ES2894724T3

ES2894724T3 - Vacuna contra la malaria falciparum

Info

Publication number: ES2894724T3
Application number: ES12854476T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Kurtis; Christian Parcher Nixon; Dipak Kumar Raj; Jennifer Frances Friedman; Michal Fried; Patrick Emmet Duffy
Original assignee: Rhode Island Hospital; Seattle Childrens Hospital
Current assignee: Rhode Island Hospital; Seattle Childrens Hospital
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2032-11-30
Also published as: EP2785370A4; WO2013082500A3; US20200023047A1; EP2785370B1; US10213502B2; ZA201403950B; US20170326219A1; US10960065B2; BR112014013170A2; US20210283233A1; EP2785370A2; US20170258884A1; US10272145B2; EP3984551A1; US20140341918A1; US9662379B2; US20230293654A1; WO2013082500A2; US11554165B2

Abstract

Una vacuna para prevenir o reducir la gravedad de la malaria que comprende una composición que conduce a la inhibición de la salida del parásito de los glóbulos rojos o inhibe la salida del parásito de dichos glóbulos rojos, donde dicha composición comprende un polipéptido de PfSEP-1 (proteína de salida del esquizonte-1Plasmodium falciparum) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma o un ácido nucleico que codifica un producto del gen PfSEP-1 que comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento está definido por SEQ ID NO: 2 y provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o donde dicha composición comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y donde dicho fragmento de polinucleótido codifica un producto del gen PfSEP-1 que provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o donde dicha composición comprende un anticuerpo purificado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno PfSEP-1 de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna contra la malaria falciparum

Referencia a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reclama prioridad a la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61 / 566,365, presentada el 2 de diciembre de 2011 y a la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61 / 641,445, presentada el 2 de mayo de 2012.

Declaración sobre la investigación patrocinada federalmente

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos en virtud de la subvención 1R01AI076353 de los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general al campo de las vacunas contra la malaria.

Antecedentes de la invención

La malaria es una enfermedad infecciosa transmitida por mosquitos causada por un parásito. Al menos cuatro especies de parásitos de la malaria pueden infectar a los humanos en condiciones naturales: Plasmodium falciparum (P. falciparum), P. vivax, P. ovale y P. malariae. Las dos primeras especies causan la mayoría de las infecciones en todo el mundo. P. vivax y P. ovale tiene parásitos del hígado en estado latente (hipnozoítos) que pueden reactivarse (o "recaer") y causar malaria varios meses o años después de la picadura del mosquito infectante; en consecuencia, estas especies pueden ser difíciles de detectar en individuos infectados. La enfermedad grave es causada en gran parte por P. falciparum mientras que la enfermedad causada por P. vivax, P. ovale, y P. malariae es generalmente una enfermedad más leve que rara vez es fatal.

En los seres humanos, los parásitos crecen y se multiplican primero en las células del hígado y luego en los glóbulos rojos. En la sangre, sucesivas crías de parásitos crecen dentro de los glóbulos rojos y los destruyen, liberando parásitos hijos (merozoitos) que continúan el ciclo al invadir otros glóbulos rojos. Los parásitos del estadio sanguíneo causan los síntomas de la malaria. Cuando un mosquito hembra Anopheles recoge ciertas formas de parásitos en estadio sanguíneo, gametocitos, durante una ingestión de sangre, comienzan otro ciclo diferente de crecimiento y multiplicación en el mosquito. Después de 10-18 días, los parásitos se encuentran como esporozoitos en las glándulas salivales del mosquito. Cuando el mosquito Anopheles ingiere sangre de otro humano, los esporozoitos se inyectan con la saliva del mosquito y comienzan otra infección humana cuando parasitan las células del hígado.

La infección por los parásitos de la malaria puede provocar una amplia variedad de síntomas, que generalmente incluyen fiebre y dolor de cabeza, en casos graves que progresan al coma o la muerte. Se estima que hubo 225 millones de casos de malaria en todo el mundo en 2009. Se estima que 781.000 personas murieron a causa de la malaria en 2009 según el Informe mundial sobre el paludismo 2010 de la Organización Mundial de la Salud, lo que representa el 2,23% de las muertes en todo el mundo. El noventa por ciento de las muertes relacionadas con la malaria ocurren en África subsahariana, y la mayoría de las muertes son de niños pequeños. Plasmodium falciparum, la forma más grave de malaria es responsable de la gran mayoría de las muertes asociadas con la enfermedad. Los niños sufren la mayor morbilidad y mortalidad por malaria, sin embargo, este grupo de edad no ha sido incluido en la etapa de identificación del desarrollo de la vacuna. De los 100 candidatos a vacunas que se están investigando actualmente, más del 60% se basan en solo cuatro antígenos de parásitos, un hecho que ha causado una gran preocupación. Se necesitan con urgencia nuevos candidatos a antígenos.

Nirianne et al., Vaccine 29 (2011) 5838-5845 describe el antígeno 5 de repetición de serina Plasmodium falciparum como vacuna contra la malaria. El documento US 2004/137512 describe el antígeno 5 de repetición de serina y su uso como vacuna contra la malaria y como agente de diagnóstico de la malaria.

Breve descripción de la invención

La vacuna de la invención provoca con éxito y sorprendentemente una respuesta inmune que bloquea la ruptura de los RBCs por esquizontes (salida del parásito de los RBCs), protegiendo así a los individuos vacunados de la malaria grave. Las vacunas provocan una fuerte respuesta de anticuerpos al antígeno de la vacuna, como PfSEP1 o PfSEP-1A. Debido a la permeabilidad de los glóbulos rojos (RBCs por sus siglas en inglés) parasitados en las últimas etapas de la esquizogonía, los anticuerpos obtienen acceso a los RBCs infectados. Los anticuerpos contra el antígeno de la vacuna, por ejemplo, una proteína de salida de esquizontes (SEP por sus siglas en inglés) como PfSEP-1A (SEQ ID NO: 2, y otros fragmentos antigénicos de la proteína completa PfSEP-1 (SEQ ID NO: 3)) disminuyen la replicación del parásito a al menos el 10% (por ejemplo, 20, 40, 60%, 70% o más) deteniendo la rotura del esquizonte.

En consecuencia, la invención presenta una vacuna para prevenir o reducir la gravedad de la malaria que comprende una composición que conduce a la inhibición de la salida del parásito de los glóbulos rojos o inhibe la salida del parásito de dichos glóbulos rojos, donde dicha composición comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo o un ácido nucleico que codifica un producto génico que comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o donde dicha composición comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y donde dicho fragmento de polinucleótido codifica un producto génico que provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o donde dicha composición comprende un anticuerpo anti-PfSEP-1 purificado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde dicho anticuerpo o antígeno unido a un fragmento del mismo inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos. Además, la invención presenta una composición que inhibe la salida de parásitos de los glóbulos rojos para su uso en un método para prevenir o reducir la gravedad de la malaria, donde dicho método comprende administrar la composición a un sujeto, donde dicha composición comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo o un ácido nucleico que codifica un producto génico que comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y donde dicho fragmento de polinucleótido codifica un producto génico que provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o

donde dicha composición comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y donde dicho fragmento de polinucleótido codifica un producto génico que provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o donde dicha composición comprende un anticuerpo anti-PfSEP-1 purificado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y provoca una respuesta inmune que inhibe salida del parásito de los glóbulos rojos.

Además, la invención presenta una vacuna para prevenir o reducir la gravedad de la malaria que comprende una composición polipeptídica, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, donde dicho fragmento provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos.

Se describe una vacuna para prevenir o reducir la gravedad de la malaria que comprende una composición que conduce a la inhibición de la salida del parásito de los glóbulos rojos o inhibe la salida del parásito.

Según la invención, por ejemplo, la composición comprende un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o un ácido nucleico purificado que codifica un producto génico que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La vacuna puede contener una o más composiciones de una clase de proteínas que están implicadas en la salida del esquizonte, por lo que la vacuna puede contener PfSEP-1 / 1A (SEQ ID ^{NO: 3, 2, respectivamente) y posiblemente PbSEP-1 / 1A (SEQ}iD ^{NO: 67, 68, respectivamente), PfCDPK5 (SEQ ID}NO: 47), SERA5 (SEQ ID NO: 70, 72), PFSUB1) SEQ ID NO: 74) o PfPKG (SEQ ID NO: 76). Una respuesta inmune provocada por la inmunización con estos antígenos de la vacuna inhibe la salida de esquizontes. Según la invención, la composición comprende un antígeno purificado que provoca una respuesta de anticuerpo anti-PfSEP-1. Alternativamente, se usa un enfoque de inmunización pasiva. En el último caso, la composición comprende un anticuerpo purificado que se une específicamente a uno o más de los antígenos de la vacuna que están implicados en la salida de esquizontes (enumerados anteriormente), por lo que la composición comprende un anticuerpo anti-PfSEP-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Por tanto, se incluye una composición que inhibe la salida de parásitos de los glóbulos rojos para su uso en un método para prevenir o reducir la gravedad de la malaria, comprendiendo el método administrar la composición a un sujeto.

Se describe una vacuna para prevenir o reducir la gravedad de la malaria que comprende una composición polipeptídica, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SeQ ^{ID NO: 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 y 46, 68 y 74 (polipéptidos antigénicos o fragmentos de proteínas). Se da}a conocer una vacuna para prevenir o reducir la gravedad de la malaria que comprende una composición polipeptídica que comprende antígenos proteicos completos tales como proteínas que comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 8, 11, 15, 19, 22, 27,31, 35, 39, 43, 47, 67, 70, 74 y / o 76.

Se describe un péptido aislado que comprende un péptido que tiene al menos 90%, 95% o 99% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 2; un péptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90%, 95% o 99% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 1, o un fragmento del mismo en una composición de vacuna para el tratamiento o prevención de P. falciparum malaria. Alternativamente, el péptido aislado puede ser un péptido de SEQ ID NO: 3, un péptido codificado por un ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, o un fragmento del mismo.

Se describe una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90%, 95% o 99% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4, o cualquier fragmento del mismo en una composición de vacuna para el tratamiento o prevención de P. falciparum malaria.

Los antígenos para usarse en una vacuna contra la malaria incluyen uno o más de los siguientes polipéptidos (o fragmentos de los mismos) que provocan una disminución clínicamente relevante en la gravedad de la enfermedad o que reducen / previenen la infección o propagación de parásitos, reducen o inhiben la salida de parásitos de un glóbulo rojo (RBC), reducen o inhiben la salida de gametocitos (reduciendo / inhibiendo así la transmisión humana ^ mosquito), provocan un anticuerpo específico del parásito o una respuesta inmune celular o nucleótidos que codifican tales polipéptidos / fragmentos: SEQ ID NO: 2 según la invención, y / o SEQ ID NO: 3 según la invención, y posiblemente SEQ ID NO: 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 28, 39, 42, 43, 46, 47, 66, 67, 70, 72, 74 y / o 76. Por ejemplo, la composición de la vacuna comprende polipéptidos (o ácidos nucleicos que los codifican) que comprenden las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 2 según la invención, y posiblemente SEQ ID NO: 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 47, 66, 67, 70, 72, 74 y / o 76.

Se describe un vector o una célula huésped que expresa uno o más péptidos aislados o una o más secuencias de ácido nucleico aisladas descritas en el presente documento.

Otro aspecto se refiere a una composición de vacuna. La composición de vacuna contiene uno o más péptidos aislados o una o más secuencias de ácido nucleico aisladas descritas en el presente documento. La vacuna peptídica también puede contener un adyuvante. Los adyuvantes ejemplares incluyen sales de aluminio, tales como fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio. Otro adyuvante ejemplar es un adyuvante oleoso tal como la serie Montanide ISA, por ejemplo, ISA 50 V2 o ISA 720 VG. La vacuna de ADN contiene un vector eucariota para dirigir / controlar la expresión del antígeno en el sujeto a tratar.

La vacuna proporciona un nuevo régimen para tratar o prevenir P. falciparum malaria en un sujeto. Por consiguiente, la presente invención proporciona además la vacuna para su uso en un método de tratamiento o prevención de P. falciparum paludismo en un sujeto que lo necesite, el método comprende administrar la vacuna al sujeto. Preferiblemente, el sujeto es un niño menor de 5 años. Más preferiblemente, el sujeto tiene al menos aproximadamente 6-8 semanas de edad. La vacuna también es adecuada para su administración a niños mayores o adultos. La vacuna se puede administrar por vía oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, rectal, transbucal, intranasal, liposómica, vía inhalación, vaginal, intraoccular, vía administración local por catéter o stent, vía subcutánea, intraadural, por vía intraarticular, intratecal o en una forma de dosificación de liberación lenta. Preferiblemente, la vacuna se administra por vía intramuscular. El régimen de dosificación que se puede utilizar incluye, pero no se limita a, diario, tres veces por semana (intermitente), dos veces por semana, semanalmente o cada 14 días. Alternativamente, el régimen de dosificación incluye, pero no se limita a, una dosificación mensual o una dosificación cada 6-8 semanas. La vacuna se puede administrar por vía intramuscular una vez cada dos semanas durante 1, 2, 3, 4 o más veces sola o en combinación con 1, 2, 3, 4 o más vacunas adicionales en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano. Una vacuna adicional ejemplar contiene un inhibidor de la invasión del hígado por parásitos, tal como RTS,S (Mosquirix ™). Otra vacuna adicional ejemplar contiene un inhibidor de la invasión de glóbulos rojos de parásitos, como MSP-1. La vacuna se puede preparar mediante cualquier método conocido en la técnica.

También se proporciona en el presente documento un anticuerpo purificado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento está definido por SEQ ID NO: 2 y donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos. Además, la invención proporciona el anticuerpo purificado o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para prevenir o reducir la gravedad de la malaria, donde dicho método comprende administrar el anticuerpo purificado o fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto.

Se describe un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno que comprende el péptido aislado y un método de tratamiento de P. falciparum malaria en un sujeto que lo necesite mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo al sujeto. La P. falciparum malaria puede ser P. falciparum malaria aguda.

Aquí se describe un método para tratar P. falciparum malaria en un sujeto que lo necesite administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en el presente documento.

Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal purificado, por ejemplo, uno que se ha producido y es específico para la proteína de SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado. El tratamiento puede iniciarse en una etapa temprana después de la aparición de parásitos recrudescentes. Los síntomas del sujeto pueden ser leves o estar ausentes y la parasitemia es baja pero en aumento, por ejemplo, entre 4.000 y 10.000 / |jl. Alternativamente, el sujeto puede tener fiebre < 38,5 °C sin ningún otro síntoma acompañante. El sujeto puede ser un niño menor de 10 años. El sujeto también puede ser un niño mayor o un adulto. En un ejemplo, el sujeto se caracteriza por sufrir de P. falciparum malaria aguda, pero no ha respondido al tratamiento con fármacos anti-malaria. En este enfoque de inmunidad pasiva, el anticuerpo monoclonal humanizado purificado que se une específicamente a la proteína de SEQ ID NO: 2 se administra al sujeto para matar el agente infeccioso y / o inhibir la invasión de RBC.

El anticuerpo se puede administrar por vía oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, rectal, transbucal, intranasal, liposómica, por inhalación, vaginal, intraocular, vía administración local por catéter o stent, subcutáneamente, intraadiposalmente, intraarticularmente, intratecalmente o en una forma de dosificación de liberación lenta. Preferiblemente, el anticuerpo se administra por vía intravenosa o intramuscular. Por ejemplo, el anticuerpo se administra en cantidades de 1-2 gramos, 1, 2, 3 o 4 veces. El régimen de dosificación que se puede utilizar incluye, pero no se limita a, diario, tres veces por semana (intermitente), dos veces por semana, semanalmente o cada 14 días. Alternativamente, el régimen de dosificación incluye, pero no se limita a, una dosificación mensual o una dosificación cada 6-8 semanas. El anticuerpo se puede administrar por vía intravenosa una, dos o tres veces solo o en combinación con 1, 2, 3, 4 o más agentes terapéuticos adicionales en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano. El agente terapéutico adicional es, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más vacunas o anticuerpos adicionales, una terapia de combinación antimalaria con artemisinina o una inmunoterapia. Puede administrarse cualquier tratamiento terapéutico adecuado para la malaria. La vacuna adicional puede comprender un inhibidor de la invasión del hígado por parásitos o un inhibidor de la invasión de glóbulos rojos del parásito. Tales vacunas adicionales incluyen, pero no se limitan a, vacunas anti-invasión de RBC (MSP-1), RTS, S (Mosquirix ™), NYVAC-Pf7, CSP y [NANP] 19-5.1. El anticuerpo se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de otros agentes terapéuticos.

Las cantidades efectivas para este uso dependerán de, p. ej, la composición del anticuerpo, la forma de administración, la etapa y la gravedad de la P. falciparum malaria que se está tratando, el peso y el estado general de salud del paciente y el criterio del médico que prescribe, pero generalmente varían para el tratamiento de aproximadamente 10 mg / kg (peso de un sujeto) a 300 mg / kg, preferiblemente 20 mg / kg - 200 mg / kg.

Se divulga un kit para determinar la presencia de anticuerpos contra P. falciparum en una muestra obtenida de un sujeto. Una "muestra" es cualquier muestra de tejido o fluido corporal obtenida de un sujeto, que incluye, pero no se limita a, sangre, suero sanguíneo, orina y saliva. El kit contiene un antígeno o un anticuerpo y opcionalmente uno o más reactivos para la detección.

El kit también puede contener un medio de colección de muestras, un medio de almacenamiento para almacenar la muestra colectada y para su envío. El kit comprende además instrucciones de uso o un CD o CD-ROM con instrucciones sobre cómo colectar la muestra, enviar la muestra y los medios para interpretar los resultados de la prueba. El kit también puede contener una instrucción para su uso para diagnosticar la malaria o un receptáculo para recibir fluido o tejido corporal derivado del sujeto.

El kit también puede contener una muestra de control ya sea positiva o negativa o un estándar y / o un dispositivo algorítmico para evaluar los resultados y reactivos y componentes adicionales. El kit puede comprender además uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable.

Una "vacuna" debe entenderse como una composición para generar inmunidad para la profilaxis y / o el tratamiento de enfermedades. Por consiguiente, las vacunas son medicamentos que comprenden antígenos y están destinados a ser utilizados en humanos o animales para generar una defensa específica y una sustancia protectora mediante vacunación.

Un "sujeto" en el contexto de este documento es preferiblemente un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca, pero no se limitan a estos ejemplos. Un sujeto puede ser hombre o mujer. Un sujeto puede ser un niño o un adulto. Un sujeto puede ser uno que haya sido previamente diagnosticado o identificado con malaria y, opcionalmente, ya se ha sometido, o está sufriendo, una intervención terapéutica para la malaria. Alternativamente, un sujeto también puede ser uno que no ha sido diagnosticado previamente con malaria, pero que está en riesgo de desarrollar tal condición. p. ej debido a una infección o debido a un viaje dentro de una región en la que prevalece la malaria. Por ejemplo, un sujeto puede ser uno que presente uno o más síntomas de malaria.

Un sujeto "en riesgo de desarrollar malaria" en el contexto de este documento se refiere a un sujeto que vive en un área donde prevalece la malaria, como las áreas tropicales y subtropicales, o un sujeto que viaja en dicha área. Alternativamente, un sujeto en riesgo de desarrollar malaria también puede referirse a un sujeto que vive con o vive cerca de un sujeto diagnosticado o identificado con malaria.

Como se usa en el presente documento, un nucleótido o polipéptido "aislado" o "purificado" está sustancialmente libre de otros nucleótidos y polipéptidos. Los nucleótidos y polipéptidos purificados también están libres de material celular u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. Los compuestos purificados son al menos 60% en peso (peso seco) del compuesto de interés. Preferiblemente, la preparación es al menos 75%, más preferiblemente al menos 90% y lo más preferiblemente al menos 99% en peso del compuesto de interés. Por ejemplo, nucleótidos y polipéptidos purificados son unos que tienen al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% o 100% (p / p) del ácido nucleico o polipéptido deseado en peso.

La pureza se mide mediante cualquier método estándar apropiado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna, cromatografía en capa fina, o análisis de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC por sus siglas en inglés). Los nucleótidos y polipéptidos se purifican y se utilizan en una serie de productos para el consumo humano y animal, tal como animales de compañía (perros, gatos) y ganado (bovinos, equinos, ovinos, caprinos o porcinos, así como aves de corral). Un polinucleótido purificado o aislado (ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN)) está libre de genes o secuencias que lo flanquean en su estado natural. Por ejemplo, el ADN es un ADNc. "Purificado" también define un grado de esterilidad que es seguro para la administración a un sujeto humano, por ejemplo, que carece de agentes tóxicos o infecciosos.

De manera similar, por "sustancialmente puro" se entiende un nucleótido o polipéptido que se ha separado de los componentes que lo acompañan de forma natural. Por lo general, los nucleótidos y polipéptidos son sustancialmente puros cuando están al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99%, en peso, libres de proteínas y moléculas orgánicas de origen natural con los que están asociados naturalmente.

Por los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" de una formulación o componente de formulación se entiende una cantidad suficiente de la formulación o componente para proporcionar el efecto deseado. Por ejemplo, "una cantidad eficaz" de una vacuna es una cantidad de un compuesto necesaria para bloquear la ruptura de los glóbulos rojos (RBCs), bloquear la salida de parásitos de los RBCs, bloquear la salida de los gametocitos o provocar una respuesta inmunitaria celular o de anticuerpos al antígeno(s) de la vacuna. En última instancia, el médico o veterinario que lo atiende decide la cantidad y el régimen de dosificación adecuados.

Los términos "tratar" y "tratamiento", como se usan en el presente documento, se refieren a la administración de un agente o formulación a un individuo clínicamente sintomático que padece una afección, trastorno o enfermedad adversa, a fin de efectuar una reducción en la gravedad y / o frecuencia de síntomas, eliminar los síntomas y / o su causa subyacente, y / o facilitar la mejora o reparación del daño. Los términos "prevenir" y "prevención" se refieren a la administración de un agente o composición a un individuo clínicamente asintomático que es susceptible o predispuesto a una condición, trastorno o enfermedad adversa particular y, por lo tanto, se relaciona con la prevención de la aparición de síntomas. y / o su causa subyacente.

El término de transición "que comprende", que es sinónimo de "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por qué", es inclusivo o ilimitado y no excluye elementos o pasos de método adicionales no citados. Por el contrario, la frase de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en la reivindicación. La frase de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o pasos especificados y permite aquellos que no afecten materialmente a las características básicas y de la invención reivindicada.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción y de las reivindicaciones. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar en la práctica métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento o ensayos en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones, controlará todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, números de acceso a Genbank / NCBI y otras referencias mencionadas en este documento. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-C son gráficos de barras que muestran que los anticuerpos anti-PfSEP-1 generados por la vacunación con ADN inhiben el crecimiento / invasión de parásitos en un 58-65% en 3 cepas de parásitos in vitro. Los parásitos en etapa de anillo 3D7 (A), W2 (B) y D10 (C) se sincronizaron tres veces con sorbitol, se sembraron en placas con una parasitemia de 0,3-0,4% y se cultivaron para obtener trofozoítos maduros. Se cultivaron trofozoítos maduros en presencia de sueros de ratón anti-PfSEP-1 (dilución 1:10). Los controles negativos no incluyeron sueros de ratón y sueros de ratón preinmunes (dilución 1:10). Los sueros se inactivaron por calor y se dializaron antes de su uso. Los parásitos se cultivaron durante 24 horas y los parásitos en etapa de anillo se enumeraron mediante examen microscópico. Las barras representan la media de 5 réplicas independientes con cada réplica realizada por triplicado. Las barras de error representan SEM. P < 0,009 para la comparación entre sueros de ratón pre y post inmunes mediante la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica.

