밝혀진 내용에 제시되었고, NEIL3 증폭을 위한 프라이머는 WO2003/27322에서 찾을 수 있다.
바람직하게는, 상기 진단 방법은 생물체의 시료 내의 NEIL3 HLA 결합 펩티드의 존재를 감지하기 위하여 NEIL3 HLA 결합 펩티드 특이적 약제와 개체에서 분리된 생물체 시료의 접촉이 수반된다. 본 발명에서 사용되는, "접촉"은 생물체 시료가 약제 및 생물체 시료 내에 존재하는 NEIL3 HLA 결합 펩티드 사이의 특이적 상호작용을 허용하는 적절한 예를 들면, 농도, 온도, 시간, 이온 강도와 같은 조건하에, 약제와 충분히 근접하게 놓이는 것을 의미한다. 일반적으로, 생물체 시료와 약제의 접촉을 위한 상기 조건은 분자 및 생물체 시료 내의 그것의 동족(cognate)(예를 들어, 단백질 및 그것의 수용체 동족, 항체 및 그것의 단백질 항원 동족, 핵산 및 그것의 상보적 서열 동족) 사이의 특이적 상호작용을 가능하게 하기 위한 당업계의 보통의 기술에 의해 알려진 조건이다. 분자 및 그것의 동족 사이의 특이적 상호작용을 가능하게 하기 위한 바람직한 조건은 Low 등에 의해 발표된 U.S. 특허 번호 5,108,921에 기재되어 있다.
본 발명의 진단 방법은 생체 내 및 시험관 내에서 각각 또는 함께 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 생물체의 시료는 생체 내 및 시험관 내에 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 생물체의 시료는 생체 내의 조직일 수 있으며, NEIL3 면역성의 폴리펩티드에 특이적인 약제는 조직 내의 이런 분자의 존재를 감지하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 상기 생물체의 시료는 시험관 내에서 모아지거나 분리될 수 있다(예를 들어, 혈액 시료, 종양 생검, 조직 추출물). 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 생물체의 시료는 세포-함유 시료일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 진단 또는 치료를 위해 개체에게서 모아진 종양 세포를 함유하는 시료일 수 있다.
또는, 상기 진단은 형광-표지 HLA 다중(multimeric) 복합체로 염색하여 항원-특이적 T 세포의 직접적인 정량을 허용하는 방법으로 수행될 수 있다(예를 들어, Altman, J. D. et al., 1996, Science 274 : 94; Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330). 또한, 세포 내의 림포카인 염색, 및 인터페론-감마 방출 분석 또는 ELISPOT 분석이 제공되었다. 다중 염색, 세포 내의 림포카인 염색 및 ELISPOT 분석 모두 종래의 분석(Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413)에 비해 최소한 10배 이상 민감하게 나타났다. 또한, 오량체(pantamers)(예를 들어, US2004-209295A), 덱스트라머(dextramers)(예를 들어, WO 02/072631), 및 스트랩타머(streptamers)(예를 들어, Nature medicine 6. 631-637 (2002))가 사용될 수 있다.
ⅩⅠ. 항체
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 본 발명의 펩티드에 특이적으로 결합하고 본 발명의 펩티드가 아닌 것에는 결하지 않을(또는 약하게 결합할) 것이다. 또는, 항체는 그들의 상동체만큼 본 발명의 펩티드에 결합한다. 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체는 암의 진단 및 예후 분석, 이미징 방법론에 사용될 수 있다. 유사하게, 이런 항체는 암환자에서의 NEIL3 발현 또는 과발현되는 정도의 다른 암의 치료, 진단, 및/또는 예후에 사용될 수 있다. 또한, 세포 내에서 발현되는 항체(예를 들어, 단쇄(single chain) 항체)는 NEIL3의 발현이 수반된, 예를 들어, 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 암종(cholangiocellular carcinoma), 결장암(colorectal cancer), 자궁내막증(endometriosis), 식도암(esophagus cancer), 간암(liver cancer), NSCLC, 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal cancer), SCLC, 연조직 종양(soft tissue tumor), AML 및 CML과 같은 암의 치료에 치료적으로 사용된다.
또한, 본 발명은 NEIL3 단백질(서열번호 45) 또는 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43으로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함하는 것의 단편의 감지 및/또는 정량을 위한 다양한 면역학적 분석을 제공한다. 이런 분석은 NEIL3 단백질 또는 그것의 단편을 인식 및 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항-NEIL3 항체를 적절히 포함할 수 있다. 본 발명에서, NEIL3 폴리펩티드에 결합하는 항-NEIL3 항체는 바람직하게 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43으로 구성되는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 인식한다. 항체의 결합 특이성은 억제 시험(inhibition test)로 확인될 수 있다. 그것은, 분석될 항체와 NEIL3 폴리펩티드의 전장의 결합이 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43의 아미노산으로 구성된 어떤 폴리펩티드 단편의 존재하에 억제되는 때, 이 항체가 단편에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다. 본 발명에서, 이런 면역학적 분석은 당업계에 잘 알려진 다양한 형태의 방사면역측정법(radioimmunoassay), 면역-크로마토그래프 기법(immuno-chromatograph technique), 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 효소면역형광측정법(enzyme-linked immunofluorescent assay, ELIFA), 및 이와 유사한 것을 포함하는 다양한 면역학적 분석 방식 내에서 수행되나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 관련된 비-항체가 아닌 면역학적 분석은 MHC 결합 분석과 마찬가지로 T 세포 면역반응유발성(immunogenicity) 분석(억제적 또는 자극적)을 포함할 수 있다. 또한, NEIL3를 발현하는 암의 감지가 가능한 본 발명의 표지된 항체를 사용한 방사선핵의학적(radioscintigraphic) 이미징 방법을 포함하는 면역학적 이미징(imaging) 방법이 본 발명에 의해 제공되나, 이에 한정되지 않는다.
이런 분석은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML과 같은 암에서의 NEIL3 발현의 감지, 모니터링, 및 진단에 임상적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody) 또는 다중클론항체(polyclonal antibody)와 같은 어떤 형태로든 사용될 수 있고, 본 발명의 펩티드로 면역화한 토끼와 같은 동물에게서 얻어진 항혈청, 다중클론항체 및 단일클론항체의 모든 종류, 유전적 재조합에 의해 생산된 인간 항체 및 인간화된 항체를 포함한다.
항체를 얻기 위해 항원으로 사용된 본 발명의 펩티드는 어떤 동물 종에서 유래될 수 있으며, 바람직하게는 인간, 쥐, 또는 랫트(rat)에서 유래될 수 있고, 더욱 바람직하게는 사람에게서 유래될 수 있다. 인간-유래 펩티드는 본 발명에 있어서 밝혀진 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서 얻어질 수 있다.
본 발명에 따르면, 면역 항원으로써 사용되는 펩티드는 상기 단백질의 완전한 단백질 또는 단백질의 일부일 수 있다. 단백질의 일부는 예를 들어, 본 발명의 펩티드의 아미노 N-말단 또는 카복시 C-말단 단편을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체는 NEIL3 펩티드의 전장 또는 단편 각각과 반응하는 단백질로써 정의된다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21, 22, 24, 33, 35, 41 및 43으로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열로 구성된 NEIL3의 단편을 인식할 수 있다. 올리고펩티드 합성을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 합성 후, 펩티드는 면역원으로 사용되기에 앞서 선택적으로 정제될 수 있다. 본 발명에서, 상기 올리고펩티드(예를 들어, 9 또는 10머(mer))는 면역원성을 향상하기 위해 매개체(carrier)와 결합 또는 연결될 수 있다. 키홀-림펫 헤모사이아닌(KLH)은 매개체로서 잘 알려져 있다. 또한, KLH와 펩티드를 결합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
또는, 본 발명의 펩티드 또는 그것의 단편을 암호화하는 유전자는 알려진 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 발현 벡터는 여기에 기재된 숙주 세포로 도입(transform)하는데 사용된다. 원하는 펩티드 또는 그것의 단편은 어떤 표준 방법에 의해 숙주세포의 외 또는 내에서 회수될 수 있고, 그 뒤 항원으로서 사용될 수 있다. 또는, 상기 펩티드 또는 그것의 용해물 또는 화학적으로 합성된 펩티드를 발현하는 전체 세포는 항원으로서 사용될 수 있다.
어떤 포유 동물은 항원으로 면역화될 수 있으며, 바람직하게는 세포 융합에 사용되는 부모 세포와의 공존 가능성이 고려된다. 일반적으로, 쥐목(Rodentia), 토끼목(Lagomorpha), 또는 영장류(Primates)의 동물들이 사용될 수 있다. 쥐목의 동물은, 예를 들어, 쥐, 랫트(rat) 및 햄스터를 포함한다. 토끼목의 동물은, 예를 들어, 토끼를 포함한다. 영장류의 동물은, 예를 들어, 게잡이짧은꼬리원숭이(Macaca fascicularis), 레서스원숭이(rhesus monkey), 망토개코원숭이(sacred baboon) 및 침팬지와 같은 협비원류 원숭이(구세계 원숭이)를 포함한다.
