DE69637472T2

DE69637472T2 - Rekombinante vesiculoviren und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69637472T2
Application number: DE69637472T
Authority: DE
Inventors: John K. Guilford ROSE
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-01
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2016-05-02
Also published as: US20050238656A1; ATE390145T1; EP0871482B1; AU714616B2; EP0871482A4; DE69637472D1; US6168943B1; CA2220133A1; CA2220133C; US7153510B1; ES2304787T3; DK0871482T3; AU5634596A; EP0871482A1; WO1996034625A1; PT871482E

Description

1. EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Vesiculoviren, die replizierbar sind und in der Lage sind, fremde, in ihrem Genom enthaltene Nucleinsäuren zu exprimieren. Ebenfalls bereitgestellt werden inaktivierte Formen der rekombinanten Viren. Die Vesiculoviren sind in Impfstoffformulierungen zur Prävention oder Behandlung verschiedener Erkrankungen und Gesundheitsstörungen nützlich.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
2.1. RHABDOVIREN
Rhabdoviren sind von einer Membran eingehüllte Viren, die in der Natur weit verbreitet sind, wo sie Vertebraten, Invertebraten und Pflanzen infizieren. Es gibt innerhalb der Rhabdoviren zwei verschiedene Gattungen, die Gattung Lyssavirus und die Gattung Vesiculovirus. Rhabdoviren haben Genome aus einzelsträngiger RNA negativer Polarität von 11–12 000 Nucleotiden (Rose und Schubert, 1987, Rhabdovirus genomes and their products, in The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Publishing Corp., N. Y., S. 129–166). Die Viruspartikel enthalten einen helikalen Nucleocapsidkern, der aus der genomischen RNA und Protein besteht. Im Allgemeinen finden sich drei Proteine, die als N (Nucleocapsid), P (früher als NS bezeichnet, was ursprünglich nicht-strukturell bedeutete) und L (Large) bezeichnet werden, mit dem Nucleocapsid assoziiert. Ein weiteres Matrix (M)-Protein liegt innerhalb der Membranhülle, möglicherweise in Wechselwirkung sowohl mit der Membran als auch dem Nucleocapsidkern. Ein einziges Glycoprotein (G) durchdringt die gesamte Membran und bildet die Spikes auf der Oberfläche des Viruspartikels. Da das Genom negative Polarität hat (d. h. komplementär zu der RNA-Sequenz (positive Polarität) ist, die als mRNA fungiert und dadurch direkt das codierte Protein erzeugt), müssen Rhabdoviren für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase codieren und sie im Virion verpacken (Baltimore et al., 1970, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66: 572–576), das aus dem P- und dem L-Protein besteht. Dieses Enzym transkribiert genomische RNA unter Bildung subgenomischer mRNAs, die für die 5–6 viralen Proteine codieren, und es repliziert auch vollständige RNAs mit positiver und negativer Polarität. Die Gene werden nacheinander transkribiert, beginnend am 3'-Ende der Genome. Das gleiche grundlegende genetische System wird auch von den Paramyxoviren und Filoviren verwendet.
Der Prototyp der Rhabdoviren, das Vesicular Stomatitis Virus (VSV), vermehrt sich in den meisten tierischen Zellen bis zu sehr hohen Titern und kann in großen Mengen präpariert werden. Das hat dazu geführt, dass das VSV häufig als Modellsystem für die Untersuchung der Replikation und des Zusammenbaus von RNA-Viren mit Hüllen eingesetzt worden ist. Die Untersuchung des VSV und verwandter Viren mit negativem Strang wurde dadurch eingeschränkt, dass es nicht möglich war, eine direkte genetische Manipulation des Virus mittels gentechnischer Verfahren durchzuführen. Die Schwierigkeit bei der Erzeugung des VSV aus DNA besteht darin, dass weder die vollständigen genomischen noch die antigenomischen RNAs infektiös sind. Die minimale infektiöse Einheit ist die genomische RNA, die fest an 1250 Untereinheiten des Nucleocapsid (N)-Proteins (Thomas et al., 1985, J. Virol. 54: 598–607) sowie kleinere Mengen der beiden vom Virus codierten Polymerase-Untereinheiten L und P gebunden ist. Zur Rekonstitution eines infektiösen Virus aus der viralen RNA ist es erforderlich, zunächst den Komplex aus N-Protein und RNA zusammenzubauen, der als Matrize für die Transkription und die Replikation durch die VSV-Polymerase dient. Zwar können kleinere Abschnitte der RNA des negativen Stranges des Genoms des Influenza-Virus in vitro in Nucleocapsiden verpackt und dann einem Rescue in Influenza-infizierten Zellen unterzogen werden (Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3802–3805, Luytjes et al., 1989, Cell 59: 1107–1113), aber Systeme zur Verpackung der viel größeren genomischen RNAs von Rhabdoviren in vitro stehen noch nicht zur Verfügung.
Kürzlich wurden Systeme für die Replikation und Transkription von Minigenomen, die von DNA abstammten, oder kleiner defekter RNAs von Rhabdoviren (Conzelmann und Schnell, 1994, J. Virol. 68: 713–719, Pattnaik et al., 1992, Cell 69: 1011–1120) und Paramyxoviren (Calain et al., 1992, Virology 191: 62–71, Collins et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9663–9667, Collins et al., 1993, Virology 195: 252–256, De und Banerjee, 1993, Virology 196: 344–348, Dimock und Collins, 1993, J. Virol. 67: 2772–2778, Park et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5537–5541) beschrieben. In diesen Systemen werden RNAs zu Nucleocapsiden in Zellen zusammengefügt, die das virale N-Protein und Polymerase-Proteine exprimieren. Diese Systeme sind zwar sehr nützlich, aber sie ermöglichen keine genetische Manipulation des vollständigen Genoms infektiöser Viren.
Die Gewinnung des Tollwut-Virus aus einem vollständigen cDNA-Klon wurde kürzlich veröffentlicht (Schnell et al., 1994, EMBO J. 13: 4195–4203). Der Infektionszyklus wurde durch die Expression der antigenomischen RNA (vollständiger positiver Strang) in Zellen initiiert, die das virale N-, P- und L-Protein exprimieren. Das Tollwut-Virus ist zwar ein Rhabdovirus, aber es unterscheidet sich in seiner Struktur und seiner Funktion von den Vesiculoviren. Das Tollwut-Virus ist ein Lyssavirus, kein Vesiculovirus. Lyssaviren befallen das Zentralnervensystem. Vesiculoviren befallen Epithelzellen, vorwiegend diejenigen der Zunge, unter Erzeugung von Vesikeln. Das Tollwut-Virus verursacht bei verschiedenen Tieren und beim Menschen eine Enzephalitis, während das VSV bei Rindern eine epidemische, aber selbstbegrenzende Erkrankung auslöst. Im ausgeprägten Gegensatz zu VSV-infizierten Zellen führt das Tollwut-Virus in infizierten Zellkulturen nur zu einer geringen oder zu keiner zytopathischen Wirkung, repliziert in der Zellkultur weniger effektiv als das VSV und führt in infizierten Zellkulturen zu einer geringen Hemmung der zellulären DNA-, RNA- oder Protein-Synthese (siehe Baer et al., 1990, in Virology, 2. Ausgabe, Fields et al. (Hrsg.), Raven Press Ltd., N. Y., S. 883, 887). Tatsächlich wird keine Kreuzhybridisierung zwischen den Genomen des Tollwut-Virus und des VSV beobachtet, und eine Sequenzhomologie zwischen den beiden Genomen lässt sich im Allgemeinen nur mit Hilfe von Computerprogrammen zur Bestimmung von Homologien finden.
Palese (Trends in Microbiology, Bd. 3, Nr. 4, Seiten 123–125, 4. April 1995) berichten das Rescue infektiöser VSV aus einem vollständigen DNA-Klon, aber das rekombinante VSV war genetisch markiert und exprimierte keine fremden Peptide oder Proteine.
Die Gewinnung eines infektiösen Masern-Virus, eines weiteren RNA-Virus mit einem negativen Strang, mittels klonierter cDNA wurde ohne Erfolg versucht (siehe Ballart et al., EMBO J. 9(2): 379–384 und den Widerruf von Eschle et al., 1991, EMBO J. 10(11): 3558).
2.2. IMPFSTOFFE
Die Entwicklung von Impfstoffen zur Prävention viraler, bakterieller oder parasitischer Erkrankungen steht im Mittelpunkt vieler Forschungsanstrengungen.
Zu den herkömmlichen Verfahren zur Erzeugung von Impfstoffen gehört die Verwendung inaktivierter oder abgeschwächter Pathogene. Eine geeignete Inaktivierung des pathogenen Mikroorganismus macht ihn als biologisches Agens unschädlich, zerstört aber nicht seine Immunogenität. Die Injektion dieser „abgetöteten" Partikel in einen Wirt führt dann zu einer Immunreaktion, die in der Lage ist, eine zukünftige Infektion mit einem lebenden Mikroorganismus zu verhindern. Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Totimpfstoffen (mit Einsatz inaktivierter Pathogene) ist eine mögliche unvollständige Inaktivierung aller Mikroorganismuspartikel. Sogar wenn diese erreicht wird, ist die erzielte Immunität, da abgetötete Pathogene sich in ihrem Wirt nicht vermehren, oder aus anderen unbekannten Gründen, häufig unvollständig, von kurzer Dauer, und sie erfordert wiederholte Immunisierungen. Schließlich kann der Inaktivierungsprozess die Antigene des Mikroorganismus verändern, was sie als Immunogene weniger wirksam macht.
Die Abschwächung bezieht sich auf die Erzeugung von Stämmen pathogener Mikroorganismen, die ihre Fähigkeit zur Erzeugung von Krankheiten im Wesentlichen verloren haben. Ein Weg, das zu erreichen, besteht darin, den Mikroorganismus ungewöhnlichen Wachstumsbedingungen und/oder einer häufigen Passagierung in einer Zellkultur auszusetzen.
Es werden dann Mutanten selektiert, die die Virulenz verloren haben, aber immer noch in der Lage sind, eine Immunreaktion hervorzurufen. Abgeschwächte Pathogene führen oft zu guten Immunogenen, da sie tatsächlich in der Wirtszelle replizieren und eine lang anhaltende Immunität hervorrufen. Allerdings sind mit der Verwendung von Lebendimpfstoffen verschiedene Probleme verbunden, von denen die bedenklichsten eine unzureichende Abschwächung und das Risiko einer Wiederherstellung der Virulenz sind.
Eine Alternative zu den obigen Verfahren ist die Verwendung von Subunit-Vakzinen. Sie beinhaltet die Immunisierung mit lediglich denjenigen Komponenten, die das relevante immunologische Material enthalten.
Impfstoffe werden häufig mit verschiedenen Adjuvanzien formuliert und inokuliert. Die Adjuvanzien unterstützen die Erzielung eines länger anhaltenden und höheren Spiegels einer Immunität bei Einsatz geringerer Antigenmengen oder weniger Dosen, als wenn das Immunogen alleine verabreicht wird. Der Mechanismus der Adjuvanswirkung ist komplex und nicht vollständig verstanden. Er könnte jedoch die Stimulierung einer Cytokinproduktion, einer Phagozytose und anderer Aktivitäten des retikuloendothelialen Systems sowie eine verzögerte Freisetzung und einen verzögerten Abbau des Antigens beinhalten. Beispiele für Adjuvanzien sind Freunds Adjuvans (komplett oder inkomplett), das Adjuvans 65 (das Erdnussöl, Mannidmonooleat und Aluminiummonostearat enthält), das Pluronic-Polyol L-121, Avridin und Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat etc. Freunds Adjuvans wird in Impfstoffformulierungen für den Menschen nicht mehr verwendet, da es nicht-metabolisierbares Mineralöl enthält und ein potenzielles Kanzerogen ist.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante replizierbare Vesiculoviren bereit. Nach dem Stande der Technik war es bisher nicht möglich, erfolgreich replizierbare Vesiculoviren aus klonierter DNA zu erzeugen. Im Gegensatz dazu stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, das zum ersten Mal die Erzeugung und Gewinnung replizierbarer Vesiculoviren sowie rekombinanter replizierbarer Vesiculoviren aus klonierter DNA möglich gemacht hat.
Die erfindungsgemäßen Vesiculoviren werden erzeugt, indem in einer geeigneten Wirtszelle bereitgestellt werden: a) DNA, die transkribiert werden kann, so dass sie zu antigenomischer (zum Vesiculovirus-Genom komplementärer) (+) Vesiculovirus-RNA führt (für sie codiert), b) eine rekombinante Quelle für das Vesiculovirus-N-Protein, c) eine rekombinante Quelle für das Vesiculovirus-P-Protein und d) eine rekombinante Quelle für das Vesiculovirus-L-Protein, und zwar unter Bedingungen, unter denen die DNA unter Erzeugung der antigenomischen RNA transkribiert wird und ein Vesiculovirus bereitgestellt wird, das genomische RNA enthält, die komplementär zur antigenomischen RNA ist, die von der DNA erzeugt wird.
Die Erfindung stellt ein infektiöses rekombinantes Vesiculovirus bereit, das fähig ist, in einem Tier zu replizieren, in das das rekombinante Vesiculovirus eingeführt wird, wobei das Genom des Vesiculovirus fremde RNA umfasst, die nicht natürlicherweise ein Teil des Vesiculovirus-Genoms ist. Das rekombinante Vesiculovirus wird durch die Erzeugung von Vesiculoviren gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildet, wobei in Bereiche der DNA, die für antigenomische (+) Vesiculovirus-RNA codieren, die für die Virusreplikation nicht essenziell sind, fremde DNA eingefügt wurde oder diese Bereiche durch fremde DNA ersetzt wurden.
Die im Genom des rekombinanten Vesiculovirus enthaltene fremde RNA (die ursprünglich von der fremden DNA codiert wurde) erzeugt bei der Expression in einer geeigneten Wirtszelle ein Protein oder Peptid, das antigenisch oder immunogen ist.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculoviren finden als Impfstoffe Verwendung. Bei einer Ausführungsform, bei der die fremde RNA die Erzeugung eines Antigens steuert, das eine Immunreaktion gegen ein Pathogen induziert, finden die erfindungsgemäßen Impfstoffe Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Infektionen durch ein derartiges Pathogen (insbesondere einen pathogenen Mikroorganismus) und seiner klinischen Manifestationen, d. h. der Infektionskrankheit. Bei einer bevorzugten Ausführungsform zeigt ein derartiges Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Hüll-Glycoproteins eines Virus, bei dem es sich nicht um ein Vesiculovirus handelt, und das Antigen wird in die Hülle des Vesiculovirus inkorporiert. Die rekombinanten Vesiculoviren finden auch Anwendung bei der Diagnose und der Überwachung des Verlaufs von Infektionskrankheiten, einschließlich der Reaktion auf eine Impfung und/oder Therapie.
Bei einer anderen Ausführungsform, bei der die fremde RNA die Erzeugung eines Antigens steuert, das eine Immunreaktion gegen einen Tumor bewirkt, finden die erfindungsgemäßen rekombinanten Viren Anwendung bei der Immunprophylaxe gegen Krebs, bei der Immuntherapie und der Diagnose und bei der Überwachung der Tumorprogression oder -regression.
Die rekombinanten Vesiculoviren können als Lebendimpfstoffe eingesetzt werden, oder sie können für eine Verwendung als Totimpfstoffe inaktiviert werden. Die rekombinanten Viren können auch zur Erzeugung großer Mengen an leicht zu reinigendem Antigen verwendet werden, z. B. für die Verwendung in Subunit-Vakzinen.
Die Erfindung stellt auch Impfstoffformulierungen, Kits und rekombinante Wirtszellen bereit.
4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Nucleotidsequenz des Plasmids pVSVFL(+), die die vollständige DNA-Sequenz zeigt, die unter Erzeugung der antigenomischen (+) VSV-RNA transkribiert wird, sowie die vorhergesagten Sequenzen der codierten VSV-Proteine. [N-Protein: SEQ ID NO: 2, P-Protein: SEQ ID NO: 3, M-Protein: SEQ ID NO: 4, G-Protein: SEQ ID NO: 5, L-Protein: SEQ ID NO: 6]. Die nicht-codierenden und die intergenischen Bereiche sind sichtbar. Die obere Sequenzreihe (SEQ ID NO: 1) ist der antigenomische positive Strang des VSV, die untere Reihe = SEQ ID NO: 7. Die Restriktionsstellen sind angegeben. Die Transmembran-Domäne und die zytoplasmatische Domäne des G-Proteins sind ebenfalls angegeben. Die Sequenzen des ersten T7-RNA-Polymerase-Promotors (SEQ ID NO: 8), des zweiten T7-RNA-Polymerase-Promotors (SEQ ID NO: 9), der Leader-Sequenz (SEQ ID NO: 10), des Terminationssignals für die Transkription durch die T7-RNA-Polymerase (SEQ ID NO: 11) und die Sequenz, die unter Erzeugung des HDV-Ribozyms transkribiert wird (SEQ ID NO: 12), sind gezeigt.
2. Nucleotidsequenz eines Teils des Plasmids pVSVSS1, die das synthetische DNA-Insert zeigt, das den Polylinker-Bereich enthält, der zwischen den für G und L codierenden Bereichen (3' von G und 5' von L) eingefügt ist, der einmal vorkommende Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthält, nämlich XmaI, NotI und SmaI. Obere Sequenzreihe: SEQ ID NO: 13, untere Sequenzreihe: SEQ ID NO: 14.
3. Gen-Verbindungen des VSV. Die Nucleotidsequenzen am 3'-Ende der Leader-RNA und den 5'- und 3'-Enden jeder mRNA sind zusammen mit den entsprechenden genomischen Sequenzen (vRNA) gezeigt (SEQ ID NO: 15–31). Die intergenischen Dinucleotide sind mit fetten Buchstaben bezeichnet. Aus Rose und Schubert, 1987, in The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Press, N. Y., S. 129–166, auf S. 136.
4. Konstruktion der Plasmid-DNA. A. Das Diagramm zeigt die klonierte genomische Sequenz des VSV und die vier DNA-Fragmente (nummeriert von 1 bis 4), die zur Erzeugung des Plasmids pVSVFL(+) verwendet wurden. Die horizontalen Pfeile stehen für PCR-Primer, die für die Erzeugung der Fragmente 1 und 3 eingesetzt wurden. B. Diagramm des Plasmids pVSVFL(+), das zu infektiösen VSV führt. Es ist die Lage der VSV-Gene, die für die fünf Proteine N, P, M, G und L codieren, gezeigt. Der gepunktete Bereich von SacI bis XhoI steht für die Sequenz des pBSSK⁺-Vektors, und die schraffierten Abschnitte stehen für die Bereiche des VSV-Genoms, die mittels PCR erzeugt wurden. Die Transkription vom T7-Promotor erzeugt die vollständige (+)-Strang-VSV-RNA.
5. Proteine, die im Wildtyp-VSV und im rekombinanten VSV vorkommen. Die Proteine aus 1% der Viren, die aus ungefähr 5 × 10⁶ infizierten BHK-Zellen gewonnen wurden, wurden über eine SDS-PAGE (10% Acrylamid) aufgetrennt und durch Anfärben mit Coomassie Brilliant Blue sichtbar gemacht. Die Positionen der fünf VSV-Proteine sind angegeben.
6. Identifizierung einer Restriktionsenzym-Erkennungssequenz im rekombinanten VSV. Ein Abschnitt von 620 Nucleotiden genomischer RNA, der aus dem Wildtyp-VSV und dem rekombinanten VSV isoliert worden war, wurde über eine reverse Transkription und PCR unter Verwendung der Primer 5'-CATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCC (SEQ ID NO: 32) und 5'-CATGAATGTTAACATCTCAAGA (SEQ ID NO: 33) amplifiziert. Die Kontrollen, bei denen die reverse Transkriptase aus dem Reaktionsansatz weggelassen wurde, sind gezeigt. Die DNA-Proben wurden entweder mit NheI verdaut oder unverdaut gelassen, ehe sie wie angegeben einer Elektrophorese auf einem 6%-igen Polyacrylamidgel unterzogen wurden. Die DNA wurde durch Färben mit Ethidiumbromid nachgewiesen. Die Größe der DNA-Marker ist auf der linken Seite angegeben.
7. Autoradiogramm, das die Sequenz der genomischen RNA aus dem rekombinanten VSV zeigt. Aus dem rekombinanten VSV präparierte RNA wurde mittels des Didesoxyverfahrens unter Verwendung der reversen Transkriptase sequenziert. Die ausgeschriebene Sequenz entspricht den Nucleotiden 1563–1593 in der G-mRNA (Rose und Gallione, 1981, J. Virol. 39: 519–528). Die unterstrichene Sequenz steht für die vier Nucleotide, die zur Erzeugung der NheI-Stelle verändert wurden.
8. Proteinanalyse des rekombinanten VSV, das das Glycoprotein des New-Jersey-Serotyps exprimiert. Die Proteine von 1% der Viren, die aus dem Medium von ungefähr 5 × 10⁶ BHK-Zellen abzentrifugiert worden waren, die 24 Stunden mit dem Wildtyp-VSV (Spur 1), dem rekombinanten VSV_I/NJG (Spur 2) oder dem Wildtyp-VSV_NJ (Spur 3) infiziert worden waren, wurden über eine SDS-PAGE (10% Acrylamid) aufgetrennt. Die Proteine wurden durch Anfärben mit Coomassie-Brilliant-Blue sichtbar gemacht. Die Positionen der viralen Proteine sind angegeben.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante replizierbare Vesiculoviren bereit, die eine Insertion einer fremden RNA-Sequenz aufweisen, die für ein Peptid oder Protein codiert, das bei der Expression in einem geeigneten Wirt eine Immunreaktion bewirkt. Die Expression der vollständigen Vesiculovirus-RNA aus dem positiven Strang in Wirtszellen hat die erfolgreiche Erzeugung rekombinanter Vesiculoviren von DNA ermöglicht, wodurch rekombinante Viren bereitgestellt werden, die keine ernsten pathologischen Wirkungen auf Menschen haben, und die in hohen Titern erhalten werden können, die als Impfstoffe Verwendung finden können.
Die erfindungsgemäßen Vesiculoviren werden erzeugt, indem in einer geeigneten Wirtszelle bereitgestellt werden: a) DNA, die transkribiert werden kann, so dass sie zu antigenomischer (zum Vesiculovirus-Genom komplementärer) (+) Vesiculovirus-RNA führt (für sie codiert), und eine Insertion einer fremden RNA-Sequenz aufweist, die für ein Peptid oder Protein codiert, das bei der Expression in einem geeigneten Wirt eine Immunreaktion bewirkt, b) eine rekombinante Quelle für das Vesiculovirus-N-Protein, c) eine rekombinante Quelle für das Vesiculovirus-P-Protein und d) eine rekombinante Quelle für das Vesiculovirus-L-Protein, und zwar unter Bedingungen, unter denen die DNA unter Erzeugung der antigenomischen RNA transkribiert wird und ein Vesiculovirus bereitgestellt wird, das genomische RNA enthält, die komplementär zur antigenomischen RNA ist, die von der DNA erzeugt wird.
Die Erfindung stellt ein infektiöses rekombinantes Vesiculovirus bereit, das fähig ist, in einem Tier zu replizieren, in das das rekombinante Vesiculovirus eingeführt wird, wobei das Genom des Vesiculovirus fremde RNA umfasst, die nicht natürlicherweise ein Teil des Vesiculovirus-Genoms ist. Das rekombinante Vesiculovirus wird durch die Erzeugung von Vesiculoviren gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildet, wobei in Bereiche der DNA, die für antigenomische (+) Vesiculovirus-RNA codieren, die für die Virusreplikation nicht essenziell sind, fremde DNA eingefügt wurde oder diese Bereiche durch fremde DNA ersetzt wurden.
Da die Viren replizierbar (d. h. nicht replikationsdefekt) sind, codieren sie für die gesamte Maschinerie des Vesiculovirus, die für die Replikation in einer Zelle nach deren Infektion mit dem Virus erforderlich ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das rekombinante Vesiculovirus ein rekombinantes Vesicular Stomatitis Virus (VSV).
Die im Genom des rekombinanten Vesiculovirus enthaltene fremde RNA (die ursprünglich von der fremden DNA codiert wurde) erzeugt bei der Expression in einer geeigneten Wirtszelle ein Protein oder Peptid, das antigenisch oder immunogen ist. Ein derartiges antigenisches oder immunogenes Protein oder Peptid, dessen Expression durch die fremde RNA (die mit negativer Polarität vorliegt) im Vesiculovirus-Genom gesteuert wird (durch die Expression von der (+)-antigenomischen Message) wird hier im Folgenden als das „Antigen" bezeichnet. Zu geeigneten Antigenen gehören, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, bekannte Antigene von pathogenen Mikroorganismen oder von Tumoren sowie Fragmente oder Derivate derartiger Antigen, die die Antigenität oder Immunogenität dieser Antigene aufweisen. Ein Protein weist die Antigenität eines Antigens auf, wenn das Protein in der Lage ist, immunspezifisch von einem Antikörper gegen das Antigen gebunden zu werden. Ein Protein weist die Immunogenität eines Antigens auf, wenn es eine Immunreaktion gegen das Antigen bewirkt (z. B. wenn eine Immunisierung mit dem Protein die Erzeugung eines Antikörpers bewirkt, der das Antigen immunspezifisch bindet, oder eine zellvermittelte, gegen das Antigen gerichtete Immunreaktion hervorruft).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculoviren finden als Impfstoffe Verwendung. Wenn die fremde RNA die Erzeugung eines Antigens steuert (das ursprünglich von der fremden DNA codiert wurde, die zur Erzeugung des rekombinanten Vesiculovirus oder seines Vorläufers eingesetzt wurde), das eine Immunreaktion gegen ein Pathogen induziert, finden die erfindungsgemäßen Impfstoffe Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Infektionen durch ein derartiges Pathogen (insbesondere einen pathogenen Mikroorganismus) und seiner klinischen Manifestationen, d. h. der Infektionskrankheit. Die Erfindung stellt somit Verfahren zur Prävention oder Behandlung von Infektionen und Infektionskrankheiten bereit, die das Verabreichen eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculoviren an ein Subjekt umfasst, für das eine derartige Behandlung oder Prävention gewünscht wird. Die rekombinanten Vesiculoviren finden auch Anwendung bei der Diagnose und der Überwachung des Verlaufs von Infektionskrankheiten, einschließlich der Reaktion auf eine Impfung und/oder Therapie.
Bei einer anderen Ausführungsform, bei der das Antigen eine Immunreaktion gegen einen Tumor induziert, finden die erfindungsgemäßen rekombinanten Viren Anwendung bei der Immunprophylaxe gegen Krebs, bei der Immuntherapie und der Diagnose und bei der Überwachung der Tumorprogression oder -regression.
Die rekombinanten Vesiculoviren können als Lebendimpfstoffe eingesetzt werden, oder sie können für eine Verwendung als Totimpfstoffe inaktiviert werden. Die rekombinanten Viren können auch zur Erzeugung großer Mengen an leicht zu reinigendem Antigen verwendet werden, z. B. für die Verwendung in Subunit-Vakzinen.
Bei einer spezifischen Ausführungsform kann die fremde DNA, die zunächst zur Erzeugung der rekombinanten Vesiculoviren eingesetzt wird, auch eine Sequenz umfassen, die für einen nachweisbaren Marker codiert, zum Beispiel die β-Galactosidase, die β-Glucuronidase oder β-Geo (Friedrich & Soriano, 1991, Genes Dev. 5: 1513–1523).
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform kann die fremde DNA auch eine Sequenz umfassen, die für ein Cytokin codiert, das in der Lage ist, eine Immunreaktion zu stimulieren. Zu derartigen Cytokinen gehören, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-12, Interferone und Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierende Faktoren.
Bei einem bevorzugten Aspekt wird nach einer Infektion mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculovirus das Antigen als ein Protein, das kein Fusionsprotein ist, exprimiert. Bei einer weniger bevorzugten Ausführungsform wird das Antigen als ein Fusionsprotein, zum Beispiel mit dem viralen G-Protein, exprimiert. „Fusionsprotein" bezieht sich, so wie der Begriff hier verwendet wird, auf ein Protein, das eine Aminosäuresequenz eines ersten Proteins umfasst, die kovalent über eine Peptidbindung an ihrem Carboxyterminus mit dem Aminoterminus einer Aminosäuresequenz eines zweiten, anderen Proteins verknüpft ist.
Bei einer Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße Impfstoffformulierung nur einen Typ des erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculovirus. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst eine Impfstoffformulierung eine Mischung aus zwei oder mehreren erfindungsgemäßen rekombinanten Viren.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen stellen einen oder mehrere der folgenden Vorteile bereit: Stabilität über lange Zeiträume ohne Kühlung, Einfachheit der Herstellung, geringe Kosten und Erzeugung mit hohen Titern, Fähigkeit zur Verabreichung durch Angestellte vor Ort ohne umfangreiches medizinisches Training und Verabreichung eines Mikroorganismus, von dem bekannt ist, dass er beim Menschen keine ernsthaften Erkrankungen bewirkt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Wirtszelle bereit, die mit einem rekombinanten Vesiculovirus infiziert ist, das zur Replikation fähig ist. Bei einer Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Säugetierzelle. Vorzugsweise ist die Säugetierzelle eine Hamster-Nierenzelle.
5.1. DNA, DIE UNTER ERZEUGUNG VON ANTIGENOMISCHER (+)RNA DES VESICULOVIRUS TRANSKRIBIERT WERDEN KANN

Viele Vesiculoviren sind in diesem Fachgebiet bekannt, und sie können gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren genmanipuliert werden. Beispiele für derartige Vesiculoviren sind in der Tabelle I aufgeführt.

TABELLE I
MITGLIEDER DER GATTUNG VESICULOVIRUS
Virus	Natürliche Quelle des Virus

VSV, New Jersey	Säuger, Moskitos, Mücken, Kriebelmücken, Hausfliegen
VSV, Indiana	Säuger, Moskitos, Sandfliegen
Alagoas	Säuger, Sandfliegen
Cocal	Säuger, Moskitos, Milben
Jurona	Moskitos
Carajas	Sandfliegen
Maraba	Sandfliegen
Piry	Säuger
Calchaqui	Moskitos
Yug Bogdanovac	Sandfliegen
Isfahan	Sandfliegen, Zecken
Chandipura	Säuger, Sandfliegen
Perinct	Moskitos, Sandfliegen
Porton-S	Moskitos

Es kann jede beliebige DNA, die unter Erzeugung von antigenomischer (+)RNA des Vesiculovirus (komplementär zum VSV-Genom) transkribiert werden kann, zur Konstruktion einer rekombinanten DNA, die fremde DNA, die für ein Antigen codiert, enthält, für den Einsatz bei der Erzeugung der erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculoviren eingesetzt werden.
DNA, die zur Erzeugung antigenomischer (+)RNA transkribiert werden kann (wobei diese DNA hier als „Vesiculovirus (–)DNA" bezeichnet wird), steht in diesem Fachgebiet zur Verfügung und/oder kann mittels Standardverfahren erhalten werden. Im Einzelnen wurde das Plasmid pVSVFL(+), das VSV(–)DNA enthält, und das für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung bevorzugt wird, bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Zugangs-Nr. 97134. Bei einem bevorzugten Aspekt wird eine DNA, die unter Erzeugung von VSV(+)RNA transkribiert werden kann [d. h. VSV(–)DNA], eingesetzt. Es kann eine VSV(–)DNA für jeden beliebigen Serotyp oder Stamm, den man in diesem Fachgebiet kennt, zum Beispiel die New-Jersey- oder Indiana-Serotypen des VSV, eingesetzt werden. Die vollständige Nucleotidsequenz und die abgeleitete Proteinsequenz des VSV-Genoms sind bekannt, sie sind als Genbank VSVCG, Zugangs-Nr. J02428, NCBI Seq ID 335873 verfügbar, und sie wurden bei Rose und Schubert, 1987, in The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Press, N. Y., S. 129–166 publiziert. Teilsequenzen anderer Vesiculovirus-Genome sind publiziert worden und stehen in diesem Gebiet zur Verfügung. Die vollständige Sequenz der VSV(–)-DNA, die in einer bevorzugten Ausführungsform verwendet wird, ist im Plasmid pVSVFL(+) enthalten und wird in der 1 gezeigt. Ebenfalls gezeigt sind die vorhergesagten Sequenzen der VSV-Proteine (diese Sequenz enthält mehrere Sequenzkorrekturen im Vergleich zu der von Genbank erhältlichen). Vesiculovirus(–)DNA kann, wenn sie nicht schon verfügbar ist, mittels Standardverfahren wie folgt hergestellt werden: Wenn die cDNA des Vesiculovirus noch nicht verfügbar ist, kann genomische RNA des Vesiculovirus aus Viruspräparationen gereinigt werden, und eine reverse Transkription kann zusammen mit einer großräumigen Polymerase-Kettenreaktion zur Erzeugung der Vesiculovirus(–)DNA eingesetzt werden. Alternativ kann nach der Reinigung der genomischen RNA die VSV-mRNA in vitro synthetisiert werden, und cDNA kann mittels Standardverfahren präpariert werden, woran sich die Insertion in Klonierungsvektoren anschließt (siehe z. B. Rose und Gallione, 1981, J. Virol. 39(2): 519–528). Einzelne cDNA-Klone der Vesiculovirus-RNA können mit Hilfe von kleinen DNA-Fragmenten verknüpft werden, die die Gen-Übergänge abdecken und die mittels Reverser Transkription und der Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) (Mullis und Faloona, 1987, Meth. Enzymol. 155: 335–350) aus genomischer VSV-RNA (siehe Abschnitt 6, unten) erzeugt werden. Vesiculoviren stehen in diesem Fachgebiet zur Verfügung. Zum Beispiel kann das VSV von der American Type Culture Collection bezogen werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine oder werden mehrere vorzugsweise einmal vorkommende Restriktionsstelle(n) (z. B. in einem Polylinker) in die Vesiculovirus(–)DNA eingefügt, und zwar in intergenischen Bereichen oder 5' zu der Sequenz, die komplementär zum 3'-Ende des Vesiculovirus-Genoms ist, oder 3' zu der Sequenz, die komplementär zum 5'-Ende des Vesiculovirus-Genoms ist, um die Insertion der fremden DNA zu erleichtern.
Bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird die Vesiculovirus(–)DNA so konstruiert, dass sie einen Promotor aufweist, der funktionsfähig mit ihr verknüpft ist. Der Promotor sollte imstande sein, die Transkription der (–)DNA in einem Tier oder in einer Insektenzelle zu initiieren, in der das rekombinante Vesiculovirus produziert werden soll. Zu Promotoren, die eingesetzt werden können, gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, der Bereich des frühen SV40-Promotors (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), der Promotor, der im 3'-ständigen Long Terminal Repeat des Rous Sarcoma Virus enthalten ist (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787–797), der Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42), Heat-Shock-Promotoren (z. B. hsp70 für den Einsatz in Drosophila-S2-Zellen), der ADC (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, der PGK (Phosphoglycerolkinase)-Promotor, der Promotor der alkalischen Phosphatase und die folgenden tierischen Transkriptionskontrollbereiche, die eine Gewebespezifität zeigen, und die in transgenen Tieren eingesetzt worden sind: der Kontrollbereich des Elastase-I-Gens, der in Azinuszellen des Pankreas aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646, Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409, MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515), der Kontrollbereich des Insulin-Gens, der in Betazellen des Pankreas aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115–122), der Kontrollbereich der Immunglobulin-Gene, der in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658, Adames et al., 1985, Nature 318: 533–538, Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), der Kontrollbereich des Mouse Mammary Tumor Virus, der in Hodenzellen, Brustzellen, lymphoiden Zellen und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485–495), der Kontrollbereich des Albumin-Gens, der in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276), der Kontrollbereich des Alpha-Fetoprotein-Gens, der in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648, Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58), der Kontrollbereich des Alpha-1-Antitrypsin-Gens, der in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171), der Kontrollbereich des Betaglobin-Gens, der in myeloischen Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338–340, Kollias et al., 1986, Cell 46: 89–94), der Kontrollbereich des Gens des basischen Myelinproteins, der in oligodendrozytischen Zellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712), und der Kontrollbereich der leichten Kette 2 des Myosin-Gens, der im Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314: 283–286). Vorzugsweise ist der Promotor ein RNA-Polymerase-Promotor, vorzugsweise ein RNA-Polymerase-Promotor von Bakteriophagen oder Viren oder Insekten, einschließlich, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, der Promotoren der T7-RNA-Polymerase, der SP6-RNA-Polymerase und der T3-RNA-Polymerase. Wenn ein RNA-Polymerase-Promotor verwendet wird, bei dem die RNA-Polymerase nicht endogen von der Wirtszelle, in der das rekombinante Vesiculovirus produziert werden soll, produziert wird, muss auch eine rekombinante Quelle für die RNA-Polymerase in der Wirtszelle bereitgestellt werden.
Die Vesiculovirus(–)DNA kann vor oder nach der Insertion der für ein Antigen codierenden fremden DNA funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft werden. Vorzugsweise liegt ein Terminator der Transkription stromabwärts der Vesiculovirus(–)DNA.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt eine DNA-Sequenz, die unter Erzeugung einer Ribozymsequenz transkribiert werden kann, unmittelbar am 3'-Ende der Vesiculovirus(–)DNA vor dem Terminationssignal für die Transkription, so dass bei der Transkription eine sich selbst spaltende Ribozymsequenz am 3'-Ende der antigenomischen RNA erzeugt wird, wobei diese Ribozymsequenz dieses Fusionstranskript unter Freisetzung des exakten 3'-Endes der antigenomischen (+)RNA des Vesiculovirus autolytisch spaltet (nach einem U). Es kann jede beliebige in diesem Fachgebiet bekannte Ribozymsequenz eingesetzt werden, solange die korrekte Sequenz erkannt und gespalten wird. (Es wird angemerkt, dass das Hammerhead-Ribozym wahrscheinlich nicht für eine Verwendung geeignet ist.) Bei einem bevorzugten Aspekt wird das Ribozym des Hepatitis-Delta-Virus (HDV) eingesetzt (Perrotta und Been, 1991, Nature 350: 434–436, Pattnaik et al., 1992, Cell 69: 1011–1020).
Eine bevorzugte VSV(–)DNA für den Einsatz zur Insertion fremder DNA ist die in der 1 gezeigte und im Plasmid pVSVFL(+) enthaltene, bei der ein T7-RNA-Polymerase-Promotor 5' der Sequenz, die komplementär zum 3'-Ende des VSV-Genoms ist, vorliegt. Das Plasmid pVSVFL(+) umfasst somit (in der Reihenfolge 5' nach 3') die folgenden funktionsfähig miteinander verknüpften Komponenten: den T7-RNA-Polymerase-Promotor, VSV(–)DNA, eine DNA-Sequenz, die unter Erzeugung einer HDV-Ribozymsequenz transkribiert wird (unmittelbar stromabwärts der VSV(–)DNA) und eine Stelle für die Termination der Transkription durch die T7-RNA-Polymerase. Ein Plasmid, das ebenfalls hergestellt und eingesetzt werden kann, ist das Plasmid pVSVSS1, von dem ein Teil der Sequenz in der 2 gezeigt ist, bei dem ein synthetischer DNA-Polylinker, der die Insertion fremder DNA erleichtert, in pVSVFL(+) zwischen den für G und L codierenden Bereichen eingefügt wurde. Der Polylinker wurde mittels eines DNA-Synthesegerätes so synthetisiert, dass er Enden hat, die für eine Ligation in eine NheI-Stelle geeignet sind, und dass er die einmal vorkommenden Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme XmaI, SmaI und NotI enthält, wodurch die Insertion fremder DNA erleichtert wird, die durch die Spaltung mit einem dieser Enzyme generiert wird oder an einen Linker ligiert wird, der eine Erkennungsstelle für eines dieser Enzyme enthält (der dann vor der Insertion einer Spaltung unterzogen wird).
Die für ein Antigen codierende fremde DNA wird in einen beliebigen Bereich der Vesiculovirus(–)DNA insertiert oder ersetzt einen beliebigen Bereich der Vesiculovirus(–)DNA, der nicht essenziell für die Replikation des Vesiculovirus ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die fremde DNA somit in einen intergenischen Bereich insertiert oder einen Bereich der Vesiculovirus(–)DNA, der unter Bildung des nicht-codierenden Bereichs einer viralen mRNA transkribiert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die die DNA-Sequenz des Plasmids pVSVFL(+) umfasst, wie sie in der 1 dargestellt ist, und zwar die Nucleotide Nr. 623–12088 (ein Teil der SEQ ID NO: 1), bei der in einen Abschnitt, der für die Replikation des Vesiculovirus nicht essenziell ist, fremde DNA insertiert wurde oder dieser Abschnitt von ihr ersetzt wurde.
Vesiculoviren haben eine definierte intergenische Struktur. Extensive Homologien finden sich um die intergenischen Dinucleotide herum (3). Diese Bereiche haben die gemeinsame Struktur (3')AUACUUUUUUUNAUUGUCNNUAG (5') (SEQ ID NO: 34), wobei N ein beliebiges Nucleotid bedeutet (und somit drei variable Positionen vorliegen), und das intergenische Dinucleotid ist unterstrichen. Diese Dinucleotid-Spacer sind GA, außer am NS-M-Übergang, bei dem das Dinucleotid CA ist. Die ersten 11 Nucleotide der gemeinsamen Sequenz sind zur Sequenz (5') ... UAUGAAAAAAA ... (3') (SEQ ID NO: 35) komplementär, die an der mRNA-Polyadenylat[poly(A)]-Verbindung in jeder mRNA, einschließlich von L, vorkommt. Das wiederholte Kopieren der U-Reste durch die VSV-Polymerase erzeugt vermutlich den Poly(A)-Schwanz jeder mRNA (McGeoch, 1979, Cell 17: 3199, Rose, 1980, Cell 19: 415, Schubert et al., 1980, J. Virol. 34: 550). Die zum 5'-Ende der mRNA komplementäre Sequenz folgt dem intergenischen Dinucleotid. Die L-mRNA hört auch mit der Sequenz UAUG-Poly(A) auf, die von der Sequenz (3')AUACUUUUUUU (SEQ ID NO: 36) codiert wird, und ist vermutlich ebenfalls durch einen Polymerase-"Slippage"-Mechanismus polyadenyliert (Schubert et al., 1980, J. Virol. 34: 550, Schubert und Lazarini, 1981, J. Virol. 38: 256).
Somit bestehen die intergenischen Bereiche in der Vesiculovirus(–)DNA aus drei Teilen, die die Transkription und Reinitiation sowohl 5' als auch 3' von jedem Gen (dargestellt als die 5'-nach-3'-Sequenz des Stranges der Vesiculovirus(–)DNA mit der positiven Polarität) auslösen: a) TATGAAAAAAA (SEQ ID NO: 37), gefolgt von b) dem Dinucleotid GT oder CT, gefolgt von c) AACAG. Deshalb kann bei einem bevorzugten Aspekt fremde, für ein Antigen codierende DNA leicht als ein Protein, das kein Fusionsprotein ist, von intergenischen Bereichen exprimiert werden, einfach indem sichergestellt wird, dass dieser aus drei Teilen bestehende intergenische Bereich rekonstituiert wird, d. h., dass diese intergenische Region 5' und 3' von der fremden DNA erscheint und auch 5' und 3' von den angrenzenden Genen. Zum Beispiel wird bei einer bevorzugten Ausführungsform DNA, die aus a) diesem aus drei Teilen bestehenden intergenischen Bereich, der fusioniert ist an b) fremde DNA, die für ein gewünschtes Antigen codiert (und vorzugsweise die normalen Start- und Stopp-Codons für die Initiation des Gens des Antigens enthält), besteht, in einen Teil der Vesiculovirus(–)DNA insertiert, die unter Bildung des 3'-ständigen nicht-codierenden Bereichs einer beliebigen Vesiculovirus-mRNA transkribiert wird. Bei einem besonders bevorzugten Aspekt wird die fremde DNA in den nicht-codierenden Bereich zwischen G und L insertiert.
Bei einer alternativen Ausführungsform kann die fremde DNA so in das G-Gen insertiert werden, dass sie für ein Fusionsprotein mit G codiert, so dass es zu einer Exposition des Antigens auf der Oberfläche des Vesiculovirus-Partikels kommt. Es sollte eine Selektion durchgeführt werden um sicherzustellen, dass die Insertion der fremden DNA nicht die Funktion des G-Proteins zerstört.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Antigen, das von einem rekombinanten Vesiculovirus exprimiert wird, ein vollständiges Hüll-Glycoprotein oder ein Teil eines Hüll-Glycoproteins eines Virus, bei dem es sich nicht um ein Vesiculovirus handelt. Ein solches Antigen kann das endogene G-Protein im Vesiculovirus ersetzen, oder es kann als eine Fusion mit dem endogenen G-Protein exprimiert werden, oder es kann zusätzlich zum endogenen G-Protein entweder als ein Fusionsprotein oder als ein Protein, bei dem es sich nicht um ein Fusionsprotein handelt, exprimiert werden. Bei einer spezifischen Ausführungsform bildet ein derartiges Antigen einen Teil der Hülle des Vesiculovirus und wird somit auf der Oberfläche des Vesiculovirus-Partikels exponiert. Beispielsweise kann gp160 oder ein Fragment von diesem des Humanen Immunschwäche-Virus das Antigen sein, das unter Bildung von gp120 und gp41 gespalten wird (siehe Owens und Rose, 1993, J. Virol. 67(1): 360–365). Bei einer spezifischen Ausführungsform kann das G-Gen des VSV in der VSV(–)DNA des Plasmids pVSVFL(+) leicht ausgeschnitten und ersetzt werden, und zwar durch eine Spaltung an den NheI- und MluI-Stellen, die das G-Gen flankieren, und die Insertion der gewünschten Sequenz. Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist das Antigen ein fremdes Hüll-Glycoprotein oder ein Teil davon, das bzw. der als ein Fusionsprotein exprimiert wird, das die zytoplasmatische Domäne (und gegebenenfalls auch den Transmembranbereich) des nativen G-Proteins des Vesiculovirus umfasst (siehe Owens und Rose, 1993, J. Virol. 67(1): 360–365). Ein derartiges Fusionsprotein kann das endogene G-Protein des Vesiculovirus ersetzen oder zusätzlich zu diesem exprimiert werden. Wie als Beispiel im Abschnitt 6 unten gezeigt wird, kann die gesamte für das native G codierende Sequenz durch eine codierende Sequenz eines anderen G ersetzt werden, wodurch rekombinante replizierbare Vesiculoviren erzeugt werden, die ein nicht-natives Glycoprotein exprimieren. Zwar können rekombinante Vesiculoviren, die ein Epitop oder Epitope des Hüll-Glycoproteins anderer Viren exprimieren und exponieren, als Lebendimpfstoffe verwendet werden, aber derartige Vesiculoviren sind auch besonders als Totimpfstoffe nützlich sowie für die Produktion von Subunit-Vakzinen, die das vom Vesiculovirus erzeugte Protein, das ein derartiges Epitop oder derartige Epitope umfasst, enthalten.
Bei einer spezifischen Ausführungsform exprimiert ein erfindungsgemäßes rekombinantes Vesiculovirus in einem Wirt, dem es zugeführt wurde, ein Antigen oder mehrere Antigene. Bei einer Ausführungsform wird eine Vielzahl von Antigenen exprimiert, von denen jedes eine andere Antigenität oder Immunogenität aufweist.
5.2. FÜR ANTIGENE CODIERENDE DNA-SEQUENZEN
Die Erfindung stellt rekombinante Vesiculoviren bereit, die zur Replikation fähig sind und die eine fremde RNA-Sequenz enthalten, die in eine Stelle des Genoms insertiert ist oder die eine Stelle des Genoms ersetzt, die für die Replikation nicht essenziell ist, wobei die fremde RNA-Sequenz (die negative Polarität hat) die Erzeugung eines Antigens steuert, das in der Lage ist, in einen Wirt exprimiert zu werden, der mit dem rekombinanten Virus infiziert wurde. Dieses rekombinante Genom wird ursprünglich durch die Insertion der fremden, für das Antigen codierenden DNA in die Vesiculovirus(–)DNA erzeugt. Jede beliebige DNA-Sequenz, die für ein immunogenes (zur Bewirkung einer Immunreaktion fähiges) Antigen codiert, das eine prophylaktische oder therapeutische Immunität gegen eine Krankheit oder Gesundheitsstörung bewirkt, wenn es als ein Fusionsprotein oder, vorzugsweise, ein Protein, bei dem es sich nicht um ein Fusionsprotein handelt, in einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculovirus exprimiert wird, und zwar allein oder in Kombination mit anderen Antigenen, die vom gleichen oder einem anderen rekombinanten Vesiculovirus exprimiert werden, kann für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen isoliert werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform induziert die Expression eines Antigens durch ein rekombinantes Vesiculovirus eine Immunreaktion gegen einen pathogenen Mikroorganismus. Zum Beispiel kann ein Antigen die Immunogenität oder Antigenität eines Antigens aufweisen, das auf Bakterien, Parasiten, Viren oder Pilzen vorkommt, die Krankheiten oder Gesundheitsstörungen verursachen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Antigene eingesetzt, die die Antigenität oder Immunogenität von Antigenen tierischer Viren mit Bedeutung für die Tiermedizin aufweisen (die zum Beispiel Krankheiten oder Gesundheitsstörungen bei Tieren, bei denen es sich nicht um Menschen handelt, wie Haustieren oder Nutztieren, z. B. Kühen, Hühnern, Pferden, Hunden, Katzen etc., verursachen). Bei einer weiteren Ausführungsform werden Antigene verwendet, die die Antigenität oder Immunogenität eines Antigens eines Humanpathogens aufweisen.
Zur Bestimmung der Immunogenität oder Antigenität über den Nachweis einer Bindung an den Antikörper können verschiedene Immunoassays, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, eingesetzt werden, einschließlich von, ohne auf diese beschränkt zu sein, kompetitiven und nicht-kompetitiven Assay-Systemen unter Verwendung von Techniken wie Radioimmunoassays, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), „Sandwich"-Immunoassays, immunradiometrischen Assays, Geldiffusions-Präzipitin-Reaktionen, Immundiffusionsassays, In-situ-Immunoassays (unter Verwendung von zum Beispiel kolloidalem Gold, Enzym- oder Radioisotopen-Markierungen), Western-Blots, Immunpräzipitationsreaktionen, Agglutinationsassays (z. B. Gelagglutinationsassays, Hämagglutinationsassays), Komplementfixierungsassays, Immunfluoreszenzassays, Protein-A-Assays und Immunelektrophoreseassays etc. Bei einer Ausführungsform wird die Antikörperbindung über den Nachweis einer Markierung auf dem primären Antikörper nachgewiesen. Bei einer weiteren Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch den Nachweis der Bindung eines sekundären Antikörpers oder eines Reagens an den primären Antikörper nachgewiesen. Bei einer weiteren Ausführungsform ist der sekundäre Antikörper markiert. Es sind viele Verfahren in diesem Gebiet zum Nachweis der Bindung in einem Immunoassay bekannt, und man stellt sich ihren Einsatz vor. Bei einer Ausführungsform zum Nachweis der Immunogenität können T-Zell-vermittelte Reaktionen mittels Standardverfahren untersucht werden, zum Beispiel mittels In-vitro-Zytotoxizitätsassays oder in-vivo-Assays auf eine Hypersensitivität vom verzögerten Typ.