Las Figuras 2A-D son microfotografías que muestran la inmunolocalización de PfSEP-1. A) Los RBCs infectados fijados con metanol se sondaron con anti-PfSEP-1 de ratón (verde) y anti-MSP-1 de conejo (rojo) y se contratiñeron con DAPI para marcar los núcleos del parásito. PfSEP-1 se detecta solo en RBCs infectados con esquizontes, B) los RBCs infectados con esquizontes fijados con metanol no se marcan cuando se sondean con sueros de ratón preinmunes, C) los RBCs infectados con esquizontes no fijados y no permeabilizados se sondaron con anti-PfSEP-1 de ratón (rojo) y anti-glicoforina A de conejo (verde) y teñidas con DAPI para marcar los núcleos del parásito. PfSEP-1 co-localizado con glucoforina A en la superficie de los RBCs infectados por esquizontes, D) los RBCs infectados por esquizontes no fijados y no permeabilizados se sondaron con anti-PfSEP-1 de ratón (partículas de oro de 5 nm) y antiglicoforina A de conejo (partículas de oro de 10 nm) y teñidas con acetato de uranilo para mejorar el contraste de la membrana. PfSEP-1 localizado en la membrana de la vacuola esquizonte / parasitóforo (flecha negra), las hendiduras de Maurer (flecha amarilla) y la valva interna de la membrana de los RBC (flecha gris) mientras que la glucoforina A estaba confinada a la valva exterior de la membrana de los RBC (flecha blanca). Se obtuvieron resultados similares cuando se detectó PfSEP-1 con partículas de oro de 18 nm.

Las Figuras 3A-C son gráficos de barras que muestran que los anticuerpos anti-PfSEP-1 generados por la vacunación con ADN inhiben la salida de esquizontes a través de 3 cepas de parásitos in vitro.

Los parásitos en etapa de anillo 3D7 (A), W2 (B) y D10 (C) se sincronizaron tres veces usando sorbitol, se colocaron en placas con una parasitemia del 3,5% y se cultivaron para obtener esquizontes prematuros. Los parásitos se incubaron en presencia de sueros de ratón anti-PfSEP-1 (dilución 1:10). Los controles negativos no incluyeron sueros de ratón y sueros de ratón preinmunes (dilución 1:10). Los sueros se inactivaron por calor y se dializaron antes de su uso. Los esquizontes se enumeraron 12 horas después del tratamiento. Las barras representan la media de 5 réplicas independientes con cada réplica realizada por triplicado. Las barras de error representan SEM. P < 0,001 para la comparación entre sueros de ratón pre y post inmunes mediante la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica. La esquizontemia fue 5,3-6,8 veces mayor en cultivos tratados con sueros post-inmunes frente a pre-inmunes.

La Figura 4A es una fotografía de un gel electroforético, la Figura 4B es un gráfico de barras que muestra las respuestas de anticuerpos de ratones vacunados con rPbSEP-1A, y la Figura 4C es un gráfico de líneas que muestra la carga de parásitos. Las Figuras 4A-C muestran que la vacunación con rPbSEP-1A (polipéptido antigénico SEP-1A recombinante de P. berghei) protege a los ratones de la exposición al agente infeccioso, por ejemplo, P. berghei ANKA. A) Se expresó y purificó rPbSEP-1A a partir de lisados solubles de E. coli clarificados, inducidos. Las fracciones que contienen proteína recombinante se resolvieron en un gel SDS-PAGE al 8-15% y se tiñeron con Gel-Code Blue. Carril 1) cromatografía de quelato de níquel de lisado de E. coli soluble, carril 2) cromatografía de interacción hidrófoba del carril 1, carril 3) cromatografía de intercambio aniónico del carril 2. B) Respuesta de anticuerpos de ratones vacunados con rPbSEP-1A. Después de la vacunación, los ratones generaron respuestas de IgG anti-rPbSEP-1A de títulos altos. C) Los ratones vacunados con rPbSEP-1A tenían una parasitemia marcadamente reducida (reducción de 4,5 veces el día 7 después de la exposición, P <0,002) y la tasa de crecimiento del parásito en comparación con los ratones de control. Todos los ratones de control fueron sacrificados el día 7 debido a una alta parasitemia y enfermedad asociada.

La figura 5 es un gráfico de líneas que muestra la incidencia de malaria grave y muerte en niños de 1,5 a 3,5 años de edad durante intervalos con anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables e indetectables (1.688 y 23.806 semanas respectivamente). No se produjeron casos de malaria grave o muerte durante los intervalos con anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables. Las barras de error representan el IC del 95% ajustado para medidas repetidas.

La Figura 6 es un diagrama de puntos que muestra la relación entre la parasitemia y la edad para todos los frotis de sangre disponibles (n = 34.038). En el análisis de regresión multivariante, tanto la edad (P <0,001) como la edad2 (P <0,001) se relacionaron con la parsitemia. La línea de regresión polinomial de segundo grado (edad y edad2) se representa en rojo. El eje vertical está truncado a 1000 parásitos / 200 WBC para mayor claridad.

La Figura 7 es un diagrama que muestra la ubicación de los SNPs en PfSEP-1. Los datos obtenidos de Plasmodb.org representan la secuenciación de quince aislamientos de laboratorio y de campo. No se informan SNPs en la región identificada en el cribado diferencial (nt 2.431-3.249).

Las Figuras 8A-B son diagramas y la Figura 16C es una fotografía de un gel electroforético. Estas figuras muestran la estrategia de derribo y desactivación para PfSEP-1. A) vector de dirección para la estrategia de eliminación diseñada para interrumpir la región promotora, B) vector de dirección para la estrategia de desactivación diseñada para interrumpir la región codificante de proteínas, C) Evaluación de parásitos resistentes a fármacos para la interrupción de genes. La amplificación por PCR de los parásitos seleccionados por el fármaco se llevó a cabo usando: carril 1) cebadores F1 y R1, carril 2) cebadores F2 y R2 y, carril 3) cebadores F2 y R3. Solo los cebadores F1 y R1 se amplificaron con éxito, lo que indica la presencia de un vector episómico, pero no integrado.

La Figura 9 es una fotografía de un gel electroforético que muestra los resultados de la purificación cromatográfica de rPfSEP-1A. Las fracciones que contienen proteína recombinante se resolvieron en un gel SDS-PAGE al 8-15% y se tiñeron con Gel-Code Blue. Carril 1) lisado inducido, carril 2) cromatografía de quelato de níquel del carril 1, carril 3) cromatografía de interacción hidrofóbica del carril 2, carril 4) cromatografía de intercambio aniónico del carril 3, carril 5) cromatografía de hidroxiappatita del carril 4 y carril 6) rPfSEP-1A post-filtración de flujo tangencial, liofilización y reconstitución.

La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra el reconocimiento diferencial de rPfSEP-1A por anticuerpos IgG en plasma de individuos resistentes frente a susceptibles. Los pocillos de microvaloración recubiertos de antígeno se sondaron con plasma combinado de individuos resistentes (barras claras, n = 11) o individuos susceptibles (barras negras, n = 14, tabla S1) y el anticuerpo unido se detectó con IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina. RAMA-E es una proteína de merozoíto de P. falciparum, BSA es albúmina de suero bovino. Las barras representan la media de 4 pozos replicados. Las barras de error representan SEM. El reconocimiento de rPfSEP-1A por anticuerpos en plasma resistente, evaluado por densidad óptica, fue 4,4 veces mayor que por anticuerpos en plasma susceptible (prueba t de Student, P <0,0002).

Las Figuras 11A-B son fotografías de geles electroforéticos que muestran que los anticuerpos anti-Pf SEP-1 reconocen una proteína de 244 kDa en extractos de P. falciparum. Los RBCs infectados en la etapa mixta 3D7, los RBCs no infectados y rPf SEP-1A se analizaron mediante transferencia de Western. A) carriles 1 y 3 extractos de RBCs infectados con 3D7, carriles 2 y 4 extractos de RBCs no infectados. Los carriles 1 y 2 sondas con antisuero anti-PfSEP-1 (1: 500), los carriles 3 y 4 sondas con sueros de ratón preinmunes (1: 500). B) carriles 1 y 2, 0,05 |jg de rPfSEP-1A, carril 1 sonda con sueros de ratón anti-Pf SEP-1 (1: 2000), carril 2 sonda con sueros de ratón preinmunes (1: 2000). Las Figuras 12A-B son gráficos de barras que muestran que los anticuerpos anti-rPfSEP-1A generados por inmunización de proteínas inhiben el crecimiento / invasión de parásitos en un 72-74% a través de 2 cepas de parásitos in vitro. Los parásitos en etapa de anillo 3D7 (A) y W2 (B) se sincronizaron tres veces usando sorbitol, se colocaron en placas con una parasitemia del 0,3-0,4% y se cultivaron para obtener trofozoítos maduros. Se cultivaron trofozoítos maduros en presencia de sueros de ratón anti-rPfSEP-1A (dilución 1:10). Los controles negativos no incluyeron sueros de ratón y sueros de ratón preinmunes (dilución 1:10). Los sueros se inactivaron por calor y se dializaron antes de su uso. Los parásitos se cultivaron durante 24 horas y los parásitos en etapa de anillo se enumeraron mediante examen microscópico. Las barras representan la media de 5 réplicas independientes con cada réplica realizada por triplicado. Las barras de error representan SEM. P < 0,009 para la comparación entre sueros de ratón pre y post inmunes mediante la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica.

Las Figuras 13A-B son microfotografías que muestran que PfSEP-1 no se detecta en los RBCs infectados con trofozoíto o en los RBCs no infectados. Los RBCs infectados con trofozoítos no fijados y no permeabilizados (A) o los RBCs no infectados (B) se sondaron con anti-PfSEP-1 de ratón (partículas de oro de 5 nm) y antiglicoforina A de conejo (partículas de oro de 10 nm) y se tiñeron con acetato de uranilo para mejorar el contraste de la membrana. No se detectó PfSEP-1 en los RBCs infectados con trofozoíto o en los RBCs no infectados, mientras que la glucoforina A se limitó a la valva exterior de la membrana de los RBCs (flecha blanca).

La Figura 14A es un gráfico de barras y la Figura 14B es una microfotografía que muestra que los anticuerpos antirPfSEP-1A generados por inmunización de proteínas inhiben la salida de esquizontes a través de 2 cepas de parásitos in vitro. A) Los parásitos en etapa de anillo 3D7 (panel superior) y W2 (panel inferior) se sincronizaron tres veces usando sorbitol, se colocaron en placas con una parasitemia del 3,5% y se cultivaron para obtener esquizontes prematuros. Los parásitos se incubaron en presencia de sueros de ratón anti-PfSEP-1 (dilución 1:10). Los controles negativos no incluyeron sueros de ratón y sueros de ratón preinmunes (dilución 1:10). Los sueros se inactivaron por calor y se dializaron antes de su uso. Los esquizontes se enumeraron a las 12 horas después del tratamiento. Las barras representan la media de 5 réplicas independientes con cada réplica realizada por triplicado. Las barras de error representan SEM. P < 0,009 para la comparación entre sueros de ratón pre y post inmunes mediante la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica. La esquizontemia fue 4,3-6,0 veces mayor en cultivos tratados con sueros post-inmunes frente a pre-inmunes. B) Micrografías representativas de películas de sangre teñidas con giemsa preparadas a partir de cultivos 3D7 tratados con sueros pre-inmunes (panel superior) y post-inmunes (panel inferior).

Las Figuras 15A-C son gráficos de barras. La densidad de parásitos en A) todos los frotis de sangre y B) frotis de sangre positivos en niños de 2-3,5 años durante intervalos con anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables e indetectables, después de ajustar por fenotipo de hemoglobina, edad, parasitemia previa promedio en todos los frotis de sangre, y medidas repetidas. Las barras de error representan SEM.

C) Incidencia de malaria leve en niños de 2-3,5 años de edad durante intervalos con anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables e indetectables después de ajustar por fenotipo de hemoglobina, edad, parasitemia previa promedio en todos los frotis de sangre y medidas repetidas. Las barras de error representan el IC del 95%.

La Figura 16 es una tabla que muestra las características epidemiológicas de los individuos resistentes y susceptibles usados en ensayos de detección diferencial.

La Figura 17 es una tabla que muestra las características epidemiológicas de los individuos resistentes y susceptibles utilizados en los ensayos ELISA confirmatorios.

Las Figuras 18A-G son microfotografías que muestran los resultados de un análisis de inmunofluorescencia en glóbulos rojos infectados (iRBCs) fijados con metanol utilizando sueros anti-PfSEP-1 de ratón.

La Figura 19 es un gráfico de barras que muestra un ensayo de inhibición del crecimiento. El anti-PfSEP-1 de conejo inhibe el crecimiento / invasión de parásitos en un 68% in vitro.

La Figura 20 es un diagrama que muestra los mecanismos de salida del esquizonte y las interacciones proteína-proteína implicadas en el proceso. Las Figuras 21A-B son diagramas que muestran proteínas intracelulares y sus interacciones en los RBCs no infectados (A) en comparación con los RBCs infectados por parásitos (B). La Figura 21B ilustra el papel de la PfSEP en las interacciones proteína-proteína implicadas en la salida del esquizonte.

Descripción detallada de la invención

La invención representa un avance significativo en el tratamiento o la prevención de la malaria, por ejemplo, como P. falciparum malaria. Antes de la presente invención, todavía no estaba disponible una vacuna eficaz para la malaria, aunque se están desarrollando varias vacunas. La vacuna, SPf66, se probó extensamente en áreas endémicas en la década de 1990, pero los ensayos clínicos demostraron que no era lo suficientemente eficaz. Otras vacunas candidatas, dirigidas a la etapa sanguínea del ciclo de vida del parásito, como la invasión anti-glóbulos rojos (RBC) (antígeno de la proteína específica de merozoito 1 (MSP-1 por sus siglas en inglés) P. falciparum y antígeno del antígeno Apical de membrana 1 (AMA-1 por sus siglas en inglés) de merozoitos P. falciparum), también han sido insuficientes por sí solos. Se están desarrollando varias vacunas potenciales, por ejemplo, RTS,S (también llamada Mosquirix™) dirigidas a la etapa preeritrocítica. Un desafío importante en el campo es el tiempo de acción corto de una vacuna debido al rápido ciclo de infección / vida del parásito. Una vacuna, como la RTS,S, que funciona en la etapa previa al hígado, solo tiene 5 minutos para actuar antes de que el esporazoito entre en los hepatocitos. Las vacunas contra la invasión de RBCs tienen solo 15 segundos antes de que el merozoito ingrese a los glóbulos rojos.

P. falciparum sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los países en desarrollo y se necesitan con urgencia vacunas contra este parásito. Los humanos residentes de áreas endémicas desarrollan inmunidad protectora que limita la parasitemia y la enfermedad. La presente invención se refiere a secuencias de polipéptidos y ácidos nucleicos diseñadas a partir de P. falciparum en una composición de vacuna. Los antígenos de la vacuna se identificaron mediante una estrategia de cribado diferencial utilizando sueros de individuos resistentes y de susceptibles. Los antígenos se identificaron mediante la unión a antisueros de individuos resistentes y se caracterizaron adicionalmente. Se encontró que tales secuencias de ácido nucleico y polipéptidos eran útiles tanto con fines terapéuticos como de diagnóstico.

Secuencia de polinucleótidos y polipéptidos codificados

La invención está dirigida en parte a polinucleótidos y polipéptidos P. falciparum que son útiles, por ejemplo, para antígenos para vacunas contra P. falciparum malaria.

Los humanos residentes en áreas endémicas desarrollan inmunidad protectora que limita la parasitemia y la enfermedad, y la inmunidad humana adquirida de forma natural proporciona un modelo atractivo para la identificación de antígenos de vacunas. Se utilizaron muestras de plasma y datos parasitológicos recopilados durante un estudio de cohorte de nacimiento longitudinal en Muheza, Tanzania (TZN) para identificar antígenos P. falciparum previamente desconocidos asociados con la resistencia durante la vida temprana. Luego, los antígenos se validaron como dianas de anticuerpos asociados con la resistencia a la parasitemia en una gran cohorte de niños pequeños.

Utilizando plasma obtenido de miembros de la cohorte Muheza con máxima resistencia y susceptibilidad, se identificaron los antígenos del parásito reconocidos por los anticuerpos del huésped que median la resistencia a la parasitemia.

750.000 fagos de una librería de P. falciparum en estadio sanguíneo basado en 3D7 se cribaron diferencialmente usando plasma combinado de los individuos resistentes y susceptibles. Se identificaron tres clones que son reconocidos únicamente por anticuerpos en el plasma de grupos resistentes, pero no susceptibles. Estos clones codifican MSP-7 (MSP-7 nts 200 - 1.052), un gen hipotético único en Ch10 (cromosoma # 10 pb 901175 a 900359) y un gen hipotético único en Ch11 (cromosoma # 11 nts. 1333936 a 1335849). El gen de Ch11 tiene el ID de gen PF10_0212a.

La invención también se dirige en parte a polinucleótidos y polipéptidos mostrados en la Tabla siguiente que son útiles, por ejemplo, para antígenos para vacunas contra P. falciparum malaria,

fectado por pará

____________

ncia 2,080-2,53

AAAATAAA

AATT AA AG

ACT GAAGA

AAT ATTCTT

AAAAAAAG

AGT AAAGA

TTGAAAAA

AGT GAT AG

_____________

ENKDKVIG

ENHTESKD

_____________

Proteína quinasa dependiente de calcio de Plasmodium falciparum (PF-CDPK5), gen putativo PF3D7_1337800 (fragmento C)

Secuencia de ácido nucléico 255bp (Secuencia 1452-1706(255) del gen PF3D7_1337800

TTCTTAGCAGCTTGTTTAGATCATAGTATATTTCAACAAGATGTTATCTGTAGAAATGCTTTCA ATGTTTTTGATTTAGATGGTGATGGTGTTATAACAAAGGATGAATTATTTAAAATTCTATCCTT TAG T G C T G TACAAG TAT C C T T TAG TAAAGAAATTAT T GAAAATC T TAT TAAAGAAGT C GAT T C T AATAATGAT GGAT T TATAGATTAT GAT GAATT T TATAAGATGAT GAC GGGAGT TAAAGAAT GA

Longitud de secuencia:255 (SEQ ID NO: 45)

Secuencia de aminoácidos del fragmento C (Pf-CDPK5)

FLAACLDHSIFQQDVICRNAFNVFDLDGDGVITKDELFKILSFSAVQVSFSKEIIENLIKEVDS NNDGFIDYDEFYKMMTGVKE

Longitud de secuencia:84 (SEQ ID NO: 46)

Secuencia de aminoácidos de PF3D7_1337800(Pf-CDPK5)

MKETEVEDMDTNRKDGKIKKKEKIVNMKNEEVKSTTKSTLADSDEDYSIITLCTKCLSKK LE DNKNRIILDS KAFKDNRLKGRCSVS SNEDPLDNKLNLS PYFDRS QIIQE11LMNNDEL S DVYEIDRYKLGKGS YGNWKAVSKRTGQQRAIKIIEKKKIHNIERLKREILIMKQMDHP NIIKLYEVYEDNEKLYLVLELCDGGELFDKIVKYGSFSEYEAYKIMKQIFSALYYCHSKN IMHRDLKPENILYVDNTEDSPIQIIDWGFASKCMNNHNLKSWGTPYYIAPEILRGKYDK RCDIWSSGVIMYILLCGYPPFNGKNNDEILKKVEKGEFVFDSNYWARVSDDAKDLICQCL NYNYKERIDVEQVLKHRWFKKFKSNNLIINKTLNKTLIEKFKEFHKLCKIKKLAVTCIAY QLNEKDIGKLKKTFEAFDHNGDGVLTISEIFQCLKVNDNEFDRELYFLLKQLDTDGNGLI DYTEFLAACLPHSIFQQPVICRNAFNVFDLPGDGVITKDELFKILSFSAVQVSFSKEIIE N LIK EVD SN N D G FID YD EFYK M M TG VK E

Longitud de secuencia: 568 aa (SEQ ID NO:47)

Secuencia de nucleótidos codificante de PF3D7_1337800 (Pf-CDPK5)

AT GAAAGAGAC G GAG G T C GAAG AT AT G GAT AC GAAT AGAAAAGAT G G TAAAAT TAAAAAG AAAGAAAAAATAG TAAATAT GAAAAATGAAGAAGTGAAAAGTACGACAAAGAGTACGT TA G C C GATAG T GAT GAAGACTAT T C GAT TATAACTTTATGTACGAAATGT T TAT CTAAAAAA C T T GAAGATAATAAGAATCGAATAAT T C T T GATAGTAAAGC T T T TAAAGATAATAGAT TA AAAGGTAGAT GTAGT GT TAGTTC CAATGAAGAT CC T T TAGATAACAAAT TAAAT T TAT CA C CATAT T T T GATAGAT C C CAAATAAT T CAAGAAATAAT T T T GAT GAATAAT GAT GAAT TA AGTGATGTATATGAAATAGATAGATACAAGTTAGGCAAAGGATCTTATGGAAATGTTGTT AAAGC C GTAAGTAAAAGAAC T G G T CAACAGAGAGC TATAAAAAT TATAGAGAAAAAGAAA AT T CATAATAT T GAAAGATTAAAAAGAGAAATATTAATAATGAAACAGATGGAT CAT CCT AATAT TATAAAATTATAT GAAGTT TAT GAAGACAATGAAAAAT TATAT T TAGTATTAGAA T TAT G T GAC G G T G GAGAAT TAT T T GATAAAAT T G TAAAATAT GGTAGCTTCTCT GAATAT GAAGCATATAAAAT TAT GAAACAAATAT T T T CAGCTTTATAT TAT T GT CATAGTAAAAAT AT TAT GCATAGAGAT T TAAAACCAGAAAATAT T T TATAT GTAGATAATACAGAAGATT CT CCTATACAAATAAT T GAT T GGGGAT T CGC TAGTAAAT GTAT GAATAAT CATAAT T T GAAA T CAGTTGTT GGGACACC T TAT TATATAGCAC CC GAAATAT TAAGAG GTAAATATGACAAA AGATGTGATATATGGAGTAGTGGTGTAATTATGTATATTTTATTATGTGGATATCCACCA TTTAATGGAAAAAATAATGATGAAATCTTAAAAAAAGTGGAAAAAGGAGAATTTGTTTTC GAT T C CAAT TAT T GGG CAAGAGT TAGT GAT GAT GC TAAAGAT T TAAT T T G T CAAT G T T TA AAT TATAAT TATAAAGAAAGAATAGAT GT T GAGCAAGT T CTAAAACATAGAT GGT T CAAA AAAT T TAAATCAAATAAT CT TAT TATAAATAAAACAT TAAATAAAACT T TAAT C GAAAAA T T TAAAGAATT C CATAAAT TAT GTAAAATTAAAAAGC TAGC T GTAACATG TATAGCATAC CAATTAAAT GAAAAAGATATAGGGAAAT TAAAAAAAACAT T T GAAGCT T T T GAT CATAAT GGAGATGGAGTATTAACCATAT CAGAAATT T T T CAAT GT T TAAAAGT TAATGACAATGAA T T T GATAGAGAATTATACT T T T TAT TAAAACAAC T T GATACAGAT G GAAAT GGATTAAT T GAT TATAC T GAAT T C T TAG CAGCTT GT T TAGAT CATAG TATAT T T CAACAAGAT GT TAT C TGTAGAAATG "TI"!' "AATGTTTTTGATTTAGATGGTGATGGTGTTATAACAAAGGATGAA _ _ JTTCTATCCTTTAGTGCTG" _ _ _ ^ _ TTTAGTAAAGAAATTATTGAA AAT C T TAT T AAAGAAG T C GAT T C TAAT AAT GAT GGAT T TAT AGAT TAT GAT GAAT T T TAT AAGAT GAT GAC G G GAG T T AAAGAAT GA

Longitud de secuencia: 1707 bp (SEQ ID NO:48)

PbSEP-1; Gen PBANKA_050600 (PbSEP-1A)

Secuencia de ácido nucléico de PB Clon #2828 bp (Secuencia 2172-2991 del gen PBANKA_050600)