항원으로 동물을 면역화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원의 복강내 주사 또는 피하 주사는 포유류의 면역화(immunization)를 위한 표준 방법이다. 더욱 구체적으로, 항원은 적절한 양의 인산 완충 식염수(PBS), 생리식염수, 등에 희석 및 부유될 수 있다. 원한다면, 항원 부유물은 적절한 양의 완전 프로인트 보조약(Complete Freund's adjuvant, CFA)과 같은 표준 보조제와 섞이고, 에멀젼이 된 다음 포유동물에게 투여될 수 있다. 바람직하게, 적절한 양의 프로인트 보조약과 혼합된 항원의 여러 가지 투여가 매 4 내지 21일에 뒤따른다. 또한, 적절한 매개체가 면역화(immunization)를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같이 면역화한 후, 혈청은 원하는 항체의 양을 증가시기기 위한 표준 방법으로 실험될 수 있다.
본 발명의 펩티드에 결합하는 다중클론항체는 혈청 내의 원하는 항체의 증가를 위하여 실험된 면역화된 포유류에서 모아진 혈액, 및 어떤 종래의 방법으로 혈액에서 분리된 혈청에서 준비될 수 있다. 다중클론항체는 다중클론항체를 포함하는 혈청뿐만 아니라, 혈청에서 분리될 수 있는 다중클론항체를 포함한 분획도 포함한다. 면역글로불린 G 또는 M은, 예를 들어, 본 발명의 펩티드와 연결된 친화성 컬럼, 및 더 나아가 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 이용한 상기 분획의 정제를 이용하여, 오직 본 발명의 펩티드만을 인식하는 분획에서 준비될 수 있다.
단일클론항체를 준비하기 위하여, 면역 세포들은 면역원으로 면역화되고 상기 기재된 바와 같이, 혈청 내의 원하는 항체의 증가 수준을 위해 점검된 포유류에서 모아지고, 세포 융합된다. 세포 융합을 위해 사용된 상기 면역 세포는 비장(spleen)에서 바람직하게 얻어질 수 있다. 상기 면역세포와 융합되는 다른 부모 세포들은 바람직하게는, 예를 들어, 포유류의 골수세포(myeloma cells)을 포함하고, 더욱 바람직하게는, 약에 의해 융합되는 세포의 선별을 위해 요구되는 특성을 가진 골수세포을 포함한다.
상기의 면역세포 및 골수세포은, 예를 들어, Milstein 등(Galfre 및 Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))의 방법과 같은 알려진 방법에 따라 융합될 수 있다.
세포 융합의 결과에 의해 얻어진 하이브리도마(hybridoma)는 그들을 HAT 배지(하이모크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine) 포함 배지)와 같은 표준 선별 배지에서 배양하여 선별될 수 있다. 상기 세포 배양은 일반적으로 HAT 배지에서 며칠 내지 몇주 동안 계속되고, 상기 시간은 원하는 하이브리도마를 제외한 다른 모든 세포들(비-융합 세포)이 죽기에 충분한 시간이다. 또한, 표준 한계희석은 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 스크리닝 및 복제하기 위해 수행될 수 있다.
상기 방법과 더불어, 비-인간 동물은 하이브리도마를 준비하기 위해 항원으로 면역화되는 경우, 그들이 EB 바이러스에 의해 감염되는 것처럼 인간 림프구는 실험실 내에서 펩티드, 펩티드 발현 세포 또는 그들의 용해물로 면역화될 수 있다. 그 후, 상기 얻어진 펩티드에 결합할 수 있는 원하는 인간항체를 생산하는 하이브리도마를 만들기 위하여, 림프구를 U266과 같이 무한하게 분열할 수 있는 인간-유래 골수세포와 면역화된 림프구를 융합된다(심사되지 않고 공개된 일본 특허 출원 번호 Sho 63-17688).
상기 얻어진 하이브리도마는 그 뒤에 쥐의 복강에 이식되고 복수(ascites)가 추출된다. 얻어진 단일클론 항체는 본 발명의 펩티드가 연결된, 예를 들어, 황산암모늄 침출(ammonium sulfate precipitation), 단백질 A 또는 G 컬럼, DEAE 이온교환 크로마토그래피(DEAE ion exchange chromatography) 또는 친화성 컬럼(affinity column) 에 의해 정제될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드의 정제 및 검출을 위해서 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드의 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist)의 후보로서도 사용될 수 있다.
또는, 면역화된 림프구와 같은 항체를 생산하는 면역 세포는 암유전자(oncogene)에 의해 불멸화(immortalized)되고 단일클론항체를 준비하기 위해 사용된다.
또한, 이와 같이 얻어진 단일클론항체는 유전자 조작 기술을 이용하여 재조합형으로 준비될 수 있다(예를 들면, Borrebaeck 및 Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD (1990)). 예를 들어, 항체를 암호화하는 DNA는 재조합된 항체를 준비하기 위하여 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은 면역 세포에서 복제될 수 있고, 적절한 벡터에 삽입될 수 있으며, 숙주 세포로 도입될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기에 기재된 것과 같이 준비된 재조합 항체를 제공한다.
또한, 본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드와 결합하는한, 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단쇄(single chain) Fv(scFv), H 및 L 체인 유래 Fv 단편이 적절한 링커에 의해 결찰된 것일 수 있다(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). 보다 구체적으로 항체 단편은 항체에 파파인(papain) 또는 펩신(pepsin)과 같은 효소를 처리하여 생성될 수 있다. 또는, 항체 단편을 암호화하는 유전자는 조합(construct), 발현 벡터에 삽입될 수 있고 적절한 숙주 세포에서 발현될 수 있다(예를 들면, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).
항체는 여러 가지의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 분자와 연결되어 변형될 수 있다. 본 발명은 이러한 변형된 항체를 제공한다. 상기 변형된 항체는 항체를 화학적으로 변형하여 얻어질 수 있다. 이런 변형 방법은 당업계에서 관습적이다.
또는, 본 발명의 항체는 비인간 유래 항체의 여러 부위와 인간 항체 유래의 불변 부위 사이의 키메릭 항체로서, 또는 비인간 항체 유래의 상보성 결정 부위(CDR), 프레임워크(frame work) 부위 및 인간 항체 유래의 불변 부위를 포함하는 인간화된 항체로서 얻어질 수 있다. 이러한 항체는 알려진 기술에 따라서 준비될 수 있다. 인간화는 설치류 CDRs 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체하여 수행될 수 있다(예를 들면, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). 따라서, 이러한 인간화 항체는 비-인간 종 유래의 상응하는 서열로 대체된 온전한 인간 가변 도메인보다 대체로 적은 키메릭 항체이다.
또한, 인간 프레임워크 및 불변 부위 이외에도 인간 가변 부위를 포함한 완전한 인간 항체는 사용될 수 있다. 이런 항체는 당업계에 잘 알려진 여러 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 방법은 박테리오파지에 제시된 인간 항체 단편의 라이브러리 재조합의 이용을 수반한다(예를 들어, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 예를 들어, 내생의 면역글로불린 유전자가 일부분 또는 완전히 불활성된 쥐와 같은 유전자이식동물로 도입하여 만들어질 수 있다. 이러한 접근은 예를 들어, U.S 특허 번호 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016에 기재되었다.
상기와 같이 얻어진 항체는 동질성을 위해 정제될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 알맞게 선택 및 결합된 친화성 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과(ultrafiltration), 염석(salting-out), 투석(dialysis), SDS 폴리아크릴아마이드겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis) 및 등전점전기영동(isoelectric focusing)의 이용에 의해 분리 및 격리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로써 사용될 수 있다. 사용된 바람직한 단백질 A 컬럼은, 예를 들어, 하이퍼(Hyper) D, 포로스(POROS) 및 세파로오스(Sepharose) F.F.(Pharmacia)와 같은 것을 포함한다.
친화성을 제외한 바람직한 크로마토그래피는, 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 겔 여과(gel filtration), 역 상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 및 그와 유사한 것을 포함한다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). 크로마토 그래피 과정은 HPLC 및 FPLC와 같은 액상 크로마토그래피로 실행될 수 있다.
예를 들어, 흡광도 측정, 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 효소항체법(enzyme immunoassay, EIA), 방사선면역측정법(radioimmunoassay, RIA) 및/또는 면역형광법(immunofluorescence)이 본 발명의 항체의 항원 결합 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체는 플레이트 위에 고정되고, 본 발명의 펩티드는 상기 플레이트에 가해지며, 그 후, 항체 생산 세포의 배양 상등액 또는 정제된 항체와 같은 원하는 항체를 포함한 시료가 가해진다. 그 후, 일차 항체를 인식하고, 알칼라인 포스페이트와 같은 효소로 표지된 이차 항체가 가해지고, 상기 플레이트는 인큐베이션 된다. 그 다음, 씻은 후에, p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 효소 기질이 플레이트에 가해지고, 시료의 항원 결합 활성을 평가하기 위해 흡광도가 측정되어 진다. C-말단 또는 N-말단과 같은 펩티드의 단편은 항체의 결합 활성을 평가하기 위하여 항원으로서 사용될 수 있다. 비아코어(BIAcore)(파마시아(pharmacia))는 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 펩티르를 포함한다고 추정되는 시료에 본 발명의 항체를 노출하여 본 발명의 펩티드의 검출 또는 측정, 펩티드 및 항체로 형성되는 면역 복합체 검출 또는 측정을 참작한다.
본 발명에 따른 펩티드의 검출 또는 측정 방법이 펩티드를 특이적으로 검출 또는 측정할 수 있기 때문에, 상기 방법은 펩티드가 사용되는 여러 실험에 사용될 수 있다.
