KR20140026543A - Sema5b 펩티드 및 이를 포함한 백신 - Google Patents

Sema5b 펩티드 및 이를 포함한 백신 Download PDF

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류지 오사와
사치코 요시무라
토모히사 와타나베
가쿠 나카야마
유스케 나카무라
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 명세서에 기재되었듯이, SEMA5B 유래 분리된 에피토프 펩티드는 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구를 유도하며 따라서 암 면역치료, 더 특이적으로는 된 암 백신으로 이용에 적합하다. 창의적인 펩티드는, 하나, 둘, 또는 여러 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 또는 첨가되어, 이러한 변형된 형태가 본래 펩티드의 필요한 HLA 결합 및/또는 CTL 유도성을 유지하면, 상기 언급된 아미노산 서열 및 이의 변형된 형태를 모두 포함한다. 또한 본 발명은 상기 언급된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 약학적 제제(agents) 또는 조성물(composition)뿐만 아니라 상기 언급된 펩티드 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 약학적 제제 또는 조성물은 예를 들면 급성골수성 식도암(esophagus cancer), NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하는, 암 및 종양에 대한 치료 및/또는 예방에서 특히 유용하게 사용된다.

Description

SEMA5B 펩티드 및 이를 포함한 백신{SEMA5B PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME}
본 발명은 생물과학 분야, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 예방 및 치료 둘 다 또는 둘 중 하나를 위한 약으로뿐 아니라 암 백신으로서 효과적인 신규한 펩티드에 관한 것이다.
우선권
본 출원은 2011년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 제 61/495,819 호에 대한 우선권을 주장한다.
세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes; CTLs)는 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 종류 I 분자에서 발견되는 종양관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)에서 유래한 에피토프 펩티드(epitope peptide)를 인지한 후, 종양세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. TAA의 첫 번째 예로 흑색종 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리의 발견 이후, 다른 많은 TAA가 주로 면역학적 접근을 통해 발견되었다(비특허문헌 1, Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2, Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). 이러한 TAA 중 일부는 현재 면역치료법의 표적으로서 임상 개발 과정에 있다.
유망한 TAA는 암 세포의 증식 및 생존에 필수적이다. 면역치료를 위한 표적으로서 이러한 TAA의 이용은 치료상으로 유도된 면역 선별(immune selection)의 결과로서, TAA의 결실, 돌연변이 또는 하향-조절(down-regulation)에 기인한 암세포의 면역 회피(immune escape)의 잘 묘사된 위험을 최소화할 수 있다. 따라서, 강력하고 특이적인 항-종양 면역반응을 유도할 수 있는 새로운 TAA의 동정은 추가적인 개발을 보장한다; 따라서, 다양한 유형의 암에 대한 펩티드 백신화 전략의 임상 조사가 진행중이다(비특허문헌 3, Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; 비특허문헌 4, Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; 비특허문헌 5, Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; 비특허문헌 6, van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; 비특허문헌 7, Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; 비특허문헌 8, Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; 비특허문헌 9, Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; 비특허문헌 10, Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). 지금까지, 종양-연관된 항원 유래 펩티드를 이용한 일부 임상 시도가 보고되었다. 불행히도, 많은 수의 현재 암 백신의 시도는 오직 낮은 목표 회답률(response rate)만을 보였다(비특허문헌 11, Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; 비특허문헌 12, Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; 비특허문헌 13, Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15). 그러므로, 면역요법의 표적으로 유용한 신규 TAA의 필요성이 여전히 요구된다.
SEMA5B는 세마포린(semaphorin) 단백질 패밀리(family) 중 하나이고, 단백질 패밀리는 신경 발달 동안 축삭유도(axonal guidance)에 있어 중요한 역할을 한다(NPL 14, O'Connor TP et.al., Neural Dev. 2009 May 23;4:18). 최근 연구들에 따르면, 세마포린 패밀리 단백질의 기능이 신경 체계뿐만 아니라 기관형성(organogenesis), 노화(angiogenesis) 및 암 발달에도 관련이 있다.
신세포암(renal cell carcinoma; RCC)의 분자 메커니즘을 밝히기 위한 방법으로서 23,040 개의 유전자로 구성된 cDNA 마이크로어레이를 사용한 유전자-발현 프로파일 분석 동안, SEMA5B가 RCC에서 빈번하게 상향조절됨을 확인하였다. 추가적인 노던 블럿 분석을 통해 SEMA5B 전사물이 RCC 조직에서 높게 발현되나 태아 뇌 및 태아 신장을 제외한 정상적인 인간 조직에서 거의 발견되지 않음을 밝혔다. 더욱이, RCC 세포주에서 siRNA에 의한 SEMA5B의 넉다운(knockdown)은 RCC 세포의 생장을 약화시킴을 제시하였다(NPL15, Hirota E. et.al., Int J Oncol. 2006 Oct; 29(4):799-827; PTL1, WO2007/013575).
인용문헌 목록
[특허문헌]
(특허문헌 1) WO2007/013575
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
(비특허문헌 2) Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
(비특허문헌 3) Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
(비특허문헌 4) Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
(비특허문헌 5) Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
(비특허문헌 6) van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
(비특허문헌 7) Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
(비특허문헌 8) Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
(비특허문헌 9) Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
(비특허문헌 10) Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
(비특허문헌 11) Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
(비특허문헌 12) Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
(비특허문헌 13) Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
(비특허문헌 14) O'Connor TP et.al., Neural Dev. 2009 May 23;4:18
(비특허문헌 15) Hirota E. et.al., Int J Oncol. 2006 Oct; 29(4):799-827
발명의 요약
본 발명은, 최소한 부분적으로, 면역치료법의 적합한 표적으로서 작용할 수 있는 신규한 펩티드의 발견에 기초한다. TAA는 일반적으로 면역계에 의해 "자기(self)"로 인지되어 따라서 종종 면역원성(immunogenicity)을 갖지 않기 때문에, 적절한 표적의 발견은 매우 중요하다. 상기에 언급한 것과 같이, SEMA5B(예를 들어, GenBank Accession No. NM_001031702(서열번호: 48)의 유전자로 암호화된 서열번호: 49))는 식도암(esophageal cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), RCC 및 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC)을 포함하나, 이에 한정하지 않는, 암에서 상향 조절된(up-regulated) 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명은 SEMA5B를 적합한 면역치료 표적으로 제공될 수 있고 더욱 특이적이고 신규한 SEMA5B 에피토프 펩티드(epitope peptides)를 암/종양 면역치료의 표적 후보자로 초점을 맞춘다.
그 목적을 위하여, 본 발명은, 최소한 부분적으로, SEMA5B에서 유래된 펩티드 중에서 SEMA5B 특이적인 CTL을 유도하는 능력을 갖는 특이적 에피토프 펩티드를 동정하기 위함이다. 하기에 더 자세히 기술된 것과 같이, 건강한 공여자로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 SEMA5B에서 유래된 HLA-A*0201에 결합하는 후보 펩티드를 사용하여 자극되었다. 그런 다음 각 후보 펩티드로 부가된(pulsed) HLA-A2 양성 표적 세포에 대하여 특이적 세포독성을 갖는 CTL 세포주가 수립되었다. 결과는 여기에서 이러한 펩티드가 SEMA5B를 발현하는 세포에 대해 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A2에 제한된 에피토프 펩티드임을 증명한다. 이러한 결과는 더욱이 SEMA5B는 강한 면역성을 가지며 그것의 에피토프는 암/종양 면역치료법에 효과적인 표적임을 확인한다.
따라서, 본 발명의 목적은 HLA 항원에 결합하고 SEMA5B(서열번호: 49)의 면역학적 활성 단편을 포함한 분리된 펩티드를 제공하는 것이다. 이러한 펩티드는 CTL 유도성(inducibility)을 가지는 것으로 예상되고, 따라서, 시험관내(in vitro) 또는 체외(ex vivo)에서 CTL을 유도하거나 암에 대하여 면역 반응을 유도하기 위해 개체에 투여될 수 있으며, 암의 예는 식도암, NSCLC, RCC 및SCLC를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 펩티드는 노나펩티드(nonapeptide) 및 데카펩티드(decapeptide)이고, 더욱 바람직하게는, 서열번호: 1 내지 7 및 9 내지 47 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 노나펩티드 및 데카펩티드이다. 서열번호: 5, 7, 27 및 34 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 강력한 CTL 유도성을 나타내고 따라서 특히 바람직하다.
본 발명은 변형된 펩티드가 본래의 변형되지 않은 펩티드의 필수적인 CTL 유도성을 유지하는 한, 서열번호: 5, 7, 27 및 34 중으로부터 선택되고, 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 치환(substituted), 삭제(deleted), 삽입(inserted) 또는 첨가(added)된 아미노산 서열을 가지는 변형된 펩티드도 또한 포함한다. 그 목적을 위하여, 본 발명은 하기를 포함한 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 14, 13, 12, 11 또는 10개 아미노산보다 짧은 길이의 분리된 펩티드를 제공한다:
(i) 서열번호: 5 및 7로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로, 결과적인 변형된 펩티드가 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)를 유도한다면, 상기 아미노산은 1, 2, 또는 여러 개의 아미노산(들)이 치환, 삭제, 삽입 또는 첨가된다, 및
(ii) (i)에 있어서, 상기 아미노산 서열은 하기의 특징 중 하나 또는 모두를 갖는다:
(a) 서열번호의 N-말단(N-terminus)에서 두 번째 아미노산은 루신(leucine) 및 메티오닌(methionine)을 포함하는 군으로부터 선택; 및
(b) 서열번호의 C-말단(C-terminal) 아미노산은 발린(valine) 및 루신을 포함하는 군으로부터 선택.
또한 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 15, 14, 13, 12, 또는 11개의 아미노산보다 짧은 길이의 변형된 펩티드도 제공한다:
(i') 서열번호: 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로, 결과적인 변형된 펩티드가 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구를 유도한다면, 상기 아미노산 서열은 1, 2, 또는 여러 개의 아미노산(들)이 치환, 삭제, 삽입 또는 첨가된다, 및
(ii') (i')에 있어서, 상기 아미노산 서열은 하기의 특징 중 하나 또는 모두를 갖는다:
(a) 서열번호의 N-말단에서 두 번째 아미노산은 루신 및 메티오닌을 포함하는 군으로부터 선택; 및
(b) 서열번호의 C-말단 아미노산은 발린 및 루신을 포함하는 군으로부터 선택.
여기에서 나타낸 바와 같이, 이러한 펩티드들은 APC에서 펩티드들이 APC와 접촉되거나, APC로 삽입될 때, 상기 (i), (ii), (i') 또는 (ii')의 펩티드를 제시하도록 가공될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 변형된 펩티드가 원래 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 유지하는 한, 서열번호: 5, 7, 27 및 34 중에서 선택된 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지는 변형된 펩티드도 포함한다. 그 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기를 포함한 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 14, 13, 12, 11, 또는 10개의 아미노산보다 짧은 길이의 분리된 펩티드를 제공한다:
(i) 서열번호: 5 및 7로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 1, 2, 또는 여러 개의 아미노산(들)이 치환, 삭제, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열로, 펩티드는 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구를 유도한다, 및
(ii) (i)의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 서열은 하기의 특징 중 하나 또는 모두를 갖는다:
(a) 상기 서열번호의 N-말단에서 두 번째 아미노산은 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택; 및
(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산은 발린 및 루신으로 구성되는 군으로부터 선택.
게다가, 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 15, 14, 13, 12, 또는 11개 아미노산보다 짧은 길이의 분리된 펩티드도 제공한다.
(i') 서열번호: 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에서 1, 2, 또는 여러 개의 아미노산(들)이 치환, 삭제, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열로, 상기 펩티드는 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구를 유도한다, 및
(ii') (i')의 아미노산 서열에 있어서, 상기 아미노산 서열은 하기의 특징 중 하나 또는 모두를 갖는다:
(a) 상기 서열번호의 N-말단에서 두 번째 아미노산은 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택; 및
(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산은 발린 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택.
이러한 펩티드들은 APC에서 이러한 펩티드들이 APC와 접촉되거나, APC로 삽입될 때 (i), (ii), (i'), 또는 (ii')의 펩티드를 제시하도록 가공된다.
본 발명은 본 발명의 어느 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 추가적으로 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하거나 준비하는 것에 이용될 수 있다. 본 발명의 상기-기술된 펩티드와 같이, 이러한 APC는 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 수 있다.
개체에 투여될 때, 본 발명의 펩티드는 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도하기 위하여 APC의 표면에 제시된다. 그러므로, 본 발명의 한 목적은 CTL을 유도하기 위해 본 발명에 의해 제공되는 어떤 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 혼입하는 제제(agents) 또는 조성물(compositions)을 제공하는 것이다. 이러한 제제 또는 조성물은 암의 치료 및/또는 예방(prophylaxis) 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지(prevention)에 대하여 이용될 수 있고, 특히 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC와 같은 암을 포함한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 제형화된 약제와 같이, 암의 치료 및/또는 예방 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한 약학적 제제 또는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 대신 또는 추가하여, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 본 발명의 펩티드 중 어느 것을 제시하는 활성 구성요소인 APC 또는 엑소솜(exosomes)을 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 본 발명의 펩티드를 개체 유래 APC에 접촉시키거나 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 삽입시킴으로써, HLA 항원과 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 APC 유도에 사용될 수 있다. 이러한 APC는 표적 펩티드를 표면에 제시하는 세포를 특이적으로 인지하는 CTL 유도능을 가지고 암 면역치료법에 이용된다. 따라서, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 APC 뿐만 아니라 이러한 방법에 의해 수득된 APC를 유도하는 방법을 포함한다. 게다가, 본 발명은 또한 CTL 유도성을 가지는 APC를 삽입하기 위한 제제 또는 조성물을 포함하고, 이러한 제제 또는 조성물은 본 발명의 어떤 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드든지 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 CTL 삽입 방법을 제공하는 것이고, 이러한 방법은 CD8 양성 T 세포(CD8 positive T cell)와 이의 표면에 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC 또는 엑소솜을 공배양하는(co-culturing) 단계 또는 본 발명의 펩티드에 결합하는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 아단위(subunit)를 둘 다 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시키는 단계를 포함하고, 여기에서 TCR은 세포 표면에 제시되는 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체와 결합할 수 있다. 이러한 방법으로 수득된 CTL은 암의 치료 및/또는 예방에서 유용하고, 암의 예는 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
그러나 본 발명의 또 다른 목적은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 APC를 제공하는 것이다. 본 발명은 더욱이 본 발명의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL을 제공한다. 이러한 APC 및 CTL은 암 면역치료법에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암에 대한 면역 반응을 그것을 필요로 하는 개체에 유도하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 SEMA5B 폴리펩티드 또는 이의 면역학적 활성 단편, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 제시하는 엑소좀 또는 APC 및 이를 이들의 표면에 제시하는 세포를 인지하는 CTL을 포함하는 제제 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 적용가능성(applicability)은 암과 같이, SEMA5B 과-발현과 관련되거나 이로부터 발생하고, 이러한 암의 예는 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
보다 특이적으로, 본 발명은 하기를 제공한다:
[1] 서열번호 49의 아미노산 서열 또는 이의 면역학적 활성 단편으로 구성되고, HLA 항원에 결합하며 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 유도하는 분리된 펩티드,
[2] [1]에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A2인 분리된 펩티드,
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 5, 7, 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드,
[4] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 분리된 펩티드:
(a) HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(CTL)를 유도하며, 서열번호 49의 아미노산 서열로 구성된 펩티드의 면역학적 활성 단편을 포함하는 분리된 펩티드,
(b) 상기 (a)에 있어서, 서열번호 5, 7, 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드,
(c) (i) (a) 또는 (b) 펩티드의 아미노산 서열에서 1, 2, 또는 다수의 아미노산(들)이 치환, 삭제, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하고 (ii) HLA 항원에 결합하며, (iii) 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는, 분리된 펩티드, 및
(d) (a), (b) 또는 (c)에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A2인, 분리된 펩티드,
[5] 하기의 특성 중 하나 또는 둘을 가지는, [4]의 분리된 펩티드:
(a) N-말단(N-terminus)에서부터 두 번째 아미노산은 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택; 및
(b) C-말단(C-terminal) 아미노산은 발린 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택,
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드는 노나펩티드nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인 분리된 펩티드,
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드,
[8] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 [7]의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드(들)을 포함하는 CTL 유도용 조성물,
[9] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 활성 성분을 포함하고:
(a) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들);
(b) [7]의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들);
(c) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 하나 또는 그 이상의 엑소좀(exosome)(들) 또는 APC(들);
(d) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 세포를 인지하는 하나 또는 그 이상의 CTL(들); 및
(e) 이의 조합
하기로 구성된 군으로부터 선택된 목적을 위해 제형화된 약학적 조성물:
(i) 암의 치료,
(ii) 암의 예방,
(iii) 이의 수술 후 재발 방지, 및
(iv) 이의 조합,
[10] [9]에 있어서, 상기 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여하기 위해 제형화된 약학적 조성물,
[11] [9] 또는 [10]에 있어서, 상기 조성물은 암의 치료를 위해 제형화된 약학적 조성물,
[12] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는, CTL 유도성을 갖는 항원제시세포(Antigen-presenting cell; APC)를 유도하는 방법:
(a) 시험관내(in vitro), 체외(ex vivo) 및 생체내(in vivo)에서 제 1항 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드와 APC를 접촉하는 단계, 및
(b) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 삽입하는 단계,
[13] 하기의 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL을 유도하는 방법:
(a) CD8 양성 T 세포와, HLA 항원 및 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 APC를 공배양하는 단계;
(b) CD8 양성 T 세포와, HLA 항원 및 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 엑소좀을 공배양하는 단계; 및
(c) 세포 표면에 제시된, HLA 항원 및 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체에 결합할 수 있는, T 세포 수용체(TCR) 아단위(subunits) 둘을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들을 CD8 양성 T 세포 내로 삽입하는 단계,
[14] HLA 항원 및 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 APC,
[15] [14]에 있어서, 상기 APC는 [12]의 방법으로 유도된 APC,
[16] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL,
[17] [16]에 있어서, 상기 CTL은 [13]의 방법으로 유도된 CTL,
[18] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 상기 펩티드 또는 상기 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대한 면역반응이 필요한 개체에서 암에 대한 면역반응을 유도하는 방법,
[19] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드에 대한 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편,
[20] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열을 포함하는 벡터,
[21] [20]에 따른 발현 벡터로 형질전환(transformated) 또는 형질감염(transfected)된 숙주 세포, 및
[22] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드, [7]의 폴리뉴클레오티드 또는 [19]의 항체를 포함하는 진단 키트.
또 다른 실시예에 있어서, [4]의 분리된 펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:
(a) HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(CTL)을 유도하며 서열번호 49의 아미노산 서열 또는 이의 면역학적 활성 단편으로 구성된 분리된 펩티드,
(b) 서열번호 5, 7, 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, (a) 또는 (b)의 분리된 펩티드,
(c) 변형된 펩티드가 HLA 항원과 결합하고 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지한다면, 1, 2, 또는 여러 개의 아미노산(등)이 치환, 삭제, 삽입, 또는 첨가된, 서열번호 5, 7, 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드, 및
(d) HLA 항원은 HLA-A2인, (a), (b) 또는 (c)의 분리된 펩티드.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명의 [4] 및 [5]는 하기 [4'] 및 [5']일 수 있다.
[4'] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 분리된 펩티드:
(a) HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(CTL)를 유도하며, 서열번호 49의 아미노산 서열로 구성된 펩티드의 면역학적 활성 단편을 포함하는 분리된 펩티드,
(b) (a)에 있어서, 상기 면역학적 활성 단편은 서열번호 5, 7, 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드,
(c) (i) (a) 또는 (b) 펩티드의 아미노산 서열에서 1, 2, 또는 다수의 아미노산(들)이 치환, 삭제, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하고, (ii) HLA 항원에 결합하며, (iii) 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는, 분리된 펩티드, 및
(d) (a), (b) 또는 (c)에 있어서, HLA 항원은 HLA-A2인, 분리된 펩티드.
[5'] [4]에 있어서, 상기 면역학적 활성 단편은 서열번호 5, 7, 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되고, 하기의 특성 중 하나 또는 둘을 가지는, 분리된 펩티드:
(a) N-말단(N-terminus)에서부터 두 번째 아미노산은 루신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택; 및
(b) C-말단(C-terminal) 아미노산은 발린(valine) 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택.
본 발명의 목적 및 특징은 함께 있는 도면 및 실시예를 포함하는 하기의 자세한 묘사를 읽을 때 더욱 확실히 명백해 질 것이다 앞에서 언급한 본 발명의 요약 및 하기의 자세한 묘사는 모두 실시예에 설명되어 있어 이해될 것이고, 본 발명 또는 본 발명의 다른 대안적 실시예에 제한되지 않는다.
특히, 본 발명은 많은 특정한 실시예와 관련하여 기술되어 있고, 이러한 기술은 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 구성을 제한하지 않는다. 다양한 변형 및 적용이, 본 발명의 뜻(spirit) 및 범위(scope) 내에서, 첨부된 청구항에 의해 기술된 것과 같이, 당업자에게 일어날 수 있다. 유사하게, 본 발명의 다른 목적, 특징, 유용성(benefit) 및 이점(advantages)은 이러한 요약 및 하기에 기술된 특정 실시예로부터 명백해질 것이고, 용이하게 당업자에게도 명백할 것이다. 이러한 목적, 특징, 유용성 및 이점은 동반되는 실시예, 데이터, 도면 및 그로부터 가능한 모든 타당한 추론과 함께, 단독으로 또는 여기서 통합된 참조문헌과 고려되어, 상기로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 다양한 측면 및 적용은 하기의 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 자세한 설명 및 이의 바람직한 실시예를 고려하여 당업자에게 명백해 질 것이다.
[도 1] 도 1은 SEMA5B 유래 펩티드로 유도된 CTL에 대한 IFN-감마(gamma) ELISPOT 분석의 결과를 묘사하는 일련의 사진, (a) 내지 (e)로 구성된다. SEMA5B-A02-9-70(서열번호: 5)으로 자극된 #1 번 웰 (a), SEMA5B-A02-9-1049(서열번호: 7)로 자극된 #7 번 웰 (b), SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27)로 자극된 #5 번 웰 (c) 및 SEMA5B-A02-10-370(서열번호: 34)로 자극된 #5 번 웰 (d)는 각각, 대조군에 비해 강력한 IFN-감마 생산을 나타냈다. 이러한 웰 사진의 사각형은 해당하는 웰의 세포가 CTL 세포주를 수립하기 위해 증식한 것을 나타낸다. 대조적으로, 음성 데이터의 전형적인 예로, SEMA5B-A02-9-59(서열번호: 8) (e)로 자극된 CTL로부터 특이적인 IFN-감마 생산은 제시되지 않았다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, "-"는 어떤 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다.
[도 2] 도 2는 (a) SEMA5B-A02-9-70(서열번호: 5), (b) SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27) 및 (c) SEMA5B-A02-10-370(서열번호: 34)로 자극된 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 입증하는, IFN-감마 ELISA 분석의 결과를 묘사하는, 일련의 선 그래프, (a) 내지 (c)로 구성된다. CTL이 생산한 IFN-감마의 양은 IFN-감마 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 측정된다. 상기 결과는 각 펩티드 자극에 의해 수립된 CTL 세포주가 대조군에 비해 강력한 IFN-감마 생산을 제시하는 것을 입증한다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고, "-"는 어떤 펩티드로도 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다. R/S 비율은 반응 세포(CTL 세포주) 및 자극 세포의 수에 대한 비율을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 (a) SEMA5B-A02-9-70(서열번호: 5), (b) SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27) 및 (c) SEMA5B-A02-10-370(서열번호: 34)로 자극된 CTL 세포주로부터 제한 희석(limiting dilution)되어 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 묘사하는, 일련의 선 그래프, (a) 내지 (c)로 구성된다. 이러한 결과는 대조군과 비교하여 각 펩티드에 의해 자극되어 수립된 CTL 클론이 강력한 IFN-감마 생산을 보인 것을 증명한다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타내고 "-"는 어떤 펩티드로도 부가되지 않은 표적 세포에 대하여 IFN-감마 생산을 나타낸다. R/S 비율은 반응 세포(CTL 클론) 및 자극 세포의 수에 대한 비율을 나타낸다.