T TAAAAGATAGTGAT GGATAT GAGAAATTAT TAAAAAATGACAT GTACGAT T TATATAATAT TA AGAT GCAT GAT T TAAATAAC T TAAAAT CATAT GAT T T T GAAT T T T CAAAAAATT TAT TAAAAAA C GAGATTTTTTTTTGTGGTGATAATATAAAAAG T GAT GAAATAAAT T TAAAT GATAAT GACATA AAT GAAAAGATT GAT T CAC TAAT GAACAAT TACAATAT TAT GAAAAACAAAC GT GACAAATT TA AT GAAGAAGAAAACGAAAT T CAAAAC T T T T TAG CAGAAT TAAAAGC T GAT GTAAC TAAT CAAC T CAATCTAAATAACGGGGAAGATGAACAGGCTTTTGATTTGCTTAATTCGTTTGATATAAACAAT AAC T T T GAC GAT TTTGTTGG CAAC T T T GAT GATACAAAT GAT AACATAG C T CAAAATAAAT CAG ACATAGACAATAATAAAGAG T T C GAACAC GAAAATGATATAAAT CAT GAT TATAAC GAT T GT GG TACATATAT G GAT GATATATATAATAACAATAAT G G T GAT GATAT T T C GAGAAAGGGAT CAC GT CTGAAATTGTCTGATTTAAATGACGAAAAGAATTTATTTCCAGATGTCAACTCCTCTTTTAATA C T C C TATAAAAT C T T C T GAAC TAAAGAGAGATT CAGAAT GC CAAACAAATT CAC CAC T TATAT T T T C TAGAAGTAATAGAAC T C C TAGGAAAAAAAGT GTAGAAG TAATAT TAG TAAAGAAAAAAT TA AAAAAAAGAAAAGAAAAAGAATCAAATATAT CAT T T GAAAATACAACACAT GAT GAT TAT

Longitud de secuencia:828 bp (SEQ ID NO:65)

PBANKA_050600 (PMEP-14 aa 724-997)

LKDSDGYEKLLKNDMYDLYNIKMHDLNNLKSYDFEFSKNLLKNEIFFCGDNIKSDEINLNDNDI NEKIDSLMNNYNIMKNKRDKFNEEENEIQNFLAELKADVTNQLNLNNGEDEQAFDLLNSFDINN NFDDFVGNFDDTNDNIAQNKSDIDNNKEFEHENDINHDYNDCGTYMDDIYNNNNGDDISRKGSR LKLSDLNDEKNLFPDVNSSFNTPIKSSELKRDSECQTNSPLIFSRSNRTPRKKSVEVILVKKKL KKRKEKESNISFENTTHDDY

Longitud de secuencia:276 aa (SEQ ID NO:66)

Secuencia de aminoácidos del gen PBANKA_050600

M TDNEDQNKEDLIYYINRYSVNDILGNLEENDKLTNYDENSGICEYEIPFLLENVDNNNN NNTKEHSDRNSVSSYFDDGTCSIISKNDEKHYIDKCEKDKM PKEKINIIFIQNKGEM NSF EDILSMNNASSENLENKLNDRFYQLCCKSIADVNTHNLNKTKNIVKDKKGTLNIEHIDYG DIFLTIRHRLRGREEKTNNMLNNNNNNDNNNNHLYS DMADSVISNWREIKNHENFIKYEN YKEHEKEFIRRKLKKKCVNSLNGDKYFMANRKVFDYYRNNLDSYMTNGNEKDICKQENMS LHFLPKKRKSMNNSSLYNSQIIGQNEYILKNRTELKKEYIKKNEKQQEHIHNDDYYCDDN HSENLYNDDIYNYNKNLSNRQGNLPSNDFIYSCEIQNKKNSIPHNICVDRNVITPRNSTW NNENEIHEEDMVYYHSQNKGKNSHYVEAENEIQSNHYCEDKNTNSFNEYVNEIDKLDENY NMFNKVEEDDNNNNKENFNIYDGDEIDNNEAFDIKIEENDDYETYNNELELEVEVDDGIG NNIPFNNNDNFVNSNKNEDLDNINNCEHVSNSNHTKYGEEDNEQKAPSITSKDDKDYFDL LIKKYEQTRM SINESSTASLSESIYLSKEGTKEPSLNAHEM LKIASNTKNDVNNKIECLN ENLIDLKNNKEIINEGECESNGFSIEKNDIEKENDNIVKLGSVYNNDKTEGERGNIGNKN EKVDLKDSDGYEKLLKNDMYDLYNIKMHDLNNLKSYDFEFSKNLLKNEIFFCGDNIKSDE INLNDNDINFKIDSLMNNYNIMKNKRDKFNFFFNFIQNFLAELKADVTNQLNLNNGFDEQ AFDLLNSFDINNNFDDFVGNFDDTNDNIAGNKf SÍKEFEHENDINHDYNDCGTYMDD

IY DDI RK RLI IDEK LFPD F TPIK ELK RD E Q TNSPLIFS RSNRTPRKKSVEI (KLKKRKEKESNIS FENTTHDDYTVGTTTATS SINSKRRYPKR NRIKTLRYW IGERELTRRNPETGEIDW GFSECKNLEELSPHIIGPVYYKKM YLRDVNNL HGKGNEDANNNIDRNDNTDEENEITIEINNGMYENEVYNKIQNKENSVNKNDNVSNILKK SINGSIHNRSDNDAITRNGKKKRKKFINW NYIKKKTKKKLVKVIDKEVEQENENVDNRN TFSN N D N IIN D IT N V N H N SQ N N L D Q N FIA ISN D FIE N D D N IFFD A ISL G D N A H IN D IPE K SEEIIEAPGVDAIETTKVNGNEKEINLEKEINLEKEINLEKNKDVHVKKKLLDKKKKKKK KKNKGKEKEIDEMYKQLSFLNFNSFYS KGNEDKSKIEILKKTS TKKKGSKIDKEKVDEEN DKHNKNSGKEAKELITKKKKAKNMKKNKKRNMQNKEMKNYYEYTNNEIEKFYNNPNDRIE NEYNM GVDLEASIKTEEEKTEKIGELPILNSYTNEQYEHITNTNDITNSKSENFELHKNE DEEVEKLQTSTRRKKKKKSESLIHDTNELNKKRRKTDGNNSGELISINENDEIKNVDADK KINDKEGKYIKKVDKDTIMGSNGNNIDELNKDFEDNDQIKNIKKDEKKKETNTDGSNNMR NINLLEEIDANEKNSTLCLVTHNKKNNTNSQS FIIDK LK SYFNIK ELINVK K Q K TNNVIL NTFENKQIINNNPIRISLSYPSSVELSVENRCNQ TRNG Q FPLIQ K NLSNFK VDINLFCVQ IFPNK AH SSNSYDK ILIG YIYQ G K K VK IYFK NQ ERYFEK DEFFYIPK YSPFK IVNISRDN C ILY V Y PIN K

Longitud de secuencia: 1810 aa (SEQ ID NO:67)

Secuencia de nucleótidos codificante de PBANKA_050600

AT GACAGACAAC GAGGATCAAAATAAAGAAGAT C T GATATAT TACATAAATAGATACAGT GT CAATGATATAT TGGGAAATT TAGAAGAAAATGATAAGT TAACAAATTAT GAT GAAAAT AGC GGAATAT GT GAATATGAAATTCCATT T C T T T T GGAAAAT GT CGATAATAATAATAAT AATAATACTAAAGAACAT T C C GATAGAAAT TCTGTATCTAGTTATTTCGATGAT G GAACA T GT T CGAT TAT T T CTAAAAATGAT GAAAAACAT TATATAGACAAAT GT GAAAAAGACAAA AT G C CAAAGGAAAAAATAAATAT TATAT T TAT T CAGAATAAAGGT GAAATGAATAGC T T T GAAGATATT T TAT CCAT GAATAAT GCAAGCAGT GAAAAT T TAGAAAACAAGT TAAAT GAT AGAT T T TAT CAACTAT G T T GTAAAAGTAT T G C T GAT GT GAACACC CACAAT T TAAATAAA ACTAAAAATA TTGTAAAAGATAAAAAAGGGACATTGAATA TT GAGCATATAGATTATGGT GATATATTTTTAACCATTCGTCATCGTCTAAGAGGGCGTGAAGAAAAAACGAATAACATG C TAAATAATAATAATAATAATGATAATAATAATAATCATT TATATAG T GACAT G GC T GAT AGT G T TAT TAGTAATT G GAGG GAAATAAAAAAT CAT GAAAAT T T TATAAAATAT GAAAAG TATAAAGAG CAT GAAAAGGAG T T TATAAG GAGGAAAT T GAAAAAGAAATGCGTCAATAGT T TAAAT G GAGATAAATATT T TAT GG CCAATAGAAAAGTAT T T GAT TAT TAT C GTAATAAT T TAGATAGT TAC AT GAC TAAT GGGAAT GAAAAAGAT ATAT GCAAGCAAGAAAATAT GT CT C TACAT T T T T TAC CAAAAAAGAGAAAATCAATGAATAATAGT T CT T TATACAATT CTCAA AT AAT TGGAC AAAAT GAAT ATAT T T T AAAGAAT AGAACAT T T T TAAAAAAAT T T TAT ATA AAAAAAAAT TT TAAGCAACAAGAACATATC CATAAT GATGAT TAT TAT T G T GAT GATAAT CATAGTGAAAAT T TATATAATGAT GATATATATAAT TATAATAAAAACT T GAGTAATAGA CAAG G TAAT C TAC C CAG CAAT GAT T T TAT T TAT T CAT G T GAAAT T CAAAATAAGAAAAAT T CAATACCACATAATATAT GT GT CGATAGAAAT GTAATAACC CCACG GAACAGTACAT GG AATAATGAAAAC GAAAT T CAC GAAGAGGATAT G GT T TATTAT CAT T C T CAAAATAAGGGA AAAAAT T C AC AT T AT G TAGAAG C AGAAAAT G AAAT AC AAT C AAAT CATTATTGT GAAGAT AAAAAT ACAAACAG T T T TAAC GAATAT GT TAAT GAAAT TGATAAAC T C GAT GAAAAT TAT AATAT GT T TAACAAAGT T GAAGAGGAC GATAATAATAATAACAAAGAAAAT T T TAACATT TAT GAT GGT GAT GAAATAGATAATAAC GAAGCAT T T GATAT CAAAAT CGAAGAAAATGAT GAT TAT GAAAC AT AT AACAAC GAAT TAGAAT TAGAGGTAGAGGTAGAT GATGGAATAGGT AAT AAT AT T C CAT T TAAT AAT AAT GATAAT T T TGTAAATTCAAATAAGAAT GAAGAT T T G GAT AAT AT AAAT AAT T G T GAACAT G T T T CAAAT T CAAATCAT ACAAAAT AT GGG GAAGAA GAC AAT GAG CAAAAAG C T C CAT CAAT AAC C AG T AAAG AT GATAAAGAT TATTTTGATTTA C TAAT AAAAAAAT AT GAACAAAC T AGAAT GT CAAT TAAT GAAT C TAG T AC AGCC T C AC T T AGT GAAAGTAT T TAT T TAT CAAAAGAAGGAACAAAAGAACC T T C T T TAAAT GCT CACGAA AT GT TAAAAAT C GCAT C TAACACAAAGAAT GAT GTAAATAATAAAAT T GAAT GT T T GAAT GAAAACT TAATAGAT T 7AAAAAATAACAAGGAAAT TAT TAAT GAAGG GGAAT GT T T TAGT AAT GGTTTT TC TAT C GAAAAAAATGACATAGAAAAGGAAAAT GATAATATAGTAAAAT TA G GAAG T G TATATAATAAT GACAAAACAGAG G GG GAAAGAGG GAATAT T GGAAACAAAAAT GAAAAAG TAGAC C T TAAAAGATAGT GAT G GATAT GAGARATTAT T AAAAAAT GACAT GT AC A T T TATATAATAT T AAGAT Gv^AT GAT T TAAAT AAC T T AAAAT CAT AT GAT TT T GAAT T T T C AAAA AATTT A ’ F TAAAAAACGAGAT T T T T T T T T GT GGTGATAA TATAAAAAGT GATGAA AT AAAT T TAAAT GATAAT GAG AT AAAT GAAAAGAT T GA.TT CAA TAAT GAACAAT T AcAAT A T T M A A ^ ^ ^ ^ E G T C ^ ^ ^ T T A A f ^ A ^ A G A A ^ C ^ ^ T T ^ ^ A C T T T T m GCAGAAT TAAAAGCTGATG TAACTAATCAACTCAAT C TAAATAAC GGGGAAGAT GAACAG GCT T T TAGT TT GCT T AATAC G T' TT GAT AT AAACTGAT AACT T T GAC GAT T T T GT T GGCAAC T TTGATGATACAAAT GAT AAC AT AG CT CAAAAT AAAT CAGtA CATAGACAAT’AATAÁAGAG TTCGAACACGAAAATGATATAAAT CAT GAT TAT AAC G ATT GT G GTAC ATATAT G GAT GAT ÁTATATAATAAJAñTAATGGTGATGATATTT CGAGAAñ.GGGAT CACG T CT GAAAT T GT CT GAT T TAAATGAC GñAAAGAATTTAT TTCCAGATGTCAACT C CT CT T T TAATACTCCTATA AAAT C TT CT GAAG fAAAGAGAGATTCAGAAT GCCAAACAAAA T CAC CACTTATATT TT CT AGAAGTAATAGAAl..i C C T Ai j G AAAAAAAG T G TAG.AAGT AAT Ai? TAlG T AAAGAAAAAAT TA AAAAAAAGAAAAijAñAAAbtAA T CAAAT ATA TC AT T T GAAAAT AcAA CAL A i1 GAT GAT TA: T

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Longitud de secuencia: 5434 bp (SEQ ID NO:68)

SERA5 (antígeno repetido de serina 5)

PlasmoDB ID: PF3D7_0207600

Cromosoma 2; posición 303,593 - 307,027

Secuencia completa: pares de base 1-2994 (excluyendo intrones)

ATGAAGTCATATATTTCCTTGTTTTTCATATTGTGTGTTATATTTAACAAAAATGTTATAAAAT GTACAGGAGAAAGTCAAACAGGTAATACAGGAGGAGGTCAAGCAGGTAATACAGGAGGAGATCA AGCAGGTAGTACAGGAGGAAGTCCACAAGGTAGTACGGGAGCAAGTCCACAAGGTAGTACGGGA GCAAGTCCACAAGGTAGTACGGGAGCAAGTCAACCCGGAAGTTCCGAACCAAGCAATCCTGTAA GTTCCGGACATTCTGTAAGTACTGTATCAGTATCACAAACTTCAACTTCTTCAGAAAAACAGGA T AC AAT TC AAGT AAAAT C AG CT T TAT7 AAAAG AT TAT AT GGGTT TAAAAG TTACT GGTCC ATGT AAC GAAAATTTCATAATGT T CT TAGT TC CT CATATATATAT T GATGTT GATACAGAAGATACTA ATAT CGAATTAAGAACAACATT GAAAAAAACAAATAATGCAATAT CAT T T GAATCAAACAGTGG TTCATTAGAAAAAAAAAAATATG TAAAACTACCATCAAATGG TACAAC TG GTGAACAAGGTTCA AGTACGGGAACAGT TAGAGGAGATACAGAAC CAATTT CAGATTCAAGCTCAAGTTCAAGTT CAA GCTCTAGTTCAAGT T CAAGT TCAAGTTCAAG TT C TAG TT CAAGTT CTAGT TCAAGT TCAGAAAG TCTTCCTGCTAATGGAC CT GAT T CC CCTAC T GTTAAAC C GC CAAGAAAT T TACAAAATATATGT G AAACT GG AAAAAAC TT CAAGT 'I' GGT AG T AT ATATT AAG GAG AAT ACAT T AAT ACT T AAAT GGA AAG T AT AC G GAG AAACAAAAGAT AC T AC TGAAAAT AACAAAGTTG ATG TAAGAAAGT ATT T GAT AAAT GAAAAGGAAACCC CAT TTACTAATATACTAATACATGCGTATAAAGAACATAAT GGAACA AAC T TAAT AG AAAGTAa AAACT ACGC AAT AG GAT CAG AC AT T CC AG AAAAATG TGAT ACCT TAG CTTCCAATTGCTTTTTAAGTGGTAATTTTAACATTGAAAAATGCTTTCAATGTGCTCTTTTAGT AGAAAAAGAAAATAAAAAT GAC G TAT GT TACAAATACCTAT C TGAAGATAT TG TAAGTAAATT C AAAG AAAT AAAAGC T GAG AC AG AAGATG ATG ATG AAG AT GAT TAT ACT GAATATAAAT T AAC AG AAT CTATT GAT AATATATTAGT AAAAAT GT T T AAAAC AAAT G AAAATAAT G AT AAATCAGAATT AATAAAAT TAGAAGAAG TAGAT GATAGT TT GAAATTAGAATTAAT GAATTACTGTAGTTTACTT AAAG ACGT AG AT AC AAC AGG TAC CT T AG AT AATT AT G GG AT G GGAAAT GAAAT GGAT ATAT TTA ATAACT TAAA.G AG AT TATT AAT T TAT C ATT C AGAAG AAAAT ATT AATAC T TTAAAAAAT AAAT T CCGTAATGCAGCTGTAT GT C TT AAAAAT GT T GAT GAT TG GAT TGTAAAT AAGAGAGGT TT AGTA TTAC CT GAATTAAATTATGATT TAGAATAT T TCAAT GAACAT TTATATAATGATAAAAAT T CTC CAG AAG AT AAAG AT AAC AAAGGAAAAGG TGT GGT AC ATG TT G AT AC AACT TTAG AAAAAGAAGA TAC T TT AT C AT ATGATAAC T CAG AT AAT AT GTTT TGTAATAAAGAATAT T GTAAC AGATTAAAA GAT GAAAAT AAT TGT AT ATCTAATCTTC AAG TTG AAG AT CAAGGT AAT TG TGATAC TTC AT GGA TTTTTGCTT CAAAATA? C AT TTAG AAAC TAT T AG AT G TATGAAAG G AT AT G AACC TACO AAAAT TTCTGCTCTTTATGTAG CTAAT TGT TATAAAGGTGAACATAAAGATAGATGTGAT GAAGGT TCT AGT C CAAT G GAATT C TTACAAAT TATTGAAGAT TAT G GATT C TTACCAGCAGAAT CAAAT TATO CATATAAC TATG TGAAAGT T GGAGAACAAT G TCCAAAGGTAGAAGATCAC TGGATGAATCTATG GG AT AATG G AAñAATCT TAC AT AAC AAAAAT G AACCT AAT AG TT T AG AT G GTAAGGG ATAT ACT GCAT AT GAAAGT G AAAG AT T TC ATGAT AAT ATGG AT G CATT T GT T AAAAT TAT T AAAACT GAAG TAAT GAATAAAG GT T CAGTTAT T GCATATAT TAAAGCTGAAAATGTTATG GGATAT GAATT TAG TGGAAAGAAAGTACAGAACTTATGTGGTGAT GATACAGC TGATCATGCAG TTAATATTGTTGGT TAT G GTAAT TAT GT GAATAGCG AAGGAGAAAAAAAATCC TAT TGGATT GTAAGAAACAGT T GGG GTC C AT AT T GG G GAGA? GAAGGT TATTT T AAAGT AG ATATG TAT G G AC C AACT C AT TGTCATTT TAAC TT TAT TCACAG TG TTGTTATATTCAAT GTT GAT T TACC TAT GAATAATAAAACAAC TAAA AAAGAATC AAAAATATATGATTATTATTTAAAGGCC T CT CC AGAATTT TATCATAACCTTTACT TTAAGAAT T TTAATG TT GGTAAGAAAAATTTAT T CT C TGAAAAGGAAGATAAT GAAAACAACAA AAAATT AG G TAAC AACT ATATT AT ATTC GGT C AAGAT AC GGCAGGATCAG G AC AAAGTGG AAAjG G AAAGC AAT AC T GC ATT AGAAT C TGC AjG G AACTT GAAAT G AAGTCTCAGAACG TGT TCATGTTT ATC ACATAT TAAAAC AT ATAAAG GATGG C AAAAT AAG AATGGGTATGC GT AAATAT ATAGAT AC ACAAGATGTAAATAAGAAACAT TCT TGTACAAGATC C TATGCATTTAATC CAGAGAATTATGAA AAAT GTGTAAATTTATG TAATGT GAACTGGAAAACATGC GAG GAAAAAACATCACCAGGAC TTT GTT TATGCAAAT TGGATACAAATAACGAAT G TTATTT CT GT TATGTATAA

(SEQ ID NO: 69)

Secuencia completa: 1-997 aminoácidos

MKSYISLFFILCVIFNKNVIKCTGESQTGNTGGGQAGNTGGDQAGSTGGSPQGSTGASPQGSTG ASPQGSTGASQPGSSEPSNPVSSGHSVSTVSVSQTSTSSEKQDTIQVKSALLKDYMGLKVTGPC NENFIMFLVPHIYIDVDTEDTNIELRTTLKKTNNAI S FE £ N S G £ L EKKK Y VKL PSNGTTG EQGS STGTVRGDTEPISDSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSESSSSESLPANGPDSPTVKPPRNLQNIC ETGKNF KLWYIKENT LILKWKVYGET KDTT ENNKVDVRKY LINE KE T ? FTW ILI HA YKE HNGT NLIESKNYAIGSDIPEKCDTLASNC FLSGHFHIEKCFQCALLVEKENKH DVCYKYLSEDIVSKF KE IKAETEDDDEDDYTE YKLTESIDNILVKM FTCTNENN DKS ELIKLE EVDDS L KL ELMNYC S L L K DVDTTGT LDNY GMGN EMDIFNN L KRLLIYH SE ENINTL KN K FRNAAVC LKNVDDWIVNKRGLV LPELN YDL EYFNEH LYNDKN S P EDFÍDNKGKG W K VD T T L E K EDTL SYDNS DNMFCNK E YC NRLK DE NNCI£NLQVEDQGNC DT S WI FAS K YH LETIRCMKGYE PT K I£ALYVANC YKGE HK DRC DE GS S PMEFLQIIEDYGFLPAESNYPYNYVKVGEQCPKVEDHWKWLWDNGKILHNKHEPNSLDGKGYT AYE S ERFH DNM DAFVKIIKT EVMN KG S VI AY IKAE N VMG YE FS GK KVQN LC GDDT ADHAVHIVG YGN YVN SEGEKKSYWIVRNSWG PYWG DEGY FKVDMYG PT HC H FN FT HSWIFNVD L FMNNKT TK KE S K IYDYYLKAS PEFYHNLYFKNFNVGKKN L FSEK E DN EN NKKL GN NY11FGQDTAGSGQSGK E SNTAL ESAG TS NE' VS E RVHVYHILKHIKDGKIRMGMRK YIDT QDVNKKHSCTRS YAFNP ENYE KC VNLCNVNWKTCE EKPS PG LC LSKL DTNNECY FC YV

(SEQ ID NO: 70)

Nombre del clon Y2H: 17-1 (nucleótidos 2433-2994; aminoácidos

561 pares de bases

AAC T T TAT T CACAGTGTT GT TATAT T CAATGTTGAT T TACCTATGAATAATAAAACAAC TAAAAAAGAAT CAAAAATATATGAT TAT TAT T TAAAGGC C T C T C CAGAATT T TAT CATAAC C T T TAC T T TAAGAATT T TAAT GT T G GTAAGAAAAATT TAT T CT C T GAAAAGGAAGATAATGAAAACA ACAAAAAAT TAG G TAACAAC TATAT TATAT T C G G T CAAGATAC G G CAG GAT CAG GACAAAG T G G AAAG GAAAG CAATAC T G CAT TAGAAT C T G CAG GAAC T T CAAAT GAAG T C T CAGAAC G T GT T CAT GT T TATCACATAT TAAAACATATAAAG GAT G G CAAAATAAGAAT G G G TATGCGTAAATATATAG ATACACAAGAT G TAAATAAGAAACAT T C T T G TACAAGATC C TAT GCAT T TAAT C CAGAGAATTA T GAAAAAT G T G TAAAT T TAT G TAAT G T GAAC T G GAAAACAT G C GAG GAAAAAACAT CAC CAG GA CTTTGTTTATCCAAATTGGATACAAATAACGAATGTTATTTCTGTTATGTATAA

(SEQ ID NO: 71)

186 aminoácidos

NFIHSWIFNVDLPMNNKTTKKESKIYDYYLKASPEFYHNLYFKNFNVGKKNLFSEKEDNENNK KLGNNYIIFGQDTAGSGQSGKESNTALESAGTSNEVSERVHVYHILKHIKDGKIRMGMRKYIDT QDVNKKHSCTRSYAFNPENYEKCVNLCNVNWKTCEEKTSPGLCLSKLDTNNECYFCYV