XII . 벡터 및 숙주 세포
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드가 삽입된 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주 세포 안의 본 발명의 뉴클레오티드(특히 DNA)를 간직하기 위해, 본 발명의 펩티드를 발현하기 위해, 또는 유전자치료(gene therapy)를 위해 본 발명의 뉴클레오티드를 투여하기 위하여 사용할 수 있다.
대장균이 숙주세포이고 벡터가 많은 양의 대장균에서 증폭 및 생산될 때(에를 들면, JM109, DH5 alpha, HB101 or XL1Blue), 상기 벡터는 대장균에서 증폭되기 위해 "ori" 및 형질전환된 대장균을 선별하기 위한 마커 유전자(예를 들어, 엠피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 이와 유사한 것과 같은 약제에 의해 선별되는 약제 내성 유전자)를 가져야 한다. 예를 들어, M13-series 벡터, pUC-series 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script, 등이 사용될 수 있다. 또한, pGEM-T, pDIRECT 및 pT7가 상기 기재된 벡터들과 마찬가지로 서브클로닝(subcloning) 및 cDNA를 추출하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 벡터가 사용될 때, 발현 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 대장균에서 발현되기 위한 발현 벡터는 대장균에서 증폭되기 위한 상기의 특징을 갖고 있어야 한다. JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1 Blue와 같은 대장균이 숙주세포로서 사용될 때, 상기 벡터는 대장균에서 원하는 유전자를 효율적으로 발현할 수 있는, 예를 들어, lacZ 프로모터(Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), araB 프로모터(Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)), T7 프로모터 또는 그와 유사한 프로모터를 가져야 한다. 그런 점에서, 예를 들어, pGEX-5X-1(Pharmacia), "QIAexpress system"(Qiagen), pEGFP 및 pET(이 경우에 있어서, 숙주는 T7 RNA 합성효소를 발현하는 BL21이 바람직하다)가 상기 벡터를 대신해서 사용될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 펩티드 분비를 위해 신호서열을 포함할 수 있다. 대장균의 주변세포질로 분비되기 위한 펩티드를 향한 바람직한 신호 서열은 pelB 신호 서열이다(Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). 표적 숙주세포로 벡터를 삽입하는 것의 의미는, 예를 들어, 염화칼슘 방법(calcium chloride method), 및 전기천공법(electroporation method)을 포함한다.
대장균과 더불어, 예를 들어, 포유류 유래의 발현 벡터(예를 들어, pcDNA3 (Invitrogen) and pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), 곤충 유래의 발현 벡터(예를 들어, "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GIBCO BRL), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들어, pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들어, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들어, pZIpneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들어, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) 및 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 발현 벡터(예를 들어, pPL608, pKTH50)는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위하여 사용될 수 있다.
CHO, COS 또는 NIH3T3 세포와 같은 동물세포에서 벡터를 발현하기 위하여, 상기 벡터는 그런 세포에서 발현하기 위해 필요한 예를 들어, SV40 프로모터(Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), MMLV-LTR 프로모터, EF1 알파 프로모터(Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), CMV 프로모터 및 그와 유사한 프로모터를 가져야 하며, 형질전환체의 선별을 위한 마커 유전자가 바람직하다(예를 들어, 약제에 의해 선별되는 약제 내성 유전자(예를 들어, neomycin, G418)). 이러한 특징을 갖는 알려진 벡터의 예는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13를 포함한다.
XIII . 암 진단을 위한 방법:
또한, 본 발명은 암 진단 방법을 제공한다. NEIL3의 발현이 여러 종류의 암 세포에서 특별하게 증가되는 것이 발견되었다(표 1 및 도 5). 따라서, 본 발명에 있어서 확인된 유전자들 뿐만 아니라 그들의 전사 및 번역 산물은 암의 마커로써 진단 유용성을 밝히고, 생물체 시료(예를 들어, 세포 시료)에서 NEIL3의 발현을 측정하여 암은 진단될 수 있다. 특히, 본 발명은 개체에서의 NEIL3의 발현 수준을 결정하여 암을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 진단되는 암은, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 폐 선암 및 폐 편평세포암종(SCC)를 포함하는 NSCLC도 본 발명에 의해 진단 또는 검출될 수 있다.
본 발명에 따르면, 개체의 상태 검사에 대한 중간 결과가 제공될 수 있다. 이런 중간 결과는 의사, 간호사, 또는 다른 현역을 보조하고 병으로 고통받는 개체를 진단하기 위한 추가적인 정보와 결합될 수 있다. 또는, 본 발명은 개체-유래 조직에서 암 세포를 검출하기 위해 사용될 수 있고, 질환에 의해 고통받는 개체를 진단하기 위한 유용한 정보를 의사에게 제공한다.
특히, 본 발명은 하기의 [1] 내지 [10] 방법을 제공한다:
[1] 암 진단의 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) 생물체 시료에서 NEIL3의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 단계; 및
(b) 검출된 발현 수준이 유전자의 정상 대조 수준에 비해 증가한 것을 질환의 존재와 연관시키는 단계.
[2] 상기 [1]의 방법에서, 상기 발현 수준은 정상 대조 수준보다 적어도 10% 보다 크다.
[3] 상기 [1]의 방법에서, 발현 수준은 하기 중에 선택되는 방법에 의해 검출된다:
(a) NEIL3의 서열을 포함한 mRNA를 검출,
(b) NEIL3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 검출, 및
(c) NEIL3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 생물학적 활성을 검출.
[4] 상기 [1]의 방법에서, 상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML의 그룹에서 선택된다.
[5] 상기 [3]의 방법에서, 상기 발현 수준은 유전자의 유전자 전사에 대한 프로브의 검출 혼성화에 의해 결정된다.
[6] 상기 [3]의 방법에서, 상기 발현 수준은 유전자의 발현 수준으로서 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체의 결합 검출에 의해 결정된다.
[7] 상기 [1]의 방법에서, 생물학적 시료는 생검(biopsy), 객담(sputum), 혈액(blood), 흉수(pleural effusion) 또는 소변(urine)을 포함한다.
[8] 상기 [1]의 방법에서, 상기 개체-유래 생물학적 시료는 상피 세포(epithelial cell)를 포함한다.
[9] 상기 [1]의 방법에서, 상기 개체-유래 생물학적 시료는 암 세포를 포함한다.
[10] 상기 [1]의 방법에서, 상기 개체-유래 생물학적 시료는 암 상피 세포를 포함한다.
또는, 본 발명은 개체-유래 시료에서 암 세포를 검출 또는 확인하기 위한, 개체-유래의 생물학적 시료에서 NEIL3 유전자의 발현 증가를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 여기에서 앞에 말한 유전자의 앞에 말한 발현 수준의 정상 대조 수준에 반한 증가는 조직에 암세포의 존재 또는 의심을 나타낸다.
이런 결과는 병으로 고통받는 개체로서의 진단에서 의사, 간호사, 또는 다른 건강관리 현역을 보조하기 위해 추가적인 정보와 결합될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명은 병으로 고통받는 개체로서 진단하기 위한 유용한 정보를 의사에게 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 개체에게서 얻어진 조직에서 암 세포의 존재한다고 보는 의문이 있을 때, 임상의 결정은 NEIL3 유전자의 발현 수준, 또한, 조직 병리학을 포함하는 질환의 다른 측면, 혈액 내의 알려진 종양 마커(들)의 수준, 및 개체의 임상적 진행, 등등을 고려함으로써 도달될 수 있다.
예를 들어, 혈액 내의 일부 잘-알려진 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML 진단의 마커는 하기와 같다:
방광암; SCC, TPA, 또는 IAP
유방암; BCA225 , TPA, CEA, IAP, 또는 CA15-3
자궁경부암; SCC, TPA, 또는 CA125
암종; CA19-9, 또는 CEA
결장암 ; CEA
자궁내막증; CA125
식도암; CEA, DUPAN-2, IAP, NSE, SCC, SLX, 또는 Span-1
간암; AFP, 또는 ICDH
NSCLC; CEA
골육종; ALP
췌장암; BFP, CA19-9, CA125, 또는 CEA
전립선암; PSA, 또는 PAP
신장암; IAP
SCLC; ProGRP 또는 NSE
AML; TK 활성
CML; TK 활성.
다시 말해서, 본 발명의 몇몇의 실시태양에서, 개체의 질환 상태의 더 나아간 진단을 위한 중간 결과로서 유전자 발현 분석 결과를 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 암의 진단 마커 검출을 위한 방법을 제공하고, 앞에 말한 방법은 개체-유래의 생물체 시료에서 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, 연조직 종양, AML 및 CML의 진단 마커로서 NEIL3의 발현을 검출하는 단계를 제공하나, 이에 한정되지 않는다.
암 진단의 방법은 하기에 더욱 자세히 기재될 것이다.
본 발명에 의해 진단될 개체는 포유류인 것이 바람직하다. 바람직한 포유류는, 예를 들어, 인간, 비-인간 유인원, 쥐, 랫트(rat), 개, 고양이, 말, 및 소를 포함한, 이에 한정되지 않는다.