[도 4] 도 4는 SEMA5B 및 HLA-A*0201을 외생적(exogenously)으로 발현하는 표적세포에 대하여 특이적인 CTL 활성을 묘사하는 선 그래프이다. HLA-A*0201 또는 전장의 SEMA5B 유전자가 형질감염된(transfected) COS7 세포가 대조군으로 제조되었다. SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27)으로 수립된 CTL 세포주는 SEMA5B 및 HLA-A*0201 둘다로 형질전환된 COS7 세포에 대하여 특이적 CTL 활성을 제시했다(검정색 삼각형). 한편, HLA-A*0201(흰색 삼각형) 또는 SEMA5B(흰색 원) 둘 중 어느 하나를 발현하는 표적 세포에 대한 어떠한 유의적인 특이적 CTL 활성도 탐지되지 않았다.
실시예에 대한 설명
비록 여기에서 기술한 것과 유사하거나 또는 동등한 어떤 방법 및 재료가 본 발명의 실시예의 검사 또는 실행에서 사용될 수 있지만, 선호되는 방법, 장치, 및 재료는 여기서 기술된다. 하지만, 본 발명의 재료 및 방법을 기술하기 전에, 이러한 설명이 전적으로 설명하는 것일 뿐 제한하려는 의도가 아닌 것이 이해되어야 한다. 본 발명이 여기에서 기재된, 특정한 크기, 모양, 규모, 물질, 방법론, 프로토콜 등이 제한되지 않으며, 일반적인 실험 및/또는 최적화에 따라 다를 수 있음이 또한 이해되어야 한다. 더욱이, 본 기술에서 사용되는 전문용어(terminology)는 오직 특정 버젼(version) 또는 실시예를 기술하는 것을 목적으로 하고, 오직 하기 청구항에 의해서만 제한할 뿐 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
본 명세서에서 언급된 각 발표(publication)의 공개, 특허 또는 특허 출원은 그 전문이 구체적으로 여기에서 참고문헌으로 통합된다. 하지만, 어느 것도 여기에서 이전 발명 또는 그러한 공개보다 선행한다는 자격으로 본 발명에서 인정되지 아니함을 이해해야 한다.
따로 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 대립이 있는 경우에는, 용어의 정의를 포함한, 본 명세서가 규제할 것이다. 또한, 재료(materials), 방법, 및 실시예는 오직 설명하는 것이며 제한하려는 것이 아니다.
I. 정의
여기에서 사용되는 단어 "a", "an", 및 "the"는 따로 명시되지 않는 한, "적어도 1개"를 의미한다.
물질(예를 들면, 펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 등)과 관련되어 사용된 용어 "분리된(isolated)" 및 "정제된(purified)"은 물질이 자연 물질에 그밖에 포함될 수 있는 적어도 하나의 물질을 완전히 제거함을 가리킨다. 따라서, 분리된 또는 정제된 펩티드는 탄수화물, 지질, 또는 펩티드가 유래된 세포나 조직원으로부터의 다른 오염 단백질과 같은 세포 물질이 완전히 제거된, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 완전히 제거된 펩티드를 지칭한다. 용어 "세포 물질이 완전히 제거된"은 분리되거나 재조합하여 생산된 세포로부터 세포 내 구성 물질에서 분리된 펩티드의 준비를 포함한다. 따라서, 세포 내 구성 물질이 완전히 제거된 펩티드는 (여기에서 "오염 단백질"로 또한 지칭되는) 이종(heterologous) 단백질을 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 중량) 미만으로 가지는 폴리펩티드의 준비를 포함한다. 펩티드가 재조합하여 생산될 때, 이는 또한 배양 배지가 완전히 제거되는 것이 선호되고, 이는 펩티드의 준비 부피의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만의 배양 배지로 펩티드의 준비를 포함한다. 펩티드가 화학적 합성에 의해 생산될 때, 이는 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 완전히 제거된 것을 선호하고, 이는 펩티드의 준비 부피의 약 30%, 20%, 10%, 5%(건조 중량) 미만의 펩티드 합성과 관련 있는 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질로 펩티드의 준비를 포함한다. 특이적 펩티드 준비는 분리되거나 정제된 단백질을 포함한다는 것은 예를 들면, 단백질 준비 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색의 SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 또는 젤과 유사한 것에 따른 단일 밴드 양상에 의해 제시될 수 있다. 선호된 실시예에 있어서, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 분리되거나 정제된다.
여기에서 용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 중합체에 관련하여 호환적으로 사용된다. 이러한 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기(들)가 변형된 잔기(들), 또는 자연적으로 발생한 아미노산 중합체(naturally occurring amino acid polymer)뿐만 아니라, 자연적으로 발생한 아미노산(들)에 상응하는 인공 화학 모방체(artificial chemical mimetic)(들)와 같이, 비자연적으로 발생한 잔기(non-naturally occurring residue)(들)를 가질 수 있는 아미노산 중합체에 적용된다.
본 명세서에서 종종 사용된 용어 "올리고펩티드(oligopeptide)"는 20개 잔기 또는 보다 적은, 일반적으로 15개 잔기 또는 보다 적은 길이이고 일반적으로 약 8개 및 약 11개 사이의 잔기, 종종 9개 또는 10개 잔기 사이로 구성되는 본 발명의 펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 후자는 여기에서 각각 "노나펩티드" 및 "데카펩티드"를 지칭한다.
여기에서 사용되듯이 용어 "아미노산(amino acid)"은 자연적으로 발생한 아미노산과 비슷한 기능을 하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체 뿐만 아니라 자연적으로 발생 및 합성(synthetic)한 아미노산을 지칭한다. 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산 중 어느 하나일 수 있다. 자연적으로 발생한 아미노산은 세포에서 번역(tranlation) 후에 변형된 것뿐 아니라, 유전자 코드에 의해 암호화된 것이다(예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(γ-carboxyglutamate), 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)). 구 "아미노산 유사체"는 자연적으로 발생한 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 가지고 있지만(수소, 카복실기, 아미노기, 및 R기에 결합하는 α 탄소), 하나 또는 그 이상의 변형된 R 기(들) 또는 변형된 골격(backbone)을 가지는 화합물을 지칭한다(예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)). 구 "아미노산 모방체"는 다른 구조를 갖지만 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 지칭한다.
아미노산은 여기에서 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회가 권장하는 일반적으로 알려진 3문자 약어(symbol) 또는 1문자 약어에 의해 지칭될 수 있다.
용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 여기에서 호환되어 사용되고, 따로 명시되지 않는 한 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 지칭되는 아미노산과 유사하다.
용어 "제제(agent)" 및 "조성물(composition)"은 구체적 양의 구체적 구성의 조합으로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 형성되는 어떠한 생산물뿐만 아니라, 구체적 양의 구체적 성분을 포함하는 생산물에 관해 호환적으로 사용된다. 이러한 용어는, 조절자 "약학적"("약학적 제제" 및 "약학적 조성물"에서처럼)에 관하여 사용될 때 유효 성분(들), 및 운반체를 구성하는 어떤 부속 성분(들)을 포함하는 생산물뿐만 아니라, 직접적으로 또는 간접적으로, 어떤 둘 또는 그 이상의 성분의 조합, 복합(complexation) 또는 집적(aggregation)으로부터, 또는 성분의 하나 또는 그 이상의 분리로부터, 또는 성분의 하나 또는 그 이상의 반응 또는 상호결합의 다른 종류로부터 형성되는 어떤 생산물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 내용에서, 용어 "약학적 제제" 및 "약학적 조성물"은 본 발명의 분자 또는 화합물과 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 운반체를 혼합함으로써 제조된 어떤 생산물을 지칭한다.
여기서 사용되듯이, 구 "약학적으로 허용가능한 운반체" 또는 "생리학적으로 허용가능한 운반체"는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 재료, 조성물, 물질 또는 수단(vehicle)을 의미하고, 액체 또는 고체 필러(filler), 희석제, 첨가제, 영제 또는 캡슐화 물질(encapsulating material)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 백신(vaccine)으로 특히 사용된다. 본 발명의 내용에서, 구 "백신"(또한 "면역성 조성물(immunogenic composition)"로 지칭된)은 동물에 접종할 때 항-종양 면역력(immunity)을 유도하는 기능을 가지는 제제 또는 조성물을 지칭한다.
여기에서 용어 "유효 성분"은 생물학적 또는 생리학적인 활성이 있는 제제 또는 조성물 내 물질을 지칭한다. 특별히, 약학적 제제 또는 조성물의 맥락에서, 용어 "유효 성분"은 약리작용을 목적으로 보이는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 암의 치료 또는 예방으로 사용되는 약학적 제제 또는 조성물의 경우, 제제 또는 조성물 속의 유효 성분은 직접적으로나 간접적으로 암 세포 및/또는 조직에 최소한 하나의 생물학적 또는 생리학적 작용을 유도할 수 있다. 가급적이면, 이러한 작용은 암세포 성장을 감소 또는 억제, 암세포 및/또는 조직의 손상 또는 제거, 등을 포함할 것이다. 전형적으로, 유효 성분의 간접효과는 CTL의 인식 또는 암세포의 제거를 유도한다. 제형화되기 이전에, "유효 성분"은 또한 "대량(bulk)", "약의 원료" 또는 "기술적 생산물"로 언급될 것이다.
별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 "암(cancer)"은 SEMA5B 유전자를 과발현하는 암으로, 그 예는 식도암(esophageal cancer), NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
별도로 명시되지 않는 한, 용어 "세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)", "세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)" 및 "CTL"은 여기에서 호환되어 사용되며 따로 특별히 명시되지 않는 한, 비자기 세포(non-self cell, 예를 들면 종양/암 세포, 바이러스에 감염된 세포)를 인식할 수 있고 이러한 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 림프구의 하위집단(sub-group)을 지칭한다.
별도로 명시되지 않는 한, 여기에서 사용되듯이, 용어 "HLA-A2"는 대표하는 아형을 지칭하는 것으로, 이의 예는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 및 HLA-A*0250을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
별도로 명시되지 않는 한, 여기에서 사용되듯이 용어 "키트(kit)"는 시약(reagent) 및 다른 재료의 혼합과 관련하여 사용된다. 키트는 마이크로어레이(microarray), 칩(chip), 마커(marker) 등을 포함할 수 있다고 여기에서 여겨진다. 용어 "키트"는 시약 및/또는 다른 재료의 특정 혼합으로 한정되지 않는다.
여기에서 사용되듯이, 개체 또는 환자의 맥락에서, 구 "개체의(또는 환자의) HLA 항원인 HLA-A2"는 개체 또는 환자가 동형 또는 이형으로 HLA-A2 항원 유전자를 MHC(주요 조직 적합 유전자 복합체) 클래스 I 분자로서 소유하고, HLA-A2 항원은 HLA항원으로서 개체 또는 환자의 세포에서 발현되는 것을 지칭한다.
본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "치료(treatment)"라는 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, 개체 내에서 암의 크기, 유병(prevalence), 또는 전이력(metastatic potential)의 감소, 생존 시간, 수술 후 재발의 방지 등과 같은 임상적 이득을 초래한다면 치료는 "효과적(efficacious)"인 것으로 여겨진다. 치료가 예방적으로 이용될 때, "효과적"은 치료가 암의 형성을 지연 또는 방지하거나 또는 암의 임상적 증상을 방지 또는 경감시키는 것을 의미한다. 효과는 특정 종양 타입을 진단하거나 또는 치료하기 위해 알려진 어떤 방법과 연관되어 결정된다.
본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "방지(prevention)" 및 "예방(prophylaxis)"의 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, 질병으로부터 치사율(mortality) 또는 사망률(morbidity)의 부담(burden)을 감소시키는 어떤 활성을 지칭하기 위하여 이러한 용어들은 여기서 상호교환되어 사용된다. 방지 및 예방은 "1차, 2차 및 3차 예방 수준"에서 일어날 수 있다. 1차 방지 및 예방은 질병의 발달을 피하는 것인 반면, 2차 및 3차 방지 및 예방은 기능을 복구 또는 질병 관련 합병증을 감소시킴으로서 이미 수립된 질병의 부정적인 영향을 감소시킬 뿐 아니라 질병 진행 및 증상 발생의 방지 및 예방이 목적인 활성을 포함한다. 대안하여, 방지 및 예방은 특정 장애(disorder)의 심각도를 완화시키는, 예를 들면 종양의 증식 및 전이를 감소시키는, 예방적 치료법의 넓은 범위를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 암의 치료 및/또는 예방 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지는 예를 들면, 암 세포의 수술적 제거, 암성 세포의 성장 억제, 종양의 퇴화(involution) 또는 퇴행(regression), 암 발생의 완화(remission) 및 억제(suppression) 유도, 종양의 퇴행, 및 전이의 감소 또는 억제, 암의 수술 후 재발의 억제, 및 생존 시간의 연장과 같은, 이벤트를 유도하는 어떠한 활성을 포함한다. 효과적인 암의 치료 및/또는 예방은 치사율을 감소시키고 암 환자 개개인의 예후를 개선시키며, 혈액에 있는 종양 마커의 수준을 감소시키고, 암에 동반되는 탐지가능한 증상을 완화시킨다. 예를 들면, 증상의 감소 또는 개선은 효과적인 치료로 구성되고 및/또는 예방은 10%, 20%, 30%, 또는 그 이상의 감소, 또는 안정 병변(stable disease)을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항체(antibody)"는 지정된 단백질 또는 그것의 펩티드에 대해 특이적으로 반응하는 면역글로불린(immunoglobulin) 및 그것의 단편을 의미한다. 항체는 인간 항체(human antibodies), 영장류 항체(primatized antibodies), 키메라 항체(chimeric antibodies), 이중특이적 항체(bispecific antibodies), 인간화된 항체(humanized antibodies), 다른 단백질 또는 방사선 표지와 결합된 항체, 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 또한, 여기서 항체는 넓은 의미에서 사용되고 특히 완전한 단일클론 항체(intact monoclonal antibodies), 다클론 항체(polyclonal abtibodies), 최소한 2개의 완전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(multispecific antibodies, 예를 들면 이중특이적 항체(bispecific antibodies)), 및 항체 단편을 그들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 포함한다. "항체"는 모든 종류(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)를 가르킨다.
II . 펩티드:
하기에 자세히 기재된 본 발명의 펩티드는 "SEMA5B 펩티드(들)" 또는 "SEMA5B 폴리펩티드(들)"처럼 지칭될 수 있다.
SEMA5B로부터 유래된 펩티드가 CTL에 의해 인식되는 항원으로서 기능하는 것을 보이기 위하여, SEMA5B(서열 번호: 49)에서 유래된 펩티드가 흔히 HLA 대립 유전자와 만나는 HLA-A2에 의해 제한되는 항원 에피토프인지를 결정하기 위하여 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155:4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994).
HLA-A2와의 결합 친화력(binding affinity)을 바탕으로 SEMA5B로부터 유래된 HLA-A2 결합 펩티드 후보가 동정되었다. 하기 후보 펩티드가 확인되었다:
SEMA5B-A2-9-330(서열번호: 1),
SEMA5B-A2-9-450(서열번호: 2),
SEMA5B-A2-9-69(서열번호: 3),
SEMA5B-A2-9-1045(서열번호: 4),
SEMA5B-A2-9-70(서열번호: 5),
SEMA5B-A2-9-287(서열번호: 6),
SEMA5B-A2-9-1049(서열번호: 7),
SEMA5B-A2-9-447(서열번호: 9),
SEMA5B-A2-9-592(서열번호: 10),
SEMA5B-A2-9-281(서열번호: 11),
SEMA5B-A2-9-52(서열번호: 12),
SEMA5B-A2-9-543(서열번호: 13),
SEMA5B-A2-9-24(서열번호: 14),
SEMA5B-A2-9-35(서열번호: 15),
SEMA5B-A2-9-313(서열번호: 16),
SEMA5B-A2-9-155(서열번호: 17),
SEMA5B-A2-9-648(서열번호: 18),
SEMA5B-A2-9-68(서열번호: 19),
SEMA5B-A2-9-218(서열번호: 20),
SEMA5B-A2-9-43(서열번호: 21),
SEMA5B-A2-9-148(서열번호: 22),
SEMA5B-A2-9-31(서열번호: 23),
SEMA5B-A2-9-590(서열번호: 24),
SEMA5B-A2-10-449(서열번호: 25),
SEMA5B-A2-10-145(서열번호: 26),
SEMA5B-A2-10-69(서열번호: 27),
SEMA5B-A2-10-1045(서열번호: 28),
SEMA5B-A2-10-58(서열번호: 29),
SEMA5B-A2-10-533(서열번호: 30),
SEMA5B-A2-10-42(서열번호: 31),
SEMA5B-A2-10-68(서열번호: 32),
SEMA5B-A2-10-508(서열번호: 33),
SEMA5B-A2-10-370(서열번호: 34),
SEMA5B-A2-10-539(서열번호: 35),
SEMA5B-A2-10-38(서열번호: 36),
SEMA5B-A2-10-441(서열번호: 37),
SEMA5B-A2-10-35(서열번호: 38),
SEMA5B-A2-10-484(서열번호: 39),
SEMA5B-A2-10-137(서열번호: 40),
SEMA5B-A2-10-148(서열번호: 41),
SEMA5B-A2-10-479(서열번호: 42),
SEMA5B-A2-10-243(서열번호: 43),
SEMA5B-A2-10-106(서열번호: 44),
SEMA5B-A2-10-60(서열번호: 45),
SEMA5B-A2-10-281(서열번호: 46) 및
SEMA5B-A2-10-592(서열번호: 47).
또한, 시험관 내(in vitro)에서 이러한 펩티드를 부가한(pulsed)(적재한(loaded)) 수지상 세포(dendritic cells; DC)에 의해 T-세포를 자극시킨 후, CTL은 각각의 하기 펩티드와 함께 DC로 자극하여 성공적으로 수립되었다:
SEMA5B-A2-9-70(서열번호: 5),
SEMA5B-A2-9-1049(서열번호: 7),
SEMA5B-A2-10-69(서열번호: 27) 및
SEMA5B-A2-10-370(서열번호: 34).
이러한 수립된 CTL은 각각의 펩티드를 부가한 표적 세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 SEMA5B가 CTL에 의해 인식되는 항원이며 상기 검사되는 펩티드들은 HLA-A2에 의해 제한되는 SEMA5B의 에피토프 펩티드임을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 SEMA5B 유래 CTL로 인지되는 에피토프의 노나펩티드(nonapeptides, 아홉 개 아미노산 잔기로 구성된 펩티드) 및 데카펩티드(decapeptides, 열개의 아미노산으로 구성된 펩티드)를 제공한다. 또는, 본 발명은 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(CTL)를 유도하는 분리된 펩티드를 제공하고, 상기 펩티드는 SEMA5B의 면역학적 활성 단편(서열번호: 49)으로 구성된다. 보다 특이적으로, 일부 실시예에서, 본 발명은 서열번호 5, 7, 27 및 34 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다. 선호된 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 5, 7, 27 및 34 중으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드이다.
일반적으로, 인터넷상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램은, 예를 들면, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75 and Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17에 기재된 것으로서, 다양한 펩티드 및 HLA 항원 사이의 결합 친화성(binding affinities)을 컴퓨터상에서 계산하는 것에 사용될 수 있다. HLA 항원과의 결합 친화도는 예를 들면, Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220에 요약된, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17, 및 Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796에 기재된 것과 같이 측정될 수 있다. 결합 친화성을 결정하는 방법은, 예를 들면, the Journal of Immunological Methods,(1995, 185: 181-190) 및 Protein Science(2000, 9: 1838-1846)에 기재되어 있다. 그러므로 당업자는 HLA 항원에 강하게 결합 친화력을 가지는, SEMA5B로부터 유래된 이러한 단편을 선택하기 위해 이러한 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이렇게 알려진 프로그램으로 HLA 항원과 결합을 결정될 수 있는, SEMA5B 유래의 어떤 단편으로 구성된 펩티드를 포함한다. 더욱이, 이러한 펩티드는 SEMA5B의 전장으로 구성된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드들, 특히, 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드는, 이러한 펩티드들이 그들의 CTL 유도성을 유지하는 한 부가적인 아미노산 잔기가 측면에 배치될 수 있다. 특정한 부가적인 아미노산 잔기는, 그들이 원래의 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한 어떤 종류의 아미노산으로든 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 SEMA5B로부터 유래된 특정 펩티드를 포함하고, CTL 유도성 및 HLA 항원에 대한 결합 친화도를 가지는 펩티드를 포함한다. 이와 같은 펩티드는 예를 들면, 약 40개의 아미노산보다 적고, 종종 약 20개의 아미노산보다 적고, 일반적으로 약 15개의 아미노산보다 적다.
일반적으로, 펩티드 중의 하나, 둘, 여러 개 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 펩티드의 기능에 영향을 미치지 않거나, 어떠한 경우에는 원래 펩티드의 바람직한 기능을 향상시킬 수 있는 것이 알려져 있다. 사실, 변형된 펩티드(즉, 원래의 참조 서열에 대하여 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기를 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가됨으로써 변형된 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)가 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 보유하고 있다는 것이 알려져 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13). 따라서, 본 발명의 한 실시예에서, 본 발명의 CTL 유도성을 가지는 펩티드는 서열번호 5, 7, 27 및 34에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산이 첨가, 결실, 삽입 및/또는 치환된 펩티드로 구성된 것 일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 변형된 펩티드가 원래 펩티드의 CTL 유도성을 보존한다면, 서열번호 5, 7, 27 및 34로부터 선택된 아미노산 서열에서 하나, 둘, 또는 여러 개의 아미노산(들)이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성된 펩티드일 것이다.
당업자는 단독 아미노산 또는 전체 아미노산의 소수 비율로 변경된 아미노산 서열에 개개의 변형(예를 들머, 첨가, 삽입, 결실, 및/또는 치환)이 원래의 아미노산-쇄(chain) 특성의 보존을 야기하려고 함을 인지할 것이다. 이와 같이, 이는 "보존적 치환(conservative substitution)" 또는 "보존적 변형(conservative modification)"처럼 관용적으로 지칭되고, 단백질의 변경이 유사한 기능이 있는 단백질을 야기한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에서 잘 알려져 있다. 아미노산 측쇄 특징의 예는 소수성 아미노산(hydrophobic amino acids: A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(hydrophillic amino acids: R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공통적 특징을 가지는 측쇄를 포함한다; 지방족 측쇄(aliphatic side-chain: G, A, V, L, I, P); 수산기(hydroxy group)를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자(sulfur atom)를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드(carboxylic acid and amide)를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기(base)를 포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족(aromatic) 군을 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 또한, 하기 8개 군 각각은 서로에게 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(alanine; A), 글리신(glycine; G);
2) 아스파라긴산(aspartic acid; D), 글루탐산(glutamic acid; E);
3) 아스파라긴(asparagine; N), 글루타민(glutamine; Q);
4) 아르기닌(arginine; R), 리신(lysine; K);
5) 이소루신(isoleucine; I), 루신(leucine; L), 메티오닌(methionine; M), 발린(valine; V);
6) 페닐알라닌(phenylalanine; F), 티로신(tyrosine; Y), 트립토판(tryptophan; W);
7) 세린(serine; S), 트레오닌(threonine; T); 및
8) 시스테인(cysteine; C), 메티오닌(methionine; M)(예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 펩티드 또한 본 발명의 펩티드로 간주된다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들에 한정되지 않고 그 결과적인 변형된 펩티드가 원래 비변형된 펩티드의 필요한 CTL 유도성이 유지되는 한, 비-보존적인 변형도 포함할 수 있다. 또한, 변형된 펩티드는 다형성 변종(polymorphic variants), 종간 상동체(interspecies homologues), 및 SEMA5B 대립 유전자로부터 유래된 CTL 유도가능한 펩티드를 제외하지 않아야 한다.
