EA028216B1 - Пептиды tomm34 и содержащие их вакцины - Google Patents

Пептиды tomm34 и содержащие их вакцины Download PDF

Info

Publication number
EA028216B1
EA028216B1 EA201390811A EA201390811A EA028216B1 EA 028216 B1 EA028216 B1 EA 028216B1 EA 201390811 A EA201390811 A EA 201390811A EA 201390811 A EA201390811 A EA 201390811A EA 028216 B1 EA028216 B1 EA 028216B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
present
peptides
cancer
tomm34
Prior art date
Application number
EA201390811A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390811A1 (ru
Inventor
Юсуке Накамура
Такуя Цунода
Рюдзи Осава
Сатико Йосимура
Томохиса Ватанабе
Гаку Накаяма
Original Assignee
Онкотерапи Сайенс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Онкотерапи Сайенс, Инк. filed Critical Онкотерапи Сайенс, Инк.
Publication of EA201390811A1 publication Critical patent/EA201390811A1/ru
Publication of EA028216B1 publication Critical patent/EA028216B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к выделенным пептидам или фрагментам, полученным из SEQ ID NO: 42, которые связываются HLA-антигеном и индуцируют цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ). Эти пептиды могут включать в себя одну из вышеупомянутых аминокислотных последовательностей с заменой, делецией или добавлением одной, двух или нескольких аминокислотных последовательностей. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим в себя эти пептиды. Пептиды изобретения могут применяться для лечения рака.

