MXPA06002311A - Epitopos de celulas t cd8+ del virus del papiloma humano (vph). - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona los medios para identificar los epitopos de celulas T CD8+ funcionales, en cualquier proteina de interes. La presente invencion proporciona ademas los epitopos de celulas T CD8+ de diversas proteinas. En moderadores opcionales, la presente invencion proporciona los epitopos adecuados para el uso en las vacunas profilacticas y/o terapeuticas. En modalidades particularmente preferidas, la presente invencion proporciona los epitopos modificados adecuados para el uso en vacunas profilacticas y/o terapeuticas. En algunas modalidades preferidas, la presente invencion proporciona los medios para el desarrollo de vacunas de HPV, en particular vacunas multivalentes para la prevencion de infeccion con cepas de HPV de alto riesgo. En particular, la presente invencion proporciona los medios para identificar los epitopos de celulas T CD8+ en cepas de HPV tales como HPV 16 y HPV 18. En modalidades adicionales, la presente invencion proporciona los medios para el desarrollo de vacunas terapeuticas contra los tipos de HPV de alto riesgo que previenen el desarrollo de tumores benignos y/o malignos en individuos infectados. La presente invencion proporciona ademas los epitopos adecuados para el uso en vacunas profilacticas y terapeuticas.

Description

EPITOPOS DE CELULAS T CD8+ DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los medios para identificar los epitopos de células T CD8+ funcionales, en cualquier proteina de interés. La presente invención proporciona además los epitopos de células T CD8+ de diversas proteínas. En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona epitopos de células T CD8+ del virus del papiloma humano (VPH) . En modalidades adicionales, la presente invención proporciona los epitopos adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. En modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona epitopos modificados adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los linfocitos, en particular "células B" y "células T" son dos de los tipos celulares principales involucrados en la respuesta inmune de humanos y otros animales. Mientras que las células B están involucradas en los aspectos humorales de la respuesta inmune y son responsables de la producción de anticuerpos, las células T están involucradas en aspectos mediados por células de la respuesta inmune. No obstante, estas dos clases de linfocitos funcionan conjuntamente vía una red complicada de factores de reconocimiento, citocinas y EEF:170238 otros elementos de la respuesta inmune. Dentro de las células T, existen dos clases de células principales, a saber, las células T citotóxicas (Te) y las células T cooperadoras (Th) . Después de la activación, las células T citotóxicas matan a las células infectadas, mientras que las células T cooperadoras activan en otras células, tales como las células B y los macrófagos . Las células T intactas son activadas para producir las células T infectoras "armadas" después de la exposición de un antigeno específico que es presentado sobre la superficie de una célula presentadora de antigeno (APC, por sus siglas en inglés) en conjunto con un componente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) . Las dos clases principales de células T son a menudo descritas con base en sus receptores de la superficie celular. Las células Te son frecuentemente denominadas como células "CD8" ("CD8+"), y las células Th son frecuentemente denominadas como células "CD4" (,XCD4+"). A pesar de sus diferentes funciones, a las células CD4+ y CD8+ no funcionan independientemente una de la otra. Más bien, se sabe que las células CD8+ son frecuentemente dependientes de las células CD4+ en el montaje de una respuesta a un inmunógeno . De este modo, las células CD8+ frecuentemente requieren la activación de las células CD4+ para matar las células infectadas. Además, parece que en algunos casos, las células CD8+ son efectivas en matar las células infectadas, mientras que en otros casos, estas células no son efectivas. No obstante, a pesar de los avances recientes en el entendimiento de la respuesta inmune, se necesitan todavía medios para la identificación confiable de los epitopos de células CD8+ que sean efectivos, así como los medios para diferenciar los epitopos efectivos de los no efectivos . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los medios para identificar los epitopos de células CD8+, funcionales, en cualquier proteína de interés . La presente invención proporciona además los epitopos de células CD8+ de diversas proteínas. En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona los epitopos de células CD8+ del virus del papiloma humano (HPV) . La presente invención proporciona además los epitopos adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. En modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona los epitopos modificados, adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas . La presente invención proporciona los medios para evaluar las respuestas de las células T CD8+ de una manera funcional . En particular, la presente invención proporciona los medios in Vitro para evaluar la respuesta de células T CD8+-en presencia de un anticuerpo que imita la activación de las células T in vivo. En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona los medios para identificar la inmunogenicidad de una proteína de interés, que comprende los pasos de: obtener una proteína de interés; preparar una pluralidad de fragmentos de aminoácidos de .la protelna de interés, tal que cada fragmento se traslapa en secuencia con sus fragmentos contiguos; poner en contacto los fragmentos de aminoácidos de la proteína de interés con una solución que comprende las células T CD8+ humanas intactas, y células dendríticas, en donde las células dendríticas han sido diferenciadas, y en donde las células T CD8+ han sido expuestas al anticuerpo anti-CD40, antes de poner en contacto las células con las células dendríticas y los péptidos; e identificar una región de epitopo con los fragmentos de aminoácidos de la proteína de interés, en donde el paso de identificación comprende la medición de la habilidad de la región de epitopo para estimular la proliferación de las células T CD8+ humanas, intactas. En algunas modalidades particularmente preferidas, las células dendríticas y las células CD8+ son obtenidas de una fuente de sangre única. En modalidades particularmente preferidas, adicionales, al anticuerpo anti-CD40 es agregado a la solución después de que las células CD8+, las células dendríticas y los péptidos han sido combinados . La presente invención proporciona además los métodos para modificar la inmunogenicidad de una proteina de interés que comprende los pasos de: obtener una proteína de interés; preparar una pluralidad de fragmentos de aminoácidos de la proteína de interés, tal que cada fragmento se traslapa en secuencia con sus fragmentos contiguos; poner en contacto los fragmentos de aminoácidos de la proteína de interés con una solución que comprende las células T CD8+ humanas, intactas, y células dendríticas, en donde las células dendríticas han sido diferenciadas, y en donde las células T CD8+ han sido expuestas al anticuerpo anti-CD40 ya sea antes de o después del contacto de las células con las células dendríticas y los péptidos; identificar una región de epitopo con los fragmentos de aminoácidos de la proteína de interés, en donde el paso de identificación comprende medir la habilidad de la región de epitopo para estimular la proliferación de las células ? CD8+ humanas, intactas; y luego modificar la región de epitopo identificada de la proteína de interés, tal como la inmunogenicidad del epitopo modificado es ya sea mayor que o menor que la imunogenicidad de la proteína original de interés. En algunas modalidades, son modificados epitopos múltiples. En algunas modalidades particularmente preferidas, las células dendríticas y las células CD8+ son obtenidas de una fuente sanguínea simple. En modalidades particularmente preferidas, adicionales, el anticuerpo anti-CD40 es agregado a la solución después de que las células T CD8+, células dendríticas y los péptidos han sido combinados .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona los métodos y las composiciones para la identificación de los epitopos en virus, incluyendo pero no limitados al HPV. En particular, la presente invención proporciona las aplicaciones para un sistema de ensayo modificado de células T (por ejemplo, el ensayo I-MU E®) , para la identificación de epitopos de células T CDF8+ en diversos virus, incluyendo el HPV. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona los métodos para la identificación de los epitopos de HPV en las secuencias de diversos tipos de HPV, así como la producción de los péptidos los cuales, cuando son incorporados a una secuencia de HPV, son capaces de iniciar una respuesta de células T CD8+ . En algunas modalidades, la presente invención proporciona los métodos para la identificación de los epitopos de células T CD8+ en secuencias de HPV, y la producción de péptidos que son capaces de iniciar la respuesta de células T CD8+. En particular, la presente invención proporciona los medios y las composiciones adecuadas para incrementar la inmunogenicidad de epitopos de HPV, para el uso en preparaciones de vacuna de HPV. En estas modalidades, la presente invención proporciona los medios para determinar la respuesta de células T de humanos, contra diversos epitopos que comprenden una proteína de interés. En modalidades adicionales, una vez que los epitopos significativos son identificados utilizando el sistema de ensayo I-MU E® descrito en la presente, los epitopos significativos son alterados para producir epitopos que inducen una respuesta inmune aumentada, hacia la proteína. De este modo, como se indica anteriormente, las proteínas de la presente invención muestran respuestas inmunogénicas modificadas (por ejemplo, antigenicidad y/o inmunogenicidad) cuando se comparan a las proteínas nativas codificadas por sus ADNs precursores. Por ejemplo, los HPVs que muestran- respuestas inmunogénicas incrementadas (por ejemplo, epitopos de HPV variantes) encuentran uso en composiciones de vacunas terapéuticas y profilácticas . La presente invención también proporciona los epitopos de células T CD8+ en las proteínas E7 provenientes de dos cepas del virus del papiloma humano (HPV) . En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona los medios para el desarrollo de las vacunas de HPV, en particular vacunas multivalentes para la prevención de la infección con las cepas HPV de alto riesgo. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona los medios para el desarrollo de vacunas terapéuticas contra los tipos de HPV de alto riesgo, adecuadas para el uso en la prevención del desarrollo de tumores benignos y/o malignos en individuos infectados. La presente invención proporciona además los epitopos adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona los epitopos descritos en las SEQ ID Nos.: 1-25. En modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona los epitopos modificados adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. La presente invención proporciona además las composiciones y métodos para el desarrollo de composiciones de vacunas dirigidas contra las proteínas E7 de dos de las cepas de HPV de alto riesgo (por e emplo, cepas 16 y 18) . En algunas modalidades particularmente preferidas, las composiciones de vacuna están comprendidas de al menos un epitopo seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 1 a la 25. En algunas modalidades alternativamente preferidas, las composiciones de vacuna comprenden epitopos seleccionados de al menos una de las cepas de HPV de alto riesgo y/o al menos una de las cepas HPV de riesgo moderado, conocidas en la técnica. Por supuesto, se contempla que las vacunas de HPV de la presente invención encontrarán uso en el tratamiento y profilaxis de numerosas cepas de HPV. No se pretende que la presente invención esté limitada a los epitopos particulares y/o a las composiciones de vacuna que comprenden cualquiera de los epitopos particulares. De este modo, en las diversas modalidades de vacuna de la presente invención, cualquier combinación de epitopo, adecuada para el uso pretendido, demostrará uso en la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 proporciona una gráfica que muestra las respuestas a cada epitopo que en HPV E7.16 es probado. La figura 2 es una gráfica que muestra las respuestas a cada epitopo en HPV E7.18 probado. La figura 3 proporciona una gráfica que muestra las respuestas de HPV E7.18 en presencia del anticuerpo anti-CD40 y del anticuerpo anti-isotipo de IgGl. La figura 4 proporciona una gráfica que muestra las respuestas de 20 donadores aleatorios que fueron probados en paralelo en un ensayo de INF-? ELISPOT y el ensayo I-MUNE® de CD8 , utilizando los péptidos HPV18.E7. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA I3 ENCIÓN La presente invención proporciona los medios para identificar los epitopos funcionales de células T CD8+ en cualquier proteína de interés . La presente invención proporciona además los epitopos de células T CD8+ de diversas proteínas. En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona los epitopos de células T CD8+ del virus del papiloma humano (HPV) . En modalidades adicionales, la presente invención proporciona los epitopos adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. En modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona los epitopos modificados, adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. En algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona los medios para desarrollar vacunas, con base en los epitopos de células T, provenientes de diversas cepas de microorganismos, incluyendo virus, así como para la prevención del cáncer. Como se describe en la presente, y en las solicitudes de patentes de los Estados Unidos Nos . de Serie 09/060,872, presentada el 15 de Abril de 1998; 09/500,135, presentada el 2 de Febrero del 2000; 09/768,080, presentada el 23 de Enero del 2001; y solicitudes relacionadas, en el ensayo I- UNE® fue desarrollado para identificar los epitopos de células T funcionales en cualquier proteína de interés. Una característica de este ensayo involucra el uso de células obtenidas a partir de donadores de la comunidad, que probablemente incluyen individuos quienes no han sido expuestos a la proteína de interés . Como se describe en la solicitud de publicaciones citadas, el ensayo fue utilizado con gran éxito en la identificación de los epitopos de células T CD4+ en diversas proteínas. No obstante, los resultados fueron típicamente menos robustos cuando los epitopos de células T CD8+ estuvieron bajo estudio. De acuerdo a la literatura, las respuestas de células T CD8+ son frecuentemente dependientes de las células T CD4+ para "ayudarlas" a responder. En parte, esta ayuda involucra la activación de las células presentadores de antígeno (APCs, por sus siglas en inglés) . La activación de APC ocurre cuando una célula T CD4+ interactúa con las APCs . La interacción entre las células T CD4+ y las APCs es mediada en parte por una interacción del ligando CD4O/receptor de CD40. De este modo, durante el desarrollo de la presente invención, el anticuerpo monoclonal anti-CD40 fueron utilizados en el ensayo como un sustituto para la presencia de células T CD4+ de activación. Además, se cree que en algunos casos, los pacientes quienes despejan las enfermedades tienen respuestas inmunes que están dirigidas contra diferentes epitopos de manera contraria a los pacientes quienes desarrollan enfermedad crónica. Por supuesto, esto ha sido mostrado en los individuos infectados con el HCV, quienes espontáneamente despejan la infección (Ver, Wertheimer et al., Hepatol, 37:577-589 [2003] ) , y en individuos infectados con el VIH quienes tienen respuestas de CD8+ robustas, al tiempo que poseen altas cargas virales (Ver, Addo et al., J. Virol . , 77-2081-2092 [2003]). De este modo, la identificación de los epitopos en donadores saludables normales es descrita en la presente, y encontrará uso en la identificación de epitopos ' de CD8+ potenciales eficaces versus los no eficaces. Como se describe en la presente, un anticuerpo monoclonal anti-CD40 fue probado en réplicas del ensayo inmune CD8+, para evaluar los efectos sobre las respuestas proliferativas de células T CD8+. Como se describe con mayor detalle en los ejemplos, se encontró que es efectivo un intervalo estrecho de concentraciones (in Vitro) . Como se indica, la proliferación de CD8+ y la secreción de IFN-?, fueron supra-regulados in Vitro mediante el uso del anticuerpo anti-CD40. 'Sin embargo, como también se describe en la presente, un número de estos anticuerpos fueron probados en experimentos similares, pero éstos no indujeron la activación de células T CD8+. Otros métodos de identificación de los epitopos de células T CD8+, funcionales, confían en las células provenientes de los donadores que poseen respuestas inmunes de memoria. En estos ensayos, se utilizan células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) o son cultivadas in vitro antes del uso, o son clonadas. Por supuesto, la mayoría de los métodos de identificación actuales de péptidos epitopos de HPV y otros epitopos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) de la clase I, confieren el uso de fuentes de sangre periférica provenientes de donadores expuestos verificados, quienes tienen un enriquecimiento para las células T CD8+, específicas del antígeno. Para estas poblaciones enriquecidas, pueden ser utilizados los métodos de tinción de tetrámero y los métodos proliferativos . Por supuesto, el análisis de tetrámeros que utiliza grupos de péptidos, ha sido utilizado para encontrar las respuestas de epitopos en conjunto con los análisis Elispot para asegurar que las células T CD8+ sean funcionales (ver por ejemplo, Terajima et al., J. Exp. Med., 197:927-932 [2003]). No obstante, el uso de tetrámeros está limitado, ya que únicamente están actualmente disponibles un puñado de construcciones de la clase I (ver por ejemplo, Sato et al., J. Immunol, Meth. , 271:177-184 [2002]; y Altman et al., Science 274:94-96 [1996], erratum at Science 280:1821 [1998] ) . Además , son conocidos _ un número de algoritmos predictivos para los epitopos de células T CD8+, algunos de los cuales parecen ser muy eficaces y precisos (Ver, Mussbaum et al., Curr. Opin. Immunol., 15:69-74 [2003]). En algunas modalidades, estos métodos de algoritmos por computadora son utilizados para predecir el enlace de MHC de Clase I. No obstante, la respuesta completa no es proporcionada por estos métodos ya que los epitopos predichos que son identificados con base en los algoritmos de computadora, deben también ser funcionalmente validados . La presente invención proporciona ventajas significativas sobre los métodos actualmente utilizados, ya que el ensayo utiliza donadores de células no expuestos, y no confia en los algoritmos de computadora para evaluar las relaciones entre los epitopos y la respuesta inmune. De manera importante, la presente invención proporciona los medios para validar funcionalmente los resultados obtenidos para cada epitopo y muestra . Definiciones A no ser que se definan de otro modo en la presente, todo los . términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el que es comúnmente comprendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, a la cual pretende esta invención. Por ejemplo, Singleton y Sainsbury, . Dictionary of Microbiology and Molecular Biology; 2a. Edición, John Wiley and Sons, NY (1994) ; y Hale y Marham, The Harper Colllns Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) les proporcionan a aquellos expertos en la técnica, un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes aquellos descritos en la presente, encuentran uso en la práctica de la presente invención, los métodos y materiales preferidos son descritos en la presente. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente más adelante son más completamente descritos por referencia a la Especificación como un todo. También, como se utiliza en la presente, los términos singulares "un", "uno" y "una" incluyen la referencia plural a no ser que el contexto lo indique claramente de otro modo. Para facilitar el entendimiento de la invención, son definidos más adelante un número de términos . Como se utiliza en la presente, "HPV" y "virus del papiloma humano" se refieren a los miembros del género Papillomavirus que son capaces de infectar a humanos . Existen dos grupos principales de HPV. (por ejemplo, los grupos genital y cutáneo) , cada uno de los cuales contienen múltiples "tipos" o "cepas" de virus (por ejemplo, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 32, etc.). De interés particular en la presente invención son los tipos de HPV que están asociados con la infección genital y la malignidad. Como se utiliza en la presente, las vacunas "profilácticas" y "preventivas" son vacunas que son diseñadas y administradas para prevenir la infección, la enfermedad y/o cualesquiera secuelas relacionadas provocadas por o asociadas con un organismo patógeno, particularmente HPV. Como se utiliza en la presente, vacunas "terapéuticas" son vacunas que están diseñadas y son administradas a pacientes ya infectados con un organismo patógeno tal como al menos una cepa de HPV. Las vacunas terapéuticas (por ejemplo, vacunas terapéuticas de HPV) son utilizadas para prevenir y/o tratar el desarrollo de tumores benignos o malignos en estos individuos infectados. "Células presentadoras de antígeno" ( "APC" ) como se utilizan en la presente, se refieren a las células del sistema inmune que presentan antígeno sobre sus superficies . Este antígeno es reconocido por las células T. Los ejemplos de células presentadoras de antígeno son las células dendríticas, células de interdigitalización, células B activadas y macrófagos . El término "linfoide" cuando se utiliza en referencia a una línea celular o una célula, significa que la línea celular o la célula es derivada de la línea linfoide e incluye células de las líneas de linfocitos B y T. Como se utilizan en la presente, los términos "linfocito T" y "célula T" , abarcan cualquier célula dentro de la línea de linfocitos T provenientes de precursores de células T (incluyendo las células positivas a Thyl que no han reacomodado los genes del receptor de células T [TCR] ) a células T maduras (por ejemplo, positivas simples ya sea para CD4+ ó CD8+, células positivas a TCR superficial) . Como se utiliza en la presente, los términos "linfocito B" y "célula B" abarcan cualquier célula dentro de la línea de células B provenientes de precursores de células B, tales como las células pre-B (células B220+ que han comenzado a reacomodar los genes de la cadena pesada de Ig) , a células B maduras y células plasmáticas. Como se utilizan en la presente, "célula T CD4+" y "célula T CD4" se refieren a las células T cooperadoras, mientras que, "célula T CD8+" y "célula T CD8" se refieren a células T citotóxicas. Como se utiliza en la presente, "proliferación de células B" , se refiere al número incrementado de células B producidas durante la incubación de las células B con las células presentadoras de antigeno, con o sin antígeno. Como se utiliza en la presente, "proliferación de células B de línea base" como se utiliza en la presente, se refiere . al grado de proliferación de células B que es normalmente observado en un individuo, en respuesta a la exposición a las células presentadores de antígeno, en ausencia del péptido o el antígeno proteico. Para los propósitos de la presente, el nivel de proliferación de células B de línea base es determinado en una base por muestra para cada individuo, como la proliferación de células B en ausencia de antígeno. Como se utiliza en la presente, "epitopo de célula B" se refiere a una característica de un péptido o proteína que es reconocida por un receptor de célula B en la respuesta inmunogénica al péptido que comprende ese antígeno (por e emplo, el inmunógeno) . Como se utiliza en la presente, "epitopo de célula B alterado" se refiere a una secuencia de aminoácidos del epitopo que difiere del péptido precursor o del péptido de interés; tal que el péptido variante de interés produce diferentes respuestas inmunogénicas (por ejemplo, alteradas) en un humano u otro animal . Se contempla que una respuesta inmunogénica alterada incluya la inmunogenicidad y la alergenicidad alteradas (por ejemplo, una respuesta inmunogénica total incrementada o disminuida) . En algunas modalidades, el epitopo alterado de células B comprende la sustitución y/o supresión de un aminoácido seleccionado de aquellos residuos dentro del epitopo identificado. En una modalidad alternativa, el epitopo alterado de células B comprende una adición de uno o más residuos dentro del epitopo . Como se utiliza en la presente, "epitopo de célula T" significa una característica de un péptido o proteína que es reconocido por un receptor de célula T en el inicio de una respuesta inmunológica al péptido que comprende ese antígeno. El reconocimiento de un epitopo de célula T por una célula T, se cree en general que es vía un mecanismo en donde las células T reconocen fragmentos peptídicos de antígenos que son enlazados a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilídad de la Clase I o Clase II (MHC) expresada sobre las células presentadoras de antígenos (Ver por ejemplo, Moeller (ed. ) , Immunol . Rev. , 98:187 [1997]). En algunas modalidades de la presente invención, los epitopos o fragmentos epitópicos identificados como se describe en la presente, encuentran uso en la detección de células presentadoras de antígeno que tienen moléculas MHC capaces de enlazarse y mostrar los epitopos o fragmentos . En algunas modalidades, los epitopos/fragmentos epitópicos comprenden además un marcador detectable (por ejemplo, un marcador) que facilita la identificación de las células que se enlazan a y/o muestran el epitopo/fragmento epitópico de interés. Como se utiliza en la presente, "proliferación de células T" se refiere al número de células T producidas durante la incubación de las células T con las células presentadoras de antigeno, con o sin el antigeno. "Proliferación de células T de línea base", como se utiliza en la presente, se refiere al grado de proliferación en células T que es normalmente observado en un individuo, en respuesta a la exposición a las células presentadoras de antigeno en ausencia del antígeno peptídico o proteico. Para los propósitos de la presente, el nivel de proliferación de células T de línea base es determinado en una base por muestra por cada individuo, como la proliferación de las células T en respuesta a las células presentadoras de antígeno en ausencia del antígeno . Como se utiliza , en la presente, "respuesta inmunogénica alterada" se refiere a una respuesta inmunogénica incrementada o reducida. Las proteínas y péptidos muestran una "respuesta inmunogénica incrementada" cuando la respuesta de células T y/o de células B que éstas evocan, es mayor que aquella evocada por una proteina o péptido progenitor (por ejemplo, precursor) (por ejemplo, la proteína de interés) . Típicamente, el resultado neto de esta respuesta mayor es una respuesta incrementada de anticuerpo dirigida contra la proteína o péptido variante. Las proteína y péptidos muestran una "respuesta inmunogénica reducida" cuando la respuesta de célula T y/o de célula B que éstas evocan, es menor que aquella evocada por una