아미노산 잔기는 본 발명의 펩티드에 삽입, 치환, 결실 및/또는 첨가될 수 있거나, 또는, 아미노산 잔기는 더 높은 결합 친화도를 달성하기 위해 그것으로부터 결실될 수 있다. 필수적인 CTL 유도성을 계속 유지하기 위하여, 소수만이(예를 들면, 1, 2 또는 여러 개) 또는 아미노산의 낮은 비율이 바람직하게 변형된다(삽입, 결실, 첨가/또는 치환). 여기에서, 용어 "여러 개"는 5 개 또는 그 이하의 아미노산, 예를 들면 4 또는 3 개 또는 그 이하의 아미노산을 의미한다. 변형되는 아미노산의 비율은 20% 또는 그 이하, 바람직하게 15% 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 10% 또는 그 이하, 가장 바람직하게 1 내지 5%일 수 있다.
암 면역치료법 맥락에서 사용되었을 경우, 본 발명의 펩티드는 세포의 표면 또는 엑소솜에 HLA 항원과 복합체로서 제시될 수 있다. 따라서, CTL을 유도하고 HLA 항원에 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 그 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩티드는 향상된 결합 친화성을 가지는 변형된 펩티드를 생산하기 위하여 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가로 변형될 수 있다. 자연적으로 나타나는 펩티드뿐만 아니라, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있기 때문에(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155:4307), 이러한 규칙성에 근거한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드(immunogenic peptides)에 삽입될 수 있다.
예를 들면, 높은 HLA-A2 결합 친화성을 보이는 펩티드는 N-말단으로부터 두 번째 아미노산을 루신 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산을 가지는 경향이 있다. 비슷하게, C-말단 아미노산이 발린 또는 루신으로 치환된 펩티드도 역시 알맞게 사용될 수 있다. 따라서, 서열번호 5, 7, 27 및 34 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드, 이는 상기 서열번호의 아미노산의 N-말단의 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 이는 상기 서열번호의 아미노산 서열의 C-말단이 발린 또는 루신으로 치환된 펩티드가 본 발명에 고려된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 서열번호 5, 7, 27 및 34 중으로부터 선택된 아미노산 서열의 N-말단에서 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환된, 및/또는 상기 서열번호의 아미노산의 C-말단이 발린 또는 루신으로 치환된 아미노산 서열을 가진 펩티드를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 5, 7, 27 및 34 중으로부터 선택된 아미노산의 N-말단에서 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환된, 및/또는 상기 서열번호의 아미노산 서열의 C-말단이 발린 또는 루신으로 치환된 아미노산을 포함할 수 있는 아미노산 서열로 구성된다.
한 실시예에서, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 펩티드를 제공하고, 여기에서 펩티드는 하기와 같이 (55) 내지 (58)로 구성된 군으로부터 선택된 일반적 형태를 가진다:
(55) -서열번호: 5에 해당되는-
Leu [X1] Pro Ser Leu Thr Leu Leu [X2],
(56) -서열번호: 7에 해당되는-
Gly [X1] Leu Thr Leu Ala Val Tyr [X2],
(57) -서열번호: 27에 해당되는-
Leu [X1] Leu Pro Ser Leu Thr Leu Leu [X2], 및
(58) -서열번호: 34에 해당되는-
Leu [X1] Tyr Gly Val Phe Thr Thr Asn [X2].
일반적 형태인 (55)-(58)에서, [X1]는 류신 또는 메티오닌, 및 [X2]는 발린 또는 류신이다.
더욱이, 본 발명은 또한 상기 정의된 일반적 형태인 (55)-(58)에 의해 나타낸 분리된 펩티드를 제공하고, 여기에 하나, 둘, 또는 여러 개 아미노산은 이의 N-말단 및 C-말단 둘 중 어느 하나 또는 둘 다에 첨가된다. 또한, 본 발명은 (55)-(58)에 의해 나타낸 분리된 펩티드를 더 제공하고, 여기에 하나, 둘 또는 여러 개 아미노산은 이의 N-말단 및 C-말단 둘 중 어느 하나 또는 둘 다에 제거된다.
치환은 말단 아미노산 뿐만 아니라 가능성 있는 펩티드의 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 인지 부위에 삽입될 수 있다. 여러 연구, 예를 들면 CAP1, p53(264-272), Her-2/neu(369-377) 또는 gp100(209-217)(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol.(2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother.(2003) 52: 199-206 및 S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004) 53, 307-314)는 아미노산 치환을 가지는 펩티드는 원래의 펩티드와 동일하거나 또는 보다 좋은 기능을 가질 수 있다는 것을 나타내었다.
본 발명은 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산이 본 발명의 펩티드의 N 및/또는 C-말단으로 첨가될 수 있음을 또한 고려한다. 높은 HLA 항원 결합 친화성이 있고 CTL 유도성을 보유하는 이러한 변형된 펩티드는 또한 본 발명에 포함된다.
예를 들면, 본 발명은 HLA 항원에 결합하고, CTL 유도성을 가지고, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 14, 13, 12, 11, 또는 10 개보다 적은 아미노산 길이의 분리된 펩티드를 제공한다:
(i) 하나, 둘 또는 여러 개 아미노산(들)이 변형된 서열번호 5 및 7로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
(ii) (i)의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 서열은 하기 특징 중 하나 또는 둘 다를 가진다:
(a) 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이거나 또는 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 류신 또는 메티오닌으로 변형됨; 및
(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산이거나 또는 상기 서열번호의 C-말단 아미노산이 발린 또는 류신으로 변형됨.
본 발명은 HLA 항원에 결합하고, CTL 유도성을 가지고, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 15, 14, 13, 12, 또는 11 개보다 적은 아미노산 길이의 분리된 펩티드를 또한 제공한다:
(i') 하나, 둘 또는 여러 개 아미노산(들)이 변형된 서열번호 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
(ii') (i')의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 서열은 하기 특징 중 하나 또는 둘 다를 가진다:
(a) 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이거나 또는 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 류신 또는 메티오닌으로 변형됨; 및
(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산이거나 또는 상기 서열번호의 C-말단 아미노산이 발린 또는 류신으로 변형됨.
이러한 펩티드는 이러한 펩티드가 APC와 접하거나, 삽입될 때, (i), (ii), (i'), 및 (ii')의 펩티드를 제시하기 위해 APC에 가공될 수 있다.
그러나, 상기 펩티드 서열이 서로 다른 기능을 가지는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 한 부분과 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역질환 및/또는 특정 물질에 대한 알레르기 증상 등의 부작용이 유발될 가능성이 있다. 따라서, 하나는 상기 펩티드 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 상황을 피하기 위해서 사용가능한 데이터베이스를 이용하여 상동성 검색을 수행할 수 있다. 목표 펩티드(objective peptide)와 하나 또는 두 개의 아미노산 차이가 있는 펩티드마저도 존재하지 않는다는 것이 상동성 검색에서 명백해질 경우, 어떠한 부작용의 위험 없이 HLA 항원과 결합 친화성을 증가시키고, 및/또는 CTL 유도성을 증가시키기 위해, 상기 목표 펩티드는 변형될 수 있다.
상기와 같이 HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드는 매우 효과적일 것이라고 기대되지만, 높은 결합 친화성의 존재에 따라 지표로서 선택된, 후보 펩티드는 CTL 유도성의 존재에 대해 한층 더 검토된다. 여기에서, 구 "CTL 유도성"은 항원-제시 세포(antigen-presenting cells; APCs) 상에 제시될 경우에 CTL을 유도하는 펩티드의 능력을 가리킨다. 또한, "CTL 유도성"은 펩티드의 CTL 활성화, CTL 증식을 유도하고, 표적세포의 CTL 용해를 촉진시키며, 및 CTL의 IFN-감마(gamma) 생산을 증가시키는 능력을 포함한다.
CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원을 보유하는 APCs(예를 들면, B-림프구, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell; DC)), 또는 보다 구체적으로는 인간 말초 혈액 단핵 백혈구(human peripheral blood mononuclear leukocytes)에서 유래된 수지상세포를 유도하고, 및 시험 펩티드를 사용하여 APC를 자극시킨 후, CTL을 유도하기 위해 CD8 양성 T 세포와 혼합하고, 그 후에 표적세포에 대한 CTL에 의해 생산 및 방출되는 표적 세포에 대해 IFN-감마를 측정하여 수행할 수 있다. 반응계로서, 인간 MHC(HLA) 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(예를 들면, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8):764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*2402/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response에 기재된 것)을 사용할 수 있다. 또는, 표적 세포를 51Cr 등으로 방사 표지할 수 있고, 표적 세포로부터 방출된 방사능으로부터 CTL 세포독성 활성을 산출할 수 있다. 또는, 이것은 고정화된 펩티드를 수반하는 세포의 존재하에 CTL에 의해 생산되고 발생된 IFN-감마(gamma)를 측정함으로써, 그리고 항-IFN-감마 단일클론 항체를 이용한 배지에서 억제 영역을 가시화함으로써 검사될 수 있다.
상기 기술된 펩티드의 CTL 유도성을 시험한 결과, 서열번호 5, 7, 27 및 34로 나타낸 아미노산 서열을 가지는 이러한 펩티드들 중에서 선택된 노나펩티드 및 데카펩티드가 특히 높은 CTL 유도성뿐만 아니라 HLA 항원에 높은 결합 친화성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 펩티드들은 본 발명의 바람직한 실시예로서 예시된다.
또한, 상동성 분석(homology analysis)의 결과는 이러한 펩티드들이 어떠한 다른 알려진 인간 유전자 산물 유래 펩티드와 현저한 상동성을 공유하지 않음을 증명하였다. 이것은 면역치료법에서 사용하였을 때 알려지지 않거나 또는 원하지 않은 면역 반응에 대한 가능성을 낮춘다. 그러므로, 또한 이러한 측면으로부터, 이러한 펩티드들은 암 환자의 SEMA5B에 대한 면역력을 이끌어내는 것에 유용하다. 따라서, 본 발명의 펩티드, 바람직하게, 서열번호 5, 7, 27 및 34 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 본 발명에 포함된다.
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명의 펩티드의 변형뿐 아니라, 결과로 야기된 연결된 펩티드가 원래의 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 유지하고, 보다 바람직하게, 또한, 이의 필요한 HLA 결합을 유지하는 한, 본 발명의 펩티드는 다른 펩티드에 연결될 수 있다. 적당한 "다른" 펩티드의 예는 하기를 포함한다: 다른 TAA로부터 유래된 본 발명의 펩티드 또는 CTL 유도성 펩티드. 본 발명의 펩티드는 링커(linker)를 통해 직접적 또는 간접적으로 "다른"펩티드와 연결될 수 있다. 펩티드 사이의 링커는 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들면, AAY(P.M. Daftarian et al., J Trans Med 2007. 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000. 165: 7308-7315) 또는 K(S. Ota et al., Can Res. 62. 1471-1476. K.S. Kawamura et al., J Immunol. 2002. 168: 5709-5715)가 있다.
예를 들면, 비-SEMA5B(non-SEMA5B) 종양-관련 항원으로부터 유래한 펩티드는 HLA 종류 I 및/또는 종류 II를 통해서 면역 반응을 증가시키기 위하여 또한 사용될 수 있다. 암 세포는 하나 이상의 종양관련 유전자를 발현할 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 특정 개체가 추가적 종양관련 유전자를 발현하는지를 결정하는 것 및 그 후 본 발명의 SEMA5B 조성물 또는 백신에서 상기 유전자의 발현 생산물로부터 유래된 HLA 종류 I 및/또는 HLA 종류 II 결합 펩티드를 포함하는 것은 당업자에게 통상적인 실험방법의 범위 내에 있다.
HLA 종류 I 및 HLA 종류 II 결합 펩티드의 예는 당업자에게 알려져 있고(예를 들면, Coulie. Stem Cells 13:393-403. 1995를 참조), 여기서 공개하는 것과 같은 방법으로 본 발명에서 사용될 수 있다. 당업자는 하나 또는 그 이상의 SEMA5B 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 비-SEMA5B 펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 또는 종래의 분자 생물학적 절차에 따라 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 준비할 수 있다.
상기 기재된 연결된 펩티드는 여기에서 "폴리톱(polytopes)"이라고 하며, 즉, 다양한 조절(예를 들면, 연결(concatenated), 겹침(overlapping))에서 함께 연결될 수 있는 펩티드를 자극시키는 둘 또는 그 이상의 잠재적인 면역형성적 또는 면역 반응의 군이다. 면역 반응을 자극, 증진 및/또는 유발시키는 폴리톱의 효과를 검사하기 위하여 상기 폴리톱(polytope, 또는 폴리톱을 암호화하는 핵산)은 표준 면역화 프로토콜에 따라, 예를 들면, 동물에 투여될 수 있다.
펩티드는 폴리톱을 형성하기 위해 직접적으로 또는 인근 서열의 사용을 통해 함께 연결될 수 있고, 백신으로서 폴리톱의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들면 Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849. 1995; Gilbert et al., Nature Biothechnol. 15(12):1280-1284. 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):882-826. 1996; Tarn et al., J Exp Med. 171(1):299-306. 1990을 참조). 에피토프의 다양한 수 및 조합을 포함하는 폴리톱이 제조될 수 있고 CTL에 의한 인지 및 면역 반응을 증강시키는 효과(efficacy)를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 그들이 필요한 CTL 유도성을 보유하고 있는 한, 다른 물질에 더 결합될 수 있다. 모범적인 물질, 예를 들어 "다른(other)" 물질은 펩티드, 지질, 당 및 당 측쇄, 아세틸기, 천연 및 합성 폴리머 등을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 상기 변형이 여기에 기재된 펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한, 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 및/또는 인산화 등의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능(예를 들어, 표적 기능, 및 전달 기능)을 제공하거나 또는 상기 폴리펩티드를 안정시키기 위해 수행될 수 있다.
예를 들면, 폴리펩티드의 생체 내 안정성을 증대시키기 위해, D-아미노산, 아미노산 모방체, 또는 비천연 아미노산을 삽입하는 것은 당업계에서 잘 알려져 있다; 이 개념은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 채택될 수 있다. 폴리펩티드의 안정성은 여러 가지 방법으로 검사될 수 있다. 예를 들면, 펩티다제(peptidases) 및 인간 혈장 및 혈청과 같은 다양한 생물학적 배지는 안정성 시험에 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302 참조).
본 발명의 펩티드가 시스테인(cysteine) 잔기를 포함할 때, 상기 펩티드는 시스테인 잔기의 SH 기(SH group) 사이의 이황화 결합(disulfide bond)을 통해 이합체(dimers)를 형성하는 경향이 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드의 이합체는 본 발명의 펩티드에 포함된다.
또한, 상기에 기술된 것과 같이, 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기에 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가되어 변형된 펩티드 중에서, 원래의 펩티드와 비교하여 동일하거나 또는 더 높은 활성을 갖는 것은 스크리닝되거나 또는 선택될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 원래의 것에 비교하여 동일하거나 더 높은 활성을 갖는 변형된 펩티드를 스크리닝하거나 또는 선택하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a: 본 발명 펩티드의 최소한 하나의 아미노산 잔기를 변형(즉, 치환, 결실, 삽입 또는 첨가)시키는 단계:
b: 단계 (a)에서 변형된 펩티드의 활성을 결정하는 단계: 및
c: 원래의 펩티드와 비교하여 동일하거나 더 높은 활성을 갖는 펩티드를 선택하는 단계.
여기에서, 상기 활성은 MHC 결합 활성, APC 또는 CTL 유도성을 포함할 수 있다. 바람직하게, 펩티드의 활성은 세포독성 활성이다.
III. SEMA5B 펩티드의 제조:
본 발명의 펩티드는 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성으로 합성적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로, 또는 두 개 또는 이상의 펩티드를 포함하는 더 긴 폴리펩티드로 합성할 수 있다. 상기 펩티드는 다른 자연적으로 발생한 숙주 세포 단백질 및 이의 단편, 또는 다른 화학 물질이 거의 없도록 분리, 즉 정제되거나 분리될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 여기서 기술하는 본 펩티드(original peptide)의 생물학적 활성을 저해하지 않는다면, 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 다른 예시적 변형은 펩티드의 혈청 반감기(serum half life)를 증가시키기 위해, D-아미노산 또는 사용될 수 있는 다른 아미노산 모방체의 통합을 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열을 기반으로 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 예를 들면, 합성에 적용될 수 있는 보편적인 펩티드 합성 방법은 하기를 포함한다:
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Preteins, Vol 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis(일본어),Maruzen Co, 1975;
(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1985;
(v) Development of Pharmaceuticals(제 2판)(일본어), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
(vi) WO99/67288; 및
(vii) Barany G. & Merrifield RB, Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.
또는, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 잘 알려진 유전자 조작 방법을 사용해서 얻을 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.) 1983, 101:347-62). 예를 들면, 우선, 목표 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 종류(예를 들면, 프로모터 서열에 해당하는 조절 서열의 아래부분(downstream))로 포함하여 적절한 벡터를 제조하고 적절한 숙주 세포에 형질전환한다. 또한, 이러한 벡터 및 숙주세포는 본 발명에 의해 제공된다. 그 다음에, 상기 숙주 세포를 원하는 펩티드를 제작하기 위해 배양한다. 또한 상기 펩티드는 시험관 내(in vitro) 번역 시스템을 조정하여(adapting) 시험관 내에서 제조될 수도 있다.
IV. 폴리뉴클레오티드:
본 발명은 본 발명의 상기 언급한 펩티드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 또한 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 SEMA5B 유전자(예를 들면, GenBank Accession No. NM_001031702(서열 번호: 48))에서 유래한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 여기에서, 구 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy) 때문에, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 어느 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌의 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩티드의 변경 없이 상기 코돈은 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 당업계에서 바람직하게 "침묵 변이(silent variations)"라 지칭하고, 보존적으로 변형된 변종의 한 종류를 나타낸다. 펩티드를 암호화하는 여기에 기재된 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종을 나타낸다. 당업자는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 따라서, 각각의 밝혀진 펩티드 암호화(peptide-encoding) 뉴클레오티드 서열은 그것과 함께 결합한 침묵변이에 내포되는 사실임을 나타낸다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로 구성될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있듯이, DNA 분자는 자연적으로 발생한 염기 A, T, C 및 G와 같은 염기로 적절하게 구성되고, T는 RNA에서 U로 대체된다. 당업자는 비-자연적으로 존재하는 염기 또한 폴리뉴클레오티드에 포함된다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 개입(intervening) 유무를 불문하고 본 발명의 펩티드를 포함하는 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 상기 개입 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들면, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대한 어떠한 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합형 폴리뉴클레오티드일 수 있고 또는 마커 유전자등을 가지는 발현 벡터(플라스미드)일 수도 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 중합효소(polymerase)및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조할 수 있다.
재조합 기술 및 화학 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드의 코딩 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터 내에 삽입하여 제작할 수 있고, 이는 반응능(competent) 세포로 형질감염될 때 발현될 수 있다. 또는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술을 사용하여 증폭될 수 있고 또는 적절한 숙주에서 복제될 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989를 참고). 또는, Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재되어 있는 것과 같이, 고체상 기술을 이용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
V. 엑소솜 ( Exosomes ):
본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜이라는 세포 내 소낭을 또한 제공한다. 엑소솜은 예를 들면, 일본 특허출원 제11-510507호 및 WO99/03499에 설명된 방법을 사용하여 제조할 수 있고, 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 얻어진 APCs를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 상기 펩티드와 유사한 방법으로 백신으로서 접종할 수 있다.
복합체에 포함된 HLA 항원의 종류는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원의 종류와 일치해야 한다. 예를 들면, 일본인을 위해서는, HLA-A2, 특히, HLA-A*0201 및 HLA-A*0206가 보통 적합하다. 일본인과 백인에게서 높게 발현되는 상기 HLA-A2 종류의 사용은 효과적인 결과를 얻기 위해 바람직하고, HLA-A*0201 및 HLA-A*0206과 같은 아류형(subtype)을 이용할 수 있다. 일반적으로, 임상에서는, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 종류는 미리 검사되고 있어, 상기 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화성을 갖거나, 항원제시에 의한 세포독성 T 세포(CTL) 유도성을 보이는 펩티드를 적절하게 선택하는 것이 가능하게 된다. 또한, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 가지는 펩티드를 얻기 위하여, 자연에 존재하는 SEMA5B 부분적 펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 하나, 둘 또는 여러 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가가 수행될 수 있다.
HLA 항원에 대한 HLA-A2형을 본 발명의 엑소솜을 위해 사용한 경우, 서열번호 5, 7, 27 및 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 특정한 유용성을 가진다. 어떤 실시예에서, 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 펩티드 및 HLA-A2 항원의 복합체를 이의 표면에 제시한다. 이러한 복합체에 포함된 HLA-A2 항원의 전형적인 예는 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
VI. 항원-제시 세포(antigen-presenting cells, APCs):
또한 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드와 형성된 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 항원-제시 세포(antigen presenting cell; APC)를 제공한다. 상기 APC는 치료 및/또는 예방을 받는 환자로부터 유래될 수 있고, 그 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜, 또는 CTL을 포함하는 다른 약물과 조합하여 백신으로 투여될 수 있다.
상기 APC는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않고, 림프구에 의해 인식되기 위하여 세포 표면에 단백질성 항원을 제시하는 것이 알려져 있는, 수지상세포(DC), 랑게르한스(Langerhans) 세포, 마크로파지(macrophage), B세포 및 활성화 T 세포를 포함한다. DCs는 강력한 CTL 유도 활성을 가지는 APCs 중 하나이므로, DC는 본 발명의 APC에 적합하다.
예를 들면, 말초 혈액 단핵구로부터 DC를 유도하고, 그런 다음 그것들을 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)시켜 본 발명의 APC를 유도할 수 있다. 본 발명의 펩티드가 개체에 투여될 때, 본 발명의 펩티드가 제시된 APC가 개체의 체내에서 유도된다. 따라서, 본 발명의 APC는 본 발명의 펩티드를 개체에 주입한 후 개체에서 수집할 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 상기 APC는 본 발명의 상기 펩티드가 주입된 개체로부터 수집한 APC와 접촉함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 APC는 그들 자체로 또는 상기 펩티드, 엑소솜 또는 본 발명의 CTL을 포함하는 다른 약물과의 조합으로, 개체에서 암에 대한 면역반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 외 투여는 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 첫 번째 개체로부터 APC 수집하는 단계,
b: 단계 a의 APC와, 본 발명의 펩티드를 접촉하는 단계, 및
c; 단계 b의 APC를 두 번째 개체에 투여하는 단계.
첫 번째 개체와 두 번째 개체는 같은 개체일 수 있고, 또는 다른 개체일 수 있다. 단계 b에서 수득된 APC는 암 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로 투여될 수 있고, 암의 예는 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함한다.
본 발명은 APC 유도용 약학적 조성물의 제조를 위한 방법 또는 과정을 또한 제공하며, 이 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)를 혼합하거나 제형화하는 과정을 포함한다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, 본 발명의 APC는 CTL 유도성을 가지고 있다. APC의 맥락에서, 구 "CTL 유도성을 가진다"는 어떠한 펩티드와도 접촉시키지 않는 APC의 것보다 더 높은 CTL 유도성을 보이는 것을 지칭한다. CTL 유도성을 가지는 이러한 APC는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서 APC에 전달하는 단계를 포함하는 방법뿐만 아니라 상기 언급된 방법으로 제조될 수 있다. 상기 도입된 유전자는 DNA 또는 RNA 종류일 수 있다. 삽입 방법의 예로는, 특별한 제한 없이, 리포펙션(lipofection), 전기천공법(electroporation), 또는 인산칼슘법과 같이 본 기술분야에서 일반적으로 실시되는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; 공개된 국제공개 일본여 번역문 제 2000-509281호에 기재된 것에 따라 실시할 수 있다. 유전자가 APC 내로 이동함으로써, 상기 유전자는 세포 안에서 전사 및 번역을 거치고, 이렇게 얻어진 단백질은 MHC 종류 I 또는 종류 II에 의해 처리되고, 제시 경로를 거쳐 본 발명의 일부 펩티드가 제시된다.
어떤 실시예에서, 본 발명의 APC는 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 APC이다. 이러한 복합체에 포함된 HLA-A2 항원의 전형적인 예는 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
VII . 세포독성 T 세포( Cytotoxic T lymphocytes ; CTL ):
본 발명의 임의의 펩티드에 대해 유도된 CTL은 생체 내에서 표적 암세포의 면역반응을 증강하고, 그로 인하여 상기 펩티드와 유사하게 백신으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 어떤 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화된 분리된 CTL을 제공한다.
이러한 CTL은 (1) 본 발명의 펩티드를 개체에 투여, (2) 시험관 내에서 개체 유래 APC 및 CD8 양성 T 세포 또는 말초 혈액 단핵 림프구와 본 발명의 펩티드를 함께 접촉(자극), (3) 시험관 내에서 CD8 양성 T 세포 또는 말초 혈액 단핵 림프구와 그것들의 표면에 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 APC 또는 엑소솜을 접촉 또는 (4) 본 발명의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체 아단위(subunit) 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입으로 얻어질 수 있고, 여기에서 TCR은 본 발명의 펩티드 및 HLA-A2 항원의 복합체를 세포 표면에 결합할 수 있다. CTL 준비에 사용될 이러한 APC 또는 엑소솜은 상기에 기재되 방법에 의해 제조될 수 있다. (4) 방법의 세부사항은 아래 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에 기재되어 있다.
본 발명의 CTL은 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 개체로부터 유래할 수 있고, 효과 조절의 목적을 위해 본 발명의 그 자체, 또는 본 발명의 펩티드, APC 또는 엑소솜을 포함한 다른 약물과의 조합으로 투여할 수 있다. 상기 얻어진 CTL은 본 발명의 펩티드, 예를 들어, 유도를 위해 사용한 것과 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 암세포와 같은 SEMA5B를 내생적으로 발현하는 세포, 또는 SEMA5B 유전자가 형질전환된 세포일 수 있고; 본 발명의 펩티드에 의한 자극에 의해 세포 표면에 상기 펩티드를 제시하는 세포도 활성화된 CTL 공격의 표적이 될 수 있다.
어떤 실시예에서, 본 발명의 CTL은 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 세포를 인지하는 CTL이다. CTL의 맥락에서, 구 "세포를 인지"는 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 TCR을 통해 세포 표면에 결합하고 세포에 대한 특이적인 세포독성 활성을 제시하는 것을 지칭한다. 여기에서, "특이적인 세포독성 활성"은 다른 세포를 제외한 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 세포에 대해 세포독성 활성을 제시하는 것을 지칭한다. 이러한 복합체에 포함된 HLA-A2 항원의 전형적인 예는 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
VIII . T 세포 수용체(T cell receptor , TCR ):
본 발명은 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 결합할 수 있는, TCR의 아단위(subunit) 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 및 이를 이용한 방법을 또한 제공한다. 이러한 TCR 아단위는 SEMA5B를 발현하는 종양세포에 대한 특이성을 T 세포에 부여하는 TCR 형성 능력을 가진다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 펩티드로 유도된 CTL의 TCR의 알파(alpha)- 및 베타(beta)- 사슬(chain)을 각각 암호화하는 핵산을 동정할 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288, (2003)). 예를 들면, PCR 방법은 TCR을 분석하는데 바람직하다. 상기분석을 위한 PCR 프라이머는, 예를 들어, 5' 측면(side) 프라이머로서 5'-R 프라이머(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3')(서열 번호: 50) 및 TCR 알파 사슬(alpha chain) C 부위에 특이적인 3-TRa-C 프라이머(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3')(서열 번호: 51), TCR 베타 사슬(beta chain) C1 부위에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3')(서열 번호: 52) 또는 3' 측면 프라이머로서 TCR 베타 사슬 C2 부위에 특이적인 3-TR 베타-C2 프라이머(5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3')(서열 번호: 53)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. TCR 유도체는 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적세포에 높은 결합력(avidity)으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적 세포의 효과적인 사멸을 선택적으로 매개할 수 있다.
상기 TCR 아단위 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 그것을 포함하는 벡터는 T 세포(예를 들어, CD8 양성 T 세포), 예를 들면 환자로부터의 T 세포에 유용하게 삽입될 수 있다. 유리하게는, 본 발명은 우수한 암 세포를 사멸시키는 특징을 가진 변형된 T 세포를 쉽고 빠르게 생산하기 위해 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유류의 것)의 빠른 변형을 허용하는 바로 살 수 있는 조성물(off-the-shelf composition)을 제공한다.
본 발명의 펩티드에 대해 특이적인 TCR은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원자의 복합체를 특이적으로 인지할 수 있는 수용체(receptor)이고, 이것은 상기 TCR이 상기 T 세포 표면에 제시될 때 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 제시하는 표적 세포에 대한 T 세포 특이적 활성을 제공한다. 상기 복합체의 특이적 인식은 어떤 알려진 방법에 의해 확인될 수 있고, 바람직한 방법은 예를 들면, HLA 분자 및 본 발명의 펩티드를 이용한 HLA 멀티머(multimer) 염색 분석, 및 ELISPOT 분석을 포함한다. ELISPOT 분석을 수행함으로써, 세포 표면에 TCR을 발현하는 T 세포가 TCR에 의해 세포를 인지하고, 신호가 세포 내부로 이동되는 것이 확인될 수 있다. T 세포 표면에 상기 복합체가 존재할 때, 상기 복합체가 T 세포 세포독성 활성을 줄 수 있는 것의 확인은 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 방법은, 예를 들면, 크로미움 방출 분석(chromium release assay)과 같은 HLA 양성 표적세포에 대한 세포독성 활성의 확인을 포함한다.
또한, 본 발명은 예를 들면 HLA-A2의 맥락에서 서열번호 5, 7, 27 및 34의 SEMA5B 펩티드에 결합하는 TCR 아단위 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(nucleic acid)이 형질도입하여 제조된 CTL을 제공한다.
형질도입된 CTL은 생체 내에서 암세포로 홈밍(homing)할 수 있으며, 시험관 내에서 잘 알려진 배양 방법으로 증식시킬 수 있다(예를 들면, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)). 본 발명의 상기 CTL은 치료나 보호를 필요로 하는 환자의 암의 치료 또는 예방에 유용한 면역학적 조성물을 구성하는데 쓰일 수 있다(WO2006/031221).
IX . 약학적 조성물:
SEMA5B 발현은 정상 조직과 비교하여, 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC을 포함하는, 암에서 특이적으로 증가되어 있기 때문에, 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방을 위한, 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효 성분으로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이러한 제제 또는 조성물로, 이러한 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위해 제조된 약학적 제제 또는 조성물을 제공한다. 또는, 본 발명의 펩티드는 약학적 제제 또는 조성물로 사용되기 위해 어떠한 상기 엑소솜 또는 APC와 같은, 세포의 표면에 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 제시하는 세포를 인지할 수 있는, 앞서 언급한 CTL은 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 유효 성분으로서 또한 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 하나의 유효 성분을 포함하는 제제 또는 조성물을 제공한다:
(a) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 여기에서 공개된 것과 같이 이러한 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 APC 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 CTL.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 구 "백신(vaccine)"(또한 면역원 조성물(immunogenic composition)이라고도 지칭된)은 동물에게 주입되었을 때 항-종양 면역을 개선시키고, 향상시키며, 및/또는 유도하는 기능을 가지는 조성물을 일컫는다. 다시 말해서, 본 발명은 개체에서 면역반응을 유도하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 마우스(mouse), 랫(rat), 기니피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬치를 포함하지만, 이로 제한되지 않은, 다른 포유류, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 사육되는 동물, 및 인간을 포함한 개체 또는 환자에서 암을 치료 및/또는 방지, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여하기 위하여 제조될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 재발을 방지하기 위해 제형화된 약학적 제제 또는 조성물의 생산에서, 하기에서 선택된 유효성분의 사용을 또한 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 본 발명에 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또는, 본 발명은 종양 또는 암의 치료 및/또는 방지, 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한, 하기에서 선택된 유효 성분을 또한 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 본 발명에 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또는, 본 발명은 추가적으로 암 또는 종양을 치료 및/또는 방지, 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 운반체를 하기에서 선택된 유효성분과 함께 제형화하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 본 발명에 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 또한 종양 또는 암을 치료 및/또는 방지, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하기 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 운반체와 하기로부터 선택되는 유효 성분을 혼합하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 본 발명에 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한 방법을 또한 제공하고, 상기 방법은 하기로부터 선택된 적어도 하나의 유효 성분을 개체에 투여하기 위한 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 본 발명에 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
본 발명에 따라, 서열번호 5, 7, 27 및 34 중에서 선택된 아미노산 서열을 가진 펩티드는 HLA-A2에 제한된 에피토프 펩티드이고 개체에서 HLA-A2 및 SEMA5B를 발현하는 암에 대해 강력하고 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 후보자로 밝혀졌다. 따라서, 서열번호 5, 7, 27 및 34의 아미노산 서열을 가지는 이들 펩티드 중 어느 것을 포함하는 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여에 특히 적합하다. 같은 것이 본 발명의 펩티드 중 어떤 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물에 적용된다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물에 의해 치료되는 암은 제한되지 않고 SEMA5B가 관여된(예를 들면, 과발현된) 어떠한 암이든지 포함하며, 그 예는 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하지만, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 앞서 언급한 유효 성분뿐만 아니라, 암 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력이 있는 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드들, 또는 이와 같은 것을 제시하는 다른 세포를 포함할 수 있다. 여기서, 암성 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력을 가지는 이러한 "다른" 펩티드들의 예는 암 특이적 항원(예를 들어, 동정된 TAA들)을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
필요하다면, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 물질이 본 발명의 유효 성분, 예를 들어, 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜, APC, CTL에 대한 항종양적 효과를 억제하지 않는 한, 다른 치료적 물질을 유효 성분으로서 선택적으로 포함할 것이다. 예를 들면, 제조는 항염증 물질 진통제, 화학요법, 및 그와 같은 것을 포함할 수 있다. 그 약제 안의 다른 치료적 물질뿐만 아니라, 본 발명의 약제는 역시 하나 또는 그 이상의 다른 약학적 물질 또는 조성물과 단계적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 물질 또는 조성물의 양은, 예를 들면, 사용되는 약학적 물질(들) 또는 조성물(들)의 유형, 치료되는 질병, 및 투여의 일정과 루트(route)에 의존한다.
특히 여기에서 언급한 성분뿐만 아니라, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 논의가 되고 있는 제형의 종류(예를 들어, 필러, 바인더, 희석제, 첨가제, 등)에 관하여 당업계에서 일반적인 다른 제제, 물질 또는 조성물을 포함할 수 있다고 당업자는 쉽게 인지할 것이다.
본 발명의 한 실시예에서, 상기 약학적 제제 또는 조성물은, 예를 들어 암과 같은, 질병의 병리 조건을 치료하는데, 유용한 물질을 포함하는 키트와 같이, 제조하여 포장될 수 있다. 상기 제품은 라벨이 있는 상기 약학적 제제 또는 조성물 중 어느 하나의 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이알(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은, 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 상기 용기의 라벨은 질병의 하나 또는 그 이상의 상태를 치료 또는 예방하는데 사용되는 제제 또는 조성물을 나타내야 한다. 또한 라벨은 투여에 관한 지시 등에 대해 나타낼 수 있다.
또한 상기 기재한 용기뿐 아니라, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 포함한 키트는 약학적으로 허용할 수 있는 희석액을 보관하는 두 번째 용기를 선택적으로 더 포함할 수 있다. 또한 이것은 상업적 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 버퍼, 희석액, 필터, 니들, 주사기, 및 사용설명서를 포함하는, 다른 물질도 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은, 바람직하다면, 유효 성분이 포함된 하나 또는 그 이상의 구성 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 포장될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 블리스터 팩과 같은, 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지시에 의해 동반될 수 있다.
(1) 활성성분으로 펩티드를 포함하는 약학적 조성물:
본 발명의 펩티드는 약학적 제제 또는 조성물로 직접적으로 투여될 수 있으며, 또는 필요하다면, 종래의 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드뿐만 아니라, 약에 일반적으로 사용되는 운반체, 첨가제, 및 이와 같은 것을 특이적 제한 없이 적절하게 포함할 수 있다. 이러한 운반체들의 예는 멸균된 물, 생리학적 살린(saline), 인산 버퍼(phosphate buffer), 배양 유액 및 이와 같은 것이 있다. 더욱이, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 안정제, 현탁액, 보존료, 계면활성제 및 이와 같은 것을 필요에 의해 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 생체 내에서 CTL을 유도하기 위해, 둘 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드를 포함하는, 조성물로 준비될 수 있다. 상기 펩티드는 혼합제(cocktail)일 수 있거나 또는 표준 기술을 이용하여 서로 접합 될 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 화학적으로 결합되거나, 링커(linker)로서 하나 또는 여러 아미노산(들)을 가질 수 있는 단독 융합 폴리펩티드 서열로서 발현된다(예를 들면, Lysine linker: K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715). 조성물의 펩티드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 본 발명의 펩티드들을 투여함으로써, 펩티드들은 APC에 HLA 항원에 의해 높은 밀도로 제시되며, 그 후에 제시된 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체에 대해 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 또는, APC(예를 들면, DC)는 개체로부터 제거될 수 있고 그런 다음 그들의 세포 표면에 본 발명의 펩티드 중 어느 것을 제시하는 APC를 수득하기 위하여 본 발명의 펩티드로 자극된다. 이러한 APC들은 개체에서 CTL을 유도하기 위하여 개체에 재-투여될 수 있고, 결과적으로, 종양-관련된 내피에 대한 공격성이 증가할 수 있다.
본 발명의 펩티드 중 어느 것을 유효성분으로 포함하는, 암의 치료 및/또는 방지를 위한 상기 약학적 제제 또는 조성물은, 또한 세포 면역이 효과적으로 수립되도록 보강제(adjuvant)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 다른 유효 성분과 함께 투여될 수 있거나 또는 과립(granule) 제형으로 투여될 수 있다. 보강제는 면역학적 활성을 가진 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여될 때, 상기 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키는 어떤 화합물, 물질 또는 조성물을 지칭한다. 적용될 수 있는 보강제는 문헌(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89)에 기술되어 있는 것들을 포함한다. 예시적인 보강제는 알루미늄 포스패이트(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록시드(aluminum hydroxide), 알럼(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin), Incomplete Freund's adjuvant(IFA), Complete Freund's adjuvant(CFA), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, O/W emulsion, 및 이와 같은 것을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다.
더욱이, 리포좀(liposome) 제형, 펩티드가 적은-마이크로미터 직경의 비드(bead)에 결합하는 과립 제형, 및 지질이 펩티드에 결합되는 제형이 편리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 또한 본 발명의 펩티드들은 약학적으로 허용가능한 염(salts)의 종류로 투여될 수 있다. 상기 염의 바람직한 예는 알칼리 금속(alkali metal), 금속염(salts with a metal), 유기염기염(salts with an organic base), 아민염(salts with an amine), 유기산염(salts with an organic acid)(아세트산, 포름산, 프로피온산(propionic acid), 푸마르산(fumaric acid), 말레산(maleic acid), 숙신산(succinic acid), 타르타르산(tartaric acid), 시트르산(citric acid), 말산(malic acid), 옥살산(oxalic acid), 벤조산(benzoic acid), 메탄설폰산(methanesulfonic acid) 등) 및 무기산염(salts with an inorganic acid)(염산(hydrochloric acid), 인산(phosphoric acid), 브롬산(hydrobromic acid), 황산(sulfuric acid) 등)을 포함한다. 여기에서 사용된 것처럼, 구 "약학적으로 수용가능한 염"은 생물학적 유효성 및 조성물의 특성을 유지하고 무기 또는 유기 산 또는 염기와 반응함으로써 수득되는 이러한 염을 지칭한다.
어떤 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 적합한 CTL을 구성요소로 또한 포함한다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체 내에서 CTL을 초회감작(priming)시킬 수 있는 물질로 확인되었다. 예를 들면, 팔미트산 잔기(palmitic acid residues)는 라이신 잔기의 엡실론-아미노(epsilon-amino) 및 알파-아미노(alpha-amino) 그룹에 붙여진 후에 본 발명의 펩티드들과 연결될 수 있다. 지질화된 펩티드들은 마이셀(micelle) 또는 입자(particle) 안에 직접적으로 투여되거나, 리포좀(liposome)에 통합되거나, 또는 보강제에 유화시키는 것 중 어느 하나가 될 수 있다. CTL 반응을 준비시키는 지질의 또 다른 예로, 적절한 펩티드들과 공유적으로 결합될 때, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine, P3CSS)과 같은, 대장균(E. coli) 지질 단백질(lipidprotein)이 CTL을 준비하는 것에 사용될 수 있다(참조, 예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).
투여의 적절한 방법의 예는 경구, 피내, 피하, 근육내, 골내, 복막, 및 정맥 주사, 또는 이와 같은 것, 및 전신 투여 또는 표적 장소 부근에 국소 투여를 포함할 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있거나 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 및 이와 같은 것에 알맞게 적용될 수 있고, 보통 0.001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.01 mg 내지 100 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 10 mg이며, 며칠 내지 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자가 적절하게 알맞은 용량을 선택할 수 있다.
(2) 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물:
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 발현할 수 있는 종류로 여기에서 공개된 발현 가능한 펩티드(들)를 암호화하는 핵산을 또한 포함할 수 있다. 여기에서, 구 "발현가능한 형태"는 세포 안으로 폴리뉴클레오티드가 도입될 때, 생체 내에서 폴리뉴클레오티드가 항종양 면역을 유도하는 폴리펩티드로 발현될 것임을 의미한다. 예시된 실시예에서, 관심 있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현에 대해 필요한 조절 요소를 포함한다. 폴리뉴클레오티드(들)는 표적 세포의 유전체로 안정한 삽입을 달성하기 위해 준비될 수 있다(예를 들어, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; 미국 특허 Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720를 또한 참조). DNA-기반의 전달 기술의 예는 "네이키트 DNA(naked DNA)", 용이한 전달(부피바카인(bupivacaine), 폴리머, 펩티드-매개), 양이온 지질 복합체, 및 입자-매개("유전자 총") 또는 압력-매개 전달을 포함한다(참조, 예를 들어, 미국 특허 제5,922,687호).
본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 세균 벡터로 또한 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예로 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은, 약화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은 백시니아 바이러스의 사용, 예를 들어, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터를 포함한다. 숙주에 삽입하였을 때, 상기 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 면역성 펩티드를 발현하고, 그렇게 함으로써 면역 반응을 유도한다. 면역법 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은, 예를 들어, 미국 특허 No. 4,722,848에 기재되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재되어 있다. 치료상의 투여 또는 면역법에 대한 유용한 다양한 종류의 다른 벡터는, 예를 들어, 아데노 및 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vectors), 레트로바이럴 벡터(retroviral vectors), 살모넬라 타이피 벡터(Salmonella typhi vectors), 독성이 없는 탄저균 독소 벡터(detoxified anthrax toxin vectors) 등이 분명할 것이다. 참조, 예를 들어, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.
환자로의 폴리뉴클레오티드 전달은 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 환자가 직접적으로 노출되는 직접적 경우 또는 세포가 시험관 내에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 첫 번째로 형질 전환된 후, 세포가 환자에 이식되는 간접적 경우 중 어느 것이 될 수 있다. 이러한 두 가지 방법이 각각, 생체 내 및 생체 외 유전자 치료법으로 알려져 있다.
유전자 치료의 상기 방법의 일반적인 리뷰는 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215를 참조한다. 본 발명에서 적용될 수 있는 재조합 DNA의 당업계에 알려진 일반적인 방법은 Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; and Krieger, in Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재되어 있다.
펩티드의 투여와 같이, 폴리펩티드의 투여는 경구, 피내, 피하, 근육 내, 골내, 및/또는 복막 주사, 또는 이와 같은 것, 예를 들어, 전신 투여 또는 표적 장소 부근에의 국소 투여가 사용될 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 적절한 운반체 또는 본 발명의 펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 폴리뉴클레오티드의 용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 및 이와 같은 것에 알맞게 적용될 수 있으며, 그리고 보통 0.001 mg 내지 1000 mg, 예를 들면, 0.01 mg 내지 100 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 10 mg이며, 며칠 내지 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 용량을 적절히 선택할 수 있다.
X. 펩티드, 엑소솜, APC 및 CTL을 이용하는 방법:
본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 APC 및 CTL을 제조하거나 또는 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소솜 및 APC는 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APC는 부가적인 화합물이 그들의 CTL 유도성을 저해하지 않는 한 어떠한 다른 화합물의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기에 언급한 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물 중 어떤 것은 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 그것에 더하여, 또한 이러한 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것은 아래 설명된 APC를 유도하는데 사용될 수 있다.
(1) 항원-제시 세포(Antigen-Presenting Cells, APCs) 유도 방법:
본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 높은 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드를 APC와 접촉하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 생체 외에서 본 발명의 펩티드와 APC를 접촉하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APC를 수집하는 단계; 및
b: 펩티드와 단계 a의 APC를 접촉하는 단계.
APC는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않으며, 림프구에 의해 인식되기 위해서 단백질성의 항원을 그들의 세포 표면에 발현하는 것으로 알려져 있는 DC, 랑게르한스 세포, 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 바람직하게, DC는 APC들 사이에서 그들이 가장 강한 CTL 유도성을 가지기 때문에 사용될 수 있다. 본 발명의 어떠한 펩티드는 단독으로 또는 본 발명의 다른 펩티드 또는 SEMA5B와 다른 TAA에서 유래된 CTL 유도성 펩티드와 조합하여 사용될 수 있다.
다른 한편으로는, 본 발명의 펩티드가 개체에 투여될 때, 상기 APC는 생체 내에서 상기 펩티드와 접촉되고, 결과적으로, 높은 CTL 유도성이 있는 APC는 개체의 몸 안에서 유도된다. 따라서, 본 발명의 방법은 개체의 신체에 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하기 위해 개체에 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현가능한 형태로 개체에 투여될 때, 생체 내에서 본 발명의 펩티드가 발현되고 APC와 접촉하므로, 결과적으로, 높은 CTL 유도성이 있는 APC가 개체의 신체 내에서 유도된다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 개체의 신체에 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하기 위해 개체로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 구 "발현가능한 형태(Expressible form)"는 "IX. 약학적 조성물, (2) 유효성분으로 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물" 부분에 앞서 기재되어 있다.