(SEQ ID NO: 72)

SUB1 (proteasa 1 similar a la subtilisina)

PlasmoDB ID: PF3D7_0507500

Cromosoma 5; posición 307,490 - 309,556

Secuencia completa: pares de bases 1-2067 (excluyendo intrones)

ATGATGCTCAATAAAAAAGTTGTTGCTTTGTGCACACTTACCTTACATCTTTTTTGTATATTTC TAT G T C TAG GAAAG GAAG TAAG G T C T GAAGAAAAT G G GAAAATACAAGAT GAT G C TAAAAAGAT T G T TAG C GAAT TAC GAT T C C TAGAAAAAG TAGAAGAT G T TAT T GAAAAGAG TAACATAGGAG G G AAT G AG GTAGAT G C C GAT GAAAAT T C AT T T AAT C C G GAT AC T GAG G T T C C C ATAG AAGAG ATAG AAG AAAT AAAAAT GAG G GAAC T GAAAG AT G TAAAG GAAGAAAAAAAT AAAAAT GAC AAC C AT AA TAATAATAATAATAATATTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAATACTTTTGGTGAAGAAAAA GAAGAAG TAT C TAAGAAAAAAAAAAAG T TAAGAC T TATAG T TAG C GAGAAT CAT G CAAC TAC C C CCTCGTTTTTCCAAGAATCCCTTTTAGAACCTGATGTTTTATCCTTTTTAGAAAGTAAAGGGAA T T T G T C CAACT T GAAAAATATCAATT C TAT GAT TATAGAAC TAAAGGAAGATACAACGGAT GAT GAAT T AAT AT C T T AT AT TAAAAT T C T T GAGGAGAAG GGAGC T T T GAT T GAAT CAGATAAAT T AG T GAGT GCAGATAATAT T GATAT AAGT GGTAT AAAAGAT GCT ATAAGAAGAGGT GAAGAAAATAT T GAT GTTAAT GAT TATAAAAGTAT GT TAGAAGT CGAAAAT GAT GC T GAAGATTAT GATAAAATG TTTGGTATGTTTAATGAATCACATGCTGCAACATCTAAAAGGAAACGCCATTCAACAAATGAGC GT G GATAT GATACAT T T T CAT CAC C T T CATATAAGACATAT T CAAAAAGTGAT TAT T TATAT GA T GAT GATAATAATAATAATAAT TAT TAT TATAGT CATAGTAGTAAT GGT CATAATAGTAGTAGT C G TAATAG TAG TAG TAG T C G TAG TAGAC CAG G TAAATAT CAT T T CAAT GAT GAAT T T C GT AAT T TGCAATGGGGTTTAGATT TAT C CAGATTAGATGAAACACAAGAATTAAT TAACGAACATCAAGT GAT GAG TAC T C G TATAT G T G T TATAGATAG T G G TAT T GAT TATAAT CAT C C C GAT T TAAAAGAT AATAT TGAAT TAAATT TAAAAGAATTACAT GGAAGGAAAGGT T T T GAT GAT GATAATAAT GGTA TAGT T GAT GATATATAT GGT GC TAAT T T T GT AAAT AAT T C AG GAAAC C C GAT G GAT GATAAT T A T CAT G G TAC T CAT G TAT CAG GAAT TATAT C T G C CATAG GAAATAATAATATAG G T G T T GT AG G T GT T GATGTAAAT T CAAAATTAAT TAT T TGTAAAGCATTAGAT GAACATAAATTAGGAAGATTAG GAGATAT GT T CAAAT GT T TAGAT TAT T GTATAAGTAGAAAT GCACATAT GATAAAT GGAAGCT T T T CAT TT GAT GAATATAGT GGTAT T T T TAAT T CT T C TGTAGAATATT TACAAAGAAAAGGTAT C CTCTTTTTTGTATCTGCAAGTAATTGTAGTCATCCTAAATCGTCAACACCAGATATTAGAAAAT G T GAT T TAT C CATAAAT G CAAAATAT CCCCCTATCTTATCTACTGTTTATGATAAT GT TATAT C T GT TGCTAATT TAAAAAAAAATGATAATAATAAT CAT TAT T CAT TAT C CAT TAAT T C T TT T TAT AG CAATAAATAT T G T CAAC TAG C T G CAC CAG GAAC TAATATATAT T C TAC T G C T C CACAT AAT T CATAT C GAAAAT TAAAT G G TACAT C TAT GGCTGCTC CACAT G TAG C T G CAATAG CAT CAC T CAT ATTTTCTATTAATCCTGAC T TAT CATATAAAAAAGT TATACAAATAT TAAAAGAT TCTATTGTA TAT CTCCCTTCCT TAAAAAATAT G G T T G CAT G G G CAG GATAT G CAGATATAAATAAG G CAG T CA AT T TAG C CATAAAAT CAAAAAAAACATATAT CAAT T C TAATATAT C TAACAAG T G GAAAAAAAA AAG TAGATAT T T G CAT TAA

(SEQ ID NO: 73)

Secuencia completa: 1-688 aminoácidos

MMLNKKWALCTLTLHLFCIFLCLGKEVRSEENGKIQDDAKKIVSELRFLEKVEDVIEKSNIGG NEVDADENS FNPDTEVPIEEIEEIKMRE LKDVKE E KNKNDNHNNNNNNISSSSSSSSNTFGEEK EEVSKKKKKLRLIVSENHATTPSFFQESLLEPDVLSFLESKGNLSNLKNINSMIIELKEDTTDD ELISYIKILEEKGALIESDKLVSADNIDISGIKDAIRRGEENIDVNDYKSMLEVENDAEDYDKM FGMFNESHAATSKRKRHSTNERGYDTFSSPSYKTYSKSDYLYDDDNNNNNYYYSHSSNGHNSSS RNSSSSRSRPGKYHFNDEFRNLQWGLDLSRLDETQELINEHQVMSTRICVIDSGIDYNHPDLKD NI E LNLKE LHGRKGFDDDNNGIVDDIYGANFVNNS GNPMDDNYHGTHVS G i l SAI GNNNIGWG VDVNSKLIICKALDEHKLGRLGDMFKCLDYCISRNAHMINGSFSFDEYSGIFNSSVEYLQRKGI LFFVSASNCSHPKSSTPDIRKCDLSINAKYPPILSTVYDNVISVANLKKNDNNNHYSLSINSFY SNKYCQLAAPGTNIYSTAPHNSYRKLNGTSMAAPHVAAIASLIFSINPDLSYKKVIQILKDSIV YL P S LKNMVAWAGYADINKAVNLAIKSKKTYINSNISNKWKKKS RYLH

(SEQ ID NO: 74)

PKG (proteína quinasa dependiente de cGMP)

PlasmoDB ID: PF3D7_1436600

Cromosoma 14; posición 1,490,654 - 1,494,214

Secuencia completa: pares de bases 1-2562 (excluyendo intrones)

AT GGAAGAAGATGATAATC TAAAAAAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC TATAT T T T CAAATGAT G ATTTTACAGGAGAAGATAGTTTAATGGAGGATCATTTAGAACTTCGGGAAAAGCTTTCAGAAGATATTGA TATGATAAAGACTTCCTTAAAAAATAATCTAGTTTGTAGTACATTAAACGATAATGAAATATTGACTCTG TCTAATTATATGCAATTCTTTGTTTTTAAAAGTGGAAATTTAGTAATAAAACAAGGGGAAAAAGGGTCAT ACTTTTTCATTATTAATAGTGGCAAATTTGACGTTTATGTAAATGATAAAAAAGTAAAGACTATGGGAAA AGGTAGT T C T T T C GGT GAAGCTGCTTTAAT T CATAATACCCAAAGAAGT GCAACTAT TAT T GCAGAAACT GAT GGAAC T C TAT GGGGAGTTCAAAGAAGTACAT T TAGAGCTACCC TAAAACAAT TATC TAATAGAAAT T T TAACGAAAACAGAACAT T TAT C GAT T CC GT T TCAGT T T T T GATAT GT TAACT GAAGCACAAAAAAACAT GATTACTAATGCTTGTGTAATACAAAACTTTAAATCTGGTGAAACCATTGTTAAACAAGGAGATTATGGA GATGTCTTATACATTTTGAAAGAAGGAAAGGCTACAGTATATATTAACGATGAAGAGATAAGGGTTTTAG AGAAAGGTTCCTATTTTGGGGAAAGAGCTCTACT GTAT GAT GAACCAAGAAGT GCAACAAT CAT T GCAAA AGAACCAACCGCTTGTGCATCCATTTGTAGGAAATTATTAAATATTGTTCTAGGAAACTTACAAGTAGTT T TAT T T CGTAATAT TAT GACT GAAGC T T TACAACAGAGT GAAAT T T T TAAACAAT T TAGT GGGGATCAAT TAAACGAT TTAGCAGATACCGCCATT GT TC GAGAT TATCCAGCTAAT TATAATATAT TACATAAGGATAA GGTAAAATCCGTTAAATATATTATTGTATTGGAAGGTAAAGTAGAATTATTTCTTGATGATACTTCTATT GGTATAT TAT CCAGAGGAAT GT CT T T T GGAGATCAATAT GTAT TAAATCAGAAACAACCAT TTAAGCATA CTATTAAATCATTAGAAGTTTGTAAAATCGCATTAATAACGGAAACTTGTTTAGCTGATTGTCTAGGAAA TAATAATAT T GAT GCAT CTAT T GAT TATAATAATAAAAAAAGTAT TATAAAGAAAATGTATAT C T T TAGA TACT TAAC T GATAAACAAT GTAAT T TAT TAAT T GAAGC T T T TAGAACCACAAGATAT GAAGAAGGTGAT T ATATAATACAAGAAGGAGAAGTAGGATCTAGATTTTATATAATAAAAAATGGAGAAGTAGAAATAGTAAA AAATAAAAAAAGGTTACGTACCTTAGGAAAGAATGATTACTTTGGTGAAAGAGCTTTATTATATGATGAA CCAAGAACAGCTTCTGTTATAAGTAAAGTAAATAATGTTGAATGTTGGTTTGTTGATAAAAGTGTGTTTT TACAAAT TATACAAGGACC TAT GT TAGCACAT T T GGAAGAAAGAATAAAAAT GCAAGATAC TAAAGTAGA AAT GGAT GAACTAGAAACAGAAC GAATTAT T GGAAGAGGTAC T T TC GGAACAGT TAAAT TAGT T CATCAT AAACCAACAAAAATAAGATAT GC T T TAAAATGT GT TAGTAAAAGAAGTAT TAT TAAT T TAAAT CAACAAA ACAATATAAAAT TAGAAAGAGAAATAACAGCAGAAAAT GATCAT CCAT T TAT TATAAGAT TAGTAAGAAC AT T TAAAGAT TC TAAATAT T T C TAT T T TC TAACAGAAT TAGTAACAGGT GGAGAATTATAT GAT GC TAT T AGAAAATTAGGTTTATTATCTAAATCACAAGCTCAATTTTATTTAGGTTCTATCATTTTAGCTATTGAAT AT T TACAT GAAAGAAATAT T GTATATAGAGAT T TAAAACCAGAAAACAT T T TAT TAGATAAACAAGGT TA TGTAAAACTAATCGATTTTGGTTGTGCCAAAAAGGTACAAGGTAGAGCTTATACATTAGTAGGTACACCT CATTATATGGCACCTGAGGTTATTTTAGGAAAAGGTTATGGATGTACTGTTGACATATGGGCATTGGGAA TATGCCTATATGAATTTATATGTGGTCCATTACCATTTGGTAATGATGAAGAAGATCAATTAGAAATTTT CC GT GATATAT TAACC GGCCAAC T TACAT T T CCAGAT TAT GTAACAGACACAGATAGCATAAATT T GAT G AAAAGACTTC TAT GTAGAT TACC TCAAGGAAGAAT T GGT T GT T CAATAAAT GGCTTCAAAGACATAAAGG ATCACCCATTTTTCTCAAACTTTAATTGGGATAAATTGGCTGGTCGTTTGCTTGATCCGCCTTTAGTATC AAAAAGTGAAACT TAT GCAGAAGATAT T GATAT TAAACAAATAGAGGAGGAGGAT GC T GAGGATGAT GAG GAACCAT T GAACGAT GAAGACAAC T GGGACATAGAT T T T TAA

(SEQ ID NO: 75)

Secuencia completa: 1-853 aminoácidos

MEEDDNLKKGNERNKKKAIFSNDDFTGEDSLMEDHLELREKLSEDIDMIKTSLKNNLVCSTLNDNEILTL SNYMQFFVFKSGNLVIKQGEKGSYFFIINSGKFDVYVNDKKVKTMGKGSSFGEAALIHNTQRSATIIAET DGTLWGVQRSTFRATLKQLSNRNFNENRTFIDSVSVFDMLTEAQKNMITNACVIQNFKSGETIVKQGDYG DVLYILKEGKATVYINDEEIRVLEKGSYFGERALLYDEPRSATIIAKEPTACASICRKLLNIVLGNLQVV LFRNIM TEALQQSEIFKQFSGDQLNDLADTAIVRDYPANYNILHKDKVKSVKYIIVLEGKVELFLDDTSI GILSRGM SFGDQYVLNQKQPFKHTIKSLEVCKIALITETCLADCLGNNNIDASIDYNNKKSIIKKM YIFR YLTDKQCNLLIEAFRTTRYEEGDYIIQEGEVGSRFYIIKNGEVEIVKNKKRLRTLGKNDYFGERALLYDE PRTASVISKVNNVECW FVDKSVFLQIIQGPMLAHLEERIKMQDTKVEMDELETERIIGRGTFGTVKLVHH K PTK IRYA LKCV SK RSIIN LN Q Q N N IK LEREITA EN D H PFIIRLV RTFK D SK Y FY FLTELV TG G ELY D A I RKLGLLSKSQAQFYLGSIILAIEYLHERNIVYRDLKPENILLDKQGYVKLIDFGCAKKVQGRAYTLVGTP HYM APEVILGKGYGCTVDIW ALGICLYEFICGPLPFGNDEEDQLEIFRDILTGQLTFPDYVTDTDSINLM KRLLCRLPQGRIGCSINGFKDIKDHPFFSNFNW DKLAGRLLDPPLVSKSETYAEDIDIKQIEEEDAEDDE EPLNDEDNWDIDF

(SEQ ID NO: 76)

Las secuencias de aminoácidos subrayadas y las secuencias de ácidos nucleicos de ADNc corresponden a regiones inmunorrelevantes de los productos génicos y ácidos nucleicos que las codifican. Los fragmentos antigénicos (polipéptidos) se identificaron en virtud de la unión de anticuerpos de pacientes resistentes a la malaria.

La invención abarca "fragmentos" y "péptidos" de SEQ ID NOs: 2 o 3. Se describen "fragmentos" y "péptidos" de las SEQ ID NOs: 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, o 43, 47, 67, 70, 74, o 76. El polipéptido del clon 2 o el polipéptido de PF10_0212a (también conocido como PfSEP-1A; SEQ ID NO: 2) están incluidos en la presente invención. Dichos péptidos representan porciones del polipéptido que tienen, por ejemplo, propiedades de unión o inmunogénicas específicas. Un fragmento puede tener entre 3 y 10 aminoácidos, entre 10 y 20 aminoácidos, entre 20 y 40 aminoácidos, entre 40 y 56 aminoácidos de longitud o incluso más. Las secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad y lo más preferiblemente un 95% de identidad con los fragmentos descritos en el presente documento, se describen en el presente documento.

Además, se describen fragmentos y derivados de las secuencias de ácido nucleico, así como fragmentos y porciones de las secuencias de aminoácidos.

Un "polinucleótido" es un polímero de ácido nucleico de ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN), ARN o aDn modificado, o miméticos de ARN o ADN (tales como PNA) y derivados de los mismos y homólogos de los mismos. Por tanto, los polinucleótidos incluyen polímeros compuestos de nucleobases de origen natural, azúcares y enlaces internucleósidos covalentes (columna vertebral), así como polímeros que tienen porciones de origen no natural que funcionan de manera similar. Dichos polímeros de ácido nucleico modificados o sustituidos son bien conocidos en la técnica y, para los fines de la presente, se denominan "análogos". Los oligonucleótidos son generalmente polinucleótidos cortos desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 160 o 200 nucleótidos.

Un "polinucleótido variante" o una "secuencia de ácido nucleico variante" significa un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico y aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45 o 48, preferiblemente SEQ ID NO: 1. Las variantes no abarcan la secuencia de nucleótidos nativa. Otros polinucleótidos variantes incluyen aquellos que difieren de la SEQ ID NO: 1, pero debido a la redundancia del código genético, codifica un polipéptido de SEQ ID No: 2, o los aminoácidos 2-50 de SEQ ID No: 2, fragmentos de variantes de los mismos.

Por lo general, los polinucleótidos variantes tienen al menos aproximadamente 8 nucleótidos de longitud, a menudo al menos aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 2930, 35, 40, 45, 50, 55, 60 nucleótidos de longitud, o incluso aproximadamente 75-200 nucleótidos de longitud, o más.

En general, una variante de polipéptido conserva la función antigénica e incluye cualquier variante en la que los residuos en una posición particular de la secuencia hayan sido sustituidos por otros aminoácidos, y además incluye la posibilidad de insertar un residuo o residuos adicionales entre dos residuos del polipéptido original, así como la posibilidad de eliminar uno o más residuos de la secuencia original, que comprende

"Una variante de polipéptido" significa un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de S^eQ ID NO: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las variantes de polipéptidos incluyen aquellas en las que uno o más residuos de aminoácidos se añaden o eliminan en el N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Una variante de polipéptido tendrá al menos aproximadamente 71% -75% de identidad de secuencia de aminoácidos; al menos aproximadamente 76% -79% de identidad de secuencia de aminoácidos; al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia de aminoácidos y al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de longitud completa. Normalmente, los polipéptidos variantes tienen al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, a menudo al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o 300 aminoácidos de longitud o más.

Las sustituciones conservadoras útiles se muestran en la Tabla 2 a continuación. Las sustituciones conservadoras en las que un aminoácido de una clase se reemplaza por otro aminoácido del mismo tipo están dentro del alcance de la presente invención siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto.

Tabla 2.

Sustituciones ejemplares

Residuo original Sustituciones ejemplares Sustituciones preferidas

Cys (C) Ser Ser

Glu (Q) Asn Asn

Glu (E) Asp Asp

Gly (G) Pro, Ala Ala

(continúa)

Sustituciones ejemplares

Residuo original Sustituciones ejemplares Sustituciones preferidas

His (H) Asn, Gln. Lys, Arg Arg

Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu

Leu (L) Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile

Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg

Met (M) Leu, Phe, Ile Leu

Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu

Pro (P) Ala Ala

Ser (S) Thr Thr

Thr (T) Ser Ser

Trp (W) Tyr, Phe Tyr

Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucina Leu

Los polipéptidos se pueden sintetizar in vitro o expresado de forma recombinante a partir de las secuencias de polinudeótidos. Debido a la redundancia en el código genético, las secuencias no necesitan ser idénticas para practicar la invención. Las identidades de secuencia de polinucleótidos y polipéptidos pueden ser del 70% al 100%, tal como 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y por supuesto, 100%.

Los polipéptidos se pueden sintetizar fácilmente in vitro usando la química de los polipéptidos. Por ejemplo, la síntesis de polipéptidos se puede llevar a cabo de manera escalonada en un soporte de fase sólida usando un sintetizador de polipéptidos automatizado, tal como un sintetizador de péptidos Rainin Symphony, un sintetizador de péptidos Advanced Chemtech, un sistema de síntesis paralelo de Argonaut o un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems. El instrumento sintetizador de péptidos combina la química Fmoc con la activación de HOBt / HBTU / DIEA para realizar la síntesis de péptidos en fase sólida.

Las cadenas laterales de muchos aminoácidos contienen grupos químicamente reactivos, como aminas, alcoholes o tioles. Estas cadenas laterales deben protegerse adicionalmente para evitar reacciones secundarias no deseadas durante el paso de acoplamiento. Los grupos protectores de la cadena lateral que son estables a las bases, más preferiblemente, tanto estables a las bases como lábiles a los ácidos, son los más útiles.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencias de ácido nucleico se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico se puede lograr de varias formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando software de computadora disponible públicamente, como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNAS-TAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias que se comparan.

"Que consiste esencialmente en un polinucleótido que tiene un % de identidad de secuencia" significa que el polinucleótido no difiere sustancialmente en longitud, pero puede diferir sustancialmente en secuencia. Por tanto, un polinucleótido "A" que consiste esencialmente en un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia conocida "B" de 100 nucleótidos significa que el polinucleótido "A" tiene aproximadamente 100 nts de largo, pero hasta 20 nts pueden variar de la Secuencia "B". La secuencia de polinucleótidos en cuestión puede ser más larga o más corta debido a la modificación de los extremos, como, por ejemplo, la adición de 1-15 nucleótidos para producir tipos específicos de sondas, cebadores y otras herramientas moleculares, etc., como el caso de cuando se agregan secuencias sustancialmente no idénticas para crear estructuras secundarias deseadas. Tales nucleótidos no idénticos no se consideran en el cálculo de la identidad de secuencia cuando la secuencia se modifica porque “consiste esencialmente en".

Composiciones de vacunas

Se da a conocer una composición inmunogénica, p. ej, una composición de vacuna capaz de bloquear la infección por P. falciparum, por ejemplo, una vacuna de péptidos o una vacuna de ADN capaz de bloquear la ruptura de esquizontes en la etapa de infección sanguínea. La composición de la vacuna comprende uno o más de los polipéptidos, las secuencias de ácido nucleico o antígenos de los mismos, como se describe en el presente documento.

Una persona experta en la técnica podrá seleccionar péptidos, polipéptidos, secuencias de ácido nucleico o combinaciones de los mismos, preferidos, mediante la prueba, por ejemplo, del bloqueo de la ruptura del esquizonte o la salida del parásito de los RBCs in vitro. El péptido o péptidos con la actividad deseada se combinan luego como una vacuna. Una vacuna adecuada contendrá preferiblemente entre 1 y 20 péptidos, más preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 péptidos diferentes, preferiblemente 6, 7, 8, 9, 1011, 12, 13 o 14 péptidos diferentes, y más preferiblemente 12, 13 o 14 péptidos diferentes. Alternativamente, una vacuna adecuada contendrá preferiblemente entre 1 y 20 secuencias de ácido nucleico, más preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 secuencias de ácidos nucleicos diferentes, además se prefieren 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 o 14 secuencias de ácidos nucleicos diferentes y lo más preferiblemente 12, 13 o 14 secuencias de ácidos nucleicos diferentes.

Dicha vacuna se usa para la inmunización activa de un mamífero, por ejemplo, un ser humano que corre el riesgo de estar expuesto a uno o más antígenos de Plasmodium (por ejemplo, debido a viajar dentro de una región en la que prevalece la malaria). Se divulga que la vacuna puede contener al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: 1) un antígeno de P. falciparum que comprende un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 28, 39, 42, 43, 46, 47, 66, 67, 70, 72, 74 y / o 76, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3; 2) un antígeno de P. falciparum que comprende un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 28, 39, 42, 43, 46, 47, 66, 67, 70, 72, 74 y / o 76, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3, o fragmentos de los mismos; 3) un antígeno P. falciparum que comprende un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 28, 39, 42, 43, 46, 47, 66, 67, 70, 72, 74 y / o 76, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3, 4) un antígeno de P. falciparum que comprende un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 28, 39, 42, 43, 46, 47, 66, 67, 70, 72, 74 y / o 76, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3; 5) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de los péptidos enumerados anteriormente, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4; 6) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico que codifica los polipéptidos enumerados, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4; 7) una secuencia de ácido nucleico que consiste esencialmente en las secuencias de secuencia de ácido nucleico descritas anteriormente, y 8) una secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8-56 residuos de aminoácidos, tales como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56 residuos. Un fragmento de estas secuencias de ácido nucleico puede tener aproximadamente 10-300 nucleótidos, como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 nucleótidos.

Alternativamente, si se desea la inmunización pasiva, se describe la administración de uno o más anticuerpos contra los siguientes antígenos (como una vacuna): 1) un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47 preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3; 2) un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3, o fragmentos de los mismos; 3) un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3; y 4) una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8-56 residuos de aminoácidos, tales como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56 residuos.

