KR20130101529A

KR20130101529A - Ｔｔｌｌ４ 펩티드 및 이를 포함하는 백신

Info

Publication number: KR20130101529A
Application number: KR1020137008815A
Authority: KR
Inventors: 유스케 나카무라; 타쿠야 츠노다; 류지 오사와
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2010-09-07
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2013-09-13
Also published as: WO2012032764A1; BR112013005448A2; EP2614146A4; CA2810636A1; AU2011300253B2; CN103189510A; AU2011300253A1; US20130224234A1; SG187847A1; RU2013115434A; MX2013002303A; CN103189510B; EP2614146A1; TW201210608A; JP2013540419A

Abstract

암에 대한 펩티드 백신이 본 명에서에 서술되었다. 특히, CTL을 끌어내는 TTLL4 유전자 유래 에피토프(epitope) 펩티드가 제공된다. 항원-제시 세포(antigen-presenting cell) 및 CTL을 유도하기 위한 방법뿐만 아니라, 항원-제시 세포 및 상기 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL 또한 제공된다. 본 발명은 추가적으로 TTLL4 유래 펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 게다가, 본 발명은 CTL을 유도하기 위한 방법, 항-종양 면역력(anti-tumor immunity)을 유도하기 위한 방법, TTLL4 유래 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도, 또는 상기 펩티드를 제시하는 항원-제시 세포, 또는 본 발명의 약학적 조성물 뿐만 아니라, 암(종양)의 치료 및/또는 예방(prophylaxis)[즉, 방지(preventing)], 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하기 위한 방법을 제공한다.

Description

ＴＴＬＬ４ 펩티드 및 이를 포함하는 백신{TTLL4 PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME}

본 발명은 생물과학 분야, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양(tumor)을 진단하기 위한 방법뿐만 아니라, 종양을 치료 및 예방하기 위한 암 백신, 약으로서 효과적인 신규한 펩티드에 관한 것이다.

우선권

본 출원은 2010년 9월 7일에 출원된 미국 가출원 제 61/380,611호에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 통합된다.

CD8 양성(CD8 positive)세포독성 T 세포(CTL)는 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 종류 I 분자에서 발견되는 종양관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)에서 유래한 에피토프 펩티드(epitope peptide)를 인지하고, 종양세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. TAA의 첫 번째 예로 흑색종 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리의 발견 이후, 다른 많은 TAA가 주로 면역학적 접근을 통해 발견되었다(비특허문헌 1: 비특허문헌 2). 상기 TAA 중 일부는 현재 면역치료법의 표적으로서 임상 개발 과정에 있다.

유망한 TAA는 암 세포의 증식 및 생존에 필수적이다. 면역치료를 위한 표적으로서 이러한 TAA의 이용은 치료상으로 유도된 면역 선별(immune selection)의 결과로서, TAA의 결실, 돌연변이 또는 하향-조절(down-regulation)에 기인한 암세포의 면역 회피(immune escape)의 잘 묘사된 위험을 최소화할 수 있다. 따라서, 강력하고 특이적인 항-종양 면역반응을 유도할 수 있는 새로운 TAA의 동정은 추가적인 개발을 보장하고, 따라서 현재 다양한 유형의 암에 대한 펩티드 백신화의 임상적 적용이 진행중이다(비특허문헌 3, 비특허문헌 4, 비특허문헌 5, 비특허문헌 6, 비특허문헌 7, 비특허문헌 8, 비특허문헌 9, 비특허문헌 10). 지금까지 TAA 유도된 펩티드를 사용한 임상 시험의 몇몇 보고가 있었다. 불행히도, 오직 낮은 목표 회답률(objective response rate)만이 상기 암 백신 시험에서 관찰되었다(비특허문헌 11, 비특허문헌 12, 비특허문헌 13). 따라서, 면역요법의 표적으로 유용한 신규 TAA의 확인이 여전히 요구된다.

튜블린 티로신 연결효소-성 패밀리 멤버 4(tubulin tyrosine ligase-like family member 4)인 TTLL4(GenBank Accssion No: NP_055455)는 폴리글루타밀라제 효소(polyglutamylase enzyme)이다. 이는 몇몇 미세관(microtubule) 기능에 있어서 중요한 역할을 한다. 폴리글루타밀라제는 표적 단백질 내부의 글루타메이트 잔기(glutamate residue)의 글루타민산(glutamic acid)에 순차적인 공유접합(sequential covalent attachment)에 의해 생성된 되돌릴 수 있는 변형(reversible modification)이다(비특허문헌 14). 이의 생물학적 중요성은 잘 알려져 있지 않다. 오직 상기 폴리글루타밀화(polyglutamylation)의 표적이 알파(alpha)- 및 베타(beta)-튜블린(tublin), 미세관의 구조적 단위(structural unit)(비특허문헌 15), 및 뉴클레오솜 결합 단백질(nucleosome assembly protein)인 NAP1 및 NAP2(비특허문헌 16)라는 것이 알려져 있다.

췌장 관세포암(pancreatic ductal adenocarcinoma; PDAC) 세포주의 전체 유전체 유전자 발현 개요분석(genome-wide gene expression profile anaylsis)는 TTLL4가 PDAC에서 과발현됨을 나타낸다. PDAC 세포주 및 TTLL4의 외생적 도입(exogenous introduction)은 세포성장을 촉진하였다(비특허문헌 17). 노던블랏 분석(Northern blotting analysis)은 TTLL4가 고환(testis)을 제외하고 정상 기관(normal organ)에서는 발현하지 않는다는 것을 증명하였다.

이를 종합하여, 이러한 데이터는 TTLL4가 암 면역치료 프로토콜(cancer immunotherapy protocol), 특히 TTLL4 발현 종양을 가진 환자를 위해 적합한 표적일 것임을 고려한다.

Boon T, Int J Cancer 1993, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002, Oct 15, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004, 10(9): 909-15 Edde B. et al., Science. 1990: 247(4938): 83-5 Rudiger M. et al., FEBS Lett. 1992: 308(1): 101-5 Regnard C., J Biol Chem. 2000: 275(21): 15969-76 Kotoe K., Cancer Res. 2010: 70(10): 4024-33

[발명의 요약]

본 발명은, 최소한 부분적으로, 면역치료법의 적합한 표적으로 제공될 신규한 펩티드의 발견에 기초한다. TAA(tumor-associated antigen)는 일반적으로 면역계에 의해 "자기(self)"로 인지되어 종종 선천적인 면역성(innate immunogenicity)을 갖지 않기 때문에, 적절한 표적의 발견은 매우 중요하다. 본 발명을 통해서, TTLL4[GenBank Accession No.NM_014640(서열번호 79)의 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 80]가 특히, 방광암(bladder cancer), 담관세포암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia; CML), 결장(colon) 및 직장(rectum) 암, 식도암(esophageal cancer), 간암(liver cancer), 림프종(lymphoma), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal carcinoma), 소세포폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비소세포성폐암(non-small-cell-lung cancer; NSCLC), 연조직종양(soft tissue tumor) 및 골육종(osteosarcoma)을 포함하나 이에 한정하지 않는 암에서 특히 과발현되는 것을 증명하였다. 따라서, 본 발명은 적절한 암 마커로서 TTLL4 및 면역요법의 표적을 위한 후보에 초점을 맞췄다.

본 발명은 추가적으로 본 발명은 TTLL4 특이적인 CTL을 유도하는 능력을 가지는 TTLL4의 유전자 산물 중에서 특이적 에피토프 펩티드(epitope peptide)의 동정에 관련된다. 하기에 기술된 것과 같이, 건강한 공여자로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 TTLL4로부터 유래된 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201에 결합하는 후보 펩티드를 사용하여 자극되었다. 그런 다음 각 후보 펩티드를 부가(pulsed)하여 HLA-A24 또는 HLA-A2 양성 표적 세포에 대하여 특이적 세포 독성을 갖는 CTL 세포주가 확립되었다. 본 발명에서, 상기 결과는 상기 펩티드가 TTLL4를 발현하는 세포에 대해 강력하고 특이적 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 또는 HLA-A2에 제한된 에피토프(epitope) 펩티드임을 증명한다. 또한, 상기 결과는 TTLL4는 강한 면역반응을 유도하고 그것의 에피토프는 종양 면역치료법에 효과적인 표적임을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 목적은 HLA 항원에 결합하고 TTLL4 서열(서열번호 80) 또는 이의 면역학적 단편(immunogenic fragment)을 포함하는 분리된 펩티드를 제공하는 것이다. 상기 펩티드는 CTL 유도성을 가질 것으로 예상되고, 따라서, 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 CTL을 유도하기 위해 사용될 수 있고, 또는 예를 들어 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암, 비소세포성폐암, 연조직종양 및 골육종을 포함하나 이에 한정하지 않는 암에 대한 면역반응을 유도하기 위해 개체에 투여될 수 있다. 바람직한 펩티드는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 노나펩티드 및 데카펩티드이다. 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명은 서열번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 상기 변형된 펩티드가 변형되지 않은 펩티드의 필요한 CTL 유도성 및 HLA 결합능력을 유지하는 한 하나, 두 개 또는 그 이상의 아미노산이 치환(substituted), 삭제(deleted), 삽입(inserted) 또는 첨가(added)되는 변형된 펩티드를 고려한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 어느 한 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 CTL 유도성을 갖는 APC를 유도하거나 준비하는 것에 이용될 수 있다. 상기 기술된 본 발명의 펩티드와 같이, 상기 APC는 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 수 있다.

개체에 투여할 때, 본 발명의 펩티드는 바람직하게 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도하기 위하여 APC의 표면에 제시된다. 따라서, 본 발명의 하나의 목표는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물(composition) 또는 제제(agent)와 같이 CTL을 유도하는 제제 및/또는 조성물을 제공하는 것이다. 상기 제제, 물질(substance) 및/또는 조성물은 원발암(primary cancer), 전이(metastasis) 또는 이의 수술 후의 재발의 치료 및/또는 예방(prophylaxis)을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 암의 예는 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암, 비소세포성폐암, 연조직종양 및 골육종을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 서술된 원발암, 전이 또는 수술후 재발의 치료 및/또는 예방을 위해 제형화된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함 또는 통합하는(incorporate) 약학적 조성물 또는 제제를 고려한다. 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 대신에 또는 추가적으로, 상기 약학적 제제 및/또는 조성물은 본 발명의 펩티드의 어느것을 제시하는 APC 또는 엑소솜(exsosome)을 유효성분으로 포함할 것이다.

본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 개체 유래 APC를 펩티드에 접촉시키거나 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입시킴으로써 상기 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 APC를 유도에 사용될 수 있다. 이러한 APC는 상기 표적 펩티드에 대한 높은 CTL 유도성(inducibility)를 갖고 그러므로 암 면역치료법에 유용하다. 따라서, 본 발명은 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하는 방법 및 상기 방법에 의해 수득된 APC를 고려한다.

본 발명의 다른 목적은 HLA 항원 및 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 복합체를 제시하는 APC와 CD8 양성 T 세포를 공-배양(co-culturing)하는 단계, HLA 항원 및 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 복합체를 이의 표면에 제시하는 엑소솜과 CD8 양성 T 세포를 공-배양 하는 단계, 또는 본 발명의 펩티드에 결합하는 T 세포 수용체(receptor) 아단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 CTL을 유도하기 위한 방법을 제공한다.

상기 방법으로 얻은 CTL은 암, 더욱 바람직하게는 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암, 비소세포성폐암, 연조직종양 및 골육종의 치료 및/또는 예방을 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 CTL을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드 복합체를 표면에 제시하는 분리된 APC를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL을 제공한다. 상기 APC 및 CTL은 암 면역치료에 사용될 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이를 필요로 하는 개체에 있어서, 암에 대한 면역반응을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 적용가능성(applicability)은 TTLL4 과발현에 관련되거나, 과발현으로 인한 많은 질환 중 어떤 것으로 확장할 수 있고, 암을 포함하며, 암의 예는 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암, 비소세포성폐암, 연조직종양 및 골육종을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 전술한 본 발명의 개요 및 하기의 상세한 설명은 예시할 수 있는 실시예이고, 본 발명 또는 본 발명의 다른 대체적 실시예를 제한하려는 것이 아닌 것이 이해된다. 뿐만 아니라, 본 발명의 또 다른 목적은 도면 및 실시예를 포함하는 하기 자세한 묘사를 읽을 때, 보다 전체적으로 명백해질 것이다. 하지만, 본 발명의 상기 요약 및 하기의 자세한 묘사는 실시예이고, 본 발명이나 또는 본 발명의 다른 대안적 실시예를 제한하지 않는다. 특히, 본 발명이 여기에서 많은 구체적 실시예와 함께 기술되지만, 그 기술은 본 발명의 예일 뿐, 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 뜻(spirit) 및 범위(scope) 내에서, 첨부된 청구항에 의해 기술된 것과 같이 다양한 변형 및 적용이 당업자에게 일어날 수 있다. 동일하게, 본 발명의 다른 목적, 특징, 유용성(benefit) 및 이점(advantages)는 상기 요약 및 하기에 기술된 특정 실시예로부터 명백해질 것이고, 용이하게 당업자에게도 명백할 것이다. 상기 목적, 특징, 유용성 및 이점은 동반되는 실시예, 데이터, 도면 및 그로부터 가능한 모든 타당한 추론과 함께, 단독으로, 또는 여기서 통합된 참조문헌의 고려와 함께 상기로부터 명백할 것이다.

본 발명의 다양한 측면 및 적용은 도면의 간단한 설명을 고려하여 당업자에게 명백해 질 것이다. 그리고, 본 발명의 자세한 설명 및 이의 바람직한 실시예는 하기와 같다.
[도 1-1]
도 1-1은 일련의 사진 (a) 내지 (j)로 구성되었고, TTLL4 유래 펩티드로 유도된 CTL에 IFN-감마(gamma) ELISPOT의 결과를 나타내는 도이다. TTLL4-A24-9-750(서열번호 1)과 함께인 #7번 웰(a), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6)와 함께인 #8번 웰(b), TTLL4-A24-9-793(서열번호 11)과 함께인 #8번 웰(c), TTLL4-A24-9-691(서열번호 12)과 함께인 #5번 웰(d), TTLL4-A24-9-103(서열번호 16)과 함께인 #1번 웰(e), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20)과 함께인 #3번 웰(f), TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)과 함께인 #3번 웰(g), TTLL4-A24-10-883(서열번호 22)과 함께인 #8번 웰(h), TTLL4-A24-10-1186(서열번호 28)과 함께인 #2번 웰(i), TTLL4-A24-10-1022(서열번호 29)와 함께인 #3번 웰(j)에서 CTL은 각각 대조군에 비해 강력한 IFN-감마 생산을 나타냈다. 이러한 사진의 상기 웰의 사각형은 해당하는 웰 유래 세포를 CTL 세포주로 수립하기 위해 증식한 것을 나타낸다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, “-”는 어떤 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다.
[도 1-2]
도 1-2는 TTLL4 유래 펩티드로 유도된 CTL에 대한 IFN-감마 ELISPOT 분석의 결과를 묘사하는 일련의 사진 (k) 내지 (m)으로 구성된다. TTLL4-A24-10-994(서열번호 32)와 함께인 #1번 웰(k) 및 TTLL4-A24-10-891(서열번호 37)과 함께인 #6번 웰(l)은 각각 대조군에 비해 강력한 IFN-감마 생산을 나타냈다. 이러한 사진의 상기 웰의 사각형은 해당하는 웰 유래 세포를 CTL 세포주로 수립하기 위해 증식한 것을 나타낸다. 반면에, 음성데이타를 위한 전형적인 결과와 같이, TTLL4-A24-9-579(서열번호 2)(m)로 자극된 CTL은 어떠한 특이적 IFN-감마 생산도 탐지되지 않았다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, “-”는 어떤 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다.
[도 2]
도 2는 결국 TTLL4-A24-9-750(서열번호 1)(a), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6)(b), TTLL4-A24-9-691(서열번호 12)(c), TTLL4-A24-9-103(서열번호 16)(d), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20)(e) 및 TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)(f)로 자극된 CTL 세포주를 나타내는 IFN-감마 ELISA 분석의 결과를 표사하는 일련의 선 그래프 (a) 내지 (f)로 구성된다. 상기 결과는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 세포주가 대조군에 비해 강한 IFN-감마 생산력을 나타냄을 보여준다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, “-”는 어떤 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다.
[도 3]
도 3은 TTLL4-A24-9-750(서열번호 1)(a), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6)(b), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20)(c) 및 TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)(d)로 자극된 CTL 세포주로부터 제한희석(limiting dilution)되어 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 묘사하는 일련의 선 그래프 (a) 내지 (d)로 구성되었다. 상기 결과는 각각의 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 클론이 대조군에 비해 강한 IFN-감마 생산력을 나타냄을 보여준다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, “-”는 어떤 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다.
[도 4]
도 4는 TTLL4 및 HLA-A*2402를 외생적으로(exogenously) 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성을 묘사하는 일련의 선 그래프 (a) 내지 (c)로 구성되었다. HLA-A*2402 또는 전장(full length)의 TTLL4 유전자로 형질감염된 COS7 세포주는 대조군으로 준비되었다. TTLL4-A24-9-103(서열번호 16)(a)과 함께 수립된 CTL 세포주 및 TTLL4-A24-10-103(서열번호 20)(b) 및 TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)(c)과 함께 수립된 CTL 클론은 TTLL4 및 HLA-A*2402(검은 마름모꼴)가 모두 형질감염된 COS7 세포주에 대하여 특이적 CTL 활성을 나타냈다. 반면에, HLA-A*2402(삼각형) 또는 TTLL4(원형) 둘 중 하나만 발현하는 표적 세포에 대해서는 유의적인 특이적 CTL 활성이 탐지되지 않았다.
[도 5]
도 5는 TTLL4 유래 펩티드로 유도된 CTL의 IFN-감마 ELISPOT 분석의 결과를 묘사하는 일련의 그림 (a) 내지 (d)로 구성되었다. TTLL4-A02-9-222(서열번호 38)과 함께인 #3번 웰(a), TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)와 함께인 #7번 웰(b), TTLL4-A02-9-66(서열번호 44)과 함께인 #8번 웰(c) 및 TTLL4-A02-10-574(서열번호 59)와 함께인 #7번 웰(d)의 CTL은 각각 대조군에 비해 강력한 IFN-감마 생산력을 나타냈다. 이러한 사진의 상기 웰의 사각형은 해당하는 웰 유래 세포를 CTL 세포주로 수립하기 위해 증식한 것을 나타낸다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, “-”는 어떤 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다.
[도 6]
도 6은 결국 IFN-감마 ELISA 분석으로 탐지된 TTLL4-A02-9-222(서열번호 38)(a), TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)(b), TTLL4-A02-9-66(서열번호 44)(c) 및 TTLL4-A02-10-574(서열번호 59)(d)로 자극된 CTL 세포주의 IFN-감마 생산력을 증명하는 IFN-감마 ELISA 분석 결과를 묘사하는 일련의 선 그래프 (a) 내지 (d)로 구성되었다. 상기 결과는 대조군에 비해, 각 펩티드 자극으로 수립된 CTL 세포주가 강력한 IFN-감마 생산을 보이는 것을 증명한다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, “-”는 어떤 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다.
[도 7]
도 7은 결국 TTLL4-A02-9-222(서열번호 38)(a), TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)(b) 및 TTLL4-A02-10-574(서열번호 59)(c)로 자극된 CTL 세포주로부터 제한희석되어 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산력을 증명하는 IFN-감마 ELISA 분석법의 결과를 묘사하는 일련의 선 그래프 (a) 내지 (c)로 구성되었다. 상기 결과는 대조군에 비해, 각 펩티드 자극으로 수립된 CTL 세포주가 강력한 IFN-감마 생산을 보이는 것을 증명한다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, “-”는 어떤 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다.
[도 8]
도 8은 TTLL4 및 HLA-A*0201을 외생적으로 발현하는 표적세포에 대한 특이적 CTL 활성을 묘사하는 일련의 선 그래프로 구성된다. HLA-A*0201 또는 전장의 TTLL4 유전자를 형질전환시킨 COS7세포를 대조군으로 제조하였다. TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)(a)로 수립된 CTL 클론 및 TTLL4-A02-9-66(서열번호 44)(b)로 수립된 CTL 세포주는 TTLL4 및 HLA-A*0201(검은 마름모꼴) 모두로 형질감염된 COS7 세포주에 대해 특이적 CTL 활성을 나타내었다. 반면에, HLA-A*0201(삼각형) 또는 TTLL4(원형)을 각각을 발현하는 표적세포에 대하여 유의적인 특이적 CTL 활성은 탐지되지 않았다.

상기 요약에 더하여, 본 발명의 목적은,

[1] 펩티드는 TTLL4의 아미노산 서열 또는 이의 면역학적 활성 단편을 포함하는 CTL 유도성을 갖는 분리된 펩티드.

[2] [1]에 있어서, 상기 분리된 펩티드는 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 분리된 펩티드.

[3] 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 있어서 1, 2 또는 여러개의 아미노산이 치환(substituted), 결실(deleted), 삽입(inserted), 및/또는 도입(added)된 아미노산 서열을 포함하고, 세포독성 T 세포(cytotoxic T lynphocyte; CTL) 유도성을 갖는 분리된 펩티드.

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드는 HLA 항원에 결합하는 분리된 펩티드.

[5] [4]에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A24 또는 HLA-A2인 분리된 펩티드.

[6] [5]에 있어서, 상기 펩티드는 하기 특성을 하나 또는 모두를 갖는 분리된 펩티드:

(a) 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32 및 37로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 N-말단(N-terminus)로부터 두 번째 아미노산은 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군으로부터 선택, 및

(b) 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32 및 37로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal) 아미노산이 페닐알라닌, 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판, 또는 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택.

[7] [5]에 있어서, 상기 펩티드는 하기의 특성을 하나 또는 모두 갖는 펩티드:

(a) 서열번호 38, 39, 44 및 59로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산은 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택; 및

(b) 서열번호 38, 39, 44 및 59로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산의 C-말단은 발린(valine) 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택.

[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인 분리된 펩티드.

[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 분리된 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.

[10] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드(들)의 하나 또는 그 이상, 또는 [9]의 폴리뉴클레오티드(들)의 하나 또는 그 이상을 포함하는 CTL 유도를 위한 조성물.

[11] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드(들)의 하나 또는 그 이상, 또는 [9]의 폴리뉴클레오티드(들) 중 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발(recurrence)을 막기 위한 약학적 조성물.

[12] [11]에 있어서, 상기 조성물은 HLA 항원이 HLA-A24 또는 A2인 개체에 투여하기 위해 제형화된 약학적 조성물.

[13] 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL 유도성을 갖는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell; APC)을 유도 방법:

(a) [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드와 APC를 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 접촉시키는 단계, 및

(b) [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 유도하는 단계.

[14] 하기의 단계로 구성된 군으로부터 선택된 단계로 구성되는 CTL 유도 방법:

(a) HLA 항원 및 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 APC와 CD8 양성 T 세포(CD8 positive T cell)을 공배양(co-culturing) 하는 단계,

(b) HLA 항원 및 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 엑소솜(exosome)과 CD8 양성 T 세포를 공배양 하는 단계, 및

(c) [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드에 결합하는 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR)의 아단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자를 T 세포 내로 도입하는 단계.

[15] HLA 항원 및 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 APC.

[16] [13]의 방법에 의해 유도되는 [15]의 APC.

[17] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL.

[18] [14]의 방법에 의해 유도되는 [17]의 CTL.

[19] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 상기 펩티드 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 방법을 이를 필요로 하는 개체에 있어서 암에 대하여 면역반응을 유도하기 위한 방법.

[20] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드에 대한 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편.

[21] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 벡터.

[22] [21]에 따른 발현벡터가 형질전환(transformed) 또는 형질주입(transfected)된 숙주세포.

[23] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 펩티드, [9]의 뉴클레오티드 또는 [20]의 항체로 구성된 진단 키트.

[24] 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59로 이루어진 군으로부터 선택된 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 분리된 펩티드.

반면에, 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 또한 하기의 펩티드 및 이의 용도를 제공한다:

[1] TTLL4의 아미노산 서열 또는 이의 면역학적 활성 단편으로 구성된 CTL 유도성을 갖는 분리된 펩티드, 또는 서열번호 80의 아미노산 서열로 구성된 펩티드의 면역학적 활성 단편의 아미노산 서열을 구성 또는 포함하는 CTL 유도성을 갖는 분리된 펩티드.

[2] [1]에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드.

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 원래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 변형된 펩티드를 수득하기 위하여, 1, 2, 또는 여러개의 아미노산이 치환, 삽입, 결실, 또는 도입된 분리된 펩티드.

[4] [1] 내지 [3]에 있어서, 상기 펩티드는 HLA 항원에 결합하는 분리된 펩티드.

[6] [3] 내지 [5]에 있어서, HLA-A24의 맥락에 있어서, 상기 펩티드를 하기의 특성을 하나 또는 모두 가진 분리된 펩티드:

(a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 이로 변형, 및

(b) C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소루신, 트립토판 또는 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 이로 변형.

[7] [3] 내지 [5]에 있어서, HLA-A2의 맥락에 있어서, 상기 펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 갖는 분리된 펩티드:

(a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택; 및

(b) C-말단 아미노산이 발린 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택.

[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드는 노나펩티드 또는 데카펩티드인 분리된 펩티드.

비록 여기서 기술한 것과 유사하거나 또는 동등한 어떤 방법 및 재료가 본 발명의 실시예의 검사 또는 실행에서 사용될 수 있지만, 선호되는 방법, 장치 및 재료는 여기서 기술된다. 하지만, 본 발명의 재료 및 방법을 기술하기 전에, 이러한 설명이 전적으로 설명하는 것일 뿐, 제한하려는 의도가 아닌 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명이 본 발명에 기재된 특정한 크기, 모양, 규모, 물질, 방법론, 프로토콜등이 일반적인 실험 및 최적화에 따라 다를 수 있는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 기술에서 사용되는 전문용어(terminology)는 오직 실시예 또는 특정 버젼(version)을 기술하려는 것이고, 이것은 오직 하기 청구항에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

각 발표(publication)의 공개, 특허 또는 특허 출원은 그 전문이 구체적으로 여기에서 참고문헌으로 통합된다. 하지만, 어느 것도 여기에서 이전 발명 또는 그러한 공개보다 선행한다는 자격으로 본 발명에서 인정되지 아니함을 이해해야 한다.