더욱이, 본 발명의 방법은 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하기 위해 APC로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APC를 수집하는 단계;, 및
b: 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입하는 단계.
단계 b는 상기 "VI. 항원-제시 세포" 부분에 기재한 것과 같이 수행될 수 있다.
또는, 본 발명은 SEMA5B에 대한 CTL 활성을 특이적으로 유도하는 항원-제시 세포(APC)를 제조하는 방법을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 하기의 단계의 하나를 포함할 수 있다:
(a) 시험관 내에서, 생체 외에서 또는 생체 내에서 APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 삽입시키는 단계.
또는, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하는 방법을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함한다:
(a) APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 삽입시키는 단계.
본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. CTL 유도성을 가지는 APC의 유도를 위해 사용되는 APC는 바람직하게 HLA-A2 항원을 발현하는 APC일 수 있다. 이러한 APC는 HLA 항원이 HLA-A2인 개체로부터 수득한 PBMCs(peripheral blood mononuclear cells)로부터 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 제조되었다. 본 발명의 방법에 의해 유도된 APC는 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원(HLA-A2 항원)의 복합체를 그들의 표면에 제시하는 APC일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 유도된 APC가 개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개체에 투여될 때, 개체는 APC가 유도된 개체와 동일인인 것이 바람직하다. 그러나, 개체가 APC 공여자와 같은 HLA 유형을 가지는 한 APC 공여자로부터 다른 것일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하는데 사용하기 위한 제제 또는 조성물을 제공하고, 이러한 제제 또는 조성물은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 APC를 유도하기 위해 제형화된 제제 또는 조성물의 제조에 있어서 본 발명의 펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하도록 사용하기 위해 본 발명의 펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드를 더 제공한다.
(2) CTL을 유도하는 방법:
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 엑소솜 또는 APC를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 TCR 아단위 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 또한 제공하고, 여기에서 TCR은 본 발명의 펩티드 및 세포 표면에 제시된 HLA 항원의 복합체를 인지(결합)할 수 있다. 바람직하게, CTL을 유도하는 방법은 하기 중에서 선택된 최소 하나의 단계를 포함할 수 있다:
a) CD8-양성 T 세포와 그 표면에 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜을 접촉시키는 단계; 및
b) 세포 표면에 제시된 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인지(결합)할 수 있는 TCR에 있어서, TCR 아단위 둘다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포로 삽입시키는 단계.
본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC, 또는 엑소솜이 개체로 투여될 때, CTL은 개체의 몸에서 유도되고, SEMA5B를 발현하는 표적 암 세포에 대한 면역 반응의 강도는 증진된다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC 또는 엑소솜을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
또는, CTL은 또한 그들을 이용하여 체외에서 유도될 수 있고, CTL을 유도한 후에, 상기 활성화된 CTL은 개체에 다시 되돌려 질 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APC를 수집하는 단계;
b: 본 발명의 펩티드와, 단계 a의 APC를 접촉하는 단계; 및
c: CD8 양성 T 세포와 단계 b의 APC를 공배양(co-culture)하는 단계.
상기 단계 c에서 CD8 양성 T 세포와 공배양된 APC는 상기 "VI. 항원-제시 세포" 부분에서 기재한 것과 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 APC에 형질전환함으로써 준비될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 따라서, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 그들의 표면에 효과적으로 제시하는 어떠한 APC를 포함한다.
앞서 언급한 APC 대신에 본 발명의 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 엑소솜을 선택적으로 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 엑소솜과 공배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 엑소솜은 "V. 엑소솜"에 기재된 방법으로 제조될 수 있다.
CTL 유도에 사용될 APC 또는 엑소솜은 본 발명의 펩티드 및 HLA-A2 항원의 복합체를 이들의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜인 것이 바람직할 수 있다.
더욱이, TCR 아단위를 모두 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 세포에 도입시킴으로써 CTL은 유도될 수 있다. 이러한 형질 삽입은 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에서 앞서 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. CTL 유도를 위해 사용되는 CD8 양성 T 세포는 개체로부터 수득한 PBMC로부터 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직한 실시예에서, CD8 양성 T 세포에 대한 공여자는 HLA항원이 HLA-A2인 개체가 될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 유도되는 CTL은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이들의 표면에 제시하는 세포를 인지할 수 있는 CTL이 될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 유도된 CTL이 개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 때, 그 개체는 CD8 양성 T 세포가 유래될 개체와 동일한 것이 바람직하다. 그러나, 개체가 CD8 양성 T 세포 공여자와 동일한 HLA 유형을 가지는 한 CD8 양성 T 세포 공여자와 다른 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CTL을 유도하는 약학적 제제 또는 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 여기에서 상기 방법 또는 과정은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체를 혼합 또는 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL을 유도하기 위한 제제 또는 조성물을 제공하고, 여기에서 상기 제제 또는 조성물은 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들), 또는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 APC 또는 엑소솜을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL을 유도하기 위해 제조된 제제 또는 조성물의 제조에 있어서 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 APC 또는 엑소솜의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은 CTL을 유도하는데 사용하기 위해 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 APC 또는 엑소솜을 더 제공한다.
(3) 면역 반응을 유도하는 방법:
더욱이, 본 발명은 SEMA5B와 관련된 질병에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 적합한 질병은 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제제(들) 또는 조성물(들)을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APC의 투여를 고려할 수 있다. 상세하게는, "IX. 약학적 조성물", 특히 백신으로서 본 발명의 약학적 제제 및 조성물의 사용을 기술하는 부분을 참조할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 엑소솜 또는 APC는, 상기 "V. 엑소솜", "VI. 항원-제시 세포(APC)", 및 "X. 펩티드, 엑소솜, APC 및 CTL을 사용하는 방법"의 (1) 및 (2)에 상세하게 기술되어 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 처리된 개체들은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체일 수 있다.
또한 본 발명은 면역 반응을 유도하기 위한 약학적 물질, 제제 또는 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 운반체(carrier)와 함께 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 첨가하거나 또는 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
또는, 본 발명의 방법은 하기를 함유하는 본 발명의 백신 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현 가능한 형태로서 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산(폴리뉴클레오티드);
(c) 표면에 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC 또는 엑소솜; 또는
(d) 본 발명의 CTL.
본 발명의 맥락에서, SEMA5B를 과발현하는 암은 이러한 유효 성분으로 치료될 수 있다. 이러한 암의 예는 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 유효 성분을 포함하는 백신 또는 약학적 조성물의 투여 이전에, 검사될 세포 또는 조직에서 SEMA5B의 발현 수준이 동일한 기관의 정상 세포와 비교하여 증가되었는지 확인하는 것은 바람직하다. 따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 SEMA5B를 (과)발현하는 암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
i) 치료될 암을 갖는 개체로부터 수득된 세포 또는 조직에서 SEMA5B의 발현 수준을 결정하는 단계;
ii) SEMA5B의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및
iii) 상기 기술된 (a) 내지 (d) 중에서 선택된 최소 하나의 구성요소를 정상 대조군과 비교하여 SEMA5B가 과발현되는 암을 갖는 개체에게 투여되는 단계.
또는, 본 발명은 또한 SEMA5B가 과발현된 암을 갖는 개체에 투여에서 사용을 위한 상기 기술된 (a) 내지 (d) 중에서 선택된 최소 하나의 구성요소를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물을 제공한다. 다시 말하면, 본 발명은 본 발명의 SEMA5B 폴리펩티드로 치료되는 개체를 알아내는 방법을 제공하고, 이러한 방법은 개체-유래 세포 또는 조직(들)에서 SEMA5B의 발현수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 증가된 수준은 그 개체가 본 발명의 SEMA5B 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암을 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명의 치료될 암을 가진 개체를 알아내는 방법은 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
SEMA5B의 전사 또는 번역 생산물을 포함하는 한, 어떤 개체-유래 암 세포 또는 조직은 SEMA5B의 발현의 결정을 위해 사용될 수 있다. 적절한 생물학적 시료의 예는 몸 조직 및 혈액, 가래 및 요(urine)과 같은 체액을 포함하지만, 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 개체-유래 세포 또는 조직은 상피 세포, 보다 바람직하게는 암 상피세포 또는 암으로 의심되는 조직으로부터 유래한 상피세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 또한, 필요하다면, 상기 세포는 수득된 몸의 조직 및 체액으로부터 정제된 후, 개체-유래 세포 또는 조직으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 개체는 바람직하게는 포유류이다. 포유류의 예는 인간, 비-인간 영장류(non-human primate), 쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 개체로부터 수득된 세포 또는 조직에서 SEMA5B의 발현 수준이 결정될 수 있다. 상기 발현 수준은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 전사(핵산) 생산물 수준에서 결정될 수 있다. 예를 들면, SEMA5B의 mRNA는 혼성화 방법으로 탐침을 이용하여 정량될 수 있다(예를 들어, Northern hybridization). 탐지는 칩, 어레이(array) 또는 그와 같이 수행될 수 있다. 어레이의 사용은 SEMA5B의 발현 수준을 탐지하는데 바람직할 수 있다. 당업자들은 이러한 SEMA5B의 서열정보를 이용하여 탐침을 제조할 수 있다. 예를 들면, SEMA5B의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광 물질 및 동위원소와 같은, 적절한 표지로 표지될 수 있으며, 유전자의 발현 수준은 혼성화된 표지의 강도로 탐지될 수 있다.
더욱이, SEMA5B 유전자의 전사 생산물(예를 들면, 서열번호: 49)은 증폭-기반 탐지 방법에 의해 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다(예를 들면, RT-PCR). 이러한 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 기반으로 제조될 수 있다.
특히, 상기 제시된 방법에 대해 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한 상태, 적절하게 엄격한 상태 또는 낮게 엄격한 상태하에서 SEMA5B의 mRNA와 혼성화된다. 본 명세서에 사용되었던, 상기 용어 "엄격한(혼성화) 조건"은 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화하는 조건을 나타내지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경하에서 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적 혼성화는 짧은 서열에 비해 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열융해점(Thermal melting point, Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 50%의 상기 탐침이 상보적으로 상기 표적 서열에 동등하게 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열이 일반적으로 과다하게 존재하므로, Tm에서 상기 탐침의 50%는 동등하게 점유된다. 일반적으로, pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M 소듐 이온(또는 다른 염들)인 엄격한 조건은, 일반적으로 약 1.0 M 소듐 이온 미만인 농도이며, 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 약 30℃이고(예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드) 긴 탐침 또는 프라이머에 대해서는 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은, 불안정화 물질의 첨가로 얻을 수 있다.
본 발명의 탐침 또는 프라이머는 전형적으로 상당히 정제된 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 SEMA5B를 포함하는 핵산의 보존된 정방향 뉴클레오티드, 또는 SEMA5B를 포함하는 핵산의 보존된 역방향 뉴클레오티드인, 적어도 약 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 또는 25 개의 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열, 또는 이러한 서열의 자연적으로 발생하는 돌연변이 지역을 포함한다. 특히, 예를 들면, 바람직한 실시예에서, 5-50 개 길이의 올리고뉴클레오티드는 검출을 위해, 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, SEMA5B 유전자의 mRNA 또는 cDNA는 일반적으로 15-30b 길이의, 특정 크기의 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머로 검출될 수 있다. 그 크기는 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 20 뉴클레오티드, 적어도 25 뉴클레오티드, 적어도 30 뉴클레오티드의 범위일 것이고 탐침 및 프라이머는 5-10 뉴클레오티드, 10-15 뉴클레오티드, 15-20 뉴클레오티드, 25-30 뉴클레오티드의 범위일 것이다. 바람직한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머의 길이는 15-25로부터 선택될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머를 사용함으로써 유전자 검출을 위한 검사 절차, 장치, 또는 시약이 잘 알려져 있다(예를 들면, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 또는 PCR). 이러한 검사에서, 탐침 또는 프라이머는 또한 택 또는 링커 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 탐침 또는 프라이머는 포획될 검출가능한 라벨 또는 친화성 리간드로 변형될 수 있다. 또한, 혼성화를 바탕으로 한 탐지 절차에서, 수백 개의 염기(예를 들면, 약 100-200) 내지 수 킬로(예를 들면, 약 1000-2000) 염기 길이로 된 폴리뉴클레오티드는 또한 탐침으로 사용될 수 있다(예를 들면, 노던 블럿팅 검사 또는 cDNA 마이크로어레이 분석).
또한, 번역 생산물(즉 단백질)은 본 발명의 진단을 위해 탐지될 수 있다. 예를 들면, SEMA5B 단백질(서열 번호: 49) 또는 이의 면역학적 단편의 양은 결정될 수 있다. 번역 생산물로서 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 또한, 그 단편 또는 변형된 항체가 SEMA5B 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등등)은 탐지를 위해 쓰일 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 이의 단편에 대한 상기 항체 또한 본 발명에 의해 제공된다. 단백질의 탐지를 위해 상기 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 항체 및 그들의 등가물을 준비하기 위하여 본 발명에선 상기의 어떤 방법이 사용되었다.
SEMA5B 유전자 발현 수준을 탐지하기 위한 다른 방법은 그것의 번역 산물에 기초하기 때문에, 염색의 강도는 SEMA5B 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직학적 분석을 통해 측정될 수 있다. 즉, 이러한 측정에서, 강한 염색은 증가된 단백질의 존재/수준 및 동시에, SEMA5B 유전자의 높은 발현수준을 나타낸다.
암세포에서 표적 유전자, 예를 들면 SEMA5B 유전자의 발현수준은 만약 표적 유전자의 대조군 수준(예를 들면, 정상 세포 내 수준)이 증가하였다면, 예를 들어, 10%, 25% 또는 50%; 또는 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2.0배 이상, 5.0배 이상, 10.0배 이상, 또는 그 이상 증가한다면, 증가되는 것으로 결정될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 암이 없는(non-cancerous)것으로 알려진 생물 시료로부터 결정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준(normal control level)"으로 나타낸다. 한편, 만약 상기 대조군 수준이 암 생물 시료로부터 결정될 경우, 이것은 "암 대조군 수준(cancerous control level)"으로 나타낸다. 시료 발현 수준 및 대조군 수준 사이의 차이는, 예를 들면 발현 수준이 상기 세포가 암 또는 암이 아닌(non-cancerous) 상태에 따라 다르지 않은 것이 알려진 하우스키핑 유전자와 같은 대조군 핵산의 발현 수준으로 평준화될 수 있다. 대조군 유전자의 예에는 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드3포스패이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜단백질(ribosomal protein) P1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
질환 상태(들)(암성 또는 비암성)라고 알려진 개체(들)로부터 이전에 수거되고 저장된 시료(들)를 사용하여 암세포와 동일한 시간에 대조군 수준은 결정될 수 있다. 또한, 치료될 암을 갖는 기관의 비-암성 부위로부터 수득된 정상 세포는 정상 대조군으로서 사용할 수 있다. 또는, 상기 대조군 수준은 질환 상태에 있다고 알려진 시료에서 확인된 SEMA5B 유전자의 발현 수준(들)의 이전 결정을 분석함으로써 얻어진 상기 결과를 기반으로 하는 통계학적인 방법으로 확인될 수 있다. 또한, 이전에 시험된 세포의 발현 패턴 데이터베이스로부터 대조군 수준은 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 측면에 따르면, 생물학적 시료 안의 SEMA5B 유전자의 발현 수준은 복수의 대조군 수준과 비교될 수 있으며, 이는 복수의 참조 시료로부터 결정될 수 있다. 개체 유래 생물학적 시료과 유사한 조직 종류로부터 유래된 참조 시료로부터 대조군을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태로 알려져 있는 군의 SEMA5B 유전자의 발현 수준의 기준치를 이용하는 것이 바람직하다. 기준치는 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D. 의 범위가 기준치로 사용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 암이 없는(non-cancerous)것으로 알려진 생물 시료로부터 결정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준(normal control level)"으로 나타낸다. 한편, 만약 상기 대조군 수준이 암 생물 시료로부터 결정될 경우, 이것은 "암 대조군 수준(cancerous control level)"으로 나타낸다. 시료 발현 수준 및 대조군 수준 사이의 차이는, 예를 들면 발현 수준이 상기 세포가 암 또는 암이 아닌(non-cancerous) 상태에 따라 다르지 않은 것이 알려진 하우스키핑 유전자와 같은 대조군 핵산의 발현 수준으로 평준화될 수 있다. 대조군 유전자의 예에는 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드3포스패이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜단백질(ribosomal protein) P1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
SEMA5B 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준에 비해 증가되었을 때, 또는 암 대조군 수준에 유사/동등할 때, 개체는 치료될 암을 갖는 것으로 진단될 수 있다.
본 발명은 (i) 치료될 암을 가질 것으로 의심되는 개체를 진단, 및/또는 (ii) 암을 치료하기 위한 개체를 선택하는 방법을 또한 제공하고, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 세포 또는 조직(들)에서 SEMA5B의 발현 수준을 결정하는 단계;
b) SEMA5B의 발현 수준을 정상 대조군 수준과 비교하는 단계;
c) 만약 SEMA5B의 발현 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 증가되었다면, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단되었다면, 암 치료를 위한 개체를 선택하는 단계.
또는, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득한 세포 또는 조직(들)에서 SEMA5B의 발현 수준을 결정하는 단계;
b) SEMA5B의 발현 수준을 암 대조군 수준(cancerous control level)과 비교하는 단계;
c) 만약 SEMA5B의 수준이 암 대조군 수준과 비교하거나 또는 동등하다면, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단되었다면, 암 치료를 위한 개체를 선택하는 단계.
본 발명은 본 발명의 SEMA5B 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암으로부터 고통받거나 위험할 것으로 의심되는 개체를 진단 또는 결정하기 위한 진단 키트를 또한 제공하며, 이는 암 면역치료의 효과 또는 적용가능성을 평가 및/또는 모니터하는 것에 사용될 수 있다. 바람직하게는 암은 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 키트는 바람직하게는 개체에서 얻은 세포(subject-derived cell)안의 SEMA5B 유전자의 발현을 검출하기 위한, 하기의 군에서 선택된 최소 하나의 시약을 포함할 수 있다:
(a) SEMA5B 유전자의 mRNA를 탐지하기 위한 시약;
(b) SEMA5B 단백질 또는 이의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 시약; 및
(c) SEMA5B 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 시약.
SEMA5B의 mRNA를 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 SEMA5B mRNA에 특이적으로 결합하거나 또는 확인하는, 예를 들면 SEMA5B mRNA의 부분에 대한 상보적 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산을 포함한다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 SEMA5B mRNA에 특이적인 프라이머 및 탐침으로 증폭될 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 준비될 수 있다. 만약 필요하다면, SEMA5B mRNA를 탐지하기 위한 시약은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 또한, SEMA5B mRNA를 탐지하기 위한 하나 이상의 시약이 키트에 포함될 수 있다.
다른 한편으로는, SEMA5B 단백질 또는 이의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 SEMA5B 단백질 또는 이의 면역학적 단편에 대한 항체를 포함할 수 있다. 항체는 단일클론(monoclonal) 또는 다중클론(polyclonal)일 수 있다. 더욱이, 단편 또는 변형된 항체가 SEMA5B 단백질 또는 이의 면역학적 단편에 결합하는 능력을 유지하는 한, 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)된 상기 항체는 시약으로 사용될 수 있다. 단백질 탐지를 위한 이러한 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명에서 이러한 항체 및 그것의 등가물을 준비하기 위해 어떤 방법을 적용하였다. 또한, 항체는 직접적인 연결 또는 간접적인 표지 기술을 통해 신호 발생 분자로 표지 될 수 있다. 표지 및 항체 표지에 대한 방법 및 그들의 표적으로 항체의 결합을 탐지하는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 표지 및 방법은 본 발명에 적용될 수 있다.
또한, SEMA5B 단백질을 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트 안에 포함될 수 있다.
키트는 상기 언급한 시약의 하나 이상을 포함할 수 있다. 키트는 더욱이 고체 매트릭스 및 SEMA5B 유전자에 대한 탐침에 결합하는 시약 또는 SEMA5B 펩티드에 대한 항체, 배지 및 배양하는 세포를 위한 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 SEMA5B 펩티드에 대한 항체를 탐지하기 위한 2차 항체를 포함한다. 예를 들면, 암이 없거나 또는 암을 겪고 있는 개체(이에 관계없이)로부터 얻어진 조직 시료는 유용한 대조 시약으로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 바람직한 상업적 및 사용자의 관점으로부터 버퍼, 희석액, 필터, 바늘(needle), 주사기 및 사용설명서(예를 들어, 문서, 테이프, CD-ROM)를 포함하는 다른 물질을 포함한다. 이들 시약은 표지된 용기에 유지될 수 있다. 적절한 용기는 병, 바이알(vials) 및 테스트 튜브(test tube)를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 만들어졌다.
본 발명의 실시예에서, SEMA5B mRNA에 대한 탐침이 시약일 때, 상기 시약은 탐지 부위가 적어도 한 개로 구성되는 다공성 스트립과 같은 고체 메트릭스에 고정화될 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 탐지는 각각의 구성하는 핵산(탐침)부위의 많은 수를 포함할 수 있다. 시험 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 또는, 대조군 부위는 시험 스트립으로부터 분리된 스트립에 위치할 수 있다. 선택적으로 다른 탐지 부위는 고정화된 핵산의 다른 양, 즉, 첫번째 탐지 부위의 높은 양 및 다음 부위 안의 적은 양을 포함할 수 있다. 시험 시료를 더했을 때, 탐지가능한 신호를 제시하는 부위의 수는 시료 안에 존재하는 SEMA5B mRNA의 양의 정량적 지표를 제공한다. 상기 탐지 부위는 적절하게 탐지가능한 어떠한 모양으로 구성될 수 있으며, 일반적으로 시험 스트립의 바 또는 도트 스패닝(dot spanning) 상기 너비 안에 설정될 수 있다.
본 발명의 키트는 양성 대조군 시료 또는 SEMA5B 표준 시료를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 양성 대조군 시료는 SEMA5B 양성 시료를 수거하고 그들의 SEMA5B 수준을 검사함으로써 준비될 수 있다. 또는, 양성 시료 또는 SEMA5B 가닥(strand) 시료를 형성하기 위해, 정제된 SEMA5B 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 SEMA5B를 발현하지 않는 세포에 첨가할 수 있다. 본 발명에서, 정제된 SEMA5B는 재조합 단백질일 수 있다. 양성 대조군 시료의 SEMA5B 수준은, 예를 들면, 판정 기준치(cut-off) 값 이상이다.
또한 한 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 항원 또는 그것의 단편을 특이적으로 인지하는 단백질 또는 그것의 부분 단백질을 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 부분 펩티드(partial peptide) 예는 본 발명 단백질의 아미노산 서열에서 최소한 8개, 바람직하게는 15개, 보다 바람직하게는 20개의 연속적인 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 암은, 본 발명의 펩티드(폴리펩티드) 또는 단백질을 사용하여 시료(예를 들면, 혈액, 조직)에서 항체를 탐지함으로써 진단될 수 있다. 본 발명의 단백질 및 펩티드를 제조하는 방법은 상기에 기술되어 있다.
암을 진단하기 위한 방법은 항-SEMA5B 항체와 상기 기술된 것과 같은 상응하는 대조군 시료 사이에서 양 차이를 결정함으로써 수행될 수 있다. 만약 개체에서 얻어진 세포 또는 조직이 유전자의 발현 생산물(SEMA5B)에 대한 항체를 포함하고, 항-SEMA5B 항체의 양이 정상 대조군과 비교하여 판정 기준치(cut-off) 이상으로 결정되면, 개체는 암을 앓고 있는 것으로 예상된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 진단용 키트는 본 발명의 펩티드 및 그것에 결합하는 HLA 분자를 포함할 수 있다. 항원성 펩티드 및 HLA 분자를 사용하여 항원 특이적 CTL을 탐지하는 방법은 이미 수립되었다(예를 들면, Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6). 따라서, 본 발명의 펩티드와 HLA 분자의 복합체는 종양 항원 특이적 CTL을 탐지하기 위한 탐지 방법에 적용될 수 있고, 그러므로 조기 탐지(earlier detection), 암의 재발 및/또는 전이가 가능하다. 또한, 이것은 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 약학물(pharmaceuticals)과 함께 적용할 수 있는 개체의 선택, 또는 약학물의 치료 효과의 검사에 적용될 수 있다.