proteína o péptido progenitor (por ejemplo, precursor) . En algunas modalidades, el resultado neto de esta menor respuesta es una respuesta reducida de anticuerpo, dirigida contra la proteína variante o el péptido variante. En algunas modalidades preferidas, la proteína progenitora es una proteína o péptido de tipo silvestre. Con respecto a una secuencia de aminoácidos particulares, un "epitopo" es un grupo de residuos de aminoácidos que está involucrado en el reconocimiento por una inmunoglobulina particular, o en el contexto de las células T, a aquellos residuos necesarios para el reconocimiento por las proteínas receptoras de células T y/o los receptores del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) . En el establecimiento de una respuesta inmune in vivo o in vi tro, un epitopo son los rasgos colectivos de una molécula, tales como la estructura peptídica primaria, secundaria y terciaria, y la carga, que conjuntamente forman un tamaño reconocido por una inmunoglobulina, receptor de célula T o HLA. A todo lo largo de esta descripción, "epitopo" y "péptido" son a menudo utilizados intercambiablemente. Como se utiliza en la presente, el término "epitopo mayor" se refiere a un epitopo (por ejemplo, un epitopo de célula T y/o de célula B) , en donde la velocidad de respuesta dentro del combinado de donador es probado es al menos tres desviaciones estándares por arriba de la velocidad de respuesta antecedente media. Como se utiliza en la presente, el término "epitopo moderado" se refiere a un epitopo (por e emplo, un epitopo de célula T y/o de célula B) , en donde la velocidad o proporción de respuesta dentro del combinado de donadores probados, es al menos dos desviaciones estándares por arriba de la media o tres veces el antecedente. Gomo se utiliza en la presente, el término "epitopo menor" se refiere a un epitopo (por ejemplo, un epitopo de célula T y/o de célula B) , en donde la proporción o velocidad de respuesta dentro del combinado de donadores probados, es al menos dos veces el antecedente. Como se utiliza en la presente, el término "epitopo significativo" se refiere a un epitopo (por ejemplo, un epitopo de célula T y/o de célula B) , en donde la proporción o velocidad de respuesta dentro del combinado del donador probado, es igual a o mayor de aproximadamente tres veces la velocidad o proporción de respuesta del antecedente . Como se utiliza en la presente, un "epitopo débilmente significativo" se refiere a un epitopo (por e emplo, un epitopo de célula T y/o de célula B) , en donde la proporción o velocidad de respuesta dentro del combinado del donador probado, es mayor que la proporción- de respuesta del antecedente, pero menor de aproximadamente tres veces la proporción antecedente . Como se utiliza en la presente, "nivel antecedente" y "respuesta antecedente" se refieren al porcentaje promedio de respondedores para cualquier péptido dado en el grupo de datos para cualquier proteína probada. Este valor es determinado al promediar el porcentaje de respondedores para todos los péptidos en el grupo, como son recopilados para todos los donadores probados. Como un ejemplo, una respuesta antecedente del 3% indicaría que en promedio podrían existir tres respuestas positivas (SI mayor de 2.95) para cualquier péptido en un grupo de datos cuando se prueban sobre 100 donadores . El término "muestra" como se utiliza en la presente, es utilizado en su sentido más amplio. No obstante, en modalidades preferidas, el término es utilizado con referencia a una muestra (por ejemplo, una alícuota) que comprende un péptido (por ejemplo, un péptido dentro de un grupo de péptidos , que comprende una secuencia de una proteína de interés) que esta siendo analizado, identificado, modificado y/o comparado con otros péptidos. De este modo, en la mayoría de los casos, este término es utilizado con referencia al material que incluye una proteína o péptido que es de interés . Como se utiliza en la presente, "proteína de interés" se refiere a una proteína que está siendo analizada, identificada y/o modificada. Las proteínas de origen natural así como recombinantes, las proteínas sintéticamente producidas, variantes y derivadas, encuentran todas uso en la presente invención. Como se utiliza en la presente, "proteína" se refiere a cualquier composición comprendida de aminoácidos y reconocida como una proteína por aquellos de experiencia en la técnica. Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se utilizan intercambiablemente en la presente. Los aminoácidos pueden ser denominados por sus nombres completos (por ejemplo, alanina) o por las abreviaturas aceptadas de una sola letra (por ejemplo, A) , o de tres letras (por ejemplo, ala) . En donde un péptido es una porción de una proteína, aquellos expertos en la técnica comprenden el uso del término en el contexto. El término "proteína" abarca las formas maduras de las proteínas, así como las pro- y pre-formas de las proteínas relacionadas. Las prepro-formas de las proteínas comprenden la forma madura de la proteína que tienen una prosecuencia operablemente enlazada al extremo amino de la proteína y una secuencia "pre-" o "de señal" operablemente enlazada al extremo amino de la prosecuencia. Como se utiliza en la presente, las proteínas funcionalmente similares son consideradas como "proteínas relacionadas" . En algunas modalidades, estas proteínas son derivadas de un género y/o especie diferente, incluyendo diferentes clases de organismos (por ejemplo, una proteína bacteriana y una proteína fúngica) . En modalidades adicionales, las proteínas relacionadas son proporcionadas a partir de la misma especie. Por supuesto, no se pretende que la presente invención esté limitada a las proteínas relacionadas provenientes de algunas o varias fuentes particulares. Como se utiliza en la presente, el término "derivado" se refiere a una proteína que es derivada de una proteína precursora por adición de uno o · más aminoácidos a cualquiera de los extremos C- y N-terminales, la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o en un número de diferentes sitios en la secuencia de aminoácidos, y/o la supresión de uno o más aminoácidos en uno o ambos extremos de la proteína, y en uno o ambos sitios en la secuencia de aminoácidos, y/o la inserción de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos . La preparación de un derivado de proteínas preferentemente lograda mediante la modificación de una secuencia de ADN que codifica para la proteína nativa. La transformación de esa secuencia de ADN en un hospedero adecuado, y la expresión de la secuencia de ADN modificada para formar la proteína derivada. Un tipo de proteína relacionada (y derivadas) son las "proteínas variantes". En modalidades preferidas, las proteínas variantes difieren de una proteína progenitora y de otra más por un número pequeño de residuos de aminoácidos . El número de diferentes residuos de aminoácidos puede ser uno o más, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ó más residuos de aminoácidos. En una modalidad preferida, el número de diferentes aminoácidos entre las variantes están entre 1 y 10. En modalidades particularmente preferidas, las proteínas relacionadas y particularmente las proteínas variantes comprenden al menos 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos. Además, una proteína relacionada o una proteína variante como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína que difiere de otra proteína relacionada o de una proteína progenitora en el número de regiones prominentes. Por ejemplo, en algunas modalidades, las proteína variantes tienen 1, 2, 3, 4, 5 ó 10 regiones prominentes correspondientes que difieren de la proteína progenitora. En una modalidad, la región correspondiente prominente de una variante produce únicamente una respuesta inmunogénica a nivel de antecedente. Algunos de los residuos identificados para la sustitución, inserción o supresión, son considerados residuos, mientras que otros no lo son. En el caso de los residuos que no son controlados, el reemplazo de uno o más aminoácidos está limitado a las sustituciones que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a una encontrada en la naturaleza. En el caso de residuos conservados, tales reemplazos no deben dar como resultado una secuencia de origen natural . En algunas modalidades, el siguiente método de mutagénesis por cásete encuentra uso en la construcción de las variantes de proteína de la presente invención, aunque pueden ser utilizados otros métodos. Primeramente, el gen de origen natural que codifica para la proteína, es obtenido secuenciado total o parcialmente. Luego, la secuencia es explorada para un punto en el cual se desea realizar una mutación (supresión, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la proteína codificada. Las secuencias que flanquean este punto son evaluadas por la presente en los sitios de restricción, para reemplazar un segmento corto del gen con un combinado de oligonucleótidos los cuales, cuando son expresados codificarán diversos mutantes . Tales sitios de restricción son preferentemente sitios únicos dentro del gen de la proteína, para facilitar así el reemplazo del segmento del gen. No obstante, cualquier sitio de restricción conveniente que no sea excesivamente redundante en el gen de la proteína, pueden ser utilizados, con la condición de que los fragmentos de gen generados por la digestión de restricción, puedan ser reensamblados en la secuencia apropiada. Si los sitios de restricción no están presentes en las posiciones dentro de una distancia conveniente del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos) , tales sitios son generados por la sustitución de los nucleótidos en el gen, de una manera tal que ni la estructura de lectura ni los aminoácidos codificados son cambiados en la construcción final . La mutación del gen con el fin de cambiar su secuencia para conformar la secuencia deseada, es lograda por la extensión del cebador M13 de acuerdo con los métodos en general conocidos . La tarea de colocar las regiones flanqueantes adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitios de restricción convenientes, se realiza rutinariamente por la redundancia del código genético, un mapa de enzimas de restricción del gen y el gran número de diferentes enzimas de restricción. Nótese que si un sitio de restricción flanqueante conveniente está disponible, el método anterior necesita ser utilizado únicamente en conexión con la región flanqueante que no contiene un sitio. Una vez que el ADN de origen natural o el ADN sintético es clonado, los sitios de restricción flanqueantes a las posiciones que van a ser mutadas son digeridos con las enzimas de restricción cognadas y una pluralidad de casetes oligonucleotxdicos complementarios en los extremos, son ligados dentro del gen. La mutagénesis es simplificada mediante este método debido a que todos los oligonucleótidos pueden ser sintetizados para tener los mismos sitios de restricción y no son necesarios ligadores sintéticos para crear los sitios de restricción. Como se utiliza en la presente, "correspondiente a" se refiere a un residuo en la posición enumerada en una proteína o péptido, o un residuo que es análogo, homólogo o equivalente, a un residuo numerado en una proteína o péptido. Como se utiliza en la presente, "región correspondiente" se refiere en general a una posición análoga a lo largo de las proteínas relacionadas a una proteína progenitora . Como se utiliza en la presente, el término "secuencia análoga" se refiere a una secuencia dentro de una proteína que proporciona función similar, estructura terciaria y/o residuos conservados como la proteína de interés (por ejemplo, típicamente la proteína original de interés) . En modalidades particularmente preferidas, la secuencia análoga involucra una o más secuencias en o cerca de un epitopo. Por ejemplo, en las regiones de epitopo que contienen una hélice alfa o una estructura de lámina beta, los aminoácidos de reemplazo en la secuencia análoga mantiene preferentemente la misma estructura específica. El término se refiere también a las secuencias nucleotídicas, así como las secuencias de aminoácidos. En algunas modalidades, las secuencias análogas son desarrolladas tal que los aminoácidos de reemplazo muestran una función similar, la estructura terciaria y/o los residuos conservados a los aminoácidos en la proteína de interés en o cerca del epitopo. De este modo, donde la región de epitopo contiene, por ejemplo, una estructura de hélice alfa o de lámina beta, los aminoácidos de reemplazo mantienen preferentemente esa estructura especifica. Como se utiliza en la presente, "proteína homologa", se refiere a un proteína que tiene acción, estructura, respuesta antigénica y/o inmunogénica similares a la proteína de interés . No se pretende que un homólogo y una proteína de interés estén necesariamente relacionados evolutivamente. De este modo, se pretende que el término abarque la misma proteína funcional obtenida de diferentes especies. En algunas modalidades preferidas, es deseable identificar un homólogo que tiene una estructura terciaria y/o primaria similar a la proteína de interés, como reemplazo para el epitopo en la proteína de interés con un segmento análogo del homólogo reducirá la desorganización del cambio. De este modo, la mayoría de los casos, las proteínas estrechamente homologas proporcionan las fuentes más deseables de sustituciones de epitopos . Alternativamente, es ventajoso buscar análogos humanos para una proteína dada. Por ejemplo, en algunas modalidades, se sustituye un epitopo específico en un tipo de HPV humano, con una secuencia proveniente de otro HPV u otra especie de papilomavirus , lo cual da como resultado la producción de un tipo de HPV que incrementa la inmunogenicidad a un nivel adecuado para el uso en preparaciones de vacuna.

Como se utiliza en la presente, "genes homólogos" se refiere al menos a un par de genes después de diferentes pero usualmente relacionadas, que corresponden una con la otra y que son idénticas o muy similares una a la otra. El término abarca los genes que están separados por especiación (por ejemplo, el desarrollo de nuevas especies) (por ejemplo, genes ortólogos) , asi como genes que han sido separados por duplicación genética (por ejemplo, genes parálogos) . Estos genes codifican para "proteínas homologas" . Como se utiliza en la presente, "ortólogo" y "genes ortólogos" se refieren a genes en diferentes especies que han evolucionado de un gen ancestral común (por ejemplo, un gen homólogo) mediante especiación. Típicamente, los ortólogos conservan la misma función durante el curso de la evolución. La identificación de los ortólogos encuentra uso en la predicción confiable de la función génica en genomas recién secuenciados . Como se utiliza en la presente, "parálogo" y "genes parálogos" se refiere a los genes que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Mientras que los ortólogos conservan la misma función a través del curso de la evolución, los parálogos evolucionan nuevas funciones, aún cuando algunas funciones son frecuentemente relacionadas a aquella original . Los ejemplos de genes parálogos incluyen, pero no están limitados a genes que codifican para la tripsina, quimotripsina, elastasa y trombina, que son todas proteinasas de serina y aparecen juntas dentro de la misma especie. Como se utiliza en la presente, proteínas de "tipo silvestre" y "nativas" son aquellas encontradas en la naturaleza. Los términos "secuencia de tipo silvestre" y "gen de tipo silvestre" se utilizan aquí intercambiablemente, para referirse a una secuencia que es nativa o de origen natural en una célula hospedera. En algunas modalidades, la secuencia de tipo silvestre, se refiere a una secuencia de interés que es el punto inicial de un proyecto de ingeniería de proteínas . Los genes que codifican para la proteína de origen natural (por ejemplo, precursoras) pueden ser obtenidos de acuerdo con los métodos generales conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los métodos comprenden en general la síntesis de sondas marcadas que tienen secuencias putativas que codifican para las regiones de la proteína de interés, la preparación de bibliotecas genómicas provenientes de organismos que expresan la proteína, y la selección de las bibliotecas para el gen de interés, mediante la hibridación a las sondas. Los clones que se hibridan positivamente son luego mapeados y secuenciados . El término "molécula de ADN recombinante" como se utiliza en la presente, se refiere a un molécula de ADN que está comprendida de segmentos de ADN unidos entre sí por medio de técnicas biológicas moleculares . El grado de homología entre las secuencias puede ser determinado utilizando cualquier método adecuado conocido por la técnica (Ver por ejemplo, Smith y Waterman, Adv. Appl . Math., 2:482 [1981]; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol . , 48:443 [1970]; Pearson y Lipman, Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 85:2444 [1988] ; programas tales como GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI) ; y Devereux et al., Nucí. Acid Res., 12:387-395 {1984]). Por ejemplo, PILEUP es un programa útil para determinar los niveles de homología secuencial . PILEUP crea un alineamiento de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas, utilizando alineaciones por pares y progresivas . Este puede también trazar una gráfica de un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol . , 35:351-360 [1987]). El método es similar a aquel descrito por Higgins y Sharp (Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). Los parámetros de PILEUP útiles que incluyen un peso de espacio vacío por omisión de 3.00, un peso de longitud de espacio vacío por omisión de 0.10, y espacios vacíos extremos ponderados. Otro ejemplo más de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 [1990]; y Karlin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:5873-5787 [1993]). Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 (Ver, Altschul et al., Meth. Enzymol . , 266:460-480 [1996]). Los parámetros "W" , "T" y "X" determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como omisiones una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de calificación BLOSUM62 (Ver, Henikoff y Henikoff, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 89:10915 [1989]) las alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N' -4 y una comparación de ambas hebras . Como se utiliza en la presente, "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos" es definida como el porcentaje de residuos de nucleótidos, en una secuencia candidata que son idénticos como residuos nucleotídicos de la secuencia. Como se utiliza en la presente, el término "hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una hebra de ácidos nucleicos se une con una hebra complementaria a través de apareamiento de bases, como es conocido en la técnica . Como se utiliza en la presente, "exigencia máxima" se refiere al nivel de hibridación que ocurre típicamente aproximadamente a Tm-5°C (5°C por deba o de la Tm de la sonda) ; "alta exigencia" aproximadamente a 5°C hasta 10 °C por debajo de la Tm; "exigencia intermedia" aproximadamente a 10°C hasta 20°C por debajo de la Tm; y "exigencia baja" aproximadamente a 20°C hasta 25°C por debajo de la Tm. Como será comprendido por aquellos de experiencia en la técnica, puede ser utilizada una hibridación de secuencia máxima para identificar o detectar las secuencias poligonucleotídicas idénticas, mientras que una hibridación de estringencia intermedia o baja puede ser utilizada para identificar o detectar los homólogos de las secuencias polinucleotídicas . Las frases "sustancialmente similar" y "sustancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos , significa típicamente que un polinucleótido o polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos 75% de identidad secuencial, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90%, todavía más preferentemente 95%, lo más preferentemente 97%, algunas veces tanto como 98% ó 99% de identidad secuencial, en comparación a las secuencias de referencia (por ejemplo, de tipo silvestre) . La identidad secuencial puede ser determinada utilizando programas conocidos tales como BLAST, ALIGN, y CLUSTAL utilizando parámetros estándares (ver por ejemplo, Altschul, et al., J. Mol. Biol . 215:403-410 [1990]; Henikoff et al., Proc. Nati. Acad Sci . EUA 89:10915 [1989]; Karin et al., Proc . Nati Acad. Sci EUA 90:5873 [1993]; y Higgins et al., Gene 73:237-244 [1988]). El software para la realización de los análisis BLAST es públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información de Tecnología (Nacional Centre for Biotechnology Information de los Estados Unidos) . También, las bases de datos pueden ser buscadas utilizando FASTA (Pearson et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 85:2444-2448

[1988] ) . Como se utiliza en la presente, "residuos equivalentes" se refiere a las proteínas que comparten residuos de aminoácidos particulares. Por ejemplo, los residuos equivalentes pueden ser identificados mediante la determinación de la homología al nivel de la estructura terciaria para una proteína (por ejemplo, IFN-ß) cuya estructura terciaria ha sido determinada mediante cristalografía de rayos x. Los residuos equivalentes son definidos como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal, de un residuo de aminoácido particular de la proteína que tiene residuos equivalentes putativos y la proteína de interés (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C y O sobre O) están dentro de 0.13 nm, y preferentemente 0.1 nm después de la alineación. La alineación es lograda después de que el mejor modelo ha sido orientado y colocado para dar el traslape máximo de las coordenadas atómicas de los átomos de las proteínas diferentes del hidrógeno, de las proteínas analizadas. El modelo preferido es el modelo cristalográfico que da el más bajo factor R para los datos de difracción experimental a la más alta resolución disponible, determinado utilizando los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica de la cristalografía y la caracterización/análisis de proteína. En algunas modalidades, la modificación es preferentemente realizada a la "secuencia de ADN precursor" que codifica para la secuencia de aminoácidos de la enzima precursora, pero puede ser mediante la manipulación de la proteína precursora. En el caso de residuos que no están conservados, el reemplazo de uno o más aminoácidos está limitado a sustituciones que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a aquella encontrada en la naturaleza. En el caso de los residuos conservados, tales reemplazos no deben dar como resultado una secuencia de origen natural . Los derivados proporcionados por la presente invención incluyen además una o varias modificaciones químicas que cambian las características de la proteasa . En algunas modalidades preferidas, el gen de la proteína es ligado dentro de un plásmido de expresión apropiado. El gen de la proteína clonada es luego utilizado para transformar o transfectar una célula hospedera con el fin de expresar el gen de la proteína. Este plásmido puede replicarse en hospederos en el sentido de que éste contiene los elementos bien conocidos, necesarios para la replicación del plásmido, o el plásmido puede ser diseñado para integrarse dentro del cromosoma del hospedero. Los elementos necesarios son proporcionados para la expresión eficaz del gen (por ejemplo, un promotor operablemente enlazado al gen de interés) . En algunas modalidades, estos elementos necesarios son suministrados como el promotor homólogo propio del gen si éste es reconocido (por ejemplo, transcrito por el hospedero) , un terminador de la transcripción (una región de poliadenilacion para las células hospederas eucarióticas) que es exógeno o es suministrado por la región terminadora endógena del gen de la proteína. En algunas modalidades, es también incluido un gen de selección tal como un gen de resistencia a antibióticos que hace posible el mantenimiento continuo del cultivo de las células hospederas infectadas con el plásmido, mediante desarrollo en medios que contienen antimicrobianos . La presente invención abarca las propiedades que tienen inmunogenicidad alterada que son equivalentes . Por "equivalente" se entiende que las proteínas son codificadas por un polinucleótido capaz de hibridarse al polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en cualquiera de aquellas proporcionadas en la presente, bajo condiciones de exigencia media a alta, y que conserva todavía la respuesta inmunogénica alterada a las células T humanas. Por "equivalente" se entiende que la proteasa comprende al menos 55%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% ó al menos 99% de identidad a las secuencias de epitopo y las proteasas variantes que tienen tales epitopos (por ejemplo, que tienen la secuencia de aminoácidos modificadas) . Como se utiliza en la presente, los términos "proteínas híbridas" y "proteínas de fusión" se refieren a las proteínas que son manipuladas por ingeniería genética, a partir de al menos dos proteínas diferentes o "progenitoras" . En modalidades preferidas, estas proteínas progenitoras son homologas una con la otra. Por ejemplo, en algunas modalidades, una proteasa híbrida preferida o proteína de fusión contiene el extremo N de una proteína, y el extremo C de un homólogo de la proteína. En alguna modalidad preferida, los. dos extremos terminales son combinados para corresponder a la proteína activa de longitud completa. En las modalidades preferidas alternativas, los homólogos comparten similitud sustancial, pero no tienen epitopos idénticos de células T. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona una proteasa de interés que tiene uno o más de los epitopos de células T en el extremo C, pero en el cual el extremo C es reemplazado con el extremo C de un homólogo que tiene un epitopo de célula T menos potente, o menos epitopos de células T o ausencia de epitopos de células en el extremo C. De este modo, el experto en la técnica entiende que al ser capaz de identificar los epitopos de células T entre los homólogos, puede ser formada una variedad de variantes que producen diferentes respuestas inmunogénicas . Además, se entiende que las porciones internas, y más de un homólogo pueden ser utilizados para producir las variantes de la presente invención. "Operablemente enlazado" y "en combinación operable" , cuando se describe la relación entre las dos regiones de ADN, simplemente significa que éstas están funcionalmente relacionadas una con la otra. Por ejemplo, una presecuencia está operablemente enlazada a un péptido, si ésta funciona como una secuencia de señal, participando en la secreción de la forma madura de la proteína, lo más probablemente involucrando la escisión de la secuencia de señal. Un promotor es operablemente enlazado a una secuencia de codificación si éste controla la transcripción de la secuencia; un sitio de enlace al ribosoma es operablemente enlazado a una secuencia de codificación si éste es colocado para permitir la traducción. Se dice que las moléculas de ADN tienen "extremos 5'" y "extremos 3'" debido a que los mononucleótidos se hacen reaccionar para elaborar oligonucleótidos de una manera tal que el fosfato 5' de un anillo de pentosa del mononucleótido está enlazado al oxígeno 3 ' de su vecino en una dirección vía un enlace fosfodiéster . Por lo tanto, un extremo de uno de los oligonucleótidos es denominado como el "extremo 5'" si su fosfato 5' no está enlazado al oxígeno 3' de un anillo de pentosa de mononucleótido, y como él, "extremo 3'", si su oxígeno 3' no está enlazado a un fosfato 5' de un anillo de pentosa de mononucleótido subsecuente. Como se utiliza en la presente, una secuencia de ácido nucleico, incluso si es interna a un oligonucleotido más grande se puede decir también que tiene extremos 5' y 3'. En una molécula de ADN lineal o circular, los elementos dispersos son denominados como "corriente arriba" ó 5' de los elementos "corriente abajo" ó 3'. Esta terminología refleja el hecho de que la transcripción procede en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra de ADN. Los elementos promotor y aumentador que dirigen la transcripción de un gen ligado están en general localizados 5' o corriente arriba de . la región de codificación (elementos aumentadores pueden ejercer su efecto incluso cuando están localizados 3' del elemento promotor y la región de codificación) . Las señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación están localizadas 3' o corriente abajo de la región de codificación. El término "un oligonucleotido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un gen" significa una secuencia de ADN que comprende la región de codificación de un gen o, en otras palabras, la