진단을 수행하기 위해 진단될 개체에서 생물체 시료가 수집되는 것이 바람직하다. 어떠한 생물학적 재료든 목적 NEIL3의 전사 또는 번역 산물을 포함하기만 하면 측정을 위한 생물체 시료로서 사용될 수 있다. 상기 생물체 시료는, 신체 조직(bodily tissues) 및 혈액, 객담 및 소변과 같은 유동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇의 실시태양에서, 상기 생물체 치료는 상피 세포로 구성된 세포군(cell population)을 포함하고, 암 상피 세포 또는 암으로 의심되는 조직 유래의 상피 세포를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 필요하다면, 상기 세포는 얻어진 신체 조직 및 유동물에서 정제될 수 있으며, 그 후, 생물체 시료로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 개체 유래의 생물체 시료에서 NEIL3의 발현 수준이 결정된다. 상기 발현 수준은 전사(핵산) 산물 수준에서 결정될 수 있으며, 당업계에 알려진 방법을 사용한다. 예를 들어, NEIL3의 mRNA는 혼성화 방법에 의하여 프로브를 사용해 정량될 수 있다(예를 들면, 노던 혼성화(Northern hybridization)). 검출은 칩(chip) 또는 어레이(array)에서 수행될 수 있다. 어레이의 이용은 NEIL3를 포함한 많은 수의 유전자(예를 들어, 여러 가지 암 특이적 유전자)의 발현 수준을 검출하기 위해 바람직하다. 당업계의 기술은 NEIL3의 서열 정보(서열번호: 44;GenBank accession number: NM_018248)를 이용하는 그런 프로브를 준비할 수 있다. 예를 들어, NEIL3의 cDNA는 프로브로서 사용될 수 있다. 만일 필요하다면, 상기 프로브는 염료, 형광 및 동위원소와 같은 적절한 표지로 표지될 수 있으며, 유전자의 발현 수준은 혼성화된 표지의 강도로써 검출될 수 있다.
또한, NEIL3의 전사 산물은 프라이머를 사용해 증폭-기반(amplification-based) 검출 방법(예를 들어, RT-PCR)으로 정량될 수 있다. 또한, 그런 프라이머는 유전자의 가능한 서열 정보에 기초하여 준비될 수 있다. 예를 들어, 실시예에서 사용된 상기 프라이머(서열번호:46 및 47)는 검출하기 위해 RT-PCR 또는 노던 블롯으로 쓰일 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
특히, 본 발명의 방법에 사용된 프로브 또는 프라이머는 엄격한, 중간 정도로 엄격한, 또는 적게 엄격한 조건 하에 NEIL3의 mRNA에 혼성화된다
또는, 상기 번역 산물은 본 발명의 진단을 위해 검출될 수 있다. 예를 들어, NEIL3 단백질의 양은 결정될 수 있다. 상기 번역 산물로서 단백질의 양을 결정하기 위한 방법은 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 단일클론 또는 다중클론일 수 있다. 또한, 상기 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들면, 키메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등등.)은 상기 단편이 NEIL3 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 검출을 위해 사용될 수 있다. 단백질의 검출을 위한 이런 종류의 항체를 제작하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 본 발명에서 항체 및 그와 동등한 이런 것을 준비하기 위해 쓰일 수 있다.
NEIL3 유전자의 전사 산물에 기초한 NEIL3 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 또 다른 방법으로서, 염색의 강도는 NEIL3 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직화학(immunohistochemical) 분석을 통해 관찰될 수 있다. 다시 말해서, 상기 강한 염색의 관찰은 증가한 단백질의 존재 및 동시에 NEIL3 유전자의 높은 발현 수준을 나타낸다.
또한, NEIL3 유전자의 발현 수준과 더불어, 예를 들어, 암에서 달리 발현한다고 알려진 유전자와 같은 다른 암-관련 유전자의 발현 수준은 진단의 정확성을 향상시키기 위해 결정될 수 있다.
생물체 시료 내의 NEIL3 유전자를 포함한 암 마커 유전자의 발현 수준은, 예를 들어, 10%, 25%, 또는 50% 또는 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2.0배 이상, 5.0배, 10.0배 이상, 또는 그 이상과 같이, 해당하는 암 마커 유전자의 대조군 수준보다 증가된 것에 따라 고려될 수 있다.
상기 대조 수준은 사전에 질환 상태(암에 걸린 또는 암에 걸리지 않은)가 알려진 개체에게서 수집 및 보관된 시료를 이용한 생물체 시료 검사와 동시에 결정될 수 있다. 또는, 상기 대조 수준은 질환 상태가 알려진 개체 유래의 시료 안의 사전에 결정된 NEIL3 유전자의 발현 수준의 분석으로 얻어진 결과에 기초한 통계적인 방법으로 결정될 수 있다. 또한, 상기 대조 수준은 사전에 시험된 세포에서의 발현 양상의 데이타베이스일 수 있다. 또한, 본 발명의 한 측면에 따르면, 생물체 시료 안의 NEIL3 유전자의 발현 수준은 다수의 참조 시료에서 결정된 다수의 대조 수준과 비교될 수 있다. 환자-유래 생물체 시료와 유사한 조직 형태 유래의 참조 시료에서 결정된 대조 수준을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태로 알려져 있는 군의 NEIL3 유전자의 발현 수준의 기준치를 이용하는 것이 바람직하다. 기준치는 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D. 의 범위는 기준치로 쓰일 수 있다.
NEIL3 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준에 비해 증가 또는 암 대조군 수준과 유사할 때, 개체는 병으로 고통받게 되거나 암 발병 위험률이 있는 것으로 진단될 수 있다. 또한, 다수의 암-관련 유전자들의 발현 수준이 비교되는 경우, 시료 및 참조 사이의 유전자 발현 양상의 유사성은, 개체가 병으로 고통받게 되거나 암 발병 위험률이 있음을 나타낸다.
시험 생물체 시료 및 대조군 수준의 발현 수준 사이의 차이는, 예를 들어, 발현 수준이 암 또는 암이 아닌 세포의 상태에 따라 달라지지 않는다고 알려진 항존 유전자와 같은 대조군 핵산의 발현 수준으로 정상화될 수 있다. 바람직한 대조군 유전자는 베타 액틴, 글리세르알데하이드 3 포스페이트 디하이드로제나아제(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜 단백질 P1(ribosomal protein P1)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 문서에 기재된 것들에 유사하거나 같은 어떤 방법 및 재료들이 본 발명의 수행 또는 시험에서 이용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료는 하기에 기재하였다. 여기의 모든 발행, 특허 출원, 특허, 및 다른 언급된 참조는 그들 전부의 참조에 의해 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 통제할 것이다. 또한, 상기 재료, 방법, 및 실시예는 실례일 뿐 제한하려는 것이 아니다.
상기 발명은 하기의 실시예에서 더 기재될 것이나, 이는 청구항에서 기재된 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
[ 실시예 ]
재료 및 방법
세포주
T2(HLA-A2), 인간 B-림프아구양 세포주, COS7 및 아프리칸 그린 원숭이 신장 세포주를 ATCC에서 구입하였으며, PSCCA0922(HLA-*A0206)은 Japan Health Foundation에서 구입하였다. TISI, HLA-A*2402-양성 B-림프아구양 (lymphoblastoid) 세포주를 IHWG Cell 및 Gene Bank(시애틀, WA)에서 구입하였다.
NEIL3 유래 펩티드의 후보 선택
HLA-A*0201 분자에 결합하는 NEIL3 유래의 9-머 및 10-머 아미노산 펩티드는 결합 예측 소프트웨어 "BIMAS"(http://www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind)를 사용하여 예측되었다(Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1):163-75) 및 Kuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6):1872-81)). HLA-A*2402 분자에 결합하는 NEIL3 유래의 9-머 및 10-머 펩티드는 "NetNHC3.0"결합 예측 서버(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) 를 사용하여 예측되었다(Buus et al. (Tissue Antigens., 62:378-84, 2003) 및 Nielsen et al. (Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004)). 이러한 펩티드는 표준적인 고체상 합성법에 따라 Biosynthesis Inc.(Lewisville, TX)에서 합성하였고, 역상고속액체크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 동일성은 각각 분석용 HPLC 및 질량분석을 통하여 측정하였다. 펩티드를 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO) 20 ㎎/㎖에 용해하고, -80℃에서 저장하였다.
시험관 내에서의 CTL 유도
단핵세포 유래 수지상세포(dendritic cell, DC)를 APCs(antigen-presenting cell, APC)로 사용하여 인간 백혈구 항체(human leukocyte antigen, HLA)에 제시된 펩티드에 대한 CTL 반응을 유도하였다. 참고 문헌(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8)에 기재된 바와 같이, 수지상세포를 시험관 내에서 제작하였다. 구체적으로, Ficoll-Plaque(Pharmacia) 용액을 사용하여 정상적인 지원자(HLA-A*0201 또는 HLA-A*0206 양성)에서 분리한 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 단핵세포 비율을 높이기 위하여 플라스틱 조직 배양 접시(Becton Dickinson)에 붙여서 분리하였다. 단핵세포가 많은 개체군을 1000 U/ml의 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)(R&D System) 및 1000 U/ml 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)(R&D System)가 존재하고 2%의 열에 의해 비활성화된 자가혈청(autologous, AS)을 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 7일 후, 사이토카인으로 유도한 수지상세포에, AIM-V 배지에서 20 ℃에서 4시간 동안, 3 ㎍/ml의 β2-마이크로글로불린 존재하에서 20 ㎍/ml의 각각의 합성 펩티드를 적용하였다. 제조된 세포는 그 세포표면에, CD80, CD83, CD86 및 HLA 클래스 II 등의 DC 관련 분자를 발현하는 것으로 나타났다(결과는 나타내지 않음). 그런 다음, 펩티드 자극한 수지상세포를 마이토마이신 C(mitomycin C, MMC)로 불활성화(30 ㎍/ml로 30분간)하여, CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)를 사용하여 양성 선택으로 얻은 자가 CD8 양성 T 세포와 1:20의 비율로 혼합하였다. 이들 배양물을 48-웰 플레이트(Corning)에 배양하여; 각 웰은 0.5 ㎖의 AIM-V/2% AS 배지에 1.5×104개의 수지상세포, 3×105개의 펩티드 자극한 CD8 양성 T 세포, 및 10 ng/ml의 IL-7(R&D System)을 포함하였다. 배양 3일 후, 상기 배양액에 최종 농도를 20 IU/ml가 되도록 하여 IL-2(CHIRON)를 첨가하였다. 7일 및 14일째에, 펩티드로 자극한 자가 수지상세포로 T 세포를 더 자극하였다. 상기와 같은 방법으로 상기 수지상세포를 매회 제조하였다. 21일째에 3차 펩티드 자극 후, 펩티드를 자극한 T2 또는 PSCCA0922 세포에 대하여 CTL 활성을 측정하였다. (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1):94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8):1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506).