특히, 알려진 방법에 따르면(예를 들면 Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6 참조), 방사선 표지된 HLA 분자와 본 발명의 펩티드의 테트라머와 같은 올리고머 복합체가 준비될 수 있다. 복합체를 사용하여, 예를 들면, 암으로 고통받는 것으로 의심되는 개체 유래 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes)에서 항원-펩티드 특이적 CTL을 정량함으로써 상기 진단이 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 여기에서 기술된 펩티드 에피토프를 이용함으로서 개체의 면역 반응을 평가하기 위한 방법 또는 진단제를 제공한다. 본 발명의 어떤 실시예에서, 여기서 기술된 HLA-A2 제한된 펩티드는 개체에서 면역 반응을 평가하거나 또는 예측하기 위한 시약으로서 사용된다. 평가되는 면역 반응은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역원(immunogen)을 면역능력이 있는 세포(immunocompetent cell)을 접촉시킴으로써 유도될 것이다. 특정 실시예에서, 펩티드 에피토프(peptide epitope)(들)를 인식 및 결합하여 항원 특이적인 CTL의 생산의 결과가 될 어떤 물질 또는 조성물은 시약으로 사용될 수 있다. 펩티드 시약은 면역원으로서 사용하지 않을 필요가 있다. 관련된 최신 기술발달이 포함된 검사로는 테트라머(tetramers), 세포 내의 림포카인(lymphokines) 염색 및 인터페론 분비능 검사(interferon release assay) 또는 ELISPOT 검사가 사용되었다. 바람직한 실시예에서, 면역 반응을 평가하는 면역능력이(immunocompetent) 있는 세포는 말초 혈액(peripheral blood), 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte, PBL) 및 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 중에서 선택될 수 있다. 상기 면역능력이 있는 세포를 수집하거나 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 변형된 바람직한 실시예에서, 펩티드 시약과 접촉하는 면역기능이 있는 세포는 수지상 세포과 같은 항원-제시 세포를 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 펩티드는, 종양 세포 항원 또는 면역원에 노출된 후, 항원-특이적 CTL의 존재를 위한 말초 혈액 단핵구를 검사하기 위한 테트라머 염색 검사법에서 사용될 수 있다. HLA 테트라머 복합체는 말초 혈액 단핵구의 시료에서 직접적으로 항원 특이적 CTL을 가시화 하고(Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; 및 Altman et al., Science 174: 94-96. 1996 참조), 항원-특이적 CTL 집단의 빈도를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 사용한 테트라머 시약은 하기에 기술된 것과 같이 생산될 수 있다.
HLA 분자에 결합하는 펩티드는 3분자 복합체를 생산하기 위해 HLA 중쇄 및 베타 2-마이크로글로불린에 상응하는 것이 존재할 때 다시 접혀진다(refolded). 상기 복합체에서, 중쇄의 카복실 말단을 이전에 단백질로 조작되었던 부위에서 바이오틴화한다. 그 후, 상기 3분자 복합체와 스트렙토아비딘(streptoavidin)으로 구성된 테트라머를 형성하기 위하여 스트렙토아비딘을 복합체에 첨가한다. 형광으로 표지된 스트렙토아비딘으로써, 상기 테트라머는 항원 특이적 세포를 염색시키는데 사용될 수 있다. 그 후 상기 세포는, 예를 들면 세포 유동 분석(flow cytometry)에 의해서 동정된다. 이러한 분석은 진단용 또는 예후의 목적을 위해 사용될 수 있다. 상기 과정에 의해 동정된 세포는 또한 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 면역 회상 반응(immune recall response)을 평가하기 위해 본 발명의 펩티드를 포함하는 시약을 제공한다(Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503-513.1997 및 Penna et al., J. Exp. Med. 174: 1565-1570. 1991 참조). 예를 들면, 치료될 암을 앓고 있는 환자 개개인으로부터 수득한 PBMC 시료는 특이적 펩티드를 사용하여 항원-특이적 CTL의 존재를 위해 분석된다. 단핵구를 포함하는 혈액 시료는 PBMC를 배양하고 상기 세포를 본 발명의 펩티드로 자극시킴으로써 검사된다. 적절한 배양기간 후에, 상기 증식된 세포 집단에서 예를 들면 CTL 활성을 분석한다.
상기 펩티드는 백신의 효험(efficacy)를 평가하기 위해 시약으로서 사용될 수 있다. 면역원으로 예방접종 된 환자로부터 수득한 PBMC를, 예를 들면 상기 방법 중 하나를 사용하여 분석할 수 있다. 환자는 HLA 종류가 있고, 분석을 위해 상기 환자에 존재하는 대립 유전자 특이적 분자를 인지하는 에피토프 펩티드 시약이 선택되었다. 백신의 면역원성은 PBMC 시료에서 에피토프-특이적 CTL의 존재에 의해 나타날 수 있다. 본 발명의 펩티드는 당업계에서 잘 알려진 기술을 사용함으로써 항체를 만드는데 사용될 수 있고(예를 들면 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Wiley/Greene. NY; 및 Antibodies a laboratory Manual. Harlow and Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989를 참조), 이것은 암을 진단, 탐지 또는 모니터하는 시약으로서 사용할 수 있다. 이러한 항체는 HLA 분자의 맥락에서 펩티드를 인지하는 것, 즉 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 항체일 수도 있다.
본 발명의 펩티드 및 조성물은 많은 첨가적 용도를 갖고, 그 일부는 여기서 기술된다. 예를 들면, 본 발명은 SEMA5B 면역원성 폴리펩티드의 발현에 의해 특징화되는 질환을 진단하고 탐지하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 시료에서 SEMA5B HLA 결합 펩티드, 또는 SEMA5B HLA 결합 펩티드와 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 펩티드 또는 펩티드와 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현은 상기 펩티드 또는 복합체의 결합 파트너로 검사함으로써 결정되거나 탐지될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 펩티드 또는 복합체를 위한 결합 파트너는 상기 펩티드에 특이적으로 결합하고 인지하는 항체일 수 있다. 생물학적 시료, 예를 들면 종양 조직검사(biopsy)에서 SEMA5B의 발현은 SEMA5B 프라이머를 사용한 일반적인 PCR 증폭 프로토콜에 의하여 검사될 수 있다. 종양 발현의 예는 여기서 나타나고 나아가 SEMA5B 증폭에 대한 예시적인 조건 및 프라이머의 공개는 본 명세서의 참고문헌에 포함된 WO2003/27322에서 찾을 수 있다.
바람직하게, 상기 진단 방법은 생물학적 시료에서 SEMA5B HLA 결합 펩티드의 존재를 탐지하기 위하여 SEMA5B HLA 결합 펩티드를 위한 특이적 제제와 함께 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 것을 포함한다. 여기서 사용된 "접촉"은 제제와 생물학적 시료에 존재하는 SEMA5B HLA 결합 펩티드 사이에서 특이적 상호결합이 생성될 수 있도록, 시약과 충분히 근접한 곳 및 예를 들면 농축, 온도, 시간, 이온화 강도와 같은 적절한 조건에 생물학적 시료를 놓아두는 것을 의미한다. 일반적으로, 생물학적 시료에 있는 분자와 그것의 인지체(cognate)(예를 들면, 단백질 및 이의 수용체 인지체, 항체 및 이의 단백질 항원 인지체, 핵산 및 이의 상보적 서열 인지체) 사이의 특이적 상호결합을 촉진하기 위해 물질을 생물학적 시료과 접촉시키는 조건은 당업자에게 자명하다. 분자와 그것의 인지체 사이의 특이적 상호결합을 촉진시키기 위한 최적의 조건은 본 명세서의 참고문헌에 포함된 Low et al.에 의해 발행된 U.S. Patent No. 5,108,921에 기술되어 있다.
본 발명의 진단 방법은 생체 내 및 시험관 내 중 하나 또는 그 모두에서 수행될 수 있다. 따라서, 생물학적 시료는 본 발명에서 생체 내 또는 시험관 내에 위치할 수 있다. 예를 들면, 생물학적 시료는 생체 내에서 조직일 수 있고, SEMA5B 면역원성 폴리펩티드에 특이적인 제제는 그 조직에서 상기 분자의 존재를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 생물학적 시료는 시험관 내에서 수집되거나 또는 분리될 수 있다(예를 들면, 혈액 시료, 종양 조직검사, 조직 추출물). 특별히 선호되는 예에서, 생물학적 시료는 세포 포함 시료일 수 있고, 보다 바람직하게는 진단되거나 치료되는 개체로부터 수집된 종양 세포를 포함하는 시료일 수 있다.
또는, 상기 진단은 형광으로 표지된 HLA 다중결합 복합체를 사용한 염색을 통해 항원-특이적 T 세포의 직접적인 정량을 허용하는 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, Altman. J. D. et al., 1996, Science 274: 94; Altman. J. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330;). 세포 내 림포카인 염색 및 인터페론-감마(interferon-gamma) 분비 검사법 또는 ELISPOT이 제공되었다. 중합체 염색, 세포내 림포카인 염색 및 ELISPOT 검사법은 모두, 더욱 일반적인 검사에 비해 최소한 10배 이상 더욱 민감하다(Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 314;). 오합체(pentamer)(예를 들면 US 2004-209295A), 덱스트라머(dextramer)(예를 들면, WO 02/072631), 및 스트렙타머(예를 들면 Nature Medicine 6. 631-637 (2002)) 또한 사용될 수 있다.
따라서, 어떤 실시예에서, 본 발명은, 본 발명의 SEMA5B 펩티드 중 최소 하나가 투여된 개체의 면역학적 반응을 진단하거나 평가하는, 하기의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 면역원(immunogen)에 특이적인 CTL 유도를 위한
적합한 조건하에, 면역원과 면역능력이 있는 세포(immunocompetent cells)를 접촉하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 상기 유도된 CTL의 유도 수준을 탐지하거나 결정하는 단계; 및
(c) 개체의 면역반응을 CTL 유도 수준과 연관시키는(correlating) 단계.
본 발명의 내용에서, 면역원은 (a) 서열번호 5, 7, 27 및 34 중에서 선택된 최소 하나의 SEMA5B 펩티드 및 (b) 이러한 아미노산 서열이 1, 2 또는 그 이상의 아미노산 치환(들)으로 변형된 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 그 동안에, 면역원 특이적 CTL의 유도 적합 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 면역능력이 있는 세포는 시험관 내에서 면역원 특이적 CTL을 유도하기 위해 면역원(들)의 존재 하에 배양될 수 있다. 면역원 특이적 CTL을 유도하기 위해, 어떤 자극 인자(stimulating factors)가 상기 세포 배양에 첨가될 수 있다. 예를 들면, IL-2는 CTL 유도를 위한 바람직한 자극 인자이다.
어떤 실시예에서, 펩티드 암 치료로 치료되는 개체의 면역학적 반응을 모니터하거나 평가하는 단계는 치료 전, 동안 및/또는 후에 수행될 수 있다. 일반적으로, 암 치료의 프로토콜(protocol) 동안, 면역성 펩티드는 치료될 개체에 반복적으로 투여된다. 예를 들면, 면역성 펩티드는 3-10주 동안 매주 투여될 수 있다. 따라서, 개체의 면역학적 반응은 암 치료 프로토콜 동안 평가되거나 모니터 될 수 있다. 또는 암 치료에 대한 면역학적 반응의 평가 또는 모니터링(monitoring)의 단계는 치료 프로토콜의 완료일 수 있다.
본 발명에 따라, 대조군에 비해 면역원 특이적 CTL 유도의 증가는 투여된 면역원(들)에 대한 면역학적 반응으로 평가되거나 진단된 개체를 나타낸다. 상기 면역학적 반응을 평가하기 위한 적합한 대조군은, 예를 들면, 면역능력이 있는 세포가 펩티드 없이, 또는 어떤 SEMA5B 펩티드 외에 다른 아미노산 서열을 가지는 대조군 펩티드(들)와 접촉되었을 때 CTL 유도 수준을 포함한다. (예를 들면, 무작위 아미노산 서열). 바람직한 실시예에서, 상기 개체의 면역학적 반응은, 개체에 투여된 각 면역원 사이의 면역 반응을 비교함으로써 서열 특이적인 방식에서 평가된다. 특히, SEMA5B 펩티드의 일부 유형의 혼합물이 개체에 투여될지라도, 면역학적 반응은 상기 펩티드에 의존적일 수 있다. 그런 경우에는, 각 펩티드 사이의 면역학적 반응의 비교에 의해 개체에서 더 높은 반응을 보이는 펩티드가 동정 될 수 있다.
XI . 항체:
본 발명은 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 본 발명의 펩티드와 특이적으로 결합하고, 본 발명의 펩티드가 아닌 것에 결합하지 않을 것이다(또는 약하게 결합). 또는, 항체는 본 발명의 펩티드뿐만 아니라 그것의 상동체와 결합한다. 본 발명의 펩티드에 대한 항체는 암 진단 또는 예후 검사법, 및 이미지화 방법론(imaging methodology)에서 사용될 수 있다. 유사하게, 상기 항체는 암환자에서 SEMA5B가 발현 또는 과발현된다는 점에서, 다른 암의 치료, 진단 및/또는 예후에서 사용될 수 있다. 또한, 세포 내 발현되는 항체(예를 들면, 단일 사슬 항체)는, 예를 들면 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 SEMA5B의 발현이 포함된 암에서 치료상으로 사용될 수 있다.
본 발명은 서열번호 5, 7, 27 및 34 중에서 선택된 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함하고, SEMA5B 단백질(서열번호: 49) 또는 이의 단편을 탐지 및/또는 정량하기 위한 다양한 면역학적 검사법을 제공한다. 상기 검사법은 SEMA5B 단백질을 인식 및 결합할 수 있는 적절한 하나 또는 그 이상의 항-SEMA5B 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명에서, SEMA5B 폴리펩티드와 항-SEMA5B 항체의 결합은 바람직하게 서열 번호 5, 7, 27 및 34 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 폴레펩티드를 인지한다. 항체의 결합 특이성은 억제 검사(inhibition test)를 사용하여 확인될 수 있다. 즉, 서열 번호 5, 7, 27 및 34의 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 어떤 단편의 폴리펩티드의 존재하에서 분석될 항체 및 SEMA5B 폴리펩티드 전장 사이의 결합이 억제될 때, 상기 항체는 그 단편에 특이적으로 결합한다. 본 발명에서, 상기 면역학적 검사법은 당업계에 잘 알려진 다양한 면역학적 검사법 종류 내에서 수행되고, 방사선면역검사법(radioimmunoassay), 면역-크로마토그래프 기술(immuno-chromatograph technique), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), ELIFA(enzyme-linked immunofluorescent assay), 및 그와 같은 것의 다양한 유형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 관련된 면역학적이지만 비항체 검사법은 T 세포 면역원성 검사법(억제성 또는 자극성)뿐만 아니라 MHC(major histocompatibility complex) 결합 검사법을 또한 포함할 수 있다. 또한, SEMA5B를 발현하는 암을 탐지할 수 있는 면역학적 이미지 방법은 본 발명에 의해 제공되고, 본 발명의 표지된 항체를 사용한 방사선 동위 원소 이미지 방법(radioscintigraphic imaging method)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 검사법은 SEMA5B를 발현하는 암, 예를 들면 식도암, NSCLC, RCC 및 SCLC를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 암의 탐지, 모니터, 및 예후에 임상적으로 유용하다.
본 발명은 본 발명의 펩티드와 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체와 같은 어떠한 형체에서도 사용될 수 있고, 또한 본 발명의 펩티드로 면역화된 동물, 예를 들면 토끼에 의해 수득된 항혈청을 포함하고, 모든 종류의 다중클론 및 단일클론 항체, 인간 항체, 및 유전적 재조합에 의해 생성된 인간화된 항체를 포함한다.
항체를 얻기 위해 항원으로서 사용된 본 발명의 펩티드는 어떠한 동물의 종류에서도 유래될 수 있으나, 바람직하게는 인간, 마우스(mouse), 또는 랫(rat)과 같은 포유류에서, 보다 바람직하게는 인간에서 유래된 것이다. 인간-유래 펩티드는 여기서 공개된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따라, 면역원성 항원으로서 사용되는 상기 펩티드는 완전한 단백질일 수도 있고 상기 단백질의 부분적 펩티드일 수도 있다. 부분적 펩티드는, 예를 들면 본 발명 펩티드의 아미노 (N)-말단(amino-terminal) 또는 카복실 (C)-말단(carboxyl-terminal) 단편을 포함할 수 있다.
여기에서, 항체는 SEMA5B 펩티드의 전장 또는 단편에 반응하는 단백질로 정의된다. 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 항체는 서열 번호 5, 7, 27 및 34 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 SEMA5B의 단편 펩티드를 인지할 수 있다. 올리고펩티드를 합성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 합성 후에, 펩티드는 면역원으로서 사용되기 전에 선택적으로 정제될 수 있다. 본 발명에서, 올리고펩티드(예를 들면 9- 또는 10mer)는 면역원성을 증진시키기 위해 운반체와 결합되거나 연결될 수 있다. KLH(Keyhole-Limpet hemocyanin)은 운반체로서 잘 알려져 있다. KLH와 펩티드를 결합시키는 방법도 당업계에 잘 알려져 있다.
또는, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자 또는 그것의 단편은 알려진 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 그 후 여기서 기술되는 것과 같이 숙주 세포에 형질전환시키는데 사용된다. 원하는 펩티드 또는 그것의 단편은 어떤 표준 방법에 의해 숙주 세포의 안 또는 밖으로부터 회복될 수 있고, 그 후에 항원으로서 사용될 수 있다. 또는, 펩티드를 발현하는 전체 세포 또는 그들의 용해물(lysate) 또는 화학적으로 합성된 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있다.
어떤 포유류 동물은 항원으로 면역화될 수 있지만, 바람직하게는 세포 융합에 사용된 모 세포(parental cell)와의 양립성(compatibility)을 고려한다. 일반적으로, 설치류(Rodentia), 토끼류(Lagomorpha) 또는 영장류(Primates) 과(family)의 동물이 사용될 수 있다. 설치류의 동물은 예를 들면 마우스, 랫 및 햄스터(hamster)를 포함한다. 토끼류는 예를 들면 토끼(rabbit)을 포함한다. 영장류는 예를 들면 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 망토개코원숭이(sacred baboon) 및 침팬지와 같은 토끼목(Catarrhini(늙은 세계 원숭이, old world monkey))의 원숭이를 포함한다.
항원으로 동물을 면역화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원의 복강내(intraperitoneal) 주입 또는 피하(subcutaneous) 주입은 포유류의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로, 항원은 PBS(phosphate buffered saline), 생리적 살린(physiological saline) 등의 적절한 양에서 희석되거나 서스펜션될 수 있다. 바람직하다면, 상기 항원 서스펜션은 적절한 양의 프로인트 완전 보강제(Freund's complete adjuvant)와 같은 표준 보강제와 혼합되고, 유화액으로 만들어진 후 포유류 동물에게 투여된다. 바람직하게는, 그 후에 4 내지 21일마다 프로인트 완전 보강제의 적절한 양과 함께 혼합한 항체를 여러 번 투여하는 것이다. 적절한 운반체(carrier)도 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역화 후, 혈청은 원하는 항체의 양의 증가를 위한 표준 방법에 의해 조사될 수 있다.
본 발명의 펩티드에 대한 다중 클론 항체는 혈청에서 바라는 항체의 증가를 위해 시험되는 면역화된 포유류의 혈액을 수거, 및 어떠한 보편적인 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리시킴으로써 준비될 수 있다. 다중클론 항체는, 혈청에서 분리될 수 있는 분획물이 다중클론 항체를 포함하는 한, 다중클론 항체를 포함한 혈청을 포함한다. 면역글로불린(immunoglobulin) G 또는 M은 오직 본 발명의 펩티드를 인지하는 분획물로부터, 예를 들면 본 발명의 펩티드와 연결된 친화성 컬럼을 사용하여, 그리고 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 사용하여 상기 분획물을 정제하는 것에 의해 준비될 수 있다.
단일클론 항체를 준비하기 위하여, 항원으로 면역화시킨 포유류로부터 면역세포를 수거하고, 그 면역세포에서 상기 기술된 것과 같이 혈청에서 바라는 항체의 증가된 수준을 검사하고, 세포 융합을 한다. 바람직하게, 세포 융합을 위해 사용되는 면역 세포는 비장으로부터 수득된다. 상기 면역세포와 함께 융합되는 다른 바람직한 모 세포는, 포유류의 골수 세포(myeloma cell), 보다 바람직하게는 약물에 의해 융합된 세포의 선택을 위해 획득한 특성을 갖는 골수 세포를 포함한다.
상기 면역 세포 및 골수 세포는 알려진 방법, 예를 들면 Milstein et al.(Galfre and Milstein, Method Enzymol 73: 3-26(1981))의 방법에 따라 융합될 수 있다.
상기 세포 융합에 의해 수득된 하이브리도마(hybridoma) 결과는 HAT 배지(히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지)와 같은 표준 선택 배지에 그들을 배양함으로써 선택될 수 있다. 상기 세포 배양은 일반적으로 HAT 배지에서 며칠 내지 몇 주 동안 지속되는데, 이는 원하는 하이브리도마를 제외하고 모든 다른 세포(non-fused cell)을 사멸시키기 위해 충분한 시간이다. 그 후, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포을 복제(clone)시키고 스크린하기 위해 표준 제한 희석(standard limiting dilution)을 수행한다.
상기 방법에 더하여, 하이브리도마를 준비하기 위해 항원으로 면역화된 비인간 동물로써, EB 바이러스에 의해 감염된 것과 같은 인간 림프구는 시험관 내에서 펩티드, 펩티드를 발현하는 세포 또는 그들의 용해물로 면역화될 수 있다. 그 후, 면역화된 림프구는, 상기 펩티드에 결합할 수 있는 원하는 인간항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 생산하기 위해 U266과 같이 무기한으로 분열할 수 있는 인간-유래 골수세포에 융합시킨다(Unexamined Published Japanese Patent Application No. Sho 63-17688).
상기 수득된 하이브리도마를 마우스(mouse)의 복강(abdominal cavity)로 이식하고 그 복수를 추출한다. 상기 수득한 단일클론 항체는, 예를 들면 암모늄 황산 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 펩티드가 연결된 친화성 컬럼과 같은 방법에 의해 정제할 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드의 정제 및 탐지에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드의 작용제 및 길항제에 대한 후보자로 사용될 수도 있다.
또한, 항체를 생산하는, 면역화된 림프구와 같은 면역 세포는 종양유전자(oncogene)에 의해 무한증식(immortalization)될 수 있고 단일클론 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
그러므로 수득된 단일클론 항체는 유전자 조작 기술을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다(예를 들면 MacMillan Publishers LTD의해 영국에서 출간된 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies(1990) 참조). 예를 들면, 항체를 암호화하는 DNA는, 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은 면역 세포로부터 클론될 수 있고, 적절한 벡터로 삽입될 수 있으며, 재조합 항체를 만들기 위해 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 본 발명은 상기 기술된 재조합 항체를 또한 제공한다.
