KR102004900B1

KR102004900B1 - Tomm34 펩티드 및 이를 포함한 백신

Info

Publication number: KR102004900B1
Application number: KR1020137017079A
Authority: KR
Inventors: 유스케 나카무라; 타쿠야 츠노다; 류지 오사와; 사치코 요시무라; 토모히사 와타나베; 가쿠 나카야마
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2011-11-25
Publication date: 2019-07-29
Also published as: UA110119C2; ZA201303886B; US20150374810A1; BR112013013158B1; MY166516A; US20140023671A1; AU2011336019A1; WO2012073459A1; CN103339253B; TW201225973A; CN105111281A; MX2013006014A; CO6862100A2; CN103339253A; NZ611361A; EA201390811A1; JP2016222676A; AU2011336019B2; IL226068B; SG10201509823WA

Abstract

본 발명은 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 유도하는, 서열번호: 42에서 유래한 분리된 펩티드 또는 단편을 제공한다. 펩티드는 하나, 둘, 또는 여러 개의 아미노산 서열이 치환(substitution), 결실(deletion), 또는 첨가(addition)한 상기 언급된 아미노산 서열의 하나를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩티드는 암을 치료하기 위하여 이용될 수 있다.

Description

TOMM34 펩티드 및 이를 포함한 백신{TOMM34 PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME}

본 발명은 생물과학 분야, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 백신으로서 매우 효과적인 신규한 펩티드, 및 종양 치료 및 예방을 위한 약물에 관한 것이다.

우선권

본 출원은 2010년 12월 2일에 출원된 미국 가출원 제 61/419,181호에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 통합된다.

CD8-양성(CD8-positive)CTL은 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 종류 I 분자 위의 종양관련 항원(tumor-associated antigen, TAA)들에서 유래한 에피토프 펩티드(epitope peptide)들을 인지한 다음, 종양 세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. TAA의 첫 번째 예로 흑색종 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리의 발견 이후, 다른 많은 TAA가 주로 면역학적 접근을 통해 발견되었고(비특허문헌 1, 2), 이러한 TAA들 중 일부는 현재 면역치료법의 표적으로서 임상 개발 과정에 있다.

이러한 TAA들의 이용은 치료상으로 유래된 면역 선별(immune selection)의 결과로서, TAA의 결실, 돌연변이, 또는 하향-조절(down-regulation)에 기인한 암 세포의 면역 회피(immune escape)의 잘 알려진 위험을 최소화할 수 있기 때문에, 유망한 TAA는 면역치료를 위한 표적으로서, 암 세포의 증식 및 생존에 필수적이다. 따라서, 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있는 새로운 TAA의 동정(identification)은 더 나은 발전을 보장하고, 따라서 다양한 종류의 암에 대한 펩티드 백신 전략의 임상 적용이 진행되고 있다(비특허문헌 3 내지 10). 지금까지, 이러한 TAA 유래 펩티드들을 이용한 여러 임상 시도가 보고되었다. 불행하게, 현재 다수의 암 백신 시도들은 낮은 목표 회답률(response rate)만을 보였다(비특허문헌 11 내지 13). 따라서, 면역요법의 표적으로 새로운 TAA의 요구가 존재한다.

유전자 TOMM34, translocase of outer mitochondrial membrane 34(유전자 등록번호(GenBank Accession No. NM_006809)는 인간 EST 및 cDNA 데이타베이스로부터 동정(identified)되었고, TPR(degenerated tetratricopeptide repeat) 모티프를 포함하는 단백질을 암호화하도록 예측되었다(비특허문헌 14). 이 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 단백질 전구체의 미토콘드리아로의 유입과 관련되어 있다. 이러한 단백질은 샤페론-유사 활성을 가지고, 폴딩되지 않은 단백질(unfolded protein)들의 성숙한 부분과 결합하며 미토콘드리아로의 이들의 유입을 지원한다(비특허문헌 15).

최근 연구에서, TOMM34는 23040 개의 유전자들로 구성된 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자-발현 프로파일 분석에 의해 결장암에서 빈번하게 상향-조절된다고 나타내고 있다. 더욱이, 결장암 세포주에서 siRNA에 의한 TOMM34 발현억제(knockdown)는 결장암 세포의 성장을 약화시켰다(비특허문헌 16).

PCT/JP2006/314947

Boon T, Int J Cancer 1993, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004, 10(9):909-15 Nuttal SD et al., DNA Cell Biol. 1997 Sep;16(9):1067-74 Mukhopadhyay A et al., Arch Biochem Biophys. 2002 Aprl;400(1):97-104 Shimokawa et al., Int J Oncol. 2006 Aug;29(2):381-6

발명의 요약

본 발명은, 최소 부분으로, 면역치료법의 적합한 표적으로서 역할을 할 수 있는 새로운 펩티드들의 발견을 기반으로 한다. TAA들은 일반적으로 면역계에 의해 "자기(self)"로 인지되고 종종 면역원성(immunogenicity)을 갖지 않기 때문에, 적절한 표적의 발견은 매우 중요하다. 앞서 언급했듯이, TOMM34(예를 들어, 서열 번호: 41 및 42, 또한 유전자 등록번호 NM_006809로 동정)는 급성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia, AML), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 간암(liver cancer), 골육종(osteosarcoma), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal carcinoma), 소세포성 폐암(small cell lung cancer, SCLC), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 및 연부 조직 종양(soft tissue tumor)을 포함하지만, 이에 한정하지 않고, 암에서 상향-조절되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 적절한 암 마커 및 면역치료의 표적에 대한 후보로서 TOMM34에 초점을 맞춘다.

본 발명의 과정에서, TOMM34에 특이적인 CTL들을 도입하는 능력을 가지는 TOMM34 유전자 산물의 특정 에피토프 펩티드들이 동정되었다. 하기에 더욱 자세히 논한 것과 같이, 건강한 공여자(donor)로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포들(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)은 TOMM34로부터 유래된 HLA-A*0201에 결합하는 후보 펩티드들을 사용하여 자극되었다. 그리고나서, 각 후보 펩티드들에 부가(pulsed)하여 HLA-A2 양성 표적 세포에 대하여 특이적 세포독성을 갖는 CTL 세포주가 수립되었다. 이 결과는 본 발명에서 이러한 펩티드들이 TOMM34을 발현하는 세포들에 대하여 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A2에 제한된 에피토프 펩티드들임을 입증한다. 이러한 결과는 더욱이 TOMM34가 강력한 면역성이 있고 이의 에피토프들이 종양 면역치료법에 효과적인 표적임을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 목적은 HLA 항원에 결합하고 TOMM34(서열번호: 42)의 아미노산 서열 또는 이의 면역학적 활성 단편을 포함하는 분리된 펩티드들을 제공하는 것이다. 이러한 펩티드들은 CTL 유도성을 지닐 것으로 예상되고, 따라서 시험관 내(in vitro) 또는 체 외(ex vivo)에서 CTL을 유도하거나, 또는 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개체에 투여되기 위해 사용될 수 있으며, 그 암의 예는 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 바람직한 이러한 펩티드들은 노나펩티드(nonapeptides) 또는 데카펩티드(decapeptides)이고, 보다 바람직하게, 서열번호: 1 내지 20 및 22 내지 40 중으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 노나펩티드 또는 데카펩티드이다. 이들 중에서, 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드들은 특히 강력한 CTL 유도성을 보였고 따라서 특히 바람직하다.

본 발명은 변형된 펩티드가 원래의 변형되지 않은 펩티드의 필수적인 CTL 유도성을 유지하는 한, 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 도입 또는 첨가되는 TOMM34의 면역학적 활성 단편의 아미노산 서열을 가지는 변형된 펩티드들을 또한 고려한다. 이 중, 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 도입 또는 첨가된 서열번호: 1, 5, 31 또는 32의 아미노 서열을 가지는 펩티드가 특히 바람직하다.

본 발명은 본 발명의 어느 펩티드들을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드들을 또한 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드들은 CTL 유도성을 갖는 APCs를 유도 또는 준비하기 위해 사용될 수 있다. 상기-기술된 본 발명의 펩티드들과 같이, 이러한 APCs는 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개체에 투여될 수 있다.

개체로 투여될 때, 본 발명의 펩티드들은 각각의 펩티드들을 표적으로 하는 CTL을 유도하기 위하여 APCs의 표면에 제시된다. 그러므로, 본 발명의 하나의 목적은 CTL을 유도하기 위하여 본 발명에서 제공된 어떤 펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 조성물(composition) 또는 제제(agent)를 제공하는 것이다. 어떤 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 포함하는, 이러한 조성물 또는 제제는 암들의 치료 및/또는 예방 또는 수술 후 암의 재발, 상기 암은 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않으며, 및/또는 이의 수술 후 재발 방지를 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 암, 특히 원발암의 치료 및/또는 예방, 또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위해 제형화된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함 또는 통합하는 약학적 제제 또는 조성물을 고려한다. 본 펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드들을 대신 또는 추가하여, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 활성성분으로서 본 발명의 어떤 펩티드들을 제시하는 APCs 또는 엑소솜을 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드들은 예를 들어, 개체로부터 유래된 APCs가 펩티드와 접촉하거나 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APCs 내로 도입함으로써, 이들의 HLA 항원 및 상기 펩티드의 복합체를 제시하는 APCs를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 APCs는 표적 펩티드들에 대한 높은 CTL 유도성을 지니고 있고 암 면역치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 CTL 유도성을 갖는 APCs 및 이러한 방법으로 얻어진 APCs를 유도하기 위한 방법들을 모두 고려한다.

본 발명의 다른 목적은 CD8-양성 세포를 이의 표면에 본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs 또는 엑소솜과 공-배양하는(co-culturing) 단계 또는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 아단위(subunit) 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들을 도입시키는 단계를 포함하는 이러한 방법들인, CTL 유도를 위한 상기 방법들을 제공하는 것이고, 여기에서 이러한 아단위 폴리펩티드들에 의해 형성된 TCR은 HLA 항원 및 본 펩티드의 복합체를 세포 표면에 결합할 수 있다. 이러한 방법으로 획득된 CTL들은 암의 치료 및 예방에 유용하고, 암의 예로는 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

그러나 본 발명의 또 다른 목적은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 APCs를 제공하는 것이다. 본 발명은 더욱이 본 발명의 펩티드들을 표적으로 하는 분리된 CTL들을 제공한다. 상기 APCs 및 CTL들은 암 면역치료를 위해 사용될 수 있다.

그러나 본 발명의 또 다른 목적은 암에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 개체에 유도하기 위한 방법을 제공하는 것이고, 이러한 방법은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드들, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드들, 또는 본 발명의 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APCs를 포함하는 조성물 또는 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 적용가능성은, 암과 같이, TOMM34의 과발현과 관련 있거나 이로부터 발생하는 수많은 질병 중 어느 것으로도 확대할 수 있고, 암의 예로는 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하나, 이에 한정하지 않는다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 [1] 내지 [20]을 제공한다:

[1]하기 (a) 또는 (b)의 분리된 펩티드:

(a) 서열번호: 1, 5, 31 및 32로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 분리된 펩티드;

(b) HLA 항원에 결합하는 능력 및 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes; CTL) 유도성(inducibility)을 유지하는 변형된 펩티드를 생산하기 위해 서열번호: 1, 5, 31 및 32로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 하나, 둘, 또는 여러 개의 아미노산(들)이 치환, 결실, 도입 또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드;

[2]상기 HLA 항원은 HLA-A2인, [1]의 분리된 펩티드;

[3]상기 펩티드는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인, [1] 또는 [2]의 분리된 펩티드;

[4]하기로 구성된 군으로부터 선택된 최소 하나의 치환을 가지는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드:

(a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산은 루신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산, 또는 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 변형된 것임, 및

(b) C-말단 아미노산은 발린(valine) 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산, 또는 발린 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 변형된 것임;

[5][1] 내지 [4] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화(encoding)하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide);

[6][1] 내지 [4] 중 어느 하나의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 [5]의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 CTL 유도용 조성물;

[7]하기를 포함하는 약학적 조성물:

(a) [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들);

(b) [5]의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드들;

(c) [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면(surface)에 제시하는 하나 또는 그 이상의 APCs 또는 엑소솜(exosomes); 또는

(d) 하기로 구성된 군으로부터 선택된 목적을 위해 제형화되는, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면에 제시하는 세포를 인지하는, 약학적으로 수용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)와 조합된 하나 또는 그 이상의 CTL:

(i) 기존(existing) 암의 치료,

(ii) 암의 예방(prophylaxis),

(iii) 암의 수술 후 재발에 대한 방지(prevention), 및

(vi) 이의 조합;

[8]HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여하기 위하여 제형화된, [7]의 약학적 조성물;

[9]하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하고, CTL 유도성과 함께 항원제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 유도하는 방법:

(a) 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드를 APC에 접촉시키는 단계, 및

(b) [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입시키는 단계.

[10]하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는, CTL을 유도하는 방법:

(a) HLA 항원 및 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC와 CD8-양성 T 세포를 공-배양(co-culture)하는 단계,

(b) HLA 항원 및 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는, 엑소솜(exosome)과 CD8-양성 T 세포를 공-배양하는 단계, 및

(c) T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 아단위(subunit) 폴리펩티드들에 의해 형성된 TCR은 세포 표면의 HLA 항원 및 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체와 결합할 수 있고, 상기 T 세포 수용체(TCR) 아단위 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들을 T 세포에 도입하는 단계;

[11]HLA 항원 및 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 APC;

[12]하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 방법으로, CTL 유도성을 지닌 항원제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 유도하는 방법에 의해 유도되는, [11]의 APC:

(a) 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드와 APC를 접촉하는 단계, 및

(b) [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입하는 단계;

[13][1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL;

[14]하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 방법으로, CTL을 유도하는 방법에 의해 유도되는, [13]의 CTL:

(a) HLA 항원 및 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC와 CD8-양성 T 세포를 공-배양하는 단계,

(b) HLA 항원 및 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜과 CD8-양성 T 세포를 공-배양하는 단계, 및

(c) TCR 아단위 폴리펩티드들에 의해 형성된 TCR은 세포 표면의 HLA 항원 및 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체와 결합할 수 있고, 상기 T 세포 수용체(TCR) 아단위 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들을 T 세포에 도입하는 단계;

[15][1] 내지 [4]의 펩티드, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 상기 펩티드 또는 상기 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법;

[16][1] 내지 [4] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터;

[17][16]의 발현 벡터로 형질전환(transformed) 또는 형질감염된(transfected) 숙주세포(host cell);

[18][1] 내지 [4] 중 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 엑소솜;

[19][1] 내지 [4] 중 어느 하나의 펩티드, 또는 이의 면역학적 활성 단편에 대한 항체(antibody);및

[20][1] 내지 [4] 중 어느 하나의 펩티드, [5]의 폴리뉴클레오티드 또는 [19]의 항체 또는 면역학적 활성 단편을 포함하는 진단 키트(diagnostic kit).

본 발명의 목적 및 특징은 하기 상세한 설명을 동봉된 도면 및 실시예와 연계하여 읽을 때 더욱 완전하게 명백하게 될 것이다. 본 발명의 상기 요약 및 하기의 상세한 설명 둘 다는 본보기가 되는 실시예에 속하고, 본 발명 또는 본 발명의 다른 대안적 실시예를 제한하지 않는다고 이해될 것이다. 특히, 본 발명은 여기에서 많은 구체적인 실시예에 관하여 설명되지만, 그 설명은 본 발명의 예시일뿐이고 본 발명의 제한으로 구성되지 않는다고 평가받을 것이다. 본 발명의 정신(spirit) 및 범위(scope)에서 벗어나지 않는 한, 첨부된 청구항에 의해 기술된 것과 같이, 다양한 변형 및 적용이 당업자에게 일어날 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 다른 목적, 특징, 유용성(benefits) 및 이점(advantages)은 상기 요약 및 하기에 기술된 특정 실시예로부터 명백해질 것이고, 당업자에게도 용이하게 명백하게 될 것이다. 상기 목적, 특징, 유용성 및 이점은 동봉된 실시예, 데이터, 도면 및 그로부터 가져온 모든 타당한 추론과 함께, 단독으로 또는 여기에서 통합된 참조문헌의 고려와 함께 상기로부터 명백하게 될 것이다.

본 발명의 다양한 측면 및 적용은 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 자세한 설명 및 이의 하기 바람직한 실시예를 고려하여 당업자에게 명백하게 될 것이다.
[도 1] 도 1은 TOMM34 유래 펩티드들로 유도된 CTL들의 인터페론(IFN)-감마 효소-연결 이뮤노스팟(ELISPOT) 검사 결과를 나타낸, 일련의 사진, (a)-(e)로 구성되어 있다. 웰(well) 번호 #4 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1)(a)의, #2 TOMM34-A02-9-220(서열번호: 5)(b)의, #4 TOMM34-A02-10-30(서열번호: 31)(c)의 및 #2 TOMM34-A02-10-220(서열번호: 32)(d)의 CTL들은 각각, 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산물을 제시하였다. 이러한 사진의 웰에 있는 사각형은 해당 웰의 세포가 CTL 라인을 수립하기 위해 확장되었음을 나타낸다. 대조적으로, 네거티브 데이터에 대한 일반적인 경우에서처럼, TOMM34-A02-10-143(서열번호: 21)(e)로 자극된 CTL로부터의 특이적인 IFN-감마 생산물은 제시되지 않았다. 도면에서, "+"는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타내고, 및 "-"는 어떤 펩티드로도 부가되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타낸다.
[도 2] 도 2는 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1)로 자극된 CTL 라인의 IFN-감마 생산물을 나타낸 선 그래프이다. CTL이 생산한 IFN-감마의 양은 IFN-감마 효소-연결 이뮤노스팟(ELISPOT) 검사에 의해 측정되었다. 이 결과는 이 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 라인이 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산물을 제시함을 나타낸다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타내고, 및 “-”는 어떠한 펩티드로 부가되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1)로 자극된 CTL 라인으로부터 제한 희석(limiting dilution)하여 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산물을 설명하는 선 그래프이다. 이 결과는 이 펩티드로 자극되어 수립된 CTL 클론들이 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산물을 제시함을 나타낸다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타내고 “-”는 어떠한 펩티드로도 부가되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타낸다.
[도 4] 도 4는 TOMM34 및 HLA-A*0201을 발현하는 표적 세포에 대한 특이적인 CTL 활성을 설명하는 선 그래프이다. HLA-A*0201 또는 전장의 TOMM34 유전자로 형질감염(transfected)된 COS7 세포가 대조군으로 준비되었다. TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1)로 수립된 CTL 라인은 TOMM34 및 HLA-A*0201 둘 다로 형질감염된 COS7 세포(검은 마름모꼴)에 대하여 특이적인 CTL 활성을 제시했다. 한편, HLA-A*0201(삼각형) 또는 TOMM34(원) 중 어느 하나를 발현하는 표적 세포에 대한 어떠한 중요한 특이적인 CTL 활성도 탐지되지 않았다.

비록 여기에서 기술한 것과 유사 또는 동등한 어떤 방법 및 재료가 본 발명의 실시예의 실행 또는 검사에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치, 및 재료는 이제 기술된다. 하지만, 본 재료 및 방법을 기술하기 전에, 이 설명은 단지 설명하기 위한 것일 뿐 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 여기에서 기술된 특정한 크기, 모양, 면적, 재료, 방법론, 프로토콜(protocol) 등으로 제한되지 않고, 이것은 그것들이 통상적인 실험 및 최적화에 따라 다양할 수 있기 때문이라고 또한 이해되어야 한다. 본 기술에서 사용되는 전문용어(terminology)는 오직 특정 버전(version) 또는 실시예를 기술하려는 목적을 위해 존재하고, 오직 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.

본 명세서에서 언급된 모든 공개, 특허 또는 특허 출원은 여기에서 이의 전체가 구체적으로 참조로서 통합된다. 하지만, 본 명세서상의 어떤 것도 이전 발명의 공지에 의해 공개된 바와 같이 선행된 권리로서 인정되지 않는다.

I. 정의

달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 대립이 있는 경우에는, 정의를 포함한, 본 상세한 명세서(specification)가 규제할 것이다. 게다가, 재료, 방법, 및 예시는 단지 설명하는 것일 뿐 제한하려는 의도는 아니다.

여기에서 사용되는 단어 "a", "an", 및 "the"는 달리 분명하게 명시되지 않는 한 "적어도 하나(at least one)"를 의미한다.