secuencia de ADN que codifica para un producto génico. La región de codificación puede estar presente ya sea en una forma de ADNc o de ADN genómico. Los elementos de control adecuados tales como aumentadores/promotores, uniones de empalme, señales de poliadenilación, etc., pueden ser colocadas en estrecha proximidad a la región de codificación del gen si es necesario, para permitir el inicio apropiado de la transcripción y/o el procesamiento correcto del transcripto de ARN primario. Alternativamente, la región de codificación utilizada en los vectores de expresión de la presente invención puede contener aumentadores/promotores de endógenos, uniones de empalme, secuencias de intervención, señales de poliadenilación, etc., o una combinación de elementos de control de endógenos y exógenos . El término "oligonucleótidos recombinantes" se refiere a un oligonucleótido creado utilizando manipulaciones biológicas moleculares, incluyendo pero no limitadas a, ligadura de dos o más secuencias oligonucleotidicas generadas por digestión por enzima de restricción de una secuencia polinucleotidica, la síntesis de los oligonucleótidos (por ejemplo, la síntesis de los cebadores u oligonucleótidos) y similares . El término "unidades de transcripción" como se utiliza en la presente, se refiere al segmento de ADN entre los sitios de inicio y terminación de la transcripción y los elementos reguladores necesarios para el inicio y terminación eficiente. Por ejemplo, un segmento de ADN que comprende un aumentador/promotor, una región de codificación y una secuencia de terminación y de poliadenilación, comprende una unidad de transcripción. El término "elemento regulador" como se utiliza en la presente, se refiere a un elemento genético que controla algún aspecto de la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador que facilita el inicio de la transcripción de una región de codificación operablemente enlazada. Otros elementos reguladores son señales de empalme, señales de poliadenilación, señales de terminación, etc. (definidos más adelante) . El término "vector de expresión" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y la secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación operablemente enlazada, en un organismo hospedero particular. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotes incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de enlace al ribosoma y posiblemente otras secuencias. Se sabe que las células eucarioticas utilizan promotores, aumentadores y señales de terminación y de poliadenilación. Una vez transformada dentro de un hospedero adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del hospedero, o puede en algunos casos, integrarse dentro del genoma mismo. En la presente especificación "plásmido" y "vector" son algunas veces utilizados intercambiablemente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector a la fecha. No obstante, la invención está destinada a incluir otras formas tales de vectores de expresión que sirven funciones equivalentes y las cuales son, o se vuelven, conocidas en la técnica, incluyendo pero no limitadas a plásmidos, partículas de fagos, vectores virales y/o simplemente insertos genómicos potenciales . Las "células hospederas" utilizadas en la presente invención son en general hospederos eucarióticos o procarióticos que contienen un vector de expresión y/o un gen de interés . Las células hospederas son transformadas o transíectadas con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinantes . Tales células hospederas transformadas son capaces ya sea de aplicar vectores que codifican para las variantes de proteína o expresar la variante de proteína deseada. En el caso de vectores que codifican para la pre- o pre-pro-forma de la variante de proteína, tales variantes, cuando son expresadas, son típicamente secretadas de la célula hospedera, hacia el medio de la célula hospedera. El término "promotor/aumentador" denota un segmento de ADN que contiene las secuencias capaces de proporcionar funciones promotoras y aumentadoras (por ejemplo, las repeticiones terminales largas del retrovirus que contienen funciones promotoras y aumentadoras) . El aumentador/promotor puede ser "endógeno" o "exógeno" o "heterólogo" . Un aumentador/promotor endógeno es uno en el cual está naturalmente enlazado con un gen dado en el genoma. Un aumentador/promotor exógeno (heterólogo) es uno que es colocado en yuxtaposición a un gen por medio de manipulación genética (por ejemplo, técnicas de biología molecular). La presencia de "señales de empalme" sobre un vector de expresión, frecuentemente dan como resultado mayores niveles de expresión del transcripto recombinante. Las señales de empalme son mediadoras de la eliminación de los intrones a partir del transcripto de A N primario y consisten de un donador de empalme y un sitio aceptor (Sambrook et al., Molecular Cloning: ? Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989], pp. 16.7-16.8). Un donador de empalme comúnmente utilizado y un sitio aceptor o aceptador es la unión de empalme proveniente del ARN 16S del SV40. La expresión eficiente de las secuencias de ADN recombiantes en células eucarióticas requieren señales que dirigen la terminación eficiente y la poliadenilación del transcripto resultante. Las señales de terminación de la transcripción son en general encontradas corriente abajo de la señal de poliadenilación y son de unos pocos cientos de nucleótidos de longitud. El término "sitio poli A" o "secuencia poli A" como se utiliza en la presente, denota una secuencia de ADN que dirige la terminación y la poliadenilación del transcripto de ARN naciente. La poliadenilación eficiente del transcripto recombinante es deseable ya que los - transcriptos que carecen de una cola poli A son inestables y son rápidamente degradados . La señal poli A utilizada en un vector de expresión puede ser "heteróloga" o "endógena" . Una señal endógena poli A es una que es encontrada naturalmente en el extremo 3' de la región de codificación de un gen dado en el genoma. Una señal poli A heteróloga es una que es aislada de un gen y colocada 3' de otro gen. Una señal poli A heteróloga, comúnmente utilizada es la señal poli A de SV40. Los términos "transfección estable" y "transíectado establemente" se refiere a la introducción e integración del ADN extraño dentro del genoma de la célula infectada. El término "transíectante estable" se refiere a una célula que ha integrado establemente el ADN extraño dentro del ADN genómico. Los términos "marcador seleccionable" y "producto de gen seleccionable" como se utiliza en la presente, se refieren al uso de un gen que codifica para una actividad enzimática que confiere resistencia a un antibiótico o fármaco sobre la célula en la cual es expresado el marcador seleccionable. Como se utiliza en la presente, los términos "amplificación" y ¾amplificación del gen" se refieren a un proceso mediante el cual las secuencias específicas de ADN son desproporcionadamente replicadas, tal que el gen amplificado se vuelve presente en un número más amplio de copias que el que estaba inicialmente presente en el genoma. En algunas modalidades, la selección de las células por desarrollo en presencia de un fármaco (por ejemplo, un inhibidor de una enzima inhibible) da como resultado la amplificación ya sea del gen endógeno que codifica para el producto génico requerido para el crecimiento en presencia del fármaco, o mediante amplificación de las secuencias exógenas (por ejemplo, introducidas) que codifican para este producto génico, o ambas. La amplificación del gen ocurre naturalmente durante el desarrollo en genes particulares tales como la amplificación de genes ribosomas en oocitos de anfibios . La amplificación del gen puede ser inducida mediante tratamiento de las células cultivadas con fármacos. Un ejemplo de amplificación inducida por fármacos es la amplificación inducida por metotrexato del gen dhfr endógeno en células de mamífero (Schmike et al., Science 202:1051 [1978]). La selección de las células mediante desarrollo en presencia de un fármaco (por ejemplo, un inhibidor de una enzima inhibible) puede dar como resultado la amplificación ya sea del gen endógeno que codifica para el producto génico requerido para el desarrollo en presencia del fármaco, o bien mediante amplificación de las secuencias exógenas (por ejemplo, introducidas) que codifican para este producto génico, o ambas . La amplificación es un caso especial de una replicación de ácido nucleico que involucra la especificidad de plantilla. Esta tiene que ser contrastada con la replicación de plantilla no específica (por ejemplo, la replicación que es dependiente de la plantilla pero no dependiente de una plantilla específica) . La especificidad de plantilla es aquí distinguida de la fidelidad de replicación (por ejemplo, la síntesis de la secuencia poligonucleotídica apropiada) y la especificidad del nucleótido (ribo- o desoxírribo- ) . La especificidad de plantilla es frecuentemente descrita en términos de especificidad "objetivo". Las secuencias objetivo son "objetivos" o dianas en el sentido en que éstas son buscadas para ser clasificadas de otro ácido nucleico. Las técnicas de amplificación han sido diseñadas principalmente para ésta clasificación. Como se utiliza en la presente, el término "coamplificación" se refiere a una producción dentro de una célula hospedera simple, de un marcador amplificable en conjunto con otras secuencias génicas (por ejemplo, que comprenden uno o más genes no seleccionables, tales como aquellos contenidos dentro de un vector de expresión) y la aplicación de la presión selectiva apropiada, tal que la célula amplifica el marcador amplificable y las otras secuencias génicas , no seleccionables . El marcador amplificable puede estar físicamente enlazado a las otras secuencias génicas, o alternativamente dos piezas separadas de ADN, una conteniendo el marcador amplificable y la otra conteniendo el marcador no seleccionable, pueden ser introducidas dentro de la misma célula. Co o se utilizan en la presente, los términos "marcador amplificable", "gen amplificable", y "vector de amplificación" se refieren a un gen o un vector que codifica para un gen que permite la amplificación de ese gen bajo condiciones de crecimiento apropiadas . Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico amplificable" se refiere a los ácidos nucleicos que pueden ser amplificados mediante cualquier método de amplificación. Se contempla que el "ácido nucleico amplificable" comprenderá usualmente la "misma plantilla" . Como se utiliza en la presente, el término "plantilla muestra" se refiere al ácido nucleico que se origina de una muestra que es analizada para la presencia del "objetivo" (definido más adelante) . En contraste, la "plantilla antecedente" es utilizada en referencia al ácido nucleico diferente de la plantilla muestra, que puede o no estar presente en una muestra. La plantilla antecedente es lo más frecuentemente inadvertida. Esta puede ser el resultado del transporte, o puede ser debida a la presencia de contaminantes de ácido nucleico que se buscan purificar de la muestra. Por ejemplo, los ácidos nucleicos provenientes de organismos diferentes de aquellos que van a ser detectados, pueden estar presentes como el antecedente en una muestra de prueba . "Especificidad de plantilla" es lograda en la mayoría de las técnicas de amplificación por la elección de la enzima. Las enzimas de amplificación son enzimas que, bajo condiciones en las que éstas son utilizadas, procesarán únicamente secuencias específicas del ácido nucleico en una mezcla heterogénea del ácido nucleico. Por ejemplo, en el caso de la replicasa ?)ß, el ARN de MDV-1 es la plantilla específica para la replicasa (Ver por ejemplo, Kacian et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 69:3038 [1972]). Otros ácidos nucleicos no son replicados por esta enzima de amplificación. Similarmente , en el caso de la ARN-polimerasa T7, esta enzima de amplificación tiene una especificidad estricta para sus propios promotores (Ver, Chamberlin et al., Nature 228:227 [1970]). En el caso de la ADN-ligasa T4, la enzima no se ligará a los dos oligonucleótidos o polinucleótidos, donde existe un mal acoplamiento entre el sustrato oligonucleotídico o polinucleotídico y la plantilla en la unión de ligadura (Ver, Wu y Wallace, Genomics 4:560 [1989]) . Finalmente, las polimerasas Taq y Pfu, en virtud de su habilidad para funcionar a alta temperatura, se encuentra que muestran alta especificidad para las secuencias enlazadas, y de este modo definidas por los cebadores; la alta temperatura da como resultado condiciones termodinámicas que favorecen la hibridación del cebador con las secuencias objetivo, y la no hibridación con la secuencia no objetivo. Como se utiliza en la presente, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural como una digestión de restricción purificada, o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales es inducida la síntesis de un producto de extensión de cebador, que es complementario a una hebra de ácido nucleico (por ejemplo, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como la ADN-polimerasa y a una temperatura y pH adecuados) . El cebador es preferentemente de una sola hebra para eficiencia máxima en la amplificación, pero puede ser alternativamente de doble hebra. Si es de doble hebra, el cebador es primeramente tratado para separar sus hebras antes de ser utilizado para preparar los productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido . El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores incluyendo la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método .

Como se utiliza en la presente, el término "sonda" se refiere a un oligonucleotido (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos) , ya sea de origen natural como en una digestión de restricción purificada o sintéticamente producida, recombinantemente o mediante amplificación por PCR, que es capaz de hibridarse a otro oligonucleotido de interés. Una sonda puede ser de una sola hebra o doble hebra. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares. Se contempla que cualquier sonda utilizada en la presente invención será marcada con cualquier "molécula reportera" , de modo que es detectable en cualquier sistema de detección, incluyendo, pero no limitado a, enzima (por ejemplo, ELISA, asi como los ensayos histoquím cos basados en enzimas) , sistemas fluorescentes, radioactivos, y luminiscentes. No se pretende que la presente invención esté limitada a algún sistema o marcador de detección particular. Como se utiliza en la presente, el término "objetivo", cuando se utiliza en referencia a la reacción en cadena de polimerasa, se refiere a la región de ácido nucleico enlazada por los cebadores utilizados por la reacción en cadena de polimerasa. De este modo, el "objetivo" es buscado para ser clasificado de otra secuencia de ácido nucleico. Un "segmento" es definido como una región de ácido nucleico dentro de una secuencia objetivo.