Description

Изобретение относится к области биологической науки, а более конкретно к области терапии рака. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые являются очень эффективными в качестве противораковых вакцин, и лекарственным препаратам для лечения и предупреждения опухолей.
Приоритет
Настоящая заявка заявляет преимущество приоритета предварительной заявки на патент США №61/419181, поданной 2 декабря 2010 года, полное содержание которой включено в данную заявку путем ссылки.
Уровень техники
Было показано, что СО8-позитивные ЦТЛ распознают эпитопные пептиды опухолеассоциированных антигенов (ОАА) на молекулах класса I главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и затем уничтожают опухолевые клетки. С момента открытия семейства антигенов меланомы (МАСЕ) в качестве первого примера ОАА многие другие ОАА были открыты при помощи иммунологических подходов (НПЛ 1, 2), и некоторые из этих ОАА в настоящее время находятся в процессе клинических испытаний в качестве мишеней для иммунотерапии.
Предпочтительным для использования в качестве мишени для иммунотерапии является ОАА, который является необходимым для пролиферации и выживания раковых клеток, так как использование таких ОАА может минимизировать хорошо описанный риск ускользания раковых клеток от иммунного ответа в связи с делецией, мутацией или подавлением экспрессии ОАА в результате терапевтически индуцируемой иммунной селекции. Следовательно, идентификация новых ОАА, способных вызывать сильные и специфичные противоопухолевые иммунные ответы, обеспечивает дальнейшее развитие и, таким образом, продолжается клиническое применение стратегий пептидной вакцинации от различных типов рака (НПЛ 3-10). На сегодняшний день имеются сообщения о нескольких клинических испытаниях с использованием этих полученных из ОАА пептидов. К сожалению, было показано, что многие из проводимых в настоящее время клинических испытаний противораковых вакцин имеют низкую частоту объективных ответов (НПЛ 11-13). Таким образом, остается потребность в новых ОАА в качестве мишеней для иммунотерапии.
Ген ТОММ34 транслоказы внешней митохондриальной мембраны 34 (регистрационный номер в СепВапк ΝΜ_006809) был идентифицирован в базах данных меток экспрессируемых последовательностей (МЭП) и кДНК человека, и предположительно он кодирует белок, содержащий вырожденные мотивы тетратрикопептидных повторов (ТРИ) (НПЛ 14). Белок, кодируемый этим геном, вовлечен в импорт белков-предшественников в митохондрии. Этот белок, обладающий шаперонподобной активностью, связывается со зрелой частью развернутых белков и способствует их импорту в митохондрии (НПЛ 15).
В недавнем исследовании при помощи анализа профиля генной экспрессии с использованием кДНК-микрочипа, состоящего из 23040 генов, было показано, что ТОММ34 часто находится в активированном состоянии при колоректальном раке. Кроме того, нокдаун ТОММ34 с помощью миРНК в клеточных линях рака толстой кишки ослаблял рост клеток рака толстой кишки (НПЛ 16).
Список цитированных источников
Патентная литература.
[ПТЛ 1] РСТ/ЛР2 0 0 6/314 94 7
Непатентная литература.
[НПЛ 1] Βοοη Т, 1п£ Л Сапсег 1993, 54(2): 177-80
[НПЛ 2 ] Βοοη Т & νβη Дег Вгиддеп Р, Л Ехр Мес 4 1996,
183 (3) : 725- 9
[НПЛ 3] Нагггз СС, Л Ыак1 Сапсег 1пз£ 1996, 88 (20) : 1442-
55
[НПЛ 4] Ви£кег£1е1Д ЬН е£ а1. , Сапсег Вез 1999, 59 (13) :
3134-42
[НПЛ 5] ЛЛззегз ЛЬ еП а1., Сапсег Кез 1999, 59(21): 5554-9
[НПЛ б] νηη Дег Вигд ЗН ек а1. , Л 1ттипо1199б, 156(9) :
3308-14
[НПЛ 7] Тапака Еека1., Сапсег Кез 1997, 57(20): 4465-8
- 1 028216
Ιηί Л Сапсег 1999, 80(2): 169-72 [НПЛ 9] К1кисЫ Мека1., Ιηί Л Сапсег 1999, 81(3): 459-66 [НПЛ 10] 0150 МеЕа1., Ιηί Л Сапсег 1999, 81(3): 387-94 [НПЛ 11] Ве1П Века1., Л СПп Опсо1 2002, 20(20): 4169-80 [НПЛ 12] СоиПе Р6 ек а1. , 1ттипо1 Ηθν 2002, 188: 33-42 [НПЛ 13] НозепЬегд ЗА ек а1., Лак МеЛ 2004, 10(9): 909-15 'НПЛ [НПЛ 14] ЛиССа! 3Ώ ек а1. ,
ΏΝΑ СеП ΒίοΙ.
1997
Зер;16(9):1067-74 [НПЛ 15] МикЬораЛЬуау А ек а1., АгсЬ ВгосЬет ВгорЬуз,
2002
Арг 1; 400 (1) :97-104 [НПЛ 16] ЗЫтокама
Аид;29(2):381-6 ек а1. ,
Ιηί
Л 0псо1.
2006
Сущность изобретения.
Настоящее изобретение, по меньшей мере, частично основано на открытии новых пептидов, которые могут служить подходящими мишенями для иммунотерапии. Так как ОАА, как правило, воспринимаются иммунной системой как свои и поэтому часто не обладают иммуногенностью, открытие подходящих мишеней является очень важным. Как отмечалось выше, было установлено, что ТОММ34 (например, ЗЕО ГО N0: 41 и 42, также зарегистрированы в СепВапк под номером ΝΜ_006809) находится в активированном состоянии при различных типах рака, включая, но не ограничиваясь, острую миелоцитарную лейкемию (ОМЛ), хроническую миелоцитарную лейкемию (ХМЛ), рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, мелкоклеточный рак легкого (МРЛ), немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и опухоль мягких тканей. Таким образом, изобретение направлено на ТОММ34 в качестве подходящего онкомаркера и кандидата на мишень для иммунотерапии.
В рамках настоящего изобретения были идентифицированы конкретные эпитопные пептиды продуктов гена ТОММ34, которые обладают способностью к индуцированию ЦТЛ, специфичных по отношению к ТОММ34. Как более подробно обсуждается ниже, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), полученные от здорового донора, стимулировали с использованием связывающих НЕАА*0201 кандидатных пептидов, полученных из ТОММ34. Затем были выделены линии ЦТЛ, обладающие специфичной цитотоксичностью в отношении НЬА-А2-позитивных клеток-мишеней, активированных каждым из кандидатных пептидов. Приводимые здесь результаты показывают, что эти пептиды являются НЕА-А2 ограниченными эпитопными пептидами, которые могут вызывать сильные и специфичные иммунные ответы в отношении клеток, экспрессирующих ТОММ34. Эти результаты также указывают на то, что ТОММ34 обладает высокой иммуногенностью, и что его эпитопы являются эффективными мишенями для иммунотерапии опухолей.
Таким образом, целью настоящего изобретения является получение выделенных пептидов, связывающих НЬА-антиген и включающих в себя аминокислотную последовательность ТОММ34 (ЗЕО ГО N0: 42) или ее иммунологически активные фрагменты. Предполагается, что эти пептиды обладают способностью к индуцированию ЦТЛ, и, таким образом, они могут быть использованы для индуцирования ЦТЛ ΐπ νΐίτο или ех νίνο, или для введения субъекту, с целью вызвать у него иммунные ответы против различных типов рака, примеры которых включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей. Предпочтительно эти пептиды представляют собой нонапептиды или декапептиды, и, более предпочтительно, нонапептид или декапептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из ЗЕО ГО N0: 1-20 и 22-40. Из них пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕР ГО N0: 1, 5, 31 и 32, обладают особенно сильной способностью к индуцированию ЦТЛ и, таким образом, являются особенно предпочтительными.
Настоящее изобретение также предполагает модифицированные пептиды, содержащие иммунологически активный фрагмент ТОММ34, в котором одна, две или более аминокислот заменены, удалены, вставлены или добавлены при условии, что эти модифицированные пептиды сохраняют необходимую способность к индуцированию ЦТЛ исходного немодифицированного пептида. Из них пептид, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 1, 5, 31 или 32, в которой одна, две или более аминокислот, заменены, удалены, вставлены или добавлены, является особенно предпочтительным.
Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим любой из пептидов настоящего изобретения. Эти полинуклеотиды могут быть использованы для индуцирования или получения АПК, обладающих способностью к индуцированию ЦТЛ. Как и вышеописанные пептиды настоящего изобретения, такие АПК могут быть введены субъекту, с целью вызвать у него иммунные
- 2 028216 ответы против различных типов рака.
При введении субъекту настоящие пептиды презентируются на поверхности АПК, для того чтобы вызвать направленную доставку соответствующих пептидов к ЦТЛ. Поэтому одной целью настоящего изобретения является получение композиций или агентов, включающих в себя любые пептиды или полинуклеотиды, предназначенные в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования ЦТЛ. Такие композиции или агенты, включающие в себя любые пептиды или полинуклеотиды, могут применяться для лечения и/или профилактики различных типов рака или для предупреждения послеоперационного рецидива рака, примеры которого включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей, и/или предупреждение их послеоперационного рецидива.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим агентам или композициям, которые содержат или включают в себя один или более пептидов или полинуклеотидов настоящего изобретения, предназначенным для лечения и/или профилактики рака, в частности первичного рака, или для предупреждения его послеоперационного рецидива. Вместо или кроме настоящих пептидов или полинуклеотидов настоящие фармацевтические агенты или композиции могут включать в себя в качестве активных ингредиентов АПК или экзосомы, которые презентируют любые из настоящих пептидов.
Пептиды или полинуклеотиды настоящего изобретения могут использоваться для индуцирования АПК, которые презентируют на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и настоящего пептида, например, путем контактирования полученных от субъекта АПК с пептидом, или путем введения полинуклеотида, кодирующего пептид настоящего изобретения, в АПК. Такие АПК обладают высокой способностью к индуцированию ЦТЛ, специфичных по отношению к целевым пептидам, и являются пригодными для иммунотерапии рака. Таким образом, настоящее изобретение включает в себя как способы индуцирования АПК, обладающих способностью к индуцированию ЦТЛ, так и к АПК, полученным такими способами.
Другой целью настоящего изобретение является создание способов индуцирования ЦТЛ, такие способы включают в себя этап совместного культивирования СГО8-позитивных клеток с АПК или экзосомами, презентирующими пептид настоящего изобретения на своей поверхности, или этап введения полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц Т-клеточного рецептора (ТСК), где ТСК, образованный такими полипептидами субъединиц, способен связываться с комплексом НЬАантигена и настоящего пептида на поверхности клетки. Полученные такими способами ЦТЛ являются пригодными для лечения и предупреждения различных типов рака, примеры которых включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
Еще одной целью настоящего изобретение является получение АПК, которые презентируют на поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным ЦТЛ, которые являются специфичными по отношению к пептидам настоящего изобретения. Эти АПК и ЦТЛ могут применяться для иммунотерапии рака.
Еще одной целью настоящего изобретение является создание способов индуцирования иммунного ответа против рака у нуждающегося в этом субъекта, такие способы включают в себя этап введения этому субъекту композиции или агента, включающих в себя один или более пептидов настоящего изобретения, полинуклеотидов, кодирующих пептид настоящего изобретения, или экзосом или АПК, презентирующих пептид настоящего изобретения.
Применимость настоящего изобретения распространяется на любое количество заболеваний, связанных с или возникших в результате сверхэкспрессии ТОММ34, таких как рак, примеры различных типов рака включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
В частности, настоящее изобретение относится к следующим пунктам [1]-[20]:
[1] Выделенный пептид (а) или (Ь):
(a) выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕЦ ГО N0: 1, 5, 31 и 32;
(b) выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, где одна, две или более аминокислот, заменены, удалены, вставлены или добавлены у аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕЦ ГО N0: 1, 5, 31 и 32, для получения модифицированного пептида, который сохраняет способность связываться с НЬА-антигеном и способность к индуцированию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ);
[2] выделенный пептид по п.[1], где НЬА-антиген представляет собой НЬА-А2;
[3] выделенный пептид по пп.[1] или [2], где указанный пептид представляет собой нонапептид или декапептид;
[4] пептид по любому из пп.[1]-[3], имеющий по меньшей мере одну замену, выбранную из группы,
- 3 028216 состоящей из:
(a) вторая аминокислота с Ν-конца является или модифицирована, чтобы быть, аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина и метионина, и (b) С-концевая аминокислота является или модифицирована, чтобы быть аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из валина и лейцина;
[5] выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.[1]-[4];
[6] композиция для индуцирования ЦТЛ, где данная композиция включает в себя один или более пептидов по любому из пп. [1]-[4], или один или более полинуклеотидов по п.[5];
[7] фармацевтическая композиция, содержащая:
(a) один или более пептидов по любому из пп.[1]-[4];
(b) один или более полинуклеотидов по п.[5];
(c) одну или более АПК или экзосом, которые презентируют комплекс пептида по любому из пп.[1]-[4] и НЬА-антигена на своей поверхности; или (б) один или более ЦТЛ, которые распознают клетки, презентирующие комплекс пептида по любому из пп.[1]-[4] и НЬА-антигена на своей поверхности, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, предназначенная для целей, выбранных из группы, состоящей из:
(ί) лечения существующего рака, (ίί) профилактики рака, (ίίί) предупреждения послеоперационного рецидива рака, и (ίν) их комбинации;
[8] фармацевтическая композиция по п.[7], предназначенная для введения субъекту, чей НЬАантиген представляет собой НЬА-А2;
[9] способ индуцирования антигенпрезентирующей клетки (АПК), обладающей способностью к индуцированию ЦТЛ, включающий в себя этап, выбранный из группы, состоящей из:
(a) контактирования АПК с пептидом по любому из пп.[1]-[4] ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο, и (b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп.[1]- [4], в АПК;
[10] способ индуцирования ЦТЛ, включающий в себя этап, выбранный из группы, состоящей из:
(a) совместного культивирования СО8-позитивной Т-клетки с АПК, презентирующей на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4], (b) совместного культивирования СО8-позитивной Т-клетки с экзосомой, презентирующей на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4], и (c) введения в Т-клетку полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц Т-клеточного рецептора (ТСК), где ТСК, образованный указанными полипептидами субъединиц, способен связываться с комплексом НЬА-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4] на поверхности клетки;
[11] выделенная АПК, презентирующая на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4];
[12] АПК по п.[11], индуцированная способом индуцирования антигенпрезентирующей клетки (АПК), обладающей способностью к индуцированию ЦТЛ, где данный способ включает в себя этап, выбранный из группы, состоящей из:
(a) контактирования АПК с пептидом по любому из пп.[1]-[4] ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο, и (b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп.[1]-[4], в АПК;
[13] выделенный ЦТЛ, специфичный по отношению к любому из пептидов по пп.[1]-[4];
[14] ЦТЛ по п.[13], индуцированный способом индуцирования ЦТЛ, где данный способ включает в себя этап, выбранный из группы, состоящей из:
(a) совместного культивирования СО8-позитивной Т-клетки с АПК, презентирующей на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4], (b) совместного культивирования СО8-позитивной Т-клетки с экзосомой, презентирующей на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4], и (c) введения в Т-клетку полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц Т-клеточного рецептора (ТСК), где ТСК, образованный указанными полипептидами субъединиц, способен связываться с комплексом НЬА-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4] на поверхности клетки;
[15] способ индуцирования иммунного ответа против рака у субъекта, включающий в себя этап введения этому субъекту пептида по пп.[1]-[4], его иммунологически активного фрагмента или полинуклеотида, кодирующего этот пептид или фрагмент;
[16] вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид по любому из пп.[1]-[4];
[17] клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная экспрессионным вектором по п.[16];
[18] экзосома, презентирующая комплекс, содержащий пептид по любому из пп.[1]-[4] и НЬАантиген;
[19] антитело против пептида по любому из пп.[1]-[4] или его иммунологически активный фраг- 4 028216 мент; и [20] диагностический набор, включающий в себя пептид по любому из пп.[1]-[4], полинуклеотид по п. [5] или антитело или его иммунологически активный фрагмент по п.[19].
Цели и признаки настоящего изобретения станут более очевидными после прочтения следующего подробного описания вместе с прилагаемыми фигурами и примерами. Следует понимать, что как вышеизложенная сущность настоящего изобретения, так и последующее подробное описание являются вариантами осуществления изобретения, приведенными в качестве примеров, и не ограничивают настоящее изобретение или альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, когда настоящее изобретение описывается здесь со ссылкой на ряд конкретных вариантов осуществления изобретения, следует понимать, что это описание является иллюстрацией настоящего изобретения и не представляет собой ограничение настоящего изобретения. Различные модификации и применения могут быть сделаны специалистами в данной области техники без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения. Также другие цели, признаки, эффекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из этого описания сущности изобретения и некоторых вариантов осуществления изобретения, описанных ниже, и будут очевидны специалистам в данной области техники. Такие цели, признаки, эффекты и преимущества будут очевидны из приведенного выше описания в сочетании с прилагаемыми примерами, данными, фигурами и всеми разумными выводами, которые могут быть из них сделаны, по отдельности или с учетом ссылок, включенных в настоящее описание.
Краткое описание чертежей
Различные аспекты и применения настоящего изобретения станут понятны специалистам в данной области техники после рассмотрения краткого описания чертежей и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, следующих далее.
Фиг. 1 состоит из серии фотографий (а)-(е), изображающих результаты анализ интерферона(ИФН)гамма методом иммуноферментных пятен (ЕЫ8Р0Т) у ЦТЛ, которые были индуцированы пептидами, полученными из ТОММ34. ЦТЛ в лунке номер #4 с ТОММ34-А02-9-30 (8ЕЦ ГО N0: 1) (а), в лунке #2 с ТОММ34-А02-9-220 (81Т) ГО N0: 5) (Ь), в лунке #4 с ТОММ34-А02-10-30 (81Т) ГО N0: 31) (с) и в лунке #2 с ТОММ34-А02-10-220 (8ЕЦ ГО N0: 32) (4) показали высокий уровень синтеза ИФН-гамма по сравнению с контролем соответственно. Квадрат на лунке на этих изображениях указывает на то, что клетки из соответствующей лунки были размножены для получения линий ЦТЛ. В противоположность этому, что является типичным случаем отрицательных данных, специфичный синтез ИФН-гамма ЦТЛ, стимулированными ТОММ34-А02-10-143 (8ЕЦ ГО N0: 21) (е), не наблюдался. На фигурах + обозначает синтез ИФН-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом, и - обозначает синтез ИФН-гамма против клеток-мишеней, не активированных никаким пептидом;
фиг. 2 представляет собой линейный график, показывающий синтез ИФН-гамма линией ЦТЛ, стимулированной ТОММ34-А02-9-30 (8ЕЦ ГО N0: 1). Количество ИФН-гамма, синтезируемое ЦТЛ, измеряли при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) ИФН-гамма. Полученные результаты показывают, что линия ЦТЛ, созданная путем стимуляции этим пептидом, имеет высокий уровень синтеза ИФН-гамма по сравнению с контролем. На фигурах + обозначает синтез ИФН-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом, и - обозначает синтез ИФН-гамма против клеток-мишеней, не активированных никаким пептидом;
фиг. 3 - линейный график, показывающий синтез ИФН-гамма клоном ЦТЛ, полученным путем предельного разведения из линии ЦТЛ, стимулированной ТОММ34-А02-9-30 (8ЕЦ ГО N0: 1). Полученные результаты показывают, что клон ЦТЛ, полученный путем стимуляции этим пептидом, имеет высокий уровень синтеза ИФН-гамма по сравнению с контролем. На фигурах + обозначает синтез ИФН-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом, и - обозначает синтез ИФНгамма против клеток-мишеней, не активированных никаким пептидом;
фиг. 4 - линейный график, показывающий специфичную активность ЦТЛ в отношении клетокмишеней, экспрессирующих ТОММ34 и НЬА-А*0201. Клетки линии С087, трансфицированные НЬАА*0201 или полноразмерным геном ТОММ34, были приготовлены в качестве контролей. Линия ЦТЛ, полученная с ТОММ34-А02-9-30 (8ЕЦ ГО N0: 1), показала специфичную активность ЦТЛ в отношении клеток С087, трансфицированных, как ТОММ34, так и НЬА-А*0201 (черный ромб). С другой стороны, никакой существенной специфичной активности ЦТЛ не было обнаружено в отношении клетокмишеней, экспрессирующих или НЬА-А*0201 (треугольник) или ТОММ34 (кружок).
Описание вариантов осуществления изобретения
Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, могут быть использованы при осуществлении или испытании вариантов осуществления настоящего изобретения, сейчас описываются предпочтительные способы, устройства и материалы. Однако прежде чем эти материалы и способы будут описаны, следует понимать, что эти описания являются только иллюстративными и не предполагается, что они являются ограничивающими. Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными размерами, формами, измерениями, материалами, методиками, протоколами и т.д., описанными здесь, так как они могут изменяться в результате стандарт- 5 028216 ных экспериментов и оптимизаций. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном описании, служит только для цели описания конкретных исполнений или вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначена для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения, который ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.
Все публикации, патенты или патентные заявки, упомянутые в этом описании, специально включены в настоящее изобретение путем ссылки полностью. Однако ни один из упомянутых здесь источников информации не следует рассматривать как допущение того, что настоящее изобретение не имеет право противопоставлять такое раскрытие как более раннее изобретение.
I. Определения.
Если не указано иное, то все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, какое обычно понимается специалистом в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае конфликта, настоящее описание, содержащее определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры приведены только в качестве иллюстраций, и не предполагается, что они являются ограничивающими.
Использование в настоящем описании единственного числа существительного означает по меньшей мере одно, если специально не указано иное.
Термины выделенный или очищенный, применяемые по отношению к веществу (например, пептиду, антителу, полинуклеотиду и т.д.), указывают на то, что это вещество практически не содержит, по меньшей мере, одно веществ, которое может также содержаться в естественном источнике. Так термин выделенный или очищенный пептид относится к пептиду, который практически не содержит клеточный материал, такой как углеводы, липиды или другие загрязняющие белки из клетки или ткани, из которых данный пептид был получен, или практически не содержит химических предшественников или других химических веществ, когда он синтезирован химически. Термин практически не содержит клеточный материал включает в себя препараты пептида, в которых этот пептид отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или рекомбинантно синтезирован. Таким образом, пептид, который практически не содержит клеточный материал, включает в себя препараты полипептида, содержащие менее примерно 30, 20, 10 или 5% (по сухой массе) гетерологичного белка (также именуемого здесь как загрязняющий белок). Когда пептид является рекомбинантно синтезированным, он также практически не содержит культуральной среды и включает в себя препараты пептида с содержанием культуральной среды менее примерно 20, 10 или 5% от объема пептидного препарата. Когда пептид получен путем химического синтеза, он предпочтительно практически не содержит химических предшественников или других химических веществ и включает в себя препараты пептида, содержащие химические предшественники или другие химические вещества, используемые для синтеза этого пептида, в количестве меньшем, чем примерно 30, 20, 10, 5% (по сухой массе) от объема пептидного препарата. То, что конкретный пептидный препарат содержит выделенный или очищенный пептид, может быть показано, например, наличием единственной зоны после электрофореза белкового препарата в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) и окрашивания этого геля кумасси бриллиантовым голубым или тому подобным способом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептиды и полинуклеотиды настоящего изобретения являются выделенными или очищенными.
Термины полипептид, пептид и белок используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо для обозначения полимера аминокислотных остатков. Эти термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков являются модифицированными остатками, или не встречающимися в природе остатками, такими как искусственные химические миметики соответствующих встречающихся в природе аминокислот, а также к встречающимися в природе аминокислотным полимерам.
Иногда используемый в настоящем описании термин олигопептид относится к пептидам настоящего изобретения, которые имеют 20 остатков или менее, как правило, 15 остатков или менее в длину и, как правило, состоят из примерно 8-11 остатков, часто из 9 или 10 остатков.
Используемый в настоящем изобретении термин аминокислота относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые выполняют функцию, аналогичную функции встречающихся в природе аминокислот. Аминокислота может быть или Ь-аминокислотой или Ό-аминокислотой. Встречающимся в природе аминокислотами являются те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые модифицируются после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гаммакарбоксиглутамат и О-фосфосерин). Термин аналог аминокислоты относится к химическим соединениям, которые имеют основную химическую структуру (альфа-углеродный атом, связанный с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и К-группой), такую же, как аминокислота, встречающаяся в природе, но имеет модифицированную К-группу или модифицированную основу (например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метил-метионин-сульфоний). Термин миметик аминокислоты относится к химическим соединениям, которые имеют различные структуры, но одинаковые функции с обычными аминокислотами.
Аминокислоты в настоящем изобретении могут также обозначаться своими общеизвестными трех- 6 028216 буквенными символами или однобуквенными символами, рекомендованными комиссией по биохимической номенклатуре ИЮПАК-МБС.
Термины ген, полинуклеотиды и нуклеиновые кислоты используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо и, если специально не указано иное, аналогично аминокислотам обозначаются своими общепринятыми однобуквенными кодами.
Предполагается, что используемый здесь термин композиция относится к продукту, содержащему определенные ингредиенты в определенных количествах, а также к любому продукту, который образуется прямо или опосредованно в результате комбинации определенных ингредиентов в определенных количествах. Предполагается, что этот термин по отношению к фармацевтической композиции относится к продукту, содержащему активный ингредиент(ы) и любой инертный ингредиент(ы), который является носителем, а также к любому продукту, который образуется прямо или опосредованно в результате комбинации, комплексирования или агрегирования любых двух или нескольких ингредиентов, или в результате диссоциации одного или нескольких ингредиентов, или в результате других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин фармацевтическая композиция относится к любой композиции, полученной путем смешивания химического соединения или вещества настоящего изобретения и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя.
Используемый в настоящем изобретении термин фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель означает фармацевтически или физиологически приемлемый материал, композицию, вещество, химическое соединение или наполнитель, включая, но не ограничиваясь, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующий материал.
Используемый здесь термин активный ингредиент относится к веществу в композиции, которое является биологически или физиологически активным. В частности, в контексте фармацевтической композиции термин активный ингредиент относится к веществу, которое обладает объективным фармакологическим эффектом. Например, в случае фармацевтических композиций для применения в лечении или предупреждении рака активные ингредиенты в этих композициях могут приводить по меньшей мере к одному биологическому или физиологическому действию на раковые клетки и/или ткани прямо или опосредованно. Предпочтительно такое действие может включать в себя уменьшение или подавление роста раковых клеток, повреждение или уничтожение раковых клеток и/или тканей и тому подобное. Как правило, опосредованным эффектом активных ингредиентов является индуцирование ЦТЛ, распознающих или уничтожающих раковые клетки. До начала приготовления композиции термин активный ингредиент может также именоваться как нерасфасованный ингредиент, действующее вещество или технический продукт.
Если не указано иное, то термин рак относится к различным типам рака, для которых характерна сверхэкспрессия гена ТОММ34, примеры которых включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
Если не указано иное, то термины цитотоксический Т-лимфоцит, цитотоксическая Т-клетка и ЦТЛ используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо и, если специально не указано иное, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые обладают способностью распознавать не свои клетки (например, опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки) и вызывать гибель таких клеток.
Если не указано иное, то термины НЬА-А2 относятся к типу НЬА-А2, содержащему субтипы, примеры которых включают в себя без ограничений НЬА-А*0201, НЬА-А*0202, НЬА-А*0203, НЬАА*0204, НЬА-А*0205, НЬА-А*0206, НЬА-А*0207, НЬА-А*0210, НЬА-А*0211, НЬА-А*0213, НЬАА*0216, НЬА-А*0218, НЬА-А*0219, НЬА-А*0228 и НЬА-А*0250.
Если не указано иное, то используемый в настоящем изобретении термин набор используется для обозначения комбинации реагентов и других материалов. В настоящем изобретении предполагается, что набор может включать в себя микрочип, чип, маркер и тому подобное. Не предполагается, что термин набор ограничен конкретной комбинацией реагентов и/или материалов.
Используемый в настоящем изобретении по отношению к субъекту или пациенту термин НЬАантиген субъекта (или пациента) представляет собой НЬА-А2 означает, что этот субъект или пациент имеет в гомозиготном или гетерозиготном состоянии ген антигена НЬА-А2 в качестве молекулы класса I ГКГС (главного комплекса гистосовместимости), и НЬА-А2 антиген экспрессируется в клетках этого субъекта или пациента в качестве НЬА-антигена.
В тех случаях, когда способы и композиции настоящего изобретения находят применение в контексте термина лечение рака, лечение считается эффективным, если оно приводит к клиническому результату, такому как уменьшение экспрессии гена ТОММ34, или уменьшение размера, распространенности или метастатического потенциала рака у субъекта. Когда лечение осуществляется в профилактических целях, то оно считается эффективным, если оно задерживает или предупреждает возникновение рака или предупреждает или ослабляет клинические симптомы рака. Эффективность определяется в сочетании с
- 7 028216 любым известным способом диагностики или лечения конкретного типа опухоли.
В тех случаях, когда способы и композиции настоящего изобретения находят применение в контексте терминов предупреждение и профилактика рака, такие термины используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо для обозначения любой активности, которая уменьшает уровень смертности или заболеваемости данного заболевания. Предупреждение и профилактика могут осуществляться на первичном, вторичном и третичном уровне предупреждения. В то время как первичное предупреждение и профилактика направлены на то, чтобы избежать развития заболевания, вторичный и третичный уровни предупреждения и профилактики включают в себя активности, направленные на предупреждение и профилактику прогрессирования заболевания и появления его симптомов, а также на уменьшение отрицательного влияния уже развившегося заболевания путем восстановления функции и уменьшения осложнений, связанных с заболеванием. В другом варианте, предупреждение и профилактика могут включать в себя широкий спектр профилактического лечения, направленного на облегчение тяжести конкретного расстройства, например, уменьшение пролиферации и метастазирования опухолей.
В контексте настоящего изобретения лечение и/или профилактика рака и/или предупреждение его послеоперационного рецидива включает в себя любые из следующих этапов, таких как хирургическое удаление раковых клеток, подавление роста раковых клеток, инволюция или регрессия опухоли, индуцирование ремиссии и подавление распространения рака, регрессия опухоли и уменьшение или подавление метастазирования. Эффективное лечение и/или профилактика рака снижает смертность и улучшает прогноз у лиц, имеющих рак, снижает уровни онкомаркеров в крови и ослабляет выявляемые симптомы, сопровождающие рак. Например, уменьшение или ослабление симптомов представляет собой эффективное лечение и/или профилактику, которые включают в себя уменьшение на 10, 20, 30% или более, или стабилизацию заболевания.
В контексте настоящего изобретения термин антитело относится к иммуноглобулинам или их фрагментам, которые специфично реагируют с определенным белком или его пептидом. Антитело может включать в себя человеческие антитела, приматизированные антитела, гибридные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или радиоактивными метками, и фрагменты антител. Кроме того, термин антитело используется в настоящем изобретении в самом широком смысле и в частности включает в себя интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), полученные из по меньшей мере двух интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они обладают желаемой биологической активностью. Термин антитело относится ко всем классам антител (например, 1дА, ΙβΌ. 1дЕ, 1дО и 1дМ).
Если не указано иное, то все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, какое обычно понимается специалистом в той области техники, к которой относится настоящее изобретение.
ΙΙ. Пептиды.
Пептиды настоящего изобретения, подробно описанные ниже, могут являться ТОММ34 пептидами.
Чтобы показать, что пептиды, полученные из ТОММ34, функционируют в качестве антигенов, распознаваемых ЦТЛ, пептиды, полученные из ТОММ34 (8ЕО ГО N0: 42), анализировали, чтобы определить являются ли они антигенными эпитопами, ограниченными НЬА-А2, который является часто встречающимся аллелем НЬА (Эа!е Υ. е! а1. Т15вие Аийдеив 47: 93-101, 1996; Копбо А. е! а1. 1. 1ттипо1. 155: 4307-12, 1995; КиЬо КТ. е! а1. 1. 1ттипо1. 152: 3913-24, 1994). Кандидаты связывающих НЬА-А2 пептидов, полученных из ТОММ34, были идентифицированы с использованием информации об их аффинности связывания с НЬА-А2. Были идентифицированы следующие кандидатные пептиды:
- 8 028216
ТОММ34-А02-9-30 (ЗЕО Ιϋ N0: 1),
ТОММ34-А02-9-77 (ЗЕО ΙΌ N0: 2),
ТОММ34-А02-9-52 (ЗЕО ΙΌ N0: 3),
ТОММ34-А02-9-1Ю (ЗЕО ΙΌ N0: 4),
ТОММ34-А02-9-220 (ЗЕО ΙΌ N0: 5),
ТОММ34-А02-9-230 (ЗЕО ΙΌ N0: 6),
ТОММ34-А02-9-103 (ЗЕО ΙΌ N0: 7),
ТОММ34-А02-9-80 (ЗЕО ΙΌ N0: 8),
ТОММ34-А02-9-255 (ЗЕО ΙΌ N0: 9),
ТОММ34-А02-9-23 (ЗЕО ΙΌ N0: 10),
ТОММ34-А02-9-195 (ЗЕО ΙΌ N0: 11),
ТОММ34-А02-9-111 (ЗЕО ΙΌ N0: 12),
ТОММ34-А02-9-238 (ЗЕО ΙΌ N0: 13),
ТОММ34-А02-9-1 (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 14),
ΤΟΜΜ34-Α02-9-113 (3Ε0 ΙΌ N0: 15) Λ
ΤΟΜΜ34-Α02-9-253 (3Ε0 ΙΌ N0: 16) ,
ΤΟΜΜ34-Α02-9-239 (3Ε0 ΙΌ N0: 17) ,
ΤΟΜΜ34-Α02-9-144 (3Ε0 ΙΌ N0: 18) ,
ΤΟΜΜ34-Α02-9-142 (3Ε0 ΙΌ N0: 19) ,
ΤΟΜΜ34-Α02-9-279 (3Ε0 ΙΌ N0: 20)
ТОММ34-А02-Ю-143 (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 21),
ТОММ34-А02-Ю-97 (3Ε0 ΙΌ N0: : 22) ,
ΤΟΜΜ34-Α02-10-79 (ЗЕО Ю N0: 23) ,
ТОММ34-А02-Ю-237 (3Ε0 Ю N0: 24) ,
ТОММ34-А02-Ю-135 (3Ε0 Ю N0: 25) ,
ТОММ34-А02-Ю-219 (3Ε0 Ю N0: 26) ,
ТОММ34-А02-Ю-238 (3Ε0 Ю N0: 27) ,
ТОММ34-А02-Ю-127 (3Ε0 Ю N0: 28) ,
ТОММ34-А02-Ю-113 (3Ε0 Ю N0: 29) ,
ТОММ34-А02-Ю-241 (3Ε0 Ю N0: 30) ,
ТОММ34-А02-Ю-30 (ЗЕО Ю N0: 31) ,
ТОММ34-А02-Ю-220 (3Ε0 Ю N0: 32) ,
ТОММ34-А02-Ю-195 (3Ε0 Ю N0: 33) ,
ТОММ34-А02-Ю-112 (3Ε0 Ю N0: 34) ,
ТОММ34-А02-Ю-194 (3Ε0 Ю N0: 35) ,
ТОММ34-А02-Ю-299 (3Ε0 Ю N0: 36) ,
ТОММ34-А02-Ю-141 (3Ε0 Ю N0: 37) ,
ΤΟΜΜ34-Α02-10-160 (3Ε0 Ю N0: 38) ,
ТОММ34-А02-Ю-175 (3Ε0 Ю N0: 39) и
ΤΟΜΜ34-Α02-10-186 (3Ε0 Ю N0: 40) .
Кроме того, после ίη νίΐτο стимуляции Т-клеток дендритными клетками (ДК), нагруженными этими пептидами, ЦТЛ успешно образовывались с использованием каждого из следующих пептидов:
ТОММ34-А02-9-30 (ЗЕО Ю ΝΟ: 1),
ТОММ34-А02-9-220 (ЗЕО Ю N0: 5),
ТОММ34-А02-Ю-30 (ЗЕО ΙΌ N0: 31) и ТОММ34-А02-Ю-220 (ЗЕО Ю N0: 32) .
Эти образованные ЦТЛ обладали сильной специфичной ЦТЛ активностью в отношении клетокмишеней, активированных соответствующими пептидами. Результаты, приведенные здесь, показывают, что ТОММ34 является распознаваемым ЦТЛ антигеном и что проанализированные пептиды являются ограниченными НЬА-А2 эпитопными пептидами ТОММ34.
Так как ген ТОММ34 сверхэкспрессируется в раковых клетка и тканях, включая без ограничений клетки и ткани ОМЛ, ХМЛ, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, колоректального рака, рака пищевода, рака печени, остеосаркомы, рака предстательной железы, почечноклеточной карциномы, МРЛ, НМРЛ и опухоли мягких тканей, но не экспрессируется в большинстве
- 9 028216 нормальных органов, то он является хорошей мишенью для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение относится к нонапептидам (пептидам, состоящим из девяти аминокислотных остатков) и декапептидам (пептидам, состоящим из десяти аминокислотных остатков) ЦТЛ-распознаваемых эпитопов ТОММ34. В другом варианте настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, который связывается с НЬА-антигеном и индуцирует цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), где этот пептид имеет аминокислотную последовательность (8ЕЦ ГО N0: 42) или является ее иммунологически активным фрагментом. В частности, настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 1, 5, 31 и 32. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к петидам, состоящим из аминокислотных последовательностей, выбранных из 8ЕЦ ГО N0: 1, 5, 31 и 32.