또한, 본 발명의 항체는, 이것이 하나 또는 그 이상의 본 발명 펩티드와 결합하는 한 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fc(scFv)일 수 있고, 여기서 H 및 L 사슬로부터의 Fv 단편은 적절한 링커(linker)에 의해 연결된다(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83(1988)). 보다 구체적으로, 항체 단편은 파페인(papain) 또는 펩신(pepsin)과 같은 효소를 항체에 처리함으로써 생성될 수 있다. 또는, 상기 항체 단편을 암호화하는 유전자는 제조될 수 있고, 발현 벡터로 삽입될 수 있으며, 적절한 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다(예를 들면, Co et al., J Immunol 152: 2968-76(1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96(1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515(1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63(1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9(1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7(1991) 참조).
항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG)와 같은 다양한 분자와 연결됨으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 상기 변형된 항체를 제공한다. 상기 변형된 항체는 화학적으로 변형된 항체로부터 얻을 수 있다. 상기 변형 방법은 당업계에서 보편적이다.
또는, 본 발명의 항체는, 비인간 항체에서 유래된 가변 부위(variable region)과 인간 항체에서 유리된 불가변 부위(constant region), 또는 비인간 항체에서 유래된 CDR(complementarity determining region)을 포함하는 인간 항체, 인간 항체에서 유래한 FR(frame work region)과 불가변 부위 사이에서 키메라 항체로 얻어질 수 있다. 상기 항체는 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 인간화(humanization)이 수행될 수 있다(예를 들면, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988) 참조). 따라서, 상기 인간화된 항체는 키메라 항체이고, 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 상당히 적은 도메인이 비인간 종류로부터 그에 상응하는 서열에 의해 치환되었다.
인간 프레임워크 및 불변 부위뿐만 아니라 인간 가변 부위로 구성된 완전한 인간 항체 또한 사용될 수 있다. 상기 항체는 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들면 시험관 내 방법(in vitro method)은 인간 항체 단편이 제시되는 박테리오파지의 재조합 라이브러리의 사용을 포함한다(예를 들면, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381(1991)). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 위치(loci)를 형질전환 동물, 예를 들면 내재성 면역 글로불린 유전자(endogenous immunoglobulin gene)가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스로 삽입시킴으로써 만들어질 수 있다. 상기 접근은 예를 들면 U.S. Patent Nos. 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016에 기술되어 있다.
상기와 같이 수득한 항체는 동종성(homogeneity)으로 정제될 수 있다. 예를 들면 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에서 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 적절하게 선택되고 혼합된 컬럼 크로마토그래피의 사용, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 여과, 울트라여과, 염-외 희석(salting-out dialysis), SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 등점적 전기영동(isoelectric focusing)에 의해 상기 항체는 분리(sepseration) 및 분리(isolation)될 수 있으나(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)), 이에 한정되지는 않는다. 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로서 사용될 수 있다. 사용되는 예시적인 단백질 A 컬럼은 예를 들면 Hyper D, POROS 및 Sepharose F.F.(Pharmacia)를 포함한다.
친화성을 제외한 크로마토그래피의 예는, 예를 들면 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 겔 여과(gel filtration), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 및 그와 같은 것(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))을 포함한다. 크로마토그래피 절차는, HPLC 및 FPLC와 같은 액체상 크로마토그래피(liquid-phase chromatography)에 의해 수행될 수 있다.
예를 들면, 흡수도의 측정, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), EIA(enzyme immunoassay), RIA(radioimmunoassay) 및/또는 면역형광이 본 발명 항체의 항원 결합 활성(antigen binding activity)을 측정하기 위해 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체를 플레이트에 고정시키고, 본 발명의 펩티드를 플레이트에 첨가한 후, 항체를 생산하는 세포의 배양 상층액 또는 정제된 항체와 같은 원하는 항체를 포함하는 시료를 첨가한다. 그 후, 1차 항체를 인지하고 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 효소로 표지된 2차 항체를 적용하고, 상기 플레이트를 배양한다. 그 다음, 씻어준 후, p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 효소 기질을 플레이트에 적용시키고, 상기 시료의 항원 결합 활성을 평가하기 위하여 그 흡수도를 측정한다. C-말단 또는 N-말단 단편과 같은 펩티드의 단편은 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 항원으로서 사용될 수 있다. 비아코어(BIAcore(Pharmacia))는 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 항체를 본 발명의 펩티드를 포함한다고 가정되는 시료에 노출시킴으로써 본 발명의 펩티드를 탐지 또는 측정하게 해주고 상기 항체 및 상기 펩티드에 의해 형성된 면역 복합체를 탐지 또는 측정하게 해준다.
본 발명에 따른 펩티드를 탐지 또는 측정하는 방법은 특이적으로 펩티드를 탐지 또는 측정할 수 있기 때문에, 이 방법은 상기 펩티드를 사용하는 다양한 실험에서 유용할 것이다.
XII. 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 삽입시키는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주세포에서 본 발명의 뉴클레오티드, 특히, DNA를 보유, 본 발명의 펩티드를 발현, 또는 유전자 치료를 위한 본 발명의 뉴클레오티드를 투여에 유용할 수 있다.
E.coli가 숙주 세포이고, 벡터가 E.coli 내에서(예를 들면, JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1Blue) 대량으로 증폭되고 생산될 때, 상기 벡터는 E.coli 내에서 증폭되기 위해 "ori" 및 형질전환된 E.coli를 선별하기 위한 유전자 마커(예를 들면 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 그와 같은, 약물에 의해 선별되는 약물 내성 유전자)를 가져야 한다. 예를 들면 M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 기술된 벡터 뿐만 아니라, pGEM-T, pDIRECT 및 pT7 역시 cDNA를 서브클로닝하고 추출하기 위해 사용될 수 있다. 벡터가 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 사용될 때, 발현 벡터는 특히 유용하다. 예를 들면, E.coli에서 발현되는 발현 벡터는 E.coli 내에서 증폭되는 상기 특징을 가져야한다. JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1 Blue와 같은 E.coli를 숙주 세포로서 사용할 때, 벡터는 E.coli내에서 원하는 유전자를 효율적으로 발현시키는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward et al., Nature 341: 544-6(1989); FASEB J 6: 2422-7(1992)), araB 프로모터(Better et al., Science 240: 1041-3(1988)), T7 프로모터 또는 그와 같은 것을 가져야 한다. 상기 면에서, 예를 들면 pGEX-5X-1(Pharmacia), "QIAexpress system"(Qiagen), pEGFP 및 pET(이 경우에는, 숙주 세포는 T7 RNA 중합효소를 발현하는 BL21이 바람직하다)가 상기 벡터들 대신 사용될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 펩티드 분비를 위한 신호 서열(signal sequence)을 포함할 것이다. E. coli의 주변 세포질(periplasm)로 분비되도록 펩티드에 지시하는 신호 서열의 예는, pelB 신호 서열(Lei et al., J Bacteriol 169: 4379(1987))이 있다. 벡터를 표적 숙주 세포로 삽입시키기 위한 수단은, 예를 들면 칼슘 클로라이드(calcium chloride) 방법 및 전기침공(electroporation) 방법을 포함한다.
대장균(E. coli) 뿐만 아니라, 예를 들면, 포유류로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pcDNA3(Invitrogen) 및 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17): 5322(1990)), pEF, pCDM8), 곤충 세포로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, "Bac-to-BAC baculovirus expression system"(GIBCO BRL), pBacPAK8), 식물로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pMH1, pMH2), 동물 바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pZIpneo), 효모로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, "Pichia Expression Kit"(Invitrogen), pNV11, SP-Q01) 및 바실러스 섭틸릭스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 발현 벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)가 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
CHO, COS 또는 NIH3T3와 같은 동물 세포에서 벡터를 발현시키기 위해서, 벡터는 상기 세포 내에서 발현에 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan et al., Nature 277: 108(1979)), MMLV-LTR 프로모터, EF1 알파 프로모터(Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322(1990)), CMV 프로모터 및 그와 같은 것을 가져야 하고, 바람직하게 형질전환체를 선별하기 위한 유전자 마커(예를 들면, 약물(neomycin, G418)에 의해 선별되는 약물 내성 유전자)를 가져야 한다. 상기 특징을 가진 알려진 벡터의 예는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13를 포함한다.
이하에, 본 발명은 실시예에 관하여 더욱 자세하게 기재되어 있다. 그러나, 하기 재료, 방법 및 실시예는 본 발명의 특정 실시예(embodiments)를 만들고 사용하는 데 있어서 당업자를 돕기 위하여 제공될 수 있으나, 단지 본 발명의 양상을 설명하려는 것이고 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 의도가 아니다. 당업자가 쉽게 알 수 있도록, 여기에서 기재된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 예시 또는 시험으로 사용될 수 있다.
실시예
재료 및 방법
세포주
HLA-A*0201-양성 B-림프구아형(lymphoblastoid) 세포주인 T2, 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주인 COS7를 ATCC로부터 구입하였다.
SEMA5B 유래 펩티드의 후보 선별
HLA-A*0201 분자에 결합하는 SEMA5B 유래 9-머(mer) 및 10-머 펩티드를 결합 예측 소프트웨어 "NetMHC 3.0"를 이용하여 예측하였다(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.(Tissue Antigens., 62:378-84, 2003), Nielsen et al.(Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004)). 이러한 펩티드는 표준 고체상 합성 방법에 따른 Biosynthesis(Lewisville, Texas)로 합성하였고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reversed phase high performance liquid chromatography, HPLC)로 정제하였다. 펩티드의 순도(>90%) 및 동정을 분석적 HPLC 및 질량 분석으로 각각 결정하였다. 펩티드는 20 mg/ml의 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하였고 -80℃에 보관하였다.
시험관 내에서 CTL 유도
단핵구-유래된 수지상세포(dendritic cells, DC)를 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)에 제시된 펩티드에 대하여 세포독성 T 림프구 반응을 유도하기 위하여 항원 제시 세포(antigen-presenting cells, APC)로서 사용하였다. DC는 다른 곳에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 제조되었다(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). 특이적으로, 피콜-플라크(Ficoll-Paque plus)(Pharmacia) 용액으로 정상 기증자(HLA-A*0201 양성)로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포를 플라스틱 조직 배양 디쉬(plastic tissue culture dish)(Becton Dickinson)에 부착하여 단핵구 분획으로 그들을 풍부하게 얻기 위하여 분리하였다. 풍부한-단핵구 집단을 2% 열-불활성화된 자가유래 혈청을 함유하는 AIM-V 배지(Invitrogen)에서 1000 U/ml 과립-대식세포 집락-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)(R&D System) 및 1000 U/ml 인터루킨(interleukin, IL)-4(R&D System) 존재하에 배양하였다. 배양 7일 후에, 상기 사이토카인으로 유도된 DC를 AIM-V 배지에서 3 시간 동안 37℃에서 3 micro g/ml 베타 2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin) 존재하에, 각 합성된 펩티드 20 micro g/ml로 자극하였다. 제조된 세포는 그들의 세포 표면에, CD80, CD83, CD86 및 HLA class II와 같은, DC와 연관된 분자를 발현하는 것으로 보인다(표시되지 않은 데이터). 이러한 펩티드로 자극된 DC를 X-선 조사(X-ray irradiated)(20 Gy)로 불활성화한 다음 자가유래 CD8+ T 세포와 1:20 비율로 혼합하였고, CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)으로 양성 선별하여 수득하였다. 이러한 배양을 48-웰 플레이트(Corning)에 수립하였다; 각 웰은 0.5 ml AIM-V/2% AS 배지에서, 1.5 x 104 펩티드-자극된 DC, 3 x 105 CD8+ T 세포 및 10 ng/ml IL-7(R&D System)을 포함한다. 3일 후에, 이러한 배양은 최종 농도 20 IU/ml가 되도록 IL-2(CHIRON)로 보충되었다. 7일 및 14일에, T 세포를 자가유래 펩티드-부가된(pulsed) DC로 더 자극하였다. DC는 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 각각의 시간마다 제조되었다. 3회 펩티드 자극 후 21일째에 CTL은 펩티드-부가된 T2 세포에 대하여 시험되었다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
CTL 증식 방법
CTL을 Riddell et al.에 기재된 것과 유사한 방식을 이용한 배양에서 증식하였다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). 총 5 x 104 CTL을 마이토마이신 C(Mitomycin C)으로 불활성화된, 두 종류의 인간 B-림프구아형 세포주가 있는 25 ml AIM-V/5% AS 배지에서, 40 ng/ml 항-CD3 단일클론 항체(monoclonal antibody)(Pharmingen) 존재 하에 부유하였다. 배양을 개시한 후 1일째에, 120 IU/ml IL-2를 상기 배양에 첨가하였다. 상기 배양에 30 IU/ml IL-2를 함유한 신선한 AIM-V/5% AS 배지를 5, 8 및 11일에 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
CTL 클론의 수립
희석액을 0.3, 1, 및 3 CTL/웰이 되도록 96 둥근-바닥 마이크로 타이터 플레이트(96 round-bottomed micro titer plate)(Nalge Nunc International)에 제조하였다. CTL을 총 150 micro l/웰에서 5% AS를 함유하는 AIM-V 배지로, 두 종류의 인간 B-림프구아형 세포주 1 X 104 세포/웰, 30ng/ml 항-CD3 항체, 및 125 U/ml IL-2과 배양하였다. IL-2 50 micro l/웰을 10 일 후에 최종 농도가 125 U/ml IL-2에 도달하도록 배지에 첨가하였다. CTL 활성을 14일째에 시험하였고, CTL 클론을 상기 기재된 것과 같은 동일한 방식을 이용하여 증식하였다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
특이적 CTL 활성
특이적 CTL 활성을 시험하기 위하여, 인터페론(interferon, IFN)-감마(gamma) 효소-연계된 면역스팟(enzyme-linked immunospot, ELISPOT) 분석 및 IFN-감마 효소-연계된 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 수행하였다. 특이적으로, 펩티드-부가된 T2(1 x 104/웰)을 자극 세포(stimulator cells)로서 제조하였다. 48 웰에서 배양된 세포를 응답 세포(responder cells)로서 이용하였다. IFN-감마 ELISPOT 분석 및 IFN-감마 ELISA 분석을 제조 절차하에 수행하였다.
표적 유전자 및 HLA -A02 중 어느 하나 또는 둘 모두를 강제로 발현하는 세포의 수립
표적 유전자 또는 HLA-A*0201의 개방형 해독틀(open reading frame)을 암호화하는 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 증폭된-PCR 산물을 발현 벡터로 클로닝하였다. 플라스미드를 제조자의 추천 방법에 따라 리포펙타민(lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 이용하여, HLA-A*0201-널(null) 세포주인, COS7로 형질감염하였다. 형질감염한 후 2일째에, 형질감염된 세포를 versene(Invitrogen)으로 수확하였고 CTL 활성 분석을 위한 상기 자극 세포(5 X 104 세포/웰)로서 사용하였다.
결과
암에서 증가된 SEMA5B 발현
cDNA-마이크로어레이를 이용하여 다양한 종류의 암에서 수득한 광범위한 유전자 발현 프로파일(profile) 데이터를 통하여 SEMA5B(GenBank Accession No. NM_001031702; 서열번호 48)의 발현이 증가함을 밝혔다. SEMA5B 발현은 해당 정상 조직과 비교하여, 2건의 식도암(Esophageal Cancer) 중 1건, 1건의 NSCLC 중 1건, 17건의 RCC 중 14건 및 4건의 SCLC 중 4건에서 유의적으로 증가하였다(표 1).
해당 정상 조직과 비교하여 암 조직에서 관측된 SEMA5B 의 상향-조절 예의 비율
암/종양 비율
식도암 1/2
NSCLC 1/1
RCC 14/17
SCLC 4/4
SEMA5B 에서 유래된 HLA -A02에 결합하는 펩티드의 예측
표 2a 및 2b는 높은 결합 친화도 순서로 SEMA5B의 9머 및 10머 펩티드에 결합하는 HLA-A02를 나타낸다. 잠재적인 HLA-A02 결합 능력이 있는 전체 49개 펩티드가 선별되었고 에피토프 펩티드를 결정하기 위해 조사되었다.
[표 2a]
Figure pct00001

[표 2b]
Figure pct00002
시작 위치는 SEMA5B의 N-말단으로부터 아미노산 잔기의 수를 나타낸다.
결합 해리 상수[Kd (nM)]는 "NetMHC3.0"로부터 유래된다.
HLA -A*0201로 제한된 SEMA5B 유래 예측된 펩티드에 의한 CTL 유도
SEMA5B에서 유래된 펩티드에 대한 CTL은 "재료 및 방법"에 기재된 것과 같은 절차(protocol)에 따라 제조되었다. 펩티드-특이적 CTL 활성을 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 검출하였다(도 1). SEMA5B-A02-9-70(서열번호: 5)으로 자극된 #1번 웰(a), SEMA5B-A02-9-1049(서열번호: 7)로 자극된 #7번 웰(b), SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27)로 자극된 #5번 웰(c) 및 SEMA5B-A02-10-370(서열번호: 34)로 자극된 #5번 웰(d)은 대조군 웰과 비교하여 강한 IFN-감마 생산을 나타내었다. 한편, 표 2a 및 2b에서 제시되는 펩티드는 HLA-A*0201과 결합 가능한 활성이 있으나, 그렇지 않은 다른 펩티드들에 의한 자극은 어떠한 특이적인 CTL 활성도 탐지되지 않았다. 음성 데이터의 전형적인 경우와 같이, 펩티드-부가된 표적세포에 대항하여 SEMA5B-A02-9-59(서열번호: 8)(e)로 자극된 CTL로부터의 특이적 IFN-감마 생산은 제시되지 않았다. 결과적으로, 이는 SEMA5B에서 유래된 4개의 펩티드가 강력한 CTL을 유도할 수 있는 펩티드로 선택되었다.
SEMA5B 유래 펩티드에 대한 CTL 세포주 및 클론의 수립
IFN-감마 ELISPOT 검사에서 펩티드-특이적 CTL 활성이 제시된, SEMA5B-A02-9-70(서열번호: 5)으로 자극된 #1번 웰(a), SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27)으로 자극된 #5번 웰(b) 및 SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27)으로 자극된 #5번 웰(c)에 있는 세포를, 증식하고 CTL 세포주로 수립하였다. 이러한 CTL 세포주의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA로 측정되었다(도 2). CTL 세포주는 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포와 비교하여 해당 펩티드로 부가된 표적 세포에 대해 강한 IFN-감마 생산을 나타냄을 확인하였다. 더욱이, CTL 클론을 CTL 세포주로부터 제한 희석하여 수립하였고, 각 펩티드로 부가된(pulsed) 표적 세포에 대하여 CTL 클론으로부터 IFN-감마 생산을 IFN-감마 ELISA로 측정하였다. 강력한 IFN-감마 생산은 SEMA5B-A02-9-70(서열번호: 5)(a), SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27)(b) 또는 SEMA5B-A02-10-370(서열번호: 34)(c)으로 자극된 CTL 클론으로부터 관찰되었다(도 3).
SEMA5B 및 HLA-A*0201를 외생적으로 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성
SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27) 펩티드에 대하여 형성된 상기 수립된 CTL 세포주는 SEMA5B 및 HLA-A*0201 분자를 발현하는 표적 세포를 인지하는 능력에 대해 조사되었다. 전장의 SEMA5B 및 HLA-A*0201 유전자(SEMA5B 및 HLA-A*0201 유전자를 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 모델) 모두를 형질감염한(transfected) COS7 세포를 자극 세포로서 준비하였고, 전장의 SEMA5B 또는 HLA-A*0201 둘 중 어느 하나를 형질감염시킨 COS7 세포를 대조군으로 사용하였다. 도 4에서, 상기 SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27)으로 자극된 CTL 세포주는 SEMA5B과 HLA-A*0201 모두를 발현하는 COS7 세포에 대하여 강력한 CTL 활성을 보였다. 한편, 대조군에 대하여 유의적이고 특이적인 CTL 활성은 탐지되지 않았다. 따라서, 이러한 데이터는 SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27)의 펩티드가 내생적으로(endogenously) 처리하여 HLA-A*0201 분자와 함께 표적세포에서 발현되고 CTL에 의해 인지되는 것을 명백히 증명한다. 이러한 결과들은 SEMA5B 유래 이러한 펩티드가 SEMA5B 발현 종양이 있는 환자를 위한 암 백신으로 적용될 수 있는 것을 나타낸다.
항원 펩티드의 상동성 분석
SEMA5B-A02-9-70(서열번호: 5), SEMA5B-A02-9-1049(서열번호: 7), SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27) 및 SEMA5B-A02-10-370(서열번호: 34)로 자극된 CTL은 유의적이고 특이적인 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 EMA5B-A02-9-70(서열번호: 5), SEMA5B-A02-9-1049(서열번호: 7), SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27) 및 SEMA5B-A02-10-370(서열번호: 34)의 서열이 인간 면역 시스템을 민감하게 하는 것으로 알려진 다른 분자 유래 펩티드와 상동성이 있기 때문일 것이다. 이러한 가능성을 배제하기 위하여, 상동성 분석은 유의적인 상동성이 있는 서열을 나타내지 않는 BLAST 알고리즘(algorithm)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) 쿼리(queries)를 이용하여 이러한 펩티드 서열에 대하여 수행하였다. 상동성 분석의 결과는 SEMA5B-A02-9-70(서열번호: 5), SEMA5B-A02-9-1049(서열번호: 7), SEMA5B-A02-10-69(서열번호: 27) 및 SEMA5B-A02-10-370(서열번호: 34)의 서열이 유일하고 따라서, 우리의 최선의 지식에 의하면, 이 분자가 어떤 관련없는 분자에 대하여 의도하지 않은 면역 반응을 야기할 수 있는 가능성은 거의 없다.
본 발명은, 강력하고 특이적인 항-종양 면역반응을 유도하고 다양한 종류의 암에 적용 가능성을 가진, 구체적으로 SEMA5B으로부터 유래된 새로운 TTA를 제공한다. 이러한 TAA는 SEMA5B와 관련된 질병, 예를 들면 암, 보다 구체적으로, 식도암(esophagus cancer), NSCLC, RCC 및 SCLC에 대한 펩티드 백신으로 사용할 수 있다.