Zu Parasiten und Bakterien, die Epitope (antigenische Determinanten) exprimieren, die von rekombinanten Vesiculoviren exprimiert werden können (wobei die fremde RNA die Produktion eines Antigens des Parasiten oder des Bakteriums oder eines Derivats davon, das ein Epitop von diesen enthält, steuert), gehören, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, die in der Tabelle II aufgeführten.

TABELLE II

PARASITEN UND BAKTERIEN, DIE EPITOPE EXPRIMIEREN, DIE VON REKOMBINANTEN VESICULOVIREN EXPRIMIERT WERDEN KÖNNEN

PARASITEN:

Plasmodium spp.

Eimeria spp.

BAKTERIEN:

Vibrio cholerae

Streptococcus pneumoniae

Neisseria meningitidis

Neisseria gonorrhoeae

Corynebacteria diphtheriae

Colstridium tetani

Bordetella pertussis

Haemophilus spp. (z. B. influenzae)

Chlamydia spp.

enterotoxigene Escherichia coli

Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das Antigen ein Epitop eines Antigens eines Nematoden, um vor Erkrankungen zu schützen, die von solchen Würmern verursacht werden.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform kann eine beliebige DNA-Sequenz, die für ein Plasmodium-Epitop codiert, das, wenn es von einem rekombinanten Vesiculovirus exprimiert wird, in einem Vertebraten-Wirt immunogen ist, für die Insertion in die Vesiculovirus(–)DNA gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert werden. Zu den Plasmodium-Spezies, die als DNA-Quellen dienen können, gehören, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, die humanen Malaria-Parasiten P. falciparum, P. malariae, P. ovale und P. vivax sowie die tierischen Malaria-Parasiten P. berghei, P. yoelii, P. knowlesi und P. cynomolgi. Bei einer besonderen Ausführungsform ist das Epitop, das exprimiert werden soll, ein Epitop des Circumsporozoiten (CS)-Proteins einer Plasmodium-Spezies (Miller et al., 1986, Science 234: 1349).
Bei noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Antigen ein Peptid der β-Untereinheit des Choleratoxins (Jacob et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7611).
Zu Viren, die Epitope (antigenische Determinanten) exprimieren, die von rekombinanten Vesiculoviren exprimiert werden können (wobei die fremde RNA die Produktion eines Antigens des Virus oder eines Derivats davon, das ein Epitop des Antigens umfasst, steuert), gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die in der Tabelle III aufgeführten, wobei die Tabelle diese Viren nach der Familie sortiert auflistet, und zwar aus Gründen der Übersichtlichkeit und nicht als Einschränkung (siehe 1990, Fields Virology, 2. Ausgabe, Fields und Knipe (Hrsg.), Rauen Press, N. Y.).
Bei spezifischen Ausführungsformen weist das Antigen, das durch die fremden Sequenzen codiert wird und das nach der Infektion eines Wirtes mit einem rekombinanten Vesiculovirus exprimiert wird, die Antigenität oder Immunogenität eines Hämagglutinins des Influenza-Virus auf (Genbank-Zugangs-Nr. J02132; Air, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7639–7643, Newton et al., 1983, Virology 128: 495–501), des Glycoproteins des humanen Respiratorischen Syncytial-Virus G (Genbank-Zugangs-Nr. Z33429, Garcia et al., 1994, J. Virol., Collins et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7683), des Core-Proteins, des Matrix-Proteins oder anderer Proteine des Dengue-Virus (Genbank-Zugangs-Nr. M19197, Hahn et al., 1988, Virology 162: 167–180), des Hämagglutinins des Masern-Virus (Genbank-Zugangs-Nr. M81899, Rota et al., 1992, Virology 188: 135–142) und des Glycoproteins gB des Herpes-Simplex-Virus vom Typ 2 (Genbank-Zugangs-Nr. M14923, Bzik et al., 1986, Virology 155: 322–333).
Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein Epitop oder können mehrere Epitope des Fusionsproteins des Respiratorischen Syncytial-Virus (RSV) als ein Antigen exprimiert werden.
Zu weiteren Antigenen, die von einem rekombinanten Vesiculovirus exprimiert werden können, gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, diejenigen, die die Antigenität oder Immunogenität der folgenden Antigene aufweisen: Poliovirus I VP1 (Emini et al., 1983, Nature 304: 699), Hüll-Glycoproteine des HIV I (Putney et al., 1986, Science 234: 1392–1395), Hepatitis-B-Oberflächenantigen (Itoh et al., 1986, Nature 308: 19, Neurath et al., 1986, Vaccine 4: 34), Diphtherie-Toxin (Audibert et al., 1981, Nature 289: 543), Streptococcus-24M-Epitop (Beachey, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 182: 193) und Gonokokken-Pilin (Rothbard und Schoolnik, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185: 247).
Bei anderen Ausführungsformen hat das vom rekombinanten Vesiculovirus exprimierte Antigen die Antigenität oder Immunogenität des Pseudotollwut-Virus g50 (gpD), des Pseudotollwut-Virus II (gpB), des Pseudotollwut-Virus gIII (gpC), des Glycoproteins H des Pseudotollwut-Virus, des Glycoproteins E des Pseudotollwut-Virus, des Glycoproteins 195 der übertragbaren Gastroenteritis, des Matrix-Proteins der übertragbaren Gastroenteritis, des Glycoproteins 38 des Schweine-Rotavirus, des Capsidproteins des Schweine-Parvovirus, des Serpulina hydrodysenteriae Protective Antigen, des Glycoproteins 55 der Bovinen Viralen Diarrhoe, der Hämagglutinin-Neuraminidase des Newcastle Disease Virus, des Hämagglutinins der Schweinegrippe oder der Neuraminidase der Schweinegrippe.
Bei verschiedenen Ausführungsformen weist das vom rekombinanten Vesiculovirus exprimierte Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Antigens auf, das von Serpulina hyodysenteriae, dem Maul- und Klauensäure-Virus, dem Schweinepest-Virus, dem Schweinegrippe-Virus, dem Afrikanischen Schweinefieber-Virus, von Mycoplasma hyopneumoniae, vom infektiösen bovinen Rhinotracheitis-Virus (z. B. dem Glycoprotein E oder dem Glycoprotein G des infektiösen bovinen Rhinotracheitis-Virus) oder dem infektiösen Laryngotracheitis-Virus (z. B. dem Glycoprotein G oder dem Glycoprotein I des infektiösen Laryngotracheitis-Virus) stammt.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist das Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Glycoproteins des La-Crosse-Virus (Gonzales-Scarano et al., 1982, Virology 120: 42), des Neonatal Calf Diarrhea-Virus (Matsuno und Inouye, 1983, Infection and Immunity 39: 155), des Venezolanischen equinen Encephalomyelitis-Virus (Mathews und Roehrig, 1982, J. Immunol. 129: 2763), des Punta-Toro-Virus (Dalrymple et al., 1981, in Replication of Negative Strand Viruses, Bishop und Compans (Hrsg.), Elsevier, N. Y., S. 167), des des murinen Leukämie-Virus (Steeves et al., 1974, J. Virol. 14: 187 oder des Mouse Mammary Tumor Virus (Massey und Schochetman, 1981, Virology 115: 20) auf.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist das Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Antigens eines Humanpathogens auf, einschließlich, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, des humanen Herpesvirus, des Herpes-Simplex-Virus-1, des Herpes-Simplex-Virus-2, des humanen Zytomegalovirus, des Epstein-Barr-Virus, des Varicella-Zoster-Virus, des humanen Herpesvirus-6, des humanen Herpesvirus-7, des humanen Grippe-Virus, des humanen Immunschwäche-Virus, des Tollwut-Virus, des Masern-Virus, des Hepatitis-B-Virus, des Hepatitis-C-Virus, von Plasmodium falciparum und Bordetella Pertussis.
Bei einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung exprimiert ein rekombinantes Vesiculovirus das Core-Protein des Hepatitis-B-Virus und/oder das Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus oder ein Fragment oder Derivat des Antigens (siehe z. B. die GB-Patentveröffentlichung Nr. GB 2034323A , veröffentlicht am 4. Juni 1980, Ganem und Varmus, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56: 651–693, Tiollais et al., 1985, Nature 317: 489–495). Das HBV-Genom (Subtyp adw) ist im Plasmid pAM6 enthalten (Moriarty et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2606–2610, erhältlich bei der American Type Culture Collection (ATCC), Zugangs-Nr. 45020), ein pBR322-basierter Vektor, der in E. coli repliziert werden kann.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist das vom rekombinanten Vesiculovirus exprimierte Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Antigens eines equinen Grippe-Virus oder eines equinen Herpes-Virus auf. Beispiele für derartige Antigene sind die Neuramidase des equinen Grippe-Virus vom Typ A/Alaska 91, die Neuramidase des equinen Grippen-Virus vom Typ A/Miami 63, die Neuramidase des equinen Grippe-Virus vom Typ A/Kentucky 81, das Glycoprotein B des equinen Herpes-Virus vom Typ 1 und das Glycoprotein D des equinen Herpes-Virus vom Typ 1.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist das Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Antigens des bovinen Respiratorischen Syncytial-Virus oder des bovinen Parainfluenza-Virus auf. Zum Beispiel gehören zu derartigen Antigenen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, das Anheftungsprotein des bovinen Respiratorischen Syncytial-Virus (BRSV G), das Fusionsprotein des bovinen Respiratorischen Syncytial-Virus (BRSV F), das Nucleocapsid-Protein des bovinen Respiratorischen Syncytial-Virus (BRSV N), das Fusionsprotein des bovinen Parainfluenza-Virus vom Typ 3 und die Hämagglutinin-Neuramidase des bovinen Parainfluenza-Virus vom Typ 3.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist das Antigen die Antigenität oder Immunogenität des Glycoproteins 48 oder des Glycoproteins 53 des bovinen Diarrhoe-Virus auf.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist das Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Antigens des Virus der Infektiösen Bursitis auf. Beispiele für derartige Antigene sind das Polyprotein und das VP2 des Virus der Infektiösen Bursitis.
Potenziell nützliche Antigene oder Derivate von diesen für den Einsatz als Antigene, die von rekombinanten Vesiculoviren exprimiert werden, können anhand verschiedener Kriterien identifiziert werden, wie der Beteiligung des Antigens an der Neutralisierung der Infektiosität eines Pathogens (Norrby, 1985, Summary, in Vaccines 85, Lerner et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York, S. 388–389), der Typen- oder Gruppenspezifität, der Erkennung durch Antiseren oder Immunzellen von Patienten und/oder der Demonstration schützender Wirkungen von Antiseren oder Immunzellen, die für das Antigen spezifisch sind. Außerdem sollte das codierte Epitop des Antigens vorzugsweise nur eine geringe oder keine Variabilität der Antigenität in Abhängigkeit von der Zeit oder von unterschiedlichen Isolaten des gleichen Pathogens zeigen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform codiert die fremde, in die Vesiculovirus(–)DNA insertierte DNA für ein immunaktives dominantes Epitop eines Pathogens. Fremde DNAs, die für Epitope codieren, die mit einem Antikörper reagieren, auch wenn sie nicht in der Lage sind, eine Immunantwort hervorzurufen, haben immer noch potenzielle Anwendungen in Immunoassays (siehe Abschnitt 5.8 unten).
Bei einer anderen Ausführungsform steuert die fremde RNA des rekombinanten Vesiculovirus die Produktion eines Antigens, das ein Epitop aufweist, das, wenn das rekombinante Vesiculovirus in einen gewünschten Wirt eingeführt wird, eine Immunreaktion hervorruft, die gegen eine Gesundheitsstörung oder eine Erkrankung schützt, die von einer das Epitop enthaltenden Einheit hervorgerufen wird. Zum Beispiel kann das Antigen ein tumorspezifisches Antigen oder tumorassoziiertes Antigen für die Induktion einer schützenden Immunreaktion gegen einen Tumor (z. B. einen malignen Tumor) sein. Zu derartigen tumorspezifischen oder tumorassoziierten Antigenen gehören, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, das KS 1/4-Pan-Carcinoma-Antigen (Perez und Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662–3667, Bumal, 1988, Hybridoma 7(4): 407–415), das Ovarian-Carcinoma-Antigen (CA125) (Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2): 468–475), Prostatic Acid Phosphate (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928), das Prostata-spezifische Antigen (Henttu und Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2): 903–910, Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227–230), das melanomassoziierte Antigen p97 (Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 445–446), das Melanom-Antigen gp75 (Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375–1380), das Hochmolekulare Melanom-Antigen (Natali et al., 1987, Cancer 59: 55–63), und das Prostata-spezifische Membran-Antigen.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das vom rekombinanten Vesiculovirus exprimierte Antigen große Bereiche von Proteinen, die mehrere B-Zell-Epitope (d. h. Epitope, die in der Lage sind, eine humorale Immunreaktion auszulösen) sowie T-Zell-Epitope (d. h. Epitope, die in der Lage sind, eine zellvermittelte Immunreaktion auszulösen) enthalten.
Peptide oder Proteine, für die bekannt ist, dass sie antigenische Determinanten enthalten, können als das Antigen eingesetzt werden. Wenn man keine spezifischen gewünschten Antigene kennt, kann eine Identifizierung und Charakterisierung immunreaktiver Sequenzen durchgeführt werden. Eine Art und Weise, auf die das erreicht werden kann, beinhaltet die Verwendung monoklonaler Antikörper, die, je nach Lage des Falles, gegen die Oberflächenproteine oder andere Moleküle eines Pathogens oder Tumors erzeugt wurden. Die Peptidsequenzen, die von den Antikörpern erkannt werden können, sind definierte Epitope. Alternativ können kleine synthetische Peptide, die an Trägermoleküle konjugiert sind, bezüglich der Erzeugung monoklonaler Antikörper getestet werden, die an Stellen, die dem Peptid entsprechen, auf dem intakten Molekül binden (siehe z. B. Wilson et al., 1984, Cell 37: 767).
Bei einer spezifischen Ausführungsform können geeignete Antigene, einschließlich von Fragmenten oder Derivaten bekannter Antigene, über ihre Hydrophilie identifiziert werden, indem eine Hydrophilie-Analyse durchgeführt wird (Hopp und Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824), um ein Hydrophilie-Profil zu generieren. Ein Hydrophilie-Profil kann zur Identifizierung der hydrophoben und hydrophilen Bereiche eines Proteins und der entsprechenden Bereiche der Gensequenz, die für derartige Proteine codiert, eingesetzt werden. Für hydrophile Bereiche wird vorhergesagt, dass sie immunogen/antigenisch sind. Andere in diesem Gebiet bekannte Verfahren, die zur Identifizierung und Charakterisierung antigenischer Determinanten eingesetzt werden können, sind ebenfalls im Umfang der Erfindung eingeschlossen.
Die für das Antigen codierende fremde DNA, die in eine nicht-essenzielle Stelle der Vesiculovirus(–)DNA insertiert wird, kann gegebenenfalls ferner eine fremde, für ein Cytokin codierende DNA-Sequenz umfassen, die in einem Wirt, der mit dem rekombinanten Vesiculovirus infiziert wurde, exprimiert werden kann und eine Immunreaktion stimulieren kann. Zum Beispiel gehören zu derartigen Cytokinen, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-12, Interferone, Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierende Faktoren und Interleukin-Rezeptoren.
Die fremde DNA kann gegebenenfalls ferner eine Sequenz umfassen, die für einen nachweisbaren Marker codiert und in der Lage ist, diesen zu exprimieren (z. B. die β-Galactosidase).
5.3. KONSTRUKTION VON VESICULOVIRUS(–)DNA, DIE FREMDE DNA ENTHÄLT
Für die initiale Erzeugung eines rekombinanten Vesiculovirus wird die fremde DNA, die eine Sequenz aufweist, die für das gewünschte Antigen codiert, in einen Bereich der Vesiculovirus(–)DNA insertiert oder ersetzt einen Bereich der Vesiculovirus(–)DNA, der für die Replikation nicht essenziell ist. Viele auf diesem Gebiet bekannte Strategien können für die Konstruktion der die fremde DNA enthaltenden Vesiculovirus(–)DNA eingesetzt werden. Zum Beispiel können die relevanten Sequenzen der fremden DNA und der Vesiculovirus(–)DNA mittels in diesem Gebiet bekannter Techniken an geeigneten Stellen mit einer Restriktionsendonuclease oder mit Restriktionsendonucleasen gespalten, isoliert und in vitro ligiert werden. Wenn durch den Restriktionsverdau kohäsive Enden erzeugt werden, kann es sein, dass keine weitere Modifikation der DNA vor der Ligation erforderlich ist. Wenn jedoch keine kohäsiven Enden der DNA durch einen Restriktionsverdau erzeugt werden können oder andere als die vorhandenen Stellen bevorzugt werden, kann eine beliebige der zahlreichen Techniken, die in diesem Gebiet bekannt sind, zur Erzielung einer Ligation der heterologen DNA an den gewünschten Stellen eingesetzt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Stelle für ein gewünschtes Restriktionsenzym leicht über die Amplifizierung der DNA mittels PCR mit Primern, die die Stelle für das Restriktionsenzym enthalten, in die gewünschte DNA eingeführt. Ein anderes Beispiel ist die Spaltung mit einem Restriktionsenzym, an die sich eine Modifizierung zur Erzeugung stumpfer Enden über einen Rückverdau oder das Auffüllen einzelsträngiger DNA-Enden vor der Ligation anschließt. Alternativ können die Enden der gespaltenen Vesiculovirus(–)DNA oder der fremden DNA mittels einer Nuclease, wie der Nuclease Bal 31, der Exonuclease III, der Lambda-Exonuclease, der Mungobohnen-Nuclease oder der Exonuclease-Aktivität der T4-DNA-Polymerase, um nur einige zu nennen, partiell abgebaut werden, um Teile der Sequenz zu entfernen.
Zur Erleichterung der Insertion der fremden DNA kann eine Oligonucleotidsequenz (ein Linker), die für eine Restriktionsstelle oder mehrere Restriktionsstellen codiert, über eine Ligation an DNA-Enden in einen Bereich der Vesiculovirus(–)DNA insertiert werden (siehe z. B. den Polylinker in pVSVSS1, 2). Ein Linker kann auch zur Erzeugung geeigneter Restriktionsstellen in der Sequenz der fremden DNA eingesetzt werden.
Zusätzlich kann die Vesiculovirus(–)DNA oder die fremde DNA-Sequenz in vitro oder in vivo zur Bildung neuer Restriktionsstellen oder zur Zerstörung bereits bestehender mutiert werden, um die Verfahren der In-vitro-Ligaiton zu erleichtern. Es kann jede beliebige Mutagenesetechnik, die in diesem Gebiet bekannt ist, verwendet werden, einschließlich, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, einer ortsgerichteten Mutagenese in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), einer chemischen Mutagenese etc.
Sequenzen der Vesiculovirus(–)DNA, die durch derartige In-vitro-Manipulationen auf unerwünschte Weise modifiziert wurden, können, wenn es gewünscht ist, über die Einführung geeigneter Sequenzen an den gewünschten Stellen „restauriert" werden.
Die jeweilige Strategie für die Einführung der fremden DNA hängt von der spezifischen Stelle der Vesiculovirus(–)DNA, die ersetzt werden soll oder in die insertiert werden soll, sowie von der fremden DNA, die insertiert werden soll, ab.
Die für die immunogenen Peptide oder Proteine codierenden Sequenzen liegen vorzugsweise als einzelne Kopien vor, aber sie können auch als multiple Kopien im Virusgenom vorliegen.
Die Bildung der gewünschten, die fremde DNA enthaltenden Vesiculovirus(–)DNA kann mittels Standardverfahren, wie einer DNA-Sequenzanalyse, einer Hybridisierungsanalyse und/oder einer Restriktionskartierung über Verfahren, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, bestätigt werden.
Für ein gewünschtes Antigen codierende fremde DNA kann von einer beliebigen der zahlreichen möglichen Quellen erhalten werden, wie klonierter DNA, genomischer DNA oder cDNA, die mittels RNA des gewünschten Pathogens oder Tumors, je nach Lage der Dinge, hergestellt wurde, oder chemisch synthetisierter DNA, und sie kann mittels gentechnischer Verfahren, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, manipuliert werden (siehe Sambrook et al., 1991, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York). Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung des gewünschten Fragments der fremden DNA aus einer rohen DNA-Präparation oder einer kleinen DNA-Probe mittels Standardverfahren eingesetzt. Geeignete Primer für den Einsatz in der PCR können leicht basierend auf publizierten Sequenzen abgeleitet werden.
Zur Erzeugung der geeigneten DNA-Fragmente kann die DNA (z. B. des interessierenden Pathogens oder Tumors) an spezifischen Stellen mittels verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Alternativ kann man DNaseI in Gegenwart von Mangan oder die Mungobohnen-Nuclease (McCutchan et al., 1984, Science 225: 626) zur Fragmentierung der DNA einsetzen, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, zum Beispiel durch Sonifizieren. Die linearen DNA-Fragmente können dann nach ihrer Größe mittels Standardtechniken aufgetrennt werden, zu denen, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, eine Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese und eine Säulenchromatografie gehören.
Am bevorzugtesten wird eine PCR-Amplifizierung von DNA-Fragmenten, die das gewünschte Epitop oder die gewünschten Epitope enthalten, durchgeführt, wobei die PCR-Primer eine Erkennungsstelle für ein gewünschtes Restriktionsenzym enthalten und diese damit in die amplifizierte DNA einführen. Alternativ kann jedes beliebige Restriktionsenzym oder jede beliebige Kombination von Restriktionsenzymen zur Erzeugung eines DNA-Fragments oder von DNA-Fragmenten, das das gewünschte Epitop enthält bzw. die die gewünschten Epitope enthalten, eingesetzt werden, vorausgesetzt, die Enzyme zerstören die Immunaktivität des codierten Produktes nicht. Demnach können viele Kombinationen von Restriktionsenzymen zur Generierung von DNA-Fragmenten eingesetzt werden, die, wenn sie in die Vesiculovirus(–)DNA eingeführt werden, in der Lage sind, rekombinante Vesiculoviren zu erzeugen, die die Produktion des Peptids, das das Epitop oder die Epitope enthält, steuern.
Nachdem die DNA-Fragmente generiert wurden, kann die Identifizierung des spezifischen Fragments, das die gewünschte Sequenz enthält, auf verschiedene Art und Weise erfolgen. Zum Beispiel kann, wenn eine geringe Menge der gewünschten DNA-Sequenz oder eine homologe Sequenz bereits vorhanden ist, sie als markierte Sonde (z. B. Nick-translatiert) für den Nachweis des DNA-Fragments, das die gewünschte Sequenz enthält, über eine Nucleinsäure-Hybridisierung eingesetzt werden. Alternativ können, wenn die Sequenz des abgeleiteten Gens oder des Genfragments bekannt ist, isolierte Fragmente oder Teile von diesen mit Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind, sequenziert werden und über einen Vergleich der abgeleiteten Sequenz mit der der bekannten DNA- oder Protein-Sequenz identifiziert werden. Alternativ kann das gewünschte Fragment mittels Techniken identifiziert werden, zu denen, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, eine mRNA-Selektion, das Umschreiben der identifizierten mRNA in cDNA, das chemische Synthetisieren der Gensequenz (vorausgesetzt, die Sequenz ist bekannt) oder eine Selektion auf Basis der Expression des codierten Proteins (z. B. über eine Antikörperbindung) nach einem „Shotgun-Cloning" verschiedener DNA-Fragmente in ein Expressionssystem gehören.
Zu den Sequenzen, die für Peptide codieren, die in rekombinanten Vesiculoviren gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert werden sollen, gehören, unabhängig davon, ob sie mittels gentechnologischer Verfahren, einer chemischen Synthese oder mittels Reinigungstechniken erzeugt werden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Sequenzen, die für die gesamten Aminosäuresequenzen oder Teile (Fragmente) der Aminosäuresequenzen pathogenspezifischer und tumorspezifischer Antigene codieren, sowie andere Derivate und Analoge von diesen, die deren Antigenität oder Immunogenität aufweisen. Derivate oder Analoge von Antigenen können mittels Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind und zu denen, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Standard-Immunoassays gehören, auf die gewünschte Aktivität getestet werden.