Как правило, программное обеспечение, доступное в настоящее время, например, в сети Интернет, такое как программное обеспечение, описанное в Рагкег К.С. е! а1. 1. 1ттипо1. 1994, 152(1) : 163-75, может быть использовано для вычисления аффинности связывания между различными пептидами и НЬАантигенами ίη 8т1тсо. Аффинность связывания с НЬА-антигенам может быть измерена как описано, например, в Рагкег К.С. е! а1. 1. 1ттипо1. 1994, 152(1): 163-75; и Κιιζιΐδΐιίιηα К. е! а1. В1ооб 2001, 98(6): 187281, Ьагкеп Μ.ν. е! а1. ВМС ВюшТогтабск. 2007; 8: 424, и Вии8 8. е! а1. Т188ие Апбдепк., 62:378-84, 2003. Способы определения аффинности связывания описаны, например, в Тйе 1оигпа1 о! 1ттипо1одюа1 Ме1кобк, 1995, 185: 181-190 и Рго!еш 8с1епсе, 2000, 9: 1838-1846. Поэтому можно с легкостью использовать такое программное обеспечение для выбора тех фрагментов, полученных из ТОММ34, которые обладают высокой аффинностью связывания с НЬА-антигенам. Таким образом, настоящее изобретение включает в себя пептиды, состоящие из любых фрагментов, полученных из ТОММ34, которые обладают высокой аффинностью связывания с НЬА-антигенам, определенной при помощи этих известных программ. Кроме того, такие пептиды могут включать в себя полноразмерную последовательность ТОММ34 (8ЕЦ ГО N0: 42).
Пептиды настоящего изобретения, в частности нонапептиды и декапептиды настоящего изобретения, могут быть фланкированы дополнительными аминокислотными остатками, при условии, что пептид сохраняет свою способность к индуцированию ЦТЛ. В частности, дополнительные аминокислотные остатки могут состоять из любого типа аминокислот, при условии, что они не ухудшают способность к индуцированию ЦТЛ исходного пептида. Таким образом, настоящее изобретение включает в себя пептиды, обладающие аффинностью связывания с НЬА-антигенам, в частности, включая пептиды, полученные из ТОММ34. Такие пептиды состоят, например, из менее чем примерно 40 аминокислот, часто из менее чем примерно 20 аминокислот, как правило, из менее чем примерно 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот.
В целом, известно, что модификации одной или нескольких аминокислот в пептиде не оказывают влияния на функцию этого пептида или, в некоторых случаях, даже усиливают желаемую функцию исходного белка. Более того, известно, что модифицированные пептиды (т.е. пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, модифицированной путем замены, удаления, вставки или добавления одного, двух или нескольких аминокислотных остатков в исходной стандартной последовательности) сохраняют биологическую активность исходного пептида (Магк е! а1. Ргос. №·ιΐ1. Асаб. 8сг И8А 1984, 81: 5662-6; 2о11ег апб 8нШк ШЛею АЛбк Кек. 1982, 10: 6487-500; Иа1Ьаб1е-МсРаг1апб е! а1. Ргос. №ч1. Асаб. 8с1. И8А 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения пептид, обладающий способностью к индуцированию ЦТЛ, настоящего изобретения может состоять из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО N0: 1, 5, 31 и 32, в которой одна, две или даже несколько аминокислот добавлены, удалены, вставлены и/или заменены.
Специалисту в данной области техники известно, что отдельные модификации (т.е. делеции, инсерции, добавления или замены) в аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент от всей аминокислотной последовательности, приводят к сохранению свойств исходной боковой цепи аминокислот, таким образом, это называется консервативная замена или консервативная модификация, когда в результате изменения белка образуется белок с аналогичными функциями. Таблицы консервативных замен с функционально аналогичными аминокислотами хорошо известны из уровня техники. Примерами свойств боковых цепей аминокислот являются гидрофобные аминокислоты (А, I, Ь, Μ, Р, Р, Υ, V), гидрофильные аминокислоты (К, Ό, N С, Е, О. С, Н, К, 8, Т), и боковые цепи, имеющие следующие функциональные группы или свойства в целом: алифатическая боковая цепь (С, А, V, Ь, I, Р); боковая цепь, содержащая гидроксильную группу, (8, Т, Υ); боковая цепь, содержащая атом серы, (С, М); боковая цепь, содержащая карбоновую кислоту и амид, (Ό, N Е, О); боковая цепь, содержащая основание, (К, К, Н) и боковая цепь, содержащая ароматическую группу (Н, Р, Υ, ^). Кроме того, каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга:
1) алании (А), глицин (С);
2) аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е);
3) аспарагин (N1, глутамин (О);
- 10 028216
4) аргинин (К), лизин (К);
5) изолейцин (I), лейцин (Ь), метионин (М), валин (V);
6) фенилаланин (Р), тирозин (Υ), триптофан (^);
7) серин (8), треонин (Т), и
8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, СгсщШоп. РгоЮтк 1984).
Предполагается, что такие консервативно модифицированные пептиды также являются пептидами настоящего изобретения. Однако пептиды настоящего изобретения не ограничиваются ими и могут включать в себя неконсервативные модификации при условии, что получаемый модифицированный пептид сохраняет способность к индуцированию ЦТЛ, присущую исходному немодифицированному пептиду. Кроме того, модифицированные пептиды не исключают ЦТЛ-индуцирующие пептиды полиморфных вариантов, межвидовых гомологов и аллелей ТОММ34.
Аминокислотные остатки могут быть вставлены, заменены или добавлены в пептиды настоящего изобретения или, в другом случае, аминокислотные остатки могут быть удалены из них, чтобы добиться более высокой аффинности связывания. Чтобы сохранить необходимую способность к индуцированию ЦТЛ, предпочтительно модифицировать (т.е. удалять, вставлять, добавлять или заменять) небольшое количество (например, 1, 2 или более) или небольшой процент аминокислот. В данном контексте термин несколько означает 5 или менее аминокислот, например 3 или менее. Процент модифицированных аминокислот может составлять 20% или менее, например 15% или менее, например 10% или менее, например от 1 до 5%.
Кроме того, такие аминокислотные остатки могут быть заменяющими или добавленными в пептиды для достижения более высокой аффинности связывания. При применении в иммунотерапии настоящие пептиды презентируются на поверхности клетки или экзосомы в виде комплекса с НЬА-антигеном. Кроме пептидов, которые презентируются в норме, так как уже известна закономерность последовательностей, презентируемых путем связывания с НЬА-антигенами (1. 1ттипо1. 1994, 152: 3913; 1ттиподепе!1С5 1995, 41: 178; 1. 1ттипо1. 1994, 155: 4307), модификации, основанные на такой закономерности, могут быть введены в иммуногенные пептиды настоящего изобретения.
Например, пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с НЬА-А2, как правило, имеют замену второй аминокислоты с Ν-конца на лейцин или метионин. Кроме того, пептиды, у которых Сконец заменен валином или лейцином, также могут быть с успехом использованы. Таким образом, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из 8ЕО ГО N0: 1, 5, 31 и 32, в которых вторая аминокислота с Ν-конца аминокислотной последовательности указанного 8Е0 ГО N0, заменена на лейцин или метионин, и/или С-конец аминокислотной последовательности указанного 8Е0 ГО N0 заменен валином или лейцином, включены в настоящее изобретение. Замены могут быть введены не только в области концевых аминокислот, но и в положение потенциального распознавания Т-клеточным рецептором (ТСК). В нескольких исследованиях было показано, что пептид с аминокислотными заменами может быть аналогичным или даже лучшим, чем исходный, например, САР1, р53(264-272), Нег-2/пеи(369377) или §ρ100(209-2ΐ7) (2атетЬа е! а1. Сапсег Ке8. 57, 4570-4577, 1997, Т.К. Нойтапп е! а1. 1. 1ттипо1. (20θ2); 168(3): 1338-47., 8.0. Эюппе е! а1. Сапсег 1ттипо1. нптипоШег. (2003) 52: 199-206 и 8.0. Эюппе е! а1. Сапсег 1ттипо1оду, 1ттипо!йегару (2004) 53, 307-314).
Настоящее изобретение также включает в себя добавление одной, двух или более аминокислот к N и/или С-концам настоящих пептидов. Такие модифицированные пептиды с высокой аффинностью связывания с НЬА-антигеном и сохраненной способностью к индуцированию ЦТЛ также включены в настоящее изобретение.
Например, настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, имеющему менее чем 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот в длину, который связывается с НЬА-антигеном, обладает способностью к индуцированию ЦТЛ и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
(ί) аминокислотная последовательность, выбранная из 8Е0 ГО N0: 1 и 5;
(ίί) аминокислотная последовательность, в которой одна, две или более аминокислот являются модифицированными в аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ГО N0: 1 и 5, и (ίίί) аминокислотная последовательность, указанная в (ίί), где аминокислотная последовательность обладает одной или обеими из следующих характеристик:
(a) вторая аминокислота с Оконца указанного 8Е0 ГО N0 выбрана из лейцина и метионина; и (b) С-концевая аминокислота указанного 8Е0 ГО N0 выбрана из валина и лейцина.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к выделенному пептиду, имеющему менее чем 15, 14, 13, 12 или 11 аминокислот в длину, который связывается с НЬА-антигеном, обладает способностью к индуцированию ЦТЛ и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
(Г) аминокислотная последовательность, выбранная из 8Е0 ГО N0: 31 и 32;
(ίί1) аминокислотная последовательность, в которой одна, две или более аминокислот являются модифицированными в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 31 и 32, и (ίίί1) аминокислотная последовательность, указанная в (ίί1), где аминокислотная последовательность обладает одной или обеими из следующих характеристик:
- 11 028216 (a) вторая аминокислота с Ν-конца указанного ЗЕД ГО N0 выбрана из лейцина и метионина; и (b) С-концевая аминокислота указанного ЗЕД ГО N0 выбрана из валина и лейцина.
Когда эти пептиды контактируют с АПК, эти пептиды связываются с НЬА-антигенами на АПК, чтобы быть презентированными на АПК в виде комплекса с НЬА-антигенами. В другом варианте, эти пептиды вводятся в АПК и процессируются в АПК до фрагментов, состоящих из аминокислотных последовательностей, выбранных из (ί)-(ίίί) и (ί')-(ίίί'), чтобы быть презентированными на АПК в виде комплекса с НЬА-антигенами. В результате индуцируются ЦТЛ, специфичные к таким пептидам.
Однако когда пептидная последовательность является идентичной части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего другую функцию, могут иметь место побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения или аллергические симптомы в отношении конкретных веществ. Поэтому, чтобы избежать ситуаций, при которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого петида, можно проводить поиск гомологии с использованием доступных баз данных. Когда в результате поиска гомологии становится ясно, что не существует пептида, отличающегося даже на 1 или 2 аминокислоты от целевого пептида, целевой пептид может быть модифицирован, чтобы повысить его аффинность связывания с НЬА-антигенам и/или повысить его способность к индуцированию ЦТЛ без какого-либо риска таких побочных эффектов.
Хотя ожидается, что пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с НЬА-антигенам, как описано выше, будут высоко эффективными, кандидатные пептиды, отобранные по наличию у них высокой аффинности связывания в качестве индикатора, далее исследуют на наличие способности к индуцированию ЦТЛ. В данном контексте термин способность к индуцированию ЦТЛ означает способность пептида индуцировать ЦТЛ, когда он презентирован на антигенпрезентирующих клетках (АПК). Кроме того, способность к индуцированию ЦТЛ включает в себя способность пептида индуцировать активацию ЦТЛ, пролиферацию ЦТЛ, стимулировать лизис ЦТЛ клеток-мишеней, и увеличивать синтез ИФН-гамма ЦТЛ.
Подтверждение способности к индуцированию ЦТЛ может быть осуществлено путем индуцирования АПК, несущих человеческие антигены ГКГС (например, В-клеток, макрофагов и дендритных клеток (ДК)) или, более конкретно, ДК, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и после стимуляции пептидами смешивания с СГО8-позитивны\1и Т-клетками и затем измерения количества ИФН-гамма, синтезированного и высвобожденного ЦТЛ против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы могут быть использованы трансгенные животные, которые были получены, чтобы экспрессировать человеческий НЬА-антиген (например, те, которые описаны в ВепМоЬатеб Ь., КгЫшап К., ЬопдтаЮ 1., Аиде С., Ьо\у Ь., Рптив 1., Ь|атопб Ό.Τ, Нит. 1ттипо1. 2000, 61(8): 764-79, Ке1а1еб Агбс1ев, Воокв, Ьткои! 1пбисйоп о£ СТЬ тевропве Ьу а тиита1 ерборе уассте ίη НЬА-А*0201ГОК1 Цапвдетс тюе: берепбепсе оп НЬА с1ав5 II гез1г1с1еП Т (Н) гевропве). Например, клетки-мишени могут быть радиоактивно меченными 51 Сг и тому подобным, и цитотоксическая активность может быть рассчитана по радиоактивности клеток-мишеней. В другом варианте она может быть изучена путем измерения количества ИФН-гамма, синтезированного и высвобожденного ЦТЛ в присутствии АПК, несущих иммобилизованные пептиды, и визуализации зоны подавления на среде с использованием анти-ИФН-гамма моноклональных антител.
Путем изучения способности к индуцированию ЦТЛ у пептидов, как описано выше, было обнаружено, что нонапептиды или декапептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 1, 5, 31 и 32, обладали особенно высокой способностью к индуцированию ЦТЛ, а также высокой аффинностью связывания с НЬА-антигеном. Таким образом, эти пептиды являются примерами предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.
Кроме того, анализ гомологии показал, что такие пептиды не обладают значительной гомологией с пептидами, полученными из любых других генетических продуктов человека. Таким образом, возможность неизвестных или нежелательных иммунных реакций, возникающих при применении их для иммунотерапии, может быть снижена. Поэтому также с этой точки зрения эти пептиды находят применение для установления иммунитета у онкологических пациентов в отношении ТОММ34. Таким образом, предпочтительными пептидами настоящего изобретения являются пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1, 5, 31 и 32.
Кроме обсуждаемых выше модификаций настоящих пептидов, пептиды настоящего изобретения могут быть соединены с другими пептидами при условии, что они сохраняют способность к индуцированию ЦТЛ и, более предпочтительно, также сохраняют необходимое связывание с НЬА. Примеры подходящих других пептидов включают в себя пептиды настоящего изобретения или ЦТЛ-индуцирующие пептиды, полученные из других ОАА. Линкеры между пептидами хорошо известны из уровня техники, например, ААУ (Р.М. ЬаПапап е1 а1. 1. Тгапв. Меб. 2007, 5:26), ААА, NΚКΚ (К.Р.М. §и1ти11ег е1 а1. 1. 1ттипо1. 2000, 165: 7308-7315) или К (8. 01а е1 а1. Сап. Кее. 62, 1471-1476, К.8. Кататига е1 а1. 1. 1ттипо1. 2002, 168: 5709-5715).
Например, пептиды отличные от опухолеассоциированного антигена ТОММ34 могут быть использованы практически одновременно для увеличения иммунного ответа через НЬА-антигены класса I и/или класса II. Хорошо известно, что раковые клетки могут экспрессировать более чем один опухолеассоции- 12 028216 рованный ген. Таким образом, в рамках обычного эксперимента специалист в данной области техники сможет определить, экспрессируются ли у конкретного субъекта дополнительные опухолеассоциированные гены и затем включить связывающие НЬА-антигены класса I и/или НЬА-антигены класса II пептиды, полученные из продуктов экспрессии таких генов, в содержащие ТОММ34 композиции или вакцины.
Примеры связывающих НЬА-антигены класса I и/или НЬА-антигены класса II пептидов известны специалистам в данной области техники (см., например, СоиНе, §!ет Се11в 13: 393-403, 1995), и, таким образом, их можно использовать в настоящем изобретении, аналогично тому, как раскрыто в этом источнике. Таким образом, специалист в данной области техники может легко получить полипептиды, содержащие один или более пептидов ТОММ34 и один или более пептидов, отличных от ТОММ34, или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, при помощи стандартных методов молекулярной биологии.
В настоящем изобретении вышеописанные пептиды относятся к политопам, т.е. группам из двух или более потенциально иммуногенных или стимулирующих иммунный ответ пептидов, которые могут быть соединены вместе в различном порядке (например, последовательно связываясь, перекрываясь). Политоп (или кодирующая политоп нуклеиновая кислота) может быть введен в стандартный протокол иммунизации, например животных, для проверки эффективности этого политопа в стимуляции, усилении и/или индуцировании иммунного ответа.
Для образования политопа пептиды могут быть соединены вместе непосредственно или при помощи фланкирующих последовательностей, и применение политопов в качестве вакцин хорошо известно из уровня техники (см., например, ТЬотвоп е! а1. Ргос. №!1. Асаб. δει. И8А 92(13): 5845-5849, 1995; Οί1Ьег! е! а1. №!иге Бю!есЬпо1. 15(12): 1280-1284, 1997; ТЬотвоп е! а1. I. Iттиηо1. 157(2): 822-826, 1996; Тагп е! а1. I. Ехр. Меб. 171(1) : 299-306, 1990). Политопы, содержащие различные количества и комбинации эпитопов, могут быть получены и проверены на распознавание ЦТЛ и на эффективность в повышении иммунного ответа.
Пептиды настоящего изобретения могут быть дополнительно соединены с другими веществами при условии, что они сохраняют способность к индуцированию ЦТЛ исходного пептида. Примеры подходящих веществ могут включать в себя пептиды, липиды, сахар и сахарные цепи, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Петиды могут иметь модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, при условии, что эти модификации не нарушают биологической активности пептидов, как описано здесь. Эти виды модификаций могут быть осуществлены с целью придать дополнительные функции (например, функцию направленности и функцию доставки), или чтобы стабилизировать полипептид.
Например, из уровня техники известно, что для того, чтобы повысить стабильность пептида ш У1уо, вводятся Ό-аминокислоты, миметики аминокислот или не встречающиеся в природе аминокислоты; этот подход также может быть применен в отношении настоящих полипетидов. Стабильность полипептида можно оценить несколькими способами. Например, пептиды и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка крови человека, могут быть использованы для проверки стабильности (см., например, УегкоеГ е! а1. Еиг. I. Όγη§ Ме!аЬ. РЬаттасокш. 1986, 11: 291-302).
Кроме того, как отмечалось выше, среди модифицированных пептидов, у которых заменено, удалено, вставлено или добавлено один два или более аминокислотных остатков, пептиды, обладающие такой же или более высокой активностью по сравнению с исходными пептидами, могут быть проскринированы и отобраны. Поэтому настоящее изобретение также относится к способу скрининга или отбора модифицированных пептидов, обладающих такой же или более высокой активностью по сравнению с исходными пептидами. Например, этот способ включает в себя этапы:
а: замены, удаления, вставки или добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка пептида настоящего изобретения,
Ь: определения активности указанного пептида, и с: выбора пептида, обладающего такой же или более высокой активностью по сравнению с исходным пептидом.
Здесь указанная активность может включать в себя ГКГС-связывающую активность, способность к индуцированию АПК или ЦТЛ и цитотоксическую активность.
Когда пептиды настоящего изобретения содержат цистеиновый остаток, эти пептиды имеют склонность к образованию димеров при помощи дисульфидной связи между §Н группами цистеиновых остатков. Поэтому димеры пептидов настоящего изобретения также включены в пептиды изобретения.
III. Получение пептидов ТОММ34.
Пептиды изобретения могут быть получены при помощи хорошо известных методов. Например, пептиды могут быть получены синтетически, при помощи технологии рекомбинантных ДНК или при помощи химического синтеза. Пептиды настоящего изобретения могут быть синтезированы по отдельности или в виде более длинных пептидов, включающих в себя два или более пептидов. Пептиды могут быть выделены, т.е. быть очищенными или выделенными практически не содержащими другие встречающиеся в природе белки клетки-хозяина и их фрагменты или любые другие химические вещества.
Пептиды настоящего изобретения могут иметь модификации, такие как гликозилирование, окисле- 13 028216 ние боковой цепи или фосфорилирование, при условии, что такие модификации не нарушают биологической активности исходного пептида. Другие иллюстративные модификации включают в себя введение Ό-аминокислот или других миметиков аминокислот, которые могут быть использованы для того, чтобы, например, увеличить время полужизни этих пептидов в сыворотке крови.
Пептиды настоящего изобретения могут быть получены при помощи химического синтеза, основанного на выбранной аминокислотной последовательности. Например, общепринятые способы синтеза пептидов, которые могут быть использованы для данного синтеза, включают в себя (ί) РерЫЛе ЗупкЬезтз, 1п£егзс1епсе, Νθμ Уогк, 1966;
ТЬе Ргокегпз, νοί. 2, АсаЛепмс Ргезз, Νθμ Уогк, 1976; Ρθρίίάθ Зупккезгз (на японском), Магигеп Со., 1975; Ваз1сз апс( Ехреггтепк о£ Ρθρίίάθ 5уп£]аез1з (на Магигеп Со., 1985;
ϋθνθίορπίθηί о£ Ρ)θΗΠΐΐΗθθΗ£ίθΗΐ5 (зесопЛ мо1ите) (на νοί. 14 (рер-ЫЛе зупкЬезгз) , Нггакама, 1991;
И099/67288; и (ϋ) (ίϋ) (ίν) японском), (V) японском), (νί) (νίί) Вагапу 6. & Мегг1£1е1Л Н.В., РеркгЛез νοί. 2, «Βοϊίά Рказе Ρθρίίάθ Зупккезгз», АсаЛетгс Ргезз, Νθμ Уогк, 1980, 100118 .
В другом варианте настоящие пептиды могут быть получены путем адаптации любого известного способа генной инженерии для получения пептидов (например, Μοιτίδοη I., I. ВаОегюЬду 1977, 132: 34951; С1агк-Сиг^ & Ειιιΐίδδ. Μеίйοάδ ίη Еηζутο1οду (ебз. Ж1 е! а1.) 1983, 101: 347-62). Например, сначала получают подходящий вектор, несущий полинуклеотид, кодирующий целевой пептид в экспрессируемой форме (например, после регуляторной последовательности, соответствующей промоторной последовательности), и этим вектором трансформируют подходящую клетку-хозяин. Такие векторы и клеткихозяева также включены в настоящее изобретение. Затем клетку-хозяин культивируют, чтобы получить целевой пептид. Пептид также может быть получен ίη νΐίΓο при помощи системы трансляции ΐη νΐίΓο.
IV. Полинуклеотиды.
Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, которые кодируют любой из вышеупомянутых пептидов настоящего изобретения. Они включают в себя полинуклеотиды, полученные из существующего в природе гена ТОММ34 (например, ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 42 (регистрационный номер в ΘеηВаηк ΝΜ_006809)), и полинуклеотиды, имеющие его консервативно модифицированные нуклеотидные последовательности. В настоящем изобретении термин консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность относится к последовательностям, которые кодируют идентичные или существенно идентичные аминокислотные последовательности. Благодаря вырожденности генетического кода любой конкретный белок кодирует большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, кодоны ОСА, ОСС, ОСО, и ОСИ все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором кодоном задается аланин, этот кодон может быть заменен любым соответствующим вышеописанным кодоном без изменения кодируемого полипептида. Такие изменения нуклеиновых кислот представляют собой молчащие замены, которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариантов. В настоящем изобретении каждая последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует пептид, также включает в себя все возможные молчащие замены этой нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области техники понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением АИО, который, как правило, является единственным кодоном для метионина, и ТОО, который, как правило, является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая молчащая замена в нуклеиновой кислоте, которая кодирует пептид, косвенно подразумевается в каждой раскрытой последовательности.
Полинуклеотиды настоящего изобретения могут состоять из ДНК, РНК и их производных. Как хорошо известно из уровня техники, молекула ДНК состоит из оснований, таких как встречающиеся в природе А, Т, С и О, и в РНК Т заменен на и. Специалисту в данной области техники понятно, что не встречающиеся в природе основания также могут входить в состав полинуклеотидов.
Полинуклеотиды настоящего изобретения могут кодировать несколько пептидов настоящего изобретения, как со вставочными аминокислотными последовательностями, так и без них. Например, вставочные аминокислотные последовательности могут обеспечивать сайт расщепления (например, последовательность, узнаваемая ферментом) полинуклеотида или транслированных пептидов. Кроме того, наряду с кодирующей последовательностью, кодирующей пептид настоящего изобретения, полинуклеотид может включать в себя любые дополнительные последовательности. Например, полинуклеотид может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид, который включает в себя регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии пептида, или может представлять собой экспрессионный вектор
- 14 028216 (плазмиду) с маркерными генами, и тому подобное. Как правило, такие рекомбинантные полинуклеотиды могут быть получены при помощи манипуляций с полинуклеотидами с применением общепринятых методик, использующих, например, полимеразы и эндонуклеазы.
И рекомбинантные технологии и методы химического синтеза могут быть использованы для получения полинуклеотидов настоящего изобретения. Например, полинуклеотид может быть получен путем вставки в соответствующий вектор, который может экспрессироваться, когда им трансфицируют компетентную клетку. В другом варианте, полинуклеотид может быть амплифицирован при помощи ПЦР технологий или экспрессирован в подходящих хозяевах (см., например, ЗатЬгоок с1 а1. Мо1еси1аг С1оти§: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу, №ν Уогк, 1989). В другом варианте полинуклеотид может быть синтезирован с использованием твердофазных методов, как описано в Веаисаде З.Ь. & 1уег К.Р., ТейаЬебгоп 1992, 48: 2223-311; МайЬев е1 а1. ЕМВ0 I. 1984, 3: 801-5.
V. Экзосомы.
Настоящее изобретение также относится к внутриклеточным везикулам, называемым экзосомами, которые презентируют комплексы, образованные между пептидами настоящего изобретения и НЬАантигенами, на своей поверхности. Экзосомы могут быть получены, например, при помощи способов, подробно описанных в заявке на патент Япониии (КоЬуо) номер публикации Не1 11-510507 и в международной патентной заявке \У0 99/03499, и могут быть получены с использованием АПК, полученных от пациентов, подлежащих лечению и/или профилактике. Экзосомы настоящего изобретения могут вводиться в виде вакцин, аналогично пептидам настоящего изобретения.
Тип НЬА-антигенов, входящих в комплексы, должен соответствовать типу субъекта, которому требуется лечение или профилактика. Например, для японской популяции наиболее распространенным является НЬА-А2, в частности НЬА-А*0201 и НЬА-А*0206, и поэтому он является подходящим для лечения японских пациентов. Использование типа НЬА-А2, который экспрессируется на высоком уровне в японской и европеоидной популяциях, является предпочтительным для получения эффективных результатов, и субтипы НЬА-А*0201 и НЬА-А*0206 находят применение. Как правило, в условиях клиники тип НЬА-антигена пациента, нуждающегося в лечении, определяют заранее, что позволяет сделать надлежащий выбор пептидов, обладающих высокой аффинностью связывания с этим антигеном, или обладающих способностью к индуцированию ЦТЛ посредством презентации антигена. Кроме того, для того чтобы получить пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания и способностью к индуцированию ЦТЛ, в части аминокислотной последовательности встречающегося в природе пептида ТОММ34 может быть произведена замена, делеция, инсерция или добавление одной, двух или нескольких аминокислот.
Когда экзосома настоящего изобретения в качестве НЬА-антигена имеет антиген типа НЬА-А2, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕЦ ГО N0: 1, 5, 31 и 32, являются наиболее эффективными.
VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК).
Настоящее изобретение также относится к выделенным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), которые презентируют комплексы, образованные между НЬА-антигенами и пептидами настоящего изобретения, на своей поверхности. АПК могут быть получены от пациентов, подлежащих лечению и/или профилактике, и могут вводиться в качестве вакцин сами по себе или в комбинации с другими лекарственными препаратами, включая пептиды настоящего изобретения, экзосомы или ЦТЛ.
АПК не ограничиваются конкретным видом клеток. Примеры АПК включают в себя без ограничений дендритные клетки (ДК), клетки Лангерганса, макрофаги, В-клетки и активированные Т-клетки, о которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности, чтобы быть распознанными лимфоцитами. Поскольку ДК являются представителями АПК, обладающими самым сильным ЦТЛ-индуцирующим действием среди всех АПК, ДК находят применение в качестве АПК настоящего изобретения.
Например, АПК настоящего изобретения могут быть получены путем индуцирования ДК из моноцитов периферической крови и затем контактирования (стимуляции) их пептидами настоящего изобретения ίη νΐΐΐΌ, ех У1уо или ίη У1уо. Когда пептиды настоящего изобретения вводятся субъектам, АПК, презентирующие пептиды настоящего изобретения, индуцируются в организме субъекта. Термин индуцирование АПК включает в себя контактирование (стимуляцию) клетки с пептидами настоящего изобретения, или введение полинуклеотида, кодирующего пептиды настоящего изобретения в клетку, презентирующую комплекс, образованный между НЬА-антигеном и пептидами настоящего изобретения, на клеточной поверхности. Таким образом, АПК настоящего изобретения могут быть получены путем забора АПК у субъекта после введения этому субъекту пептидов настоящего изобретения. В другом варианте, АПК настоящего изобретения могут быть получены путем контактирования полученных от субъекта АПК с пептидом настоящего изобретения.
АПК настоящего изобретения могут быть введены субъекту для индуцирования у этого субъекта иммунного ответа против рака, как сами по себе, так и в комбинации с другими лекарственными препаратами, включая пептиды, экзосомы или ЦТЛ настоящего изобретения. Например, введение ех У1уо может включать в себя этапы:
а: забор АПК у первого субъекта,
- 15 028216
Ь: контактирование АПК, полученных на этапе а, с пептидом, и с: введение АПК, полученных на этапе Ь, второму субъекту.
Первый субъект и второй субъект могут быть одним и тем же лицом, или могут быть разными лицами. АПК, полученные на этапе Ь, могут применяться в качестве вакцины для лечения и/или предупреждения различных типов рака, примеры которых включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
В контексте настоящего изобретения можно использовать пептиды настоящего изобретения для производства фармацевтической композиции или агента, способного индуцировать антигенпрезентирующие клетки. Способ или процесс производства фармацевтической композиции или агента для индуцирования антигенпрезентирующих клеток предложен в настоящем изобретении и предпочтительно включает в себя этап смешивания или введения в рецептуру пептида настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение также относится к применению пептидов настоящего изобретения для индуцирования антигенпрезентирующих клеток.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения АПК настоящего изобретения обладают высокой способностью к индуцированию ЦТЛ. В термине высокая способность к индуцированию ЦТЛ слово высокая означает, что способность к индуцированию ЦТЛ является относительно более сильной по сравнению с уровнем этой способности, отмечаемым без контакта АПК с пептидом. Такие АПК, обладающие высокой способностью к индуцированию ЦТЛ, могут быть получены способом, который включает в себя этап переноса полинуклеотида, кодирующего пептид настоящего изобретения в АПК ίη νίίτο, а также вышеупомянутым способом. Вводимые полинуклеотиды могут представлять собой ДНК или РНК. Примеры способов введения включают в себя без особых ограничений различные способы, традиционно используемые в данной области, например, могут быть использованы липофекция, электропорация и кальциево-фосфатный способ. Более конкретно, оно может быть осуществлено, как описано в Сапсег Кее. 1996, 56: 5672-7; 1. 1ттипо1. 1998, 161: 5607-13; 1. Ехр. Μβά. 1996, 184: 465-72; опубликованном японском переводе международной публикации №2000-509281. За счет переноса гена, кодирующего пептид настоящего изобретения, в АПК, этот ген подвергается в клетке транскрипции, трансляции и тому подобному, и затем полученный белок процессируются ГКГС класса I и ГКГС класса II и проходит через путь презентации, чтобы презентировать пептиды настоящего изобретения. В другом варианте АПК настоящего изобретения могут быть получены способом, который включает в себя этап контактирования АПК с пептидом настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения АПК настоящего изобретения презентируют комплексы НЬА-антигена и пептида настоящего изобретения на своей поверхности.
VII. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ).
ЦТЛ, индуцированные против любого из пептидов настоящего изобретения, усиливают иммунный ответ, направленный на раковые клетки, ίη νίνο, и, таким образом, они могут применяться в качестве вакцин аналогично пептидам сами по себе. Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенным ЦТЛ, которые специфично индуцированы или активированы любым из настоящих пептидов.
Такие ЦТЛ могут быть получены путем (1) введения пептида(ов) настоящего изобретения субъекту, (2) контактирования (стимуляции) ίη νίίτο полученных от субъекта АПК и СО8-позитивных Тлимфоцитов или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с пептидом(ами) настоящего изобретения, (3) контактирования ίη νίίτο СО8-позитивных Т-лимфоцитов или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с АПК или экзосомами, презентирующими на своей поверхности комплекс НЬАантигена и пептида настоящего изобретения, или (4) введения полинуклеотида/поинуклеотидов, кодирующих субъединицы Т-клеточного рецептора (ТСК), где ТСК, образованный такими субъединицами ТСК, способен связываться с комплексом НЬА-антигена и пептида настоящего изобретения на поверхности клетки. Такие АПК или экзосомы для способа (3) могут быть получены способами, писанными выше. Подробное описание способа (4) приводится ниже, в разделе VIII. Т-клеточный рецептор (ТСК).
ЦТЛ настоящего изобретения могут быть получены от пациентов, подлежащих лечению и/или профилактике, и могут вводиться сами по себе или в комбинации с другими лекарственными препаратами, включая пептиды настоящего изобретения или экзосомы, с целью регулирующего эффекта. Полученные ЦТЛ специфично действуют на клетки-мишени, презентирующие пептиды настоящего изобретения, например, те же пептиды, которые использовались для индуцирования. Клетки-мишени могут представлять собой клетки, которые эндогенно экспрессируют ТОММ34, такие как раковые клетки или клетки, трансфицированные геном ТОММ34; и клетки, которые презентируют пептид настоящего изобретения на клеточной поверхности, благодаря стимуляции пептидом, также могут служить в качестве мишеней для атаки активированных ЦТЛ.
В некоторых вариантах осуществления ЦТЛ настоящего изобретения представляют собой ЦТЛ, которые распознают клетки, презентирующие комплексы НЬА-А2-антигена и пептида настоящего изобретения на своей поверхности. По отношению к ЦТЛ термин распознают клетку означает связывание
- 16 028216 комплекса НЬА-А2-антигена и пептида настоящего изобретения на поверхности клетки через их ТСК и проявление специфичной цитотоксической активности в отношении этой клетки. В настоящем изобретении термин специфичная цитотоксическая активность относится к проявлению цитотоксической активности по отношению к клетке, презентирующей комплекс НЬА-А2-антигена и пептида настоящего изобретения, но не по отношению к другим клеткам.
VIII. Т-клеточный рецептор (ТСК).
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей полинуклеотид/полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, способные образовывать субъединицу Т-клеточного рецептора (ТСК), и способам ее применения. Такие субъединицы ТСК обладают способностью образовывать ТСК, которые придают Т-клеткам специфичность по отношению к раковым клеткам, экспрессирующим ТОММ34. Полинуклеотид/полинуклеотиды, кодирующие каждый из альфа- и бета-цепей субъединиц ТСК индуцированного пептидами настоящего изобретения ЦТЛ, могут быть идентифицированы при помощи известных из уровня техники способов (\У0 2007/032255 и Могдаи с1 а1. 1. Iттиηο1., 171, 3288 (2003)). Например, способ ПЦР является предпочтительным для анализа ТСК. ПЦР праймеры для анализа могут представлять собой, например, праймеры 5'-К (5'-д1с1ассаддсайсдсйса1-3') (δΕφ ГО N0: 43) в качестве 5'-концевых праймеров и праймеры 3-ТКа-С (5'-1садс1ддассасадссдсадсд1-3') (δΕφ ГО N0: 44), специфичные по отношению к С домену альфа цепи ТСК, праймеры 3-ТКЙ-С1 (5'-1садааа1ссШс1сйдас-3') (δΕφ ГО N0: 45), специфичные по отношению к С1 домену бета цепи ТСК, или праймеры 3-ТКЬс1а-С2 (5'-с1адсс1с1ддаа1ссШс1сй-3') (δΕφ ГО N0: 46), специфичные по отношению к С2 домену бета цепи ТСК, в качестве 3'-концевых праймеров, но не ограничиваются ими. Производные ТСК могут с высокой авидностью связываться с клетками-мишенями, презентирующими пептид ТОММ34 настоящего изобретения, и в некоторых случаях опосредовать эффективное уничтожение клеток-мишеней, презентирующих пептид ТОММ34 настоящего изобретения, ίη νίνο и ίη νίίτο.
Полинуклеотид/полинуклеотиды, кодирующие субъединицы ТСК (т.е. полинуклеотид, кодирующий обе субъединицы ТСК, или полинуклеотиды, кодирующие каждую из субъединиц ТСК), могут быть встроены в подходящие векторы, например в ретровирусные векторы. Эти векторы хорошо известны из уровня техники. Полинуклеотид или содержащий его вектор могут быть эффективно перенесены в Тклетку (например, в СО8-позитивную Т-клетку), например в Т-клетку, полученную от пациента. Предпочтительно, настоящее изобретение относится к готовой к применению композиции, позволяющей быстро осуществлять модификацию собственных Т-клеток пациента (или Т-клеток другого млекопитающего), для того чтобы быстро и легко получать Т-клетки, обладающие превосходными свойствами по уничтожению раковых клеток.
ТСК, специфичный в отношении пептида настоящего изобретения, представляет собой рецептор, способный специфично распознавать комплекс пептида настоящего изобретения и НЬЛ-антигена, придавая Т-клетке специфичную активность в отношении клетки-мишени, презентирующей комплекс пептида настоящего изобретения и НЬЛ-антигена, когда ТСК экспрессируется на поверхности Т-клетки. То что ЦТЛ, полученные путем введения полинуклеотида (ов), кодирующего такие субъединицы ТСК, могут специфично распознавать такие клетки-мишени, может быть подтверждено любым из известных способов. Предпочтительные примеры таких способов включают в себя, например, тетрамерный анализ с использованием НЬЛ-молекулы и пептида настоящего изобретения и Ε^I§РОТ-анализ. При помощи Би^РОТ-анализа можно подтвердить, что ЦТЛ, полученные вышеописанным способом, могут специфично распознавать клетки-мишени и что сигналы, генерируемые таким распознаванием, могут передаваться внутриклеточно. Кроме того, при помощи известных способов также может быть подтверждено, что ЦТЛ, полученные вышеописанным способом, обладают специфичной цитотоксической активностью в отношении клеток-мишеней. Примеры таких способов включают в себя, например, анализ высвобождения хрома с использованием клеток, экспрессирующих как НЬА-А2-антиген, так и ТОММ34.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к ЦТЛ, полученным путем трансдукции полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц ТСК (т.е. полинуклеотид, кодирующий обе субъединицы ТСК, или полинуклеотиды, кодирующие каждую из субъединиц ТСК), где ТСК, образованный такими субъединицами ТСК, способен связываться с комплексом пептида ТОММ34, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из δΕφ ГО N0: 1, 5, 31 и 32, и НЬАантигена на поверхности клетки.
Трансдуцированные ЦТЛ способны целенаправленно взаимодействовать с раковыми клетками ίη νίνο, и могут быть размножены при помощи хорошо известных способов культивирования ίη νίίτο (например, 1<а\уакапи с1 а1. ί. ^шипоЕ, 142, 3452-3461 (1989)). ЦТЛ настоящего изобретения могут применяться для получения иммуногенной композиции, пригодной или для лечения или для предупреждения рака у пациента, нуждающегося в лечение или профилактике, или для того и другого (\У0 2006/031221).
IX. Фармацевтические агенты или композиции.
Так как экспрессия ТОММ34 характерным образом повышена при различных типах рака, примеры которых включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей, по сравнению с нормальной тка- 17 028216 нью, пептиды или полинуклеотиды настоящего изобретения могут применяться для лечения и/или профилактики рака и/или предупреждения его послеоперационного рецидива. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическому агенту или композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики рака и/или предупреждения его послеоперационного рецидива, такая композиция включает в себя в качестве активного ингредиента один или более пептидов или полинуклеотидов настоящего изобретения в качестве активного ингредиента. В другом варианте настоящий пептид может быть экспрессирован на поверхности любой из вышеупомянутых экзосом или клеток, таких как АПК, для применения в качестве фармацевтических агентов или композиций. Кроме того, вышеупомянутые ЦТЛ, нацеленные на любой из пептидов настоящего изобретения, также могут применяться в качестве активного ингредиента настоящих фармацевтических агентов или композиций.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут применяться в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения термин вакцина (также именуемая как иммуногенная композиция) относится к композиции, которая имеет своей функцией улучшать, усиливать и/или индуцировать противоопухолевый иммунитет после введения животным.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут применяться для лечения и/или предупреждения рака и/или предупреждения его послеоперационного рецидива у субъектов или пациентов, включая человека и любое другое млекопитающее, включая без ограничений мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, корову, лошадь, мартышку, бабуина и шимпанзе, особенно коммерчески значимых животных или домашних животных.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению активного ингредиента в производстве фармацевтической композиции или агента для лечения рака или опухоли, указанный активный ингредиент выбран из:
(a) пептида настоящего изобретения;
(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как здесь описано, в экспрессируемой форме;
(c) АПК или экзосомы, презентирующей пептид настоящего изобретения на своей поверхности; и (к) цитотоксической Т-клетки настоящего изобретения.
В другом варианте настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту для применения в лечении и/или предупреждении различных типов рака и опухолей, указанный активный ингредиент выбран из:
(a) пептида настоящего изобретения;
(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как здесь описано, в экспрессируемой форме;
(c) АПК или экзосомы, презентирующей пептид настоящего изобретения на своей поверхности; и (к) цитотоксической Т-клетки настоящего изобретения.
В другом варианте настоящее изобретение также относится к способу или процессу производства фармацевтической композиции или агента для лечения или предупреждения рака или опухоли, где данный способ или процесс включает в себя этап составления рецептуры фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из:
(a) пептида настоящего изобретения;
(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как здесь описано, в экспрессируемой форме;
(c) АПК или экзосомы, презентирующей пептид настоящего изобретения на своей поверхности; и (к) цитотоксической Т-клетки настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу или процессу производства фармацевтической композиции или агента для лечения или предупреждения рака или опухоли, где данный способ или процесс включает в себя этапы смешивания активного ингредиента с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, где активный ингредиент выбран из:
(a) пептида настоящего изобретения;
(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как здесь описано, в экспрессируемой форме;
(c) АПК или экзосомы, презентирующей пептид настоящего изобретения на своей поверхности; и (к) цитотоксической Т-клетки настоящего изобретения. Фармацевтические агенты или композиции настоящего изобретения могут применяться для лечения и/или предупреждения рака и/или предупреждения его послеоперационного рецидива у субъектов или пациентов, включая человека и любое другое млекопитающее, включая без ограничений мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, корову, лошадь, мартышку, бабуина и шимпанзе, особенно коммерчески значимых животных или домашних животных.
В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из 5>Е0 ГО N0: 1, 5, 31 и 32, являются НЬА-А2 ограниченными эпитопными пептидами или кандидатами, которые могут вызывать сильный и специфичный иммунный ответ. Поэтому, настоящие фармацевтические агенты или композиции, содержащие любой из этих пептидов с аминокислотными последовательностями 5>Е0 ГО N0: 1, 5, 31 и 32, являются особенно пригодными для введения субъектам, чей НЬА-антиген представляет собой НЬА-А2. То же самое относится к фармацевтическим агентам или композициям, содержащим полинуклеотиды, кодирующие любой из этих пептидов (т.е. полинуклеотиды настоящего изобретения).
- 18 028216
Типы рака, подлежащие лечению с применением фармацевтических агентов или композиций настоящего изобретения, не ограничены и включают в себя любые типы рака, в которые вовлечен ТОММ34 (т.е. сверхэкспрессируется), включая без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
Фармацевтические агенты или композиции настоящего изобретения в дополнение к вышеупомянутым активным ингредиентам могут содержать другие пептиды, обладающие способностью индуцировать ЦТЛ против раковых клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие эти другие пептиды, другие клетки, презентирующие эти другие пептиды, или тому подобное. Примеры таких других пептидов, обладающих способностью индуцировать ЦТЛ против раковых клеток, включают в себя без ограничений специфичные для рака антигены (например, идентифицированные ОАА).
При необходимости фармацевтические агенты или композиции настоящего изобретения могут необязательно содержать в качестве активных ингредиентов другие терапевтические вещества, при условии, что эти вещества не подавляют противоопухолевое действие активного ингредиента, например, любого из настоящих пептидов. Например, рецептуры могут включать в себя противовоспалительные вещества или композиции, обезболивающие средства, химиотерапевтические препараты и тому подобное. Кроме включения других терапевтических веществ в сам лекарственный препарат, лекарственные препараты настоящего изобретения также могут вводиться последовательно или одновременно с одним или несколькими другими фармакологическими композициями. Количества лекарственного препарата и фармакологической композиции зависят, например, от используемого типа фармакологической композиции(ий), заболевания, подлежащего лечению, и схемы и пути введения.
Специалистам в данной области техники сразу будет понятно, что в дополнение к ингредиентам, конкретно упомянутым в настоящем изобретении, фармацевтические агенты или композиции настоящего изобретения могут дополнительно содержать другие стандартные в данной области техники вещества, имеющие отношение к типу рассматриваемого препарата (например, наполнители, связывающие вещества, разбавители и т.д.).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения настоящие фармацевтические агенты или композиции могут быть упакованы в изделия промышленного производства, например в виде наборов, содержащих материалы, пригодные для лечения патологических состояний или заболеваний, подлежащих лечению, например, рака. Изделия промышленного производства могут включать в себя контейнер с любым из настоящих фармацевтических агентов или композиций с этикеткой. Подходящие контейнеры включают в себя, флаконы, ампулы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. На этикетке на контейнере должны быть указаны агент или композиция, используемые для лечения или предупреждения одного или нескольких состояний или заболеваний. На этикетке также могут содержаться указания по введению и так далее.
Кроме вышеописанного контейнера, набор, содержащий фармацевтический агент или композицию настоящего изобретения, может при необходимости дополнительно включать в себя второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель. Он может дополнительно включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями по применению.
Фармацевтические композиции, если это желательно, могут быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которое может содержать одну или более единичных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, включать в себя металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями по применению.
(1) Фармацевтические агенты или композиции, содержащие пептиды в качестве активного ингредиента.
Пептиды настоящего изобретения могут вводиться непосредственно в качестве фармацевтического агента или композиции, или, при необходимости, могут быть включены в рецептуру препарата при помощи общеизвестных способов составления рецептур. В последнем случае в дополнение к пептидам настоящего изобретения в рецептуру по мере необходимости и без особых ограничений могут быть включены стандартно используемые в лекарственных препаратах носители, наполнители и тому подобное. Примерами таких носителей являются стерильная вода, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральная жидкость и тому подобное. Кроме того, фармацевтические агенты или композиции могут при необходимости содержать стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и тому подобное. Фармацевтические агенты или композиции настоящего изобретения могут применяться в противораковых целях.
Пептиды настоящего изобретения могут быть получены в комбинации, которая включает в себя два или более пептидов настоящего изобретения, чтобы индуцировать ЦТЛ ίη νίνο. Пептиды могут находиться в виде смеси или быть конъюгированы друг с другом с помощью стандартных методов. Например, пептиды могут быть химически соединены или экспрессированы в виде одной слитой полипептидной последовательности, которая может содержать одну или более аминокислот в качестве линкера (на- 19 028216 пример, лизиновый линкер: К.З. Кататига е1 а1. 1. 1ттипо1. 2002, 168: 5709-5715). Пептиды в комбинации могут быть одинаковыми или различными. При введении пептидов настоящего изобретения эти пептиды с высокой плотностью презентируются НЬА-антигенами на АПК, и затем индуцируются ЦТЛ, которые специфично реагируют с комплексом, образованным между презнтированным пептидом и НЬАантигеном. В другом варианте АПК (например, ДК) отбирают у субъекта и затем стимулируют пептидами настоящего изобретения, чтобы получить АПК, презентирующие любой из пептидов настоящего изобретения на своей клеточной поверхности. Эти АПК повторно вводят субъектам, чтобы индуцировать ЦТЛ у этих субъектов, и в результате может быть повышена агрессивность по отношению к опухолеассоциированному эндотелию.
Фармацевтические агенты или композиции для лечения и/или предупреждения рака, включающие в себя в качестве активного ингредиента любой из пептидов настоящего изобретения, могут дополнительно содержать адъювант для эффективного создания клеточного иммунитета, или они могут вводиться с другими активными ингредиентами, и они могут вводиться в составе препарата в виде гранул. Термин адъювант относится к химическому соединению, которое усиливает иммунный ответ против белка, когда вводиться вместе (или последовательно) с белком, обладающим иммунологической активностью. Адъювант, который может применяться, включает в себя адъюванты, описанные в литературе (СПп. ΜίсгоЫаТ Реу. 1994, 7: 277-89). Примеры адъювантов включают в себя фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, холерный токсин, токсин сальмонеллы, неполный адъювант Фрейнда (НАФ), полный адъювант Фрейнда (ПАФ), 1ЗС0Ма1п.х. ГМ-КСФ, СрС, эмульсию типа масло в воде и тому подобное, но не ограничиваются ими.
Кроме того, липосомные препараты, гранулярные препараты, в которых пептид связан с частицами диаметром несколько микрометров, и препараты, в которых липид связан с пептидом, могут быть эффективно использованы.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения пептиды настоящего изобретения могут также вводиться в виде фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительные примеры солей включают в себя соли щелочного металла, соли металла, соли органического основания, соли органической кислоты и соли неорганической кислоты. Используемый в настоящем изобретении термин фармацевтически приемлемая соль относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства химического соединения, и которые получаются путем реакции с неорганическими кислотами или основаниями, таким как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, птолуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические агенты или композиции настоящего изобретения могут дополнительно включать в себя компонент, подготавливающий ЦТЛ. Липиды были идентифицированы в качестве веществ или композиций, способных подготавливать ЦТЛ против вирусных антигенов ίη νίνο. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут быть присоединены к эпсилон- и альфа-аминогруппам остатка лизина и затем соединены с пептидом настоящего изобретения. Липидированный пептид затем может вводиться или непосредственно в мицеллу или частицу, включенную в липосому, или быть эмульгирован в адъюванте. Другим примером липидной подготовки ответа ЦТЛ являются липопротеины Е.соЬ, такие как З-глицерилцистеинил-серил-серин (Р3СЗЗ), которые, будучи ковалентно связанными с соответствующим пептидом, могут применяться для подготовки ЦТЛ (см., например, Бегее е1 а1. №-Циге 1989, 342: 561-4).
Примеры подходящих способов введения включают в себя, но не обязательно ограничиваются этим списком, пероральную, внутрикожную, подкожную, внутримышечную, внутрикостную, перитонеальную и внутривенную инъекцию и тому подобное, а также системное введение или местное введение в непосредственной близости от целевых областей. Введение можно осуществлять путем однократного введения или усиленного несколькими введениям. Доза пептидов настоящего изобретения может быть подобрана надлежащим образом в соответствии с заболеванием, подлежащим лечению, возрастом пациента, весом, способом введения и тому подобным, и, как правило, составляет от 0,001 до 1000 мг, например от 0,01 до 100 мг, например от 0,1 до 10 мг, например от 0,5 до 5 мг, и может вводиться один раз в течение периода времени от нескольких дней до нескольких месяцев. Специалист в данной области техники сможет надлежащим образом подобрать подходящую дозу.
(2) Фармацевтические агенты или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента.
Фармацевтические агенты или композиции настоящего изобретения могут также включать в себя нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, раскрытые в настоящем изобретении, в экспрессируемой форме. Используемый в настоящем изобретении термин в экспрессируемой форме означает, что полинуклеотид при введении в клетку будет экспрессироваться ίη νίνο в виде пептида, индуцирующего противоопухолевый иммунитет. В приводимом в качестве примера варианте осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты соответствующего полинуклеотида включает в себя регуляторные элементы, необходимые для экспрессии этого полинуклеотида. Полинуклеотид(ы) может быть сконструирован таким образом, чтобы обеспечить стабильное встраивание в геном клетки-мишени (см.,
- 20 028216 например, Тйотак К.К. & СарессЫ М.К., Се11 1987, 51: 503-12 для описания кассетных векторов для гомологичной рекомбинации). См., например, \Уо1ГГ е! а1. 8с1епсе 1990, 247: 1465-8; Патенты США №5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5736524; 5679647; и международная патентная заявка \У0 98/04720. Примеры основанных на ДНК методов доставки включают в себя доставку оголенной ДНК, облегченную (с бупивакаином, полимерами, посредством пептидов) доставку, доставку в составе катионных липидных комплексов и доставку посредством частиц (генная пушка) или давления (см., например, Патент США №5922687).
Пептиды настоящего изобретения также могут экспрессироваться вирусными или бактериальными векторами. Примеры экспрессионных векторов включают в себя ослабленные вирусы, такие как вирус осповакцины или вирус оспы кур. Данный подход предусматривает использование вируса осповакцины, например в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих пептид. После введения в хозяина рекомбинантный вирус осповакцины экспрессирует иммуногенный пептид, и таким образом вызывает иммунный ответ. Векторы на основе вируса осповакцины и способы, применяемые в протоколах иммунизации, описаны, например, в патенте США №4722848. Другим вектором является вектор на основе БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена). БЦЖ векторы описаны в 81оуег е! а1. №11иге 1991, 351: 456-60. Известно большое разнообразие других векторов, пригодных для терапевтического введения или иммунизации, например векторы на основе адено- или аденоассоциированного вируса, ретровирусные векторы, векторы на основе 8а1топе11а 1ур1й, векторы на основе обезвреженного сибиреязвенного токсина и тому подобное. См., например, 8йа1а е! а1. Мо1. Мей. Тойау 2000, 6: 66-71; 8йей1оск е! а1. 1. Ьеикос. Бю1. 2000, 68: 793-806; Шрр е! а1. 1п УКо 2000, 14: 571-85.
Доставка полинуклеотида пациенту может быть или непосредственной, и в этом случае пациент непосредственно подвергается воздействию несущего полинуклеотид вектора, или опосредованной, и в этом случае сначала клетки трансформируются целевым полинуклеотидом ίη уйго, а затем эти клетки пересаживают в организм пациента. Эти два подхода известны как ίη угуо и ех угуо генная терапия соответственно.
Общий обзор способов генной терапии см. в Со1Й8р1е1 е! а1. Сйтса1 Рйагтасу 1993, 12: 488-505; \Уи апй \Уи, ВюШегару 1991, 3: 87-95; ТокЮкйеу, Апп. Кеу. Рйагтасак Тохюо1. 1993, 33: 573-96; МиШдап, 8с1епсе 1993, 260: 926-32; Могдап & Апйегкоп, Апп. Кеу. Вюсйет. 1993, 62: 191-217; Тгепйк ш Вю1есйпо1оду 1993, 11(5): 155-215. Способы, общеизвестные в области технологий рекомбинантных ДНК, которые являются применимыми к настоящему изобретению описаны в Аи8иЬе1 е! а1. Сштеп1 РгоЮсой ш Мо1еси1аг Вю1оду, йойп \УПеу & 8оп§, 1993; и Кпедег, Сепе ТгапкГег апй Ехргеккюп, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 8ЮскЮп Рге88, ΚΥ, 1990.
Как и введение пептидов, введение полинуклеотидов может осуществляться путем пероральной, внутрикожной, подкожной, внутрикостной, перитонеальной и/или внутривенной инъекции и тому подобным способом, например, оно может осуществляться путем системного введения или местного введения в непосредственной близости от целевых областей. Введение можно осуществлять путем однократного введения или усиленного несколькими введениям. Доза полинуклеотида в подходящем носителе или клеток, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептиды настоящего изобретения, может быть подобрана надлежащим образом в соответствии с заболеванием, подлежащим лечению, возрастом пациента, весом, способом введения и тому подобным, и, как правило, составляет от 0,001 до 1000 мг, например от 0,01 до 100 мг, например от 0,1 до 10 мг, например от 0,5 до 5 мг, и может вводиться один раз в течение периода времени от нескольких дней до нескольких месяцев. Специалист в данной области техники сможет надлежащим образом подобрать подходящую дозу.
X. Способы применения пептидов, экзосом, АПК и ЦТЛ.
Пептиды и полинуклеотиды настоящего изобретения могут применяться для получения или индуцирования АПК и ЦТЛ. Экзосомы и АПК настоящего изобретения также могут применяться для индуцирования ЦТЛ. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и АПК могут применяться в комбинации с любыми другими химическими соединениями при условии, что эти дополнительные химические соединения не подавляют их способность к индуцированию ЦТЛ. Таким образом, любые из вышеупомянутых фармацевтических агентов или композиций настоящего изобретения могут применяться для индуцирования ЦТЛ. Кроме того, те агенты или композиции, которые содержат пептиды и полинуклеотиды, также могут применяться для индуцирования АПК, как описано ниже.
(1) Способ индуцирования антигенпрезентирующих клеток (АПК).
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования АПК, обладающих высокой способностью к индуцированию ЦТЛ, с применением пептидов или полинуклеотидов настоящего изобретения.
Способы настоящего изобретения включают в себя этап контактирования АПК с пептидами настоящего изобретения ш уйго, ех угуо или ш угуо. Например, способ контактирования АПК с пептидами ех угуо включает в себя этапы:
а: забора АПК у субъекта, и
Ь: контактирования АПК, полученных на этапе а, с пептидом настоящего изобретения.
АПК не ограничиваются конкретным видом клеток. Примеры АПК включают в себя без ограничений ДК, клетки Лангерганса, макрофаги, В-клетки и активированные Т-клетки, о которых известно, что
- 21 028216 они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности, чтобы быть распознанными лимфоцитами. Предпочтительным является применение ДК, так как они обладают самой сильной способностью к индуцированию ЦТЛ среди всех АПК. Любые пептиды настоящего изобретения могут применяться сами по себе или с другими пептидами настоящего изобретения.
С другой стороны, когда пептиды настоящего изобретения вводятся субъекту, то АПК контактируют с этими пептидами ш γί\Ό, следовательно, АПК, обладающие высокой способностью к индуцированию ЦТЛ, индуцируются в организме субъекта. Таким образом, способ настоящего изобретения может включать в себя введение пептидов настоящего изобретения субъекту. Аналогично, когда полинуклеотиды настоящего изобретения вводятся субъекту в экспрессируемой форме, то пептиды настоящего изобретения экспрессируются и контактируют с АПК ш γί\Ό, следовательно, АПК, обладающие высокой способностью к индуцированию ЦТЛ, индуцируются в организме субъекта. Таким образом, вместо вышеупомянутого этапа способ настоящего изобретения может включать в себя введение субъекту полинуклеотидов настоящего изобретения. Термин экспрессируемая форма объясняется выше в разделе IX. Фармацевтические агенты или композиции, (2) Фармацевтические агенты или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента.
В другом варианте способ настоящего изобретения может включать в себя введение полинуклеотида настоящего изобретения в АПК, чтобы индуцировать АПК, обладающую способностью к индуцированию ЦТЛ. Например, данный способ может включать в себя этапы:
а: забора АПК у субъекта, и
Ь: введения полинуклеотида, кодирующего пептид настоящего изобретения.
Этап Ь может быть выполнен, как описано выше в разделе VI. Антигенпрезентирующие клетки.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения антигенпрезентирующей клетки (АПК), которая специфично индуцирует активность ЦТЛ против ТОММ34, где данный способ включает в себя один из следующих этапов:
а: контактирование АПК с пептидом настоящего изобретения ш νίΙΐΌ, ех νί\Ό или ш νί\Ό; и
Ь: введение полинуклеотида, кодирующего пептид настоящего изобретения в АПК.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способам индуцирования АПК, обладающей способностью к индуцированию ЦТЛ, где данные способы включают в себя этап, выбранный из группы, состоящей из:
а: контактирования АПК с пептидом настоящего изобретения, и
Ь: введения полинуклеотида, кодирующего пептид настоящего изобретения в АПК.
Способы настоящего изобретения могут быть осуществлены ш νίΙΐΌ, ех νί\Ό или ш νί\Ό. Предпочтительно, способы настоящего изобретения могут быть осуществлены ш У1!го или ех νί\Ό. АПК, используемые для индуцирования АПК, обладающих способностью к индуцированию ЦТЛ, предпочтительно, могут представлять собой АПК, экспрессирующие НЬА-А2-антиген. Такие АПК могут быть получены хорошо известными из уровня техники способами из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных от субъекта, чей НЬА-антиген представляет собой НЬА-А2. АПК, индуцированные способом настоящего изобретения, могут представлять собой АПК, презентирующие комплекс пептида настоящего изобретения и НЬА-антигена (НЬА-А2-антигена) на своей поверхности. Когда АПК, индуцированные способом настоящего изобретения, вводятся субъекту, для того чтобы индуцировать у этого субъекта иммунный ответ против рака, то этот субъект предпочтительно является тем же субъектом, от которого были получены АПК. Однако этот субъект может быть субъектом, отличным от донора АПК, при условии, что этот субъект имеет тот же тип НЬА, что и донор АПК.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к агентам или композициям для применения при индуцировании АПК, обладающей способностью к индуцированию ЦТЛ, и такие агенты или композиции включают в себя один или более пептидов или полинуклеотидов настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению пептида настоящего изобретения или полинуклеотида, кодирующего этот пептид, в производстве агента или композиции, предназначенной для индуцирования АПК.
В другом варианте настоящее изобретение также относится к пептиду настоящего изобретения или полинуклеотиду, кодирующему этот пептид, для применения при индуцировании АПК, обладающей способностью к индуцированию ЦТЛ.
(2) Способ индуцирования ЦТЛ.
Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования ЦТЛ с применением пептидов, полинуклеотидов или экзосом или АПК настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования ЦТЛ с применением полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды (т.е. субъединицы ТСК), которые способны образовывать Т-клеточный рецептор (ТСК), способный распознавать комплекс пептидов настоящего изобретения и НЬА-антигенов. Предпочтительно, эти способы индуцирования ЦТЛ включают в себя по меньшей мере один этап, выбранный из:
а) контактирования СЭ8-позитивной Т-клетки с антигенпрезентирующей клеткой и/или экзосомой,
- 22 028216 которая презентирует на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида изобретения; и
Ь) введения в СЬ8-позитивную Т-клетку полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, которые способны образовывать ТСК, способный распознавать комплекс пептида настоящего изобретения и НЬА-антигена.
Когда пептиды, полинуклеотиды, АПК или экзосомы настоящего изобретения вводятся субъекту, то в организме субъекта индуцируются ЦТЛ, и сила иммунного ответа, направленного на раковые клетки, увеличивается. Таким образом, вместо вышеупомянутого этапа способы настоящего изобретения могут включать в себя этап введения субъекту пептидов, полинуклеотидов, АПК или экзосом настоящего изобретения.
В другом варианте ЦТЛ также могут быть индуцированы с применением их ех νίνο, и после индуцирования ЦТЛ активированные ЦТЛ обратно вводят субъекту. Например, данный способ может включать в себя этапы:
а: забора АПК у субъекта,
Ь: контактирования АПК, полученных на этапе а, с пептидом настоящего изобретения, и с: совместного культивирования АПК, полученных на этапе Ь, с СЬ8-позитивными Т-клетками. АПК, для совместного культивирования с СЬ8-позитивными Т-клетками на вышеуказанном этапе с, также могут быть получены путем переноса гена, включающего в себя полинуклеотид настоящего изобретения, в АПК, как описано выше в разделе VI. Антигенпрезентирующие клетки, хотя настоящее изобретение не ограничивается ими, и включает в себя любую АПК, которая эффективно презентирует на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида настоящего изобретения.
В некоторых случаях вместо вышеупомянутых АПК можно использовать экзосомы, презентирующие на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида настоящего изобретения. А именно, настоящее изобретение может включать в себя этап совместного культивирования экзосом, презентирующих на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида настоящего изобретения. Такие экзосомы могут быть получены способами, описанными выше в разделе V. Экзосомы.
Кроме того, ЦТЛ настоящего изобретения может быть индуцирован путем введения в СЬ8позитивную Т-клетку полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих субъединицы ТСК, где образованный такими субъединицами ТСК способен связываться с комплексом НЬА-антигена и пептида настоящего изобретения на поверхности клетки. Такая трансдукция может быть осуществлена, как описано выше в разделе VIII. Т-клеточный рецептор (ТСК).
Способы настоящего изобретения могут быть осуществлены ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο. Предпочтительно, способы настоящего изобретения могут быть осуществлены ίη νίίτο или ех νίνο. СЬ8позитивные Т-клетки, используемые для индуцирования ЦТЛ, могут быть получены хорошо известными из уровня техники способами из МКПК, полученных от субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения донором СЬ8-позитивных Т-клеток может быть субъект, чей НЬА-антиген представляет собой НЬА-А2. ЦТЛ, индуцированные способами настоящего изобретения, могут представлять собой ЦТЛ, способные распознавать клетки, презентирующие комплекс пептида настоящего изобретения и НЬА-антигена на своей поверхности. Когда ЦТЛ, индуцированные способом настоящего изобретения, вводятся субъекту, для того чтобы индуцировать у этого субъекта иммунный ответ против рака, то этот субъект предпочтительно является тем же субъектом, от которого были получены СЬ8-позитивные Тклетки. Однако этот субъект может быть субъектом, отличным от донора СЬ8-позитивных Т-клеток при условии, что этот субъект имеет одинаковый тип НЬА с донором СЬ8-позитивных Т-клеток.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу производства фармацевтической композиции, содержащей ЦТЛ, где данный способ включает в себя этап смешивания или введения в рецептуру пептида настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым носителем.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к агенту или композиции для индуцирования ЦТЛ, где агент или композиция включает в себя один или более пептидов, один или более полинуклеотидов или одну или более АПК или экзосом настоящего изобретения.
В другом варианте настоящее изобретение относится к применению пептида, полинуклеотида или АПК или экзосомы настоящего изобретения в производстве агента или композиции, предназаначенной для индуцирования ЦТЛ.
В другом варианте настоящее изобретение также относится к пептиду, полинуклеотиду или АПК или экзосоме настоящего изобретения для применения в индуцировании ЦТЛ.
(3) Способ индуцирования иммунного ответа.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа против заболеваний, связанных с ТОММ34. Подходящие заболевания включают в себя рак, примеры которого включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
Способы настоящего изобретения включают в себя этап введения агентов или композиций, содержащих любой из пептидов настоящего изобретения или кодирующих их полинуклеотидов. В другом варианте способ настоящего изобретения может включать в себя этап введения экзосом или АПК, презен- 23 028216 тирующих любой из пептидов настоящего изобретения. Подробнее см. параграф IX. Фармацевтические агенты или композиции, в частности раздел, описывающий применение фармацевтических агентов или композиций настоящего изобретения в качестве вакцин. Кроме того, экзосомы и АПК, которые могут применяться в настоящих способах для индуцирования иммунного ответа, подробно описаны выше в параграфах V. Экзосомы, VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК) и пп.(1) и (2) параграфа X. Способы применения пептидов, экзосом, АПК и ЦТЛ.
Настоящее изобретение также относится к способу или процессу производства фармацевтического агента или композиции, индуцирующей иммунный ответ, где данный способ включает в себя этап смешивания или введения в рецептуру пептида настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым носителем.
В другом варианте способ настоящего изобретения может включать в себя этап введения вакцины или фармацевтической композиции настоящего изобретения, которая содержит:
(a) пептид настоящего изобретения;
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид, как здесь описано, в экспрессируемой форме;
(c) АПК или экзосому, презентирующую пептид настоящего изобретения на своей поверхности;
или (б) цитотоксическую Т-клетку настоящего изобретения.
В контексте настоящего изобретения этими активными ингредиентами можно лечить рак, при котором имеет место сверхэкспрессия ТОММ34. Примеры такого рака включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей. Таким образом, до введения вакцин или фармацевтических композиций, содержащих активные ингредиенты, предпочтительно убедиться в том, что уровень экспрессии ТОММ34 в клетках или тканях, подлежащих лечению, повышен по сравнению нормальными клетками того же органа. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака, при котором имеет место сверхэкспрессия ТОММ34, данный способ может включать в себя этапы:
ί) определения уровня экспрессии ТОММ34 в клетках или ткани(ях), полученных от субъекта, имеющего подлежащий лечению рак;
ίί) сравнения уровня экспрессии ТОММ34 с нормальным контролем; и ίίί) введения по меньшей мере одного компонента, выбранного из вышеуказанных (а)-(б), субъекту, имеющему рак, при котором имеет место сверхэкспрессия ТОММ34 по сравнению с нормальным контролем.
В другом варианте настоящее изобретение относится к вакцине или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из вышеуказанных (а)-(б), для применения при введении субъекту, имеющему рак, при котором имеет место сверхэкспрессия ТОММ34. Другими словами, настоящее изобретение также относится к способу выявления субъекта, подлежащего лечению полипептидом ТОММ34 настоящего изобретения, такой способ включает в себя этап определения уровня экспрессии ТОММ34 в полученных от субъекта клетках или ткани(ях), при котором повышение уровня по сравнению с уровнем экспрессии этого гена в нормальном контроле указывает на то, что субъект имеет рак, который можно лечить полипептидом ТОММ34 настоящего изобретения. Способы лечения рака в соответствии с настоящим изобретением более подробно описаны ниже.
Любая полученная от субъекта клетка или ткань может быть использована для определения экспрессии ТОММ34, при условии, что она содержит целевой продукт транскрипции или трансляции ТОММ34. Примеры подходящих образцов включают в себя без ограничений ткани и жидкости организма, такие как кровь, слюна и моча. Предпочтительно, образцы полученной от субъекта клетки или ткани содержат клеточную популяцию, включающую в себя эпителиальную клетку, более предпочтительно, раковую эпителиальную клетку или эпителиальную клетку, полученную из предположительно раковой ткани. Далее, при необходимости, клетка может быть очищена от полученных тканей и жидкостей организма, и затем использована в качестве полученного от субъекта образца. Субъект, подлежащий лечению настоящим способом, предпочтительно является млекопитающим. Приводимые в качестве примеров млекопитающие включают в себя без ограничений, например, человека, примата, кроме человека, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь и корову.
В соответствии с настоящим изобретением определяют уровень экспрессии ТОММ34 в клетках или тканях, полученных от субъекта. Уровень экспрессии можно определить на уровне продукта транскрипции (нуклеиновая кислота) при помощи способов, известных из уровня техники. Например, количественное определение мРНК ТОММ34 можно осуществлять с использованием зондов способами гибридизации (например, Нозерн-гибридизации). Детекцию можно осуществлять на чипе или матрице. Использование матрицы для детекции уровня экспрессии ТОММ34 является предпочтительным. Специалисты в данной области техники могут синтезировать такие зонды, используя информацию о последовательности ТОММ34. Например, кДНК ТОММ34 может использоваться в качестве зондов. При необходимости зонды могут быть помечены подходящей меткой, такой как красители, флуоресцентные вещества и изото- 24 028216 пы, и уровень экспрессии гена может быть определен как интенсивность гибридизированных меток.
Кроме того, количественное определение продукта транскрипции ТОММ34 можно проводить с использованием праймеров способами обнаружения, основанными на амплификации (например, ОТ-ПЦР). Такие праймеры могут быть получены на основе доступной информации о последовательности гена.
В частности, зонд или праймер, используемый в настоящем способе, гибридизуется с мРНК ТОММ34 в жестких, умеренно жестких или нежестких условиях. Используемый в настоящем изобретении термин жесткие условия (гибридизации) относится к условиям, при которых зонд или праймер будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью, но не с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и будут различаться при различных обстоятельствах. Специфичная гибридизация более длинных последовательностей наблюдается при более высоких температурах, чем гибридизация более коротких последовательностей. Как правило, температура жестких условий выбирается таким образом, чтобы она была примерно на 5°С ниже, чем температура плавления (Тт) конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Тт является температурой (при определенной ионной силе, значении рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных своей целевой последовательности, гибридизуются с этой целевой последовательностью в состоянии равновесия. Так как целевые последовательности, как правило, присутствуют в избытке, при Тт 50% зондов находятся в состоянии равновесия. Как правило, жестким условиями будут являться те, при которых концентрация составляет менее примерно 1,0М иона натрия, как правило, примерено от 0,01 до 1,0М иона натрия (или других солей), при значении рН от 7,0 до 8,3 и температуре по меньшей мере примерно 30°С для коротких зондов или праймеров (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°С для более длинных зондов или праймеров. Жесткие условия также могут быть созданы путем добавления дестабилизирующих веществ, таких как формамид.
Зонд или праймер настоящего изобретения, как правило, представляет собой практически полностью очищенный олигонуклеотид. Этот олигонуклеотид, как правило, включает в себя участок нуклеотидной последовательности, который гибридизуется в жестких условиях со следующими друг за другом, по меньшей мере, примерно 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 или 25 нуклеотидами смысловой цепи нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, включающей в себя последовательность ТОММ34, или антисмысловой цепи нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, включающей в себя последовательность ТОММ34, или встречающегося в природе мутанта этих последовательностей. В частности, например, в предпочтительном варианте осуществления изобретения олигодуклеотид длиной 5-50 нуклеотидов может использоваться в качестве праймера для амплификации генов, которые необходимо определить. Более предпочтительно, мРНК или кДНК гена ТОММ34 можно определить с помощью олигонуклеотидного зонда или праймера определенного размера, как правило, длиной 15-30 оснований. Размер может находиться в диапазоне от по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 12 нуклеотидов, по меньшей мере 15 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов по меньшей мере 30 нуклеотидов, и зонды и праймеры могут иметь размер в диапазоне 5-10 нуклеотидов, 10-15 нуклеотидов, 15-20 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов и 25-30 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения длина олигонуклеотидного зонда или праймера может быть выбрана в диапазоне 15-25 нуклеотидов. Процедуры анализа, устройства или реагенты для определения гена при помощи такого олигонуклеотидного зонда или праймера хорошо известны (например, олигонуклеотидный микрочип или ПЦР). В этих анализах зонды и праймеры могут также включать в себя последовательности метки или линкера. Кроме того, для регистрации сигнала зонды или праймеры могут быть модифицированы с помощью детектируемой метки или аффинного лиганда. В другом варианте в методах, основанных на гибридизационной детекции, полинуклеотид, имеющий длину от нескольких сотен (например, примерно 100-200) оснований до нескольких тысяч (например, примерно 1000-2000) оснований, также может быть использован в качестве зонда (например, в нозерн-блоттинг анализе или в анализе на кДНК микрочипе).
В другом варианте для диагностики в настоящем изобретении может определяться продукт трансляции. Например, может определяться количество белка ТОММ34 (8ЕО ГО N0: 42) или его иммунологического фрагмента. Способы определения количества белка как продукта трансляции включают в себя способы иммунологического анализа, в которых используется антитело, специфично распознающее этот белок. Это антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, любой фрагмент или модификация (например, гибридное антитело, ксРу, РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν и т.д.) этого антитела может быть использован для обнаружения, при условии, что этот фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связываться с белком ТОММ34. Такие антитела против пептидов настоящего изобретения и их фрагменты также включены в настоящее изобретение. Способы получения этих видов антител для обнаружения белков хорошо известны из уровня техники, и любой способ может быть использован в настоящем изобретении для получения таких антител и их эквивалентов.
Еще одним способом определения уровня экспрессии гена ТОММ34, на основе продукта его трансляции, является интенсивность окрашивания, которая может быть измерена при помощи иммуногистохимического химического анализа с использованием антитела против белка ТОММ34. А именно, при
- 25 028216 этом измерении сильное окрашивание указывает на повышенное присутствие/уровень белка и в то же время на высокий уровень экспрессии гена ТОММ34.
Уровень экспрессии целевого гена, например гена ТОММ34, в раковых клетках может считаться повышенным, если этот уровень повышен по сравнению с контрольным уровнем (например, уровнем в нормальных клетках) целевого гена, например, на 10, 25 или 50%; или повышен более чем в 1,1 раза, более чем в 1,5 раза, более чем в 2,0 раза, более чем в 5,0 раз, более чем в 10,0 раз или более.
В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, определенный в заведомо нераковом биологическом образце, рассматривается как нормальный контрольный уровень. С другой стороны, если контрольный уровень определяется в раковом биологическом образце, то он рассматривается как раковый контрольный уровень. Различие между уровнем экспрессии в образце и контрольным уровнем может быть нормировано по уровню экспрессии контрольных нуклеиновых кислот, например генов домашнего хозяйства, об уровнях экспрессии которых известно, что они не изменяются в зависимости от ракового или неракового состояния клетки. Примеры контрольных генов включают в себя без ограничений бета-актин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и рибосомный белок Р1.
Контрольный уровень может быть определен одновременно с раковыми клетками с использованием образца(ов), предварительно отобранных с последующим хранением у субъекта/субъектов, чье состояние заболевания (раковое или нераковое) является известным. Кроме того, нормальные клетки, полученные из нераковых участков органа, имеющего подлежащий лечению рак, могут быть использованы в качестве нормального контроля. В другом варианте контрольный уровень может быть определен статистическим методом на основе результатов, полученных с помощью анализа ранее определенного уровня экспрессии гена ТОММ34 в образцах, отобранных у субъектов с известной стадией заболевания. Кроме того, контрольный уровень может быть получен из базы данных уровней экспрессии ранее исследованных клеток. Кроме того, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, уровень экспрессии гена ТОММ34 в биологическом образце можно сравнить с несколькими контрольными уровнями, определенными в нескольких контрольных образцах.
Предпочтительно использовать контрольный уровень, определенный в контрольном образце, полученном из типа ткани, аналогичного типу ткани биологического образца, полученного от субъекта. Кроме того, предпочтительно использовать стандартное значение уровня экспрессии гена ТОММ34 в популяции с известным состоянием заболевания. Стандартное значение может быть получено любым способом, известным из уровня техники. Например, в качестве стандартного значения могут быть использованы размах средней ±2 СКО или средняя ±3 СКО.
В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, определенный в заведомо нераковом биологическом образце, рассматривается как нормальный контрольный уровень. С другой стороны, если контрольный уровень определяется в раковом биологическом образце, то он рассматривается как раковый контрольный уровень.
Когда уровень экспрессии гена ТОММ34 является повышенным по сравнению с контрольным уровнем, или является аналогичным/эквивалентным раковому контрольному уровню, то можно заключить, что у субъекта имеется рак, подлежащий лечению.
Настоящее изобретение также относится к способу (ί) диагностики того, имеет ли субъект рак, подлежащий лечению, и/или (ίί) выбора субъекта для лечения рака, данный способ включает в себя этапы:
a) определения уровня экспрессии ТОММ34 в клетках или ткани(ях), полученных от субъекта, у которого предполагается наличие подлежащего лечению рака;
b) сравнения уровня экспрессии ТОММ34 с нормальным контрольным уровнем;
c) вынесения заключения о том, что субъект имеет подлежащий лечению рак, если уровень экспрессии ТОММ34 является повышенным по сравнению с нормальным контрольным уровнем; и
ά) выбора субъекта для лечения рака, если на этапе с) было сделано заключение о том, что субъект имеет подлежащий лечению рак.
В другом варианте такой способ включает в себя этапы:
a) определения уровня экспрессии ТОММ34 в клетках или ткани(ях), полученных от субъекта, у которого предполагается наличие подлежащего лечению рака;
b) сравнения уровня экспрессии ТОММ34 с раковым контрольным уровнем;
c) вынесения заключения о том, что субъект имеет подлежащий лечению рак, если уровень экспрессии ТОММ34 является аналогичным или эквивалентным раковому контрольному уровню; и
ά) выбора субъекта для лечения рака, если на этапе с) было сделано заключение о том, что субъект имеет подлежащий лечению рак.
Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для диагностики или определения субъекта, который страдает или предположительно страдает от рака, подлежащего лечению полипептидом ТОММ34 настоящего изобретения, этот набор также может применяться для оценки прогноза ракового заболевания и/или мониторинга эффективности или применимости терапии рака, в частности иммунотерапии рака. Иллюстративные примеры подходящих типов рака включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ,
- 26 028216
НМРЛ и опухоль мягких тканей. Более конкретно, набор предпочтительно включает в себя по меньшей мере один реагент для определения экспрессии гена ТОММ34 в полученной от субъекта клетке, такой реагент выбран из группы:
(a) реагент для обнаружения мРНК гена ТОММ34;
(b) реагент для обнаружения белка ТОММ34 или его иммунологического фрагмента; и (c) реагент для обнаружения биологической активности белка ТОММ34.
Примеры реагентов, подходящих для обнаружения мРНК гена ТОММ34, включают в себя нуклеиновые кислоты, которые специфично связываются с или распознают мРНК ТОММ34, такие как олигонуклеотиды, обладающие последовательностью, комплементарной части мРНК ТОММ34. Примерами олигонуклеотидов такого типа являются праймеры и зонды, специфичные по отношению к мРНК ТОММ34. Олигонуклеотиды этого типа могут быть получены способами, хорошо известными из уровня техники. При необходимости, реагент для обнаружения мРНК гена ТОММ34 может быть иммобилизован на твердой подложке. Кроме того, в состав набора может быть включено более одного реагента для обнаружения мРНК гена ТОММ34.
С другой стороны, примеры реагентов, подходящих для обнаружения белка ТОММ34 или его иммунологического фрагмента, могут включать в себя антитела к белку ТОММ34 или его иммунологическому фрагменту. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, любой фрагмент или модификация (например, гибридное антитело, всРу, РаЬ, Р(аЬ')2, Ру и т.д.) этого антитела может использоваться в качестве реагента при условии, что этот фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связываться с белком ТОММ34 или его иммунологическим фрагментом. Способы получения этих видов антител для обнаружения белков хорошо известны из уровня техники, и любой способ может быть использован в настоящем изобретении для получения таких антител и их эквивалентов. Кроме того, антитела могут быть помечены генерирующими сигнал молекулами через непосредственное связывание или при помощи опосредованного способа мечения. Метки и способы мечения антител и обнаружения связывания антител с их мишенями являются хорошо известными из уровня техники, и любые метки и способы могут применяться в настоящем изобретении. Кроме того, в состав набора может быть включено более одного реагента для обнаружения белка ТОММ34.
Набор может содержать более одного из вышеупомянутых реагентов. Набор может дополнительно включать в себя твердую подложку и реагент для связывания зонда к гену ТОММ34 или антитела к пептиду ТОММ34, среду и контейнер для культивирования клеток, реагенты положительного и отрицательного контроля, вторичное антитело для обнаружения антитела против пептида ТОММ34. Например, образцы ткани, полученные от субъектов без рака, или страдающих от рака, могут служить хорошими контрольными реагентами. Набор настоящего изобретения может также включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши (например, письменные, на пленке, СЭ-К0М и т.д.) с инструкциями по применению. Эти реагенты и тому подобное могут храниться в контейнере с этикеткой. Подходящие контейнеры включают в себя, флаконы, ампулы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда реагент представляет собой зонд к мРНК ТОММ34, этот реагент может быть иммобилизован на твердой подложке, такой как пористая полоска, образуя по меньшей мере один участок обнаружения. Область измерения или обнаружения пористой полоски может включать в себя большое количество участков, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту (зонд). Тест-полоска может также содержать участки отрицательного и/или положительного контролей. В другом варианте контрольные участки могут быть расположены на полоске отдельной от тест-полоски. При необходимости различные участки обнаружения могут содержать различные количества иммобилизованных нуклеиновых кислот, т.е. более высокое количество в первом участке обнаружения и меньшие количества в последующих участках. После добавления исследуемого образца число участков, дающих детектируемый сигнал, обеспечивает количественное определение количества мРНК ТОММ34, присутствующей в образце. Участки обнаружения могут иметь любую удобную для обнаружения форму, как правило, форму полосок или точек, расположенных по всей ширине тест-полоски.
Набор настоящего изобретения может дополнительно включать в себя положительный контрольный образец или стандартный образец ТОММ34. Положительный контрольный образец настоящего изобретения может быть получен путем сбора ТОММ34-положительных образцов и последующего определения у них уровня ТОММ34. В другом варианте для получения положительного образца или стандартного образца ТОММ34 очищенный белок или полинуклеотид ТОММ34 быть добавлен к клеткам, которые не экспрессируют ТОММ34. В настоящем изобретении очищенный ТОММ34 может представлять собой рекомбинантный белок. Уровень ТОММ34 положительного контрольного образца является, например, большим, чем значение точки разделения.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к диагностическому набору, включающему в себя белок или его неполный белок, специфично распознаваемый антителом настоящего изобретения или его фрагментом.
Примеры неполного пептида белка настоящего изобретения включают в себя полипептиды, со- 27 028216 стоящие из по меньшей мере 8, предпочтительно 15 и более предпочтительно 20 последовательных аминокислот в аминокислотной последовательности белка настоящего изобретения. Рак может быть диагностирован путем обнаружения антитела в образце (например, крови, ткани) с помощью белка или пептида (полипептида) настоящего изобретения. Способы получения белка настоящего изобретения и пептидов описаны выше.
Настоящее изобретение относится к способам диагностики рака, которая может быть осуществлена путем определения различия между количеством анти-ТОММ34 антител и их количеством в соответствующем контрольном образце, как описано выше. Субъект предположительно страдает от рака, если клетки или ткани этого субъекта содержат антитела против продуктов экспрессии гена ТОММ34, и определено, что количество анти-ТОММ34 антител является большим, чем значение точки разделения для уровня по сравнению с нормальным контролем.
В другом варианте осуществления изобретения диагностический набор настоящего изобретения может включать в себя пептид настоящего изобретения и НЬЛ-молекулу, связывающуюся с ним. Способ обнаружения антигенспецифичных ЦТЛ с применением антигенных пептидов и НЬЛ-молекул уже был разработан (например, ЛЬтап Ю. с1 а1. 8аепсе. 1996, 274(5284): 94-6). Таким образом, комплекс пептида настоящего изобретения и НЬЛ-молекулы может применяться в способе обнаружения для обнаружения ЦТЛ, специфичных по отношению к опухолевому антигену, тем самым делая возможным раннее обнаружение рецидива и/или метастазирования рака. Кроме того, он может применяться для отбора субъектов, которым могут быть показаны лекарственные препараты, содержащие в качестве активного ингредиента пептид настоящего изобретения, или для оценки эффективности лечения этими лекарственными препаратами.
В частности, в соответствии с известным способом (см., например, ЛЬтап Ю. с1 а1. 8с1спсс. 1996, 274(5284): 94-6) может быть получен олигомерный комплекс, такой как тетрамер, радиоактивно меченной НЬЛ-молекулы и пептида настоящего изобретения. С использованием этого комплекса может быть проведена диагностика, например путем количественного определения ЦТЛ, специфичных по отношению к антигенному пептиду, в лимфоцитах периферической крови, полученных от субъекта, предположительно страдающего от рака.
Настоящее изобретение также относится к способу или диагностическим агентам для оценки иммунологического ответа у субъекта при помощи эпитопных пептидов, как описано в настоящем изобретении. В одном варианте осуществления изобретения НЬЛ-Л2 ограниченные пептиды, как описано в настоящем изобретении, используются в качестве реагентов для оценки или прогнозирования иммунного ответа у субъекта. Подлежащий оценке иммунный ответ вызывается путем контактирования иммуногена с иммунокомпетентными клетками ίη νίίτο или ίη νίνο. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения иммунокомпетентные клетки для оценки иммунологического ответа могут быть выбраны из периферической крови, лимфоцитов периферической крови (ЛПК) и мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Способы сбора и выделения таких иммунокомпетентных клеток хорошо известны из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления изобретения любой агент, который может вызывать синтез антигенспецифичных ЦТЛ, распознающих и связывающихся с эпитопным пептидом(ми), может использоваться в качестве реагента. Нет необходимости использовать в качестве иммуногена пептидный реагент. Тест-системы, используемые для такого анализа, включают в себя относительно недавние технические разработки, такие как тетрамеры, красители для анализа высвобождения внутриклеточных лимфокинов и интерферона или ЕЬРЗРОТ-анализ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунокомпетентные клетки, контактирующие с пептидным реагентом, могут представлять собой антигенпрезентирующие клетки, включая дендритные клетки.
Например, пептиды настоящего изобретения могут применяться в тетрамерном анализе окрашивания для оценки мононуклеарных клеток периферической крови на наличие антигенспецифичных ЦТЛ, после контакта с антигеном опухолевой клетки или иммуногеном. НЬЛ-тетрамерный комплекс может применяться для непосредственной визуализации антигенспецифичных ЦТЛ (см., например, Одд с1 а1. 8с1епсе 279: 2103-2106, 1998; и ЛЬтап е1 а1. Заепсе 174: 94-96, 1996) и определения величины популяции антигенспецифичных ЦТЛ в образце мононуклеарных клеток периферической крови. Тетрамерный реагент с использованием пептида настоящего изобретения может быть получен следующим образом.
Пептид, который связывается с НЬЛ-молекулой, подвергают рефолдингу в присутствии соответствующей тяжелой цепи НЬЛ и бета 2-микроглобулина с образованием тримолекулярного комплекса. В этом комплексе карбоксильный конец тяжелой цепи биотинилируют на участке, который был ранее встроен в белок. Затем к комплексу добавляют стрептавидин для образования тетрамера, состоящего из тримолекулярного комплекса и стрептавидина. Благодаря флуоресцентно меченному стрептавидину, этот тетрамер может быть использован для окрашивания антигенспецифичных клеток. Клетки могут быть затем идентифицированы, например, при помощи проточной цитометрии. Такой анализ может применяться для диагностических и прогностических целей. Идентифицированные этим методом клетки также могут применяться в терапевтических целях.
Настоящее изобретение также относится к реагентам для оценки повторных иммунных ответов (см., например, Вейот е1 а1. 1. С1т. Т^евЬ 100: 503-513, 1997 и Реппа е1 а1. 1. Ехр. Меб. 174: 1565-1570,
- 28 028216
1991), содержащим пептиды настоящего изобретения. Например, образцы МКПК пациента от лиц, имеющих рак, подлежащий лечению, анализируют на наличие антигенспецифичных ЦТЛ с использованием специфичных пептидов. Образцы крови, содержащие мононуклеарные клетки, могут быть оценены путем культивирования МКПК и стимуляции клеток пептидом настоящего изобретения. После соответствующего периода культивирования возросшая в численности популяция клеток может быть проанализирована, например, на наличие ЦТЛ активности.
Пептиды также могут применяться в качестве реагентов для оценки эффективности вакцины. МКПК, полученные от пациента, вакцинированного иммуногеном, могут быть проанализированы с применением, например, любого из методов, описанных выше. Пациента подвергают НЬА-типированию и выбирают для анализа эпитопно-пептидные реагенты, которые распознают аллель-специфичные молекулы, имеющиеся у этого пациента. На иммуногенность вакцины может указывать наличие эпитопспецифичных ЦТЛ в образце МКПК.
Пептиды настоящего изобретения также могут быть использованы для получения антител при помощи методов, хорошо известных из уровня техники (см., например, СиККЕЫТ РКОТОСОЬЗ ΙΝΙΜМиЫОЬООУ, ^йеу/Огеепе, ΝΥ; и Αηίίϋοάίβδ А ЬаЪогаЮгу Мапиа1, Наг1оте апй Ьапе, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз. 1989), которые могут применяться в качестве реагентов для диагностики и мониторинга рака. Такие антитела могут включать в себя те, которые распознают пептид в контексте НЬА-молекулы, т.е. антитела, которые связываются с комплексом пептид-ГКГС.
Пептиды и композиции настоящего изобретения имеют ряд дополнительных применений, некоторые из которых здесь описаны. Например, настоящее изобретение относится к способу диагностики или обнаружения расстройства, характеризующегося экспрессией иммуногенного полипептида ТОММ34. Эти способы включают в себя этап определения уровня экспрессии пептида настоящего изобретения или комплекса пептида настоящего изобретения и НЬА-молекулы класса I в биологическом образце. Экспрессия пептида или комплекс пептида и НЬА-молекулы класса I могут быть определены или обнаружены путем анализа с партнером по связыванию для пептида или комплекса. В предпочтительном варианте осуществления изобретения партнером по связыванию для пептида или комплекса является антитело, распознающее и специфично связывающееся с пептидом. Экспрессия ТОММ34 в биологическом образце, таком как биопсия опухоли, также может быть определена при помощи стандартного протокола ПЦР амплификации с использованием ТОММ34-праймеров. Пример экспрессии в опухоли представлен здесь, и дополнительное раскрытие приводимых в качестве примера условий и праймеров для амплификации ТОММ34 можно найти в \УО 2003/27322.
Предпочтительно, способы диагностики включают в себя этап контактирования полученного от субъекта биологического образца с агентом, специфичным по отношению к пептиду настоящего изобретения, для обнаружения присутствия пептида настоящего изобретения в биологическом образце. Используемый в настоящем изобретении термин контактирование означает размещение биологического образца в достаточной близости к агенту в надлежащих условиях, например, концентрации, температуры, времени, ионной силы, чтобы обеспечить специфичное взаимодействие между агентом и пептидом настоящего изобретения, который присутствует в биологическом образце. Как правило, условия контактирования агента с биологическим образцом представляют собой условия, известные специалистам в данной области техники, позволяющие облегчать специфичное взаимодействие между молекулой и ее мишенью (например, белок и его рецептор, антитело и его белковый антиген, нуклеиновая кислота и ее комплементарная цепь) в биологическом образце. Оптимальные условия для облегчения специфичного взаимодействия между молекулой и ее мишенью описаны в патенте США №5108921, выданном Ьо\у е1 а1.
Способ диагностики настоящего изобретения может быть осуществлен как ш νίνο, так и ш νίΐτο, или в обоих условиях. Соответственно, биологический образец в настоящем изобретении может быть расположен ш νίνο или ш νίΐτο. Например, биологический образец может представлять собой ткань ш νίνο, и агент, специфичный по отношению иммуногенному полипептиду ТОММ34, может быть использован для обнаружения присутствия таких молекул в ткани. В другом варианте биологический образец может быть собран или выделен ш νίΐτο (например, образец крови, образец биопсии опухоли, экстракт ткани). В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения биологический образец может представлять собой образец, содержащий клетки, более предпочтительно, образец, содержащий опухолевые клетки, полученные от субъекта, подлежащего диагностике или лечению.
В другом варианте диагностика может быть проведена способом, обеспечивающим непосредственное количественное определение антигенспецифичных Т-клеток, путем окрашивания меченными флуоресцеином НЬА мультимерными комплексами (например, А11тап ί.Ό. е1 а1. 1996, Заепсе 274: 94; А11тап ί.Ό. е1 а1. 1993, Ргос. N11. Асай. ЗсЬ ИЗА 90: 10330). Также осуществлялись окрашивание внутриклеточных лимфокинов, анализ высвобождения интерферона или ЕЬЬЗРОТ-анализ. Тетрамерное окрашивание, окрашивание внутриклеточных лимфокинов и ЕЬЬЗРОТ-анализ все являются по меньшей мере в 10 раз более чувствительными, чем более традиционные анализы (МигаЬ-КпзЬпа К. е1 а1. 1998, ЬттипЪу 8: 177; ЬаТат А. е1 а1. 1997, ί. Ехр. Мей. 186: 859; ИипЪаг Р.К. е1 а1. 1998, Сигг. Βίοι. 8: 413). Пентамеры (например, ИЗ2004-209295А), декстрамеры (например, \УО02/072631) и стрептамеры (например, №-11иге тей1- 29 028216 сше 6. 631-637 (2002)) также могут быть использованы.
Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики или оценки иммунологического ответа у субъекта, которому был введен по меньшей мере один из пептидов ТОММ34 настоящего изобретения, данный способ включает в себя этапы:
(a) контактирования иммуногена с иммунокомпетентными клетками в условиях, подходящих для индукции ЦТЛ, специфичного по отношению к этому иммуногену;
(b) обнаружения или определения уровня индуцирования ЦТЛ, индуцированного на этапе (а); и (c) сопоставления иммунологического ответа субъекта с уровнем индуцирования ЦТЛ.
В настоящем изобретении иммуноген предпочтительно включает в себя по меньшей мере один из (а) пептидов ТОММ34 настоящего изобретения, например пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1, 5, 31 и 32, и их модифицированные пептиды (пептиды, имеющие такие аминокислотные последовательности, и пептиды, в которых такие аминокислотные последовательности были модифицированы 1, 2 или несколькими аминокислотными заменами). В то же время условия, подходящие для индуцирования иммуногенспецифичного ЦТЛ, хорошо известны из уровня техники. Например, иммунокомпетентные клетки могут культивироваться ίη νίΐτο в присутствии иммуногена(ов), чтобы индуцировать иммуногенспецифичный ЦТЛ. Для того чтобы индуцировать иммуногенспецифичный ЦТЛ, в культуру клеток могут быть добавлены любые стимулирующие факторы. Например, ГО-2 являются предпочтительными стимулирующими факторами для индуцирования ЦТЛ. В некоторых вариантах осуществления изобретения этап мониторинга или оценки иммунологического ответа у субъекта, подлежащего лечению с помощью пептидной терапии рака, может быть осуществлен до, во время и/или после лечения. Как правило, во время осуществления протокола терапии рака иммуногенные пептиды неоднократно вводятся подлежащему лечению субъекту. Например, иммуногенные пептиды могут вводиться каждую неделю в течение 3-10 недель. Соответственно, оценку или мониторинг иммунологического ответа у субъекта можно проводить во время осуществления протокола терапии рака. В другом варианте этап мониторинга или оценки иммунологического ответа на терапию рака можно осуществлять при завершении протокола терапии. В соответствии с настоящим изобретением повышенное по сравнению с контролем индуцирование иммуногенспецифичного ЦТЛ указывает на то, что у субъекта оценен или выявлен иммунологический ответ на иммуноген(ы), который/которые были введены. Подходящие контроли для оценки иммунологического ответа могут включать в себя, например, уровень индуцирования ЦТЛ, когда иммунокомпетентные клетки не контактируют с пептидом или контактируют с контрольным пептидом(и), имеющим аминокислотную последовательность, отличную от любого пептида ТОММ34 (например, случайную аминокислотную последовательность). В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунологический ответ у субъекта оценивается с учетом последовательности пептида путем сравнения между иммунологическим ответами каждого из введенных субъекту иммуногенов. В частности, даже когда субъекту вводится смесь нескольких видов пептидов ТОММ34, иммунологический ответ может изменяться в зависимости от пептидов. В этом случае путем сравнения между собой иммунологического ответа каждого из пептидо, могут быть выявлены пептиды, при введении которых у субъекта имеет место более сильный ответ.
XI. Антитела.
Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с пептидом настоящего изобретения. Предпочтительные антитела специфично связываются с пептидом настоящего изобретения и не связываются (или слабо связываются) с пептидом, не являющимся пептидом настоящего изобретения. В другом варианте, антитела связываются с пептидом настоящего изобретения, а также с его гомологом.
Антитела против пептида настоящего изобретения могут найти применение в диагностическом и прогностическом анализе рака и в методиках визуализации. Также такие антитела могут найти применение в лечении, диагностике и/или прогнозировании других типов рака, в тех случаях, когда ТОММ34 также экспрессируется или сверхэкспрессируется у ракового пациента. Кроме того, внутриклеточно экспрессируемые антитела (например, одноцепочечные антитела) являются терапевтически применимыми в лечении тех типов рака, у которых имеет место экспрессия ТОММ34, примеры которых включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
Настоящее изобретение также относится к различным иммунологическим анализам для обнаружения и/или количественного определения белка ТОММ34 (δΕΟ ГО ΝΟ: 42) или его фрагментов, включающих в себя пептиды настоящего изобретения. Такие анализы могут включать в себя одно или более анти-ТОММ34 антител, способных распознавать и связываться с белком ТОММ34 или его фрагментом, в зависимости от конкретного случая. В контексте настоящего изобретения анти-ТОММ34 антитела, связывающиеся с полипептидом ТОММ34, предпочтительно распознают пептид настоящего изобретения. Специфичность связывания может быть подтверждена тестом на подавление. Т.е., когда связывание между анализируемым антителом и полноразмерным полипептидом ТОММ34 подавляется в присутствии пептида настоящего изобретения, это указывает на то, что данное антитело специфично связывается с данным фрагментом. В контексте настоящего изобретения такие иммунологические анализы могут быть
- 30 028216 выполнены в различных форматах иммунологического анализа, хорошо известных из уровня техники, включая без ограничений различные типы радиоиммунологического анализа, метод иммунохроматографии, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), твердофазный иммунофлюоресцентный анализ (ЕЫРА) и тому подобное.
Соответствующие иммунологические, но не использующие антитела, анализы настоящего изобретения также включают в себя анализ иммуногенности Т-клеток, а также анализ связывания главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Кроме того, настоящее изобретение также относится к способам иммунологической визуализации, позволяющим обнаруживать различные типы рака, при которых имеет место экспрессия ТОММ34, включая без ограничений способы радиосцинтиграфической визуализации с использованием меченых антител настоящего изобретения. Такие анализы являются клинически применимыми для обнаружения мониторинга и прогнозирования различных типов рака, при которых имеет место экспрессия ТОММ34, примеры которых включают в себя без ограничений ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркому, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с пептидом настоящего изобретения. Антитела настоящего изобретения могут применяться в любом виде, таком как моноклональные или поликлональные антитела, и включают в себя антисыворотку, полученную путем иммунизации животного, такого как кролик, пептидом настоящего изобретения, все классы поликлональных и моноклональных антител, человеческие антитела и гуманизированные антитела, полученные путем генетической рекомбинации.
Пептид настоящего изобретения, используемый в качестве антигена для получения антитела, может быть получен от любого вида животных, но предпочтительно он получен от млекопитающего, такого как человек, мышь или крыса, более предпочтительно от человека. Полученный от человека пептид может быть получен из нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем изобретении.
В соответствии с настоящим изобретением пептид, используемый в качестве антигена для иммунизации, может представлять собой полный белок или неполный пептид этого белка. Неполный пептид может включать в себя, например, амино-(Ц)-концевой или карбокси-(С)-концевой фрагмент пептида настоящего изобретения.
Здесь антитело настоящего изобретения определяется как белок, который реагирует или с полноразмерным пептидом ТОММ34 или с его фрагментом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения распознает фрагмент пептидов ТОММ34, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕф ГО N0: 1, 5, 31 и 32. Способы синтеза олигопептида хорошо известны из уровня техники. После синтеза пептиды при необходимости могут быть очищены перед применением в качестве иммуногена. В настоящем изобретении олигопептид (например, 9 или 10 мономерных звеньев) может быть конъюгирован или соединен с носителями для повышения иммуногенности. Гемоцианин молюска фиссуреллы (КЕН) хорошо известен в качестве носителя. Способ конъюгации КЬН и пептида хорошо известен из уровня техники.
В другом варианте ген, кодирующий пептид настоящего изобретения или его фрагмент, может быть вставлен в известный экспрессионный вектор, которым затем трансформируют клетку-хозяин, как описано в настоящем изобретении. Желаемый пептид может быть выделен снаружи или изнутри клетокхозяев любым стандартным способом и впоследствии может быть использован в качестве антигена. В другом варианте целые клетки, экспрессирующие пептид, или их лизаты или химически синтезированный пептид могут быть использованы в качестве антигена.
Любое млекопитающее животное может быть иммунизированно антигеном, но предпочтительно учитывать совместимость исходных клеток, используемых для клеточного слияния. Как правило, используются животные отрядов Грызуны, Зайцеобразные и Приматы. Животные отряда Грызуны включают в себя, например, мышь, крысу и хомяка. Животные отряда Зайцеобразные включают в себя, например, кролика. Животные отряда Приматы включают в себя, например, обезьян подотряда Узконосые обезьяны (обезьяны Старого Света), такие как Масаса Гаесюи1апе, макака-резус, гамадрил и шимпанзе.
Способы иммунизации животных антигенами хорошо известны из уровня техники. Внутрибрюшинная инъекция или подкожная инъекция антигенов является стандартным способом иммунизации млекопитающих. В частности, антигены могут быть разбавлены или суспендированы в соответствующем количестве фосфатно-солевого буфера (ФСБ), физиологического раствора и т.д. Если это желательно, то суспензия антигена может быть смешана с соответствующим количеством стандартного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, с образованием эмульсии, и затем введена млекопитающим животным. Предпочтительно, за этим следует несколько введений антигена, смешанного с соответствующим количеством неполного адъюванта Фрейнда, каждые 4-21 дней. Соответствующий носитель также может быть использован для иммунизации. После иммунизации, как описано выше, сыворотку крови исследуют стандартным способом на увеличение количества желаемых антител.
Поликлональные антитела против пептидов настоящего изобретения могут быть получены путем
- 31 028216 забора крови у иммунизированного млекопитающего, исследуемого на увеличение желаемых антител в сыворотке крови и отделения сыворотки от крови любым стандартным способом. Поликлональные антитела могут включать в себя сыворотку крови, содержащую поликлональные антитела, а также фракция, содержащая поликлональные антитела, может быть выделена из сыворотки. Иммуноглобулин С или М может быть получен из фракции, распознающей только пептид настоящего изобретения, с использованием, например, аффинной колонки с пептидом настоящего изобретения и последующей очистки этой фракции с использованием колонки с белком А или белком С.
Для получения моноклональных антител иммунные клетки отбирают у млекопитающего, иммунизированного антигеном и проверенного на наличие повышенного уровня желаемых антител в сыворотке крови, как описано выше, и подвергают клеточному слиянию. Иммунные клетки, используемые для клеточного слияния, предпочтительно получают из селезенки. Другие предпочтительные исходные клетки, предназначенные для слияния с вышеупомянутым иммуноцитом, включают в себя, например, клетки миеломы млекопитающих и более предпочтительно клетки миеломы, обладающие приобретенными свойствами для отбора слившихся клеток при помощи лекарственных препаратов.
Вышеупомянутый иммуноцит и клетки миеломы могут быть слиты при помощи известных способов, например способа, описанного в Мбв1еш е! а1. (Са1£ге апб МПЧет. Мебюбв Еп/уто1 73: 3-46 (1981)).
Конечные гибридомы, полученные путем клеточного слияния, могут быть отобраны путем культивирования их в стандартной селективной среде, такой как ГАТ-среда (гипоксантин-аминоптеринтимидиновая среда). Культуру клеток, как правило, поддерживают на ГАТ-среде в течение периода времени от нескольких дней до нескольких недель, времени, достаточного для гибели всех других клеток (неслившихся клеток) за исключением желаемых гибридом. Затем проводят стандартное предельное разведение для скрининга и клонирования гибридомной клетки, продуцирующей желаемое антитело.
Кроме вышеуказанного способа, в котором для получения гибридомы не являющееся человеком животное иммунизируют антигеном, человеческие лимфоциты, например лимфоциты, инфицированные вирусом Эпштейна-Барр, могут быть иммунизированы пептидом, экспрессирующими пептид клетками или их лизатами ш νίΙΐΌ. Затем иммунизированные лимфоциты сливают с полученными от человека клетками миеломы, способными к бесконечному делению, такими как И266, в результате, гибридома, продуцирующая желаемое человеческое антитело, которое способно связываться с пептидом, может быть получена (публикация нерассмотренной японской патентной заявки №(!Р-А) §йо 63-17688).
Полученные гибридомы затем пересаживают в брюшную полость мыши и отбирают асцит. Полученные моноклональные антитела могут быть очищены, например, фракционированием сульфатом аммония, на колонке с белком А или белком С, ДЭАЭ ионообменной хроматографией или на аффинной колонке с пептидом настоящего изобретения. Антитело настоящего изобретения может быть использовано не только для очистки и обнаружения пептида настоящего изобретения, но также в качестве кандидата на агониста или антагониста пептида настоящего изобретения.
В другом варианте иммунная клетка, такая как иммунизированный лимфоцит, продуцирующий антитела, может быть сделана бессмертной при помощи онкогена и использоваться для получения моноклональных антител.
Полученные таким образом моноклолнальные антитела могут также быть получены рекомбинантно с использованием методов генной инженерии (см., например, ВоггеЬаеск апб Ьапгск, Тйетареийс Мопос1опа1 АпйЬоб1ев, опубликовано в Великобритании МасМШап РиЬНвйегв ЬТЬ. (1990)). Например, ДНК, кодирующая антитело, может быть клонирована из иммунной клетки, такой как гибридома или иммунизированный лимфоцит, продуцирующий антитело, вставлена в подходящий вектор, и введена в клеткухозяин для получения рекомбинантного антитела. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным антителам, полученным так, как описано выше.
Кроме того, антитело настоящего изобретения может представлять собой фрагмент антитела или модифицированное антитело, при условии, что они связываются с одним или несколькими пептидами настоящего изобретения. Например, фрагмент антитела может представлять собой, РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν или одноцепочечный вариабельный фрагмент (всРу), в котором Ρν-фрагменты тяжелой (Н) и легкой (Ь) цепей лигированы соответствующим линкером (НивЮп е! а1. Ргос. N6. Асаб. δα. И8А 85: 5879-83 (1988)). В частности, фрагмент антитела может быть получен путем обработки антитела ферментом, таким как папаин или пепсин. В другом варианте ген, кодирующий фрагмент антитела, может быть сконструирован, вставлен в экспрессионный вектор и экспрессирован в соответствующей клетке-хозяине (см., например, Со е! а1. 1. Iттиηо1. 152: 2968-76 (1994); Вейег апб Ног\\й/, МеИобв Еп/уто1. 178: 476-96 (1989); Р1иск1йип апб 8кегга, МеИобв Еп/уто1. 178: 497-515 (1989); Ьатоук МеИобв Еп/уто1. 121: 652-63 (1986); Коиввеаих е! а1. МеИобв Еп/уто1. 121: 663-9 (1986); Вий апб \Уа1кег, Ттепбв Вю1есЬпо1. 9: 132-7 (1991)).
Антитело может быть модифицировано путем конъюгации с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Настоящее изобретение относится к таким модифицированным антителам. Модифицированное антитело может быть получено путем химической модификации антитела. Эти способы модификации являются стандартными для данной области техники.
В другом варианте антитело настоящего изобретения может быть получено в виде гибридного антитела между вариабельной областью, полученной из нечеловеческого антитела, и константной обла- 32 028216 стью, полученной из человеческого антитела, или в виде гуманизированного антитела, содержащего определяющую комплементарность область (СОК), полученную из нечеловеческого антитела, каркасную область (РК) и константную область, полученные из человеческого антитела. Такие антитела могут быть получены в соответствии с известной технологией. Гуманизация может быть осуществлена путем замены СОК или последовательностей СОК грызунов соответствующими последовательностями человеческого антитела (см., например, νβΓΡοογβη е1 а1. Зае^е 239:1534-1536 (1988)). Таким образом, такие гуманизированные антитела представляют собой гибридные антитела, у которых существенно меньше, чем целый человеческий вариабельный домен был заменен соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека.
Полностью человеческие антитела в дополнение к человеческим каркасной и константной областям, содержащие человеческие вариабельные области, также могут быть использованы. Такие антитела могут быть получены с помощью различных методов, известных из уровня техники. Например, способы ίη νίίτο включают в себя использование рекомбинантных библиотек фрагментов человеческих антител на основе бактериофага (например, НοοдеηЬοοт & ХУиНег. ί. Μο1. ΒίοΙ. 227: 381 (1991)) Аналогичным образом, человеческие антитела могут быть получены путем введения человеческих локусов иммуноглобулинов в трансгенных животных, например мышей, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов были частично или полностью инактивированы. Этот подход описан, например, в патентах США №6150584, 5545807; 5545806; 5569825;5625126;5633425;5661016.
Антитела, полученные как описано выше, могут быть очищены до гомогенности. Например, отделение и очистка антитела могут быть выполнены в соответствии со способами отделения и очистки, используемыми для обычных белков. Например, антитело может быть отделено и выделено при помощи соответствующим образом подобранного и комбинированного использования колоночной хроматографии, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтации, высаливания, диализа, электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН и изоэлектрической фокусировки (ΑηίίΡο^β: А ^аЬο^аίο^у Маииа1. Ε6 НаШу ааб Оа\аб Гане, Со1б §ртшд Наг^т ^аЬο^аίο^у (1988)), но не ограничивается ими. В качестве колонки для аффинной хроматографии могут быть использованы колонка с белком А и колонка с белком О. Примеры используемых колонок с белком А включают в себя Нурег Ό, Р0К0З и Зерйагоке Р.Р. (РЬатшааа).
Примеры подходящих способов хроматографии помимо аффинной хроматографии включают в себя, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой, адсорбционную хроматография и тому подобное (§1та1ед1е8 ίοτ Рго1ет Ριιπίχ3ΐίοη аиб СЬа^асίе^^ζаί^οη: А ^аЬο^аίο^у Сошъе Маииа1. Ε6 Оаше1 К. Магейак е1 а1. Со1б §ртшд Наг6οτ ΕηΕοηιΙοιύ Рте88 (1996)). Процедура хроматографии может быть осуществлена путем жидкофазной хроматографии, такой как ВЭЖХ и ЖХБР.
Например, для измерения антигенсвязывающей активности антитела настоящего изобретения может быть использовано измерение поглощения, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноферментный анализ, радиоиммунологический анализ (РИА) и/или иммунофлуоресценция. В случае ИФА антитело настоящего изобретения иммобилизуется на планшете, на планшет наносится пептид настоящего изобретения и затем наносится образец, содержащий желаемое антитело, такой как культуральный супернатант клеток, продуцирующих антитело, или очищенные антитела. Затем наносится вторичное антитело, распознающее первичное антитело и меченное ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и планшет инкубируют. Затем после отмывки в планшет добавляют субстрат фермента, такой как пнитрофенилфосфат, и измеряют поглощение, для того чтобы оценить антигенсвязывающую активность образца. Фрагмент пептида, такой как С-концевой или ^концевой фрагмент, может быть использован в качестве антигена для оценки связывающей активности антитела. Набор реагентов ВШ^те (Рйаттааа) может быть использован для оценки активности антитела в соответствии с настоящим изобретением.
Вышеописанные способы позволяют проводить обнаружение или измерение пептида настоящего изобретения путем воздействия антитела настоящего изобретения на образец, предположительно содержащий пептид настоящего изобретения, и обнаружения или измерения иммунного комплекса, образованного антителом и пептидом.
Так как способом обнаружения или измерения пептида в соответствии с настоящим изобретением можно специфично обнаруживать или измерять пептид, этот способ может быть пригодным для использования в различных экспериментах, в которых используется этот пептид.
XII. Векторы и клетки-хозяева.
Настоящее изобретение также относится к вектору и клетке-хозяину, в которые вводится нуклеотид, кодирующий пептид настоящего изобретения. Вектор настоящего изобретения пригоден для поддержания нуклеотида, особенно ДНК, настоящего изобретения в клетке-хозяине, для экспрессии петида настоящего изобретения или для введения нуклеотида настоящего изобретения при генной терапии.
Когда клеткой-хозяином является Εχοΐί, и вектор амплифицируется и продуцируется в большом количестве в Εχοΐί (например, в 1М109, ЭН5 альфа, НВ101 или ХЬ1В1ие), этот вектор должен иметь точку начала репликации οτί, для амплификации в Ε^οΐί, и маркерный ген для отбора трансформированных Ε^οΐί (например, ген устойчивости к выбранному лекарственному препарату, такому как ампицил- 33 028216 лин, тетрациклин, канамицин, хлорамфеникол или тому подобное). Например, могут быть использованы векторы серии М13, векторы серии рИС, рВК.322, рВ1ис5СГ1р1. рС.’Р-5>спр1 и т.д. Кроме того, векторы рОЕМ-Т, рЛШЕСТ и рТ7 также могут быть использованы для субклонирования и экстрагирования кДНК, а также векторы, описанные выше. Если вектор используется для продуцирования белка настоящего изобретения, то экспрессионный вектор является особенно пригодным. Например, экспрессионный вектор для экспрессии в Е.сой должен обладать вышеуказанными свойствами, чтобы быть амплифицированным в Е.соП. Когда в качестве клетки хозяина используются Е.соП такие как 1М109, ΌΗ5 альфа, НВ101 или ХЬ1В1ие, вектор должен иметь промотор, например, промотор 1ас2 (АУагб е1 а1. №Иигс 341: 544-6 (1989); РА8ЕВ 1 6: 2422-7 (1992)), промотор агаВ (Ве11ег е1 а1. 8с1епсе 240: 1041-3 (1988)), промотор Т7 или тому подобное, который может эффективно экспрессировать желаемый ген в Е.соП. В этом отношении, например, рОЕХ-5Х-1 (РПагташа), О1Ае\рге88 8у81ет(Р1адеп), рЕОРР и рЕТ (в этом случае хозяином предпочтительно является штамм ВЬ21, который экспрессирует Т7 РНК-полимеразу) могут быть использованы вместо вышеуказанных векторов. Кроме того, вектор может также содержать сигнальную последовательность для секреции пептида. Примером сигнальной последовательности, направляющей секрецию пептида в периплазму Е.соП, является сигнальная последовательность ре1В (Ье1 е1 а1. 1. Вас1егю1. 169: 4379 (1987)). Способы введения векторов в целевые клетки-хозяева включают в себя, например, и кальциево-хлоридный способ и способ электропорации.
Кроме Е.соП, например, экспрессионные векторы, полученные из млекопитающих, (например, рсЛМА3 (1пуйгодеп) и рЕОР-ВО8 (Ыис1ею Ас1Й8 Кее 18(17): 5322 (1990)), рЕР, рСЛМ8), экспрессионные векторы, полученные из клеток насекомых, (например, Вас-1о-ВАС Ьаси1оу1ги8 е\рге88юп 8У81ет (О1ВСО ВКЬ), рВасРАК8), экспрессионные векторы, полученные из растений, (например, рМН1, рМН2), экспрессионные векторы, полученные из вирусов животных, (например, рН§У, рМУ, рАйехЕоУ), экспрессионные векторы, полученные из ретровирусов, (например, р21рпео), экспрессионные векторы, полученные из дрожжей, (например, РюЫа Е\рге88юп Κίΐ (1пу11годеп), рЫУ11, 8Р-О01) и экспрессионные векторы, полученные из ВасШи8 8иЬНП8, (например, рРЬ608, рКТН50) могут быть использованы для продуцирования полипептида настоящего изобретения.
Для того чтобы экспрессировать вектор в животных клетках, таких как клетки СНО, СО8 или ΝΙΗ3Τ3, вектор должен иметь промотор, необходимый для экспрессии в таких клетках, например промотор 8У40 (МиШдап е1 а1. №-11иге 277: 108 (1979)), промотор ММЕУ-ЬТК, промотор ЕР1 альфа (М|/н8Ыта е1 а1. ШсШс. Ас1Й8. Ке8. 18: 5322 (1990)), промотор СМУ и тому подобное, и предпочтительно маркерный ген для отбора трансформантов (например, ген устойчивости к выбранному лекарственному препарату (например, неомицину, О418)). Примеры известных векторов с такими характеристиками включают в себя, например, рМАМ, рЛК2, рВК-К§У, рВК-СМУ, рОРК§У и рОР13.
Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, могут быть использованы при осуществлении или испытании настоящего изобретения, описываются подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упоминаемые в этом описании, включены в настоящее изобретение путем ссылки полностью. В случае конфликта настоящее описание, содержащее определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры приведены только в качестве иллюстраций, и не предполагается, что они являются ограничивающими.
Следующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения также, для того чтобы помочь специалисту в данной области техники в его осуществлении и применении. Данные примеры не предназначены для того, чтобы каким-либо образом иначе ограничивать объем изобретения.
Примеры
Материалы и методы.
Клеточные линии.
Т2, НЬА-А*0201-положительная В-лимфобластная клеточная линия, и СО87, линия клеток почки африканской зеленой мартышки, были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС).
Отбор кандидатных пептидов, полученных из ТОММ34.
9-членные и 10-членные пептиды, полученные из ТОММ34, которые связываются с молекулой НЬА-А*0201, были теоретически вычислены с использованием программного обеспечения для прогнозирования связывания В1МА8 (1111р://\у\у\\-ЬПпа8.сП.пПг8оу/то1Ыо/Н1а_Ьп1П) (Рагкег е1 а1. (1. 1ттипо1. 1994, 152(1): 163-75), Ки/и8ППпа е1 а1. (В1оой 2001, 98(6): 1872-81). Эти пептиды были синтезированы фирмой Вю8уп1ке818 (ЕеМ8уШе, Те\а8) в соответствии со стандартным методом твердофазного синтеза и очищены при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ВЭЖХ). Чистоту (>90%) и идентичность пептидов определяли при помощи аналитической ВЭЖХ и массспектрометрического анализа соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде в концентрации 20 мг/мл и хранили при температуре -80°С.
Индуцирование ЦТЛ ш уйго.
Моноцитарные дендритные клетки (ДК) использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток, чтобы индуцировать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) против пептидов, презентируемых на лейкоцитарном антигене человека (НЬА). ДК получали ш уйго, как описано в другой публикации Щака- 34 028216 кага 8е!а1., Сапсег Кек. 2003 Ы1. 15, 63(14): 4112-8). В частности, мононуклеарные клетки периферической крови, полученные от нормального добровольца (НЬА-А*0201 положительного) при помощи раствора ПсоП-Расцк р1ик (РкагтаЛа) разделяли путем адгезии с пластиковой чашкой Петри (Вес!оп ИкЫпкоп), для того чтобы обогатить их фракцию моноцитов. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали в присутствии 1000 Ед/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (К&И 8ук!ет) и 1000 Ед/мл интерлейкина (ГО-)-4 (К&И 8ук!ет) в среде ΛΣΜ-ν (ПтуПгодеп), содержащей 2% термоинактивированной аутологичной сыворотки (АС). После 7 дней культвирования цитокининдуцированные ДК активировали 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета-2-микроглобулина в течение 3 ч при температуре 37°С в среде АЕМ-ν. Полученные клетки, по-видимому, экспрессировали на своей поверхности ДК-ассоциированные молекулы, такие как СЭ80, ί'.Ό83, С.П86 и НЬА-молекулы класса II (данные не приводятся). Эти активированные пептидом ДК затем инактивировали рентгеновским излучением (20 Гр) и смешивали в соотношении 1:20 с аутологичными СГО8+ Т-клетками, полученными путем положительного отбора с СИ8 РоккТОе !ко1а11оп Кк (Лупа1). Эти культуры помещали на 48-луночные планшеты (СогЫпд); каждая лунка содержала 1,5х104 активированных пептидом ДК, 3х105 СИ8+ Т-клеток и 10 нг/мл ГЬ-7 (К&И 8ук!ет) в 0,5 мл среды АШ-ν с 2%АС. Через три дня в эти культуры добавляли ГЬ-2 (СШК0К) до конечной концентрации 20 МЕ/мл. На 7 и 14 дни Т-клетки дополнительно стимулировали аутологичными активированными пептидом ДК. ДК получали каждый раз тем же вышеописанным способом. ЦТЛ проверяли на активность против активированных пептидом Т2 клеток после 3-го раунда стимуляции пептидом на 21 день (Тапака Н. е! а1. Вг. ί. Сапсег 2001 .Ып. 5, 84(1): 94-9; Итапо Υ. е! а1. Вг. I. Сапсег 2001 Арг. 20, 84(8): 1052-7; ИсЫба N. е! а1. С1ш. Сапсег Кек. 2004 Иес. 15, 10(24): 8577-86; 8иба Т. е! а1. Сапсег 8Л. 2006 Мау, 97(5): 411-9; \а!апаЬе Т. е! а1. Сапсег 8ά. 2005 Аид., 96(8): 498-506).
Процедура размножения ЦТЛ.
ЦТЛ размножали в культуре способом аналогичным тому, который описан в Клббе11 е! а1. (\а1!ег Е.А. е! а1. N. Епд1. I. Меб. 1995 0с!. 19, 333(16): 1038-44; Клббе11 8.К. е! а1. N3!. Меб. 1996 РеЬ., 2(2): 21623). Всего 5х104 ЦТЛ суспендировали в 25 мл среды АШ-ν с 5%АС с двумя видами человеческих Влимфобластных клеточных линий, инактивированных митомицином С, в присутствии 40 нг/мл анти-СИ3 моноклональных антител (Ркагтшдеп). Через днь после начала культивирования в культуру добавляли 120 МЕ/мл !П-2. На 5, 8 и 11 дни в культуру добавляли свежую среду АШ-ν с 5%АС, содержащую 30 МЕ/мл ГО-2 (Тапака Н. е! а1. Вг. I. Сапсег 2001 кип 5, 84(1): 94-9; Итапо Υ. е! а1. Вг. I. Сапсег 2001 Арг. 20, 84(8): 1052-7; ИсЫба N. е! а1. Скп. Сапсег Кек. 2004 Иес. 15, 10(24): 8577-86; 8иба Т. е! а1. Сапсег 8ά. 2006 Мау, 97(5): 411-9; \а!апаЬе Т. е! а1. Сапсег 8сп 2005 Аид., 96(8): 498-506).
Получение клонов ЦТЛ.
В 96-луночном круглодонном титрационном микропланшете готовили разведения, чтобы получить 0,3, 1 и 3 ЦТЛ на лунку. ЦТЛ культивировали с 1х104 клеток на лунку двух видов человеческих Влимфобластных клеточных линий, 30 нг/мл анти-СИ3 моноклональных антител и 125 Ед/мл ГО-2 в общем объеме 150 мкл на лунку среды АШ-ν с 5%АС. Через 10 дней в среду добавляли 50 мкл на лунку ГО-2, чтобы получить конечную концентрацию ГО-2 125 Ед/мл. Активность ЦТЛ проверяли на 14-й день, и клоны ЦТЛ размножали таким же способом, как описано выше (ИсЫба N. е! а1. Скп. Сапсег Кек. 2004 Иес. 15, 10(24): 8577-86; 8иба Т. е! а1. Сапсег 8Л. 2006 Мау, 97(5): 411-9; \а!апаЬе Т. е! а1. Сапсег 8Л. 2005 Аид., 96(8): 498-506).
Специфичная активность ЦТЛ.
Для изучения специфичной активности ЦТЛ проводили анализ ИФН-гамма методом ЕЫ8Р0Т и методом ИФА. Активированные пептидом Т2 клетки (1х104 клеток на лунку) использовали в качестве клеток-стимуляторов. Клетки, культируемые в 48 лунках, использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ИФН-гамма методом ЕЫ8Р0Т и анализ ИФН-гамма методом ИФА проводили в соответствии с инструкцией производителя.
Получение клеток, принудительно экспрессирующих целевой ген и/или НЬА-А02.
кДНК, кодирующую открытую рамку считывания целевых генов или НЬА-А*0201, амплифицировали с помощью ПЦР. ПЦР-амплифицированный продукт клонировали в экспрессионный вектор. Плазмидами трансфицировали С087, представляющие собой НЬА-А*0201-нулевую клеточную линию с целевыми генами, с использованием липофектамина 2000 (Зпукгодеп) в соответствии с инструкцией производителя. Через два дня после трансфекции клетки собирали раствором Версена (ГОукгодеп) и использовали в качестве клеток-стимуляторов (5х 104 клеток на лунку) для анализа активности ЦТЛ.
Результаты 1.
Повышенная экспрессия ТОММ34 при различных типах рака.
Большой объем данных о профилях генной экспрессии, полученных при различных типах рака с использование кДНК-микрочипа, выявил, что экспрессия ТОММ34 (регистрационный номер в СепВапк ИМ 006809; например 8ЕЦ ГО N0: 42) была повышенной. Экспрессия ТОММ34 была достоверно повышена по сравнению с соответствующими нормальными тканями в 4 из 28 случаев ОМЛ, 4 из 14 случаев ХМЛ, 8 из 11 случаев рака мочевого пузыря, 1 из 4 случаев рака молочной железы, 1 из 5 случаев рака
- 35 028216 шейки матки, 12 из 12 случаев колоректального рака, 5 из 17 случаев рака пищевода, 6 из 6 случаев рака печени, 1 из 10 случаев остеосаркомы, 1 из 26 случаев рака предстательной железы, 1 из 19 случаев почечно-клеточной карциномы, 2 из 14 случаев МРЛ, 5 из 20 случаев НМРЛ и 10 из 51 случая опухоли мягких тканей (табл. 1).
Таблица 1. Соотношение случаев наблюдаемого увеличения экспрессии в раковой ткани по сравнению с соответствующей нормальной тканью
Результаты 2.
Прогнозирование НЬА-А02-связывающих пептидов, полученных из ТОММ34.
В табл. 2а и 2Ь приведены связывающиеся с I ΙΙ.Λ-Λ2 9-членные и 10-членные пептиды ТОММ34 в порядке величины аффинности связывания. В общей сложности было отобрано 40 пептидов, потенциально обладающих аффинностью связывания с НЬА-А2, которые были исследованы для определения эпитопных пептидов.
Таблица 2а. НЬА-А02-связывающие 9-членные пептиды, полученные из ТОММ34
Начальное положение Аминокислотная последовательность Балл 5ΕΩ Ιϋ ΝΟ
30 АЪУСНАЪНУ 222,566 1
77 АЬАЬУРЕ31 60,51 2
52 УЪУЗИНААС 27,026 3
110 ТУЪОЮОИУ 11,034 4
220 ЬЬСЗИЬЕЗА 9, 518 5
230 УЗИНАЪСУЪ 8,115 6
103 ΜΑΥνϋΥΚΤν 7,883 7
80 ЬУРЕ31КРЬ 7,309 8
255 κιωσκΝνκΑ 6, 955 9
23 СОУАЕАЗАЪ 6, 931 10
195 УЬКЕЕСИЕЬ 5,211 11
111 УЬОЮОИУТ 5, 194 12
238 ЬУЬКОУТЕА 4, 101 13
1 МАРКЕРОЗУ 3, 058 14
113 0ΙϋϋΝνΤ3Α 2,577 15
253 АЬКЬОСКИУ 2,434 16
239 УЬКОУТЕАУ 2,028 17
144 ЬР31РЬУРУ 1,775 18
142 ЬКЬР31РЬУ 1,398 19
279 33ΕΑΏΙ3ΝΕ 1, 187 20
Таблица 2Ь. НЬА-А02-связывающие 10-членные пептиды, полученные из ТОММ34
- 36 028216
Начальное положение Аминокислотная последовательность Балл 5Εζ) Ιϋ N0
143 КЬРЗгРЬУРУ 559,894 21
97 АЬЕКуРМАУУ 56,309 22
79 АЬУР£31КРЬ 49,134 23
237 УЬУЪкОУТЕА 34,279 24
135 ЗЬСРеИНЬКЬ 21,362 25
219 ЗЬЬСзЫЬЕЗА 20,716 26
238 ЬУЬКчУТЕАУ 18,757 27
127 КМТНаЬМОЗЬ 17,388 28
113 ОЮОпУТЗАУ 15,684 29
241 ΚβΥΤθΑνΚϋΟ 12,975 30
30 АЬУСгАЬКУЬ 12,893 31
220 ЬЬСЗпЬЕЗАТ 12,668 32
195 УЬКЕеСЫЕЬУ 8,314 33
112 ьоюаыутзА 8,075 34
194 КУЬКеЕСЫЕЬ 6, 916 35
299 КЬНОеУКОЫЬ 5, 682 36
141 КЬКЬр31РЬУ 5, 599 37
160 ЗЬРЗеЫНКЕМ 4,968 38
175 КЕТТаТКЫКУ 4,733 39
186 3Α6ϋνΕΚΑΒ.ν 3, 961 40
Начальное положение указывает номер аминокислотного остатка с Оконца ТОММ34.
Балл связывания получен из программы В1МА8.
Индуцирование ЦТЛ спрогнозированными пептидами из ТОММ34, ограниченными НЬА-А*0201.
ЦТЛ для этих пептидов, полученных из ТОММ34, были получены в соответствии с протоколами, описанными в разделе Материалы и методы. Пептид-специфичную активность ЦТЛ обнаруживали путем анализ ИФН-гамма методом ЕЫ8Р0Т (Фиг. 1а-й). В лунках со следующими номерами был обнаружен высокий уровень синтеза ИФН-гамма по сравнению с контрольными лунками: лунка номер #4 с ТОММ34-А02-9-30 (8Е9 ГО N0: 1) (а), лунка #2 с ТОММ34-А02-9-220 (8Е9 ГО N0: 5) (Ь), лунка #4 с ТОММ34-А02-10-30 (8Е9 ГО N0: 31) (с) и лунка #2 с ТОММ34-А02-10-220 (8Е9 ГО N0: 32) (й) . С другой стороны, никакой специфичной активности ЦТЛ не было обнаружено при стимуляции другими пептидами, приведенными в табл. 2а и 2Ь, несмотря на то что эти пептиды обладали возможной связывающей активностью с НЬА-А*0201. Типичным случаем отрицательных данных являлось отсутствие специфичного синтеза ИФН-гамма ЦТЛ, стимулированными ТОММ34-А02-10-143 (8Е9 ГО N0: 21) (е) . В результате было показано, что 4 пептида, полученных из ТОММ34, было отобрано в качестве пептидов, способных эффективно индуцировать ЦТЛ.
Получение линии и клона ЦТЛ против полученного из ТОММ34 пептида.
Клетки, которые показали пептид-специфичную активность ЦТЛ, обнаруженную с помощью анализа ИФН-гамма методом ЕЫ8Р0Т в лунке номер #4 с ТОММ34-А02-9-30 (8Е9 ГО N0: 1), размножали, и линию ЦТЛ получали с помощью процедуры размножения, описанной выше в разделе Материалы и методы. Активность ЦТЛ этой линии ЦТЛ измеряли при помощи анализа ИФН-гамма методом ИФА (фиг. 2). Линия ЦТЛ показала высокий уровень синтеза ИФН-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом, по сравнению с клетками-мишенями, не активированными никаким пептидом. Кроме того, клон ЦТЛ был получен путем предельного разведения из линии ЦТЛ, как описано в разделе Материалы и методы, и синтез ИФН-гамма клоном ЦТЛ против клеток-мишеней, активированных пептидом, измеряли при помощи анализа ИФН-гамма методом ИФА. Клон ЦТЛ, стимулированный ТОММ34-А02-9-30 (8Е9 ГО N0: 1), имел высокий уровень синтеза ИФН-гамма (фиг. 3).
Специфичная активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих ТОММ34 и НЬАА*0201.
Полученную линию ЦТЛ, индуцированную против пептида ТОММ34-А02-9-30 (8Е9 ГО N0: 1), исследовали на способность распознавать клетки-мишени, экспрессирующие ТОММ34 и молекулу НЬАА*0201. Клетки С087, трансфицированные полноразмерным геном ТОММ34 и геном НЬА-А*0201 (специфичная модель клеток-мишеней, экспрессирующих гены ТОММ34 и НЬА-А*0201), были приготовлены в качестве клеток-стимуляторов, и клетки С087, трансфицированные или полноразмерным геном ТОММ34 или НЬА-А*0201, использовали в качестве контролей. На фиг. 4 линия ЦТЛ, стимулированная ТОММ34-А02-9-30 (8Е9 ГО N0: 1), показала высокую активность ЦТЛ против клеток С087, экс- 37 028216 прессирующих, как ТОММ34, так и НЬА-А*0201. С другой стороны, никакой существенной специфичной активности ЦТЛ не было обнаружено в отношении контролей. Таким образом, эти данные ясно показали, что пептид ТОММ34-А02-9-30 (8Е0 ГО N0: 1) эндогенно процессировался и презентировался на клетках-мишенях с молекулой НЬА-А*0201 и распознавался ЦТЛ. Эти результаты указывают на то, что этот пептид, полученный из ТОММ34, может быть пригоден в качестве противораковой вакцины для пациентов, имеющих экспрессирующие ТОММ34 опухоли.
Анализ гомологии антигенных пептидов.
ЦТЛ, стимулированные ТОММ34-А02-9-30 (8ЕО ГО N0: 1), ТОММ34-А02-9-220 (8ЕО ГО N0: 5), Т0ММ34-А02-10-30 (8ЕО ГО N0: 31) и ТОММ34-А02-10-220 (8ЕО ГО N0: 32), показали значительную и специфическую активность ЦТЛ. Этот результат может быть обусловлен тем фактом, что последовательности ТОММ34-А02-9-30 (8ЕО ГО N0: 1), ТОММ34-А02-9-220 (8ЕО ГО N0: 5), Т0ММ34-А02-10-30 (8Е0 ГО N0: 31) и ТОММ34-А02-10-220 (8Е0 ГО N0: 32) являются гомологичными пептиду, полученному из других молекул, о которых известно, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Чтобы исключить такую возможность, был проведен анализ гомологии этих пептидных последовательностей, используя их в качестве запросов для алгоритма ВЬАЗТ (1ιΠρ://\γ\γ\γ.ικ+ί.η1ιη.ηί1ι.§ογ/ ЫаЧ/ЫаЧ.сдО, который не выявил последовательностей со значительной гомологией. Результат анализа гомологии показал, что последовательности ТОММ34-А02-9-30 (8Е0 ГО N0: 1), ТОММ34-А02-9-220 (8ЕО ГО N0: 5), Т0ММ34-А02-10-30 (8ЕО ГО N0: 31) и ТОММ34-А02-10-220 (8ЕО ГО N0: 32) являются уникальными, и, таким образом, исходя из имеющихся сведений, существует малая вероятность того, что эти молекулы индуцируют непредусмотренный иммунологический ответ на некоторую не родственную им молекулу.
В заключение, авторы настоящего изобретения идентифицировали новые НЬА-А*0201 эпитопные пептиды, полученные из ТОММ34. Кроме того, приведенные здесь результаты показывают, что эпитопный пептид ТОММ34 может быть пригоден для применения в иммунотерапии рака.
Промышленная применимость
Изобретение относится к новым ОАА, в частности к ОАА, полученным из ТОММ34, которые вызывают сильные и специфичные противоопухолевые иммунные ответы и применимы к широкому спектру типов рака. Такие ОАА являются пригодными в качестве пептидных вакцин против заболеваний, связанных с ТОММ34, например рак, в частности ОМЛ, ХМЛ, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак печени, остеосаркома, рак предстательной железы, почечно-клеточная карцинома, МРЛ, НМРЛ и опухоль мягких тканей.
Хотя настоящее изобретение описано здесь подробно и со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, следует понимать, что вышеизложенное описание приведено в качестве примера и имеет объяснительный характер, и оно предназначено для иллюстрации настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. С помощью стандартных экспериментов специалист в данной области техники легко поймет, что различные изменения и модификации могут быть сделаны здесь без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, пределы и границы которого определяются прилагаемой формулой изобретения.
- 38 028216
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ΟΝΟΟΤΗΕΚΑΡΥ ЗС1ЕЫСЕ, ΙΝ0.
<120> ПЕПТИДЫ ТОММ34 И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ВАКЦИНЫ
<130> ОЫС-А1035Р
<150> <151> из 61/419,181 2010-12-02
<16 0> 46
<170> РаЬепЫп νθΓ3ίοη 3.5
<210> <211> <212> <213> 1 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 1
А1а Ьеи Туг О1у Агд А1а Ьеи Агд Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 2 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 2
А1а Ьеи А1а Ьеи Ыа1 Рго РЬе Зег Не 1 5
<210> <211> <212> <213> 3 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 3
Уа1 Ьеи Туг Зег Азп Агд А1а А1а Суз
1 5
<210> <211> <212> <213> 4 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220>
- 39 028216 <223> искусственно синтезированная последовательность пептида <400> 4
Тйг Уа1 Ьеи 01п Не Азр Азр Азп Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 5 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<40 0> 5
Ьеи Ьеи Суз Зег Азп Ьеи С1и Зег А1а
1 5
<210> <211> <212> <213> 6 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<40 0> б
Туг Зег Азп Агд А1а Ьеи Суз Туг Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 7 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<40 0> 7
МеЬ А1а Туг Уа1 Азр Туг Ьуз ТЬг Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 8 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<40 0> 8
Ьеи Уа1 Рго РЬе Зег 11е Ьуз Рго Ьеи 1 5
- 40 028216
<210> <211> <212> <213> 9 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 9
Ьуз Ьеи Азр О1у Ьуз Азп УаТ Ьуз А1а
1 5
<210> <211> <212> <213> 10 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 10
О1у О1п Туг АТа О1и АТа Зег АТа Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 11 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 11
УаТ Ьеи Ьуз О1и О1и О1у Азп О1и Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 12 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 12
УаТ Ьеи О1п ТТе Азр Азр Азп УаТ ТЬг
1 5
<210> <211> <212> <213> 13 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
- 41 028216 <400> 13
Ьеи Уа1 Ьеи Ьуз С1п Туг ТЬг О1и А1а
1 5
<210> <211> <212> <213> 14 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<400> 14
МеЬ А1а Рго Ьуз РЬе Рго Азр 5ег Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 15 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<400> 15
01п Не Азр Азр Азп Уа1 ТЬг 5ег А1а
1 5
<210> <211> <212> <213> 16 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<400> 16
А1а Ьеи Ьуз Ьеи Азр 01у Ьуз Азп Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 17 9 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<400> 17
Уа1 Ьеи Ьуз 01п Туг ТАг 01и А1а Уа1
1 5
<210> <211> 18 9
- 42 028216 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> искусственно синтезированная последовательность пептида <400> 18
Ьеи Рго Зег Не Рго Ьеи 1/а1 Рго 1/а1
5
<210> 19
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> искусственно синтезированная последовательность пептида
<4 0 0> 19
Ьеи Ьуз Ьеи Рго Зег Не Рго Ьеи Уа1
<210> 20
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> искусственно синтезированная последовательность пептида
<4 0 0> 20
Зег Зег РЬе А1а Азр 11е Зег Азп Ьеи
<210> 21
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> искусственно синтезированная последовательность пептида
<4 0 0> 21
Ьуз Ьеи ι Рго Зег Не Рго Ьеи Уа1 Рго Уа1
<210> 22 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> искусственно синтезированная последовательность пептида <400> 22
- 43 028216
А1а Ьеи О1и Ьуз Туг Рго МеЬ А1а Туг Уа1
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 23 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 23
А1а Ьеи Уа1 Рго РЬе Зег Не Ьуз Рго Ьеи
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 24 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 24
Туг Ьеи Уа1 Ьеи Ьуз 01п Туг ТЬг 01и А1а
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 25 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 25
Зег Ьеи 01у Рго 01и Тгр Агд Ьеи Ьуз Ьеи
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 26 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 26
Зег Ьеи Ьеи Суз Зег Азп Ьеи 01и Зег А1а
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 27 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
- 44 028216
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0 > 27
Ьеи Уа1 Ьеи Ьуз О1п Туг ТЪг О1и А1а Уа1
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 28 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0 > 28
Агд МеЬ ТЪг Агд А1а Ьеи МеЬ Азр Зег Ьеи
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 29 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0 > 29
εΐη Не Азр Азр Азп Уа1 ТЪг Зег А1а Уа1
1 5 10
<210 > <211> <212> <213> 30 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0 > 30
Ьуз О1п Туг ТЪг О1и А1а Уа1 Ьуз Азр Суз
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 31 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0 > 31
А1а Ьеи Туг С1у Агд А1а Ьеи Агд 1/а1 Ьеи 15 10
- 45 028216
<210> <211> <212> <213> 32 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 32
Ьеи Ьеи Суз Зег Азп Ьеи С1и Зег А1а ТЬг
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 33 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 33
Уа1 Ьеи Ьуз С1и С1и С1у Азп С1и Ьеи Уа1
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 34 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 34
Ьеи С1п Не Азр Азр Азп Уа1 ТЬг Зег А1а
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 35 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 35
Агд Уа1 Ьеи Ьуз С1и С1и С1у Азп С1и Ьеи
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 36 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220>
- 46 028216 <223> искусственно синтезированная последовательность пептида <400> 36
Ьуз Ьеи Агд О1п О1и Уа1 Ьуз О1п Азп Ьеи
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 37 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 37
Агд Ьеи Ьуз Ьеи Рго Зег Не Рго Ьеи Уа1
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 38 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 38
Зег Ьеи Рго Зег О1и Азп Нтз Ьуз О1и Мер
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 39 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 39
Ьуз О1и ТЬг ТЬг А1а ТЬг Ьуз Азп Агд Уа1
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 40 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> искусственно синтезированная последователвноств пептида
<4 0 0> 40
Зег А1а О1у Азр Уа1 О1и Ьуз А1а Агд Уа1 15 10
- 47 028216
<210> 41 <211> 2066 <212> ДНК <213> Нотс > зартепз
<400> 41 аддЬсЬсдса ддссссдссс ссЬсдссдсд ддЬЬсдсЬдЬ Ьдддсддада ЬаЬЬсдссдс 60
сддсдсЬЬдс дсссддаадд ЬдЬдссдсас сасасддддд арраарраар дадсЬсссаа 120
сЬсдссддсс Ьддссасддд аЬддссссса ааЬЬсссада сЬсЬдЬддад дадсЬссдсд 180
ссдссддсаа ЬдададЬЬЬс сдсаасддсс адЬасдссда ддссЬссдсд сЬсЬасддсс 240
дсдсдсЬдсд ддЬдсЬдсад дсдсааддЬЬ сЬЬсадассс адаадаадаа адЬдЬЬсЬсЬ 300
асЬссаассд адсадсаЬдЬ сасЬЬдаадд аЬддааасЬд сададасЬдс аЬсааадаЬЬ 360
дсасЬЬсадс асЬддссЬЬд дЬЬсссЫса дсаЬЬаадсс ссЬдсЬдсдд сдадсаЬсЬд 420
сЬЬаЬдаддс ЬсЬддадаад ЬасссЬаЬдд ссЬаЬдЬЬда сЬаЬаадасЬ дЬдсЬдсада 480
ЬЬдаЬдаЬаа ЬдЬдасдЬса дссдЬадаад дсабсаасад аабдассада дсЬсЬсаЬдд 540
асЬсдсЬЬдд дссЬдадЬдд сдссЬдаадс ЬдсссЬсааЬ ссссЬЬддЬд ссЬдЬЬЬсад 600
сЬсадаадад дЬддааЬЬсс ЬЬдссЬЬсдд адаассасаа ададаЬддсЬ аааадсаааЬ 660
ссааадааас сасадсбаса аадаасадад ЬдссЬЬсЬдс ЬддддаЬдЬд дадааадсса 720
дадЬЬсЬдаа ддаадааддс ааЬдадсЬЬд Ьааадааддд ааассабаад ааадсЬаЬЬд 780
адаадбасад ЬдааадссЬс ЬЬдЬдЬадЬа ассЬддааЬс ЬдссасдЬас адсаасадад 840
сасЬсЬдсЬа ЬЬЬддЬссЬд аадсадЬаса садаадсадЬ дааддасЬдс асадаадссс 900
ЬсаадсЬдда Ьддааадаас дЬдааддсаЬ ЬсЬасадасд ддсЬсаадсс сасааадсас 960
ЬсааддасЬа ЬаааЬссадс ЬЬЬдсадаса ЬсадсаассЬ ссЬасадаЬЬ дадссбадда 1020
аЬддЬссЬдс асадаадЬЬд сддсаддаад Ьдаадсадаа ссЬасасЬаа ааасссааса 1080
дддсаасДдд аассссДдсс ДдассДДасс сададаадсс аДдддссасс ДдсДсДдДдс 1140
ссдсЬссЬда аасссадсаЬ дссссаадЬд адсЬсЬдаад сссссЬссЬс ааЬсссЬЬда 1200
ЬддссЬссса сссЬдЬаада ддсЬЬЬдсЬЬ дЬЬсаааЬЬа аасЬсадЬдЬ адЬсааасас 1260
адасаЬддЬЬ дЬЬдсассад аааддЬсссс асЬададсЬа адсдЬдаадс ЬдаадсЬсЬд 1320
ЬсссЬаЬЬсс сссадсссад сЬадсЬдаЬс асассаасад аЬссЬсаЬса дсааадсаЬЬ 1380
ЬддсЬЬЬдЬс сЬдсссаадЬ дддсЬдсада сЬдадЬдсЬд сссЬЬдЬадс ЬЬссссадас 1440
сссаасЬсас ЬдсадЬЬсаЬ сЬдаасаасс ЬдадсЬссЬд ддссддддЬд дааддадддд 1500
даЬааассЬа аддсссЬдаЬ ссааадсадс сЬдЬЬдадсЬ ддЬЬсЬссад ддсЬдсадЬс 1560
ЬсЬссаддЬд ЬасадсЬдсЬ дЬсссЬдссс ЬдЬссЬдЬсс ЬЬдсасадЬс ЬссЬаЬдЬсЬ 1620
дадссссадЬ дссЬЬсЬдЬЬ сдддсссЬсс ЬЬЬддЬддда аддсададсс сЬдасссЬЬд 1680
ааЬддЬЬдЬс сЬЬдасЬсЬд ЬдсЬдсЬдсс ЬЬсЬдсадад аддсассбаа дсЬдЬЬЬааа 1740
- 48 028216
дадсссадАд аААдАддсАд сАссАссАад аддАдддадд дддсаададд ссАссААддА 1800
садАдАссаА дсАААсАддд садддасААд дААААААдАА ссаасадАдд ссААсАссдд 1860
дсААсаАадА АсАААдАааА аАдААдаадА АааАААдааА АдасАдаААА АдААдаасАд 1920
АдАдАААаад сАдААдсаАА ааааадсААА сААсАасаАс ааАаАсАдсА дАдсАААсаА 1980
ААаАдссААА АсадсАААдс ассАддаасА сАдАадАааА ааАаааадАА аААдсААаАА 2040
дддсаААсаа аааааааааа аааааа 2066
<210> 42
<211> 309
<212> БЕЛОК
<213> Ното :
<40 0> 42
МеА А1а Рго ]
Азп С1и Зег РАе Агд Азп С1у С1п Туг А1а С1и А1а Зег А1а Ьеи Туг 20 25 30
С1у Агд А1а Ьеи Агд Уа1 Ьеи С1п А1а С1п С1у Зег Зег Азр Рго С1и 35 40 45
С1и С1и Зег Уа1 Ьеи Туг Зег Азп Агд А1а А1а Суз Н1з Ьеи Ьуз Азр 50 55 60
С1у Азп Суз Агд Азр Суз Не Ьуз Азр Суз ТАг Зег А1а Ьеи А1а Ьеи 65 70 75 80
Уа1 Рго РАе Зег 11е Ьуз Рго Ьеи Ьеи Агд Агд А1а Зег А1а Туг С1и 85 90 95
А1а Ьеи С1и Ьуз Туг Рго МеА А1а Туг Уа1 Азр Туг Ьуз ТАг Уа1 Ьеи 100 105 110
С1п 11е Азр Азр Азп Уа1 ТАг Зег А1а Уа1 С1и С1у 11е Азп Агд МеА 115 120 125
ТАг Агд А1а Ьеи МеА Азр Зег Ьеи С1у Рго С1и Тгр Агд Ьеи Ьуз Ьеи 130 135 140
Рго Зег 11е Рго Ьеи 1/а1 Рго 1/а1 Зег А1а С1п Ьуз Агд Тгр Азп Зег 145 150 155 160
Ьеи Рго Зег С1и Азп Н1з Ьуз С1и МеА А1а Ьуз Зег Ьуз Зег Ьуз С1и 165 170 175
ТЬг ТЬг А1а ТЬг Ьуз Азп Агд Уа1 Рго Зег А1а С1у Азр Уа1 С1и Ьуз 180 185 190
А1а Агд Уа1 Ьеи Ьуз С1и С1и С1у Азп С1и Ьеи Уа1 Ьуз Ьуз С1у Азп 195 200 205
ЕЬз Ьуз Ьуз А1а Не С1и Ьуз Туг Зег С1и Зег Ьеи Ьеи Суз Зег Азп 210 215 220
Ьеи С1и Зег А1а ТЬг Туг Зег Азп Агд А1а Ьеи Суз Туг Ьеи Уа1 Ьеи 225 230 235 240
Ьуз С1п Туг ТЬг С1и А1а Уа1 Ьуз Азр Суз ТЬг С1и А1а Ьеи Ьуз Ьеи 245 250 255
Азр С1у Ьуз Азп Уа1 Ьуз А1а РЬе Туг Агд Агд А1а С1п А1а ЕЬз Ьуз 260 265 270
А1а Ьеи Ьуз Азр Туг Ьуз Зег Зег РЬе А1а Азр 11е Зег Азп Ьеи Ьеи 275 280 285
С1п 11е С1и Рго Агд Азп С1у Рго А1а С1п Ьуз Ьеи Агд С1п С1и Уа1 290 295 300
Ьуз С1п Азп Ьеи ЕЬз 305 <210> 43 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Искусственная последовательность <400> 43 дЬсЬассадд саЬЬсдсЬЬс аЬ <210> 44 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Искусственная последовательность <400> 44
ЬсадсЬддас сасадссдса дсдЬ <210> 45 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 50 028216 <220>
<223> Искусственная последовательность <400> 45
ЬсадаааЬсс ЬЬЬсЬсЬЬда с 21 <210> 46 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Искусственная последовательность <400> 46 сЬадссЬсЬд дааЬссЬЬЬс ЬсЬЬ 24

Claims (23)

1. Выделенный пептид, имеющий длину менее 15 аминокислот, согласно следующим (а) или (Ь):
(a) выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из δΕΟ ГО N0: 1, 5, 31 и 32;
(b) выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, где одна или две аминокислоты заменены, вставлены или добавлены в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1, 5, 31 и 32, для получения модифицированного пептида, который сохраняет способность связываться с НЕА-антигеном и способность к индуцированию цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ).
2. Выделенный пептид по п.1, где НЕА-антиген представляет собой НЬА-А2.
3. Выделенный пептид по п.1 или 2, где указанный пептид представляет собой нонапептид или декапептид.
4. Пептид по любому из пп.1-3, имеющий по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из:
(a) вторая аминокислота с Ν-конца является или модифицирована, чтобы быть аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина и метионина, и (b) С-концевая аминокислота является или модифицирована, чтобы быть аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из валина и лейцина.
5. Выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из δΕΟ ГО N0: 1, 5, 31 и 32.
6. Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.1-5.
7. Композиция для индуцирования ЦТЛ, где данная композиция включает в себя один или более пептидов по любому из пп.1-5.
8. Фармацевтическая композиция, содержащая один или более пептидов по любому из пп.1-5, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, составленная для цели, выбранной из группы, состоящей из:
(ί) лечения существующего рака, (ίί) профилактики рака, (ίίί) предупреждения послеоперационного рецидива рака, и (ίν) их комбинации.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая одну или более АПК или экзосом, которые презентируют комплекс пептида по любому из пп.1-5 и НЕА-антигена на своей поверхности, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, составленная для цели, выбранной из группы, состоящей из:
(ί) лечения существующего рака, (ίί) профилактики рака, (ίίί) предупреждения послеоперационного рецидива рака, и (ίν) их комбинации.
10. Фармацевтическая композиция по п.8, где указанная композиция составлена для введения субъекту, чей НЕА-антиген представляет собой НЬА-А2.
11. Фармацевтическая композиция по п.9, составленная для введения субъекту, чей НЕА-антиген представляет собой НЬА-А2.
12. Способ индуцирования антигенпрезентирующей клетки (АПК), обладающей способностью к индуцированию ЦТЛ, включающий в себя стадию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) приведения АПК в контакт с пептидом по любому из пп.1-5 ίη νίίΓο, ех νίνο или ίη νίνο, и (b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп.1-5, в АПК.
13. Способ индуцирования ЦТЛ, включающий в себя стадию, выбранную из группы, состоящей из:
- 51 028216 (a) совместного культивирования СБ8-позитивной Т-клетки с АПК, презентирующей на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.1-5, (b) совместного культивирования СБ8-позитивной Т-клетки с экзосомой, презентирующей на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.1-5, и (c) введения в Т-клетку полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц Т-клеточного рецептора (ТСК), где ТСК, образованный указанными полипептидами субъединиц, способен связываться с комплексом НЬА-антигена и пептида по любому из пп.1-5 на поверхности клетки.
14. Выделенная АПК, презентирующая на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.1-5.
15. АПК по п.14, индуцированная способом индуцирования антигенпрезентирующей клетки (АПК), обладающей способностью к индуцированию ЦТЛ, где данный способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) приведения АПК в контакт с пептидом по любому из пп.1-5 ΐη νΐΐΐΌ, ех νίνο или ΐη νίνο, и (b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп.1-5, в АПК.
16. Выделенный ЦТЛ, имеющий своей мишенью любой из пептидов по пп.1-5.
17. ЦТЛ по п.16, индуцированный способом индуцирования ЦТЛ, где данный способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) совместного культивирования СБ8-позитивной Т-клетки с АПК, презентирующей на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.1-5, (b) совместного культивирования СБ8-позитивной Т-клетки с экзосомой, презентирующей на своей поверхности комплекс НЬА-антигена и пептида по любому из пп.1-5, и (c) введения в Т-клетку полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц Т-клеточного рецептора (ТСК), где ТСК, образованный указанными полипептидами субъединиц, способен связываться с комплексом НЬА-антигена и пептида по любому из пп.1-5 на поверхности клетки.
18. Способ индуцирования иммунного ответа против рака у субъекта, включающий этап введения этому субъекту пептида по пп.1-5, его иммунологически активного фрагмента или полинуклеотида, кодирующего этот пептид или фрагмент.
19. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид по любому из пп.1-5.
20. Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная экспрессионным вектором по п.19.
21. Экзосома, презентирующая комплекс, содержащий пептид по любому из пп.1-5 и НЬА-антиген.
22. Антитело против пептида по любому из пп.1-5 или его иммунологический активный фрагмент.
23. Диагностический набор, включающий пептид по любому из пп.1-5, полинуклеотид по п.6 или антитело или его иммунологически активный фрагмент по п.22.
EA201390811A 2010-12-02 2011-11-25 Пептиды tomm34 и содержащие их вакцины EA028216B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41918110P 2010-12-02 2010-12-02
PCT/JP2011/006551 WO2012073459A1 (en) 2010-12-02 2011-11-25 Tomm34 peptides and vaccines including the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390811A1 EA201390811A1 (ru) 2013-12-30
EA028216B1 true EA028216B1 (ru) 2017-10-31

Family

ID=46171433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390811A EA028216B1 (ru) 2010-12-02 2011-11-25 Пептиды tomm34 и содержащие их вакцины

Country Status (22)

Country Link
US (3) US9125849B2 (ru)
EP (1) EP2646546B1 (ru)
JP (2) JP6064186B2 (ru)
KR (1) KR102004900B1 (ru)
CN (2) CN105111281A (ru)
AR (1) AR084095A1 (ru)
AU (1) AU2011336019B2 (ru)
BR (1) BR112013013158B1 (ru)
CA (1) CA2819463C (ru)
CO (1) CO6862100A2 (ru)
DK (1) DK2646546T3 (ru)
EA (1) EA028216B1 (ru)
ES (1) ES2677118T3 (ru)
IL (1) IL226068B (ru)
MX (1) MX344586B (ru)
MY (1) MY166516A (ru)
NZ (1) NZ611361A (ru)
SG (2) SG190407A1 (ru)
TW (1) TWI618541B (ru)
UA (1) UA110119C2 (ru)
WO (1) WO2012073459A1 (ru)
ZA (1) ZA201303886B (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013317194B2 (en) 2012-09-11 2018-07-12 Oncotherapy Science, Inc. UBE2T peptides and vaccines containing the same
JP2015228191A (ja) * 2014-06-03 2015-12-17 カシオ計算機株式会社 コンテンツ出力システム、コンテンツ出力方法、コンテンツ出力プログラム、および通信端末
WO2017150084A1 (ja) * 2016-02-29 2017-09-08 京セラドキュメントソリューションズ株式会社 電子機器およびマーカー処理方法
US11325959B2 (en) 2017-01-25 2022-05-10 Ose Immunotherapeutics Method for manufacturing a stable emulsion for peptide delivery

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003104275A2 (en) * 2002-06-06 2003-12-18 Oncotherapy Science, Inc. Genes and polypeptides relating to human colon cancers
WO2004024766A1 (ja) * 2002-09-12 2004-03-25 Oncotherapy Science, Inc. Kdrペプチド及びこれを含むワクチン
WO2007013576A1 (en) * 2005-07-27 2007-02-01 Oncotherapy Science, Inc. Colon cancer related gene tom34
WO2008126413A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 Oncotherapy Science, Inc. Tem8 peptides and vaccines comprising the same

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5785973A (en) 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
CA2047191A1 (en) 1989-02-17 1990-08-18 Hendrik M. Geysen Method for the use and synthesis of peptides
WO1994021808A1 (de) * 1993-03-19 1994-09-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen
US5840839A (en) 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
US20020137683A1 (en) 2000-01-03 2002-09-26 Hogan Kevin T. C-ski oncogene-derived peptides for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
US7700359B2 (en) 2000-06-02 2010-04-20 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Gene products differentially expressed in cancerous cells
US20040181344A1 (en) 2002-01-29 2004-09-16 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for providing diagnostic services
JP4406607B2 (ja) 2002-08-26 2010-02-03 オンコセラピー・サイエンス株式会社 ペプチド及びこれを含む医薬
WO2004061423A2 (en) 2003-01-06 2004-07-22 Wyeth Compositions and methods for diagnosing and treating colon cancers
US20080274129A1 (en) * 2003-04-18 2008-11-06 Fikes John D Hla-A2 Tumor Associated Antigen Peptides and Compositions
DE602005016112D1 (de) * 2005-09-05 2009-10-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumorassoziierte Peptide, die HLA Klasse I oder II-Moleküle binden, und anti-Tumor Impfstoffe
TWI615403B (zh) 2007-02-21 2018-02-21 腫瘤療法 科學股份有限公司 表現腫瘤相關抗原之癌症的胜肽疫苗
ES2617434T3 (es) * 2009-03-18 2017-06-19 Oncotherapy Science, Inc. Péptidos NEIL3 y vacunas que incluyen los mismos

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003104275A2 (en) * 2002-06-06 2003-12-18 Oncotherapy Science, Inc. Genes and polypeptides relating to human colon cancers
WO2004024766A1 (ja) * 2002-09-12 2004-03-25 Oncotherapy Science, Inc. Kdrペプチド及びこれを含むワクチン
WO2007013576A1 (en) * 2005-07-27 2007-02-01 Oncotherapy Science, Inc. Colon cancer related gene tom34
WO2008126413A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 Oncotherapy Science, Inc. Tem8 peptides and vaccines comprising the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAZAMA S. et al. Novel Vaccine Strategies for Colorectal Cancer, Biotherapy, 2009, vol. 23, No. 2, p. 160-164 *
OKUNO K. et al. Phase I clinical trial of a novel peptide vaccine in combination with UFT/LV for metastatic colorectal cancer, Experimental and Therapeutic Medicine, 2011.02, vol. 2, p. 73-79 *

Also Published As

Publication number Publication date
UA110119C2 (xx) 2015-11-25
CN105111281A (zh) 2015-12-02
US20150374810A1 (en) 2015-12-31
BR112013013158B1 (pt) 2020-04-28
ZA201303886B (en) 2014-03-26
CA2819463C (en) 2018-10-23
NZ611361A (en) 2014-10-31
MX2013006014A (es) 2013-07-29
KR102004900B1 (ko) 2019-07-29
AU2011336019B2 (en) 2016-07-07
MX344586B (es) 2016-12-20
ES2677118T3 (es) 2018-07-30
US9585948B2 (en) 2017-03-07
CA2819463A1 (en) 2012-06-07
EP2646546B1 (en) 2018-05-16
TW201225973A (en) 2012-07-01
IL226068B (en) 2019-01-31
EA201390811A1 (ru) 2013-12-30
CN103339253A (zh) 2013-10-02
CO6862100A2 (es) 2014-02-10
IL226068A0 (en) 2013-06-27
EP2646546A4 (en) 2015-12-23
DK2646546T3 (en) 2018-08-06
SG190407A1 (en) 2013-06-28
JP2016222676A (ja) 2016-12-28
AR084095A1 (es) 2013-04-17
WO2012073459A1 (en) 2012-06-07
JP6064186B2 (ja) 2017-01-25
CN103339253B (zh) 2015-09-09
BR112013013158A2 (pt) 2017-08-01
MY166516A (en) 2018-07-05
EP2646546A1 (en) 2013-10-09
US9125849B2 (en) 2015-09-08
US20170198010A1 (en) 2017-07-13
TWI618541B (zh) 2018-03-21
JP2014506114A (ja) 2014-03-13
AU2011336019A1 (en) 2013-07-04
US20140023671A1 (en) 2014-01-23
SG10201509823WA (en) 2015-12-30
KR20130121910A (ko) 2013-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201443077A (zh) Ｋｎｔｃ２胜肽及含此胜肽之疫苗
KR102015648B1 (ko) Ｍｐｈｏｓｐｈ１ 펩티드 및 이를 포함한 백신
ES2665576T3 (es) Péptidos TOPK y vacunas que los incluyen
TWI485245B (zh) 經修飾之ｍｅｌｋ胜肽及含此胜肽之疫苗
KR20130043627A (ko) Cdca5 펩티드 및 이를 포함한 백신
JP6518921B2 (ja) Ｔｈ１細胞のＩＭＰ−３エピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン
TW201302800A (zh) Ｓｅｍａ５ｂ胜肽及含其之疫苗
RU2531348C2 (ru) Пептиды ттк и вакцины, их содержащие
KR20150054710A (ko) Ube2t 펩티드 및 이를 포함하는 백신
JP2016222676A (ja) Ｔｏｍｍ３４ペプチドおよびそれを含むワクチン
KR101872284B1 (ko) Ｈｊｕｒｐ 펩티드 및 이를 포함한 백신
KR101863557B1 (ko) Ｅｃｔ２펩티드 및 이를 포함한 백신
WO2012032764A1 (en) Ttll4 peptides and vaccines containing the same
WO2014087626A1 (en) Sema5b peptides and vaccines containing the same
JP2014504146A (ja) Ｗｄｈｄ１ペプチドおよびそれを含むワクチン
JP2014500001A (ja) Ｃ１８ｏｒｆ５４ペプチドおよびそれを含むワクチン
TW201512223A (zh) Ｓｍｙｄ３胜肽及含此之疫苗
TW201439114A (zh) Ｃｄｃａ５胜肽及含此胜肽之疫苗
JP2013523083A (ja) Ｃｌｕａｐ１ペプチドおよびそれを含むワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM