ES2259478T3 - Metodos para tratar trastornos asociados con la ige y composiciones para este uso. - Google Patents

Abstract

Una primera composición que inhibe la actividad de IgE lo suficiente para disminuir la actividad de IgE en un individuo, en donde la primera composición comprende un anticuerpo anti IgE y una segunda composición que comprende una cantidad de un antígeno suficiente para modular la respuesta inmune al antígeno en donde el antígeno se une a un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante, para uso en combinación en el tratamiento de una respuesta alérgica al antígeno o trastorno relacionado con la alergia durante la inmunoterapia específica al antígeno del individuo.

Description

Métodos para tratar trastornos asociados con la IgE y composiciones para este uso.

Campo técnico

La presente invención proporciona métodos para tratar trastornos asociados con la IgE y composiciones para este uso. Los métodos son particularmente útiles en el tratamiento de alergias y trastornos relacionados con alergias.

Antecedentes de la técnica

Las respuestas alérgicas, que incluyen las del asma alérgico y rinitis alérgica, se caracterizan por una etapa temprana de respuesta, que ocurre de segundos a minutos de la exposición al alérgeno y se caracteriza por la desgranulación celular, y una etapa tardía de respuesta, que ocurre de 4 a 24 horas más tarde y se caracteriza por la infiltración de eosinófilos en el lugar de exposición al alérgeno. Específicamente, durante la etapa temprana de la respuesta alérgica, la activación de los linfocitos tipo Th2 estimula la producción de anticuerpos IgE específicos al antígeno, que a su vez origina la liberación de histamina y otros mediadores de la inflamación de las células de mastocitos y basófilos. Durante la etapa tardía de la respuesta, se aumenta la producción de IL-4 e IL-5 por células Th2 CD4^{+}. Estas citoquinas parecen jugar un papel significativo para reclutar eosinófilos al lugar de exposición al alérgeno, donde sucede el daño tisular y la disfunción.

En la actualidad, la inmunoterapia de antígeno para trastornos alérgicos envuelve la infiltración subcutánea de pequeñas, pero gradualmente mayores cantidades, de un antígeno en un procedimiento llamado terapia de desensibilización. Dicha inmunoterapia generalmente consiste en muchas inyecciones en el curso de meses, seguido de terapia de mantenimiento con generalmente inyecciones mensuales en el transcurso de hasta cinco años, sin ningún indicador de laboratorio para guiar la finalización de la terapia. La inmunoterapia de antígeno es simplemente paliativa, y en la actualidad, no curativa. Weber (1997) JAMA 278:1881-1887; Stevens (1998) Acta Clinica Beligica 53:66-72; y Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology (1995) Can. Med. Assoc. J. 152:1413-1419. Muchos pacientes que inician la terapia no completan el régimen, y si se interrumpen las inyecciones durante una semana el paciente debe empezar el régimen de tratamiento completo de nuevo. Se han identificado una variedad de antígenos que se han producido por medios de recombinación. Para las revisiones Baldo et al. Allergy (1989), 44:81-97; Baldo Curr Opin Immunol. (1991), 3 :841-50; Blaser Ther Umsch (1994), 51: 19-23; Bousquet Arb Paul Ehrlich Inst Bundesamt Sera Impfstoffe Frankf A K 1994:257-62; Bousquet et al. Adv Exp Med Biol. (1996), 409:463-9; Breiteneder et al. Arb Paul Ehrlich Inst Bundesamt Sera Impfstoffe Frankf A M, 1997:80-6; Crameri et al. Pneumologie (1996), 50 (6):387-93; Donovan et al. Monogr Allergy (1990), 28:52-83; Kraft, Adv Exp Med Biol. (1996), 409:471-4; Nakagawa et al. Int Arch Allergy Immunol. (1993), 102:117-20; Schou, Adv Exp Med Biol. (1996), 409:13 7-40; Thomas, Adv Exp Med Biol. (1996), 409:85-93; Valenta et al. Adv Exp Med Biol. (1996), 409:185-96; Valenta et al. Arb Paul Ehrlich Inst Bundesarnt Sera Impfstoffe Frankf A M, 1997:222-9.

Los tratamientos de inmunoterapia de antígeno presentan el riesgo de inducir anafilaxis mediada por la IgE potencialmente letal y no consideran los eventos de la respuesta alérgica de fase tardía mediados por las citoquinas. De hecho, un médico practicante ha descrito esta terapia como que tiene "el potencial para la desgracia". Weber (1997). Otro problema significativo con la inmunoterapia de antígeno es el riesgo de que las reacciones adversas, especialmente la anafilaxis, reducen significativamente la dosis de antígeno en relación a la cantidad administrada en cada administración y a la cantidad administrada en un periodo de tiempo. Así la inmunoterapia de alergia tradicional es pesada y por lo tanto consume mucho tiempo, inconveniente y cara.

Una aproximación alternativa para el tratamiento de trastornos asociados con la IgE tales como las alergias envuelve la administración de compuestos que inhiben la liberación de histamina. Hay muchos fármacos de este tipo comercializados como remedios obtenibles sin receta. Otros fármacos incluyen un anticuerpo anti IgE que se une a ella. Sin embargo un inconveniente de esta aproximación es que simplemente se enmascaran los síntomas, mientras que no se proporciona ningún tipo de cura permanente o protección.

Lo que se necesita son métodos mejores para tratar los trastornos asociados con la IgE, tales como las alergias.

Descripción de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una primera composición que inhibe la actividad de IgE suficientemente para disminuir la actividad de IgE en un individuo en donde la primera composición comprende un anticuerpo anti IgE y una segunda composición que comprende una cantidad de un antígeno suficiente para modular la respuesta inmune al antígeno en donde el antígeno está unido a un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante, para uso en combinación para tratar una respuesta alérgica al antígeno o trastorno relacionado con alergias durante la inmunoterapia específica de antígeno del individuo.

Así, describimos métodos de tratar una respuesta alérgica a un antígeno o trastorno relacionado con la alergia durante la inmunoterapia específica de antígeno de un individuo administrando al individuo una cantidad de una primera composición que inhibe la actividad de IgE lo bastante para disminuir la actividad de IgE en el individuo y administrar al individuo una cantidad del antígeno (o una segunda composición que comprende el antígeno) suficiente para paliar la respuesta o trastorno, en donde el antígeno está unido a un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una primera composición que inhibe la actividad de IgE suficientemente para paliar un trastorno asociado con la IgE en donde la primera composición comprende un anticuerpo anti IgE y una segunda composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante suficiente para aumentar la actividad de la primera composición, para uso en combinación para tratar un individuo que tiene el trastorno asociado con la IgE.

Así, describimos también métodos de tratar a un individuo que tiene un trastorno asociado con la IgE administrando al individuo una cantidad de una primera composición que inhibe la actividad de la IgE suficientemente para paliar el trastorno y; administrando al individuo una cantidad de una segunda composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante suficiente para aumentar la actividad de la primera composición. En la práctica de la invención, la primera y segunda composición pueden administrarse al individuo en cualquier orden y simultáneamente. Además, como es fácilmente comprensible para cualquier persona que conoce la técnica, los ingredientes activos descritos en cualquiera de las realizaciones presentes (por ejemplo inhibidor de IgE y/o de la anafilaxis, ISS, y/o antígeno) pueden combinarse en una única composición para administración simultánea de uno o más de los ingredientes
activos.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una primera composición que comprende un agente que inhibe la anafilaxis en una cantidad eficaz para inhibir la anafilaxis en donde la primera composición comprende un anticuerpo anti IgE y una segunda composición que comprende un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante en una cantidad suficiente para mejorar la actividad de la primera composición, para uso en combinación para tratar un trastorno asociado con la IgE en un individuo.

Describimos también métodos de tratar una respuesta alérgica o trastorno relacionado con alergias a un alérgeno durante inmunoterapia específica de antígeno administrando al individuo una cantidad de una primera composición que inhibe la actividad de IgE lo suficiente para paliar el trastorno; administrar al individuo una cantidad de una segunda composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante suficiente para aumentar la actividad de la primera composición y; administrar al individuo una tercera composición que comprende una cantidad del antígeno suficiente para inducir la desensibilización al alérgeno. Preferiblemente, la tercera composición se administra después de la primera composición, para evitar el choque anafiláctico. De otro modo, la segunda y tercera composición pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente. Los conjugados de ISS-antígeno aquí descritos son particularmente útiles para la administración simultánea de estas composiciones.