La composición de vacuna puede comprender además un adyuvante y / o un portador. A continuación, se dan ejemplos de adyuvantes y portadores útiles. Los péptidos y / o polipéptidos en la composición se pueden asociar con un vehículo como p. ej una proteína o una célula presentadora de antígenos como p. ej una célula dendrítica (DC por sus siglas en inglés) capaz de presentar el péptido a una célula T.

Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla en la composición de la vacuna aumenta o modifica de otro modo la respuesta inmune al péptido mutante. Los portadores son estructuras de armazón, por ejemplo, un polipéptido o un polisacárido, a los que pueden asociarse los péptidos neoantigénicos. Opcionalmente, los adyuvantes se conjugan de forma covalente o no covalente a los péptidos o polipéptidos.

La capacidad de un adyuvante para aumentar la respuesta inmunitaria a un antígeno se manifiesta típicamente por un aumento significativo de la reacción mediada por el sistema inmunitario o una reducción de los síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, un aumento en la inmunidad humoral se manifiesta típicamente por un aumento significativo en el título de anticuerpos producidos contra el antígeno, y un aumento en la actividad de las células T se manifiesta típicamente en un aumento de la proliferación celular, citotoxicidad celular o secreción de citocinas. Un adyuvante también puede alterar una respuesta inmune, por ejemplo, cambiando una respuesta principalmente humoral o Th en una respuesta principalmente celular o Th.

Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA 50, Montanide ISA-51, Montanide ISA-720, 1018 ISS, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA , dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, sistema de vector PepTel.RTM., micropartículas PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, Mass., EE. UU.) que se deriva de saponina, extractos de micobacterias e imitadores de la pared celular bacteriana sintética y otros adyuvantes patentados como Ribi's Detox. Quil o Superfos. Se prefieren adyuvantes tales como Freund incompleto o GM-CSF. Varios adyuvantes inmunológicos (p. ej, MF59) específicos para células dendríticas y su preparación se han descrito previamente (Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186 (1): 18-27; Allison AC; Stand de Dev Biol. 1998; 92: 3- 11). También se pueden usar citocinas. Varias citocinas se han relacionado directamente con influir en la migración de células dendríticas a los tejidos linfoides (p. ej, TNF-alfa), lo cual acelera la maduración de células dendríticas en células presentadoras de antígenos eficaces para linfocitos T (por ejemplo, GM-CSF, IL-1 e IL-4) (patente de EE.UU. No.

5,849,589) y actúan como inmunoadyuvantes (por ejemplo, IL-12) (Gabrilovich DI, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996(6): 414- 418).

Otros ejemplos de agentes inmunoestimuladores útiles incluyen, pero no se limitan a, agonistas del receptor tipo Toll (TLR por sus siglas en inglés) tales como CpGs químicamente modificados (p. ej CpR, Idera), poli (I: C) (por ejemplo, polii: CI2U), ADN o ARN bacteriano no CpG, así como moléculas pequeñas inmunoactivas, como ciclofosfamida, que pueden actuar terapéuticamente y / o como adyuvante. El experto en la materia puede determinar fácilmente las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención sin una experimentación excesiva. Los adyuvantes adicionales incluyen factores estimulantes de colonias, tales como Factor Estimulante de Colonias de Macrófagos de Granulocitos (GM-CSF, sargramostim). La vacuna también puede contener un bloqueador de la unión de PD-L1 (CD274) a su receptor (PD-1) o CD80 para prevenir / inhibir el desarrollo de células T reguladoras (Treg) y reducir así el desarrollo de tolerancia al antígeno de la vacuna. Y un inhibidor de PD-1 ejemplar es BMS-936558 de Bristol Meyers Squibb (también conocido como MDX-1106 y ONO-4538).

Una composición de vacuna puede comprender más de un adyuvante diferente. Además, se describe una composición terapéutica que comprende cualquier sustancia adyuvante que incluya cualquiera de los anteriores o combinaciones de los mismos. También se contempla que el péptido o polipéptido y el adyuvante se pueden administrar por separado en cualquier secuencia apropiada.

Puede estar presente un portador independientemente de un adyuvante. La función de un portador puede ser, por ejemplo, aumentar el peso molecular de un mutante en particular para aumentar su actividad o inmunogenicidad, conferir estabilidad, aumentar la actividad biológica o aumentar la semivida en suero. Además, un portador puede ayudar a presentar péptidos a las células T. El portador puede ser cualquier portador adecuado conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, una proteína o una célula presentadora de antígenos. Una proteína portadora podría ser, pero no se limita a, hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas tales como transferrina, albúmina de suero bovino, albúmina de suero humano, tiroglobulina u ovoalbúmina, inmunoglobulinas u hormonas, tales como insulina o ácido palmítico. Para la inmunización de seres humanos, el portador debe ser un portador fisiológicamente aceptable, aceptable para los seres humanos y seguro. Sin embargo, el toxoide tetánico y / o el toxoide diftérico pueden ser portadores adecuados. Alternativamente, el portador puede ser dextranos, por ejemplo, sefarosa.

Las células T citotóxicas (CTL) reconocen un antígeno en forma de péptido unido a una molécula de MHC en lugar del propio antígeno extraño intacto. La propia molécula de MHC se encuentra en la superficie celular de una célula presentadora de antígeno. Por tanto, una activación de CTL sólo es posible si está presente un complejo trimérico de antígeno peptídico, molécula MHC y APC. En consecuencia, puede potenciar la respuesta inmune si no solo se usa el péptido para la activación de CTL, sino si además se añaden APCs con la molécula de MHC respectiva. Por tanto, la composición de vacuna puede contener adicionalmente al menos una célula presentadora de antígeno.

En el caso de una vacuna de ADN, un ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45 o 48, según de la invención SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4, se formula en un vector eucariota para su uso como vacuna que se administra a sujetos humanos. Los nucleótidos que codifican el antígeno están operativamente unidos al promotor y otras secuencias reguladoras en el vector. Tal eucariota, p. ej, vectores de mamíferos, son conocidos en la técnica [p. ej, pcDNA ™ (Invitrogen) y vectores disponibles de Vical Inc. (San Diego, CA)]. Otros vectores ejemplares, p. ej, pNGVL4a, y sus derivados, se describen en Moorty et al., 2003, Vaccine 21: 1995-2002; Cebere et al., 2006, Vaccine 24: 41-425; o Trimble et al., 2009, Clin. Cancer Res. 15: 364-367).

Vectores de expresión recombinante y células huésped

El antígeno se puede preparar mediante cualquier método recombinante que proporcione el epítopo de interés. Por consiguiente, se describen vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica cualquier clon de la Tabla 1, tal como una proteína PF10_0212a o clon 2, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario lineal o circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (p. ej, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ^aDⁿrecombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, se describen otras formas de vectores de expresión, como los vectores virales (p. ej, replicación defectuosa de retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes. Además, algunos vectores virales son capaces de dirigirse a un tipo de células en particular, ya sea de forma específica o no específica.

Los vectores de expresión recombinantes comprenden un ácido nucleico en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células huésped que se utilizarán para la expresión, que está operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "enlazado operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej, en un sistema de transcripción / traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células hospedadoras (p. ej, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión se pueden introducir en células huésped para producir de ese modo proteínas o péptidos, incluidas proteínas de fusión o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento (p. ej, PF10_0212a o proteínas del clon 2, formas mutantes de PF10_0212a o clon 2 (p. ej., Pf¿EP-1A, SEQ ID NO: 2), proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes pueden diseñarse para la expresión de cualquiera de los polipéptidos o secuencias de polinucleótidos en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos o secuencias de polinucleótidos puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células huésped adecuadas se discuten con más detalle en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y polimerasa de T7.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo con mayor frecuencia en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en ellos, normalmente al extremo amino de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión suelen tener tres propósitos: (1) aumentar la expresión de proteína recombinante; (2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y (3) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen el factor Xa, la trombina y la enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson (1988) Gene 67:3140), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutatión S transferasa (GST por sus siglas en inglés), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. Ejemplos de vectores de expresión de E. coli no fusionados inducibles adecuados incluyen pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301 315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 6089).

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. coli es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad alterada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante. Ver, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119 128. Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que se insertará en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido sean los que se utilizan preferentemente en E. coli (Wada y col., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111 2118). Tal alteración de las secuencias de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de ADN.

En otras realizaciones, el vector es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) EMBO J 6: 229 234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30: 933 943), pJRY88 (Schultz et al. al., (1987) Gene 54: 113 123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, CA).

Alternativamente, cualquiera de los polipéptidos o secuencias de polinucleótidos se puede expresar en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (p. ej, células SF9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3: 21562165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170: 3139).

Alternativamente, se expresa un ácido nucleico en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187195). Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión a menudo son proporcionadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas. Ver, p. ej, Capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989.

Alternativamente, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (p. ej, se utilizan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido se conocen en la técnica. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev 1: 268277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv Immunol 43: ^{235 275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989)}EmBO ^{J 8: 729 733) e}inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729 740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33: 741 748), promotores específicos de neuronas (p.ej, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) PNAS 86: 5473 5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230: 912 916) y promotores específicos de la glándula mamaria (p.ej, promotor de suero de leche; Patente de EE.UU. No. 4,873,316 y publicación de solicitud europea No. 264,166). También se incluyen los promotores regulados por el desarrollo, p. ej, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249: 374379) y el promotor a-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev 3: 537546).

Se describe un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está operativamente ligada a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm de cualquiera de las secuencias polinucleotídicas. Se pueden elegir secuencias reguladoras unidas operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células, por ejemplo, promotores y / o potenciadores virales, o se pueden elegir secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo celular de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en el que se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad puede ser determinada por el tipo de célula en la que se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión génica usando genes antisentido, ver Weintraub et al., "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis," Reviews Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.

Se describen células hospedadoras en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan indistintamente en el presente documento. Se entiende que tales términos se refieren no solo a la célula objeto particular, sino también a la progenie o la progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero todavía está incluida dentro del alcance del término como se usa en este documento.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos o secuencias de polinucleótidos puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos, levaduras o células de mamíferos (como células de ovario de hámster chino (CHO por sus siglas en inglés) o células COS). Alternativamente, una célula huésped puede ser una célula de mamífero prematura, es decir, una célula madre pluripotente. Una célula huésped también puede derivarse de otro tejido humano. Los expertos en la técnica conocen otras células huésped adecuadas.

El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas convencionales de transformación, transducción, infección o transfección. Como se usa en este documento, los términos "transformación" "transducción", "infección" y "transfección" están destinados a hacer referencia a una variedad de técnicas reconocidas para introducir ácido nucleico extraño (p. ej, ADN) en una célula huésped, incluida la coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE dextrano, lipofección o electroporación. Además, la transfección puede estar mediada por un agente de transfección. Por "agente de transfección" se entiende que incluye cualquier compuesto que medie la incorporación de ADN en la célula huésped, p. ej, liposoma. Se pueden encontrar métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped en Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORAT^oR^yMANUAL.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio. La transfección puede ser "estable" (es decir, integración del ADN extraño en el genoma del huésped) o "transitorio" (es decir, el ADN se expresa episómicamente en las células huésped).

Para la transfección estable de células de mamíferos, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma, el resto del ADN permanece episómico. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej, resistencia a los antibióticos) generalmente se introduce en las células huésped junto con el gen de interés. Varios marcadores seleccionables incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica cualquiera de los polipéptidos o las secuencias de polinucleótidos se pueden introducir en un vector separado. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección de fármacos (p. ej, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células mueren). El promotor puede ser el promotor de insulina que impulsa la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). Se describe que un ácido nucleico de cualquiera de los polipéptidos o secuencias de polinucleótidos está presente en un vector viral. El ácido nucleico puede encapsularse en un virus. El virus infecta preferiblemente células pluripotentes de varios tipos de tejidos, p. ej células madre hematopoyéticas, células madre neuronales, células madre hepáticas o células madre embrionarias, preferiblemente el virus es hepatrópico. Por "hepatotrópico" se entiende que el virus tiene la capacidad de dirigirse preferiblemente a las células del hígado de forma específica o no específica. El virus puede ser un virus de hepatitis modulado, SV-40 o virus de Epstein-Bar. El virus puede ser un adenovirus.

"Recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. También se puede usar un mamífero transgénico para expresar la proteína de interés codificada por una o ambas de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente. Más específicamente, una vez que se crea la construcción descrita anteriormente, se puede insertar en el pronúcleo de un embrión. Luego, el embrión puede implantarse en una hembra receptora. Alternativamente, también se podría utilizar un método de transferencia nuclear (Schnieke et al., 1997). Entonces se permite que ocurra la gestación y el nacimiento (ver, p. ej, Patente de EE.UU. No. 5,750,176 y la patente de EE.UU. No. 5,700,671), y las muestras de leche, tejido u otros fluidos de la descendencia deben contener la proteína de interés. El mamífero utilizado como huésped puede seleccionarse del grupo que consiste, por ejemplo, en un ratón, una rata, un conejo, un cerdo, una cabra, una oveja, un caballo y una vaca. Sin embargo, se puede utilizar cualquier mamífero siempre que tenga la capacidad de incorporar ADN que codifica la proteína de interés en su genoma.

Métodos terapéuticos

La invención proporciona además la vacuna según la presente invención para su uso en un método de tratamiento o prevención de P. falciparum malaria, donde dicho método comprende administrar la composición a un sujeto. Preferiblemente, el sujeto tiene al menos aproximadamente 6-8 semanas de edad, o el sujeto es una mujer adolescente o una mujer en edad fértil. Preferiblemente, la vacuna se administra por vía intramuscular. Preferiblemente, la vacuna comprende además una segunda vacuna para su uso en dicho método, donde dicha segunda vacuna comprende un inhibidor de la invasión del hígado por parásitos, tal como RTS, S (Mosquirix ™). Preferiblemente, la vacuna comprende además una segunda vacuna para su uso en dicho método, donde dicha segunda vacuna comprende un inhibidor de la invasión de glóbulos rojos de parásitos, tal como MSP-I. La invención proporciona además el anticuerpo purificado o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención para su uso en un método para prevenir o reducir la gravedad de la malaria, donde dicho método comprende administrar el anticuerpo purificado o fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto.

Se da a conocer un método para inducir una respuesta inmune específica de P. falciparum en un sujeto, vacunación contra la malaria, tratamiento o alivio de un síntoma de malaria en un sujeto administrando al sujeto un péptido o una composición de vacuna.

El sujeto ha sido diagnosticado con malaria o tiene riesgo de desarrollar malaria. El sujeto tiene resistencia a la malaria. El sujeto es un ser humano, perro, gato, caballo o cualquier animal en el que se desea una respuesta inmune específica de P. falciparum. Preferiblemente, el sujeto es un niño menor de 5 años. Más preferiblemente, el sujeto tiene al menos aproximadamente 6-8 semanas de edad.

El péptido o composición se administra en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune.

Se describen métodos para tratar o prevenir la malaria administrando a un sujeto uno o más péptidos. El péptido antígeno, polipéptido, secuencias de ácido nucleico o composición de vacuna se puede administrar solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. El agente terapéutico es, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más vacunas o anticuerpos adicionales, una terapia de combinación antimalaria con artemisinina o una inmunoterapia. Puede administrarse cualquier tratamiento terapéutico adecuado para la malaria. La vacuna adicional puede comprender un inhibidor de la invasión del hígado por parásitos o un inhibidor de la invasión de glóbulos rojos del parásito. Tales vacunas adicionales incluyen, pero no se limitan a, vacunas anti-invasión de RBC (MSP-1), RTS, S (Mosquirix ™), NYVAC-Pf7, CSP y [NANP] 19-5.1. El péptido antígeno, polipéptido, secuencias de ácido nucleico o composición de vacuna se pueden administrar antes, simultáneamente o después de otros agentes terapéuticos.

Un experto en la técnica puede determinar la cantidad óptima de cada péptido a incluir en la composición de vacuna y el régimen de dosificación óptimo sin una experimentación indebida. Por ejemplo, el péptido o su variante puede prepararse para inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.), inyección intramuscular (i.m.). Los métodos preferidos de inyección de péptidos incluyen s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos preferidos de inyección de ADN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Por ejemplo, se pueden administrar dosis de entre 1 y 500 mg, 50 mg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 mg a 500 mg, de péptido o ADN y dependerán del péptido o ADN respectivo. Se utilizaron con éxito dosis de este rango en ensayos anteriores (Brunsvig PF, et al., Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, et al., ASCO meeting 2007; Abstract No 3017). Los expertos en la técnica conocen otros métodos de administración de la composición de vacuna.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido se pueden administrar a un individuo que ya padece malaria. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune eficaz al presente antígeno y curar o al menos detener parcialmente los síntomas y / o complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de, p.ej, la composición del péptido, la forma de administración, la etapa y la gravedad de la enfermedad que se está tratando, el peso y el estado general de salud del paciente, y el criterio del médico que prescribe, pero generalmente varía para la inmunización inicial (es decir, para fines terapéuticos o administración profiláctica) de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 50.000 mg de péptido para un paciente de 70 kg, seguido de dosis de refuerzo o de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 10.000 mg de péptido de acuerdo con un régimen de refuerzo durante semanas a meses dependiendo de la respuesta del paciente y condición mediante la medición de la actividad inmunitaria específica en la sangre del paciente.

Las composiciones farmacéuticas (p. ej, composiciones de vacuna) para tratamiento terapéutico están destinadas a la administración parenteral, tópica, nasal, oral o local. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, p. ej, por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. Preferiblemente, la vacuna se administra por vía intramuscular. Se describen composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos y las composiciones de vacuna se disuelven o suspenden en un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Se pueden usar una variedad de portadores acuosos, p. ej, agua, agua tamponada, solución salina al 0,9%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o pueden esterilizarse por filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes reguladores y tamponadores del pH, agentes reguladores de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.

La concentración de péptidos en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 0,1%, normalmente de o al menos aproximadamente 2% hasta tanto como 20% a 50% o más en peso, y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionada.

El péptido también se puede administrar a través de liposomas, que dirigen los péptidos a un tejido celular particular, como el tejido linfoide. Los liposomas también son útiles para aumentar la vida media de los péptidos. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares. En estas preparaciones, el péptido que se va a administrar se incorpora como parte de un liposoma, solo o junto con una molécula que se une a, p. ej, un receptor que prevalece entre las células linfoides, como los anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. Por tanto, los liposomas llenos de un péptido deseado pueden dirigirse al sitio de las células linfoides, donde los liposomas administran las composiciones de péptidos terapéuticos / inmunogénicos seleccionadas. Los liposomas para su uso en la presente invención se forman a partir de lípidos formadores de vesículas estándar, que generalmente incluyen fosfolípidos neutrales y cargados negativamente y un esterol, como el colesterol. La selección de lípidos generalmente se guía por la consideración de, p. ej, tamaño de los liposomas, labilidad ácida y estabilidad de los liposomas en el torrente sanguíneo. Hay una variedad de métodos disponibles para preparar liposomas, como se describe en, p. ej, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng.9;467 (1980), UsAU.S. Patentes Nos.4,235,871, 4,501,728 USA, 4,501,728, 4,837,028 y 5,019,369.

Para dirigirse a las células inmunes, un ligando a incorporar en el liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para los determinantes de la superficie celular de las células deseadas del sistema inmunológico. Una suspensión de liposomas que contiene un péptido puede administrarse por vía intravenosa, local, tópica, etc. en una dosis que varía según, entre otras cosas, la forma de administración, el péptido que se administra y la etapa de la enfermedad que se está tratando.

Para composiciones sólidas, se pueden usar portadores sólidos no tóxicos convencionales o en nanopartículas que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para la administración oral, se forma una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable incorporando cualquiera de los excipientes empleados normalmente, tales como los portadores enumerados anteriormente, y generalmente 10-95% de ingrediente activo, es decir, uno o más péptidos, y más preferiblemente a concentración de 25% - 75%.

Para la administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos se suministran preferiblemente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y un propelente. Los porcentajes típicos de péptidos son 0,01% -20% en peso, preferiblemente 1% -10%. El tensioactivo, por supuesto, debe ser no tóxico y preferiblemente soluble en el propelente. Representativos de tales agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oléico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Se pueden emplear ésteres mixtos, tales como glicéridos naturales o mixtos. El tensioactivo puede constituir 0,1% -20% en peso de la composición, preferiblemente 0,25-5%. El resto de la composición es normalmente propelente. También se puede incluir un portador según se desee, como con, p. ej, lecitina para administración intranasal.

Con fines terapéuticos o de inmunización, los ácidos nucleicos que codifican el péptido y opcionalmente uno o más de los péptidos descritos en el presente documento también se pueden administrar al paciente. Se utilizan convenientemente varios métodos para administrar los ácidos nucleicos al paciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede administrarse directamente, como "ADN desnudo". Este enfoque se describe, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990) así como las Patentes de EE.UU. Nos.5,580,859 y 5,589,466. Los ácidos nucleicos también se pueden administrar usando liberación balística como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No.5,204,253. Se pueden administrar partículas que comprenden únicamente ADN. Alternativamente, el ADN se puede adherir a partículas, como partículas de oro.

Los ácidos nucleicos también se pueden administrar acomplejados con compuestos catiónicos, tales como lípidos catiónicos. Los métodos de administración de genes mediados por lípidos se describen, por ejemplo, en 9618372WOAWO 96/18372; 9324640WOAWO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite, BioTechniques 6 (7): 682 - 691 (1988); 5279833 EE. UU., Patente de EE. UU. No.5,279,833; 9106309WOAWO 91/06309; y Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.84: 7413- 7414 (1987).

Los péptidos y polipéptidos también pueden ser expresados por huéspedes virales atenuados, tales como vaccinia o viruela aviar. Este enfoque implica el uso de virus vaccinia como vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican el péptido. Tras la introducción en un huésped infectado de forma aguda o crónica o en un huésped no infectado, el virus vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico y, por lo tanto, provoca una respuesta CTL del huésped. Los vectores de vaccinia y los métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen en, p. ej, Patente de EE.UU. No.4,722,848. Otro vector es BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)). Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización de los péptidos, p. ej., vectores de Salmonella typhi y similares, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción en este documento.

Un medio preferido para administrar ácidos nucleicos que codifican el péptido usa construcciones de minigén que codifican múltiples epítopos. Para crear una secuencia de ADN que codifique los epítopos CTL seleccionados (minigén) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopos se traducen de forma inversa. Se usa una tabla de uso de codones humanos para guiar la elección de codones para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican el epítopo se unen directamente, creando una secuencia polipeptídica continua. Para optimizar la expresión y / o la inmunogenicidad, se pueden incorporar elementos adicionales en el diseño del minigén. Ejemplos de secuencias de aminoácidos que podrían traducirse de forma inversa e incluirse en la secuencia del minigén incluyen: linfocitos T auxiliares, epítopos, una secuencia líder (señal) y una señal de retención del retículo endoplásmico. Además, la presentación de mHc de epítopos CTL puede mejorarse al incluir sintéticos (p. ej polialanina) o secuencias flanqueantes de origen natural adyacentes a los epítopos de CTL.

El régimen de dosificación que se puede utilizar incluye, pero no se limita a, diario, tres veces por semana (intermitente), dos veces por semana, semanalmente o cada 14 días. Alternativamente, el régimen de dosificación incluye, pero no se limita a, una dosificación mensual o una dosificación cada 6-8 semanas. La vacuna se puede administrar por vía intramuscular una vez cada dos semanas durante 1, 2, 3, 4, 5 o más veces, sola o en combinación con 1, 2, 3, 4 o más vacunas adicionales en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano.

Anticuerpos

"Anticuerpo" (Ab) comprende Abs individuales dirigidos contra un antígeno diana (un antígeno anti-diana Ab), composiciones de Ab de antígeno anti-diana con especificidad de poliepítopo, Abs monocatenario de antígeno anti diana y fragmentos de Abs de antígeno anti-diana. Se obtiene un "anticuerpo monoclonal" (mAb) a partir de una población de Abs sustancialmente homogéneos, es decir, los Abs individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los Abs ejemplares incluyen Abs policlonales (pAb), monoclonales (mAb), humanizados, biespecíficos (bsAb) y heteroconjugados. La invención abarca no sólo un anticuerpo monoclonal intacto, sino también un fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo, por ejemplo, un fragmento Fab o (Fab)2; una molécula Fv monocatenaria modificada por ingeniería genética; o una molécula quimérica, por ejemplo, un anticuerpo que contiene la especificidad de unión de un anticuerpo, por ejemplo, de origen murino, y las porciones restantes de otro anticuerpo, por ejemplo, de origen humano.