물질(예를 들어, 펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 등)과 연관되어 사용되는 용어 "추출(isolated)" 및 "정제(purified)"는 천연 재료에서 그 밖에 포함될 수 있는 적어도 하나의 물질의 상당한 제거를 나타낸다. 따라서, 추출 또는 정제된 펩티드는 펩티드가 유래된 세포 또는 조직 재료로부터의 탄수화물, 지질, 또는 다른 오염발생 단백질과 같은 세포 물질이 상당히 제거되거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구물질 또는 다른 화학물질이 상당히 제거된 펩티드를 지칭한다. 용어 "세포 물질의 상당한 제거(substantially free of cellular material)"는 펩티드 준비를 포함하고 여기에서 이 펩티드는 세포의 세포 구성요소로부터 분리되며 이 세포로부터 추출 또는 재조합하여 생산된다. 따라서, 세포 물질이 상당히 제거된 펩티드는(또한 여기에서 "오염유발 단백질(contaminating protein)"로 지칭되는) 이종(heterologous) 단백질(건조 중량을 기준)의 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%보다 적은 폴리펩티드의 준비를 포함한다. 상기 펩티드가 재조합되어 생산될 때, 이는 또한 바람직하게 배양 배지를 상당히 제거하고, 이는 상기 펩티드 준비 부피의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만의 배양 배지와 펩티드 준비를 포함한다. 상기 펩티드가 화학적 합성에 의해 생산될 때, 이는 바람직하게 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질을 상당히 제거하고, 이는 상기 펩티드 준비 부피의 약 30%, 20%, 10%, 5%(건조 중량을 기준)보다 적게 펩티드 합성과 관련된 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질과 함께 펩티드의 준비를 포함한다. 특정한 펩티드 준비가 추출 또는 정제된 펩티드를 함유하는 것은 예를 들어, 단백질 준비의 소듐 도데실 황산염(sodium dodecyl sulfate, SDS)-폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤 전기영동 및 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)의 하나의 밴드 출현 또는 상기 젤의 유사물에 의해 제시될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드들 또는 폴리펩티드들은 추출 또는 정제된다.

용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 여기에서 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형된 잔기, 또는 자연적으로 발생한 아미노산 중합체들(naturally occurring amino acid polymers)뿐만 아니라, 자연적으로 발생한 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체(artificial chemical mimetic)와 같은, 비자연적으로 발생한 잔기(non-naturally occurring residue)인 아미노산 중합체에 적용된다.

본 명세서에서 종종 사용되는 용어 “올리고펩티드(oligopeptide)”는 길이가 20개 또는 보다 적은 잔기, 전형적으로 15개 또는 보다 적은 잔기인 본 발명의 펩티드를 나타내기 위해 사용되고 전형적으로 약 8개 및 약 11개 잔기, 종종 9개 또는 10개 잔기 사이로 구성된다.

여기에서 사용되는 용어 "아미노산(amino acid)"은 자연적으로 발생한 아미노산과 비슷하게 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체 뿐만 아니라, 자연적으로 발생 및 합성(synthetic)된 아미노산을 나타낸다. 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산 둘 중 어느 하나일 수 있다. 자연적으로 발생한 아미노산은 세포 안에서 번역(tranlation) 후에 변형된 것뿐 아니라, 유전자 코드에 의해 암호화된 것이다(예를 들어, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(gamma-carboxyglutamate), 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)). 상기 구 "아미노산 유사체"는 자연적으로 발생한 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기, 및 R기에 결합하는 알파 탄소)를 가지고 있지만 그러나 변형된 R기 또는 변형된 골격(backbone)(예를 들어, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium))을 가지는 화합물을 나타낸다. 상기 구 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조를 갖지만 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 나타낸다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomeclatere Commission)가 권장하는 일반적으로 알려진 3문자 약어(symbol) 또는 1-문자 약어로 여기에서 지칭될 수 있다.

용어 "유전자(gene)", "폴리뉴클레오티드(polynucleotides)" 및 "핵산(nucleic acids)"은 여기에서 호환하여 사용되고, 달리 명백하게 나타내지 않는 한 일반적으로 인정되는 한-문자 코드로 나타나는 상기 아미노산과 유사하다.

여기에서 사용되는 용어 "조성물(composition)"은 구체적 양의 구체적 성분의 조합으로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 형성되는 어떠한 생산물뿐 아니라, 구체적 양의 구체적 성분을 포함하는 생산물을 포함하려는 의도이다. "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"에 관련된 상기 용어는, 유효 성분(들), 및 담체로 구성된 어떤 비유효(inert) 성분(들)을 포함하는 생산물, 뿐만 아니라 어느 둘 또는 그 이상의 성분의 조합, 복합(complexation) 또는 집적(aggregation)으로부터, 또는 상기 성분의 하나 또는 그 이상의 분리로부터, 또는 상기 성분의 하나 또는 그 이상의 반응 또는 상호결합의 다른 종류로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 형성되는 어떤 생산물을 포함하려는 의도이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 상기 용어 "약학적 조성물"은 본 발명의 화합물 또는 물질 및 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 혼합함으로써 만들어진 어떠한 조성물에 관한 것이다. 여기에서 사용되는, "약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)" 또는 "생리학적으로 허용가능한 담체(physiologically acceptable carrier)"는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 재료, 조성물, 물질, 혼합물 또는 수단(vehicle)을 의미하고, 액체 또는 고체 필러(filler), 희석제, 첨가제(exipient), 용제(solvent) 또는 캡슐화 물질(encapsulating material)을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다.

여기에서 용어 "유효 성분(active ingredient)"은 생물학적 또는 생리학적으로 활성이 있는 조성물의 물질에 관한 것이다. 특히, 약학적 조성물의 맥락에서, 상기 용어 "유효 성분"은 목적성 약학적 효과를 나타내는 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 암의 치료 또는 예방에서 사용을 위한 약학적 조성물의 경우, 조성물의 유효 성분은 암 세포 및/또는 조직에 직접적으로 또는 간접적으로 최소 하나의 생물학적 또는 생리학적 작용(action)을 유도할 수 있다. 바람직하게, 이러한 작용은 암 세포 성장의 감소 또는 저해, 암 세포 및/또는 조직의 손상 또는 살해(killing), 등을 포함할 수 있다. 일반적으로, 유효 성분의 간접적 효과는 암 세포를 인지 또는 살해하는 CTL의 유도이다. 제형화되기 전에, 상기 "유효 성분"은 또한 "대량(bulk)", "약물 물질(drug substance)" 또는 "기술적 생산물(technical product)"로 나타낼 것이다.

달리 정의하지 않는 한, 용어 "암(cancer)"은 TOMM34 유전자를 과발현하는 암을 나타내며, 이의 예는 AML, CML, 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 간암(liver cancer), 골육종(osteosarcoma), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal carcinoma), SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양(soft tissue tumor)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 용어 "세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)", "세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)" 및 "CTL"은 여기에서 호환되어 사용되며 달리 구체적으로 지정되지 않는 한, 비-자기 세포(non-self cell)(예를 들어, 종양 세포, 바이러스-감염된 세포)를 인식 및 이러한 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 림프구의 하위군(sub-group)을 지칭한다.

달리 정의되지 않는 한, 용어 "HLA-A2"는 아류형(subtype)를 포함하는HLA-A2 형태를 지칭하고, 이의 예는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 및 HLA-A*0250을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 용어 "키트(kit)"는, 시약(reagent) 및 다른 물질의 혼합에 관하여 사용된다. 키트는 마이크로어레이(microarray), 칩(chip), 마커(marker), 등을 포함할 수 있다고 여기에서 고려된다. 용어 "키트"는 시약 및/또는 물질의 특정 혼합으로 한정됨을 의도하지 않는다.

여기에서 사용되듯이, 개체 또는 환자의 맥락에서, 구 “개체의(또는 환자의) HLA 항원은 HLA-A2"는 개체 또는 환자가 MHC(major histocompatibility complex) 종류 I 분자로서 HLA-A2 항원 유전자를 동형 또는 이형으로 소유하고, HLA-A2 항원은 HLA 항원으로서 상기 개체 또는 환자의 세포에서 발현되는 것을 지칭한다.

본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "치료(treatment)" 맥락에서 유용성을 갖는 범위에서, TOMM34 유전자의 발현 감소, 또는 개체 내에서 암의 크기, 유병(prevalence), 또는 전이력(metastatic potential)이 감소하는 것과 같은 임상적 이득을 초래한다면 치료는 "효과적(efficacious)"으로 여겨진다. 상기 치료가 예방을 위하여 이용될 때, "효과적"은 그것이 암의 형성을 지연 또는 방지하거나 또는 암의 임상적 증상을 방지 또는 경감시키는 것을 의미한다. 효과성은 특정 종양 종류를 진단 또는 치료하기 위해 어떠한 알려진 방법과 관련하여 결정된다.

본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "방지(prevention)" 및 "예방(prophylaxis)"의 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, 질병으로부터 치사율(mortality) 또는 사망률(morbidity)의 부담(burden)을 감소시키는 어떤 활성을 나타내기 위하여 상기의 용어들은 여기에서 상호교환되어 사용된다. 방지 및 예방은 "1차, 2차 및 3차 예방 수준"에서 일어날 수 있다. 1차 예방 및 방지가 질병의 발달을 회피하는 반면, 2차 및 3차 수준의 방지 및 예방은 질병 진행 및 증상 발현의 방지 및 예방뿐만 아니라 기능을 개선 또는 질병 관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 수립된 질병의 부정적 영향을 감소를 목적으로 한 활성을 포함한다. 그 대신에, 방지 및 예방은 특정 장애(disorder)의 심각성을 완화시키는, 예를 들면 종양의 증식 및 전이를 감소시키는 목적으로 한 넓은 범위의 예방적 치료법을 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 암의 치료 및/또는 예방 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지는 암 세포의 수술적 제거, 암 세포의 성장 억제, 종양의 퇴화(involution) 또는 퇴행(regression), 암 발생의 완화(remission) 및 억제(suppression)의 유도, 종양의 퇴행, 및 전이의 감소 또는 억제와 같은, 상기 단계 중 어느 것을 포함한다. 암의 효과적인 치료 및/또는 예방은 치사율을 감소시키고 암에 걸린 개인의 예후(progrosis)를 개선시키며, 혈액 내 종양 마커의 수준을 감소시키고, 암에 동반하는 탐지가능한 증상을 완화시킨다. 예를 들어, 증상의 감소 또는 개선은 효과적인 치료로 간주 및/또는 상기 예방은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정 병변(stable disease)을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "항체(antibody)"는 지정된 단백질 또는 이의 펩티드에 대해 특이적으로 반응하는 면역글로불린(immunoglobulin) 및 이의 단편을 지칭한다. 항체는 인간 항체(human antibodies), 영장류 항체(primatized antibodies), 키메라 항체(chimeric antibodies), 이중특이적 항체(bispecific antibodies), 인간화된 항체(humanized antibodies), 다른 단백질 또는 방사선 표지와 결합된 항체, 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 더욱이, 여기에서 항체는 가장 넓은 의미로 사용되고 특히 완전한 단일클론 항체(intact monoclonal antibodies), 다클론 항체(polyclonal abtibodies), 최소한 두 개의 완전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(multispecific antibodies)(예를 들어, 이중특이적 항체(bispecific antibodies)), 및 항체 단편을 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 포함된다. "항체"는 모든 클래스(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)를 나타낸다.

달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적인 용어는 본 발명의 당업자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지칭한다.

II . 펩티드

하기 상세히 기술된 본 발명의 펩티드는 TOMM34 펩티드(들)로서 지칭될 수 있다.

TOMM34로부터 유래된 펩티드가 CTL들에 의해 인식되는 항원으로서 기능함을 입증하기 위하여, 흔히 HLA 대립 유전자와 만나는 HLA-A2에 의해 제한된 항원 에피토프인지 여부를 결정하기 위하여 TOMM34(서열 번호: 42)에서 유래된 펩티드를 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). HLA-A2와 결합 친화력(binding affinity)이 있는 정보를 이용하여 TOMM34으로부터 유래된 HLA-A2 결합 펩티드 후보들이 동정되었다. 하기의 후보 펩티드들이 동정되었다;

TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1),

TOMM34-A02-9-77(서열번호: 2),

TOMM34-A02-9-52(서열번호: 3),

TOMM34-A02-9-110(서열번호: 4),

TOMM34-A02-9-220(서열번호: 5),

TOMM34-A02-9-230(서열번호: 6),

TOMM34-A02-9-103(서열번호: 7),

TOMM34-A02-9-80(서열번호: 8),

TOMM34-A02-9-255(서열번호: 9),

TOMM34-A02-9-23(서열번호: 10),

TOMM34-A02-9-195(서열번호: 11),

TOMM34-A02-9-111(서열번호: 12),

TOMM34-A02-9-238(서열번호: 13),

TOMM34-A02-9-1(서열번호: 14),

TOMM34-A02-9-113(서열번호: 15),

TOMM34-A02-9-253(서열번호: 16),

TOMM34-A02-9-239(서열번호: 17),

TOMM34-A02-9-144(서열번호: 18),

TOMM34-A02-9-142(서열번호: 19),

TOMM34-A02-9-279(서열번호: 20),

TOMM34-A02-10-143(서열번호: 21),

TOMM34-A02-10-97(서열번호: 22),

TOMM34-A02-10-79(서열번호: 23),

TOMM34-A02-10-237(서열번호: 24),

TOMM34-A02-10-135(서열번호: 25),

TOMM34-A02-10-219(서열번호: 26),

TOMM34-A02-10-238(서열번호: 27),

TOMM34-A02-10-127(서열번호: 28),

TOMM34-A02-10-113(서열번호: 29),

TOMM34-A02-10-241(서열번호: 30),

TOMM34-A02-10-30(서열번호: 31),

TOMM34-A02-10-220(서열번호: 32),

TOMM34-A02-10-195(서열번호: 33),

TOMM34-A02-10-112(서열번호: 34),

TOMM34-A02-10-194(서열번호: 35),

TOMM34-A02-10-299(서열번호: 36),

TOMM34-A02-10-141(서열번호: 37),

TOMM34-A02-10-160(서열번호: 38),

TOMM34-A02-10-175(서열번호: 39) 및

TOMM34-A02-10-186(서열번호: 40).

또한, 시험관 내(in vitro)에서 상기 펩티드들을 적재한(loaded) 수지상 세포(dendritic cells; DCs)에 의해 T-세포의 자극 이후, CTL들은 하기 펩티드들 각각을 이용하여 성공적으로 수립되었다;

TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1),

TOMM34-A02-9-220(서열번호: 5),

TOMM34-A02-10-30(서열번호: 31) 및

TOMM34-A02-10-220(서열번호: 32).

이러한 수립된 CTL들은 각각의 펩티드들에 의해 부가된 표적 세포에 대한 강력한 특이적 CTL 활성을 보인다. 이 결과는 여기에서 TOMM34이 CTL에 의해 인지되는 항원임을 및 상기 검사되는 펩티드들은 HLA-A2에 의해 제한된 TOMM34의 에피토프 펩티드들임을 입증한다.

상기 TOMM34 유전자가 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 암 세포 및 조직에 과발현되어 있지만 대부분의 정상 기관에서 발현되지 않기 때문에, 이것은 면역치료에 대한 좋은 표적이다. 따라서, 본 발명은 TOMM34 유래 CTL-인식 에피토프의 노나펩티드(nonapeptides, 9 개의 아미노산으로 구성된 펩티드) 및 데카펩티드(decapeptides, 10 개의 아미노산으로 구성된 펩티드)를 제공한다. 그 대신에, 본 발명은 HLA 항원에 결합 및 세포독성 T 세포(CTL)를 유도하는 분리된 펩티드를 제공하고, 상기 펩티드는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 가지거나 또는 이의 면역학적 활성 단편이다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다. 더욱 구체적으로, 어떤 실시예에서, 본 발명은 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 제공한다.

일반적으로, Parker KC et al., J Immunol 1994, 152(1): 163-75에 기재되어 있는 것과 같이, 예를 들어, 인터넷상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램은 컴퓨터 상(in silico)에서 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화성(binding affinity)을 산출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Parker KC et al., J Immunol 1994, 152(1): 163-75; 및 Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV et al., BMC Bioinformatics. 2007; 8: 424, 및 Buus S et al., Tissue Antigens., 62:378-84, 2003에 기재되어 있는 것과 같이, HLA 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성을 결정하는 방법은, 예를 들어, the Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190; 및 Protein Science, 2000, 9: 1838-1846에 기재되어 있다. 따라서, 하나를 HLA 항원에 높은 결합 친화도를 가지는 TOMM34 유래 그것들의 단편을 선별하기 위하여 이러한 소프트웨어 프로그램을 쉽게 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 알려진 프로그램에 의하여 결정된 HLA 항원에 높은 결합 친화성을 가지는 TOMM34 유래 어떤 단편으로 구성된 펩티드를 포함한다. 더욱이, 상기 펩티드는 TOMM34의 전장(full length) 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 서열번호: 42).

본 발명의 펩티드, 특히 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드는 상기 펩티드가 이의 CTL 유도성을 유지하는 한, 부가적 아미노산 잔기를 인접(flank)시킬 수 있다. 상기 특정한 부가적인 아미노산 잔기는 원래 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한 어떤 유형의 아미노산으로도 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 HLA 항원에 결합 친화성을 가진 펩티드를 포함하고, 특히 TOMM34 유래의 펩티드를 포함한다. 상기 펩티드들은, 예를 들어, 약 40개 아미노산 미만, 보통 약 20개 아미노산 미만, 대개 약 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개 아미노산 미만이다.

일반적으로, 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 상기 펩티드의 기능에 영향을 미치지 않고, 또한 어떠한 경우에는 심지어 원래 단백질의 원하는 기능을 증진시킨다고 알려져 있다. 실제로, 변형된 펩티드(즉, 원래의 참조 서열에 대하여 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 도입, 또는 첨가됨으로써 변형된 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)가 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 보유한다는 것이 알려져왔다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 따라서, 본 발명의 한 실시예에 따라서, 본 발명의 CTL 유도성을 가진 펩티드는 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되며, 여기에서 하나, 둘 또는 심지어 그 이상의 아미노산이 첨가, 결실, 도입 및/또는 치환되었다.

당업자는 단일 아미노산 또는 전체 아미노산 서열 중 적은 비율의 아미노산을 변화시키는 아미노산 서열에 대한 개개의 변형(즉, 결실, 도입, 첨가 또는 치환)이 원래 아미노산 측쇄(side-chain) 특성의 보존을 야기시키는 것을 인지할 것이다; 이는 따라서 "보존적 치환(conservative substitution)" 또는 "보존적 변형(conservative modification)"으로서 지칭되며, 여기에서 단백질의 변화는 비슷한 기능을 가지는 단백질을 야기한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에서 잘 알려져 있다. 아미노산 측쇄의 특징의 예는 소수성(hydrophobic) 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성(hydrophillic) 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공통적 특징을 가지는 측쇄이다: 지방족(aliphatic) 측쇄(G, A, V, L, I, P); 수산기(hydroxy group)를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자(sulfur atom)를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산(carboxylic acid) 및 아미드(amide)를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기(base)를 포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족(aromatic)을 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 게다가, 하기 8개 군 각각은 서로에게 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌(Alanine; A), 글리신(Glycine; G);

2) 아스파르트산(Aspartic acid; D), 글루탐산(Glutamic acid; E);

3) 아스파라긴(Asparagine; N), 글루타민(Glutamine; Q);

4) 아르기닌(Arginine; R), 리신(lysine; K);

5) 이소루신(Isoleucine; I), 루신(Leucine; L), 메티오닌(Methionine; M), 발린(Valine; V);

6) 페닐알라닌(Phenylalanine; F), 티로신(Tyrosine; Y), 트립토판(Tryptophan; W);

7) 세린(Serine; S), 트레오닌(Threonine; T); 및

8) 시스테인(Cysteine; C), 메티오닌(Methionine; M)(예를 들어, Creighton, Proteins 1984 참조).

이러한 보존적으로 변형된 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드인 것으로 간주한다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들에 한정되지 않고 그 결과적인 변형된 펩티드가 원래의 변형되지 않은 펩티드의 CTL 유도성을 보유하는 한, 비보존적인 변형도 포함할 것이다. 더욱이, 상기 변형된 펩티드는 다형성 변종(polymorphic variants), 종간 상동체(interspecies homologues), 및 TOMM34 대립 유전자의 CTL 유도 가능한 펩티드를 제외하지 않는다.

아미노산 잔기는 본 발명의 펩티드에 도입, 치환 또는 첨가될 수 있거나, 그 대신에, 아미노산 잔기는 더 높은 결합 친화도를 달성하기 위해 그것으로부터 결실될 수 있다. 필수적인 CTL 유도성을 유지하기 위하여, 소수(예를 들어, 1, 2 또는 여러 개) 또는 아미노산의 적은 비율이 바람직하게 변형된다(즉, 결실, 도입, 첨가 또는 치환). 여기에서, 상기 용어 "여러 개"는 5개 또는 그 이하의 아미노산, 예를 들면 3개 또는 그 이하를 의미한다. 변형되는 아미노산의 비율은 20% 또는 그 이하, 예를 들어, 15% 또는 그 이하, 예를 들어 10% 또는 그 이하, 예를 들어 1 내지 5%일 수 있다.

또한, 펩티드들은 높은 결합 친화성을 획득하기 위해 아미노산 잔기와 같은 것에 의해 치환 또한 첨가될 수 있다. 면역치료법에서 사용되었을 때, 본 발명의 펩티드는 HLA 항원과 복합체로서 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시될 것이다. 자연적으로 나타나는 펩티드뿐만 아니라, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있기 때문에(J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), 상기 규칙성에 근거한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드(immunogenic peptides)에 도입될 수 있다.