따로 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그러나, 대립이 있는 경우에는, 용어의 정의를 포함한 본 발명의 상세한 설명이 규제할 것이다. 또한, 상기 재료(materials), 방법 및 실시예는 오직 설명하는 것이며, 제한하려는 것이 아니다.

I. 정의

본 발명에서 물질(substance)(예를 들어, 펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드 등)과 관련되어 사용되는 용어 "분리된(isolated)" 및 "정제된(purified)"은 아마도 천연자원(natural source)을 포함하는 적어도 한 물질로부터 실질적 자유인(free) 물질을 나타낸다. 따라서, 분리된 또는 정제된 펩티드는 펩티드 유래된 세포 또는 조직 자원으로부터 탄수화물, 지질 또는 다른 다른 오염시키는 단백질(contaminating protein)과 같은 세포 물질(cellular material)로부터 실질적 자유인 물질, 또는 실질적 자유인 화학적 전구체(chemical precursor) 또는 화학적으로 합성된 다른 화학물질을 고려한다. 상기 용어 "실질적 자유인 세포 물질(substantially free of cellular material)"은 분리되거나 재조합적으로 생산된 세포의 세포 구성요소(cellular component)로부터 분리된 펩티드의 제조를 포함한다. 따라서, 실질적 자유인 세포 물질인 펩티드는 이종 단백질(heterologous protein)(또한, "오염시키는 단백질"이라고도 언급된)의 약 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만을 갖는 폴리펩티드의 제조를 포함한다. 펩티드가 재조합적으로 생산될 때, 이는 바람직하게 펩티드 제조의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만의 배양 배지와 함께 펩티드의 제조를 포함하는 실질적 자유인 세포 배지(culture medium)이다. 펩티드가 화학적 합성으로 생산될 때, 이는 바람직하게 펩티드 제조 부피의 약 30%, 20%, 10%, 5%(건조무게) 미만인 펩티드의 합성을 포함하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질과 함께 펩티드의 제조를 포함하는 실질적 자유인 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이다. 특정 펩티드의 제조는, 예를 들어 단백질 분리의 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis) 및 코마시 브릴란트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 또는 겔과 같은 것의 단일밴드(single band)의 존재에 의해 보여지는 분리된 또는 정제된 펩티드를 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분리 또는 정제되었다.

본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형된 잔기, 또는 자연적으로 발생한 아미노산 중합체(naturally occurring amino acid polymer)뿐만 아니라 자연적으로 발생한 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체(artificial chemical mimetic)와 같은 비자연적으로 발생한 잔기(non-naturally occurring residue)를 가질 수 있는 아미노산 중합체에 적용된다.

본 명세서에서 쓰인 상기 용어 “올리고펩티드(oligopeptide)”는 20 개 잔기 또는 보다 적은, 일반적으로 15개 잔기 또는 보다 적은 길이이고, 일반적으로 약 8 개 및 약 11 개 잔기, 종종 9 개 또는 10 개 잔기 사이로 구성되는 본 발명의 펩티드에 관련하여 사용된다. 마지막은 본 명세서의 "노나펩티드(nonapeptide)" 및 "데카펩티드(decapeptide)"로 각각 불린다.

본 발명에서 사용되는 "아미노산(amino acid)"라는 용어는 자연적으로 발생한 아미노산과 비슷하게 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체 뿐만 아니라 자연적으로 발생한 및 합성(synthetic) 아미노산을 의미한다. 자연적으로 발생한 아미노산은 세포 안에서 번역(tranlation) 후에 변형된 것뿐 아니라 유전자코드에 의해 암호화된 것이다[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(γ-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]. 상기 용어 "아미노산 유사체"는 자연적으로 발생한 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 α탄소)를 가지고 있지만, 변형된 R기 또는 변형된 골격(backbone)을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. 상기 용어 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조를 갖지만, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 약어(symbol) 또는 1문자 약어에 의해 불린다.

본 발명에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 불린다.

여기서 호환적으로 사용되는 "제제(agent)" 및 "조성물(composition)"이라는 용어는 구체적 양의 구체적 성분의 조합으로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 형성되는 어떠한 생산물뿐 아니라, 구체적 양의 구체적 성분을 포함하는 생산물에 관한 것이다. 상기 용어와 관련한 "약학적" 조성물은 유효 성분, 및 담체로 구성된 비유효 성분을 포함하는 생산물, 뿐만 아니라 둘 또는 그 이상의 성분의 조합, 복합(complexation) 또는 집적(aggregation)으로부터, 또는 성분의 하나 또는 그 이상의 분리로부터, 또는 성분의 하나 또는 그 이상의 상호결합 또는 반응의 다른 종류로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 형성되는 어떤 생산물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 조성물 및 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 혼합함으로써 제조된 어떤 조성물을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "유효성분(active ingredient)"은 생물학적 또는 생리학적으로 유효한 제제 또는 조성물의 물질을 나타낸다. 특히, 약학적 제제 또는 조성물의 맥락에서, 상기 용어 "유효성분"은 목표 약물학적 효과(objective pharmacological effect)를 나타내는 물질을 나타낸다. 예를 들어, 암의 치료 또는 예방에 있어서 용도를 위한 약학적 제제 또는 조성물의 경우, 제제 또는 조성물의 유효성분은 암세포 및/또는 조직에 직접적 또는 간접적으로 적어도 하나의 생물학적 또는 생리학적 활성(action)을 유도할 것이다. 바람직하게, 상기 활성은 암 세포의 성장을 감소 또는 억제, 암 세포 및/또는 조직에 손상을 주거나 또는 죽임, 및 이와 같은 것을 포함할 것이다. 일반적으로, 유효성분의 간접적 효과는 CTL 인식의 유도 또는 암 세포를 죽이는 것이다. 제형화되기 전에, "유효성분"은 "벌크(bulk)", "약 물질(drug substance)" 또는 "원제(technical product)"로 나타낸다.

여기서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "생리학적으로 허용가능한 담체"라는 표현은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 재료(material), 조성물, 물질 또는 수단(vehicle)을 의미하고, 액체 또는 고체 필러(filler), 희석제, 첨가제, 영제 또는 캡슐화 물질(encapsulating material)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 어떤 약학적 제제 또는 조성물은 백신(vaccine)으로 특히 사용된다. 본 발명의 맥락에서, 상기 구 “백신”(또한 “면역성 조성물(immunogenic composition)”로 나타낸)은 동물에 접종할 때 항-종양 면역력(immunity)을 개선, 증가 및/또는 유도하는 기능을 가지는 제제 또는 조성물에 관한 것이다.

별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 “암(cancer)”은 TTLL4 유전자를 과발현하는 암 또는 종양, 암의 예는 방광암(bladder cancer), 담관세포암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia; CML), 결장(colon) 및 직장(rectum) 암, 식도암(esophageal cancer), 간암(liver cancer), 림프종(lymphoma), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신세포암(renal carcinoma), 소세포폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비-소세포폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor) 및 골육종(osteosarcoma)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

별도로 명시되지 않는 한, "세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)", "세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)" 및 "CTL"이라는 용어는 호환되어 쓰이며 따로 명시되지 않는 한, 비자기 세포(non-self cell, 예를 들면 종양/암 세포, 바이러스에 감염된 세포)를 인식할 수 있고 이러한 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 림프구의 하위집단(sub-group)을 나타낸다.

별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 “HLA-A24”는 상기 아형을 포함하는 HLA-A24 유형에 관한 것이고, 아형의 예는 HLA-A*2401, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2404, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2420, HLA-A*2425 및 HLA-A*2488 를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

별도로 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 것으로서, 상기 용어 “HLA-A2”는 상기 아형에 관한 것으로, 아형의 예는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 및 HLA-A*0250를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 "키트(kit)"라는 용어는 시약(reagent) 및 다른 물질의 혼합을 의미한다. 키트는 마이크로어레이(microarray), 칩(chip), 마커(marker)등을 포함할 수 있다. "키트" 용어는 시약 및/또는 다른 물질의 특정 혼합으로 한정하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 개체 또는 환자의 맥락에서, 상기 구 "개체의(또는 환자의) HLA 항원은 HLA-A24 또는 HLA-A2이다"는 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 1형 분자로서 HLA-A24 또는 HLA-A2 항원 유전자를 동형(homozygously) 또는 이형(heterozygously)으로 갖는 개체 또는 환자를 나타내고, HLA-A24 또는 HLA-A2 항원이 HLA 항원으로 개체 또는 환자의 세포에서 발현된다.

본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "치료(treatment)"라는 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, TTLL4 유전자의 발현 감소, 또는 개체 내에서 암의 크기, 유병(prevalence), 또는 전이력(metastatic potential)이 감소하는 것과 같은 임상적 이득을 초래한다면 치료는 "효과적인(efficacious)"것으로 여겨진다. 상기 치료가 예방적으로 이용될 때에는, "효과적(efficacious)"이라는 의미는 그것이 암의 형성을 지연시키거나 방지하거나 또는 암의 임상적 증상을 방지하거나 경감시키는 것을 의미한다. 효과는 특정 종양 타입을 진단하거나 또는 치료하기 위해 알려진 방법과 관련하여 결정된다.

본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "예방(prevention)" 및 "예방(prophylaxis)"의 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, 질병으로부터 치사율(mortality) 또는 사망률(morbidity)의 부담(burden)을 감소시키는 어떤 활성을 지칭하기 위하여 상기의 용어들은 여기서 상호교환된다. 방지 및 예방은 "1차, 2차 및 3차 예방 수준"에서 일어날 수 있가. 1차 예방 및 방지가 질병의 발달을 피하는 것인 반면, 2차 및 3차 예방 및 방지는 질병 진행의 방지 및 예방 및 증상의 나타남 뿐만 아니라 기능을 개선시킴으로써 또는 질병 관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 수립된 질병의 부정적 영향 감소시키는 활성을 포함한다. 또는, 방지 및 예방은 특정 장애(disorder)의 심각도를 완화시키는, 예를 들면 종양의 증식 및 전이를 감소시키는 예방적 치료법의 넓은 범위를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 암의 치료 및/또는 예방 및/또는 암 수술 후 재발의 방지는 암세포의 수술적 제거, 암세포의 성장 억제, 종양의 퇴화(involution) 또는 퇴행(regression), 암 발생의 완화(remission) 및 억제(suppression), 종양의 퇴행, 및 전이의 감소 또는 억제와 같은 상기 단계의 하나를 포함한다. 효과적인 암의 치료 및/또는 예방은 치사율을 감소시키고 암을 가지는 개개인의 진단을 개선시키며, 혈액에 있는 종양 마커의 수준을 감소시킨다. 예를 들면, 증상의 감소 또는 개선은 효과적으로 치료하는 것을 의미하고 및/또는 예방은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정 병변(stable disease)을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, "항체(antibody)"라는 용어는 지정된 단백질 또는 그것의 펩티드에 대해 특이적으로 반응하는 면역글로불린(immunoglobulin) 및 그것의 단편을 의미한다. 항체는 인간 항체(human antibodies), 영장류 항체(primatized antibodies), 키메라 항체(chimeric antibodies), 이중특이적 항체(bispecific antibodies), 인간화된 항체(humanized antibodies), 다른 단백질 또는 방사선 표지와 결합된 항체, 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 또한, 여기서 항체는 넓은 의미에서 사용되고 특히 완전한 단일클론 항체(intact monoclonal antibodies), 다클론 항체(polyclonal abtibodies), 최소한 2개의 완전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체[multispecific antibodies, 예를 들면 이중특이적 항체(bispecific antibodies)], 및 항체 단편을 그들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 포함한다. "항체"는 모든 종류(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)를 가르킨다.

별도로 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다.

II. 펩티드

본 발명의 펩티드는 하기에 상세하게 "TTLL4 펩티드(들)" 또는 "TTLL4 폴리펩티드(들)"로 언급되어 설명되었다.

TTLL4로부터 유래된 펩티드가 CTL에 의해 인식되는 항원으로서 기능 한다는 것을 보이기 위하여, TTLL4(서열 번호: 80)에서 유래된 펩티드가 흔히 HLA 대립 유전자와 만나는 HLA-A24 또는 A2에 의해 제한되는 항원 에피토프인지 결정하기 위하여 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155:4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994).

HLA-A24와 결합 친화력(binding affinity)에 기초하여 TTLL4로부터 유래된 HLA-A24 결합 펩티드 후보가 동정되었다. 하기 후보 펩티드가 확인되었다:

TTLL4-A24-9-750(서열번호 1),

TTLL4-A24-9-994(서열번호 3),

TTLL4-A24-9-769(서열번호 4),

TTLL4-A24-9-755(서열번호 5),

TTLL4-A24-9-79(서열번호 6),

TTLL4-A24-9-684(서열번호 7),

TTLL4-A24-9-689(서열번호 8),

TTLL4-A24-9-779(서열번호 9),

TTLL4-A24-9-304(서열번호 10),

TTLL4-A24-9-793(서열번호 11),

TTLL4-A24-9-691(서열번호 12),

TTLL4-A24-9-41(서열번호 13),

TTLL4-A24-9-1086(서열번호 14),

TTLL4-A24-9-1186(서열번호 15),

TTLL4-A24-9-103(서열번호 16),

TTLL4-A24-9-62(서열번호 17),

TTLL4-A24-9-1037(서열번호 18),

TTLL4-A24-9-773(서열번호 19),

TTLL4-A24-10-103(서열번호 20),

TTLL4-A24-10-773(서열번호 21),

TTLL4-A24-10-883(서열번호 22),

TTLL4-A24-10-127(서열번호 23),

TTLL4-A24-10-684(서열번호 24),

TTLL4-A24-10-1043(서열번호 25),

TTLL4-A24-10-223(서열번호 26),

TTLL4-A24-10-122(서열번호 27),

TTLL4-A24-10-1186(서열번호 28),

TTLL4-A24-10-1022(서열번호 29),

TTLL4-A24-10-689(서열번호 30),

TTLL4-A24-10-804(서열번호 31),

TTLL4-A24-10-994(서열번호 32),

TTLL4-A24-10-993(서열번호 33),

TTLL4-A24-10-1105(서열번호 34),

TTLL4-A24-10-696(서열번호 35),

TTLL4-A24-10-665(서열번호 36),

TTLL4-A24-10-891(서열번호 37),

TTLL4-A24-10-254(서열번호 38), 및

TTLL4-A24-10-194(서열번호 39).

또한, 시험관 내(in vitro)에서 상기 펩티드를 적재한(loaded) 수지상 세포(dendritic cells; DC)에 의해 T 세포를 자극시킨 후, CTL은 하기 펩티드의 각각을 사용하여 성공적으로 수립되었다:

TTLL4-A24-9-750(서열번호 1),

TTLL4-A24-9-79(서열번호 6),

TTLL4-A24-9-793(서열번호 11),

TTLL4-A24-9-691(서열번호 12),

TTLL4-A24-9-103(서열번호 16),

TTLL4-A24-10-103(서열번호 20),

TTLL4-A24-10-773(서열번호 21),

TTLL4-A24-10-883(서열번호 22),

TTLL4-A24-10-1186(서열번호 28),

TTLL4-A24-10-1022(서열번호 29),

TTLL4-A24-10-994(서열번호 32), 및

TTLL4-A24-10-891(서열번호 37).

TTLL4 유래 펩티드에 결합하는 HLA-A2 후보는 HLA-A2에 대한 그들의 결합 친화성에 기초하여 확인되었다. 하기 펩티드가 면역요법을 위한 후보 펩티드로 고려되었다:

TTLL4-A2-9-222(서열번호 38),

TTLL4-A2-9-805(서열번호 39),

TTLL4-A2-9-610(서열번호 40),

TTLL4-A2-9-1163(서열번호 41),

TTLL4-A2-9-575(서열번호 42),

TTLL4-A2-9-1189(서열번호 43),

TTLL4-A2-9-66(서열번호 44),

TTLL4-A2-9-864(서열번호 45),

TTLL4-A2-9-899(서열번호 46),

TTLL4-A2-9-147(서열번호 47),

TTLL4-A2-9-578(서열번호 48),

TTLL4-A2-9-697(서열번호 49),

TTLL4-A2-9-1088(서열번호 50),

TTLL4-A2-9-988(서열번호 51),

TTLL4-A2-9-423(서열번호 52),

TTLL4-A2-9-852(서열번호 53),

TTLL4-A2-9-128(서열번호 54),

TTLL4-A2-9-107(서열번호 55),

TTLL4-A2-9-605(서열번호 56),

TTLL4-A2-9-356(서열번호 57),

TTLL4-A2-10-363(서열번호 58),

TTLL4-A2-10-574(서열번호 59),

TTLL4-A2-10-895(서열번호 60),

TTLL4-A2-10-605(서열번호 61),

TTLL4-A2-10-578(서열번호 62),

TTLL4-A2-10-756(서열번호 63),

TTLL4-A2-10-550(서열번호 64),

TTLL4-A2-10-610(서열번호 65),

TTLL4-A2-10-107(서열번호 66),

TTLL4-A2-10-933(서열번호 67),

TTLL4-A2-10-1163(서열번호 68),

TTLL4-A2-10-871(서열번호 69),

TTLL4-A2-10-863(서열번호 70),

TTLL4-A2-10-852(서열번호 71),

TTLL4-A2-10-62(서열번호 72),

TTLL4-A2-10-804(서열번호 73),

TTLL4-A2-10-70(서열번호 74),

TTLL4-A2-10-1092(서열번호 75),

TTLL4-A2-10-1113(서열번호 76),

TTLL4-A2-10-778(서열번호 77), 및

TTLL4-A2-10-86(서열번호 78).

또한, 이러한 펩티드로 부가한(pulsed)[적재한] DC에 의한 T 세포의 시험관내 자극 후에, CLT은 하기 각 펩티드를 이용하여 성공적으로 수립되었다:

TTLL4-A02-9-222(서열번호 38),

TTLL4-A02-9-805(서열번호 39),

TTLL4-A02-9-66(서열번호 44), 및

TTLL4-A02-10-574(서열번호 59).

상기 수립된 CTL은 각각의 펩티드에 의해 자극받은 표적 세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 보인다. 본 발명의 이러한 결과는 TTLL4가 CTL에 의해 인식되는 항원이며, 상기 펩티드들은 HLA-A24 또는 HLA-A2에 의해 제한되는 TTLL4의 에피토프 펩티드임을 나타낸다.

예를 들어, 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하는 암 세포 및 조직에서 TTLL4 유전자가 과발현되고, 대부분의 일반 조직에서는 발현되지 않는 이후, 이는 면역치료를 위한 좋은 표적으로 제시된다. 따라서, 본 발명은 TTLL4 유래 CTL로 인지되는 상응하는 에피토프의 노나펩티드(nonapeptides)(아홉 개 아미노산 잔기로 구성된 펩티드) 및 데카펩티드(decapeptides)(열개의 아미노산으로 구성된 펩티드)를 제공한다. 특히, 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드의 바람직한 실시예는 서열번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 상기 펩티드를 포함한다.

일반적으로, 인터넷 상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램은, 예를 들면, Parker KC et al., J Immunol 1994, 152(1): 163-75 and Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17에 기재된 것으로서, 다양한 펩티드 및 HLA 항원 사이의 결합 친화성(binding affinities)을 컴퓨터 상에서 계산하는 것에 사용될 수 있다. HLA 항원과의 결합 친화도는 예를 들면, Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220에 요약된, Parker KC et al., J Immunol 1994, 152(1): 163-75, Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17, 및 Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796에 기재된 것과 같이 계산될 수 있다. 결합 친화성을 결정하는 방법은, 예를 들면: the Journal of Immunological Methods,(1995, 185:181-190); 및 Protein Science,(2000, 9:1838-1846)에 기재되어 있다. 그러므로, 상기 소프트웨어 프로그램을 사용하여 HLA 항원과 높은 결합력을 갖는 TTLL4 유래된 상기 단편을 선택하기 위해 상기 소프트웨어 프로그램을 손쉽게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 알려진 프로그램으로 HLA 항원과 결합을 결정될 수 있는 TTLL4 유래 임의의 단편으로 구성된 펩티드를 고려한다. 또한, 이러한 펩티드는 TTLL4의 전장을 구성하는 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드들, 특히, 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드는, 상기 펩티드들이 그들의 CTL 유도성을 유지하는 펩티드인 한, 부가적인 아미노산 잔기가 측면에 배치될 수 있다. 상기 특정한 부가적인 아미노산 잔기는, 그들이 원래의 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한, 어떤 종류의 아미노산으로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히 TTLL4로부터 유래된 펩티드를 포함하고, HLA 항원에 결합 친화도를 가지는 펩티드를 고려한다. 상기 펩티드는 예를 들어, 약 40 아미노산 미만, 종종 약 20 아미노산 미나, 및 일반적으로 약 15 아미노산 미만이다.

일반적으로, 펩티드에 있어서 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 상기 펩티드의 기능에 영향을 미치지 않거고, 어떠한 경우에는 원래 단백질의 원하는 기능을 심지어 증진시킬 것이다. 실제로, 변형된 펩티드[즉, 원래의 참조 서열과 비교하여 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기가 변형된 아미노산(즉, 치환, 도입, 결실 또는 삽입) 서열로 구성되는 펩티드]가 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 보유하고 있다는 것이 알려져 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13). 따라서, 본 발명의 한 실시예에 있어서, 본 발명의 펩티드는 CTL 유도성 및 하나, 둘 또는 심지어 그 이상의 아미노산이 도입 및/또는 치환된 서열번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73 중에서 선택된 아미노산 서열을 모두 갖는다.

당업계의 당업자는 아미노산 서열의 각각의 변형(즉, 결실, 도입, 첨가 및/또는 치환)이 단일 아미노산 또는 원래 아미노산의 측쇄(side-chain)의 특성을 보존하는 결과를 야기하는 전체적인 아미노산의 적은 비율로 인식할 것이다. 이와 같이, 이들은 종종 “보존적 치환(conservative substitution)” 또는 “보존적 변형(conservative modification)”으로 불리고, 상기 단백질의 변형은 원래 단백질과 기능적으로 유사함을 갖는 변형된 단백질의 결과이다. 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에서 잘 알려져 있다. 아미노산 측쇄 특징의 예는 소수성 아미노산(hydrophobic amino acids: A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(hydrophillic amino acids: R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공통적 특징을 가지는 측쇄를 포함하는 것이 바람직하다; 지방족 측쇄(aliphatic side-chain: G, A, V, L, I, P); 수산기(hydroxy group)를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자(sulfur atom)를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드(carboxylic acid and amide)를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기(base)를 포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족(aromatic)을 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 또한, 하기 8개 군 각각은 서로에게 보존적 치환으로 당업계에 받아들여진다:

1) 알라닌(alanine; A), 글리신(glycine; G);

2) 아스파라긴산(aspartic acid; D), 글루탐산(glutamic acid; E);

3) 아스파라긴(aspargine; N), 글루타민(glutamine; Q);

4) 아르기닌(arginine; R), 리신(lysine; K);

5) 이소루신(isoleucine; I), 루신(leucine; L), 메티오닌(methionine; M), 발린(valine; V);

6) 페닐알라닌(phenylalanine; F), 티로신(tyrosine; Y), 트립토판(tryptophan; W);

7) 세린(serine; S), 트레오닌(threonine; T); 및

8) 시스테인(cysteine; C), 메티오닌(methionine; M)(예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조).

이러한 보존적으로 변형된 펩티드 또한 본 발명의 펩티드로 간주한다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들에 한정되지 않고, 그 결과적인 변형된 펩티드가 원래 펩티드의 CTL 유도성을 가지는 한, 비보존적인 변형도 포함할 수 있다. 또한, 변형된 펩티드는 CTL 유도 가능한, 다형성 변종(polymorphic variants), 종간 상동체(interspecies homologues), 및 TTLL4 대립 유전자로부터 유래된 펩티드를 제외하지 않는다.

아미노산 잔기는 본 발명의 펩티드에 도입, 치환 또는 첨가될 수 있거나, 또는, 아미노산 잔기는 더 높은 결합 친화도를 달성하기 위해 그것으로부터 결실될 수 있다. 필수적인 CTL 유도성을 계속 유지하기 위하여, 소수만이(예를 들어, 1, 2 또는 여러 개) 또는 아미노산의 적은 비율이 바람직하게 변형된다(즉, 결실, 도입, 첨가 및/또는 치환). 본 발명에서, 상기 용어 "여러 개"는 5 개 또는 그 이하의 아미노산, 예를 들면 4 개, 3 개 또는 그 이하의 아미노산을 의미한다. 변형되는 아미노산의 비율은 바람직하게는 20% 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 15% 또는 그 이하, 및 그보다 더 바람직하게는 10% 또는 그 이하, 예를 들면 1 내지 5%일 수 있다.

면역치료의 맥락에서 사용되었을 경우, 본 발명의 펩티드는 세포의 표면 또는 엑소솜에 바람직하게 HLA 항원과 복합체로서 제시되어야 한다. 따라서, CTL을 유도하고, 바람직하게 HLA 항원에 높은 결합 친화도를 가지는 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 그 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩티드는 향상된 결합 친화도를 가지는 변형된 펩티드를 생산하기 위하여 아미노산 잔기의 치환, 도입, 결실 및/또는 첨가로 변형될 수 있다. 자연적으로 나타나는 펩티드뿐만 아니라, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있기 때문에(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; J Immunol 1994, 155:4307), 상기 규칙성에 근거한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드(immunogenic peptides)에 도입될 수 있다.

예를 들면, 높은 HLA-A24 결합 친화도를 가지는 펩티드는 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan)으로 치환된, N-말단으로부터 두 번째 아미노산을 가지는 경향이 있다. 비슷하게, C-말단 아미노산인 펩티드도 페닐알리닌, 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환될 수 있다. 따라서, 이는 HLA-A24 결합력을 증가시키기 위해 N-말단의 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환, 및/또는 C-말단의 아미노산이 루신, 이소루신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환되는 것이 바람직하다. 따라서, 서열번호 1 및 3 내지 37 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 상기 서열번호의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환 및/또는 상기 서열번호의 C-말단의 아미노산 서열이 발린 또는 루신으로 치환된 것이 본 발명에 의해 포함된다.