Los métodos aquí proporcionados son adecuados para tratar cualquier trastorno asociado con la IgE incluyendo, pero no limitado a las alergias, los trastorno relacionados con las alergias y las infecciones parasitarias. Una lista no exhaustiva de sustancias a la que los individuos pueden ser alérgicos se proporciona en la tabla 1. Se conoce una variedad de trastornos relacionados con alergias, incluyendo, pero no limitados a, el asma, la urticaria y otros aquí descritos. Las infecciones parasitarias incluyen, pero no están limitadas a aquellas asociadas con los helmintos.

Como se describe aquí, la composición que inhibe la actividad de IgE es un anticuerpo anti IgE.

La invención proporciona además composiciones que contienen al menos un antígeno para uso en inmunoterapia según los métodos aquí descritos. Es importante, que estas composiciones sean adecuadas para administración a un individuo en una concentración mayor que la aceptable para uso en terapia de desensibilización a la alergia. Las composiciones pueden así proporcionarse en una forma más concentrada comparada con las composiciones típicamente usadas en la terapia de desensibilización.

La presente invención proporciona además composiciones que contienen una composición que inhibe la actividad de IgE, que comprenden un anticuerpo anti IgE y un oligonucleótido inmunoestimulante para uso en los métodos aquí descritos.

Formas de realizar la invención

Esta invención proporciona una combinación de (a) uno (o más) agente(s) en una o más composiciones que inhiben la actividad de IgE en un individuo, preferiblemente lo suficiente para reducir, o bloquear, reacciones adversas, incluyendo la anafilaxis (cuando hay administración y/o exposición a un antígeno), y (b) inmunoterapia que emplea un polinucleótido inmunoestimulante o antígeno y secuencias de polinucleótido inmunoestimulante (ISS) en el contexto de trastornos asociados con la IgE, tales como condiciones alérgicas. Dicha combinación permite ventajas significativas sobre la terapia tradicional actual. Con la terapia de combinación de la invención, más agresiva, y por lo tanto más eficaz, es posible la inmunoterapia (debido a las cantidades mayores de antígeno que pueden administrarse) con un riesgo significativamente reducido de efectos secundarios no deseados, tales como la anafilaxis. Además, el tratamiento puede proceder más rápidamente, ahorrando tiempo e inconveniencia. Esto es una consideración significativa especialmente en la inmunoterapia tradicional de la alergia, donde un paciente tiene que ir a la clínica muchas veces en un largo periodo de tiempo, a menudo para conseguir sólo resultados cuestionables. El tiempo de terapia más corto es también ventajoso ya que el éxito del tratamiento puede ser más fácilmente y exactamente determinado.

En contraste con la terapia convencional de desensibilización, que mantiene una dosis relativamente baja que lentamente aumenta con el tiempo, la presente invención permite administrar antígeno en dosis significativamente más altas (por ejemplo puede administrarse una cantidad de antígeno que normalmente produciría un riesgo alto de anafilaxis si no se administrara los inhibidores de IgE).

Técnicas generales

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de la biología molecular (incluyendo técnicas de recombinación), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican en su totalidad en la bibliografía, tales como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); y Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (David Wild, ed., Stochton Press NY, 1994); and Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, and N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH,1993).

Definiciones

Como se usa aquí, "el tratamiento" es un planteamiento para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a, el alivio de uno o más de los síntomas, la disminución de la magnitud del trastorno o enfermedad, el estado estabilizado (o sea no empeorando) del trastorno o enfermedad, el retraso o la lentificación de la progresión del trastorno o enfermedad, la mejora o paliado del trastorno o el estado de la enfermedad, y la remisión (sea parcial o total), sea esta detectable o no detectable. "El tratamiento" puede también significar prolongar la supervivencia comparada con la supervivencia esperable si no se recibe tratamiento.

"Paliar" una enfermedad o trastorno significa que la magnitud y/o manifestaciones clínicas no deseables de un trastorno o estado de enfermedad se minimizan y/o el tiempo de la progresión se lentifica o se alarga, cuando se compara con el trastorno no tratado. Especialmente en el contexto de la alergia, como se entiende bien por aquellos que conocen la técnica, el paliado puede ocurrir con la modulación de la respuesta inmune contra un alérgeno(s). Además el paliado no ocurre necesariamente con la administración de una dosis, sino que a menudo ocurre con la administración de una serie de dosis. Así una cantidad suficiente para paliar una respuesta o trastorno puede administrarse en una o más administraciones.

Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, animales de granja, animales para deporte, roedores y animales domésticos.

Un "trastorno asociado con la IgE" es una condición fisiológica que se caracteriza, en parte, por concentraciones elevadas de IgE, que pueden o no ser persistentes. Los trastornos asociados con la IgE incluyen, pero no están limitados a, la alergia y reacciones alérgicas, trastornos relacionados con la alergia (descritos a continuación), asma, rinitis, conjuntivitis, urticaria, shock, alergias de picadura de los himenópteros, y alergias a fármacos, e infecciones parasitarias. El término incluye también manifestaciones relacionadas con estos trastornos. Generalmente la IgE en dichos trastornos es específica al antígeno.

Una "respuesta alérgica al antígeno" significa una respuesta inmune generalmente caracterizada por la generación de IgE específica al antígeno y el efecto resultante de los anticuerpos de IgE. Como se sabe bien en la técnica, la IgE se une a los receptores de IgE en las células de mastocitos y basófilos. En la exposición posterior al antígeno reconocido por la IgE, el antígeno se entrecruza con la IgE en las células mastocitos y basófilos causando la desgranulación de estas células. Se entiende y se intenta que el término "respuesta alérgica a un antígeno", "alergia", y "condición alérgica" sean igualmente apropiados en la aplicación de los métodos de la invención. Además se entiende y se intenta que los métodos de la invención sean igualmente apropiados para prevenir una respuesta alérgica así como para tratar una condición alérgica preexistente.

Un "trastorno relacionado con la alergia" significa un trastorno que resulta de los efectos de una respuesta inmune de IgE específica a un antígeno. Dichos efectos pueden incluir, pero no están limitados a, la hipotensión y el shock. La anafilaxis es un ejemplo de un trastorno relacionado con la alergia durante el cual se libera histamina en la circulación que causa vasodilatación así como un aumento de permeabilidad de los capilares con una marcada pérdida resultante de plasma de la circulación. La anafilaxis puede ocurrir sistémica mente, con los efectos asociados experimentados en el cuerpo entero, y puede ocurrir localmente, con la reacción limitada a un tejido u órgano diana especí-
fico.

Una "infección parasitaria" significa una infección por parásitos metazoos, incluyendo los helmintos, por ejemplo la Esquistosoma mansoni. Para los propósitos de esta invención, una infección parasitaria está acompañada de concentraciones elevadas de IgE (y así es un trastorno asociado con la IgE).

Como se usa aquí, el término "antígeno" significa una sustancia que es reconocida y se une específicamente a un anticuerpo o a un receptor antígeno de célula T. Los antígenos pueden incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, gangliósidos y lípidos; partes de los mismos y combinaciones de los mismos. Los antígenos pueden ser aquellos encontrados en la naturaleza o pueden ser sintéticos. Los haptenos están incluidos dentro del alcance de "antígeno". Un hapteno es un compuesto de bajo peso molecular que no es inmunogénico por sí mismo pero se vuelve inmunogénico cuando se conjuga con una molécula inmunógena que contiene determinantes antígenos.

Como se usa aquí el término "alérgeno" significa un antígeno o parte antígena de una molécula, normalmente una proteína, que produce una respuesta alérgica después de exposición a un individuo. Típicamente el individuo es alérgico al alérgeno como se indica, por ejemplo, por la prueba de la roncha y el enrojecido (wheal and flare) o cualquier método conocido en la técnica. Se dice que una molécula es un alérgeno si solo una pequeña parte de individuos exhiben una respuesta inmune después de la exposición a la molécula. Se conocen un número de alérgenos aislados en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados a, los que se proporcionan en la tabla 1 (a continuación).

El término desensibilización se refiere al procedimiento de administrar cantidades en aumento de un alérgeno al que el individuo ha demostrado sensibilidad. Ejemplos de dosis de alérgenos usadas para la desensibilización se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, Fornadley (1998) Otoralyngol. Clin. North Am. 31:111-127.

Una "cantidad eficaz" de una sustancia es la cantidad suficiente para conseguir resultados clínicos beneficiosos o deseados, y, como tal, una "cantidad eficaz" de pende del contexto en que se aplica. En el contexto de tratamiento, o terapia, una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para conseguir la mejora o paliado del trastorno que se trata por los métodos de la presente invención. En el contexto de administrar una composición que inhibe la actividad de IgE (o sea, una composición que comprende un agente que inhibe la actividad de IgE), una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para conseguir dicha inhibición (que no necesita ser total, o absoluta). Lo más preferible, particularmente en el contexto de la alergia, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para reducir y/o suprimir la anafilaxis (u otros efectos secundarios no deseados) con la administración y/o exposición al antígeno. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones, y se entiende que, especialmente en el contexto de la terapia de desensibilización de la alergia, una cantidad eficaz se consigue en una serie de administraciones, típicamente en dosis que van en aumento.

El término "ISS" como se usa aquí se refiere a secuencias de oligonucleótidos que producen una respuesta inmune que se puede medir como se mide in vitro, in vivo y/o ex vivo. Como se entiende bien en la técnica, el término oligonucleótido reúne varias longitudes de secuencia, y como se describe aquí, y es fácilmente aparente para aquellos que conocen la técnica, el término "ISS" incluye polinucleótidos que contienen (o alternativamente pueden consistir en) un ISS. Ejemplos de respuestas. inmunes que puede ser medidas incluyen, pero no están limitadas a, producción de anticuerpos específicos al antígeno, secreción de citoquinas, activación o expansión de poblaciones de linfocitos tales como células NK, linfocitos CD4^{+}, linfocitos CD8^{+}, linfocitos B, y similares. Preferiblemente, las secuencias de ISS preferentemente activan una respuesta tipo Th1. Una descripción adicional de ISS adecuados para uso en la presente invención se describe a continuación.

Un "conjugado antígeno de ISS" se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido de ISS que comprende un ISS unido a un antígeno a través de interacciones covalentes y/o no covalentes.

Como se usa aquí, el término "agente" significa un compuesto biológico o químico tal como una molécula orgánica o inorgánica sencilla o compleja, un péptido, una proteína o un oligonucleótido. Pueden sintetizarse un gran número de compuestos, por ejemplo, proteínas, péptidos, y polinucleótidos y compuestos orgánicos sintéticos basados en varias estructuras básicas, y estos también están incluidos en el término "agente". Además varias fuentes naturales pueden proporcionar compuestos, tales como extractos de plantas o animales, y similares. Los agentes pueden administrarse solos o en varias combinaciones.

Una composición o agente que "inhibe la actividad de IgE" es una composición que contiene un agente(s) que reduce la actividad de IgE cuando se compara, en las mismas condiciones, con la composición sin el agente. Como se conoce en la técnica, la actividad de IgE es generalmente indicada y medida por las concentraciones en circulación de IgE, pero puede también ser indicada y medida con actividades asociadas con la función de IgE, tal como unión a los basófilos, anafilaxis, y unión a los receptores tales como los receptores Fc (incluyendo receptores Fc de alta afinidad y el receptor de baja afinidad, CD23). Cualquier cantidad de reducción es suficiente. Preferiblemente, cuando es en términos de IgE circulante, la concentración se reduce al menos alrededor del 10%, preferiblemente al menos alrededor del 20%, preferiblemente al menos alrededor del 40%, más preferiblemente al menos alrededor del 50%, más preferiblemente al menos alrededor del 60%, más preferiblemente al menos alrededor del 75%, más preferiblemente al menos alrededor del 80%, más preferiblemente al menos alrededor del 90%, más preferiblemente al menos alrededor del 95%. Otra medida de la reducción de la actividad de IgE, y especialmente pertinente para la presente invención, es la inhibición de anafilaxis (o reducción a eliminación del riesgo de anafilaxis). Los agentes que inhiben la actividad de IgE se describen aquí, e incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos anti IgE, receptores de IgE, anticuerpos anti receptores IgE, ligandos para receptores IgE.

Un agente (o composición) que "inhibe" la anafilaxis es el que disminuye la magnitud de la anafilaxis que habría ocurrido en las mismas condiciones, exceptuando la ausencia del agente. Según esto, un agente o composición que inhibe la anafilaxis es uno que reduce (o incluso elimina) el riesgo de anafilaxis. Más corrientemente el inhibir la anafilaxis envuelve reducir la actividad de IgE (incluyendo reducir las concentraciones de IgE en circulación por, por ejemplo, unión a la IgE); unirse a la IgE en células B que segregan IgE; antagonistas; afectar eventos en la producción inicial de IgE; bloquear la habilidad de IgE para unirse a los receptores de las células mastocitos (por ejemplo, uniéndose al receptor de las células mastocitos sin originar la liberación de histamina). Para los propósitos de esta invención, cualquier agente que actúa antes de la liberación de histamina es aceptable. Se prefiere un agente que actúa inhibiendo la producción de y/o la actividad de IgE, siempre que el inhibidor(es) no induzca anafilaxis sistémica. Así, preferiblemente, los inhibidores de la actividad de IgE usados en esta invención no originan la liberación de histamina por los basófilos o células mastocitos.

Métodos de la invención

En la invención se proporcionan métodos para tratar alergias así como otros trastornos asociados con IgE. Según esto, en una realización, la invención proporciona métodos para tratar una respuesta alérgica a un antígeno o un trastorno relacionado con la alergia durante inmunoterapia específica de antígeno (por ejemplo métodos para inmunoterapia específica de antígeno o terapia de desensibilización) de un individuo, que comprende (a) administrar una primera composición que inhibe la actividad de IgE (preferiblemente inhibe o suprime la anafilaxis); y (b) administrar una segunda composición que comprende una cantidad de antígeno suficiente para modular la respuesta inmune a un antígeno en donde el antígeno está unido a un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante. La modulación de la respuesta inmune debería paliar la respuesta o trastorno. Como se describe aquí, se entiende que, en estas realizaciones, la cantidad de antígeno administrado es mayor que la que se administraría en la desensibilización cuando no se administra un inhibidor de IgE (o sea la cantidad de antígeno administrado es mayor que la que se usa generalmente en la terapia convencional de desensibilización). En una realización preferida, la primera composición comprende un anticuerpo anti IgE, preferiblemente humanizado, como se describe a continuación. Además del anticuerpo anti IgE, el antígeno de la segunda composición está unido a un polinucleótido que comprende un oligonucleótido tremulantes (por ejemplo un ISS). Esta unión puede ser covalente, no covalente, o por otros mecanismos, tales como encapsulación o unión a una molécula de plataforma. En otras realizaciones, la primera composición comprende un anticuerpo anti IgE, y la segunda composición comprende un antígeno unido a un polinucleótido que comprende o consiste en un ISS, preferiblemente por conjugación.

En otra realización, se proporcionan métodos para tratar un trastorno asociado con la IgE en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad de una primera composición que inhibe la actividad de IgE suficientemente para paliar el trastorno; y administrar al individuo una cantidad de una segunda composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante suficiente para aumentar la actividad de la primera composición. En otras realizaciones, se administra también un antígeno(s). Generalmente, la primera composición se administra en una cantidad suficiente para disminuir la actividad de IgE. Estas realizaciones son particularmente útiles ya que la administración de ISS ayuda a disminuir y mantener la disminución en la concentración de IgE, mientras que aumenta la respuesta Th1. El trastorno asociado con IgE, como se describe a continuación, incluye, pero no está limitado a, alergias (cualquier tipo de alergias); trastornos relacionados con la alergia; y asma.

En los métodos de la invención, se administra una composición que inhibe la actividad de IgE (por ejemplo la composición contiene un agente(s) que inhibe la actividad de IgE). Preferiblemente, esta inhibición es suficiente para evitar, o suprimir la magnitud de la anafilaxis durante la administración y/o exposición al antígeno.

En otra realización, la invención proporciona métodos para tratar un trastorno asociado con IgE en un individuo, que comprende administrar al individuo una primera composición que comprende un agente que inhibe la anafilaxis, o reduce el riesgo de anafilaxis, preferiblemente un agente que inhibe la actividad de IgE, en donde una cantidad eficaz de la primera composición es una cantidad eficaz para inhibir la anafilaxis (o reducir el riesgo de anafilaxis), y una segunda composición comprende un ISS (o un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante), en donde una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar, o aumentar la actividad de la primera composición. Preferiblemente, se administra también el antígeno al individuo (o en la segunda composición o en una tercera composición).

En una realización preferida, el agente(s) en la primera composición es un anticuerpo anti IgE, preferiblemente humanizado, como se describe a continuación. En algunas realizaciones, además del anticuerpo anti IgE, se administra un antígeno unido a un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante (por ejemplo ISS). Esta unión puede ser covalente, no covalente, o por otros mecanismos, tales como encapsulación o unión a una molécula de plataforma. En otras realizaciones, el primer agente es un anticuerpo anti IgE, y la segunda composición comprende un antígeno unido a ISS (o un polinucleótido que comprende un ISS), preferiblemente por conjugación.

Composiciones para inhibir la actividad de IgE

En los métodos de la invención, se administra una primera composición que inhibe la actividad de IgE (o sea, contiene un agente que inhibe la actividad de IgE), y más preferiblemente inhibe la anafilaxis (o reduce o elimina el riesgo de anafilaxis) particularmente anafilaxis sistémica. Preferiblemente, y como se describe a continuación, se usa un anticuerpo anti IgE, más preferiblemente un anticuerpo humanizado.

Se conocen inhibidores de la actividad de IgE en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos anti IgE, fragmentos que se unen a IgE (incluyendo fragmentos de anticuerpo), receptores, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo algunos inhibidores de la actividad de IgE de la invención actúan bloqueando la unión de IgE a sus receptores en las células B, células mastocitos o basófilos, o bloqueando el lugar de unión de los receptores en la molécula de IgE o bloqueando el lugar de unión de IgE en el receptor. Un anticuerpo anti IgE puede conducir a la eliminación clonal de las células B que producen IgE a través de la unión a IgE en la superficie de las células B y así, a una disminución en la producción de IgE. Además, los inhibidores de la actividad de IgE pueden actuar uniéndose a la IgE soluble y por lo tanto eliminándola de la circulación.

Se conocen inhibidores de la actividad de IgE en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos anti IgE, fragmentos que se unen al antígeno, receptores, o fragmentos de los mismos. El documento de patente de Estados Unidos 5.614.611 describe anticuerpos monoclonales anti IgE humanizados específicos para células B portadoras de IgE. Por medio de la unión específica a las células B y no a los basófilos o células mastocitos, estos anticuerpos anti IgE no inducen la liberación de histamina por los basófilos o células mastocitos.

El documento de patente de Estados Unidos 5.449.760 describe anticuerpos anti IgE que se unen a la IgE soluble pero no a la IgE en la superficie de células B o basófilos. Anticuerpos tales como estos se unen a la IgE soluble e inhiben la actividad de IgE por medio de, por ejemplo, bloquear los lugares de unión del receptor IgE, bloquear el lugar de unión del antígeno y/o simplemente eliminando la IgE de la circulación. Anticuerpos anti IgE y fragmentos que se unen a la IgE adicionales derivados de los anticuerpos anti IgE se describen en el documento de patente de Estados Unidos 5.656.273. El documento de patente de Estados Unidos 5.543.144 describe anticuerpos anti IgE que se unen a la IgE soluble y a la IgE en la membrana de las células que expresan IgE pero no a la IgE unida a los basófilos.

Otro método de inhibir la actividad de IgE es eliminar la IgE de la circulación usando aféresis, en donde el plasma o suero se pasa por una columna de afinidad, que selectivamente elimina el anticuerpo. El grado de selectividad puede determinarse por la naturaleza de la columna de afinidad. Por ejemplo podría diseñarse una columna de afinidad en la cual un anticuerpo anti IgE (policlonal o monoclonal) está entrecruzado con la matriz de la columna.

Preparación de anticuerpos anti IgE

Como se describe aquí, los inhibidores de la actividad de IgE incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos anti IgE y anticuerpos anti receptor de IgE.

Para la producción de anticuerpos anti IgE, IgE humana para inmunización puede purificarse del suero humano, por ejemplo. Alternativamente, puede producirse IgE humana por cultivo de una línea celular que produce IgE, por ejemplo, la línea celular U266, número de ATCC CRL8033. La IgE humana puede ser purificada por cromatografía de afinidad, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, anticuerpos monoclonales del ratón específicos para IgE humana conjugados a una matriz adecuada pueden proporcionar un inmunoabsorbente específico a IgE. Después de que la preparación de IgE se ha puesto en contacto con el inmunoabsorbente, la IgE adsorbida puede ser eluida del inmunoabsorbente en forma sustancialmente pura. Dicha preparación de IgE humana puede usarse como un inmunógeno para la producción de anticuerpos anti IgE

Pueden obtenerse anticuerpos policlonales por administración del conjugado inmunogénico a un hospedante mamífero, usualmente mezclado con un adyuvante. El inmunógeno se prepara convenientemente para inyección rehidratando el inmunógeno liofilizado para formar una solución o suspensión. Adyuvantes preferidos son inmersiones de agua en aceite, particularmente adyuvante de Freund completo para la primera administración, y adyuvante de Freund incompleto para las administraciones de refuerzo. La preparación típicamente se administra en una variedad de lugares, y típicamente en dos o más dosis en el curso de al menos cuatro semanas. Se obtiene el suero y se examina en cuanto a presencia de anticuerpos específicos usando un conjugado hapteno-proteína u otro compuesto de unión competitiva para el analito en un inmunoensayo estándar o reacción de precipitación.

Los antisueros policlonales contendrán típicamente anticuerpos no reactivos con el analito o que tienen reactividad cruzada no deseable. Se conocen métodos para purificar anticuerpos específicos de un antisuero policlonal, particularmente la purificación por afinidad usando una columna de analito conjugado a una fase sólida. El antisuero se pasa por la columna, se lava la columna, y el anticuerpo se eluye con un tampón suave de desnaturalización tal como glicina 0,1 M, NaCl 0,2 M, a pH 2,5. Si se pasa el antisuero por la columna en un tampón que contiene sustancias que potencialmente puedan interferir, entonces la fracción unida y la eluida estarán enriquecidas en anticuerpos que no reaccionan en cruzado.

Preferiblemente, los anticuerpos anti IgE usados en esta invención son monoclonales. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales por un número de técnicas distintas conocidas en la técnica. Para la tecnología de hibridoma, se cita generalmente al lector a Harrow & Lane (1988), documentos de patente de Estados Unidos números 4.491.632, 4.472.500, y 4.444.887, y Methods in Enzymology, 73B:3 (1981). La forma más corriente de producir anticuerpos monoclonales es inmortalizar y clonar un esplenocito u otras células que producen anticuerpos obtenidas de un animal inmunizado. El clon se inmortaliza por un procedimiento tal como fusión con un mieloma no productor, por transfección con un virus de Epstein Barr, o por transformación con ADN oncogénico. Las células tratadas se clonan y cultivan, y se seleccionan los clones que producen anticuerpos de la especificidad deseada. Se prueba la especificidad en los sobrenadantes del cultivo por un número de técnicas, tales como usar el antígeno inmunizador como el reactivo de detección en un inmunoensayo. Una cantidad de anticuerpo monoclonal del clon seleccionado puede entonces purificarse de un gran volumen de sobrenadante de cultivo, o del fluido de ascitis de animales hospedantes adecuadamente preparados inyectados con el clon. El anticuerpo puede probarse en cuanto a actividad como sobrenadante crudo o ascitis, y opcionalmente es purificado usando técnicas bioquímicas estándares de preparación tales como precipitación con sulfato amónico, cromatografía de intercambio de iones, y cromatografía de filtración de gel.

Métodos alternativos para obtener anticuerpos monoclonales envuelven poner en contacto una célula o partícula viral inmunocompetente con el analito deseado o un complejo analito-proteína in vitro. En este contexto, "inmunocompetente" significa que la célula o partícula es capaz de expresar un anticuerpo específico para el antígeno sin reposicionamiento adicional genético, y puede ser seleccionada de una mezcla de células por presentación del antígeno. Células eucariótidas inmunocompetentes pueden recogerse de un mamífero donante inmunizado, o pueden recogerse de un donante no inmunizado y ser preestimuladas in vitro por cultivo en presencia del inmunógeno y factores de crecimiento inmunoestimulantes. Pueden seleccionarse células de la especificidad deseada poniéndolas en contacto con el inmunógeno en condiciones de cultivo que originan la proliferación de clones específicos pero no clones no específicos. Pueden construirse fagos inmunocompetentes que expresen fragmentos de regiones variables de inmunoglobulina en su superficie. Véase Marks et al. (1996) N. Engl. J. Med. 335:730; las solicitudes de patente internacional 94/13804, 92/01047, 90/02809; y McGuinness et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:1149. Pueden seleccionarse fagos de la especificidad deseada, por ejemplo, por adherencia a un complejo hapteno-proteína unido a una fase sólida, y después amplificado en E. Coli.

Pueden también prepararse anticuerpos por técnicas de bioingeniería. Se obtienen secuencias de aminoácidos con regiones variables de cadena pesada y ligera de la especificidad deseada con moléculas de anticuerpos prototipo y opcionalmente modificadas, por ejemplo, para los propósitos de humanización. Los polinucleótidos que las codifican se sintetizan o clonan después, unidos operativamente a elementos de transcripción y traducción, y después expresados en una célula hospedante adecuada. Véase, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos números 5.225.539 y 5.693.761.

Incluso más preferentemente, los anticuerpos usados en la invención son "humanizados" o quiméricos. Los anticuerpos humanizados comprenden regiones variables o que se unen al antígeno (hipervariables o determinantes de la complementariedad) derivadas de un anticuerpo animal (por ejemplo de ratón) y el resto de las regiones se derivan de un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son generalmente menos inmunógenicos en los seres humanos que los anticuerpos no humanos. Métodos para producir anticuerpos humanizados se describen en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos números 5.449.760 y Better et al. (1988) Science 240:1041-1043.

La cantidad de anticuerpos (o cualquier inhibidor de IgE) que debe administrarse puede determinarse empíricamente; además las dosis sugeridas se encuentran típicamente en las publicaciones que describen los anticuerpos. Ejemplos de cantidades eficaces de anticuerpos anti IgE pueden encontrarse, por ejemplo, en los documentos de patente de Estados Unidos 5.543.144 y 5.656.273. El medir las concentraciones de IgE y/o monitorizar los síntomas, por ejemplo, puede ser indicativo de que se ha administrado una cantidad apropiada.

Fragmentos que se unen a IgE

Los inhibidores de actividad de IgE incluyen, pero no están limitados a, fragmentos que se unen a IgE. El término "fragmentos que se unen a IgE" como se usa en esta descripción incluye no sólo moléculas de inmunoglobulina intactas, sino también dichos fragmentos y derivados (incluyendo derivados recombinantes) de moléculas de inmunoglobulina o receptores de células T con la especificidad deseada. Un fragmento que se une al antígeno puede consistir en una cadena de polipéptido única (tal como un scFv), polipéptidos múltiples unidos con enlaces disulfuro (tal como una inmunoglobulina intacta) o péptidos múltiples que están asociados no covalentemente (tal como fragmentos Fv). Los fragmentos que se unen al antígeno típicamente contienen dos dominios variables opuestos, cada uno de una inmunoglobulina o receptor de célula T, pero pueden encontrarse dominios únicos variables de afinidad suficiente que se unen al antígeno por su cuenta.

Los fragmentos de anticuerpos pueden prepararse por métodos estándares de química de proteínas, tales como someter al anticuerpo a la ruptura con un enzima proteolítico como la pepsina, papaína o tripsina; y reducir los enlaces disulfuro con reactivos tales como el ditiotreitol. Ejemplos incluyen fragmentos de Fab (que comprenden dominios V_{H}-C_{H1} y V_{L}-C_{L}), fragmentos F(ab)_{2}, fragmentos Fd (que comprenden dominios V_{H}-C_{H1}-C_{H2} y V_{L}-C_{L}), fragmentos Fv (que comprenden dominios V_{H} y V_{L}), y fragmentos aislados de cadena pesada o ligera con actividad de unión al antígeno. Pueden producirse variantes por ingeniería genética de inmunoglobulinas intactas obteniendo un polinucleótido que codifica el anticuerpo, y aplicando los métodos generales de la biología molecular para cortar secuencias de codificación o introducir mutaciones y traducir la variante. Variantes de ingeniería de interés particular incluyen anticuerpos quiméricos y humanizados, fragmentos tipo Fab, fragmentos de cadena única de región variable (scFv, que comprende regiones variables de cadenas pesadas y ligeras unidos por un enlazador peptídico), y diacuerpos (péptidos que comprenden dos regiones variables que se dimerizan para formar un péptido bivalente que se une al antígeno).

La actividad de unión al antígeno puede determinarse por cualquier ensayo de unión adecuado en el cual el antígeno y el fragmento candidato se combinan en condiciones que permiten que ocurran los complejos - típicamente un tampón isotónico a pH fisiológico. La formación de complejos estables se determina, por ejemplo, por medios fisicoquímicos (tales como un biosensor) o usando una etiqueta adecuada (tal como una etiqueta de radioisótopo o enzima) unida a uno de los componentes reactivos. La presencia de complejos estables tiene una correlación con la actividad de unión. La avidez total entre el antígeno y el péptido es preferiblemente al menos alrededor de 10^{8} M^{-1}, más preferiblemente al menos alrededor de10^{10} M^{-1}, y aún más preferiblemente al menos alrededor de 10^{12} M^{-1}. Los fragmentos que se unen al antígeno se desarrollan típicamente obteniendo un prototipo de anticuerpo de la especificidad deseada, produciendo un fragmento o de otra forma adaptando la estructura, y después probando de nuevo en cuanto a la actividad de unión. La subfragmentación o modificación puede continuar mientras que se mantenga la actividad de unión al antígeno.

Como se entiende en la técnica, la cantidad de fragmentos que se unen a IgE (o cualquier inhibidor de IgE) puede determinarse empíricamente. El medir las concentraciones de IgE y/o monitorizar los síntomas, por ejemplo, puede ser indicativo de que se ha administrado una cantidad apropiada.

Inmunoterapia de antígeno

En algunas realizaciones de la invención se administra el antígeno (o sea una composición que comprende un antígeno(s)). Puesto que el antígeno se administra en el contexto de administración de una composición que inhibe la actividad de IgE (especialmente una que inhibe la anafilaxis con la administración y/o exposición al antígeno), se entiende que la cantidad de antígeno administrada es mayor que la cantidad que se administraría en ausencia de una composición que inhibe la actividad de IgE. Según esto, dichas cantidades son mayores que la dosis máxima tolerada (MTD) de la inmunoterapia convencional de la alergia, que no incluye o contempla usar un inhibidor de IgE. Como se conoce en la técnica, una MTD es la dosis más alta que no induce una reacción anafiláctica sistémica. Alternativamente, la cantidad de antígeno administrada para un individuo que está recibiendo tratamiento según la invención es menor que la MTD.

Según esto, en algunas realizaciones, se administra el antígeno en cantidades de al menos alrededor de1,25, al menos alrededor de 1,5, al menos alrededor de 1,75, al menos alrededor de 2,00 veces más altas que la cantidad que se habría dado, o se daría, durante la terapia convencional de desensibilización (o sea, en ausencia de administrar una composición que inhibe la actividad de IgE). En otras realizaciones, se administra el antígeno en cantidades de al menos alrededor de 5, al menos alrededor de 7, al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 12, al menos alrededor de 15, al menos alrededor de 20 veces más altas que la cantidad que se habría dado o se daría, durante la terapia convencional de desensibilización. En algunas realizaciones, una dosis inicial de antígeno es cualquiera de las siguientes: alrededor de 0,25, alrededor de 0,5, alrededor de 1,0, alrededor de 2,0, alrededor de 5,0, alrededor de 10, alrededor de 15, alrededor de 20 \mug. En algunas realizaciones, una dosis final, o de punto final, es cualquiera de las siguientes: alrededor de 25, alrededor de 40, alrededor de 50, alrededor de 75, alrededor de 100, alrededor de 125, alrededor de 150, alrededor de 175, alrededor de 200 \mug. La cantidad de antígeno administrada puede hacerse en concentraciones mayores y/o volúmenes mayores. Según esto, la "cantidad" de antígeno podría aumentarse en términos de concentración. Se entiende que, además de administrar dosis más altas que las convencionales, es también posible (pero no requerido) aumentar más rápidamente las dosis secuenciales.

Se conocen protocolos de dosis en la técnica. Véase, por ejemplo, Weber (1997); Fornadley (1998) Otolaryngology Clinics North America 31:111-127; Remington's Pharmaceutical Sciences 19 ed. Mack Publishing (1995), capítulo 82. Las dosis de cada antígeno dependen del antígeno particular así como del individuo que recibe la terapia, y además son algo a la discreción del médico individual. Generalmente se administra la inmunoterapia de alérgenos semanalmente con dosis en aumento, y la cantidad de antígeno administrada está en el intervalo del microgramo. La cantidad de antígeno se aumenta hasta que se observa el alivio (o eliminación) de los síntomas o se observan síntomas adversos. Alternativamente, la llamada terapia rápida (de "rush") envuelve administrar inicialmente grupos de administraciones (tales como varias en un día, una vez a la semana), seguida de administraciones semanales. La terapia se da para siempre, con una dosis de mantenimiento administrada a intervalos de dos a cuatro semanas. Con el tiempo, pueden organizarse las dosis de mantenimiento incluso menos frecuentemente, tal como cada seis a ocho semanas.

En los métodos de la invención, pueden usarse cantidades de antígeno variables, siempre que la dosis no induzca anafilaxis sistémica (o sea la MTD). Pueden también usarse dosis más bajas que la MTD.

Se conocen muchos antígenos y se han aislado, a menudo con técnicas recombinantes. La tabla 1 muestra una lista de alérgenos que pueden usarse.

TABLA 1 Alérgenos recombinanates

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Administración de ISS

En algunas realizaciones, los métodos de la invención comprenden la administración de ISS (por ejemplo, un polinucleótido que comprende un ISS) en adición a la administración de un inhibidor de IgE (o inhibidor de la anafilaxis), generalmente en una cantidad suficiente para aumentar la actividad del inhibidor de IgE. Como sería entendido por una persona experta en la técnica, este aumento puede manifestarse en cualquiera de un número de maneras, que incluyen, pero no se limitan a, permitir la persistencia elevada de la supresión de IgE y/o aumentar la reducción de la actividad de IgE cuando se compara con la administración del inhibidor de IgE solo.

Se conocen ISS y pueden ser identificados fácilmente por la actividad inmunoestimulante utilizando métodos estándares de la técnica, tales como medidas de la producción de citoquina y/o producción de anticuerpos. Generalmente, el ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3'. Más particularmente, el ISS comprende la secuencia hexámera 5', purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina-3'.

El ISS preferido comprende la secuencia octámera general 5'-Purina, Purina, Citosina, Guanina, Pirimidina, Pirimidina, Citosina, (Citosina o Guanina)-3'. Lo más preferido, el ISS comprende un octámero seleccionado del grupo que consiste en: AACGTTCC, AACGTTCG, GACGTTCC, y GACGTTCG. En algunas realizaciones, el ISS comprende la secuencia TGACTGTGAACGTTCGAGATGA.

En algunas realizaciones se administra un conjugado de ISS-antígeno. Se hacen uniones covalentes y/o no covalentes entre polinucleótidos y otros restos, tal como péptidos, empleando técnicas estándares de la técnica.

El ISS, o el polinucleótido que comprende un ISS, pueden ser acoplados con la parte de la molécula inmunomoduladora de un conjugado en una variedad de formas, que incluyen interacciones covalentes y/o no covalentes.

La unión entre las partes puede hacerse en el extremo terminal 3' o 5' del polinucleótido que contiene el ISS, o en una base modificada adecuadamente en una posición interna del ISS. Si la molécula inmunomoduladora es un péptido y contiene un grupo reactivo adecuado (por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimida) puede hacerse reaccionar directamente con el grupo N^{4} amino de los residuos de citosina. Dependiendo del número y la localización de los residuos de citosina del ISS, puede conseguirse el marcado específico en uno o más residuos.

Alternativamente, oligonucleósidos modificados, tales como son conocidos en la técnica, pueden incorporarse en cada extremo terminal, o en posiciones internas del polinucleótido que contiene el ISS. Estos pueden contener grupos funcionales bloqueados que, cuando se desbloquean, pueden reaccionar con una variedad de grupos funcionales que pueden estar presentes en, o unidos a, la molécula inmunomoduladora de interés.

Cuando la molécula inmunomoduladora es un péptido, esta parte del conjugado puede unirse al extremo 3' del ISS usando química de soporte sólido. Por ejemplo, la parte ISS puede añadirse a una parte polipeptídica que ha sido presintetizada sobre un soporte. Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499; y Haralambidis et al. (1990b) Nucleic Acids Res. 18:501-505. Alternativamente, el ISS puede sintetizarse de forma que esté conectado a un soporte sólido a través de un conector eliminable que se extiende desde el extremo 3'. Después de romper por vía química el ISS del soporte, se deja un grupo tiol terminal en la posición 3' terminal del oligonucleótido (Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:5305-5321; y Corey et al. (1987) Science 238:1401-1403) o se deja un grupo amino terminal en la posición 3' terminal del oligonucleótido (Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:1781-1794). La conjugación del ISS modificado por amino a grupos amino del péptido puede efectuarse como se describe por Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43-72. La conjugación del ISS modificado por tiol a grupos carboxilo del péptido puede efectuarse como se describe por Sinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press. El acoplamiento de un oligonucleótido que lleva una maleimida con la cadena lateral del tiol de un resto de cisteína de un péptido se ha descrito también. Tung et al. Bioconjug. Chem. 2:464-465.

La porción peptídica del conjugado puede ser unida a la posición 5' terminal del polinucleótido que contiene el ISS a través de un grupo amino, tiol o carboxilo que ha sido incorporado al oligonucleótido durante su síntesis. Preferiblemente, mientras que el oligonucleótido está fijado a un soporte sólido, un grupo de unión que comprende una amina protegida, tiol o carboxilo en un extremo y una fosforamidita en el otro, está covalentemente unido al hidroxilo 5' terminal. Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15: 3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299; y documentos de patente de los Estados Unidos Nºs. 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800, y 5.118.802. Después de la desprotección, las funcionalidades latentes de amina, tiol, y carboxilo pueden usarse para unir covalentemente el oligonucleótido a un péptido. Benoit et al (1987); y Sinach et al. (1991).

La parte peptídica puede unirse a una citosina o uracilo modificados en cualquier posición del polinucleótido que contiene el ISS. La incorporación de un "brazo de unión" que posee una funcionalidad reactiva latente, tal como un grupo amino o carboxilo, en C-5 de la base modificada proporciona un enganche para la unión peptídica. Ruth, 4th Annual Congress for Recombinant DNA Research, p 123.

Un conjugado de la molécula inmunomoduladora de ISS puede formarse también a través de interacciones no-covalentes, tales como enlaces iónicos, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno y/o atracciones de van der Waals.

Conjugados unidos no covalentemente pueden incluir una interacción no covalente tal como un complejo biotina-estreptavidina. Un grupo biotinilo puede ser unido, por ejemplo, a una base modificada de un ISS. Roger et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651. La incorporación de un resto de estreptavidina en la parte peptídica permite la formación de un complejo de enlace no covalente del péptido conjugado a la estreptavidina y al oligonucleótido biotinilado.

Las asociaciones no covalentes pueden también ocurrir a través de interacciones iónicas que envuelven un ISS y restos dentro de la molécula inmunomoduladora, tal como aminoácidos cargados, o a través de una parte de unión que comprende restos cargados que pueden interaccionar con ambos el oligonucleótido y la molécula inmunomoduladora. Por ejemplo, la conjugación no covalente puede ocurrir entre un ISS generalmente cargado negativamente y un resto de aminoácido de un péptido cargado positivamente, por ejemplo restos de polilisina y poliarginina.

La conjugación no covalente entre el ISS y las moléculas inmunomoduladoras puede ocurrir a través de los principales elementos de unión de ADN de moléculas que interaccionan con el ADN como sus ligandos naturales. Por ejemplo, tales principales elementos de unión de ADN pueden encontrarse en los factores de transcripción y en los anticuerpos anti-ADN.

La unión del ISS a un lípido puede formarse utilizando métodos estándares. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, la síntesis de conjugados oligonucleótido-fosfolípido (Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192), conjugados oligonucleótido-ácido graso (Grabarek et al. (1990) Anal Biochem. 185:131-135; y Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156:220-222), y conjugados oligonucleótido-esterol. Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731.

La unión del oligonucleótido a un oligosacárido puede formarse usando métodos conocidos estándares. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, la síntesis de conjugados oligonucleótido-oligosacárido, en donde el oligosacárido es un resto de una inmunoglobulina. O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7:347-355.

La unión de un ISS circular a un péptido o antígeno puede formarse de varias maneras. Cuando el ISS circular se sintetiza utilizando métodos recombinantes o químicos, un nucleósido modificado es adecuado. Ruth (1991) en Oligonuclotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press. Tecnología de unión estándar puede usarse después para conectar el ISS circular al antígeno u otro péptido. Goodchild (1990) Bioconjug. Chem. 1:165. Cuando el ISS circular se aísla, o sintetiza utilizando métodos recombinantes o químicos, la unión puede formarse por activación química, o fotoactivación, de un grupo reactivo (por ejemplo carbeno, radical) que ha sido incorporado en el antígeno u otro péptido.

Métodos adicionales para la unión de péptidos y otras moléculas a. oligonucleótidos pueden encontrarse en el documento de patente de los Estados Unidos Nº. 5.391.723; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for nucleic acids" en Kricka (ed) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; y Geoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem.3:138-146.

Un ISS puede también ser asociado con antígeno(s) en proximidad por (a) encapsulación (tal como, por ejemplo, un liposoma); (b) adsorción sobre una superficie; y (c) vía una molécula de plataforma (por ejemplo, una molécula sintética o nativa que contiene sitios que permiten la unión del ISS y el antígeno(s)).

El ISS puede administrarse solo o en combinación con otros agentes farmacéuticos y/o inmunógenos y/o inmunoestimulantes y puede combinarse con un transportador de los mismos fisiológicamente aceptable. La cantidad eficaz y el método de administración de la formulación de la administración particular del ISS pueden variar basado en el paciente particular y el estado de la enfermedad y otros factores evidentes para la persona experta en la técnica. La(s)
ruta(s) de administración útil(es) en una aplicación particular es(son) evidente(s) para una persona experta en la técnica. Las rutas de administración incluyen pero no están limitadas a vía tópica, dérmica, transdérmica, transmucosal, parenteral epidérmica, gastrointestinal, nasofaríngea y pulmonar, incluyendo transbronquial y transalveolar. Un intervalo de dosis adecuado es aquel que proporciona suficiente composición conteniendo ISS como para obtener una concentración tisular de alrededor de 1-10 \muM medida por las concentraciones en sangre. La cantidad absoluta dada a cada paciente depende de las propiedades farmacológicas tales como la biodisponibilidad, la eliminación y la ruta de administración.

La presente invención proporciona composiciones que contienen ISS adecuadas para la administración tópica que incluyen, pero no se limitan a, implantes fisiológicamente aceptables, pomadas, cremas, enjuagues y geles. La administración tópica es, por ejemplo, mediante una cobertura o vendaje que tiene disperso en él el sistema de administración, o por administración directa de un sistema de administración en incisiones o heridas abiertas. Cremas, enjuagues, geles o pomadas, en las que se ha dispersado una composición que contiene ISS son adecuados para el uso como pomadas tópicas o agentes de cobertura de heridas

Las rutas preferidas de administración dérmica son aquellas que son las menos invasivas. Las preferidas entre estas son transmisión transdérmica, administración epidérmica e inyección subcutánea. De éstas, la administración epidérmica se prefiere debido a la concentración mayor de APCs (células presentadoras de antígeno) que se espera en el tejido intradérmico.

La administración transdérmica se lleva a cabo por aplicación de una crema, enjuague, gel, etc. capaz de permitir que la composición que contiene ISS penetre la piel y entre en el flujo sanguíneo. Las composiciones adecuadas para la administración transdérmica incluyen, pero no se limitan a, suspensiones farmacéuticamente aceptables, aceites, cremas y pomadas aplicadas directamente sobre la piel o incorporadas en un vehículo protector tal como un dispositivo transdérmico (llamado parche). Ejemplos de cremas adecuadas, pomadas etc. pueden encontrarse, por ejemplo, en el Physician's Desk Reference.

Para la transmisión transdérmica, la iontoforesis es un método adecuado. La transmisión iontoforética puede conseguirse usando parches comercializados que envían su producto continuamente a través de la piel intacta por periodos de varios días o más. El uso de este método permite la transmisión controlada de composiciones farmacéuticas en relativamente grandes concentraciones, permite la infusión de fármacos de combinación y permite el uso contemporáneo de un promotor de la absorción.

Un producto de parche como ejemplo para usar en este método es el LECTRO PATCH producto de marca registrada de General Medical Company de Los Ángeles, California. Este producto electrónicamente mantiene los electrodos del depósito a pH neutro y puede adaptarse para proporcionar dosis de diferentes concentraciones, para dosificación continua y/o periódica. La preparación y uso del parche debe llevarse a cabo según las instrucciones impresas del fabricante que acompañan al producto LECTRO PATCH; estas instrucciones se incorporan aquí como referen-
cia.

Para la transmisión transdérmica, el envío ultrasónico de baja frecuencia es también un método adecuado. Mitragotri et al. (1995) Science 269:850-853. La aplicación de frecuencias ultrasónicas de baja frecuencia (alrededor de 1 MHz) permite el envío generalmente controlado de composiciones terapéuticas, que incluye las de alto peso molecular.

La administración epidérmica envuelve esencialmente la irritación mecánica o química de la capa externa de la epidermis suficientemente como para provocar una respuesta inmune al irritante. Específicamente, la irritación debería ser suficiente para atraer APCs al lugar de la irritación.

Un medio de irritación mecánico como ejemplo emplea una multiplicidad de puntas cortas de muy pequeño diámetro, que pueden usarse para irritar la piel y atraer APCs al lugar de irritación, para tomar las composiciones que contienen ISS transferidas desde el extremo de las puntas. Por ejemplo, la antigua prueba de la tuberculina de MONO-VAC de Pasteur Merieux de Lión, Francia que contiene un aparato adecuado para la introducción de composiciones que contienen ISS.

El aparato (que es distribuido en los Estados Unidos por Connaught Laboratories, Inc. de Swiftwater, PA) consiste en un recipiente de plástico que tiene un émbolo de jeringa en un extremo y un disco de punta en el otro. El disco de punta soporta una multiplicidad de puntas de pequeño diámetro de una longitud que justo rasca la capa externa de las células de la epidermis. Cada una de las puntas del kit de MONO - VACC está recubierta con tuberculina antigua; en la presente invención, cada aguja esta recubierta con una composición farmacéutica que contiene la composición de ISS. El uso del aparato es preferiblemente según las instrucciones escritas del fabricante incluidas con el aparato. Aparatos similares que pueden usarse en esta realización son aquellos que se usan normalmente para llevar a cabo las pruebas de alergia.

Otra aproximación adecuada para la administración epidérmica de ISS es el empleo de un producto químico que irrita las células más externas de la epidermis, provocando así una respuesta inmune suficiente para atraer APCs al área. Un ejemplo es un agente queratinolítico, tal como el ácido salicílico usado en la crema de depilar tópica que está comercializada por Noxema Corporation con el nombre de NAIR. Esta aproximación puede usarse también para conseguir la administración epitelial a la mucosa. El irritante químico puede aplicarse también en conjunción con el irritante mecánico (como, por ejemplo, ocurriría si la punta tipo MONO-VACC estuviera también recubierta con el irritante químico). El ISS puede suspenderse en un vehículo que contenga también el irritante químico o coadministrarlo con él.

Otro método de administración para las composiciones que contienen ISS hace uso de polímeros no lípidos, tales como un polímero de amino sintético policatiónico. Leff (1997) Bioworld 86:1-2.

Las rutas de administración parenterales incluyen pero no están limitadas a inyección eléctrica (iontoforesis) o inyección directa tal como una inyección directa en una línea venosa central, intravenosa, inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, o subcutánea. Las composiciones adecuadas para la administración parenteral incluyen, pero no están limitadas a, soluciones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables. Tales soluciones incluyen, pero no están limitadas a, solución salina y solución salina tamponada de fosfato para inyección de composiciones que contienen el ISS.

Las rutas de administración gastrointestinal incluyen, pero no están limitadas a, de ingestión y rectal. La invención incluye composiciones que contienen ISS adecuadas para la administración gastrointestinal que incluyen, pero no están limitadas a, polvos, píldoras o líquidos farmacéuticamente aceptables, para la ingestión y supositorios para la administración rectal.

Las rutas de administración nasofaríngea y pulmonar incluyen, pero no están limitadas a, rutas por inhalación, transbronquial y transalveolar. La invención incluye composiciones que contienen ISS adecuadas para la administración por inhalación que incluyen, pero no están limitadas a, varios tipos de aerosoles para la inhalación, así como formas en polvo para sistemas de administración. Los aparatos adecuados para la administración por inhalación de composiciones que contienen ISS incluyen, pero no están limitados a, atomizadores y vaporizadores. Los atomizadores y vaporizadores llenos con los polvos están entre una variedad de aparatos adecuados para el uso para la administración de polvos por inhalación. Véase, por ejemplo, Lindberg (1993) Summary of Lecture at Management Forum 6-7 Diciembre 1993 "Creating the Future for Portable Inhalers".

Los métodos para la producción de aparatos adecuados para la inyección, aplicación tópica, atomizadores y vaporizadores se conocen en la técnica y no se describirán en detalle.

La elección de las rutas de administración puede usarse para modular la respuesta inmune provocada. Por ejemplo, los títulos de IgG y las actividades CTL fueron idénticos cuando el vector del virus de la gripe se administró por rutas intramuscular o epidérmica (con acelerador de partículas, gene gun); sin embargo, la inoculación muscular produjo primariamente IgG2A, mientras que la ruta epidérmica produjo principalmente IgG1. Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70:6119-6125. Así, una persona conocedora de la técnica puede usar con ventaja las pequeñas diferencias en la inmunogenicidad provocadas por las diferentes rutas de administración de las composiciones de la presente invención.

Las composiciones mencionadas anteriormente y los métodos de administración intentan describir pero no limitan los métodos de la invención. Los métodos de producir las varias composiciones y aparatos están dentro de la habilidad de una persona conocedora de la técnica y no se describen en detalle aquí.

Dosis

Las dosis para los inhibidores de IgE (especialmente anticuerpos anti IgE) y antígenos han sido descritas anteriormente, y envuelven generalmente determinaciones empíricas bien conocidas en la técnica. Con respecto a ISS, en general, un intervalo de dosis adecuado es uno que proporciona suficiente composición que contiene ISS para obtener una concentración tisular de alrededor de 1-10 \muM como se mide en las concentraciones sanguíneas. Como con el inhibidor de IgE y el antígeno, las dosis adecuadas de ISS pueden determinarse empíricamente por una persona con conocimiento de la técnica.

Las composiciones pueden darse en cualquier orden o simultáneamente.

Evaluación de la respuesta inmune

El análisis (cualitativo y cuantitativo) de la respuesta inmune a composiciones de la presente invención puede ser por cualquier método conocido en la técnica, que incluye, pero no está limitado a, medir la producción del anticuerpo específico al antígeno, activación de las poblaciones específicas de linfocitos tales como células TCD4^{+} o células NK, y/o producción de citoquinas tales como IFN, IL-2, IL-4, o IL-12. Los métodos para medir las respuestas de anticuerpo específico incluyen el ensayo de inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA) y son bien conocidos en la técnica. La medida de los números de los tipos específicos de linfocitos tales como células TCD4^{+} puede obtenerse, por ejemplo, por sorteo celular activado por fluorescencia (FACS). Los ensayos de citotoxicidad pueden llevarse a cabo, por ejemplo, como se describe por Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523. Las concentraciones de suero de citoquinas pueden medirse, por ejemplo, por ELISA. Estos y otros ensayos para evaluar la respuesta inmune a un inmunógeno son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Selected Methods in Cellular Immunology (1980) Mishell y Shiigi, eds., W.H. Freeman y Co. La valoración de la respuesta inmune puede también ser subjetiva. Por ejemplo, un sujeto puede reportar una incidencia disminuida o severidad de las reacciones alérgicas a alérgenos particulares.

Kits y composiciones

La presente invención también proporciona kits y composiciones adecuadas para usar con los métodos descritos aquí.

Los kits de la invención comprenden cualquiera de las composiciones siguientes en el empaquetamiento adecuado: (a) inhibidor(es) de IgE y un antígeno; (b) un antígeno en concentración mayor que está generalmente formulado para la terapia de desensibilización convencional (véase la descripción a continuación); (c) un inhibidor(es) de IgE y uno o más ISS; (d) un inhibidor(es) de IgE y uno o más ISS y un antígeno; (e) un inhibidor(es) de IgE y un conjugado ISS-Ag; (f) un inhibidor(es) de IgE y un ISS próximo asociado con el antígeno. Los kits de la invención pueden opcionalmente contener instrucciones para su uso y/o cualquier otro componente adecuado.

Las composiciones de la invención son formulaciones nuevas en las cuales la concentración del antígeno(s) es mayor que aquella (o aquellos) usados en la terapia actual de desensibilización convencional. Según esto, la cantidad de antígeno por unidad de volumen en las nuevas formulaciones de la invención es una cantidad eficaz para inducir la desensibilización del antígeno (que se consigue generalmente con una serie de dosis en aumento) mientras que no induzca anafilaxis. Las cantidades de antígeno(s) de las nuevas formulaciones de la invención son significativamente mayores que, y no son sugeridas por, las formulaciones anteriores de la técnica. En algunas realizaciones, las concentraciones son una cualquiera de las siguientes: alrededor de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 veces más concentradas que las formulaciones usadas en la terapia convencional. Las concentraciones de las formulaciones de antígeno actualmente en uso son conocidas en la técnica y no necesitan ser descritas aquí.

La invención también proporciona composiciones que comprenden una composición o agente que inhibe la actividad de la IgE y un oligonucleótido inmunoestimulante (ISS).

Generalmente, las composiciones de la invención preferiblemente también comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como es bien conocido en la técnica, un excipiente farmacéuticamente aceptable es una sustancia relativamente inerte que facilita la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como un diluyente. Excipientes adecuados incluyen pero no están limitados a agentes estabilizantes, humectantes y agentes emulsificantes, sales para variar la osmolaridad, agentes para encapsulación, tampones, aumentadores de la penetración por la piel. Excipientes así como formulaciones para la administración del fármaco por vía parenteral y no parenteral se establecen en Remington's Pharmaceutical Sciences 19 edición Mack Publishing (1995).

Otras formulaciones incluyen formas de administración adecuadas conocidas en la técnica que incluyen, pero no están limitadas a, vehículos como liposomas. Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. La preparación de los liposomas incluye, pero no está limitada a, citofectinas, vesículas multilamelares y vesículas unilamelares.

Generalmente, estas composiciones se formulan para la administración por inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). Según esto, estas composiciones están preferiblemente combinadas con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y similares. El régimen de dosis particular, por ejemplo, dosis, tiempo y repetición, dependerá del individuo particular y de la historia médica individual.

Otras formulaciones incluyen formas de administración adecuadas conocidas en la técnica que incluyen, pero no están limitadas a, vehículos como liposomas, Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Las preparaciones de liposomas incluyen, pero no están limitadas a, citofectinas, vesículas multilamelares y vesículas unilamelares.

En algunas realizaciones, más de un antígeno(s) puede estar presente en una composición. Tales composiciones pueden contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco diferentes antígeno(s).
Tales "cockteles", como son denominados a menudo en la técnica, pueden ser particularmente eficaces en el tratamiento de individuos quienes, por ejemplo, son alérgicos a más de un alérgeno.

Claims (12)

1. Una primera composición que inhibe la actividad de IgE lo suficiente para disminuir la actividad de IgE en un individuo, en donde la primera composición comprende un anticuerpo anti IgE y una segunda composición que comprende una cantidad de un antígeno suficiente para modular la respuesta inmune al antígeno en donde el antígeno se une a un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante, para uso en combinación en el tratamiento de una respuesta alérgica al antígeno o trastorno relacionado con la alergia durante la inmunoterapia específica al antígeno del individuo.

2. Una primera composición que inhibe la actividad de IgE lo suficiente para paliar un trastorno asociado con la IgE, en donde la primera composición comprende un anticuerpo anti IgE y una segunda composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante suficiente para aumentar la actividad de la primera composición, para uso en combinación en el tratamiento de un individuo que tiene el trastorno asociado con la IgE.

3. Las composiciones según la reivindicación 2, en donde el trastorno asociado con la IgE es una alergia o trastorno relacionado con la alergia, o una infección parasitaria.

4. Las composiciones según la reivindicación 3, en donde el anticuerpo anti IgE es un anticuerpo murino humanizado.

5. Las composiciones según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 4, en donde la primera composición se administra antes de la segunda composición, la segunda composición se administra antes de la primera composición, o la primera composición se administra con la segunda composición.

6. Las composiciones de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, para tratar una respuesta alérgica o trastorno relacionado con la alergia a un alérgeno durante la inmunoterapia específica al antígeno, que comprende además una tercera composición que comprende una cantidad de antígeno suficiente para inducir la desensibilización al alérgeno.

7. Las composiciones según la reivindicación 6, en donde la segunda composición y la tercera composición comprenden una composición única que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante conjugado al antígeno.

8. Una primera composición que comprende un agente que inhibe la anafilaxis en una cantidad eficaz para inhibir la anafilaxis, en donde el agente en la primera composición es un anticuerpo anti IgE y una segunda composición que comprende un polinucleótido que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante en una cantidad suficiente para mejorar la actividad de la primera composición, para uso en combinación en el tratamiento de un trastorno asociado con la IgE en un individuo.

9. Las composiciones de la reivindicación 8, que comprenden además un antígeno.

10. Las composiciones de la reivindicación 9, en donde el antígeno está unido al polinucleótido.

11. Una composición que comprende una composición que inhibe la actividad de IgE, en donde la composición comprende un anticuerpo anti IgE y un oligonucleótido inmunoestimulante.

12. Un kit que comprende:

(a) una composición que inhibe la actividad de IgE, en donde la composición comprende un anticuerpo anti IgE; y

(b) un oligonucleótido inmunoestimulante;

en un empaquetamiento adecuado.