En el presente documento se describen anticuerpos contra los siguientes antígenos (como vacuna): 1) un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3; 2) un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3, o fragmentos de los mismos; 3) un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 6 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3; y 4) una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8-56 residuos de aminoácidos, tales como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56 residuos.

Los Abs policlonales se pueden generar en un huésped mamífero mediante una o más inyecciones de un inmunógeno y, si se desea, un adyuvante. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos por cualquier hibridoma susceptible de formarse según métodos clásicos a partir de células de ganglio linfático o esplénico de un animal, particularmente de un ratón o rata, inmunizado contra los polipéptidos o péptidos del clon 2 según la invención.

El antígeno y el anticuerpo se pueden unir a un compuesto generador de señal o "marca". Este compuesto o marcador generador de señales es en sí mismo detectable o puede reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable. Ejemplos de tales compuestos generadores de señales incluyen cromógenos, radioisótopos (p. ej, 125I, 131I, 32P, 3H, 35S 14C), compuestos fluorescentes (p. ej, fluoresceína, rodamina), compuestos quimioluminiscentes, partículas (visibles o fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes complejantes o catalizadores como enzimas (p. ej, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa y ribonucleasa).

En el caso del uso de enzimas, la adición de sustrato cromogénico, fluorogénico o lumogénico da como resultado la generación de una señal detectable. Otros sistemas de detección, como fluorescencia resuelta en el tiempo, fluorescencia de reflexión interna, amplificación (p. ej, reacción en cadena de la polimerasa) y la espectroscopia Raman también son útiles.

Se describe un método para tratar P. falciparum malaria en un sujeto que lo necesite administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en el presente documento. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal purificado, por ejemplo, uno que se ha producido y es específico para la proteína de sEq ID NO: 2. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado. El tratamiento puede iniciarse en una etapa temprana después de la aparición de parásitos recrudescentes. Los síntomas del sujeto pueden ser leves o estar ausentes y la parasitemia es baja, pero en aumento, por ejemplo, entre 4.000 y 10.000 / pl. Alternativamente, el sujeto puede tener fiebre < 38,5 °C sin ningún otro síntoma acompañante. El sujeto puede ser un niño menor de 10 años. El sujeto también puede ser un niño mayor o un adulto. En un ejemplo, el sujeto se caracteriza por sufrir de P. falciparum malaria aguda, pero no ha respondido al tratamiento con fármacos anti-malaria. En este enfoque de inmunidad pasiva, el anticuerpo monoclonal humanizado purificado que se une específicamente a la proteína de los clones de la Tabla 1, preferiblemente SEQ ID NO: 2 se administra al sujeto para matar el agente infeccioso y / o inhibir la invasión de glóbulos rojos.

Kits

También se describen kits. Se describen kits para determinar la presencia de anticuerpos contra P. falciparum en una muestra de prueba. Un kit puede comprender: (a) un antígeno de P. falciparum que comprende un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3; y (b) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señales capaz de generar una señal detectable. El kit también puede contener un control o calibrador que comprende un reactivo que se une al antígeno. El antígeno P. falciparum puede comprender un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3, o fragmento de los mismos. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8-56 residuos de aminoácidos, tales como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56 residuos. El antígeno puede comprender un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3. Finalmente, el antígeno puede consistir en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46 o 47, preferiblemente SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, o los residuos de aminoácidos 811-1083 de SEQ ID NO: 3.

También se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de la vacuna en una forma adecuada para la administración intramuscular u otras vías de administración. Los kits también pueden contener uno o más anticuerpos descritos aquí. Opcionalmente, el kit puede contener artículos desechables, como artículos biodegradables. El kit también puede contener un medio de recogida de muestras, que incluye, pero no se limita a, una aguja para recoger sangre, un medio de almacenamiento para almacenar la muestra colectada y para el envío. Alternativamente, cualquier kit puede contener puede contener una instrucción para su uso para diagnosticar la malaria o un receptáculo para recibir fluido o tejido corporal derivado del sujeto.

El kit comprende además instrucciones de uso o un CD o CD-ROM con instrucciones sobre cómo colectar la muestra, enviar la muestra y los medios para interpretar los resultados de la prueba. El kit también puede contener una muestra de control ya sea positiva o negativa o un estándar y / o un dispositivo algorítmico para evaluar los resultados y reactivos y componentes adicionales.

Una "muestra biológica" es cualquier muestra de tejido o fluido corporal obtenida de un sujeto, que incluye, pero no se limita a, sangre, suero sanguíneo, orina y saliva.

El kit puede comprender además uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable. Ejemplos de tales compuestos generadores de señales incluyen cromógenos, radioisótopos (p. ej, 125I, 131I, 32P, 3H, 35S 14C), compuestos fluorescentes (p. ej, fluoresceína, rodamina), compuestos quimioluminiscentes, partículas (visibles o fluorescentes), agentes complejantes o catalizadores como enzimas (p. ej, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, rábano picante, p-galactosidasa y ribonucleasa).

A modo de ejemplo, y no de limitación, se darán ahora ejemplos de la presente invención.

EJEMPLO 1: Los anticuerpos contra la PfSEP-1 bloquean la salida del parásito de los glóbulos rojos y protegen a los sujetos de la malaria grave

P. falciparum malaria es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los países en desarrollo, infectando a cientos de millones de personas y matando a más de un millón de niños en el África subsahariana cada año. Estimaciones recientes indican que incluso estas asombrosas cifras subestiman significativamente la carga de morbilidad real. Los niños sufren la mayor morbilidad y mortalidad por malaria, sin embargo, este grupo de edad no ha sido incluido en la etapa de identificación del desarrollo de la vacuna. De los aproximadamente 100 candidatos a vacunas que se están investigando actualmente, más del 60% se basan en solo cuatro antígenos del parásito. Se necesitan con urgencia nuevos candidatos a antígenos, pero las estrategias para identificar nuevos antígenos son limitadas y muchas se centran en malarias de roedores.

Los humanos residentes en áreas endémicas desarrollan inmunidad protectora que limita la parasitemia y la enfermedad, y la inmunidad humana adquirida de forma natural proporciona un modelo atractivo para la identificación de antígenos de vacunas. El plasma de algunos individuos expuestos crónicamente contiene anticuerpos que limitan el crecimiento del parásito ex vivo y tras la transferencia adoptiva, un hallazgo que confirma la eficacia protectora de los anticuerpos antiparasitarios. Un enfoque para identificar y caracterizar nuevos antígenos candidatos a vacunas contra la malaria es identificar proteínas de la malaria que son reconocidas de manera única por los anticuerpos en el plasma de individuos expuestos crónicamente, pero resistentes. Debido a las dificultades logísticas para caracterizar la resistencia adquirida naturalmente en poblaciones endémicas, este enfoque no ha sido ampliamente explotado.

Se llevaron a cabo estudios para identificar candidatos a vacunas para la malaria por falciparum pediátrica mediante la identificación de las dianas parasitarias de los anticuerpos humanos protectores adquiridos de forma natural. Se utilizó un método de detección diferencial de proteoma completo que utiliza datos plasmáticos y epidemiológicos de una cohorte de niños que viven en Tanzania para identificar antígenos P. falciparum asociados con la resistencia en niños de dos años. Se identificó la proteína de salida del esquizonte-1 (PfSEP-1), un antígeno del parásito de 244 kDa, que se localiza en la membrana de la vacuola esquizonte / parasitófora, las hendiduras de Maurer y la valva interna de la membrana de los RBC en los RBCs infectados con esquizontes. Los anticuerpos contra PfSEP-1 disminuyen la replicación del parásito en un 60% al detener la ruptura del esquizonte. La vacunación activa con rPbSEP-1 dio como resultado una reducción de 4,5 veces en la parasitemia después de la exposición con parásitos ANKA P. berghei. Los niños de la cohorte experimentaron una incidencia drásticamente mayor de malaria grave durante los períodos con niveles indetectables de anticuerpos anti-PfSEP-1 (45 casos / 23,806 semanas de niños) en comparación con los períodos con niveles de anticuerpos detectables (0 casos / 1,688 semanas de niños). Al bloquear la salida de esquizontes, PfSEP-1 se sinergiza con las vacunas dirigidas a la invasión de hepatocitos y glóbulos rojos.

Identificación y evaluación in vitro de candidatos a vacunas

Usando un método de cribado diferencial, se interrogó al proteoma en estadio sanguíneo P. falciparum con plasma de niños de dos años resistentes y susceptibles para identificar las proteínas del parásito que son el objetivo de las respuestas de anticuerpos protectores. Nos centramos en niños de 2 años porque en nuestra cohorte, la resistencia a la parasitemia se detecta por primera vez a esta edad (Fig. 6). Seleccionamos doce niños de 2 años resistentes y once susceptibles con una combinación cuidadosa de posibles factores no inmunológicos, que pueden estar relacionados con la resistencia (ver la Tabla siguiente y la Fig. 16). La resistencia se determinó en función de la densidad media geométrica de los parásitos en todos los frotis de sangre colectados entre las edades de 2 y 3,5 años. Reunimos el plasma recolectado a la edad de 2 años (+ / - 2 semanas) de los individuos resistentes (RP) y los individuos susceptibles (SP) y realizamos experimentos de detección diferencial en una librería de ADNc de P. falciparum en etapa sanguínea de la cepa 3D7. Proyectamos 1,25 x 106 clones e identificaron tres clones que fueron reconocidos únicamente por RP, pero no por SP. Las secuencias de estos clones se compararon con el genoma de falciparum publicado (PlasmoDB.org) ^{y se encontró que codifica nt 2.431-3.249 de PF3D7_1021800 - un gen en el cromosoma 10, nt 3.490-5.412 de}PF3d7 1134300 - un gen en el cromosoma 11, y nt 201 - 1.052 de PF3D7 1335100 - que codifica la proteína de superficie de merozoito- 7 (MSP -7) - una proteína involucrada en la invasión de glóbulos rojos que se encuentra actualmente en estudio como posible candidata a vacuna.

En análisis de silico (PlasmoDB.org) predice que PF3D7_1021800 contiene un gen de 6225 bp que codifica una fosfoproteína ácida de 244 kDa (SEQ ID NO: 2), contiene dos intrones cerca de su extremo 3' y tiene ortólogos sinténicos en todas las malarias de roedores y humanos evaluadas. Con base en experimentos in vitro, designamos el producto proteico de PF3D7_1021800 como proteína de salida de esquizonte 1 (PfSEP-1) Plasmodium falciparum. La expresión de ARNm de PF3D7_1021800 aumenta a lo largo de la esquizogenia en el estadio sanguíneo y el gen muestra una variación de secuencia mínima, sin SNPs en la región clonada (nt 2.431-3.249), en quince aislamientos de campo y de laboratorio (Fig. 16). Un esfuerzo de secuenciación profunda recientemente informado en 227 muestras de campo identificó 3 SNPs no sinónimos y 1 SNP sinónimo en la región clonada. Hemos secuenciado nt 2.431-3.249 de PF3D7_1021800 en 6 aislamientos de campo obtenidos de niños de nuestra cohorte y encontramos un aislado con una inserción de seis bp (que codifica Asp-Gly-Asp-Gly en lugar de la canónica Asp-Gly), así como un SNP sinónimo. Estos datos indican que hay poca o ninguna variabilidad de secuencia entre las cepas de parásitos.

PfSEP-1 no tiene una homología significativa con proteínas de función conocidas. Para explorar la función de PfSEP-1, hemos construido vectores diseñados para interrumpir las regiones codificadoras y promotoras del gen a través del proceso bien descrito de recombinación homóloga9. Hemos obtenido el transporte episomal de ambos vectores de direccionamiento, pero no hemos recuperado integrantes homólogos con ninguno de los vectores, lo que sugiere que la expresión de PF3D7_1021800 es esencial para la replicación del estadio sanguíneo (Figs.8A-C).

Hemos expresado y purificado el polipéptido codificado por nt 2.431-3.249 de PF3^d7_1021800 (aa 810-1083) en E. coli y se designó a esta proteína recombinante rPfSEP-1A (Fig. 9). Utilizando una selección independiente de individuos resistentes y susceptibles (ver Tabla a continuación), confirmamos y generalizamos el reconocimiento diferencial de rPfSEP-1A (SEQ ID NO: 2) en un ensayo basado en ELISA. El reconocimiento de anticuerpos IgG de rSEP-1A fue 4,4 veces mayor en RP (n = 11) que en SP (n = 14, P <0,0002, Fig.10), pero no difirió para otras proteínas o controles de la malaria.

Variable Resistente Susceptible valor de Pa

Numero de sujetos 12 11 -Fenotipo de hemoglobina (% AS) 16,6 0 0,47 Sexo (% mujeres) 41,6 45,4 1 Semanas de seguimiento (mediana [IQR]) 140,5 [44,5] 152 [44] 0,31 # de frotis de sangre de 2 a 3,5 de edad (mediana [IQR]) 16,5 [21,5] 21 [24] 0,31 # de frotis de sangre positivos de 2 a 3,5 de edad (mediana [IQR]) 0 [1] 4 [10] 0,04 # de tratamientos contra la malaria antes de los 2 años (mediana [IQR]) 2 [1,75] 8 [8] 0,01 Malaria durante el embarazo (%) 16,6 9 1 Edad materna (años, mediana [IQR]) 22,5 [9,5] 28 [10] 0,35 Temporada de nacimiento (% en temporada alta) 25 9 0,59 Niños que utilizan Bed Net (%) 33,3 0 0,09 # de embarazos anteriores (mediana [IQR]) 0 [2] 1 [2] 0,19 Densidad de parásitos (parásitos / 200 WBCs) a los 2 años de extracción 0 [0] 0 [0] 1 de sangre (mediana [IQR])

Densidad de parásitos (parásitos / 200 WBCs) desde los 2-3,5 años 0 [25,6] 320,3 [944,1] 0,05 (mediana [IQR])

Comparaciones de variables catagóricas mediante la prueba exacta de Fisher de 2 colas. Comparaciones de variables continuas mediante la prueba U de Mann-Whitney

Variable Resistente Susceptible valor de Pa

Numero de sujetos 11 14 1 Fenotipo de hemoglobina (% AS) 36 21 0,66 Sexo (% mujeres) 45 43 1 Semanas de seguimiento (mediana [IQR]) 154 [14] 165 [19] 0,34 # de frotis de sangre de 2 a 3,5 de edad (mediana [IQR]) 14 [5,8] 20,5 [9,5] 0,02 # de frotis de sangre positivos de 2 a 3,5 de edad (mediana [IQR]) 0 7,8 [6] <0,001 # de tratamientos contra la malaria antes de los 2 años (mediana [IQR]) 2,6 [2,9] 6,3 [3,1] 0,008 Malaria durante el embarazo (%) 9 14 1 Edad materna (años, mediana [IQR]) 27 [8] 27 [7] 0,85 Temporada de nacimiento (% en temporada alta) 73 50 0,41 Niños que utilizan Bed Net (%) 0 0 1 # de embarazos anteriores (mediana [IQR]) 1 [3,0] 1 [3,0] 0,89 Densidad de parásitos (parásitos / 200 WBCs) a los 2 años de extracción 0 [0] 0 [0] 1 de sangre (mediana [IQR])

Densidad de parásitos (parásitos / 200 WBCs) de 2-3,5 años de edad 0 [0] 2106,9 [2700] <0,001 (mediana [IQR])

Hemos clonado esta secuencia en un plásmido de expresión eucariota (VR2001), inmunizado ratones y generado antisueros anti-rPfSEP-1A. Para confirmar que PF3D7_1021800 codifica una proteína del parásito, sondamos RBCs infectados y no infectados con P. falciparum 3D7, con sueros tanto pre-inmunes como pos-inmunes. El anti-rPfSEP-1A reconoció una proteína de 244 kDa en RBC infectados, pero no sin infectar (Figs.11A-B).

Realizamos ensayos de inhibición del crecimiento utilizando antisueros anti-rPfSEP-1A preparados mediante vacunación con ADN e inmunización con proteína recombinante. Los parásitos se sincronizaron con la etapa de anillo, se cultivaron para obtener trofozoítos maduros y luego se incubaron con antisueros anti-rPfSEP-1A o controles durante 24 horas seguido de la enumeración de los parásitos en etapa de anillo recién invadidos. El anti-rPfSEP-1A generado tanto por el plásmido de ADN como por la inmunización basada en proteínas recombinantes inhibió el crecimiento del parásito en un 58-75% en tres cepas de parásitos en comparación con los controles (todos P < 0,009). Los antisueros preparados mediante vacunación con ^aDⁿcontra una proteína falciparum irrelevante (fosfatidilglicerofosfato sintasa, PF3D7_0820200) no mostraron inhibición del crecimiento.

Como se muestra en la Fig.19, el conejo anti-PfSEP-1 inhibe el crecimiento / invasión de parásitos en un 68% in vitro. Los parásitos en etapa de anillo 3D7 se sincronizaron dos veces usando placas de sorbitol al 1% de parasitemia, se dejaron madurar a trofozoítos (24 horas), seguido de la adición de sueros de conejo anti-clon 2 (dilución 1:10). Los controles negativos no incluyeron sueros de conejo y sueros de conejo preinmunes (dilución 1:10). Los parásitos se cultivaron durante 24 horas y los parásitos en etapa de anillo se enumeraron mediante examen microscópico. Las barras representan la media de 3 réplicas independientes. Las barras de error representan SEM. P < 0,0001 para la comparación entre sueros de conejo pre y post inmunes mediante la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica.

Inmunolocalizamos PfSEP-1 tanto por microscopía confocal de inmunofluorescencia como por microscopía electrónica de transmisión de immunogold (Figs.2A-C). Anti-PfSEP-1 no se unió a merozoitos libres, anillos o parásitos en etapa tardía del trofozoíto, pero reconoció específicamente un antígeno expresado por RBCs infectados con esquizontes tardíos (Figs.2A-B). En los RBCs infectados por esquizontes no fijados y no permeabilizados, PfSEP-1 se co-localizó con glucoforina A (Fig.2C). Esta localización se evaluó adicionalmente mediante microscopía inmunoelectrónica (Fig. 2D). En los RBCs infectados por esquizontes no fijados y no permeabilizados, PfSEP-1 se localizó en la membrana de la vacuola esquizonte / parasitófora, las hendiduras de Maurer y la valva interna de la membrana de los RBCs, mientras que la glucoforina A se limitó a la valva exterior de la membrana de los RBCs. Este patrón de tinción se observó esencialmente en todos los RBCs infectados con esquizontes tardíos examinados. No se observó tinción para PfSEP-1 en RBCs no infectados o RBCs infectados con anillo / trofozoíto (Figs. 13A-B). La estrecha yuxtaposición de estas estructuras en los RBCs infectados con esquizontes tardíos con la membrana externa de los RBCs explica la aparente co-localización de PfSEP-1 con glucoforina A observada por microscopía confocal. La accesibilidad de los anticuerpos a PfSEP-1 en los RBCs infectados por esquizontes no fijados y no permeabilizados es coherente con la permeabilidad conocida de los RBCs parasitados en las últimas etapas de la esquizogonía.

La localización de PfSEP-1 no fue consistente con un papel en la invasión de glóbulos rojos, más bien sugirió un papel en la salida del parásito de los glóbulos rojos infectados. Para determinar el mecanismo de inhibición del crecimiento, realizamos ensayos de detención de esquizontes usando antisueros anti-rPfSEP-1A preparados mediante vacunación con ADN (Fig.3A-C) e inmunización con proteína recombinante (Figs. 14A-B). Los parásitos se sincronizaron con la etapa de anillo a una densidad de parásitos alta (3,5%), se cultivaron para obtener esquizontes prematuros y luego se incubaron con antisueros o controles anti-rPfSEP-1A durante 12 horas, seguido de la enumeración de los parásitos en etapa de esquizontes restantes. En estas condiciones, la mayoría de los glóbulos rojos infectados con esquizontes deberían romperse, liberando merozoitos, que invadirían nuevos glóbulos rojos y se convertirían en parásitos en etapa de anillo. El anti-rPfSEP-1A generado tanto por el plásmido de ADN como por la inmunización basada en proteínas recombinantes inhibió drásticamente la salida de esquizontes, lo que resultó en una proporción de esquizontes de 4,3 a 6,8 veces mayor en tres cepas de parásitos en comparación con los controles (todos PAG <0,009).

La vacunación activa con SEP-1 protege a los ratones de la exposición de P. berghei

Para evaluar la eficacia protectora de la vacunación activa con SEP-1 in vivo, clonamos la cepa ortóloga ANKA de P. berghei de PfSEP-1 (nt 2173-3000) en el plásmido de expresión pET30 y expresó y purificó rPbSEP-1A (aa 725-1000) de (Fig.4A). Vacunamos ratones Balb / C (n = 11) con rPbSEP-1A en adyuvante TiterMax Gold o adyuvante solo (n = 11), medimos las respuestas de sus anticuerpos a rPbSEP-1A (Fig. 4B) y los expusimos al parásito ANKA 106 P. berghei infectando los glóbulos rojos por vía intraperitoneal. Los ratones vacunados con rPbSEP-1A tenían una parasitemia 4,5 veces menor en el día 7 después de la exposición en comparación con los controles tratados con adyuvante solo (Fig.4C).

Respuestas de anticuerpos humanos a PfSEP-1

Para evaluar el impacto de los anticuerpos anti-PfSEP-1 adquiridos naturalmente en la malaria clínica, medimos los niveles de anticuerpos IgG anti-PfSEP-1 utilizando un ensayo fluorescente basado en perlas en nuestra cohorte de nacimiento y relacionamos estos niveles con los resultados posteriores de la malaria. Medimos los niveles de anticuerpos IgG anti-PfSEP-1 en el plasma disponible obtenido en visitas programadas sin enfermedad entre 2 y 3,5 años de vida (total de 156 medidas de anticuerpos en 155 niños). Los anticuerpos anti-PfSEP-1 fueron detectables en el 3,2% de estas muestras y los niños fueron seguidos, para un total de 6,350 niños por 4 semanas de observación (201 semanas con anti-PfSEP-1 detectable y 6,149 semanas con niveles indetectables). Relacionamos la presencia de anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables con los resultados de la malaria, incluida la densidad de parásitos, la malaria leve, la malaria grave, todas las causas y la mortalidad atribuida a la malaria. Para cada medición de anticuerpos, el intervalo de tiempo examinado para los resultados de la malaria se extendió desde el momento de la medición de anticuerpos hasta que el niño tuvo una determinación de anticuerpos posterior o completó el estudio.

Utilizamos modelos de regresión longitudinal basados en ecuaciones de estimación generalizadas (GEE por sus siglas en inglés) para evaluar la relación entre las respuestas de anticuerpos anti-PfSEP-1 que varían en el tiempo y los criterios de valoración dicotómicos de la malaria. Se utilizaron modelos de regresión lineal basados en GEE similares para las valoraciones continuas de densidad de parásitos en todos los frotis de sangre disponibles y densidad de parásitos en frotis de sangre positivos. Estos modelos se ajustan tanto a posibles factores de confusión como a la falta de independencia (correlación) entre las observaciones tomadas del mismo sujeto a lo largo del tiempo. Los posibles factores de confusión incluyeron el fenotipo de la hemoglobina, la edad y la parasitemia previa promedio en todos los frotis de sangre.