비슷하게, 높은 HLA-A2 결합력을 나타내는 펩티드는 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환 및/또는 C-말단의 아미노산이 발린 또는 루신으로 치환된 것을 갖는 경향이 있다. 따라서, 이는 N-말단으로부터 두 번째 아미노산을 루신 또는 메티오닌으로 치환 및/또는 C-말단의 아미노산을 발린 또는 류신으로 치환하는 것이 HLA-A2 결합력을 증가시키기 위해 바람직하다. 따라서, 서열번호 38 내지 73 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드는, 서열번호의 아미노산 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환 및/또는 서열번호의 아미노산 C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소루신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 것이 본 발명에 의해서 고려된다.

치환은 말단 아미노산 뿐만 아니라 가능성 있는 펩티드의 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR)인지 부위에 도입될 수 있다. 여러 연구, 예를 들면 CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu_(369-377) 또는 gp100_(209-217)(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol.(2002);168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother.(2003) 52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004) 53, 307-314)는 아미노산 치환을 가지는 펩티드는 원래의 펩티드와 동일하거나 또는 보다 나을 수 있다는 것을 나타내었다.

또한, 본 발명은 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산이 상기 기재된 펩티드의 N 및/또는 C-말단으로 또한 첨가될 수 있다. 높은 HLA 항원 결합 친화력을 갖고 CTL 유도성을 보유하는 상기 변형 펩티드는 본 발명에 의해 포함될 수 있다.

예를 들면, 본 발명은 CTL 유도성을 갖고 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 14, 13, 12, 11, 또는 10개의 아미노산 길이 이하의 분리된 펩티드를 제공한다:

(i) 서열번호 1 내지 19 및 38 내지 57로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 있어서, 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 서열은 HLA 항원에 결합하고, 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes)를 유도한다.

(ii) (i)에 있어서, 상기 아미노산 서열은, HLA-A24의 맥락에서 하기의 특성을 하나 또는 모두 갖는다:

(a) 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 이거나, 이로 변형된 것, 및

(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소루신, 트립토판, 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 이거나, 이로 변형된 것, 및

(iii) (i)에 있어서, 상기 아미노산 서열은, HLA-A2의 맥락에서 하기의 특성을 하나 또는 모두 갖는다:

(a) 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 이거나, 이로 변형된 것, 및

(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산이 발린 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 이거나, 이로 변형된 것.

게다가, 본 발명은 또한 CTL 유도성을 갖고, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 15, 14, 13, 12 또는 11 이하의 아미노산 길이의 분리된 펩티드를 제공한다.

(i') 서열번호 20 내지 37 및 58 내지 78로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 변형되고, 상기 펩티드는 HLA 항원에 결합하고, 세포독성 T 세포를 유도한다,

(ii') (i')에 있어서 HLA-A24의 맥락에서 상기 아미노산 서열은 하기의 하나 또는 모든 특성을 갖는다:

(a) 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 이로 변형, 및

(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소루신, 트립토판, 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 이로 변형.

(iii') (i')에 있어서, HLA-A2의 맥락에서, 상기 아미노산 서열은 하기의 하나 또는 모든 특성을 갖는다:

(a) 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 이로 변형, 및

(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산이 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 이로 변형.

APC와 접촉되거나, 도입되는 이러한 펩티드들은 그것에 대해 (i), (ii), (iii), (i'), (ii') 및 (iii')의 펩티드를 제시하기 위하여 APC에서 가공된다.

그러나, 상기 펩티드 서열이 서로 다른 기능을 가지는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 한 부분과 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역질환 및/또는 특정 물질에 대한 알레르기 증상 등의 부작용이 유발될 가능성이 있다. 따라서, 바람직하게 처음으로 상기 펩티드 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 상황을 피하기 위해서, 사용가능한 데이터베이스를 이용하여 상동성 검색을 먼저 수행한다. 목표 펩티드(objective peptide)와 비교하여 하나 또는 두 개의 아미노산에 차이가 있는 펩티드마저도 존재하지 않는다는 것이 상동성 검색에서 드러날 경우, 어떠한 부작용의 위험 없이 HLA 항원과 결합 친화성, 및/또는 CTL 유도성을 증강시키기 위해, 상기 목표 펩티드를 변형시킬 수 있다.

상기와 같이, HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드는 매우 효과적일 것이라고 기대되지만, 높은 결합 친화성의 존재에 따라 지표로서 선택된 후보 펩티드는 CTL 유도성의 존재에 대해 한층 더 검토된다. 본 발명에서, 상기 용어 "CTL 유도성"은 항원-제시 세포(antigen-presenting cells; APCs) 상에 제시될 경우에 세포독성 T 세포(CTL)fmf 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 또한, "CTL 유도성"은 펩티드의 CTL 활성화, CTL 증식을 유도하고, CTL에 의한 표적세포의 용해 촉진시키며, 및 CTL에 의한 IFN-감마(gamma) 생산을 증가시키는 능력을 포함한다.

CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원을 보유하는 APCs[예를 들면, B-림프구, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell; DC)], 또는 보다 구체적으로는 인간 말초 혈액 단핵 백혈구(human peripheral blood mononuclear leukocytes)에서 유래된 수지상세포를 유도하고, 및 시험 펩티드를 사용하여 APC를 자극시킨 후, CTL을 유도하기 위하여 상기 APC를 CD8 양성 세포와 혼합하고, 그 후에 표적세포에 대한 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-감마를 측정하여 수행할 수 있다. 반응계로서, 인간 MHC(HLA) 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(예를 들면, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000, 61(8):764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*2402/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response에 기재된 것)을 사용할 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 표적세포를 ⁵¹Cr 등으로 방사 표지할 수 있고, 상기 표적세포로부터 방출된 방사능으로부터 CTL의 세포독성 활성을 산출할 수 있다. 또는, CTL 유도성은 고정화된 펩티드를 가진 항원-제시 세포(APCs)의 존재하에 CTL에 의해 IFN-감마(gamma)를 측정함으로써 그리고 항-IFN-감마 단일클론 항체를 이용한 배지에서 억제 영역을 가시화함으로써 평가될 수 있다.

상기 기술된 펩티드의 CTL 유도성을 시험한 결과, 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59에 의해 표시된 아미노산들 중에서 선택된 노나펩티드(nonapeptides) 또는 데카펩티드(decapeptides)가 특히 높은 CTL 유도성 및 HLA-A 항원에 높은 결합 친화도를 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 펩티드들은 본 발명의 바람직한 실시예로서 예시된다.

또한, 상동성 분석(homology analysis)의 결과는 이러한 펩티드들이 어떠한 다른 알려진 인간 유전자 산물 유래 펩티드와 현저한 상동성을 갖지 않음을 증명하였다. 또는, 상기 펩티드를 면역치료법에서 사용하였을 때, 알려지지 않거나 또는 원하지 않은 면역 반응에 대한 가능성을 낮춘다. 그러므로, 또한 이러한 측면으로부터, 이러한 펩티드들은 암 환자의 TTLL4에 대한 면역력을 유도하는 것에 유용하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 펩티드는, 바람직하게, 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 본 발명에의해서 고려된다.

상기에 기재된 변형뿐 아니라, 상기 결과로 야기된 연결된 펩티드가 원래의 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 유지하고, 보다 바람직하게, 또한, 필요한 HLA 결합을 유지하는 한, 본 발명의 펩티드는 다른 펩티드에 연결될 수 있다. 적절한 "다른" 펩티드의 예는 하기를 포함한다: 본 발명의 펩티드 또는 다른 TAA로부터 유래된, CTL-유도성 펩티드. 본 발명의 펩티드는 직접적으로 또는 간적접으로 링커(linker)를 통하여 "다른" 펩티드와 연결될 수 있다. 적합한 사이-펩티드(inter-peptide) 링커는 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들면, AAY(P.M. Daftarian et al., J Trans Med 2007. 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000. 165: 7308-7315) 또는 K(S. Ota et al., Can Res. 62. 1471-1476. K.S. Kawamura et al., J Immunol. 2002. 168: 5709-5715)를 포함한다.

예를 들면, 비-TTLL4(non-TTLL4) 종양관련 항원 펩티드는 HLA 종류 I 및/또는 종류 II를 통해서 면역반응을 증강시키기 위하여 거의 동시에 사용될 수 있다. 암 세포는 하나 이상의 종양관련 유전자를 발현할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 특정 개체가 추가적 종양관련 유전자를 발현하는지 결정하는 것 및 그 후 본 발명에 따른 TTLL4 조성물 또는 백신에서 상기 유전자의 발현 생산물로부터 유래된 HLA 종류 I 및/또는 HLA 종류 II 결합 펩티드를 포함하는 것은 당업계에서 평범한 기술 중 하나를 위한 일반적인 실험방법의 영역 내에 있다.

HLA 종류 I 및 HLA 종류 II 결합 펩티드의 예는 당업자에게 알려져 있고(예를 들면, Coulie. Stem Cells 13:393-403. 1995를 참조), 여기서 공개하는 것과 같은 방법으로 본 발명에서 사용될 수 있다. 당업자는 하나 또는 그 이상의 TTLL4 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 비-TTLL4 펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 또는 분자 생물학의 표준 절차를 사용하여 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 용이하게 제조할 수 있다.

상기 언급된 연결된 펩티드는 여기에서 "폴리톱(polytopes)"이라고 하며, 즉, 다양한 조절[예를 들면, 연결(concatenated), 겹칩(overlapping)]에서 함께 연결될 수 있는 펩티드를 자극시키는 둘 또는 그 이상의 잠재적인 면역형성적 또는 면역 반응의 군이다. 면역 반응을 자극, 증진 및/또는 유발시키는 폴리톱의 효과를 검사하기 위하여 상기 폴리토프(polytope)(또는 폴리톱을 암호화하는 핵산)은 표준 면역화 프로토콜에 따라, 예를 들면 동물에 투여될 수 있다.

펩티드는 폴리톱을 형성하기 위해 직접적으로 또는 인근 서열의 사용을 통해 함께 연결될 수 있고, 백신으로서 폴리톱의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다[예를 들면 Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849. 1995; Gilbert et al., Nature Biothechnol. 15(12):1280-1284. 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):882-826. 1996; Tarn et al., J Exp Med. 171(1):299-306. 1990을 참조]. 에피토프의 다양한 수 및 조합을 포함하는 폴리톱은 제조될 수 있고 CTL에 의한 인지 및 면역 반응을 증강시키는 효과(efficacy)를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 결합된 펩티드의 결과 원래의 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 보유하고 있는 한, 다른 물질에 더 결합될 수 있다. 적합한 물질의 예는 예를 들어, 하기를 포함한다: 펩티드, 지질, 당 및 당 측쇄, 아세틸기, 천연 및 합성 폴리머 등. 상기 변형이 원래 펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않게 제공된 변형에서 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 및/또는 인산화 등의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능(예를 들어, 표적 기능 및 전달 기능)을 제공하거나 또는 상기 펩티드를 안정시키기 위해 수행될 수 있다.

예를 들면, 펩티드의 생체 내 안정성을 증대시키기 위해, D-아미노산, 아미노산 모방체, 또는 비천연 아미노산을 도입하는 것은 당업계에서 잘 알려져 있으며; 이 개념은 또한 본 발명의 펩티드에 쓰일 수 있다. 펩티드의 안정성은 여러 가지 방법으로 검사될 수 있다. 예를 들면, 펩티다제(peptidases) 및 인간 혈장 및 혈청과 같은 다양한 생물학적 배지는 안정성 시험에 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302 참조).

또한, 상기에 기술된 것과 같이, 1, 2 또는 여러 개의 아미노산 잔기에 의해 치환되거나, 결실되거나, 삽입되거나 또는 첨가되어 변형된 펩티드 중에서, 원래의 펩티드와 비교하여 동일하거나 또는 더 높은 활성을 갖는 것은 스크리닝 되거나 또는 선택될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 원래의 것에 비교하여 동일하거나 더 높은 활성을 갖는 변형된 펩티드를 스크리닝하거나 또는 선택하는 방법을 제공한다. 실례가 되는 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a: 본 발명 펩티드의 최소한 하나의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 또는 첨가하는 단계:

b: 펩티드의 활성을 결정하는 단계: 및

c: 원래의 것에 비교하여 동일하거나 더 높은 활성을 갖는 펩티드를 선택하는 단계.

여기서, 검사되기 위한 상기 활성은 MHC 결합 활성, APC, 또는 CTL 유도성및 세포독성 활성을 포함할 수 있다.

III. TTLL4 펩티드의 제조

본 발명의 펩티드는 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성을 사용하여 합성적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로, 또는 두 개 또는 이상의 펩티드를 포함하는 더 긴 폴리펩티드로 합성할 수 있다. 상기 펩티드는 그리고나서, 다른 자연적으로 발생한 숙주 세포 단백질 및 이의 단편, 또는 다른 화학 물질이 거의 없도록 분리, 즉 정제 되거나 분리될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 여기서 기술하는 원래 펩티드(original peptide)의 생물학적 활성을 저해하지 않는다면, 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화, 변형을 포함할 수 있다. 다른 예시적 변형은 펩티드의 혈청 반감기(serum half life)를 증가시키기 위해 D-아미노산 또는 사용될 수 있는 다른 아미노산 모방체의 통합을 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열을 기반으로 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 합성에 적용될 수 있는 보편적인 펩티드 합성 방법의 예는 하기를 포함할 수 있다:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Preteins, Vol 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis(일본어),Maruzen Co, 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals(제 2판)(일본어), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；

(vi) WO99/67288; 및

(vii) Barany G. & Merrifield RB, Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis,"Academic Press, New York, 1980, 100-118.

또는, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 잘 알려진 유전자 조작 방법을 사용해서 얻을 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.) 1983, 101:347-62). 예를 들면, 우선, 목표 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 종류(예를 들면, 프로모터 서열에 해당하는 조절 서열의 아래부분(downstream))로 포함하여 적절한 벡터를 제조하고 적절한 숙주 세포에 형질전환한다. 그 다음에, 상기 숙주 세포를 원하는 펩티드를 제작하기 위해 배양한다. 또한 상기 펩티드는 시험관 내(in vitro) 번역 시스템을 조정하여(adapting) 시험관 내에서 제조될 수도 있다.

IV. 폴리뉴클레오티드

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 언급한 펩티드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들은 자연적으로 존재하는 TTLL4 유전자[GenBank Accession No. NM_014640(예를 들면, 서열 번호 79)]에서 유래한 폴리뉴클레오티드 및 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서, 상기 용어 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy) 때문에, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 모든 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCU및 GCG은 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌의 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩티드의 변경없이, 상기 코돈은 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이(silent variations)"라 하고, 보존적으로 변형된 변종의 한 종류이다. 펩티드를 암호화하는 본 발명의 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종도 나타낸다. 당업계에서 보편적인 것 중 하나는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 공개된 각 서열에서 암시적으로 기재되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로 구성될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있듯이, DNA는 A, T, C 및 G와 같은 염기로 적절하게 구성되고, T는 RNA에서 U로 대체된다. 당업자는 비-자연적으로 존재하는 염기 또한 폴리뉴클레오티드에 포함된다는 것을 인지할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 중간에 아미노산 서열 개입(intervening) 유무를 불문하고 본 발명의 펩티드를 포함하는 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 상기 개재 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들면, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대한 어떠한 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합형 폴리뉴클레오티드일 수 있고 또는 마커 유전자등을 가지는 발현 벡터(플라스미드)일 수도 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 중합효소(polymerase)및 엔드뉴클레아제(end nuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조할 수 있다.

재조합 기술 및 화학 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 반응능(competent) 세포에 형질전환되어 발현하는 적절한 벡터 내에 삽입하여 제작할 수 있다. 또는, PCR 기술 또는 적절한 숙주에서의 발현을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). 또는, Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재되어 있는 것과 같이, 고체상 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

V. 엑소솜(Exosomes)

본 발명은 더나아가 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜이라는 세포내 소낭을 제공한다. 엑소솜은 예를 들면, 일본 특허출원 제 11-510507호 및 WO99/03499에 설명된 방법을 사용하여 제조할 수 있고, 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 얻어진 APC를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 상기 펩티드와 유사한 방법으로 백신으로서 접종할 수 있다.

복합체에 포함된 HLA 항원의 종류는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원의 종류와 일치해야 한다. 예를 들면, 일본인 집단에 대하여, HLA-A24 및 HLA-A2, 특히, HLA-A*2402 및 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206가 일반적이고, 따라서 일본인 환자의 치료를 위해 적합할 것이다. 일본인과 백인에게서 높게 발현되는 상기 A24 종류의 사용은 효과적인 결과를 얻기 위해 바람직하고, A2402, A*0201 및 A*0206과 같은 아류형(subtype)을 이용할 수 있다. 일반적으로, 임상에서는, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 종류는 미리 검사되고 있어, 상기 특정 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화성을 갖거나, 항원제시에 의한 세포독성 T 세포(CTL) 유도성을 보이는 펩티드를 적절하게 선택하는 것이 가능하게 된다. 또한, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 가지는 펩티드를 얻기 위하여, 자연에 존재하는 TTLL4 부분적 펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 하나, 둘 또는 여러 아미노산의 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가가 수행될 수 있다.

A24형 HLA 항원을 본 발명의 엑소솜을 위해 사용한 경우, 서열번호 1 및 3 내지 37 중으로부터 선택된 서열을 가지는 펩티드는 특정한 유용성을 가진다.

또는, A2 형 HLA 항원을 본 발명의 엑소솜을 위해 사용할 경우, 서열번호 38 내지 73 중으로부터 선택된 서열을 가지는 펩티드가 특히 유용하다.

어떤 실시예에서, 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 펩티드 및 HLA-A24 또는 HLA-A2 항원의 복합체를 그들의 표면에 제시하는 엑소솜이다.

VI. 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC)

또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드와 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 분리된 항원-제시 세포(antigen presenting cell; APC)를 제공한다. 상기 APCs는 치료 및/또는 예방을 받는 환자로부터 유래될 수 있고, 그 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜 또는 CTL을 포함하는 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다.

상기 APC는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않고, 수지상세포(DC), 랑게르한스(Langerhans) 세포, 마크로파지(macrophage), B세포 및 활성화 T 세포를 포함할 수 있는데, 이들은 림프구에 의해 인식되기 위하여 세포 표면에 단백질성 항원을 제시하는 것이 알려져 있다. 수지상세포는 강력한 CTL 유도 작용을 가지는 APC 중 하나이므로, 수지상세포는 본 발명의 APC로서 사용할 수 있다.

예를 들면, 말초 혈액 단핵구로부터 DC를 유도하고, 그런 다음 그것들을 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)시켜 본 발명의 APC를 얻을 수 있다. 본 발명의 펩티드를 개체에 투여하면, 본 발명의 펩티드가 제시된 APC가 개체의 체내에서 유도된다. 상기 구(phrase) "APC 유도(inducing APC)"는 본 발명의 펩티드, 또는 세포주의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 제시하기 위한 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드와의 접촉(자극)을 포함한다. 따라서 본 발명의 APC는 본 발명의 펩티드를 개체에 주입한 후 개체에서 수집할 수 있다. 또는, 본 발명의 상기 APC는 본 발명의 상기 펩티드가 주입된 개체로부터 수집한 APC와 접촉함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 APC는 그들로 자체로 또는 상기 펩티드, 엑소솜 또는 본 발명의 CTL을 포함하는 다른 약물과의 조합으로, 개체에서 암에 대한 면역반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 외 투여는 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 첫번째 개체로부터 APC 수집하는 단계,

b: 단계 a의 APC와 상기 펩티드를 접촉하는 단계, 및

c; 단계 b의 APC를 2번째 개체에 투여하는 단계.

첫 번째 개체와 두 번째 개체는 같은 개체일 수 있고, 또는 다른 개체일 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 본 발명의 펩티드는 항원-제시 세포를 유도할 수 있는 약학적 조성물로 제조하기 유용할 것이다. 항원-제시 세포를 유도하기 위한 약학적 조성물 제조를 위한 방법 또는 과정은 본 명세서에서 제공되고, 바람직하게는 혼합 단계 또는 본 발명의 펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화 하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 항원-제시 세포를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다. 단계 b에서 수득된 APC는 암 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로 제형화 될 수 있고, 암의 예는 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면, 본 발명의 APC는 높은 수준의 CTL 유도성을 가지고 있다. "높은 수준의 CTL 유도성"이라는 용어에 있어서, 상기 높은 수준은 펩티드와 접촉되지 않는 APC 또는 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉시킨 APC의 CTL 유도성 수준과 비교한 CTL 유도성 수준이다. 높은 수준의 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 이러한 APC는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 유전자를 시험관 내에서 APC에 도입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 도입 유전자는 DNA 또는 RNA 종류일 수 있다. 도입 방법으로는, 특별한 제한 없이, 본 기술분야에서 일반적으로 실시되는 다양한 방법을 포함할 수 있거나, 리포펙션(lipofection), 전기천공법(electroporation), 또는 인산칼슘법등이 이용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; 특허공보 제 2000-509281호에 기재된 것에 따라 실시할 수 있다. 유전자를 APC로 도입함으로써, 상기 유전자는 세포 안에서 전사 및 번역을 겪고, 이렇게 얻어진 단백질은 MHC 종류 I 또는 종류 II에 의해 처리되고, 제시 경로를 거쳐 일부 펩티드가 제시된다.

어떤 실시예에서, 본 발명의 APC는 HLA-A24 또는 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 APC이다.

VII. 세포독성 T 세포(Cytotoxic T lymphocytes; CTL)

본 발명의 어떤 하나의 펩티드에 대해 유도된 세포독성 T 세포는 생체 내에서 종양 관련 내피를 표적으로 하는 면역반응을 증강하고 그로 인하여 상기 펩티드 그 자체와 유사한 방법으로 백신으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 어떤 하나의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화된 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다.

이러한 CTL은 (1) 본 발명의 펩티드를 개체에 투여; 또는 (2) 개체 유래 APC, CD8 양성 T 세포, 또는 본 발명의 펩티드와 함께 시험관 내에서 말초 혈액 단핵 림프구 접촉(자극) 후 CTL 분리; 또는 (3) CD8 양성 T 세포 또는 말초 혈액 단핵 림프구와 시험관 내에서 그것의 표면에 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 APC 또는 엑소솜을 접촉; 또는 (4) 본 발명의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체 서브유닛(subnit)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자의 도입으로 얻어질 수 있다. 상기 APC 및 엑소솜은 상기 기재 방법 및 (4) 방법에 의해 준비될 수 있으며,(4)의 자세한 방법은 아래 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에서 기재된다.

본 발명의 CTL은 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 개체로부터 유래할 수 있고, 그 자체, 또는 조절 효과의 목적을 위한 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하여 다른 약물과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 얻어진 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드, 예를 들어, 유도를 위해 사용한 것과 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 암세포와 같은 TTLL4를 내생적으로 발현하는 세포, 또는 TTLL4 유전자가 형질전환된 세포이고; 본 발명의 펩티드에 의한 자극에 의해 세포 표면에 상기 펩티드를 제시하는 세포도 활성화된 CTL 공격의 표적이 될 수 있다.

어떤 실시예에서, 본 발명의 CTL은 HLA-A24 또는 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 세포를 인식하는 CTL이다. CTL의 맥락에서, 상기 구 "세포를 인식하다(recognize a cell)"는 이의 표면에 있는 HLA-A24 또는 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드 복합체가 이의 TCR을 통하여 결합하고, 상기 세포에 대하여 특이적 세포독성 활성을 나타내는 것을 말한다. 본 명세서에서 "특이적 세포독성 활성(specific cytotoxic activity)"는 HLA-A24 또는 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 세포에 대하여 세포독성 활성을 나타내는 것을 말하며, 다른 세포를 나타내지 않는다.

VIII. T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)

또한, 본 발명은 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)의 서브유닛(subunit)를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법을 제공한다. TCR 서브유닛(subunit)는 TTLL4를 발현하는 종양세포에 대한 특이성을 T 세포에 부여하는 TCR 형성 능력을 가진다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드로 유도된 CTL의 TCR 서브유닛(subunit)을 구성하는 알파쇄(alpha chain) 및 베타쇄(beta chain)를 암호화하는 핵산을 동정할 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288, 2003). 예를 들면, 상기 PCR 방법은 TCR을 분석하는데 바람직하다. 상기분석을 위한 PCR 프라이머는, 예를 들어, 5' 측면(side) 프라이머로서 5'-R 프라이머(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3')(서열 번호: 81) 및 TCR 알파 사슬(alpha chain) C 부위에 특이적인 3-TRa-C 프라이머(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3')(서열 번호: 82), TCR 베타 사슬(beta chain) C1 부위에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3')(서열 번호: 83) 또는 3' 측면 프라이머로서 TCR 베타 사슬 C2 부위에 특이적인 3-TR 베타-C2 프라이머(5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3')(서열 번호: 84)일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 TCR 유도체는 TTLL4를 제시하는 표적세포에 높은 결합력(avidity)으로 결합할 수 있고, 상기 TTLL4 펩티드를 제시하는 표적세포의 효과적인 사멸을 생체 내 또는 시험관 내에서 선택적으로 매개할 수 있다.

상기 TCR 서브유닛을 암호화하는 핵산은 적절한 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 핵산 또는 그것을 포함하는 벡터는 T 세포, 예를 들면 환자로부터의 T 세포에 유용하게 도입될 수 있다. 유리하게는, 본 발명은 환자 그들의(또는 다른 포유류의 것) T 세포가 암세포를 죽일 수 있는 탁월한 특징을 갖는, 용이하고 빠르게 변형된 T 세포를 생산하도록 급격한 변화를 허용하는, 바로 살 수 있는 조성물(off-the-shelf composition)을 제공한다.

