CN101171033A - 包含具免疫刺激序列iss之寡核苷酸的疫苗：其中iss与抗原缀合并通过缓冲条件和其他赋形剂稳定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子在大约2℃至8℃的温度结构稳定。在一些实例中，缀合物分子包含抗原，如变应原。在一些实例中，缀合物分子包含豚草抗原Amb a1。本发明提供了制备和使用此类组合物的方法。本文提供了用于在个体中调节免疫应答的方法，包括施用包含本文所述结构稳定缀合物分子的组合物。

Description

包含具免疫刺激序列ISS之寡核苷酸的疫苗：其中ISS与抗原缀合并通过缓冲条件和其他赋形剂稳定

与相关申请交互参考

本申请要求在2005年3月4日递交的美国临时专利申请60/658,947的优先权，其公开内容在本文整体引用作为参考。

关于联邦发起的研究或项目的陈述

不适用。

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不适用。

发明背景

消退不同病理的免疫应答(如在病毒感染、细菌感染、癌症和变应性反应中观察到的那些)对宿主的整体健康非常重要。成功消退感染、癌症或变应性反应可能取决于免疫应答的类型和强度。免疫接种(其中使用抗原引起进一步的免疫应答)可能有助于成功地消退感染、癌症和/或变应性反应。WO98/16247公开了免疫刺激多核苷酸-免疫调节分子缀合物的组合物。WO01/35991中描述了含有与抗原连接的免疫刺激序列的免疫调节组合物。使用免疫调节序列调节免疫应答的方法公开于WO01/12223。

本文所述所有出版物、参考文件、专利申请、专利出版物和专利在本文引用其整体作为参考。

发明概述

本文提供了包含结构稳定缀合物分子的组合物，其中缀合物分子包含缀合配偶体以及包含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸，其中所述组合物还包含能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分。在一些实例中，缀合物配偶体为抗原，例如变应原。在其他实例中，变应原选自甲壳动物变应原、昆虫变应原、哺乳动物变应原、软体动物变应原、植物变应原和真菌变应原。在其他实例中，变应原为植物变应原豚草(Ragweed)抗原Amb a1。在一些实例中，缀合物分子为如本文所述的AIC。在一些实例中，于约2℃至约8℃的温度，经直角光散射(Right Angle Light Scatter，RALS)测量，组合物包含多于约70％非聚集体形式的所述缀合物分子。在其他实例中，于约2℃至约8℃的温度，经直角光散射(RALS)测量，组合物包含多于约80％、多于约90％、多于约95％或多于约97％非聚集体形式的所述缀合物分子。在其他实例中，包含缀合物配偶体的组合物包含能够维持pH的组分，所述组分选自非极性组分和非负电荷组分。在其他实例中，能够维持pH的组分为组氨酸。在一些实例中，组氨酸以约1mM至约50mM的浓度存在于组合物中。在其他实例中，组氨酸以约5mM至约20mM的浓度存在于组合物中。又在其他实例中，能够维持pH的组分为磷酸盐。在一些实例中，磷酸盐以约5mM至约50mM的浓度存在于组合物中，而在其他实例中，为约20mM至约50mM。在一些实例中，组合物具有约6.0至约9.0的pH范围。在一些实例中，组合物具有约7.0至约8.0的pH范围；而在其他实例中，pH范围约7.5至约8.0。在一些实例中，缀合物分子包含ISS，所述ISS包含六聚体基序AACGTT。在其他实例中，ISS包含基序  GACGCTCC；GACGTCCC；GACGTTCC；GACGCCCC；

AGCGTTCC；AGCGCTCC；AGCGTCCC；AGCGCCCC；AACGTCCC；

AACGCCCC；AACGTTCC；AACGCTCC；GGCGTTCC；GGCGCTCC；

GGCGTCCC；GGCGCCCC；GACGCTCG；GACGTCCG；GACGCCCG；

GACGTTCG；AGCGCTCG；AGCGTTCG；AGCGTCCG；AGCGCCCG；

AACGTCCG；AACGCCCG；AACGTTCG；AACGCTCG；GGCGTTCG；

GGCGCTCG；GGCGTCCG；GGCGCCCG；GACGCT；GACGTC；

GACGTT；GACGCC；GACGCU；GACGUC；GACGUU；GACGUT；

GACGTU；AGCGTT；AGCGCT；AGCGTC；AGCGCC；AGCGUU；

AGCGCU；AGCGUC；AGCGUT；AGCGTU；AACGTC；AACGCC；

AACGTT；AACGCT；AACGUC；AACGUU；AACGCU；AACGUT；

AACGTU；GGCGTT；GGCGCT；GGCGTC；GGCGCC；GGCGUU；

GGCGCU；GGCGUC；GGCGUT或GGCGTU。又在其他实例中，ISS包含序列：

5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)；

5’-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：2)；

5’-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3’(SEQ ID NO：3)；

5’-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO：4)；

5’-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3’(SEQ ID NO：5)；

5’-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO：6)；

5’-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：7)或

5’-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3’(SEQ ID NO：8)，

其中B为5-溴胞嘧啶。在其他实例中，ISS包含

5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3′。

在一些实例中，缀合物配偶体为抗原，而在其他实例中为变应原。又在其他实例中，变应原选自甲壳动物变应原、昆虫变应原、哺乳动物变应原、软体动物变应原、植物变应原和真菌变应原。在其他实例中，变应原为植物变应原豚草抗原Amb a1。

在一些实例中，包含缀合物配偶体的组合物还包含选自组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸的氨基酸。在一些实例中，氨基酸为甘氨酸；在一些实例中，甘氨酸以约230mM至约285mM的浓度存在于组合物中。在其他实例中，组合物还包含选自乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、山梨糖醇和葡萄糖的糖类。在一些实例中，糖类为蔗糖。在一些实例中，蔗糖以约1％至10％的浓度存在于组合物中。在其他实例中，糖类为山梨糖醇。在一些实例中，山梨糖醇以约3％至约5％的浓度存在于组合物中。又在其他实例中，本文提供包含缀合物分子、浓度范围约1mM至约50mM的组氨酸、和浓度范围约50mM至约300mM的甘氨酸的组合物，其中所述组合物具有约6.0至约9.0的pH范围。在其他实例中，本文提供的包含缀合物分子的组合物还包含约1％到10％范围的山梨糖醇或约200mM至约250mM浓度的蔗糖。在一些实例中，组合物具有约7.0至约8.0的pH范围。在其他实例中，本文提供包含缀合物分子、5mM组氨酸和285mM甘氨酸，pH范围约7.0至约8.0的组合物。

在其他实例中，本文提供包含缀合物配偶体、20mM组氨酸和270mM甘氨酸，pH范围约7.0至约8.0的组合物。在其他实例中，本文提供包含20mM组氨酸、50mM甘氨酸和3.8％山梨糖醇，pH范围约7.0至约8.0的组合物。在其他实例中，本文提供包含20mM组氨酸、50mM甘氨酸和210mM蔗糖，pH范围约7.0至约8.0的组合物。本发明提供液体形式的、冻干形式的和从冻干形式重构的液体形式的组合物。

本发明还提供用于制备和使用本文所述组合物(其包含结构稳定缀合物分子，例如但不仅限于AIC)的方法，和包含这类组合物的试剂盒和制品。

附图简述

图1显示如实施例5中所述通过RALS确定的离子强度、时间和温度对AIC的影响。对照为10mM磷酸钠、141.7mM NaCl，pH7.2(从左至右的棒为各对照和NaCl浓度的t0、t7 30C、t7 40C、t14 30C)。

图2A-2C显示如实施例5所述在t₇(30℃)时0.1M NaCl基础缓冲液(BB)中AIC的SEC-HPLC层析图。图2A为215nm；图2B为260nm；图2C为280nm。

图3显示如实施例5中所述通过外源荧光测量的pH、时间和温度对AIC的影响。对照为10mM磷酸钠、141.7mM NaCl，pH7.2(从左至右的棒为各pH值的t0、t7-30C、t7-40C、t14-30)。

图4A-4C.图4A显示pH对AIC：t₀ SEC-HPLC(215nm)的影响。图4B显示pH、时间和温度(40°)对AIC：t₇ SEC-HPLC(215nm)的影响。图4C显示pH、时间和温度(30℃)对AIC：t₁₄ SEC-HPLC(215nm)的影响。对照为10mM磷酸钠、141.7mM NaCl，pH7.2。％MRc为％单体回收；％Tot Rc为％总回收；且M Rec t0为0时间的单体回收(对图4A而言，从左至右的棒为各Ctl(对照)、PBS对照和各pH值的％非聚集体、％MRc和％Tot Rc。对于图4B-4C，从左到右的棒为各Ctl(对照)、PBS对照和各pH值的％非聚集体、％MRc和％Tot Rc)。

图5显示如实施例中所示通过RALS测量的组分组合、时间和温度对AIC的影响。PBS对照为10mM磷酸钠、141.7mM NaCl，pH7.2(从左到右的棒为各组合物的t0、t7、t14和t28)。

发明详述

本文描述了包含缀合物分子的组合物，其中缀合物分子包含缀合物配偶体和包含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸。本发明部分基于下述发现：组合物中缀合物分子的结构稳定性取决于温度、盐和pH条件。本发明人发现当在包含磷酸钠和氯化钠的组合物中于2-8℃以液体贮存时，包含抗原的缀合物分子随时间发生聚集。还发现低pH引起包含抗原的缀合物分子在低离子强度的条件下可逆地聚集。本文提供了开发用于最小化或降低缀合物分子聚集的组合物，以及用于制备和使用这类组合物的方法。本文描述了包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子于约2℃至约8℃的温度结构稳定。在一些实例中，缀合物分子包含抗原，例如变应原。在一些实例中，变应原为经纯化的短豚草抗原(Amb a1)。因此，本文提供了包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子包含于约2℃至约8℃结构稳定的Amb a1。

本文描述了包含缀合物分子和能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分。在一些实例中，组合物包含多于70％，多于80％，多于90％，多于95％，多于97％，多于98％或多于99％的于约2℃至约8℃的温度为非聚合体形式的所述缀合物分子。在一些实例中，组合物包含多于70％，多于80％，多于90％，多于95％或多于97％的在至多约1周、至多约2周、至多约3周、至多约4周、至多约6周、至多约8周、至多约10周、至多约12周、至多约14周、至多约16周、至多约18周、至多约20周、至多约22周、至多约24周、至多约1年或至多约2年的时期内为非聚集体形式的所述缀合物分子。在一些实例中，聚集通过直角光散射(RALS)测量。在其他实例中，组合物中缀合物分子的聚集通过内源荧光(IF)、外源荧光(EF)和/或SEC-HPLC测量，其可与RALS组合或不与之组合。在一些实例中，缀合物分子包含抗原。抗原的实例为本领域已知，但不仅限于肽、脂质、多糖、神经节苷脂和糖蛋白。在一些实例中，抗原为变应原。变应原的实例为本领域已知并在文中描述，且包括但不仅限于甲壳动物变应原、昆虫变应原、哺乳动物变应原、软体动物变应原、植物变应原和真菌变应原。在一些实例中，变应原为植物变应原，例如豚草抗原。在一些实例中，变应原为Amb a1。因此，本文提供了包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子包含Amb a1，所述组合物还包含能够将组合物pH范围稳定在约6.0至约9.0的组分，其中所述组合物包含多于约70％，多于约80％，多于约90％，多于约95％或多于约97％的于约2℃至约8℃的温度为非聚集体形式的所述缀合物分子。在其他实施例中，包含缀合物分子的组合物还可包含以下的一种或多种：1)氨基酸，2)糖类，3)表面活性剂，或4)其他合适的组分，只要组合物包含多于约70％，多于约80％，多于约90％，多于约95％或多于约97％的非聚集体形式的包含Amb a1的所述缀合物分子。在一些实例中，组合物为液体形式。在其他实例中，组合物被冻干，并在其他实例中，组合物为从冻干形式重构的液体形式。

本文描述了包含缀合物分子的组合物，其中组合物中存在的缀合物分子少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或少于约3％在约2℃至约8℃的温度为聚集体形式。在一些实例中，组合物中存在的缀合物分子少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或少于约3％在约2℃至约8℃的温度在至多约1周、至多约2周、至多约3周、至多约4周、至多约6周、至多约8周、至多约10周、至多约12周、至多约14周、至多约16周、至多约18周、至多约20周、至多约22周、至多约24周、至多约1年或至多约2年的时期内为聚集体形式。在一些实例中，组合物中缀合物分子的聚集通过直角光散射(RALS)测量。在一些实例中，缀合物分子包含抗原。通常抗原为肽、脂质(例如除胆固醇外的固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖、神经节苷脂和糖蛋白。在一些实例中，抗原包括但不仅限于来自传染因子的抗原，所述传染因子包括原生动物、细菌、真菌(包括单细胞的和多细胞的)和病毒传染因子。例如，来自寄生生物的抗原包括来自血吸虫物种(例如曼氏血吸虫(S.mansoni)的血吸虫卵抗原(例如Sm-p40)以及来自弓形虫物种(例如刚地弓形虫(T.gondii))的抗原。参阅例如Stadecker等(1998)Parasite Immunol.20：217-221；Subauste等(1993)Curr.Opin.Immunol.5：532-527。在一些实例中，抗原为变应原。变应原的实例为本领域已知并在文中描述，且包括但不仅限于甲壳动物变应原、昆虫变应原、哺乳动物变应原、软体动物变应原、植物变应原和真菌变应原。在一些实例中，变应原为植物变应原，例如豚草抗原。在一些实例中，变应原为Amb a1。因此，本文提供了包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子包含Amb a1，其中组合物中存在的缀合物分子少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或少于约3％在约2℃至约8℃的温度为聚合体形式。

本文提供了包含如本文所述结构稳定缀合物分子的组合物的制备和使用方法。本文提供了用于调节哺乳动物宿主免疫应答的方法，包括向哺乳动物宿主施用包含如本文所述结构稳定缀合物分子的组合物；包含结构稳定缀合物分子的药学组合物；包含这样的组合物的试剂盒，所述组合物包含结构稳定的缀合物分子；和包含结构稳定缀合物分子的组合物的制品。在一些实例中，制品包括包含缀合物分子的组合物，其中所述组合物包含多于约70％、多于约80％、多于约90％、多于约95％或多于约97％的在约2℃至约8℃为非聚集体形式的缀合物。在一些实例中，聚集通过RALS测量。在其他实例中，制品包括包含缀合物分子的液体组合物，在其他实例中，制品包含包含缀合物分子的冻干的组合物。又在其他实例中，制品包含包含结构稳定缀合物分子的(从冻干的组合物复原)被复原的液体组合物。

一般技术

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这类技术在诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait编，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编，1987)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir&CC.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos编，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编，1991)；TheImmunoassay Handbook(David Wild编，Stockton Press NY，1994)以及Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines编，Weinheim：VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)和Gennaro等2000，Remington：the Science and Practice of Pharmacy，第20版，LipincottWilliams and Wilkins：Baltimore，MD.的文献中有充分说明。

定义

除非另有说明，本文使用单数形式的“一”、“一个/一种”和“所述”包括复数指代。例如，“一”ISS包括一种或多种ISS。

本文使用术语“免疫刺激序列”或“ISS”是指引起体外、体内和/或离体可测量免疫应答的多核苷酸序列。可测量免疫应答的实例包括，但不仅限于抗原特异抗体的产生、细胞因子的分泌、淋巴细胞群如NK细胞、CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞、B淋巴细胞等的激活或扩增。优选ISS序列优先激活Th1型应答。用于本发明的多核苷酸含有至少一个ISS。本文使用“ISS”也是含ISS多核苷酸的简称。

本文使用“缀合物分子”是指包含ISS(即含ISS多核苷酸)和缀合物配偶体的分子或复合物。在一些实例中，ISS和缀合物配偶体直接或间接相连。这类缀合物键包括共价和/或非共价键。缀合物配偶体包括但不仅限于抗原。“缀合物分子群”是指一群ISS-缀合物配偶体(即与缀合物配偶体直接或间接连接或附着的ISS)。就本发明目的而言，应理解这类群体不必须具有，并可具有或不具有定量的ISS与各缀合物配偶体附着。一般地，给定的群体会具有分子量分布(基于给定群体中不同程度的缀合)，并因此具有与缀合物配偶体缀合的ISS平均数量。应理解由于例如不完全缀合和/或纯化，本文所述的任何缀合物分子群体可含有游离缀合物配偶体(即未与ISS连接的缀合物配偶体)和/或游离ISS(即未与缀合物配偶体连接的ISS)分子。就本发明的目的而言，本文所述群体含有缀合物分子，但是不必只包含缀合物分子。本文使用“AIC”缀合物分子是指与ISS缀合的豚草变应原Amb a1。

组合物中缀合物分子的结构稳定性是指其中缀合物分子基本上保持其物理稳定性和完整性的组合物。组合物中缀合物分子的物理稳定性通过组合物中缀合物分子的聚集量，即百分比(％)来测量。一般地，组合物中缀合物分子升高的聚集％与组合物中缀合物分子降低的结构稳定性相关联。组合物中缀合物分子的结构稳定性不要求组合物中缀合物分子的0％聚集，或如果组合物中存在缀合物配偶体时0％的游离(即未缀合的)缀合物配偶体聚集，或如果组合物中存在ISS时0％的游离(即未缀合的)ISS聚集。包含结构稳定缀合物分子的组合物是指这样的组合物，其中多于约70％、多于约80％、多于约90％、多于约95％或多于约97％的缀合物分子以非聚集体的形式存在于组合物中。本文关于缀合物分子使用的短语“非聚集体形式”包括但不仅限于单体形式的缀合物分子。一般地，组合物中缀合物分子提高的单体％与组合物中缀合物分子提高的结构稳定性相关联。因此，包含结构稳定的缀合物分子的组合物是指(即包括)这样的组合物，其中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％和至少约97％的缀合物分子在约2℃至约8℃的温度以单体形式存在于组合物中。包含结构稳定缀合物分子的组合物是指(即包括)这样的组合物，其中少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或少于约3％的缀合物分子以聚集体存在于组合物中。用于测量结构稳定性的多种方法可在本领域获得并在本文公开，其包括但不仅限于单独或与其他本领域已知并在文中描述的方法组合的直角光散射(RALS)，所述其他方法包括但不仅限于IF、EF和SEC-HPLC。在一些实例中，组合物中缀合物分子的聚集％通过RALS测量。包含“不稳定”缀合物分子的组合物是组合物中具有多于约30％、多于约40％、多于约50％、多于约60％、多于约70％、多于约80％、多于约90％或多于约95％的缀合物分子以聚集体形式存在的组合物。

在给定群体中给定参数(例如含ISS多核苷酸的数量或质量)的“均值”是指整个群体的参数总和除以群体成员数量。例如，附着于缀合物配偶体的含ISS多核苷酸的平均数量是指在缀合物配偶体分子群体中每个缀合物配偶体上含ISS多核苷酸的平均数量(即含ISS多核苷酸的总数除以缀合物配偶体的总数)。如下文所述，该数量通常通过例如光谱法测量的相对于缀合配偶体的多核苷酸重量确定来获得。

给定群体的“中值”数或重量是指一半群体高于它、一半群体低于它的数量或重量。例如，每缀合物配偶体上含ISS多核苷酸的中位数是指群体中一半缀合物配偶体中其每缀合物配偶体上含ISS多核苷酸数量更低，一半数量更高。

如本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)、经修饰的寡核苷酸和寡聚核苷或其组合。寡核苷酸可以是线性或环状构型的，或寡核苷酸可线性或环状区段两者均含有。寡核苷酸为通常通过磷酸酯键结合的核苷多聚体。核苷由键合在糖上的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤，或其衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶，或其衍生物)碱基组成。DNA中的四个核苷单位(或碱基)称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。核苷酸为核苷的磷酸酯。

本文使用术语“免疫调节”或“调节免疫应答”包括免疫刺激效应以及免疫抑制效应。免疫刺激效应包括但不仅限于直接或间接地增强细胞或体液免疫应答的效应。免疫刺激效应的实例包括但不仅限于提高的抗原特异性抗体的产生；淋巴细胞种群例如NK细胞、CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞、巨噬细胞等的激活或增殖；提高的免疫刺激细胞因子合成，所述细胞因子包括但不仅限于IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α等。免疫抑制效应包括直接或间接降低细胞或体液免疫应答的效应。免疫抑制效应包括但不仅限于抗原特异性抗体产生的减少，例如减少的IgE产生；具有免疫抑制活性(如引起免疫耐受)的淋巴细胞或其他细胞群体的激活；以及对某些细胞功能具有抑制效应的细胞因子合成的提高。实例之一为IFN-γ，其似乎封闭IL-4诱导的向IgE和IgG1的类别转换，从而降低这些抗体亚类的水平。

“缀合程度”是指给定群体中缀合的平均程度。如本文所述，缀合程度可通过任何结构和/或功能参数单独或组合表征。

术语“抗原”是指被抗体或T细胞抗原受体特异性识别并结合的物质。抗原可包括肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、复合糖类、糖、神经节苷脂、脂质和磷脂；其部分及其组合。抗原可以是天然发现的或合成的。适用于与ISS一起施用的抗原包括能够引发B细胞或T细胞抗原特异性应答的任何分子。优选地，抗原引发特异于所述抗原的抗体应答。半抗原包括在“抗原”的范围内。半抗原是其自身无免疫原性，但是与含有抗原决定簇的免疫原性分子缀合后被赋予免疫原性的低分子量化合物。小分子可能需要被半抗原化从而被赋予抗原性。优选在一些实例中，本发明的抗原包括肽、脂质(例如固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖如用于流感嗜血杆菌(Hemophilusinfluenza)疫苗的多糖、神经节苷脂和糖蛋白。

“佐剂”是指下述物质：其被添加至免疫原性物质如抗原时非特异地增强或加强接触混合物的受体宿主对所述物质的免疫应答。

术语“肽”是其长度和组成足以影响生物应答(例如抗体产生或细胞因子活性)的多肽，无论所述肽是否为半抗原。通常，肽长度为至少六个氨基酸残基。术语“肽”还包括经修饰的氨基酸(无论是否天然或非天然存在)，这类修饰包括但不仅限于磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、脂化和甲基化。

“抗原肽”可包括经纯化的天然肽、合成肽、重组蛋白质、蛋白质粗提取物、减毒或灭活的病毒、细胞、微生物，或这类肽的片段。相应地，“抗原肽”或“抗原多肽”是指显示一种或多种抗原特性的多肽整体或部分。因此，例如“Amb a1抗原多肽”或“Amb a1多肽抗原”是来自Amba1的显示抗原特性(即与抗体或T细胞受体特异性结合)的氨基酸序列，无论是整个序列、部分序列和/或修饰序列。

“递送分子”或“递送载体”是便于、允许和/或增强ISS和/或抗原至特定位点和/或涉及特定时间的递送的化学部分。递送载体可以额外地刺激或不刺激免疫应答。

“对抗原的变应性应答”是指通常表征为嗜酸性粒细胞和/或抗原特异性IgE产生及其所产生效应的免疫应答。如本领域所公知，IgE与IgE受体在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上结合。随后接触为IgE所识别的抗原后，所述抗原在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上与IgE的交联引起这些细胞的脱粒，所述脱粒包括但不仅限于组胺释放。应理解并预期，术语“对抗原的变应性应答”、“变态反应”和“过敏症”等同适用于一些本发明的方法中。另外，应理解并预期，本发明的方法包括等同适用于预防变应性应答以及治疗预先存在的过敏症的方法。

本文使用术语“变应原”是指受试者接触时引发变应性应答的抗原或分子(通常为蛋白质)的抗原性部分。例如通过风团和潮红测试或本领域已知的任何方法所显示的那样，受试者一般对所述变应原是过敏的。接触一种分子时即便仅有小部分受试者显示变应性(例如IgE)免疫应答，该分子也被称为变应原。本领域已知许多分离的变应原。这些变应原包括但不仅限于本文所提供的变应原。

术语“脱敏”是指施用递增剂量的受试者对其显示敏感性的变应原的方法。用于脱敏的变应原剂量实例为本领域已知，参阅例如Fornadley(1998)Otolaryngol Clin.North Am.31：111-127。

“抗原特异性免疫疗法”是指涉及抗原并产生免疫应答的抗原特异性调节的任何形式的免疫疗法。在变态反应的上下文中，抗原特异性免疫治疗包括但不仅限于脱敏疗法。

“个体”是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不仅限于人、灵长动物、农场动物、体育动物、啮齿类和宠物。

物质的“有效量”或“足够量”是指足以达到有利的或期望的结果，包括临床结果的量，同样，“有效量”取决于其使用语境。在施用调节针对抗原的免疫应答的组合物的语境中，包含ISS-缀合物配偶体(即ISS和缀合物配偶体)的组合物的有效量是足以获得与单独施用抗原时所获得的免疫应答相当的调节的量。有效量可在一次或多次施用中施用。

本文使用术语“共施用”是指在时间上足够接近地施用至少两种不同物质以调节免疫应答。优选地，共施用是指同时施用至少两种不同物质。

“刺激”免疫应答如Th1应答，是指应答的提高，其可起于应答的引发和/或增强。

“变态反应相关紊乱”是指由抗原特异性IgE免疫应答的效应引起的紊乱。这类效应可包括，但不仅限于低血压和休克。过敏反应是变态反应相关紊乱的一个实例，其中组胺被释放进循环中，引起血管舒张并提高毛细血管通透性，导致循环中血浆的显著流失。过敏反应可全身性发生(整个身体经受相关效应)，且可局部发生(反应仅限于特定靶组织或器官)。

“IgE相关紊乱”是部分表征为提高的IgE水平(其可持续或不持续)的生理条件。IgE相关紊乱包括，但不仅限于变态反应和变应性反应、变态反应相关紊乱(描述于下文)、哮喘、鼻炎、结膜炎、荨麻疹、休克、膜翅目昆虫蛰咬变态反应(hymenoptera sting allergies)和药物变态反应以及寄生虫感染。该术语还包括这些紊乱的相关表现。一般地，这类紊乱中的IgE为抗原特异性的。

如本文使用并如本领域所公知的，“治疗”是用于获得有利或期望的结果(包括临床结果)的途径。就本发明目的而言，有利或期望的临床结果包括但不仅限于减轻或改善一种或多种症状、减小疾病的程度、稳定(即不恶化)疾病的状态、预防疾病的扩散、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态以及消退(部分或全部)，无论是否可以检测。“治疗”还可指与未接受治疗的预期存活期相比延长存活期。

“减轻”疾病或紊乱是指与不治疗紊乱相比，紊乱或疾病状态的程度和/或不期望的临床表现被减轻和/或进展的时间过程被减缓或延长。特别是在变态反应语境中，如本领域技术人员所公知的那样，减轻可基于针对变应原的免疫应答调节而发生。另外，减轻在施用一次剂量时不一定会发生，而经常在施用一系列剂量时发生。因此，足以减轻应答或紊乱的量可以在一次或多次施用中施用。

被ISS-缀合物配偶体或ISS抗原“引发”的“抗体效价”或“抗体量”是指施用缀合物或抗原后的时间点测量的给定抗体的量。

“Th1相关抗体”是其产生和/或增加与Th1免疫应答相关的抗体。例如，IgG2a是小鼠中的Th1相关抗体。就本发明目的而言，Th1相关抗体的测量可以是一种或多种这类抗体的测量。例如在人中，测量Th1相关抗体可以伴随测量IgG1和/或IgG3。

“Th2相关抗体”是其产生和/或增加与Th2免疫应答相关的抗体。例如，IgG1是小鼠中的Th2相关抗体。就本发明目的而言，Th2相关抗体的测量可以是一种或多种这类抗体的测量。例如在人中，测量Th2相关抗体可以伴随测量IgG2和/或IgG4。

“阻抑”或“抑制”功能或活性(如细胞因子产生、抗体产生或组胺释放)是指与除目的条件或参数外其他条件相同时相比，或者可选地，与另一条件相比，降低功能与活性。例如，阻抑组胺释放的缀合物分子群体与例如抗原单独诱导的组胺释放相比降低组胺释放。作为另一实例，阻抑抗体产生的缀合物分子群体与例如抗原单独产生的抗体程度和/或水平相比，降低抗体的程度和/或水平。

包含缀合物分子的组合物

本发明部分涉及包含缀合物分子的组合物，其中缀合物分子包含缀合物配偶体和包含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸，并部分涉及制备和使用这类化合物的方法。本发明还部分涉及包含结构稳定缀合物分子的组合物以及制备及使用这类组合物的方法。本文描述了本发明所涵盖的ISS和缀合物配偶体。本领域技术人员将会理解，本发明所涵盖的缀合物分子可具有不同且独特的生物特性，基于缀合物配偶体、缀合物分子中存在的ISS的类型和数量，以及ISS和缀合物配偶体之间缀合的平均程度。在一些实例中，缀合物配偶体为蛋白质，例如抗原或变应原。在一些实例中，缀合物配偶体包含变应原Amb a1。在其他实例中，ISS可以是大于6个碱基或碱基对的任何长度的多核苷酸，而在一些实例中其包含序列5’-胞嘧啶(C)，鸟嘌呤-3’(G)，而在其他实例中包含序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶-3’(如5′-AACGTT-3′)，而在其他实例中为大于15个碱基或碱基对，而在其他实例中大于20个碱基或碱基对长度。在一些实例中，ISS包含序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，G-3’；或序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，C-3’；或序列5’-T，C，G-3’。在一些实例中，ISS包含5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’。

在一些实例中，  缀合物分子包含缀合于包含5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’的ISS的Amb a1。这类组合物可用于例如治疗和诊断方法，其中维持缀合物分子的结构稳定性是必须的。含有与抗原连接的免疫刺激序列(ISS)的缀合物分子公开于PCT出版物WO01/35991、WO98/16247和WO01/12223中，其公开内容在本文明确引用作为参考。

本发明人发现组合物中缀合物分子的结构稳定性取决于温度、盐和pH条件。发现组合物中存在的磷酸钠、氯化钠、带负电荷组分和/或极性组分使得包含变应原的缀合物分子在高于0℃或更高的温度在液体组合物中不稳定。发现低pH引起包含变应原的缀合物分子在低离子强度的条件下可逆聚集。

不受理论束缚，认为由于缀合物分子中因ISS的存在所致的负电荷，期望包含不带负电荷组分或具有中性电荷或非极性组分的组合物来维持组合物中存在的缀合物分子的结构稳定性。已经发现添加带负电荷的组分如氯化钠会引起包含ISS的缀合物分子聚集，从而变得不稳定。已经发现包含缀合物分子的组合物中的亲核物质如叠氮化物或甚至低氯化钠会使缀合物分子不稳定。

多种组合物中包含变应原的缀合物的结构稳定性如本文所述表征。设计实验评估组合物中缀合物分子可能的结构改变作为pH、温度、时间以及组合物条件(如离子强度和表面活性剂存在)的函数。如本文所述，将包含约0.1μg到200μg浓度范围的经纯化的与ISS共价连接的短豚草抗原AMB a1(在本文称为Amb a1-ISS寡核苷酸缀合物或“AIC”)的缀合物分子的说明性实例透析为含有多种离子强度和多种pH条件的组合物，然后通过使用内源荧光(IF)、外源荧光(EF)和直角光散射(RALS)分析，同时对所述缀合物分子进行温度改变。IF、EF和RALS在文中描述于实施例中。使缀合物分子经受剪切应力并通过RALS和尺寸排阻色谱高效液相色谱(SEC-HPLC)分析。相同的方法(即IF、EF、RALS和SEC-HPLC)平行使用，以检测包含AIC的组合物在存在磷酸钠和氯化钠(在本文实施例中称为PBS)时的冻熔敏感性。

被设计用于阐释组合物中AIC结构变化的实验结果在文中包括实施例和表10、11和12中描述。表10显示用于维持pH条件的多种组分的分析结果。相应地，在一些实例中，用于维持包含缀合物分子的组合物pH条件的组分包括pH7.5的组氨酸、pH8.0的组氨酸、pH7.5的磷酸盐、pH8.0的磷酸盐、pH7.0的磷酸盐、pH7.0的组氨酸或pH6.5的组氨酸。如本文所述，对于组合研究(即包含缀合物分子的组合物中的组分组合)而言，制备包含组氨酸的组合物。表11显示多种氨基酸的分析结果。相应地，在一些实例中，用于包含缀合物分子的组合物中的氨基酸包括组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸或丙氨酸。对于组合研究(即包含缀合物分子的组合物中的组分组合)而言，制备包含甘氨酸的组合物。表12显示多种糖类的分析结果。相应地，在一些实例中，包含缀合物分子的组合物包括糖类，如乳糖、蔗糖、甘露糖或麦芽糖。实施例6描述了组合研究的结果。

本文提供了组合物，其包含在约2℃至约8℃温度结构稳定的缀合物分子。在一些实例中，组合物为液体形式，而在其他实例中为冻干形式。本文提供了组合物，其包含结果稳定缀合物分子和能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分。在一些实例中，所述组分能够将pH范围维持在约7.0至约8.0，在其他实例中，范围约7.5至约7.8，而在其他实例中，pH约7.5。在一些实例中，能够将pH范围维持在约6.0至约9.0的组分具有中性电荷或碱性电荷。在一些实例中，能够将pH范围维持在约6.0至约9.0的组分为非极性的。在一些实例中，能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分选自组氨酸或磷酸盐。在一些实例中，能够维持pH的组分以这样的量存在于组合物中，所述量足以使多于约70％、多于约80％、多于约90％、多于约95％或多于约97％的所述缀合物分子在约2℃至约8℃的温度为非聚集体的形式。缀合物分子的聚集可通过本文所公开的方法如直角光散射(RALS)或本领域已知的方法测量。

在其他实例中，包含缀合物分子的组合物还可包含下述一种或多种：1)氨基酸，2)糖类，3)表面活性剂，和4)其他合适的可药用载体，只要组合物包含多于70％、多于80％、多于90％、多于95％或多于97％的非聚集体或单体形式的所述缀合物分子。在一些实例中，氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸。在一些实例中，氨基酸为组氨酸或甘氨酸。在一些实例中，糖类选自乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、山梨糖醇和葡萄糖。在一些实例中，糖类为山梨糖醇或蔗糖。本文提供了这样的组合物，其包含结构稳定的缀合物分子和能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分。本文提供了这样的组合物，其包含结构稳定的缀合物分子、能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分以及氨基酸。本文提供了这样的组合物，其包含结构稳定的缀合物分子、能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分以及糖类。本文提供了这样的组合物，其包含结构稳定的缀合物分子、能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分、氨基酸以及糖类。在一些实例中，包含结构稳定缀合物分子的组合物还包含表面活性剂。在一些实例中，组合物为液体形式，而在其他实例中为冻干形式。本发明包括由冻干形式重构的液体形式的包含缀合物分子的组合物。

如本文所述，多种液体形式的组合物的评估鉴定了在约2℃至8℃的温度维持AIC结构稳定性的组合物，所述组合物包含本文所述的AIC(包括约30ug/ml和约60ug/ml的浓度)并包含每摩尔Amb 1a(平均分子量约65 kDa)平均约4.0摩尔的ISS。在一些实例中，结构稳定性维持至少6个月。这些包含AIC的组合物包括但不仅限于包含约1mM至约50mM范围组氨酸的组合物；包含约1mM至约50mM范围组氨酸和约50mM至约300mM范围甘氨酸的组合物；包含约1mM至约50mM范围组氨酸和占组合物约1％至约5％范围山梨糖醇的组合物；包含约1mM至约50mM范围组氨酸、约50mM至约300mM范围甘氨酸和占组合物约1％至约5％范围山梨糖醇的组合物；所述组合物均具有约7.0至约8.0的pH范围。本文提供了包含AIC(如本文所述，其可以是低的(L)、中等的(M)或高的(H))的组合物，其中组合物中的AIC在约2℃至8℃的温度是结构稳定的，其包括但不仅限于：

·5mM组氨酸、285mM甘氨酸，pH范围约7.0至约8.0的或约pH7.5；

·20mM组氨酸、270 mM甘氨酸，pH范围约7.0至约8.0或约pH7.5；

·20mM组氨酸、50mM甘氨酸、3.8％山梨糖醇，pH范围约7.0至约8.0或约pH7.5；和

·20mM组氨酸、50mM甘氨酸、210mM山梨糖醇，pH范围约7.0至约8.0或约pH7.5。

基于本文公开的实验结果，下文显示了预测为结构稳定的其他AIC组合物。

组合物编号	缀合物分子	维持pH的组分；pH条件	氨基酸组分	糖类	组合物状态/温度
						1.	浓度范围约0.1μg至约200μg的AIC	浓度约5mm至约20mm的组氨酸·pH约6.5至约8.0·pH约7.5·pH约8.0			液体/约2℃至约8℃
2.	同组合物1中的AIC	同组合物1中的组氨酸	浓度约50mm至约300mm的甘氨酸		与组合物1同
						3.	同组合物1中的AIC	同组合物1中的组氨酸	同组合物2中的甘氨酸	约1％至约10％的山梨糖醇	与组合物1同
4.	同组合物1中的AIC	同组合物1中的组氨酸	同组合物2中的甘氨酸	同组合物3中的山梨糖醇	·冻干/约2℃至约8℃·冻干/0℃或低于0℃
						5.	同组合物1中的AIC	同组合物1中的组氨酸	同组合物2中的甘氨酸	约200mm至约250mm的蔗糖	与组合物1同
6.	同组合物1中的AIC	同组合物1中的组氨酸	同组合物2中的甘氨酸	同组合物5中的蔗糖	·冻干/约2℃至约8℃·冻干/0℃或低于0℃
						7.	同组合物1中的AIC	同组合物1中的组氨酸	浓度约50mm至约300mm的异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸或丙氨酸		与组合物1同
8.	同组合物1中的AIC	同组合物1中的组氨酸	同组合物7中的氨基酸	同组合物3中的山梨糖醇或同组合物5中的蔗糖	·冻干/约2℃至约8℃·冻干/0℃或低于0℃·液体/约2℃至约8℃

与分析性HPLC方法如尺寸排除(SEC-HPLC)和SDS-PAGE结合的IF、EF和RALS可设计为将组合物中任何缀合物分子的行为作为pH、温度和时间以及溶液条件(即离子强度、表面活性剂等)的函数进行绘图，以确定组合物中缀合物分子结构稳定性的条件。

缀合物配偶体

本发明涵盖的缀合物配偶体包括但不仅限于抗原，如肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、复合糖类、糖、神经节苷脂、脂质和磷脂；其部分及其组合。在一些实例中，抗原可来自传染因子，包括原生动物、细菌、真菌(包括单细胞和多细胞的)和病毒传染因子。例如来自寄生生物的抗原包括来自血吸虫物种(如曼氏血吸虫)的血吸虫卵抗原(例如Sm-40)和来自弓虫物种(例如刚地弓形虫)的抗原。参阅例如Stadecker等(1998)ParasiteImmunol.20：217-221；Subauste等(1993)Ciirr.Opm.Immunoi.5：532-527。可使用本领域已知的纯化技术从其来源中分离抗原，或更便利地使用重组方法制备抗原。抗原性的肽可包括经纯化的天然肽、合成肽、重组蛋白质、蛋白粗提取物、减毒的或灭活的病毒、细胞、微生物或这类肽的片段。免疫调节肽可以是天然的或化学或酶促合成的。本领域已知的任何化学合成法是合适的。液相肽合成可用于构建中等大小的肽，或可使用固相合成用于化学构建肽。Atherton等(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362：833-839。也可使用蛋白水解酶偶联氨基酸以产生肽。或者可通过使用细胞的生化机器，或通过从生物来源中分离获得肽。可使用重组DNA技术用于制备肽。还可使用标准技术如亲和层析分离肽。一般地，抗原为肽、脂质(例如除胆固醇外的固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖、神经节苷脂和糖蛋白。这些可通过本领域已知的若干方法获得，包括使用化学和酶促方法分离和合成。在某些情况下(例如对许多固醇、脂肪酸和磷脂而言)，分子的抗原性部分是可商业获得的。来自传染因子的抗原可使用本领域已知方法获得，例如来自天然病毒或细菌提取物、来自被传染因子感染了的细胞、来自经纯化的多肽、来自重组产生的多肽和/或合成肽。

在一些实例中，抗原为变应原。重组变应原的实例在表1中提供，并包括但不仅限于甲壳动物变应原、昆虫变应原、哺乳动物变应原、软体动物变应原、植物变应原和真菌变应原。在一些实例中，变应原为植物变应原。在其他实例中，变应原为豚草抗原Amb a1。许多变应原的制备为本领域公知，包括但不仅限于豚草花粉变应原抗原E(Amb al)的制备(Rafhar等(1991)J.Biol.Chem.266：1229-1236)、尘螨主要变应原Der pI和Der PII的制备(Chua等(1988)J.Exp.Med.167：175-182；Chua等(1990)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91：124-129)、白桦花粉Bet vl的制备(Breiteneder等(1989)EMBO J.8：1935-1938)、家养猫变应原FeI dI的制备(Rogers等(1993)Mol.Immunol.30：559-568)和来自树木花粉的蛋白质抗原的制备(Elsayed等(1991)Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.204：17-31)。如前所述，来自树木的变应原是已知的，包括来自桦树(birch)、杜松(juniper)和柳杉(Japanese cedar)的变应原。用于体内施用的来自草花粉的蛋白质抗原制备已有报导。Malley(1989)J.Reprod.Immunol.16：173-186。如表1所示，在一些实例中，变应原为食品变应原，例如花生变应原如Ara hI，而在一些实例中，变应原为草变应原，例如黑麦变应原如LoI pI。表1显示了涵盖在本发明中的变应原列表。

表1

重组变应原

组	变应原	参考文献
			动物：
甲壳动物
			虾/龙虾	原肌球蛋白Pan sI	Leung等J.Allergy Clin.Immunol.，1996，98：954-961Leung等Mol.Mar.Biol.Biotechnol.，1998：7：12-20
昆虫
			蚂蚁	SolI2(毒液)	Schmidt等J.Allergy Clin.Immunol.，1996，98：82-8
蜜蜂	磷脂酶A2(PLA)透明质酸酶(Hya)	Muller等J.Allergy Clin.Immunol.，1995，96：395-402Forster等J.Allergy Clin.Immunol.，1995，95：1229-35Muller等Clin Exp Allergy，1997，27：915-20Soldatova等J.Allergy Clin.Immunol.，1998，101：691-8
			蟑螂	Bla g Bd9OKBla g4(一种calycin)谷胱甘肽S转移酶Per a3	Helm等J.Allergy Clin.Immunol.，1996，98：172-80Vailes等J.Allergy Clin.Immunol.，1998，101：274-80Arruda等J Biol Chem，1997，272：20907-12Wu等Mol Immunol，1997，34：1-8

尘螨	Der p2(主要变应原)Der p2变体Der f2Der p10Tyr p2	Lynch等J Allergy Clin Immunol，1998，101：562-4Hakkaart等Clin Exp Allergy，1998，28：169-74Hakkaart等Clin Exp Allergy，1998，28：45-52Hakkaart等Int Arch Allergy Immunol，1998，115(2)：150-6Muller等J Biol Chem，1997，272：26893-8Smith等J Allergy Clin Immunol，1998，101：423-5Yasue等Clin Exp Immunol，1998，113：1-9Yasue等Cell Immunol，1997，181：30-7Asturias等Biochem Biophys Acta，1998，1397：27-30Eriksson等Eur J Biochem，1998
			大胡蜂	抗原5aka Dol m V(毒液)	Tomalski等Arch Insect Biochem Physiol，1993，22：303-13
蚊子	Aed aI(唾液腺苷三磷酸双磷酸酶)	Xu等Int Arch Allergy Immunol，1998，115：245-51
			黄蜂	抗原5、透明质酸酶和磷脂酶(毒液)	King等J Allergy Clin Immunol，1996，98：588-600
哺乳动物
			猫	Fel dI	Slunt等JAllergy Clin Immunol，1995，95：1221-8
牛	Bos d2(毛屑；一种脂卡林(lipocalin))β-乳球蛋白(BLG，牛奶主要变应原)	Zeiler等J Allergy Clin Immunol，1997，100：721-7Rautiainen等Biochem Bioph.Res Comm.，1998，247：746-50Chatel等Mol Immunol，1996，33：1113-8Lehrer等Crit Rev Food Sci Nutr，1996，36：553-64
			犬	Can fI和Can f2，唾液脂卡林	Konieczny等Immunology，1997，92：577-86Spitzauer等J Allergy Clin Immunol，1994，93：614-27Vrtala等J Immunol，1998，160：6137-44
马	Equ c1(主要变应原，一种脂卡林)	Gregoire等J Bio Chem，1996，271：32951-9
			小鼠	小鼠尿蛋白(MUP)	Konieczny等Immunology，1997，92：577-86
其他哺乳动物变应原
			胰岛素		Ganz等J Allergy Clin Immunol，1990，86：45-51Grammer等J Lab Clin Med，1987，109：141-6Gonzalo等Allergy，1998，53：106-7
干扰素	干扰素α2c	Detmar等Contact Dermatis，1989，20：149-50
			软体动物	原肌球蛋白(topomyosin)	Leung等J.Allergy Clin.Immunol.，1996，98：954-61
植物变应原：
			大麦	Hor v9	Astwood等Adv Exp Med Biol，1996，409：269-77
桦树	花粉变应原，Bet v4rBet v1 Bet v2：(肌动蛋白抑制蛋白)	Twardosz等Biochem Bioph.Res Comm.，1997，239：197Pauli等J Allergy Clin Immunol，1996，97：1100-9Van Neerven等Clin Exp Allergy，1998，28：423-33Jahn-Schmid等Immunotechnology，1996，2：103-13Breitwieser等Biotechniques，1996，21：918-25

		Fuchs等J AUergy Clin Immunol，1997，100：356-64
			巴西坚果	球蛋白	Bartolome等AllergolImmunopathol，1997，25：135-44
樱桃	Pru aI(主要变应原)	Scheurer等Mol Immunol，1997，34：619-29
			玉米	Zml3(花粉)	Heiss等FEBS Lett，1996，381：217-21Lehrer等Int Arch Allergy Immunol，1997，113：122-4
草	Phl p、Phl p2、Phl p5(梯牧草花粉)	Bufe等Am J Respir Crit Care Med，1998，157：1269-76Vrtala等J Immunol，1998年6月15日，160：6137-44Niederberger等  J AUergy Clin Immunol，1998，101：258-64
				Hol 15鹿茸草(velvet grass)花粉	Schramm等Eur J Biochem，1998，205：200-6
	蓝草(bluegrass)变应原	Zhang等J Immunol，1993，151：791-9
				Cyn d7狗牙根草	Smith等Int Arch Allergy Immunol，1997，114：265-71
	Cyn d12(肌动蛋白抑制蛋白)	Asturias等Clin Exp Allergy，1997，27：1307-13Fuchs等J AUergy Clin Immunol，1997，100：356-64
			杜松	Jun o2(花粉)	Tinghino等J Allergy Clin Immunol，1998，101：772-7
橡胶	Hev b7	Sowka等Eur J Biochem，1998，255：213-9Fuchs等J Allergy Clin Immunol，1997，100：356-64
			山靛(mercurialis)	Mer aI(肌动蛋白抑制蛋白)	Vallverdu等JAllergy Clin Immunol，1998，101：363-70
芥末(黄)	Sin aI(种子)	Gonzalez de la Pena等Biochem Bioph.Res Comm.，1993，190：648-53
			油菜籽油菜	Bra rI花粉变应原	Smith等Int Arch Allergy Immunol，1997，114：265-71
花生	Ara h1	Stanley等Adv Exp Med Biol，1996，409：213-6Burks等J Clin Invest，1995，96：1715-21Burks等Int Arch Allergy Immunol，1995，107：248-50
			草地早熟禾	Poap9	Parronchi等Eur J Immunol，1996，26：697-703Astwood等Adv Exp Med Biol，1996，409：269-77
豚草	Amb a1	Sun等Biotechnology 1995年8月，13：779-86Hirschwher等J Allergy Clin Immunol，1 998，101：196-206Casale等JAllergy Clin Immunol，1997，100：110-21
			黑麦	Lol pI	Tamborini等Eur J Biochem，1997，249：886-94
胡桃	Jug rI	Teuber等J Allergy Clin Immunol，1998，101：807-14
			小麦	变应原	Fuchs等J Allergy Clin Immunol，1997，100：356-64Donovan等Electrophoresis，1993，14：917-22
真菌：
			曲霉	Asp f1、Asp f2、Asp f3、Asp f4、Asp f6锰超氧化物岐化酶(MNSOD)	Crameri等Mycoses，1998，41 Suppl 1：56-60Hemmann等Eur J Immunol，1998，28：1155-60Banerjee等J Allergy Clin Immunol，1997，99：821-7Crameri等Int Arch Allergy Immunol，1998，115：99-114Crameri等Adv Exp Med Biol，1996，409：111-6Moser等JAllergy Clin Immunol，1994，93：1-11Mayer等Int Arch Allergy Immunol，1997，113：213-5

无爪螨属(Blomia)	变应原	Caraballo等Adv Exp Med Biol，1996，409：81-3
			青霉	变应原	Shen等Clin Exp Allergy，1997，27：682-90
裸盖菇属(psilocybe)	Psi c2	Horner等Int Arch Allergy Immunol，1995，107：298-300

在一些实例中，抗原来自传染因子，包括原生动物、细菌、真菌(包括单细胞和多细胞的)和病毒传染因子。合适病毒抗原的实例描述于本文并为本领域已知。细菌包括流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)。原生动物传染因子包括疟疾疟原虫、利什曼原虫物种、锥虫物种和血吸虫物种。真菌包括白色念珠菌(Candida albicans)。

在一些实例中，抗原为病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不仅限于核心蛋白如HIV gag蛋白(包括但不仅限于膜锚定(MA)蛋白、核心衣壳(CA)蛋白和核衣壳(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基质(M)蛋白和流感病毒核衣壳(NP)蛋白。讨论流感疫苗接种的参考文献包括Scherle和Gerhard(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：4446-4450；Scherle和Gerhard(1986)J.Exp.Med.164：1114-1128；Granoff等(1993)Vaccine 11：S46-51；Kodihalli等(1997)J Virol.71：3391-3396；Ahmeida等(1993)Vaccine 11：1302-1309；Chen等(1999)Vaccine 17：653-659；Govorkova和Smimov(1997)ActaVirol.(1997)41：251-257；Koide等(1995)Vaccine 13：3-5；Mbawuike等(1994)Vaccine 12：1340-1348；Tamura等(1994)Vaccine 12：310-316；Tamura等(1992)Eur.J.Immunol.22：477-481；Hirabayashi等(1990)Vaccine 8：595-599。抗原多肽的其他实例为对于大量传染因子而言已知的型特异或亚型特异性抗原，包括但不仅限于腺病毒、单纯疱疹病毒、乳头状瘤病毒、呼吸道合胞病毒和痘病毒。

许多抗原性肽和蛋白质是已知的，并可在本领域中获得；其他的可使用常规技术鉴定。关于针对肿瘤形成的免疫接种，免疫调节肽可包括肿瘤细胞(活的或经辐照的)、肿瘤细胞提取物或肿瘤抗原的蛋白质亚基(如Her-2/neu、Mart1)、癌胚抗原(CEA)、神经节苷脂、人乳脂肪球(HMFG)、粘蛋白(MUCI)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)和酪氨酸酶。以免疫为基础的避孕疫苗可通过包含与ISS一起施用的精子蛋白质形成。Lea等(1996)Biochim.Biophys.Acta1307：263。

减毒的和灭活的病毒在本文适用于作为抗原。这些病毒的制备为本领域公知，并且许多可以商业获得(参阅例如Physicians’Desk Reference(1998)第52版，Medical Economics Company，Inc.)。例如脊髓灰质炎病毒可作为IPOL(Pasteur Merieux Connaught)和ORMUNE(LederleLaboratories)获得，甲型肝炎病毒可作为VAQTA(Merck)获得，麻疹病毒可作为ATTENUVAX(Merck)获得，腮腺炎病毒可作为MUMPSVAX(Merck)获得，风疹病毒可作为MERUVAXII(Merck)获得。另外，减毒的和灭活的病毒如HIV-1、HIV-2、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、轮状病毒、人和非人乳头瘤病毒和脑慢病毒(slow brain virus)能够提供肽抗原。

在一些实例中，抗原包含病毒载体，例如牛痘、腺病毒和金丝雀痘。

抗原可使用本领域已知的纯化技术从其来源中分离，或可更便利地使用重组方法制备。

抗原性肽可包括经纯化的天然肽、合成肽、重组蛋白质、蛋白质粗提取物、减毒的或灭活的病毒、细胞、微生物或这类肽的片段。免疫调节肽可以是天然的或化学或酶促合成的。本领域已知的化学合成的任何方法是合适的。液相肽合成可用于构建中等大小的肽，或可使用固相合成用于化学构建肽。Atherton等(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362：833-839。也可使用蛋白水解酶偶联氨基酸以产生肽。Kullmann(1987)Enzymatic Peptide Synthesis，CRC Press，Inc.。或者可通过使用细胞的生化机器，或通过从生物来源中分离获得肽。可使用重组DNA技术用于制备肽。Hames等(1 987)Transcription and Translation：A Practical Approach，IRL Press。还可使用标准技术如亲和层析分离肽。

在一些实例中，抗原为肽、脂质(例如固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖(例如流感嗜血杆菌疫苗中使用的多糖)、神经节苷脂和糖蛋白。这些可通过本领域已知的若干方法获得，包括使用化学和酶促方法分离和合成。在某些情况下(例如对许多固醇、脂肪酸和磷脂而言)分子的抗原性部分是可商业获得的。

用于所述组合物和使用所述组合物的方法中的病毒抗原的实例包括，但不仅限于HIV抗原。这类抗原包括，但不仅限于来自HIV包膜糖蛋白(包括但不仅限于gp160、gp120和gp41)的抗原。已知众多HIV基因和抗原的序列。例如洛斯阿拉莫斯国家实验室(Los Alamos NationalLaboratory)HIV序列数据库收集、组织和注释HIV核苷酸和氨基酸序列。该数据库可通过因特网由http://hiv-web.lanl.gov/以及年刊中获得，参阅Human Retroviruses and AIDS Compendium(例如1998版)。

来自传染因子的抗原可使用本领域已知的方法获得，例如从天然病毒或细菌提取物中、从用传染因子感染的细胞中、从经纯化的多肽中、从重组产生的多肽和/或合成多肽中获得。

ISS

根据本发明，缀合物分子含有至少一个ISS，并且能够含有多个ISS。ISS可在多核苷酸中相邻，或它们可被多核苷酸中其他核苷酸碱基分隔开。

ISS已在本领域描述，并可使用显示多方面免疫应答的标准测定法容易地鉴定，例如细胞因子分泌、抗体产生、NK细胞激活和T细胞增殖。参阅例如WO97/28259；WO98/16247；WO99/11275；Krieg等(1995)Nature 374：546-549；Yamamoto等(1992a)；Ballas等(1996)；Klinman等(1997)；Sato等(1996)；Pisetsky(1996a)；Shimada等(1986)Jpn.J.CancerRes.77：808-816；Cowdery等(1996)J.Immunol.156：4570-4575；Roman等(1997)和Lipford等(1997a)。

ISS可以是大于6个碱基或碱基对的任何长度，并且通常包含序列5’胞嘧啶，鸟嘌呤-3’，特别是包含序列5’嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶-3’(如5′-AACGTT-3′)，优选在一些实例中为大于15个碱基或碱基对，更优选在一些实例中大于20个碱基或碱基对长度。ISS还可包含序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，G-3’。ISS还可包含序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，C-3’。如以下多核苷酸序列所示，ISS还可包含序列5’-T，C，G-3’。

在一些实例中，ISS包含任何以下序列：GACGCTCC；GACGTCCC；

GACGTTCC；GACGCCCC；AGCGTTCC；AGCGCTCC；AGCGTCCC；

AGCGCCCC；AACGTCCC；AACGCCCC；AACGTTCC；AACGCTCC；

GGCGTTCC；GGCGCTCC；GGCGTCCC；GGCGCCCC；GACGCTCG；

GACGTCCG；GACGCCCG；GACGTTCG；AGCGCTCG；AGCGTTCG；

AGCGTCCG；AGCGCCCG；AACGTCCG；AACGCCCG；AACGTTCG；

AACGCTCG；GGCGTTCG；GGCGCTCG；GGCGTCCG；GGCGCCCG。

在一些实例中，ISS包含任何以下序列：GACGCT；GACGTC；

GACGTT；GACGCC；GACGCU；GACGUC；GACGUU；GACGUT；

GACGTU；AGCGTT；AGCGCT；AGCGTC；AGCGCC；AGCGUU；

AGCGCU；AGCGUC；AGCGUT；AGCGTU；AACGTC；AACGCC；

AACGTT；AACGCT；AACGUC；AACGUU；AACGCU；AACGUT；

AACGTU；GGCGTT；GGCGCT；GGCGTC；GGCGCC；GGCGUU；

GGCGCU；GGCGUC；GGCGUT；GGCGTU。

在一些实例中，免疫调节多核苷酸包含序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)。在其他实例中，ISS包含任何以下序列：

5’-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：2)；

5’-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3’(SEQ ID NO：3)；

5’-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO：4)；

5’-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3’(SEQ ID NO：5)；

5’-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO：6)，其中B为5-溴胞嘧啶；

5’-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：7)，其中B为5-溴胞嘧啶；和

5’-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3’(SEQ ID NO：8)，其中B为5-溴胞嘧啶。

ISS和/或含ISS的多核苷酸可包含修饰。ISS的修饰包括本领域已知的任何修饰，但不仅限于3’OH或5’OH基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖组分的修饰和磷酸基团的修饰。多种这类修饰在下文描述。

ISS可以是单链或双链DNA以及单链或双链RNA或其他被修饰的多核苷酸。ISS可以包括或不包括一个或多个回文区，其可存在于上述六聚体基序中或可延伸至该基序外。ISS可包含额外的侧翼序列，其中一些在文中描述。ISS可包含天然存在的或经修饰的、非天然存在的碱基，并可包含经修饰的糖、磷酸和/或末端。例如磷酸修饰包括但不仅限于甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酰胺(桥接或非桥接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并可使用任何组合。也可使用其他非磷酸酯键。在一些实例中，本发明的寡核苷酸包含硫代磷酸酯主链。也可以使用本领域已知的糖修饰和本文所述的其他糖修饰，并与任何磷酸修饰组合，所述糖修饰例如2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。碱基修饰的实例包括但不仅限于向ISS胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子部分(例如5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶)。

ISS可使用本领域公知的技术和核酸合成设备合成，所述方法包括但不仅限于酶促方法、化学方法以及较大寡核苷酸序列的降解。参阅例如Ausubel等(1987)和Sambrook等(1989)。当酶促组装时，可用连接酶如T4DNA或RNA连接酶将单个单元连接。美国专利No.5,124,246。寡核苷酸降解可通过使寡核苷酸接触核酸酶完成，如美国专利No.4,650,675中所述。

ISS还可使用常规多核苷酸分离操作进行分离。这类操作包括但不仅限于使探针与基因组或cDNA文库杂交以检测共享的核苷酸序列、对表达文库进行抗体筛选以检测共享的结构特征，以及通过聚合酶链式反应合成特定的天然序列。

可分离、通过重组方法合成或化学合成环状ISS。当通过分离或通过重组方法获得环状ISS时，在一些实例中ISS是质粒。更小环状寡核苷酸的化学合成可使用文献中描述的任何方法进行。参阅例如Gao等(1995)Nucleic Acids Res.23：2025-2029和Wang等(1994)Nucleic Acids Res.22：2326-2333。

用于制备寡核苷酸和经修饰寡核苷酸的技术为本领域已知。含有磷酸二酯键的天然存在的DNA或RNA通常如下合成：将合适的核苷亚磷酰胺与3’端附着在固相支持物上的正在延伸的寡核苷酸的5’羟基相继偶联，然后将中间体亚磷酸三酯氧化为磷酸三酯。一旦合成了所需寡核苷酸序列，则将所述寡核苷酸从支持物上移除，去保护磷酸三酯基团为磷酸二酯基团，并使用氨水或其他碱将核苷碱基去保护。参阅例如Beaucage(1993)“Oligodeoxyribonucleotide Synthesis”in Protocols for Oligonucleotides andAnalogs，Synthesis and Properties(Agrawal编)Humana Press，Totowa，NJ；Warner等(1984)DNA 3：401和美国专利No.4,458,066。

ISS还可包含磷酸酯经修饰的寡核苷酸。包含经修饰的磷酸酯键或非磷酸酯键的寡核苷酸的合成为本领域公知。综述参阅Matteucci(1997)“Oligonucleotide Analogs：an Overview”in Oligonucleotides as TherapeuticAgents，(DJ.Chadwick和G.Cardew编)John Wiley and Sons，New York，NY。可附着在本发明寡核苷酸的糖或糖类似物部分上的磷衍生物(或经修饰的磷酸基团)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。上述磷酸类似物的制备及其向核苷酸、经修饰的核苷酸和寡核苷酸中的掺入本身是已知的，并不需要在本文详细描述。Peyrottes等(1996)Nucleic Acids Res.24：1841-1848；Chaturvedi等(1996)Nucleic Acids Res.24：2318-2323；和Schultz等(1996)Nucleic Acids Res.24：2966-2973。例如硫代磷酸酯寡核苷酸的合成与用于天然存在寡核苷酸的合成类似，除了氧化步骤被硫化步骤替换外(Zon(1993)“OliognucleosidePhosphorothioates”in Protocols for Oliognucleotides and Analogs，Synthesisand Properties(Agrawal编)Humana Press，165-190页)。类似地也描述了其他磷酸类似物的合成，如磷酸三酯(Miller等(1971)JACS93：6657-6665)、非桥接亚磷酰胺(Jager等(1988)Biochem.27：7247-7246)、N3’至P5’亚磷酰胺(Nelson等(1997)JOC 62：7278-7287)和二硫代磷酸酯(美国专利No.5,453,496)。也可使用其他基于非磷修饰的寡核苷酸(Stirchak等(1989)Nucleic Acids Res.17：6129-6141)。带有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸与带有磷酸二酯主链的寡核苷酸相比可更具免疫原性，且在注射进宿主后显示更抗降解。Braun等(1988)J Immunol.141：2084-2089和Latimer等(1995)Mol.Immunol.32：1057-1064。

本发明使用的含ISS多核苷酸可包含核糖核苷酸(包含核糖作为唯一的或主要的糖组分)、脱氧核糖核苷酸(包含脱氧核糖作为主要的糖组分)或如本领域已知，经修饰的糖或糖类似物可掺入在ISS中。因此，除核糖和脱氧核糖之外，糖部分可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖“类似物”环戊基。糖可以是吡喃糖或呋喃糖的形式。在ISS中，糖部分在一些实例中为核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖的呋喃糖苷，并且糖可以以α或β异头构型附着于相应的杂环碱基。糖修饰包括但不仅限于2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。这些糖或糖类似物和相应的“核苷”(其中这类糖或类似物附着于杂环碱基(核酸碱基))的的制备本身已知，并不需要在本文描述，除非这类制备涉及任何特定实例。在ISS制备中也可进行糖修饰，并与任何磷酸修饰组合。

掺入在ISS中的杂环碱基或核酸碱基可以是天然存在的主要嘌呤和嘧啶碱基(如上所述，即尿嘧啶或胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤)，以及所述主要碱基天然存在的修饰和合成的修饰。

本领域技术人员会明白，只要满足了本发明的其他标准，可在本领域获得大量包含多种杂环碱基和多种糖部分(和糖类似物)的“合成的”非天然核苷，所述ISS可包括除天然存在核酸五种主要碱基组分外的一种或数种杂环碱基。然而在一些实例中，ISS中的杂环碱基包括但不仅限于尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基等基团，其中嘌呤通过9-位附着于ISS的糖部分，通过1-位附着于吡咯烷，通过7-位附着于吡咯并嘧啶，通过1-位附着于吡唑并嘧啶。

ISS可包含至少一个如上所述经修饰的碱基，如在共同拥有的美国专利No.6,562,798(USSN324,191)和国际申请WO99/62923中所述。如本文使用术语“经修饰的碱基”与“碱基类似物”同义，例如“经修饰的胞嘧啶”与“胞嘧啶类似物”同义。类似地，“经修饰的”核苷或核苷酸在本文定义为与核苷或核苷酸“类似物”同义。碱基修饰的实例包括但不仅限于向ISS胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子部分。在一些实例中，吸电子部分为卤素。这类经修饰的胞嘧啶可包括，但不仅限于氮杂胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、环胞嘧啶、胞嘧啶阿糖胞苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5，6-二氢胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羟基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、尿嘧啶和任何其他嘧啶类似物或经修饰的嘧啶。

碱基经修饰的核苷的制备，以及使用所述碱基经修饰的核苷作为前体合成经修饰的寡核苷酸已描述于例如美国专利4,910,300、4,948,882和5,093,232。这些碱基经修饰的核苷被设计为它们可通过化学合成掺入寡核苷酸的末端或内部位置。这类碱基经修饰的核苷(无论存在于寡核苷酸的末端或内部位置)可作为肽或其他抗原的附着位点。其糖部分经修饰的核苷也已描述(包括但不仅限于例如美国专利4,849,513、5,015,733、5,118,800、5,118,802)并可类似地使用。

在一些实例中，含ISS的多核苷酸短于约任何以下长度(碱基或碱基对)：10,000、5,000、2500、2000、1500、1250、1000、750、500、300、250、200、175、150、125、100、75、50、25、10。在一些实例中，含ISS的多核苷酸长于约任何以下长度(碱基或碱基对)：6、7、8、10、15、20、25、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、750、1000、2000、5000、7500、10000、20000、50000。在一些实例中，含ISS的多核苷酸为长于约6个碱基或碱基对长度且短于约200个碱基或碱基对长度。

具有多样化结构和免疫调节特性的缀合物分子群体

通常本发明和本文所述的缀合物分子的种类或群体可通过任何大量结构和/或功能特性来区分和/或定义，包括：

(a)与抗原附着或连接的含ISS多核苷酸的平均数量；

(b)与抗原附着或连接的含ISS多核苷酸的中位数；

(c)含ISS多核苷酸的平均质量与抗原平均质量的比率；

(d)含ISS多核苷酸中位质量与抗原中位质量的比率；

(e)(i)与(ii)的比率：(i)抑制抗原特异性抗体与抗原结合所需的ISS-抗原缀合物的浓度；(ii)以相同程度抑制抗原特异性抗体与抗原结合所需的抗原浓度(如下文所述，这些比率通常，但不必须在50％抑制时计算)；

(f)对于抗原是变应原的情况，(i)与(ii)的比率：(i)从抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放组胺所需的ISS-抗原缀合物浓度；(ii)从抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中以相同程度释放组胺所需的抗原浓度(如下文所述，这些比率可以在，但不必须在40％组胺释放时计算)；

(g)(i)与(ii)的比率：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1相关抗体和Th2相关抗体的总和；(ii)由抗原引发的Th1相关抗体和Th2相关抗体的总和；

(h)(i)与(ii)的比率：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1相关抗体；(ii)由ISS-抗原缀合物引发的Th2相关抗体；

(i)与抗原单独相比差异的细胞因子产生谱；

(j)抗原特异抗体制备的抑制程度。

本文所述的所有种类和实例可由上文所列特性中的一个、一个以上和/或任何组合描述和/或定义。因此，本发明提供包含结构稳定缀合物分子群体的组合物，所述缀合物分子包含抗原和一个或多个包含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸，其中所述群体包含任一个或任多个本文所述特性(单独或任意组合)。所述特性(包括比率)可使用本领域和本文所述的标准技术测量，并应理解任意的这些特性可以以多种体系测量，包括体内体系如脊椎动物和哺乳动物，包括例如小鼠和/或人。

例如，根据上文，并基于涉及Amb a1和含ISS 22聚体多核苷酸(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’，SEQ ID NO：1)的观察结果，“H”类由任意以下特性单独或任意组合定义：

(a)每抗原分子平均至少约5.5个含ISS多核苷酸，且在一些实例中为6个；

(b)(i)含ISS多核苷酸平均质量与(ii)抗原平均质量的比率为(i)约或可选地至少约35、40或45至(ii)约40。

(c)(i)与(ii)的比率为约3.5至约6.0或更多(包括但不仅限于7.0、8.0、9.0、10.0、15、20、25、30、35、40、45、50或更多)或可选地为至少约以下任一：3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10、15、20、25(如果表达为范围，则上限可以是任何数字，包括所列数字)：(i)抑制抗原特异性抗体与抗原结合50％所需的ISS-抗原缀合物浓度，(ii)抑制抗原特异性抗体与抗原的结合50％所需的抗原浓度；

(d)例如在抗原为变应原的情况中，(i)与(ii)的比率为大于约300、大于约500、大于约750、大于约1000、大于约1250、大于约1400、大于约1500(上限可以是任何数字，包括但不仅限于750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000)：(i)从来自抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放40％组胺所需的ISS-抗原缀合物浓度，(ii)从来自抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放40％组胺所需的抗原浓度；

(e)(i)与(ii)的比率约为以下任意或可选地小于约以下任意：10、7、5、4、3.5、3.0；2.5、2.0、1.5、1.0、0.75、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由抗原引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照所施用抗原的单位质量)。

(f)(i)与(ii)的比率约为以下任意或可选地小于约以下任意：1.0、0.7、0.6、0.5、0.4、0.35；0.3；0.25、0.2、0.15、0.11、0.075、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由抗原引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照与缀合物施用量相比所施用抗原的10倍单位质量)。

(g)(i)与(ii)的比率约为以下任意或可选地小于约以下任意：60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-相关抗体的效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由抗原引发的Th1-相关抗体的效价(按照与缀合物施用量相比所施用抗原的单位质量)；

(h)(i)与(ii)的比率约为以下任意或可选地大于约以下任意：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10。如果表达为范围，上限可以是包括所列的以及其他的任何数字，例如15、20、25、30、40、50、60、75、80、90、100：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-相关抗体的效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由缀合物引发的Th2-相关抗体的效价；

(i)与施用相同量未连接的含ISS多核苷酸和抗原比较，或与单独施用相同量的抗原比较，抑制抗原特异性抗体的产生(包括Th1-相关和/或Th2-相关抗体的产生)。

“M”类由以下任意特性单独或任意组合定义：

(a)每个抗原分子平均约3个至约5个含ISS多核苷酸；

(b)(i)含ISS多核苷酸平均质量与(ii)抗原平均质量的比率为(i)约20、约25、或约30至(ii)约40；

(c)(i)与(ii)的比率为约2.5至约3.0，或可选地约3.25：(i)抑制抗体与抗原结合50％所需的ISS-抗原缀合物浓度，(ii)抑制抗原特异性抗体与抗原结合50％所需的抗原浓度；

(d)例如当抗原为变应原时，(i)与(ii)的比率为约100至约200，或可选地约100，或可选地约为约75至约250：(i)从来自抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放40％组胺所需的ISS-抗原缀合物的浓度，(ii)从来自抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放40％组胺所需的抗原浓度，

(e)(i)与(ii)的比率为约13，或可选地为约10或约12至约100(或在一些实例中约12至约50)：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由抗原引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照所施用缀合物的单位质量)；

(f)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)与由抗原引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照与缀合物施用量相比所施用缀合物的10倍单位质量)的比率为约1.3，或可选地为约1.0或约1.2至约10(或在一些实例中约1.2至约5.0)；

(g)(i)与(ii)的比率约为约70至约500：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-相关抗体的效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由抗原引发的Th1-相关抗体的效价(按照与缀合物施用量相比所施用抗原的单位质量)；

(h)(i)与(ii)的比率为约2至约4：(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-相关抗体的效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由缀合物引发的Th2相关抗体的效价。

“L”类由以下任意特性单独或任意组合定义：

(a)每个抗原分子平均少于约3个含ISS多核苷酸；

(b)(i)含ISS多核苷酸平均质量与(ii)抗原平均质量的比率为(i)约15或可选地小于约15(在一些实例中为约10或可选地小于约10)至(ii)约40；

(c)(i)抑制抗原特异性抗体与抗原结合50％所需的ISS-抗原缀合物浓度与(ii)抑制抗原特异性抗体与抗原结合50％所需的抗原浓度的比率为小于约2.0，或可选地约2.0；

(d)例如当抗原为变应原时，(i)与(ii)的比率为小于约75，或可选地约75(在一些实例中小于约60，或可选地约60)至约200，或可选地至约100：(i)从来自抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放40％组胺所需的ISS-抗原缀合物的浓度，(ii)从来自抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放40％组胺所需的抗原浓度，

(e)(i)与(ii)的比率为约150，或可选地多于以下任意：100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800。如果表达为范围，则上限可以是任何数字，包括所列数字。其中(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由抗原引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照所施用缀合物的单位质量)。

(f)(i)与(ii)的比率约为以下任意或可选地大于约以下任意：10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80，其中(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由抗原引发的Th1-和Th2-相关抗体的总效价(按照与缀合物施用量相比所施用缀合物的10倍单位质量)；

(g)(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-相关抗体的效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)与(ii)由抗原引发的Th1-相关抗体的效价的比率为约500或以上，包括但不仅限于约500或以上，约600或以上，约700或以上，约800或以上，约900或以上，约1000或以上。如果表达为范围，则上限可以是任何数字，包括但不仅限于600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2500、3000、3500、400、4500、5000；

(h)(i)与(ii)的比率约为以下任意或可选地少于约以下任意：2.0、1.5、1.25，其中(i)由ISS-抗原缀合物引发的Th1-相关抗体的效价(按照每单位质量施用的缀合物所引发的抗体)，(ii)由缀合物引发的Th2相关抗体的效价。

根据本文描述可以清楚，应理解可产生任何大量的缀合物分子群体，并且“L”、“M”和“H”的分类是缀合物分子群体种类的几个实例。改变并控制缀合程度从而控制免疫应答调变类型的能力除本文所举例的这些外，扩展至其他群体。给定可容易测量的结构和功能特征后，建立任何大量群体充分落入本领域技术的范围。因此，本发明还包括由以下任何(单独或以任意组合)表征的缀合物群体：

(a)(i)抑制抗原特异性抗体与抗原结合50％所需的ISS-抗原缀合物浓度与(ii)抑制抗原特异性抗体与抗原的结合50％所需的抗原浓度的比率为大于约1.5、2.0、2.25、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.50、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0中任何。如果表达为范围，则上限可以是任何数字，包括所列数字(例如，缀合物群体可以是大于约2.0，大于约2.0且小于约5.5，大于约2.0且小于约20.0)。

(b)(i)抑制抗原特异性抗体与抗原结合50％所需的ISS-抗原缀合物浓度与(ii)抑制抗原特异性抗体与抗原的结合50％所需的抗原浓度的比率为小于约1.5、2.0、2.25、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.50、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0中任何。如果表达为范围，则下限可以是任何所列数字以及零(例如，缀合物群体可以是小于约5.0，或可选地小于约5.0且大于约2.0)。

(c)在抗原为变应原的情况中，(i)从来自抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放40％组胺所需的ISS-抗原缀合物浓度与(ii)从来自抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放40％组胺所需的抗原浓度的比率为至少约以下任意：2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、75、80、90、95、100、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000。如果表达为范围，则上限可以是包括所列的任何数字。可选地，该比率可以小于以下任意：2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、75、80、90、95、100、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000。如果表达为范围，则下限可以是任何所列数字以及零。

(d)每单位质量ISS-抗原缀合物所引发的抗体效价(更特别地，IgG效价，例如Th1-和Th2-相关的IgG效价总和)与每单位质量抗原所引发的抗体效价(更特别地，IgG效价，例如Th1-和Th2-相关的IgG效价总和)的比率为至少大于约以下任意：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、2、5、10、15、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1250、1500、2000、2250、2500、2750、3000。如果表达为范围，则上限可以是任何数字，包括所列数字。可选地，比率可以小于约以下任意：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1250、1500、2000、2250、2500、2750、3000。如果表达为范围，则下限可以是零或任何所列数字。

(e)缀合物引发的Th1-相关抗体效价与缀合物引发的Th2-相关抗体效价(每单位质量)的比率小于约以下任意：20、15、12、10、7、5、4.5、4.25、4.0、3.75、3.5、3.25、3.0、2.5、2.0、1.5、1.25、1.0、0.5。如果表达为范围，则下限可以是任何所列数字，包括零。可选地，该比率可以大于以下任意：0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、3.25、3.5、4.0、4.5、5.0。如果表达为范围，则上限可以是任何数字，包括所列数字。

(f)缀合物引发的Th1-相关抗体效价与抗原引发的Th1-相关抗体效价(每单位质量)的比率小于约以下任意：5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、150、100、50、75、60、50、40、45、30、35、25、20、14、10、5。如果表达为范围，则下限可以是任何所列数字，包括零。可选地，该比率可以大于约以下任意：10、20、50、60、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、800、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、3000、3500、4000、4500、5000。如果表达为范围，则上限可以是任何数字，包括所列数字。

缀合程度可以以多种方式控制，其均使用本领域公知的化学技术，并也描述于本文中。控制缀合程度的一种方式为改变ISS相对于抗原上连接位点的当量。即恒定数或量的连接位点与特定量的ISS反应。例如，对本文所例证的ISS-Amb aI缀合物分子而言，基于马来酰亚胺活化的Amb a1，4摩尔当量的5’硫代ISS、7摩尔当量的5’硫代ISS和17摩尔当量的5’硫代ISS与1摩尔当量的Amb a1反应，分别得到“L”、“M”和“H”群体。控制缀合程度的另一方式为用ISS饱和反应，并改变抗原上可用的连接位点的量。连接位点可通过例如选择提供期望数量连接位点的某一连接部分进行控制(例如，与氨基基团相反，选择通过糖类连接)，或可选地通过控制连接活化反应从而活化期望平均数的连接位点而进行控制。

通常，给定的抗原具有最大数量的可能连接位点，取决于抗原-ISS连接的性质。缀合的程度可通过这些用于连接ISS的连接位点的数量进行控制。因此，本发明还包括下述实例，其中附着于含ISS多核苷酸的连接位点的总数量平均百分比为至少约以下任意：5％、10％、20％、30％、33％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％。可选地，本发明还包括下述实例，其中附着于含ISS多核苷酸的连接位点的总数量平均百分比小于约以下任意：10％、20％、30％、33％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％。连接位点的总数量由附着模式决定。例如，如果抗原通过游离氨基基团(例如赖氨酸)与含ISS多核苷酸连接，则连接位点的总数量为赖氨酸的数量。如果抗原通过巯基(例如通过半胱氨酸)连接，则连接位点的总数量为游离巯基基团的总数量。如果抗原通过糖类部分连接，则连接位点的总数量为糖类部分的总数量。就任何这些实例而言，附着于含ISS多核苷酸的连接位点平均百分比可伴随上文所列任何免疫调节特征(单独或组合)。

ISS-抗原缀合物分子种类的表征

缀合物分子群体可通过任何大量方式鉴定和/或表征，包括上文所列方式。例如，就结构而言，缀合的程度可由以下描述：(a)相对于抗原分子的ISS平均数或可选的中位数；(b)ISS与抗原总连接位点的比率；(c)ISS质量(均值或中位数)对抗原质量(均值或中位数)的比率；(d)ISS与抗原T细胞表位的比率；(e)ISS与抗原B细胞表位对比率。就功能(其包括但不仅限于免疫调节)而言，本发明的缀合物分子群体可由以下表征：(a)抗原特异性抗体应答如IgG应答的程度；(b)Th1-相关抗体与Th2-相关抗体的比率；(c)组胺释放抑制程度；(d)与抗原特异性抗体竞争结合抗原的程度；(e)Th2-相关免疫应答抑制程度；(f)Th1-相关细胞因子如干扰素的分泌；(g)Th2-相关细胞因子如IL-4和/或I1-5的分泌。

结构表征

ISS-抗原缀合的程度可使用本领域已知的任何大量蛋白质和核酸测量方法确定。例如，抗原和/或蛋白质特异性检测技术(例如抗原特异性抗体和/或考马斯亮蓝染色)和核酸特异性检测技术(例如用可检测标记的DNA探针杂交)可用于分析缀合反应产物。使用合适的定量标准，可确定相对于抗原的多核苷酸量。

与多肽结合的寡核苷酸量也可通过测量缀合物大小或分子量确定。缀合物分子大小可使用本领域已知方法确定，所述方法包括但不仅限于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析和尺寸排阻层析(SEC)。

ISS-抗原缀合物分子可使用尺寸确定和/或分离技术及核酸和蛋白质确定技术进行分析。例如使用SEC将缀合物分子反应产物分级后，各级分的蛋白质与核酸含量可分别通过所述级分在280nm和260nm的吸光度确定。以此种方式可将缀合物分子尺寸和核酸与蛋白质检测分析的结果组合以表征缀合物分子的结构。各缀合物级分中多核苷酸量与蛋白质量的比率指示每抗原分子的ISS分子平均数。

功能表征

本领域已知的多种方法可用于确定响应ISS-抗原缀合物分子施用而产生的抗原特异性和抗体种类和/或抗体亚类。例如，标准ELISA型测定法可用于检测并测量响应多种ISS-抗原缀合物分子而产生的抗体的量、特异性和/或类型。在这类测定法中，例如抗原附着于基质上，并与来自ISS-抗原缀合物分子处理个体的血清孵育。然后使用抗体特异性试剂(如特异于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE等的抗体)确定附着于基质结合抗原的抗原特异性抗体量。

本领域已知的方法可用于确定抑制抗原特异性抗体与抗原结合所需的ISS-抗原缀合物分子浓度，如本文所述的竞争性ELISA测定法。

本领域已知的方法可用于测量响应ISS-抗原缀合物分子而从抗原致敏个体嗜碱性粒细胞中释放的组胺量。例如，如本文所述，释放至细胞培养物上清液的组胺量可在用不同浓度和/或制品的ISS-抗原缀合物分子处理来自变应性个体血液的白细胞后确定。

本领域已知的方法可用于确定响应ISS-抗原缀合物分子施用而产生的细胞因子产生谱。例如，用ISS-缀合物分子体外处理的细胞的上清液用于分析细胞因子的存在。由接触ISS-抗原缀合物分子的淋巴细胞所产生的细胞因子量可使用标准ELISA型测定法测量。响应ISS-抗原缀合物分子而产生的细胞因子谱也可使用标准细胞因子生物测定法确定，所述方法包括但不仅限于其中细胞存活依赖于特定细胞因子(例如IL-2)存在的方法，和其中特定细胞因子(例如干扰素)抑制病毒复制的方法。

缀合物分子类别也可表征为施用后或相对于单独施用抗原而言抗原特异性抗体抑制的程度。例如血清抗体水平可在施用ISS-抗原缀合物分子和/或单独施用抗原之前和之后确定。然后可将多个时间点的抗体水平比较以确定抗体抑制的程度。

缀合物分子类别也可表征为抗体应答(在一些实例中为抗原特异性抗体应答，特别是IgG应答)的程度。如上所述，类别可以表征为(i)应答缀合物分子而产生的IgG抗体与(ii)应答单独的抗原而产生的IgG抗体的比率。对这些特征和实例而言，所述比率可以是

(i)由ISS-抗原缀合物分子引发的Th1-相关抗体和TH2-相关抗体的总和比(ii)由抗原引发的Th1-相关抗体和Th2-相关抗体的总和；

(ii)(i)由ISS-抗原缀合物分子引发的一种或多种Th1-相关抗体比(ii)由抗原引发的TH1-相关抗体；

(iii)(i)由ISS-抗原缀合物分子引发的一种或多种Th2-相关抗体比(ii)由抗原引发的TH2-相关抗体；

Th1-相关抗体是与Th1应答相关的抗体。例如在小鼠中，IgG2a与TH1应答相关。在人中，IgG1和/或IgG3抗体显示与Th1应答相关。参阅例如Widhe等(1998)Scand.J.Immunol.47：575-581和de Martino等(1999)Ann.Allergy Asthma Immunol.83：160-164。相似地，Th2-相关抗体为与Th2应答相关的抗体。在小鼠中，IgG1与Th2应答相关。在人中，IgG2和/或IgG4显示与Th2应答相关(Widhe等(1998)和de Martino等(1999))。在人和小鼠二者中，IgE均与Th2应答相关。应当理解对于这些特征和实例而言，可以评价任何一种或多种类型的抗体，只要相同的抗体或抗体生产水平与由抗原单独引发的相比即可。

一种计算该比率的方式是按照每单位质量缀合物分子所产生的一种或多种目的抗体的量与每单位质量抗原所产生的一种或多种相同抗体的量相比。所述缀合物分子的单位质量可以按照缀合物分子抗原组分、缀合物分子多核苷酸组分的质量和/或缀合物分子的质量。例如，如果缀合物分子具有100的总分子量，其中抗原组分占80而ISS组分占20，则用于计算和比较抗体生产水平的单位质量可以是100、80或20中的任意。在实施例提供的计算中，缀合物分子中抗原组分(Amb a1)的质量作为计算和比较抗原生产水平的基础与单独抗原进行比较。

另外，计算由缀合物分子产生的抗体与由抗原产生的抗体的比率时，缀合物分子的质量比抗原的质量可以是或不是1∶1。例如在一些实例中，由单位质量缀合物分子产生的抗体与2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、40倍抗原质量中任意所产生的抗体相比。例如在Amb a1情况下，1μg缀合物分子所产生的抗体(如通过抗原量所测量的；因此是缀合物分子中的1μg抗原)与10μgAmb a1所产生的抗体相比较。

ISS-抗原缀合

在本文所述组合物的一些实例中，含ISS多核苷酸与抗原缀合。ISS部分可以与缀合物分子的抗原部分以多种方式(包括共价和/或非共价相互作用)偶联。

各部分间的连接可以在ISS的3’或5’端，或在ISS内部位置经适当修饰的碱基上进行。如果抗原是肽，并含有合适的反应性基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)，其可与胞嘧啶残基的N⁴氨基基团直接反应。根据ISS中胞嘧啶残基的数量和位置，可实现一个或多个残基上的特异性偶联。

可选地，经修饰的寡核苷(例如本领域所已知的)可以掺入ISS中的任一端或内部位置。这些可含有被封闭的官能团，在去封闭后可与多种官能团反应，后者可以存在于或附着于目的抗原上。

当抗原为肽时，缀合物分子的该部分可以通过固相支持物化学附着于ISS的3’端。例如，ISS部分可以被添加在已预先在支持物上合成的多肽部分上。Haralambidis等(1990a)Nucleic Acids Res.18：493-499和Haralambidis等(1990b)Nucleic Acids Res.18：501-505。可选地，可合成ISS，使其通过从3’端延伸的可切割接头附着于固相支持物。将ISS从支持物上化学切割后，寡核苷酸3’端留下端巯基(Zuckermann等(1987)Nucleic Acids Res.15：5305-5321和Corey等(1987)Science 238：1401-1403)或寡核苷酸3’端留下端氨基(Nelson等(1989)Nucleic Acids Res.17：1781-1794)。经氨基修饰的ISS与肽氨基的缀合可以如Benoit等(1987)Neuromethods 6：43-72中所述进行。经巯基修饰的ISS与肽羧基的缀合可如Sinha等(1991)，185-210页，Oligonucleotide Analogues：A PracticalApproach，IRL Press中所述进行。带有附加的马来酰亚胺的寡核苷酸与肽半胱氨酸残基的巯基侧链的偶联也已被描述。Tung等(1991)Bioconjug.Chem.2：464-465。

缀合物分子的肽部分可通过在其合成期间掺入寡核苷酸的氨基、巯基或羧基附着于ISS的5’端。在一些实例中，当寡核苷酸被固定在固相支持物上时，将一端上包含被保护的氨基、巯基或羧基而另一端上包含亚磷酰胺的连接基团共价附着在5’羟基上。Agrawal等(1986)Nucleic Acids Res.14：6227-6245；Connolly(1985)Nucleic Acids Res.13：4485-4502；Kremsky等(1987)Nucleic Acids Res.15：2891-2909；Connolly(1987)Nucleic AcidsRes.15：3131-3139；Bischoff等(1987)Anal.Biochem.164：336-344；Blanks等(1988)Nucleic Acids Res.16：10283-10299和美国专利No.4,849,513、5,015,733、5,118,800和5,118,802。脱保护后，氨基、巯基和羧基官能团可用于将寡核苷酸与肽共价附着。Benoit等(1987)和Sinha等(1991)。

ISS-抗原缀合物分子也可通过非共价相互作用形成，例如离子键、疏水性相互作用、氢键和/或范德华引力。

非共价连接的缀合物分子可包括非共价相互作用，例如生物素-链亲和素复合物。生物素基团可以附着在例如ISS经修饰的碱基上。Roget等(1989)Nucleic Acids Res.17：7643-7651。链亲和素部分掺入肽部分，能够形成链亲和素缀合肽与生物素化寡核苷酸之间非共价键合的复合物。

非共价缔合也可通过涉及ISS和抗原内残基(例如带电氨基酸)的离子相互作用发生，或通过包含带电残基的接头部分(其可与寡核苷酸和抗原二者均相互作用)发生。例如，非共价缀合可在通常带负电荷的ISS和肽中带正电荷的氨基酸残基(例如多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚组氨酸残基)之间发生。

ISS和抗原之间的非共价缀合可通过分子的DNA结合基序发生，所述DNA结合基序与它们的天然配体DNA相互作用。例如，这类DNA结合基序可发现于转录因子和抗DNA抗体中。

ISS与脂质的连接可使用标准方法形成。这些方法包括，但不限于寡核苷酸-磷脂缀合物分子(Yanagawa等(1988)Nucleic Acids Symp.Ser.19：189-192)、寡核苷酸-脂肪酸缀合物分子(Grabarek等(1990)Anal.Biochem.185：131-135和Staros等(1986)Anal.Biochem.156：220-222)和寡核苷酸-固醇缀合物分子的合成。Boujrad等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5728-5731。

寡核苷酸与寡糖的连接可使用标准的已知方法形成。这些方法包括，但不限于寡核苷酸-寡糖缀合物分子的合成，其中寡糖为免疫球蛋白的部分。O’Shannessy等(1985)J.Applied Biochem.7：347-355。

环状ISS与肽或抗原的连接可以以数种方式形成。环状ISS使用重组或化学方法合成时，经修饰的核苷是合适的。Ruth(1991)，255-282页，inOligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，IRL Press。然后可使用标准的连接技术将环状ISS与抗原或其他肽连接起来。Goodchild(1990)Bioconjug.Chem.1：165。环状ISS是被分离或使用重组或化学方法合成时，连接可通过化学激活或光激活反应基团(例如卡宾、基团)而形成，所述反应基团已掺入抗原或其他肽中。

用于肽和其他分子与寡核苷酸附着的其他方法可见于美国专利No.5,391,723；Kessler(1992)“Nonradioactive labeling methods for nucleicacids”in Kricka(编)Nonisotopic DNA Probe Techniques，Academic Press；和Geoghegan等(1992)Bioconjug.Chem.3：138-146。

包含缀合物分子的试剂盒

本发明还提供包含组合物的试剂盒，所述组合物包含结构稳定的缀合物分子和如本文所述的任意一种或多种额外的组分，包括但不限于：能够将组合物的pH范围维持在约6.0至约9.0的组合物，氨基酸，糖类，表面活性剂和/或其他可药用载体。试剂盒可包括含有这类组合物的制品，其中所述组合物可以是液体或冻干形式。在一些实例中，制品包含含有缀合物分子的组合物，其中所述组合物在约2℃和约8℃的温度包含多于约70％、多于约80％、多于约90％、多于约95％或多于约97％的非聚集体形式的缀合物分子。在一些其中制品包含含有变应原的组合物的实例中，试剂盒可包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种包含所述组合物的制品。在一些实例中，变应原为Amb a1。在一些实例中，通过RALS测量聚集。在其他实例中，制品包含含有缀合物分子的液体组合物，而在其他实例中包含含有缀合物分子的冻干组合物。又在其他实例中，制品包含含有缀合物配偶体的重构液体组合物(即从冻干的组合物重构)。本发明的试剂盒可任选的含有它们的使用说明书(例如本文所述任意方法的说明)和/或任何其他合适的组分。

包含缀合物分子的组合物的使用和制备方法

本发明还包括包含结构稳定的缀合物分子的组合物的制备和使用方法。如本文所述的包含结构稳定缀合物分子的组合物对向需要免疫调节的个体(在上下文中为例如传染性疾病、癌症和/或变态反应)施用特别有用。因此，本发明提供包含结构稳定的缀合物分子的药物组合物。方法通常包括：将如本文所述的包含结构稳定缀合物分子或缀合物分子群体的组合物以足以在个体中调节免疫应答的量施用给个体。在一些实例中，调节免疫应答的方法包括施用包含缀合物分子的组合物，从而实现期望的免疫应答调节。免疫应答的评估已在上文描述。在一些实例中，试剂盒包含含有组合物的制品，所述组合物包含约0.1μg至约200μg范围的结构稳定的AIC。在其他实例中，组合物包含至少约10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg或100μg和至多约110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg或200μg范围的AIC。在一些实例中，组合物包含约30μg至约60μg范围的AIC。

本文提供了用于在个体中调节免疫应答的方法，包括向个体施用包含结构稳定缀合物分子的组合物的步骤。在一些实例中，缀合物分子包含变应原，而在其他实例中，缀合物分子包含Amb a1。又在其他实例中，缀合物分子为AIC。在一些实例中，组合物包含AIC和能够将组合物的pH范围维持在约6.0至约9.0的组分，并可额外含有以下任意一种或多种：1)氨基酸；2)糖类；3)表面活性剂，或4)其他可药用载体，只要组合物的AIC结构稳定即可。

在一些实例中，本发明提供在个体中调节免疫应答的方法，所述方法包括向个体以足以调节免疫应答的量施用包含本文所述任何缀合物分子或缀合物分子群体的组合物。一般地，个体需要或将需要这类调节是因为例如疾病状态或处于发展疾病状态的风险中。疾病状态的实例包括，但不限于变态反应、癌症、传染性疾病(例如病毒或细菌感染)。在一些实例中，疾病状态为变态反应。

在一些实例中，免疫调节包括刺激(即一种或多种)Th1相关的细胞因子，例如干扰素-γ。在一些实例中，免疫调节包括抑制(即一种或多种)Th2相关细胞因子的产生，例如IL-4和/或IL-5。这些参数的测量使用本领域标准的和上文已讨论的方法。

在一些实例中，产生一种(或多种)Th1-相关的细胞因子，而抑制抗原特异性抗体的产生。这些参数的测量使用本领域标准的和上文已讨论的方法。

在一个实例中，免疫调节免疫调节包括刺激(即一种或多种)Th1-相关的细胞因子例如干扰素-γ并抑制抗原特异性抗体的产生。关于多种缀合物分子群体抑制抗原特异性抗体产生(包括Th1-相关抗体产生以及Th1-和Th2-相关抗体产生的组合)的程度已在上文描述并适用于这些方法。

在一些实例中，免疫调节包括抑制组胺释放。关于多种缀合物分子群体抑制组胺释放的程度已在上文描述并适用于这些方法。

在一些实例中，抑制个体中抗体形成(优选抗原特异性抗体形成)同时刺激Th1-相关细胞因子产生的方法包括向个体施用包含H类ISS-抗原缀合物分子群体的组合物，从而抑制抗体合成同时刺激Th1-相关的细胞因子。这些参数的测量使用本领域标准的和上文已讨论的方法。

在一些实例中，本发明提供治疗个体变态反应状态的方法，所述方法包括以足以改善或缓和变态反应状态(通常通过调节针对抗原的免疫应答)的量，施用包含本文所述结构稳定缀合物分子或缀合物分子群体的任何组合物，其中抗原为变应原。缓和可通过例如减轻一种或多种与变态反应相关的症状来确定。

本发明还提供了用于降低抗原(特别是变应原)的变应原性的方法，包括向有需要的个体施用包含本文所述结构稳定缀合物分子的组合物，从而降低变应原性。在一些实例中，缀合物分子为AIC。

一般地，可用于具体应用的包含结构稳定缀合物分子的组合物的施用途径对于本领域技术人员是显而易见的。施用途径包括，但不限于血管内(动脉或静脉)、皮下、腹膜内、器官内、肌内、口、经粘膜、表皮、肠胃外和胃肠等。对体外或离体施用而言，化合物可在细胞和/或器官的培养基内作为单次大剂量(single bolus)、通过重复添加、通过持续输注等形式提供。

对于施用而言，组合物可以便利地以单位剂型存在，并可以通过制药领域公知的任何方法制备。这类方法包括将缀合物分子或缀合物分子群体与本文所述的组分缔合的步骤。为了确定缀合物分子用于任何应用的最适浓度，可以使用常规技术。组合物可包括水性和非水性等渗无菌注射液，其可含有抑菌剂和使得组合物与目的受体的血液等渗的溶质，只要所述组合物中缀合物分子保持结构稳定即可。如果包含结构稳定缀合物分子的组合物作为气雾剂提供，可将本领域已知的推进剂添加至液体组合物中。

上述组合物和施用方法旨在描述而非限制本发明的方法和组合物。制备多种组合物的方法和设备落入本领域技术人员的能力范围，在此不做详细描述。

本发明还提供了包含结构稳定缀合物分子的组合物的制备方法，所述方法包括本文所述的任何技术和/或步骤。因此，本文提供了包含结构稳定缀合物分子的组合物的制备方法，所述方法包括将缀合物分子与能够将pH范围维持在约6.0至约9.0的组分组合。这类组分在本文描述。在一些实例中，包含结构稳定缀合物分子的组合物的制备方法还包括将缀合物分子与以下任意一个或多个以任意顺序组合：1)如本文所述的氨基酸；2)如本文所述的糖类；3)表面活性剂；和4)可药用载体，只要所述缀合物分子保持结构稳定即可。本发明还提供冻干组合物的制备方法，所述方法包括将包含结构稳定缀合物分子的液体组合物冻干的步骤。本发明还提供了重构组合物的制备方法，包括重构冻干的组合物。

提供以下实施例用于举例说明而非限制本发明。根据上述描述和附图，除本文所述以外的多种本发明的修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。这类修饰旨在落入所附的权利要求书的范围内。

实施例

实施例1：AIC-L、AIC-M或AIC-H的制备

Amb a1-ISS寡核苷酸缀合物(AIC)是通过纯化的短豚草抗原Amb a1与硫代磷酸酯免疫刺激(ISS)寡核苷酸共价连接而制备的蛋白质-寡核苷酸缀合物。Amb a1在2-8℃通过提取和硫酸铵沉淀从花粉中分离。粗提取物在室温通过两步层析步骤加工。Amb a1通过DEAE琼脂糖快速流动阴离子交换层析随后通过丁基琼脂糖快速流动疏水相互作用层析纯化。

交联通过杂双官能接头磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC)进行。sSMCC在ISS寡核苷酸和Amb a1之间产生了稳定的酰胺和硫醚键。AIC具有每摩尔Amb a1约4.0摩尔ISS寡核苷酸的均值，并具有约65kDa的平均分子量。Amb a1抗原(分子量约37,800Da)使用标准化学和层析技术从脱脂的短豚草花粉(Ambrosiaartemisiifolia)中纯化。纯化后用N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)封闭游离的Amb a1巯基。然后用s-SMCC活化被封闭的蛋白质。在pH7.2处，Amb a1氨基与s-SMCC的琥珀酰亚胺酯专一反应形成稳定的酰胺键，得到马来酰亚胺活化的Amb a1。与Amb a1活化反应同时进行的是，用三-(2-羧乙基)氯化膦(TCEP)还原5’二硫化ISS寡核苷酸产生5’硫代ISS寡核苷酸。被活化的Amb a1马来酰亚胺基团与5’硫代ISS寡核苷酸的巯基反应形成稳定的硫醚键，将Amb a1与ISS共价连接并产生AIC。AIC通过Superdex HR 200凝胶过滤层析纯化。含有免疫刺激六聚体基序5’-AACGTT的5’二硫化ISS寡核苷酸具有5’-二硫化-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’的序列。理论分子量为约7500Da。

AIC-L、AIC-M和AIC-H是豚草变应原Amb a1与含ISS多核苷酸5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)的共价缀合物分子。所有三类缀合物分子由相同的含ISS多核苷酸使用相同的在双官能接头制备。与Amb a1缀合的寡核苷酸数量能够区分类别。与Amb a1结合的寡核苷酸量可通过测量缀合物分子的尺寸或分子量来确定。AIC-L含有每个Amb a1分子2-3个寡核苷酸的均值，AIC-M为3.5到4.5的均值，AIC-H含有＞5.5的均值。这三类AIC具有所述的不同生物特性。

制备和分离5’硫代ISS寡核苷酸

5’二硫化ISS寡核苷酸在可控多孔玻璃支持物(CPG)上使用自动化合成仪作为硫代磷酸酯合成。所需的序列使用脱三苯甲基、偶联、氧化和加帽的标准β-氰乙基亚磷酰胺“DMT off”步骤装配。HSP过程产生冻干的5’-二硫化ISS寡核苷酸作为HSP释放的主要药物。

使三羧乙基膦(TCEP)达到室温并溶解在10mM NaPO₄/141mMNaCl/pH7.2中。使5’二硫化ISS寡核苷酸达到室温，溶解在相同缓冲液中，并在40℃用TCEP溶液处理2小时。对该材料直接进行分离步骤。

两个预先装好的脱盐柱串联连接，并用10mM NaPO₄/141mMNaCl/pH7.2缓冲液平衡。将5’二硫化ISS寡核苷酸还原混合物上样至柱，并对5’硫代ISS寡核苷酸进行等度(isocratically)洗脱。

马来酰亚胺活化的Amb a1的制备和分离

使N-乙基马来酰亚胺(NEM)达到室温并搅拌溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。将Amb a1融化并用NEM溶液在20℃处理2小时。使磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC)达到室温并溶解在DMSO中。经NEM封闭的Amb a1在20℃用sSMCC溶液处理2.5小时。对该材料直接进行分离步骤。两个预先装好的脱盐柱串联连接，并用10mM NaPO₄/141mM NaCl/pH7.2缓冲液平衡。将Amb a1活化混合物上样至柱，并对马来酰亚胺活化的Amb a1进行等度洗脱。

AIC-L、AIC-M或AIC-H的制备和分离

将4摩尔当量5’硫代ISS寡核苷酸与1摩尔当量马来酰亚胺活化的Amb a1的混合物在20℃孵育3小时，制备粗AIC-L缀合物分子。粗AIC-M和AIC-H以类似方式制备，但是分别添加7和17摩尔当量的5’硫代ISS寡核苷酸。用10mM NaPO₄/141mM NaCl/pH7.2缓冲液平衡预先装好的凝胶过滤柱，并将粗AIC-L、AIC-M或AIC-H上样至柱。AIC用10mMNaPO₄/141mM NaCl/pH7.2缓冲液等度洗脱。

实施例2：包含AIC组合物的稳定性曲线

设计实验，将组合物中缀合物分子AIC(每Amb a1为3至5个ISS的比率)可能的结构改变作为pH、温度、时间和组合物条件(例如离子强度和表面活性剂的存在)的函数测定。研究在约2℃至约8℃的温度(实时稳定性)和升高的温度(促进稳定性)进行。设计实验，以比较冷冻贮存在＜-60℃、含10mM磷酸钠、141mM氯化钠、pH7.2(PBS)的组合物中AIC的结构稳定性，以及液体贮存在2-8℃、含20mM组氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖、pH7.5(HGS)的组合物中AIC的结构稳定性。所述含PBS和HGS的组合物使用完全释放试验分析，并使用体外组氨酸释放试验分析额外的特征。证明了对于贮存在2-8℃、HGS制剂中的AIC而言有至少六个月的实时稳定性。对PBS中的AIC而言，所述AIC通过将AIC稀释进10mM磷酸钠、141mM氯化钠pH7.2(PBS)的组合物中，然后无菌过滤制备，并在＜-60℃冷冻贮存。PBS中AIC的实时稳定性研究表面，当贮存于＜-60℃时至少有24个月的稳定性。选择＜-60℃贮存温度是因为促进稳定性研究揭示：在PBS中液体贮存于2-8℃时，AIC药物产物随时间发生聚集。通过尺寸排阻层析(SEC)法评估，该聚集导致12个月中AIC单体含量下降约30％。通过鼠IgG2a抗体(描述于本文)产生测定，至多33％的聚集体不导致效价降低。使用SEC方法用于表征在＜-60℃和2-8℃贮存于PBS中的AIC的结果显示在下表2和表3中。

表2

10mM磷酸钠、141mM氯化钠、pH7.2中的30μg/ml AIC

在＜-60℃和2-8℃的稳定性

贮存月数	SEC测定的AIC单体百分比
				2-8℃	＜-60℃
0	95	95
			1	91	97
2	88	93
			3	84	93

6	82	96
			9	79	96
12	67	93
			18	70	94
24	71	97

表3

10mM磷酸钠、141mM氯化钠、pH7.2中的60μg/ml AIC

在＜-60℃和2-8℃的稳定性

贮存月数	SEC测定的AIC主峰纯度百分比
				2-8℃	＜-60℃
0	94	94
			1	88	95
2	87	96
			3	85	97
6	44	95
			9	68	94
12	64	94
			18	67	95
24	65	95

包含AIC的液体组合物稳定性曲线显示带负电荷的组分使AIC不稳定，导致推测的构象变化和聚集。PBS制剂中的磷酸钠和氯化钠均促成AIC的聚集。额外的稳定性曲线导致开发出含有20mM组氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖，pH7.5(HGS)的AIC组合物，其在2-8℃是结构稳定的液体。与PBS组合物中的AIC相比，对HGS中AIC的促进研究显示在20-22℃的最小AIC单体丧失。对贮存于＜-60℃和2-8℃的AIC使用SEC方法的结果显示在下表4和表5中。

表4

20mM组氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖，pH7.5中的30μg/ml AIC

在20-22℃和2-8℃的稳定性

贮存月数	通过SEC测定的AIC主峰纯度百分比
				2-8℃	20-22℃
0	97	97
			1	95	92
3	97	90
			6	93	93

表5

10mM磷酸钠、141mM氯化钠、pH7.2中的30μg/ml AIC

在20-22℃和2-8℃的稳定性

贮存月数	通过SEC测定的AIC主峰纯度百分比
				2-8℃	20-22℃
0	98	98
			1	95	52
3	89	25
			6	77	11

对贮存于2-8℃、HGS中AIC的实时稳定性研究证明了至少2个月的稳定性，没有显著的聚集体形式。对于2-8℃贮存和23-27℃促进的AIC使用SEC方法的结果显示在下表6和表7中。

表6

20mM组氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖，pH7.5中的30μg/ml AIC

在23-27℃和2-8℃的稳定性

贮存月数	通过SEC测定的AIC主峰纯度百分比
				2-8℃	23-27℃
0	95	95
			1	93	91
2	93	87

表7

20mM组氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖，pH7.5中的60μg/mlAIC

在23-27℃和2-8℃的稳定性

贮存月数	通过SEC测定的AIC主峰纯度百分比
				2-8℃	23-27℃
0	95	95
			1	93	91
2	93	88

实施例3：PBS或HGS中AIC的活性：鼠IgG2a活性

鼠IgG2a活性

AIC的生物活性由在BALB/c小鼠中产生Amb a1特异性IgG2a应答的能力确定。用1μg剂量的AIC以两周间隔在来自Jackson Labs的12周龄雌性BALB/c小鼠的尾部皮内免疫两次(10只小鼠/组)。Amb a1特异性IgG2a效价通过ELISA从第二次免疫后两周收集的血清测定。用磷酸盐缓冲液中1μg/ml的Amb a1在4℃包被Nunc Maxisorp 96-孔板过夜，洗涤并封闭。将血清稀释液上样在平板上并在4℃孵育过夜。Amb a1IgG2a抗体使用生物素化的山羊抗小鼠IgG2a缀合物分子检测。用链亲和素-HRP缀合物分子处理后，用3，3’，5，5’四甲基联苯胺使平板显影。在ELISA平板读数器上测定A₄₅₀。效价被测定为给出0.5 A₄₅₀的血清稀释液的倒数。10mM磷酸钠、141mM氯化钠、pH7.2中的30μg/ml AIC的IgG2a活性(效价)＝112,356，而20mM组氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖(HGS)，pH7.5中的30μg/ml AIC的IgG2a活性(效价)＝69,705。10mM磷酸钠、141mM氯化钠、pH7.2中的60μg/ml AIC的IgG2a活性(效价)＝64,422，而HGS中60μg/mlAIC的IgG2a活性(效价＝58,057)。

实施例4：PBS或HGS中AIC的变应原性：组胺释放

除了实施例3中所述的对AIC进行的测试外，还对HGS和PBS中AIC进行体外表征。具体地，使用体外组胺释放测定测试这些组合物的变应原性。使用体外组胺释放测定将PBS和HGS中AIC的变应原性与Amba1比较。在该测定中，从豚草变态反应患者的血液中制备白细胞。这些细胞与0.0001至1.0μg/ml浓度范围的Amb a1或AIC一起孵育45分钟。然后通过离心沉淀细胞，并通过自动化荧光仪分析上清液的组胺含量。100％组胺释放通过用2％HCIO₄裂解细胞来测定。结果显示在表8中。结果以术语HR₄₀表达，其定义为诱导人细胞释放40％组胺所需的样品(Amb a1或AIC，单位μg/ml)浓度。结果显示两种组合物中的AIC具有相当的被降低了的诱导组胺释放的能力，两种组合物的HR₄₀范围比Amb a1高59到46倍(诱导组胺释放需要59到46倍的更多AIC)。两种组合物变应原性均显著地小于未缀合的Amb a1。

表8

由Amb a1和AIC诱导的人白细胞的组胺释放(HR₄₀)^a

患者	测试材料浓度(μg/ml)
				Amb a1对照	AIC(HGS)	AIC(PBS)
	1234	0.000250.0001750.000270.00035	0.00350.00350.020.0045				0.0060.00350.0270.009

56中值标准差	0.000550.0010.00046±0.00030	0.10.030.027±0.037	0.050.030.021±0.018
				AIC：Amb a1比率	-	59	46

(HR₄₀)^a——诱导40％组胺释放所需的Amb a1或AIC浓度

实施例5：PBS和HGS中AIC的稳定性研究

本发明人发现缀合物分子的结构稳定性取决于温度、盐和pH条件。本发明人已发现当以液体贮存于2-8℃包含磷酸钠和氯化钠的组合物中时，包含抗原的缀合物分子随时间发生聚集。不受理论束缚，认为由于缀合物分子中因ISS的存在所致的负电荷，期望包含非负电荷组分或具有中性电荷的组分或非极性组分的组合物来维持组合物中存在的缀合物分子的结构稳定性。多种组合物中包含变应原Amb a1变应原的缀合物分子的结构稳定性使用如本文所述的IF、EF RALS、HPLC-SEC、SDS PAGE表征。

材料和方法

IF、EF和RALS方法

内源荧光(IF)测量由应激诱导的构象变化所产生的色氨酸环境的可能改变。虽然应激相关的结构改变效应可以是非常微妙的，并通过检测色氨酸(Trp)和/或酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)内源荧光(IF)的可能改变来检测，但是在在大部分缀合物分子中，极性敏感的Trp荧光在所有的内源荧光团中占主导地位。当分子经受应激环境改变时，该依赖于极性的荧光敏感性可用于监测构象改变。对环境敏感的残基对溶剂可及性、pH以及相邻侧链的接近性等敏感。因此纯色氨酸在极性环境中具有355nm的发射最大值，在非极性环境中具有305nm的发射最大值。因此，强度比率(高/低)可提供有关外界刺激的解折叠/结构应答信息。另外，使用比率能够消除由AIC浓度差异和仪器改变引起的不准确性。在IF中，比率越高，分子越是解折叠(Trp残基与更具极性的环境接触)。

外源荧光(EF)使用外部非共价极性敏感的荧光探针如ANS(8-苯胺基-萘磺酸)，以探测缀合物分子疏水结构域的表观接触(apparent exposure)，并探测该参数作为多种环境应激和条件函数的可能改变。对缀合物分子上疏水结构域具有亲和力的荧光探针可补充内源荧光。由多种溶液应激诱导的AIC或其他缀合物分子改变可导致这类探针结合的疏水结构域的改变，这进而能够影响非共价键结合的探针荧光的光谱特征。因此，ANS与AIC或其他缀合物分子中疏水裂口的结合可受到pH、离子强度、极性、聚集等改变的影响。无AIC时ANS荧光不依赖于pH和温度。ANS具有在极性环境中为520nm，在非极性环境中为490nm的发射最大值。因此，520nm和490nm(520/490)处荧光发射比率指示所研究AIC或其他缀合物分子上疏水结构域的表观接触，而较低的比率指示可供探针利用的疏水裂口增加，因此分子更加解折叠。

直角光散射(RALS)可用于检测和监测否则将是视觉上清亮的制剂中应激的缀合物分子缔合行为中的微妙改变。缀合物分子中的构象变化能够导致分子间缔合至可能排除极性水的程度。该缔合行为可以是微妙的，或可以作为可溶或不溶聚集体或甚至是可见的沉淀而被容易地检测到。RALS监测转换为不溶性聚集体的否则将是可溶分子的宏观改变。在0-10的标度中(最小/最大强度的仪器标度)，10可以表明否则将是视觉上清亮的制剂中的自身缔合。

温度应激

使用程序可控的循环水浴将AIC样品以2℃/分钟从20℃加热至90℃。以1分钟的间隔记录样品温度以及EF或RALS和IF的数据，以确定不同应激温度可能的构象改变。

剪切应激(Shear Stress)

在使用三角形搅拌棒的锥形玻璃瓶中，快速搅动AIC样品(300rpm，避免气穴)。以预先确定的时间间隔记录溶液澄清度，并取出等分式样通过RALS评价聚集，通过SEC评价回收和聚集体的含量。

PH曲线

大部分缀合物的结构稳定性受pH影响。使用RALS、IF和EF探测AIC，得到pH转换期间可能的由pH诱导的构象改变。这通过将AIC透析至允许容易的pH转换的基础缓冲液(如下文所述)中然后用HCl和NaOH滴定，同时观察RALS来进行。另外，使用系列pH条件范围，用IF和RALS或EF检测产物稳定性。

实验操作

对所有的实验，在荧光仪中相同时间记录RALS和IF二者的数据。由于纳入外部探针，所以EF测量结果在单独的实验中记录。

单色仪设置的确定

在10mM磷酸钠、141.7mM NaCl，pH7.2(PBS)中配制30pg/mL AIC溶液。使用紫外分光光度计对该样品进行吸光度扫描。发现最大吸光度的波长是258nm。然后使用激发和发射扫描研究样品。尽管AIC在258运行(即258nm)显示最大吸光度，但是IF激发选择在295nm处，因为Trp的激发与Phe和Tyr的重叠。因此IF激发波长被选择为高于最大值10nm。使用发射波长比率评价构象变化。根据发射扫描选择295nm的发射波长，同时选择产生最大发射值一半的波长。对于AIC而言，这些波长为323nm和363nm。

RALS和EF不要求测定波长。然而，RALS要求测定电压，并且所使用的电压根据AIC浓度而变化。通过将激发和发射波长设定在320nm处最佳监测RALS。外部探针ANS在380nm处激发，在490nm和520nm处观察发射。ANS具有极性环境中520nm的发射最大值和非极性环境中490nm的最大值。因此，520nm和490nm(520/490)处荧光发射比率指示所研究AIC上疏水结构域的表观接触，而较低的比率指示可供探针利用的疏水裂口增加。

对于外源荧光测量，向样品中添加ANS(8-苯胺基-萘磺酸)作为外部探针。为了确定追踪AIC构象改变所需的ANS量，将ANS滴定至400pL当前剂型的药物样品(30μg/mL)。通过监测该滴定过程中的荧光强度，通过将7AL的10mM贮存液添加进400gL 30pg/mL样品中获得的0.175mM的ANS终浓度被确定为最适用于测试。

使用胍滴定测定由于构象变化，Trp环境改变所致的最大可能IF强度改变。将样品制备为含有0M到6M范围的胍(在室温孵育30分钟)，并进行荧光发射扫描。使用295nm激发获得扫描结果。三个比率使用最大发射波长(343)处和距离峰值+20nm和-20nm处的发射波长。

这些扫描提示，在大于5M的胍浓度下AIC变性，并且由于构象变化，存在的Trp残基现在则以更高的波长发射荧光。由于323/363的比率给出胍滴定的最大比率范围，因此选择该比率用于研究。

为了研究AIC的剪切敏感性，使用425μL的30μg/mLAIC进行初步研究。PBS缓冲液中的这些样品使用以350rpm转动的三角形搅拌棒在锥形玻璃瓶(每个时间点一个瓶)中快速搅动(不形成气穴)。在预先确定的时间间隔处(0、0.5、1、2、3、4、8和24小时)，从磁力搅拌器中取出每个条件下的一个瓶。将所有样品保持在室温，直至研究完成。然后记录溶液澄清度，并通过RALS评价聚集，通过HPLC评价回收和降解。

AIC似乎是中度剪切应激敏感的。3小时时RALS显著上升，之后没有再观察到RALS的上升。因此，在用于该研究的浓度处，短期剪切应当具有最小效应或不具有效应。注意在更高浓度处，该敏感性会成为一个重大问题。

尽管回收不一致，但是贯穿整个剪切应激测试，非聚集体％证明了适中但是稳定的下降(即聚集体％上升)。

在PBS中缓慢冻熔

为了表征PBS中的AIC，测定分子对反复冻熔循环的敏感性。该数据也用于确定在其他分析之前应如何贮存样品。样品以460μg/mL在-80℃PBS中贮存。用30μg/mL在PBS中的1mL样品制备五个Eppendorf管，并制备一个不冷冻的200μL样品作为对照。所有的样品通过将它们置于冰箱盒中在-80℃缓慢冷冻。冷冻完成后将所有五个1mL等分式样在实验台上熔化(室温)。然后通过IF和RALS(同时研究)以及EF(总共800μL)分析一个等分式样，而剩余的四个在-80℃再冷冻至少2小时。剩余的经分析的200μL样品被标记，并再冷冻通过HPLC进行进一步分析。重复该过程直到五个冻熔循环已经完成并被研究。在第一个冻熔样品中观查到RALS中的变异性，遂改变RALS操作，恰好在进行所有后续实验分析之前纳入一个除气步骤。

RALS数据显示PBS中的AIC(10mM磷酸钠、141.7mM NaCl、pH7.2)响应提高的温度时不发生聚集和沉淀。重复的冻熔循环似乎不改变分子对温度斜线上升(ramp)的应答，因为当样品加热时RALS没有提高。

冷冻和熔化过程自身可能改变AIC的聚集。因此分析了RALS值。

熔化后立刻研究各样品的初始RALS，表明存在一些响应冻熔的AIC聚集。单个冻熔循环足够提高RALS。最大提高发生在3次冻熔后。

IF测量Trp荧光。由于Trp具有极性环境中355nm、非极性环境中305nm的最大发射，因此比率越低，Trp残基所接触的环境越是极性的，分子越是解折叠。冻熔对AIC构象的影响通过IF测量。

温度上升时IF比率最初下降，提示构象变化作为温度的函数与之相关，导致增加Trp残基与缓冲液的接触。IF比率的提高提示在约55℃处分子发生重大的构象改变。该构象改变不伴随(可在荧光仪杯中看到，或通过RALS测量)可检测的聚集。

除了通过IF研究的FTI和其他样品之间的最大差异外，重复冻熔不影响AIC。这些数据支持通过RALS获得的数据。

外部非共价极性敏感的荧光探针ANS具有极性环境中为520nm和非极性环境中为490nm的发射最大值。因此，520/490的比值指示所研究AIC溶液的表观疏水性。较高的比率指出所述分子更加疏水，较低的比率指出其正在暴露疏水结构域用于ANS结合。

由于高至约40℃时EF比率提高，分子经历连续构象变化，引起暴露更少疏水结构域。-40℃、-60℃和-85℃的转变反映了这些温度处AIC的构象变化。

荧光分析法实验后贮存在-80℃的经冻熔样品被熔化，并注射进SEC-HPLC柱上。

HPLC结果提示响应重复冻熔的一些轻微降解。

缓慢冻熔研究结论

通过EF测量的分子开始暴露更多疏水残基的温度(Tm约40℃)略低于Trp残基开始经历更具极性环境的温度(如IF图所示，Tm约50℃)。因此，这两个方法互相支持，并提示AIC在40℃至50℃开始解折叠。

由于温度升高，AIC经历构象改变，引起一些聚集。所有三个测定法在不同的冻熔样品中显示相似的曲线，提示AIC对于重复的缓慢冻熔相对稳定。

研究AIC中游离巯基含量：PyMal测定

溶解在DMSO(二甲基亚砜)中的PyMaI[N-(1-芘)马来酰亚胺]是用于监测分子中可能存在的游离-SH基团的外部-SH特异性探针。当PyMaI与游离的巯基反应时，其变成荧光基团，在374nm和394nm处具有峰值荧光。向30μg/mL的AIC样品中加入20倍摩尔过量的PyMaI，并将样品在存在6M胍或10％SDS时孵育30分钟以解折叠分子。数据从荧光值中减去缓冲液样品值。数据提示天然状态下分子中不隐藏游离的巯基，因为将天然PBS和SDS预处理的样品比较时PyMaI荧光是完全相同的。胍似乎抑制PyMaI与AIC的反应。由于PyMaI荧光随时间提高，数据还提示即使在分子的天然状态下，其可能暴露游离的巯基，这可能引起聚集。所述数据未提供游离巯基的可定量测量。

随时间和温度，离子强度对AIC的影响

对AIC研究不同的离子强度作为时间和温度的函数，随后进行pH研究。为了保持一致性并允许这类研究之间的比较，它们均在共同缓冲体系中进行，所述缓冲体系在文中称为基础缓冲液(BB)。BB是设计以便于容易的pH转换的多缓冲液体系，其使用最小浓度的缓冲液降低来自缓冲液自身的稳定性影响。一般地，如下制备10×浓度的溶液：

10×BB的制备

化学品	10×浓度	g/L10×
			甘氨酸	20mM	1.50
柠檬酸	20mM	4.20
			Hepes	20mM	4.76
MES	20mM	4.26
			Tris	20mM	2.43

多种离子强度的BB中AIC的制备

为了使用，将10×BB稀释至1×(各缓冲液组分2mM的终浓度)，加入所需组分，并按照需要调节pH。就本文中提出的离子强度研究而言，制备具有不同浓度NaCl(0mM、10mM、100mM、500mM)的BB缓冲液，并将溶液调节至pH7.2从而匹配PBS组合物。将AIC(约300μg/条件)在Slide-A-Lyzer透析盒中于具有不同NaCl浓度的BB中透析。更换三次透析缓冲液，其中第二次孵育过夜。回收后将样品稀释，然后通过紫外分光光度计研究以测定浓度。随后，将样品进一步稀释，得到30μg/mL的期望终浓度。出于生物安全性考虑，使用0.2gm PES滤器将样品灭菌至15mL无菌管中，然后等分进1.5mL无菌冷冻管(聚丙烯，Coming产品目录号430659)中。将这些样品贮存在4℃，直到第二天早上将它们置于培养箱中的贮存盒中。对于稳定性研究而言，将两组约1.1mL的样品置于30℃，一组置于40℃。剩余的样品组贮存在4℃，直到通过EF、IF、RALS和通过pH滴定分析样品(见下文)。

最终稀释液之前紫外分光光度计分析的经透析的AIC

条件	Ave.A280	浓度(mg/mL)	回收％
				CF	0.510	39.8	102.9
0mM NaCl	0.585	45.5	105.5
				10mM NaCl	0.543	42.5	98.6
100mM NaCl	0.515	40.0	92.8
				500mM NaCl	0.454	35.2	81.7

通过RALS监测的具有不同离子强度的AIC制剂

如上所述制备样品，过滤后通过紫外分光光度计监测以验证终浓度。它们在温度斜线上升期间通过IF、RALS和EF研究。冷冻来自这些样品的等分式样，稍后通过SEC-HPLC研究。

500mM条件下RALS提高，显示当在较高温度置于高离子强度条件下时分子形成聚集体。所有其他条件通过该测定法未显示可检测的聚集。

为了促进AIC中的不稳定性，本文提出的离子强度样品也在30℃和40℃孵育7天(t₇)并通过RALS、IF和EF分析。冷冻来自这些样品的等分式样，稍后通过SEC-HPLC研究。

40℃7天的孵育看起来与得自30℃孵育的结果几乎相同。仅有的差异是在40℃孵育的样品在100mM和500mM NaCl条件下RALS小有提高(图1)。这提示该较高的温度也许揭示了RALS研究的AIC行为的微妙差异。在30℃孵育14天的相同制剂中获得类似的结果。如图1所示，500mM NaCl制剂显示通过RALS测定的聚集的大幅增加。

通过IF监测的具有不同离子强度的AIC制剂

在离子强度RALS研究中，在RALS温度曲线中同时研究IF改变。

当低/高IF发射波长比率提高时，分子改变构象，从而色氨酸(Trp)被隔离在更加疏水的环境中。较低的比率指示Trp残基处于极性环境中，且该比率的改变与分子的解折叠相关。

温度上升时，AIC显示出Tm约50℃的构象变化，这对所有组合物是相同的。然而，500mM NaCl样品显示最大的构象变化，其次是100mM样品。经IF比率判断，含141mM NaCl的组合物显示与100mM样品所观察的等同的构象变化。这些数据提示高离子强度对AIC分子的稳定性可能是有害的。

使用t₇样品通过IF研究AIC的稳定性

t₇样品显示在较低离子强度条件下，AIC分子呈现指示着解折叠的构象变化(基于胍滴定)。随着温度上升所有的制剂显示相同的构象变化(IF比率在相同Tm处改变)，但是较低离子强度条件下较低的IF指示AIC的Trp残基更多暴露于极性环境。

在40℃孵育7天的样品在提高的温度未显示在30℃孵育的样品中观察到的显著构象变化。然而，室温IF比率依照与30℃样品相同的模式。通过IF测定，500mM NaCl制剂显示重大的构象变化。

通过EF监测的具有不同离子强度的AIC制剂

离子强度样品进行温度斜线上升处理，并使用外源荧光研究。

7天40℃孵育的结果与30℃孵育的结果相似。高离子强度组合物中EF的下降提示：室温该条件中AIC改变构象以暴露更多的疏水结构域。由于这些疏水结构域彼此结合，疏水结构域提高的暴露可导致提高的聚集。随着温度升高，高离子强度样品经历更大的构象变化。这些EF数据支持来自RALS和IF实验的结果，并提示高离子强度不是AIC的良好条件。

通过SEC-HPLC研究的不同离子强度中的AIC制剂

来自离子强度荧光分析研究的样品被冷冻贮存在-80℃直到通过SEC-HPLC分析。

将温度斜线提高到90℃后冷却样品，然后转移至Eppendorf管中并贮存在-80℃直到通过SEC-HPLC分析。向未处理样品组中加入额外的NaCl并也保持在-80℃。NaCl t₀用于证明高的非聚集体％。

研究来自t₇-30 ℃和t₁₄-30℃研究的温度斜线上升样品

在30℃与40℃孵育7天的样品中获得的结果相比不存在显著差异，除500mM NaCl条件外。整体上，未进行温度斜线上升的样品中非聚集体％更高，温度斜线上升后总回收百分比(通过层析峰面积测量)更低。

在30℃将AIC孵育另外7天(总共14天)导致所有样品的回收百分比(通过层析峰面积测量)适度下降，且100mM和500mM NaCl条件下非聚集体％下降(即聚集体％提高)。在含0.1M NaCl的BB中配制并在30℃孵育7天的AIC的层析图显示在图2A-2C中215、260和280nm处。这显示如SEC-HPLC所示的AIC降解。其展示降解产物的滞留时间(7、10、13、15、16、18分钟)。所有的测定证明AIC在较高的离子强度制剂中更不稳定。

PH作为离子强度的函数对BB中AIC的影响

在不同离子强度进行pH滴定。为了研究pH变化期间AIC的稳定性，使用在不同NaCl浓度的BB中制备的AIC。将2.7mL(对于500mM NaCl为2.4mL)样品制剂置于荧光仪杯中，并将pH探头降低进入溶液。这允许在获得RALS和IF数据的同时对pH进行实时测定。然后用5μL的1NHCl或NaOH滴定样品，导致约1个单位的pH变化。每次添加之后3分钟的时间段允许pH平衡。此后记录pH、RALS和IF值。该整个方法在2小时的时间过程中进行。对每个条件，将样品的pH从pH7.2调节到pH3到pH11并调回pH7.2(3＞11)，或从pH7.2到11到3并调回pH7.2(11-＞3)。低pH引起AIC在低离子强度下可逆地聚集。

随着pH降低，AIC经历可逆的构象变化，其引起Trp残基暴露于更具疏水性的环境中。在0mM NaCl处，由pH改变引起的AIC的RALS和IF改变是可逆的。

在存在500MM NaCl时，随着pH降低，AIC经历可逆的构象变化，其引起Trp残基暴露于更具疏水性的环境中。如果pH最初上升至11，而不是首先被降低，则该效应次显著，尽管仍然是可逆的。

在10mM和100mM处的pH滴定证明NaCl浓度效应——其中高NaCl浓度对AIC是有害的。

离子强度和pH滴定对AIC的效应：SEC-HPLC分析

NaCl样品贮存在4℃。1-2周后，这些样品在pH滴定实验中使用。滴定后将样品冷冻贮存在-80℃直到用SEC-HPLC分析。

高NaCl浓度(500mm)显著降低非聚集体％(即聚集体％提高)。当pH首先升至11然后降至3时，100MM NaCl样品显示轻微的非聚集体％降低。将pH调节至3然后调节至11对于100mM NaCl组合物而言不降低非聚集体％。

在注射至HPLC前，相对于对照样品计算熔化和制备的单体回收。500mM NaCl处单体回收被降低。在这些500MM样品中，在约10分钟的滞留时间处出现新峰，其不如本报告中存在的任何其他HPLC层析图中的大。该峰对500mM NaCl样品而言显著地提高了表观总回收百分比。这些数据支持荧光仪数据，所述荧光仪数据提示高NaCl浓度使AIC不稳定。

PH作为时间和温度的函数对BB中AIC的影响

对最初的pH研究而言，在从pH3到pH11的pH范围制备一系列BB缓冲液(0mM NaCl)。在4℃将AIC(约150μg/制剂在pH7的BB中稀释至75μg/mL)在Slide-A-Lyzer透析盒中于不同pH的BB中透析，使用新鲜熔化的AIC材料。透析缓冲液更换三次，第三次缓冲液更换后透析过夜。回收后通过紫外分光光度计研究样品以确定浓度，然后稀释产生30μg/mL的期望终浓度。出于生物安全性考虑，使用0.2μm PES滤器将样品灭菌至15mL无菌管中，然后等分进1.5mL无菌冷冻管(聚丙烯，Coming产品目录号430659)中。将这些样品置于湿度可控培养箱中的贮存盒中。将三组约1.0mL的样品置于30℃条件，一组置于40℃。剩余的样品组贮存在4℃直到通过EF、IF，RALS分析所有的样品。剩余的材料冷冻，随后进行HPLC分析。

使用任何样品之前，测定AIC浓度。这些结果总结在表9中。使用280nm处的吸光度测量AIC浓度。透析进BB后AIC回收的结果用t₀样品浓度表示。PH3、pH4和pH5样品具有异常高的读数(如通过回收百分比所指示的)，因此基于来自其他样品结果的体积进行稀释。

注意所有的回收率大于100％。这很可能是由于AIC测定未经样品稀释进行的事实。因此，紫外分光光度计读数均高于1，其中准确度和线性度降低。这也可影响稀释计算，导致变化更大的浓度。

表9

pH样品：基于t₀-t₁₄ AIC的A₂₈₀的AIC浓度

样品	透析回收％	t0(μg/mL)	t730℃(μg/mL)	％t0	T740℃(μg/mL)	％t0	T14 30℃(μg/mL)	％t0
									*PBS对照	102.1	27.53	26.49	96.2	28.46	103.4	27.19	98.8
pH3	148.6	31.31	27.80	109.1	21.25	83.4	21.83	85.6
									pH4	131.6	25.49	34.81	100.8	25.11	72.7	38.05	110.2
pH5	129.1	34.54	33.16	100.8	34.20	104.0	33.23	101.0
									pH6	114.3	32.89	30.23	105.0	30.85	107.1	30.04	104.3
pH7	110.0	28.80	29.84	104.0	30.69	107.0	30.04	104.7
									pH8	111.9	28.69	28.61	99.4	29.57	102.8	29.19	101.5
pH9	111.9	28.77	30.81	100.4	31.62	103.0	30.15	98.2
									pH10	11.20	30.69	29.69	101.6	31.12	106.5	31.35	107.2

pH11

111.3

29.23

29.96

102.9

31.66

108.7

30.11

103.4

^*PBS对照＝10mM磷酸钠、141.7mM NaCl，pH7.2

也使用A260测定AIC浓度，结果与在A280处获得的结果相似但不相同。稳定性孵育不显著改变浓度(与t₀值相比)。

通过RALS监测不同pH下的AIC制剂

对pH研究而言，在温度在30分钟内从20℃斜线上升到90℃期间，使用RALS监测pH样品。为了促进分子的不稳定性并区分不同制剂的稳定性，在30℃和40℃将AIC孵育7天和14天(t₇和t₁₄)。在不同pH的BB中制备的样品在温度曲线中通过RALS研究。

在t₀处仅低pH制剂(pH3和pH4)显示与其他样品不同。通过RALS测量，这两种制剂显示大量聚集。所有的样品在进行温度斜线上升之前是清亮的。到达90℃后，仅pH3样品成为混浊的。其余的仍然清亮。将在不同pH值的BB中制备的样品在30℃孵育7天后，再次在温度曲线中予以研究。

根据RALS，在30℃孵育7天后，低pH(3-5)诱导AIC聚集，所述聚集通过RALS读数判断。在40℃孵育7天后，极端pH(3-4，和10-11)处的制剂显示更小的稳定性，导致聚集体的形成。渐增的温度诱导低pH(pH4)下额外聚集体的形成，但是在高pH(pH10和pH11)下解聚AIC。在pH6和pH9之间的pH下，温度对聚集没有明显的影响。

在30℃孵育14天导致在pH4下聚集的增加。所有其他制剂与t₀和t₇数据相似。

RALS值也提供有关不同pH下AIC稳定性的信息。

酸性pH(3-5)导致聚集增加，在30℃或40℃孵育随时间推移所述聚集增加。在碱性pH(10和11)下，仅在40℃的孵育导致聚集。

通过IF监测不同pH的AIC制剂

在30℃和40℃孵育之前和之后，在温度斜线上升中也使用IF研究pH样品。

PH3的制剂显示更高的IF比率。所有制剂呈现温度转换，较低pH样品的Tm较低。这些结果指出低PH引起AIC构象的重大变化，因为在pH3-pH6整体IF比率显著更高。PH3呈现甚至更高的IF比率。30℃时，孵育在1.55开始并随温度曲线稳定提高，在90℃约2.3时结束。在pH7及以上时，高温度分子不显示构象变化。40℃孵育后，pH3和pH4均超出(高)曲线的整个长度。最初的IF比率证实了通过温度曲线获得的结果。

这些结果指示低pH引起AIC构象的重大变化，因为在pH3-pH6时整体IF比率显著更高。

通过EF监测不同pH的AIC制剂

在温度斜线上升期间以及30℃长期孵育后，也使用EF研究pH样品。t₀和t₇样品均在下文提供。

除pH3外，在14天的稳定性研究期间，酸性样品显示EF比率的显著降低，提示在这些pH制剂中分子暴露更多的疏水结构域。这支持t₀和t₇先前的结果。见图3。

EF比率越低，暴露越多的疏水区供外部探针ANS结合。数据提示pH3到pH6的制剂诱导显著的构象变化，导致增加的疏水性，这可引起聚集。这些数据受到RALS数据和pH滴定数据的支持。长期孵育后pH3处EF比率的提高可能是分子完全降解的结果。

通过SEC-HPLC研究含不同缓冲液的AIC制剂

将制备用于pH研究的样品冷冻贮存在-80℃直到通过HPLC分析。参阅图4A-4C。在碱性pH(pH7到pH11)处非聚集体％和单体回收率(MRc)更高。MRc t₀是0时间处的单体回收率。

在30℃孵育7天导致与40℃孵育相比更高的非聚集体％和回收百分比。在40℃孵育将AIC降解至下述程度：其中观察到pH3-5处分子的完全丧失和pH大于5处降低的回收百分比。除pH8外，在30℃孵育14天引起所有样品非聚集体％降低(即聚集增加)。

对pH5、pH10和pH11样品而言，与孵育7天相比，在30℃孵育14天具有显著的效应。与30℃的7天孵育效应相比，对pH6到pH9的样品仅存在适中的效应。根据稳定性研究中AIC在低pH下的完全破坏，AIC显示在pH7-9处具有最大的稳定性。

如本文所述的测定法：RALS、IF、EF和SEC-HPLC已显示是AIC稳定性的良好指标，并且预计为任何缀合物分子结构稳定性的良好指标。根据上述实验的结果，依照以下参数设计组合物，所述组合物提供结构稳定的缀合物分子。研究应被设计为监测pK值为7至9的测试组分。不使用盐(离子强度研究的确提示低浓度对调节最终制剂中渗透性是可行的，因为10mM NaCl不显著影响分子的稳定性)。

表10、11和12根据用于评价组分的决策矩阵的制备而绘制，所述组分通过RALS、EF、IF和HPLC-SEC测试。在多种组合物中时间和温度对AIC的效应通过荧光测定法分析，结果以两种方式之一通过定性和比较分析予以评分。在一些研究中，根据每个测定法在每个时间点上所做的判断，将组合物从最佳到最差编号(例如1到10，1是最佳)。每个测定法就起始值、急剧温度斜线上升方面的变化以及40℃孵育随时间的变化(t₀(0时间)相对于t₇(7天)、t₁₄(14天)和t₂₈(28天)；较小的改变给出较高的分值)进行评分。然后将数字转化为从0到100的分值，100为最佳。其他研究使用来自每个测定法的精确值，而不是对组合物的排序。所有这些分值被平均，并报告在表10、11、12中。HPLC结果通过将每个孵育时间点(即0、7天、14天和28天)精确的非聚集体％和回收率值数学地扩展在0-100的范围来评分。来自所有三个波长的结果被平均用于评分。t₇、t₁₄和t₂₈ HPLC数据单独评价，从而给予这些数据更大的权重。

对AIC的热应激研究指示40℃可用于促进结构稳定性的研究，因为在该温度AIC比其约50℃至约60℃的热解折叠转换低10℃(如通过IF和EF研究所评价的)。RALS实验证明AIC在约75℃至约80℃聚集和沉淀。适用于对其他缀合物分子进行促进结构稳定性研究的温度可通过测量待分析缀合物分子的热解折叠转换温度来测定，并将研究温度维持在低于所述解折叠转化温度10℃的温度。这类测定可通过技术人员已知方法以及本文公开的IF和EF方法进行。AIC的IF和EF使用或不使用急剧温度斜线上升(30分钟，从20℃到90℃)研究。

来自pH研究的结果证明AIC在高于pH6.0的制剂中显著地更加稳定。根据这些结果，着手研究含不同组分的组合物，所述不同组分具有从pH6.0到pH8.0的pKa值。结果显示在表10中。对表10的结果，如下制备组分。通过将145μgAIC针对表10中所列的每种组合物透析来制备样品。将每种组合物的pH调节至期望值，并使用0.2μm Nalgene滤器过滤。透析在4℃Slide-A-Lyzer透析盒中进行，同时在300mL烧杯中以60rpm搅拌，更换透析缓冲液3次。无菌缓冲液被等分并贮存在4℃，在AIC测定中用作对照并用于注射在HPLC中。考虑到生物安全性，透析后使用0.2μm PES滤器将样品过滤灭菌，并等分在4个无菌冷冻管中。三组每种组合物配制为30μg/mL，并置于40℃培养箱内。一组立即用于t₀研究。对照组合物为pH7.2的20mM磷酸氢二钠(JT Baker)；苯甲酸盐(Ben)为20mM苯甲酸钠(Sigma)；柠檬酸盐(Cit)为20mM柠檬酸钠(JT Baker)；组氨酸(His)为20mM(Sigma)；磷酸盐(Phos)为20mM磷酸氢二钠(JTBaker)，而琥珀酸盐(Sue)为20mM琥珀酸(Sue)，均为所示的pH值。

表10

选择用于维持AIC pH条件的组分的矩阵

	透析回收％		基础RALS		基础EF		IF曲线		HPLC			评分
													Carbo	t7	t0	t7	t0	t7	t0	t7	MP	Rc	Deg
*PBS		100	100	70	70	70	50	75	40	50	50	50													65.9

对照
													Ben6.5	70	100	70	90	75	60	85	60	95	90	90	80.5
Ben7.0	80	100	50	50	80	70	90	65	95	95	95	79.1
													Cit6.5	80	60	75	90	70	70	90	40	50	40	50	65.0
His6.5	100	100	60	85	85	80	75	60	95	95	95	84.5
													His7.0	100	100	70	75	90	85	80	90	95	100	90	88.6
His7.5	100	100	75	80	100	100	100	95	100	100	100	95.5
													His8.0	100	100	65	95	100	80	100	100	95	100	85	92.7
Phos7.0	95	100	75	90	85	80	95	80	95	95	90	89.1
													Phos7.5	100	100	100	100	85	60	95	80	95	95	95	91.4
Phos8.0	100	100	95	95	85	90	95	85	90	95	75	91.4
													Suc6.5	90	75	95	95	75	75	90	50	55	55	50	73.2

Key：Deg＝形成的降解产物；

^*10mm磷酸钠，141.7mM NaCl，pH7.2

结果如上所示。根据决策矩阵表，选择pH7.5的组氨酸；pH8.0的组氨酸；pH7.5、pH8.0、pH7.0的磷酸盐以及pH7.0和pH6.5的组氨酸用于组合物。

在一些实例中，pH7.5的组氨酸用于包含缀合物的组合物中。评价了多种氨基酸稳定剂对AIC的影响。下文所选择的组是根据它们在许可药物产品中作为可注射肠胃外药剂的用途来选择的。包含待测试氨基酸的组合物被配制为用20mM组氨酸和50mM氨基酸透析，并将pH调节至7.5。使用0.2μm Nalgene滤器过滤组合物。作为对照，配制5mM、20mM和50mM仅含组氨酸的组合物。所有测试氨基酸得自Sigma。氨基酸的结果显示在表11中。

表11

用于选择AIC氨基酸稳定剂的矩阵

					t7			t14			t28
															RALS	IF	EF		MP	Rc		MP	Rc		MP	Rc	Avg.
PBS对照	53	14	28		40	31		29	9		49	40	33
														Ala	45	57	79		99	74		98	61		96	62	74
Arg	30	44	52		65	39		68	31		66	40	48
														Asp	65	47	38		73	1		84	32		79	43	51
Cre	51	45	65		0	31		1	3		0	2	22
														Glu	68	46	51		77	20		79	41		75	40	55
Gly	59	50	79		59	100		95	73		100	69	76
														5His	54	55	88		96	84		95	75		99	65	79
20His	43	53	74		95	80		90	66		96	61	73
														50His	45	56	73		86	80		95	72		97	63	74
Ile	65	56	66		93	82		94	73		96	62	76
														Leu	53	63	63		93	81		87	76		98	65	75
Lys	30	64	38		71	73		37	72		57	43	54
														Phe	34	58	34		82	84		36	97		83	74	65
Pro	58	66	75		93	72		99	66		92	58	75
														Trp	28	66	43		59	92		24	72		23	52	51

六种氨基酸被选择用于开发组合物。被选择的六种氨基酸具有相似的稳定效应。它们是：5mM组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸。对组合研究而言，甘氨酸是首要选择的氨基酸。

为了研究能够潜在地稳定AIC的其他组分，研究了多种糖类和表面活性剂。如果从事冻干开发，则这些组分可用作填充剂。下文所列研究评价作为稳定剂的10种糖类和4种表面活性剂。它们根据其作为可注射肠胃外药剂的用途而被选择用于研究。所有的组合物使用20mM组氨酸，pH7.5，用表12所列组分制备。作为对照，使用pH7.2的20mM磷酸氢二钠中的AIC，且组合物含有20mM组氨酸。3％果糖(Fru)(Sigma)；3％葡萄糖(Glu)(Sigma)；3％乳糖(Lac)(Sigma)；3％麦芽糖(Mal)(Fru、Glu、Lac和Mal都是冻干和液体制剂中参与梅拉德(Maillard)反应的还原糖)；3％甘露糖(Man)(Sigma)；3％甘露醇(Mtol)(Sigma)；3％山梨糖醇(Sor)(Sigma)；3％蔗糖(Suc)(Sigma)；3％海藻糖(Tre)(Sigma)；3％木糖醇(Xyl)(Sigma)；0.1％PEG 3350(P3350或P3)(Sigma)；0.1％PEG 4000(P4000或P4)(Mallinckrodt)；0.1％吐温20(T20)(JT Baker)以及0.1％吐温80(T80)(JTBaker)。

表12

用于选择AIC的糖类或表面活性剂组分的矩阵

					HPLCt0			HPLCt7			HPLCt14			HPLCt28
																			RALS	IF	EF		*MP	*Rc		MP	Rc		MP	Rc		MP	Rc		Avg.
PBS	23	47	51		88	60		17	24		0	0		29	13		32.0
																		Fru	68	38	18		89	78		96	68		74	72		28	54		62.1
Glc	51	65	48		95	64		85	57		87	55		85	39		66.4
																		His	57	62	85		79	76		84	72		70	71		81	27		69.5
Lac	78	53	53		87	99		97	94		87	89		87	77		82.0
																		Mal	61	48	44		83	82		91	75		96	68		100	32		70.8
Man	74	36	36		94	97		95	87		76	92		62	44		72.0
																		Mtol	53	43	63		60	55		74	53		70	53		20	44		53.3
Sor	56	73	42		95	64		93	59		94	62		91	20		68.2
																		Suc	77	65	70		100	80		88	72		73	80		44	62		73.7
Tre	73	65	62		94	69		79	62		65	75		56	32		66.6
																		Xyl	41	69	48		90	68		90	66		89	67		49	42		65.5
P3	43	53			83	76		86	71		67	84		67	38		66.7

P4	18	31			83	80		88	74		59	89		75	37		63.2
																		T20	46	60			75	78		84	78		43	87		27	76		65.4
T80	49	33			71	84		88	84		56	94		30	61		65.0

^*单体％

^**总回收率

从该研究选择的四种组分为：乳糖、蔗糖和甘露糖和麦芽糖。然而，尽管蔗糖显示最好的整体得分，但是它对40℃孵育具有弱应答(通过t₂₈的AIC非聚集体％评价)。蔗糖和山梨糖醇的稳定性孵育效应使用t₂₈的HPLC-SEC评价。结果证明与山梨糖醇制剂相比，在260nm和280nm处含蔗糖的组合物具有更大的降解产物。因为乳糖和麦芽糖是还原糖，而甘露糖在t₄和t₂₈具有弱HPLC结果，所以组合研究集中于蔗糖和山梨糖醇。

实施例6：组合组合物研究

制备用于组合研究的组合物

研究1

为了研究组合经鉴定为AIC优良稳定剂(即有助于缀合物分子的结构稳定性)的组分的效应，下文的研究评价了含有组合的组合物，所述组合包括2种缓冲液、2种氨基酸和2种糖类。除糖类从14天研究的数据中选择外，根据得自28天稳定性研究的数据选择这些组分用于研究。设计组合物以简化单一组分改变之间的比较，同时减少评价所需组合物的数量。组合物使用所示组合和本文所述方法用表13中所列组分制备(pH7.5)。一组立刻用于t₀研究。

表13

具有组合组分的组合物

组合物	组氨酸	磷酸盐	甘氨酸	异亮氨酸	蔗糖	甘露糖	mOsm
								1	20mM	-	50mM	-	-	-	61

2	20mM	-	-	-	3％	-	100
								3	20mM	-	270mM	-		-	289
4	20mM	-	50mM	-	7％	-	297
								5	20mM	-	175mM	-	3％	-	287
6	20mM	-	115mM	-	5.15％	-	300
								7	50mM	-	20mM	-	7％	-	298
8	5mM	-	115mM	-	5％	-	281
								9	20mM	-	50mM	-	-	4.5％	334
10	20mM	-	50mM	50mM	5.3％	-	291
								11	-	20mM	50mM	-	-	-	93
12	-	50mM	-		4.6％	-	261
								13	-	20mM	50mM		6.2％	-	305
14	-	50mM	50mM		4.6％	-	311
								PBS对照							483

注释：最终稀释和过滤(为组合物)后分析组合物的渗透性。

使用280nM的吸光度测定每个时间点的AIC浓度和回收率，并显示在表14中。

使用RALS、IF、EF和SEC-HPLC通过本文所述方法进一步分析组合物。

为了选择组合物，构建决策矩阵表——表14。

表14

为组合物选择组分的决策表格

				t7		t14		t28
												RALS	IF	EF	*MP	*Rc	MP	Rc	MP	Rc	Avg.
PBS对照	32	36	62	25	52	0	34	1	10	37.0

1	75	79	71	90	100	94	95	90	68	85.8
											2	76	70	68	84	91	84	100	79	76	81.8
3	45	78	63	95	87	88	91	95	77	80.3
											4	88	73	56	96	91	92	91	83	79	84.1
5	70	76	58	88	83	87	90	89	73	78.1
											6	84	73	60	89	90	86	95	86	82	81.4
7	92	64	47	81	72	24	83	55	75	67.9
											8	87	78	66	90	82	92	90	82	83	80.4
9	85	39	35	70	69	13	79	1	75	56.7
											10	55	72	68	76	87	60	93	78	79	75.9
11	81	69	88	100	59	100	64	99	16	76.2
											12	74	65	80	60	23	80	7	91	43	59.5
13	80	74	76	80	55	91	46	97	66	74.7
											14	80	76	71	69	58	79	29	90	61	71.0
PBS对照	32	36	62	25	52	0	34	1	10	37.0

^*单体％

^**总回收率

根据表14的结果，选择组合物3、4、6和8(均具有相似结果)。组合物1和2是对照组合物，不具有足够被选择为最终组合物的渗透性。

通过比较多种组合物，得出以下结论：

提高的甘氨酸浓度和降低的蔗糖浓度(组合物4-6)引起稳定性降低。纳入甘露糖(组合物9)代替蔗糖(组合物4)得到的组合物导致稳定性相当地下降。添加异亮氨酸(组合物10)和减少蔗糖(组合物4)浓度导致稳定性降低。磷酸盐缓冲的组合物(11-14)整体上不如组氨酸缓冲的组合物表现好。然而，单独考虑HPLC数据时，磷酸盐缓冲的组合物几乎与组氨酸缓冲的组合物表现同样好。含5mM(组合物8)和20mM(组合物

6)组氨酸的组合物之间几乎未观察到差异，但是50mM组氨酸(组合物

7)引起稳定性显著降低。

研究2

制备用于组合研究2的组合物

为了进一步研究组合经鉴定为优良稳定剂的组分的效应，此处所示研究评价了含有1种缓冲液、2种氨基酸和3种糖类作为稳定剂的组合物。根据得自28天稳定性研究的数据选择它们用于研究。设计组合物以探索山梨糖醇的用途，因为来自28天AIC孵育的数据指示山梨糖醇比蔗糖更好地稳定AIC。

使用表15所列组分制备组合物。每种组合物的pH被调节至7.5，然后如本文所述制备每种组合物。

表15

具有组合组分的组合物

组合物	His	磷酸盐	Gly	Leu	Sorb	Mai	Suc	mOsm*
									1	20mM		50mM	-	-	-	-	68
2	20Mm	-	-	-	3％	-	-	182
									3	20mM	-	-	-	4.6％	-	-	273
4	20mM	-	-	-	-	8％	-	251
									5	-	20mM	-	-	4.3％	-	-	306
6	-	20mM	50mM	-	3.5％	-	-	332
									7	20mM	-	50mM	-	3.80％	-	-	280
8	20mM	-	50mM	-	-	7％	-	270
									9	20mM	-	-	50mM	3.80％	-	-	282
10	20mM	-	50mM	-	-	-	7％	290
												PBS对照					476

^*经测量的实际渗透性

透析和过滤后(t₀)以及40℃孵育7天、14天和29天后的AIC浓度和回收率使用280nm处的吸光度测定。

使用RALS、IF、EF和SEC-HPLC通过本文所述方法进一步分析组合物。

为了选择组合物，构建决策矩阵表——表16。

表16

					t7			t14			t28
																RALS	IF	EF		MP	Rc		MP	Rc		MP	Rc		Avg.
PBS对照	7	26	47		25	49		0	20		0	34		31.9
															1	78	79	75		96	65		89	58		86	73		76.4
2	84	70	73		96	60		95	55		91	60		76.5
															3	75	79	62		88	97		94	96		91	97		86.9
4	52	34	40		100	84		99	84		97	41		71.1
															5	68	52	59		99	58		93	29		88	60		71.5
6	67	62	42		93	45		79	44		79	54		62.0
															7	69	84	41		94	87		95	81		97	77		81.1
8	55	45	45		98	91		98	81		99	81		77.7
															9	53	80	57		98	97		92	88		91	87		83.2
10	76	68	47		98	96		97	96		95	54		80.2

选择组合物3、7、9和10。这四种均具有相似的结果。

通过比较多种组合物，得出以下结论。选择使用组合物10。提高的山梨糖醇浓度提高稳定性，如组合物2相对于3以及组合物6相对于7所证明的那样。用甘氨酸(组合物7)代替亮氨酸(组合物9)引起轻微的稳定性降低。组合物3含有山梨糖醇，不合甘氨酸或亮氨酸，证明与使用山梨糖醇与甘氨酸或亮氨酸组合的组合物相比，是更好的稳定剂。含有组氨酸而不是磷酸盐的组合物根据它们的整体得分(组合物5和6)显示更高的稳定性，尽管当只考虑HPLC数据时，磷酸盐组合山梨糖醇几乎与含组氨酸和山梨糖醇的组合物一样好地稳定AIC(组合物3相对于5)。

研究3：组分组合

制备用于组合研究3的组合物

回顾上述2个组合研究后，准备组合研究，比较甘氨酸、脯氨酸和亮氨酸与3％山梨糖醇和20mM组氨酸的相互作用。另外，由于AIC稳定性可能不需要糖类，研究多种盐作为AIC组合物中的等渗调节剂。在先前的离子强度研究中，NaCl作为模式化合物被使用。尽管数据显示无稳定剂时，更高的离子强度对AIC是有害的，但是该组合物重复是在存在组氨酸作为稳定剂时，使用不同盐或等渗调节剂进行的。

使用所示组合用表17所列组分制备组合物。各组合物的pH调节为7.5，并如本文所述制备组合物。

表17

具有组合组分的组合物

组合物	组氨酸	山梨糖醇	甘氨酸	亮氨酸	脯氨酸	NaCl	mOSm*
								1	20mM	3％	-	-	-	-	178
2	20mM	3％	110mM	-	-	-	301
								3	20mM	3％	-	110mM	-	-	312
4	20mM	3％	-	-	110mM	-	304
								5	20mM	-	270mM	-	-	-	286
6	20mM	3％	-	-	-	570mM**	1266
	组氨酸	KCl	醋酸钠	NaSO4	KH2PO4
								7	20mM	145mM	-	-	-	-	278

8	20mM	-	140mM	-	-	-	299
								9	20mM	-	-	115mM	-	-	292
10	20mM	-	-	-	115mM	-	301
								11	20mM	-	-	-	-	155mM	413
12	20mM	-	-	-	-	-	21
								PBS对照							480

^*在t₀处测量的实际渗透性

^**组合物制备中存在错误。组合物应当为57mM NaCl。

使用280nm处的吸光度测定透析和过滤后(t₀)以及40℃孵育7、14和28天后的AIC浓度和回收率。使用本文所述方法通过RALS、IF、EF和SEC-HPLC进一步分析组合物。

表18提供用于选择组合物组合的矩阵。

表18

用于选择组合物的矩阵

					t7			t14			t28
															RALS	IF	EF		MP	Rc		MP	Rc		MP	Rc	Avg.
PBS	47	87	49		57	64		33	33		0	1	49.1
														1	76	91	68		99	95		97	81		99	68	87.5
2	89	91	47		99	84		95	78		93	73	85.0
														3	85	91	46		99	93		98	91		95	85	88.6
4	85	90	47		100	97		100	98		98	82	90.2
														5	87	92	55		97	96		95	97		82	97	90.4
6	25	87	42		25	53		0	28				45.1
														7	83	90	50					67	71				75.5
8	87	90	41		76	77		64	56				70.8
														9	77	89	47		59	43		30	16				56.8
10	85	89	38		65	38		46	25				59.3
														11	81	90	44		43	49		22	11				55.0
12	81	90	57		99	90		96	87				87.9

从组合研究中选择五种组合物：1、3、4、5、12。所述组合物均具有相似结果。

通过比较多种组合物得出以下结论。与早先的AIC在有盐时不稳定(组合物6-11)的观察一致，盐不能用作等渗调节剂。与上轮组合物相比，在该轮组合物中组合物1得分更好，但是其不具有足够的渗透性。与不含亮氨酸或脯氨酸的组合物(组合物1)相比，含有亮氨酸或脯氨酸与组氨酸和山梨糖醇的组合物(组合物3和4)提供更好的稳定性。就稳定性而言，与山梨糖醇组合时亮氨酸和脯氨酸是比甘氨酸更好的组分(组合物3和4相对于2)，但是无山梨糖醇(组合物5)时甘氨酸是比组合物3或4更好的稳定剂。

研究4

回顾3个组合研究后，准备最终的组合研究，用于研究能够维持所需pH的组分的效应。由于在20mM组氨酸pH7.5中含有270mM甘氨酸的组合物在先前的研究中表现良好，所以研究了表19中概述的组合物。

使用所示组合用表19中所列组分制备组合物。各组合物的组分调节至7.5，并根据本文所述方法制备组合物。

表19

具有组合组分的组合物

组合物	组氨酸	甘氨酸	磷酸二氢盐	mOsm
					1	20mM	270mM	-	300
2	-	230mM	20mM	268
					3	5mM	285mM	-	330
PBS对照				512

制备组合物，从而可以确认组氨酸相对于磷酸盐的使用。使用280nm处的吸光度测定透析和过滤后(t₀)所有时间点的AIC浓度，并显示在表20中。

表20

具有组合组分的组合物：A₂₈₀处AIC的AIC浓度

样品		透析回收％	t0(μg/mL)		％t0	t7 40℃(μg/mL)		％t0	t14 4℃(μg/mL)
										PBS对照		103.5	27.11		103.02	27.76		105.94	28.54
1		119.6	26.99		98.75	26.01		96.34	25.38
										2		111.3	26.30		46.05	12.15		91.37	24.10
3		112.3	28.77		98.85	29.98		92.56	27.14

未获得t₂₈的蛋白质浓度。

使用本文所述方法通过RALS、IF、EF和SEC-HPLC进一步分析组合物。RAL测量的结果显示在图5中。

为了从该研究中选择组合物，构建决策矩阵表(表21)。

表21

用于选择AIC的组合3组分的矩阵

					t7			t14			t28
															RALS	IF	EF		MP	Re		MP	Re		MP	Rc	Avg.
PBS对照	33	80	31		25	58		0	44		0	12	42.6
														1	79	87	54		100	55		97	79		97	66	80.0
2	82	83	47		95	24		85	11		72	80	66.6
														3	83	87	68		99	97		100	93		100	95	92.6

通过比较多种组合物，得出以下结论。含组氨酸的组合物(1和3)与含磷酸盐(2)的组合物相比，提供更好的稳定性。具有低组氨酸浓度和高甘氨酸浓度的组合物(组合物3)与具有高组氨酸浓度和低甘氨酸浓度的组合物(组合物1)相比提供更好的稳定性。数据提示在无NaCl时AIC最为稳定。对AIC而言，最佳pH为7.5(范围7-9)。AIC基本上不是剪切敏感性的。高于40℃的温度产生降解的AIC。温度和pH应激均产生不溶的和聚集的物质。用于维持AIC组合物pH的最佳组分为pH7.5的组氨酸，然后是pH8.0的组氨酸以及pH7.5和pH8.0的磷酸盐。稳定的AIC组合物最适宜的氨基酸为：单独的5mM组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸。总体上，用于稳定的AIC组合物的最佳糖类为：乳糖、蔗糖以及甘露糖和麦芽糖。麦芽糖和乳糖是还原糖。仅考虑HPLC结果时，山梨糖醇和葡萄糖提供超过所有糖类(除还原糖外)的改善的稳定性。在一些实例中，可使用以下组合物用于在约2℃至约8℃结构稳定的AIC液体组合物：5mM组氨酸、285mM甘氨酸；20mM组氨酸、270mM甘氨酸；和20mM组氨酸、50mM甘氨酸和3.8％山梨糖醇。

已经通过直接描述并通过实施例详述本发明。本发明的等同方案和修饰对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并涵盖在本发明范围内。

Claims (40)

1.包含结构稳定缀合物分子的组合物，其中缀合物分子包含缀合物配偶体和含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸，且其中组合物还包含能够将组合物pH范围维持在约6.0至约9.0的组分。

2.权利要求1的组合物，其中根据直角光散射(RALS)测量，组合物在约2℃至约8℃的温度包含多于约70％的非聚集体形式的所述缀合物分子。

3.权利要求1的组合物，其中能够维持pH的组分从由非极性组分和非负电荷组分组成的组中选择。

4.权利要求1的组合物，其中能维持pH的组分为组氨酸。

5.权利要求4的组合物，其中组氨酸以约1mM至约50mM的浓度存在于组合物中。

6.权利要求4的组合物，其中组氨酸以约5mM至约20mM的浓度存在于组合物中。

7.权利要求1的组合物，其中能维持pH的组分为磷酸盐。

8.权利要求7的组合物，其中磷酸盐以约5mM至约50mM的浓度存在于组合物中。

9.权利要求7的组合物，其中磷酸盐以约20mM至约50mM的浓度存在于组合物中

10.权利要求1的组合物，其中组合物的pH范围约7.0至约8.0。

11.权利要求1的组合物，其中组合物的pH范围约7.5至约8.0。

12.权利要求1的组合物，其中ISS包含六聚体基序AACGTT。

13.权利要求1的组合物，其中ISS包含基序GACGCTCC；

GACGTCCC；GACGTTCC；GACGCCCC；AGCGTTCC；AGCGCTCC；

AGCGTCCC；AGCGCCCC；AACGTCCC；AACGCCCC；AACGTTCC；

AACGCTCC；GGCGTTCC；GGCGCTCC；GGCGTCCC；GGCGCCCC；

GACGCTCG；GACGTCCG；GACGCCCG；GACGTTCG；AGCGCTCG；

AGCGTTCG；AGCGTCCG；AGCGCCCG；AACGTCCG；AACGCCCG；

AACGTTCG；AACGCTCG；GGCGTTCG；GGCGCTCG；GGCGTCCG；

GGCGCCCG GACGCT；GACGTC；GACGTT；GACGCC；GACGCU；

GACGUC；GACGUU；GACGUT；GACGTU；AGCGTT；AGCGCT；

AGCGTC；AGCGCC；AGCGUU；AGCGCU；AGCGUC；AGCGUT；

AGCGTU；AACGTC；AACGCC；AACGTT；AACGCT；AACGUC；

AACGUU；AACGCU；AACGUT；AACGTU；GGCGTT；GGCGCT；

GGCGTC；GGCGCC；GGCGUU；GGCGCU；GGCGUC；GGCGUT或

GGCGTU。

14.权利要求1的组合物，其中ISS包含序列

5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)；

5’-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：2)；

5’-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3’(SEQ ID NO：3)；

5’-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO：4)；

5’-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3’(SEQ ID NO：5)；

5’-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO：6)；

5’-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：7)；或

5’-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3’(SEQ ID NO：8)，

其中B为5-溴胞嘧啶。

15.权利要求12的组合物，其中ISS包含

5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’。

16.权利要求1的组合物，其中缀合物配偶体为抗原。

17.权利要求16的组合物，其中抗原为变应原。

18.权利要求16的组合物，其中变应原从由甲壳动物变应原、昆虫变应原、哺乳动物变应原、软体动物变应原、植物变应原和真菌变应原组成的组中选择。

19.权利要求18的组合物，其中变应原为植物变应原豚草抗原Amb a1。

20.权利要求1的组合物，还包含从由组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸组成的组中选择的氨基酸。

21.权利要求20的组合物，其中氨基酸为甘氨酸。

22.权利要求21的组合物，其中甘氨酸以约230mM至约285mM的浓度存在于组合物中。

23.权利要求1的组合物，还包含从由乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、山梨糖醇和葡萄糖组成的组中选择的糖类。

24.权利要求23的组合物，其中糖类为蔗糖。

25.权利要求24的组合物，其中蔗糖以约1％至10％的浓度存在于组合物中。

26.权利要求23的组合物，其中糖类为山梨糖醇。

27.权利要求26的组合物，其中山梨糖醇以约3％至约5％的浓度存在于组合物中。

28.组合物，包含缀合物分子、约1mM至约50mM浓度范围的组氨酸和约50mM至约300mM浓度范围的甘氨酸，其中所述组合物具有约6.0至约9.0的pH范围。

29.权利要求28的组合物，还包含约1％至10％范围的山梨糖醇。

30.权利要求28的组合物，还包含约200mM至约250mM浓度的蔗糖。

31.权利要求28的组合物，其中所述组合物具有约7.0至约8.0的pH范围。

32.权利要求28的组合物，包含5mM组氨酸和285mM甘氨酸，pH范围约7.0至约8.0。

33.权利要求28的组合物，包含20mM组氨酸和270mM甘氨酸，pH范围约7.0至约8.0。

34.权利要求28的组合物，包含20mM组氨酸、50mM甘氨酸和3.8％山梨糖醇，pH范围约7.0至约8.0。

35.权利要求28的组合物，包含20mM组氨酸、50mM甘氨酸和210mM蔗糖，pH范围约7.0至约8.0。

36.权利要求28的组合物，其中缀合物配偶体为变应原。

37.权利要求36的组合物，其中变应原为植物变应原。

38.权利要求37的组合物，其中植物变应原为豚草抗原Amb a1。

39.冻干组合物，通过在合适的条件下冻干权利要求23的组合物产生。

40.冻干组合物，其包含权利要求29或30的组合物。

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