CTL 증식 과정
Riddell 등에 의해 보고된 방법과 같은 방법을 사용하여 CTL을 배양하여 증식시켰다(Walter et al., N Engl J Med 1995, 333(16):1038-44; Riddell et al, Nat Med 1996 Feb, 2(2):216-23). 총 5×104 개의 CTL을 40 ng/ml의 항 CD3 단일 클론 항체(Pharmingen)의 존재 하에서, MMC에 의해 불활성화된 두 종류의 인간 B 림프아구양(lymphoblastoid) 세포주와 함께, 25 ml의 AIM-V/5% AS 배지에 현탁하였다. 배양 시작한 뒤 1일 후, 120 IU/ml의 IL-2를 상기 배양물에 첨가하였다. 5, 8 및 11일째에 30 IU/ml의 IL-2를 함유하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지를 상기 배양물에 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1):94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8):1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May ,97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506).
CTL 클론( clone )의 수립
96 웰 둥근 바닥 마이크로 타이터 플레이트(round-bottomed micro titer plate, Nalge Nunc International)에 한 웰당 0.3, 1 및 3 CTL이 되도록 희석하였다. 한 웰당 5% AS를 함유하는 총 150 ㎕의 AIM-V 배지에서 한 웰당 1×104 세포의 두 종류의 인간 B 림프아구양 세포주, 30 ng/ml의 항 CD3 항체, 및 125 U/ml의 IL-2와 함께 CTL을 배양하였다. 10일 후, IL-2의 최종농도가 125 U/ml이 되도록 상기 배지에 한 웰당 50 ml의 IL-2를 첨가하였다. 14일째에 CTL 활성을 시험하였고, 상기와 같은 방법을 이용하여 CTL 복제(clone)를 증식시켰다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506).
특이적인 CTL 활성
특이적인 CTL 활성을 조사하기 위하여, 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ) 효소결합 이뮤노스팟(enzyme-linked immunospot, ELISPOT) 분석 및 IFN-gamma효소결합면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 실시하였다. 구체적으로, 펩티드 자극한 T2 (1×104개/웰)을 자극세포로서 제조하였다. 48 웰에 배양한 세포 또는 한계 희석 후의 CTL 클론(clone)을 반응 세포(responder cell)로서 사용하였다. IFN-gamma ELISPOT 분석 및 IFN-gamma ELISA 분석을 제작자의 과정에 따라서 수행하였다.
플라스미드 형질전환
표적 유전자, HLA-A*0201, HLA-A*0206 또는 HLA-A*2402의 전사 해독틀(open reading frame)을 암호화하는 cDNA를 PCR로 증폭하였다. PCR-증폭 산물을 벡터(vector)에 클로닝하였다. 플라스미드를 제작자의 권장된 절차에 따라 리포펙타민(lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 이용하여 표적 유전자, HLA-A2 및 A24-음성 세포주 COS7로 형질전환되었다. 형질전환한 2주 후에, 형질전환된 세포는 버센(versene, Invitrogen)으로 수득하였고, CTL 활성 분석에 대한 표적 세포 (5 X 104 세포/웰)로 이용하였다.
반-정량적( semi - quantitative ) RT - PCR 분석
총 RNA는 제작자의 절차에 따라 Qiagen RNeasy 키트(Qiagen) 또는 Trizol 시약(Life Technologies, Inc)으로 추출하였다. 총 RNA의 10 ug 표본은 Superscript II 역전사효소(Life Technologies)와 함께 poly dT12 -18 프라이머(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용해서 외-가닥 cDNAs로 역으로 전사되었다. 각 외-가닥 cDNA 물질은 차후에 표준 RT-PCR 실험을 수행해 PCR 증폭하기 위해 12 ㎕의 PCR 버퍼(TAKARA)에 희석되었다. 증폭 과정은 GeneAmp PCR system 9700(Perk㎕in-Elmer, Foster City, CA)에서 94℃에서 4 분 동안 변성되고, 뒤이어 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 50초의 사이클을 28회 반복한다. NEIL3의 프라이머 서열은: 정방향, 5'- TTGGTCCTCCTCTGTTTCATAGA-3'(서열번호: 46) 및 역방향, 5'-GCTTCTCCCCAGTTACAAGAGAC-3'(서열번호: 47)이다.
결과
암에서 증가된 NEIL3 발현
전체 유전자 발현 분석 데이타는 다양한 암으로부터 NEIL3(GenBank Accession No. NM_018248; 서열번호 44)발현이 증가한 것으로 나타나는 cDNA-마이크로어레이(cDNA-microarray)로부터 수득하였다. NEIL3 발현은 20례 AML 중 3례에서, 6례 방광암 중 5례에서, 11례 유방암 중 10례에서, 8례 자궁경부암 중 8례에서, 1례 암종 중 1례에서, 12례 CMLs 중 12례에서, 6례 결장암 중 3례에서, 1례 자궁내막증 중 1례에서, 8례 식도암 중 4례에서, 10례 간암 중 6례에서, 7례 NSCLCs 중 7례에서, 16례 골육종 중 16례에서, 1례 췌장암 중 1례에서, 10례 전립선 암 중 10례에서, 2례 신장암 중 2례에서, 12례 SCLCs 중 12례에서 및 12례 연조직 종양 중 12례에서 이에 상응하는 정상 조직과 비교하여 유효하게 증가하였다(표 1).
상응하는 정상조직과 비교하여 암 조직에서 NEIL3의 상향 조절이 나타난 사례의 비율
암(cancers) 비율(Ratio)
AML 4/20
방광암(bladder cancer) 5/6
유방암(breast cancer) 10/11
자궁경부암(cervical cancer) 8/8
암종(cholangiocellular carcinoma) 1/1
CML 12/12
결장암(colorectal cancer) 3/6
자궁내막증(endometriosis) 1/1
식도암(esophagus cancer) 4/8
간암(liver cancer) 6/10
NSCLC 7/7
골육종(osteosarcoma) 16/16
췌장암(pancreatic cancer) 1/1
전립선암(prostate cancer) 10/10
신장암(renal cancer) 2/2
SCLC 12/12
연조직 종양(soft tissue tumor) 12/12
( 실험예 1)
NEIL3 유래 HLA -A2에 결합하는 펩티드의 예측
표 2는 NEIL3 중 HLA-A2에 결합하는 펩티드를 결합 친화성이 높은 순서대로 나타낸다. 잠재적 HLA-A2 결합성을 가지는 총 23개의 펩티드를 선택하였고, 에피톱 펩티드를 결정하기 위해 시험하였다(표 2).
Figure pct00001
HLA -A*0201 또는 0206에 제한적인 NEIL3 유래 예측된 펩티드로 CTL 유도 및 NEIL3 유래 펩티드로 자극된 CTL 세포주의 수립
NEIL3 유래 이러한 펩티드들에 대한 CTL은 "재료 및 방법"에 기재한 프로토콜에 따라 제작하였다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-gamma ELISPOT 분석으로 결정되었다(도 1a-j). 도 1은 NEIL3-A2-9-585(서열번호 3)로 자극한 8번 웰(a), NEIL3-A2-9-127(서열번호 4)로 자극한 2번 웰(b), NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)로 자극한 4번 및 5번 웰(c), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6)로 자극한 3번 웰(d), NEIL3-A2-9-271(서열번호 11)로 자극한 1번 웰(e), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)로 자극한 3번 웰(f), NEIL3-A2-10-340(서열번호 17)로 자극한 1번 웰(g), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21)로 자극한 2번 및 3번 웰(h), 및 NEIL3-A02-10-378(서열번호 22)로 자극한 6번 웰(i)은 대조군의 웰에 비해서 강력한 IFN-gamma 생산을 입증하는 것을 나타낸다. 또한, NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)로 자극한 9, 10, 12 및 13번 웰(j)은 펩티드로 자극된 A0206 양성 PSCCA0922 세포에 대한 강력한 IFN-gamma 생산을 입증했다. 또한, NEIL3-A2-9-585(서열번호 3)로 자극한 8번 양성 웰, NEIL3-A2-9-127(서열번호 4)로 자극한 2번 양성 웰, NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)로 자극한 4 및 5번 양성 웰, NEIL3-A2-9-71(서열번호 6)로 자극한 3번 양성 웰, NEIL3-A2-9-271(서열번호 11)로 자극한 1번 양성 웰, NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)로 자극한 3번 양성 웰 및, NEIL3-A2-10-590(서열번호 21)로 자극한 2 및 3번 양성 웰 안의 상기 세포는 증식되었고, CTL 세포주로 수립되며, 또한, A0206에 대하여 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)로 자극한 10 및 12번 웰 안의 세포도 증식되고, CTL 세포주로 수립된다. 이러한 CTL 세포주의 CTL 활성은 IFN-gamma ELISA 분석으로 확인되었다(도 2a-k). 모든 CTL 세포주는 펩티드 자극이 없는 표적 세포에 비해서 상응하는 펩티드로 자극된 표적 세포에 대해 강력한 IFN-gamma 생산을 나타내는 것으로 보인다. 한편, 이러한 펩티드들이 HLA-A*0201와 잠재적 결합 활성을 가짐에도 불구하고, 표 2에서와 같이 다른 펩티드의 자극에 의해 CTL 세포주는 수립될 수 없다(데이타 표시 않음). 결과적으로, 상기 데이타는 NEIL3 유래 7 펩티드들이 강력한 CTL들을 유도할 수 있는 펩티드들을 선별하는 것을 나타냈다.