특이적 TCR은 특이적으로 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체를 특이적으로 인지할 수 있는 수용체(receptor)이고, 이것은 상기 TCR이 상기 T 세포 표면에 제시될 때, 표적세포에 대한 T 세포 특이적 활성을 제공한다. 상기 복합체의 특이적 인식은 어떤 알려진 방법에 의해 수행될 수 있고, 바람직한 예는, HLA 분자 및 본 발명의 펩티드를 이용한 HLA 멀티머(multimer) 염색 분석, 및 ELISPOT 분석을 포함한다. ELISPOT 분석을 수행함으로써, 세포 표면에 TCR을 발현하는 T 세포가 TCR에 의해 세포를 인지하고, 신호가 세포내부로 이동되는 것이 확인될 수 있다. 상기 복합체가 T 세포 표면에 상기 복합체가 존재할 때, T 세포 세포독성 활성을 줄 수 있는 것의 확인은 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 방법은, 예를 들면, 크로미움 방출 분석(chromium release assay)과 같은 HLA 양성 표적세포에 대한 세포독성 활성의 확인을 포함한다.

또한, 본 발명은 TTLL4 펩티드, 예를 들면 HLA-A24의 맥락에서, 서열번호 1 및 3 내지 37, 및 HLA-A2 맥락에서 서열번호 38 내지 73 펩티드에 결합하는 TCR 아단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(nucleic acid)로 형질전환하여 제조된 CTL을 제공한다.

상기 형질전환된 CTL은 생체 내에서 암세포로 홈밍(homing)할 수 있으며, 잘 알려진 시험관 내 배양 방법으로 증식시킬 수 있다[예를 들면, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)]. 본 발명의 상기 CTL은 치료나 보호를 필요로 하는 환자의 암의 치료 또는 예방에 유용한 면역학적 조성물을 구성하는데 쓰일 수 있다[본 명세서에 참조로 포함되어 있는 콘텐츠(content)인 WO2006/031221을 보라].

IX. 약학적 물질 또는 조성물

TTLL4의 발현은 정상 조직에 비해 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하는 암에서 특이적으로 증가되어 있기 때문에, 본 발명의 펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)는 암의 치료를 위한 및/또는 예방을 위한, 및/또는 이의 수술 후 재발의 예방에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효성분으로 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 제제, 물질 또는 조성물과 같은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한 약학적 조성물 또는 제형화된 제제를 제공한다. 또는, 본 발명의 펩티드는 상기 엑소솜 또는 약학적 조성물로 사용되는 APC와 같은 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 또한, 상기 언급한 본 발명의 어떤 한 펩티드를 표적으로 하는 세포독성 T 세포는 또한 본 발명의 약학적 조성물의 유효 성분으로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 하나의 유효성분을 포함하는 제제 또는 조성물을 제공한다:

(a) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드;

(b) 본 명세서에 공개된 상기 펩티드를 발현가능한 형태로 암호화하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드;

(c) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 APC 또는 엑소솜; 및

(d) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 CTL.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 백신의 용도로 사용된다. 본 발명의 맥락에서, 상기 구 "백신(vaccine)"[또한, "면역성의 조성물(immunogenic composition)"이라고 불림)은 동물에 접종되어 항-종양 면역력(anti-tumor immunity)을 개선, 증가 및/또는 유도하기 위한 기능을 갖는 제제 또는 조성물을 말한다.

다른말로, 본 발명은 개체에 있어서 암에 대한 면역반응을 유도하기 위한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 마우스, 랫(rat), 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소(cattle), 말, 원숭이, 비비(baboon), 및 침팬지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 포유류, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 가축(domesticated animal) 및 인간을 포함하는 개체 또는 환자에서 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발의 예방을 위해서 사용할 수 있다.

어떤 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 개체에 투여하기 위해 제형화 될 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 또한 암 또는 종양의 치료를 위한 약학적 조성물 또는 제제의 제조에서 하기에서 선택된 유효성분의 용도를 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현가능한 형태로 본 발명에 공개된 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드;

(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

또는, 본 발명은 또한, 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방의 용도를 위한 하기에서 선택된 유효 성분을 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

또는, 본 발명은 추가적으로 암 또는 종양을 치료 또는 방지를 위한 약학적 조성물 또는 물질을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 유효 성분으로서 하기로부터 선택되는 약학적으로 또는 생리활성적으로 허용가능한 유효 성분이 있는 담체를 제형화하는 단계를 포함한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현할 수 있는 종류로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드;

(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 및

(d) 본 발명의 CTL.

다른 실시예에서, 본 발명은 또한 종양 또는 암을 치료 또는 방지하기 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 하기로부터 선택되는 유효 성분이 있는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜;및

(d) 본 발명의 CTL.

본 발명에 따라, HLA-A24에 제한된 에피토프 펩티드 또는 후보로 알려진 서열번호 1 및 3 내지 37 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드 및 또한 HLA-A2에 제한된 에피토프 또는 상기 후보로 알려진 서열번호 38 내지 73은 개체에 있어서 HLA-A24 또는 HLA-A2 및 TTLL4를 발현하는 암에 대해 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 서열번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73의 아미노산 서열을 가지는 이러한 펩티드 중 어느 것을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제는 HLA 항원이 각각 HLA-A24 및 HLA-A2인 개체에 투여에 특히 적합하다. 같은 것이 본 발명의 펩티드 중 어떤 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 약학적 조성물 또는 제제에 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물 또는 제제에 의해 치료되는 암은 제한되지 않고, TTLL4가 관여된 모든 종류의 암을 포함하며, 암은 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다.

상기 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제는 상기 기재한 유효 성분뿐만 아니라, 암 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력이 있는 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드들을 제시하는 다른 세포를 포함할 수 있다. 여기서, 암세포에 대해 CTL을 유도하는 능력을 가지는 다른 펩티드들은 암 특이적 항원(예를 들어, 동정된 TAA들)에 의해 예시가 될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 상기 약학적 조성물 또는 제제는 상기 유효 성분, 예를 들면 본 발명의 펩티드의 어떤 것과 같은 것의 항종양적 효과를 억제하지 않는 한, 필요하다면 선택적으로 다른 치료적 물질을 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 예를 들면, 제제는 항염증적 조성물, 진통제, 화학요법 및 그와 같은 종류의 것을 포함할 수 있다. 그 약제 안에 다른 치료적 물질을 포함하는 것뿐 아니라, 본 발명의 약제는 역시 하나 또는 그 이상의 다른 약학적 조성물과 단계적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 조성물의 양은, 예를 들면, 사용되는 약학적 조성물의 유형, 치료되는 질병, 투여의 일정과 루트(route)에 의존한다.

특히 본 명세서에 언급된 유효성분에 더하여, 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제는 문제가 되고 있는 제형의 형태와 관련하여 당업계의 전통적인 다른 조성물을 포함될 수 있음이 이해되어야 한다.

본 발명의 한 실시예에서, 본 발명의 상기 약학적 조성물 또는 제제는, 예를 들어 암과 같은, 질병의 병리 조건을 치료하는데, 유용한 물질을 포함하는 제품 및 키트에 포함될 수 있다. 상기 제품은 라벨이 있는 상기 약학적 조성물 또는 제제 중 어느 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이알(vial) 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 상기 용기의 라벨은 상기 질병의 하나 또는 그 이상의 조건을 치료 또는 예방하는데 사용되는 조성물 또는 제제인 것을 나타내야 한다. 또한 라벨은 투여에 관한 지시 등에 대해 나타낼 수 있다.

또한 상기 기재한 용기뿐 아니라, 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제를 포함한 키트는 선택적으로 약학적으로 허용할 수 있는 희석액을 보관하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 또한 이것은 상업적 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질, 다른 버퍼, 희석액, 필터, 니들, 주사기 및 사용설명서를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물 또는 제제는, 바람직하다면, 유효 성분이 포함된 하나 또는 그 이상의 구성 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 존재할 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 블리스터 팩과 같은 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여에 대한 지시에 의해 동반될 수 있다.

(1) 상기 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물

본 발명의 펩티드들은 약학적 조성물 또는 제제로 직접적으로 투여될 수 있으며, 또는 필요하다면, 종래의 제조 방법에 의해 제조되기도 한다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드 뿐만 아니라, 담체, 부형약 및 약물에서 평이하게 사용되는 것이 특이적 제한 없이 적절한 것으로 포함될 수 있다. 상기 담체들은 멸균된 물, 생리학적 살린(saline), 인산 버퍼(phosphate buffer), 배양 유액 등이다. 또한, 상기 약학적 조성물 또는 제제는 필요하다면, 안정제, 현탁액, 보존료, 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제는 항암 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드들은 생체 내에서 CTL을 유도하기 위해 둘 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드로 구성된 조합으로 준비될 수 있다. 상기 펩티드 조합은 혼합제(cocktail)일 수 있고, 또는 표준 기술을 이용하여 각각 다른 것이 접합된 형태일 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드들은 단독 융합 폴리펩티드 서열로서 발현되거나 화학적으로 연결될 수 있다. 상기 조합의 펩티드들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 본 발명의 펩티드들을 투여함으로써, 펩티드들은 APC에 HLA 항원에 의해 높은 밀도로 제시되며, 그 후에 제시된 펩티드 및 HLA 항원으로 구성된 복합체에 대해 특이적으로 반응하는 CTL은 유도된다. 또는, APC(예를 들면, DC)는 개체로부터 제거된 후에, 그들의 세포 표면에 본 발명의 펩티드 중 어느 것을 제시하는 APC를 수득하기 위하여, 본 발명의 펩티드로 자극된다. 이러한 APC들은 개체에서 CTL을 유도하기 위하여 개체에 재-투여되고, 결과적으로, 종양-관련된 내피에 대한 공격성이 증가될 수 있다.

본 발명의 펩티드 중 어느 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 및/또는 방지를 위한 상기 약학적 조성물 또는 제제는 세포 면역이 효과적으로 수립되도록 보강제(adjuvant)를 또한 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물 또는 제제는 그들은 다른 유효 성분과 함께 투여될 수 있고, 과립(granule) 제형으로 투여될 수 있다. 보강제는 면역학적 활성을 가진 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여될 때, 상기 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키는 어떤 화합물을 나타낸다. 여기서 고려될 수 있는 보강제는 문헌(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89)에 기술된 것을 포함한다. 적합한 보강제의 예는 알루미늄 포스패이트(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록시드(aluminum hydroxide), 알럼(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin), IFA(Incomplete Freund's adjuvant), CFA(Complete Freund's adjuvant)와 같은 것을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다.

또한, 리포좀 제형, 미세한 마이크로미터 지름의 비드(bead)가 결합된 펩티드를 가지는 과립 제형, 및 지질(lipid)과 결합되는 펩티드 제형이 편리하게 쓰일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서, 또한 본 발명의 펩티드들은 약학적으로 허용가능한 염의 종류로 투여될 수 있다. 바람직한 염(salts)의 예는 알칼리 금속(alkali metal), 금속염(salts with a metal), 유기염기염(salts with an organic base), 유기산염(salts with an organic acid) 및 무기산염(salts with an inorganic acid)를 포함한다. 여기서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 염"은 생물학적 효과성 및 화합물의 특성을 보유하고, 하이드로클로릭산(hydrochloric acid), 하이드로브로믹산(hydrobromic acid), 술푸릭산(sulfuric acid), 니트릭산(nitric acid), 포스포릭산(phosphoric acid), 메탄술포닉산(methanesulfonic acid), 에탄술포닉산(ethanesulfonic acid), p-톨루엔술포닉산(p-toluenesulfonic acid), 살리실릭산(salicylic acid) 및 그와 같은 것과 같은 무기산 또는 염기와 반응함으로써 수득될 수 있는 염을 의미한다.

또한, 어떤 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제는 CTL을 준비하는 구성요소를 추가적으로 포함한다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체 내에서 CTL을 초회감작(priming)시킬 수 있는 조성물로 확인되었다. 예를 들면, 팔미트산 잔기(palmitic acid residues)는 라이신 잔기의 엡실론-아미노(epsilon-amino) 및 알파-아미노(alpha-amino) 그룹에 붙여질 수 있으며, 그 후에 본 발명의 펩티드들과 연결될 수 있다. 지질화 펩티드들은 마이셀(micelle) 또는 입자(particle) 안에 직접적으로 투여되거나, 리포좀(liposome)에 통합되거나, 또는 보강제에 유화시킬 수 있다. CTL 반응을 준비시키는 지질의 또 다른 예로, 적절한 펩티드들과 공유적으로 결합될 때, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지질단백질(lipidprotein)이 CTL을 준비하는 것에 사용될 수 있다(참조, 예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소 투여일 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 등등에 알맞게 적용될 수 있고, 보통 0.001mg 내지 1000mg, 예를 들면, 0.01mg 내지 100mg, 예를 들면, 0.1mg 내지 10mg이며, 몇 일 내지 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자가 적절하게 알맞은 용량을 선택할 수 있다.

(2)폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물

또한, 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제는 발현할 수 있는 종류로 본 명세서에서 공개된 발현가능한 형태의 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 용어 "발현할 수 있는 종류”는 세포 안으로 상기 폴리뉴클레오티드가 도입되었을 때, 생체 내에서 폴리뉴클레오티드가 항종양 면역을 유도하는 폴리펩티드로 발현될 것임을 의미한다. 예시된 실시태양에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현에 대해 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적세포의 유전체로 안정한 삽입을 향상시키기 위해 준비 될 수 있다(예를 들어, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대해 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; U.S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720를 참조한다. DNA-기반의 전달 기술의 예로서 “네이키트 DNA(naked DNA)”, 용이한 전달[부피바카인(bupivacaine), 폴리머, 펩티드-매개], 양이온 지질 복합체 및 입자-매개("유전자 총”)또는 압력-매개 전달을 포함한다(참조, 예를 들어, U.S. Patent No. 5,922,687).

또한, 본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 세균 벡터로 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예로 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은 백시니아 바이러스의 사용, 예를 들어, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터를 포함한다. 숙주에 도입하였을 때, 상기 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 면역성 펩티드를 발현하고, 그렇게 함으로써 면역 반응을 유도한다. 면역법 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은, 예를 들어, U.S. Patent No. 4,722,848에 기재되어 있다. 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재되어 있다. 치료상의 투여 또는 면역법에 대한 유용한 다양한 다른 벡터들, 예를 들어, 아데노 및 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vectors), 레트로바이럴 벡터(retroviral vectors), 살모넬라 타이피 벡터(Salmonella typhi vectors), 독성이 없는 탄저균 독소 벡터(detoxified anthrax toxin vectors), 기타 같은 종류의 것이 분명할 것이다(참조, 예를 들어, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85).

환자로의 폴리뉴클레오티드 전달은 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 환자가 직접적으로 노출되는 직접적 경우 또는 세포가 시험관 내에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 첫 번째로 형질 전환된 후, 세포가 환자에 이식되는 간접적 경우 중 어느 것이 될 수 있다. 이 두 가지 방법이 각각 생체 내 및 생체 외 유전자 치료법으로 알려져 있다.

유전자 치료의 상기 방법의 일반적인 리뷰는(Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215 참조)를 참조한다. 또한, 본 발명에서 적용될 수 있는 재조합 DNA의 일반적으로 당업계에 알려진 방법은 Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, NY, 1993); and Krieger in Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual(Stockton Press, NY, 1990)에 기재되어 있다.

투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소 투여일 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 적절한 담체에 포함된 상기 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 등등에 알맞게 적용될 수 있으며, 그리고 보통 0.001mg 내지 1000mg, 예를 들면, 0.01mg 내지 100mg, 예를 들면, 0.1mg 내지 10mg이며, 몇 일 내지 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 용량을 적절히 선택할 수 있다.

X.펩티드, 엑소솜, APC 및 CTL을 이용하는 방법

본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 APC 및 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소솜 및 APC는 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APC는 부가적인 화합물이 그들의 CTL 유도성을 저해하지 않는 한 어떠한 다른 화합물의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기에 언급한 본 발명의 약학적 조성물 또는 제제의 어떤 것은 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 그것에 더하여, 또한 이러한 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것은 하기 논의된 APC를 유도하는데 사용될 수 있다.

(1) 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC) 유도 방법

본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 높은 CTL유도성이 있는 APC를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드를 APC와 접촉하는 하기 단계를 포함한다. 예를 들어, 생체 외에서 펩티드와 APC를 접촉하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APC를 수집하는 단계, 및

b: 펩티드 및 단계 a의 APC를 접촉하는 단계.

APC는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않으며, 림프구에 의해 인식되기 위해서 단백질성의 항원을 그들의 세포 표면에 발현하는 것으로 알려져 있는 수지상세포, 랑게르한스 세포, 대식세포, B 세포 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 바람직하게 DC는 상기 APC들 사이에서 그들이 가장 강한 CTL 유도성을 가지기 때문에 사용될 수 있다. 본 발명의 어떤 한 펩티드는 단독으로 또는 본 발명의 다른 펩티드와 조합 또는 TTLL4 외에 TAA로부터 유래된 펩티드를 유도하는 CTL과 사용될 수 있다.

다른 한편으로는, 본 발명의 펩티드가 개체에 투여될 때, 상기 APC는 생체 내에서 상기 펩티드와 접촉되고, 그 결과, 높은 CTL 유도성이 있는 상기 APC는 개체의 몸 안에서 유도된다. 따라서, 본 발명의 방법은 개체의 몸안에서 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하기 위해 개체에 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현가능한 형태로 개체에 투여하는 경우, 생체 내에서 본 발명의 펩티드가 발현되고, APC와 접촉하므로, 그 결과, 상기 높은 CTL 유도성이 있는 APC가 개체의 몸안에서 유도된다. 따라서, 본 발명은 또한 개체의 몸에 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하기 위해 개체로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 구 “발현가능한 형태(expressible form)”는 “IX. 약학적 물질 또는 조성물 (2) 유효성분으로 폴리뉴클레오티드를 함유하는 약학적 조성물” 부분에 기재된다.

또한, 본 발명은 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하기 위해 APC로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APC를 수집하는 단계; 및

b: 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 도입하는 단계.

단계 b는 상기 "VI. 항원-제시 세포" 부분에 기재한 것과 같이 수행될 수 있다.

또는, 본 발명은 TTLL4에 대한 특이적 CTL 활성을 유도하는 항원-제시 세포(APC)를 제조하는 방법을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 하기의 단계의 하나를 포함할 수 있다:

(a) 시험관내에서(in vitro), 생체외에서(ex vivo), 또는 생체내에서(in vivo) APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및

(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 도입시키는 단계.

또한, 본 발명은 CTL 유도성을 갖는 APC를 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 중에서 선택된 단계를 포함한다:

(a) APC를 본 발명의 펩티드와 접촉하는 단계; 및

(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 도입하는 단계.

본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. CTL 유도성을 갖는 APC를 유도하기 위해 사용된 APC는 바람직하게 HLA-A24 또는 HLA-A2 항원을 발현하는 APC일 수 있다. 상기 APC는 HLA 항원이 HLA-A23 또는 HLA-A2인 개체로부터 수득한 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)로부터 당업계에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 유도된 상기 APC는 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원(HLA-A24 또는 HLA-A2 항원) 복합체가 이의 표면에 제시되는 APC일 수 있다. 본 발명의 방법으로 유도된 APC가 개체에 있어 암에 대한 면역반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 때, 상기 개체는 바람직하게 APC가 유도된 같은것이다. 그러나, 상기 개체는 APC 기증자(donor)와 같은 HLA 형을 갖는 개체인한 상기 APC 기증자와는 다른 것일 것이다.

다른 실시예에서, 본 발명은 CTL 유도성을 갖는 APC를 유도하기 위한 용도의 제제 또는 조성물을 제공하고, 상기 제제 또는 조성물은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 APC 유도를 위해 제형화된 제제 또는 조성물의 제조에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화히는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 CTL 유도성을 갖는 APC를 유도하기 위한 용도로 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드를 추가적으로 제공한다.

(2) CTL을 유도하는 방법

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 엑소솜 또는 APC를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인지하는 T 세포 수용체(TCR) 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직하게, CTL을 유도하는 방법은 하기 중에서 선택된 최소 하나의 단계를 포함한다:

a: CD8-양성 T 세포를 그 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜과 접촉시키는 단계; 및

b: 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인지하는 TCR 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포로 도입시키는 단계.

본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC, 또는 엑소솜이 개체로 투여될 때, CTL은 개체의 몸에서 유도되고, 표적하는 TTLL4를 발현하는 암세포에 대한 면역 반응의 강도는 증진된다. 따라서, 본 발명의 방법은 CTL을 유도하기 위해 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC 또는 엑소솜을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

또는, CTL은 또한 그들을 이용하여 생체 외 또는 생체 내에서 유도될 수 있고, CTL을 유도한 후에, 상기 활성화된 CTL은 개체에 다시 되돌려진다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APC를 수집하는 단계,

b: 펩티드와 단계 a)의 APC를 접촉하는 단계, 및

c: CD8 양성 T 세포와 단계 b)의 APC를 공배양(co-culture)하는 단계.

상기 단계(c)에서 CD8 양성 T 세포와 공-배양된 APC는 상기 "VI. 항원-제시 세포" 부분에서 기재한 것과 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 APC에 형질전환함으로써 준비될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정하지 않고, 따라서 본 발명은 본 발명의 펩티드 및 HLA항원의 복합체를 그것의 표면에 효과적으로 제시하는 모든 APC를 포함한다.

상기 APC 대신에, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 표면에 제시하는 엑소솜도 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 엑소솜과 공배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 엑소솜은 “V. 엑소솜”에 기재된 방법으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드에 결합하는 TCR 서브유닛를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 CD8-양성 세포에 도입시킴으로써 CTL은 유도될 수 있다. 이러한 형질 도입은 상기 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 CTL을 유도하는 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체를 혼합 또는 제조하는 단계를 포함한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 CTL을 유도하기 위한 제제 또는 조성물을 제공하고, 상기 제제 또는 조성물은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들), 또는 하나 또는 그 이상의 APC 또는 엑소솜을 제공한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 CTL을 유도하기 위해 제형화된 제제 또는 조성물의 생산에 있어서, 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 APC 또는 엑소솜의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 CTL 유도의 용도를 위한 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 APC 또는 엑소솜을 추가적으로 제공한다.

XI. 면역 반응을 유도하는 방법

또한, 본 발명은 TTLL4와 관련된 질병에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 적합한 질병은 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 물질(들) 또는 조성물(들)을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APC의 투여를 고려할 수 있다. 상세하게는, "IX. 약학적 조성물", 특히 백신으로서 본 발명의 약학적 조성물의 사용을 기술하는 부분을 참조할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 엑소솜 또는 APCs는 상기 "V.엑소솜", "VI. 항원-제시 세포(APC)", 및 "X. 펩티드, 엑소솜, APC 및 CTL을 사용하는 방법"의(1) 및 (2)에 상세하게 기술되어 있다.

또한, 본 발명은 면역 반응을 유도하기 위한 약학적 조성물 또는 물질을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)와 함께 본 발명의 펩티드를 첨가하거나 또는 제형하는 단계를 포함할 수 있다.

또는, 본 발명의 방법은 하기를 함유하는 백신 또는 약학적 조성물 또는 물질을 투여하는 단계를 포함할 수 있다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현 가능한 형태로서 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산;

(c) 표면에 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC 또는 엑소솜; 또는

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

본 발명의 맥락에서, TTLL4를 과발현하는 암은 이러한 유효 성분으로 치료될 수 있다. 이러한 암의 예는 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 유효 성분을 포함하는 백신 또는 약학적 조성물 또는 물질의 투여 이전에, 검사될 개체에서 TTLL4의 발현 수준이 증가되었다는 것을 확인하는 것은 바람직하다. 따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 이를 필요로하는 환자에 있어서 TTLL4를 (과)발현하는 암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

i) 치료될 암을 갖는 개체로부터 수득된 생물학적 시료(들)에서 TTLL4의 발현 수준을 결정하는 단계;

ii) TTLL4의 발현 수준을 정상 대조군 수준과 비교하는 단계; 및

iii) 상기 기술된 (a) 내지 (d) 중에서 선택된 최소 하나의 구성요소를 TTLL4가 정상 대조군과 비교하여 과발현되는 암을 갖는 개체에게 투여되는 단계.

또는, 본 발명은 TTLL4가 과발현된 암을 갖는 개체에 투여하기 위한 상기 기술된 (a) 내지 (d) 중에서 선택된 최소 하나의 구성요소를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물을 제공한다. 다시 말하면, 본 발명은 본 발명의 TTLL4 폴리펩티드로 치료되는 개체를 알아내는 방법을 제공하고, 이러한 방법은 개체-유래 생물학적 시료에서 TTLL4의 발현수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 증가된 수준은 그 개체가 본 발명의 TTLL4 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암을 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명의 암을 치료하는 상기 방법은 하기에 보다 상세하게 기술될것이다.

TTLL4의 전사 또는 번역 생산물을 포함하는 한, 어떤 개체-유래 암 세포 또는 조직은 TTLL4의 발현의 결정을 위해 사용될 수 있다. 적절한 생물학적 시료는 몸 조직 및 혈액, 가래 및 요(urine)과 같은 체액을 포함하지만, 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 개체-유래 세포 또는 조직은 상피 세포, 보다 바람직하게는 암 상피세포 또는 암으로 의심되는 조직으로부터 유래한 상피세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 또한, 필요하다면, 상기 세포는 수득된 몸의 조직 및 체액으로부터 정제된 후, 개체-유래 세포 또는 조직으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 개체는 바람직하게는 포유류이다. 포유류의 예는 인간, 비-인간 영장류(non-human primate), 쥐(mouse), 쥐(rat), 개 고양이, 말, 및 소를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

본 발명에 따르면, 개체로부터 수득된 생물학적 시료에서 TTLL4의 발현 수준이 결정될 수 있다. 상기 발현 수준은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 전사(핵산) 생산물 수준에서 결정될 수 있다. 예를 들면, TTLL4의 mRNA는 혼성화 방법으로 탐침을 이용하여 정량될 수 있다(예를 들어, Northern hybridization). 탐지는 칩 또는 어레이(array)로 수행될 수 있다. 어레이의 사용은 TTLL4의 발현 수준을 탐지하는데 바람직하다. 당업자들은 이러한 TTLL4의 서열정보를 이용하여 탐침을 제조할 수 있다. 예를 들면, TTLL4의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광 물질 및 동위원소와 같은, 적절한 표지로 표지될 수 있으며, 유전자의 발현 수준은 혼성화된 표지의 강도로 탐지될 수 있다.

