JP6078844B2 - 癌免疫療法のためのペプチド及びその利用 - Google Patents
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Description
腎臓癌には、特異的な腫瘍マーカーがないのが現状であるので、早期診断が困難である。
非特許文献1〜3は、CA9ペプチドワクチン療法を開示している。ワクチン接種により特異的細胞傷害性T細胞は誘導できるものの、極めて限られた臨床効果であり、23例の患者のうち癌の部分的縮小を2名で認めたのみである。CA9は腎臓癌(淡明細胞癌)でほぼ100%の発現であるが、ワクチンとしての有用性は現時点では高くない。
非特許文献4は、変異VHLペプチドワクチン療法を開示している。腎臓癌患者では高率にVHL遺伝子の変異が認められる。この変異VHL遺伝子由来のペプチドを用いて腎臓癌患者リンパ球より、細胞傷害性T細胞の誘導が可能であると示されているが、臨床効果は不明である。
非特許文献5は、WT1ペプチドワクチン療法を開示している。WT1遺伝子由来で細胞傷害性T細胞の誘導可能なペプチドを用いたワクチン療法である。少数例の臨床試験の報告があるが、臨床効果は限定的である。
非特許文献6は、HIFPH3ペプチドによる細胞傷害性T細胞の誘導を開示している。HIFPH3は高率に腎臓癌に発現している。特異的細胞傷害性T細胞の誘導が証明されているものの、臨床での検討はこれからである。
特許文献1は、主に食道癌に関するものであるが、cDNAマイクロアレイを用いて食道癌の抗原を発見し、その抗原アミノ酸配列由来のペプチドを用いたワクチン療法を開示している。腎臓癌にも適用可能との記載もあるが、高いE:T比(大量のCTL)での癌細胞に対する細胞傷害活性である。
ILCEAHCLKV ‥‥‥(1)
VIEGDVVSAL ‥‥‥(2)
113-3-1)を同定し、これら抗原より高い活性を有する特異的細胞傷害性T細胞を誘導する6種類のペプチドを見出した。
その研究を進め、今回、更に、2種類の抗原遺伝子(36-6-1, 113-3-1)より、高い活性を有する特異的細胞傷害性T細胞を誘導する2種類のペプチドを見出して、本発明を完成するに至った。
サイトカイン療法が有効であった進行性腎臓癌患者血清を用いた解析は、本発明が初めてである。従来の着想では、当該遺伝子の発見には至らず、本発明は得られなかったと考えられる。
本発明のペプチドは、下記(1)〜(2)のいずれかのアミノ酸配列から成り、免疫誘導活性を有することを特徴とするペプチド。
ILCEAHCLKV ‥‥‥(1)
VIEGDVVSAL ‥‥‥(2)
天然由来の蛋白質を入手する場合には、その蛋白質を発現している細胞または組織から蛋白質の単離精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成の蛋白質を入手する場合には、Fmoc法やtBoc法などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。
組み替え蛋白質として産生するには、その蛋白質をコードする塩基配列を有するDNAまたはその変異体または相同体を入手し、好適な発現系に導入することにより製造することができる。
形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、微生物が資化しうる炭素原、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地でも合成培地でもよい。また、培養条件も微生物を培養するのに通常用いられる条件で行なえばよい。培養後、所望の蛋白質を単離精製するには、従来公知の蛋白質の単離精製法を用いればよい。
本発明のDNAは、上記に記載した蛋白質またはペプチドをコードするDNAであり、好ましくは、下記(a)、(b)、(c)のいずれかに記載のDNAである。
(a)上記(1)〜(2)のいずれかに記載の塩基配列を有するDNA。
(b)前記(a)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、免疫誘導活性を有する蛋白質またはペプチドをコードするDNA。
(c)前記(a)または(b)のDNAの部分配列を有し、免疫誘導活性を有する蛋白質またはペプチドをコードするDNA。
本発明は、本発明の蛋白質またはペプチドの一部もしくは全部をエピトープとして認識する抗体、並びに、本発明の蛋白質またはペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導された細胞傷害性T細胞にも関する。一般的には、細胞傷害性T細胞の方が抗体よりも強い抗腫瘍活性を示す。
ポリクローナル抗体は、本発明の蛋白質を抗原として哺乳動物を免疫感作して血液を採取し、採取した血液から抗体を分離精製することにより得られる。
哺乳動物としては、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどが挙げられ、例えば、抗原約0.05〜2mg程度を7〜30日間隔で2〜3回投与する。抗原は完全フロインドアジュバントや水酸化アルミニウム等のアジュパントを含有する適当な緩衝液に溶解して用い、投与経路としては、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与などが挙げられる。免疫感作した哺
乳動物から血液を採取して、遠心分離、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコールを用いた沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーなどによって分離精製することによりポリクローナル抗血清として、本発明の蛋白質を認識するポリクローナル抗体を得ることができる。