NEIL3 특이적 펩티드에 대한 CTL 클론의 수립
CTL 클론을 "재료 및 방법"에 기재한 것에 따라 CTL세포주로부터 희석을 제한함으로써 수립하였으며, 펩티드로 자극된 표적 세포에 대한 CTL 클론의 IFN-gamma 생산은 IFN-gamma ELISA 분석으로 확인하였다. 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 15 및 서열번호 21로 자극된 CTL 클론으로부터 강력한 IFN-gamma 생산을 도 3에서 확인하였다.
외생적으로 NEIL3 및 HLA -A*0201 또는 HLA -A*0206을 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성
이러한 펩티드에 대해 수립된 상기의 CTL 세포주에 대하여 NEIL3 및 HLA-A*0201 또는 HLA-A*0206 분자를 외생적으로 발현하는 표적 세포를 인식하는 그들의 능력을 시험하였다. NEIL3 및 HLA-A*0201 또는 HLA-A*0206 분자 유전자의 전장으로 형질전환된 COS7세포에 대한 특이적 CTL 활성(NEIL3 및 HLA-A*0201 또는 HLA-A*0206 유전자를 외생적으로 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 모델)은 효과 세포로서 상응하는 펩티드에 의해 유도된 CTL 세포주를 이용하여 시험하였다. 전장의 NEIL3 및 HLA-A*0201 또는 HLA-A*0206 유전자로 형질 전환한 COS7 세포는 대조군으로 준비되었다. 도 4에서, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 15로 자극된 CTL은 NEIL3 및 HLA-A*0206 모두를 발현하는 COS7 세포에 대해 강력한 활성을 보였으며, 서열번호 5로 자극된 CTL 또한 NEIL3 및 HLA-A*0206 모두를 발현하는 COS7 세포에 대해 강력한 활성을 보였다. 한편에, 대조군에 대해 특이적 CTL 활성은 나타나지 않았다. 따라서, 이러한 데이타는 NEIL3-A2-9-416(서열번호 5), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6) 및 NEIL3-A2-10-198(서열번호 15)가 HLA-A*0201 분자와 함께 표적 세포에 자연적으로 발현하면 CTL에 의해 인식된다는 것을 명백하게 증명하며, 또한, NEIL3-A2-9-416(서열번호 5)가 HLA-A*0201 분자와 함께 표적 세포에 자연적으로 발현하면 CTL에 의해 인식된다. 이러한 결과는 NEIL3 유래 이러한 펩티드가 NEIL3를 발현하는 암이 있는 환자에 대한 암 백신에 적용될 수 있음을 나타낸다.
항원 펩티드의 상동성 분석
NEIL3-A2-9-585(서열번호 3), NEIL3-A2-9-127(서열번호 4), NEIL3-A2-9-416(서열번호 5), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6), NEIL3-A2-9-271(서열번호 11), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15), NEIL3-A2-10-340(서열번호 17), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21) 및 NEIL3-A2-10-378(서열번호 22)로 자극된 CTL은 현저하고 특이적인 CTL 활성을 보인다. 이러한 결과는 NEIL3-A2-9-585(서열번호 3), NEIL3-A2-9-127(서열번호 4), NEIL3-A2-9-416(서열번호 5), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6), NEIL3-A2-9-271(서열번호 11), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15), NEIL3-A2-10-340(서열번호 17), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21) 및 NEIL3-A2-10-378(서열번호 22)의 서열이 사람의 면역 반응을 예민하게 하는 것으로 알려진 다른 분자 유래 펩티드에 대해 상동성이 있다는 사실로 인한 것일 것이다. 이러한 가능성을 차단하기 위해, 이러한 펩티드 서열에 대한 상동성 분석은 특이적 상동성이 없는 서열을 나타내는 BLAST 알고리즘(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)을 이용하여 수행된다. 하기의 서열의 상동성 분석 결과, NEIL3-A2-9-585(서열번호 3), NEIL3-A2-9-127(서열번호 4), NEIL3-A2-9-416(서열번호 5), NEIL3-A2-9-71(서열번호 6), NEIL3-A2-9-271(서열번호 11), NEIL3-A2-10-198(서열번호 15), NEIL3-A2-10-340(서열번호 17), NEIL3-A2-10-590(서열번호 21) 및 NEIL3-A2-10-378(서열번호 22)은 유일하며 따라서, 본 출원인의 지식으로, 이러한 분자는 연관되지 않은 분자에 대한 의도되지 않은 면역 반응을 일으킬 가능성이 거의 없다.
결론적으로, NEIL3 유래의 신규한 HLA-A2 에피톱 펩티드가 확인되었다. 또한, NEIL3 유래의 신규한 HLA-A2 에피톱 펩티드는 암의 면역치료에 적용될 수 있음이 증명되었다.
다양한 인간 암에서의 NEIL3 의 증가된 발현
추후에 반-정량적 RT-PCR 분석으로 마이크로어레이 분석되는 ICC들 8 중 7에서 NEIL3 발현이 증가된 것을 밝혔다(도 5a).
간 암에서의 이 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 임상적 간 암 표본 및 정상 간 세포를 포함한 정상 인간 조직을 사용한 반-정량적 RT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 NEIL3가 정상 간 세포에 비해 임상적 간암 세포 표본(분화 불량성 병변(poorly-differentiated lesions)) 8 중 7에서 발현이 증가 되었으며(도 5a), HCC 세포주 5 중 5에서 과발현되고 다른 정상 조직에서는 발현되지 않는 것을 발견하였다(도 5b).
( 실험예 2)
NEIL3 유래 HLA -A24에 결합하는 펩티드의 예측
표 3a 및 3b는 NEIL3의 HLA-A24 결합 9-머 및 10-머 펩티드를 높은 결합 친화성 순으로 나타낸다. 잠재적인 HLA-A24 결합 능력이 있는 총 21개의 펩티드가 선택되었으며 에피톱 펩티드를 결정하는 것이 시험되었다.
Figure pct00002

Figure pct00003
HLA -A*2402에 제한적인 NEIL3 유래 예측된 펩티드로 CTL 유도
NEIL3 유래 이러한 펩티드에 대한 CTL은 "재료 및 방법"에 기재된 프로토콜에 따라 만들어진다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-gamma ELISPOT 분석에 의해 결정된다(도 6a-e). NEIL3-A24-9-545(서열번호 24)로 자극한 7번 웰(a), NEIL3-A24-9-362(서열번호 33)로 자극한 6번 웰(b), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35)로 자극한 2 및 8번 웰(c), NEIL3-A24-10-544(서열번호 41)로 자극한 8번 웰(d) 및 NEIL3-A24-10-87(서열번호 43)로 자극한 1 및 4번 웰(e)은 대조군 웰에 비해 강력한 IFN-gamma 생산을 증명하였다. 한편에, 이러한 펩티드가 HLA-A*2402 에 결합하는 특성을 보임에도 불구하고, 특별한 CTL 활성은 표3에 나타난 다른 펩티드의 자극에 의해 결정되지 않았다. 예를 들어, 펩티드-자극된 표적 세포에 대해 NEIL3-A24-9-364(서열번호 25)로 자극한 CTL 반응의 전형적인 음성 데이타(f). 결과적으로, NEIL3 유래 다섯 개의 펩티드가 강력한 CTL을 유도할 수 있는 펩티드로 선별되는 것을 나타냈다.