Im Einzelnen können Antigenderivate durch die Veränderung der codierenden Nucleotidsequenzen des Antigens über Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die die Antigenität oder Immunogenität des Antigens nicht zerstören, hergestellt werden. Zum Beispiel können wegen der Degeneriertheit der codierenden Nucleotidsequenzen andere DNA- Sequenzen, die im Wesentlichen für die gleiche Aminosäuresequenz wie das Gen des nativen Antigens oder ein Teil von diesem codieren, bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Andere Beispiele sind, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Nucleotidsequenzen, die die gesamten Gene oder cDNAs oder Teile von Genen oder cDNAs umfassen, die durch die Substitution mit verschiedenen Codons abgeändert wurden, die für einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest in der Sequenz codieren, wodurch eine stumme Veränderung erzeugt wird. Zum Beispiel kann ein Aminosäurerest oder können mehrere Aminosäurereste in der Sequenz durch eine andere Aminosäure mit ähnlicher Polarität, die als funktionelles Äquivalent wirkt, ersetzt werden, was zu einer stummen Änderung führt. Ein Ersatz für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz kann aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beispiel gehören zu den unpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Zu den polaren neutralen Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Zu den positiv geladenen (basischen) Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin. Zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren gehören Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Die Antigenderivate und -analogen können mittels verschiedener Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind, erzeugt werden. Zum Beispiel kann eine klonierte Gensequenz mittels einer der zahlreichen Strategien, die in diesem Gebiet bekannt sind, modifiziert werden (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York). Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit einer Restriktionsendonuclease oder mit Restriktionsendonucleasen gespalten werden, woran sich, wenn es gewünscht ist, eine weitere enzymatische Modifizierung anschließen kann, sie kann isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Erzeugung des für ein Derivat oder Analoges des Antigens codierenden Gens sollte darauf geachtet werden, dass sichergestellt wird, dass das modifizierte Gen in dem Bereich des Gens, wo das gewünschte Epitop codiert ist, bzw. die gewünschten Epitope codiert sind, im gleichen Leserahmen für die Translation wie das Antigen vorliegt und nicht von Stopp-Signalen für die Translation unterbrochen ist,.
Zusätzlich kann die für das Antigen codierende Nucleotidsequenz in vitro oder in vivo mutiert werden, um Sequenzen für die Translationsinitiation und/oder -termination zu erzeugen und/oder zu zerstören oder um Variationen in codierenden Bereichen zu erzeugen und/oder neue Stellen für Restriktionsendonucleasen zu bilden oder bereits bestehende zu erzeugen, so dass eine weitere Modifizierung in vitro erleichtert wird. Es kann jede beliebige in diesem Gebiet bekannte Technik für die Mutagenese eingesetzt werden, einschließlich, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, einer ortsgerichteten Mutagenese in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), einer Verwendung von TAB^®-Linkern (Pharmacia), etc.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist das codierte Antigenderivat ein schimärisches Protein oder Fusionsprotein, das ein erstes Protein oder ein Fragment von diesem aufweist, das mit einer zweiten anderen Aminosäuresequenz fusioniert ist. Ein derartiges schimärisches Protein wird durch eine schimärische Nucleinsäure codiert, bei der die beiden codierenden Sequenzen im Leserahmen miteinander verknüpft sind. Ein derartiges schimärisches Produkt kann durch das Aneinanderlegieren der geeigneten Nucleinsäuresequenzen, die für die gewünschten Aminosäuresequenzen codieren, im richtigen Leserahmen mittels Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Bei einer spezifischen Ausführungsform wird ein Fusionsprotein erzeugt, bei dem die erste Proteinsequenz ein Epitop eines Antigens enthält und die zweite Proteinsequenz ein Epitop eines anderen Antigens enthält.
Derivate und Fragmente bekannter Antigene können leicht mittels Standard-Immunoassay-Techniken getestet werden, um sicherzustellen, dass sie die gewünschte Immunogenität oder Antigenität aufweisen, die eine DNA-Sequenz, die für ein derartiges Fragment oder Derivat codiert, für die Insertion in die Vesiculovirus(–)DNA geeignet macht.
Eine DNA-Sequenz, die für ein Epitop codiert, das ein Hapten ist, d. h. ein Molekül, das insofern antigenisch ist, als es selektiv mit zugehörigen Antikörpern reagiert, aber insofern nicht immunogen ist, als es keine Immunreaktion bewirken kann, wenn es ohne Adjuvans oder Trägerproteine verabreicht wird, kann ebenfalls für eine Anwendung isoliert werden, da man sich vorstellt, dass bei bestimmten Ausführungsformen die Präsentation durch die erfindungsgemäßen Vesiculoviren dem vom Virus exprimierten Hapten eine Immunogenität übertragen kann.
Nachdem sie identifiziert und isoliert wurde wird die fremde DNA, die die interessierende Sequenz oder die interessierenden Sequenzen enthält, dann für die Produktion eines rekombinanten Vesiculovirus in die Vesiculovirus(–)DNA eingefügt.
5.4. PRODUKTION REKOMBINANTER VESICULOVIREN
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculoviren werden hergestellt durch das Bereitstellen von Vesiculovirus(–)DNA, bei der in Bereiche, die für die Replikation nicht essenziell sind, fremde DNA insertiert wurde oder diese Bereiche durch fremde DNA ersetzt wurden, die eine Sequenz umfasst, die für ein Antigen codiert, sowie von rekombinanten Quellen für das N-Protein, das P-Protein und das L-Protein des Vesiculovirus in einer geeigneten Wirtszelle. Die Produktion erfolgt vorzugsweise in vitro in Zellkulturen.
Die für die Produktion des rekombinanten Vesiculovirus eingesetzte Wirtszelle kann jede beliebige Zelle sein, in der Vesiculoviren wachsen, zum Beispiel Säugetierzellen und einige Insektenzellen (z. B. Drosophila). Es können primäre Zellen und, bevorzugter, Zelllinien eingesetzt werden. Eine große Zahl von Zelllinien, die in diesem Gebiet allgemein bekannt sind, stehen für den Einsatz zur Verfügung. Beispielsweise gehören zu derartigen Zelllinien, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, BHK (Baby Hamster Kidney)-Zellen, CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellen, HeLa-Zellen (human), Mäuse-L-Zellen, Vero-Zellen (Affe), ESK-4-, PK-15-, EMSK-Zellen, MDCK (Madin-Darby Canine Kidney)-Zellen, MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney)-Zellen, 293-Zellen (human) und Hep-2-Zellen.
Die Quellen für das N-, P- und L-Protein können die gleichen oder verschiedene rekombinante Nucleinsäuren sein, die das N-, P- und L-Protein codieren und fähig sind, es in der Wirtszelle, in der das rekombinante Vesiculovirus produziert werden soll, zu exprimieren.
Die für das N-, P- und L-Protein codierenden Nucleinsäuren werden mittels beliebiger in diesem Gebiet zur Verfügung stehender Verfahren erhalten. Die Nucleinsäuresequenzen für N, P und L sind offenbart worden und können verwendet werden. Siehe zum Beispiel die Genbank-Zugangs-Nr. J02428, Rose und Schubert, 1987, in The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Press, N. Y., S. 129–166. Die für das N-, P- und L-Gen codierenden Sequenzen können auch aus dem Plasmid pVSVFL(+) erhalten werden, das bei der ATCC hinterlegt ist und die Zugangs-Nr. 97134 hat, z. B. über eine PCR-Amplifizierung des gewünschten Gens (PCR, US-Patent Nr. 4 683 202 , 4 683 195 und 4 889 818 , Gyllenstein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7652–7656, Ochman et al., 1988, Genetics 120: 621–623, Loh et al., 1989, Science 243: 217–220). Wenn ein Nucleinsäureklon für ein beliebiges der N-, P- oder L-Gene nicht bereits erhältlich ist, kann der Klon mit Hilfe gentechnologischer Standardverfahren erhalten werden. Zum Beispiel kann die DNA mittels Standardverfahren erhalten werden, die in diesem Gebiet bekannt sind, über die Reinigung von RNA aus Vesiculoviren gefolgt von einer reversen Transkription und einer Polymerase-Kettenreaktion (Mullis und Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155: 335–350). Zu Alternativen für die Isolierung eines N-, P- oder L-Gens gehört, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die chemische Synthese der Gensequenz selbst. Andere Verfahren sind möglich und sind im Umfang der Erfindung eingeschlossen.
Wenn es gewünscht ist, kann das identifizierte und isolierte Gen dann vor dem Transfer in einen Expressionsvektor optimal in einen geeigneten Klonierungsvektor eingefügt werden.
Nucleinsäuren, die für Derivate (einschließlich von Fragmenten) und Analoge der nativen N-, P- und L-Gene codieren, sowie Derivate und Analoge der Vesiculovirus(–)DNA können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, solange solche Derivate und Analoge ihre Funktion beibehalten, wie sie zum Beispiel durch die Fähigkeit dokumentiert wird, dass sie, wenn sie gemäß der Erfindung eingesetzt werden, zur Produktion eines replizierbaren Vesiculovirus, das eine genomische RNA enthält, die eine fremde DNA enthält, fähig sind. Im Einzelnen können Derivate durch das Verändern der Sequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die funktionell aktive Moleküle liefern, hergestellt werden. Weiterhin können aufgrund der inhärenten Degeneriertheit der codierenden Nucleotidsequenzen andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen für die gleiche oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz codieren, bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis der Ähnlichkeit bezüglich der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der beteiligten Reste durchgeführt werden.
Die gewünschte, für N/P/L codierende Nucleinsäure wird dann vorzugsweise in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, d. h. einen Vektor, der die für die Transkription und Translation der eingefügten, für das Protein codierenden Sequenz in dem Wirt, in dem das gewünschte rekombinante Vesiculovirus erzeugt werden soll, erforderlichen Elemente enthält, wodurch ein Vektor erzeugt wird, der die Steuerung der Synthese des N/P/L-Proteins bewirkt, das sich anschließend mit der genomischen RNA des Vesiculovirus, die die fremde Sequenz enthält (die in der Wirtszelle aus der antigenomischen Vesiculovirus(+)RNA erzeugt wurde, die durch Transkription der Vesiculovirus(–)DNA erzeugt wurde), zusammenfügt. Es können verschiedene Vektorsysteme für die Expression der für N, P und L codierenden Sequenzen eingesetzt werden und um die Vesiculovirus(–)DNA, die die fremde DNA enthält, zu transkribieren, solange der Vektor im Wirt funktional ist und mit einem möglichen weiteren vorhandenen Vektor kompatibel ist. Zu derartigen Vektoren gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Bakteriophagen, Plasmide oder Cosmide. Bei einem bevorzugten Aspekt wird ein Plasmid-Expressionsvektor verwendet. Die Expressionselemente von Vektoren variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. Es kann ein beliebiges aus einer Anzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden, solange diese im Wirt funktional sind.
Gentechnologische Standardverfahren können zur Konstruieren der Expressionsvektoren, die die DNA, die für das N-, P- und L-Protein codiert, enthalten, sowie der Vesiculovirus(–)DNA, die die fremde DNA enthält, die die geeigneten Signale für die Kontrolle der Transkription/Translation aufweist, eingesetzt werden (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, oben, und die dort beschriebenen Verfahren). (Signale für die Kontrolle der Translation werden für die Transkription der Vesiculovirus(–)DNA nicht benötigt, und somit können sie von einem Vektor, der die Vesiculovirus(–)DNA enthält, weggelassen werden, auch wenn derartige Signale im Vektor vorhanden und funktionsfähig mit anderen Sequenzen, die für ein Protein codieren, dessen Expression gewünscht ist, verknüpft sein können.) Die Expression kann mittels eines beliebigen Promotor/Enhancer-Elements, das in diesem Gebiet bekannt ist, gesteuert werden. Die Promotoren, die zur Steuerung der Expression eingesetzt werden können, können konstitutiv oder induzierbar sein. Bei einer spezifischen Ausführungsform ist der Promotor ein RNA-Polymerase-Promotor.
Signale für die Termination der Transkription (stromabwärts des Gens) und selektierbare Marker sind vorzugsweise ebenfalls in einem Plasmid-Expressionsvektor enthalten. Zusätzlich zu den Promotorsequenzen enthalten Expressionsvektoren für das N-, P- und L-Protein vorzugsweise spezifische Initiationssignale für eine effiziente Translation insertierter N/P/L-Sequenzen, z. B. eine Ribosomenbindungsstelle.
Spezifische Initiationssignale werden für eine effiziente Translation der insertierten, für Proteine codierenden Sequenzen benötigt. Zu diesen Signalen gehören das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In Fällen, in denen das gesamte N-, P- oder L-Gen einschließlich seines eigenen Initiationscodons und angrenzender Sequenzen in die geeigneten Vektoren insertiert ist, kann es sein, dass keine weiteren Signale für die Kontrolle der Translation erforderlich sind. In Fällen jedoch, bei denen nur ein Teil der Gensequenz insertiert ist, müssen exogene Signale für die Kontrolle der Translation, einschließlich des ATG-Initiationscodons, bereitgestellt werden. Das Initiationscodon muss ferner in Phase mit dem Leserahmen der für Proteine codierenden Sequenzen vorliegen, um die Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Diese exogenen Signale für die Steuerung der Translation und Initiationscodons können unterschiedlichen Ursprungs sein, sowohl natürlichen als auch synthetischen.
Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst ein von der Erfindung bereitgestellter rekombinanter Expressionsvektor, der für ein N-, P- oder L-Protein oder funktionale Derivate von diesen codiert, die folgenden funktionsfähig miteinander verknüpften Komponenten: einen Promotor, der die Expression des N-, P- oder L-Proteins oder eines funktionellen Derivates von diesen steuert, ein Signal für die Initiation der Translation, eine DNA-Sequenz, die für das N-, P- oder L-Protein oder funktionale Derivate von diesen codiert, und ein Signal für die Termination der Transkription. Bei einem bevorzugten Aspekt liegen die obigen Komponenten, wie sie oben aufgeführt wurden, in der Reihenfolge von 5' nach 3' vor.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform wird das für das N-, P- oder L-Protein codierende Gen stromabwärts des T7-RNA-Polymerase-Promotors vom Gen 10 des Phagen T7 eingefügt, so dass es mit einem A in der Position –3 angeordnet ist. Ein Terminator für die T7-RNA-Polymerase und ein Replikon sind ebenfalls im Expressionsvektor vorhanden. Bei dieser Ausführungsform wird die T7-RNA-Polymerase für die Transkription der N/P/L-Sequenz bereitgestellt. Die T7-RNA-Polymerase kann von einer in das Chromosom integrierten Sequenz oder episomal erzeugt werden, und am bevorzugtesten wird sie über die intrazelluläre Expression von einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das für die T7-RNA-Polymerase codiert, bereitgestellt (siehe unten). Vorzugsweise werden das N-, P- und L-Protein jeweils von einer DNA-Sequenz codiert, die funktionsfähig mit einem Promotor in einem Expressionsplasmid verknüpft ist, das die erforderlichen regulatorischen Signale für die Transkription und Translation des N-, P- und L-Proteins enthält. Ein derartiges Expressionsplasmid enthält vorzugsweise einen Promotor, die codierende Sequenz und ein Signal für die Termination der Transkription und die Polyadenylierung und gegebenenfalls einen selektierbaren Marker (z. B. β-Galactosidase). Das N-, P- und L-Protein kann vom gleichen Plasmid oder von verschiedenen Plasmiden codiert werden oder von einer Kombination von diesen, und vorzugsweise liegen sie in unterschiedlichen Plasmiden vor. Weniger bevorzugt ist, dass eines oder mehrere des N-, P- und L-Proteins intrachromosomal exprimiert werden können.
Die klonierten Sequenzen, die die Vesiculovirus(–)DNA, die die fremde DNA enthält, umfassen, und die klonierten Sequenzen, die die für das N-, P- und L-Protein codierenden Sequenzen umfassen, können mittels eines beliebigen in diesem Gebiet bekannten Verfahrens in die gewünschte Wirtszelle eingeführt werden, zum Beispiel durch eine Transfektion, Elektroporation, Infektion (wenn die Sequenzen z. B. in einem viralen Vektor enthalten sind), eine Mikroinjektion etc.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden DNA, die Vesiculovirus(–)DNA umfasst, die fremde DNA enthält, die für ein Antigen codiert, und die funktionsfähig mit einem RNA-Polymerase-Promotor (vorzugsweise einem RNA-Polymerase-Promotor eines Bakteriophagen) verknüpft ist, DNA, die für N codiert und funktionsfähig mit dem gleichen RNA-Polymerase-Promotor verknüpft ist, DNA, die für P codiert und funktionsfähig mit dem gleichen Polymerase-Promotor verknüpft ist, und DNA, die für L codiert und funktionsfähig mit dem gleichen Polymerase-Promotor verknüpft ist, alle in die gleiche Wirtszelle eingeführt (vorzugsweise über eine Transfektion), wobei die RNA-Polymerase in dieser Wirtszelle im Zytoplasma bereitgestellt worden ist. Die RNA-Polymerase wird im Zytoplasma vorzugsweise über die Expression von einem rekombinanten Virus bereitgestellt, das im Zytoplasma repliziert und die RNA-Polymerase exprimiert, am bevorzugtesten von einem Vaccinia-Virus (siehe den Abschnitt weiter unten), das in die gleiche Wirtszelle eingeführt wurde (z. B. über eine Infektion). Die zytoplasmatische Bereitstellung der RNA-Polymerase wird bevorzugt, da sie zu einer zytoplasmatischen Transkription und Prozessierung der VSV(–)DNA, die die fremde DNA enthält, und des N-, P- und L-Proteins führt, wodurch die Spleißmaschinerie im Zellkern umgangen wird und somit die richtige Prozessierung und Produktion des N-, P- und L-Proteins und der resultierende Zusammenbau des rekombinanten Vesiculovirus maximiert werden. Zum Beispiel stellt das Vaccinia-Virus auch zytoplasmatische Enzyme für die Prozessierung (Capping und Polyadenylierung) von mRNA bereit, was eine korrekte Translation erleichtert. Bei einem am stärksten bevorzugten Aspekt werden T7-RNA-Polymerase-Promotoren eingesetzt, und es wird eine zytoplasmatische Quelle für die T7-RNA-Polymerase bereitgestellt, indem in die Wirtszelle auch ein rekombinantes Vaccinia-Virus eingeführt wird, das für eine T7-RNA-Polymerase in der Wirtszelle codiert. Solche Vaccinia-Viren können mittels gut bekannter Verfahren erhalten werden (siehe Abschnitt 5.5, unten). Bei einem bevorzugten Aspekt kann ein rekombinantes Vaccinia-Virus wie vTF7-3 (Fuerst et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8122–8126) verwendet werden. Bei einem am stärksten bevorzugten Aspekt ist die DNA, die die Vesiculovirus(–)DNA umfasst, die fremde DNA enthält, das Plasmid pVSVSS1, bei dem fremde DNA in den Polylinkerbereich insertiert wurde.
Alternativ, auch wenn es weniger bevorzugt ist, kann die RNA-Polymerase (z. B. die T7-RNA-Polymerase) über den Einsatz einer Wirtszelle bereitgestellt werden, die die T7-RNA-Polymerase von einer in das Chromosom integrierten Sequenz exprimiert (z. B. ursprünglich über eine homologe Rekombination in das Chromosom insertiert wurde), und zwar vorzugsweise konstitutiv, oder die die T7-RNA-Polymerase episomal von einem Plasmid exprimiert.
Bei einer weiteren, weniger bevorzugten Ausführungsform kann die für ein Antigen codierende VSV(–)DNA, die funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist, in eine Wirtszelle transfiziert werden, die stabil rekombinant das N-, P- und L-Protein von in das Chromosom integrierten Sequenzen exprimiert.
Die Zellen werden kultiviert, und das rekombinante Vesiculovirus wird mittels Standardverfahren gewonnen. Zum Beispiel werden, ohne dass es als Einschränkung gemeint ist, nach ungefähr 24 Stunden die Zellen und das Medium gesammelt, eingefroren und aufgetaut, und die Lysate werden geklärt, wodurch Viruspräparation erhalten werden. Alternativ werden die Zellen und das Medium gesammelt und einfach durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit von Zellen und Zelltrümmern befreit.
Vorzugsweise wird dann die Bestätigung, dass die richtige fremde Sequenz im Genom des rekombinanten Vesiculovirus vorhanden ist und die Produktion des gewünschten Proteins oder der gewünschten Proteine in einer infizierten Zelle steuert, durchgeführt. Zu diesem Zweck können In diesem Gebiet bekannte Standardverfahren angewandt werden. Zum Beispiel wird genomische RNA aus dem Vesiculovirus über eine Extraktion der Virus-Präparationen mit SDS und Phenol gewonnen, und sie kann einer reversen Transkription unterzogen werden (und, wenn es gewünscht ist, einer PCR), woran sich eine Sequenzierung, eine Southern-Hybridisierung mittels einer für die fremde DNA spezifischen Sonde oder eine Kartierung mit Restriktionsenzymen etc. anschließt. Das Virus kann zur Infektion von Wirtszellen eingesetzt werden, die dann mit Hilfe von Standard-Immunoassay-Techniken unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein oder mittels Assays, die auf der funktionellen Aktivität des Proteins beruhen, auf eine Expression des gewünschten Proteins untersucht werden. Es können andere Techniken, die in diesem Gebiet bekannt sind, eingesetzt werden.
Die Erfindung stellt auch Kits für die Produktion rekombinanter Vesiculoviren bereit. Bei einer Ausführungsform umfasst das Kit in einem Behälter oder mehreren (und am bevorzugtesten in separaten) Behältern: a) eine erste rekombinante DNA, die in einer geeigneten Wirtszelle unter Produktion einer antigenomischen (+)RNA des Vesiculovirus transkribiert werden kann, wobei in einen Teil der RNA, der für die Replikation des Vesiculovirus nicht essenziell ist, eine fremde RNA-Sequenz insertiert wurde oder dieser Teil durch eine fremde RNA-Sequenz ersetzt wurde, b) eine zweite rekombinante DNA, die eine Sequenz umfasst, die für ein N-Protein des Vesiculovirus codiert, c) eine dritte rekombinante DNA, die eine Sequenz umfasst, die für ein L-Protein des Vesiculovirus codiert und d) eine vierte rekombinante DNA, die eine Sequenz umfasst, die für ein P-Protein des Vesiculovirus codiert. Die zweite, die dritte und die vierte rekombinante DNA können ein Teil desselben oder unterschiedlicher DNA-Moleküle sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Sequenzen, die für das N-, P- und L-Protein codieren, jeweils funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft, der die Expression des N-, P- und L-Proteins in der geeigneten Wirtszelle steuert. Bei verschiedenen Ausführungsformen kann das Kit die verschiedenen Nucleinsäuren enthalten, zum Beispiel Plasmid-Expressionsvektoren, die hier weiter oben für die Verwendung bei der Produktion rekombinanter Vesiculoviren beschrieben wurden.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Kit a) eine erste rekombinante DNA, die in einer geeigneten Wirtszelle unter Bildung einer antigenomischen Vesiculovirus-DNA transkribiert werden kann, wobei in einen Teil der RNA, der für die Replikation des Vesiculovirus nicht essenziell ist, eine fremde RNA-Sequenz insertiert wurde oder dieser Teil durch eine fremde RNA-Sequenz ersetzt wurde, und b) eine Wirtszelle, die rekombinant das N-, P- und L-Protein des Vesiculovirus exprimiert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Kit in separaten Behältern:

a) ein erstes Plasmid, das die folgenden funktionsfähig miteinander verknüpften Komponenten umfasst: i) einen Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, ii) eine DNA, die eine Sequenz umfasst, die in einer geeigneten Wirtszelle unter Bildung eines RNA-Moleküls transkribiert werden kann, das eine antigenomische RNA des Vesiculovirus umfasst, wobei in einen Teil der RNA, der für die Replikation des Vesiculovirus nicht essenziell ist, eine fremde RNA-Sequenz insertiert wurde oder dieser Teil durch eine fremde RNA-Sequenz ersetzt wurde, und wobei das 3'-Ende der antigenomischen RNA unmittelbar an eine Ribozymsequenz angrenzt, die am 3'-Ende der antigenomischen RNA spaltet, und iii) ein Signal für die Termination der Transkription durch die Bakteriophagen-RNA-Polymerase, und
b) ein zweites Plasmid, das die folgenden funktionsfähig miteinander verknüpften Komponenten umfasst: i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, ii) eine DNA, die eine Sequenz umfasst, die für das N-Protein des Vesiculovirus codiert, und iii) ein Signal für die Termination der Transkription durch die Bakteriophagen-RNA-Polymerase, und
c) ein drittes Plasmid, das die folgenden funktionsfähig miteinander verknüpften Komponenten umfasst: i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, ii) eine DNA, die eine Sequenz umfasst, die für das P-Protein des Vesiculovirus codiert, und iii) ein Signal für die Termination der Transkription durch die Bakteriophagen-RNA-Polymerase, und
d) ein viertes Plasmid, das die folgenden funktionsfähig miteinander verknüpften Komponenten umfasst: i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, ii) eine DNA, die eine Sequenz umfasst, die für das L-Protein des Vesiculovirus codiert, und iii) ein Signal für die Termination der Transkription durch die Bakteriophagen-RNA-Polymerase.

Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Kit ferner in einem separaten Behälter ein rekombinantes Vaccinia-Virus, das für die Bakteriophagen-RNA-Polymerase codiert und zu deren Expression fähig ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Komponenten in den Behältern in gereinigter Form vor.
5.4.1 REKOMBINANTE VACCINIA-VIREN, DIE FREMDE RNA-POLYMERASEN CODIEREN UND ZU DEREN EXPRESSION IN DER LAGE SIND
Bei einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird die Transkription der Vesiculovirus(–)DNA, die die fremde, für ein Antigen codierende DNA enthält, und/oder die Transkription der DNA, die für das N-, P- und L-Protein in der Wirtszelle codiert, durch einen RNA-Polymerase-Promotor (wobei die RNA-Polymerase vorzugsweise nicht endogen in der Wirtszelle vorkommt) gesteuert, und die RNA-Polymerase (die die Transkription vom Promotor initiiert) wird in der Wirtszelle rekombinant über die Expression von einem rekombinanten Vaccinia-Virus bereitgestellt. DNA-Sequenzen, die für RNA-Polymerasen codieren, sind gut bekannt, stehen in diesem Fachgebiet zur Verfügung und können verwendet werden. Zum Beispiel kann Phagen-DNA erhalten werden und eine PCR zur Amplifizierung des gewünschten Polymerase-Gens eingesetzt werden.
Die Insertion der gewünschten rekombinanten DNA-Sequenz, die für die RNA-Polymerase codiert und zu deren Expression in der Lage ist, in ein Vaccinia-Virus für die Expression durch das Vaccinia-Virus wird vorzugsweise erreicht, indem zunächst die DNA-Sequenz in einen Plasmid-Vektor eingefügt wird, der anschließend über eine homologe Rekombination in ein Vaccinia-Virusgenom transferiert werden kann. Somit wird bei einem bevorzugten Aspekt der Erfindung zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren die gewünschte DNA-Sequenz, die für die Polymerase codiert, mittels gentechnologischer Verfahren (siehe Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York) in einen Insertionsvektor (vorzugsweise Plasmid-Vektor) flankiert von (vorzugsweise) nicht-essenziellen Vaccinia-DNA- Sequenzen eingefügt, wodurch der nachfolgende Transfer des schimärischen Gens bzw. der schimärischen Gene in das Vaccinia-Virus über eine homologe Rekombination ermöglicht wird. Die Sequenzen werden so in den Vektor eingefügt, dass sie unter der Kontrolle eines Promotors, der im Vaccinia-Virus funktional ist, exprimiert werden können.
Die Expression fremder DNA in rekombinanten Vaccinia-Viren erfordert, dass die Promotoren so angeordnet sind, dass sie im Vaccinia-Virus funktional sind, so dass sie die Expression der für das Protein codierenden DNA-Sequenzen der Polymerase steuern. Es sind Plasmid-Insertionsvektoren konstruiert worden, um schimärische Gene in das Vaccinia-Virus für ihre Expression in diesem einzufügen. Beispiele für derartige Vektoren werden bei Mackett (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857–864) beschrieben. Die für die Polymerase codierende DNA wird in eine geeignete Klonierungsstelle für eine Restriktionsendonuclease eingefügt. Zusätzlich zu Plasmid-Insertionsvektoren können Insertionsvektoren verwendet werden, die auf der einzelsträngigen M13-Bakteriophagen-DNA basieren (Wilson et al., 1986, Gene 49: 207–213).
Die insertierte Polymerase-DNA sollte vorzugsweise keine Introns enthalten, und die Insertion sollte vorzugsweise so erfolgen, dass die codierenden Sequenzen in enger Nachbarschaft zum Promotor angeordnet werden, ohne dass andere Startcodons zwischen dem Initiator-ATG und dem 5'-Ende des Transkripts liegen.
Der Plasmid-Insertionsvektor sollte regulatorische Elemente für die Transkription und die Translation, die im Vaccinia-Virus aktiv sind, enthalten. Das Plasmid sollte so konfiguriert sein, dass sich die Polymerasesequenzen unter der Kontrolle eines Promotors befinden, der im Vaccinia-Virus aktiv ist. Zu Promotoren, die in den Insertionsvektoren eingesetzt werden können, gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, der Thymidinkinase-(TK)-Promotor des Vaccinia-Virus, der 7,5K-Promotor (Cochran et al., 1985, J. Virol. 54: 30–37), der 11K-Promotor ( Europäische Patentschrift 0198328 ), der F-Promotor (Paoletti et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 193–197) sowie verschiedene frühe und späte Vaccinia-Promotoren (siehe Moss, 1990, Virology, 2. Auflage, Kapitel 74, Fields et al., Hrsg., Raven Press Ltd., New York, S. 2079–2111).
Bei einer spezifischen Ausführungsform enthält der Plasmid-Insertionsvektor (für den schließlichen Transfer in das Vaccinia-Virus) eine für die T7-RNA-Polymerase codierende Sequenz unter der Kontrolle eines Promotors, der im Vaccinia-Virus aktiv ist. Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform enthält ein Plasmid-Insertionsvektor ein Coexpressionssystem, das aus unterschiedlich orientierten Promotoren besteht, wobei einer die Transkription der Polymerasesequenzen steuert, der andere die Transkription eines Reportergens oder selektierbaren Markers steuert, so dass der Nachweis oder die Selektion des letztendlichen rekombinanten Vaccinia-Virus erleichtert wird (siehe z. B. Fuerst et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 5: 1918–1924).
Wie oben beschrieben enthält der Plasmid-Insertionsvektor wenigstens ein Set von Sequenzen, die für die Polymerase codieren und die funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft sind und von Sequenzen flankiert werden, die vorzugsweise für die Replikation des Vaccinia-Virus nicht essenziell sind. Zu derartigen nicht-essenziellen Sequenzen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, das TK-Gen (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857–864), das HindIII-F-DNA-Fragment des Vaccinia-Virus (Paoletti et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 193–197), das Gen des Vaccinia-Wachstumsfaktors, das innerhalb der beiden terminalen Repeats gelegen ist (Buller et al., 1988, J. Virol. 62: 866–874), das N2- und M1-Gen (Tamin et al., 1988, Virology 165: 141–150), die M1-Untereinheit des Ribonucleotidreduktase-Gens im HindIII-I-DNA-Fragment von Vaccinia (Child et al., 1990, Virology 174: 625–629), das Vaccinia-Hämagglutinin (Shida et al., 1988, J. Virol. 62: 4474–4480), das Gen des Fusionsproteins von 14 kD von Vaccinia (Rodriguez et al., 1989, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 86: 1287–1291) etc. (siehe auch Buller und Palumbo, 1991, Microbiol. Rev. 55(1): 80–122). Die TK-Sequenzen werden für den Einsatz bevorzugt. Der Einsatz derartiger Sequenzen führt zur Erzeugung rekombinanter TK^–-Viren.
Die rekombinanten Vaccinia-Viren werden vorzugsweise über die Transfektion der rekombinanten Insertionsvektoren, die die Polymerasesequenzen enthalten, in Zellen, die zuvor mit dem Vaccinia-Virus infiziert wurden, produziert. Alternativ kann die Transfektion vor der Infektion mit dem Vaccinia-Virus erfolgen. Die homologe Rekombination erfolgt in den infizierten Zellen und führt zur Insertion des fremden Gens in das virale Genom, und zwar in dem Bereich, der den Bereichen entspricht, die den Insertionsvektor flankieren. Die infizierten Zellen können mittels einer Vielzahl von Verfahren gescreent werden, wie immunologischer Techniken, einer DNA-Plaque-Hybridisierung oder einer genetischen Selektion auf rekombinante Viren, die anschließend isoliert werden können. Diese Vaccinia-Rekombinanten behalten vorzugsweise ihren essenziellen Funktionen und ihre Infektivität bei und können so konstruiert werden, dass sie ungefähr 35 Kilobasen an fremder DNA aufnehmen können.
Die Transfektionen können mittels Verfahren durchgeführt werden, die in diesem Gebiet bekannt sind, zum Beispiel mittels eines Calciumchlorid-vermittelten Verfahrens (Mackett et al., 1985, The construction and characterization of vaccinia vrus recombinants expressing foreign genes, in DNA Cloning, Bd. II, Rickwood und Hames (Hrsg.), IRL Press, Oxford-Washington D.C.) oder eines Liposomen-vermittelten Verfahrens (Rose et al., 1991, Biotechniques 10: 520–525).
Wenn, wie es bevorzugt wird, flankierende TK-Sequenzen zur Förderung der homologen Rekombination eingesetzt werden, haben die resultierenden rekombinanten Viren somit einen zerstörten TK-Bereich, was es ihnen ermöglicht, in einer TK^–-Wirtszelle wie Rat2 (ATCC-Zugangs-Nr.. CRL 1764) in Gegenwart von 5-Brom-2'-desoxyuridin (BUDR) zu wachsen, während nicht-rekombinante (TK⁺)-Viren unter diesen Bedingungen nicht wachsen.
Bei einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen rekombinanten Vaccinia-Viren über ein eine In-vitro-Klonierung und eine anschließende Verpackung mit einem Poxvirus, das gegenüber einem Selektionsverfahren empfindlich ist, erzeugt werden, und nicht über eine homologe Rekombination (siehe International Publication Nr. WO 94/12617 vom 9. Juni 1994). Zum Beispiel können die HBV-DNA-Sequenzen mittels gentechnologischer Standardverfahren in vitro in genomische Vaccinia-DNA eingefügt werden. Diese rekombinante DNA kann dann in Gegenwart eines „Helfer"-Poxvirus, wie einer temperaturempfindlichen Vaccinia-Virus-Mutante oder eines Geflügelpocken-Virus, gegen das unter geeigneten Bedingungen selektiert werden kann, verpackt werden.
Verschiedene in diesem Gebiet bekannte Vaccinia-Virus-Stämme können zur Erzeugung der erfindungsgemäßen rekombinanten Viren eingesetzt werden. Ein bevorzugtes Vaccinia-Virus ist der Stamm der New York City Department of Health Laborstories, der von Wyeth präpariert wurde (erhältlich bei der American Type Culture Collection (ATCC), Zugangs-Nr. VR-325). Zu weiteren Vaccinia-Stämme gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die Elstree- und Moskau-Stämme, der Stamm von Rivers (CV-1 und CV-2) und der LC16m8-Stamm von Hashizume.
Die Selektion des rekombinanten Vaccinia-Virus kann mittels eines beliebigen der in diesem Gebiet bekannten Verfahren erfolgen, einschließlich von Hybridisierungstechniken (z. B. unter Verwendung von DNA-Sequenzen der Polymerase als Hybridisierungssonde), immunologischer Techniken (z. B. eines Tests auf die Bindung von Antikörpern, die das codierte Polymerase-Epitop oder die codierten Polymerase-Epitope erkennen etc. Bei einem bevorzugten Aspekt, bei dem die flankierenden TK-Sequenzen im Insertionsvektor verwendet werden, erfolgt die Selektion wie oben beschrieben auf TK^–-Rekombinanten; das Screenen auf die korrekten Rekombinanten kann dann auch mittels molekularen Standardanalyseverfahren durchgeführt werden. Bei vielen bevorzugten Aspekten wird das Selektionsverfahren der Wahl durch den selektierbaren Marker in einem Insertionsvektor, der zur Generierung der rekombinanten Viren verwendet wurde, vorgegeben.
Das selektierte rekombinante Vaccinia-Virus wird dann im Allgemeinen Plaque-gereinigt und vorzugsweise Standardverfahren der Nucleinsäure- und Proteinanalyse unterzogen, um seine Identität und Reinheit und eine Expression der insertierten Polymerase zu verifizieren.
5.5. KULTIVIERUNG UND REINIGUNG REKOMBINANTER REPLIZIERBARER VESICULOVIREN IM GROSSEN MASSSTAB
Die gewonnenen rekombinanten Vesiculoviren können nach einer Plaque-Reinigung dann stark vermehrt werden, zum Beispiel wie folgt. Die Viren aus einem einzelnen Plaque (~10⁶ PBE) werden gewonnen und zur Infizierung von ~10^–7 Zellen (z. B. BHK-Zellen) eingesetzt, wodurch im typischen Fall 10 ml mit einem Titer von 10⁹–10¹⁰ PBE/ml mit insgesamt ungefähr 10¹¹ PBE erhalten werden. Es kann dann die Infektion von ~10¹² Zellen durchgeführt werden (mit einer Multiplizität der Infektion von 0,1), und man kann die Zellen in Suspensionskultur in großen Kulturschalen oder in Rollflaschen mittels Standardverfahren wachsen lassen.
Es wird angemerkt, dass rekombinante Vesiculoviren, die den extrazellulären Bereich des G-Proteins des Vesiculovirus (die den Wirtsbereich bestimmen) nicht mehr exprimieren und stattdessen ein Hüll-Glycoprotein eines anderen Virus exprimieren, in Zellen gezüchtet werden müssen, die von dem anderen Virus infiziert werden können (und die somit einen Rezeptor exprimieren, der die Infektion durch ein Virus fördert, das das Hüll-Glycoprotein des anderen Virus exprimiert). So wird zum Beispiel, wenn das rekombinante Vesiculovirus das Hüll-Glycoprotein des HIV exprimiert, das Virus in CD4⁺-Zellen gezüchtet (z. B. lymphoiden CD4⁺-Zellen).
Das Virus kann dann für die Herstellung von Impfstoffen aus den Kulturüberständen gesammelt werden, und die Überstände können zur Entfernung von Zelltrümmern geklärt werden. Wenn es gewünscht ist, besteht ein Verfahren zur Isolierung und Konzentrierung des Virus, das eingesetzt werden kann, daraus, dass der Überstand mit Hilfe einer Tangentialflussmembran konzentriert wird. Das Volumen des Produkts kann durch das Zentrifugieren durch eine Glycerolschicht und durch die Konzentrierung mittels eines Saccharose-Stufengradienten weiter reduziert werden. Ein alternatives Verfahren zur Konzentrierung besteht aus einer Reinigung über eine Affinitätssäule (Daniel et al., 1988, Int. J. Cancer 41: 601–608). Allerdings können auch anderen Reinigungsverfahren eingesetzt werden (siehe z. B. Arthur et al., 1986, J. Cell. Biochem. Suppl. 10A: 226), und beliebige mögliche Modifikationen der obigen Prozedur dürften Fachleuten auf diesem Gebiet offensichtlich sein. Die Reinigung sollte so sanft wie möglich erfolgen, damit die Integrität des Viruspartikels erhalten bleibt.
5.6. REKOMBINANTE REPLIZIERBARE VESICULOVIREN FÜR DIE VERWENDUNG ALS LEBENDIMPFSTOFFE
Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden die rekombinanten replizierbaren Vesiculoviren, die ein immunogenes Antigen exprimieren, als Lebendimpfstoffe eingesetzt.
Die rekombinanten Vesiculoviren für die Verwendung als therapeutische oder prophylaktische Lebendimpfstoffe gemäß der Erfindung sind vorzugsweise etwas abgeschwächt. Die meisten verfügbaren Stämme, z. B. die Laborstämme des VSV, könnten für die Verwendung genügend abgeschwächt sein. Sollte eine zusätzliche Abschwächung erwünscht sein, zum Beispiel auf der Basis einer Pathogenitätstestung an Tieren, wird die Abschwächung am bevorzugtesten einfach dadurch erreicht, dass das rekombinante Vesiculovirus im Labor passagiert wird (z. B. in BHK-Zellen oder einer beliebigen anderen geeigneten Zelllinie). Generell können abgeschwächte Viren mittels zahlreicher Verfahren erhalten werden, die in diesem Gebiet bekannt sind und zu denen, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, eine chemische Mutagenese, eine genetische Insertion, Deletion (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, N. Y.) oder eine Rekombination mittels gentechnologischer Verfahren (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, N. Y.) sowie eine Selektion natürlicher Mutanten im Labor etc. gehören.
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Impfstoff formuliert, bei dem das Immunogen aus einem oder mehreren rekombinanten Vesiculovirus bzw. Vesiculoviren besteht, bei dem bzw. denen die fremde RNA im Genom die Produktion eines Antigens in einem Wirt steuert, so dass eine Immunreaktion (humoral und/oder zellvermittelt) im Wirt bewirkt wird, die prophylaktisch oder therapeutisch ist. Bei einer Ausführungsform, bei der das Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Antigens eines Pathogens aufweist, erfolgt die Verabreichung des Impfstoffes zur Verhinderung oder Behandlung einer Infektion mit dem Pathogen und/oder der resultierenden Infektionskrankheit und/oder anderer unerwünschter Wirkungen der Infektion. Bei einer Ausführungsform, bei der das Antigen ein Tumor-Antigen ist, erfolgt die Verabreichung des Impfstoffes zur Prävention oder Behandlung von Tumoren (insbesondere von Krebs).
Bei einer bevorzugten spezifischen Ausführungsform werden die rekombinanten Vesiculoviren prophylaktisch verabreicht, um eine Infektion und/oder Infektionskrankheit oder eine Tumorbildung (z. B. Krebs) zu verhindern oder vor ihnen zu schützen.
Bei einer spezifischen, auf Therapeutika abzielenden Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculoviren, die für ein immunogenes Epitop oder immunogene Epitope codieren, für die Behandlung einer Infektion oder einer Tumorbildung therapeutisch verabreicht. Die Verabreichung solcher Viren, zum Beispiel an Neugeborene oder andere menschliche Patienten, kann als ein Verfahren zur Immunstimulation, zum Boostern des Immunsystems des Wirts, zur Verstärkung der zellvermittelten und/oder humoralen Immunität und zur Verbesserung der Clearance infektiöser Agenzien oder von Tumoren eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Viren können allein oder in Kombination mit anderen Therapien verabreicht werden (wobei Beispiele für antivirale Therapien, die nicht als Einschränkung verstanden werden sollen, Behandlungen mit α-Interferon und Vidarabinphosphat sind und Beispiele für eine Tumortherapie, die nicht als Einschränkung verstanden werden sollen, eine Bestrahlung und eine Krebs-Chemotherapie sind).
5.7. INAKTIVIERTE REKOMBINANTE VESICULOVIREN FÜR DEN EINSATZ ALS IMPFSTOFFE
Bei einer spezifischen Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen rekombinanten replizierbaren Vesiculoviren vor der Verwendung als Impfstoff inaktiviert (d. h. abgetötet oder nicht-replizierbar gemacht), um einen Totimpfstoff bereitzustellen. Da die Hülle des Vesiculovirus hochimmunogen ist, kann bei einer Ausführungsform, bei der ein fremdes Protein oder mehrere fremde Proteine (z. B. ein Hüll-Glycoprotein eines anderen Virus als des Vesiculovirus) in die Hülle des Vesiculovirus inkorporiert ist bzw. sind, ein derartiges Virus sogar in abgetöteter Form eine Immunreaktion gegen das genannte fremde Protein oder die genannten fremden Proteine in einem Wirt bewirken, dem es verabreicht wird. Bei einer spezifischen Ausführungsform sind mehrere Antigene, die alle die Immunogenität oder Antigenität eines Hüll-Glycoproteins eines anderen Virus aufweisen, in den Partikeln des rekombinanten Vesiculovirus vorhanden.
Die erfindungsgemäßen inaktivierten rekombinanten Viren unterscheiden sich von defekten interferierenden Partikeln insofern, als das Virus vor der Inaktivierung replizierbar ist (d. h. es codiert für alle der Vesiculovirus-Proteine, die erforderlich sind, um ihm eine Replikation in einer infizierten Zelle zu ermöglichen). Somit kann es, da das Virus ursprünglich in einem replizierbaren Zustand vorliegt, leicht vermehrt und vor der Inaktivierung in großen Mengen gewonnen werden, so dass eine große Menge an abgetötetem Virus für eine Verwendung in Impfstoffen oder für die Reinigung des exprimierten Antigens für die Verwendung in einer Subunit-Vakzine bereitgestellt wird (siehe Abschnitt 5.8., unten).
Es gibt in diesem Gebiet verschiedene bekannte Verfahren, die zur Inaktivierung der erfindungsgemäßen rekombinanten replizierbaren Vesiculoviren für eine Verwendung als Totimpfstoffe eingesetzt werden können. Zu derartigen Verfahren gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die Inaktivierung mit Hilfe von Formalin, Betapropiolacton, einer Gamma-Bestrahlung und einer Behandlung mit Psoralen und ultraviolettem Licht.
Bei einer spezifischen Ausführungsform können rekombinante Vesiculoviren leicht durch das Resuspendieren gereinigter Virione in einer geeigneten Konzentration von Formaldehyd inaktiviert werden. Zwar kann 0,8 Formaldehyd ausreichend sein, aber eine Verifizierung der für ein bestimmtes Virus optimalen Formaldehydkonzentration kann leicht über eine Titration oder Verdünnungsreihen von Formaldehyd mit infektiösem Virus zur Bestimmung der Inaktivierungskurve des Formalins für dieses Virus erhalten werden. Diese Technik wurde detailliert von Salk und Gori, 1960, Ann. N. Y. Acad. Sci. 83: 609–637) beschrieben. Durch eine Extrapolation auf Null kann die Konzentration, für die erwartet wird, dass sie das letzte infektiöse Partikel inaktiviert, abgeschätzt werden. Durch den Einsatz einer erheblich höheren Konzentration, z. B. einer, die 4-fach über der abgeschätzten Konzentration liegt, kann eine vollständige Inaktivierung sichergestellt werden.
Auch wenn sich eine Inaktivierung mit Formalin allein als effektiv erwiesen hat, kann es erwünscht sein, und zwar aus Sicherheitsgründen und für regulatorische Zwecke, das Virus unter Einsatz eines oder mehrerer der zahlreichen anderen Verfahren, die man derzeit für die Virusinaktivierung kennt, zweimal oder öfter abzutöten. So stellt man sich vor, auch wenn es nicht essenziell ist, dass das in der letztendlichen Formulierung eingesetzte Virus nach der Behandlung mit Formalin häufig mit einem zweiten Mittel inaktiviert wird.
5.8. VERWENDUNG REKOMBINANTER REPLIZIERBARER VESICULOVIREN BEI DER HERSTELLUNG VON SUBUNIT-VAKZINEN
Da die erfindungsgemäßen rekombinanten Vesiculoviren vermehrt und in großer Menge gezüchtet werden können, wobei die rekombinanten Vesiculoviren ein Antigen exprimieren, stellt die Züchtung derartiger Vesiculoviren ein Verfahren zur Produktion und leichten Reinigung des exprimierten Antigens bereit, insbesondere wenn das Antigen in die Hülle des rekombinanten Vesiculovirus inkorporiert ist. Bei einer spezifischen Ausführungsform ist das Antigen das vollständige Hüll-Glycoprotein oder ein Teil davon eines anderen Virus, z. B. das gp160 des HIV, das als ein Protein, bei dem es sich nicht um ein Fusionsprotein handelt, exprimiert wird, oder das als eine Fusion mit der zytoplasmatischen Domäne eines G-Proteins eines Vesiculovirus exprimiert wird.
Die so erzeugten und gereinigten Antigene finden in Subunit-Vakzinen Anwendung. Die rekombinanten Vesiculoviren, die ein Antigen exprimieren, können auch für die rekombinante Produktion des Antigens in infizierten Zellen in vitro eingesetzt werden, so dass eine Quelle für das Antigen für den Einsatz in Immunoassays bereitgestellt wird, zum Beispiel für den Nachweis oder die Messung des Vorliegens von Antikörpern gegen das Antigen in einer Probe oder Körperflüssigkeit eines geimpften Subjekts, und somit für die Diagnose einer Infektion oder des Vorliegens eines Tumors und/oder zur Verfolgung der Immunreaktion des Subjekts nach der Impfung.
5.9. BESTIMMUNG DER WIRKSAMKEIT DES IMPFSTOFFES
Die Immunpotenz des einen Antigens oder der mehreren Antigene in der Formulierung des Impfstoffes mit dem lebenden oder dem inaktivierten Vesiculovirus oder in der Formulierung der Subunit-Vakzine kann durch das Verfolgen der Immunreaktion von Testtieren nach der Immunisierung mit dem rekombinanten Vesiculovirus bzw. den rekombinanten Vesiculoviren, die das Antigen bzw. die Antigene exprimieren, oder mit der das Antigen enthaltenden Subunit-Vakzine mittels eines beliebigen in diesem Gebiet bekannten Immunoassays bestimmt werden. Die Erzeugung einer humoralen (Antikörper-)Reaktion und/oder einer zellvermittelten Immunität kann als Hinweis auf eine Immunreaktion gewertet werden. Zu den Testtieren können Mäuse, Hamster, Hunde, Katzen, Affen, Kaninchen, Schimpansen etc. und schließlich auch menschliche Subjekte gehören.
Zu den Verfahren zur Einführung des Impfstoffes kann eine orale, intrazerebrale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane oder intranasale Verabreichung oder ein beliebiger anderer Standardweg einer Immunisierung gehören. Die Immunreaktion der Testsubjekte kann über verschiedene Ansätze analysiert werden, wie die Reaktivität des resultierenden Immunserums mit dem Antigen, wie sie mittels bekannter Verfahren, zum Beispiel eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Immunoblots, Radioimmunpräzipitationen etc. bestimmt wird, oder in dem Falle, in dem das Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Antigens eines Pathogens aufweist, über den Schutz der immunisierten Wirte vor einer Infektion mit dem Pathogen und/oder die Abschwächung von Symptomen als Folge einer Infektion mit dem Pathogen in immunisierten Wirten, oder in dem Falle, bei dem das Antigen die Antigenität oder Immunogenität eines Tumor-Antigens aufweist, über die Verhinderung einer Tumorbildung oder eine Verhinderung von Metastasen oder über eine Regression oder über eine Hemmung der Tumor-Progression in immunisierten Wirten.
Ein Beispiel für einen geeigneten Tierversuch mit einem Lebendimpfstoff ist die Testung der erfindungsgemäßen Impfstoffe in Kaninchen auf ihre Fähigkeit zur Auslösung einer Antikörperreaktion gegen die Antigene. Es können männliche, spezifisch pathogenfreie (SPF), junge, adulte weiße Neuseeland-Kaninchen verwendet werden. In der Testgruppe erhalten die Kaninchen jeweils ungefähr 5 × 10⁸ PBE (Plaque-bildende Einheiten) des Impfstoffes. Eine Kontrollgruppe der Kaninchen erhält eine Injektion eines nicht-rekombinanten Vesiculovirus oder eines rekombinanten Vesiculovirus, das nicht das gleiche Antigen exprimiert, in 1 mM Tris-HCl, pH 9,0.
Den Kaninchen können jede Woche oder alle zwei Wochen Blutproben abgenommen werden, und das Serum kann auf Antikörper gegen das Antigen bzw. gegen die Antigene analysiert werden. Das Vorliegen spezifischer Antikörper gegen das Antigen bzw. die Antigene kann zum Beispiel mittels eines ELISA bestimmt werden.
Tiere können auch zur Bestimmung der Impfstoffwirksamkeit eingesetzt werden (z. B. in Challenge-Experimenten). Zum Beispiel können bei einer spezifischen Ausführungsform bezüglich einer Lebendimpfstoff-Formulierung Affen jeweils intradermal ungefähr 5 × 10⁸ PBE des rekombinanten Vesiculovirus erhalten. Ein Kontrollaffe erhält (Kontrolle) intradermal nicht-rekombinantes Virus. Blut wird 12 Wochen lang wöchentlich abgenommen und das Serum wird bezüglich Antikörpern gegen das Antigen oder die Antigene analysiert.
5.10. IMPFSTOFFFORMULIERUNG UND -VERABREICHUNG
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können multivalent oder univalent sein. Multivalente Impfstoffe werden aus rekombinanten Viren hergestellt, die die Expression von mehr als einem Antigen bewirken, und zwar aus gleichen oder unterschiedlichen rekombinanten Viren.
Es können viele verschiedene Verfahren zur Einführung der erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen eingesetzt werden. Zu diesen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, der orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Weg und eine Verabreichung über eine Skarifizierung (das Kratzen durch die obersten Hautschichten, zum Beispiel mittels einer gegabelten Nadel).
Der Patient, dem der Impfstoff verabreicht wird, ist vorzugsweise ein Säugetier, am bevorzugtesten ein Mensch, aber es kann auch ein Tier sein, bei dem es sich nicht um einen Menschen handelt, einschließlich von, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, Kühen, Pferden, Schafen, Schweinen, Geflügel (z. B. Hühnern), Ziegen, Katzen, Hunden, Hamstern, Mäusen und Ratten. Bei der Verwendung eines Vesiculovirus-Lebendimpfstoffes kann der Patient ein beliebiges Tier sein, in dem das Vesiculovirus repliziert (zum Beispiel die oben aufgeführten Tiere).
Die erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen mit dem Virus umfassen eine wirksame immunisierende Menge eines rekombinanten Vesiculovirus oder mehrerer rekombinanter Vesiculoviren (lebend oder inaktiviert, je nach Lage der Dinge) sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff. Subunit-Vakzine umfassen eine wirksame immunisierende Menge eines Antigens oder mehrerer Antigene und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff. Pharmazeutisch annehmbare Träger sind in diesem Gebiet gut bekannt, und zu ihnen gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Saline, gepufferte Saline, Dextrose, Wasser, Glycerol, sterile isotonische wässrige Puffer und Kombinationen von diesen. Ein Beispiel für einen derartigen annehmbaren Träger ist ein physiologisch ausbalanciertes Kulturmedium, das ein oder mehrere Stabilisierungsmittel, wie stabilisierte hydrolysierte Proteine, Lactose etc. enthält. Der Träger ist vorzugsweise steril. Die Formulierung sollte für die gewählte Verabreichung geeignet sein.
Die Zusammensetzung kann, wenn es gewünscht ist, auch kleinere Mengen an Benetzungsmitteln oder Emulgatoren oder an pH-Puffern enthalten. Die Zusammensetzung kann eine flüssige Lösung, eine Suspension, eine Emulsion, eine Tablette, eine Pille, eine Kapsel, eine Formulierung für eine verzögerte Freisetzung oder ein Pulver sein. Zu oralen Formulierungen können Standardträger wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat etc. von pharmazeutischer Reinheit gehören.
Im Allgemeinen werden die Inhaltsstoffe entweder separat oder als Mischung in Form einer Einheitsdosis bereitgestellt, zum Beispiel in Form eines trockenen lyophilisierten Pulvers oder eines wasserfreien Konzentrats in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie einer Ampulle oder einem Sachet, die bzw. das die Menge des aktiven Agens angibt. Wenn die Zusammensetzung über eine Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Verdünnungsmittel bereitgestellt werden, so dass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung gemischt werden können.
Bei einer spezifischen Ausführungsform wird ein lyophilisiertes erfindungsgemäßes rekombinantes Vesiculovirus in einem ersten Behälter bereitgestellt. Ein zweiter Behälter umfasst ein Verdünnungsmittel, das aus einer wässrigen Lösung von 50% Glycerin, 0,25% Phenol und einem Antiseptikum (z. B. 0,005% Brillantgrün) besteht.
Die genaue Dosis des Virus oder der Subunit-Vakzine, die in der Formulierung eingesetzt wird, hängt auch vom Verabreichungsweg und von der Art des Patienten ab und sollte in Abhängigkeit von der Einschätzung durch den Arzt und vom jeweiligen Zustand des Patienten gemäß klinischer Standardtechniken gewählt werden. Eine wirksame immunisierende Menge ist diejenige Menge, die ausreicht, eine Immunreaktion gegen das Antigen im Wirt hervorzurufen, dem der rekombinante Vesiculovirus oder die Subunit-Vakzine verabreicht wird.
Bei einer spezifischen Ausführungsform liegt eine wirksame immunisierende Menge eines erfindungsgemäßen lebenden rekombinanten Vesiculovirus im Bereich zwischen 10³ und 10⁹ PBE/Dosis, bevorzugter 10⁶ und 10⁹ PBE/Dosis. Ein Boostern ist möglich, wird aber nicht bevorzugt. Wenn ein Boostern gewünscht ist, kann man gegebenenfalls mit dem Antigen in gereinigter Form boostern, statt ein erfindungsgemäßes rekombinantes Vesiculovirus einzusetzen.
Für Impfstoffe mit einem inaktivierten rekombinanten Vesiculovirus umfasst die Impfstoffformulierung eine wirksame immunisierende Menge des inaktivierten Virus, vorzugsweise in Kombination mit einem Immunstimulans und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. So, wie der Begriff „Immunstimulans" im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, soll er jede beliebige Verbindung oder Zusammenfassung einschließen, die die Fähigkeit zur Verstärkung der Aktivität des Immunsystems hat, unabhängig davon, ob es eine spezifische potenzierende Wirkung in Kombination mit einem spezifischen Antigen oder einfach eine unabhängige Wirkung auf die Aktivität eines Elements oder mehrerer Elemente der Immunreaktion ist. Einige der üblicherweise in Impfstoffzusammensetzungen eingesetzten immunstimulierenden Verbindungen sind die Adjuvanzien Alum oder Muramyldipeptid (MDP) und dessen Analoge. Verfahren zur Anwendung dieser Materialien sind in diesem Gebiet bekannt, und ein Fachmann auf diesem Gebiet kann ohne weiteres eine optimale Menge eines Stimulans für einen gegebenen Virusimpfstoff bestimmen. Es kann auch erwünscht sein, mehr als ein Immunstimulans in einer gegebenen Formulierung einzusetzen.
Die genaue Menge des in einer gegebenen Präparation eingesetzten inaktivierten Virus ist nicht kritisch, vorausgesetzt, dass die minimale Virusmenge, die zur Bewirkung einer Immunreaktion erforderlich ist, verabreicht wird. Man stellt sich einen Dosisbereich von lediglich ungefähr 10 μg bis zu einer Menge von 1 mg oder mehr vor. Beispielsweise können die einzelnen Dosierungen bei einer spezifischen Ausführungsform im Bereich von ungefähr 50 bis 650 μg pro Immunisierung liegen.
Der Einsatz gereinigter Antigene als Subunit-Vakzine kann mittels Standardverfahren erfolgen. Zum Beispiel sollte das gereinigte Protein oder sollten die gereinigten Proteine auf eine passende Konzentration eingestellt werden, mit einem beliebigen geeigneten Impfstoffadjuvans formuliert und für die Anwendung abgepackt werden. Zu geeigneten Adjuvanzien können, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, Mineralgele, z. B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl-Emulsionen, Alum und MDP gehören. Das Immunogen kann auch in Liposomen inkorporiert werden oder mit Polysacchariden und/oder anderen Polymeren für den Einsatz in einer Impfstoffformulierung konjugiert werden. In Fällen, bei denen das rekombinante Antigen ein Hapten ist, d. h. ein Molekül, das insofern antigenisch ist, als es selektiv mit zugehörigen Antikörpern reagieren kann, aber insofern nicht immunogen ist, als es keine Immunreaktion hervorrufen kann, kann das Hapten kovalent an einen Träger oder ein immunogenes Molekül gebunden werden. Zum Beispiel kann ein großes Protein wie Serumalbumin eine Immunogenität an das daran gekoppelte Hapten übertragen. Der Hapten-Träger-Komplex kann für eine Verwendung als Impfstoff formuliert werden.
Die wirksamen Dosen (immunisierenden Mengen) der erfindungsgemäßen Impfstoffe können auch aus Dosis-Wirkungs-Kurven extrapoliert werden, die aus Testsystemen mit Tiermodellen abgeleitet wurden.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder ein pharmazeutisches Kit bereit, das einen oder mehrere Behälter umfasst, der bzw. die eine oder mehrere der Inhaltsstoffe der erfindungsgemäßen Formulierungen umfasst bzw. umfassen. In einem solchen Behälter oder in solchen Behältern kann ein Beipackzettel in der Form vorhanden sein, die von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, die Verwendung und den Vertrieb von Pharmazeutika oder biologischen Produkte reguliert, wobei dieser Beipackzettel die Zulassung der Behörde bezüglich der Herstellung, der Verwendung oder des Vertriebs für eine Anwendung am Menschen wiedergibt.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Immunisierung eines Tieres oder zur Behandlung oder Prävention verschiedener Krankheiten oder Gesundheitsstörungen bei einem Tier bereit, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen immunisierenden Dosis eines erfindungsgemäßen Impfstoffes an das Tier umfasst.
5.11. EINSATZ VON ANTIKÖRPERN, DIE MITTELS DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN IMPFSTOFFE ERZEUGT WURDEN
Die gegen das Antigen durch Immunisierung mit den rekombinanten Viren erzeugten Antikörper haben auch potenzielle Anwendungen in diagnostischen Immunoassays, in der passiven Immuntherapie und der Erzeugung antiidiotypischer Antikörper.
Die erzeugten Antikörper können mittels Standardtechniken, die in diesem Gebiet bekannt sind (zum Beispiel einer Immunaffinitätschromatografie, Zentrifugation, Präzipitation etc.) isoliert und in diagnostischen Immunoassays eingesetzt werden. Die Antikörper können auch zur Verfolgung der Behandlung und/oder des Krankheitsverlaufes eingesetzt werden. Es kann jedes beliebige Immunoassay-System, das in diesem Gebiet bekannt ist, wie die oben aufgeführten, für diesen Zweck eingesetzt werden, zu denen, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die folgenden gehören: kompetitive und nicht-kompetitive Assay-Systeme unter Verwendung von Techniken wie Radioimmunoassays, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Aassays), „Sandwich"-Immunoassays, Präzipitinreaktionen, Geldiffusions-Präzipitinreaktionen, Immundiffusionsassays, Agglutinationsassays, Komplementfixierungsassays, immunradiometrische Assays, Fluoreszenz-Immunoassays, Protein-A-Immunoassays und Immunelektrophorese-Assays, um nur einige zu nennen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen können auch zur Erzeugung von Antikörpern für den Einsatz in der passiven Immuntherapie eingesetzt werden, bei der ein kurzfristiger Schutz eines Wirtes über die Verabreichung eines gegen einen heterologen Organismus gerichteten fertigen Antikörpers erzielt wird.
Die mit den erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen erzeugten Antikörper können auch für die Produktion antiidiotypischer Antikörper eingesetzt werden. Der antiidiotypische Antikörper kann dann wiederum zur Immunisierung eingesetzt werden, um eine Subpopulation von Antikörpern zu erzeugen, die das ursprüngliche Antigen des pathogenen Mikroorganismus binden (Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c: 373, Jerne et al., 1982, EMBO J. 1: 234).
6. REKOMBINANTE VESIKULÄRE STOMATITIS-VIREN MITTELS DNA
Wir bauten einen DNA-Klon zusammen, der die Sequenz von 11 161 Nucleotiden des prototypischen Rhabdovirus, des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV), so enthielt, dass sie von der Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase transkribiert werden konnte, wodurch eine vollständige Positivstrang-RNA erhalten wurde, die komplementär zum VSV-Genom war. Die Expression dieser RNA in Zellen, die auch das VSV-Nucleocapsid-Protein und die beiden Untereinheiten der VSV-Polymerase exprimierten, führte zur Produktion eines VSV mit den Wachstumseigenschaften des Wildtyp-VSV. Die Gewinnung des Virus aus der DNA wurde verifiziert über 1) das Vorhandensein zweier genetischer Tags, die neuartige Restriktionsstellen in DNA, die aus dem Genom gewonnen wurde, erzeugten, 2) die direkte Sequenzierung der genomischen RNA des gewonnenen Virus und 3) die Produktion einer VSV-Rekombinanten, bei der das Glycoprotein von einem zweiten Serotyp stammte. Die Fähigkeit zur Generierung von VSV aus DNA eröffnet zahlreiche Möglichkeiten für die genetische Analyse der VSV-Replikation. Außerdem kann man, da das VSV relativ leicht bis zu sehr hohen Titern und in großen Mengen kultiviert werden kann, gentechnisch rekombinante VSVs erzeugen, die neuartige Antigene aufweisen. Derartige modifizierte Viren können als Impfstoffe, die einen Schutz gegen andere Viren oder pathogene Mikroorganismen bewirken, oder zur Erzeugung einer generellen Immunität gegen ein durch sie codiertes fremdes Antigen eingesetzt werden.
6.1. MATERIALIEN UND METHODEN
Plasmidkonstruktion Das Plasmid pVSVFL(+), das die (antigenomische) VSV-RNA-Sequenz des positiven Stranges von 11 161 Nucleotiden exprimiert, wurde aus vier DNA-Fragmenten konstruiert, die in pBluescript SK⁺ (Stratagene) kloniert worden waren. Das Ausgangsplasmid für die Konstruktion, pVSVFL(–), exprimierte die vollständige genomische VSV-RNA (Indiana-Serotyp) negativer Polarität von einem T7-Promotor. Dieses Plasmid wurde in einem Klonierungsverfahren aus neun Schritten erzeugt, das das Verknüpfen der fünf ursprünglichen cDNA-Klone der VSV-mRNAs (Gallione et al., 1981, J. Virol. 39: 529–535, Rose und Gallione, 1981, J. Virol. 39: 519–528, Schubert et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7984–7988) mit Gen-Verknüpfungsfragmenten und terminalen Fragmenten beinhaltete. Diese Fragmente wurden durch eine reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) (Mullis und Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155: 335–350) aus genomischer VSV-RNA generiert (M. A. Whitt, R. Burdine, E. A. Stillman und J. K. Rose, Manuskript in Vorbereitung). Zur Erleichterung der genetischen Manipulation des VSV-Genoms und zur Bereitstellung genetischer Tags wurden vor der Konstruktion des vollständigen Genoms einmal vorkommende MluI- und NheI-Restriktionsstellen über eine Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese in die 5'- und 3'-nicht-codierenden flankierenden Bereiche des VSV-Glycoprotein-Gens eingeführt.
Beim ersten Schritt der Konstruktion von pVSVFL(+) setzten wir die Primer (5'CCGGCTCGAGTTGTAATACGACTCACTATAGGGACGAAGACAAACAAACCATTATTATC-3') (SEQ ID NO: 38) und (5'GAACTCTCCTCTAGATGAGAAC-3') (SEQ ID NO: 39) zur Amplifizierung (Mullis und Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155: 335–350) eines Fragments von pVSVFL(–) (Nr. 1, 4A) von 2124 Nucleotiden ein. Dieses Fragment entspricht dem 3'-Ende des VSV-Genoms. Der erste Primer führte eine XhoI-Stelle und einen T7-Promotor (unterstrichen) unmittelbar vor der zum 3'-Ende des VSV-Genoms komplementären Sequenz ein. Der zweite Primer deckte eine einmal vorkommende XbaI-Stelle im P-Gen des VSV ab. Das PCR-Produkt wurde mit XhoI und XbaI verdaut und in pBluescript SK⁺ (Stratagene), das mit XhoI und XbaI verdaut worden war, kloniert. Das resultierende Plasmid, das die Sequenz trug, die dem 3'-Ende des VSV-Genoms entsprach, dem ein T7-Promotor voranging, wurde pBSXX genannt. Man beachte, dass auch ein weiterer T7-Promotor stromaufwärts der XhoI-Stelle im Vektor vorhanden ist. Als Nächstes erzeugten wir die Sequenz, die dem 5'-Ende des VSV-Genoms und einem Teil des Ribozyms des Hepatitis-Delta-Virus (HDV) entsprach (Pattnaik et al., 1992, Cell 69: 1011–1120, Perrotta und Been, 1991, Nature 350: 434–436). Ein PCR-Produkt von 147 Nucleotiden (Nr. 3, 4A) wurde von pVSVFL(–) mit den Primern (5'AGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACGAAGACCACAAAACCA G-3') (SEQ ID NO: 40) und (5'ATGTTGAAGAGTGACCTACACG-3') (SEQ ID NO: 41) amplifiziert. Der erste Primer enthielt 39 Nucleotide der für das HDV-Ribozym codierenden Sequenz (unterstrichen), an die sich 19 Nucleotide anschlossen, die komplementär zum 3'-Ende der antigenomischen VSV-RNA waren. Der zweite Primer hybridisierte innerhalb des L-Gens (4A). Das PCR-Produkt wurde mit Afl II und RsrII verdaut, und das Afl II-RsrII-Fragment von 80 Nucleotiden wurde an ein RsrII-SacI-Fragment von 225 Nucleotiden (Nr. 4, 4A) ligiert, das von einem als pBS-GMG bezeichneten Plasmid stammte (Stillman et al., Manuskript eingereicht). Das Fragment 4 enthielt die T7-Terminator-Sequenz und den Rest der für das HDV-Ribozym codierenden Sequenz. Die ligierten Produkte wurden mit Afl II und SacI verdaut, und das Afl II-SacI-Produkt von 305 Nucleotiden wurde in die Afl II- und SacI-Stellen eines modifizierten pBSXX-Vektors kloniert, der die in die einmal vorkommende NotI-Stelle im Polylinker insertierte Afl II-Stelle enthielt. Dieses Plasmid, das das Afl II-SacI-Fragment enthielt, wurde pBXXAS genannt. Zur Vervollständigung der Konstruktion wurde ein von Bst 1107 I bis Afl II reichendes Fragment von 10 077 Nucleotiden (Nr. 2, 4A), das 90% der VSV-Sequenzen von pVSVFL(–) enthielt, in die einmal vorkommenden Bst 1107 I- und Afl II-Stellen von pBXXAS insertiert. Das fertige Plasmid wurde pVSVFL(+) genannt. Die in diesem Plasmid mittels PCR generierten Sequenzen (schraffierte Sequenzen, 4B) wurden analysiert, und die enthielten keine Fehler. Wir stellten auch ein Plasmid her, bei dem die Sequenz des Gens des VSV-Indiana-Serotyps (MluI-NheI) durch das G-Gen des New-Jersey-Serotyps des VSV ersetzt war (Gallione und Rose, 1983, J. Virol. 46: 162–169). Dieses Plasmid wird pVSVFL(+)_I/NJG genannt und hat nur einen einzigen T7-Promotor.
Transfektion und Gewinnung von rekombinantem VSV
Baby-Hamster-Kidney-Zellen (BHK-21, ATCC) wurden in DME (Dulbecco's modified Eagle's medium), das mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) supplementiert war, gezüchtet. Zellen in 10-cm-Schalen (~70% konfluent) wurden mit einer Multiplizität von 10 mit vTF7-3 infiziert (Fuerst et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122–8126). Nach 30 min wurden Plasmide, die für die antigenomische VSV-RNA und das N-, P- und L-Protein codierten, mittels eines Calciumphosphat-Transfektionskits gemäß den mitgelieferten Anweisungen (Stratagene) in die Zellen transfiziert. Die codierenden Bereiche für das N-, P- und L-Protein wurden jeweils in pBluescript SK(+) vom T7-Promotor exprimiert. Die Plasmidmengen lagen bei 10 μg pVSVFL(+), 5 μg pBS-N, 4 μg pBS-P und 2 μg pBS-L. Nach 24–48-stündiger Inkubation bei 37°C in 3% CO₂ wurden die Zellen von der Schale geschabt und zur Freisetzung des mit den Zellen assoziierten Virus drei Runden aus Einfrieren und Auftauen (–70°C, 37°C) unterzogen. Die Zelltrümmer wurden aus den Zelllysaten durch Zentrifugieren bei 1250 × g für 5 min abzentrifugiert. 5 ml dieses Lysats wurden zu ungefähr 10⁶ BHK-Zellen auf einer 10-cm-Platte in 10 ml DME + 5% FBS gegeben. Nach 48 h wurde das Medium durch Zentrifugieren bei 1250 × g für 10 min geklärt und zur Entfernung des größten Teils des Vaccinia-Virus durch einen Filter (0,2 μm Porengröße, Gelman Sciences) geleitet. Ein ml wurde dann direkt zu BHK-Zellen gegeben, die in einer 35-mm-Schale auf ein Deckglas ausgesät worden waren. Nach vier Stunden wurden die Zellen in 3% Paraformaldehyd fixiert und mit einem monoklonalen Antikörper I1 gegen das VSV-G₁-Protein (Lefrancois und Lyles, 1982, Virology 121: 168–174) oder 9B5 (Bricker et al., 1987, Virology 161: 533–540) gegen das VSV-G_NJ-Protein gefolgt von einem Rhodamin-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörper (Jackson Research) gefärbt. Die Zellen wurden dann mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Microphot-FX-Mikroskops von Nikon, das mit einem 40x-Planapochromat-Objektiv ausgerüstet war, untersucht. Wenn die VSV-Gewinnung erfolgreich war, zeigten 100% der Zellen die typische helle Färbung des G-Proteins, die charakteristisch für eine VSV-Infektion ist.
Präparation und Analyse der VSV-RNA und der VSV-Proteine
Rekombinantes VSV und Wildtyp-VSV, die aus einzelnen Plaques (10⁵ Plaque-bildende Einheiten) isoliert worden waren, wurden zur Infektion eines Monolagers von BHK-Zellen (~80% konfluent) auf einer 10-cm-Schale in 10 ml DME plus 5% FBS eingesetzt. Nach 24 h wurden die Zelltrümmer und die Kerne durch Zentrifugation bei 1250 × g für 5 min entfernt, und das Virus wurde bei 35 000 Upm in einen Beckman-SW41-Rotor aus dem Medium eine Stunde abzentrifugiert. Die Virus-Pellets wurden für die Proteinanalyse in 0,5 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, resuspendiert. Für die RNA-Isolierung wurde das Virus in 0,2 ml 0,5% SDS/0,2 M Natriumacetat, pH 8,0, resuspendiert, woran sich eine Extraktion mit Phenol/CHCl₃ anschloss. Die RNA wurde mit 95% Ethanol und 5 μg Träger-tRNA ausgefällt. Die RNA wurde durch Zentrifugieren bei 12 000 × g 15 min sedimentiert und in Wasser mit einer Einheit RNasin (Promega) resuspendiert. Für die Analyse der RNA mittels RT-PCR wurden Primerpaare, die entweder die neue NheI- oder MluI-Stelle flankierten, verwendet. Die Erststrang-DNA-Synthesereaktion wurde in 50 μl PCR-Puffer (Promega) durchgeführt, der 5 mM MgCl₂, 1 mM dNTPs, 1 Einheit RNAsin (Promega), 1 Einheit reverse Transkriptase des Vogel-Myeloblastosis-Virus (AMV RT, Promega) 0,75 μM Primer und ungefähr 0,25 μg genomischer VSV-RNA enthielt. Die Inkubation erfolgte bei 45°C für 15 min, woran sich 5 min bei 99°C und 5 min bei 5°C anschlossen. Die PCR wurde durch Zugabe von 0,5 U Taq-Polymerase, das Einstellen der MgCl₂-Konzentration auf 1,25 mM und die Zugabe des zweiten Primers (0,75 μM) durchgeführt. Die Reaktion wurde 20 thermischen Zyklen unterzogen: 95°C für 1 min, 60°C für 1,5 min. Der Reaktionsansatz wurde dann 7 min bei 60°C inkubiert.
Die direkte Sequenzierung der genomischen VSV-RNA erfolgte gemäß einem früher beschriebenen Protokoll, das auf dem Didesoxykettenabbruchverfahren (Mierendorf und Pfeffer, 1987, Methods in Enzymology 152: 563–566) beruhte, außer dass [α-³³P]dATP (Amersham, Inc.) verwendet wurde. Jeder Reaktionsansatz enthielt ungefähr 0,25 μg der genomischen VSV-RNA.
6.2. ERGEBNISSE
Zur Konstruktion eines cDNA-Klons, der für das gesamte VSV-Genom von 11 161 Nucleotiden codierte, wurden zunächst einzelne cDNA-Klone der VSV-mRNAs mit Hilfe kleiner DNA-Fragmente, die mittels RT-PCR erzeugt worden waren und die vier Genverbindungen abdeckten, verknüpft. Die korrekten genomischen terminalen Sequenzen wurden auch mittels RT-PCR des VSV-Genoms erzeugt, und sie wurden über Restriktionsstellen an die anderen DNAs geknüpft. Dieser initiale Klon wurde mit einem T7-Promotor konstruiert, der die Synthese des vollständigen negativen Stranges der VSV-RNA steuerte. Trotz zahlreicher Versuche waren wir nicht imstande, VSV aus Zellen zu gewinnen, die die genomische VSV-RNA und das N-, P- und L-Protein des VSV exprimierten. Das konstruierte VSV wurde deshalb umkonstruiert, so dass die antigenomische VSV-DNA exprimiert wurde. Die Strategie der Konstruktion wird in „Materialien und Methoden" und in den 4A–B beschrieben. Die gesamte VSV-Sequenz sowie ein T7-Promotor, ein Terminator und die HDV-Ribozymsequenz wurden in pBluescript SK+ zwischen die XhoI- und SacI-Stelle kloniert (4B, 1). Ein weiterer T7-Promotor ist ebenfalls stromaufwärts der XhoI-Stelle im Plasmid vorhanden. Eine etwas andere Klonierungsstrategie wurde zur Erzeugung von Plasmiden eingesetzt, denen der stromaufwärts liegende T7-Promotor fehlt, und aus diesen Konstrukten wurde ebenfalls VSV gewonnen.
Gewinnung von VSV aus DNA Um zu bestimmen, ob wir VSV aus Plasmid-DNA erhalten konnten, infizierten wir Zellen mit Vaccinia-vTF7-3 (Fuerst et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122–8126), um zytoplasmatisch die T7-RNA-Polymerase bereitzustellen. Diese Zellen wurden dann mit pVSVFL(+) transfiziert, das die antigenomische VSV-RNA von einem T7-Promotor exprimiert, sowie drei anderen Plasmiden, die das N-, P- und L-Protein des VSV exprimieren. Die Expression des N-Proteins war erforderlich, um die naszierende antigenomische VSV-RNA zu Nucleocapsiden zusammenzubauen. Nach der Bildung sollten diese Nucleocapside als Matrizen für die Synthese der Minus-Strang-RNA durch den L/P-Polymerase-Komplex dienen. Die Minus-Strang-RNA im Kapsid sollte dann eine Matrize für die Transkription sein und den Infektionszyklus des VSV initiieren.
Das erste Experiment zur Gewinnung setzte zwei 10-cm-Platten mit BHK-Zellen (jeweils 5 × 10⁶ Zellen) ein. 24 Stunden nach der Infektion mit vTF7-3 und der Transfektion mit den vier Plasmiden wurden die Zellen und das Medium eingefroren und aufgetaut, um die möglicherweise mit den Zellen assoziierten VSV freizusetzen, und die geklärten Lysate wurden zu frischen BHK-Zellen gegeben. Nach 48 Stunden zeigten beide Platten starke zytopathische Effekte, die entweder auf dem Vaccinia-Virus oder auf dem gewonnenen VSV beruhen konnten. Ein ml eines jeden Überstandes wurde dann zu kleinen Platten mit BHK-Zellen auf Deckgläsern gegeben. Nach zwei Stunden zeigte eines dieser Deckgläschen abgerundete Zellen, die charakteristisch für eine VSV-Infektion waren, während das andere das nicht tat. Nach 4 Stunden wurden die Zellen auf beiden Deckgläschen fixiert, mit geeigneten Antikörpern gefärbt und mittels indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie zum Nachweis des VSV-G-Proteins untersucht. Alle Zellen auf dem Deckgläschen mit den abgerundeten Zellen zeigten eine intensive Fluoreszenz, die charakteristisch für die Expression des G-Proteins während der VSV-Infektion ist (Daten nicht gezeigt). Die nachfolgende Passagierung und die unten beschriebene Analyse zeigten, dass VSV aus der Transfektion erhalten worden waren. Das andere Deckgläschen zeigte keine Expression von G, und nach der Passagierung konnten keine VSV gewonnen werden.
Basierend auf der Häufigkeit, mit der das Tollwut-Virus (Schnell et al. 1994, EMBO J. 13: 4195–4203) und VSV-Minigenome (Stillman et al., Manuskript eingereicht) erhalten wurden, sagten wir voraus, dass die Gewinnung des kompletten VSV, wenn es erhalten werden konnte, ein seltenes Ereignis sein würde. Die anfängliche Gewinnung von VSV aus lediglich einer der beiden Transfektionen legte die Möglichkeit nahe, dass der anfängliche Titer im positiven Lysat sehr niedrig war. Zur Untersuchung dieses Titers infizierten wir BHK-Zellen auf Deckgläschen mit einem Zehntel des Lysats (1 ml), das aus den beiden anfänglichen Transfektionen erhalten worden war. Nach acht Stunden wurden die Zellen mittels indirekter Immunfluoreszenz bezüglich der Expression des G-Proteins untersucht. Ein Scan des gesamten Deckgläschens zeigte keine VSV-Infektion für das negative Lysat und nur fünf kleine Bereiche einer Infektion (jeweils 2–6 Zellen) für das Lysat, das bei der nachfolgenden Passagierung zur Entstehung einer VSV-G-Expression führte. Der anfängliche Titer war demnach, wie wir vermutet hatten, sehr niedrig und repräsentierte vermutlich insgesamt 50 infektiöse Partikel, die wahrscheinlich von einer VSV-Infektion stammten, die in lediglich einer Zelle unter den 2 × 10⁷ transfizierten initiiert worden war. Diese niedrige Häufigkeit der Gewinnung von infektiösen VSV ist für die in verschiedenen Experimenten beobachtete Häufigkeit typisch.
Analyse der viralen Proteine
Die nachfolgenden Passagen und Plaque-Analysen für VSV, die in drei unabhängigen Experimenten gewonnen worden waren, zeigten Plaques, die in weniger als 16 Stunden nachweisbar waren, sowie Titer von bis zu 2 × 10⁹ PBE/ml, die charakteristisch für VSV waren. Zur weiteren Verifizierung, dass VSV gewonnen worden waren, wurden die in Viren, die aus dem Medium abzentrifugiert worden waren, gefundenen Proteine mittels einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) untersucht. Die 5 zeigt das mit Coomassie gefärbte Gel der VSV-Proteine, die aus VSV aus rekombinanter DNA (rVSV) und aus Wildtyp-VSV gewonnen worden waren. Die Beweglichkeiten und relativen Mengen der fünf viralen Proteine konnten im Wildtyp und im rekombinanten Virus nicht unterschieden werden.
Identifizierung von Sequenz-Tags
In pVSVFL(+) wurde die Nucleotidsequenz des VSV durch eine Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese zur Generierung einmal vorkommender MluI- und NheI-Restriktionsstellen in den 5'-ständigen und 3'-ständigen nicht-codierenden Bereichen des Glycoprotein-Gens verändert. Zur Verifizierung, dass diese Stellen im gewonnenen Virus vorhanden waren, führten wir eine reverse Transkription genomischer RNA durch, die aus Wildtyp-Vironen oder rekombinanten Vironen gereinigt worden war, wobei Primer stromaufwärts einer jeden Restriktionsstelle eingesetzt wurden. Die Produkte der reversen Transkription wurden dann mittels PCR unter Verwendung eines zusätzlichen Primers stromabwärts einer jeden Restriktionsstelle amplifiziert. Die Anwesenheit des genetischen Tags im rekombinanten Virus wurde über einen Verdau der PCR-Produkte mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verifiziert. Mittels dieses Verfahrens wurde das Vorliegen sowohl der MluI- als auch der NheI-Sequenz in der gewonnenen Virus-RNA verifiziert, und die Ergebnisse für die NheI-Stelle sind in der 6 gezeigt. Die Sequenzen des Wildtyp-VSV und des rekombinanten VSV wurden parallel amplifiziert, und in beiden Fällen wurde ein Fragment von 620 Nucleotiden erhalten (Spuren 3 und 5). Kein Produkt wurde erhalten, wenn die reverse Transkriptase aus den Reaktionsansätzen vor der PCR weggelassen wurde (Spuren 1 und 2), was anzeigte, dass das PCR-Produkt von der RNA stammte und nicht von kontaminierender DNA. Nach dem Verdau mit NheI wurden die erwarteten Fragmente von 273 und 347 Rasenpaaren aus der rekombinanten VSV-RNA erhalten, während die DNA, die von der Wildtyp-RNA abstammte, unverdaut blieb (Spuren 4 und 6).
Direkte Sequenzierung genomischer RNA mit Tags Das Vorliegen der neuen Restriktionsstellen in der mittels PCR erzeugten DNA lieferte einen starken Hinweis, dass VSV aus der DNA gewonnen worden waren. Um sicherzustellen, dass die Identifizierung der genetischen Tags mittels PCR nicht aus einer versehentlichen Kontamination mit Plasmid-DNA herrührte, führten wir eine direkte Sequenzanalyse der genomischen RNA mittels reverser Transkriptase und eines Primers, der stromaufwärts der NheI-Stelle hybridisierte, durch. Die Sequenz aus dem Autoradiogramm, das in der 7 gezeigt ist, stimmt exakt mit der veröffentlichten Sequenz der G-mRNA des VSV überein (Rose und Gallione, 1981, J. Virol. 39: 519–528), außer dass die vier Nucleotidveränderungen, die zur Generierung der NheI-Stelle (GCACAA nach GCTAGC) eingesetzt wurden, vorhanden sind. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass das Sequenz-Tag in der genomischen RNA vorliegt.
Rekombinantes VSV-Indiana-Virus, das das Glycoprotein des New-Jersey-Serotyps trägt Es gibt zwei Serotypen des VSV, die als Indiana und New Jersey bezeichnet werden. Die Glycoproteine dieser beiden Serotypen haben eine Sequenzübereinstimmung von ungefähr 50% (Gallione und Rose, 1983, J. Virol. 46: 162–169). In früheren Studien fanden wir, dass das Glycoprotein des New-Jersey-Serotyps eine Mutante des VSV-Serotyps komplementieren konnte, die ein defektes Glycoprotein erzeugt (Whitt et al., 1989, J. Virol. 63: 3569–3578). Es erschien deshalb wahrscheinlich, dass ein rekombinantes VSV, bei dem das Gen des Indiana-Glycoproteins (G_I) durch das Gen des New-Jersey-Glycoproteins (G_NJ) ersetzt war, trotz der ausgeprägten Sequenzunterschiede lebensfähig sein würde. Zur Erzeugung einer derartigen Rekombinante wurde die G_NJ-cDNA mittels PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die MluI- und NheI-Stellen innerhalb der 5'-ständigen und 3'-ständigen nicht-codierenden Bereiche an jedem Ende des Gens einführte. Die amplifizierte DNA wurde in pBluescript kloniert, und das G_NJ-Protein wurde in BHK-Zellen mit Hilfe des Vaccinia-T7-Systems exprimiert. Für das exprimierte Protein wurde gezeigt, dass es unterhalb pH 6,0 eine Membranfusionsaktivität hatte, was zeigte, dass es funktional war (Daten nicht gezeigt). Diese G_NJ-cDNA wurde dann nach der Entfernung der für G_I codierenden Sequenzen in die einmal vorkommenden MluI- und NheI-Stellen des vollständigen Konstrukts kloniert. Rekombinante VSV wurden im Wesentlichen wie oben beschrieben gewonnen, außer dass man die anfängliche Transfektion vor dem Schritt aus Einfrieren und Auftauen 48 Stunden ablaufen ließ. Nach der ersten Passage wurde die Expression des G_NJ-Proteins über eine indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung eines für G_NJ spezifischen monoklonalen Antikörpers verifiziert (Bricker et al., 1987, Virology 161: 533–540). Das Virus wurde dann Plaque-gereinigt und vermehrt. Zur Untersuchung der im rekombinanten Virus vorhandenen Proteine wurde das aus Zellen, die mit VSV_I, VSV_NJ und dem rekombinanten VSV_I/NJG infiziert worden waren, mittels SDS-PAGE gefolgt von einer Coomassie-Färbung analysiert. Das G-, N-, P- und M-Protein des VSV_I haben jeweils Beweglichkeiten, die sich von denen ihrer VSV_NJ-Gegenstücke unterscheiden (8, Spuren 1 und 3). Wie erwartet zeigt das rekombinante VSV_I/NJG den Mobilitätsunterschied lediglich beim G-Protein (Spur 2). Das Vorliegen der neuen NheI- und MluI-Stellen in der Rekombinante wurde ebenfalls verifiziert (Daten nicht gezeigt).
6.3. DISKUSSION
Die hier präsentierten Ergebnisse belegen, dass infektiöse VSV aus rekombinanter DNA erhalten werden können. Wir glauben, dass die Expression des positiven Stranges der antigenomischen RNA in Gegenwart des N-, P- und L-Proteins kritisch für unseren Erfolg war, da wir, wenn wir von einem äquivalenten Konstrukt ausgingen, das für die genomische RNA codierte, kein Virus gewinnen konnten.
Warum ist das anfängliche Ereignis der Generierung von VSV so selten, da es offenbar nur in einer von 10⁷ bis 10⁸ transfizierten Zellen vorkommt? Eine Möglichkeit ist, dass unser Klon einen Sequenzfehler enthält, der nur durch ein seltenes Mutationsereignis korrigiert wird. Wir glauben, dass das nicht der Fall ist, da der Klon vor seinem Zusammenbau vollständig sequenziert wurde und Abweichungen von den veröffentlichten Sequenzen korrigiert wurden und für die Proteine in Komplementierungsassays gezeigt wurde, dass sie funktional waren. Auch ist die Häufigkeit der Gewinnung tatsächlich höher, als aufgrund unserer Beobachtungen mit Minigenomen, die für ein oder zwei VSV-Proteine codieren, erwartet wurde (Stillman et al., Manuskript eingereicht). In diesen Fällen fanden wir, dass ein transkribierendes und replizierendes Minigenom (~2 kb RNA) aus ungefähr einer von 10² transfizierten Zellen, die die RNA mit dem N-, P- und L-Protein exprimierten, gewonnen wurde. Die Einfügung eines zweiten Cistrons (0,85 kb zusätzliche RNA), das für das M-Protein codierte, ließ die Häufigkeit der Gewinnung auf ungefähr eine in 10³ transfizierten Zellen sinken. Wenn es für jede zusätzliche zugefügte Kilobase RNA zu einer 10-fachen Abnahme der Gewinnungshäufigkeit kommt, kann man sich leicht eine sogar noch geringere Häufigkeit der Gewinnung für das Genom von 11 161 kb, als wir beobachteten, vorstellen. Zwar codieren diese Minigenome für RNAs negativer Polarität, aber der Vergleich der Gewinnungshäufigkeit mit der für die vollständige Länge plus Konstrukt ist wahrscheinlich berechtigt, da die Expression der N-, P- und L-mRNAs nicht zu mRNAs führt, die komplementär zum Minigenom sind.
Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Erzeugung infektiöser VSV ist zwar nicht bekannt, aber es erscheint wahrscheinlich, dass er auf der Ebene der Synthese und Verkapselung der großen antigenomischen RNA liegt, die vor der Replikation und der Transkription erfolgen müssen. Die vollständige Verkapselung mit dem N-Protein muss wahrscheinlich an der naszierenden RNA erfolgen, um sie vor einem Abbau zu schützen, und die Zellen, bei denen das erfolgt, müssen auch passende Mengen an L- und P-Protein für die Initiation der Replikation produzieren. Sobald das erfolgt ist, sollten jedoch die Transkription und die Translation des Genoms zusätzliches N-, P- und L-Protein sowie das G- und M-Protein, das für die Knospung infektiöser Viren erforderlich ist, erzeugen.
Die Gewinnung von VSV aus DNA erschließt zahlreiche Aspekte des Lebenszyklus des Virus für eine genetische Analyse. Die Untersuchungen der an der Transkription und Replikation beteiligten Signale waren bis jetzt auf die Analyse defekter RNAs beschränkt, die nicht für virale Proteine codieren (Pattnaik et al., 1992, Cell 69: 1011–1120, Wertz et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8587–8591). Diese und andere Signale können jetzt im Kontext einer VSV-Infektion untersucht werden, die in Abwesenheit einer Vaccinia-Virus-Infektion erfolgt. Das System, das wir beschrieben haben, liefert auch eine Möglichkeit zur Untersuchung der Rollen einzelner viraler Proteindomänen und -modifikationen beim Viruszusammenbau und bei der Replikation. Bisher waren diese Analysen auf In-vitro-Systeme beschränkt oder auf eine Analyse, die die Komplementierung natürlich vorkommender Mutanten einsetzt, bei der die Synthese des mutierten Proteins die Analyse verkomplizieren kann.
Vielleicht noch aufregender ist die Möglichkeit, VSV als Vektor für die Expression anderer Proteine einzusetzen. Das Experiment, in dem wir VSV-Indiana gewannen, das das Glycoprotein des New-Jersey-Serotyps trägt (8) veranschaulicht, dass lebensfähige Rekombinanten hergestellt werden können. Aus derzeit unklaren Gründen waren die Titer des rekombinanten Virus wenigstens 10-fach niedriger als diejenigen, die jeweils mit den beiden Eltern erhalten wurden. Der niedrigere Titer resultierte offenbar nicht aus einem Defekt im Viruszusammenbau, da die Mengen der Proteine in den Wildtyp-Virionen und den rekombinanten Virionen am Ende der Infektion vergleichbar waren (8). Unsere früheren Experimente zeigten, dass ein fremdes Glycoprotein, das das entsprechende Signal für den zytoplasmatischen Schwanz trug, in die VSV-Hülle inkorporiert werden konnte (Owens und Rose, 1993, J. Virol. 67: 360–365). Das legt nahe, das man möglicherweise rekombinante VSV, die neuartige Proteine in ihren Hüllen tragen, generieren kann. Nach deren geeigneter Abschwächung können sie als Impfstoffe gegen andere Viruserkrankungen verwendet werden.
Die verkürzten Genome defekter interferierender Partikel werden sehr gut repliziert und verpackt, und deshalb vermuten wir, dass bezüglich der maximalen Menge des Genoms, das verpackt werden kann, ebenfalls eine gewisse Flexibilität besteht. Vermutlich kann ein längeres Nucleocapsid als ein längeres, geschossförmiges Partikel verpackt werden. Aufgrund der modularen Natur des VSV-Genoms mit konservierten Sequenzen der Gene am Ende und am Beginn der Genverbindungen (Rose und Schubert, 1987, in The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Publishing Corp., N. Y., S. 129–166) sollte es relativ leicht sein, gentechnologisch zusätzliche Gene in VSV einzufügen.
7. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Das Plasmid pVSVFL(+) wurde am 2. Mai 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, im Rahmen des Budapest Treaty an the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures hinterlegt und erhielt die Zugangs-Nr. 97134.
Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Umfang nicht durch den hinterlegten Mikroorganismus oder die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen eingeschränkt sein. Tatsächlich dürften einem Fachmann auf diesem Gebiet aus der vorhergehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren zahlreiche Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen offensichtlich sein. Solche Modifikationen sind durch den Umfang der beigefügten Ansprüche definiert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinantes replizierbares Vesiculovirus, das Vesiculovirus N-, P- und L-Proteine sowie eine replizierbare Vesiculovirus Genom-Sense(–)RNA umfasst, wobei die genannte Genom-Sense(–)RNA modifiziert ist durch: (a) die Insertion einer fremden RNA-Sequenz in einen nichtessentiellen Abschnitt in der genannten replizierbaren Vesiculovirus Genom-Sense(–)RNA; oder (b) den Ersatz eines nichtessentiellen Abschnitts der genannten replizierbaren Vesiculovirus Genom-Sense (–)RNA durch eine fremde RNA-Sequenz, wobei eine RNA-Sequenz, die zu der genannten fremden RNA-Sequenz komplementär ist, für ein Peptid oder Protein codiert, das eine Immunreaktion gegen das genannte Peptid oder Protein auslöst, wenn es in einem geeigneten Wirt exprimiert wird, der mit dem genannten modifizierten rekombinanten replizierbaren Vesiculovirus infiziert ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 1, wobei das Peptid oder Protein in der Lage ist, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen ein Antigen eines pathogenen Mikroorganismus gebunden zu werden, oder eine Immunreaktion gegen dagegen auslöst.
Vesiculovirus nach Anspruch 1, wobei der pathogene Mikroorganismus ein Virus ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 2, wobei der pathogene Mikroorganismus ein Bakterium ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 2, wobei der pathogene Mikroorganismus ein Parasit ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 2, wobei der pathogene Mikroorganismus ein Human-Pathogen ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 2, wobei der pathogene Mikroorganismus ein Nichthuman-Pathogen ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 1, wobei das Peptid oder Protein in der Lage ist, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen ein tumorspezifisches oder tumorassoziiertes Antigen gebunden zu werden, oder eine Immunreaktion dagegen auslöst.
Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, das ein Virus der vesiculären Stomatitis ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 2, wobei das Peptid oder Protein in der Lage ist, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen ein Hüll-Glykoprotein eines Virus, das kein Vesiculovirus ist, gebunden zu werden, oder eine Immunreaktion dagegen auslöst.
Vesiculovirus nach Anspruch 10, wobei das Hüll-Glykoprotein ein Hüll-Glykoprotein eines Humanen Immundefizienz-Virus ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 10, wobei das Peptid oder Protein in die Vesiculovirus-Hülle inkorporiert ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 10, wobei das Peptid oder Protein als Fusionsprotein exprimiert wird, das die cytoplasmatische Domain eines Vesiculovirus G-Proteins umfasst.
Vesiculovirus nach Anspruch 10, wobei das endogene G-Protein des Vesiculovirus ebenfalls exprimiert wird.
Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei eine zweite RNA-Sequenz, die zu der genannten fremden RNA-Sequenz komplementär ist, für ein zweites Peptid oder Protein codiert, das in dem geeigneten Wirt exprimiert wird, wobei das erste Peptid oder Protein und das zweite Peptid oder Protein in der Lage sind, immunspezifisch durch Antikörper gegen unterschiedliche Antigene gebunden zu werden, oder eine Immunreaktion gegenüber unterschiedlichen Antigenen auszulösen.
Wirtszelle, die das rekombinante Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 16, die das modifizierte rekombinante replizierbare Vesiculovirus produziert, wobei die genannte Wirtszelle enthält (a) eine rekombinante Nucleinsäure, die unter Erzeugung eines RNA-Moleküls transkribiert werden kann, das eine Vesiculovirus-Antigenom(+)RNA umfasst, die den Vesiculoviruspromotor für die Replikation enthält, wobei eine fremde RNA-Sequenz in einen Abschnitt der RNA inseriert ist oder diesen ersetzt, der für die Replikation des Vesiculovirus nichtessentiell ist; (b) eine zweite rekombinante Nucleinsäure, die für ein Vesiculovirus N-Protein codiert; (c) eine dritte rekombinante Nucleinsäure, die für ein Vesiculovirus L-Protein codiert; und (d) eine vierte rekombinante Nucleinsäure, die für ein Vesiculovirus P-Protein codiert.
Wirtszelle nach Anspruch 16, die das modifizierte rekombinante replizierbare Vesiculovirus produziert, wobei die genannte Wirtszelle enthält: (a) einen ersten DNA-Plasmidvektor, der die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten umfasst: (i) einen Bakteriophagen-RNA-Polymerasepromotor; (ii) eine erste DNA-Sequenz, die in der Zelle unter Erzeugung eines RNA-Moleküls transkribiert wird, das umfasst (A) eine Vesiculovirus-Antigenom(+)RNA, wobei eine fremde RNA-Sequenz in einen Abschnitt der RNA inseriert ist oder diesen ersetzt, der für die Replikation des Vesiculovirus nichtessentiell ist, und (B) eine Ribozymsequenz unmittelbar stromab der genannten antigenomischen(+)RNA, die am 3'-Terminus der antigenomischen RNA spaltet; und (iii) ein Transkriptions-Terminationssignal für die RNA-Polymerase; (b) einen zweiten DNA-Plasmidvektor, der die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten umfasst: (i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerasepromotor; (ii) eine zweite DNA-Sequenz, die für ein N-Protein des Vesiculovirus codiert; und (iii) ein zweites Transkriptions-Terminationssignal für die RNA-Polymerase; (c) einen dritten DNA-Plasmidvektor, der die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten umfasst: (i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerasepromotor; (ii) eine dritte DNA-Sequenz, die für ein P-Protein des Vesiculovirus codiert; und (iii) ein drittes Transkriptions-Terminationssignal für die RNA-Polymerase; (d) einen vierten DNA-Plasmidvektor, der die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten umfasst: (i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerasepromotor, (ii) eine vierte DNA-Sequenz, die für ein L-Protein des Vesiculovirus codiert; und (iii) ein viertes Transkriptions-Terminationssignal für die RNA-Polymerase; und (e) ein rekombinantes Vacciniavirus, das eine Sequenz umfasst, die für die Bakteriophagen-RNA-Polymerase codiert; wobei in der genannten Zelle die erste DNA-Sequenz unter Erzeugung des genannten RNA-Moleküls transkribiert wird, die N-, P- und L-Proteine und die Bakteriophagen-RNA-Polymerase exprimiert werden, und das modifizierte rekombinante replizierbare Vesiculovirus erzeugt wird, das ein Genom aufweist, das das Komplement der genannten antigenomischen RNA, die die genannte fremde RNA-Sequenz umfasst, ist.
Impfstoff-Formulierung, die eine Menge des Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, die im Hinblick auf die Auslösung einer Immunreaktion gegen das Peptid oder Protein wirksam ist; sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 zur Verwendung als Arzneimittel.
Vesiculovirus nach Anspruch 20 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung oder Gesundheitsstörung bei einem Patienten.
Vesiculovirus nach Anspruch 21, wobei die Erkrankung oder Gesundheitsstörung eine Erkrankung oder Gesundheitsstörung ist, die von einem pathogenen Mikroorganismus ausgelöst wird.
Vesiculovirus nach Anspruch 21, wobei die Krankheit oder Gesundheitsstörung ein Tumor ist.
Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 23, wobei der Patient ein Mensch ist.
Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 23, wobei der Patient ein nichthumanes Tier ist.
Verwendung einer wirksamen immunisierenden Menge eines Vesiculovirus, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 beansprucht wird, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer Krankheit oder Gesundheitsstörung bei einem Patienten, die durch einen pathogenen Mikroorganismus ausgelöst wird.
Verwendung einer wirksamen immunisierenden Menge eines Vesiculovirus, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 beansprucht wird, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention eines Tumors in einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, wobei der Patient ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, wobei der Patient ein nichthumanes Tier ist.
Kit, der in einem Behälter eine Menge des Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 umfasst, die im Hinblick auf die Auslösung einer Immunreaktion gegen das Peptid oder Protein wirksam ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten replizierbaren Vesiculovirus, das das Kultivieren einer Zelle umfasst, die enthält (a) eine erste rekombinante Nucleinsäure, die unter Erzeugung eines RNA-Moleküls transkribiert werden kann, das aufweist (A) eine Vesiculovirus antigenomische(+)RNA und (B) eine Ribozymsequenz direkt stromab der genannten antigenomischen(+)RNA, die am 3'-Terminus der antigenomischen(+)RNA spaltet, wobei eine fremde RNA-Sequenz in einen Abschnitt der RNA inseriert ist oder diesen ersetzt, der für die Replikation des Vesiculovirus nichtessentiell ist, wobei die erste rekombinante Nucleinsäure die folgenden funktionsgerecht verknüpften Bestandteile aufweist: (i) einen ersten Promotor; (ii) eine erste DNA-Sequenz, die unter der Kontrolle des ersten Promotors in der Zelle transkribiert werden kann, um das genannte RNA-Molekül zu erzeugen; und (iii) ein erstes Transkriptions-Terminationssignal; (b) eine zweite rekombinante Nucleinsäure, die für ein Vesiculovirus N-Protein codiert und die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten aufweist: (i) einen zweiten Promotor, der die Expression des N-Proteins kontrolliert, (ii) ein erstes Translations-Initiationssignal; (iii) eine zweite DNA-Sequenz, die für das N-Protein codiert; und (iv) ein zweites Transkriptions-Terminationssignal; (c) eine dritte rekombinante Nucleinsäure, die für ein Vesiculovirus-L-Protein codiert und die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten aufweist: (i) einen dritten Promotor, der die Expression des L-Proteins kontrolliert; (ii) ein zweites Translations-Initiationssignal; (iii) eine dritte DNA-Sequenz, die für das L-Protein codiert; und (iv) ein drittes Transkriptions-Terminationssignal; (d) eine vierte rekombinante Nucleinsäure, die für ein Vesiculovirus P-Protein codiert und die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten aufweist: (i) einen vierten Promotor, der die Expression des P-Proteins kontrolliert; (ii) ein drittes Translations-Initiationssignal; (iii) eine vierte DNA-Sequenz, die für das P-Protein codiert; und (iv) ein viertes Transkriptions-Terminationssignal; wobei die erste rekombinante Nucleinsäure in der Zelle transkribiert wird, um das genannte RNA-Molekül zu erzeugen, und die N-, L- und P-Proteine in der Zelle exprimiert werden, und ein rekombinantes replizierbares Vesiculovirus erzeugt wird, das ein Genom aufweist, das das Komplement der genannten antigenomischen RNA, die die genannte fremde RNA-Sequenz aufweist, ist, wobei die genannte fremde RNA-Sequenz für ein Peptid oder Protein codiert, das exprimiert wird und eine Immunreaktion gegen das genannte Peptid oder Protein in einem geeigneten Wirt auslöst, der von dem Vesiculovirus infiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die erste rekombinante Nucleinsäure ein DNA-Plasmidvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 33, wobei die zweite rekombinante Nucleinsäure ein DNA-Plasmidvektor ist und wobei die dritte rekombinante Nucleinsäure ein DNA-Plasmidvektor ist und wobei die vierte rekombinante Nucleinsäure ein DNA-Plasmidvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die erste rekombinante Nucleinsäure, die zweite rekombinante Nucleinsäure, die dritte rekombinante Nucleinsäure und die vierte rekom binante Nucleinsäure jeweils außerdem einen selektierbaren Marker aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die zweite, dritte und vierte rekombinante Nucleinsäure Teile einer einzigen rekombinanten Nucleinsäure bilden, die nicht außerdem auch die genannte erste rekombinante Nucleinsäure enthält.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die erste, die zweite, die dritte und die vierte Promotorsequenz RNA-Polymerase-Promotorsequenzen für die gleiche RNA-Polymerase sind und wobei die Zelle auch eine cytoplasmatische Quelle für die genannte RNA-Polymerase enthält.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die cytoplasmatische Quelle für die genannte RNA-Polymerase ein rekombinantes Vacciniavirus ist, das die genannte RNA-Polymerase in der Zelle exprimiert.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten replizierbaren Vesiculovirus, das das Kultivieren einer Säugetierzelle umfasst, die enthält: (a) einen ersten DNA-Plasmidvektor, der die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten umfasst: (i) einen Bakteriophagen-RNA-Polymerasepromotor; (ii) eine erste DNA-Sequenz, die in der Zelle unter Erzeugung eines RNA-Moleküls transkribiert wird, das (A) eine Vesiculovirus antigenomische (+)RNA, in der eine fremde RNA-Sequenz in einen Abschnitt der RNA, der für die Replikation des Vesiculovirus nichtessentiell ist, inseriert wurde oder diese ersetzt, und (B) eine Ribozymsequenz unmittelbar stromab der genannten antigenomischen(+)RNA umfasst, die am 31 Terminus der antigenomischen RNA spaltet; und (iii) ein Transkriptions-Terminationssignal für die RNA-Polymerase; (b) einen zweiten DNA-Plasmidvektor, der die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten umfasst: (i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerasepromotor; (ii) eine zweite DNA-Sequenz, die für ein N-Protein des Vesiculovirus codiert; und (iii) ein zweites Transkriptions-Terminationssignal für die RNA-Polymerase; (c) einen dritten DNA-Plasmidvektor, der die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten umfasst: (i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerasepromotor; (ii) eine dritte DNA-Sequenz, die für ein P-Protein des Vesiculovirus codiert; und (iii) ein drittes Transkriptions-Terminationssignal für die RNA-Polymerase; (d) einen vierten DNA-Plasmidvektor, der die folgenden funktionsgerecht verknüpften Komponenten umfasst: (i) den Bakteriophagen-RNA-Polymerasepromotor, (ii) eine vierte DNA-Sequenz, die für ein L-Protein des Vesiculovirus codiert; und (iii) ein viertes Transkriptions-Terminationssignal für die RNA-Polymerase; und (e) ein rekombinantes Vacciniavirus, das eine Sequenz umfasst, die für die Bakteriophagen-RNA-Polymerase codiert; wobei in der genannten Zelle die erste DNA-Sequenz unter Erzeugung des genannten RNA-Moleküls transkribiert wird, die N-, P- und L-Proteine und die Bakteriophagen-RNA-Polymerase exprimiert werden, und das modifizierte rekombinante replizierbare Vesiculovirus erzeugt wird, das ein Genom aufweist, das das Komplement der genannten antigenomischen RNA, die die genannte fremde RNA-Sequenz umfasst, ist, wobei die genannte fremde RNA-Sequenz für ein Peptid oder Protein codiert, das exprimiert wird und eine Immunreaktion gegen das genannte Peptid oder Protein in einem geeigneten Wirt, der von dem Vesiculovirus infiziert ist, auslöst.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Ribozymsequenz die Sequenz des Hepatitis-delta-Virus-Ribozyms ist und die Bakteriophagen RNA-Polymerase die T7 RNA-Polymerase ist.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 39, wobei das Protein oder Peptid in der Lage ist, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen ein Antigen eines pathogenen Mikroorganismus gebunden zu werden oder eine Immunreaktion dagegen auslöst.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 39, wobei das Protein oder Peptid in der Lage ist, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen ein tumorspezifisches Antigen gebunden zu werden oder eine Immunreaktion dagegen auslöst.
Verfahren nach Anspruch 39, das außerdem vor Stufe (a) die Stufe der Einführung der genannten ersten, zweiten, dritten und vierten Plasmidvektoren sowie des genannten rekombinanten Vacciniavirus in die genannte Zelle umfasst.
Inaktiviertes rekombinantes Vesiculovirus, das das Produkt eines Verfahrens ist, das das Inaktivieren eines rekombinanten replizierbaren Vesiculovirus umfasst, wobei das rekombinante replizierbare Vesiculovirus Vesiculovirus N-, P- und L-Proteine sowie eine replizierbare Vesiculovirus Genom-Sense(–)RNA umfasst, wobei die genannte Genom-Sense(–)RNA modifiziert ist durch: (a) die Insertion einer fremden RNA-Sequenz in einen nichtessentiellen Abschnitt der genannten replizierbaren Vesiculovirus-Genom-Sense(–)RNA; oder (b) den Ersatz eines nichtessentiellen Abschnitts der genannten replizierbaren Vesiculovirus-Genom-Sense (–)RNA durch eine fremde RNA-Sequenz, wobei eine RNA-Sequenz, die zu der genannten fremden RNA-Sequenz komplementär ist, für ein Peptid oder Protein codiert, das eine Immunreaktion gegen das genannte Peptid oder Protein auslöst, wenn es in einem geeigneten Wirt exprimiert wird, der durch das genannte rekombinante replizierbare Vesiculovirus infiziert ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 44, wobei das Peptid oder Protein in der Lage ist, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen ein Antigen eines pathogenen Mikroorganismus gebunden zu werden oder eine Immunreaktion dagegen auslöst.
Vesiculovirus nach Anspruch 44, wobei das Peptid oder Protein in der Lage ist, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen ein tumorspezifisches oder tumorassoziiertes Antigen gebunden zu werden oder eine Immunreaktion dagegen auslöst.
Vesiculovirus nach Anspruch 44, wobei eine zweite RNA-Sequenz, die zu der genannten fremden RNA-Sequenz komplementär ist, für ein zweites Peptid oder Protein codiert, das in dem geeigneten Wirt exprimiert wird, wobei das erste Peptid oder Protein und das zweite Peptid oder Protein in der Lage sind, immunspezifisch durch Antikörper gegen unterschiedliche Antigene gebunden zu werden oder eine Immunreaktion gegen unterschiedliche Antigene auszulösen.
Vesiculovirus nach Anspruch 44, wobei das Peptid oder Protein in der Lage ist, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen ein Hüll-Glykoprotein eines Virus, das kein Vesiculovirus ist, gebunden zu werden oder eine Immunreaktion dagegen auslöst.
Vesiculovirus nach Anspruch 48, wobei das Hüll-Glykoprotein ein Hüll-Glykoprotein eines Humanen Immundefizienz-Virus ist.
Vesiculovirus nach Anspruch 48, wobei das Peptid oder Protein als ein Fusionsprotein exprimiert wird, das die cytoplasmatische Domain eines Vesiculovirus G-Proteins umfasst.
Immunogene Zusammensetzung, die eine Menge des Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 44 bis 50, die in der Lage ist, eine Immunreaktion gegen das Peptid oder Protein in einem Säugetier auszulösen, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Kit, der in einem Behälter eine Menge des Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 44 bis 50 enthält, die zur Auslösung einer Immunreaktion gegen das Peptid oder Protein in einem Säugetier wirksam ist.
Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 44 bis 50 zur Verwendung als Arzneimittel.
Vesiculovirus nach Anspruch 53 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung oder Gesundheitsstörung bei einem Patienten.
Vesiculovirus nach Anspruch 54, wobei die Erkrankung oder Gesundheitsstörung eine Erkrankung oder Gesund heitsstörung ist, die durch einen pathogenen Mikroorganismus ausgelöst wird.
Vesiculovirus nach Anspruch 54, wobei die Krankheit oder Gesundheitsstörung ein Tumor ist.
Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 54 bis 56, wobei der Patient ein Mensch ist.
Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 54 bis 56, wobei der Patient ein nichthumanes Tier ist.
Verwendung einer wirksamen immunisierenden Menge eines Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 44 bis 50 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung oder Gesundheitsstörung bei einem Patienten, die durch einen pathogenen Mikroorganismus ausgelöst wird.
Verwendung einer wirksamen immunisierenden Menge eines Vesiculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 44 bis 50 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention eines Tumors bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 59 oder 60, wobei der Patient ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 59 oder 60, wobei der Patient ein nichthumanes Tier ist.