또한, TTLL4 유전자의 전사 생산물은 증폭-기반 탐지 방법에 의해 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다(예를 들면, RT-PCR). 또한, 상기 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 기반으로 제조될 수 있다.

특히, 상기 제시된 방법에 대해 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한 상태, 적절하게 엄격한 상태 또는 낮게 엄격한 상태하에서 TTLL4의 mRNA와 혼성화된다. 본 명세서에 사용되었던, 상기 용어 “엄격한(혼성화) 조건”은 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화하는 조건을 나타내지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경하에서 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적 혼성화는 짧은 서열에 비해 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열융해점(Thermal melting point, Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 50%의 상기 탐침이 상보적으로 상기 표적 서열에 동등하게 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열이 일반적으로 과다하게 존재하므로, Tm에서 상기 탐침의 50%는 동등하게 점유된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 염 약 1.0M 소듐 이온 미만인 농도일 수 있으며, 일반적으로, pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0M 소듐 이온(또는 다른 염들) 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 약 30℃이고,(예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드) 긴 탐침 또는 프라이머에 대해서는 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정화 제제의 첨가로 얻을 수 있다.

본 발명의 탐침 또는 프라이머는 일반적으로 주로 정제된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 엄격한 조건에서 적어도 약 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 또는 25개의 TTLL4 서열을 포함하는 핵산의 연이은 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 또는 TTLL4 서열을 포함하는 핵산의 안티-센스 가닥 뉴클레오티드 서열 또는 이러한 서열의 자연적으로 발생하는 돌연변이체와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열의 부분을 일반적으로 포함한다. 특히, 예를 들면, 바람직한 예에서, 5-50 개의 길이를 가지는 올리고뉴클레오티드는 탐지되는 상기 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로 사용될 수 있다. 보다 바람직하게, TTLL4 유전자의 mRNA 또는 cDNA는 일반적으로 15-30b 길이의 특이적 크기의 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머로 탐지될 수 있다. 상기 길이는 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 20 뉴클레오티드, 적어도 25 뉴클레오티드, 적어도 30 뉴클레오티드의 범위일 것이고, 프로브 및 프라이머는 5 내지 10 뉴클레오티드, 10 내지 15 뉴클레오티드, 15 내지 20 뉴클레오티드, 20 내지 25 뉴클레오티드 및 25 내지 30 뉴클레오티드 범위일것이다. 바람직한 예에서, 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머의 길이는 15-25 로부터 선택될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머를 이용한 유전자 탐지를 위한 분석 과정, 장치 또는 시약은 잘 알려져 있다(예를 들면, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 또는 PCR). 이러한 분석에서, 탐침 또는 프라이머는 또한 택 또는 링커(linker) 서열을 포함할 수 있다. 또한, 탐침 또는 프라이머는 탐지가능한 라벨 또는 포획되는 친화도 리간드로 변형될 수 있다. 또는, 혼성화에 기초한 탐지 과정에서, 몇 백(예를 들면, 약 100-200) 염기 내지 몇 천(예를 들면 1000-2000) 염기 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드가 또한 탐침으로 사용될 수 있다(예를 들면, 노던 블랏팅 분석 또는 cDNA 마이크로어레이 분석).

또는, 번역 생산물(즉 단백질)은 본 발명의 진단을 위해 탐지될 수 있다. 예를 들면, TTLL4 단백질(서열 번호 80) 또는 이의 면역학적 단편은 결정될 수 있다. 번역 생산물로서 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 단백질을 인식하는 특이적 항체를 사용한 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 또한, 그 단편 또는 변형된 항체가 TTLL4 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등등)은 탐지를 위해 쓰일 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 이의 단편에 대한 상기 항체는 또한 본 발명에 의해 제공된다. 단백질의 탐지를 위해 상기 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 본 발명에서 이러한 항체 및 그들의 등가물을 준비하는 것에 적용될 수 있다.

TTLL4 유전자 발현 수준을 탐지하기 위한 다른 방법은 그것의 번역 산물에 기초하기 때문에, 염색의 강도는 TTLL4 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직학적 분석을 통해 측정될 수 있다. 즉, 상기 측정에서, 강한 염색은 증가된 단백질의 존재/수준, 동시에, TTLL4 유전자의 높은 발현수준을 나타낸다.

만약 예를 들어 10%, 25%, 또는 50%; 또는 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2.0배 이상, 5.0배 이상, 10.0배 이상 또는 그 이상과 같이 표적 유전자의 대조군 수준(예를 들면 정상 세포내 수준) 이상이면, 표적 유전자, 예를 들면, 암세포에서 TTLL4 유전자 발현 수준은 증가되는 것으로 결정될 수 있다.

질환 상태(암성 또는 비암성)라고 알려진 개체/개체들로부터 수거되고 저장된 시료를 사용하여 암세포와 동일한 시간에 대조군 수준은 결정될 수 있다. 또한, 치료될 암을 갖는 기관의 비-암성 부위로부터 수득된 정상 세포는 정상 대조군으로서 사용할 수 있다. 또는 이전에 수집되고 저장된 시료를 사용함으로써 상기 암세포와 동시에 확인될 수 있다. 또는, 상기 대조군 수준은 이전에 질환 상태에 있다고 알려진 생물학적 시료에서 확인된 TTLL4 유전자의 발현 수준을 분석함으로써 얻어진 상기 결과를 기반으로 하는 통계학적인 방법으로 확인될 수 있다. 또한, 이전에 시험된 세포의 발현 패턴 데이터베이스로부터 대조군 수준은 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 측면에 따르면, 생물학적 시료 안의 TTLL4 유전자의 발현 수준은 대조군 수준과 복수로 비교될 수 있으며, 이는 복수의 참조 시료로부터 결정될 수 있다. 생물학적 시료과 유사한 조직 종류로부터 유래된 참조 시료로부터 대조군을 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태로 알려져 있는 군의 TTLL4 유전자의 발현 수준의 기준치를 이용하는 것이 바람직하다. 기준치는 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D. 의 범위가 기준치로 사용될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 암이 없는(non-cancerous)것으로 알려진 생물 시료로부터 결정된 대조군 수준은 “정상 대조군 수준(normal control level)”으로 나타낸다. 한편, 만약, 상기 대조군 수준이 암 생물 시료로부터 결정될 경우, 이것은 “암 대조군 수준(cancerous control level)”으로 나타낸다. 시료 발현 수준 및 대조군 수준 사이의 차이는, 예를 들면 발현 수준이 상기 세포의 암 또는 암이 아닌(non-cancerous) 상태에 따라 다르지 않은 것이 알려진 하우스키핑 유전자와 같은 대조군 핵산의 발현 수준으로 평준화될 수 있다. 대조군 유전자는 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드3포스패이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜단백질(ribosomal protein) P1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

TTLL4 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준에 비해 증가되었을 때, 또는 암 대조군 수준에 유사/동등할 때, 개체는 치료될 암을 갖는 것으로 진단될 수 있다.

또한, 본 발명은(i) 치료될 암을 가질 것으로 의심되는 개체를 진단, 및/또는(ii) 암을 치료하기 위한 개체를 선택하는 방법을 제공하고, 그 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 생물 시료에서 TTLL4의 발현 수준을 결정하는 단계;

b) TTLL4의 발현 수준을 정상 대조군 수준과 비교하는 단계;

c) 만약 TTLL4의 발현 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 증가되었다면, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단하는 단계; 및

d) 단계 c)에서 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단되었다면, 암 치료를 위한 개체를 선택하는 단계.

또는, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득한 생물 시료에서 TTLL4의 발현 수준을 결정하는 단계;

b) TTLL4의 발현 수준을 암 대조군 수준(cancerous control level)과 비교하는 단계;

c) 만약 TTLL4의 수준이 암 대조군 수준과 비교하거나 또는 동등하다면, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단하는 단계; 및

또한, 본 발명은 본 발명의 TTLL4 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암으로부터 고통받거나 고통받을 것으로 의심되는 개체를 진단 또는 결정하기 위한 진단 키트를 제공하며, 이는 암 면역치료의 효과 또는 적용가능성을 평가 및/또는 모니터링(monitering)에 유용할것이다. 바람직하게, 암은 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하지만 이에 한정하지 않는다. 보다 구체적으로, 키트는 바람직하게는 개체-유래 세포에서 TTLL4 유전자의 발현을 탐지하기 위한 최소한 하나의 시약을 포함하고, 상기 시약은 하기 군으로부터 선택될 수 있다:

(a) TTLL4 유전자의 mRNA를 탐지하기 위한 시약;

(b) TTLL4 단백질 또는 이의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 시약; 및

(c) TTLL4 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 시약.

TTLL4의 mRNA를 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 TTLL4 mRNA에 특이적으로 결합하거나 또는 TTLL4 mRNA를 확인하는, 예를 들면 TTLL4 mRNA의 부분에 대한 상보적 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 TTLL4 mRNA에 특이적인 프라이머 및 탐침으로 증폭될 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 준비될 수 있다. 만약 필요하다면, TTLL4 mRNA를 탐지하기 위한 시약은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 또한, TTLL4 mRNA를 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트에 포함될 수 있다.

다른 한편으로는, TTLL4 단백질 또는 이의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 TTLL4 단백질 또는 이의 면역학적 단편에 대한 항체를 포함한다. 상기 항체는 단일클론(monoclonal) 또는 다중클론(polyclonal)일 수 있다. 또한 그 단편 또는 변형된 항체가 TTLL4 단백질 또는 이의 면역학적 단편에 결합하는 능력을 유지하는 한, 상기 항체의 어떤 단편 또는 변형 [예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv 등]은 시약으로 사용될 수 있다. 단백질 탐지를 위한 이러한 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 이러한 항체 및 그것의 등가물을 준비하는 방법도 본 발명에서 적용될 수 있다. 또한, 항체는 직접적인 연결 또는 간접적인 표지 기술을 통해 신호 발생 분자로 표지될 수 있다. 표지 및 항체 표지에 대한 방법 및 그들의 표적으로 항체의 결합을 탐지하는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 표지 및 방법은 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, TTLL4 단백질을 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트 안에 포함될 수 있다.

키트는 상기 언급한 시약의 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 고체 매트릭스 및 TTLL4 유전자에 대한 탐침에 결합하는 시약 또는 TTLL4 펩티드에 대한 항체, 배지 및 배양하는 세포를 위한 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 TTLL4 펩티드에 대한 항체를 탐지하기 위한 2차 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 암이 없거나 또는 암을 겪고 있는 개체(이에 관계없이)로부터 얻어진 조직 시료는 유용한 대조 시약으로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 바람직한 상업적 및 사용자의 관점으로부터, 버퍼, 희석액, 필터, 바늘(needle), 주사기 및 사용설명서(예를 들어, 문서, 테이프, CD-ROM)를 포함하는 다른 물질을 포함한다. 적절한 용기는 병, 바이알(vials) 및 테스트 튜브(test tube)를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 만들어졌다.

어떤 실시예에서, TTLL4 mRNA에 대한 탐침이 시약일 때, 상기 시약은 탐지 부위가 적어도 한 개로 구성되는 다공성 스트립과 같은 고체 메트릭스에 고정화될 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 탐지는 각각의 구성하는 핵산(탐침)부위의 많은 수를 포함할 수 있다. 시험 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 또는, 대조군 부위는 시험 스트립으로부터 분리된 스트립에 위치할 수 있다. 선택적으로 다른 탐지 부위는 고정화된 핵산의 다른 양, 즉, 첫번째 탐지 부위의 높은 양 및 다음 부위 안의 적은 양을 포함할 수 있다. 시험 시료를 더했을 때, 탐지가능한 신호를 제시하는 부위의 수는 시료 안에 존재하는 TTLL4 mRNA의 양의 정량적 지표를 제공한다. 상기 탐지 부위는 어떠한 적절하게 탐지가능한 모양으로 구성될 수 있으며, 일반적으로 시험 스트립의 바 또는 도트 스패닝(dot spanning) 상기 너비 안에 있다.

또는 본 발명의 키트는 양성 대조군 시료 또는 TTLL4 표준 시료를 포함할 수 있다. 본 발명의 양성 대조군 시료는 TTLL4 양성 시료를 수거하고 그들의 TTLL4 수준을 검사함으로써 준비될 수 있다. 또는, 양성 시료 또는 TTLL4 가닥(strand) 시료를 형성하기 위해, 정제된 TTLL4 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 TTLL4를 발현하지 않는 세포에 첨가할 수 있다. 본 발명에서, 정제된 TTLL4는 재조합 단백질일 수 있다. 양성 대조군 시료의 TTLL4 수준은, 예를 들면 판정 기준치(cut-off) 값 이상이다.

또한 한 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 항원 또는 그것의 단편을 특이적으로 인지하는 단백질 또는 그것의 단편을 포함하는 진단용 키트를 제공한다.

여기서 고려되는 본 발명의 단백질의 부분 펩티드(partial peptide) 예는 본 발명 단백질의 아미노산 서열에서 최소한 8개, 바람직하게는 15개, 보다 바람직하게는 20개의 연속적인 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 암은 시료(예를 들면, 혈액, 조직)에서 본 발명의 펩티드(폴리펩티드) 또는 단백질을 사용하여 항체를 탐지함으로써 진단될 수 있다. 본 발명의 단백질 및 펩티드를 제조하는 방법은 상기에 기술되어 있다.

암을 진단하기 위한 방법은 항-TTLL4 항체의 양 및 상기 기술된 것과 같은 상응하는 대조군 시료에서의 양 사이의 차이를 결정함으로써 수행될 수 있다. 개체의 세포 또는 조직이 유전자의 발현 생산물(TTLL4)에 대한 항체를 포함하고, 항-TTLL4 항체의 양이 정상 대조군에서의 것과 비교하여 판정 기준치(cut-off) 이상으로 결정되면, 그 개체는 암을 앓고 있는 것으로 추정된다.

한 실시예에서, 본 발명의 진단용 키트는 본 발명의 펩티드 및 그것에 결합하는 HLA 분자를 포함할 수 있다. 항원성 펩티드 및 HLA 분자를 사용하여 항원 특이적 CTL을 탐지하는 방법은 이미 수립되었다(예를 들면, Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6). 따라서, 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체는 종양 항원 특이적 CTL을 탐지하기 위한 탐지 방법에 적용될 수 있고, 그러므로 조기 탐지(earlier detection), 암의 재발 및/또는 전이가 가능하다. 또한, 이것은 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 약학물(pharmaceuticals)과 함께 적용할 수 있는 개체의 선택, 또는 약학물의 치료 효과의 검사에 적용될 수 있다.

특히, 알려진 방법에 따르면(예를 들면 Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6 참조), 방사선 표지된 HLA 분자 및 본 발명의 펩티드의 테트라머와 같은 올리고머 복합체가 준비될 수 있다. 복합체를 사용하여, 예를 들면, 암으로 고통받는 것으로 의심되는 개체 유래 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes)에서 항원-펩티드 특이적 CTL을 정량함으로써 상기 진단이 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 여기에서 기술된 펩티드 에피토프를 이용함으로서 개체의 면역 반응을 평가하기 위한 방법 또는 진단제를 제공한다. 어떤 실시예에서, 여기서 기술된 HLA-A24 또는 HLA-A24 제한된 펩티드는 개체에서 면역 반응을 평가하거나 또는 예측하기 위한 시약으로서 사용된다. 평가되는 면역 반응은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역원(immunogen)을 면역능력이 있는 세포(immunocompetent cell)을 접촉시킴으로써 유도된다. 바람직한 실시예에서, 면역 반응을 평가하는 면역능력이(immunocompetent) 있는 세포는 말초 혈액(peripheral blood), 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte, PBL) 및 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 중에서 선택될 수 있다. 상기 면역능력이 있는 세포를 수집하거나 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 어떤 실시예에서, 어떤 제제는 펩티드 에피토프와 결합하고 그것을 인지하는 항원 특이적 CTL의 형성을 야기하는 시약(reagent)으로 적용될 수 있다. 펩티드 시약은 면역원으로서 사용되지 않아도 된다. 상기 분석을 위해 사용된 검사 시스템은 테트라머(tetramer), 세포내 림포카인(lynphokine) 및 인터페론(interferon) 분비 검사법을 위한 염색, 또는 ELISPOT과 같은 상대적으로 최근의 기술 발달을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 펩티드 시약과 접촉하는 면역기능이 있는 세포는 수지상 세포를 포함한 항원-제시 세포일 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 펩티드는 종양 세포 항원 또는 면역원에 노출되어 항원-특이적 CTL의 존재를 위해 말초 혈액 단핵구를 검사하기 위한 테트라머 염색 검사법에서 사용될 수 있다. HLA 테트라머 복합체는 말초 혈액 단핵구의 시료에서 직접적으로 항원 특이적 CTL을 가시화 하고(Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; 및 Altman et al., Science 174: 94-96. 1996 참조), 항원-특이적 CTL 집단의 빈도를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 사용한 테트라머 시약은 하기에 기술된 것과 같이 생산될 수 있다.

HLA 분자에 결합하는 펩티드를 상응하는 HLA 중쇄 및 베타 2-마이크로글로불린의 존재하에 3분자 복합체를 생산하기 위하여 다시 접는다(refolding). 상기 복합체에서, 중쇄의 카복실 말단을 그 전에 단백질로 조작되었던 부위에서 바이오틴화한다. 그 후, 상기 3분자 복합체 및 스트렙토아비딘(streptoavidin)으로 구성된 테트라머를 형성하기 위하여 스트렙토아비딘을 복합체에 첨가한다. 형광으로 표지된 스트렙토아비딘으로써, 상기 테트라머는 항원-특이적 세포를 염색시키는데 사용될 수 있다. 그 후 상기 세포는, 예를 들면 세포 유동 분석(flow cytometry)에 의해서 동정된다. 상기 분석은 진단용 또는 예후의 목적을 위해 사용될 수 있다. 상기 과정에 의해 동정된 세포는 또한 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 면역 회상 반응(immune recall response)을 평가하기 위해 본 발명의 펩티드를 포함하는 시약을 제공한다(Bertoni et aL., J. Clin. Invest. 100: 503-513.1997 및 Penna et aL., J. Exp. Med. 174: 1565-1570. 1991 참조). 예를 들면, 치료될 암을 앓고 있는 개개인으로부터의 환자 PBMC 시료는 특이적 펩티드를 사용하여 항원-특이적 CTL의 존재를 위해 분석된다. 단핵구를 포함하는 혈액 시료는 PBMC를 배양하고 상기 세포를 본 발명의 펩티드로 자극시킴으로써 검사된다. 적절한 배양 기간 후에, 상기 증식된 세포 집단에서 예를 들면 CTL 활성을 분석한다.

상기 펩티드는 백신의 효험(efficacy)를 평가하기 위해 시약으로서 사용될 수 있다. 면역원으로 예방접종된 환자로부터 수득한 PBMC를, 예를 들면 상기 방법 중 하나를 사용하여 분석할 수 있다. 환자는 분석을 위해 선택되었다는 점에서, 환자는 HLA 종류가 있고, 대립 유전자 특이적 분자를 인지하는 펩티드 에피토프 시약이 있다. 백신의 면역원성은 PBMC 시료에서 에피토프-특이적 CTL의 존재에 의해 나타날 수 있다. 본 발명의 펩티드는 당업계에서 잘 알려진 기술을 사용함으로써 항체를 만드는데 유용하고(예를 들면 CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY. Wiley/Greene. NY; 및 Antibodies a laboratory Manual. Harlow and Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989를 참조), 이것은 암을 진단하고 모니터하는 시약으로서 유용할 수 있다. 상기 항체는 HLA 분자의 맥락에서, 펩티드를 인지하는 것, 즉 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 항체일 수도 있다.

본 발명의 펩티드 및 조성물은 많은 첨가적 용도를 갖고, 그 일부는 여기서 기술된다. 예를 들면, 본 발명은 TTLL4 면역원성 폴리펩티드의 발현에 의해 특징화되는 질환을 진단하고 탐지하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 시료에서 TTLL4 HLA 결합 펩티드, 또는 TTLL4 HLA 결합 펩티드 및 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현을 결정하는 것과 관련이 있다. 펩티드 또는 펩티드 및 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현은 상기 펩티드의 결합 파트너로 검사함으로써 결정되거나 탐지될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 펩티드 또는 복합체를 위한 결합 파트너는 펩티드에 특이적으로 결합하고 인지하는 항체이다. 생물학적 시료, 예를 들면 종양 조직검사(biopsy)에서 TTLL4의 발현은 TTLL4 프라이머를 사용한 일반적인 PCR 증폭 프로토콜에 의하여 검사될 수 있다. 종양 발현의 예는 여기서 나타나고 나아가 TTLL4에 대한 예시적인 조건 및 프라이머의 공개는 WO2003/27322에서 발견될 수 있다.

바람직하게, 상기 진단 방법은 생물학적 시료에서 TTLL4 결합 펩티드의 존재를 탐지하기 위하여 TTLL4 HLA 결합 펩티드를 위한 특이적 제제와 함께 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 것과 관련이 있다. 여기서 사용된 것과 같이, "접촉"은 물질 및 생물학적 시료에 존재하는 TTLL4 HLA 결합 펩티드 사이에서 특이적 상호결합이 생성될 수 있도록 시약과 충분히 근접한 곳과 예를 들면 농축, 온도, 시간, 이온화 강도와 같은 적절한 조건에 생물학적 시료를 놓아두는 것을 의미한다. 일반적으로, 분자 및 상기 분자의 생물학적 시료에 있는 인지체(cognate)(예를 들면, 단백질 및 상기 단백질 인지체 수용체, 항체 및 상기 항체 인지체 단백질, 핵산 및 상기 핵산에 상보적 서열 인지체) 사이의 특이적 상호결합을 촉진하기 위해 물질을 생물학적 시료과 접촉시키는 조건은 당업자에게 자명하다. 분자 및 그것의 인지체 사이의 특이적 상호결합을 촉진시키기 위한 예시적인 조건은 Low et al.에 의해 발행된 U.S. Patent No. 5,108,921에 기술되어 있다.

본 발명의 진단 방법은 생체 내 및 시험관 내 중 하나 또는 그 모두에서 수행될 수 있다. 따라서, 생물학적 시료는 본 발명에서 생체 내 또는 시험관 내에 위치할 수 있다. 예를 들면, 생물학적 시료는 생체 내에서 조직일 수 있고, TTLL4 면역원성 폴리펩티드에 특이적인 물질은 그 조직에서 상기 분자의 존재를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 생물학적 시료는 시험관 내에서 수집되거나 또는 분리될 수 있다(예를 들면, 혈액 시료, 종양 조직검사, 조직 추출물). 특별히 선호되는 예에서, 생물학적 시료는 세포 포함 시료일 수 있고, 보다 바람직하게는 진단되거나 치료되는 개체로부터 수집된 종양 세포를 포함하는 시료일 수 있다.

또는, 상기 진단은 형광으로 표지된 HLA 다중결합 복합체를 사용한 염색을 통해 항원-특이적 T 세포의 직접적인 정량을 허용하는 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, Altman. J. D. et al., 1996, Science 274: 94; Altman. J. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330;). 세포내 림포카인 염색 및 인터페론-감마(interferon-gamma) 분비 검사법 또는 ELISPOT이 제공된다. 테트라머 염색, 세포내 림포카인 염색 및 ELISPOT 검사법 모두는 일반적인 검사에 비해 최소한 10배 이상의 민감하다(Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 314;). 펜타머(pentamer)(예를 들면 US 2004-209295A), 덱스트라머(dextramer)(예를 들면, WO 02/072631), 및 스트렙타머[예를 들면 Nature Medicine 6. 631-637(2002)] 또한 사용될 수 있다.

예를 들면, 어떤 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 중 최소 하나의 TTLL4가 투여된 개체의 면역학적 반응을 진단하거나 평가하는, 하기의 단계를 포함하는 방법 제공한다:

(a) 면역원(immunogen)에 대해 특이적 CTL의 유도를 위한 적합한 조건하에 면역원과 면역능력이 있는 세포를 접촉하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 유도된 CTL 유도 수준을 탐지하거나 결정하는 단계;및

(c) CTL 유도 수준이 있는 개체의 면역반응을 연관시키는(correlating) 단계.

본 발명에서, 상기 면역원은 서열번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73의 아미노산 서열, 이러한 아미노산 서열을 가지는 펩티드, 및 1, 2 또는 그 이상의 아미노산 치환으로 변형된 이러한 아미노산 서열을 가지는 펩티드 중에서 선택되는 TTLL4 펩티드 중 최소 하나이다. 그 동안에 면역원 특이적 CTL의 유도 적합 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 면역능력이 있는 세포는 면역원 특이적 CTL을 유도하기 위해 면역원의 존재 하에 배양될 수 있다. 면역원 특이적 CTL을 유도하기 위해, 어떤 자극 인자(stimulating factors)가 상기 세포 배양에 첨가될 수 있다. 예를 들면, IL-2가 CTL 유도를 위한 바람직한 자극 인자이다.

어떤 실시예예서, 펩티드 암 치료로 치료되는 개체의 면역학적 반응을 모니터하거나 평가하는 단계는 치료 전, 동안 및/또는 후에 수행될 수 있다. 일반적으로, 암 치료의 프로토콜(protocol) 동안, 면역성 펩티드는 반복적으로 치료되는 개체에 투여된다. 예를 들면, 면역성 펩티드는 3-10 주 동안 매 주 투여될 수 있다. 따라서, 개체의 면역학적 반은은 암 치료 프로토콜 동안 평가되거나 모니터될 수 있다. 또는 암치료에 대한 면역학적 반응의 평가 또는 모니터링(monitoring)의 단계는 치료 프로토콜의 완료일 수 있다.

본 발명에 따라, 대조군에 비해 면역원 특이적 CTL의 증가된 유도는 투여된 면역원에 대한 면역학적으로 평가되거나 진단된 개체를 나타낸다. 상기 면역학적 반응을 평가하기 위한 적합한 대조군은, 예를들면, 면역능력이 있는 세포가 펩티드 없이 또는 어떤 TTLL4 펩티드(예를 들면, 무작위 아미노산 서열) 외에 아미노산 서열을 가지는 대조군 펩티드와 접촉되었을 때 CTL 유도 수준을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 개체에 투여된 각 면역원 사이의 면역 반응을 비교함으로써 상기 개체의 면역학적 반응은 서열 특이적 면에서 평가된다. 특히, 일부 유형의 TTLL4 펩티드의 혼합물이 개체에 투여될지라도 , 면역 반응은 상기 펩티드에 따라 다를 수 있다. 그런 경우에는 각 펩티드 사이의 면역 반응의 비교에 의해 더 높은 반응을 보이는 개체에 대한 펩티드가 동정될 수 있다.

XII. 항체

본 발명은 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 특이적으로 본 발명의 펩티드와 결합하고 본 발명의 펩티드가 아닌 것에 결합하지 않을 것이다(또는 약하게 결합). 또는, 항체는 본 발명의 펩티드 뿐만 아니라 그것의 상동체와 결합한다. 본 발명의 펩티드에 대한 항체는 암 진단 또는 예후 검사법, 이미지화 방법론(imaging methodology)에서 사용될 수 있다. 유사하게, 상기 항체는 암 환자에서 발현되거나 또는 과발현되는 정도의 다른 암을 치료, 진단 및/또는 예후에서 사용될 수 있다. 또한, 세포 내 발현되는 항체(예를 들면, 단일 사슬 항체)는 TTLL4의 발현이 관련된 암, 예를 들면 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 암에서 치료상으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 TTLL4 단백질(서열번호 80) 또는 이의 단편의 탐지 및/또는 정량을 위한 다양한 면역학적 분석을 제공한다. 상기 검사법은 TTLL4 단백질 또는 그것의 단편과 결합하고 인지할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항-TTLL4 항체를 적절하게 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, TTLL4 폴리펩티드와 항-TTLL4 항체의 결합은 바람직하게 서열 번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 폴레펩티드를 인지한다. 항체의 결합 특이성은 억제 검사(inhibition test)를 사용하여 확인될 수 있다. 즉, 서열 번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73의 아미노산 서열을 포함하는 어떤 단편의 폴리펩티드의 존재하에서 분석될 항체 및 TTLL4 폴리펩티드 전장 사이의 결합이 억제될 때, 상기 항체는 그 단편에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다. 본 발명의 맥락에서, 상기 면역학적 검사법은 당업계에 잘 알려진 다양한 면역학적 검사법 종류 내에서 수행되고, 방사선면역검사법(radioimmunoassay), 면역-크로마토그래프 기술(immuno-chromatograph technique), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), ELIFA(enzyme-linked immunofluorescent assay), 및 그와 같은 것의 다양한 유형을 포함하지만 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명의 관련된 면역학적이지만 비항체 검사법은 T 세포 면역원성 검사법(억제성 또는 자극성)뿐만 아니라 MHC(major histocompatibility complex) 결합 검사법을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 TTLL4를 발현하는 암을 탐지할 수 있는 면역학적 이미지 방법을 고려하고, 예는 본 발명의 표지된 항체를 사용한 방사선 동위 원소 이미지 방법(radioscintigraphic imaging method)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 검사법은 TTLL4를 발현하는 암, 예를 들면 방광암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병, 결장 및 직장 암, 식도암, 간암, 림프종, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 연조직 종양 및 골육종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 암의 탐지, 모니터, 및 예후에 임상적으로 유용하다.

본 발명은 본 발명의 펩티드와 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 단일클론 또는 다중클론 항체와 같은 어떠한 형태로도 사용될 수 있고, 또한 본 발명의 펩티드로 면역화된 동물, 예를 들면 토끼에 의해 수득된 항혈청을 포함하고, 모든 종류의 다중클론 및 단일클론 항체, 인간항체, 및 유전적 재조합에 의해 생성된 인간화된 항체를 포함한다.

항체를 얻기 위해 항원으로서 사용된 본 발명의 펩티드는 어떠한 동물의 종류에서도 유래될 수 있으나, 바람직하게는 인간, 마우스(mouse), 또는 랫(rat), 보다 바람직하게는 인간과 같은 포유류로부터 유래된 것이다. 인간-유래 펩티드는 여기서 공개된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 수득될 수 있다.

본 발명에 따라, 면역원성 항원으로서 사용되는 상기 펩티드는 완전한 단백질일 수도 있고 상기 단백질의 부분적 펩티드일 수도 있다. 예를 들면, 부분적 펩티드는 본 발명 펩티드의 아미노 (N)-말단 또는 카복시 (C)-말단 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 항체는 TTLL4 펩티드의 전장 또는 단편에 반응하는 단백질로 정의된다. 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 항체는 서열 번호 1, 3 내지 37 및 38 내지 73으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 TTLL4의 단편 펩티드를 인지할 수 있다. 올리고펩티드를 합성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 합성 후에, 펩티드는 면역원으로서 사용되기 전에 선택적으로 정제될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 올리고펩티드(예를 들면 9 또는 10mer)는 면역원성을 증진시키기 위해 담체와 결합되거나 연결될 수 있다. KLH(Keyhole-Limpet hemocyanin)은 담체로서 잘 알려져 있다. KLH와 펩티드를 결합시키는 방법도 당업계에 잘 알려져 있다.

또는, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자 또는 그것의 단편은 알려진 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 그 후 여기서 기술되는 것과 같이 숙주 세포에 형질도입시키는데 사용된다. 원하는 펩티드 또는 그것의 단편은 어떤 표준 방법에 의해 숙주 세포의 안 또는 밖으로부터 회복될 수 있고, 그 후에 항원으로서 사용될 수 있다. 또는, 펩티드를 발현하는 전체 세포 또는 그들의 용해물(lysate) 또는 화학적으로 합성된 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있다.

어떤 포유류 동물은 항원으로 면역화될 수 있지만, 세포 융합에 사용된 모 세포(parental cell)와 양립성(compatibility)이 있는 것이 바람직하다. 일반적으로, 설치류(Rodentia), 토끼류(Lagomorpha) 또는 영장류(Primates)의 동물이 사용될 수 있다. 설치류의 동물은 예를 들면 마우스, 랫 및 햄스터(hamster)를 포함한다. 토끼류는 예를 들면 토끼(rabbit)을 포함한다. 영장류는 예를 들면 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 망토개코원숭이(sacred baboon) 및 침팬지와 같은 토끼목[Catarrhini(늙은 세계 원숭이, old world monkey)]의 원숭이를 포함한다.

항원으로 동물을 면역화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원의 복강내(intraperitoneal) 주입 또는 피하(subcutaneous) 주입이 포유류의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로, 항원은 PBS(phosphate buffered saline), 생리적 살린(physiological saline) 등의 적절한 양에서 희석되거나 서스펜션될 수 있다. 바람직하다면, 상기 항원 서스펜션은 적절한 양의 프로인트 완전 보강제(Freund's complete adjuvant)와 같은 표준 보강제와 혼합되고, 유화액으로 만들어진 후 포유류 동물에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 그 후매 4 내지 21일마다 프로인트 완전 보강제의 적절한 양과 한께 혼합한 항체를 여러번 투여하는 것이다. 적절한 담체(carrier)도 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역화 후, 혈청은 원하는 항체의 양의 증가를 위한 표준 방법에 의해 조사될 수 있다.

본 발명의 펩티드에 대한 다중 클론 항체는 혈청에서 바라는 항체의 증가를 위해 시험되는 면역화된 포유류의 혈액을 수거함으로써, 그리고 어떠한 보편적인 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리시킴으로써 준비될 수 있다. 다중클론 항체는 다중클론 항체를 포함하는 혈청을 포함할 뿐만 아니라 상기 다중클론 항체를 포함한 분획물을 혈청으로부터 분리할 수 있다. 면역글로불린(immunoglobulin) G 또는 M은 오직 본 발명의 펩티드를 인지하는 분획물로부터 예를 들면 본 발명의 펩티드와 연결된 친화성 컬럼을 사용하여, 그리고 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 사용하여 상기 분획물을 정제하는 것에 의해 준비될 수 있다.

단일클론 항체를 준비하기 위하여, 항원으로 면역화시킨 포유류로부터 면역세포를 수거하고, 그 면역세포에서 상기 기술된 것과 같이 혈청에서 바라는 항체의 증가된 수준을 검사하고, 세포 융합을 한다. 바람직하게, 세포 융합을 위해 사용되는 면역 세포는 비장으로부터 수득된다. 바람직한 상기 면역세포와 함께 융합되는 다른 모 세포는 포유류의 골수 세포(myeloma cell), 보다 바람직하게는 약물에 의해 융합된 세포의 선택을 위해 획득한 특성을 갖는 골수 세포를 포함한다.

상기 면역 세포 및 골수 세포는 알려진 방법, 예를 들면 Milstein et al.[Galfre and Milstein, Method Enzymol 73: 3-26(1981)]의 방법에 따라 융합될 수 있다.

상기 세포 융합에 의해 수득된 결과인 하이브리도마(hybridoma)는 HAT 배지[히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지]와 같은 표준 선택 배지에 그들을 배양함으로써 선택될 수 있다. 상기 세포 배양은 일반적으로 HAT 배지에서 몇 일 내지 몇 주동안 지속되는데, 이는 원하는 하이브리도마를 제외하고 모든 다른 세포(non-fused cell)을 사멸시키기 위해 충분한 시간이다. 그 후, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포을 복제(clone)시키고 스크린하기 위해 표준 제한 희석(standard limiting dilution)을 수행한다.

하이브리도마를 제조하기 위해 비인간 동물을 항원으로 면역화시킨 상기 방법 뿐만 아니라, EB 바이러스에 의해 감염된 인간과 같은 인간 림프구는 펩티드, 펩티드를 발현하는 세포 또는 그들의 용해물을 사용하여 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 그 후, 상기 펩티드에 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위해, 면역화된 림프구를 U266과 같은 무한으로 분열할 수 있는 인간 유래 골수 세포와 융합한다(Unexamined Published Japanese Patent Application No. Sho 63-17688).

그 후 상기 수득된 하이브리도마를 마우스(mouse)의 복강(abdominal cavity)로 이식하고 그 복수를 추출한다. 상기 수득한 단일클론 항체를, 예를 들면 암모늄 황산 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 펩티드가 연결된 친화성 컬럼과 같은 방법에 의해 정제할 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드의 정제 및 탐지에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드의 작용제 및 길항제에 대한 후보로서 사용될 수도 있다.

또는, 항체를 생산하는 면역화된 림프구와 같은 면역 세포는 종양유전자(oncogene)에 의해 무한증식(immortalization)될 수 있고 단일클론 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

그러므로 수득된 단일클론 항체는 유전자 조작 기술을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다[예를 들면 MacMillan Publishers LTD의해 영국에서 출간된 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies(1990) 참조]. 예를 들면, 항체를 암호화하는 DNA는 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은 면역 세포로부터 클론될 수 있고, 적절한 벡터로 삽입될 수 있으며, 재조합 항체를 만들기 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 기술된 재조합 항체를 제공한다.

또한, 본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 본 발명 펩티드와 결합하는 한 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fc(scFv)일 수 있고, 여기서 H 및 L 사슬로부터의 Fv 단편은 적절한 링커(linker)에 의해 연결된다[Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83(1988)]. 보다 구체적으로, 항체 단편은 파페인(papain) 또는 펩신(pepsin)과 같은 효소와 함께 항체를 처리함으로써 생성될 수 있다. 또는, 상기 항체 단편을 암호화하는 유전자는 제조될 수 있고, 발현 벡터로 삽입될 수 있으며 적절한 숙주 세포내에서 발현될 수 있다[예를 들면, Co et al., J Immunol 152: 2968-76(1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96(1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515(1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63(1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9(1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7(1991) 참조].

항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG)와 같은 다양한 분자와 연결됨으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 상기 변형된 항체를 제공한다. 상기 변형된 항체는 화학적으로 변형된 항체로부터 얻을 수 있다. 상기 변형 방법은 당업계에서 보편적이다.

또는, 본 발명의 항체는 비인간 항체로부터 유래된 가변 부위(variable region) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 부위(constant region) 사이의 키메라 항체로서, 또는 비인간 항체로부터 유래된 CDR(complementarity determining region), FR(framework region) 및 인간항체로부터 유래된 불변 부위를 포함하는 인간화된 항체로서 수득될 수 있다. 상기 항체는 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 인간화(humanization)이 수행될 수 있다[예를 들면, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988) 참조]. 따라서, 상기 인간화된 항체는 키메라 항체이고, 여기서 온전한 인간 가변 도메인 보다 상당히 적은 도메인은 비인간 종류로부터 그에 상응하는 서열에 의해 치환되었다.

전체적으로 인간 프레임워크 및 불변 부위뿐만 아니라 인간 가변 부위로 구성된 인간 항체 또한 사용될 수 있다. 상기 항체는 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들면 시험관 내 방법(in vitro method)은 인간 항체 단편이 제시되는 박테리오파지의 재조합 라이브러리[예를 들면, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381(1991)]의 사용과 관련이 있다. 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 위치(loci)를 형질전환 동물, 예를 들면 내재성 면역 글로불린 유전자(endogenous immunoglobulin gene)이 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스로 도입시킴으로써 만들어질 수 있다. 상기 접근은 예를 들면 U.S. Patent Nos. 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016에 기술되어 있다.

상기와 같이 수득한 항체는 동종성(homogeneity)으로 정제될 수 있다. 예를 들면 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에서 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 적절하게 선택되고 혼합된 컬럼 크로마토그래피의 사용, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 여과, 울트라여과, 염-외 희석(salting-out dialysis), SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 등점적 전기영동(isoelectric focusing)에 의해 상기 항체는 분리(sepseration) 및 분리(isolation)될 수 있으나[Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)], 이에 한정되지는 않는다. 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로서 사용될 수 있다. 사용되는 예시적인 단백질 A 컬럼은 예를 들면 Hyper D, POROS 및 Sepharose F.F.(Pharmacia)를 포함한다.

친화성을 제외한 크로마토그래피의 예는, 예를 들면 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 겔 여과(gel filtration), 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 및 그와 같은 것[Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)]을 포함한다. HPLC 및 FPLC와 같은 크로마토그래피 절차는 액체상 크로마토그래피(liquid-phase chromatography)에 의해 수행될 수 있다.

예를 들면, 흡수도의 측정, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), EIA(enzyme immunoassay), RIA(radioimmunoassay) 및/또는 면역형광이 본 발명 항체의 항원 결합 활성(antigen binding activity)을 측정하기 위해 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체를 플레이트에 고정시키고, 본 발명의 펩티드를 플레이트에 첨가한 후, 항체를 생산하는 세포의 배양 상층액 또는 정제된 항체와 같은 원하는 항체를 포함하는 시료를 첨가한다. 그 후, 1차 항체를 인지하고 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 효소로 표지된 2차 항체를 적용하고, 상기 플레이트를 배양한다. 그 다음, 씻어준 후, p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 효소 기질을 플레이트에 적용시키고, 상기 시료의 항원 결합 활성을 평가하기 위하여 그 흡수도를 측정한다. C 말단 또는 N 말단 단편과 같은 펩티드의 단편은 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 항원으로서 사용될 수 있다. 비아코어[BIAcore(Pharmacia)]는 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.

상기 방법은 본 발명의 항체를 본 발명의 펩티드를 포함한다고 추정되는 시료에 노출시킴으로써 본 발명의 펩티드를 탐지 또는 측정하게 해주고 상기 항체 및 상기 펩티드에 의해 형성된 면역 복합체를 탐지 또는 측정하게 해준다.

본 발명에 따른 펩티드를 탐지 또는 측정하는 방법은 특이적으로 펩티드를 탐지 또는 특정할 수 있기 때문에, 이 방법은 상기 펩티드를 사용하는 다양한 실험에서 유용할 것이다.

XIII. 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 도입시키는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터는 뉴클레오티드, 특히 숙주세포에서 본 발명의 DNA를 보유하기에 유용할 수 있고, 본 발명의 펩티드를 발현시키기에 또는 유전자 치료를 위한 본 발명의 뉴클레오티드를 투여하기에 유용할 것이다.

E.coli가 숙주 세포이고 벡터가 E.coli 내에서(예를 들면, JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1Blue) 대량으로 증폭되고 생산될 때, 상기 벡터는 E.coli 내에서 증폭되기 위해 "ori" 및 형질전환된 E.coli를 선별하기 위한 유전자 마커[예를 들면 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 그와 같은 것과 같은 약물에 의해 선별되는 약물 내성 유전자]을 가져야 한다. 예를 들면 M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등이 사용될 수 있다. 또한, pGEM-T, pDIRECT 및 pT7 또한 상기 기술된 cDNA 뿐만 아니라 벡터를 서브클로닝하고 추출하기 위해 사용될 수 있다. 벡터가 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 사용될 때, 발현 벡터는 특히 유용하다. 예를 들면, E.coli에서 발현되는 발현 벡터는 E.coli 내에서 증폭되기 위하여 상기 특징을 가져야 한다. JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1 Blue와 같은 E.coli를 숙주 세포로서 사용할 때, 벡터는 E.coli내에서 원하는 유전자를 효율적으로 발현시키는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터[Ward et al., Nature 341: 544-6(1989); FASEB J 6: 2422-7(1992)], araB 프로모터[Better et al., Science 240: 1041-3(1988)], T7 프로모터 또는 그와 같은 것을 가져야 한다. 상기 면에서, 예를 들면 pGEX-5X-1(Pharmacia), "QIAexpress system"(Qiagen), pEGFP 및 pET(이 경우에는, 숙주 세포는 우선적으로 T7 RNA 중합효소를 발현하는 BL21이다)가 상기 벡터들 대신 사용될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 펩티드 분비를 위한 신호 서열(signal sequence)을 포함할 수 있다. E. coli의 주변 세포질(periplasm)로 분비되도록 펩티드에 지시하는 신호 서열의 예는 pelB 신호 서열[Lei et al., J Bacteriol 169: 4379(1987)]이 있다. 벡터를 표적 숙주 세포로 도입시키기 위한 수단은 예를 들면 칼슘 클로라이드(calcium chloride) 방법 및 전기침공(electroporation) 방법을 포함한다.

E.coli 뿐만 아니라, 예를 들면, 포유류로부터 유래된 발현 벡터[예를 들면, pcDNA3(Invitrogen) 및 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17): 5322(1990)), pEF, pCDM8], 곤충 세포로부터 유래된 발현 벡터[예를 들면, "Bac-to-BAC baculovirus expression system"(GIBCO BRL), pBacPAK8], 식물로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pMH1, pMH2), 동물 바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pZIpneo), 효모로부터 유래된 발현 벡터[예를 들면, "Pichia Expression Kit"(Invitrogen), pNV11, SP-Q01] 및 바실러스 섭틸릭스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)가 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

CHO, COS 또는 NIH3T3와 같은 동물 세포에서 벡터를 발현시키기 위해서, 벡터는 상기 세포 내에서 발현에 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터[Mulligan et al., Nature 277: 108(1979)], MMLV-LTR 프로모터, EF1 알파 프로모터[Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322(1990)], CMV 프로모터 및 그와 같은 것를 가져야 하고, 바람직하게 형질전환체를 선별하기 위한 유전자 마커[예를 들면, 약물(neomycin, G418)에 의해 선별되는 약물 내성 유전자]를 가져야 한다. 상기 특징을 가진 알려진 벡터의 예는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13를 포함한다.

비록 본 명세서에 서술된 상기 방법 및 재료와 비슷한 또는 동등한 것이 본 발명의 실행(practics) 또는 테스팅(testing)을 위해 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 서술되었다. 본 명세서에 언급된 모든 출판물(publication), 특허 출원(patent application), 특허(patent), 및 다른 참조문헌은 그들의 전체는 참조로 포함된다. 충돌(conflict)의 경우에 있어서, 정의를 포함하는 발명의 명세서는 통제(control)될 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 오직 예시일뿐, 제한하려는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

재료 및 방법

세포주

HLA-A*2402-양성 B-림프아형 세포주(lymphoblastoid cell line)인 TISI는 IHWG Cell and Gene Bank(Seattle, WA)로부터 구입하였다. 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주(African green monkey kidney cell line)인 COS7는 ATCC로부터 구입하였다.

TTLL4 유래 펩티드의 후보 선별

HLA-A*2402 분자에 결합하는 TTLL4 유래 9-머(9-mer) 및 10-머(10-mer) 펩티드를 결합은 "NetMHC 3.0" 결합 예상 서버(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.(Tissue Antigens., 62:378-84, 2003), Nielsen et al.(Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004))를 이용하여 예측하였다. 이러한 펩티드들은 표준 고체상 합성 방법(standard solid phase synthesis method)에 따라 BioSynthesis(Lewisville, Texas)로부터 합성되었고, 역상 고속 액체 크로마토그래피(reversed phase high performance liquid chromatography, HPLC)로 정제되었다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 확인(identity)은 각각 분석용 HPLC 및 질량분석(mass spectrometry analysis)을 통하여 각각 측정하였다. 펩티드를 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 20mg/ml로 용해하고, -80℃에서 저장하였다.

시험관 내에서의 CTL 유도

단핵구 유래 수지상세포(dendritic cell, DC)를 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC)로 사용하여 인간 백혈구 항체(human leukocyte antigen, HLA)에 제시된 펩티드에 대한 CTL 반응을 유도하였다. DC를(Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14): 4112-8)에 기술된 것과 같이 생산하였다. 특히, 정상 지원자(HLA-A*2402 양성)로부터 피콜-플라크(Ficoll-Plaque; Pharmacia) 용액에 의해 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 플라스틱 조직 배양 접시(Becton Dickinson)에 부착하는 것을 이용하여 분리하여 그들을 단핵구 분획물로 수득하였다. 단핵구가 많은 집단을 2% 열-불활성화 자신의 혈청(heat-inactivated autologous serum; AS)를 포함한 AIM-V 배지(Invitrogen)에 과립대식세포집락자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, R&D System)의 1000 U/ml 및 IL(interleukin)-4(R&D System) 의 1000 U/ml의 존재하에 배양하였다. 배양 7일 후, 3시간 동안 37℃에서 AIM-V 배지안에서, 베타 2-마이크로글로볼린(beta 2-microglobulin) 3 micro-g/ml의 존재하에서 사이토카인-유도 DC에 합성된 펩티드 각각의 20 micro-g/ml를 부과하였다. 생성된 세포는 그들의 표면에 CD80, CD83, CD86 및 HLA 종류 II와 같은 DC-관련 분자를 발현하는 것으로 나타났다(데이터는 보여지지 않음). 상기 펩티드-부과 DC는 X-방사선 처리(20 Gy)에 의하여 비활성화되었고 자신의 CD8+ T 세포와 1:20 비율로 혼합되어, CD8 양성 분리 키트(CD8 positive Isolation Kit; Dynal)를 사용한 양성 선택에 의해 수득되었다. 상기 배양은 48-웰 플레이트(Corning)에서 수행되었고; 각 웰은 AIM-V/2% AS 배지 0.5ml에 1.5x10⁴ 펩티드-부과 DC, 3x10⁵ CD8+ T 세포 및 IL-7(R&D system)의 10ng/ml을 포함하였다. 3일 후, 상기 배양에 IL-2(CHIRON)을 첨가하여 최종 농도가 20U/ml이 되도록 하였다. 7일 째 및 14일 째, 상기 T 세포를 나아가 자신의 펩티트-부과 DC로 자극시켰다. 상기 DC를 상기 기술된 동일한 방법으로 각 시간에서 준비되었다. 21일 째 펩티드 자극 3번 째 후 CTL은 펩티드-부가된(pulsed) TISI 세포에 대하여 검사되었다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

CTL 증식 과정

Riddell et al.에 의해 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 CTL을 배양하에 증식시켰다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). 40ng/ml의 항 CD3 단일 클론 항체(Pharmingen)의 존재 하에서, 미토마이신 C(mitomycin C)에 의해 불활성화된 두 종류의 인간 B 림프아세포주와 함께 총 5x10⁴ CTL을 AIM-V/5% AS 배지의 25ml에 부유하였다. 배양 시작한 뒤 1일 후, IL-2의 120IU/ml를 상기 배양에 첨가하였다. 5, 8 및 11일째에 IL-2의 30 IU/ml를 포함하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지를 상기 배양에 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

CTL 클론의 수립

96 웰 둥근 밑면 마이크로 타이터 플레이트(round-bottomed micro titer plate, Nalge Nunc International)에 한 웰당 0.3, 1 및 3 CTL이 되도록 희석하였다. CTL을 1×10⁴세포/웰(well)의 두 종류의 인간 B 림프아구양 세포주, 30 ng/ml의 항-CD3 항체 및 IL-2의 125U/ml와 함께, 5%의 AS를 포함하는 AIM-M 배지의 총 150 micro-l/웰에서 배양하였다. 10일 후, IL-2의 최종농도가 125U/ml이 되도록 상기 배지에 IL-2의 50 micro-l/웰을 첨가하였다. 14일째에 CTL 활성을 시험하였고, 상기와 기술된 것과 동일한 방법을 이용하여 CTL 클론을 증식시켰다[Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8):498-506].

특이적인 CTL 활성

특이적인 CTL 활성을 조사하기 위하여, 인터페론-감마(interferon-gamma; IFN-γ) ELISPOT(enzyme-linked immunospot) 검사 및 IFN-감마 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. 구체적으로, 펩티드-부가 TISI(1×10⁴/웰)을 자극 세포(stimulator cell)로서 제조하였다. 반응 세포(responder cell)로서 48웰에 배양된 세포를 사용하였다. IFN-감마 ELISPOT 검사 및 IFN-감마 ELISA 검사를 제조사 과정에 따라서 수행하였다.

표적 유전자 및 HLA-A24 중 하나 또는 모두를 강제로 발현하는 세포주의 수립

표적 유전자 또는 HLA-A*2402의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 암호화하는 cDNA를 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 PCR-증폭 생산물은 벡터로 클로닝되었다. 제조사에서 제공하는 과정에 따라서 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)(Invitrogen)을 사용하여, 상기 플라스미드를 표적 유전자 및 HLA-A*2402-눌(null) 세포주, COS7으로 형질도입시켰다. 형질도입 2일 후에, 상기 형질도입된 세포를 versene(Invitrogen)을 사용하여 수거하였고, CTL 활성 검사를 위해 표적세포로서 사용되었다(5 X 10⁴세포/웰).

결과

TTLL4 유래 펩티드에 결합하는 HLA-A24의 예상

표 1a 및 1b는 HLA-A24에 강한 결합력을 갖는 TTLL4의 9머 또는 10머 펩티드를 나타낸다. 잠재적인 HLA-A24 결합력을 갖는 37 펩티드의 전체는 에피토프 펩티드의 결정을 위해 선택되고 시험되었다.

시작위치는 TTLL4의 N-말단으로부터 아미노산 잔기의 수를 나타낸다.

HLA -A*2402로 제한된 TTLL4 유래 예상된 펩티드로 CTL 유도

TTLL4 유래 상기 펩티드를 위한 CTL은 "재료 및 방법"에 기재된 프로토콜에 따라서 생산된다. 특이적 CTL 활성 펩티드는 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 결정하였다(도 1a-1). 이는 TTLL4-A24-9-750(서열번호 1)이 있는 #7번 웰(a), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6)가 있는 #8번 웰(b), TTLL4-A24-9-793(서열번호 11)이 있는 #8번 웰(c), TTLL4-A24-9-691(서열번호 12)이 있는 #5번 웰(d), TTLL4-A24-9-103(서열번호 16)이 있는 #1번 웰(e), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20)이 있는 #3번 웰(f), TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)이 있는 #3번 웰(g), TTLL4-A24-10-883(서열번호 22)이 있는 #8번 웰(h), TTLL4-A24-10-1186(서열번호 28)이 있는 #2번 웰(i), TTLL4-A24-10-1022(서열번호 29)가 있는 #3번 웰(j), TTLL4-A24-10-994(서열번호 32)가 있는 #1번 웰(k) 및 TTLL4-A24-10-891(서열번호 37)이 있는 #6번 웰(l)이 대조군 웰과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 나타내었다. 반면에, 상기 펩티드가 HLA-A*2402와 결합할 가능성을 가짐에도 불구하고, 표 1a 및 1b에 서 나타나는 다른 펩티드로 자극된 경우 특이적 CTL 활성은 나타나지 않았다. 음성 데이타의 전형적인 경우와 같이, TTLL4-A24-9-579(서열번호 2)(m)으로 자극된 CTL로부터 특이적 IFN-감마 생산은 나타나지 않았다. 결과와 같이, TTLL4 유래된 12개의 펩티드가 잠재적으로 CTL을 유도할 수 있는 펩티드로 스크리닝되었다.

CTL 세포주의 수립 및 TTLL4 유래 펩티드에 대한 클론(clone)

TTLL4-A24-9-750(서열번호 1)이 있는 #7번 웰(a), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6)가 있는 #8번 웰(b), TTLL4-A24-9-691(서열번호 12)이 있는 #5번 웰(c), TTLL4-A24-9-103(서열번호 16)이 있는 #1번 웰(d), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20)이 있는 #3번 웰(e), TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)이 있는 #3번 웰(f)에 있어서, IFN-감마 ELISPOT 분석으로 탐지된 특이적 CTL 활성을 나타냈던 세포를 증식하였고, CTL 세포주를 “재료 및 방법”부분에서 기재한 바와 같이 수립하였다. CTL 세포주의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 탐지하였다(도 2a 및 f). CTL은 펩티드를 부가하지 않은 표적 세포와 비교하여 상응하는 펩티드를 부가한 표적 세포에 대한 강력한 IFN-감마 생산을 나타낸다. 또한, CTL 클론은 “재료 및 방법”부분에서 기재한 바와 같이 CTL 세포주로부터 제한 희석하여 수립하였고, 펩티드 부가된(pulsed) 표적 세포에 대하여 CTL 클론으로부터 IFN-감마 생산을 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 탐지하였다. 강력한 IFN-감마 생산은 도 3에서 TTLL4-A24-9-750(서열번호 1)(a), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6)(b), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20)(c) 및 TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)(d)으로 자극된 CTL 클론으로부터 탐지하였다(도 3a 내지 d).

TTLL4 및 HLA-A*2402를 발현하는 표적세포에 대한 특이적 CTL 활성

각각의 펩티드에 대하여 형성된 상기 수립된 CTL 세포주 및 클론은 TTLL4 및 HLA-A*2402 분자를 발현하는 표적 세포를 인식하기 위한 능력이 조사되었다. 전장의 TTLL4 및 HLA-A*2402 유전자(TTLL4 및 HLA-A*2402 유전자를 발현하는 반응세포(responder cell)을 위한 특이적 모델) 모두가 형질주입된(transfected) COS7 세포주에 대하여 특이적 CTL 활성은 자극세포(stimulator cell)에 상응하는 펩티드에 의해서 형성된 CTL 세포주 및 클론을 사용하여 시험되었다. 전장의 TTLL4 또는 HLA-A*2402 중 하나로 형질감염된 COS7 세포주는 대조군으로 준비되었다. 도 4에서, TTLL4-A24-9-103(서열번호 16)(a)로 자극된 CTL 세포주 및 TTLL4-A24-10-103(서열번호 20)(b) 및 TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)(c)로 자극된 CTL 클론은 TTLL4 및 HLA-A*2402 모두를 발현하는 COS7 세포주에 대하여 잠재적인 CTL 활성을 나타내었다. 반면에, 대조군에 대한 유의적이고 특이적 CTL 활성은 탐지되지 않았다. 따라서, 상기 데이터는 TTLL4-A24-9-103(서열번호 16)(a), TTLL4-A-24-10-103(서열번호 20)(b) 및 TTLL4-A24-10-773(서열번호 21)(c)의 펩티드는 내생적으로(endogenously) 가공되고, HLA-A*2402 분자와 표적 세포에 제시되며, CTL에 의해 인식된다. 상기 결과는 TTLL4 유래된 이들 펩티드가 TTLL4 발현 종양을 갖는 환자의 치료를 위한 암백신(cancer vaccine)으로 적합할 것이다.

항원 펩티드의 상동성 분석

TTLL4-A24-9-750(서열번호 1), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6), TTLL4-A24-9-793(서열번호 11), TTLL4-A24-9-691(서열번호 12), TTLL4-A24-9-103(서열번호 16), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20), TTLL4-A24-10-773(서열번호 21), TTLL4-A24-10-883(서열번호 22), TTLL4-A24-10-1186(서열번호 28), TTLL4-A24-10-1022(서열번호 29), TTLL4-A24-10-994(서열번호 32) 및 TTLL4-A24-10-891(서열번호 37)로 자극된 CTL은 유의적인 특이적 CTL 활성을 나타낸다. 상기 결과는 TTLL4-A24-9-750(서열번호 1), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6), TTLL4-A24-9-793(서열번호 11), TTLL4-A24-9-691(서열번호 12), TTLL4-A24-9-103(서열번호 16), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20), TTLL4-A24-10-773(서열번호 21), TTLL4-A24-10-883(서열번호 22), TTLL4-A24-10-1186(서열번호 28), TTLL4-A24-10-1022(서열번호 29), TTLL4-A24-10-994(서열번호 32) 및 TTLL4-A24-10-891(서열번호 37)의 서열이 사람 면역 시스템(human immune system)을 민감하게 만드는 것으로 알려진 다른 분자로부터 유래된 펩티드와 상동성이 있다. 상기 가능성을 제외하기 위하여, 상동성 분석을 유의적인 상동성이 있는 서열을 나타내지 않는 BLAST 알고리즘(algorithm)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) 쿼리(queries)를 이용하여 이러한 펩티드 서열에 대하여 수행하였다. 상동성 분석의 결과 TTLL4-A24-9-750(서열번호 1), TTLL4-A24-9-79(서열번호 6), TTLL4-A24-9-793(서열번호 11), TTLL4-A24-9-691(서열번호 12), TTLL4-A24-9-103(서열번호 16), TTLL4-A24-10-103(서열번호 20), TTLL4-A24-10-773(서열번호 21), TTLL4-A24-10-883(서열번호 22), TTLL4-A24-10-1186(서열번호 28), TTLL4-A24-10-1022(서열번호 29), TTLL4-A24-10-994(서열번호 32) 및 TTLL4-A24-10-891(서열번호 37)의 서열이 유일하고, 따라서, 우리의 최선의 지식에서 이 분자가 어떤 관련없는 분자에 대하여 의도하지 않은 면역 반응을 야기할 수 있는 가능성은 거의 없음을 나타낸다.

결론적으로, TTLL4 유래 신규한 HLA-A*2402 에피토프 펩티드가 동정되었고, 암 면역치료 이용에 적합함이 증명되었다.

실시예 2

재료 및 방법

세포주

HLA-A*0201-양성 B-림프구양성 세포주인 T2, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주인 COS7를 ATCC로부터 구입하였다.

TTLL4 유래 펩티드의 후보 선별

HLA-A*0201 분자에 결합하는 TTLL4 유래 9-머 및 10-머 펩티드를 결합 예측 서버(server) “NetMHC 3.0”를 이용하여 예측하였다(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.(Tissue Antigens., 62:378-84, 2003), Nielsen et al.(Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004)). 이러한 펩티드는 표준 고체상 합성 방법에 따른 생합성(Lewisville, Texas) 으로 합성하였고, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reversed phase high performance liquid chromatography, HPLC)로 정제하였다. 상기 순도(>90%) 및 펩티드의 동정을 분석적 HPLC 및 질량 분석으로 각각 결정하였다. 펩티드는 20 mg/ml 의 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide)에 용해하였고, -80 degrees C 에 보관하였다

시험관 내에서 CTL 유도

단핵구-유래된 수지상세포(dendritic cells, DC)를 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)에 제시된 펩티드에 대하여, 세포독성 T 림프구 반응을 유도하기 위하여 항원 제시 세포(antigen-presenting cells, APC)로서 사용하였다. DC는 다른 곳에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 제조되었다(Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14): 4112-8). 특이적으로, 피콜-플라크(Ficoll-Plaque)(Pharmacia) 용액으로 정상 기증자(HLA-A*0201 양성)로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포를 플라스틱 조직 배양 디쉬(plastic tissue culture dish)(Becton Dickinson)에 부착하여 단핵구 분획으로 그들을 풍부하게 하기 위하여 분리하였다. 상기 풍부하게 된 단핵구 집단을 2% 열-불활성화된 자가유래 혈청을 함유하는 AIM-V 배지에서 1000 U/ml 과립-대식세포집락자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)(R&D System) 및 1000 U/ml 인터루킨(interleukin, IL)-4(R&D System)존재하에 배양하였다. 배양 7일 후에, 상기 사이토카인으로 유도된 DC를 3 micro-g/ml 베타 2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin) 존재하에 3 시간 동안 37℃에서 AIM-V 배지에서, 각 합성된 펩티드 20 micro-g/ml로 자극하였다. 상기 제조된 세포는 그들의 세포 표면에, CD83, CD86 및 HLA class II와 같은 DC와 연관된 분자를 발현하는 것으로 나타났다. 이러한 펩티드로 자극된 DC를 X-조사(irradiation)(20 Gy)로 불활성화한 다음, 자가유래 CD8+ 세포와 1:20 비율로 혼합하였고, CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)로 양성 선별로 수득하였다. 이러한 배양을 48-웰 플레이트(Corning)에 수립하였다; 각 웰은 1.5 x 104 펩티드-자극된 DC, 3 x 10⁵ CD8+ T 세포 및 0.5 ml AIM-V/2% AS 배지에 10 ng/ml IL-7(R&D System). 3일 후에, 이러한 배양은 최종 농도 20 IU/ml 가 되도록 IL-2(CHIRON) 로 보충되었다. 7일 및 14일에, 상기 T 세포를 또한 자가 유래 펩티드-부가된(pulsed) DC로 자극하였다. 상기 DC는 상기 기재된 동일한 방식으로 각 시간마다 제조되었다. CTL을 3회 펩티드 자극 후에 21일에 펩티드-부가된 T2 세포에 대하여 시험하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

CTL 증식 방법

CTL을 Riddell et al에 기재된 것과 유사한 방식을 이용한 배양에서 증식하였다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). 총 5 x 10⁴ CTLs을 마이토마이신 C(Mitomycin C)으로 불활성화된 두 종류의 인간 B-림프아형 세포주가 있는 25 ml AIM-V/5% AS 배지에서, 40 ng/ml 항-CD3 단일클론 항체(monoclonal antibody)(Pharmingen) 존재하에 부유하였다. 배양을 개시한 후 1일 째, 120 IU/ml IL-2를 상기 배양에 첨가하였다. 상기 배양에 30 IU/ml IL-2 를 함유한 신선한 AIM-V/5% AS 배지를 5, 8 및 11일에 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

CTL 클론의 수립

희석액을 0.3, 1 및 3 CTLs/웰을 가지도록 96 둥근-바닥 마이크로 타이터 플레이트(96 round-bottomed micro titer plate)(Nalge Nunc International)에 제조하였다. CTL을 150 micro-l/웰 5%AS를 함유하는 AIM-V 배지에서, 두 종류의 인간 B-림프구아형 세포주 1 X 10⁴ 세포/웰, 30ng/ml 항-CD3 항체, 및 125 U/ml IL-2과 배양하였다. IL-2 50 micro-l/웰 을 10일 후에 최종농도가 125 U/ml IL-2가 되도록 배지에 첨가하였다. CTL 활성을 14일 째에 시험하였고, CTL 클론을 기재된 것과 같은 동일한 방식을 이용하여 증식하였다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

특이적 CTL 활성

특이적 CTL 활성을 시험하기 위하여, 인터페론(interferon, IFN)-감마(gamma) 효소-연계된 면역스팟(enzyme-linked immunospot, ELISPOT) 분석 및 IFN-감마 효소-연계된 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 수행하였다. 특이적으로, 펩티드-부가된 T2(1 x 10⁴/웰)을 자극 세포(stimulator cells)로서 제조하였다. 48 웰에서 배양된 세포를 응답 세포(responder cells)로서 이용하였다. IFN-감마 ELISPOT 분석 및 IFN-감마 ELISA 분석을 제조 절차하에 수행하였다.

표적 유전자 및 HLA-A02 각각 또는 둘 모두를 강제로 발현하는 세포의 수립

표적 유전자 또는 HLA-A*0201의 개방형 해독틀(open reading frame)을 암호화하는 상기 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR-증폭된 산물을 벡터로 클로닝하였다. 상기 플라스미드를 표적 유전자 및 HLA-A*0201-눌(null) 세포주인 COS7로 제조자의 추천 방법에 따라 리포펙타민(lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환으로부터 2일 후에, 상기 형질전환된 세포를 versene(Invitrogen)으로 수확하였고, CTL 활성 분석에 대한 상기 표적 세포(5 X 10⁴세포/웰)로서 사용하였다.

결과

TTLL4 유래 HLA-A02에 결합하는 펩티드의 예측

표 2a 및 2b는 HLA-A02에 결합하는 TTLL4의 9머 및 10머 펩티드를 높은 결합 친화도 순으로 나타낸다. 가능성있는 HLA-A02 결합 능력이 있는 전체 41개 펩티드가 선별되었고, 상기 에피토프 펩티드를 결정하기 위해 조사되었다.

해리상수(dissociation constant)[Kd(nM)]는 "NetMHC3.0"에서 유래되었다.

HLA-A*0201에 제한된 TTLL4 유래 예측된 펩티드에 의한 CTL 유도

TTLL4 유래 펩티드에 대한 CTL은 상기 “재료 및 방법”의 프로토콜에 따라 제조하였다. 펩티드 특이적 CTL 활성을 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 결정하였다(도 5a-d). TTLL4-A02-9-222(서열번호 38)의 #3번 웰(a), TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)의 #7번 웰(b), TTLL4-A02-9-66(서열번호 44)의 #8번 웰(c) 및 TTLL4-A02-10-574(서열번호 29)의 #7번 웰(d)은 대조군과 비교하여 강한 IFN-감마 생산력을 나타내었다. 반면에, HLA-A*0201와 결합할 가능성을 가짐에도 불구하고, 표 2a 및 2b에 나타난 다른 펩티드에 의한 자극에 의한 특이적 CTL 활성은 나타나지 않았다. 상기 결과는 TTLL4 유래 4개의 펩티드가 강한 CTL을 유도할 수 있는 펩티드로 동정되었다.

TTLL4 유래 펩티드에 대한 CTL 세포주 및 클론의 수립

TTLL4-A02-9-222(서열번호 38)의 #3번 웰(a), TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)의 #7번 웰(b), TTLL4-A02-9-66(서열번호 44)의 #8번 웰(c) 및 TTLL4-A02-10-574(서열번호 59)의 #7번 웰(d)에서 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 탐지된 펩티드 특이적 CTL 활성을 나타낸 세포들을 증식하였고, “재료 및 방법” 부분에 기재된 제한 희석으로 CTL 세포주를 수립하였다. 이러한 CTL 세포주의 CTL 활성을 IFN-감마 ELISA 분석으로 탐지하였다(도 6a-d). 상기 CTL은 펩티드 부가 없는 표적 세포에 비해 해당 펩티드로 부가된 표적세포에 대하여 강력한 IFN-감마 생산을 보였다.

또한, 상기 CTL 클론은 상기 “재료 및 방법”에 기재된 CTL 세포주로부터 제한 희석하여 수립하였고, 펩티드 부가된 표적세포에 대하여 CTL 클론으로부터 IFN-감마 생산을 IFN-감마 ELISA 분석으로 탐지하였다. 강력한 IFN-감마 생산을 TTLL4-A02-9-222(서열번호 38)(a), TTLL4-A02-9-905(서열번호 39)(b), TTLL4-A02-10-574(서열번호 59)(c)로 자극된 CTL 클론에서 확인하였다(도 7a-c).

TTLL4 및 HLA -A*0201을 발현하는 표적세포에 대한 특이적 CTL 활성

각각의 펩티드에 대하여 형성된 상기 수립된 CTL 클론은 TTLL4 및 HLA-A*0201을 발현하는 표적세포를 인지하는 능력에 대해 조사되었다. TTLL4 및 HLA-A*0201 유전자의 전장 둘 다로 형질전환된 COS7 세포(TTLL4 및 HLA-A*0201 유전자를 발현하는 반응세포(responder cell)에 대한 특이적 모델)에 대한 특이적 CTL 활성을 해당하는 펩티드에 대해 자극 세포(stimulator cell)로서 형성된 CTL 세포주 및 클론을 사용하여 시험하였다. TTLL4 유전자 또는 HLA-A*0201의 전장 각각으로 형질전환된 COS7 세포를 대조군으로 제조하였다. 도 8에서, 상기 TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)(a) 및 TTLL4-A02-9-66(서열번호 44)(b)로 자극된 CTL 클론은 TTLL4 및 HLA-A*0201 둘 다를 발현하는 COS7 세포에 대하여 강력한 CTL 활성을 보였다. 한편, 유의적인 특이적 CTL 활성은 대조군에 대하여 탐지되지 않았다. 따라서, 이러한 데이터는 TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)(a) 및 TTLL4-A02-9-66(서열번호 44)(b)의 펩티드가 내생적으로 처리되고, HLA-A*0201 분자와 함께 이의 표적세포에 발현되며, CTL에 의해 인지되는 것을 명백히 증명하였다. 이러한 결과는 TTLL4 유래된 이들 펩티드가 TTLL4를 발현하는 종양이 있는 환자의 치료에 대한 암 백신으로 적합할 수 있는 것을 나타낸다.

항원 펩티드의 상동성 분석

TTLL4-A02-9-222(서열번호 38), TTLL4-A02-9-805(서열번호 39), TTLL4-A02-9-66(서열번호 44) 및 TTLL4-A02-10-574(서열번호 59)로 자극된 상기 CTL은 유의적이고 특이적인 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 TTLL4-A02-9-222(서열번호 38), TTLL4-A02-9-805(서열번호 39), TTLL4-A02-9-66(서열번호 44) 및 TTLL4-A02-10-574(서열번호 59)의 서열이 인간 면역 시스템을 민감하게 하는 것으로 알려진 다른 분자 유래 펩티드와 상동성이 있기 때문일 것이다. 이러한 가능성을 배제하기 위하여, 상동성 분석을 유의적인 상동성이 있는 서열을 나타내지 않는 BLAST 알고리즘(algorithm)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) 쿼리(queries)를 이용하여 상기 펩티드 서열에 대하여 수행하였다. 상동성 분석의 결과는 TTLL4-A02-9-222(서열번호 38), TTLL4-A02-9-66(서열번호 44) 및 TTLL4-A02-10-574(서열번호 59)의 서열이 유일하고, 따라서, 우리의 최선의 지식에서 이 분자가 어떤 관련없는 분자에 대하여 의도하지 않은 면역 반응을 야기할 수 있는 가능성은 거의 없다. 비록, TTLL4-A02-9-805(서열번호 39)의 서열이 TTLL5와 상동성이 있음에도 불구하고, 본 발명자들의 마이크로어레이 데이타에서 TTLL5의 발현 프로필(profile)은 TTLL5 발현이 정상 조직(tissue)에서 낮고, 상기 펩티드는 암 치료에 적용될 수 있음을 나타낸다.

결론적으로, 신규한 TTLL4 유래 HLA-A*0201 에피토프 펩티드가 동정되었고, 암 면역치료의 이용에 적합할 수 있는 것을 증명한다.

본 발명은 새로운 TAA, 특히 강력하고 특이적인 항-종양 면역반응을 유도할 것이고 매우 다양한 암에 적용 가능성을 가진 TTLL4로부터 유래된 것을 제공한다. 이러한 TAA는 TTLL4 관련 질병에 대한, 예를 들면 암, 보다 구체적으로 방광암(bladder cancer), 담관세포암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia; CML), 결장(colon) 및 직장(rectum) 암, 식도암(esophageal cancer), 간암(liver cancer), 림프종(lymphoma), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신세포암(renal carcinoma), 소세포폐암(small-cell lung cancer; SCLC), 비-소세포폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC), 연조직 종양(soft tissue tumor) 및 골육종(osteosarcoma)에 대한 펩티드 백신으로 적용할 수 있다.

본 발명이 여기서 그의 구체적 실시예와 함께 상세히 기술되는 동안, 앞선 기술이 예시적 설명적 특징이었고 본 발명 및 바람직한 실시예를 예시하려는 의도를 가지고 있다는 것이 이해되어야 한다. 일반적인 실험 방법을 통해, 당업자는 본 발명의 뜻과 범위, 첨부된 청구항에 의해 정의된 경계 및 한계내에서 용이하게 다양한 변화 및 변형이 있을 수 있다는 것을 인지할 것이다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> TTLL4 PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME <130> ONC-A1031P <150> US 61/380,611 <151> 2010-09-07 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Arg Tyr Leu His Lys Pro Tyr Leu Ile 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Leu Phe Pro Asn Val Pro Pro Thr Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Phe Tyr Ala Ser Val Leu Asp Val Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Val Tyr Val Thr Ser Tyr Asp Pro Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Pro Tyr Leu Ile Ser Gly Ser Lys Phe 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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(371)..(3967) <400> 79 agactctcgg tctgtccgct gggggcgcgc gcggtgtgtg gcaggcggca gcggcgctgg 60 cggccgagtg cgcttgtcac gcgtggcggt gcgtggttgc taggggcgcc tgaggctgcc 120 gggtagccca gcaggccgag ggaggaagta gcgtggagcc ggtgccgagc cggggcgaag 180 ctggatcccc tagatagact gtcttcaagc tcactgatat tttcctctgc ttgatccatt 240 gtgctgttga gagcctctag taaatttttc agactgacag acttcaagga tgcagctgct 300 actaccggag gtgtgtggca ccttacctca gcaaggccat gagaccgtgt ggccatgatg 360 tgggcccctc atg gcc tca gca gga aca cag cac tat agt att ggc ctc cgc 412 Met Ala Ser Ala Gly Thr Gln His Tyr Ser Ile Gly Leu Arg 1 5 10 cag aaa aac agc ttc aag cag agt ggt ccc tca ggc aca gta cct gcc 460 Gln Lys Asn Ser Phe Lys Gln Ser Gly Pro Ser Gly Thr Val Pro Ala 15 20 25 30 acg cca cct gag aaa ccc tcg gag ggc aga gtc tgg cct cag gcc cat 508 Thr Pro Pro Glu Lys Pro Ser Glu Gly Arg Val Trp Pro Gln Ala His 35 40 45 cag caa gtg aag cca atc tgg aag ctg gaa aag aag caa gtg gag aca 556 Gln Gln Val Lys Pro Ile Trp Lys Leu Glu Lys Lys Gln Val Glu Thr 50 55 60 ctg tca gca ggg ttg ggc cca ggc ctc ttg ggc gtc cca ccc cag cca 604 Leu Ser Ala Gly Leu Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Pro Pro Gln Pro 65 70 75 gca tat ttc ttt tgc ccc agc act tta tgt agc tct ggg acc acg gct 652 Ala Tyr Phe Phe Cys Pro Ser Thr Leu Cys Ser Ser Gly Thr Thr Ala 80 85 90 gtc att gca ggc cac agc agt tcc tgt tac cta cac tct ctc ccg gac 700 Val Ile Ala Gly His Ser Ser Ser Cys Tyr Leu His Ser Leu Pro Asp 95 100 105 110 ttg ttc aac agc acc ctg cta tac cgc cgc tcc agc tat agg caa aaa 748 Leu Phe Asn Ser Thr Leu Leu Tyr Arg Arg Ser Ser Tyr Arg Gln Lys 115 120 125 ccg tac cag caa ctg gag tct ttc tgc ttg cgt tcg agc ccg tca gaa 796 Pro Tyr Gln Gln Leu Glu Ser Phe Cys Leu Arg Ser Ser Pro Ser Glu 130 135 140 aaa agc cct ttt tct ctc cct caa aag agc ctc cct gtc agt ctc act 844 Lys Ser Pro Phe Ser Leu Pro Gln Lys Ser Leu Pro Val Ser Leu Thr 145 150 155 gcc aac aag gcc act tct tcc atg gtc ttc tcc atg gcc cag ccc atg 892 Ala Asn Lys Ala Thr Ser Ser Met Val Phe Ser Met Ala Gln Pro Met 160 165 170 gcc tcc tca tcc aca gaa cca tac ctc tgc ttg gca gcg gct ggg gaa 940 Ala Ser Ser Ser Thr Glu Pro Tyr Leu Cys Leu Ala Ala Ala Gly Glu 175 180 185 190 aac cct tca ggg aag agc ctg gcc tct gcc atc tca ggg aag atc cca 988 Asn Pro Ser Gly Lys Ser Leu Ala Ser Ala Ile Ser Gly Lys Ile Pro 195 200 205 tct cca ctc tct tcc tcc tat aag ccc atg ctg aat aat aat tcc ttc 1036 Ser Pro Leu Ser Ser Ser Tyr Lys Pro Met Leu Asn Asn Asn Ser Phe 210 215 220 atg tgg cca aat agc acg cca gtg cct tta ttg cag acc aca cag ggc 1084 Met Trp Pro Asn Ser Thr Pro Val Pro Leu Leu Gln Thr Thr Gln Gly 225 230 235 ctg aag cca gta tcg cca ccc aag atc cag cct gtc tcc tgg cat cat 1132 Leu Lys Pro Val Ser Pro Pro Lys Ile Gln Pro Val Ser Trp His His 240 245 250 tca ggg ggt act gga gac tgt gca ccg cag cct gtt gac cat aag gtg 1180 Ser Gly Gly Thr Gly Asp Cys Ala Pro Gln Pro Val Asp His Lys Val 255 260 265 270 ccc aaa agc att ggc act gtc cca gct gat gcc agt gcc cat atc gcc 1228 Pro Lys Ser Ile Gly Thr Val Pro Ala Asp Ala Ser Ala His Ile Ala 275 280 285 ttg tct acc gct agc tcc cac gac aca tcc acc acc agt gtt gcc tct 1276 Leu Ser Thr Ala Ser Ser His Asp Thr Ser Thr Thr Ser Val Ala Ser 290 295 300 tcc tgg tat aac cgg aat aac tta gcc atg agg gca gag cca ctt tcc 1324 Ser Trp Tyr Asn Arg Asn Asn Leu Ala Met Arg Ala Glu Pro Leu Ser 305 310 315 tgt gct ctg gat gac agc tct gat tcc cag gat cca act aag gag att 1372 Cys Ala Leu Asp Asp Ser Ser Asp Ser Gln Asp Pro Thr Lys Glu Ile 320 325 330 cgg ttc act gag gcc gtg agg aaa ttg acc gca aga ggc ttt gag aag 1420 Arg Phe Thr Glu Ala Val Arg Lys Leu Thr Ala Arg Gly Phe Glu Lys 335 340 345 350 atg ccg agg caa ggc tgc cag ctt gaa cag tct agt ttc ctg aac ccc 1468 Met Pro Arg Gln Gly Cys Gln Leu Glu Gln Ser Ser Phe Leu Asn Pro 355 360 365 agc ttc cag tgg aat gtc ctc aac agg agc agg cgg tgg aaa cct cct 1516 Ser Phe Gln Trp Asn Val Leu Asn Arg Ser Arg Arg Trp Lys Pro Pro 370 375 380 gcg gta aat cag cag ttt cct cag gag gat gct gga tcg gtc agg cgg 1564 Ala Val Asn Gln Gln Phe Pro Gln Glu Asp Ala Gly Ser Val Arg Arg 385 390 395 gtc ctc cct ggt gcc tca gat acc ttg ggg ttg gac aat aca gtc ttc 1612 Val Leu Pro Gly Ala Ser Asp Thr Leu Gly Leu Asp Asn Thr Val Phe 400 405 410 tgt acc aag cgt atc agc att cac ctc ctt gcc tca cat gcc agt ggg 1660 Cys Thr Lys Arg Ile Ser Ile His Leu Leu Ala Ser His Ala Ser Gly 415 420 425 430 ctc aat cac aac cct gcc tgt gaa tct gta att gac tcc tca gca ttt 1708 Leu Asn His Asn Pro Ala Cys Glu Ser Val Ile Asp Ser Ser Ala Phe 435 440 445 gga gaa ggc aaa gct cca ggt ccc cct ttt cct caa act ctt ggc ata 1756 Gly Glu Gly Lys Ala Pro Gly Pro Pro Phe Pro Gln Thr Leu Gly Ile 450 455 460 gcc aac gtg gcc acc cgc ctc tct tcc atc cag ctg ggc cag tct gag 1804 Ala Asn Val Ala Thr Arg Leu Ser Ser Ile Gln Leu Gly Gln Ser Glu 465 470 475 aag gag aga cct gag gag gcc agg gag ctg gac tca tct gat agg gat 1852 Lys Glu Arg Pro Glu Glu Ala Arg Glu Leu Asp Ser Ser Asp Arg Asp 480 485 490 att agt tca gct act gac ctc cag cca gat cag gct gag act gaa gat 1900 Ile Ser Ser Ala Thr Asp Leu Gln Pro Asp Gln Ala Glu Thr Glu Asp 495 500 505 510 aca gaa gaa gaa cta gta gat ggt ttg gaa gac tgt tgt agc cgt gat 1948 Thr Glu Glu Glu Leu Val Asp Gly Leu Glu Asp Cys Cys Ser Arg Asp 515 520 525 gag aat gaa gag gag gag gga gac tca gag tgc tcc tca tta agt gct 1996 Glu Asn Glu Glu Glu Glu Gly Asp Ser Glu Cys Ser Ser Leu Ser Ala 530 535 540 gtc tcc ccc agc gaa tcg gtg gcc atg atc tct aga agc tgt atg gaa 2044 Val Ser Pro Ser Glu Ser Val Ala Met Ile Ser Arg Ser Cys Met Glu 545 550 555 att ctg acc aaa ccc ctt tcc aat cat gag aaa gtt gtc cga cca gcc 2092 Ile Leu Thr Lys Pro Leu Ser Asn His Glu Lys Val Val Arg Pro Ala 560 565 570 ctc atc tac agt ctc ttt ccc aac gtt ccc cct acc atc tat ttt ggc 2140 Leu Ile Tyr Ser Leu Phe Pro Asn Val Pro Pro Thr Ile Tyr Phe Gly 575 580 585 590 act cgg gat gag aga gtg gag aaa ctt ccc tgg gaa cag agg aag ttg 2188 Thr Arg Asp Glu Arg Val Glu Lys Leu Pro Trp Glu Gln Arg Lys Leu 595 600 605 ctc cga tgg aag atg agc aca gtg acc ccc aac att gtc aag cag acc 2236 Leu Arg Trp Lys Met Ser Thr Val Thr Pro Asn Ile Val Lys Gln Thr 610 615 620 att gga cgg tcc cac ttc aaa atc agc aaa aga aac gat gac tgg ctg 2284 Ile Gly Arg Ser His Phe Lys Ile Ser Lys Arg Asn Asp Asp Trp Leu 625 630 635 ggc tgc tgg ggt cac cac atg aag tct cct agt ttc cga tcc att cga 2332 Gly Cys Trp Gly His His Met Lys Ser Pro Ser Phe Arg Ser Ile Arg 640 645 650 gag cat cag aag cta aac cat ttc cca ggc tca ttc cag att ggg agg 2380 Glu His Gln Lys Leu Asn His Phe Pro Gly Ser Phe Gln Ile Gly Arg 655 660 665 670 aag gac cgg cta tgg cgg aac ctg tca cgt atg cag agc cgc ttt ggc 2428 Lys Asp Arg Leu Trp Arg Asn Leu Ser Arg Met Gln Ser Arg Phe Gly 675 680 685 aag aag gag ttc agt ttc ttc ccc cag tcc ttt atc ctg ccc cag gac 2476 Lys Lys Glu Phe Ser Phe Phe Pro Gln Ser Phe Ile Leu Pro Gln Asp 690 695 700 gcc aag ctc ctg cgc aaa gcg tgg gag agc agc agc cgc caa aag tgg 2524 Ala Lys Leu Leu Arg Lys Ala Trp Glu Ser Ser Ser Arg Gln Lys Trp 705 710 715 att gtg aag cca cca gca tca gct cga ggc att ggc atc cag gtt att 2572 Ile Val Lys Pro Pro Ala Ser Ala Arg Gly Ile Gly Ile Gln Val Ile 720 725 730 cac aag tgg agt cag ctc ccc aag cga agg ccc ctc ctg gta cag agg 2620 His Lys Trp Ser Gln Leu Pro Lys Arg Arg Pro Leu Leu Val Gln Arg 735 740 745 750 tat cta cac aaa ccc tac ctc atc agc ggc agc aag ttt gac ctg cgg 2668 Tyr Leu His Lys Pro Tyr Leu Ile Ser Gly Ser Lys Phe Asp Leu Arg 755 760 765 atc tat gtt tat gtc act tcc tac gat cct ctg cgg att tac ctc ttt 2716 Ile Tyr Val Tyr Val Thr Ser Tyr Asp Pro Leu Arg Ile Tyr Leu Phe 770 775 780 tca gat gga ctg gtc cgc ttt gcc agt tgc aag tat tcg cct tcc atg 2764 Ser Asp Gly Leu Val Arg Phe Ala Ser Cys Lys Tyr Ser Pro Ser Met 785 790 795 aag agc ctt ggc aat aag ttc atg cac ctg acc aac tac agt gtc aat 2812 Lys Ser Leu Gly Asn Lys Phe Met His Leu Thr Asn Tyr Ser Val Asn 800 805 810 aaa aag aat gcc gag tac cag gcc aat gca gat gaa atg gct tgc cag 2860 Lys Lys Asn Ala Glu Tyr Gln Ala Asn Ala Asp Glu Met Ala Cys Gln 815 820 825 830 ggc cac aaa tgg gca ctg aag gct ttg tgg aac tac ctg agc cag aag 2908 Gly His Lys Trp Ala Leu Lys Ala Leu Trp Asn Tyr Leu Ser Gln Lys 835 840 845 gga gtc aat agc gac gcc atc tgg gag aag ata aag gat gtt gtt gtc 2956 Gly Val Asn Ser Asp Ala Ile Trp Glu Lys Ile Lys Asp Val Val Val 850 855 860 aaa act atc atc tcg tca gag ccc tat gtg acc agc ctg ctc aag atg 3004 Lys Thr Ile Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Val Thr Ser Leu Leu Lys Met 865 870 875 tat gtg cga cgg ccc tat agc tgc cat gaa ctc ttt ggt ttt gac atc 3052 Tyr Val Arg Arg Pro Tyr Ser Cys His Glu Leu Phe Gly Phe Asp Ile 880 885 890 atg cta gac gaa aac ctc aag ccc tgg gtc ctg gaa gtc aac att tcc 3100 Met Leu Asp Glu Asn Leu Lys Pro Trp Val Leu Glu Val Asn Ile Ser 895 900 905 910 cca agc ctc cac tcc agc tct cca ctg gat atc agc atc aaa ggc cag 3148 Pro Ser Leu His Ser Ser Ser Pro Leu Asp Ile Ser Ile Lys Gly Gln 915 920 925 atg att cgt gac ctt ctg aat ctg gca ggt ttt gtc ctg ccc aat gca 3196 Met Ile Arg Asp Leu Leu Asn Leu Ala Gly Phe Val Leu Pro Asn Ala 930 935 940 gag gat atc att tcc agc ccc agc agc tgc agc agc tcc acc acc agc 3244 Glu Asp Ile Ile Ser Ser Pro Ser Ser Cys Ser Ser Ser Thr Thr Ser 945 950 955 ctg ccc acc tcc cct ggg gac aaa tgt cga atg gct cca gag cat gtc 3292 Leu Pro Thr Ser Pro Gly Asp Lys Cys Arg Met Ala Pro Glu His Val 960 965 970 act gca cag aag atg aag aaa gcc tat tat ctg acc cag aaa att cct 3340 Thr Ala Gln Lys Met Lys Lys Ala Tyr Tyr Leu Thr Gln Lys Ile Pro 975 980 985 990 gat cag gac ttc tat gca tct gtg ctg gat gtc ctg aca cca gat gat 3388 Asp Gln Asp Phe Tyr Ala Ser Val Leu Asp Val Leu Thr Pro Asp Asp 995 1000 1005 gtt cgg att ctg gtt gag atg gaa gat gag ttt tct cgc cgt ggt cag 3436 Val Arg Ile Leu Val Glu Met Glu Asp Glu Phe Ser Arg Arg Gly Gln 1010 1015 1020 ttt gaa cga att ttt cct tct cat atc tcc tct cgc tat ctc cgc ttt 3484 Phe Glu Arg Ile Phe Pro Ser His Ile Ser Ser Arg Tyr Leu Arg Phe 1025 1030 1035 ttt gag cag cca cga tat ttc aac att ctc acc acc caa tgg gaa cag 3532 Phe Glu Gln Pro Arg Tyr Phe Asn Ile Leu Thr Thr Gln Trp Glu Gln 1040 1045 1050 aaa tac cat ggc aac aag ctt aaa gga gta gat ctg ctc cgg agt tgg 3580 Lys Tyr His Gly Asn Lys Leu Lys Gly Val Asp Leu Leu Arg Ser Trp 1055 1060 1065 1070 tgc tac aaa ggg ttc cac atg gga gtt gtc tct gat tct gct cca gtg 3628 Cys Tyr Lys Gly Phe His Met Gly Val Val Ser Asp Ser Ala Pro Val 1075 1080 1085 tgg tct ctc ccg aca tca ctt ctg act atc tca aag gat gac gtg ata 3676 Trp Ser Leu Pro Thr Ser Leu Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asp Val Ile 1090 1095 1100 ctc aat gcc ttc agc aaa tca gag act agc aag ctg gga aaa caa agc 3724 Leu Asn Ala Phe Ser Lys Ser Glu Thr Ser Lys Leu Gly Lys Gln Ser 1105 1110 1115 tcc tgt gag gtt agc cta cta ctc tct gaa gac ggg acc acg ccc aaa 3772 Ser Cys Glu Val Ser Leu Leu Leu Ser Glu Asp Gly Thr Thr Pro Lys 1120 1125 1130 tcc aag aag act caa gct ggc ctt tcc cct tat ccc cag aaa ccc agt 3820 Ser Lys Lys Thr Gln Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Pro Gln Lys Pro Ser 1135 1140 1145 1150 tcc tca aag gac agt gag gac acc agc aaa gag ccc agc ctt tct acc 3868 Ser Ser Lys Asp Ser Glu Asp Thr Ser Lys Glu Pro Ser Leu Ser Thr 1155 1160 1165 cag acg tta cct gtg atc aag tgc tct ggg cag act tca aga ctt tct 3916 Gln Thr Leu Pro Val Ile Lys Cys Ser Gly Gln Thr Ser Arg Leu Ser 1170 1175 1180 gct tcc tcc act ttc cag tca atc agt gac tcc ctc ctg gct gtg agc 3964 Ala Ser Ser Thr Phe Gln Ser Ile Ser Asp Ser Leu Leu Ala Val Ser 1185 1190 1195 cca taa ctggcctctc tccaaaagcc tctgcccagg agcatgggca tcagctacct 4020 Pro cacgggaacc agcctgctgt tcagaccagt ctgaccccct acccctttca ccctgtccct 4080 cctcagagta ttttttgaag tggttgcatt atagagatgg gtatttgtag ggccggaggg 4140 atggtagtga tggggagaag gtgaggaagg gtcaccctct gtcacctgtc tgcctggctg 4200 gcacctcata tctcagcaga gaagccagtg gtggccacgc agccttataa agcaggtttt 4260 ggtttctacc ttaagtgagc catgtgtggt ttgtctgggg gccctggtgt ggttgctgag 4320 ttgtagctca agaggagaaa acatacagaa catatttgga ccggaaatcc tttgttctga 4380 atttgagggg gtcttctgag gtccttactt ccttaggtct ttcctcaccc ctctcccacc 4440 gctgtcctga ggagaaaccc ttgaacttcc tcagtagaca ggcggagagg ccacaacatg 4500 ccgaacccat ttcctgtcat cctagtcttg ggtcttcacc gcctccttcc aaatacccac 4560 cctgccagca gccctaggtc ttcctgttct gaccccccat cactgctcgt tcagccttct 4620 agatgtctct ctcgtggaca tctgttcttt agctgttggc tttctctgag gtgtgagagg 4680 gtctatgaac tttgtgaatt tcccatggcc ccagtgaagg agcccagata atcccagtag 4740 ctgttacctg tctccatgta tcaaaggaca cagtccaggg ggagggtgga aggagatgtg 4800 gtttctctat agtgcaacaa acatggtttc tcaatgttct gctgtgcagc aagcagggtc 4860 tggcggcttg gtaggtgggt ttcaggagca gtcactattg taggatgggc ttccaatcaa 4920 acctcagact aaactcttgt actgaactga ttctacctcc ctcctctaga ctcagtaaac 4980 agtgactatt caataaa 4997 <210> 80 <211> 1199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Met Ala Ser Ala Gly Thr Gln His Tyr Ser Ile Gly Leu Arg Gln Lys 1 5 10 15 Asn Ser Phe Lys Gln Ser Gly Pro Ser Gly Thr Val Pro Ala Thr Pro 20 25 30 Pro Glu Lys Pro Ser Glu Gly Arg Val Trp Pro Gln Ala His Gln Gln 35 40 45 Val Lys Pro Ile Trp Lys Leu Glu Lys Lys Gln Val Glu Thr Leu Ser 50 55 60 Ala Gly Leu Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Pro Pro Gln Pro Ala Tyr 65 70 75 80 Phe Phe Cys Pro Ser Thr Leu Cys Ser Ser Gly Thr Thr Ala Val Ile 85 90 95 Ala Gly His Ser Ser Ser Cys Tyr Leu His Ser Leu Pro Asp Leu Phe 100 105 110 Asn Ser Thr Leu Leu Tyr Arg Arg Ser Ser Tyr Arg Gln Lys Pro Tyr 115 120 125 Gln Gln Leu Glu Ser Phe Cys Leu Arg Ser Ser Pro Ser Glu Lys Ser 130 135 140 Pro Phe Ser Leu Pro Gln Lys Ser Leu Pro Val Ser Leu Thr Ala Asn 145 150 155 160 Lys Ala Thr Ser Ser Met Val Phe Ser Met Ala Gln Pro Met Ala Ser 165 170 175 Ser Ser Thr Glu Pro Tyr Leu Cys Leu Ala Ala Ala Gly Glu Asn Pro 180 185 190 Ser Gly Lys Ser Leu Ala Ser Ala Ile Ser Gly Lys Ile Pro Ser Pro 195 200 205 Leu Ser Ser Ser Tyr Lys Pro Met Leu Asn Asn Asn Ser Phe Met Trp 210 215 220 Pro Asn Ser Thr Pro Val Pro Leu Leu Gln Thr Thr Gln Gly Leu Lys 225 230 235 240 Pro Val Ser Pro Pro Lys Ile Gln Pro Val Ser Trp His His Ser Gly 245 250 255 Gly Thr Gly Asp Cys Ala Pro Gln Pro Val Asp His Lys Val Pro Lys 260 265 270 Ser Ile Gly Thr Val Pro Ala Asp Ala Ser Ala His Ile Ala Leu Ser 275 280 285 Thr Ala Ser Ser His Asp Thr Ser Thr Thr Ser Val Ala Ser Ser Trp 290 295 300 Tyr Asn Arg Asn Asn Leu Ala Met Arg Ala Glu Pro Leu Ser Cys Ala 305 310 315 320 Leu Asp Asp Ser Ser Asp Ser Gln Asp Pro Thr Lys Glu Ile Arg Phe 325 330 335 Thr Glu Ala Val Arg Lys Leu Thr Ala Arg Gly Phe Glu Lys Met Pro 340 345 350 Arg Gln Gly Cys Gln Leu Glu Gln Ser Ser Phe Leu Asn Pro Ser Phe 355 360 365 Gln Trp Asn Val Leu Asn Arg Ser Arg Arg Trp Lys Pro Pro Ala Val 370 375 380 Asn Gln Gln Phe Pro Gln Glu Asp Ala Gly Ser Val Arg Arg Val Leu 385 390 395 400 Pro Gly Ala Ser Asp Thr Leu Gly Leu Asp Asn Thr Val Phe Cys Thr 405 410 415 Lys Arg Ile Ser Ile His Leu Leu Ala Ser His Ala Ser Gly Leu Asn 420 425 430 His Asn Pro Ala Cys Glu Ser Val Ile Asp Ser Ser Ala Phe Gly Glu 435 440 445 Gly Lys Ala Pro Gly Pro Pro Phe Pro Gln Thr Leu Gly Ile Ala Asn 450 455 460 Val Ala Thr Arg Leu Ser Ser Ile Gln Leu Gly Gln Ser Glu Lys Glu 465 470 475 480 Arg Pro Glu Glu Ala Arg Glu Leu Asp Ser Ser Asp Arg Asp Ile Ser 485 490 495 Ser Ala Thr Asp Leu Gln Pro Asp Gln Ala Glu Thr Glu Asp Thr Glu 500 505 510 Glu Glu Leu Val Asp Gly Leu Glu Asp Cys Cys Ser Arg Asp Glu Asn 515 520 525 Glu Glu Glu Glu Gly Asp Ser Glu Cys Ser Ser Leu Ser Ala Val Ser 530 535 540 Pro Ser Glu Ser Val Ala Met Ile Ser Arg Ser Cys Met Glu Ile Leu 545 550 555 560 Thr Lys Pro Leu Ser Asn His Glu Lys Val Val Arg Pro Ala Leu Ile 565 570 575 Tyr Ser Leu Phe Pro Asn Val Pro Pro Thr Ile Tyr Phe Gly Thr Arg 580 585 590 Asp Glu Arg Val Glu Lys Leu Pro Trp Glu Gln Arg Lys Leu Leu Arg 595 600 605 Trp Lys Met Ser Thr Val Thr Pro Asn Ile Val Lys Gln Thr Ile Gly 610 615 620 Arg Ser His Phe Lys Ile Ser Lys Arg Asn Asp Asp Trp Leu Gly Cys 625 630 635 640 Trp Gly His His Met Lys Ser Pro Ser Phe Arg Ser Ile Arg Glu His 645 650 655 Gln Lys Leu Asn His Phe Pro Gly Ser Phe Gln Ile Gly Arg Lys Asp 660 665 670 Arg Leu Trp Arg Asn Leu Ser Arg Met Gln Ser Arg Phe Gly Lys Lys 675 680 685 Glu Phe Ser Phe Phe Pro Gln Ser Phe Ile 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Thr Ser Lys Leu Gly Lys Gln Ser Ser Cys 1105 1110 1115 1120 Glu Val Ser Leu Leu Leu Ser Glu Asp Gly Thr Thr Pro Lys Ser Lys 1125 1130 1135 Lys Thr Gln Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Pro Gln Lys Pro Ser Ser Ser 1140 1145 1150 Lys Asp Ser Glu Asp Thr Ser Lys Glu Pro Ser Leu Ser Thr Gln Thr 1155 1160 1165 Leu Pro Val Ile Lys Cys Ser Gly Gln Thr Ser Arg Leu Ser Ala Ser 1170 1175 1180 Ser Thr Phe Gln Ser Ile Ser Asp Ser Leu Leu Ala Val Ser Pro 1185 1190 1195 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 81 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 82 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 83 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 84 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24

Claims

TTLL4의 아미노산 서열 또는 이의 면역학적인 활성 단편(immunologically active fragment)으로 구성된 펩티드로 CTL 유도성을 갖는 분리된 펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 있어서, 1, 2 또는 여러 개의 아미노산이 치환(substituted), 결실(deleted), 도입(inserted) 및/또는 첨가(added)된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드로 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocyte; CTL) 유도성을 갖는 분리된 펩티드.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 HLA 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 4항에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A24 또는 HLA-A2인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 5항에 있어서, 상기 펩티드는 하기의 특성을 하나 또는 둘 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:
(a) 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32 및 37로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 N-말단(N-terminus)로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalnine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군으로부터 선택; 및
(b) 서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32 및 37로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal) 아미노산이 페닐알라닌, 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판, 또는 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택.
제 5항에 있어서, 상기 펩티드는 하기의 특성을 하나 또는 둘 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:
(a) 서열번호 38, 39, 44 및 59로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택; 및
(b) 서열번호 38, 39, 44 및 59로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 발린(valine) 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 분리된 펩티드를 암호화(encoding)하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 제 9항의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 CTL을 유도용 조성물.
제 1항 내지 제 8항의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들) 또는 제 9항의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 암의 치료 및/또는 예방(prophylxis), 및/또는 수술 후 이의 재발을 막기위한 약학적 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 조성물은 HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 개체에 투여하기 위해 제형화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL 유도성을 갖는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell; APC) 유도방법:
(a) 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 APC와 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 접촉하는 단계; 및
(b) 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입하는 단계.
하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL 유도방법:
(a) HLA 항원 및 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 APC와 CD8 양성 T 세포(CD8 positive T cell)을 공-배양(co-culturing)하는 단계;
(b) HLA 항원 및 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 엑소솜(exosome)과 CD8 양성 T 세포를 공-배양하는 단계; 및
(c) 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드에 결합하는 T 세포 수용체(receptor) 아단위 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자를 T 세포에 도입하는 단계.
HLA 항원 및 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 APC.
제 15항에 있어서, 제 13항의 방법에 의해 유도된 것을 특징으로 하는 분리된 APC.
제 1항 내지 제 8항의 어느 한 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL.
제 14항의 방법에 의해서 유도된 제 17항의 CTL.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 펩티드, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로 이를 필요로 하는 개체에 암에 대한 면역반응 유도방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 펩티드에 대한 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 벡터.
제 21항에 따른 발현벡터로 형질전환(transformed) 또는 형질주입(transfected)된 숙주 세포.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 펩티드, 제 9항의 뉴클레오티드 또는 제 20항의 항체로 구성된 진단 키트(kit).
서열번호 1, 6, 11, 12, 16, 20, 21, 22, 28, 29, 32, 37, 38, 39, 44 및 59로 구성된 군으로부터 선택된 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 분리된 펩티드.