例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマが得られる。抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Bリンパ球等を使用する。抗原としては、本発明の蛋白質またはペプチドを使用する。免疫動物としては、マウス、ラット等を用い、アジュバントと抗原の蛋白質またはペプチドとの懸濁液を動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内に数回投与することによって動物を免疫する。免疫動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを従来公知の定法により融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではP3X63Ag8、P3U1株、Sp2/0株などが挙げられる。細胞融合に際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選択にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地などを使用する。細胞融合により得られるハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。酵素免疫測定法でスクリーニングを行うことにより、所望の蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。
ハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、細胞培養法や腹水形成法によりハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水からモノクローナル抗体を精製する。精製には、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用する。
本発明の蛋白質、ペプチド、DNAは、抗原特異的に腎臓癌細胞株を傷害することのできるT細胞を誘導することができるので、腎臓癌の治療薬、予防薬として使用可能である。例えば、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、組換えDNAで形質転換されたBCG菌の細菌、または本発明のDNAをゲノムに組込まれたワクシニアウイルス等のウイルスをワクチンとする。アジュバントとしては、フロイントの不完全アジュバント、BCG、トレハロースダイマイコレート、リポ多糖、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられる。
本発明のDNAは、腎臓癌のDNAを取り出してその相同性を調べることで診断用プローブとして使用することができ、また、このプローブや上記抗体を使用し、腎臓癌診断薬として使用することもできる。
診断用プローブとしては、本発明の蛋白質をコードするDNAまたはRNAのアンチセンス鎖の全部または一部であり、プローブとして成立する程度の長さを有するものが好ましい。例えば、アンチセンス鎖を用いて検体から得られた腎臓癌抗原のmRNAを検出することにより診断が可能となる。検出に用いられる検体としては、被験者の腎臓等の細胞や、血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムDNAや、RNAなどを挙げられる。
本発明の蛋白質、ペプチド、または抗体をそのまま、或いは医薬的に許容される担体や希釈剤や補助剤と共に、注射や経皮吸収などで投与可能である。
本発明の蛋白質またはペプチドは、T細胞エピトープとして腎臓癌細胞特異的細胞傷害性T細胞を誘導できるので、腎臓癌の予防薬、治療薬として有用である。細胞傷害性T細胞の誘導活性を高めるための補助剤としては、サポニン系のQS−21、リポソーム、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。また、レンチナン、シゾフィラン、ピシバーニールなどの免疫賦活剤を補助剤として用いることもできる。また、IL−2、IL−4、IL−12、IL−1、IL−6、TNF、IFNなどのT細胞の増殖、分化を増強するサイトカイン等も補助剤として用いることができる。
本発明の蛋白質の発現をRNAi現象により抑制できる核酸としては、siRNA、shRNA、またはそれらの発現ベクターなどが挙げられる。
この誘導体には、合成や精製を促進するための修飾、物理、化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾などを含む。
ペプチド誘導体におけるその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化などが含まれる。
具体的には、ペプチド誘導体は、本発明のペプチドの活性を破壊せず、またこれを含有する組成物に毒性を与えない範囲において、残基の側鎖またはN末端基またはC末端基として生じる機能性基として調製することができる。例えば、体液中でペプチドの残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含む誘導体、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたはアミンと反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のN−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離の水酸基のO−アシル誘導体などが挙げられる。
この塩には、ポリペプチドのカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の双方を含む。
カルボキシル基の塩は、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛などの無機塩や、トリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成された有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸や硫酸などの鉱酸との塩、酢酸やシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。
被験者由来の生体試料において、本発明のペプチド関連遺伝子の発現レベルを求めるステップと、その発現レベルを正常対照レベルと比較し所定の閾値より高ければ、腎臓癌を発症する素因が高いと評価するステップとを有する。生体試料としては、腎臓細胞や血液などが挙げられ、その採取調製方法やペプチド関連遺伝子の発現レベルの測定方法や評価方法は、従来公知の定法が利用できる。