본 발명이 여기서 이의 구체적 실시예와 함께 상세히 기술되는 동안, 앞선 기술이 예시적 설명적 특징이었고 본 발명 및 이의 바람직한 실시예를 예시하려는 의도를 가지고 있다는 것이 이해되어야 한다. 일반적인 실험 방법을 통해, 당업자는 본 발명의 뜻과 범위, 첨부된 청구항에 의해 정의된 경계 및 한계 내에서 용이하게 다양한 변화 및 변형이 있을 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> SEMA5B PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME <130> ONC-A1107P <150> US 61/495,819 <151> 2011-06-10 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Phe Leu Leu Glu Asp Thr Trp Thr Thr 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Leu Met Ser Glu Ala Val Gln Pro Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Leu Leu Leu Pro Ser Leu Thr Leu Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Phe Leu Gly Ser Gly Leu Leu Thr Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Leu Leu Pro Ser Leu Thr Leu Leu Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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synthesized peptide sequence <400> 12 Arg Thr Ala Glu Gly Pro Ile Met Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 13 Gly Leu Arg Asp Gly Val Leu Arg Val 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 14 Gln Gln Leu Arg Cys Gly Trp Thr Val 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 15 Trp Leu Leu Ser Leu Val Arg Gly Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 16 Thr Val Tyr Ser Arg Val Ala Arg Val 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 17 Ser Leu Leu Gln Ala Thr Glu Trp Ala 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 18 Gly Leu Asp Cys Leu Gly Pro Ala Ile 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 19 Ser Leu Leu Leu Pro Ser Leu Thr Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 20 Arg Thr Ile Glu Lys Ile Asn Gly Val 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 21 Leu Leu Pro Cys Leu Pro Pro Gly Ala 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 22 Arg Leu Ser Leu Ala Asn Val Ser Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 23 Thr Val Gly Gly Trp Leu Leu Ser Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 24 Asn Met Ser Leu Trp Thr Gln Asn Ile 1 5 <210> 25 <211> 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37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 37 Ser Leu Gln Asp Ala Gln Arg Leu Phe Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 38 Trp Leu Leu Ser Leu Val Arg Gly Leu Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 39 Thr Leu Tyr His Val Leu Tyr Ile Gly Thr 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 40 Gln Leu Ile Val Gly Ala Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 41 Arg Leu Ser Leu Ala Asn Val Ser Leu Leu 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 42 Val Gln Ala Lys Asp Thr Leu Tyr His Val 1 5 10 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gcatccagcg gctgctggga gcccgagcgc agcgggcgcg ggcccgggtg gggactgcac 120 cggagcgctg agagctggag gccgttcctg cgcggccgcc ccattcccag accggccgcc 180 agcccatctg gttagctccc gccgctccgc gccgcccggg agtcgggagc cgcggggaac 240 cgggcacctg cacccgcctc tgggagtgag tggttccagc tggtgcctgg cctgtgtctc 300 ttgg atg ccc tgt ggc ttc agt ccg tct cct gtt gcc cac cac ctc 346 Met Pro Cys Gly Phe Ser Pro Ser Pro Val Ala His His Leu 1 5 10 gtc cct ggg ccg cct gat acc cca gcc caa cag cta agg tgt gga tgg 394 Val Pro Gly Pro Pro Asp Thr Pro Ala Gln Gln Leu Arg Cys Gly Trp 15 20 25 30 aca gta ggg ggc tgg ctt ctc tca ctg gtc agg ggt ctt ctc ccc tgt 442 Thr Val Gly Gly Trp Leu Leu Ser Leu Val Arg Gly Leu Leu Pro Cys 35 40 45 ctg cct ccc gga gct agg act gca gag ggg cct atc atg gtg ctt gca 490 Leu Pro Pro Gly Ala Arg Thr Ala Glu Gly Pro Ile Met Val Leu Ala 50 55 60 ggc ccc ctg gct gtc tcg ctg ttg ctg ccc agc ctc aca ctg ctg gtg 538 Gly Pro Leu Ala Val Ser Leu Leu Leu Pro Ser Leu Thr Leu Leu Val 65 70 75 tcc cac ctc tcc agc tcc cag gat gtc tcc agt gag ccc agc agt gag 586 Ser His Leu Ser Ser Ser Gln Asp Val Ser Ser Glu Pro Ser Ser Glu 80 85 90 cag cag ctg tgc gcc ctt agc aag cac ccc acc gtg gcc ttt gaa gac 634 Gln Gln Leu Cys Ala Leu Ser Lys His Pro Thr Val Ala Phe Glu Asp 95 100 105 110 ctg cag ccg tgg gtc tct aac ttc acc tac cct gga gcc cgg gat ttc 682 Leu Gln Pro Trp Val Ser Asn Phe Thr Tyr Pro Gly Ala Arg Asp Phe 115 120 125 tcc cag ctg gct ttg gac ccc tcc ggg aac cag ctc atc gtg gga gcc 730 Ser Gln Leu Ala Leu Asp Pro Ser Gly Asn Gln Leu Ile Val Gly Ala 130 135 140 agg aac tac ctc ttc aga ctc agc ctt gcc aat gtc tct ctt ctt cag 778 Arg Asn Tyr Leu Phe Arg Leu Ser Leu Ala Asn Val Ser Leu Leu Gln 145 150 155 gcc aca gag tgg gcc tcc agt gag gac acg cgc cgc tcc tgc caa agc 826 Ala Thr Glu Trp Ala Ser Ser Glu Asp Thr Arg Arg Ser Cys Gln Ser 160 165 170 aaa ggg aag act gag gag gag tgt cag aac tac gtg cga gtc ctg atc 874 Lys Gly Lys Thr Glu Glu Glu Cys Gln Asn Tyr Val Arg Val Leu Ile 175 180 185 190 gtc gcc ggc cgg aag gtg ttc atg tgt gga acc aat gcc ttt tcc ccc 922 Val Ala Gly Arg Lys Val Phe Met Cys Gly Thr Asn Ala Phe Ser Pro 195 200 205 atg tgc acc agc aga cag gtg ggg aac ctc agc cgg act att gag aag 970 Met Cys Thr Ser Arg Gln Val Gly Asn Leu Ser Arg Thr Ile Glu Lys 210 215 220 atc aat ggt gtg gcc cgc tgc ccc tat gac cca cgc cac aac tcc aca 1018 Ile Asn Gly Val Ala Arg Cys Pro Tyr Asp Pro Arg His Asn Ser Thr 225 230 235 gct gtc atc tcc tcc cag ggg gag ctc tat gca gcc acg gtc atc gac 1066 Ala Val Ile Ser Ser Gln Gly Glu Leu Tyr Ala Ala Thr Val Ile Asp 240 245 250 ttc tca ggt cgg gac cct gcc atc tac cgc agc ctg ggc agt ggg cca 1114 Phe Ser Gly Arg Asp Pro Ala Ile Tyr Arg Ser Leu Gly Ser Gly Pro 255 260 265 270 ccg ctt cgc act gcc caa tat aac tcc aag tgg ctt aat gag cca aac 1162 Pro Leu Arg Thr Ala Gln Tyr Asn Ser Lys Trp Leu Asn Glu Pro Asn 275 280 285 ttc gtg gca gcc tat gat att ggg ctg ttt gca tac ttc ttc ctg cgg 1210 Phe Val Ala Ala Tyr Asp Ile Gly Leu Phe Ala Tyr Phe Phe Leu Arg 290 295 300 gag aac gca gtg gag cac gac tgt gga cgc acc gtg tac tct cgc gtg 1258 Glu Asn Ala Val Glu His Asp Cys Gly Arg Thr Val Tyr Ser Arg Val 305 310 315 gcc cgc gtg tgc aag aat gac gtg ggg ggc cga ttc ctg ctg gag gac 1306 Ala Arg Val Cys Lys Asn Asp Val Gly Gly Arg Phe Leu Leu Glu Asp 320 325 330 aca tgg acc aca ttc atg aag gcc cgg ctc aac tgc tcc cgc ccg ggc 1354 Thr Trp Thr Thr Phe Met Lys Ala Arg Leu Asn Cys Ser Arg Pro Gly 335 340 345 350 gag gtc ccc ttc tac tat aac gag ctg cag agt gcc ttc cac ttg ccg 1402 Glu Val Pro Phe Tyr Tyr Asn Glu Leu Gln Ser Ala Phe His Leu Pro 355 360 365 gag cag gac ctc atc tat gga gtt ttc aca acc aac gta aac agc atc 1450 Glu Gln Asp Leu Ile Tyr Gly Val Phe Thr Thr Asn Val Asn Ser Ile 370 375 380 gcg gct tct gct gtc tgc gcc ttc aac ctc agt gct atc tcc cag gct 1498 Ala Ala Ser Ala Val Cys Ala Phe Asn Leu Ser Ala Ile Ser Gln Ala 385 390 395 ttc aat ggc cca ttt cgc tac cag gag aac ccc agg gct gcc tgg ctc 1546 Phe Asn Gly Pro Phe Arg Tyr Gln Glu Asn Pro Arg Ala Ala Trp Leu 400 405 410 ccc ata gcc aac ccc atc ccc aat ttc cag tgt ggc acc ctg cct gag 1594 Pro Ile Ala Asn Pro Ile Pro Asn Phe Gln Cys Gly Thr Leu Pro Glu 415 420 425 430 acc ggt ccc aac gag aac ctg acg gag cgc agc ctg cag gac gcg cag 1642 Thr Gly Pro Asn Glu Asn Leu Thr Glu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Gln 435 440 445 cgc ctc ttc ctg atg agc gag gcc gtg cag ccg gtg aca ccc gag ccc 1690 Arg Leu Phe Leu Met Ser Glu Ala Val Gln Pro Val Thr Pro Glu Pro 450 455 460 tgt gtc acc cag gac agc gtg cgc ttc tca cac ctc gtg gtg gac ctg 1738 Cys Val Thr Gln Asp Ser Val Arg Phe Ser His Leu Val Val Asp Leu 465 470 475 gtg cag gct aaa gac acg ctc tac cat gta ctc tac att ggc acc gag 1786 Val Gln Ala Lys Asp Thr Leu Tyr His Val Leu Tyr Ile Gly Thr Glu 480 485 490 tcg ggc acc atc ctg aag gcg ctg tcc acg gcg agc cgc agc ctc cac 1834 Ser Gly Thr Ile Leu Lys Ala Leu Ser Thr Ala Ser Arg Ser Leu His 495 500 505 510 ggc tgc tac ctg gag gag ctg cac gtg ctg ccc ccc ggg cgc cgc gag 1882 Gly Cys Tyr Leu Glu Glu Leu His Val Leu Pro Pro Gly Arg Arg Glu 515 520 525 ccc ctg cgc agc ctg cgc atc ctg cac agc gcc cgc gcg ctc ttc gtg 1930 Pro Leu Arg Ser Leu Arg Ile Leu His Ser Ala Arg Ala Leu Phe Val 530 535 540 ggg ctg aga gac ggc gtc ctg cgg gtc cca ctg gag agg tgc gcc gcc 1978 Gly Leu Arg Asp Gly Val Leu Arg Val Pro Leu Glu Arg Cys Ala Ala 545 550 555 tac cgc agc cag ggg gca tgc ctg ggg gcc cgg gac ccg tac tgt ggc 2026 Tyr Arg Ser Gln Gly Ala Cys Leu Gly Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Gly 560 565 570 tgg gac ggg aag cag caa cgt tgc agc aca ctc gag gac agc tcc aac 2074 Trp Asp Gly Lys Gln Gln Arg Cys Ser Thr Leu Glu Asp Ser Ser Asn 575 580 585 590 atg agc ctc tgg acc cag aac atc acc gcc tgt cct gtg cgg aat gtg 2122 Met Ser Leu Trp Thr Gln Asn Ile Thr Ala Cys Pro Val Arg Asn Val 595 600 605 aca cgg gat ggg ggc ttc ggc cca tgg tca cca tgg caa cca tgt gag 2170 Thr Arg Asp Gly Gly Phe Gly Pro Trp Ser Pro Trp Gln Pro Cys Glu 610 615 620 cac ttg gat ggg gac aac tca ggc tct tgc ctg tgt cga gct cga tcc 2218 His Leu Asp Gly Asp Asn Ser Gly Ser Cys Leu Cys Arg Ala Arg Ser 625 630 635 tgt gat tcc cct cga ccc cgc tgt ggg ggc ctt gac tgc ctg ggg cca 2266 Cys Asp Ser Pro Arg Pro Arg Cys Gly Gly Leu Asp Cys Leu Gly Pro 640 645 650 gcc atc cac atc gcc aac tgc tcc agg aat ggg gcg tgg acc ccg tgg 2314 Ala Ile His Ile Ala Asn Cys Ser Arg Asn Gly Ala Trp Thr Pro Trp 655 660 665 670 tca tcg tgg gcg ctg tgc agc acg tcc tgt ggc atc ggc ttc cag gtc 2362 Ser Ser Trp Ala Leu Cys Ser Thr Ser Cys Gly Ile Gly Phe Gln Val 675 680 685 cgc cag cga agt tgc agc aac cct gct ccc cgc cac ggg ggc cgc atc 2410 Arg Gln Arg Ser Cys Ser Asn Pro Ala Pro Arg His Gly Gly Arg Ile 690 695 700 tgc gtg ggc aag agc cgg gag gaa cgg ttc tgt aat gag aac acg cct 2458 Cys Val Gly Lys Ser Arg Glu Glu Arg Phe Cys Asn Glu Asn Thr Pro 705 710 715 tgc ccg gtg ccc atc ttc tgg gct tcc tgg ggc tcc tgg agc aag tgc 2506 Cys Pro Val Pro Ile Phe Trp Ala Ser Trp Gly Ser Trp Ser Lys Cys 720 725 730 agc agc aac tgt gga ggg ggc atg cag tcg cgg cgt cgg gcc tgc gag 2554 Ser Ser Asn Cys Gly Gly Gly Met Gln Ser Arg Arg Arg Ala Cys Glu 735 740 745 750 aac ggc aac tcc tgc ctg ggc tgc ggc gtg gag ttc aag acg tgc aac 2602 Asn Gly Asn Ser Cys Leu Gly Cys Gly Val Glu Phe Lys Thr Cys Asn 755 760 765 ccc gag ggc tgc ccc gaa gtg cgg cgc aac acc ccc tgg acg ccg tgg 2650 Pro Glu Gly Cys Pro Glu Val Arg Arg Asn Thr Pro Trp Thr Pro Trp 770 775 780 ctg ccc gtg aac gtg acg cag ggc ggg gca cgg cag gag cag cgg ttc 2698 Leu Pro Val Asn Val Thr Gln Gly Gly Ala Arg Gln Glu Gln Arg Phe 785 790 795 cgc ttc acc tgc cgc gcg ccc ctt gca gac ccg cac ggc ctg cag ttc 2746 Arg Phe Thr Cys Arg Ala Pro Leu Ala Asp Pro His Gly Leu Gln Phe 800 805 810 ggc agg aga agg acc gag acg agg acc tgt ccc gcg gac ggc tcc ggc 2794 Gly Arg Arg Arg Thr Glu Thr Arg Thr Cys Pro Ala Asp Gly Ser Gly 815 820 825 830 tcc tgc gac acc gac gcc ctg gtg gag gtc ctc ctg cgc agc ggg agc 2842 Ser Cys Asp Thr Asp Ala Leu Val Glu Val Leu Leu Arg Ser Gly Ser 835 840 845 acc tcc ccg cac acg gtg agc ggg ggc tgg gcc gcc tgg ggc ccg tgg 2890 Thr Ser Pro His Thr Val Ser Gly Gly Trp Ala Ala Trp Gly Pro Trp 850 855 860 tcg tcc tgc tcc cgg gac tgc gag ctg ggc ttc cgc gtc cgc aag aga 2938 Ser Ser Cys Ser Arg Asp Cys Glu Leu Gly Phe Arg Val Arg Lys Arg 865 870 875 acg tgc act aac ccg gag ccc cgc aac ggg ggc ctg ccc tgc gtg ggc 2986 Thr Cys Thr Asn Pro Glu Pro Arg Asn Gly Gly Leu Pro Cys Val Gly 880 885 890 gat gct gcc gag tac cag gac tgc aac ccc cag gct tgc cca gtt cgg 3034 Asp Ala Ala Glu Tyr Gln Asp Cys Asn Pro Gln Ala Cys Pro Val Arg 895 900 905 910 ggt gct tgg tcc tgc tgg acc tca tgg tct cca tgc tca gct tcc tgt 3082 Gly Ala Trp Ser Cys Trp Thr Ser Trp Ser Pro Cys Ser Ala Ser Cys 915 920 925 ggt ggg ggt cac tat caa cgc acc cgt tcc tgc acc agc ccc gca ccc 3130 Gly Gly Gly His Tyr Gln Arg Thr Arg Ser Cys Thr Ser Pro Ala Pro 930 935 940 tcc cca ggt gag gac atc tgt ctc ggg ctg cac acg gag gag gca cta 3178 Ser Pro Gly Glu Asp Ile Cys Leu Gly Leu His Thr Glu Glu Ala Leu 945 950 955 tgt gcc aca cag gcc tgc cca gaa ggc tgg tcg ccc tgg tct gag tgg 3226 Cys Ala Thr Gln Ala Cys Pro Glu Gly Trp Ser Pro Trp Ser Glu Trp 960 965 970 agt aag tgc act gac gac gga gcc cag agc cga agc cgg cac tgt gag 3274 Ser Lys Cys Thr Asp Asp Gly Ala Gln Ser Arg Ser Arg His Cys Glu 975 980 985 990 gag ctc ctc cca ggg tcc agc gcc tgt gct gga aac agc agc cag agc 3322 Glu Leu Leu Pro Gly Ser Ser Ala Cys Ala Gly Asn Ser Ser Gln Ser 995 1000 1005 cgc ccc tgc ccc tac agc gag att ccc gtc atc ctg cca gcc tcc agc 3370 Arg Pro Cys Pro Tyr Ser Glu Ile Pro Val Ile Leu Pro Ala Ser Ser 1010 1015 1020 atg gag gag gcc acc gac tgt gca ggg ttc aat ctc atc cac ttg gtg 3418 Met Glu Glu Ala Thr Asp Cys Ala Gly Phe Asn Leu Ile His Leu Val 1025 1030 1035 gcc acg ggc atc tcc tgc ttc ttg ggc tct ggg ctc ctg acc cta gca 3466 Ala Thr Gly Ile Ser Cys Phe Leu Gly Ser Gly Leu Leu Thr Leu Ala 1040 1045 1050 gtg tac ctg tct tgc cag cac tgc cag cgt cag tcc cag gag tcc aca 3514 Val Tyr Leu Ser Cys Gln His Cys Gln Arg Gln Ser Gln Glu Ser Thr 1055 1060 1065 1070 ctg gtc cat cct gcc acc ccc aac cat ttg cac tac aag ggc gga ggc 3562 Leu Val His Pro Ala Thr Pro Asn His Leu His Tyr Lys Gly Gly Gly 1075 1080 1085 acc ccg aag aat gaa aag tac aca ccc atg gaa ttc aag acc ctg aac 3610 Thr Pro Lys Asn Glu Lys Tyr Thr Pro Met Glu Phe Lys Thr Leu Asn 1090 1095 1100 aag aat aac ttg atc cct gat gac aga gcc aac ttc tac cca ttg cag 3658 Lys Asn Asn Leu Ile Pro Asp Asp Arg Ala Asn Phe Tyr Pro Leu Gln 1105 1110 1115 cag acc aat gtg tac acg act act tac tac cca agc ccc ctg aac aaa 3706 Gln Thr Asn Val Tyr Thr Thr Thr Tyr Tyr Pro Ser Pro Leu Asn Lys 1120 1125 1130 cac agc ttc cgg ccc gag gcc tca cct gga caa cgg tgc ttc ccc aac 3754 His Ser Phe Arg Pro Glu Ala Ser Pro Gly Gln Arg Cys Phe Pro Asn 1135 1140 1145 1150 agc tga taccgccgtc ctggggactt gggcttcttg ccttcataag gcacagagca 3810 Ser gatggagatg ggacagtgga gccagtttgg ttttctccct ctgcactagg ccaagaactt 3870 gctgccttgc ctgtgggggg tcccatccgg cttcagagag ctctggctgg cattgaccat 3930 gggggaaagg gctggtttca ggctgacata tggccgcagg tccagttcag cccaggtctc 3990 tcatggttat cttccaaccc actgtcacgc tgacactatg ctgccatgcc tgggctgtgg 4050 acctactggg catttgagga attggagaat ggagatggca agagggcagg cttttaagtt 4110 tgggttggag acaacttcct gtggccccca caagctgagt ctggccttct ccagctggcc 4170 ccaaaaaagg cctttgctac atcctgatta tctctgaaag taatcaatca agtggctcca 4230 gtagctctgg attttctgcc agggctgggc cattgtggtg ctgccccagt atgacatggg 4290 accaaggcca gcgcaggtta tccacctctg cctggaagtc tatactctac ccagggcatc 4350 cctctggtca gaggcagtga gtactgggaa ctggaggctg acctgtgctt agaagtcctt 4410 taatctgggc tggtacaggc ctcagccttg ccctcaatgc acgaaaggtg gcccaggaga 4470 gaggatcaat gccataggag gcagaagtct ggcctctgtg cctctatgga gactatcttc 4530 cagttgctgc tcaacagagt tgttggctga gacctgcttg ggagtctctg ctggcccttc 4590 atctgttcag gaacacacac acacacacac tcacacacgc acacacaatc acaatttgct 4650 acagcaacaa aaaagacatt gggctgtggc attattaatt aaagatgata tccagtcaaa 4710 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 4737 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer sequence <400> 50 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer sequence <400> 51 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer sequence <400> 52 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer sequence <400> 53 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24

Claims (22)

  1. 서열번호 49의 아미노산 서열 또는 이의 면역학적 활성 단편으로 구성되고, HLA 항원에 결합하며 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 유도하는 분리된 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A2인 분리된 펩티드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 5, 7, 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드.
  4. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 분리된 펩티드:
    (a) HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(CTL)를 유도하며, 서열번호 49의 아미노산 서열로 구성된 펩티드의 면역학적 활성 단편을 포함하는 분리된 펩티드,
    (b) 상기 (a)에 있어서, 서열번호 5, 7, 27 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드,
    (c) (i) (a) 또는 (b) 펩티드의 아미노산 서열에서 1, 2, 또는 다수의 아미노산(들)이 치환, 삭제, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하고 (ii) HLA 항원에 결합하며, (iii) 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는, 분리된 펩티드, 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A2인, 분리된 펩티드.
  5. 하기의 특성 중 하나 또는 둘을 가지는, 제 4항의 분리된 펩티드:
    (a) N-말단(N-terminus)에서부터 두 번째 아미노산은 루신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택; 및
    (b) C-말단(C-terminal) 아미노산은 발린(valine) 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 노나펩티드nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인 분리된 펩티드.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 제 7항의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드(들)을 포함하는 CTL 유도용 조성물.
  9. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 활성 성분을 포함하고:
    (a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들);
    (b) 제 7항의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들);
    (c) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 하나 또는 그 이상의 엑소좀(exosome)(들) 또는 APC(들);
    (d) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 세포를 인지하는 하나 또는 그 이상의 CTL(들); 및
    (e) 이의 조합
    하기로 구성된 군으로부터 선택된 목적을 위해 제형화된 약학적 조성물:
    (i) 암의 치료,
    (ii) 암의 예방,
    (iii) 이의 수술 후 재발 방지, 및
    (iv) 이의 조합.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여하기 위해 제형화된 약학적 조성물.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 조성물은 암의 치료를 위해 제형화된 약학적 조성물.
  12. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는, CTL 유도성을 갖는 항원제시세포(Antigen-presenting cell; APC)를 유도하는 방법:
    (a) 시험관내(in vitro), 체외(ex vivo) 및 생체내(in vivo)에서 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드와 APC를 접촉하는 단계, 및
    (b) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 삽입하는 단계.
  13. 하기의 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL을 유도하는 방법:
    (a) CD8 양성 T 세포와, HLA 항원 및 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 APC를 공배양(co-culturing)하는 단계;
    (b) CD8 양성 T 세포와, HLA 항원 및 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 엑소좀을 공배양하는 단계; 및
    (c) 세포 표면에 제시된, HLA 항원 및 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체에 결합할 수 있는, T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 아단위(subunits) 둘을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들을 CD8 양성 T 세포 내로 삽입하는 단계.
  14. HLA 항원 및 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 APC.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 APC는 제 12항의 방법으로 유도된 APC.
  16. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 CTL은 제 13항의 방법으로 유도된 CTL.
  18. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 상기 펩티드 또는 상기 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대한 면역반응이 필요한 개체에서 암에 대한 면역반응을 유도하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드에 대한 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편.
  20. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열을 포함하는 벡터.
  21. 제 20항에 따른 발현 벡터로 형질전환(transformated) 또는 형질감염(transfected)된 숙주 세포.
  22. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 펩티드, 제 7항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 19항의 항체를 포함하는 진단 키트.
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