NEIL3 특이적 펩티드에 대한 CTL 세포주 및 클론의 수립
IFN-gamma ELISPOT 분석으로 검출된 펩티드 특이적 CTL 활성이 보여진, NEIL3-A24-9-545(서열번호 24)로 자극한 7번 웰(a), NEIL3-A24-9-362(서열번호 33)로 자극한 6번 웰(b), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35)로 자극한 8번 웰(c), NEIL3-A24-10-544(서열번호 41)로 자극한 8번 웰(d) 및 NEIL3-A24-10-87(서열번호 43)로 자극한 1번 웰(e) 안의 세포는 증식되고 CTL 세포주로 수립된다. 그러한 CTL 세포주의 CTL 활성은 IFN-gamma ELISA 분석으로 결정된다(도 7a-e). 모든 CTL 세포주는 펩티드 자극이 없는 표적 세포에 비해서 상응하는 펩티드로 자극된 표적 세포에 대해 강력한 IFN-gamma 생산이 입증된 것으로 보인다. 또한, CTL 클론은 CTL 세포주로부터 희석을 제한함으로써 수립될 수 있으며, 펩티드로 자극된 표적 세포에 대한 CTL클론으로부터 IFN-gamma 생산은 IFN-gamma ELISA 분석으로 확인될 수 있다. 강력한 IFN-gamma 생산은 도 8에서 NEIL3-A24-9-545(서열번호 24)(a), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35)(b) 및 NEIL3-A24-10-544(서열번호 41)(c)로 자극된 CTL 클론으로부터 확인되었다.
외생적으로 NEIL3 및 HLA -A* 2402을 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성
각각의 펩티드에 대해 형성되고 수립된 CTL 세포주 및 클론들은 내생적으로 NEIL3 및 HLA-A*2402 유전자를 발현하는 표적 세포를 인식하는 그들의 능력에 대해 시험 되었다. 전장의 NEIL3 및 HLA-A*2402 유전자 둘 모두 형질 전환된 COS7 세포에(NEIL3 및 HLA-A*2402 유전자를 외생적으로 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 모델) 대한 특이적 CTL 활성은 효과 세포로서 상응하는 펩티드에 의해 형성된 CTL세포주 및 클론들을 이용하여 시험되었다. COS7는 전장의 NEIL3 유전자 또는 HLA-A* 2402로 형질전환되어 대조군으로 준비되었다. 도 9에서, NEIL3-A24-9-545(서열번호 24)로 자극된 CTL은 NEIL3 및 HLA-A* 2402 둘 모두를 발현하는 COS7 세포에 대해 강력한 CTL활성을 나타내었다. 한편에, 대조군에 대해서는 상당한 특이적 CTL 활성이 발견되지 않았다. 따라서, 이러한 데이타는 NEIL3-A24-9-545(서열번호 24)가 HLA-A*2402 분자와 자연적으로 표적 세포에 발현되고 CTL에 의해 인식됨을 명백하게 증명하였다. 이러한 결과는 NEIL3 유래 펩티드들이 NEIL3를 발현하는 종양이 있는 환자에 대한 암 백신으로 적용 가능한 것을 나타낸다.
항원 펩티드의 상동성 분석
NEIL3-A24-9-545(서열번호 24), NEIL3-A24-9-362(서열번호 33), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35), NEIL3-A24-10-544(서열번호 41) 및 NEIL3-A24-10-87(서열번호 43)로 자극된 CTL은 현저하고 특이적 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 NEIL3-A24-9-545(서열번호 24), NEIL3-A24-9-362(서열번호 33), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35), NEIL3-A24-10-544(서열번호 41) 및 NEIL3-A24-10-87(서열번호 43) 의 서열이 사람 면역계를 민감하게 하는 것으로 알려진 다른 분자 유래 펩티드에 일치하는 것 때문일 것이다. 이러한 가능성을 차단하기 위해, 상동성 분석이 BLAST 알고리즘(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)을 이용하여 이러한 펩티드에 대해 수행되었으며, 유의적인 상동성이 있는 서열이 없는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상동성 분석 결과는 NEIL3-A24-9-545(서열번호 24), NEIL3-A24-9-362(서열번호 33), NEIL3-A24-10-320(서열번호 35), NEIL3-A24-10-544(서열번호 41) 및 NEIL3-A24-10-87(서열번호 43)가 독특하며 따라서, 최선의 지식으로, 이러한 분자는 연관되지 않은 분자에 대한 의도되지 않은 면역 반응을 일으킬 가능성이 거의 없다는 것을 나타낸다.
결과적으로, NEIL3 유래 신규한 HLA-A*2402 에피톱 펩티드가 확인되었다. 또한, NEIL3가 암 면역치료에 적용될 수 있음이 증명되었다.
본 발명은 강력하고 특이적인 항 종양 면역반응을 유도하고 다양한 종류의 암에 적용가능한 신규한 TAA, 특히 NEIL3 유래한 것을 제공한다. 이러한 TAA는 암의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> NEIL3 PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME <130> 11fpi-07-06 <150> US 61/210,512 <151> 2009-03-18 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Val Leu Ser Leu Phe Asn Gly Tyr Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Phe Met Tyr Phe Gly Pro Lys Ala Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Lys Gln Cys Asn Phe Phe Gln Trp Ala 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Leu Ile Cys Phe Phe Asp Ser Ser Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Phe Gln Asn Ser Pro Pro Ala Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 37 Cys His Cys Arg Ile Thr Val Cys Arg Phe 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 38 Glu His Trp Thr Cys Val Val Cys Thr Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 39 Ile Gly Pro Asn Asn Gly Lys Asn Phe Phe 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 40 Gln Leu Thr Lys Asp Leu Ile Cys Phe Phe 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 41 Phe Glu Trp Ala Asp Leu Ser Phe Pro Phe 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 42 Pro Leu Pro Arg Glu Ala Gln Cys Gly Phe 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT 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357 Leu Ser Leu Phe Asn Gly Tyr Val Tyr Ser Gly Val Glu Thr Leu Gly 65 70 75 80 aag gag ctc ttt atg tac ttt gga cca aaa gct tta cgg att cat ttc 405 Lys Glu Leu Phe Met Tyr Phe Gly Pro Lys Ala Leu Arg Ile His Phe 85 90 95 gga atg aaa ggc ttc atc atg att aat cca ctt gag tat aaa tat aaa 453 Gly Met Lys Gly Phe Ile Met Ile Asn Pro Leu Glu Tyr Lys Tyr Lys 100 105 110 aat gga gct tct cct gtt ttg gaa gtg cag ctc acc aaa gat ttg att 501 Asn Gly Ala Ser Pro Val Leu Glu Val Gln Leu Thr Lys Asp Leu Ile 115 120 125 tgt ttc ttt gac tca tca gta gaa ctc aga aac tca atg gaa agc caa 549 Cys Phe Phe Asp Ser Ser Val Glu Leu Arg Asn Ser Met Glu Ser Gln 130 135 140 cag aga ata aga atg atg aaa gaa tta gat gta tgt tca cct gaa ttt 597 Gln Arg Ile Arg Met Met Lys Glu Leu Asp Val Cys Ser Pro Glu Phe 145 150 155 160 agt ttc ttg aga gca gaa agt gaa gtt aaa aaa cag aaa ggc cgg atg 645 Ser Phe Leu Arg Ala Glu Ser Glu Val Lys Lys Gln Lys Gly Arg Met 165 170 175 cta ggt gat gtg cta atg gat cag aac gta ttg cct gga gta ggg aac 693 Leu Gly Asp Val Leu Met Asp Gln Asn Val Leu Pro Gly Val Gly Asn 180 185 190 atc atc aaa aat gaa gct ctc ttt gac agt ggt ctc cac cca gct gtt 741 Ile Ile Lys Asn Glu Ala Leu Phe Asp Ser Gly Leu His Pro Ala Val 195 200 205 aaa gtt tgt caa tta aca gat gaa cag atc cat cac ctc atg aaa atg 789 Lys Val Cys Gln Leu Thr Asp Glu Gln Ile His His Leu Met Lys Met 210 215 220 ata cgt gat ttc agc att ctc ttt tac agg tgc cgt aaa gca gga ctt 837 Ile Arg Asp Phe Ser Ile Leu Phe Tyr Arg Cys Arg Lys Ala Gly Leu 225 230 235 240 gct ctc tct aaa cac tat aag gtt tac aag cgt cct aat tgt ggt cag 885 Ala Leu Ser Lys His Tyr Lys Val Tyr Lys Arg Pro Asn Cys Gly Gln 245 250 255 tgc cac tgc aga ata act gtg tgc cgc ttt ggg gac aat aac aga atg 933 Cys His Cys Arg Ile Thr Val Cys Arg Phe Gly Asp Asn Asn Arg Met 260 265 270 aca tat ttc tgt cct cac tgt caa aaa gaa aat cct caa cat gtt gac 981 Thr Tyr Phe Cys Pro His Cys Gln Lys Glu Asn Pro Gln His Val Asp 275 280 285 ata tgc aag cta ccg act aga aat act ata atc agt tgg aca tct agc 1029 Ile Cys Lys Leu Pro Thr Arg Asn Thr Ile Ile Ser Trp Thr Ser Ser 290 295 300 agg gtg gat cat gtt atg gac tcc gtg gct cgg aag tcg gaa gag cac 1077 Arg Val Asp His Val Met Asp Ser Val Ala Arg Lys Ser Glu Glu His 305 310 315 320 tgg acc tgt gtg gtg tgt act tta atc aat aag ccc tct tct aag gca 1125 Trp Thr Cys Val Val Cys Thr Leu Ile Asn Lys Pro Ser Ser Lys Ala 325 330 335 tgt gat gct tgc ttg acc tca agg cct att gat tca gtg ctc aag agt 1173 Cys Asp Ala Cys Leu Thr Ser Arg Pro Ile Asp Ser Val Leu Lys Ser 340 345 350 gaa gaa aat tct act gtc ttt agc cac tta atg aag tac ccg tgt aat 1221 Glu Glu Asn Ser Thr Val Phe Ser His Leu Met Lys Tyr Pro Cys Asn 355 360 365 act ttt gga aaa cct cat aca gaa gtc aag atc aac aga aaa act gca 1269 Thr Phe Gly Lys Pro His Thr Glu Val Lys Ile Asn Arg Lys Thr Ala 370 375 380 ttt gga act aca act ctt gtc ttg act gat ttt agc aat aaa tcc agt 1317 Phe Gly Thr Thr Thr Leu Val Leu Thr Asp Phe Ser Asn Lys Ser Ser 385 390 395 400 act ttg gaa aga aaa aca aag caa aac cag ata cta gat gag gag ttt 1365 Thr Leu Glu Arg Lys Thr Lys Gln Asn Gln Ile Leu Asp Glu Glu Phe 405 410 415 caa aac tct cct cct gct agt gtt tgt ttg aat gat ata cag cac ccc 1413 Gln Asn Ser Pro Pro Ala Ser Val Cys Leu Asn Asp Ile Gln His Pro 420 425 430 tcc aag aag aca aca aac gat ata act caa cca tcc agc aaa gta aac 1461 Ser Lys Lys Thr Thr Asn Asp Ile Thr Gln Pro Ser Ser Lys Val Asn 435 440 445 ata tca cct aca atc agt tca gaa tct aaa tta ttt agt cca gca cat 1509 Ile Ser Pro Thr Ile Ser Ser Glu Ser Lys Leu Phe Ser Pro Ala His 450 455 460 aaa aaa ccg aaa aca gcc caa tac tca tca cca gag ctt aaa agc tgc 1557 Lys Lys Pro Lys Thr Ala Gln Tyr Ser Ser Pro Glu Leu Lys Ser Cys 465 470 475 480 aac cct gga tat tct aac agt gaa ctt caa att aat atg aca gat ggc 1605 Asn Pro Gly Tyr Ser Asn Ser Glu Leu Gln Ile Asn Met Thr Asp Gly 485 490 495 cct cgt acc tta aat cct gac agc cct cgc tgc agt aaa cac aac cgc 1653 Pro Arg Thr Leu Asn Pro Asp Ser Pro Arg Cys Ser Lys His Asn Arg 500 505 510 ctc tgc att ctc cga gtt gtg agg aag gat ggg gaa aac aag ggc agg 1701 Leu Cys Ile Leu Arg Val Val Arg Lys Asp Gly Glu Asn Lys Gly Arg 515 520 525 cag ttt tat gcc tgt cct cta cct aga gaa gca caa tgt gga ttt ttt 1749 Gln Phe Tyr Ala Cys Pro Leu Pro Arg Glu Ala Gln Cys Gly Phe Phe 530 535 540 gaa tgg gca gat ttg tcc ttc cca ttc tgc aac cat ggc aag cgt tcc 1797 Glu Trp Ala Asp Leu Ser Phe Pro Phe Cys Asn His Gly Lys Arg Ser 545 550 555 560 acc atg aaa aca gta ttg aag att gga cct aac aat gga aag aat ttt 1845 Thr Met Lys Thr Val Leu Lys Ile Gly Pro Asn Asn Gly Lys Asn Phe 565 570 575 ttt gtg tgt cct ctt ggg aag gaa aaa caa tgc aat ttt ttc cag tgg 1893 Phe Val Cys Pro Leu Gly Lys Glu Lys Gln Cys Asn Phe Phe Gln Trp 580 585 590 gca gaa aat ggg cca gga ata aaa att att cct gga tgc tat atctg 1940 Ala Glu Asn Gly Pro Gly Ile Lys Ile Ile Pro Gly Cys Tyr 595 600 605 tagattctct ggcatttagt ctcttcaaac tgtgtataat gtttggtcct cctctgtttc 2000 atagaaaagt catagaatat ctatgataca ttgaaaagtt actgcaatat ttgagaactg 2060 ttcttttttt ttcttgtgtg tgccatcttt ccattgttgg ctacgtcttt tcttttgcct 2120 tgatgaacgt tctatgtatt tcatcggata tacagcatat tccatttagg atgtgtattt 2180 aatgcattta gtaatgacga taaagtgttt ttagtatgct tttagtctct tgtaactggg 2240 gagaagcagt gttttttttt taggaaagga ttatgcgaca caataaaata agatattctg 2300 tctgtagtga atacatttct catgtactaa cactatttat aatatatgat taaagatatt 2360 tcttgtttta ttaaataata agaaataaga tctccttta 2399 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 46 ttggtcctcc tctgtttcat aga 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 47 gcttctcccc agttacaaga gac 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 48 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 49 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 50 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 51 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24

Claims (36)

  1. HLA항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocytes, CTL) 유도성을 가지며, 서열번호 45의 아미노산 서열로 구성되거나 또는 이의 면역학적 활성 단편인 분리된 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 HLA 항원이 HLA-A2인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21 및 22로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  4. 제 1항, 제 2항 및 3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21 및 22로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 첨가된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  5. 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 15, 17, 21 및 22로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 하기 특성 중 하나 또는 모두를 가지는 제 4항의 분리된 펩티드:
    (a) N-말단으로부터 두번째 아미노산이 루신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것; 및
    (b) C-말단의 아미노산이 발린(valine) 및 루신(leucine)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 HLA 항원이 HLA-A24인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  7. 제 1항 또는 제 6항에 있어서, 서열번호 24, 33, 35, 41 및 43으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  8. 제 1항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 24, 33, 35, 41 및 43으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 첨가된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  9. 제 8항에 있어서, 서열번호 24, 33, 35, 41 및 43으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 하기 특성 중 하나 또는 모두를 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:
    (a) N-말단으로부터 두번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine) 및 트립토판(tryptophan)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것; 및
    (b) C-말단의 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것.
  10. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 1 내지 10항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 제 11항의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 CTL 유도용 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 제 11항의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 암 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 암 재발 방지용 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 개체에 투여하기 위해 조성된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 암 치료를 위해 조성된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 하기 단계로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 단계를 포함하는, CTL 유도성을 가지는 항원제시세포(an antigen-presenting cell, APC) 유도 방법:
    (a) 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩티드와 APC를 시험관 내, 생체외 또는 생체 내에서 접촉하는 단계; 및
    (b) 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC 내로 도입하는 단계.
  17. 하기 단계로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 단계를 포함하는 CTL 유도 방법:
    (a) CD8-양성 T 세포를 HLA 항원과 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 APCs와 공배양하는 단계;
    (b) CD8-양성 T 세포를 HLA 항원과 제 1항 내지 제 10항에 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 엑소솜과 공배양하는 단계; 및
    (c) 제 1항 내지 제 10항에 중 어느 한 항의 펩티드에 결합하는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 아단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 T세포로 도입하는 단계.
  18. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩티드와 HLA 항원 복합체를 그것의 표면에 제시하는 분리된 APC.
  19. 제 18항에 있어서, 제 16항의 방법으로 유도된 것을 특징으로 하는 APC.
  20. 제 1항 내지 제 10항의 펩티드 중 어느 하나를 표적으로 하는 분리된 CTL.
  21. 제 20항에 있어서, 제 17항의 방법으로 유도된 것을 특징으로 하는 CTL.
  22. 제 1항 내지 제 10항의 펩티드, 이의 면역학적 활성 단편, 상기 펩티드 또는 상기 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암에 대한 면역 반응 유도 방법.
  23. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 엑소좀.
  24. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩티드에 대한 항체 또는 그의 단편.
  25. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  26. 제 25항에 따른 발현 벡터로 형질도입 또는 형질전환된 숙주 세포.
  27. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한항의 펩티드, 제 11항의 뉴클레오티드 또는 제 24항의 항체 중 어느 것을 포함하는 진단 키트.
  28. 하기 단계를 포함하는 암 진단 방법:
    (a) 개체-유래 생물체 시료에서 NEIL3 유전자의 발현 수준을 하기 단계로 구성되는 군에서 선택되는 방법 중 어느 하나에 의해 측정하는 단계;
    (ⅰ) NEIL3의 서열을 포함하는 mRNA,
    (ⅱ) NEIL3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (ⅲ) NEIL3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 생물학적 활성, 및
    (b) 단계 (a)에서 측정된 상기 발현 수준이 유전자의 정상 대조 수준에 비해 증가한 암의 존재와 연관시키는 단계.
  29. 제 28항에 있어서, 단계 (a)에서 측정된 상기 발현 수준은 정상 대조 수준보다 적어도 10% 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 암종, 결장암, 자궁내막증, 식도암, 간암, NSCLC((non-small cell lung cancer), 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC(small cell lung cancer), 연조직 종양, AML(acute myeloid leukemia) 및 CML(chronic myeloid leukemia)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28항에 있어서, 단계 (a)에서 측정된 상기 발현 수준은 상기 유전자의 유전자 전사체에 대한 프로브 혼성화의 검출에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 28항에 있어서, 단계 (a)에서 측정된 상기 발현 수준은 NEIL3의 단백질에 대한 항체 결합의 검출에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 28항에 있어서, 상기 개체-유래 생물체 시료는 생검, 객담, 혈액, 흉수 또는 소변을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 28항에 있어서, 상기 NEIL3 유전자는 서열번호 45에서 보여지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 28항에 있어서, 상기 NEIL3의 아미노산은 서열번호 45인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. NEIL3의 전사 또는 번역 산물에 결합하는 검출 시약을 포함하는 키트.
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