Como se utiliza en la presente, el término "reacción en cadena de polimerasa" ("PCR", por sus siglas en inglés) se refiere a los métodos de las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,965,188, incorporadas por referencia en la presente, que incluyen métodos para incrementar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este proceso para la amplificación de la secuencia objetivo consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleótidos a la mezcla de ADN que contiene la secuencia objetivo deseada, seguida por una secuencia precisa de sitios térmicos en presencia de una ADN-polimeras . Los dos cebadores son complementarios a sus respectivas hebras, la secuencia objetivo de doble hebra. Para efectuar la amplificación, la mezcla es desnaturalizada y los cebadores son luego recogidos a sus secuencias complementarias dentro de la molécula objetivo. Después del recocido, los cebadores son extendidos con una polimerasa para formar así un nuevo par de hebras complementarias. Los pasos de desnaturalización, recocido con cebador y extensión con polimerasa pueden ser repetidos muchas veces (por ejemplo, la desnaturalización, el recocido y la expresión constituyen un "ciclo") pueden existir numerosos "ciclos" para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada es determinada por las posiciones relativas de los cebadores uno con respecto al otro, y por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del proceso, el método es denominado como la "reacción en cadena de polimerasa" (de aquí en adelante "PCR") . Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia objetivo se vuelven las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que éstas son "amplificadas por PCR" . Como se utiliza en la presente, el término "reactivos de amplificación" se refiere a aquellos reactivos (trifosfatos de desoxirribonucleótido, amortiguador, etc.), necesarios para la amplificación, excepto por los cebadores; la plantilla de ácido nucleico y enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción son colocados y contenidos en un recipiente de reacción (tubo de prueba, micropozo, etc.). Con PCR, es posible amplificar una copia simple de una secuencia objetivo específica en el ADN genómico a un nivel detectable mediante varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda marcada, incorporación de cebadores biotinilados, seguido por la detección con el conjugado de avidina-enzima; incorporación de los trifosfatos de desoxinucleótido marcados con 32P, tales como dCTP o dATP, dentro del segmento amplificado). Además, del ADN genómico, cualquier secuencia oligonucleotídica o polinucleotídica puede ser amplificada con el grupo apropiado de moléculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el proceso de PCR mismos son, por si mismos, plantillas eficientes para las amplificaciones de PCR subsecuentes. Como se utiliza en la presente, los términos "productos de PCR" , "fragmento de PCR" y "producto de amplificación" se refieren a la mezcla resultante de los compuestos después de que dos o más ciclos de los pasos de desnaturalización, recocido y extensión de PCR, son completados. Estos términos abarcan del caso donde ha existido amplificación de uno o más segmentos de uno o más secuencias objetivo . Como se utiliza en la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN de doble hebra en o cerca de una secuencia nucleotídica específica . Los términos "codificación de la molécula de ácido nucleico" , "codificación de la secuencia de ADN" y "codificación de ADN" se refieren al orden de secuencia de los desoxirribonucleicos a lo largo de una hebra de ácido desoxirribonucleicos . El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica (proteína) . La secuencia de ADN codifica de este modo para la secuencia de aminoácidos . Los péptidos de la presente invención y las composiciones farmacéuticas y de vacuna de los mismos, son útiles para la administración a mamíferos, particularmente a humanos, para tratar y/o prevenir la infección por el HPV. Las vacunas que contienen una cantidad inmunogénicamente efectiva de uno o más péptidos, se describen en la presente, son una modalidad adicional de la invención. Una vez que han sido identificados los epitopos inmunogénicos apropiadamente, éstos pueden ser distribuidos mediante diversos medios, denominados en la presente como composiciones de "vacuna" . Tales composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (por ejemplo, Vitiello et al., J. Clin. Invest . , 95:341 [1995]); y PCT/USOO/17842 ; composiciones peptídicas encapsuladas en microesferas de poli (DL-láctido-co-glicólido) ("TLG") (Ver, por ejemplo, Eldrige et al., Molec. Immunol . , 28:287-294 [1991]; Alonso et al., Vaccine 12:299-306 [1994]; Jones et al., Vaccine 13:675-681 [1995]), composiciones peptídicas contenidas en complejos inmunoestimuladores (ISCOMS) (Ver, por ejemplo, Takahashi et al., Nature 344:873-875 [1990]; Hu et al., Clin. Exp . Immunol, 113:235-243 [1988] ) , sistemas peptídicos de antígenos múltiples (MAPs) (Ver por ejemplo, Tam. Proc . Nati. Acad. Sci . EUA, 85:5409-5413 [1988]; Tam, J. Immunol. Meth. , 196:17-32 [1996]), vectores de distribuciones virales (Perkus et al., In: Concepts in Vaccine Development , Kaufinann (ed.), p. 379 [1996]; C akrabarti et al . , Nature 320:535 [1986]; Hu et al . , Nature 320:537 [1986]; Kieny et al . , AIDS Bio/Technol . , 4:790 [1986]; Top et al . , J Infect. Dis., 124:148 [1971]; Chanda et al., Virol . , 175535 [1990]), partículas de origen viral o sintético (por ejemplo, Kofler et al., J Immunol . , Me h. , 192:25 [1996]; Eldridge eta 1., Sem. Hematol . , 30:16 [1993]; Falo et al., Nature Med., 7:649 [1995]), adyuvantes (Warren et al., Ann. Rev. Immunol, 4:369 [1986]; Gupta et al., Vaccine 11:293 [1993]), liposomas (Reddy et al., J Immunol.,. 148:1585 [1992]; Rock, Immunol. Today 17:131 [1996]), o ADNc desnudo o absorbido en partículas (Ulmer et al., Science 259:1745 [1993]; Robinson et al., Vaccine 11:957 [1993]; Shiver et al., En: Concepts in Vaccine Development, Kaufinann (ed) , p. 423 [1996]; Cease and Berzofsky, Ann. Rev. Immunol., 12:923 [1994]; y Eldridge et al., Sem. Hematol., 30:16 [1993]). Las tecnologías de distribución dirigidas a toxinas, también conocidas como dirección mediada por receptores, tales como aquellas de Avant Immunotherapeutics, _Inc. (Needham, Massachussets) pueden ser también utilizadas. Las composiciones de vacuna de la invención incluyen modalidades mediadas por ácido nucleico. El ADN o AR" que codifica para uno de los péptidos de la invención puede ser también administrado a un paciente. Este procedimiento es descrito, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247:1465 (1990) asi como las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647, WO 98/04720; y con más detalle más adelante. Los ejemplos de tecnologías de distribución basadas en ADN incluyen "ADN desnuda" , distribución facilitada (bupivicaína, polímeros, mediados por péptidos) , complejos lipidíeos catiónicos, y distribución mediada por partículas ("pistola de genes") o mediada por presión (Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 5,922,687) . Para fines de inmunización terapéutica profiláctica, los péptidos de la invención pueden ser expresados por vectores virales o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión incluyen hospederos virales atenuados, tales como la vaccinia o la viruela aviar. Este procedimiento involucra el uso del virus de la vaccinia, por ejemplo como un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican para los péptidos de la invención. Después de la introducción dentro un hospedero agudo o crónicamente infectado o dentro de un hospedero muy infectado, el virus de la vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico, y con esto promueve una respuesta CTL y/o HTL del hospedero. Los vectores de la vaccinia y los métodos útiles en los protocolos de inmunización son descritos por ejemplo en la patente de los Estados Unidos No. 4,722,848. Otro vector más es BCG (Bacille de Calmette Guerin) . Los vectores BCG son descritos en Stover et al., Nature 351:456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles de la administración terapéutica o la inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores virales adeno- y adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de la toxina destoxificada del ántrax, y similares, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción de la presente. Además, las vacunas de acuerdo a la invención pueden abarcar uno o más de los péptidos de la invención. En consecuencia, un péptido puede estar presente en una vacuna individualmente. Alternativamente, el péptido puede ser individualmente enlazado a su propio portador, alternativamente, el péptido puede existir como un homopollmero que comprende múltiples copias del mismo péptido, o como un heteropolímero de diversos péptidos . Los polímeros tienen la ventaja de tener reacción inmunológica incrementada y, donde se utilizan diferentes epitopos peptídicos para constituir el polímero, la habilidad adicional para inducir anticuerpos y/o CTLs que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del organismo patógeno dirigido para una respuesta inmune. La composición puede ser una región de origen natural de un antígeno, o puede ser preparada, por ejemplo, recombinantemente o mediante síntesis química. Los portadores que pueden ser utilizados con vacunas de la invención son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como la albúmina sérica, toxoide tetánico, poliaminoácidos , tales como poli-L-lisina, ácido poli-L-glutámico, virus de la influenza, proteína de núcleo del virus de la hepatitis B, y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (por ejemplo, aceptable) tal como agua, o solución salina, preferentemente solución salina amortiguada con fosfato. Las vacunas también incluyen típicamente un adyuvante . En adyuvantes tales como el adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, o alumbre son ejemplos de materiales bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, las respuestas de CTL pueden ser cebadas por la conjugación de los péptidos de la invención a los lípidos, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteiniliseril-serina (P3CSS) . Después de la inmunización con una composición peptídica de acuerdo a la invención, vía la inyección, aerosol, las rutas oral, transdérmica, transmucosal, intrapleural, intratecal, u otras rutas adecuadas, el sistema inmune del hospedero responde a la vacuna al iniciar una respuesta de células T CD8+. En consecuencia, el hospedero se vuelve al menos parcialmente inmune a la infección posterior, o al menos parcialmente resistente al desarrollo de una infección crónica por venir, o deriva al menos algún beneficio terapéutico cuando el antígeno fue asociado al tumor. En ciertas modalidades, los componentes que inducen las respuestas de células T son combinados con el componente que induce las respuestas de anticuerpo al antigeno objetivo de interés. Una modalidad preferida de tal composición comprende los epitopos de la Clase I y Clase II de acuerdo con la invención. Para las composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la invención son administrados a un individuo ya infectado con el HPV. Aquellos en la fase de incubación o la fase aguda de infección pueden ser tratados con los péptidos inmunogénicos separadamente o en conjunto con otros tratamientos, como sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones fueron administradas a un paciente en una cantidad suficiente para promover una respuesta efectiva de células T CD8+ hacia el virus, y para curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o las complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto es definida como la "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas para este uso dependerá de diversos factores, incluyendo pero no limitados a, la composición peptídica, la manera de administración, la etapa y la severidad de la enfermedad que se trata, el peso y el estado general de salud del paciente, y el juicio del médico que prescribe, pero en general están en el intervalo de la inmunización inicial (es decir, para la administración terapéutica o profiláctica) de aproximadamente 1.0 µ9 a aproximadamente 50,000 µg del péptido para un paciente de 70 kg, seguido por dosis de refuerzo de aproximadamente 1.0 g hasta aproximadamente 10, 000 µg del péptido de acuerdo con un régimen de refuerzo en semanas a meses dependiendo de la respuesta y la condición del paciente, mediante la medición de la actividad específica de las células T CD8+ en la sangre del paciente. Las dosis de inmunización seguidas por las dosis de refuerzo a intervalos establecidos (por ejemplo, de una a cuatro semanas) , pueden ser requeridos, posiblemente para un periodo prolongado de tiempo para inmunizar de manera efectiva a un individuo. En el caso de la infección crónica, la administración debe continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que la infección viral ha sido eliminada sustancialmente abatida y por un periodo después de esto . Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico están destinadas para la administración parenteral, tópica, oral o local. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente (por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente) . De este modo, la invención proporciona las composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un portador aceptable, preferentemente un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos pueden ser utilizados, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina de 0.95, glicina al 0.3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas convencionales de esterilización bien conocidas, o pueden ser esterilizadas por filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para el uso como es o liofilizadas, siendo combinada la preparación y utilizada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares f rmacéuticamente aceptables, como es requerido para aproximarse las condiciones fisiológicas, tal como agentes ajustadores del pH y amortiguadores, agentes ajustadores de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc. La presente invención proporciona los métodos para la identificación de los epitopos de HPV en las secuencias de diversos tipos de HPV, así como la producción de péptidos que cuando son encontrados dentro de una secuencia de HPV, son capaces de iniciar la respuesta de células T CD8+. En algunas modalidades, la presente invención proporciona los métodos para la identificación de los epitopos de células T GD8+ en secuencias de HPV, y la producción de los péptidos que son capaces de iniciar la respuesta de células T CD8+. En particular, la presente invención proporciona los medios y las composiciones adecuadas para incrementar la inmunogenicidad de los epitopos de HPV para el uso en las preparaciones de vacuna de HPV. En estas modalidades, la presente invención proporciona los medios para determinar las respuestas de células T CD8+ de humanos contra diversos epitopos que comprende una proteína de interés. En modalidades adicionales, una vez que los epitopos significativos son identificados utilizando el sistema de ensayo I-MUNE® modificado descrito en la presente, los epitopos significativos son alterados para producir epitopos que inducen una respuesta inmune mejorada hacia la proteina. De este modo, como se indica anteriormente, las proteínas de la invención muestran respuestas inmunogénicas modificadas (por ejemplo, antigenicidad y/o inmunogenicidad) cuando se comparan a las proteínas nativas codificadas por los ADNs precursores. Por ejemplo, los HPVs que muestran respuestas inmunogénicas incrementadas (por ejemplo, epitopos de HPV variantes) encuentran uso en composiciones de vacunas terapéuticas y profilácticas. La presente invención proporciona los medios para identificar los epitopos funcionales de células T CD8+ en cualquier proteína de interés . La presente invención proporciona además los epitopos de células T CD8+ de diversas proteínas . En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona los epitopos de células T CD8+ del virus del papiloma humano (HPV) . En modalidades adicionales, la presente invención proporciona los epitopos adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. En modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona los epitopos modificados adecuados para el uso en vacunas profilácticas y/o terapéuticas. Durante el desarrollo de la presente invención, se determinó que la adición del anticuerpo anti-CD40 al sistema de prueba proporcionó un medio para evaluar la respuesta de células T CD8+ a diversos péptidos . Aunque no se pretende que la presente invención está limitada a algún mecanismo particular, se cree que la inclusión del anticuerpo anti-CD40 imita el ligando CD40 sobre las células T CD4+ activadas. Este se enlaza al receptor de CD40 presente sobre las superficies de APCs (por ejemplo, células dendríticas) y estimula la activación de las células T CD8+ relevantes, a través de la expresión incrementada de MHC y B7. En experimentos preliminares, el anticuerpo anti-CD40 fue probado en el sistema de ensayo I-MUNE® con los péptidos restringidos en HLA-A2. No se observaron respuestas con el anticuerpo anti-CD40 cuando no se utilizó. En contraste, el mejoramiento significativo en la respuesta fue observado cuando se agregó el anti-CD40. En estos primeros experimentos, se probaron cinco concentraciones del anti-CD40 (10 |g/ml, 5 µg/ml, 2 µg/ml, 1 µg/ml, y 0.5 |jg/ml) . La concentración de 10 µ9/t?1 fue determinada como demasiado alta, ya que ésta mató a las células. La concentración de 0.5 µg/ml fue demasiado baja, aunque ésta si funcionó en casos donde el donador celular tenía valores antecedentes que eran más altos que los usuales. De este modo, se condujeron seis comparaciones utilizando las concentraciones de 5 µg/ml, 2 µ9 t?1, y 1 µg/ml . El análisis estadístico de los resultados fue realizado, utilizando el software Stat-Ease DX6.1 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) . Con base en estos resultados, se eligió la concentración de 1 µg/ml, ya que ésta dio como resultado la respuesta de proliferación más alta en comparación al antecedente. La concentración de 1 µg/ml también ayuda a mantener el antecedente más bajo en comparación a 2.5 µg/ml y 5 µg/ml, permitiendo que sean detectadas más respuestas. No obstante, se contempla que en otros sistemas de ensayo, diferentes concentraciones de anticuerpos encontrarán uso. La presente invención proporciona además los epitopos de células T CD8+ en las proteínas E7 provenientes de dos cepas de virus del papiloma humano (HPV) . En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona los medios para el desarrollo de las vacunas de HPV en particular, vacunas multivalentes para la prevención de la infección con cepas de HPV de alto riesgo. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona los medios para el desarrollo de vacunas terapéuticas contra tipos de HPV de alto riesgo, adecuados para el uso en la prevención del desarrollo de tumores benignos y/o malignos en individuos infectados. La presente invención proporciona además los epitopos adecuados para el uso en las vacunas profilácticas y/o terapéuticas. En modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona los epitopos modificados adecuados para el uso en las vacunas profilácticas y/o terapéuticas. La oncoproteina E7 proveniente de HPV representa un objetivo especialmente atractivo para una vacuna de ADN, debido a su expresión ubicua en casos de carcinoma cervical . La proteína E7 y la proteína E6 son responsables de las características oncogénicas de HPV (Finzer et al., Cáncer Lett., 188:15-24 [2002]). La expresión continua de estas dos proteínas es necesaria para la proliferación continuada y la supervivencia de las células cancerosas cervicales (von Knebel-Doeberitz et al., Cáncer Res., 48:3780-6 [1988]). E6 y E7 son responsables de la transformación en lesiones cervicales y la inhibición de la apoptosis . Varios estudios han indicado que las respuestas inmunológicas contra estas proteínas pueden ser protectoras contra el cáncer cervical . Las respuestas de CTL naturales a E6 Y E7 han mostrado que son más comunes en mujeres positivas a HPV16 sin neoplasia intraepitelial escamosa (SIL) que en las mujeres positivas a HPV16 con SIL (Nakagawa et al., J. Infect .

Dis., 175:927-931 [1997]). Además, las respuestas inmunes mediadas por células para los péptidos productores específicos de E6 y E7 han sido correlacionadas con la regresión de la enfermedad y la resolución de la infección viral (Kadish et al., Cáncer Epidemiol . Biomarkers Prev., 11:483-488 [2002]). Además, la vacunación con el ADN de E7 ha sido demostrada como altamente eficiente para promover la respuesta de las células T citotóxicas (Osen et al., Vaccine 19:4276-4286 [2001]). La presente invención, en la cual se utiliza una vacuna de epitopo en vez de una vacuna de longitud completa, es atractiva debido a que ésta evita el problema de administrar un producto oncogénico. También, debido a los constreñimientos de tamaño de una vacuna de ADN, la inclusión únicamente de regiones inmunogénicas de E7 permite la cobertura de cepas de más alto riesgo. Los pacientes con infecciones con HPV frecuentemente llevan más de una cepa de HPV y los individuos quienes despejan una infección de HPV de una cepa pueden llegar a reinfectarse con una segunda cepa. Aunque los epitopos de CTL son típicamente asociados con vacunas antivirales, existen varias razones para incluir los epitopos CD4+ en conjunto con los epitopos de CD8+ en algunas modalidades preferidas de la presente invención. Por ejemplo, la ayuda de CD4+ específica del antígeno, es generalmente requerida para la activación de la actividad citolítica de CD8+ a través del aprestamiento cruzado de las células presentadoras de antígeno (Ver, Bennett et al., Nature 393:478-480 [1998]); Sc oenberger et al., Nature 393:480-483 [1998]; y Ridge et al . , Nature 393:474-478 [1998]). Además, los estudios en modelos animales han demostrado que las vacunas que incluyen epitopos de CD4 y CD8 derivados del mismo antígeno, inducen una fuerte respuesta protectora (Ver, Ossendrop et al . , J. E p. Med., 187:693-702 [1998]; De Véermann et al., J. Immunol., 162:144-151 [1999]; y Zwaveling et al., J. Immunol., 169:350-8 [2002] ) . En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona las composiciones y los métodos para el desarrollo de composiciones de vacuna dirigidas contra la cepa del HPV, en particular, aquellas asociadas con más altos riesgos de malignidad. De este modo, en algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona las composiciones y los métodos para el desarrollo de composiciones de vacunas dirigidas contra las proteínas E7 de dos cepas de HPV de alto riesgo (por ejemplo, cepas 16 y 18) . De manera importante, la presencia del ADN proveniente de estas cepas de HPV ha sido asociada con las lesiones y cánceres cervicales (Lorincz et al., Obstet Gynecol . , 79:328-337. [1992] ) . Como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos copendiente No. 60/466,235, presentada el 28 de Abril del 2003, los epitopos cooperadores MHC de la Clase II en las proteínas E6 y E7 de diversas cepas de HPV de alto riesgo y de riesgo moderado, fueron identificadas. De este modo, además de los epitopos cooperadores previamente descritos, se contempla que las composiciones y métodos que involucran los epitopos CD8+ de la presente invención encontrarán uso en composiciones de vacuna terapéuticas y/o preventivas. EXPERIMENTAL Los siguientes ejemplos son proporcionados con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas modalidades y aspectos preferidos de la presente invención, y no deben ser considerados como limitantes del alcance de la misma. En la descripción experimental siguiente, aplican las siguientes abreviaturas: M (molar) ; mM (minimolar) µ? (micromolar) ; nM (nanomolar) ; mol (moles) ; mmol (milimoles) ; umol (micromoles; nmol (nanomoles; gm (gramos) ; mg (miligramos) ; µg (microgramos) ; pg (picogramos) , 1 (litros) ,- mi (mililitros) ; µ? (microlitros) ; cm (centímetros) ; mm (milímetros) ; m (micrómetros) ; nm (nanómetros) ; °C (grados Centígrado) ; ADNc (ADN de copia o complementario) ; ADN (ácido desoxirribonucleico) ; ssADN (ADN de una sola hebra) ; dsADN (ADN de doble hebra) ; dNTP (trifosfato de desoxirribonucleótido) ; AR (ácido ribonucleico) ; HRP (peroxidasa de rábano) ; sustrato AEC (solución de acetato de sodio, sulfóxido de dimetilo, metanol y peróxido de urea) ; cromógeno AEC (solución de 3-amino-9-etilcarbazol (2% p/b) , y ?,?-dimetilformamida; PBS (solución salina amortiguada con fosfato; g (gravedad) ; DC (célula dendrítica) ; PHA (fitohemaglutinina) ; OD (densidad óptica) ; DPBS (solución amortiguada con fosfato de Dulbecco; HEPES (ácido N- [2-hidroxietil]piperazin-N- [2-etansulfónico] ) ; HBS (solución salina amortiguada con HEPES) , SDS (dodecilsulfato de sodio) ; Tris-HCl (clorhidrato de tris [hidroximetil] aminometano) ; DMSO (sulfóxido de dimetilo); EGTA (ácido etilenglicol-bis- (éter ß-aminoetílico) -?,?,?' ,?' -tetraacético) ; EDTA (ácido etilendiamintetracético) ; DPBS (solución amortiguada con fosfato de Dulbecco) ; bla (gen de resistencia a la ß-lactamasa o la ampicilina) ; Endogen (Endogen, Woburn, MA) ; CytoVax (CytoVax, Edmonton, Canadá) ; Wyeth-Ayerst (Wyeth-Ayerst, Filadelfia, PA) ; NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA) ; Wallace Oy (Wallace Oy, Turku, Finlandia) ; Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Noruega) ; Dynal (Dynal, Oslo, Noruega) ; Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX) ; Mimotopos (Mimotopos, Inc., San Diego, CA) ; ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ; Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY) ; Sigma (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) ; Pharmacia (Pharmacia Biotech. Pisacataway, NJ) ; Invitrogen (Invitrogen, Ing. , Grand Island, NY) ; Abbott (Abbott Laboratorios, Abbott Park, IL) ; List (List Biological Laboratorios Inc . , Campbell , CA) ; Perkin Elmer (PerkinElmer Life Sciences, Boston MA) ; eBioscience (eBioscience, San Diego, CA) ; BD Bioscience (BD Bioscience) ; Cellular Technology (Cellular Technology, Cleveland, OH) ; y Strategene (Strategene, La Jolla, CA) .

EJEMPLO 1 Preparación de epitopos E7 Las secuencias de aminoácidos de longitud completa de las proteínas E7 de HPV 16 y 18, se utilizaron para crear los grupos de péptidos de 9-mer. SwissProt. P03129 corresponde a HPV16E7. SwissProt. P06788 corresponde a HPV18E7. Estos péptidos variantes fueron utilizados por Mimotopos, utilizando la técnica de síntesis de multiespigas conocida en la técnica (Ver por ejemplo, Maeji et al., J. Immunol. Meth., 134:23-33 [1990]): Los péptidos 9-mer fueron creados tal que las secuencias con péptidos adyacentes compartían 8 aminoácidos (por ejemplo cada péptido fue desplazado por un aminoácido) . Los péptidos fueron diluidos con DMSO para proporcionar una concentración de reserva de aproximadamente 2 mg/ml. La concentración final de los péptidos utilizados en cada ensayo fue de 5 µg/ml. EJEMPLO 2 Preparación de las células utilizadas en el sistema de ensayo para la identificación de epitopos peptídicos de células T en HPV utilizando células T humanas Células de sangre periférica humanas frescas fueron recolectadas de humanos de condición de exposición desconocida a HPV. Estas células fueron probadas para determinar los epitopos antigénicos en HPV 16 y 18, como se describe en el ejemplo 3. Células sanguíneas mononucleares periféricas (almacenadas a temperatura ambiente, de no más de 24 horas) fueron preparadas para el uso como sigue. Las PBMCs fueron aisladas del material de recubrimiento amortiguado, mediante centrifugación sobre una subcapa de Lyrnphoprep a 1000 x g por 30 minutos. La capa de interfaz fue recolectada y lavada y contada utilizando el sistema Cell-Dyn 3700 (Abbott) . Luego, se prepararon las suspensiones que contenían 108 PBMCs resuspendidas en 30 mi de AIM-V (Invitrogen) y luego se dejaron adherir a matraces de cultivo T-75 de plástico por dos horas. El resto de las células fueron congeladas a 5 x 107 células/mi en 45% de FGS (Gibco/BRL) , 45% de PBS con/sin calcio y magnesio (Miediatech) , y 10% de DMSO (Sigma) . Después de la incubación de las PBMC por dos horas, las células no adherentes fueron removidas de los matraces. Las células adherentes fueron cultivadas en los matraces con 800 unidades/ml de GM-CSF humana recombinante (R & D Systems) y 100 unidades/ml de IL-4 humana recombinante (Endogen) a 37°C, 5% de C02. En el día 5 de la incubación, se agregaron a los cultivos 50 unidades/ml de IL-lot humana recombinante (Endogen) y 0.2 unidades/ml de TNF-oc humana recombinante. Las células dendríticas adherentes y no adherentes fueron cosechadas, lavadas, y contadas en el día 7, después de un tratamiento de una hora con 30 mg/ml de mitomicina C (Sigma) y EDTA 10 mM. Las células T CD8+ análogas fueron preparadas a partir de las alícuotas congeladas de PMBCs . Después del congelamiento y lavado en DPBS, las células T CD8+ fueron aisladas utilizando un equipo de selección negativo de CD8 comercialmente disponible (Dynal) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células fueron cultivadas utilizando el sistema Abbot Cell-Dyn 3700 System. La pureza obtenida utilizando estos métodos fue en general encontrada como mayor de 90%. EJEMPLO 3 Ensayo de proliferación de células T Este ejemplo describe el sistema de ensayo utilizado en la presente invención. El sistema de prueba básico es también denominado como el sistema de ensayo "I-MUNE®" . El sistema de ensayo I-MUNE® básico fue modificado como se describe en la presente, para facilitar el análisis de las respuestas de células T CD8+. Como se describe con mayor detalle más adelante, las modificaciones utilizadas en el desarrollo de la presente invención involucraron el uso de esferas de selección negativas a CD8 sobre PB C (por ejemplo, en vez de CD4) . Además, cuando las células CD8 fueron resuspendidas , entre 1.5 x 105 mi y 2.5 x 105 mi de una solución anti-CD40 de 2 µg/ml, fueron agregados, antes de colocar los DCs y los péptidos en las placas (la concentración final de anti-CD40 fue 1 µg/lIll) ; 1 µ? de PHA. a 1 µg/ml se utilizó como un control positivo, en vez del toxoide tetánico . En placas de fondo redondo de 95 pozos, las células dendriticas autólogas, y las células T CD8+ fueron combinadas con los péptidos de prueba. Más específicamente, en un volumen de 100 µ?/????, 2 x 104 células dendriticas en AIM V fueron combinadas con los péptidos individuales (a una concentración final del péptido de 5 µ / 1 y una concentración final de D SO de 0.25%) . Después de una incubación de una hora a 37°C, 5% de C02, se agregaron 2 x 10s células de T CD8+ con 2 µg/ml de anti-CD40 (eBioscience; IgGl de ratón del clon 5C3, kappa) al cultivo para un volumen total de 200 µ? y una concentración final de anti-CD40 de 1 µg/ml por pozo. Los pozos control negativos contenían células dendriticas, las células T CD8+ y 0.25% de DMSO. Los pozos control positivos contenían células dendriticas, las células T CD8+ (a las mismas concentraciones que los pozos de prueba) y 0.25% de DMSO con 5 µg/ml de PHA (Sigma) (List). En algunos experimentos, se utilizó 1 g/ml de anti-IgGl (eBioscience; IgGl de ratón del clon P3, kappa) como un control de isotipo para fines de comparación. Los péptidos inhibidores fueron probados por duplicado o triplicado para cada donador. Después de 5 días de incubación a 37 °C, 5% de C02/ los cultivos fueron pulsados con 0.25 µ??/???? de timidina tritiada (Perkin Elmer) . Después de 24 horas de incubación subsecuentes, las placas fueron cosechadas y valuadas para la incorporación de la timidina tritiada (por ejemplo, proliferación de células T) utilizando un contador de cintilación líquida Wallac-Microbeta TriLux (Perkin Elmer) . Las respuestas fueron promediadas en pruebas por duplicado realizadas para cada espécimen. Las respuestas positivas fueron definidas como poseedoras de una respuesta al menos 2.95 veces en el antecedente. Con base en los resultados obtenidos con el anticuerpo anti-CD40 y el anticuerpo anti-isotipo IgGl, el efecto de anti-CD40 fue encontrado como específico (Ver, figura 3) . Un grupo de datos fue acumulado para ambas proteínas probadas con al menos 45 donadores . La proporción de respuestas porcentual para cada péptido fue determinada para la población completa de donadores. En este sistema de ensayo, la "proporción de respuesta antecedente media para una población de donadores" es definida como la proporción de respuesta porcentual promedio para todos los péptidos en un grupo. En otro sistema de ensayo, un "epitopo mayor" es definido como poseedor de una proporción de respuesta al menos tres desviaciones estándares por arriba de la proporción de respuesta a antecedente media. Los "epitopos moderados" son aquellos epitopos que producen resultados que son al menos dos desviaciones estándares por arriba de la media o tres veces el antecedente. Los "epitopos menores" son aquellos que tienen una proporción de respuesta que es al menos dos veces el valor del antecedente. Como se describe en la presente, este ensayo identificó varios epitopos en ambas cepas de HPV probadas . A. HPV E7.16 Para este antígeno fueron probados 45 donadores en el ensayo I-MUNE® para determinar los epitopos para HPV E7.16. La figura 1 proporciona una gráfica que muestra las respuestas para cada epitopo. También como se indica en la tabla 1, existieron 19 epitopos de interés identificados en este antigeno.

B. HPV E7.18 Para este antigeno, fueron probados 58 donadores en el ensayo I-MUNE® para determinar los epitopos de interés HPV E7.18. La figura 2 proporciona una gráfica que muestra las respuestas a cada epitopo. También como se indica en la tabla 2, existieron dos epitopos de interés identificados en este antigeno .

Tabla 2. epitopos de HPV E7.18 de interés Número del Clasificación del Secuencia del epitopo SEQ ID No: péptido epitopo 12 Mayor VLHLEPQNE SEQ ID No.: 20 17 Menor PQNEIPVDL SEQ ID No.: 21 51 Menor ARRAEPQRH SEQ ID No.: 22 66 Menor C CEARIKL SEQ ID No.: 23 71 Menor RIKLWESS SEQ ID No.: 24 95 Menor SFVCPWCAS SEQ ID No.: 25 Los resultados mostrados anteriormente proporcionan los epitopos de interés en las proteínas E7 de HPV16 y HPV18. De este modo, la presente invención no solamente proporciona los medios para evaluar las respuestas de las células T CD8+ a los epitopos de una proteína de interés, sino también proporcionan los epitopos que son adecuados para la modificación y uso en tales composiciones como vacunas. EJEMPLO 4 Ensayos de ELISPOT de INF-? En este ejemplo, se utilizaron los ensayos ELISPOT (BD Biosciences) para determinar si los epitopos identificados en los ejemplos previos eran epitopos efectores. En estos experimentos, los ensayos ELISPOT de INF-? fueron corridos con epitopos identificados como se describe anteriormente, junto con los péptidos no respondedores y bajamente respondedores provenientes del grupo de péptidos E7 de HPV 18. Estos ensayos fueron probados en paralelo con el ensayo de mapeo del epitopo CD8+ I-MÜNE® para 20 donadores. En estos experimentos, las células T CD8+ y las células dendrlticas fueron sembradas en placas de 96 pozos de fondo redondo a 100 µ?. de cada mezcla celular por pozo. Cada péptido de interés fue agregado a los pozos a una concentración final de 5 pg/ml en 0.25% de DMSO. Los pozos control contenían DMSO, pero no contenían el péptido. El anticuerpo monoclonal anti-CD40 Ab (eBioscience) fue agregado a 1 µg/ml por pozo. Cada péptido fue probado por duplicado. Los cultivos fueron incubados a 37°C, 5% de C02 por 5 días. En el día 5 de incubación, las células fueron resuspendidas al tomar mediante toma con pipeta de la suspensiones celulares fueron transferidas a una placa ELISPOT (BD Biosciences) , pre-recubierta con anticuerpo captura de ???-? a-purificado . Las placas fueron incubadas a 37 °C, 5% de C02 por 24 horas. Las placas fueron lavadas y luego incubadas por dos horas con el anticuerpo de detección de IFN-? a-humano biotinilado. Avidina-HRP y el sustrato AEC y el cromógeno fueron utilizados para el desarrollo de manchas . Las manchas o puntos fueron cuantificados utilizando un analizador InmunoSpot® (Cellular Technology) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Las respuestas positivas fueron definidas como aquellas que están al menos tres veces por arriba del nivel antecedente . Los resultados recopilados son proporcionados en la figura 4. Como se indica en esta figura, existe una fuerte correlación entre la producción de IFN-? y la proliferación para los epitopos (r = 0.67; p = 0.0019). Esta correlación entre la secreción de INF-? y la proliferación de las células T CD8+, muestran suficientemente que las células T CD8+ en proliferación son por supuesto células efectoras . La comparación de la proliferación de CD8+ con la producción de INF-? indica que los epitopos encontrados son epitopos efectores. Por lo tanto, la proliferación de CD8+ en el ensayo I-MU E® es de las células efectoras, en vez de las células anérgicas . Como se indica, existieron unos pocos péptidos donde existían más positivos para INF-? que para la proliferación. No es un fenómeno poco común el tener producción de citosina sin proliferación, especialmente como una respuesta de células de memoria. En el caso donde la proliferación sin producción de INF-? fue observada, se detectó INF-? a dos veces el nivel antecedente, pero esto no cumplió los criterios establecidos de un "positivo" en el desarrollo de la presente invención. No obstante, esto podría ser considerado por muchos investigadores como un positivo. En suma, los resultados proporcionados demuestran que los epitopos identificados como el ensayo I-MUNE® pueden ser verificados para la actividad de CTL a través de sistemas de ensayo comercialmente disponibles tales como el ensayo ELISPOT de INF-?. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método caracterizado porque es para la identificación de epitopos de CD8+. 2. Un método para determinar un epitopo de células T CD8+ en una proteina, caracterizado porque comprende los pasos de : (a) obtener de una solución de células dendríticas y una solución de células T CD8+ intactas provenientes de una fuente de sangre humana simple; (b) diferenciar las células dendríticas, en la solución de células dendríticas, para producir una solución de células dendríticas diferenciadas; (c) preparar un grupo de péptidos a partir de la proteína, en donde el grupo de péptidos comprende el epitopo de células T; (d) combinar la solución de las células T CD8+ y el anticuerpo anti-CD40 para proporcionar una solución de células T y anticuerpo; (e) combinar las células dendríticas diferenciadas y el grupo de péptidos a la solución de células T y anticuerpo; y (f) medir la proliferación de las células T en el paso (e) .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de proteínas virales, proteínas bacterianas, proteínas de parásitos, proteínas fúngicas, y proteínas relacionadas a tumores .
4. 4. Un método para reducir la alergenicidad de una proteína, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) identificar un epitopo de células T en la proteína como se describe en la reivindicación 1; y (b) modificar la proteína para neutralizar el epitopo de células T, tal que la pro'teína modificada induce menos que, o sustancialmente igual la proliferación de línea base de las células T intactas.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el epitopo de células T es modificado por una sustitución seleccionada del grupo que consiste de: (a) sustituir la secuencia de aminoácidos del epitopo de células T con una secuencia análoga proveniente de un homólogo de la proteína de interés; y (b) sustituir la secuencia de aminoácidos del epitopo de células T por una secuencia que imita sustancialmente los atributos de la estructura terciaria mayor del epitopo.
6. 6. Un método para incrementar la inmunogenicidad de una proteína, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) identificar un epitopo de células T en la proteina como se describe en la reivindicación 1; y (b) modificar la proteína para crear una proteína modificada, tal que la proteína modificada induce una mayor proliferación que la proliferación de la línea base en las células T intactas.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el epitopo de células T es modificado por una sustitución seleccionada del grupo que consiste de: (a) sustituir las secuencias de aminoácidos del epitopo de células T con una secuencia análoga proveniente de un homólogo de la proteína de interés; y (b) sustituir la secuencia de aminoácidos del epitopo de células T con una secuencia que imita sustancialmente los atributos de la estructura terciaria mayor del epitopo.
8. 8. Un epitopo de células T CD4+ del virus del papiloma humano, caracterizado porque es identificado utilizando el método de conformidad con la reivindicación 1.
9. 9. Una composición, caracterizada porque comprende el epitopo de célula T CD4+ del virus del papiloma humano de conformidad con la reivindicación 8.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además el paso de modificar el virus del papiloma humano para producir un virus del papiloma' humano variante, en donde la proteína variante muestra una respuesta inmunogénica alterada en comparación al virus del papiloma humano .
11. 11. Un virus del papiloma humano variante, caracterizado porque éste es producido de acuerdo al método de conformidad con la reivindicación 8.
12. 12. Una composición, caracterizada porque comprende la protelna variante de conformidad con la reivindicación 9.