예를 들어, 높은 HLA-A2 결합 친화도를 소유하는 펩티드는 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환되는 경향이 있다. 유사하게, C-말단이 발린 또는 루신으로 치환된 펩티드는 또한 호의적으로 사용될 수 있다. 따라서, 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드에서 상기 서열번호의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환, 및/또는 상기 서열번호의 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 발린 또는 루신으로 치환된 펩티드가 본 발명에 포함된다. 치환은 말단 아미노산뿐만 아니라 가능성 있는 펩티드의 T 세포 수용체(TCR) 인지의 부위에 도입될 수 있다. 여러 연구, 예를 들어 CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu_(369-377) 또는 gp100_(209-217)(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol.(2002);168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother.(2003) 52: 199-206 및 S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004) 53, 307-314)는 아미노산 치환을 가지는 펩티드는 원래의 펩티드와 동일하거나 또는 더욱 좋을 수 있다는 것을 나타내었다.

본 발명은 상기 펩티드의 N 및/또는 C-말단의 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산을 도입을 또한 고려한다. 높은 HLA 항원 결합 친화성을 지니고 CTL 유도성을 함유하는 상기 변형된 펩티드 역시 본 발명에 포함된다.

예를 들어, 본 발명은 HLA 항원을 결합하고, CTL 유도성을 가지고, 하기로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는, 14, 13, 12, 11, 또는 10개 미만 길이의 분리된 펩티드를 제공한다:

(i) 아미노산 서열은 서열번호: 1 및 5로부터 선택된다;

(ii) 서열번호: 1 및 5로부터 선택된 상기 아미노산 서열에 1, 2 또는 여러 개의 아미노산이 변형된 아미노산 서열, 및

(iii) (ii)의 아미노산 서열에서, 상기 아미노산 서열은 하기의 특징을 하나 또는 모두 갖는 아미노산 서열:

(a) 상기 서열번호의 N-말단에서부터 두 번째 아미노산이 루신 및 메티오닌 중으로부터 선택된다; 및

(b) 서열번호의 C-말단의 아미노산이 발린 및 루신 중으로부터 선택된다.

또한, 본 발명은 HLA 항원을 결합하고, CTL 유도성을 가지고, 하기로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는, 15, 14, 13, 12, 또는 11개 미만 길이의 분리된 펩티드를 제공한다:

(i') 서열번호: 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열;

(ii') 서열번호: 31 및 32로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 1, 2 또는 여러 개의 아미노산(들)이 변형된 아미노산 서열, 및

(iii') (ii')의 아미노산 서열에서, 상기 아미노산 서열은 하기의 특징을 하나 또는 모두 갖는 아미노산 서열:

이러한 펩티드들이 APCs와 접촉할 때, 상기 펩티드들은 HLA 항원들과 복합체로서 APCs에 제시되기 위해 APCs의 HLA 항원을 APCs에 결합한다. 그 대신에, 상기 펩티드들은 APCs로 도입되고 HLA 항원들을 가진 복합체로서 APCs에 제시되기 위해서 (i) 내지 (iii) 및 (i') 내지 (iii') 중으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 단편들을 처리된다. 결과적으로, 이러한 펩티드들에 특이적인 CTL들이 유도된다.

그러나, 상기 펩티드 서열이 다른 기능을 가지는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 부분과 동일할 때, 특이적 물질에 대한 자가면역질환 또는 특정 물질에 대한 알레르기 증상과 같은 부작용이 유발될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 상황을 피하기 위해서 사용가능한 데이터베이스를 이용하여 상동성 검색을 수행하는 것이 할 수 있는 하나이다. 목표 펩티드(objective peptide)와 하나 또는 두 개의 아미노산 차이가 있는 펩티드도 심지어 존재하지 않는다는 것이 상동성 검색에서 분명해질 때, 이러한 부작용의 어떠한 위험 없이 HLA 항원과 결합 친화성 증가, 및/또는 CTL 유도성을 증가시키기 위해 상기 목표 펩티드는 변형될 수 있다.

상기에 기술된 바와 같이 HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드들은 매우 효과적일 것이라고 기대됨에도 불구하고, 높은 결합 친화성의 존재에 따라 지표로서 선택된, 후보 펩티드들은 CTL 유도성의 존재에 의해 한층 더 검토된다. 여기에서, 상기 구 "CTL 유도성(CTL inducibility)"은 항원-제시 세포(antigen-presenting cells; APCs) 상에 제시될 때 CTL을 유도하는 펩티드의 능력을 나타낸다. 더욱이, "CTL 유도성"은 펩티드의 CTL 활성화, CTL 증식을 유도하고, 표적 세포의 CTL 용해를 촉진하기 위한, 및 CTL IFN-감마(gamma) 생산을 증가하기 위한 펩티드의 능력을 포함한다.

CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원을 보유하는 APCs(예를 들어, B-림프구, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell; DC)), 또는 보다 구체적으로 인간 말초 혈액 단핵 백혈구(human peripheral blood mononuclear leukocytes)에서 유래된 수지상세포를 유도하고, 및 펩티드호 자극시킨 후, CD8 양성 세포와 혼합하고, 그 후에 표적 세포에 대한 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-감마를 측정하여 수행할 수 있다. 반응계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작되어 온 형질전환 동물(예를 들어, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response에 기재된 것)을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포를 ⁵¹Cr 및 이러한 것으로 방사 표지할 수 있고, 상기 표적 세포로부터 방출된 방사능으로부터 세포독성 활성을 산출할 수 있다. 그 대신에, 이는 고정화된 펩티드를 수반한 APCs의 존재 하에 CTL에 의해 생산 및 방출된 IFN-감마(gamma)를 측정함으로써, 및 항-IFN-감마 단일클론 항체를 이용한 배지에서 억제 영역을 가시화함으로써 검사될 수 있다.

상기 기술된 펩티드의 CTL 유도성을 시험함으로써, 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 노나펩티드(nonapeptides) 또는 데카펩티드(decapeptides)는 특히 높은 CTL 유도성 및 HLA 항원에 높은 결합 친화성을 보이는 것이 발견되었다. 따라서, 이러한 펩티드들은 본 발명의 바람직한 실시예로서 예시된다.

더욱이, 상동성 분석들(homology analyses)은 이러한 펩티드들이 어떠한 다른 알려진 인간 유전자 생산물로부터 유래된 펩티드들과 현저한 상동성을 갖지 않음을 보였다. 따라서, 면역치료법에서 사용될 때 발생하는 알려지지 않거나 또는 원하지 않은 면역 반응에 대한 가능성은 낮아질 수 있다. 그러므로, 또한 이러한 측면으로부터, 이러한 펩티드들은 TOMM34에 대한 암 환자의 면역력을 유도하기 위한 용도를 찾아낸다. 따라서, 본 발명의 바람직한 펩티드들은 서열번호: 1, 5, 31 및 32로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 이러한 펩티드들이다.

상기에서 논의된, 본 발명의 변형에 추가하여, 본 발명의 펩티드는 CTL 유도성을 보유하고, 및 더욱 바람직하게 하게 필수적인 HLA 결합을 또한 보유하는 한, 다른 펩티드와 연결될 수 있다. 적합한 "다른" 펩티드의 예는 하기를 포함한다: 본 발명의 펩티드 또는 다른 TAA로부터 유래된, CTL 유도성 펩티드. 상기 펩티드 사이의 링커(linker)는 당업계, 예를 들어, AAY(P.M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000. 165: 7308-7315) 또는 K(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476. K.S. Kawamura et al., J Immunol. 2002. 168: 5709-5715)에 잘 알려져 있다.

예를 들어, 비-TOMM34(non-TOMM34) 종양관련 항원 펩티드는 HLA 종류 I 및/또는 종류 II를 통해서 면역 반응을 향상시키기 위하여 거의 동시에 사용될 수 있다. 암 세포는 하나 이상의 종양관련 유전자를 발현할 수 있는 것은 잘 수립되어있다. 따라서, 특정 개체가 추가적 종양관련 유전자를 발현하는지 결정하고, 그 후 본 발명의 TOMM34 조성물 또는 백신에서 상기 유전자의 발현 생산물로부터 유래된 HLA 종류 I 및/또는 HLA 종류 II 결합 펩티드를 포함하는 것은 당업자에게 일반적인 실험방법 영역 내에 있다.

HLA 종류 I 및 HLA 종류 II 결합 펩티드의 예는 당업자에게 알려져 있고(예를 들어, Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995 참조), 여기에서 공개하는 것과 같은 비슷한 방법으로 본 발명에서 사용될 수 있다. 따라서, 당업자는 분자생물학의 기본 절차를 이용하여, 하나 또는 그 이상의 TOMM34 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 비-TOMM34 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 쉽게 준비할 수 있다.

상기 기술된 펩티드는 여기에서 "폴리톱(polytopes)"이라고 지칭하며, 즉, 다양한 배열(예를 들어, 연결(concatenated), 겹칩(overlapping))에서 함께 연결될 수 있는 펩티드를 자극시키는 둘 또는 그 이상의 잠재적으로 면역형성 또는 면역 반응의 군이다. 면역 반응을 자극, 증진 및/또는 유발시키는 폴리톱의 효과를 검사하기 위해 상기 폴리톱(또는 폴리톱을 암호화하는 핵산)은, 예를 들어 동물에, 표준 면역화 절차에 따라 투여될 수 있다.

펩티드는 폴리톱을 형성하기 위해 직접적으로 또는 인근 서열의 사용을 통해 함께 연결될 수 있고, 백신으로서 폴리톱의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849. 1995; Gilbert et al., Nature Biothechnol. 15(12):1280-1284. 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):882-826. 1996; Tarn et al., J Exp Med. 171(1):299-306. 1990 참조). 에피토프의 다양한 수 및 조합을 포함하는 폴리톱은 CTL에 의한 인지 및 면역 반응을 증가시키는 효과(efficacy)를 위해 제조 및 검사될 수 있다.

본 발명의 상기 펩티드는 그들이 원래 펩티드의 CTL 유도성을 보유하고 있는 한, 다른 물질에 더 결합할 수 있다. 적합한 물질에 대한 예는 하기를 포함한다: 펩티드, 지질, 당 및 당 측쇄, 아세틸기, 천연 및 합성 폴리머 등. 상기 변형이 여기에서 기재된 펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한; 상기 펩티드는 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능(예를 들어, 표적 기능, 및 전달 기능)을 제공하거나 또는 상기 폴리펩티드를 안정시키기 위해 수행될 수 있다.

예를 들어, 폴리펩티드의 생체 내 안정성을 증대시키기 위해, D-아미노산, 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산을 도입하는 것은 당업계에 알려져 있으며; 이 개념은 또한 상기 폴리펩티드에 채택될 것이다. 폴리펩티드의 안정성은 여러 가지 방법으로 검사될 수 있다. 예를 들어, 펩티다제(peptidases) 및 인간 혈장 및 혈청과 같은, 다양한 생물학적 배지는 안정성 시험에 사용될 수 있다(예를 들어, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11:291-302 참조).

또한, 상기에 기술된 것과 같이, 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기에 의해 치환, 결실, 삽입, 또는 첨가되어 변형된 펩티드 중에서, 원래의 펩티드와 비교하여 동일하거나 또는 더 높은 활성을 갖는 것은 스크리닝 되거나 또는 선택될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 원래의 것에 비교하여 동일하거나 더 높은 활성을 갖는 변형된 펩티드를 스크리닝하거나 또는 선택하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a: 본 발명 펩티드의 최소한 하나의 아미노산 잔기가 치환, 삽입, 결실 또는 첨가하는 단계,

b: 상기 펩티드의 활성을 결정하는 단계, 및

c: 원래의 것에 비교하여 동일하거나 또는 더 높은 활성을 갖는 펩티드를 선택하는 단계.

여기에서, 상기 활성은 MHC 결합 활성, APCs 또는 CTL 유도성 및 세포독성 활성을 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드들이 시스테인 잔기를 포함할 때, 상기 펩티드들은 시스테인 잔기들의 SH 그룹들 사이의 이황화 결합을 통해 다이머를 형성하는 경향이 있다. 그러므로, 본 발명의 펩티드의 다이머는 또한 본 발명의 펩티드에 포함된다.

III . TOMM34 펩티드의 준비

본 발명의 펩티드는 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성에 의하여, 합성적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로 또는 두 개 또는 그 이상의 펩티드를 포함한 더 긴 폴리펩티드로 합성될 수 있다. 상기 펩티드는 다른 자연적으로 발생한 숙주 세포 단백질 및 이의 단편, 또는 어떤 다른 화학 물질이 거의 없도록 분리, 즉, 정제되거나 분리될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형들이 원래의 펩티드(original peptide)의 생물학적 활성을 저해하지 않는다면, 상기 변형들을 포함할 수 있다. 다른 예시적 변형들은 예를 들어, 펩티드의 혈청 반감기(serum half life)를 증가시키기 위해, D-아미노산 또는 사용될 수 있는 다른 아미노산 모방체의 통합을 포함한다.

본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열을 기반으로 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 합성을 위해 채택될 수 있는 보편적인 펩티드 합성 방법은 하기를 포함한다:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Preteins, Vol 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals(제 2판)(일본어), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; 및

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

그 대신에, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 알려진 유전자 조작 방법을 채택하여 획득할 것이다(예를 들어, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(Wu et al. 판) 1983, 101:347-62). 예를 들어, 우선, 목표 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 종류(예를 들어, 프로모터 서열에 해당하는 조절 서열의 아래부분(downstream))로 포함하는 적절한 벡터는 제조 및 적절한 숙주 세포에 형질전환된다. 상기 벡터 및 숙주세포는 본 발명에의해 또한 제공된다. 그런 다음에 상기 숙주 세포를 원하는 펩티드를 제작하기 위해 배양한다. 또한 상기 펩티드는 또한 시험관 내(in vitro) 번역 시스템을 채택하여 시험관 내에서 제조될 수 있다.

IV . 폴리뉴클레오티드

본 발명은 본 발명에서 상기 언급된 펩티드들 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들은 자연적으로 존재하는 TOMM34 유전자(예를 들어, 서열 번호: 42(유전자 등록번호 NM_006809)로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 및 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 여기에서, 상기 구 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy) 때문에, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 어떤 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌이 존재하는 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩티드의 변경 없이 기술된 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이(silent variations)"이고, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종(species)이다. 펩티드를 암호화하는 여기에서 묘사된 모든 핵산 서열은 또한 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종도 나타낸다. 당업계에서 보편적인 것 중 하나는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인, AUG, 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인, TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 각각의 펩티드를 암호화하는 핵산의 침묵 변이는 각각의 공개된 펩티드에 내포하여 기술된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 및 이들의 유도체로 구성될 것이다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, DNA 분자는 자연적으로 생성되는 염기인 A, T, C, 및 G와 같은 염기로 구성되고, T는 RNA에서 U로 대체된다. 당업자는 자연적으로 존재하지 않는 염기 또한, 폴리뉴클레오티드에 포함된다는 것을 인지할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 개입(intervening) 유무를 불문하고 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 상기 개입 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들어, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대한 어떠한 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합형 폴리뉴클레오티드일 수 있고 또는 마커 유전자 및 이와 같은 것을 가지는 발현 벡터(플라스미드)일 수 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 중합효소(polymerase) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조할 수 있을 것이다.

재조합 및 화학 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 반응능(competent) 세포에 형질감염될 때 발현하는 적절한 벡터 내에 삽입하여 제조될 수 있다. 그 대신에, PCR 기술 또는 적절한 숙주에서의 발현을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 참고). 그 대신에, Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재되어 있는 것과 같이, 고체상 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

V. 엑소솜( Exosomes )

본 발명은 본 발명의 펩티드와 그 표면의 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 제시하고, 엑소솜이라고 지칭하는, 세포 내 소낭(vehicle)을 더 제공한다. 엑소솜은, 예를 들어, 일본 특허 출원 Kohyo Publications Mos. Hei 제 11-510507호 및 WO99/03499에 설명된 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자에게서 얻어진 APCs를 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 상기 펩티드와 유사하게, 백신으로서 접종될 수 있다.

복합체에 함유된 HLA 항원의 종류는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원의 종류와 반드시 일치해야 한다. 예를 들어, 일본인 집단에서, HLA-A2, 특히 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206은 상당히 보편적이기 때문이고 따라서 일본인 환자의 치료에 적합할 것이다. 일본인과 백인(Caucasian) 집단에서 높게 발현되는 HLA-A2 종류의 사용은 효과적인 결과를 얻기 위해 바람직하고, HLA-A*0201 및 HLA-A*0206과 같은 아류형(subtype)은 이용할 수 있다. 전형적으로, 임상에서, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 종류는 미리 검사되고 있어, 상기 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화성을 갖거나, 또는 항원제시에 의한 세포독성 T 세포(CTL) 유도성을 가지는 펩티드를 적절하게 선택하는 것이 가능하게 된다. 더욱이, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 보이는 펩티드를 얻기 위하여, 1, 2, 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 도입이 자연적으로 발생하는 TOMM34 부분적 펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 수행될 수 있다.

본 발명의 엑소솜이 HLA 항원으로서 HLA-A2 종류를 보유할 때, 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 특정 유용성을 가진다.

VI . 항원-제시 세포( antigen - presenting cells , APCs )

본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 분리된 항원-제시 세포(antigen-presenting cells; APCs)를 또한 제공한다. 상기 APCs는 치료 및/또는 예방의 대상인 환자로부터 유래될 수 있고, 그 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜, 또는 CTL을 포함하는 다른 약물과 조합하여 백신으로 투여될 수 있다.

상기 APCs는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않는다. APCs의 예는 수지상세포(DCs), 랑게르한스(Langerhans) 세포, 마크로파지(macrophage), B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 이들은 림프구에 의해 인식되기 위하여 이의 세포 표면에 단백질성(proteinaceous) 항원을 제시하는 것이 알려져 있다. DCs는 APCs 중 가장 강력한 CTL 유도 활성을 가지는 대표적인 APCs이기 때문에, 수지상세포는 본 발명의 APCs로서 사용한다.

예를 들어, 말초 혈액 단핵구로부터 DC를 유도 및 그 다음 그것들을 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)함으로서 본 발명의 APCs를 수득할 수 있다. 본 발명의 펩티드를 개체에 투여할 때, 본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs가 개체의 체내에서 유도된다. 구 "APCs를 유도"는 본 발명의 펩티드들과 세포의 접촉, 또는 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 세포 표면에 제시하기 위하여 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드들을 세포에 도입을 포함한다. 따라서, 본 발명의 APCs는 본 발명의 펩티드를 개체에 주입한 후 개체에서 APCs를 수집함으로써 획득될 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 상기 APCs는 본 발명의 상기 펩티드를 가진 개체로부터 수득한 APCs와 접촉함으로써 획득될 수 있다.

본 발명의 상기 APCs는 개체 내의 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 이 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜 또는 CTL을 포함하는 다른 약물과 조합하여 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 생체 외 투여는 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 첫 번째 개체로부터 APCs를 수집하는 단계,

b: 단계 a의 APCs와, 펩티드를 접촉하는 단계, 및

c; 단계 b의 APCs를 두 번째 개체에 투여하는 단계.

첫 번째 개체 및 두 번째 개체는 같은 개체일 수 있고, 또는 다른 개체일 수 있다. 단계 b에서 수득된 APCs는 암 치료 및/또는 예방을 위한 백신처럼 사용할 수 있고, 상기 암의 예는 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 맥락에서, 항원-제시 세포를 유도할 수 있는 약학적 조성물 또는 제제의 제조에 본 발명의 펩티드를 이용할 수 있다. 항원-제시 세포를 유도할 수 있는 약학적 조성물 또는 제제의 제조를 위한 방법 또는 과정을 여기에 제시하고, 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)를 혼합 또는 제형화하는 단계를 바람직하게 포함한다.

본 발명은 또한 항원-제시 세포를 유도하기 위해 본 발명의 펩티드의 사용을 제공한다.

본 발명의 측면에 따르면, 본 발명의 APCs는 높은 수준의 CTL 유도성을 가지고 있다. 상기 구 "높은 수준의 CTL 유도성"에 있어서, 상기 높은 수준은 어떤 펩티드와도 접촉되지 않은 APCs에서 탐지된 것의 수준과 비교하여 CTL 유도성이 상대적으로 높은 것을 의미한다. 높은 수준의 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 이러한 APCs는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서 APCs에 전달 단계뿐 아니라 상기 언급된 방법을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 종류일 수 있다. 도입 방법의 예는, 특별한 제한 없이, 예를 들어, 리포펙션(lipofection), 전기천공법(electroporation), 및 인산칼슘법과 같은, 본 기술분야에서 일반적으로 실시되는 다양한 방법을 포함한다. 보다 구체적으로, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication 제 2000-509281호에 기재된 것에 따라 실시될 것이다. 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자를 APCs로 전달함으로써, 상기 유전자는 세포 안에서처럼 전사, 번역을 겪고, 그리고나서 얻어진 단백질은 MHC 종류 I 또는 종류 II에 의해 처리되고, 본 발명의 펩티드를 제시하기 위한 제시 경로를 거쳐 진행된다.

그 대신에, 본 발명의 APCs는 본 발명의 펩티드와 APCs를 접촉하는 단계를 포함하는 방법에 의해 준비될 수 있다.

어떤 실시예에서, 본 발명의 APCs는 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시한다.

VII . 세포독성 T 세포( Cytotoxic T lymphocytes ; CTLs )

본 발명의 임의의 펩티드에 대해 유도된 CTL은 생체 내에서 암 세포를 표적으로 하는 면역 반응을 강화하고 그로 인하여 상기 펩티드 그 자체(per se)와 유사하게 백신으로서 사용될 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 임의의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화된 분리된 CTL을 제공한다.

이러한 CTL들은 (1) 본 발명의 펩티드(들)를 개체에 투여, (2) 개체 유래 APCs, 및 CD8-양성 T 세포, 또는 본 발명의 펩티드(들)와 함께 시험관 내에서 말초 혈액 단핵 림프구 접촉(자극), (3) CD8-양성 T 세포 또는 말초 혈액 단핵 림프구와 시험관 내에서 그것의 표면에 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 APCs 또는 엑소솜을 접촉, 또는 (4) 본 발명의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체(TCR) 서브유닛(subunit)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들을 도입에 의하여 획득될 수 있고, 여기에서 이러한 TCR 서브유닛에 의해 형성된 TCR은 세포 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체에 결합할 수 있다. 방법 (3)을 위한 이러한 APCs 또는 엑소솜은 상기 기재된 방법에 의해 준비될 수 있다. 방법 (4)의 자세한 설명은 하기 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에 기재될 것이다.

본 발명의 CTL들은 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있고, 그 자체 또는 조절 효과의 목적을 위한 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하여 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 상기 얻어진 CTL은 본 발명의 펩티드, 예를 들어, 유도를 위해 사용한 것과 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 암 세포와 같은, TOMM34를 내생적으로 발현하는 세포, 또는 TOMM34 유전자가 형질감염된 세포일 수 있고; 펩티드에 의한 자극때문에 세포 표면에 본 발명의 상기 펩티드를 제시하는 세포도 활성화된 CTL 공격의 표적으로 사용할 수 있다.

어떤 실시예에 따르면, 본 발명의 CTL은 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 세포를 인지하는 CTL이다. CTL의 맥락에서, 구 "세포를 인지함"은 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 TCR을 통해 세포 표면에 결합함 및 상기 세포에 대한 특이적인 세포독성 활성을 제시함을 지칭한다. 여기에서, "특이적인 세포독성 활성"은 다른 세포가 아닌 HLA-A2 항원 및 상기 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 세포에 대한 세포독성 활성 제시함을 지칭한다.

VIII . T 세포 수용체(T cell receptor , TCR )

본 발명은 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)의 서브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들을 함유하는 조성물, 및 이와 동일한 것을 이용한 방법을 또한 제공한다. 상기 TCR 서브유닛은 T 세포에 TOMM34를 발현하는 종양 세포에 대한 특이성을 부여하는 TCR 형성 능력을 가진다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 펩티드로 유도된 CTL의 TCR 서브유닛을 구성하는 알파-(alpha-) 및 베타-(beta-) 사슬(chain) 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들이 동정될 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). 예를 들어, PCR 방법은 TCR을 분석하는데 바람직하다. 분석을 위한 PCR 프라이머는, 예를 들어, 5' 측면(side) 프라이머로서 5'-R 프라이머(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3')(서열 번호: 43) 및 TCR 알파 사슬 C 부위에 특이적인 3-TRa-C 프라이머(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3')(서열 번호: 44), TCR 베타 사슬 C1 부위에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3')(서열 번호: 45) 또는 3' 측면 프라이머로서 TCR 베타 사슬 C2 부위에 특이적인 3-TR 베타-C2 프라이머(5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3')(서열 번호: 46)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 TCR 유도체는 본 발명의 TOMM34 펩티드를 제시하는 표적 세포에 높은 결합력(avidity)으로 결합할 수 있고, 본 발명의 상기 TOMM34 펩티드를 제시하는 표적 세포의 효과적인 사멸을 생체 내 및 시험관 내에서 선택적으로 매개할 수 있다.

상기 TCR 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들(즉, TCR 서브유닛 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 서브유닛 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들)은 적절한 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 핵산 또는 그것을 함유한 벡터는 T 세포(예를 들어, CD8-양성 T 세포), 예를 들어, 환자로부터의 T 세포에 유용하게 전달될 수 있다. 유리하게, 본 발명은 환자 그들의(또는 다른 포유류의 것들) T 세포가 암 세포를 죽일 수 있는 탁월한 특징을 갖는 변형된 T 세포를 빠르고 용이하게 생산하도록 급격한 변화를 허용하는 바로 살 수 있는 조성물(off-the-shelf composition)을 제공한다.

본 발명의 펩티드에 대한 특이적 TCR은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 특이적으로 인지할 수 있는 수용체이고, 이것은 상기 TCR이 상기 T 세포 표면에 제시되어 있을 때, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 제시하는 표적 세포에 대한 T 세포 특이적 활성을 제공한다. 상기 TCR 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)을 도입함으로서 준비된 CTL은 상기 표적 세포로 특이적으로 인지될 수 있는 어떤 알려진 방법에 의해 확인될 수 있다. 상기 방법의 바람직한 예는 예를 들어, HLA 분자 및 본 발명의 펩티드를 이용한 테트라머(tetramer) 분석, 및 ELISPOT 분석을 포함한다. ELISPOT에 의해, 상기 기술된 방법에 의해 준비된 CTL은 표적 세포를 인지하고, 및 상기 인지에 의해 생성된 신호가 세포내부로 이동될 수 있음이 확인될 수 있다. 더욱이, 상기 기술된 방법에 의해 준비된 CTL이 표적 세포에 대한 특정 세포독성 활성을 가지는 알려진 방법에 의해 또한 확인될 수 있다. 이러한 방법의 예는, 예를 들어, HLA-A2 항원 및 TOMM34 둘 다를 발현시키는 세포를 사용한 크롬(chromium) 방출(relaese) 검사를 포함한다.

한 관점에서, 본 발명은 TCR 서브유닛 폴리펩티드들(즉, TCR 서브유닛 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 서브유닛 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들)를 암호화하는 폴리펩티드/폴리펩티드들로 전달함으로서 준비된 CTL을 제공하고, 여기에서 이러한 TCR 서브유닛에 의해 형성된 TCR은 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 TOMM34 펩티드 및 세포 표면의 HLA-A2 항원의 복합체에 결합할 수 있다.

상기 전달된 CTL은 생체 내에서 암 세포로 홈밍(homing)할 수 있으며, 잘 알려진 배양 방법으로 시험관 내에서 증식시킬 수 있다(예를 들어, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)). 본 발명의 상기 CTL은 치료나 보호를 필요로 하는 환자에서 암의 치료 및 예방 중 어느 하나 또는 둘 다에 유용한 면역학적 조성물을 형성하도록 사용될 수 있다(WO2006/031221).

IX . 약학적 제제 또는 조성물

TOMM34 발현은 정상 세포와 비교하여 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 암에서 특이적으로 증가하기 때문에, 본 발명의 펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드들은 암의 치료 및/또는 예방을 위하여, 및/또는 이의 수술 후 재발의 예방을 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효 성분으로서 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드, 또는 유효 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물과 같은, 암의 치료 및/또는 예방을 위한, 및/또는 이의 수술 후 재발의 예방을 위한 제형화된 약학적 제제 또는 조성물을 제공한다. 그 대신에, 본 펩티드는 약학적 제제 또는 조성물로서 사용되는 APCs와 같은, 상기 엑소솜 또는 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 어떤 펩티드를 표적으로 하는 앞서 언급한 CTL은 또한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 유효 성분으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 구 "백신(vaccine)"(또한 “면역원 조성물(immunogenic composition)”로 지칭)은 동물에게 투여되었을 때 항종양 면역을 증진, 향상, 및/또는 유도하는 기능을 가지는 조성물을 지칭한다.

본 발명의 약학적 조성물은 인간 및 어떤 다른 포유류, 예를 들어, 마우스(mouse), 랫(rat), 기니피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 개코원숭이(baboon) 및 침팬지를 포함하지만, 이로 제한되지 않고, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 사육되는 동물을 포함한 개체 또는 환자에게서 암을 치료 및/또는 방지, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하기 위해 사용될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 하기 중에서 선택된 상기 유효 성분으로 암 또는 종양의 치료를 위한 약학적 조성물 또는 제제를 생산함에 있어 유효 성분의 사용을 또한 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현가능한 형태로 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산;

(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

그 대신에, 본 발명은 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방의 용도를 위한 유효 성분을 또한 제공하고, 상기 유효 성분은 하기로부터 선택된다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

그 대신에, 본 발명은 추가적으로 암 또는 종양을 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하며, 여기에서 상기 방법 또는 과정은 하기로부터 선택되는 약학적으로 또는 생리활성적으로 허용가능한 유효 성분이 있는 담체를 제형화하는 단계를 포함한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현가능한 형태로 여기에서 공개된 것처럼 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 암 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 또한 제공하며, 여기에서 상기 방법 또는 과정은 하기로부터 선택되는 유효 성분이 있는, 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 유효 성분과 혼합하는 단계를 포함한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 인간 및 어떤 다른 포유류, 예를 들어, 마우스, 랫, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지를 포함하지만, 이로 제한되지 않고, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 사육되는 동물을 포함한 개체 또는 환자에게서 암을 치료 및/또는 방지, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 서열번호: 1, 5, 31 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A2에 제한된 에피토프 펩티드 또는 후보로 알려져 왔다. 따라서, 서열번호: 1, 5, 31 및 32의 아미노산 서열을 가진 이 펩티드들의 어느 것을 포함하는 본 약학적 제제 또는 조성물은 특히 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여에 특히 적합하다. 동일한 것은 이 펩티드들의 어느 것을 암호화하는 폴리펩티드(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물에 적용된다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물로 치료되는 암은 제한적이지 않고 TOMM34가 관련된(예를 들어, 과다발현된) 어떤 암을 포함하며, 암의 예는 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 상기 언급된 유효 성분뿐만 아니라, 암 세포에 대해 CTL들을 유도하는 능력이 있는 다른 펩티드들, 상기 다른 펩티드들을 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드들, 상기 다른 펩티드들을 제시하는 다른 세포들, 또는 이와 같은 것을 포함할 수 있다. 암 세포에 대해 CTLs을 유도하는 능력을 가지는 이러한 "다른" 펩티드들의 예는 암 특이적 항원(예를 들어, 동정된 TAA들)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

필요하다면, 본 발명의 상기 약학적 물질 또는 조성물은 예를 들어, 본 발명의 펩티드들 중 어떤 것과 같은 상기 유효 성분의 항종양 효과를 물질이 억제하지 않는 한, 다른 치료적 물질을 유효 성분으로서 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제형(formulation)은 항염증적 제제 또는 조성물, 진통제, 화학요법, 및 그와 같은 것을 포함할 수 있다. 그 약제(medicament) 자체 내에 다른 치료적 물질을 포함할 뿐 아니라, 본 발명의 약제는 역시 하나 또는 그 이상의 다른 약학적 조성물과 단계적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 약제 및 약학적 조성물의 양은, 예를 들어, 사용되는 약학적 조성물(들)의 유형, 치료될 질병, 및 투여의 일정 및 루트(route)에 의존한다.

특히 여기에서 언급한 성분뿐만 아니라, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 논의가 되고 있는 제형의 종류(예를 들어, 필러(filler), 결합제(binder), 희석제(diluent), 등)에 관하여 당업계에서 일반적인 다른 물질을 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 본 약학적 제제 또는 조성물은, 예를 들어 암과 같은, 치료될 질병의 병리 조건을 치료하는데 유용한 물질을 포함하는 제조물(article of manufacture), 예를 들어, 키트에 포함될 수 있다. 상기 제조물은 라벨이 있는 상기 약학적 제제 또는 조성물 중 어느 것의 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이알(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은, 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 상기 용기의 라벨은 상기 제제 또는 조성물이 상기 질병의 하나 또는 그 이상의 조건을 치료 또는 예방하기 위하여 사용되는 것을 나타내야 한다. 또한 라벨은 투여에 관한 지시 등을 나타낼 수 있다.

상기 기재한 용기에 추가하여, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 포함한 키트는 선택적으로 약학적으로 허용할 수 있는 희석액을 보관하는 두 번째 용기를 또한 포함할 수 있다. 이것은 또한 상업적 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질, 다른 버퍼, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용설명서를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은, 바람직하다면, 유효 성분이 포함된 하나 또는 그 이상의 단위 투여 형태를 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 존재할 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 블리스터 팩과 같은 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여에 대한 지시에 의해 동반 할 수 있다.

(1) 상기 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 제제 또는 조성물

본 발명의 펩티드들은 약학적 제제 또는 조성물로 직접적으로 투여될 수 있으며, 또는 필요하다면, 종래의 제조 방법에 의해 제형화될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드뿐만 아니라, 담체, 부형제(excipient), 및 약물에서 평이하게 사용되는 것이 특이적 제한 없이 적절한 것으로 포함될 수 있다. 상기 담체들의 예는 멸균된 물, 생리학적 살린(saline), 인산 버퍼(phosphate buffer), 배양 유액 및 이와 같은 것이다. 더욱이, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 필요하다면, 안정제, 현탁액, 보존료, 계면활성제(surfactant) 및 이와 같은 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드들은 생체 내에서 CTL을 유도하기 위해, 둘 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드의 조합으로 준비될 수 있다. 상기 펩티드는 혼합제(cocktail)일 수 있거나 또는 표준 기술을 이용하여 서로 다른 것이 접합 될 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드들은, 링커(예를 들어, Lysine linker: K. S. Kawamura et al., J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715)로 하나 또는 여러 개의 아미노산을 가질 수 있는 단독 융합 폴리펩티드 서열로서 발현되거나 화학적으로 연결될 수 있다. 상기 조합의 펩티드들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 본 발명의 펩티드들을 투여함으로써, 펩티드들은 APCs에 HLA 항원에 의해 높은 밀도로 제시되며, 그 후에 제시된 펩티드 및 HLA 항원 사이에 형성된 복합체에 대해 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 그 대신에, APCs(예를 들어, DC들)는 개체에서 제거되고 그리고나서 본 발명의 어떤 펩티드를 그것의 표면에 제시하고 있는 APCs를 얻기 위해 본 발명의 펩티드로 자극된다. 이 APCs는 개체에서 CTL을 유도하기 위해 개체에 재투여되고, 그 결과로, 종양-결합 내피(tumor-associated endothelium)에 대한 공격성(aggressiveness)이 증가될 수 있다.

본 발명의 어느 펩티드를 유효 성분으로 포함하는, 암의 치료 및/또는 예방에 대한 상기 약학적 제제 또는 조성물은 세포성 면역을 효과적으로 확립한다고 알려진 보강제(adjuvant)를 추가적으로 포함할 수 있거나, 또는 이들은 다른 유효 성분과 함께 투여될 수 있으며, 및 이들은 과립(granule)으로 제형되어 투여될 수 있다. 보강제는 면역학적 활성을 가진 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여될 때, 상기 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키는 어떠한 화합물을 나타낸다. 적용될 수 있는 보강제는 문헌(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89)에 기술되어 있는 것들을 포함한다. 예시적인 보강제는 알루미늄 포스패이트(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록시드(aluminum hydroxide), 알럼(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin), 불완전 프로인트 보강제(Incomplete Freund's adjuvant, IFA), 완전 프로인트 보강제(Complete Freund's adjuvant, CFA), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, O/W 에멀전(O/W emulsion), 및 이와 같은 것을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다.

더욱이, 리포좀 제형, 펩티드가 미세한 마이크로미터 지름의 비드(bead)가 결합된 과립 제형, 및 지질(lipid)이 펩티드와 결합되는 제형이 편리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 펩티드들은 약학적으로 허용가능한 염(salts)의 형태로 또한 투여될 수 있다. 상기 염의 바람직한 예는 알칼리 금속(alkali metal), 금속을 가진 염(salts with a metal), 유기 염기를 가진 염(salts with an organic base), 유기산을 가진 염(salts with an organic acid) 및 무기산을 가진 염(salts with an inorganic acid)을 포함한다. 여기에서 사용되듯이, "약학적으로 허용가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 상기 화합물의 생물학적 효율성 및 특성을 보유 및 염산(hydrochloric acid), 브롬산(hydrobromic acid), 황산, 질산, 인산, 메탄설폰산(methanesulfonic acid), 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 및 이와 같은 것과 같은 무기 산 또는 염기와의 반응에 의하여 획득한 염을 지칭한다.

어떤 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 CTL을 초회감작(prime)하는 구성요소를 또한 포함할 수 있다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체 내에서 CTL을 초회감작시킬 수 있는 물질 또는 조성물로 확인되었다. 예를 들어, 팔미트산 잔기(palmitic acid residues)는 라이신 잔기의 엡실론(epsilon)- 및 알파-아미노(alpha-amino) 그룹에 붙여질 수 있으며 그 후에 본 발명의 펩티드와 연결될 수 있다. 지질화 펩티드들은 그리고나서 마이셀(micelle) 또는 입자(particle) 둘 중 하나 안에 직접적으로 투여되거나, 리포좀(liposome)에 통합되거나, 또는 보강제에 유화시킬 수 있다. CTL 반응을 초회참작시키는 지질의 또 다른 예로서, 적절한 펩티드와 공유적으로 결합될 때, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐-세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine, P3CSS)과 같은, 대장균(E. coli) 지질단백질(lipidprotein)이 CTL을 초회참작시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4 참조).

적절한 투여 방법의 예는 경구, 피내, 피하, 근육 내, 골 내, 복막, 및 정맥내 주사, 또는 이와 같은 것, 및 전신 투여 또는 표적 장소 부근에 국소 투여를 포함하지만, 이에 필수적으로 한정하지 않는다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 및 이와 같은 것에 따라 적당하게 적용될 수 있고, 보통 0.001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들어, 0.01 mg 내지 100 mg, 예를 들어, 0.1 mg 내지 10 mg, 예를 들어, 0.5 mg 내지 5 mg, 및 며칠 내지 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자가 적절하게 알맞은 용량을 선택할 수 있다.

(2) 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 제제 또는 조성물

또한, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 발현할 수 있는 종류로 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산을 또한 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 구 "발현할 수 있는 형태에서(in an expressible form)”는 세포 안으로 상기 폴리뉴클레오티드가 도입되었을 때, 생체 내에서 폴리뉴클레오티드가 항-종양 면역을 유도하는 폴리펩티드로 발현될 것임을 의미한다. 예시된 실시예에서, 관심 있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현에 대해 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드(들)는 표적 세포의 유전체로 안정한 삽입을 향상시키기 위해 준비 될 수 있다(예를 들어, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대한 설명을 위한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; U.S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720을 참조. DNA-기반의 전달 기술의 예는 "네이키트 DNA(naked DNA)", 용이한 전달(부피바카인(bupivacaine), 폴리머, 펩티드-매개), 양이온 지질 복합체, 및 입자-매개("유전자 총(gene gun)") 또는 압력-매개 전달을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제 5,922,687호 참조).

본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 세균 벡터에 의해 또한 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예는 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은, 약화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은 예를 들어, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터로서 백시니아 바이러스의 사용을 포함한다. 숙주에 도입할 때, 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 면역성 펩티드를 발현하고, 그렇게 함으로써 면역 반응을 유도한다. 면역법 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제 4,722,848호에 기재되어 있다. 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재되어 있다. 치료상의 투여 또는 면역법에 대한 유용한 다양한 다른 벡터들, 예를 들어, 아데노 및 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vectors), 레트로바이럴 벡터(retroviral vectors), 살모넬라 타이피 벡터(Salmonella typhi vectors), 독성이 없는 탄저균 독소 벡터(detoxified anthrax toxin vectors), 및 이와 같은 것이 분명할 것이다. 예를 들어, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85을 참조한다.

환자로의 폴리뉴클레오티드 전달은 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 환자가 직접적으로 노출되는 직접적 경우, 또는 세포가 시험관 내에서 상기 관심 있는 폴리뉴클레오티드로 첫 번째 형질 전환되고, 그리고나서 세포가 개체에 이식되는 간접적 경우 중 둘 중 하나가 될 수 있다. 이 두 가지 방법이, 각각, 생체 내 및 생체 외 유전자 치료법으로 알려져 있다.

유전자 치료의 상기 방법의 일반적인 리뷰를 위하여, Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215를 참조한다. 본 발명에 적용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 일반적으로 알려진 방법은 Ausubel et al. in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; 및 Krieger in Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재되어 있다.

펩티드의 투여와 같이, 폴리펩티드의 투여 방법은 경구, 피내, 피하, 골 내, 복막, 및/또는 정맥내 주사, 또는 이와 같은 것을 수행할 수 있고, 예를 들어, 전신 투여 또는 표적 장소 부근에 국소 투여로 사용될 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 적절한 담체 또는 세포의 볼리뉴클레오티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 및 이와 같은 것에 따라 적당하게 적용될 수 있고, 보통 0.001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들어, 0.01 mg 내지 100 mg, 예를 들어, 0.1 mg 내지 10 mg, 예를 들어, 0.5 mg 내지 5 mg, 및 며칠마다 한 번 내지 몇 달마다 한 번 투여될 수 있다. 당업자가 적절하게 알맞은 용량을 선택할 수 있다.

X. 펩티드, 엑소솜 , APCs 및 CTLs 을 이용하는 방법

본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 APCs 및 CTLs을 제조 또는 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 엑소솜 및 APCs는 CTLs을 유도하기 위해 또한 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APCs는 부가적인 화합물이 그들의 CTL 유도성을 저해하지 않는 한 어떠한 다른 화합물의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기에 언급한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물 중 어떤 것은 CTL을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이에 추가하여, 또한 이러한 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것은 하기 기재되듯이 APCs를 유도하기 위해 사용될 수 있다.

(1) 항원-제시 세포(antigen-presenting cells, APCs) 유도 방법

본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 높은 CTL 유도성이 있는 APCs를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드를 APCs와 접촉하는 하기 단계를 포함한다. 예를 들어, 생체 외에서 펩티드와 APCs를 접촉하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;, 및

b: 본 발명의 펩티드와 단계 a의 APCs를 접촉하는 단계.

APCs는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않는다. APCs의 예는 림프구에 의해 인식되기 위해서 단백질성의 항원을 그들의 세포 표면에 발현하는 것으로 알려져 있는 DCs, 랑게르한스 세포, 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 바람직하게, DCs는 APCs 사이에서 가장 강력한 CTL 유도성을 갖기 때문에 사용될 수 있다. 본 발명의 어떠한 펩티드는 그 자체로 또는 본 발명의 다른 펩티드와 함께 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 펩티드가 개체에 투여될 때, 생체 내에서(in vivo) 상기 APCs는 펩티드와 접촉되고, 그 결과, 높은 CTL 유도성이 있는 APCs는 개체의 몸에서 유도된다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드를 개체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 비슷하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현되는 형태로 개체에 투여될 때, 본 발명의 펩티드가 발현되고 생체 내에서 APCs와 접촉하여, 결과적으로, 개체의 몸에서 높은 CTL 유도성이 있는 APCs를 유도한다. 따라서, 상기 언급한 단계 대신, 본 발명의 방법은 개체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. "발현가능한 형태(expressible form)"는 상기 부분 "IX. 약학적 제제 및 조성물, (2) 유효 성분으로 폴리뉴클레오티드를 함유하는 약학적 제제 또는 조성물"에 기재된다.

그 대신에, 본 발명의 방법은 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하기 위해 APC로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;, 및

b: 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계.

단계 b는 상기 "VI. 항원-제시 세포" 부분에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.

그 대신에, 본 발명은 TOMM34에 대한 CTL 활성을 특이적으로 유도하는 항원-제시 세포(APC)를 제조하는 방법을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 하기의 단계의 하나를 포함한다:

(a) 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및

(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 도입시키는 단계.

그 대신에, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 APC를 도입하는 방법을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함한다:

(a) APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계, 및

본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. CTL유도성을 가지는 APCs의 유도를 위해 사용되는 APCs는 바람직하게 HLA-A2 항원을 발현하는 APCs일 수 있다. 이러한 APCs는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 HLA 항원이 HLA-A2인 개체로부터 획득된 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)로부터 준비될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 유도된 APCs는 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원(HLA-A2 항원)의 복합체를 이의 표면에 제시하는 APCs일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 유도된 APCs는 개체에서 암에 대한 면영 반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 때, 상기 개체는 바람직하게 APCs를 유래한 것과 같은 것이다. 하지만, 상기 개체가 APC 기증자(donor)와 같은 HLA 종류를 갖는 한 APC 기증자와 다른 것일 수 있다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL 유도성을 갖는 APC를 포함하는 사용을 위한 제제 또는 조성물을 제공하고, 상기 제제 또는 조성물은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 APCs를 도입하기 위해 제형화된 제제 또는 조성물의 제조 동안 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드의 사용을 제공한다.

그 대신에, 본 발명은 더욱이 본 발명의 펩티드 또는 CTL 유도성을 갖는 APCs를 유도하는 사용을 위해 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드를 또한 제공한다.

(2) CTLs를 유도하는 방법

본 발명은 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 본 발명의 엑소솜 또는 APCs를 사용하여 CTLs를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인지할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)를 형성할 수 있는 폴리펩티드들(즉, TCR 서브유닛)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들을 사용하여 CTLs을 유도하는 방법을 또한 제공한다. 바람직하게, CTLs을 유도하는 방법은 하기 중에서 선택된 최소 하나의 단계를 포함한다:

a) CD8-양성 T 세포를 그 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜과 접촉하는 단계; 및

b) 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인지할 수 있는 TCR을 형성할 수 있는 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들을 CD8-양성 T 세포로 도입하는 단계.

본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APCs, 또는 엑소솜이 개체로 투여될 때, CTL은 개체의 몸에서 유도되고, 암 세포를 표적하는 면역 반응의 강도는 증진된다. 따라서, 상기 언급한 단계 대신, 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APCs 또는 엑소솜을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

그 대신에, CTL은 그들을 생체 외에서 사용함으로써 또한 유도될 수 있고, CTL 유도 후, 활성화된 CTLs은 개체에 되돌려질 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계:,

b: 본 발명의 펩티드와, 단계 a의 APCs를 접촉하는 단계:, 및

c: CD8-양성 T 세포와 단계 b의 APCs를 공-배양(co-culture)하는 단계.

상기 단계 c에서 CD8-양성 T 세포와 공-배양된 APCs는 상기 "VI. 항원-제시 세포" 부분에서 기재한 것과 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 APCs에 전달함으로써 또한 준비될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않고 본 발명의 HLA항원 및 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 현재(present) 효과적으로 제시하는 어떠한 APC든지 포함한다.

상기 언급한 APCs 대신 본 발명의 HLA 항원 및 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 엑소솜을 선택적으로 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 엑소솜을 공-배양하는(co-cultured) 단계를 포함할 수 있다. 이러한 엑소솜은 상기 "V. 엑소솜" 부분에 기술된 방법에 의해 준비될 수 있다.

더욱이, TCR 서브유닛를 암호화하는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드들을 CD8-양성 T 세포에 도입시킴으로써 본 발명의 CTL은 유도될 수 있고, 여기에서 이러한 TCR 서브유닛에 의해 형성된 TCR은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 세포 표면에 결합할 수 있다. 이러한 형질도입은 상기 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.

본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. CTLs의 유도를 위해 사용되는 CD8-양성 T 세포는 개체로부터 수득한 PBMCs로부터 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직한 실시예에서, CD8-양성 T 세포의 공여자(donor)는 HLA 항원이 HLA-A2인 개체일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 도입된 CTLs은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 표면에 제시하는 세포를 인지하는 CTLs일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 도입된 CTLs이 개체의 암에 면역 반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 때, 상기 개체는 바람직하게 CD8-양성 T 세포가 유래된 것으로부터 동일한 것이다. 그러나, 상기 개체가 CD8-양성 T 세포 공여자와 같은 HLA 유형을 가지고 있는 한 개체는 CD8-양성 T 세포 공여자와 다른 것일 수 있다.

추가적으로, 본 발명은 CTLs을 유도하는 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 과 정을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 혼합 또는 제형화하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL을 유도하는 제제 또는 조성물을 제공하고, 여기에서 제제 또는 조성물은 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들), 또는 하나 또는 그 이상의 APCs 또는 본 발명의 엑소솜으로 구성된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL을 유도하기 위하여 제형화된 제제 또는 제제 또는 조성물의 제조 동안 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 APC 또는 엑소솜의 사용을 제공한다.

그 대신에, 본 발명은 CTL을 유도하는 사용을 위해 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 APC 또는 엑소솜을 더 제공한다.

(3) 면역 반응을 유도하는 방법

또한, 본 발명은 TOMM34와 관련된 질병에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 적합한 질병은 암, 예를 들어, AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제제 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 것이다. 그 대신에, 본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APCs를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상세하게는, "IX. 약학적 제제 또는 조성물", 특히 백신으로서 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 사용을 기술하는 부분을 참조. 또한, 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 엑소솜 및 APCs는 "V.엑소솜", "VI. 항원-제시 세포(APCs)", 및 "X. 펩티드, 엑소솜, APCs 및 CTLs을 사용하는 방법"의 (1) 및 (2) 항목에 상세하게 기술되어 있다.

본 발명은 면역 반응을 유도하는 약학적 제제 또는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 또한 제공하고, 여기에서 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 담체와 본 발명의 펩티드를 첨가 또는 제형화하는 단계를 포함한다.

그 대신에, 본 발명의 방법은 하기를 함유하는 본 발명의 백신 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현 가능한 형태로 여기에서 공개된 펩티드와 같은 것을 암호화하는 핵산;

(c) 본 발명의 펩티드를 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 또는

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

본 발명의 맥락에서, TOMM34를 과발현하는 암은 이러한 유효 성분으로 치료될 수 있다. 이러한 암의 예는 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 유효 성분을 포함하는 백신 또는 약학적 조성물의 투여 이전에, 검사될 세포 또는 조직에서 TOMM34의 발현 수준이 동일한 기관의 정상 세포와 비교하여 향상되는가를 확인하는 것은 바람직하다. 따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 TOMM34를 (과)발현하는 암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

i) 치료될 암을 갖는 개체로부터 수득된 암 세포 또는 조직(들)에서 TOMM34의 발현 수준을 결정하는 단계;

ii) TOMM34의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및

iii) 상기 기술된 (a) 내지 (d) 중으로부터 선택된 최소 하나의 구성요소를 정상 대조군과 비교하여 TOMM34을 과발현하는 암을 갖는 개체에게 투여되는 단계.

그 대신에, 본 발명은 TOMM34를 과발현하는 암을 갖는 개체에 투여에서 사용하기 위해, 상기 기술된 (a) 내지 (d) 중으로부터 선택된 최소 하나의 구성요소를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물을 제공한다. 환언하면, 본 발명은 본 발명의 TOMM34 폴리펩티드로 치료되는 개체를 확인하는 방법을 더 제공하고, 이러한 방법은 개체-유래 암 세포 또는 조직(들)에서 TOMM34의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 유전자의 정상 대조군 수준 및 비교한 수준의 증가는 개체가 본 발명의 TOMM34 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암에 걸렸다는 것을 나타낸다. 본 발명의 암을 치료하는 상기 방법은 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있다.

TOMM34의 목표 전사 또는 번역 생산물을 포함하는 한 어떤 개체-유래 세포 또는 조직은 TOMM34 발현의 결정을 위해 사용될 수 있다. 적절한 표본의 예는 신체 조직 및 혈액, 가래 및 요(urine)과 같은, 체액을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 바람직하게, 개체-유래 세포 또는 조직 표본은 상피 세포, 보다 바람직하게는 암 상피 세포 또는 암이 될 것으로 의심되는 조직으로부터 유래한 상피 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 더욱이, 필요하다면, 상기 세포는 수득된 신체의 조직 및 체액으로부터 정제되고, 그 후 개체-유래 표본으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 개체는 바람직하게 포유류이다. 모범적인 포유류는 인간, 비-인간 영장류(non-human primate), 마우스, 랫, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에 따르면, 개체로부터 수득된 세포 또는 조직에서 TOMM34의 발현 수준이 결정된다. 상기 발현 수준은 당업계에 알려진 방법을 이용하여, 전사(핵산) 생산물 수준에서 결정될 수 있다. 예를 들어, TOMM34의 mRNA는 혼성화(hybridization) 방법에 의해 탐침(probe)을 이용하여 정량될 수 있다(예를 들어, 노던(Northern) 혼성화). 탐지는 칩 또는 어레이(array)로 수행될 수 있다. 어레이의 사용은 TOMM34의 발현 수준을 탐지하는데 바람직할 수 있다. 당업자들은 TOMM34의 서열 정보를 이용하여 이러한 탐침을 준비할 수 있다. 예를 들어, TOMM34의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광 물질 및 동위원소와 같은, 적절한 표지로 표지 될 수 있으며, 유전자의 발현 수준은 혼성화된 표지의 강도로 탐지될 수 있다.

더욱이, TOMM34의 전사 생산물은 증폭-기반 탐지 방법에 의해 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다(예를 들어, RT-PCR). 상기 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 기반으로 제조될 수 있다.

구체적으로, 상기 제시된 방법에 대해 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한, 적절하게 엄격한 또는 낮게 엄격한 조건 하에서 TOMM34의 mRNA와 혼성화된다. 여기에서 사용되듯이, 구 "엄격한(혼성화) 조건(stringent(hybridization) conditions)"은 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화하는 조건을 나타내지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 다른 환경 하에서 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적 혼성화는 짧은 서열에 비해 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열융해점(Thermal melting point, Tm)보다 약 섭씨 5 도만큼 낮게 선택된다. 상기 Tm은(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하) 표적 서열에 상보적인 상기 탐침의 50%가 표적 서열에 평형상태로 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열이 일반적으로 과다하게 존재하므로, Tm에서, 상기 탐침의 50%는 평형상태로 점유된다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0 M 소듐 이온 미만일 것이며, 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M 소듐 이온(또는 다른 염들) 및 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 약 섭씨 30 도이고(예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오티드) 긴 탐침 또는 프라이머에 대해서는 적어도 약 섭씨 60도이다. 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은, 불안정화 물질의 첨가로 또한 수득할 수 있다.

본 발명의 탐침 또는 프라이머는 전형적으로 상당히 정제된 올리고뉴클레오티드이다. 상기 올리고 뉴클레오티드는 엄격한 조건에서 최소 약 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 또는 25로 혼성화되는 뉴클레오티드 서열, TOMM34서열을 포함하는 핵산의 연이은(consecutive) 정방향 사슬(sense strand) 뉴클레오티드 서열, 또는 TOMM34서열을 포함하는 핵산의 역방향 사슬(anti-sense strand) 뉴클레오티드 서열의, 또는 상기 서열에서 자연적으로 발생한 돌연변이의 부분을 포함한다. 특히, 예를 들어, 바람직한 실시예에서, 길이로 5 - 50개를 가지는 올리고뉴클레오티드는 탐지를 위해, 상기 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, TOMM34 유전자의 mRNA 또는 cDNA는 특정한 크기, 일반적으로 15 - 30b 길이인 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머로 검출될 수 있다. 그 크기는 최소 10 뉴클레오티드, 최소 12 뉴클레오티드, 최소 15 뉴클레오티드, 최소 20 뉴클레오티드, 최소 25 뉴클레오티드, 최소 30 뉴클레오티드인 범위일 수 있고 탐침 및 프라이머는 크기에 있어서 5 - 10 뉴클레오티드, 10 - 15 뉴클레오티드, 15 - 20 뉴클레오티드, 20 - 25 뉴클레오티드 및 25 - 30 뉴클레오티드인 범위일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머의 길이는 15 - 25개로부터 선택될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머를 이용한 유전자 검출을 위한 분석 절차, 기계, 또는 시약은 잘 알려져 있다(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 또는 PCR). 이러한 분석법에서, 탐침 또는 프라이머는 태그(tag) 또는 링커 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 탐침 또는 프라이머는 검출가능한 표지 또는 포착되기 위한 친화성 리간드(affinity ligand)로 변형될 수 있다. 그 대신에, 검출 절차에 기초한 혼성화에서, 몇 백(예를 들어, 약 100-200)의 염기 내지 몇 킬로(예를 들어, 1000-2000)의 염기를 가진 폴리뉴클레오티드도 또한 탐침으로 사용될 수 있다(예를 들어, 노던 블럿팅 분석 또는 cDNA 마이크로어레이 분석).

그 대신에, 번역 생산물은 본 발명의 진단을 위해 탐지될 수 있다. 예를 들어, TOMM34 단백질(서열 번호: 42) 또는 이의 면역학적 단편의 양은 결정될 수 있다. 번역 생산물로서 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 사용하는 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 단일클론(monoclonal) 또는 다중클론(polyclonal)일 수 있다. 더욱이, 단편 또는 변형된 항체가 TOMM34 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')₂, Fv, 등)은 탐지를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 이의 단편에 대한 이러한 항체는 본 발명에 의해 또한 제공된다. 단백질의 탐지를 위해 상기 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 이러한 항체 및 이의 등가물을 준비하기 위해 본 발명에 적용될 수 있다.

TOMM34 유전자 발현 수준을 탐지하기 위해 이의 번역 생산물에 기초한 또 다른 방법으로서, 염색의 강도는 TOMM34 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직학적 분석을 통해 측정될 수 있다. 즉, 상기 측정에서, 강력한 염색은 단백질의 증가한 존재/수준과, 동시에, TOMM34 유전자의 높은 발현수준을 나타낸다.

만약 그 수준이, 예를 들어, 표적 유전자의 대조군 수준의 10%, 25%, 또는 50%까지 증가하거나; 또는 1.1 배 이상, 1.5 배 이상, 2.0 배 이상, 5.0 배 이상, 10.0 배 이상, 또는 그 이상으로 증가하면, 암 세포에서 표적 유전자, 예를 들어, TOMM34 유전자의 발현 수준은 증가할 것으로 결정될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 비-암성(non-cancerous)인 것으로 알려진 생물학적 표본으로부터 결정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준(normal control level)"으로 지칭된다. 한편, 만약 대조군 수준이 암성인 생물학적 표본으로부터 결정된다면, 이것은 "암성 대조군 수준(cancerous control level)"으로 지칭된다. 표본 발현 수준 및 대조군 발현 사이의 차이는 대조군 핵산, 예를 들어, 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 발현 수준으로 정규화될 수 있고, 이 발현 수준은 세포의 암성 또는 비-암성 상태에 의존하여 다르게 하지 않는다고 알려져 있다. 예시적인 대조군 유전자는 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드 3 인산 탈수소효소(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜 단백질 P1(ribosomal protein P1)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

질환 상태(들)(암성 또는 비-암성)라고 알려진 개체/개체들로부터 이전에 수거 및 저장된 표본(들)을 사용하여 암 세포와 동일한 시간에 대조군 수준이 결정될 수 있다. 또한, 치료될 암을 갖는 기관의 비-암성 부위로부터 수득된 정상 세포는 정상 대조군으로서 사용될 수 있다. 그 대신에, 상기 대조군 수준은 이전에 질환 상태에 있다고 알려진 개체로부터 알려진 표본에서 확인된 TOMM34 유전자의 발현 수준(들)을 분석함으로써 얻어진 상기 결과를 기반으로 하는 통계학적인 방법으로 결정될 수 있다. 또한, 이전에 시험된 세포의 발현 패턴 데이터베이스로부터 대조군 수준은 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 측면에 따르면, 생물학적 표본 내의 TOMM34 유전자의 발현 수준은 다수의 대조군 수준과 비교 및 다수의 참조 표본으로부터 결정될 수 있다. 개체 유래 생물학적 표본과 유사한 조직 종류로부터 유래된 참조 표본으로부터 대조군 수준을 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태로 알려져 있는 군의 TOMM34 유전자의 발현 수준의 기준 값을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 기준 값은 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D.의 범위가 기준 값으로 사용될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 비-암성인 것으로 알려진 생물학적 표본으로부터 결정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준"으로 지칭된다. 한편, 만약 대조군 수준이 암성인 생물학적 표본으로부터 결정된다면, 이것은 "암성 대조군 수준"으로 지칭된다.

TOMM34 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 증가하였을 때, 또는 암 대조군 수준과 유사/동등할 때, 개체는 치료될 암을 갖는 것으로 진단될 수 있다.

본 발명은 (i) 개체가 치료될 암을 가지고 있는지에 대한 여부 진단, 및/또는 (ii) 암 치료를 위한 개체를 선택하는 방법을 또한 제공하고, 그 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 세포 또는 조직(들)에서 TOMM34의 발현 수준을 결정하는 단계;

b) TOMM34의 발현 수준을 정상 대조군 수준과 비교하는 단계;

c) 만약 TOMM34의 발현 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 증가하였다면, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단하는 단계; 및

d) 단계 c)에서, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단되었다면, 암 치료를 위한 개체를 선택하는 단계.

그 대신에, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 것이다:

b) TOMM34의 발현 수준을 암성 대조군 수준과 비교하는 단계;

c) 만약 TOMM34의 발현 수준이 암성 대조군 수준과 비교하여 유사하거나 동등하다면, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단하는 단계; 및

본 발명은 본 발명의 TOMM34 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암으로 고통을 받거나 받을 것으로 의심되는 개체를 진단 또는 결정하기 위한 진단 키트(kit)를 또한 제공하고, 이는 암의 예후을 평가하거나 및/또는 암 치료법, 특히 암 면역치료법의 효율성 또는 적용가능성을 모니터링하는 데 또한 유용할 수 있다. 적합한 암의 실례가 되는 예는 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 키트는 바람직하게 개체-유래 세포에서 TOMM34 유전자의 발현을 탐지하기 위한 최소 하나의 시약을 포함하고, 상기 시약은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(a) TOMM34 유전자의 mRNA를 탐지하기 위한 시약;

(b) TOMM34 단백질 또는 이의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 시약; 및

(c) TOMM34 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 시약.

TOMM34 유전자의 mRNA를 탐지하기 위해 적합한 시약의 예는 TOMM34 mRNA에 특이적으로 결합 또는 이를 확인하는, TOMM34 mRNA의 부분에 대한 상보적 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은, 핵산을 포함한다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 TOMM34 mRNA에 특이적인 프라이머 및 탐침에 의해 증폭될 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 준비될 수 있다. 만약 필요하다면, TOMM34 mRNA를 탐지하기 위한 시약은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 또한, TOMM34 mRNA를 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트에 포함될 수 있다.

한편, TOMM34 단백질 또는 이의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 TOMM34 단백질 또는 이의 면역학적 단편에 대한 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 단일클론 또는 다중클론일 수 있다. 더욱이, 단편 또는 변형된 항체가 TOMM34 단백질 또는 이의 면역학적 단편에 결합하는 능력을 유지하는 한, 상기 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv 등)은 시약으로 사용될 수 있다. 단백질 탐지를 위한 이러한 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 항체 및 그것의 등가물을 준비하기 위해 어떤 방법이든 본 발명에서 적용될 수 있다. 더욱이, 항체는 직접적인 연결 또는 간접적인 표지 기술을 통해 신호 발생 분자로 표지될 수 있다. 항체 표지 및 그들의 표적에 항체의 결합을 탐지하는 표지 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 표지 및 방법은 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, TOMM34 단백질을 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트 안에 포함될 수 있다.

키트는 상기 언급한 시약을 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 매트릭스 및 TOMM34 유전자에 대한 탐침 또는 TOMM34 펩티드에 대한 항체에 결합하는 고형 매트릭스 및 시약, 세포를 배양하는 배지 및 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 TOMM34 펩티드에 대한 항체를 탐지하기 위한 2차 항체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 암이 없거나 또는 암을 겪고 있는 개체로부터 얻어진 조직 표본은 유용한 대조 시약으로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 바람직하게 상업적 및 사용자의 관점으로부터, 버퍼, 희석액, 필터, 바늘, 주사기 및 사용설명용 패키지 삽입물(예를 들어, 문서, 테이프, CD-ROM, 등)을 포함하는 다른 물질을 더 포함할 수 있다. 적절한 용기는 병, 바이알(vials), 및 테스트 튜브(test tube)를 포함한다. 이 시약 및 이러한 것은 라벨과 함께 용기에 함유될 수 있다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은, 다양한 물질로 형성될 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 시약이 TOMM34 mRNA에 대한 탐침일 때, 상기 시약은 적어도 하나의 탐지 부위를 형성하기 위하여, 다공성 스트립(strip)과 같은, 고체 메트릭스에 고정화될 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 탐지 지역은 각각 핵산(탐침)을 포함하는, 많은 수의 부분을 포함할 수 있다. 시험(test) 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 그 대신에, 대조군 부위는 시험 스트립으로부터 분리된 스트립에 위치할 수 있다. 선택적으로, 다른 탐지 부위는 고정화된 핵산의 다른 양, 즉, 첫 번째 탐지 부위의 더 많은 양 및 다음 부위 안의 적은 양을 포함할 수 있다. 시험 표본의 첨가에 따라, 탐지가능한 신호를 제시하는 부위의 수는 표본 안에 존재하는 TOMM34 mRNA의 양의 정량적 지표를 제공한다. 상기 탐지 부위는 어떠한 적절하게 탐지가능한 모양으로 설정될 수 있으며 전형적으로 바 또는 도트 스패닝(dot spanning)의 모양 시험 스트립의 너비이다.

본 발명의 키트는 양성 대조군 표본 또는 TOMM34 기준 표본을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 양성 대조군 표본은 TOMM34 양성 표본을 수집하고 그들의 TOMM34 수준을 검사함으로써 준비될 수 있다. 그 대신에, 양성 표본 또는 TOMM34 기준 표본을 형성하기 위해 정제된 TOMM34 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 TOMM34를 발현하지 않는 세포에 첨가될 수 있다. 본 발명에서, 정제된 TOMM34는 재조합 단백질일 수 있다. 양성 대조군 표본의 TOMM34 수준은, 예를 들어, 판정 컷오프(cut-off) 값 이상이다.

한 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 단편에 의해 특이적으로 인지되는 단백질 또는 이의 부분 단백질을 포함하는, 진단용 키트를 추가적으로 제공한다.

본 발명의 단백질의 부분 펩티드(partial peptide)의 예는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열에서 최소 8개, 바람직하게 15개, 그리고 보다 바람직하게 20개의 연속적인 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 암은 본 발명의 단백질 또는 펩티드(폴리펩티드)를 사용하는 표본(예를 들어, 혈액, 조직)에서 항체를 탐지함으로써 진단될 수 있다. 본 발명의 단백질 및 펩티드를 제조하는 방법은 상기에 기술된 바와 같다.

본 발명은 암을 진단하기 위한 방법을 제공하고, 이는 항-TOMM34 항체의 양 및 상기 기술된 것과 상응하는 대조군 표본에서의 양 사이의 차이를 결정함으로써 수행될 수 있다. 만약 개체의 세포 또는 조직이 유전자의 발현 생산물(TOMM34)에 대한 항체를 포함하고, 항-TOMM34 항체의 양이 정상 대조군에서의 것과 비교하여 판정 컷오프 이상으로 결정되면, 그 개체는 암을 앓고 있는 것으로 추정된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 진단용 키트는 본 발명의 펩티드 및 이에 결합하는 HLA 분자를 포함할 수 있다. 항원성 펩티드 및 HLA 분자를 사용하여 항원 특이적 CTLs을 탐지하는 방법은 이미 확립되었다(예를 들어, Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6). 따라서, 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체는 종양 항원 특이적 CTLs을 탐지하기 위한 탐지 방법에 적용될 수 있고, 이에 의해 암의 조기 탐지(earlier detection), 재발 및/또는 전이가 가능하다. 더욱이, 이것은 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 약학물(pharmaceuticals)과 함께 적용할 수 있는 개체의 선택, 또는 약학물의 치료 효과의 평가에 적용될 수 있다.

특히, 알려진 방법에 따르면(예를 들어, Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6 참조), 방사선 표지된 HLA 분자 및 본 발명의 펩티드의, 테트라머와 같은, 올리고머 복합체가 준비될 수 있다. 복합체를 사용하여, 예를 들어, 암으로 고통받는 것으로 의심되는 개체 유래 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes)에서 항원-펩티드 특이적 CTLs을 정량함으로써 상기 진단이 수행될 수 있다.

본 발명은 여기에서 기술된 펩티드 에피토프를 이용함으로써 개체의 면역 반응을 평가하기 위한 방법 또는 진단용 제제를 더 제공한다. 본 발명의 한 실시예에서, 여기에서 기술된 HLA A-2 제한된 펩티드는 개체의 면역 반응을 평가하거나 또는 예측하기 위한 시약으로서 사용된다. 평가되는 면역 반응은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역원(immunogen)을 면역능력이 있는 세포(immunocompetent cell)와 접촉시킴으로써 유도된다. 바람직한 실시예에서, 면역 반응을 측정하기 위한 면역기능이 있는 세포는 말초 혈액(peripheral blood), 말초 혈액 단핵구(peripheral blood lymphocyte, PBL), 및 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 중에서 선택될 수 있다. 상기 면역기능이 있는 세포를 수집 또는 분리를 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 어떤 실시예에서, 펩티드 에피토프(들)와 결합하고 그것을 인지하는 항원 특이적 CTLs의 생성을 야기할 수 있는 어떤 제제는 시약(reagent)로 적용될 수 있다. 펩티드 시약은 면역원으로서 사용될 필요가 없다. 상기 분석을 위해 사용되는 검사 시스템은 테트라머(tetramer), 세포 내 림포카인(lynphokine) 및 인터페론(interferon) 분비 검사법을 위한 염색, 또는 ELISPOT 분석과 같은, 상대적으로 최근의 기술 발달을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 펩티드 시약과 접촉될 면역기능이 있는 세포는 수지상 세포를 포함하는 항원 제시 세포일 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 펩티드는 종양 세포 항원 또는 면역원에 대한 노출 이후 항원-특이적 CTLs의 존재를 위해 말초 혈액 단핵구 세포를 평가하기 위한 테트라머 염색 검사법에서 사용될 수 있다. HLA 테트라머 복합체는 말초 혈액 단핵구세포의 표본에서 직접적으로 항원 특이적 CTL을 가시화 하고(예를 들어, Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; 및 Altman et al., Science 174: 94-96. 1996 참조) 및 항원-특이적 CTL 집단의 빈도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 사용한 테트라머 시약은 하기와 같이 생산될 수 있다:

HLA 분자에 결합하는 펩티드는 상응하는 HLA 중쇄(heavy chain) 및 베타 2-마이크로글로불린의 존재하에 3분자 복합체를 생산하기 위하여 다시 접힌다(refolded). 상기 복합체에서, 중쇄의 카복실 말단은 이전에 단백질로 조작되었던 부위에서 바이오틴화된다. 그 후, 상기 3분자 복합체 및 스트렙토아비딘(streptoavidin)으로 구성된 테트라머를 형성하기 위하여 스트렙토아비딘은 복합체로 첨가된다. 형광으로 표지된 스트렙토아비딘의 수단에 의하여, 상기 테트라머는 항원-특이적 세포를 염색시키기 위해 사용될 수 있다. 그리고나서 상기 세포는, 예를 들어, 유동 분석(flow cytometry)에 의해서 동정될 수 있다. 이렇게 분석은 진단 또는 예후의 목적을 위해 사용될 수 있다. 절차에 의해 동정된 세포는 또한 치료 목적을 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 면역 회상 반응(immune recall response)을 평가하기 위해 본 발명의 펩티드를 포함하는 시약을 또한 제공한다(예를 들어, Bertoni etaL, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997 및 Penna et al., J. Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991 참조). 예를 들어, 치료될 암을 앓고 있는 개인으로부터의 환자 PBMC 표본은 특이적 펩티드를 사용하여 항원-특이적 CTLs의 존재를 위해 분석된다. 단핵 세포를 포함하는 혈액 표본은 PBMC를 배양하고 상기 세포를 본 발명의 펩티드로 자극시킴으로써 검사될 수 있다. 적절한 배양 기간 후, 증식된 세포 집단은, 예를 들어, CTL 활성에 대하여 분석될 수 있다.

상기 펩티드는 백신의 효험(efficacy)를 평가하기 위해 시약으로서 또한 사용될 수 있다. 면역원으로 예방접종된 환자로부터 수득한 PBMCs는, 예를 들어 상기 기재된 방법들 중 어느 하나를 사용하여 분석될 수 있다. 환자는 분석을 위해 선택되었다는 점에서 환자는 HLA 종류가 있고, 대립 유전자-특이적 분자를 인지하는 펩티드 에피토프 시약이 있다. 백신의 면역원성은 PBMC 표본에서 에피토프-특이적 CTLs의 존재에 의해 나타날 수 있다.

본 발명의 펩티드는 당업계에서 잘 알려진 기술을 사용함으로써, 항체를 만드는데 또한 사용될 수 있고(예를 들어, CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY ; 및 Antibodies a Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 참조), 이는 암을 진단하고 모니터하기 위한 시약으로서 유용할 수 있다. 이러한 항체는 HLA 분자의 맥락에서, 펩티드를 인지하는 것, 즉, 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드 및 조성물은 많은 첨가적 용도를 갖고, 그 일부는 여기에서 기술된다. 예를 들어, 본 발명은 TOMM34 면역원성 폴리펩티드의 발현에 의해 특징화되는 질환을 진단 또는 탐지하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 생물학적 표본에서 본 발명의 펩티드, 또는 TOMM34 HLA 결합 펩티드 및 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 펩티드 또는 펩티드 및 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현은 상기 펩티드 또는 복합체의 결합 파트너로 검사함으로써 결정 또는 탐지될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 펩티드 또는 복합체를 위한 결합 파트너는 펩티드를 인지하고 특이적으로 결합하는 항체이다. 종양 조직검사(biopsy)와 같은, 생물학적 표본에서 TOMM34의 발현은 TOMM34 프라이머를 사용한 표준적인 PCR 증폭 프로토콜에 의하여 또한 검사될 수 있다. 종양 발현의 예는 여기에서 나타나고 나아가 TOMM34 증폭에 대한 예시적인 조건 및 프라이머의 공개는 WO2003/27322에서 발견될 수 있다.

바람직하게, 진단 방법은 생물학적 표본에서 본 발명의 펩티드의 존재를 탐지하기 위하여 본 발명의 펩티드를 위한 특이적 제제와 함께 개체로부터 분리된 생물학적 표본을 접촉시키는 단계를 포함한다. 여기에서 사용되듯이, "접촉(contacting)"은 생물학적 표본에 존재하는 본 발명의 제제 및 펩티드 사이의 특이적 상호결합을 허용하기 위해서, 제제와 충분히 근접한 곳 및 적절한 조건, 예를 들어, 농도, 온도, 시간, 이온화 강도 하에 생물학적 표본을 놓아두는 것을 의미한다. 일반적으로, 생물학적 표본에 있는 분자 및 이의 인지체(cognate)(예를 들어, 단백질 및 이의 수용체, 항체 및 이의 단백질 항원, 핵산 및 이의 상보적 스트랜드(strand)) 사이의 특이적 상호결합을 촉진하기 위해 제제를 생물학적 표본과 접촉시키기 위한 조건은 당업자에게 자명하다. 분자 및 이의 인지체 사이의 특이적 상호결합을 촉진시키기 위한 최적의 조건은 본 명세서의 선행기술문헌인 Low et al.에 의해 발행된 미국 특허 제 5,108,921호에 기술되어 있다.

본 발명의 진단 방법은 생체 내 및 시험관 내 중 어느 하나 또는 그 모두에서 수행될 수 있다. 따라서, 생물학적 표본은 본 발명에서 생체 내 또는 시험관 내에 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 표본은 생체 내 조직일 수 있고, TOMM34 면역원성 폴리펩티드에 특이적인 제제는 그 조직에서 이러한 분자의 존재를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 그 대신에, 상기 생물학적 표본은 시험관 내에서 수집 또는 분리될 수 있다(예를 들어, 혈액 표본, 종양 조직검사 표본, 조직 추출물). 특별히 바람직한 실시예에서, 상기 생물학적 표본은 세포를 포함하는 표본일 수 있고, 보다 바람직하게 진단 또는 치료될 개체로부터 수집된 종양 세포를 포함하는 표본일 수 있다.

그 대신에, 상기 진단은 형광-표지된 HLA 다중결합 복합체들을 사용한 염색에 의해 항원-특이적 T 세포의 직접적인 정량을 허용하는 방법에 의해, 수행될 수 있다(예를 들어, Altman. J. D. et al., 1996, Science 274 : 94; Altman. J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330 ;). 세포 내 림포카인 염색, 및 인터페론-감마(interferon-gamma) 분비 검사 또는 ELISPOT 분석이 또한 제공되었다. 테트라머 염색, 세포 내 림포카인 염색 및 ELISPOT 분석 모두는 더욱 보편적인 검사에 비해 최소 10-배 이상 더욱 민감할 것으로 보인다(Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186 : 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8 : 413;). 펜타머(pentamer)(예를 들어, 미국 2004-209295A), 덱스트라머(dextramer)(예를 들어, WO 02/072631), 및 스트렙타머(streptamer)(예를 들어, Nature Medicine 6. 631-637 (2002)) 또한 사용될 수 있다.

예를 들어, 어떤 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 TOMM34 펩티드 중 최소 하나가 투여된 개체의 면역학적 반응을 진단 또는 평가하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 면역원에 대해 특이적인 CTL 유도에 적합한 조건 하에서 면역능력이 있는 세포와 면역원을 접촉하는 단계;

(b) 단계(a)에서 유도된 CTL 유도 수준을 탐지 또는 결정하는 단계; 및

(c) CTL 유도 수준이 있는 개체의 면역 반응을 상호연관시키는(correlating) 단계.

본 발명에서, 상기 면역원은 바람직하게 (a) 본 발명의 TOMM34 펩티드(들), 예를 들어, 서열번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드들, 및 이의 변형된 펩티드들(이러한 아미노산 서열을 가지는 펩티드들, 및 이러한 아미노산 서열이 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산 치환(들)된 것을 가지는 펩티드들) 중 최소 하나를 포함한다. 그동안, 면역원 특이적 CTL의 유도에 적합한 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 면역능력이 있는 세포는 면역원 특이적 CTL을 유도하기 위해 면역원(들)의 존재 하에 시험관 내에서 배양될 수 있다. 면역원 특이적 CTLs을 유도하기 위해, 어떤 자극 인자(stimulating factors)든지 세포 배양에 첨가될 수 있다. 예를 들어, IL-2가 CTL 유도를 위한 바람직한 자극 인자이다. 어떤 실시예에서, 펩티드 암 치료법으로 치료될 개체의 면역학적 반응을 모니터링 또는 평가하는 단계는 치료 전, 중 및/또는 후에 시행될 수 있다. 일반적으로, 암 치료의 절차 동안, 면역성 펩티드는 치료될 개체에 반복적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역성 펩티드는 3-10 주 동안 매주 투여될 수 있다. 따라서, 개체의 면역학적 반응은 암 치료 절차 동안 평가 또는 모니터될 수 있다. 그 대신에, 암치료에 대한 면역학적 반응의 평가 또는 모니터링 단계는 치료 과정의 완성단계일 수 있다. 본 발명에 따르면, 대조군과 비교하여 면역원 특이적 CTL의 향상된 유도는 평가 또는 진단될 개체가 투여되어 온/되었던 면역원(들)에 대해 면역학적으로 반응했음을 나타낸다. 면역학적 반응을 평가하기 위해 적합한 대조군은, 예를 들어, 면역능력이 있는 세포가 펩티드 없이, 또는 어떤 TOMM34 펩티드(예를 들어, 임의의 아미노산 서열) 외의 아미노산 서열을 가지는 대조군 펩티드(들)와 접촉될 때 CTL 유도 수준을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 개체에 투여된 각 면역원 사이의 면역 반응과의 비교를 통해, 상기 개체의 면역학적 반응은 서열 특이적 방법으로 평가된다. 특히, 어떤 유형의 TOMM34 펩티드의 혼합물이 개체에 투여될 때라도, 면역학적 반응은 상기 펩티드에 따라 다를 수 있다. 그러한 경우에, 각 펩티드 사이의 면역학적 반응의 비교에 의해, 더 높은 반응을 보이는 개체에 대한 펩티드가 동정 될 수 있다.

XI . 항체

본 발명은 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 특이적으로 본 발명의 펩티드와 결합하고 본 발명의 펩티드가 없는 것에 결합하지 않을 것이다(또는 약하게 결합할 것이다). 그 대신에, 항체는 본 발명의 펩티드뿐만 아니라 그것의 상동체(homologs)와 결합한다.

본 발명의 펩티드에 대한 항체는 암 진단 및 예후 검사, 및 이미지화 방법론(imaging methodology)에서의 사용을 발견할 수 있다. 유사하게, 이러한 항체는 또한 TOMM34이 암 환자에서 발현되거나 또는 과발현되는 정도로, 다른 암의 치료, 진단 및/또는 예후에서의 사용을 발견할 수 있다. 더욱이, 세포 내에서 발현된 항체(예를 들어, 단일 사슬 항체)는 TOMM34의 발현이 관련된 암, 예를 들면 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 암을 치료하기 위해 치료법적으로 사용된다.

본 발명은 또한 TOMM34 단백질(서열 번호: 42) 또는 본 발명의 펩티드들을 포함하는 그것의 단편들을 탐지 및/또는 정량하기 위한 다양한 면역학적 검사법을 또한 제공한다. 이러한 검사법은 TOMM34 단백질 또는 이의 단편을 인지 및 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항-TOMM34 항체를, 적절하게, 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, TOMM34 폴리펩티드와 결합하는 항-TOMM34 항체는 바람직하게 본 발명의 펩티드를 인지한다. 항체의 결합 특이성은 억제 검사(inhibition test)로 확인될 수 있다. 즉, 본 발명의 펩티드의 존재 하에서 분석될 항체 및 전장의 TOMM34 폴리펩티드 사이의 결합이 억제될 때, 이 항체는 단편에 특이적으로 결합하는 것을 제시한다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 면역학적 검사법은 당업계에 잘 알려진 다양한 면역학적 검사법 종류(format) 내에서 수행되고, 방사선면역검사법(radioimmunoassay), 면역-크로마토그래프 기술(immuno-chromatograph technique), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), ELIFA(enzyme-linked immunofluorescent assay), 및 이와 같은 것의 다양한 유형을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명과 관련된 면역학적이지만 비항체 검사법들은 T 세포 면역원성 검사법(억제성 또는 자극성)뿐만 아니라 MHC(major histocompatibility complex) 결합 검사법으로 또한 구성된다. 구체적으로, TOMM34를 발현하는 암을 탐지할 수 있는 면역학적 이미지화 방법은 본 발명에 의해 또한 제공되고, 본 발명의 표지된 항체를 사용한 방사선 동위 원소 이미지화 방법(radioscintigraphic imaging method)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 검사법은 TOMM34를 발현하는 암, 예를 들면 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 간암, 골육종, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 암을 탐지, 모니터링, 및 예후에 임상적으로 유용하다.

본 발명은 본 발명의 펩티드와 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체와 같은, 어떠한 형태로도 사용될 수 있고, 그리고 본 발명의 펩티드로 토끼와 같은 동물을 면역화함으로서 수득된 항혈청(antiserum)을 포함하고, 모든 종류의 다중클론 및 단일클론 항체, 인간 항체 및 유전적 재조합에 의해 제조된 인간화된 항체를 포함한다.

항체를 수득하기 위해 항원으로서 사용된 본 발명의 펩티드는 어떠한 동물의 종으로부터든지 유래될 수 있으나, 바람직하게는 인간, 마우스(mouse), 또는 랫(rat)과 같은 포유류로부터, 보다 바람직하게는 인간으로부터 유래될 수 있다. 인간-유래 펩티드는 여기에서 공개된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 수득될 수 있다.

본 발명에 따르면, 면역원성 항원으로서 사용되는 펩티드는 완전한 단백질 또는 단백질의 부분적 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 부분적 펩티드는 본 발명 펩티드의 아미노(N)-말단의 또는 카복시(C)-말단의 단편으로 구성될 수 있다.

여기에서, 본 발명의 항체는 TOMM34 펩티드의 전장 또는 단편 중 어느 하나와 반응하는 단백질로 정의된다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 1, 5, 31 및 32 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 TOMM34의 단편 펩티드를 인지한다. 올리고펩티드를 합성하기위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 합성 후에, 펩티드는 면역원으로서 사용되기 전에 선택적으로 정제될 수 있다. 본 발명에서, 올리고펩티드(예를 들면, 9 또는 10 머(mer))는 면역원성을 향상시키기 위해 담체와 결합되거나 연결될 수 있다. KLH(Keyhole-limpet hemocyanin)은 담체로서 잘 알려져 있다. KLH 및 펩티드를 결합시키기 위한 방법도 또한 당업계에 잘 알려져 있다.

그 대신에, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자 또는 이의 단편은 알려진 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 이는 그 후 여기에서 기술되는 것과 같이 숙주 세포에 형질도입시키기 위해 사용된다. 바람직한 펩티드 또는 이의 단편은 어떤 표준 방법에 의해 숙주 세포의 밖 또는 안으로부터 회복될 수 있고, 그 후에 항원으로서 사용될 수 있다. 그 대신에, 펩티드를 발현하는 전체 세포 또는 이 용해물(lysate) 또는 화학적으로 합성된 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있다.

어떤 포유류 동물은 항원으로 면역화될 수 있지만, 바람직하게 세포 융합에 사용된 모 세포(parental cell)와의 양립성(compatibility)이 고려된다. 일반적으로, 설치류(Rodentia), 토끼류(Lagomorpha) 또는 영장류(Primates)의 동물이 사용된다. 설치류의 동물은 예를 들어, 마우스, 랫 및 햄스터(hamster)를 포함한다. 토끼류의 동물은 예를 들어, 토끼(rabbit)를 포함한다. 영장류의 동물은 예를 들어, 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 망토개코 원숭이(sacred baboon) 및 침팬지와 같은 토끼목(Catarrhini(늙은 세계 원숭이, old world monkey))의 원숭이를 포함한다.

항원으로 동물을 면역화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원의 복강내(intraperitoneal) 주입 또는 피하(subcutaneous) 주입이 포유류의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로, 항원은 PBS(phosphate buffered saline), 생리적 살린(physiological saline), 등의 적절한 양에서 희석되거나 현탁될 수 있다. 바람직하다면, 항원 현탁은 프로인트 완전 보강제(Freund's complete adjuvant)와 같은, 표준 보강제와 적절한 양으로 혼합되어, 유화액으로 만들어진 다음 포유류 동물에게 투여될 수 있다. 바람직하게, 그런 다음 매 4 내지 21일 마다 적절한 양의 프로인트 완전 보강제와 함께 혼합된 항체를 여러 번 투여한다. 적절한 담체(carrier)도 또한 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역화 이후, 혈청은 바람직한 항체의 양을 증가하기 위해 표준 방법으로 조사한다.

본 발명의 펩티드에 대한 다중 클론 항체는 혈청에서 원하는 항체의 증가를 위해 시험되는 면역화된 포유류의 혈액을 수집함으로써, 및 어떠한 관습적인 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리시킴으로써 준비될 수 있다. 다중클론 항체는 다중클론 항체를 함유하는 혈청을 포함할 뿐만 아니라, 다중클론 항체를 포함하는 분획물을 혈청으로부터 분리할 수 있다. 면역글로불린(immunoglobulin) G 또는 M은 오직 본 발명의 펩티드를 인지하는 분획물로부터, 예를 들면 본 발명의 펩티드와 연결된 친화성 컬럼을 사용하여, 그리고 더 나아가 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 사용하여 그 분획물을 정제하여 준비될 수 있다.

단일클론 항체를 준비하기 위하여, 면역세포는 항원으로 면역화된 포유류로부터 수집되고 상기 기술된 것과 같이 혈청에서 원하는 항체의 증가된 수준이 검사되고, 세포 융합을 수행한다. 세포 융합을 위해 사용되는 면역 세포는 바람직하게 비장(spleen)으로부터 수득된다. 상기 면역세포와 융합되는 다른 바람직한 모 세포는 예를 들어, 포유류의 골수 세포(myeloma cell), 및 보다 바람직하게 약물에 의해 융합된 세포의 선발을 위해 획득된 특성을 갖는 골수 세포를 포함한다.

상기 면역 세포 및 골수 세포는 알려진 방법, 예를 들면 Milstein et al.(Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46(1981))의 방법을 따라 융합될 수 있다.

세포 융합에 의해 수득된 결과인 하이브리도마(hybridoma)는 HAT 배지(히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지)와 같은, 표준 선발용 배지에 그것들을 배양함으로써 선발될 수 있다. 상기 세포 배양은 전형적으로 HAT 배지에서 수일 내지 여러 주 동안 지속되는데, 이는 원하는 하이브리도마를 제외하고, 다른 모든 세포(결합되지 않은 세포(non-fused cell))를 사멸시키도록 허용되기에 충분한 시간이다. 그런 다음, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 스크리닝하고 복제(clone)하기 위해 표준 제한 희석(standard limiting dilution)을 수행한다.

하이브리도마를 제조하기 위해 비인간 동물을 항원으로 면역화시킨, 상기 방법 뿐만 아니라, EB 바이러스에 의해 감염된 것과 같은 인간 림프구는 펩티드, 펩티드를 발현하는 세포 또는 그들의 용해물로 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 그런 다음, 상기 펩티드에 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위해, 면역화된 림프구를, U266과 같은, 무한으로 분열할 수 있는 인간-유래 골수 세포와 융합한다(Unexamined Published Japanese Patent Application No. (JP-A) Sho 63-17688).

수득된 하이브리도마를 그 이후 마우스의 복강(abdominal cavity)으로 이식하고 복수를 추출한다. 상기 수득한 단일클론 항체는, 예를 들어, 암모늄 황산 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 펩티드가 연결된 친화성 컬럼에 의해 정제될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드의 정제 및 탐지에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드의 작용제(agonist) 및 길항제(antagonist)에 대한 후보로서 사용될 수도 있다.

그 대신에, 항체를 생산하는, 면역화된 림프구와 같은, 면역 세포는 종양유전자(oncogene)에 의해 무한증식(immortalization)될 수 있고 단일클론 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

이렇게 수득된 단일클론 항체는 또한 유전자 조작 기술을 사용하여 재조합하여 준비될 수 있다(예를 들어, MacMillan Publishers LTD의해 영국에서 출간된, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies (1990) 참조). 예를 들어, 항체를 암호화하는 DNA는 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은, 면역 세포로부터 복제될 수 있고, 적절한 벡터로 삽입될 수 있으며, 재조합 항체를 준비하기 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같이 준비된 재조합 항체를 제공한다.

더욱이, 본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 본 발명 펩티드와 결합하는 한, 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fc(scFv)일 수 있고, 여기에서 H 및 L 사슬로부터의 Fv 단편은 적절한 링커(linker)에 의해 연결된다(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). 보다 구체적으로, 항체 단편은 파페인(papain) 또는 펩신(pepsin)과 같은, 효소와 함께 항체를 처리함으로써 생성될 수 있다. 그 대신에, 항체 단편을 암호화하는 유전자가 제조될 수 있고, 발현 벡터로 삽입될 수 있으며 적절한 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다(예를 들어, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991) 참조).

항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG)과 같은, 다양한 분자와 결합함으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 이러한 변형된 항체를 제공한다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형함으로서 수득할 수 있다. 이 변형 방법은 당업계에서 보편적이다.

그 대신에, 본 발명의 항체는 비인간 항체로부터 유래된 가변 부위(variable region) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 부위(constant region) 사이의, 키메라 항체로서, 또는 비인간 항체로부터 유래된 CDR(complementarity determining region), FR(framework region) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 부위를 포함하는, 인간화된 항체로서 수득될 수 있다. 상기 항체는 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 인간 항체에 상응하는 서열에 대한 설치류 CDR 또는 CDRs 서열을 치환함으로써 인간화(humanization)가 수행될 수 있다(예를 들어, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) 참조). 따라서, 이러한 인간화된 항체는 키메라 항체이고, 여기에서 상당히 적은 온전한 인간 가변 도메인은 비-인간 종으로부터 그에 상응하는 서열에 의해 치환되었다.

인간 프레임워크 및 불변 부위뿐만 아니라 인간 가변 부위로 구성된 인간 항체 전체가 또한 사용될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들면 시험관 내(in vitro) 방법은 박테리오파지에 제시된 인간 항체 단편의 재조합 라이브러리의 사용과 관련이 있다(예를 들어, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)), 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 위치(loci)를 형질전환된 동물, 예를 들어, 내재성 면역 글로불린 유전자(endogenous immunoglobulin gene)가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스로 도입시킴으로써 만들어질 수 있다. 이 접근은 예를 들어, 미국 특허 제 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016호에 기술되어 있다.

상기와 같이 수득된 항체는 동종성(homogeneity)으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에서 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피의 적절하게 선택되고 결합된 사용, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 여과, 울트라여과, 염-외(salting-out), 희석(dialysis), SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 등점적 전기영동(isoelectric focusing)에 의해 항체는 분리(sepseration) 및 추출(isolation)될 수 있으나(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이에 한정되지 않는다. 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로서 사용될 수 있다. 사용되는 예시적인 단백질 A 컬럼은, 예를 들어, Hyper D, POROS 및 Sepharose F.F.(Pharmacia)를 포함한다.

친화성을 제외한, 적합한 크로마토그래피의 예는, 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 젤 여과(gel filtration), 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 및 유사한 것(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))을 포함한다. 크로마토그래피 절차는 HPLC 및 FPLC와 같은, 액체상 크로마토그래피(liquid-phase chromatography)에 의해 수행될 수 있다.

예를 들어, 흡수도의 측정, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), EIA(enzyme immunoassay), RIA(radioimmunoassay) 및/또는 면역형광이 본 발명 항체의 항원 결합 활성(antigen binding activity)을 측정하기 위해 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체를 플레이트에 고정시키고, 본 발명의 펩티드를 플레이트에 적용하고, 그런 다음 항체를 생산하는 세포의 배양 상층액 또는 정제된 항체와 같은, 원하는 항체를 포함하는 표본에, 적용한다. 그런 다음, 1차 항체를 인지하고 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은, 효소로 표지된 2차 항체를 적용하고, 플레이트를 배양한다. 그 다음, 세척 후, p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 같은, 효소 기질을 플레이트에 첨가시키고, 상기 표본의 항원 결합 활성을 평가하기 위하여 흡수도를 측정한다. C-말단 또는 N-말단 단편과 같은, 펩티드의 단편은 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 항원으로서 사용될 수 있다. BIAcore(Pharmacia)는 본 발명에 따라 항체의 활성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.

상기 방법은 본 발명의 항체를 본 발명의 펩티드를 포함한다고 가정되는 표본에 노출시킴으로써, 그리고 항체 및 펩티드에 의해 형성된 면역 복합체를 탐지 또는 측정함으로써, 본 발명의 펩티드를 탐지 또는 측정하게 해준다.

본 발명에 따라 펩티드를 탐지 또는 측정하는 방법은 특이적으로 펩티드를 탐지 또는 측정할 수 있기 때문에, 이 방법은 펩티드를 사용하는 다양한 실험에서 유용할 것이다.

XII . 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 도입시키는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터는 뉴클레오티드, 특히 숙주 세포에 있는 본 발명의 DNA를 보유하기에, 본 발명의 펩티드를 발현시키기에, 또는 유전자 치료를 위해 본 발명의 뉴클레오티드를 투여하기에 유용하다.

대장균이 숙주 세포이고 벡터가 대장균 내에서(예를 들어, JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1Blue) 대량으로 증폭 및 생산될 때, 상기 벡터는 대장균 내에서 증폭되기 위한 "ori" 및 형질전환된 대장균을 선발하기 위한 유전자 마커(예를 들어, 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 유사한 것과 같은 약물에 의해 선발되는 약물-내성 유전자)를 가져야 한다. 예를 들어, M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script, 등이 사용될 수 있다. 게다가, pGEM-T, pDIRECT 및 pT7는 또한 상기 기술된 벡터뿐만 아니라 cDNA를 서브클로닝 및 추출하기 위해 사용될 수 있다. 벡터가 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 사용될 때, 발현 벡터는 특히 유용하다. 예를 들어, 대장균에서 발현되는 발현 벡터는 대장균 내에서 증폭되기 위하여 상기 특징을 가져야 한다. JM109, DH5 알파(alpha), HB101 또는 XL1 Blue와 같은, 대장균을 숙주 세포로서 사용할 때, 벡터는 대장균 내에서 원하는 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는, 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward et al., Nature 341: 544-6(1989); FASEB J 6: 2422-7(1992)), araB 프로모터(Better et al., Science 240: 1041-3(1988)), T7 프로모터 또는 유사한 것을 가져야 한다. 이러한 관점에서, 예를 들어, pGEX-5X-1(Pharmacia), "QIAexpress system"(Qiagen), pEGFP 및 pET(이 경우에, 숙주는 T7 RNA 중합효소를 발현하는 BL21이 바람직하다)가 상기 벡터들을 대신하여 사용될 수 있다. 게다가, 상기 벡터는 펩티드 분비를 위한 신호 서열(signal sequence)을 또한 포함할 수 있다. 대장균의 주변 세포질(periplasm)로 분비되도록 펩티드를 지시하는 예시적인 신호 서열은 pelB 신호 서열(Lei et al., J Bacteriol 169: 4379(1987))이 있다. 벡터를 표적 숙주 세포로 도입시키기 위한 수단은, 예를 들어, 칼슘 클로라이드(calcium chloride) 방법, 및 전기침공(electroporation) 방법을 포함한다.

대장균에 추가하여, 예를 들어, 포유류로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pcDNA3(Invitrogen) 및 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17): 5322(1990)), pEF, pCDM8), 곤충 세포로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, "Bac-to-BAC baculovirus expression system"(GIBCO BRL), pBacPAK8), 식물로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pMH1, pMH2), 동물 바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pZIpneo), 효모로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, "Pichia Expression Kit"(Invitrogen), pNV11, SP-Q01) 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pPL608, pKTH50)가 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

CHO, COS 또는 NIH3T3 세포와 같은, 동물 세포에서 벡터를 발현시키기 위해서, 벡터는 이러한 세포 내에서 발현에 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan et al., Nature 277: 108(1979)), MMLV-LTR 프로모터, EF1 알파 프로모터(Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322(1990)), CMV 프로모터 및 유사한 것을 가져야 하고, 바람직하게 형질전환체를 선별하기 위한 유전자 마커(예를 들어, 약물(예를 들어, 네오마이신(neomycin), G418)에 의해 선발된 약물 내성 유전자)를 가져야 한다. 이러한 특징을 가진 알려진 벡터의 예는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13을 포함한다.

여기에서 기술된 것과 비슷하거나 동일한 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있음에도 불구하고, 적합한 방법 및 재료를 기술한다. 모든 공개 발표(publication), 특허 출원, 특허, 및 여기에서 언급된 다른 참고문헌(references)은 이 전체에서 참조로서 통합된다. 갈등의 경우에, 정의를 포함하는, 본 명세서가 조절(control)될 것이다. 게다가, 재료, 방법, 및 실시예는 오직 예시하기 위한 것이고 제한하는 의도가 아니다.

본 발명을 설명하기 위해 및 당업자가 동일한 것을 만들고 이용하는 것을 돕기 위해 하기 실시예를 제시한다. 실시예는 본 발명의 범위를 어떠한 방법으로도 제한하는 의도가 아니다.

실시예

재료 및 방법

세포주

HLA-A*0201-양성의 B-림프아형 세포주(lymphoblastoid cell line)인, T2 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주(African green monkey kidney cell line)인, COS7은 ATCC로부터 구입하였다.

TOMM34 유래 펩티드의 후보 선별

HLA-A*0201 분자에 결합하는 TOMM34로부터 유래된 9-머(9-mer) 및 10-머(10-mer) 펩티드는 결합 예측 소프트웨어 "BIMAS"(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al. (J Immunol 1994, 152(1): 163-75), Kuzushima et al. (Blood 2001, 98(6): 1872-81))를 이용하여 예측되었다. 이러한 펩티드들은 표준 고체상 합성 방법(standard solid phase synthesis method)에 따라 Biosynthesis(Lewisville, Texas)에 의하여 합성되었고 역상 고속 액체 크로마토그래피(reversed phase high performance liquid chromatography, HPLC)로 정제되었다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 동정(identity)은 각각, 분석용 HPLC 및 질량 분석법(mass spectrometry analysis)에 의하여 결정되었다. 펩티드를 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 20 mg/ml로 용해하였고 섭씨 -80 도에 저장하였다.

시험관 내에서 CTL 유도

단핵구-유래 수지상세포(dendritic cells; DCs)를 인간 백혈구 항체(human leukocyte antigen; HLA)에 제시된 펩티드에 대한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하기 위하여 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)로 사용하였다. 다른 곳(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8)에 기술된 것과 같이 DCs를 시험관 내에서 생산하였다. 특히, 정상 지원자(HLA-A*0201 양성)로부터 피콜-플라크(Ficoll-Paque plus)(Pharmacia) 용액에 의해 분리된 말초 혈액 단핵구 세포를 단핵구 분획물(fraction)로서 이를 풍부하도록(enrich) 하기 위하여 플라스틱 조직 배양 접시(Becton Dickinson)에 부착함으로써 분리하였다. 단핵구-풍부한 집단을 2% 열-불활성화(heat-inactivated) 자신의 혈청(autologous serum; AS)를 포함한 AIM-V 배지(Invitrogen)에 과립-대식 세포집락-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; R&D System) 1000 U/ml 및 IL(interleukin)-4(R&D System) 1000 U/ml의 존재 하에 배양하였다. 배양 7일 후, 3 시간 동안 37℃에서 AIM-V 배지에서 베타 2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin) 3 μg/ml의 존재 하에서 사이토카인-유도된 DCs에 합성된 펩티드 각각의 20 micro-g/ml를 부과하였다. 생성된 세포는 그들의 세포 표면에 CD80, CD83, CD86 및 HLA 종류 II와 같은, DC-관련 분자를 발현하는 것으로 나타났다(데이터는 기재 안 함). 그 후 상기 펩티드-부과 DCs를 X 레이-방사선 처리(20 Gy)에 의하여 비활성화하였고 자신의 CD8+ T 세포와 1:20 비율로 혼합하여, CD8 양성 분리 키트(CD8 Positive Isolation Kit; Dynal)를 사용한 양성 선택으로 수득하였다. 상기 배양은 48-웰 플레이트(Corning)에서 수행하였고; 각 웰은 AIM-V/2% AS 배지 0.5 ml에 1.5 × 10⁴ 펩티드-부과 DCs, 3 × 10⁵ CD8+ T 세포 및 IL-7(R&D system)의 10 ng/ml을 포함하였다. 3 일 후, 이러한 배양에 최종 농도가 20 IU/ml이 되도록 IL-2(CHIRON)을 첨가하였다. 7 및 14 일째, T 세포를 또한 자신의 펩티트로 부과된 DCs로 자극하였다. DCs를 상기 기술된 동일한 방법으로 매시간 준비하였다. 21 일째 펩티드 자극 3 번째 라운드(round) 이후 CTL은 펩티드로 부가된 T2 세포에 대하여 검사하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

CTL 증식 과정

Riddell 등에 의해 기술된 것과 유사한 방법(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)을 사용한 배양에서 CTLs을 증식시켰다. 40 ng/ml의 항-CD3 단일 클론 항체(Pharmingen)의 존재 하에서, 미토마이신 C(mitomycin C)에 의해 불활성화된, 두 종류의 인간 B-림프아형 세포주와 함께 총 5 × 10⁴ CTL 25ml의 AIM-V/5% AS 배지에 부유하였다. 배양을 시작한지 1 일 후, IL-2의 120 IU/ml를 상기 배양에 첨가하였다. 5, 8 및 11 일째에 IL-2의 30 IU/ml를 포함하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지와 함께 상기 배양을 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

CTL 클론의 수립

96 둥근-밑면 마이크로 타이터 플레이트(round-bottomed micro titer plate; Nalge Nunc International)에 0.3, 1, 및 3 CTLs/웰(well)이 되도록 희석하였다. CTL을 1 × 10⁴세포/웰의 두 종류의 인간 B 림프아형 세포주, 30 ng/ml의 항-CD3 항체, 및 IL-2 125 U/ml와 함께, 5%의 AS를 포함하는 총 150 μl/웰의 AIM-V 배지에서 배양하였다. 10 일 후 IL-2의 최종농도가 125 U/ml이 되도록 상기 배지에 IL-2의 50 μl/웰을 첨가하였다. 14 일째에 CTL 활성을 시험하였고, 상기에 기술된 것과 동일한 방법을 이용하여 CTL 클론을 증식시켰다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

특이적인 CTL 활성

특이적인 CTL 활성을 조사하기 위하여, 인터페론(interferon; IFN)-감마(gamma) ELISPOT(enzyme-linked immunospot) 검사 및 IFN-감마 ELISA를 실시하였다. 펩티드-부가 T2(1 × 10⁴/웰)을 자극 세포(stimulator cell)로서 제조하였다. 반응 세포(responder cell)로서 48 웰에 배양된 세포를 사용하였다. IFN-감마 ELISPOT 검사 및 IFN-감마 ELISA 검사를 제조사 절차에 따라서 수행하였다.

표적 유전자 및 HLA -A02 중 어느 하나 또는 모두를 강제로 발현하게 하는 세포의 수립

표적 유전자 또는 HLA-A*0201의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 암호화하는 cDNA를 PCR로 증폭시켰다. 이 PCR-증폭된 생산물을 발현 벡터(expression vector)로 클로닝하였다. 제조사에서 추천하는 절차에 따라서 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)(Invitrogen)을 사용하여, 상기 플라스미드를 표적 유전자 및 HLA-A*0201-눌(null) 세포주, COS7으로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 형질감염된 세포를 versene(Invitrogen)을 사용하여 수거하였고 CTL 활성 검사를 위해 자극원(stimulator) 세포(5 × 10⁴세포/웰)로서 사용하였다.

결과 1

암에서 증가된 TOMM34 발현

cDNA-마이크로어레이(microarray)를 이용하여 다양한 암으로부터 획득된 전체 유전자 발현 프로파일(profile) 데이터는 TOMM34(유전자 등록번호: NM_006809; 예를 들어, 서열번호: 42) 발현이 증가한 것을 나타내었다. TOMM34 발현은 해당 정상 조직과 비교하여 AML 28개 중에서 4개, CML 14개 중에서 4개, 방광암 11개 중에서 8개, 유방암 4개 중에서 1개, 자궁경부암 5개 중에서 1개, 결장암 12개 중에서 12개, 식도암 17개 중에서 5개, 간암 6개 중에서 6개, 골육종 10개 중에서 1개, 전립선암 26개 중에서 1개, 신장암 19개 중에서 1개, SCLC 14개 중에서 2개, NSCLC 20개 중에서 5개, 및 연부 조직 종양 51개 중에서 10개에서 유효하게 증가하였다(표 1).

정상조직과 비교하여 암 조직에서 관측된 TOMM34의 상향조절 예의 비율

암	비율
AML	4/28
CML	4/14
방광암	8/11
유방암	1/4
자궁경부암	1/5
결장암	12/12
식도암	5/17
간암	6/6
골육종	1/10
전립선암	1/26
신장암	1/19
SCLC	2/14
NSCLC	5/20
연부 조직 종양	10/51

결과 2

TOMM34 유래 HLA -A02에 결합하는 펩티드의 예측

표 2a 및 2b는 TOMM34의 9머 및 10머 펩티드에 결합하는 HLA-A02를 높은 결합 친화도 순으로 나타낸다. 가능성 있는 HLA-A02 결합 능력이 있는 전체 40 개의 펩티드를 선별하였고 에피토프 펩티드(epitope peptides)를 결정하기 위해 조사하였다.

시작 위치는 TOMM34의 N-말단에서부터 아미노산 잔기의 수를 나타낸다.

결합 점수는 "BIMAS"으로부터 유래한다.

HLA -A*0201로 제한된 TOMM34 유래 예측된 펩티드로 CTL 유도

TOMM34 유래 이러한 펩티드에 대한 CTLs은 "재료 및 방법"에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-감마(gamma) ELISPOT 분석으로 검출하였다(도 1a-d). 하기 웰 번호는 대조군 웰과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 입증한다: 웰 번호 #4 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1)(a), #2 TOMM34-A02-9-220(서열번호: 5)(b), #4 TOMM34-A02-10-30(서열번호: 31)(c) 및 #2 TOMM34-A02-10-220(서열번호: 32)(d). 한편, 펩티드들이 HLA-A*0201와 가능한 결합 활성을 지녔음에도 불구하고, 표 2a 및 2b에서 제시한 다른 펩티드들로 자극하여 어떠한 특이적인 CTL 활성도 발견되지 않았다. 네거티브(negative) 데이터의 일반적인 경우로서, 특이적인 IFN-감마 생산물은 TOMM34-A02-10-143(서열번호: 21)(e)로 자극된 CTL로부터 관찰되지 않았다. 결과적으로, 강력한 CTL들을 유도할 수 있는 펩티드로서 TOMM34 유래 4 개의 펩티드들을 선발하였다고 나타냈다.

TOMM34 유래 펩티드에 대한 CTL 세포주 및 클론의 수립

IFN-감마 ELISPOT 검사에 의해 웰 번호 #4 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1)에서 발견된 펩티드 특이적인 CTL 활성을 보였던 세포를 증식하였고 CTL 세포주는 상기 "재료 및 방법" 부분에 기재된 증식 절차에 따라 수립하였다. 이러한 CTL 세포주의 CTL 활성을 IFN-감마 ELISA 검사로 측정하였다(도 2). CTL 세포주는 펩티드 부가되지 않은 표적 세포에 비해 해당 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 강력한 IFN-감마 생산을 보였다. 더욱이, CTL 클론은 "재료 및 방법"에 기재된 CTL 세포주로부터 제한 희석하여 수립하였고, 펩티드로 부가된 표적 세포에 대하여 CTL 클론으로부터 IFN-감마 생산을 IFN-감마 ELISA 검사로 측정하였다. 강력한 IFN-감마 생산을 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1)로 자극된 CTL 클론으로부터 관찰하였다(도 3).

TOMM34 및 HLA -A* 0201를 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성

TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1) 펩티드에 대하여 증식된 수립 CTL 세포주는 TOMM34 및 HLA-A*0201 분자를 발현하는 표적 세포를 인지하는 능력에 대해 조사되었다. TOMM34 및 HLA-A*0201 유전자의 전장 모두가 형질감염된 COS7 세포(TOMM34 및 HLA-A*0201 유전자를 발현하는 표적 세포에 대한 특이적인 모델)를 자극 세포로 준비하였고, TOMM34 및 HLA-A*0201 유전자 중 어느 하나의 전장으로 형질전환된 COS7 세포를 대조군으로서 사용하였다. 도 4에서, TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1)로 자극된 CTL 라인은 TOMM34 및 HLA-A*0201 둘 다를 발현하는 COS7 세포에 대하여 강력한 CTL 활성을 보였다. 한편, 대조군에 대하여 유의적인 특이적 CTL 활성은 발견되지 않았다. 따라서, 이 데이터는 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1) 펩티드가 HLA-A*0201 분자를 가진 채 내인성으로 생성 및 표적 세포에 제시되었고 CTL에 의해 인식되었음을 명백히 입증하였다. 이 결과는 TOMM34 유래 상기 펩티드가 TOMM34를 발현하는 종양이 있는 환자를 위한 암 백신으로 적합할 수 있음을 나타낸다.

항원 펩티드의 상동성 분석

TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1), TOMM34-A02-9-220(서열번호: 5), TOMM34-A02-10-30(서열번호: 31) 및 TOMM34-A02-10-220(서열번호: 32)로 자극된 CTL은 유의적 및 특이적 CTL 활성을 보였다. 이 결과는 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1), TOMM34-A02-9-220(서열번호: 5), TOMM34-A02-10-30(서열번호: 31) 및 TOMM34-A02-10-220(서열번호: 32)의 서열이 인간 면역 시스템을 민감하게 하는 것으로 알려진 다른 분자 유래 펩티드와 상동성이 있다는 사실 때문일 수 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위하여, 유의적인 상동성이 있는 서열을 나타내지 않는 BLAST 알고리즘(algorithm)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) 쿼리(queries)를 이용하여 상동성 분석을 이 펩티드 서열에 대하여 수행하였다. 상동성 분석의 결과는 TOMM34-A02-9-30(서열번호: 1), TOMM34-A02-9-220(서열번호: 5), TOMM34-A02-10-30(서열번호: 31) 및 TOMM34-A02-10-220(서열번호: 32)의 서열이 유일한 것임을 나타내고 따라서, 우리가 아는 한, 이 분자가 어떤 관련없는 분자에 대하여 의도하지 않은 면역 반응을 야기할 가능성은 거의 없다. 결론적으로, 신규한 TOMM34 유래 HLA-A*0201 에피토프 펩티드가 동정되었다. 더욱이, 그 결과는 본 발명에서 TOMM34의 에피토프 펩티드가 암 면역치료로의 사용에 적합할 수 있을 것으로 입증한다.

본 발명은 새로운 TAAs, 특히 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도하고 다양한 암 종류에 적용가능성을 가지는 TOMM34으로부터 유래한 것을 제공한다. 이러한 TAAs는 TOMM34과 관련된 질병에 대한, 예를 들어, 암, 보다 구체적으로, AML, CML, 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 간암(liver cancer), 골육종(osteosarcoma), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal carcinoma), SCLC, NSCLC 및 연부 조직 종양(soft tissue tumor)에 대한 펩티드 백신으로 사용할 수 있다.

본 발명이 여기에서 이의 구체적 실시예와 함께 상세히 기술되는 동안, 앞서 언급한 기술이 사실상 예시적 및 설명적이고 본 발명 및 이의 바람직한 실시예를 설명하기 위해 의도된 것이 이해되어야 한다. 통상적인 실험을 통해, 당업자는 본 발명의 뜻과 범위, 첨부된 청구항에 의해 정의된 경계 및 한계 내에서 다양한 변화 및 변형이 그 안에 존재할 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> TOMM34 PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME <130> ONC-A1035P <150> US 61/419,181 <151> 2010-12-02 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Ala Leu Tyr Gly Arg Ala Leu Arg Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Ala Leu Ala Leu Val Pro Phe Ser Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Val Leu Tyr Ser Asn Arg Ala Ala Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Thr Val Leu Gln Ile Asp Asp Asn Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Leu Leu Cys Ser Asn Leu Glu Ser Ala 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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Ser Ile Pro Leu Val Pro Val 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 19 Leu Lys Leu Pro Ser Ile Pro Leu Val 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 20 Ser Ser Phe Ala Asp Ile Ser Asn Leu 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 21 Lys Leu Pro Ser Ile Pro Leu Val Pro Val 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 22 Ala Leu Glu Lys Tyr Pro Met Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 23 Ala Leu Val Pro Phe Ser Ile Lys Pro Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 24 Tyr Leu Val Leu Lys Gln Tyr Thr Glu Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 25 Ser Leu Gly Pro Glu Trp Arg Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 26 Ser Leu Leu Cys Ser Asn Leu Glu Ser Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 27 Leu Val Leu Lys Gln Tyr Thr Glu Ala Val 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 28 Arg Met Thr Arg Ala Leu Met Asp Ser Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 29 Gln Ile Asp Asp Asn Val Thr Ser Ala Val 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 30 Lys Gln Tyr Thr Glu Ala Val Lys Asp Cys 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 31 Ala Leu Tyr Gly Arg Ala Leu Arg Val Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 32 Leu Leu Cys Ser Asn Leu Glu Ser Ala Thr 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 33 Val Leu Lys Glu Glu Gly Asn Glu Leu Val 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 34 Leu Gln Ile Asp Asp Asn Val Thr Ser Ala 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 35 Arg Val Leu Lys Glu Glu Gly Asn Glu Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 36 Lys Leu Arg Gln Glu Val Lys Gln Asn Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 37 Arg Leu Lys Leu Pro Ser Ile Pro Leu Val 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 38 Ser Leu Pro Ser Glu Asn His Lys Glu Met 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 39 Lys Glu Thr Thr Ala Thr Lys Asn Arg Val 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 40 Ser Ala Gly Asp Val Glu Lys Ala Arg Val 1 5 10 <210> 41 <211> 2066 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 aggtctcgca ggccccgccc cctcgccgcg ggttcgctgt tgggcggaga tattcgccgc 60 cggcgcttgc gcccggaagg tgtgccgcac cacacggggg aggaaggaag gagctcccaa 120 ctcgccggcc tggccacggg atggccccca aattcccaga ctctgtggag gagctccgcg 180 ccgccggcaa tgagagtttc cgcaacggcc agtacgccga ggcctccgcg ctctacggcc 240 gcgcgctgcg ggtgctgcag gcgcaaggtt cttcagaccc agaagaagaa agtgttctct 300 actccaaccg agcagcatgt cacttgaagg atggaaactg cagagactgc atcaaagatt 360 gcacttcagc actggccttg gttcccttca gcattaagcc cctgctgcgg cgagcatctg 420 cttatgaggc tctggagaag taccctatgg cctatgttga ctataagact gtgctgcaga 480 ttgatgataa tgtgacgtca gccgtagaag gcatcaacag aatgaccaga gctctcatgg 540 actcgcttgg gcctgagtgg cgcctgaagc tgccctcaat ccccttggtg cctgtttcag 600 ctcagaagag gtggaattcc ttgccttcgg agaaccacaa agagatggct aaaagcaaat 660 ccaaagaaac cacagctaca aagaacagag tgccttctgc tggggatgtg gagaaagcca 720 gagttctgaa ggaagaaggc aatgagcttg taaagaaggg aaaccataag aaagctattg 780 agaagtacag tgaaagcctc ttgtgtagta acctggaatc tgccacgtac agcaacagag 840 cactctgcta tttggtcctg aagcagtaca cagaagcagt gaaggactgc acagaagccc 900 tcaagctgga tggaaagaac gtgaaggcat tctacagacg ggctcaagcc cacaaagcac 960 tcaaggacta taaatccagc tttgcagaca tcagcaacct cctacagatt gagcctagga 1020 atggtcctgc acagaagttg cggcaggaag tgaagcagaa cctacactaa aaacccaaca 1080 gggcaactgg aacccctgcc tgaccttacc cagagaagcc atgggccacc tgctctgtgc 1140 ccgctcctga aacccagcat gccccaagtg agctctgaag ccccctcctc aatcccttga 1200 tggcctccca ccctgtaaga ggctttgctt gttcaaatta aactcagtgt agtcaaacac 1260 agacatggtt gttgcaccag aaaggtcccc actagagcta agcgtgaagc tgaagctctg 1320 tccctattcc cccagcccag ctagctgatc acaccaacag atcctcatca gcaaagcatt 1380 tggctttgtc ctgcccaagt gggctgcaga ctgagtgctg cccttgtagc ttccccagac 1440 cccaactcac tgcagttcat ctgaacaacc tgagctcctg ggccggggtg gaaggagggg 1500 gataaaccta aggccctgat ccaaagcagc ctgttgagct ggttctccag ggctgcagtc 1560 tctccaggtg tacagctgct gtccctgccc tgtcctgtcc ttgcacagtc tcctatgtct 1620 gagccccagt gccttctgtt cgggccctcc tttggtggga aggcagagcc ctgacccttg 1680 aatggttgtc cttgactctg tgctgctgcc ttctgcagag aggcacctaa gctgtttaaa 1740 gagcccagtg attgtggctg ctcctcctag aggtgggagg gggcaagagg cctccttggt 1800 cagtgtccat gctttctggg cagggacttg gttttttgtt ccaacagtgg ccttctccgg 1860 gcttcatagt tctttgtaat atgttgaagt taatttgaat tgactgattt tgttgaactg 1920 tgtgtttaag ctgttgcatt aaaaagcttt cttctacatc aatatctgct gtgctttcat 1980 ttatgccttt tcagctttgc acctggaact ctgtagtaat aataaaagtt attgcttatt 2040 gggcattcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2066 <210> 42 <211> 309 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Met Ala Pro Lys Phe Pro Asp Ser Val Glu Glu Leu Arg Ala Ala Gly 1 5 10 15 Asn Glu Ser Phe Arg Asn Gly Gln Tyr Ala Glu Ala Ser Ala Leu Tyr 20 25 30 Gly Arg Ala Leu Arg Val Leu Gln Ala Gln Gly Ser Ser Asp Pro Glu 35 40 45 Glu Glu Ser Val Leu Tyr Ser Asn Arg Ala Ala Cys His Leu Lys Asp 50 55 60 Gly Asn Cys Arg Asp Cys Ile Lys Asp Cys Thr Ser Ala Leu Ala Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ser Ile Lys Pro Leu Leu Arg Arg Ala Ser Ala Tyr Glu 85 90 95 Ala Leu Glu Lys Tyr Pro Met Ala Tyr Val Asp Tyr Lys Thr Val Leu 100 105 110 Gln Ile Asp Asp Asn Val Thr Ser Ala Val Glu Gly Ile Asn Arg Met 115 120 125 Thr Arg Ala Leu Met Asp Ser Leu Gly Pro Glu Trp Arg Leu Lys Leu 130 135 140 Pro Ser Ile Pro Leu Val Pro Val Ser Ala Gln Lys Arg Trp Asn Ser 145 150 155 160 Leu Pro Ser Glu Asn His Lys Glu Met Ala Lys Ser Lys Ser Lys Glu 165 170 175 Thr Thr Ala Thr Lys Asn Arg Val Pro Ser Ala Gly Asp Val Glu Lys 180 185 190 Ala Arg Val Leu Lys Glu Glu Gly Asn Glu Leu Val Lys Lys Gly Asn 195 200 205 His Lys Lys Ala Ile Glu Lys Tyr Ser Glu Ser Leu Leu Cys Ser Asn 210 215 220 Leu Glu Ser Ala Thr Tyr Ser Asn Arg Ala Leu Cys Tyr Leu Val Leu 225 230 235 240 Lys Gln Tyr Thr Glu Ala Val Lys Asp Cys Thr Glu Ala Leu Lys Leu 245 250 255 Asp Gly Lys Asn Val Lys Ala Phe Tyr Arg Arg Ala Gln Ala His Lys 260 265 270 Ala Leu Lys Asp Tyr Lys Ser Ser Phe Ala Asp Ile Ser Asn Leu Leu 275 280 285 Gln Ile Glu Pro Arg Asn Gly Pro Ala Gln Lys Leu Arg Gln Glu Val 290 295 300 Lys Gln Asn Leu His 305 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 43 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 44 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 45 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 46 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24

Claims

하기 (a) 또는 (b)의 분리된 펩티드:
(a) 서열번호: 1, 5 및 32로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된, 분리된 펩티드;
(b) 서열번호: 1, 5 및 32로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 하나 또는 두 개의 아미노산(들)이 치환된 아미노산 서열로 구성되고, 상기 치환(들)은 하기 (b1) 및 (b2)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 분리된 펩티드:
(b1) N-말단으로부터 두 번째 아미노산의 메티오닌(methionine)으로의 치환;
(b2) C-말단 아미노산의 발린(valine) 또는 루신(leucine)으로의 치환.
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제 1항의 펩티드를 암호화(encoding)하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide).
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하기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나를 약학적으로 수용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)와 함께 포함하고, (i) 기존(existing) 암의 치료, (ii) 암의 예방(prophylaxis), (iii) 암의 수술 후 암의 재발에 대한 방지(prevention), 및 (iv) 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 목적을 위해 제형화되는, 약학적 조성물:
(a) 제 1항의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들);
(b) 제 5항의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드들;
(c) 제 1항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면(surface)에 제시하는 하나 또는 그 이상의 항원제시 세포(antigen-presenting cells; APCs) 또는 엑소솜(exosomes); 또는
(d) 제 1항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면에 제시하는 세포를 인지하는 하나 또는 그 이상의 CTL.
제 7항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여하기 위하여 제형화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는, CTL 유도성을 지닌 항원제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 유도하는 시험관 내(in vitro) 방법:
(a) 시험관 내(in vitro)에서, 제 1항의 펩티드를 APC에 접촉시키는 단계, 및
(b) 제 1항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입시키는 단계.
하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는, CTL을 유도하는 시험관 내(in vitro) 방법:
(a) HLA 항원 및 제 1항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC와 CD8-양성 T 세포를 공-배양(co-culture)하는 단계,
(b) HLA 항원 및 제 1항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는, 엑소솜(exosome)과 CD8-양성 T 세포를 공-배양하는 단계, 및
(c) 세포 표면의 HLA 항원 및 제 1항의 펩티드의 복합체와 결합할 수 있는 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR)를 형성하는 TCR 아단위(subunit) 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)을 T 세포에 도입하는 단계.
HLA 항원 및 제 1항의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 APC.
제 11항에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 방법으로, CTL 유도성을 지닌 항원제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 유도하는 방법에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 APC:
(a) 시험관 내 또는 생체 외에서 제 1항의 펩티드와 APC를 접촉하는 단계, 및
(b) 제 1항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입하는 단계.
제 1항의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL.
제 13항에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 방법으로, CTL을 유도하는 방법에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 CTL:
(a) HLA 항원 및 제 1항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC와 CD8-양성 T 세포를 공-배양하는 단계,
(b) HLA 항원 및 제 1항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜과 CD8-양성 T 세포를 공-배양하는 단계, 및
(c) 세포 표면의 HLA 항원 및 제 1항의 펩티드의 복합체와 결합할 수 있는 TCR을 형성하는 TCR 아단위 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)을 T 세포에 도입하는 단계.
개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조에, 제 1항의 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법.
제 1항의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
제 16항의 발현 벡터로 형질전환(transformed) 또는 형질감염된(transfected) 숙주세포(host cell).
제 1항의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 엑소솜.
제 1항의 펩티드에 대한 항체(antibody).
제 1항의 펩티드, 제 5항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 19항의 항체를 포함하는 진단 키트(diagnostic kit).