Los niños sin anticuerpos IgG anti-PfSEP-1 detectables tenían densidades de parásitos más altas en todos los frotis de sangre disponibles, densidades de parásitos más altas en los frotis de sangre positivos y una mayor incidencia de malaria leve. (Figuras 15A-C). La malaria grave no ocurrió durante los períodos en los que los niños tenían niveles de anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables (0 casos / 201 semanas de niños con anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables frente a 6 casos / 6,149 semanas de niños con anticuerpos anti-PfSEP-1 indetectables), sin embargo, el pequeño número de casos totales impidió un análisis significativo. En nuestra cohorte, la malaria grave depende en gran medida de la edad y la mayoría de los casos ocurren antes de los 2 años de edad. Para aumentar el número de casos graves de malaria para el análisis, ampliamos el rango de edad examinado a 1,5 - 3,5 años de vida, que abarca 687 medidas de anticuerpos en 453 niños. Los anticuerpos anti-PfSEP-1 fueron detectables en el 6,0% de estas muestras y los niños fueron seguidos, para un total de 25.494 semanas de observación de niños (1.688 semanas de niños con anti-PfSEP-1 detectable y 23.806 semanas de niños con niveles indetectables). Sorprendentemente, la malaria grave no se produjo durante los períodos en los que los niños tenían niveles detectables de anticuerpos anti-PfSEP-1 (0 casos / 1.688 semanas de niños con anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables frente a 45 casos / 23.806 semanas de niños con anticuerpos anti-PfSEP-1 indetectables, Figura 5).

Los individuos sin anticuerpos IgG anti-PfSEP-1 detectables tenían un riesgo significativamente mayor de desarrollar malaria clínica grave (OR ajustado 4,4; efectos fijos de tipo III P <0,01) en comparación con individuos con niveles detectables de anticuerpos IgG anti-PfSEP-1 incluso después de ajustar por posibles factores de confusión. No hubo diferencias significativas en el riesgo de mortalidad por todas las causas o mortalidad asociada a la malaria, aunque las tasas de eventos de mortalidad fueron bajas. Estos resultados representan la primera demostración de que los anticuerpos que bloquean específicamente la salida del esquizonte pueden proteger contra la malaria grave en humanos.

El bloqueo de la salida del parásito protege contra la malaria

La malaria falciparum sigue siendo una de las principales causas de mortalidad infantil y se necesitan con urgencia vacunas para atenuar esta amenaza para la salud pública. Divulgamos la identificación racional de candidatos a vacunas mediante la identificación de proteínas del parásito reconocidas de forma única por anticuerpos expresados por niños resistentes, pero no susceptibles. Utilizando un cribado diferencial, identificamos dos genes que codifican antígenos de vacuna útiles, así como MSP-7, un candidato de vacuna conocido. Hemos caracterizado ampliamente PfSEP-1, el producto proteico de PF3D7 1021800. PfSEP-1 se localiza en la membrana de la vacuola esquizonte / parasitófora, las hendiduras de Maurer y la valva interna de la membrana de los RBCs en los RBCs infectados por esquizontes. PfSEP-1 es accesible a los anticuerpos durante la esquizogenia tardía y muestra una variación de secuencia mínima, particularmente en la región identificada por nuestros experimentos de cribado diferencial (aa 810 1083; SEQ ID NO: 2). Los anticuerpos contra PfSEP-1 atenúan significativamente el crecimiento del parásito a través de un mecanismo único; detener la salida de esquizontes de los glóbulos rojos infectados sin causar aglutinación de esquizontes.

La salida del esquizonte es un proceso complejo y estrictamente regulado que implica la fosforilación dependiente del calcio de las proteínas diana del parásito seguida de una remodelación proteolítica del parásito, así como de las proteínas citoesqueléticas de los RBCs. Uno de estos eventos proteolíticos involucra a SERA-5, el objetivo de los anticuerpos que aglutinan merozoitos y esquizontes y median la muerte de esquizontes en cooperación con el complemento. A diferencia de SERA 5 y otras proteínas involucradas en la salida de esquizontes, PfSEP-1 no se identificó en los perfiles globales de proteólisis durante la salida de esquizontes, y no observamos ninguna evidencia de eventos de escisión dentro de PfSEP-1 en ninguna etapa sanguínea de desarrollo. La localización de PfSEP-1 en la valva de RBC interna es consistente con un papel en la remodelación del citoesqueleto de RBC antes de la ruptura.

En experimentos de vacunación activa, rPbSEP-1A confirió una marcada protección contra la exposición de ANKA P. berghei como lo demuestra una reducción de 4,5 veces en la parasitemia siete días después de la exposición. Además, la vacunación con rPbSEP-1A dio como resultado la autocuración en uno de los once ratones vacunados. Estos datos constituyen el primer informe de protección en P. berghei mediante vacunas dirigidas a la salida de esquizontes y ofrecen un camino a seguir para el avance de estas vacunas hacia modelos de primates no humanos.

En nuestra cohorte de nacimiento longitudinal, los anticuerpos anti-PfSEP-1 se asociaron con una protección significativa contra la malaria grave, sin que se produjeran casos mientras que los niños tenían anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables. Esta es la primera vez que los anticuerpos que bloquean específicamente la salida del esquizonte se han asociado con la protección contra la malaria grave. En condiciones de exposición natural, solo el 6% de los niños de 1,5 a 3,5 años de nuestra cohorte tenían anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables. Esta baja prevalencia natural sugiere que la vacunación con adyuvante con PfSEP-1 podría tener un impacto marcado en la reducción de la malaria grave en los niños pequeños.

Los datos validan la estrategia de campo a laboratorio a campo para la identificación racional de candidatos a vacunas e indican que la PfSEP-1 es útil como vacuna para la malaria falciparum pediátrica. Al bloquear la salida de esquizontes, PfSEP-1 se sinergiza con las vacunas dirigidas a la invasión de hepatocitos y glóbulos rojos como MSP-4, mSP-7 y / o RTSS.

Los siguientes materiales y métodos se utilizaron para generar los datos descritos en este documento.

Población de estudio

Los sujetos participaron en el proyecto Mother Offspring Malaria Studies (MOMS), que tiene su sede en Muheza Designated District Hospital (DDH), en el noreste de Tanzania. Las madres que se presentaron en Muheza DDH para la administración fueron inscritas y proporcionaron un consentimiento informado firmado antes de que ellas y sus recién nacidos participaran en el estudio. Se han descrito detalles del diseño del estudio MOMS, los métodos de inscripción y los criterios de exclusión (Mutabingwa et al., PLoS Med 2, e407 (2005), y Kabyemela et al., J. Infect. Dis.198, 163-166 (2008))

Criterios de inclusión y seguimiento clínico

Controlamos N = 785 niños para la infección por P. falciparum desde el nacimiento hasta los 3,5 años de edad. Los niños fueron evaluados en visitas rutinarias de niño sano por un médico cada dos semanas desde el nacimiento hasta el año de edad, y luego mensualmente, incluido el análisis de frotis de sangre. Se recolectaron muestras de sangre de rutina una vez cada 6 meses desde 1,5 a 3,5 años de vida. También se tomaron frotis de sangre y muestras de sangre cada vez que el niño se enfermaba. Los niños enfermos eran examinados por un médico cuando se presentaban en el hospital o en la clínica móvil. El tratamiento fuera del estudio se redujo al mínimo mediante la vigilancia activa semanal de nuestras clínicas móviles.

La malaria clínica se definió como parasitemia asexual por P. falciparum por frotis de sangre junto con síntomas sugestivos de malaria, como temperatura > 37,5 °C, náuseas o vómitos, irritabilidad y mala alimentación. Se brindó tratamiento oportuno a los niños enfermos de acuerdo con las directrices del Ministerio de Salud de Tanzania, y se indicó a los participantes del estudio que obtuvieran todos los medicamentos, incluidos los antimaláricos, a través del personal del proyecto.

Recolección y procesamiento de muestras

La sangre venosa se colectó y se almacenó a 4 °C hasta su procesamiento. Después de la centrifugación, el plasma se almacenó a -80 °C. La parasitemia por P. falciparum se determinó mediante frotis de sangre espesa teñidos con Giemsa preparados a partir de sangre capilar o venosa. La densidad del parásito se expresó como el número de parásitos en etapa asexual / 200 glóbulos blancos en el frotis grueso. El rasgo de células falciformes se determinó mediante electroforesis (Helena Laboratories, Beaumont, TX, EE. UU.). Los hemogramas se obtuvieron en un analizador de impedancia (Abbott Cell Dyne® 1200).

Definiciones de casos

La malaria leve se definió como un frotis de sangre positivo y uno o más de los siguientes: 1) anemia definida por Hgb <6 g / dL; 2) vómitos; 3) enfermedad diarreica o gastroenteritis; 4) infección de las vías respiratorias inferiores; o 5) temperatura oral >= 38 °C.

La malaria grave se definió como un frotis de sangre positivo y uno o más de los siguientes: 1) dificultad respiratoria definida por una frecuencia respiratoria de >40 / min para niños mayores de dos meses de edad o una frecuencia respiratoria de >50 / min para niños menores de dos meses de edad; 2) antecedentes de una o más convulsiones en las veinticuatro horas antes o durante la hospitalización; 3) postración definida por la incapacidad de sentarse sin ayuda; 4) hipoglucemia definida por glucosa <2,2 mmol / L; 5) anemia severa definida por Hgb <6 g / dL; o 6) temperatura oral >40 °C.

La mortalidad asociada a la malaria se definió como la muerte con un frotis de sangre positivo obtenido durante la enfermedad terminal. Un niño que murió de meningitis bacteriana, pero que tuvo un frotis de sangre positivo, se consideró una muerte no malárica.

Selección de individuos susceptibles y resistentes

Se excluyeron los individuos con menos de 9 del total n = 18 de frotis de sangre mensuales programados colectados entre las edades de 2-3,5 años, los individuos con menos de 200 |jl de plasma disponible de la muestra de plasma obtenida a la edad de 2 (+ / - 2 semanas), y los individuos que estaban parasitemicos en el momento en que se obtuvo la muestra de plasma de 2 años (+ / - 2 semanas). Luego clasificamos a los individuos ordenados según la densidad media geométrica de parásitos en todos los frotis de sangre colectados entre las edades de 2 y 3,5 años. Esta densidad media de parásitos incluyó los frotis de sangre mensuales programados, así como los frotis de sangre positivos obtenidos durante las visitas por enfermedad. Se eligieron diez individuos de los extremos alto y bajo de esta distribución para formar los grupos Resistente y Susceptible. Las selecciones se realizaron con emparejamiento basado en el pueblo de residencia, el número de visitas clínicas asociadas con la malaria, el sexo y el número de dosis de antimaláricos. Los posibles factores de confusión examinados incluyeron: Fenotipo Hgb, presencia de malaria placentaria, edad materna, época de parto, uso de mosquiteros y número de embarazos previos. Se eligió una segunda selección independiente de individuos resistentes y susceptibles (tabla S2) para los ensayos de confirmación basados en ELISA.

Cribado diferencial de proteoma completo

Obtuvimos una librería de expresión de ADNc en estadio sanguíneo de P. falciparum en Lambda Zap (MRA-299) a partir de MR4. Se sembró esta librería a 25.000 clones / placa en placas NZY de 150 mm en la cepa XL-1 Blue de E. coli. Se prepararon filtros de nitrocelulosa empapados en IPTG por duplicado a partir de cada una de las 50 placas. Los filtros se bloquearon en leche al 5%, TBS pH 7,4 (MTBS). El plasma resistente (RP) y el plasma susceptible (SP) se diluyeron 1: 100 en MTBS. Los filtros duplicados se sondaron con RP o SP durante 3 horas a 37 °C. Los filtros se lavaron 3 x 5 min en Tween 20 al 0,05%, TBS pH 7,4 (TTBS) y se sondaron con IgG antihumana conjugada con fosfatasa alcalina diluida 1: 5000 en MTBS durante 1 hora a 37 grados Celsius. Los filtros se lavaron 3 x 5 min en TTBS. Los filtros se desarrollaron en BCIP / NBT. Los clones que reaccionaron con RP, pero no con SP se extrajeron de su placa correspondiente, se eluyeron en tampón SM, se volvieron a sembrar y se volvieron a cribar. Tres rondas de purificación de placas dieron como resultado típicamente clones homogéneos que son reactivos con RP, pero no reactivos con SP. Se recuperaron insertos de ADNc únicamente reactivos con RP mediante amplificación por PCR usando cebadores específicos de vector y se secuenciaron.

Expresión y purificación de PfSEP-1A

Subclonamos el ORF que codifica como 810-1083 de PfSEP-1 en pET30 (Novagen) y transformamos el plásmido resultante en el huésped de expresión E. coli BL21 (DE3) (Novagen). Los transformantes se cultivaron en caldo Terrific suplementado con 100 jg / ml de kanamicina, a 37 °C en un fermentador de 10 L con burbujeo de oxígeno (10 L / min) hasta una OD600 = 8,0. Se añadió isopropil-b-D-tiogalactopiranósido hasta una concentración final de 1 mmol / L, y el cultivo se alimentó continuamente con 0,3 g / ml de glucosa, 0,09 g / ml de extracto de levadura a 50 ml / h durante 12 h. Los cultivos se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron 750 g de pasta celular húmeda en 10 L de fosfato de potasio 10 mmol / L, NaCl 150 mmol / L e imidazol 10 mmol / L (pH 8,0) y se lisaron por disrupción a alta presión a 20.000 PSI (284.467 kg / cm2) (microfluidos, modelo 110-T). El lisado se clarificó mediante microfiltración de flujo tangencial (área de filtro 1 m2, tamaño de poro 1 jm, Milipore) y se recuperaron 8 L de lisado clarificado.

La purificación de proteínas se logró mediante un proceso de 4 pasos en un equipo de cromatografía BioPilot (Pharmacia). Brevemente, se aplicó lisado clarificado a una columna FineLine Pilot 35 (GE Healthcare) que contenía 90 ml de Ni-NTA Superflow Resin (Novagen). La proteína de interés se eluyó con un gradiente escalonado que contenía concentraciones crecientes de imidazol. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron, se ajustaron a 400 mmol / L de sulfato de amonio, 10 mmol / L de DTT y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de interacción hidrófoba en una columna FineLine Pilot 35 (GE Healthcare) que contenía 150 ml de Source 15PHE (GE Cuidado de la salud). Las proteínas recombinantes se eluyeron con un gradiente lineal de tampón de elución (Tris 10 mmol / L, DTT 1 mmol / L, EDTA 1 mmol / L [pH 8,0]). Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna FineLine Pilot 35 (GE Healthcare) que contenía 130 ml de MacroPrep High Q (BioRad). Las proteínas recombinantes se eluyeron con un gradiente lineal de tampón de elución (Tris 10 mmol / L, NaCl 1 mol / L, DTT 1 mmol / L, EDTA 1 mmol / L [pH 8,0]). La purificación final se logró mediante cromatografía de hidroxiapatita cerámica en una columna FineLine ^{Pilot 35}(Ge ^{Healthcare) que contenía 70 ml de CHT tipo 1 (BioRad). Las proteínas recombinantes se eluyeron con un}gradiente lineal de tampón de elución (500 mmol / L de fosfato de potasio y 1 mmol / L de DTT, pH 7,4)

Se intercambió tampón rPfSEP-1A purificado en fosfato de sodio 10 mmol / L, Tween 20 al 0,05%, sacarosa al 3% y se concentró a 500 mg / ml mediante ultrafiltración de flujo tangencial (área de filtro 50 cm2, tamaño de poro 5 kDa, Pall). Se liofilizó rPFSEP-1A a 500 mg / vial y se tapó bajo nitrógeno. Los niveles de endotoxinas fueron inferiores a 2 EU / mg de proteína según lo determinado por un ensayo aprobado por la FDA (Lonza). Los rendimientos típicos son > 50 mg de rPfSEP-1A por 750 gr de pasta celular húmeda.

Expresión y purificación de PbSEP-1A

Subclonamos el ORF que codifica como 725-1000 de PbSEP-1 en pET30 (Novagen) y transformamos el plásmido resultante en el huésped de expresión E. coli BL21 (DE3) (Novagen). Los transformantes se cultivaron en caldo Terrific complementado con 100 mg / ml de kanamicina, a 37 ° C en un fermentador de 10 L con burbujeo de oxígeno (10 L / min) hasta una DO600 = 8,0. Se añadió isopropil-b-D-tiogalactopiranósido hasta una concentración final de 1 mmol / L, y el cultivo se alimentó continuamente con 0,3 g / ml de glucosa, 0,09 g / ml de extracto de levadura a 50 ml / h durante 12 h. Los cultivos se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron 750 g de pasta celular húmeda en 10 L de fosfato de potasio 10 mmol / L, NaCl 150 mmol / L e imidazol 10 mmol / L (pH 8,0) y se lisaron por disrupción a alta presión a 20.000 PSI (284.467 kg / cm2) (microfluidos, modelo 110-T). El lisado se clarificó mediante microfiltración de flujo tangencial (área de filtro 1 m2, tamaño de poro 1 |jm, Milipore) y se recuperaron 8 L de lisado clarificado.

La purificación de proteínas se logró mediante un proceso de 3 pasos en un equipo de cromatografía BioPilot (Pharmacia). Brevemente, se aplicó lisado clarificado a una columna FineLine Pilot 35 (GE Healthcare) que contenía 90 ml de Ni-NTA Superflow Resin (Novagen). La proteína de interés se eluyó con un gradiente escalonado que contenía concentraciones crecientes de imidazol. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron, se ajustaron a 400 mmol / L de sulfato de amonio, 10 mmol / L de DTT y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de interacción hidrófoba en una columna FineLine Pilot 35 (GE Healthcare) que contenía 150 ml de Source 15PHE (GE Cuidado de la salud). Las proteínas recombinantes se eluyeron con un gradiente lineal de tampón de elución (Tris 10 mmol / L, DTT 1 mmol / L, EDTA 1 mmol / L [pH 8,0]). Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna FineLine Pilot 35 (GE Healthcare) que contenía 130 ml de MacroPrep High Q (BioRad). Las proteínas recombinantes se eluyeron con un gradiente lineal de tampón de elución (Tris 10 mmol / L, NaCl 1 mol / L, DTT 1 mmol / L, EDTA 1 mmol / L [pH 8,0]).

Se intercambió tampón rPbSEP-1A purificado en fosfato de sodio 10 mmol / L, Tween 20 al 0,05%, sacarosa al 3% y se concentró a 125 mg / ml mediante ultrafiltración de flujo tangencial (área de filtro 50 cm2, tamaño de poro 5 kDa, Pall). Se liofilizó rPFSEP-1A a 500 mg / vial y se tapó bajo nitrógeno. Los niveles de endotoxinas fueron inferiores a 2 EU / mg de proteína según lo determinado por un ensayo aprobado por la FDA (Lonza). Los rendimientos típicos son > 50 mg de rPbSEP-1A por 750 gr de pasta celular húmeda.

Cepas y cultivo de parásitos

Las cepas de P. falciparum (3D7, D10 y W2) se obtuvieron de MR4. Los parásitos se cultivaron in vitro según los métodos de Trager y Jensen con modificaciones menores 29. En resumen, los parásitos se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía 25 mm HEPES, 5% de eritrocitos humanos 0+, 0,5% de Albumax II (Invitrogen) o suero AB+ humano inactivado por calor al 10%, bicarbonato de sodio de 24 mm y 10 mg / ml de gentamicina a 37 °C con 5% de CO2, 1% de O2 y 94% de N2. ANKA P. berghei se obtuvo de MR4 como estabilizador y se expandió en ratones Balb / C antes de los estudios de exposición.

Producción de antisueros anti-PfSEP-1

El antisuero anti-PfSEP-1 de ratón se produjo mediante inmunización con ADN o con proteína recombinante. Para la inmunización con ADN, subclonamos el ORF que codifica como 810-1083 de PfSEP-1 en VR2001, transformado en el huésped E. coli NovaBlue (Novagen) y plásmido libre de endotoxina purificado (Endofree Giga, Qiagen). Se inmunizaron ratones Balb / C con 180 mg de plásmido (inyección intramuscular de 50 jg en cada pata trasera e inyección intradérmica de 80 mg en la base de la cola) seguido de inyecciones intradérmicas de 80 mg en la base de la cola cada dos semanas para un total de cuatro dosis. Para la inmunización de proteínas, emulsionamos rPfSEP-1 en un volumen igual de adyuvante TiterMax (CytRx Corporation) e inyectamos 50 mg de rPfSEP-1 por vía intraperitoneal a intervalos de dos semanas para un total de cuatro dosis.

Western blot

Los gránulos de parásitos se prepararon mediante el tratamiento de glóbulos rojos parasitados con saponina al 0,15% en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 en hielo durante 10 min, seguido de centrifugación (3.000 x g, 5 min), resuspensión en PBS frío y centrifugación (3.000 x g, 5 minutos). Los gránulos de parásitos o rPfSEP-1A se disolvieron en tampón de carga de muestras de SDS (Bio-Rad), se calentaron a 95 °C durante 10 min y las proteínas se separaron en geles de SDS-PAGE con gradiente de 4-11%. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa que se bloquearon en PBS de leche al 5% (pH 7,4) y Tween 20 al 0,05% durante 1 h. Las membranas se sondaron con sueros policlonales anti-PfSEP-1A o preinmunes de ratón, se detectaron mediante el uso de anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina y se desarrollaron con 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato / nitro azul tetrazolio (Sigma).

Detección de SNP en aislamientos de campo

Extrajimos ADN de papel de filtro que contenía manchas de sangre seca obtenidas de seis niños con parásitos de nuestra cohorte (QIAmp DNA Blood Mini Kit, Qiagen). Amplificamos nt 2.431-3.249 de PF3D7_1021800 a partir de ADN extraído utilizando un enfoque basado en PCR anidado. Los cebadores de la primera ronda fueron: F1 5'-GAAGAT GTTT GT CAT AAT AAT AACGT GGAAGACC- 3' (SEQ ID NO: 49), R1 5'-TCCTACAACATCTATTTCTCCTGTGTAAGG-3'. (SEQ ID NO: 50) Los cebadores de segunda ronda fueron: F2 5'-GAATAAAAAAATGGATGAGATGAAAG-3' (SEQ ID NO: 51), R25'-CTATTACTATCCTCATTTGCATCTGTATATTTATCC-3' (SEQ ID NO: 52). Las condiciones de la primera ronda de PCR fueron: 10 minutos de desnaturalización inicial a 94 °C seguido de 40 ciclos de 45 segundos a 94 °C, 60 segundos a 55 °C, 90 segundos a 70 °C, extensión a 70 °C durante 10 minutos. Las condiciones de la segunda ronda de PCR fueron: 10 minutos de desnaturalización inicial a 94 °C seguido de 35 ciclos de 45 segundos a 94 °C, 60 segundos a 55 °C, 60 segundos a 70 °C, extensión a 70 °C durante 10 minutos. Los fragmentos de ADN se purificaron con el kit Quickclean II PCR (GenScript), se clonaron en pDrive (Qiagen) y se secuenciaron.

Estrategia de eliminación / desactivación de PfSEP-1

Construimos vectores diseñados para romper la región promotora (desactivación) y la región codificante (eliminación) del gen que codifica PfSEP-1. Para el constructo de desactivación, amplificamos un segmento de 749 bp (-493-257 bp) de ADN genómico 3D7 usando cebadores directos de PCR 5'-GCACTGCAGAGCACTGAATAAATGAAATG-3 '(SEQ ID NO: 53) y cebador inverso 5'-GCAGCGGCCGCGTGGATGCACCATCATCGAG-3' (SEQ ID NO: 54). Para el constructo de eliminación, amplificamos un segmento de 868 bp (232-1099 bp) de ADN genómico 3D7 usando cebadores directos de PCR 5'-GCACTGCAG- GAGTTATCTCGATGATGGTG-3' (SEQ ID NO: 55) y cebador inverso 5'-GCAGCGGCCGCGATCCATGATATTAA- CATGGCTC-3' (SEQ ID NO: 56).

Los fragmentos de ADN amplificados se digirieron con las enzimas de restricción PstI y NotI y se clonaron en el plásmido pHD22Y 30. Las secuencias de ADN y la ubicación de todos los insertos se confirmaron mediante el uso de cebadores específicos del vector en la reacción de secuenciación que abarcó la región de clonación del vector.