なお、SEREX(serological analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning)法とは、癌患者より摘出した癌組織から直接mRNAを抽出し、作製したcDNA発現ライブラリーから癌患者の血清を用いて癌抗原を検索する方法である。マイクロアレイ等とは異なった網羅的解析法であり、データベースにSEREX抗原として多くの遺伝子が登録されているが殆どは未評価で、腎臓癌での報告は極めて少ない。
E coli phage lysateにニトロセルロース(NC)膜を浸し、E coliやファージで発現している蛋白質をNC膜に吸着させた。そのNC膜を、TBSTで5倍に希釈した腎臓癌患者血清に浸して取り出し、血清中から大腸菌やファージと交差反応する抗体を除去して、SEREX法によるスクリーニングに使用した。
TBSTで洗浄の後1時間ブロッキングを行い、1次抗体として100倍希釈の上記処理済みの患者血清と室温で2時間反応させた。TBSTで洗浄のあと、2次抗体としてgoat anti-huma IgG (ALP-conjugated)と室温で1時間反応させた。TBST及びTBSで洗った後、BCIP及びNBTを用いて発色させた。プラークリフトを取った元のファージのプレートより、NC膜で陽性のシグナルが出ている場所と一致する場所のプラークを含む培地を打ち抜いて、SMバッファーに浮かべ、2次スクリーニングに供した。
3次スクリーニングで単一のクローンを得て、ファージよりin-vivo excisionを行い、プラスミド(pBluescript)に遺伝子がクローニングされている形にして、シーケンスを行った。
その結果、全ての臨床検体の腎臓癌組織において、正常腎臓組織と比べて著しく発現の亢進している遺伝子が2種類得られた。
ATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG ‥‥‥(3)
CTATGTCTGCACATGGGTCAG ‥‥‥(4)
AAGATAATTCGCAGTGATGTGAA ‥‥‥(5)
GTAGATCAAGACAAGTAATGTTG ‥‥‥(6)
なお、図1では、正常部分と腎臓癌部分の遺伝子の発現を比較した5例のみの結果を示したが、症例を15例に増やして検討しても、36-6-1及び113-3-1も同様の結果であった。
その結果、図2(a)及び(b)に示すように、各抗原を発現している腎臓癌細胞株TUHR−10TKBにおいて、誘導された細胞傷害性T細胞により、HLA−A*0201拘束性に障害されることが明らかになった(10TKB:A*0201/A*2402,antigen(+)は腎臓癌、10RGB:A*0206/A*2402,antigen(+)は腎臓癌、NEC8:A*2402/A*2402,antigen(-)は精巣腫瘍、MCF7:A*0201/A*0201,antigen(-)は乳癌の培養細胞株)。
なお、HLA−A*0206を有する10RGB細胞に対する細胞傷害活性も認められるが、HLA−A*0201とHLA−A*0206は血清学的には区別のできない同一のタイプであり、これらのものに対しては同様に活性が認められても矛盾しない。
従来の細胞障害性T細胞を誘導するペプチドは、本発明のペプチドとは異なった方法でスクリーニングされた遺伝子由来であり、腎臓癌患者血液のリンパ球を刺激して細胞障害性T細胞の誘導を示していたが、本発明のペプチドでは、正常人のリンパ球から、高い活性の細胞障害性T細胞を誘導できた。
HLA−A*0201/A*3303の健常人の血液(少なくとも片方のアレルがHLA−A*0201)より、Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Bio-Science AB)を使用してPBMCを分離した(responder細胞)。
抗原提示細胞は、EB virusにより形質変換させ不死化したB-cellであるRBRC-HEV0041(HLA-A*0201/A*2402)を用いた。
HLA−A*0201ドナーよりPBMCを分離し、24wellプレートに3 x 106/ml/well個ずつ分注し、ペプチドを5μM濃度で添加し、5日間培養した。
その後、7〜14日間隔で、同様の刺激を4回(ここからの刺激より各wellのrespondor細胞を2x106/mL/well個に調製する)入れ、次いで、responder細胞中のCD8+T細胞を90%程度まで濃縮し、ペプチドでパルスしたRBRC-HEV0041細胞を用いて同様に刺激した。最終刺激の5〜6日後に、51Cr releasing assayにてCD8+T細胞のターゲット細胞に対する細胞傷害活性を測定した。
誘導したCTLであるエフェクター細胞を回収し、2×106cells/mlの細胞濃度の液を用いて96 wellのマイクロプレートに希釈系列を作った(2×106 cells/ml、その3/10及び1/10)。51Crでラベルした標的細胞100μlをエフェクター細胞に加え、4時間共培養した後、CTLの攻撃を受けて傷害された標的細胞から遊離される放射活性を求めた。
このことは、これら抗原が、腎臓癌抗原として高い抗原性を有し、有用な免疫療法の標的であることを示すものである。なお、本発明の2つのペプチドは、併用も可能である。
そのため、腎臓等の癌の治療や早期発見に寄与し、産業上有用である。
Claims (4)
- 下記(1)〜(2)のいずれかのアミノ酸配列から成り、進行性腎臓癌特異的細胞傷害性T細胞を誘導する活性を有する
ことを特徴とするペプチド。
ILCEAHCLKV ‥‥‥(1)
VIEGDVVSAL ‥‥‥(2) - 請求項1に記載のペプチドが有効成分である
ことを特徴とする進行性腎臓癌ワクチン。 - 請求項1に記載のペプチドを抗原として哺乳動物(ヒトを除外する)を免疫感作し、その哺乳動物(ヒトを除外する)から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離精製する
ことを特徴とするポリクローナル抗体の製造方法。 - 請求項1に記載のペプチドを抗原として哺乳動物(ヒトを除外する)を免疫感作し、その哺乳動物(ヒトを除外する)から抗体産生細胞を採取し、その抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを得て、そのハイブリドーマを培養し精製する
ことを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
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