Las etapas asexuales de los parásitos W2 y 3D7 se cultivaron como se describió anteriormente. Los parásitos se sincronizaron con d-sorbitol al 5% y los estadios de esquizontes al 10% de parasitemia se purificaron mediante un método de separación Percoll-sorbitol 31. Los RBCs no infectados se sometieron a electroporación con un retardo de 200 de insertos de ADN que contenían pHD22Y superenrollado como se describe en 9'32. Después de la transformación, se añadieron esquizontes purificados a RBCs electroporados y se mantuvieron en cultivo durante 48 h antes de la adición del fármaco WR99210 (Sigma) hasta una concentración final de 5 nmoles / L. Los parásitos resistentes a los fármacos aparecieron de tres a cuatro semanas después de la transfección. El transporte episomal de plásmidos en los parásitos resistentes a los fármacos se confirmó mediante PCR para ambas construcciones utilizando ADN genómico obtenido de los parásitos resistentes a los fármacos y cebadores específicos de vector F 15'-CATGTTTTGTAATTTATGGGATAGCG-3' (SEQ ID NO: 57) y R15'-CGCCAAGCTCGAAATTAAC- CCTCAC-3' (SEQ ID NO: 58). De seis a ocho semanas después de la transfección, probamos la integración cromosómica de ambas construcciones mediante PCR utilizando ADN genómico obtenido de los parásitos resistentes a los fármacos y cebadores cromosómicos y específicos de vectores F25'-GCCACATATAATTCTTGTACTTGTC -3' (SEQ ID NO: 59) y R25'-CGAAATTAACCCTCACTAAAGG- 3' (SEQ ID NO: 60) o R35'-GACAAGTACAAGAATTATATGTGGC-3' (SEQ ID NO: 61) para construcciones de desactivación, o F25'- GTATGATGGAAAATAAATACCCAAATG-3' (SEQ ID NO: 62) y R2 CGAAATTAACCCTCACTAAAGG-3' (SEQ ID NO: 63) o R35'-GACAAGTACAAGAATTATATGTGGC-3' (SEQ ID NO: 64) para construcciones de eliminación (Figs.16A-C).

Ensayos de anticuerpos anti-PfSEP-1

Los ensayos iniciales de anticuerpos confirmatorios se realizaron con placas ELISA recubiertas con rPfSEP-1A de acuerdo con métodos conocidos (Fig.18).

Para medir los niveles de anticuerpos IgG anti-rPfSEP-1A en toda la cohorte, se utilizó un ensayo basado en perlas. Se conjugaron 100 |jg de rPfSEP-1A o 100 |jg de BSA con 1,25 x 107 microesferas (Luminex) y se combinaron perlas conjugadas de rPfSEP-1 y BSA y se liofilizaron en alícuotas de un solo uso. Las perlas reconstituidas se incubaron durante 30 min a 37 °C con muestras de plasma humano a una dilución de 1:80 en Assay Buffer E (ABE, PBS pH 7,4 que contiene BSA al 0,1%, Tween-20 al 0,05% y azida sódica al 0,05%) en placas de fondo de filtro de microtitulación (Millipore). Las perlas se lavaron tres veces en ABE mediante filtración al vacío y se incubaron durante 30 min a 37 °C con IgG antihumana biotinilada (Pharmingen) diluida 1: 1000 en ABE. Las perlas se lavaron tres veces en ABE mediante filtración al vacío y se incubaron durante 10 min a 37 °C con estreptavidina conjugada con ficoeritrina (Pharmingen) diluida 1: 500 en ABE. Las perlas se lavaron tres veces en ABE mediante filtración al vacío, se resuspendieron en ABE y se analizaron en un analizador multianalito BioPlex 200. Los valores de fluorescencia para las perlas de BSA se restaron de las perlas de rPfSEP-1A. El punto de corte para los niveles de anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables se definió como valores de fluorescencia mayores que la media nivel de fluorescencia 2Sd de 95 niños sanos de América del Norte.

Ensayos de inhibición del crecimiento

Se llevaron a cabo ensayos de inhibición del crecimiento (GIA por sus siglas en inglés) con sueros o controles de ratón anti-PfSEP-1. Los sueros se dializaron durante la noche en ^pB^s, pH 7,4, se inactivaron con calor a 56 °C durante 30 min y se preincubaron con RBC humanos durante 1 hora antes de su uso en ensayos de GIA. Los ensayos de GIA se llevaron a cabo utilizando cepas W2, 3D7 y D10 de P. falciparun. Los parásitos se sincronizaron con la etapa de anillo mediante tratamiento con sorbitol 34 al 5% durante tres ciclos de replicación sucesivos y se cultivaron hasta la etapa de trofozoíto maduro. Los parásitos con parasitemia de 0,3-0,4% y hematocrito al 2% se incubaron con antisueros a una concentración final del 10% en un volumen final de 100 ml en pocillos de microvaloración. Los cultivos se realizaron por triplicado con cinco réplicas (que comprenden un total de 15 pocillos individuales) preparadas para cada condición de tratamiento. Después de 24 horas, se prepararon frotis de sangre de cada réplica, se tiñeron con Giemsa, se enumeraron los parásitos en etapa de anillo y se promediaron los resultados de los tres pocillos.

Ensayos de detención de esquizontes

El ensayo de detención de esquizontes (SAA por sus siglas en inglés) se llevó a cabo con sueros o controles de ratón anti-PfSEP-1. Los sueros se dializaron durante la noche en PBS, pH 7,4, se inactivaron con calor a 56 °C durante 30 min y se preincubaron con RBC humanos durante 1 hora antes de su uso en ensayos de SAA. Los ensayos de SAA se llevaron a cabo utilizando cepas W2 y 3D7 de P. falciparum. Los parásitos se sincronizaron con la etapa de anillo mediante tratamiento con sorbitol 34 al 5% durante tres ciclos de replicación sucesivos y se cultivaron hasta la etapa de esquizontes prematuros. Los parásitos con parasitemia del 3,5% y hematocrito del 2%, constituidos principalmente por esquizontes prematuros, se incubaron con antisueros a una concentración final del 10% en un volumen final de 100 |jl en pocillos de microvaloración. Los cultivos se realizaron por triplicado con cinco réplicas (que comprenden un total de 15 pocillos individuales) preparadas para cada condición de tratamiento. Después de 12 horas, se prepararon frotis de sangre de cada réplica, se tiñeron con Giemsa, se enumeraron los parásitos en estadio esquizonte y se promediaron los resultados de los tres pocillos.

Ensayos de inmunofluorescencia

Se prepararon frotis de sangre de cultivos asincrónicos de parásitos de la cepa 3D7, se fijaron en metanol frío durante 15 minutos y se sondaron con anti-PfSEP-1 preparado mediante vacunación con ADN, sueros preinmunes o anti-PfMSP-1 de conejo (MR4) diluido 1: 200 en PBS, B^sA al 5%, pH 7,4. Los frotis de sangre se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 hora a 25 °C, se lavaron tres veces en pBs, Tween-20 al 0,05% y se incubaron con IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa fluor 488 (Molecular Probes) e IgG anti-conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 594 (sondas moleculares). Los frotis de sangre se incubaron durante 10 minutos en 1 jg / ml de 4',6'-diamino-2-fenilindol (DAPI, Sigma) para marcar los núcleos y se cubrieron con el reactivo anti-desvanecimiento ProLong Gold (Invitrogen). Se tomaron imágenes de frotis de sangre utilizando un microscopio confocal (Leica SP2, Leica Microsystems, Exton, PA) equipado con un objetivo de inmersión en aceite 100x y se recogieron secciones en Z secuenciales de los eritrocitos infectados. Para la localización de PfSEP-1 en esquizontes en etapa tardía, realizamos tinción e imágenes de células vivas. Brevemente, los parásitos de la cepa 3D7 se sincronizaron con la etapa de anillo mediante tratamiento con sorbitol 34 al 5% durante tres ciclos de replicación sucesivos y se cultivaron hasta la etapa de esquizontes prematuros. Se incubaron anti-PfSEP-1 preparado mediante vacunación con ADN (1: 200) y glicoforina A antihumana de conejo (1: 200) con glóbulos rojos infectados con esquizontes vivos en PBS, BSA al 5%, pH 7,4 durante una hora a 25 °C. Muestras se lavaron tres veces en PBS y se incubaron con IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) e IgG anti-conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Las muestras se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron durante 10 minutos en 1 mg / ml de 4',6'-diamino-2-fenilindol (DAPI, Sigma) para marcar los núcleos. Se prepararon frotis de sangre y se cubrieron con el reactivo anti-decoloración ProLong Gold (Invitrogen). Se tomaron imágenes de frotis de sangre utilizando un microscopio confocal (Leica SP2, Leica Microsystems, Exton, PA) equipado con un objetivo de inmersión en aceite 100x y se recogieron secciones en Z secuenciales de los eritrocitos infectados.

Microscopía inmunoelectrónica

Los parásitos de la cepa 3D7 se sincronizaron con la etapa de anillo mediante tratamiento con sorbitol 34 al 5% durante tres ciclos de replicación sucesivos y se cultivaron hasta la etapa de esquizontes prematuros. Las muestras se bloquearon durante 1 hora a 25 °C en 1 x PBS que contenía 2% de BSA. Las muestras se incubaron con anti-PfSEP-1 preparado mediante vacunación con ADN (diluido 1:50 en PBS) y sueros policlonales glicoforina-A anti-humana de conejo (diluido 1:50 en PBS) durante 3 horas a 25 °C. Se utilizó suero de ratón preinmune como control negativo. Las muestras se lavaron tres veces en 1 x PBS y se incubaron durante 1 h a 25 °C con IgG anti-ratón de cabra conjugada con oro de 5 o 18 nm (Invitrogen) e IgG anti-conejo de cabra conjugada con oro de 10 nm (Invitrogen). Las muestras se lavaron tres veces en 1 x PBS y se fijaron durante 30 min a 4 °C con glutaraldehído al 2%, paraformaldehído al 1% en tampón de cacodildato de sodio 0,1 M. Las muestras se deshidrataron, se incrustaron en Epon (EMS), se seccionaron en un ultramicrotomo, se tiñeron por contraste durante 10 min en acetato de uranilo acuoso al 5% y se examinaron en un microscopio electrónico Philips CM10.

Estudios de vacunación y anticuerpos contra PbSEP-1A

Los ensayos de anticuerpos se realizaron con placas de ELISA recubiertas con rPbSEP-1A de acuerdo con nuestros métodos publicados 14 usando un anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con anHRP (Sigma) para la detección de anticuerpos anti-PbSEP-1A unidos.

Inmunizamos ratones Balb / C (n = 11) con 40 jg de rPbSEP-1A emulsionado en 100 jl de adyuvante TiterMax Gold o adyuvante solo (n = 11). Los ratones se inmunizaron IP los días 0, 14, 28 y 42 y SC el día 56. El día 63, los ratones se expusieron por vía IP con el parásito ANKA de P. berghei106 infectando los glóbulos rojos. Los ratones se monitorearon diariamente desde el día 4 después de la exposición con frotis de sangre para cuantificar la parasitemia. Los ratones con parasitemias superiores al 20% o que mostraban signos de enfermedad (encorvamiento, inmovilidad, disminución de la ingesta de alimentos, etc.) fueron sacrificados.

Análisis estadístico

Para evaluar la relación entre las respuestas de anticuerpos anti-PfSEP-1 y la resistencia a los resultados clínicos de la malaria, desarrollamos modelos de medidas repetidas utilizando SAS versión 9.3 (Cary, NC). Se emplearon ecuaciones de estimación generalizadas que utilizan estimación de cuasi-verosimilitud para estos datos de resultados binarios correlacionados (medidas repetidas) (Zeger, SL Y Liang, KY Longitudinal data analysis for discrete and continuous outcomes. Biometrics 42, 121-130 (1986)). Proc Genmod con una distribución binomial y una función de enlace logit se especificaron con modelos separados para cada uno de los resultados clínicos dicotómicos de malaria. Debido a la falta de independencia de las medidas repetidas en los niños a lo largo del tiempo, utilizamos técnicas de modelado longitudinal (medidas repetidas) en Proc Genmod para ajustar la correlación de respuestas dentro de los individuos. Se eligió una estructura de correlación autorregresiva dada la expectativa de que la correlación de respuestas disminuirá con el tiempo. El ajuste del modelo con diferentes estructuras de correlación se evaluó con el Criterio de Información Cuasi Akaike (QIC). Se utilizaron modelos de regresión lineal basados en GEE similares para las valoraciones continuas de densidad de parásitos en todos los frotis de sangre disponibles y densidad de parásitos en frotis de sangre positivos. Para algunos resultados de malaria dicotómicos, incluido la malaria grave, se produjeron ceros de muestreo (es decir, ningún caso de malaria grave) entre los niños con respuestas detectables de anticuerpos anti-PfSEP-1. Esto conduce a un "sesgo infinito" por el cual las razones de probabilidades están sesgadas muy por encima de la razón de probabilidades real. Para abordar esto, usamos la corrección de Laplace, agregando un evento adverso al grupo con niveles de anticuerpos anti-PfSEP-1 detectables y un número proporcional de eventos al grupo con niveles de anticuerpos anti-PfSEP-1 indetectables para restaurar las proporciones de pares discordantes. (Groenlandia, S., Schwartzbaum, J.A. & Finkle, W.D. Problems due to small samples and sparse data in conditional logistic regression analysis. Am J Epidemiol 151, 531-539 (2000)).

Los datos de estos estudios indican que los individuos resistentes tenían niveles de anticuerpos 4 veces más altos contra el Pf SEP-1 recombinante en comparación con los individuos susceptibles, el anti-Pf SEP-1 detecta un antígeno de 244 kDa en los glóbulos rojos infectados por P. falciparum, pero no en los no infectados, Pf SEP -1 se localiza en la membrana de la vacuola esquizonte / parasitófora, las hendiduras de Mauer y la valva interna de la membrana de los glóbulos rojos en los glóbulos rojos infectados con esquizontes, el anti-PfSEP-1 inhibe el crecimiento del parásito en un 48-74%. En los ensayos de detención de esquizontes, anti-Pf SEP-1 inhibe la ruptura de esquizontes entre 4 y 7 veces, y PfSEP-1 es un antígeno de vacuna útil para atacar la ruptura de esquizontes y reducir así la gravedad de la malaria.

EJEMPLO 2: Papel de la fosforilación y la interacción proteína-proteína en la salida del esquizonte

PfSEP-1 está involucrado en el proceso de salida del esquizonte de los glóbulos rojos infectados por P. falciparum. Como se describió anteriormente, PfSEP-1, un antígeno del parásito de 244 kDa, se localiza en la membrana de la vacuola esquizonte / parasitófora, las hendiduras de Maurer y la valva interna de la membrana de los RBCs en los RBCs infectados con esquizontes. Los anticuerpos contra una región central altamente conservada de 274 aa de PfSEP-1 (rPfSEP-1A, aa 810-1083) reducen la replicación del parásito en un 58-75% (todo p <0,009) al bloquear la ruptura de esquizontes. La vacunación activa con rPbSEP-1A da como resultado una reducción de 2,25 veces en la parasitemia después de la exposición in vivo con P. berghei. En estudios de cohortes en humanos, los niños experimentaron una incidencia drásticamente mayor de malaria grave durante los períodos con niveles indetectables de anticuerpos anti-PfSEP-1 (45 casos / 23,806 semanas de niños) en comparación con los períodos con niveles de anticuerpos detectables (0 casos / 1,688 semanas de niños; OR ajustado 4,4; efectos fijos del Tipo III p <0,01). Estos resultados demuestran que PfSEP-1 es fundamental para la salida del parásito y que los anticuerpos contra esta proteína son protectores in vivo contra la malaria grave.

La salida del esquizonte es un proceso complejo y estrictamente regulado que requiere tanto la señalización del calcio como la activación de una cascada de proteasas que procesa tanto las proteínas de los RBCs del parásito como del huésped. Los eventos centrales incluyen la activación de PfPKG, la liberación de PfSUB1 en la vacuola parasitófora y el procesamiento / activación proteolítica de PfSERA5 por PfSUB1. La desactivación condicional de la quinasa dependiente de calcio PfCDPK5 también da como resultado la detención de la salida de esquizontes. La vacunación con PfSERA5 reduce y bloquea la salida de esquizontes, así como la invasión de parásitos. Un sustrato(s) de fosforilación in vivo de PfCDPK-5 es PfSEP-1.

Las interacciones proteína-proteína de PfSEP-1 se estudiaron utilizando levadura de dos híbridos (Y2H) y se centraron en la región rPfSEP-1A (aa 810-1083; SEQ ID NO: 2) y se confirmaron mediante inmunoprecipitación de extractos de esquizontes con anti-PfSEP- 1 y secuenciación (Fig.20). Se clonó PfSEP-1 en un plásmido "cebo" como fusión con factor de transcripción truncado; los ADNc de la malaria se clonaron en el plásmido diana como fusión con el factor de transcripción truncado; el cribado se llevó a cabo en levadura para la complementación del factor de transcripción mediante un ensayo del gen indicador; y PfSERA5 se identificó como socio de unión para PfSEP-1. El análisis también identificó a PfMESA como socio vinculante. Estos cribados han identificado 26 proteínas de interacción potencial, incluidas PfSERA5, PfEMP2 (MESA), RAP-1 y RhopH3, que también se han identificado como sustratos para la proteasa crítica de salida PfSUB1. Una respuesta inmune contra las secuencias SERA5 y SUB 1 inhibe las salidas de esquizontes. SERA5 se identificó en el cribado de levadura-2-híbrida usando PfSEP-1A como cebo. Se encontró que rPfCDPK-5 fosforilaba rPfSEP-1A (ver Figs. 20-21).

La regulación de PfSEP-1 mediada por fosforilación y la unión de esta proteína tanto a las proteínas del parásito como a las de los glóbulos rojos es esencial para la salida del parásito. Las proteínas parásitas y RBC que interaccionan con, o fosforilan PfSEP-1, son útiles como antígenos de vacuna solos o junto con PfSEP-1 (por ejemplo, péptido PfSEP-1A) para la inmunización contra la malaria. Por lo tanto, las cinasas plasmodiales (p.ej., Pf CDPK5) y las proteínas que interactúan con PfSEP-1 (p. ej., PfSERA5, PfEMP2 (MESA), RAP-1, RhopH3) se utilizan solas o como componentes de una composición de vacuna basada en PfSEP-1 para generar una anticuerpo o respuesta inmune celular, que conduce a una reducción sinérgica en el crecimiento del parásito, la salida del esquizonte y (como resultado) una reducción en la gravedad de la malaria.

EJEMPLO 3: Bloqueo de la transmisión y reducción de la invasión de mosquitos.

Los gametocitos, una forma de parásito en etapa sanguínea, son captados por un mosquito Anopheles hembra durante una ingestión de sangre. PfSEP-1 se expresa en gametocitos masculinos y femeninos, la etapa sexual del desarrollo del parásito que se forma dentro de los glóbulos rojos del huésped. Después de ser absorbidos por el mosquito con una ingestión de sangre, los gametocitos deben desprenderse del glóbulo rojo que los recubren en un proceso análogo a la ruptura del esquizonte. Este proceso tiene lugar dentro del intestino del mosquito. Los gametocitos masculinos y femeninos que no se rompen de sus glóbulos rojos no pueden unirse para formar un ookinete y, por lo tanto, no pueden infectar al mosquito.

Varias candidatas a vacunas bloqueadoras de la transmisión intentan dirigirse al desarrollo de ookinete en el mosquito (Kaslow y col., Infect Immun 1994; 62: 5576-80; Bustamante et al., Parasite Immunol 2000; 22: 373-80). Debido a que PfSEP-1 se expresa en gametocitos (Figs. 18E-G), los anticuerpos contra PfSEP-1 absorbidos con la ingesta de sangre previenen la ruptura de los gametocitos de los glóbulos rojos del huésped dentro del mosquito, lo que proporciona un efecto de bloqueo de la transmisión. Por tanto, una vacuna que provoca una respuesta inmune de anticuerpos contra PfSEP-1 (por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a PfSEP-1A) también conduce al bloqueo de la salida de gametocitos de los glóbulos rojos. Los anticuerpos producidos como resultado del régimen de vacunación descrito en este documento obtienen fácilmente acceso a los glóbulos rojos, debido a la permeabilidad de la membrana de los glóbulos rojos infectados. Por tanto, estos datos indican que la vacuna también es útil para prevenir o reducir la invasión de mosquitos a partir de una ingestión de sangre humana.

EJEMPLO 4: Vacunación de madres y adolescentes

Se descubrió que la transmisión materna de anticuerpos anti-PfSEP-1 de una madre a un feto, por ejemplo, a través de la interfaz materno-fetal a través de la placenta, reduce la malaria en los bebés. Hemos identificado anticuerpos PfSEP-1 en el suero de mujeres embarazadas cuyos hijos estuvieron protegidos de la malaria grave durante la infancia (primer año de vida), pero no detectamos anticuerpos anti-PfSEP-1 en mujeres embarazadas cuyos hijos tienen malaria grave durante la infancia. Debido a que los recién nacidos (primeros 28 días de vida) tienen un sistema inmunológico poco desarrollado, a menudo no tienen respuestas inmunes sólidas a las vacunas. Por tanto, la vacuna descrita en el presente documento también es útil para proteger a los bebés. Las mujeres embarazadas y / o mujeres en edad fértil se inmunizan con una vacuna que contiene el péptido o péptidos PfSEP-1. Los anticuerpos anti-PfSEP-1 producidos como resultado de la inmunización atraviesan la placenta y protegen al recién nacido de la infección por malaria, la morbilidad y la mortalidad. Las mujeres se vacunan a partir de los 9 años, por ejemplo, 3 dosis durante 6 meses. La inmunización de las mujeres antes del embarazo o al principio del embarazo es útil para prevenir, retrasar o inhibir la infección y el desarrollo de la malaria en fetos y recién nacidos.

OTRAS REALIZACIONES

Si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

La patente y la literatura científica a la que se hace referencia en este documento establece el conocimiento que está disponible para los expertos en la técnica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna para prevenir o reducir la gravedad de la malaria que comprende una composición que conduce a la inhibición de la salida del parásito de los glóbulos rojos o inhibe la salida del parásito de dichos glóbulos rojos, donde dicha composición comprende un polipéptido de PfSEP-1 (proteína de salida del esquizonte-1 Plasmodium falciparum) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma o un ácido nucleico que codifica un producto del gen PfSEP-1 que comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento está definido por SEQ ID NO: 2 y provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o donde dicha composición comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y donde dicho fragmento de polinucleótido codifica un producto del gen PfSEP-1 que provoca

una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o

donde dicha composición comprende un anticuerpo purificado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno PfSEP-1 de sEq ID NO: 3 o un fragmento del mismo,

donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos.

2. Una composición que inhibe la salida de parásitos de los glóbulos rojos para su uso en un método para prevenir o reducir la gravedad de la malaria, donde dicho método comprende administrar la composición a un sujeto,

donde dicha composición comprende un polipéptido PfSEP-1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma o un ácido nucleico que codifica un producto del gen PfSEP-1 que comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y donde dicho fragmento de polinucleótido codifica un producto del gen PfSEP-1 que provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o

donde dicha composición comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y donde dicho fragmento de polinucleótido codifica un producto del gen PfSEP-1 que provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos, o

donde dicha composición comprende un anticuerpo purificado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PfSEP-1 de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos.

3. Una vacuna para su uso en la prevención o reducción de la gravedad de la malaria que comprende una composición polipeptídica, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, donde dicho fragmento provoca una respuesta inmune que inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos.

4. La vacuna de la reivindicación 1 o la vacuna para su uso según la reivindicación 3, que comprende además un adyuvante.

5. La vacuna de la reivindicación 1 o la vacuna para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4 para su uso en un método de tratamiento o prevención de P. falciparum malaria, donde dicho método comprende administrar la composición a un sujeto.

6. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde el sujeto tiene al menos aproximadamente 6-8 semanas de edad, o donde el sujeto es una mujer adolescente o una mujer en edad fértil.

7. Vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde la vacuna se administra por vía intramuscular.

8. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además una segunda vacuna para su uso en dicho método, donde dicha segunda vacuna comprende un inhibidor de la invasión del hígado por parásitos, tal como RTS,S (Mosquirix ™).

9. Vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además una segunda vacuna para su uso en dicho método, donde dicha segunda vacuna comprende un inhibidor de la invasión de glóbulos rojos por parásitos, tal como MSP-I.

10. Un anticuerpo purificado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno PfSEP-1 de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, donde dicho fragmento está definido por SEQ ID NO: 2 y donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la salida del parásito de los glóbulos rojos.

11. El anticuerpo purificado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en un método para prevenir o reducir la gravedad de la malaria, donde dicho método comprende administrar el anticuerpo purificado o fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto.