KR101059721B1 - 면역원성 조성물 및 의약 - Google Patents

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Abstract

포유동물 피험체에서 항원-특이적 면역반응을 유도하는 방법은, 상기 항원을 암호화하는 DNA 서열을 포유동물 또는 척추동물 세포에서의 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 제1 조성물의 유효량을 피험체에게 투여함을 포함한다. 당해 방법은 상기 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포유동물 또는 척추동물 세포에서의 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)를 포함하는 제2 조성물의 유효량을 피험체에게 투여함을 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, rVSV는 복제 적격성이다. 면역화 및 질환의 치료학적 처리에 사용하기 위한 키트는 상기 성분들 및 본 방법의 실시에 관한 지침을 포함한다.
프라임/부스트 요법, 항원-특이적 면역반응, 재조합 수포성 구내염 바이러스

Description

면역원성 조성물 및 의약{Immunogenic composition and medicament}
본 발명은 부분적으로 미연방정부(미국립보건원, 등록 번호 NIH NO1-AI 05397 및 NIH NO1-AI 25458)의 기금에 의해 부분적으로 지원되었다. 따라서, 미연방정부는 본 발명에서 특정한 권리를 가질 수 있다.
발명의 배경
면역원성 조성물의 효능을 증진시키기 위해, 면역원성 조성물로서 단백질 조성물, 플라스미드-기본 조성물 및 재조합 바이러스 작제물을 사용한 다양한 면역원성 조성물 및 방법이 보고된 바 있다. 이전의 연구는, 플라스미드-기본 면역원성 조성물이 전신계적 적용시 단백질 또는 재조합 바이러스와 같은 통상적 항원으로 전신 면역계를 2차 전신 면역화로 초회자극시킴을 입증하였다[참조: Xiang et al., 1997 Springer Semin. Immunopathol., 19:257-268; Schneider, J. et al, 1998 Nature Med., 4:397; and Sedeguh, M. et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:7648; Rogers, W. O. et al, 2001 Infec. & Immun., 69(9):5565-72; Eo, S. K., et al, 2001 J. Immunol., 166(9):5473-9; Ramshaw I. A. and Ramsay, A. J., 2000 Immunol. Today, 21(4):163-5].
흔히 사용되는 DNA 프라임(prime)/살아있는 벡터 부스트(boost) 요법은 부스트용 백시니아 바이러스를 포함한다. 최근 문헌에서의 예로는 사람 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 상기 면역화[참조: Hanke T. et al, 2002 Vaccine. 20(15):1995-8; Amara R.R. et al, 2002 Vaccine. 20(15):1949-55; Wee E.G. et al, 2002 J. Gen. Virol., 83(Pt 1):75-80; Amara R.R. et al, 2001 Science. 292(5514):69-74]를 포함한다. 단순포진 바이러스-2 당단백질 D, 소아 리슈만편모층(Leishmania infantum) P36/LACK 항원, 열대열원충(Plasmodium falciparum) TRAP 항원, HIV/SIV 항원, 쥐 결핵 항원 및 인플루엔자 항원과 같은 항원을 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 벡터와 DNA를 사용한 프라임-부스트 면역화는 특이적 항체 및 사이토킨 반응을 유도하는 것으로 보고되었다[참조: Meseda C.A. et al., 2002 J. Infect. Dis., 186(8):1065-73; Amara R.R. et al, 2002 J. Virol., 76(15):7625-31; Gonzalo R.M. et al, 2002 Vaccine, 20(7-8):1226-31; Schneider J. et al, 2001 Vaccine, 19(32):4595-602; Hel Z. et al, 2001 J. Immunol.,167(12):7180-91; McShane H. et al, 2001 Infec. & Immun., 69(2):681-6 and Degano P. et al 1999 Vaccine, 18(7-8):623-32 influenza and malaria models].
플라스미드 프라임-아데노바이러스 부스트 유전학적 면역화 요법은 알파-태아단백질-특이적 종양 면역을 유도하고 전형적 돼지 열병(classical swine fever)으로부터 돼지를 보호하는 것으로 최근에 보고되었다[참조: Meng W. S. 2001 Cancer Res., 61(24):8782-6; Hammond, J. M. et al, 2001 Vet. Microbio., 80(2):101-19; 및 미국 특허 제6,210,663호].
다른 DNA 플라스미드 프라임-바이러스 부스트 요법도 보고되었다[참조: Matano T. et al, 2001 J. Virol., 75(23):11891-6 (DNA 프라임/센다이 바이러스 벡터 부스트]. HIV-1 치료를 위한 DNA 프라이밍과 재조합 폭스바이러스 부스팅이 보고되었다[참조: Kent, S. J. et al, 1998 J. Virol., 72:10180-8; Robinson, H. L. et al, 1999 Nat. Med., 5:526-34; and Tartaglia, J. et al, 1998 AIDS Res. Human Retrovirus., 14:S291-8].
수많은 DNA 프라임/바이러스 부스트 요법이 평가되고 있으나, 최근에 기술된 면역화 요법은 몇가지 단점을 갖고 있다. 예를 들어, 이러한 상기 주지된 요법 중 일부는 피험체에서 질환 증상을 유발하며; 다른 요법들은 생체내 재조합을 야기할 수 있다. 또 다른 바이러스는 제조하기가 어렵고/어렵거나 외래 유전자를 수용하는 능력이 제한되어 있다. 또 다른 바이러스는 사람에서의 현저한 기존의 벡터 면역에 의해 유발된 단점들과 다른 안전성 문제가 있다.
해당 항원에 대한 증진된 수준의 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응을 생성할 수 있으며 안전성 요건, 제조 용이성 및 부스터 면역화시 벡터에 대한 포유동물 숙주의 천연 면역반응을 극복하는 능력에 부합하는 신규하고 유용한 면역화 요법이 당해 분야에서 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 개별적으로 투여되는 경우에 DNA 플라스미드 성분 또는 재조합 바이러스 성분으로 수득되는 결과와 비교하여, 항원에 대한 세포성 면역반응의 놀라운 상승작용적 자극을 나타내는 프라임/부스트 요법을 통해서 포유동물 피험체에서 병원성 항원 또는 기타 항원에 대한 면역반응을 유도하기 위한 신규한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 포유동물 피험체에서 항원-특이적 면역반응을 유도하는 신규한 방법을 제공한다. 당해 방법은 항원을 발현하는 DNA 서열을 DNA 플라스미드에 의한 포유동물 세포에서의 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 제1 조성물의 유효량을 피험체에게 투여함을 포함한다. 당해 방법은 상기 항원을 암호화하는 핵산 서열을 재조합 수포성 구내염 바이러스(recombinant vesicular stomatitis virus; rVSV)에 의한 포유동물 세포에서의 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 rVSV를 포함하는 제2 조성물의 유효량을 피험체에게 투여함을 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 재조합 VSV는 약독화된, 복제 적격성(replication competent) 바이러스이다. 다른 양태에서, 재조합 VSV는 비-복제성 바이러스이다. 제1 및 제2 조성물의 투여는 어떠한 순서로도 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명은 조성물 중 하나를 수회 투여한 다음, 나머지 조성물을 수회 투여함을 의도한다. 하나의 양태에서, 바람직하게는 사이토킨이 공동 투여된다.
다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 피험체에서 항원에 대한 항원-특이적 면역반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다. 당해 면역원성 조성물은 항원을 암호화하는 DNA 서열을 DNA 플라스미드에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 제1 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 동일한 항원을 암호화하는 핵산 서열을 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 하나 이상의 복제 적격성 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 또한 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 피험체에서 증가된 수준의 항원-특이적 면역반응을 유도하는 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 당해 키트는 특히, 항원을 암호화하는 DNA 서열을 포유동물에서의 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 하나 이상의 제1 조성물; 상기 항원을 암호화하는 핵산 서열을 상기 포유동물에서의 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 복제 적격성 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)를 포함하는 하나 이상의 제2 조성물; 및 상기 언급한 방법의 실시에 관한 지침을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 면역원성 조성물에서 사용되는 항원에 대한 동물의 면역반응을 유도하기 위한 의약의 제조에서의 상기한 면역원성 조성물 또는 이의 성분의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 측면과 양태는 하기 상세한 설명에서 기술한다.
도 1A는 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV) gag p37 단백질을 암호화하는 예시적 플라스미드 DNA의 개략적 도식이다. 당해 도식은, 상기 플라스미드가 gag 단백질의 발현을 추진하는 사람 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터/인핸서, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위(BGH 폴리A), 복제 오리진 서열(ori) 및 카나마이신 내성 (kan R ) 마커 유전자를 함유함을 보여준다.
도 1B는 레수스 인터류킨 12의 두 서브유닛 p35 및 p40을 암호화하는 예시적 이시스트론성(bicistronic) 플라스미드 DNA의 개략적 도식이다. p35 서브유닛은 HCMV 프로모터의 제어하에 있으며 SV40 폴리 A 부위를 갖고 있다. p40 서브유닛은 원숭이 사이토메갈로바이러스(SCMV) 프로모터의 제어하에 있으며 BGH 폴리 A 부위를 갖고 있고, 역방향으로 전사된다. 당해 플라스미드는 ori 서열과 kan R 유전자를 또한 함유한다.
도 2는 본 발명의 프라임/부스트 요법으로 면역화된 동물로부터의 비분획화 말초혈 단핵구(PBMC)에서의 VSV N-특이적 감마 인터페론(IFN-ν) ELISpot 반응을 나타내는 막대 그래프이다. 가장 좌측의 검정색 막대는 SIV gag 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드와 인플루엔자 적혈구응집소(flu HA) 단백질을 암호화하는 VSV 벡터의 부스트에 의한 면역화 프로토콜을 나타낸다. 담회색 막대는 프라이밍 DNA gag 플라스미드 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV 부스트를 포함하는 본 발명의 프로토콜을 나타낸다. 흰색 막대는 공(empty) DNA 플라스미드 또는 대조 DNA 플라스미드(con DNA)에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜을 나타낸다. 가장 우측의 검정색 막대는 DNA 플라스미드에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 flu HA 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜을 나타낸다. 각 그룹은 5마리의 동물로부터의 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 프라임/부스트 요법으로 면역화된 동물로부터의 비분획화 PBMC에서의 HIVenv 6101-특이적 감마 인터페론(IFN-ν) ELISpot 반응을 나타내는 막대 그래프이다. 가장 좌측의 담회색 막대는 SIV gag 단백질을 발현하는 DNA 플라스미드와 flu HA 단백질을 발현하는 VSV의 부스트에 의한 면역화 프로토콜을 나타낸다. 빗금친 막대는 프라이밍 DNA gag 플라스미드 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV 부스트를 포함하는 본 발명의 프로토콜을 나타낸다. 체크무늬 막대는 공 대조 DNA에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜을 나타낸다. 점무늬 막대는 대조 DNA 플라스미드에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 flu HA 단백질을 발현하는 VSV 부스트에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜을 나타낸다. *는 통계학적 유의차가 p=0.0001에서 일어난 경우를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 프라임/부스트 요법으로 면역화된 동물에 대한 효소-연계 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 혈청 항-SIV gag p27 항체 역가를 나타내는 그래프이다. 플라스미드 DNA는 0일째, 4주째 및 8주째에 투여되었으며, VSV(혈청형 인디아나(Indiana) G) 및 VSV(혈청형 칸디푸라(Chandipura) G) 부스트는 각각 15주째 및 23주째에 투여되었다. SIV gag 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드와 flu HA 단백질을 발현하는 VSV 벡터의 부스트에 의한 면역화 프로토콜은 (◆)로 나타낸다. 프라이밍 DNA gag 플라스미드 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV 부스트를 포함하는 본 발명의 프로토콜은 (■)로 나타낸다. 공 대조 DNA에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜은 (▲)로 나타낸다. 대조 DNA 플라스미드에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 flu HA 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜은 (●)로 나타낸다. 각 그룹은 5마리의 동물로부터의 결과를 나타낸다. 그룹들 간의 통계학적 유의차는 p=0.0073 (*); p=0.5941 (#) 또는 p=0.0027(￥)로서 제시한다.
도 5는 본 발명의 프라임/부스트 요법으로 면역화된 동물에 대한 ELISpot 분석법으로 평가된 백만개 세포당 SIV gag-특이적 스팟 형성 세포를 나타내는 그래프이다. 플라스미드 DNA는 0일째, 4주째 및 8주째에 투여되었으며, VSV(혈청형 인디아나 G) 및 VSV(혈청형 칸디푸라 G) 부스트는 각각 15주째 및 23주째에 투여되었다. SIV gag 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드와 flu HA 단백질을 암호화하는 벡터의 부스트에 의한 면역화 프로토콜은 (◆)로 나타낸다. 프라이밍 DNA gag 플라스미드 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV 부스트를 포함하는 본 발명의 프로토콜은 (■)로 나타낸다. 공 대조 DNA에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화는 (▲)로 나타낸다. (●)은 대조 DNA 플라스미드에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 flu HA 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜을 나타낸다. 각 그룹은 5마리의 동물로부터의 결과를 나타낸다. 그룹들 간의 통계학적 유의차는 p=0.0001 및 p=0.0002에 대해 괄호로 표시한다.
도 6은, 시험감염(challenge)한지 수일 경과 후 감소된 CD4 T-세포 손실로 측정한 바에 의하면, 도 5와 동일한 기호로 표시된 프라임/부스트 병용으로 유도된 상승된 면역반응이 AIDS로부터의 보호를 증진시킴을 나타내는 그래프이다.
도 7은 시험감염한지 수일 후 혈장 중 순환 바이러스(바이러스 카피/ml)의 감소로 측정한 바에 의하면, 도 5와 동일한 기호로 표시된 프라임/부스트 병용으로 유도된 상승된 면역반응이 AIDS로부터의 보호를 증진시킴을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 선행 기술에 기재된 면역원성 조성물의 특정 성분들을 조합하여 사용하고 당해 성분들을 최적화하여 놀라운 상승작용적 결과를 산출함으로써 포유동물 피험체 또는 척추동물 피험체에서 항원-특이적 면역반응을 유도하는 신규한 방법을 제공한다. 일반적으로, 당해 방법은 DNA 플라스미드에 의한 포유동물 또는 척추동물 세포에서의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 있는 항원을 암호화하는 DNA 플라스미드를 포함하는 조성물의 유효량을 피험체에게 투여함을 포함한다. 당해 방법은 또한 복제 적격성 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)을 포함하는 조성물의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 또한 포함한다. 이러한 rVSV는 항원을 암호화하는 핵산 서열을 당해 rVSV에 의한 포유동물 또는 척추동물 세포에서의 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함한다.
순서에 따라 투여될 이들 2가지 면역원성 조성물 중 제1 조성물은 프라이밍 조성물로서 지칭된다. 순서에 따라 투여될 이들 2가지 면역원성 조성물 중 제2 조성물은 부스팅 조성물로서 지칭된다. 따라서, DNA 조성물은 프라이밍 조성물로서 투여될 수 있으며 VSV 벡터 조성물은 부스팅 조성물로서 투여될 수 있고, 그 반대가 될 수 있다. 하나의 양태에서, 프라이밍 조성물은 부스팅 조성물을 투여하기 전에 피험체에게 적어도 1회 또는 수회 투여된다. 이후에, 부스팅 조성물은 후속적으로 피험체에게 적어도 1회 또는 수회 투여된다. 추가로, 본 발명은 조성물 중 하나를 수회 투여한 다음, 나머지 조성물을 수회 투여함을 의도한다. 당해 방법은 당해 방법의 한 단계로서 유효량의 사이토킨을 투여함을 추가로 의도한다.
놀랍게도, 본 발명을 실시함으로써 포유동물 피험체에서 DNA 플라스미드 또는 재조합 VSV를 단독으로 투여함으로써 달성되는 것보다 큰, 당해 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응이 유도된다는 것이 밝혀졌다. 사실, 하기 실시예에서 명시하는 바와 같이 면역반응은 2개의 면역원성 조성물의 부가적 배합으로 예상되는 면역반응보다 크다. 따라서, 당해 신규한 방법으로 유도된 면역반응은 항원에 대한 세포성 및/또는 항원 반응의 극적인 상승작용적 증가이다. 예를 들어, HIV-1 gag에 대한 최대 항원 특이적 세포성 반응이 단독의 DNA 플라스미드 면역원성 조성물 투여에 대한 반응보다 3배 이상 높거나 단독의 rVSV 면역원성 조성물의 투여에 대한 반응보다 거의 9배 높은 하기 표 1 및 도 4 및 5를 참고한다.
포유동물 피험체가 영장류, 바람직하게는 사람임이 의도되지만, 본 발명은 포유동물 피험체의 확인으로 제한되지 않는다. 당해 방법의 성분들은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 세부사항을 제공하기 위해 본원에서 참조로 인용된 문헌들을 참조로 하여 하기에서 상세히 기술한다.
A. DNA 플라스미드 면역원성 조성물
본 발명의 면역원성 조성물은 이에 대한 면역반응이 요망되는 선택된 항원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 플라스미드를 포함한다. 상기 플라스미드에서, 선택된 항원은 포유동물 또는 척추동물 세포에서 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 있다. 당해 플라스미드 자체의 성분은 통상적인 것들이다.
본 발명에서 유용한 비-바이러스성 플라스미드 벡터는 선택된 면역원성 항원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열을 함유한다. DNA 분자는 외인성 또는 이종 핵산 서열을 암호화하도록 고안된 바이러스 또는 비-바이러스, 예를 들어, 세균 종으로부터 유래될 수 있다. 이러한 플라스미드 또는 벡터는 바이러스 또는 파지로부터의 서열을 포함할 수 있다. 다양한 비-바이러스 벡터가 당해 분야에 공지되어 있으며, 제한됨이 없이 플라스미드, 세균 벡터, 박테리오파지 벡터, "나(裸)형태" DNA 및 양이온성 지질 또는 중합체와 축합된 DNA가 포함된다.
세균 벡터의 예로는 특히, 바실러스 칼메트 게렝(bacille Calmette Guerin (BCG)), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 이. 콜라이(E. coli) 및 리스테리아(Listeria)가 포함된다. 적합한 플라스미드 벡터로는 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pK37, pKC101, pAC105, pVA51, pKH47, pUB110, pMB9, pBR325, Col E1, pSC101, pBR313, pML21, RSF2124, pCR1, RP4, pBAD18 및 pBR328이 포함된다.
적합한 유도성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 발현 벡터의 예로는 pTrc[참조: Amann et al., 1988 Gene, 69:301-315], 아라비노스 발현 벡터(예: pBAD18, Guzman et al, 1995 J. Bacteriol., 177:4121-4130) 및 pETIId[참조: Studier et al., 1990 Methods in Enzymology, 185:60-89]이 포함된다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 의존한다. pETIId 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 공동 발현된 바이러스 RNA 폴리머라제 T7 gnl에 의해 매개된 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 폴리머라제는 lacUV5 프로모터의 전사적 제어하에 있는 T7 gn1 유전자를 보유한 상주 프로파지로부터 숙주 균주 BL21 (DE3) 또는 HMS I 74(DE3)에 의해 공급된다. pBAD 시스템은 araC 유전자에 의해 조절되는 유도성 아라비노스 프로모터에 의존한다. 상기 프로모터는 아라비노스의 존재하에 유도된다.
프로모터, 및 목적하는 포유동물 또는 척추동물 숙주에서의 항원 발현을 추진하는 기타 조절 서열은 이러한 목적에 유용한 것으로 공지된 광범위한 프로모터로부터 유사하게 선택될 수 있다. 이들 다양한 프로모터는 하기에 기술되어 있다. 하기하는 면역원성 DNA 플라스미드 조성물의 양태에 있어, 유용한 프로모터는 사람 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터/인핸서(예를 들어, 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제5,168,062호 및 제5,385,839호에 기재되어 있음) 및 SCMV 프로모터 인핸서이다.
본 발명의 핵산 서열, 분자 또는 벡터에 함유시키기 위한 추가의 조절 서열로는, 제한 없이, 인핸서 서열, 폴리아데닐화 서열, 스플라이스 공여 서열 및 스플라이스 수용 서열, 각각 전사될 폴리펩타이드의 처음과 말단에 있는 전사 개시 부위 및 전사 종결 부위, 전사된 영액내에서의 해독을 위한 리보솜 결합 부위, 에피토프 태그, 핵 국재화 서열, IRES 요소, 골드버그-호네스(Goldberg-Hogness) "TATA" 요소, 제한 효소 절단 부위, 선택성 마커 등이 포함된다. 인핸서 서열로는, 예를 들어 SV40 DNA의 72bp 탠덤(tandem) 반복부 또는 레트로바이러스의 긴 말단 반복부 또는 LTR 등이 포함되며, 인핸서 서열은 전사 효율을 증가시키기 위해 사용된다.
복제 오리진, 폴리아데닐화 서열(예: BGH 폴리A, SV40 폴리A), 약물 내성 마커(예: 카나마이신 내성) 등을 포함하여, DNA 플라스미드에서 유용한 이러한 다른 성분들은 실시예에서 기술되고 하기에서 구체적으로 언급하는 서열을 포함한 널리 공지된 서열로부터도 선택될 수 있다.
프로모터 및 기타 통상의 벡터 요소의 선택은 통상적이며, 많은 이러한 서열들은 입수가능하며, 이를 사용하여 본 발명에서 유용한 플라스미드를 고안할 수 있다[참조: Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989) 및 예를 들어, 페이지 3.18-3.26 및 16.17-16.27에서 인용된 참고문헌 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)]. 본 발명에서 유용한 플라스미드의 모든 성분은 당해 분야의 숙련가가 당해 분야에 공지된 물질들로부터 용이하게 선택할 수 있으며 약제 산업으로부터 입수가능하다. 플라스미드 성분과 조절 서열의 선택은 본 발명에서 제한되는 것으로 고려되지 않는다.
면역원성 조성물에서 사용하기에 적합한 DNA 플라스미드 작제물의 예는 특히, 다음 특허 공보(이의 내용은 본원에서 참조로 인용된다)에 상세히 기술되어 있다[참조: 국제 특허 공보 제WO98/17799호, 제WO99/43839호 및 제WO98/17799호; 및 미국 특허 제5,593,972호; 제5,817,637호; 제5,830,876호; 및 특히 제5,891,505호].
마찬가지로, 선택된 항원은 하기 논의에서 확인된 항원일 수 있다. 본원의 면역원성 조성물의 한 양태에서, 선택된 항원은 gag, pol, env, nef, vpr, vpu, vif 및 tat에 의해 발현된 항원과 같은 HIV-1 항원이다. 바람직하게는, 항원 서열 및 DNA 플라스미드의 다른 성분들은 예를 들어, 의도하는 숙주에 적절한 코돈의 선택 및 임의의 억제 서열의 제거에 의해 최적화되며, 또한 항원 제제와 관련하여 하기에서 논의된다.
따라서, 이러한 면역원성 조성물은 숙주에서 발현시키기 위한 하나의 선택된 항원을 암호화하는 하나의 플라스미드를 포함할 수 있다. 당해 방법에 따라서, 플라스미드 조성물은 동일한 선택된 항원의 카피 1개 이상을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 하나의 DNA 플라스미드를 또한 포함한다. 또는, 당해 조성물은 다수의 선택된 항원을 발현하는 하나의 플라스미드를 함유할 수 있다. 각각의 항원은 개별적 조절 요소 또는 성분의 제어하에 있을 수 있다. 또는, 각각의 항원은 동일한 조절 요소의 제어하에 있을 수 있다. 또 다른 양태에서, DNA 플라스미드 조성물은 다수의 플라스미드를 함유할 수 있으며, 이때 각각의 DNA 플라스미드는 동일하거나 상이한 항원을 암호화한다.
추가의 양태에서, DNA 플라스미드 면역원성 조성물은, 목적하는 사이토킨, 림포카인 또는 기타 유전학적 보조제(genetic adjuvant)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 개별적 DNA 플라스미드 성분으로서 또는 항원 함유 DNA 플라스미드의 일부분으로서 추가로 함유할 수 있다. 핵산 서열용으로 이용될 수 있는 이러한 적합한 보조제의 숙주는 하기에 확인되어 있다. 본 발명에서 예시한 양태에서, 본 발명의 DNA 플라스미드 조성물과 함께 투여하기에 바람직한 사이토킨은 인터류킨-12이다.
DNA 플라스미드 조성물은 바람직하게는 하기에 논의하는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체 중에서 투여된다. 당해 조성물이 어떠한 선택된 투여 경로에 의해서도 투여될 수 있지만, 하나의 양태에서, 바람직한 투여 방법은 플라스미드를 포함하는 조성물을 하기하는 촉진제로서의 부피바카인과 공동 투여하는 것이다.
DNA 조성물이 프라이밍 조성물인 본 발명의 방법의 한 양태에서, 당해 방법은 이에 대한 면역반응이 유도되는 것이 요망되는 항원을 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 플라스미드를 rVSV 전에 투여함을 포함한다. 다른 양태에서, DNA 프라이밍 조성물은 추가로, 선택된 사이토킨을 암호화하는 제2 플라스미드로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 하기 예시하는 바와 같이 DNA 프라이밍 조성물은 3개의 플라스미드, 즉 제1 항원을 발현하는 1개의 플라스미드, 상이한 제2 항원을 발현하는 제2 플라스미드 및 선택된 사이토킨 보조제를 발현하는 제3 플라스미드를 포함한다. 실시예에서 상세히 기술하는 바와 같이, DNA 프라이밍 조성물의 한 양태는 3개의 최적화된 플라스미드, (1) RNA 최적화된 SIV gag p37 유전자를 암호화하는 플라스미드(도 1A 참조); (2) 2개의 프로모터의 개별적 조절하에 있는 2개의 레수스 IL-12 서브유닛 p35 및 p40를 암호화하는 플라스미드(도 1B 참조) 및 (3) HIV-1 gp160 env 유전자를 암호화하는 플라스미드를 함유한다.
프라이밍 조성물로서 사용되는 경우, 이러한 DNA 플라스미드 조성물은 부스팅 rVSV 조성물 전에 1회 또는 바람직하게는 1회 이상 투여된다. 부스팅 조성물로서 사용되는 경우, 이러한 DNA 플라스미드 조성물은 프라이밍 rVSV 조성물을 투여한 후에 1회 또는 바람직하게는 1회 이상 투여된다.
B. rVSV 면역원성 조성물
본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 또 다른 면역원성 조성물은 복제 적격성의 살아있는 약독화된 수포성 구내염 바이러스(VSV) 전달 비히클이다. 이러한 재조합 VSV는 포유동물 또는 척추동물 세포에서의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 있는 선택된 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 방법에서, DNA 플라스미드 조성물에서 사용되는 항원은 rVSV 면역원성 조성물에서 사용되는 것과 동일한 항원이다.
VSV는 모노네가비랄레스(Mononegavirales)로서 명명된 분류 목(目)의 일원인 소 바이러스로서, 4개의 내부 구조 단백질 및 1개의 외부 트랜스막 단백질을 암호화하는 11kb의 비분절, 네가티브(-)-쇄 RNA 게놈을 포함한다. 3'에서 5' 방향으로, 당해 유전자는 뉴클레오캡시드(N), 인단백질(P), 매트릭스 단백질(M), 트랜스막 당단백질(G) 및 폴리머라제(L)로 명명된 단백질들을 암호화한다. 살아있는 VSV는 분리되어 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 "구제(rescue)"될 수 있다[참조: 미국 특허 제6,044,886호; 제6,168,943호; 및 제5,789,299호; 국제 특허 공보 제WO99/02657호; Conzelmann, 1998, Ann. Rev. Genet., 32:123-162; Roberts and Rose, 1998, Virol., 247:1-6; Lawson et al, 1995 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92:4477-4481]. 또한, 예를 들어, VSV(인디아나)의 게놈 서열은 NCBI 데이타베이스에 수탁번호 제NC001560호로서 등록되어 있다. VSV(칸디푸라) 서열을 포함하는 VSV의 다른 서열은 데이타베이스에서 입수가능하다; 예를 들어, 특히 수탁번호 제Ay382603호, 제Af128868호, 제V01208호, 제V01207호, 제V01206호, 제M16608호, 제M14715호, 제M14720호 및 제J04350호 참조. 뉴저지(New Jersey) 및 인디아나와 같은 VSV 균주는 또한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland)와 같은 기탁기관으로부터도 입수가능하다(예를 들어, 수탁번호 제VR-1238호 및 제VR-1239호). 기타 서열은 본 명세서 전반에 걸쳐서 인용된 문헌에 기재되어 있거나 언급되어 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌들은 참조로 인용된다.
VSV 게놈은 하나 이상의 외래 유전자를 수용하며 적어도 3kb까지 신장되어 있는 것으로 나타났다. 이들 바이러스의 게놈은 매우 안정하고 재조합되지 않으며 좀처럼 현저한 돌연변이를 겪지 않는다. 또한, 이의 복제는 세포질에서 일어나고 이의 게놈은 RNA로 이루어져 있기 때문에, 이들은 감염된 숙주 세포의 게놈내로 삽입될 수 있다. 또한, 이들 네가티브-쇄 RNA 바이러스는 효율적 외래 유전자 삽입을 위해 용이하게 조작할 수 있는 비교적 단순한 전사 제어 서열을 지니고 있다. 마지막으로, 외래 유전자의 발현 수준은 바이러스 전사 프로모터에 대한 외래 유전자의 위치를 변화시킴으로써 조절할 수 있다. 유전자 발현의 3'에서 5'로의 구배는 전사성 바이러스 폴리머라제가 게놈 주형을 따라 진행함에 따라 만나게되는 각각의 유전자간 유전자 종결/유전자 개시 시그날을 성공적으로 통과할 수 있는 가능성이 감소됨을 반영한다. 따라서, 3' 말단 전사 개시 프로모터 부근에 위치하는 외래 유전자는 풍부하게 발현되는 반면에, 보다 원위의 게놈 위치에 삽입된 외래 유전자는 훨씬 덜 발현된다.
VSV는 많은 종류의 상이한 세포 유형에서 높은 역가로 복제되며, 바이러스 단백질은 상당히 풍부하게 발현된다. 이는 VSV가 강력한 기능적 외래 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있을 뿐만 아니라, 적절한 rVSV 벡터를 사람 생물의약 생산용으로 승인된 세포주에서의 제조 수준까지 규모를 확대시킬 수 있음을 의미한다.
rVSV는 중요한 보호성 면역원을 암호화하는 외래 유전자를 바이러스 병원체로부터 광범위한 상이한 세포 유형으로 전달하고 후속적으로 진성으로 구성된(authentically-configured) 면역원성 단백질의 풍부한 발현을 야기하는 놀라운 능력을 갖고 있다[참조: Haglund, K., et al, 2000 Virol., 268:112-21; Kahn, J. S. et al, 1999 Virol., 254:81-91; Roberts, A. et al, 1999 J. Virol., 73:3723-32; Rose, N. F. et al, 2000 J. Virol., 74:10903-10; and Schlereth, B. et al. 2000 J. Virol., 74:4652-7]. 이렇게 발현된 면역원은 고도로 지속적인 바이러스 중화 항체 반응 뿐만 아니라 보호성 세포독성 T 림프구(CTL) 둘다를 동시에 유도한다[참조: Roberts, A. et al, 1998 J. Virol., 72:4704-11].
rVSV의 효능 이외에도, 야생형 VSV가 상당한 바이러스 복제에도 불구하고 건강한 사람에서 질환 증상 또는 병리상태를 거의 야기하지 않거나 전혀 야기하지 않기 때문에 이러한 살이있는 바이러스 유전자 전달 비히클은 안전하다[참조: Tesh, R. B. et al, 1969 Am. J. Epidemiol., 90:255-61]. 게다가, VSV로 감염되어 VSV에 대한 면역이 이미 존재하는 사람은 드물다. 추가로 약독화된다면, 이러한 rVSV 조성물은 면역약화된 또는 달리 덜 건강한 사람 피험체에서 사용하기에 적합하다. 본 방법에서 VSV 벡터를 사용한 경우의 중요한 이점은 VSV의 바이러스 부착 단백질 G의 변화 또는 변형으로 인해서 VSV의 수많은 혈청형이 존재한다는 것이다. 따라서, 동일한 이종 항원을 보유한 VSV 벡터의 상이한 혈청형을 반복 투여하기 위해 사용하여, 숙주의 면역계에 의해 VSV G 단백질에 대해 생성된 어떠한 간섭성 중화 항체 반응이라도 피할 수 있다.
재조합 VSV는 당해 분야에 이미 기술된 기법을 사용하여 바이러스 전사 프로모터의 제어하에 VSV의 임의의 위치에 삽입된 선택된 항원 및 이의 조절 서열을 보유하도록 고안할 수 있다. 한 양태에서, 선택된 항원을 암호화하는 이종 유전자는 VSV의 G 및 L 암호화 영역 사이에 삽입된다. 다른 양태에서, 이종 유전자는 G 단백질 부위에 융합될 수 있다. 또 다른 양태에서, 이종 유전자는 다른 VSV 유전자 중 어느 하나의 부위 또는 이에 인접한 부위에 융합된다.
또 다른 양태에서, 유전자는 게놈내에서 상이한 부위로 '셔플링(shuffling)'된다. 특히, N 유전자가 게놈내에서 상이한 부위로 셔플링된다. 셔플링된 재조합 cDNA 서열을 생산하는 클로닝은 본래 VSV 플라스미드 골격(pVSV-XN1)의 변형을 포함한다. 이러한 본래 벡터의 3가지 변이체는 정상적 유전자 순서(3'-N-P-M-G-L-5')에서 벗어난, 다음과 같은 순서의 플라스미드를 포함한다: i) 3'-P-N-M-G-L-5'; ii) 3'-P-M-N-G-L-5' 및 iii) 3'-P-M-G-N-L-5'. 이러한 플라스미드를 생성하기 위해 사용되는 클로닝 전략은 문헌[참조: Ball, L. A. et al. 1999 J. Virol., 73:4705-12]에 기술된 방법을 사용한다. 상기 기법은, 각각의 암호화 서열 간에 발견되는 유전자-말단/유전자 개시 시그날이 거의 동일하고 어떠한 뉴클레오타이드 치환을 도입하지 않고도 재배열된 유전자가 작제될 수 있도록 한다는 사실을 이용한다. 또는, 효과적인 소수개의 점 돌연변이를 비암호화 서열에 도입시켜 게놈 재배열을 촉진하는 통상의 제한 부위를 생성시킬 수 있다.
이들 벡터의 또 다른 양태에서, G 유전자의 29개 아미노산 세포질 도메인의 카복시-말단 암호화 서열은 G 유전자의 5' C 말단으로부터 아미노산을 결실시킴으로써 절두된다. 또는, G 유전자 전체가 결실된다. 한 양태에서, G 유전자의 전체 세포질 도메인이 제거된다. 또 다른 양태에서, 세포질 도메인 중 28개 이상의 아미노산이 제거된다. 또 다른 양태에서, 세포질 도메인 중 약 20개의 아미노산이 결실된다. 또 다른 추가의 양태에서, 세포질 도메인 중 약 10개 이하의 아미노산이 결실된다.
보고에 의하면, 셔플링된 게놈 전략 및 G 단백질 변형 전략은 둘다 부분적 성장 결손을 야기한다[참조: Flanagan, E. B., et al 2001 J. Virol. 75:6107-14; Schnell, M. J. et al. 1998 EMBO J., 17:1289-96]. 이러한 VSV 변형은 본 발명의 다양한 양태에서 사용하기 위한 보다 약독화된 표현형 또는 심지어 비-복제성 VSV를 유도할 수 있는 것으로 예상된다[참조: Johnson, J. E. et al, 1998 Virol., 251:244-52.37; Johnson, J. E., et al., 1997 J. Virol., 71:5060-8].
유사하게, 선택된 항원은 하기 논의에서 확인된 항원일 수 있다. 본원의 면역원성 조성물의 한 양태에서, 선택된 항원은 클레이드(clade) B 바이러스 분리체의 HIV-1 gag 및/또는 env (gp160) 유전자이다. 또 다른 양태에서, 항원은 HIV-1 pol, nef, vpr, vpu, vif 또는 tat 유전자이다. 바람직하게는, 항원 서열은 항원 제조와 관련하여 하기에서도 논의되는, 의도하는 숙주에 적절한 코돈 선택 및/또는 임의의 억제 서열의 제거에 의해 최적화된다.
순차적 투여와 함께 임의의 잠재적 벡터 복제 효율성의 감소 문제를 해결하기 위해, 각각이 상이한 VSV 혈청형으로부터의 G 유전자를 보유하는 유사한 고안의 벡터 셋트를 사용하여 성공적 부스터 면역화가 가능하다. VSV 인디아나, 뉴저지 및 칸디푸라로부터의 G 단백질의 1차 아미노산 서열은 하나에 대한 기존의 면역이 다른 것의 감염 및 복제를 방해하지 않을 정도로 충분히 상이하다. 따라서, rVSV(인디아나)에 의해 생성된 중화 항체 반응은 rVSV(뉴저지) 또는 rVSV(칸디푸라)의 복제를 방해하지 않아야 한다. 성공적인 순차적 면역화를 가능하게 할 수 있는 벡터 세트는 VSV 인디아나로부터의 G 유전자를 VSV 칸디푸라 또는 VSV 뉴저지로부터의 분기된 상동체로 대체시켜 면역학적으로 다른 3개의 벡터를 형성시킴으로써 제조할 수 있다.
따라서, 이러한 rVSV 면역원성 조성물은 숙주에서의 발현을 위해 선택된 단일 항원을 암호화하는 하나의 rVSV를 포함할 수 있다. 본 방법에 따라서, rVSV 면역원성 조성물은 동일한 선택된 항원의 1개 이상의 카피를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나의 rVSV를 포함한다. 또는, 당해 조성물은 다수의 선택된 항원을 발현하는 하나의 rVSV를 함유할 수 있다. 각각의 항원은 개별적 조절 요소 또는 성분의 제어하에 있을 수 있다. 또는, 각각의 항원은 동일한 조절 요소의 제어하에 있을 수 있다. 또 다른 양태에서, rVSV 조성물은 각각의 rVSV가 동일하거나 상이한 항원을 암호화하는 다수의 rVSV를 함유할 수 있다.
또 다른 양태에서, rVSV 면역원성 조성물은 사이토킨, 림포카인 또는 유전학적 보조제를 추가로 함유하거나 이들과 함께 투여될 수 있다. 사이토킨은 단백질로서 또는 상기한 바와 같은 플라스미드 중에서 투여되거나 재조합 VSV에 사이토킨 암호화 서열이 삽입됨으로써 암호화될 수 있다. 예를 들어, 사이토킨 암호화 서열은 VSV 게놈의 어떠한 위치에라도 삽입되어 바이러스 전사 프로모터로부터 발현될 수 있다. 핵산 서열이 입수가능한 이러한 적합한 보조제의 숙주는 하기에 확인되어 있다. 본 발명에서 예시되는 양태에서, 본 발명의 rVSV 조성물과 함께 투여하기에 바람직한 사이토킨은 인터류킨-12이다.
rVSV 조성물은 바람직하게는, 하기에서 논의되는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체 중에서 투여된다. 당해 조성물이 어떠한 선택된 투여 경로에 의해서도 투여될 수 있지만, 한 양태에서 바람직한 투여 방법은 비내 투여이다.
rVSV 조성물이 부스팅 조성물인 본 발명의 방법의 한 양태에서, 당해 방법은 DNA 면역원성 프라이밍 조성물을 투여한 후에 하나 이상의 rVSV 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다. rVSV 면역원성 조성물은 프라이밍 조성물에 의해 발현되는 것과 동일한 항원을 발현한다. 한 양태에서, rVSV 조성물은 선택된 사이토킨을 암호화하는 추가의 재조합 바이러스를 포함한다. 또 다른 양태에서, rVSV는 항원을 발현하는 것과 동일한 rVSV에 존재하는 사이토킨, 예를 들어, IL-12를 포함한다. 또 다른 양태에서, 다수의 rVSV 조성물이 추후에 부스터로서 투여된다. 한 양태에서, 2종 이상의 rVSV 조성물이 프라이밍 조성물 다음에 투여된다. 또 다른 양태에서, 3종 이상의 rVSV 조성물이 프라이밍 조성물 다음에 투여된다.
바람직하게는, 상기 논의한 바와 같이, 각각의 후속적 rVSV 조성물은 상이한 혈청형을 갖지만, 동일한 항원 암호화 서열을 갖는다. 상이한 혈청형은 공지된 천연 혈청형 및 VSV G 단백질의 조작에 의해 제공된 임의의 합성 혈청형으로부터 선택된다. rVSV의 G 단백질을 변경하는 공지된 방법 중에는 문헌[참조: 국제 공개공보 제WO99/32648호 및 Rose, N. F. et al. 2000 J. Virol., 74:10903-10]에 기재되어 있는 기법이 있다.
다른 양태에서, 각각의 rVSV는 상이한 항원 암호화 서열을 갖지만, 동일한 VSV G 단백질을 갖는다. 또 다른 양태에서, 각각의 rVSV는 상이한 항원 암호화 서열 및 상이한 VSV G 단백질을 갖는다. 실시예에서 상세히 기술되는 바와 같이, 일련의 rVSV 부스팅 조성물의 한 양태는 HIV-1 gp160 env 유전자를 함유하는 2개의 최적화된 rVSV를 포함하는데, 한 rVSV는 인디아나 혈청형이고 나머지 하나는 칸디푸라 혈청형이다.
본 발명에 따라서, 이러한 rVSV 면역원성 조성물은 숙주에게 동일한 항원을 제시하는 프라이밍 DNA 면역원성 조성물을 투여한 후에 부스팅 조성물로서 투여될 수 있다. 본 발명의 방법의 임의의 양태에서, 제2 및 임의의 추가 rVSV는 제1의 rVSV 투여 후 부스터로서 투여된다. 한 양태에서 추가의 rVSV 부스터는 동일한 항원을 보유한 동일한 혈청형의 것이다. 또는, 상이한 혈청형을 갖는 추가의 rVSV 부스터가 부스팅 DNA 면역원성 조성물을 투여하기 전에 연속적으로 투여된다. 3종 이상의 부스터를 투여하는 것이 유용한 것으로 나타났다. 부스팅 조성물로서 사용되는 경우, rVSV 면역원성 조성물은 프라이밍 DNA 조성물 후에 연속적으로 투여된다. 프라이밍 조성물로서 사용되는 경우, rVSV 조성물은 1회 또는 바람직하게는 수회 투여된다. 한 양태에서 추가의 rVSV 부스터는 동일한 항원을 보유한 동일한 혈청형의 것이다. 또는, 상이한 혈청형을 갖는 추가의 rVSV 부스터가 부스팅 DNA 면역원성 조성물을 투여하기 전에 연속적으로 투여된다.
생체내에서 HIV-1 단백질을 발현할 수 있는 적합한 rVSV 작제물의 예는 다음의 예로서 다음 간행물에 상세히 기재되어 있다[참조: Rose et al, 2000 Virol., 268:112-121; Rose et al, 2000 J. Virol., 74:10903-10910; Rose et al 2001 Cell, 106:539-549; Rose et al, 2002 J. Virol., 76:2730-2738; Rose et al, 2002 J. Virol., 76:7506-7517; 이는 본원에서 참조로 인용된다]. 추가의 rVSV 벡터는 VSV G 단백질의 진행적 절두 또는 상기한 바와 같은 VSV 구조 유전자 셔플링에 의해 추가로 약독화될 수 있다. 비-복제성 VSV도 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 약독화와 면역원성의 바람직한 균형를 나타내는 rVSV가 본 발명에서 유용할 것으로 예상된다.
하기 실시예에서 예시한 몇가지 실례 rVSV 작제물은 다음과 같은 재조합 게놈을 갖는다:
(1) 3' N- P- M- G-HIV env-L-5'
(2) 3' N- P- M- G-HIV gag-L-5'
(3) 3' N- P- M- G-SIV gag-L-5'
하나의 양태에서, 본 발명의 방법과 면역원성 조성물은 상기한 rVSV 작제물 중 하나를 사용한다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법과 면역원성 조성물은 rVSV-HIV env 및 rVSV-HIV gag 둘다를 사용한다. 후자의 면역원성 조성물은 진성적으로 구성된 gp160에 대한 체액성 면역반응과 함께, HIV-1 바이러스 감염된 세포를 치사시킬 수 있는 CTL(Env 및 Gag에 대한)을 동시에 유도한다. 이러한 방식으로 발현된 HIV-1 gp160는 CD4/공수용체에 결합하여 수용체 결합과 관련된 입체형태적 변화를 겪는다. 적절한 gp160/수용체 상호작용은 감염으로부터 항체-매개된 보호의 유도를 위해 필요한, gp160상에 존재하는 잠재적 바이러스 중화 결정기를 노출시킨다[참조: LaCasse, R. A. et al, 1999 Science. 283:357-62].
C. 본 발명의 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 항원
본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 항원성 또는 면역원성 조성물은 선택된 항원에 대한 척추동물 숙주에서의 면역반응을 증진시킨다. 선택된 항원은 플라스미드 DNA 또는 VSV에 의해 발현되는 경우, 병원성 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충으로부터 유래된 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편 또는 융합체일 수 있다. 또는, 선택된 항원은 암 세포 또는 종양 세포로부터 유래된 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 이의 단편 또는 융합체일 수 있다. 다른 양태에서, 선택된 항원은 IgE의 생산을 방해하여 알레르겐에 대한 알레르기 반응을 조절하기 위해 상기 알레르겐으로부터 유래된 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 이의 단편 또는 융합체일 수 있다. 또 다른 양태에서, 선택된 항원은 숙주에 의해서 바람직하지 않은 방식으로, 양으로 또는 위치에서 생산된 분자(자가 분자)을 의미하는 분자 또는 이의 일부분으로부터 유래된 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편 또는 융합체, 예를 들어, 척추동물 숙주에서 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 아밀로이드 전구체 단백질로부터로부터의 것들일 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 선택된 항원은 HIV-1로부터 유래된 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 이의 단편일 수 있다.
본 발명은 또한, (1) 척추동물 숙주의 면역반응을 유도하기 위한 병원성 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충, (2) 척추동물 숙주에서 치료학적 또는 예방학적 항암 효과를 유도하기 위한 암세포 또는 종양 세포로부터의 암 항원 또는 종양-관련 항원, (3) IgE 생산을 간섭하여 알레르겐에 대한 알레르기 반응을 조절하기 위한 알레르겐 또는 (4) 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위한, 숙주에 의해 바람직하지 않은 방식으로, 양으로 또는 위치에서 생산되는 분자 또는 이의 일부분으로부터 선택된 항원을 함유하는 면역원성 조성물의 능력을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명의 프라임/부스트 요법을 사용하는 바람직한 바이러스 면역원성 조성물은, 제한없이, 사람 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1형 내지 3형, 인플루엔자 바이러스, 단순 포진 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 사람 파필로마바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스, 칼리시바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 아데노바이러스, 광견병 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 린데르페스 바이러스, 사람 메타뉴모바이러스, 조류 뉴모바이러스(이전에는 칠면조 비기관지염 바이러스), 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 코로나바이러스, 파보바이러스, 감염성 비기관지염 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 전염성 복막염 바이러스, 조류 전염성낭병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 마렉병 바이러스, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스, 말 동맥염 바이러스 및 다양한 뇌염 바이러스에 의해 유발된 질환의 예방 및/또는 치료에 관한 조성물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 프라임/부스트 요법을 사용한 바람직한 세균 면역원성 조성물은, 제한없이, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(유형결정가능(typable) 및 유형결정불가능(nontypable) 둘다), 헤모필루스 솜누스( Haemophilus somnus), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 네이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 알로이오코커스 오티디티스(Alloiococcus otiditis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 시겔라 비브리오 콜레라(Shigella, Vibrio cholerae), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아비움-마이코박테리움(Mycobacterium avium-Mycobacterium) 세포내 복합체, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스트렙토코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 보렐리아 부르도르페리(Borrelia burgdorferi), 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 파스테우렐라 멀코시다(Pasteurella multocida), 악티노바실루스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum)에 의해 유발된 질환의 예방 및/또는 치료에 관한 조성물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 프라임/부스트 요법을 사용한, 진균 병원체에 대한 바람직한 면역원성 조성물은, 제한없이, 아스퍼질러스(Aspergillis), 블라스토마이세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 콕시디오데스(Coccidiodes), 크립토코커스(Cryptococcus) 및 히스토플라스마(Histoplasma)에 의해 유발된 질환의 예방 및/또는 치료에 관한 조성물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 프라임/부스트 요법을 사용한, 기생충에 대한 바람직한 면역원성 조성물은, 제한없이, 큰리슈만편모충(Leishmania major), 회충(Ascaris), 편충(Trichuris), 편모충(Giardia), 주혈흡충(Schistosoma), 와포자충 (Cryptosporidium), 트리코모나스(Trichomonas), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii) 및 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii)에 의해 유발된 질환의 예방 및/또는 치료에 관한 조성물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 프라임/부스트 요법을 사용한, 척추동물 숙주에서 치료학적 또는 예방학적 항암 효과를 유도하기 위한 바람직한 면역원성 조성물은, 제한없이, 전립선 특이적 항원, 암배아 항원, MUC-1, Her2, CA-125 및 MAGE-3을 포함하는 암 항원 또는 종양 관련 항원을 사용한 조성물을 포함한다.
상기 열거한 공지된 항원의 뉴클레오타이드 및 단백질 서열은 NCBI와 같은 데아타베이스를 통해서 대중적으로 용이하게 입수할 수 있거나, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 및 대학과 같은 다른 공급원으로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 프라임/부스트 요법을 사용한, 척추동물 숙주에서 알레르겐에 대한 반응을 조절하기 위한 바람직한 면역원성 조성물은 알레르겐 또는 이의 단편을 함유한 조성물을 포함한다. 이러한 알레르겐의 예는 미국 특허 제5,830,877호 및 국제 특허 공개공보 제WO99/51259호[이는 본원에서 참조로 인용된다]에 기재되어 있다. 이러한 알레르겐으로는, 제한없이, 꽃가루, 곤충의 독, 동물 비듬, 진균 포자 및 약물(예: 페니실린)이 포함된다. 이들 면역원성 조성물은 알레르겐 반응의 원인으로 공지된 IGE 항체 생산을 방해한다.
본 발명의 프라임/부스트 요법을 사용한, 척추동물에서 자가 분자에 대한 반응을 조절하기 위한 바람직한 면역원성 조성물은 자가 분자 또는 이의 단편을 함유한 조성물을 포함한다. 이러한 자가 분자의 예로는 당뇨병에 관여하는 β-쇄 인슐린, 위식도 역류 질환에 관여하는 G17 분자 및 다발성경화증, 루푸스 및 류마티스 관절염과 같은 질환에서 자가면역반응을 하향조절하는 항원이 포함된다. 또한, 예로는 β 및 γ 세크레타제 효소에 의한 APP의 프로세싱에 의해 생성되는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 내부 39-43 아미노산 단편인 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ 펩타이드로서도 지칭됨)가 포함된다. Aβ1-42 펩타이드는 다음과 같은 서열번호 1의 서열을 갖는다: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala.
본 발명의 DNA 플라스미드 및 rVSV 작제물의 고안을 위한 항원성 서열의 선택 및 사용에 있어서, 선택된 항원 암호화 유전자 서열 뿐만 아니라 이들 서열이 삽입되는 DNA 플라스미드의 코돈 용법을 변경시키고/시키거나 억제 서열을 제거하는 것이 또한 바람직하다. 억제 서열의 제거는 미국 특허 제5,965,726호; 제5,972,596호; 제6,174,666호; 제6,291,664호; 및 제6,414,132호; 및 국제 특허 공보 제WO01/46408호[이는 본원에서 참조로 인용된다]에 논의되어 있는 기법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 간략하게 기술하면, 상기 기법은 선택된 유전자내의 확인된 억제제/불안정성 서열을, 바람직하게는 다중 점 돌연변이를 사용하여 돌연변이시킴을 포함한다.
하기 예시된 하나의 특정한 양태로서, 본 발명의 면역원성 플라스미드 및 rVSV 조성물은 바람직하게는 gag, pol 및 nef 항원, 또는 이의 면역원성 단편 또는 융합체와 같은 HIV-항원을 암호화하도록 최적화된 하나 이상의 서열을 사용한다. 키메라 원숭이-사람 면역결핍 바이러스(SHIV)(89.6P)의 gag 및 env 유전자가 rVSV를 제조하는데 유용하여, 감염으로부터의 보호 및 바이러스 부하량과 질환의 경감이 레수스 마카크(Rhesus macaque) 모델에서 입증될 수 있다. 하기 예는 SHIV 유사체, 즉 SIV gag 및 HIV 89.6P env의 사용을 입증한다.
D. 면역원성 DNA 플라스미드 또는 rVSV 작제물에서 유용한 프로모터
본 발명의 임의의 성분에서 사용하기에 적합한 프로모터는 구성성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 등으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 활성에 있어 비특이적이고 본 발명의 항원을 암호화하는 핵산에서 사용되는 구성성 프로모터의 예로는, 제한없이, 레트로바이러스성 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서와 함께 사용됨), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(임의로 CMV 인핸서와 함께 사용됨)[참조: Boshart et al, 1985 Cell, 41:521-530], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터(제조원: Invitrogen)가 포함된다. 외부에서 공급된 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터로는, 제한없이, 아라비노스 프로모터, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 탈피호르몬 곤충 프로모터[참조: No et al, 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351], 테트라사이클린-억제성 시스템[참조: Gossen et al, 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551], 테트라사이클린-유도성 시스템[참조: Gossen et al, 1995 Science, 268:1766-1769, 또한 Harvey et al, 1998 Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518], RU486-유도성 시스템[참조: Wang et al, 1997 Nat. Biotech., 15:239-243 and Wang et al, 1997 Gene Ther., 4:432-441] 및 라파마이신-유도성 시스템[참조: Magari et al, 1997 J. Clin. Invest., 100: 2865-2872]이 포함된다.
이러한 범주에서 유용할 수 있는 다른 종류의 유도성 프로모터는 특정한 생리학적 상태, 예를 들어, 온도 또는 급성기에 의해 조절되거나 오직 복제성 세포에서만 조절되는 프로모터이다. 유용한 조직-특이적 프로모터로는 골격근 β-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제 및 천연 프로모터보다 활성이 높은 합성 근육 프로모터[참조: Li et al., 1999 Nat. Biotech., 17:241-245]가 포함된다. 조직-특이적인 프로모터의 예는 특히 간[알부민, Miyatake et al. 1997 J. Virol., 71:5124-32; B형 간염 바이러스 코어 프로모터, Sandig et al., 1996 Gene Ther., 3: 1002-9; 알파-태아단백질(AFP), Arbuthnot et al., 1996 Hum. Gene Ther., 7:1503-14], 골[오스테오칼신, Stein et al., 1997 Mol. Biol. Rep., 24:185-96; bone sialoprotein, Chen et al., 1996 J. Bone Miner. Res., 11:654-64], 림프구[CD2, Hansal et al., 1988 J. Immunol., 161:1063-8; 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 α 쇄], 신경[뉴론-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, Andersen et al. 1993 Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15; 신경미세섬유 경쇄 유전자, Piccioli et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5; 뉴론-특이적 ngf 유전자, Piccioli et al., 1995 Neuron, 15:373-84]에 대한 프로모터들이 공지되어 있다. 이러한 범주에서 유용한 추가의 목록에 대해서는 국제 특허 공보 제WO00/55335호를 참조한다.
E. 본 발명의 면역원성 조성물에 유용한 담체, 부형제, 보조제 및 제형
본 발명에서 유용한 면역원성 조성물은, DNA 플라스미드 조성물인지 또는 rVSV 조성물인지의 여부와 상관없이 면역학적으로 허용되는 희석제 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 멸균수 또는 멸균 등장성 식염수를 추가로 포함한다. 면역원성 조성물은 통상의 방식으로 이러한 희석제 또는 담체와 혼합될 수도 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"란 용어에는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항세균제, 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하고자 한다. 적절한 담체는 당해 분야의 숙련가에게 명백하며 대부분 투여 경로에 의존한다.
본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있는 다른 추가 성분은 보조제, 보존제, 계면활성제 및 화학 안정화제, 현탁화제 또는 분산제이다. 전형적으로, 안정화제, 보조제 및 보존제는 대상이되는 사람 또는 동물에서의 효능을 위한 최상의 제형을 결정하도록 최적화된다.
1. 보조제
보조제는 면역원 또는 항원과 함께 투여되는 경우에 면역반응을 증진시키는 물질이다. 인터류킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12[참조: 미국 특허 제5,723,127호], 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이체형), 인터페론-α, β 및 γ, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자[참조: 미국 특허 제5,078,996호 및 ATCC 수탁번호 39900], 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, GSF 및 종양 괴사 인자 α 및 β를 포함하나 이에 제한되지 않는 수많은 사이토킨 또는 림포카인이 면역 조절 활성을 가지고 따라서 보조제로서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 다른 보조제로는 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함하나 이에 제한되지 않는 케모카인이 포함된다. 셀렉틴, 예를 들어, L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴과 같은 부착 분자도 보조제로서 유용할 수 있다. 또 다른 유용한 보조제로는, 제한없이, 뮤신-유사 분자, 예를 들어, CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95와 같은 인테그린 게열의 구성원; PECAM, ICAM(예: ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3), CD2 및 LFA-3과 같은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원; CD40 및 CD40L과 같은 공자극 분자; 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 상피 성장 인자, B7.2, PDGF, BL-1 및 혈관 내피 성장 인자를 포함하는 성장 인자; Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6를 포함하는 수용체 분자가 포함된다. 또 다른 보조제 분자로는 카스파제(ICE)가 포함된다[참조: 국제 특허 공보 제WO98/17799호 및 제WO99/43839호, 이는 본원에서 참조로 인용된다].
면역반응을 증진시키는데 적합한 보조제로는, 제한 없이, 미국 특허 제4,912,094호[이는 본원에서 참조로 인용된다]에 기재된 MPLTM(3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; 제조원: 코릭사(Corixa), Hamilton, MT)가 포함된다. 또한, 코릭사(Hamilton, MT)로부터 시판되며 미국 특허 제6,113,918호[이는 본원에서 참조로 인용된다]에 기재되어 있는 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 이의 유도체 또는 유사체가 보조제로서 사용하기에 적합하다. 한가지 이러한 AGP는 529(이전에는 RC529로서 공지됨)로서도 공지된 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카보닐아미노] 에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데칸옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노시드이다. 상기 529 보조제는 수성 형태 또는 안정한 에멀젼으로서 제형화된다.
또 다른 보조제에는 광유 및 물 에멀젼, 알루미늄 염(alum)(예: 수산화알루미늄, 인산알루미늄), 암피겐(Amphigen), 아브리딘(Avridine), L121/스쿠알렌, D-락티드-폴리락티드/글루코시드, 플루로닉 폴리올, 무라밀 디펩타이드, 사멸된 보르데텔라, 미국 특허 제5,057,540호[이는 본원에서 참조로 인용된다]에 기술된 사포닌(예: Stimulon QS-21(제조원: Antigenics, Framingham, MA.)) 및 이로부터 생성된 입자, 예를 들어, ISCOMS(면역자극성 복합체), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 세균 지질다당류, 합성 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드[참조: 미국 특허 제6,207,646호; 이는 본원에서 참조로 인용된다], 백일해 독소(PT) 또는 이. 콜라이 열-불안정성 독소(LT), 특히 LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129[참조: 국제 특허 공개공보 제WO 93/13302호 및 제WO 92/19265호, 이는 본원에서 참조로 인용된다]가 포함된다.
또한, 국제 특허 공개공보 제 WO 00/18434호에 기재되어 있는 것들(여기서, 29번 아미노산 위치의 글루탐산은 다른 아미노산(아스파르트산 이외의), 바람직하게는 히스티딘으로 대체되어 있다)을 포함한 콜레라 독소 및 이의 돌연변이체가 보조제로서 유용하다. 유사한 CT 독소 또는 돌연변이체는 국제 공개특허공보 제WO 02/098368호(여기서, 아미노산 16번 위치의 이소류신은 단독으로 또는 아미노산 68번 위치의 세린의 대체와 함께 다른 아미노산으로 대체되고/되거나, 아미노산 72번 위치의 발린이 다른 아미노산으로 대체된다)에 기재되어 있다. 다른 CT 독소는 국제 공개특허공보 제WO 02/098369호(여기서, 아미노산 25번 위치의 아르기닌은 다른 아미노산으로 대체되고/되거나, 아미노산 49번 위치에 아미노산 삽입되고/되거나, 2개의 아미노산이 아미노산 35번 및 36번 위치에 삽입된다)에 기재되어 있다.
하기 예시하는 한 양태에서, 바람직하게는 보조제는 플라스미드로부터 발현되는 IL-12이다[참조: 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제5,457,038호; 제5,648,467호; 제5,723,127호 및 제6,168,923호]. 이러한 IL-12 발현 플라스미드는 실시예의 면역원성 DNA 플라스미드-함유 프라이밍 조성물내로 혼입된다. 그러나, 상기 플라스미드는 rVSV 조성물(또는 rVSV에 의해 발현됨)과 함께 또는 프라이밍 조성물과 부스팅 조성물 사이에 단독으로 포유동물 또는 척추동물 숙주에게 투여된다. 바람직한 양태에서, 사이토킨은, 사이토킨을 암호화하는 DNA 서열을 포유동물 세포에서의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 핵산 조성물로서 투여된다. 또 다른 유용한 양태에서, 사이토킨 발현 플라스미드는 DNA 조성물과 함께 투여된다. 또 다른 양태에서, 사이토킨은 프라임이 조성물과 부스팅 조성물의 투여 사이에 투여된다. 다른 단계에서 사이토킨은 부스팅 단계와 함께 투여된다. 또 다른 양태에서, 사이토킨은 프라이밍 조성물과 부스팅 조성물 둘다와 함께 투여된다.
하기 실시예에서와 같이 프라이밍 조성물이 DNA 플라스미드 조성물인 경우, 플라스미드 조성물은 사이토킨을 암호화하는 DNA 서열을 포유동물 세포에서의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 사이토킨-암호화 서열은 항원 암호화 서열과 동일한 DNA 플라스미드상에 존재한다. 다른 양태에서, 사이토킨 암호화 서열은 항원을 암호화하는 DNA 플라스미드와 상이한 DNA 플라스미드상에 존재한다.
2. 촉진제 또는 공동-제제
상기한 바와 같은 담체 이외에, 폴리뉴클레오타이드 분자로 이루어진 면역원성 조성물은 바람직하게는 임의의 폴리뉴클레오타이드 촉진제 또는 "공동-제제", 예를 들어, 국소 마취제, 펩타이드, 양이온성 지질, 리포좀 또는 지방질 입자를 포함하는 지질, 폴리리신과 같은 다가양이온, 덴드리머와 같은 분지된 3차원 다가양이온, 탄수화물, 양이온성 친양쪽성체, 세제, 벤질암모늄 계면활성제 또는 세포로의 폴리뉴클레오타이드 전달을 촉진하는 다른 화합물을 함유한다. 이러한 촉진제로는 국소 마취제 부피바카인 또는 테트라카인[참조: 미국 특허 제5,593,972호; 제 5,817,637호; 제5,380,876호; 제5,981,505호 및 제6,383,512호 및 국제 특허 공보 제WO98/17799호, 이는 본원에서 참조로 인용된다]가 포함된다. 본 발명에서 유용한 이러한 촉진제 또는 공동-제제의 다른 비배타적 예는 미국 특허 제5,703,055호; 제,739,118호; 제,837,533; 국제 특허 공보 제 WO96/10038호(1996년 4월 4일자로 공개됨); 및 국제 특허 공보 제WO94/16737호(1994년 8월 8일자로 공개됨)[이들 각각은 본원에서 참조로 인용된다]에 기재되어 있다.
가장 바람직하게는, 국소 마취제는 핵산 분자와 복합체 하나 이상을 형성하는 양으로 존재한다. 국소 마취제가 본 발명의 핵산 분자 또는 플라스미드와 혼합되는 경우, 이는 DNA를 싸고 있는 균질한 다양한 소형 복합체 또는 입자를 형성한다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물의 한 양태에서, 복합체는 국소 마취제와 하나 이상의 본 발명의 플라스미드를 혼합하여 형성시킨다. 이러한 혼합물로부터 생성된 단일 복합체는 상이한 플라스미드의 다양한 배합물을 함유할 수 있다. 또는, 본 발명의 조성물의 다른 양태에서, 국소 마취제는 각각의 플라스미드와 개별적으로 혼합될 수 있다. 이어서, 모든 플라스미드를 단일 거환 투여로서 투여할 경우 목적하는 비의 플라스미드가 단일 면역원성 조성물 중에 존재함을 보장하기 위해 개별적 혼합물을 단일 조성물로서 배합한다. 또는, 국소 마취제와 각각의 플라스미드를 개별적으로 혼합하고 개별적으로 투여하여 목적하는 비를 수득할 수 있다.
이후에 면역원성 조성물의 이러한 양태를 정의하기 위해 "복합체" 또는 "하나 이상의 복합체" 또는 "복합체들"이란 용어가 사용되는 경우, 당해 용어는 하나 이상의 복합체를 포함하는 것으로 이해된다. 각각의 복합체는 플라스미드의 혼합물 또는 개별적으로 형성된 복합체들의 혼합물을 함유한다. 각각의 복합체는 오직 한가지 유형의 플라스미드 또는 복합체, 또는 플라스미드 또는 복합체의 혼합물(이때, 각각의 복합체는 다시스트론성(polycistronic) DNA를 함유한다)을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 복합체는 직경이 약 50 내지 약 150nm이다. 사용되는 촉진제가 국소 마취제, 바람직하게는 부피바카인인 경우, 폴리뉴클레오타이드 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1중량% 내지 약 1.0중량%의 양이 바람직하다. 본원에서 참조로 인용되며 공동 제제로서 바람직하게는 약 0.001 내지 0.03중량%의 양으로 투여되는 벤질암모늄 계면활성제의 혼입을 교시하는 국제 특허 공보 제WO99/21591호를 참조한다. 본 발명에 따라서, 국소 마취제의 양은 상기 핵산 분자에 대해서 0.01 내지 2.5% w/v 국소 마취제 대 1 내지 10㎍/ml 핵산의 비로 존재한다. 다른 이러한 범위는 0.05 내지 1.25% w/v 국소 마취제 대 100㎍/ml 내지 1 mg/ml 핵산이다.
3. 면역원성 조성물에 대한 다른 첨가제
보존제, 안정화 성분, 계면활성제 등을 포함하는 다른 첨가제가 본 발명의 면역원성 조성물에 포함될 수 있다.
적합한 예시적 보존제로는 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀이 포함된다.
사용될 수 있는 적합한 안정화 성분으로는 예를 들어, 카사미노산, 슈크로스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 이인산일칼륨, 락토즈, 락트알부민 가수분해물 및 분유를 포함한다.
적합한 계면활성 물질로는, 제한 없이, 프로인트 불완전 보조제, 퀴논 유사체, 헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실아미노산 에스테르, 리소레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드, 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루로닉 폴리올; 폴리아민, 예를 들어, 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 카보폴; 펩타이드, 예를 들어, 무라밀 펩타이드 및 디펩타이드, 디메틸글리신, 투프트신; 오일 에멀젼; 및 미네랄 겔, 예를 들어, 인산알루미늄 등 및 면역 자극성 복합체(ISCOMS)가 포함된다. 당해 플라스미드 및 rVSV는 또한 면역원성 조성물로 사용하기 위한 리포좀내로 혼입될 수 있다. 면역원성 조성물은 조성물의 선택된 투여 방식에 적합한 다른 첨가제를 함유할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 또한 산제, 액제 또는 현탁제 투여 형태를 개발하기 위한 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 사용될 수 있는 동결건조된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19th edition (1995), 예를 들어, Chapter 95 Aerosols; 및 국제 특허 공보 제WO99/45966호, 이의 교시는 본원에서 참조로 인용된다].
이러한 면역원성 조성물은 어떠한 통상적 투여 경로를 통해서도 투여하기에 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 예를 들어, 액제, 산제, 에어로졸, 정제, 캡슐제, 장용 피복된 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 사람 피험체 투여용으로 제조한다. 따라서, 면역원성 조성물은 또한, 좌제, 용제, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트 및 이식용 서방출 또는 생분해성 제형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비경구 투여용 제형의 한 양태에서, 활성 성분은 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 전에 적합한 비히클(예: 멸균된 피로겐 비함유 물)로 재구성하기 위한 무수(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 다른 유용한, 비경구 투여가능한 제형은 활성 성분을 미정질 형태로서, 리포좀 제제로서 또는 생분해성 중합체 시스템 중의 활성 성분으로서 포함하는 제형을 포함한다. 서방출 또는 이식용 조성물은 약제학적으로 허용되는 중합체성 또는 소수성 물질, 예를 들어, 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체 또는 난용성 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 통상의 생리학적으로 허용되는 부형제, 보조제 또는 상기한 유형의 약제학적 제제에서 유용한 기타 성분의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적절한 pH 등장성, 안정성 및 기타 통상의 특징을 갖는, 상기한 성분으로부터의 이들 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당해 분야의 기술의 범위내에 있다.
F. 본 발명의 면역원성 조성물에 대한 투여량 및 투여 경로
일반적으로, 본 발명의 면역원성 조성물의 성분에 대한 적절한 "유효량" 또는 투여량의 선택은 또한, 사용되는 면역원성 조성물(들) 중의 항원의 종류 뿐만 아니라, 가장 특히, 면역화된 피험체의 전반적 건강, 연령 및 체중을 포함하는 피험체의 신체 상태에 기초할 수 있다. 투여 방법 및 투여 경로와 면역원성 조성물 중의 추가의 성분의 존재도 플라스미드 및 rVSV 조성물의 투여량 및 양에 영향을 줄 수 있다. 이러한 유효량의 선택 및 상향 또는 하향 조절은 당해 분야의 기술 범위내에 있다. 현저한 부작용 없이 환자에서 면역반응, 바람직하게는 보호 반응을 유도하거나 외인성 효과를 야기하는데 필요한 플라스미드 및 rVSV의 양은 이러한 요인들에 따라 다르다. 적합한 투여량은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정된다.
본 발명의 항원성 또는 면역원성 조성물은 비내, 경구, 질, 직장, 비경구, 피내, 경피[참조: 국제 특허 공보 제WO 98/20734호, 이는 본원에서 참조로 인용된다], 근육내, 복막내, 피하, 정맥내 및 동맥내 투여를 포함하는 다양한 경로에 의해 사람 또는 사람이 아닌 척추동물에게 투여된다. 적절한 경로는 사용되는 면역원성 조성물의 성질 및 환자의 연령, 체중, 성별 및 전반적 건강의 평가 및 면역원성 조성물 중에 존재하는 항원 및 유사한 요인들에 따라서 담당 주치의에 의해 선택된다.
하기 제공된 실시예에서, 면역원성 DNA 조성물은 근육내로(i.m.) 투여된다. 한 양태에서, rVSV 조성물을 근육내로 투여하는 것보다 비내로 투여하는 것이 바람직하다. 그러나, 투여량 및 투여 방식은 본 발명에서 제한되지 않는다.
마찬가지로, 면역원성 조성물의 투여 순서 및 개개의 투여 사이의 기간은 당해 방법의 적용에 대한 숙주의 정확한 방식 및 신체적 특징 따라서 담당 주치의 및 당해 분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있다. 이러한 최적화는 당해 분야의 기술의 범위내에 있을 것으로 예상된다.
G. 키트 성분
다른 양태에서, 본 발명은 항원에 대한 면역반응이 요망되는 상기 주지된 질환 또는 상태의 치료를 위한 면역원성, 예방학적 또는 치료학적 요법의 즉각적 실시를 위한 약제학적 키트를 제공한다. 당해 키트는 포유동물 또는 척추동물 피험체에서 고수준의 항원-특이적 면역반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위해 고안된다. 당해 키트는 포유동물 또는 척추동물 세포에서의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 항원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 하나 이상의 면역원성 조성물을 함유한다. 바람직하게는, DNA 면역원성 조성물의 다수의 예비포장된 투여량이 다중 투여용 키트내에 제공된다. 당해 키트는 동일한 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포유동물 또는 척추동물 피험체에서의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 복제 적격성 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)를 포함하는 하나 이상의 면역원성 조성물을 함유한다. 바람직하게는, rVSV 면역원성 조성물의 다수의 예비포장된 투여량이 다중 투여용 키트내에 제공된다.
상기한 면역원성 조성물이 IL-12와 같은 사이토킨을 발현하는 DNA 플라스미드 및/또는 rVSV를 또한 함유하지 않는 경우, 키트는 임의로, 개별적 사이토킨 조성물 또는 다중 투여용 사이토킨 조성물의 다수의 예비포장된 투여량을 또한 함유한다. 이러한 사이토킨 조성물은 일반적으로 선택된 사이토킨을 암호화하는 DNA 서열을 포유동물 또는 척추동물 피험체에서의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 핵산 조성물이다.
당해 키트는 또한 본원에서 기술하는 프라임/부스트 방법에서의 면역원성 조성물의 사용에 관한 지침을 함유한다. 당해 키트는 특정한 분석법의 실시에 대한 지침, 다양한 담체, 부형제, 희석제, 보조제 등 뿐만 아니라, 주사기, 분무 장치 등과 같은 조성물 투여용 장치를 포함할 수도 있다. 다른 성분들은 1회용 장갑, 오염제거 지침, 면봉 또는 용기, 특히 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명을 보다 잘 이해하기 위해서, 다음 실시예가 제시된다. 당해 실시예는 단지 예시 목적을 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하기 위함이 아니다. 다음 실시예에서 인용된 모든 문헌, 공보 및 특허는 본원에서 참조로 인용된다.
하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 프라임/부스트 프로토콜은 면역화된 피험체에서 항원-특이적 세포성 및 체액성 면역반응에 대한 놀라운 상승작용 효과를 유도한다. 사실, 본 발명의 프라임/부스트 프로토콜에 의해 유도된 이러한 반응들을 오직 다수의 프라이밍 조성물만을 투여하거나 다수의 부스팅 조성물만을 투여시의 결과와 비교하였을 때, 본 발명의 조성물에 대한 반응의 상승작용적 성질은 상당히 명백하다. DNA 플라스미드 조성물 투여에 이어서 rVSV 부스트 투여에 의한, 조합된 바람직한 항원 제시는 면역화된 피험체에서 항원-특이적 T 세포의 증가를 야기하는데, 이러한 증가는 임의의 부가적 반응을 상당히 초과하는 것이다. 마찬가지로, 목적하는 항원에 대한 체액성 반응의 증가는 면역화 프로토콜에서 DNA 플라스미드와 rVSV 면역원성 조성물을 둘다 사용한 경우에 예상밖으로 높다. 예를 들어, 하기 표 1과 도 4 및 5를 참조한다.
실시예 1: DNA 플라스미드의 제조
당해 실시예는 실시예 2 및 3에 제시된 본 발명의 한 양태에서 유용한 예시적 플라스미드를 기술한다. 이들 플라스미드는 본 발명에서 제한되지 않지만, 후 속 실험에서 사용하기 위해 최적화되었다. 다음 DNA 면역원성 조성물은 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 고안하였다. HIV 또는 SIV gag 유전자를 발현하는 DNA 골격 벡터는 HCMV 프로모터, BGH 폴리 A 종결 서열, Co1E1 세균 복제 오리진(ori); 및 선택용 카나마이신 내성 유전자를 사용한다.
A. SIV gag p37 DNA 플라스미드
플라스미드 WLV102는 이에 대한 면역반응이 요망되는 선택된 항원으로서 SIV gag p37을 발현하는 세균 플라스미드이다. 플라스미드 WLV102(4383bp)는 DNA 플라스미드 발현 벡터 WLV001에 삽입되어진 SIV로부터의 RNA 최적화된 절두된 gag 유전자(p37)[참조; Qiu et al, 1999 J. Virol., 73:9145-9152]로 이루어진다. gag 유전자를, 미국 특허 제5,965,726호; 제5,972,596호; 제6,174,666호; 제6,291,664; 및 제6,414,132; 및 국제 특허 공보 제WO01/46408호[이는 본원에서 참조로 인용된다]에 상세히 기술된 기법을 사용하여 억제 서열을 불활성화시킴으로써 RNA 최적화시켜, gag 유전자가 고수준으로 Rev 독립적 발현되도록 하였다.
WLV102 플라스미드 골격은 3개의 유전자 단위로 이루어진다. 제1 유전자 단위는 HCMV 조기 프로모터(immediate early promoter)/인핸서로부터의 유전자 요소[참조: Boshart et al. 1985, 상기 인용됨] 및 BGH 폴리아데닐화 시그날[참조: Goodwin EC and Rottman FM, 1982 J. Biol. Chem. 267: 16330-16334]을 함유하는 진핵생물 유전자 발현 단위이다. gag 유전자는 SalI 및 EcoRI 부위 사이에 클로닝시킨다. 제2 성분은 키메라 카나마이신 내성 유전자 (kmr ) 유전자, 아데닐 4'-뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 1a형[참조: 미국 특허 제5,851,804]이다. 상기 유전자는 제한된 수의 아미노글리코시드에 대한 내성을 부여하기 위해 고안되었으며, 이는 플라스미드를 함유하는 세균을 선별할 수 있도록 한다. 제3 성분은 세균 발효 동안 플라스미드의 증식을 위해 요구되는 ColE1 세균 복제 오리진이다. 당해 플라스미드는 도 1A에 예시되어 있다.
B. 사이토킨 -rIL-12 DNA를 암호화하는 플라스미드
레수스 IL-12 WLV104 플라스미드는 레수스 IL-12의 이종이량체 형태를 발현하는 이중 프로모터 작제물이다. 플라스미드 WLV103는 사람 IL12 단백질 p35 및 p40를 암호화하는 2개의 유전자로 이루어진 이중 프로모터 발현 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 총 6259개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 2개의 인터류킨-12 서브유니트 p35 또는 p40를 함유하는 WLV103 내의 각각의 시스트론은 개별적 조절 요소의 제어하에 있다. p35 서브유닛은 HCMV 프로모터/인핸서의 제어 및 SV40 폴리아데닐화 시그날(SalI 및 MluI 부위 사이에 클로닝됨)하에 있다. p40 서브유닛은 SCMV 프로모터의 제어하에 있으며 BGH 폴리아데닐화 시그날(XhoI 부위로 클로닝됨)을 갖는다.
플라스미드 골격은 몇몇 성분들로 이루어진다. 제1 성분은 HCMV 조기 프로모터/인핸서로부터의 유전자 요소 및 SV 40 폴리아데닐화 시그날[참조; Fitzgerald M and Shenk T., 1981 Cell, 24: 251-260]를 함유하는 진핵생물 유전자 발현 단위이다. 제2 성분은 SCMV 프로모터[참조: Jeang et al. 1987 J. Virol., 61: 1559-1570]와 BGH 폴리아데닐화 시그날로 이루어진 진핵생물 유전자 발현 단위이다. 제3 성분은 키메라 카나마이신 내성 유전자 (kmr ) 유전자, 아데닐 4'-뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 1a형이다. 제4 성분은 세균에서의 플라스미드 증식을 위해 요구되는 ColE1 세균 복제 오리진이다.
생성된 플라스미드 벡터 SIV gag/HIV gag 및 IL-12 DNA는 제한 효소 분해를 이용해 분석하였다. 플라스미드는 DMEM+10% 태아 송아지 혈청(FCS) 배지 및 항생제에서 성장시킨 횡문육종(Rhabdosarcoma) 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 이어서, 상기 세포들을 웨스턴 블롯 분석법에서 HIV gag(ABI)에 대한 특이적 모노클로날 항체 및 SIV gag에 대한 레수스(SIV 감염된 동물로부터의)로부터의 폴리클로날 혈청을 사용하여 바이러스 단백질의 적절한 발현에 대해 분석하였다. IL-12를 p70 단백질을 검출하는 ELISA 키트(제조원: R&D Systems)를 사용하여 상청액 중에서 검출하였다.
플라스미드 벡터를 카나마이신이 보충된 LB 배지에서 성장시킨 형질전환된 DH10B 세포에서 증식시키고, 제조업자의 원안에 따라서 퀴아겐(Qiagen) 키트를 사용하여 정제하였다. 이어서, DNA를 공지된 표준물에 대하여 아가로스 겔에서 전기영동하여 분석하였다.
다음 실험에서 사용하기 위해 각 플라스미드를 0.25% 부피바카인 중의 2.5mg/ml의 농도에서 총 용적 4.0cc로 제형화하였다.
실시예 2: 재조합 VSV 벡터의 제조
A. VSV 게놈 cDNA 클로닝
VSV 게놈 cDNA 조작에 대한 유전학적 배경은 pVSV-XN1이다[참조: Schnell, M. J., et al 1996 J. Virol., 70:2318-23]. 상기 클론은 VSV 인디아나 균주(VSVi) cDNA 서열의 변형된 형태를 함유한다. 변형은 2개의 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(XhoI 및 NheI)의 첨가 및 첨가된 VSV 유전자-개시 및 VSV 유전자-종결 시그날 카피를 포함한다. HIV-189.6p env gp160 또는 SIV gag p55 또는 HIV-1 gag와 같은 외래 유전자가 편의상 XhoI 및 NheI 부위 사이에 삽입되면, 이들 외래 유전자는 VSV 전사 제어 시그날에 의해 제어되는 발현에 적합한 위치에 존재한다. 또한, VSV cDNA 서열은 살아있는 바이러스 복사체의 구제를 촉진하는데 요구되는 시스(cis)-작용 DNA 서열에 의해 플랭킹되어 있다. T7 RNA 폴리머라제 프로모터는 바이러스 cDNA를 가로지르는 1차 전사체의 전사를 지시한다. 리보자임은 T7 RNA 폴리머라제가 전사를 종결시킨 후에 1차 전사체를 절단하여 RNA 게놈의 말단을 형성한다.
먼저, gag 유전자(HIV Clade B)를 G 및 L 유전자 사이에 삽입시킴에 의해 rVSVi 게놈 클론(pVSV-XN1)을 변형시켜 플라스미드 prVSVi-gag를 제조하였다. 마찬가지로, HIV env 유전자(게놈 클론 prVSVi-env)를 함유하는 별도의 rVSVi cDNA 클론을 제조하였다. HIV HXBc2 gag 유전자 또는 HIV 6101 균주 env 유전자를 함유하는 플라스미드 주형으로부터 암호화 영역 서열을 증폭시켜, pVSV-XN1내로 삽입하기 위한 gag 및 env cDNA 서열을 제조하였다. PCR 증폭용으로 사용된 프라이머는 후속적 클로닝에 적절한 말단 제한 효소 절단 부위를 함유하며; 5' 프라이머는 XhoI 부위를 함유하고, 3' 플라이머는 NheI 부위를 함유하였다. 증폭된 암호화 영역 서열을 pVSV-XN1내에 별도로 삽입시켜, gag를 함유하는 클론과 env를 함유하는 클론을 생성시켰다.
pVSV-XN1내로 삽입되어진 env 유전자는 HIV Env/VSV G 융합 단백질을 암호화 하는 변형된 형태였다. rVSV-HIV Env 벡터로 감염시킨 후 Env의 세포 표면 발현은, Env의 세포질 테일(tail)을 중복 PCR 과정을 사용하여 VSV G 단백질의 보다 짧은 세포질 테일로 대체시킨 경우에 증진되는 것으로 나타났다[참조: Johnson, et al, 1998 상기 인용됨; Johnson et al., 1997, 상기 인용됨]. 이들 2개의 플라스미드의 벡터 골격은 공개된 기법에 따라서 인디아나 G 유전자를 칸디푸라 또는 뉴저지 혈청형의 유전자로 변화시켜 변경하였다. G 유전자 교환은 M 유전자내 고유한 MluI 부위 및 VSV cDNA 클론내에서 조작된 XhoI 부위를 사용하여 달성하였다.
칸디푸라 균주 또는 뉴저지 균주로부터의 VSV G 유전자 암호화 서열을 M 유전자 내에서 MluI 부위를 가로질러 신장되는 5' 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. G 유전자의 3' 말단에 상동인 서열 뿐만 아니라, 유전자-말단/유전자-개시 시그날에 상응하는 추가의 서열 및 XhoI 부위를 함유하는 3' PCR 프라이머를 사용하였다. 본래의 인디아나 G 유전자를 MluI 및 XhoI를 사용하여 플라스미드 골격으로부터 절단해낸 후에 상기 프라이머들로 증폭시킨 G 유전자 암호화 서열을 본래 인디아 G 유전자를 대체하는데 사용하였다.
B. cDNA 클론으로부터 rVSV의 구제
게놈 cDNA 플라스미드 또는 게놈 cDNA 플라스미드로부터 전사된 RNA는 세포로 도입되어진 후에 바이러스 복제 사이클을 개시하는데 충분하지 않았다. 바이러스 게놈 RNA는 그 자체로는 해독 또는 복제를 위한 활성적 주형이 아니었다. 따라서, 재조합 바이러스가 다양한 VSV 게놈 cDNA 작제물로부터 회수되어야 한다. 당해 분야에 공지된 구제 과정은 클로닝된 DNA로부터 바이러스를 회수할 수 있도록 한다. 성공적 바이러스 구제는, VSV 게놈 RNA가 바이러스 게놈 RNA를 둘러싸는 VSV N 단백질뿐만 아니라 바이러스 mRNA 합성과 게놈 복제를 위해 필요한 바이러스 RNA-의존적 RNA 폴리머라제를 형성하는 P 및 L 단백질과 함께 세포내에 존재하는 것을 필요로 하였다. 배양된 세포내에서 이러한 모든 바이러스 성분들의 생산은 VSV 게놈 cDNA에 대한 플라스미드와 VSV N, P 및 L 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드를 공동 형질감염시킴으로써 달성되었다.
이러한 모든 플라스미드는 파지 폴리머라제 T7 RNA에 의한 전사용으로 고안되었다; 따라서, 형질감염된 세포를 파지 폴리머라제(MVA/T7 또는 VTF7-3)를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스로 또한 감염시켰다. VSV 구제를 위해 사용되는 표준 과정은 문헌[참조: Lawson et al. 1995, 상기 인용됨; 및 Schnell et al., 1996 J. Virol., 70:2318-23]에 기재되어 있다. 이 과정을 고도로 약독화된 바이러스의 구제에 보다 효율적이고 또한 당해 과정이 규제 기관 가이드라인에 부합되도록 변형시켰다. 간략하게 언급하면, 당해 방법은 다음과 같이 기술된다.
12.5 cm2 플라스크내의 적격의 Vero 세포를 인산칼슘 형질감염 과정을 사용하여 rVSV 게놈 클론 및 VSV N, P 및 L을 암호화하는 지지된 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염을 개시할 때에, 충분한 공인된 MVA/T7를 첨가하여 세포당 2 플라크-형성 단위의 감염다중도를 제공하였다. 형질감염 개시 3시간 후, 세포를 3시간 열 쇼크 단계에 적용시켜 몇몇 네가티브 쇄 RNA 바이러스의 구제 효율을 개선시켰다[참조: Parks, C. L. et al, 1999 J. Virol., 73:3560-6]. 형질감염 48 내지 72시간 후, 세포 및 배양 배지를 Vero 세포의 확립된 단층을 함유하는 보다 큰 플라스크를 옮긴 다음, 1일 이상 항온처리하여 구제된 바이러스가 증폭되게 하였다. 이러한 증폭 단계 후에 수거된 바이러스를 여과하여 가장 오염성인 MVA/T7을 제거하고 rVSV 균주의 클론성 분리를 위해 사용하였다.
바이러스 게놈 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 컨센서스(consensus) 서열분석 방법에 의해 결정하여 RNA 바이러스 게놈을 분석하였다. 간략하게 언급하면, 정제된 바이러스 RNA를 역전사시켜 cDNA를 생성시킨 다음, 게놈의 중복 영역을 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR 생성물을 겔 정제한 다음, 형광 염료-종결자를 사용하여 사이클-서열분석하였다. 서열분석 반응 생성물을 정제하고 자동화 서열기에서 분석하였다.
C. 실시예에서 사용된 특이적 작제물
다음 실험에서 사용된 특이적 재조합 VSV 벡터를 제조하기 위해, VSV G 단백질의 트랜스막 영역에 융합된 HIV-1 89.6P gp160(rVSV HIV-1envG) 및 SIVmac239 gag p55(rVSV SIVgag)를 발현하는 재조합 VSV를 혼합하고 실험군 면역원성 조성물로서 사용하였다. 인플루엔자 적혈구응집소 단백질을 암호화하는 rVSV(rVSV fluHA)는 대조군 조성물로서 사용하였다. 재조합 VSV 벡터는 VSV G 및 L 전사 단위 사이에 삽입된 목적하는 항원을 암호화하는 유전자를 사용하여 이미 기술된 바와 같이 제조하였다[참조: Rose et al, 2000 J. Virol. 74:10903-10]. 다음 작제는 문헌[참조: Rose et al, supra]에 기재되어 있다.
1. 플라스미드 작제
칸디푸라 당단백질[G(Ch)] 유전자를 함유하는 플라스미드[참조: Masters, P. S., 1989 Virol., 171:285-290]는 친절하게도 아미야 박사(Amiya Banerjee, Cleveland Clinic)에 의해 제공되었다. 인디아나 당단백질 [G(I)] 유전자 대신에 G(Ch) 유전자를 함유하는 VSV 벡터를 작제하기 위해, 먼저 XhoI 부위를, 상보적 프라이머 5'-CCCCTAGTGGGATCTCCAGTGATATTTGGAC(서열번호 2) 및 5'-GTCCAAATATCACTGGAGATCCCACTAGGGG (서열번호 3)와 Stratagene QuikChange 돌연변이유발 키트를 사용한 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발을 사용하여 G(Ch) 유전자내에서 제거해냈다. CTCGAG(서열번호 4)의 CTCCAG(서열번호 5)로의 돌연변이는 G(Ch) 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 XhoI 부위를 제거하였다. 이어서, 유전자를 Vent DNA 폴리머라제(제조원: New England Biolabs)을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 정방향 프라이머는 G(Ch) 단백질에 대한 ATG 개시 코돈의 하류에 있는 MluI 부위(밑줄친 부분)를 함유하는 5'-GATCGATCGAATTCACGCGTAACATGACTTCTTCAG(서열번호 6)였다. 역방향 프라이머는 5'-GAACGGTCGACGCGCCTCGAGCGTGATATCTGTTAGTTTTTTTCATATCATGTTGTTGGGCTTGAAGATC(서열번호 7)였으며 G(Ch)의 3' 암호화 서열의 상보체 다음에 있는 VSV 전사 개시 및 종결 시그날(밑줄친 부분) 다음에 SalI 및 XhoI 부위(굵은 글씨)를 함유하였다.
PCR 산물을 MluI 및 SalI로 분해시키고, MluI 및 XhoI로 분해시켜 VSV G(I) 암호화 서열을 제거한(SalI 및 XhoI는 연결에 적합한 말단을 남긴다) pVSVXN-1 벡터로 클로닝시켰다[참조: Schnell, et al 1996 J. Virol. 70:2318-2323] 이러한 방법으로 유도된 플라스미드를 pVSV(GCh)XN-1이라 명명하였으며 이는 G(Ch) 유전자와 L 유전자 사이의 고유한 XhoI 및 NheI 부위에 의해 플랭킹된 외래 유전자 발현 부위를 함유한다.
상기 기술한 바와 동일한 과정을 사용하여, 플라스미드 pNJG로부터 G(NJ) 단백질 유전자를 함유하는 벡터를 생성시켰다[참조: Gallione, C. J., and J. K. Rose. 1983 J. Virol. 46:162-169]. 정방향 프라이머는 5'-GATCGATCGAA TTCACGCGTAATATGTTGTCTTATCTAATCTTTGC (서열번호 8)였으며, 역방향 프라이머는 5'-GGAACGGTCGACGCGCCTCGAGCGTGATATCTGTTAGTTTTTTTCATATTAACGGAAATGAGCCATTTCCACG(서열번호 9)였다. 굵은 글씨로 표시된 부위 및 밑줄친 서열은 상기한 칸디푸라 작제물에 대한 것이고, 후속적 클로닝 단계도 또한 상기한 바와 같다. 유도된 마지막 벡터 플라스미드는 pVSV(GNJ)XN-1이라 명명하였으며, 이는 G(NJ) 유전자와 VSV L 유전자 사이에 고유한 XhoI 및 NheI 부위에 의해 플랭킹된 외래 유전자 발현 부위를 함유한다.
HIV Env 89.6 G 유전자를 함유하는 벡터를 생성시키기 위해, VSV G 세포질 테일을 갖는 89.6 외피 단백질을 암호화하는 유전자를 XhoI 및 NheI를 사용하여pVSV-89.6gp160G로부터 절단해내고[참조: Johnson et al 1997, 상기 인용됨] 벡터 pVSV(GNJ)XN-1 또는 pVSV(GCh)XN-1내의 XhoI 및 NheI 부위 사이에 클로닝시켰다. 상기 gp160G 유전자는 모든 gp120 및 gp41의 막외부 및 트랜스막 도메인을 암호화며, 서열 I-H-L-C(서열번호 11)로 시작하는 VSV G 세포질 도메인의 26개 C-말단 아미노산에 융합된 89.6 Env 세포질 도메인의 4개의 아미노산(N-R-V-R)(서열번호 10)을 갖는다.
2. 재조합 바이러스의 회수
재조합 VSV는 확립된 방법[참조: Lawson et al 1995, 상기 인용됨]을 사용하여 회수하였다. 간략하게 언급하면, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포를 10-cm 접시에서 약 60% 컨플루언시(confluency)까지 성장시켰다. 이어서, 상기 세포를 10의 감염다중도(MOI)에서 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스인 vTF7-3로 감염시켰다[참조: Fuerst et al 1987 Mol. Cell. Biol. 7:2538-2544]. 1시간 후, 각 세포의 접시를 pBS-N 3㎍ , pBS-P 5㎍, pBS-L 1㎍, 및 상기한 바와 같은 3개의 전체길이 재조합체들 중 하나를 암호화하는 플라스미드 10㎍로 형질감염시켰다. 형질감염은 디메틸디옥타데실 암모늄 브로마이드 및 디올레일-포스파티딜에탄올아민을 함유한 양이온성 리포좀 시약을 사용하여 수행하였다[참조: Rose et al, 1991 Biotechniques 10:520-525]. 이어서, 세포를 38℃에서 48시간 동안 항온처리하였다. 세포 상청액을 0.2-㎛ 필터를 통해 통과시켜 대다수의 백시니아 바이러스를 제거한 다음, 37℃에서 48시간 동안 신선한 BHK 세포에 적용시켰다. 일부 회수물에 대해서는 VSV G(pBS-G)를 암호화하는 추가의 플라스미드, 4㎍/플레이트를 N, P 및 L 지지 플라스미드와 함께 포함시켰다. 감염성 바이러스의 회수를 VSV 세포변성 효과에 대해서 BHK 세포 단층을 스캐닝하여 확인하였다. 이어서, 바이러스 플라크를 BHK 세포에서 분리시키고, 단일 플라크로부터의 바이러스를 BHK 세포의 10-cm 직경 플레이트에 첨가하여 개개의 플라크로부터의 바이러스 스톡을 증식시켰다. 이어서, 상기 스톡을 80℃에서 저장하였다. VSV(GI)-89.6G, VSV(GCh)-89.6G 및 VSV(GNJ)-89.6G에 대해 수득된 역가는 VSV 역가를 약 3배 감소시키는 과정인 동결 및 해동 후에 모두 107 내지 108 PFU/ml의 범위내에 있다.
다음 실험에서 사용하기 위해 각 VSV 작제물을 멸균 DME로 0.8cc의 최종 용적까지 희석시켰다.
실시예 3: 프라임/부스트 면역화 요법
A. 면역화 프로토콜
레수스 마카크(그룹당 5마리)는 레수스 IL-12 p35 및 IL-12 p40를 암호화하는 이시스트론성 DNA 플라스미드 5mg 또는 SIV gag p37 폴리단백질(그룹 1 및 2) 또는 공 DNA 플라스미드(그룹 3 및 4) 10mg과 함께 근육내 주사하여 면역화시켰다. 모든 이들 DNA 플라스미드 및 이의 제형은 실시예 1에서 상세히 기술한 바와 같다. DNA 면역화 스케쥴은 0일째의 초기 면역화 다음에 4주째 및 8주째에서의 제2 부스터 면역화를 제공한다. 바늘과 주사기를 사용하여 삼각근 및 대퇴사두근의 네 부위에 부위당 1cc씩 주사하였다.
이어서, 마카크를 15주째에, HIV-1 gp160 env 유전자를 함유하는 실시예 2의 혈청형 인디아나(I)의 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)계 벡터(5 x 106 pfu) 및 SIVgag p55 유전자를 함유하는 제2 rVSV(I)(5 x 106 pfu)(그룹 2 및 3), 또는 인플루엔자 적혈구응집소 유전자를 함유하는 rVSV(I)(1x 107 pfu)(그룹 1 및 4)로 비내 접종(0.4cc/비공, 소형 피펫터를 이용함)하여 면역화시켰다. 마카크를 다시 HIV-1 gp160 env 유전자를 함유하는 실시예 2의 rVSV(혈청형 칸디푸라, Ch)계 벡터(5 x 106 pfu) 및 SIVgag p55 유전자를 함유하는 제2 rVSV(Ch)(5 x 106 pfu)(그룹 2 및 3), 또는 인플루엔자 적혈구응집소 유전자를 함유하는 rVSV(Ch)(1x 107 pfu) (그룹 1 및 4)로 비내 접종(0.4cc/비공, 소형 피펫터를 이용함)하여 부스팅시켰다.
마카크를 말초혈에서의 세포성 및 체액성 면역반응의 유도 및 다양한 점막 표면에서의 항체반응에 대해 자세히 모니터링하였다. 이러한 모니터링은 감마 인터페론에 대한 SIV gag p55 펩타이드 풀(pool)의 효소 연계 면역스팟(enzyme-linked immunospto) 분석법(ELISpot), 감마 인터페론에 대한 HIV-1 env 6101 펩타 이드 풀의 ELISpot 및 감마 인터페론에 대한 VSV N 펩타이드 풀의 ELISpot의 수행을 포함한다. ELISpot 분석으로 PBL에서의 세포성 면역반응이 검출되었다.
체액성 면역반응은 ELISA에 의한 항-SIV gag p27 IgG 역가 및 ELISA에 의한 항-HIV-1gp160 env 역가 ELISA(데이타는 제시하지 않음)에 대해 혈청(도 4), 비강 세척액, 직장 분비물 및 타액(데이타는 제시하지 않음)을 평가함으로써 검사한다. 혈청의 경우, ELISA에서 사용된 항체는 키메라 바이러스 SHIV89.6 및 SHIV89에 대한 표준 항체였다.
B. 사이토킨-분비성 쥐 및 사람 세포를 검출하기 위한 ELISpot 분석법
먼저, 개개의 항체-분비성 B 세포를 검출하고 정량하기 위해 다르게는 효소 연계 면역스팟 분석법(ELISpot)라 불리는 필터 면역플라크 분석법을 개발하였다. 당해 기법은 본래는 통상의 플라크-형성 세포 분석법에 대한 신속하고 다목적의 대안을 제공하였다. 최근의 변형은 초당 특정 단백질 분자를 100개만큼 적은 수로 생산하는 세포가 검출될 있는 정도로 ELISpot 분석법의 감도를 개선시켰다. 이러한 분석법은 단백질-분비성 세포에 바로 인접한 환경에서 비교적 높은 농도의 소정의 단백질(예: 사이토킨)을 사용한다. 이들 세포 산물은 고친화성 항체를 사용하여 포획하고 검출한다.
ELISpot 분석법은 동일한 사이토킨 분자상의 상이한 에피토프에 대해 지시된, 다음과 같은 2개의 고친화성 사이토킨-특이적 항체를 사용한다: 2개의 모노클로날 항체 또는 1개의 모노클로날 항체와 1개의 다가 항혈청의 배합물. ELISpot은 단일 세포에 의해 분비되는 사이토킨을 검출하는 비색 반응에 기초하여 스팟을 생 성한다. 스팟은 본래 사이토킨-생산 항체의 "족적(footprint)"을 나타낸다. 스팟(즉, 스팟 형성 세포 또는 SFC)는 영구적이며 가시적으로, 현미경으로 또는 전자적으로 정량할 수 있다.
ELISpot 분석법을 다음과 같이 수행하였다: 96웰 평저 ELISpot 플레이트(제조원: Millipore, Bedford, MA)를 마우스 항-사람 γ인터페론(hIFN-ν모노클로날 항체(클론 27, BD-Pharmingen, San Diego CA)로 1㎍/mL의 농도에서 밤새 피복하고, 0.25% Tween-20이 보충된 1x PBS로 10회 세척하고, 5% 태아 송아지 혈청(FBS)을 함유하는 PBS로 2시간 동안 차단시켰다. 레수스 마카크 말초혈 림프구(PBL)를 갓 수거한 헤파린화 전혈로부터 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리에 의해 분리시키고, 50㎍/mL PHA-M(Sigma), 전체 SIV gag 오픈 리딩 프레임에 걸쳐있는 11개 아미노산에 의해 중복되는 15개 아미노산 펩타이드의 풀(1μM 최종 펩타이드 농도) 또는 단독 배지를 함유하는 완전 배양 배지(5% FCS, 2 mM L-글루타민, 100단위/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신 설페이트, 1 mM 나트륨 피루베이트, 1 mM HEPES, 100μM 비필수 아미노산이 보충된 RPMI 1640 배지)에 재현탁시켰다.
주입 세포 수는 100㎕ 중의 2 x 105 PBL/웰이었으며 이중 웰에서 분석하였다. 세포를 37℃에서 16시간 동안 항온처리한 다음, 먼저 탈이온수로 세척하고 이어서 0.25% Tween-20을 함유한 1x PBS로 10회 세척하여 플레이트로부터 제거하였다. 이어서, 플레이트를 1% BSA를 함유하는 1x PBS로 희석된 래빗 폴리클로날 항-hIFN-γ 바이오티닐화 검출기 항체(0.2㎍/웰, 제조원: Biosource, Camarillo, CA)로 처리하고 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 플레이트를 0.25% Tween-20를 함유하는 1x PBS로 세척하고, 웰당 5% FBS 및 0.005% Tween-20을 함유하는 1x PBS로 1:500으로 희석된 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제 접합체 100㎕(제조원: Southern Biotech, Birmingham AL)로 처리하고, 실온에서 추가로 2.5시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 0.25% Tween-20를 함유하는 1x PBS로 10회 세정하여 미결합된 접합체를 제거하였다. 이어서, 발색성 기질(100㎕/웰, 1-단계 NBT/BCIP, 제조원: Pierce, Rockford, IL)을 3 내지 5분 동안 첨가하고, 물로 세정하고, 플레이트를 공기 건조시키고, 수득된 스팟을 도립 해부 현미경을 사용하여 육안으로 계수하였다.
본 발명에 따라서 ELISpot 분석법을 수행하여, 감마 인터페론의 생산량으로 측정한 바에 의해 본 발명의 프라임/부스트 면역화 방법에 대해 반응하여 유도된 CD8+ T 세포(CTL) 및 CD4+ T 세포의 수를 측정하였다. 이러한 평가는 상기 처리된 마카크에 대해 25주에 걸쳐서 수행하였다(3회의 DNA 프라임 및 2회의 VSV 부스트).
C. 결과
1차 DNA 면역화 후, SIVgag-특이적 IFN-νELISpot 반응은 10마리의 SIV gag/rIL-12 DNA 면역화된 마카크에서 용이하게 검출되었다(평균 254 SFC/106개 세포). 2차 SIV gag/IL-12 DNA 면역화 후, 10마리의 면역화된 마카크 중 10마리에서 고수준의 ELISpot 반응(평균 1133 SFC/106 세포)이 나타났으며, gag/IL-12 DNA의 3차 투여는 대다수의 동물에서 gag-특이적 ELISpot 반응을 부스팅시켰다(평균 1506 SFC/106 세포). 1차 rVSV HIVenv/rVSV SIVgag 부스트 후, 평균 SIV gag ELISpot 반응은 오직 단일 rVSV HIVenv/rVSV SIVgag 면역화만을 받은 반응(평균 386 SFC/106 세포)보다 현저하게 높았다(3772 SFC/106 세포). 이러한 결과는 사이토킨의 사용이 DNA 프라임을 증진시켜 rVSV 면역화의 면역원성을 증대시켰다는 사실을 뒷받침한다.
이러한 결과는 하기 표 1 및 도 2, 3, 4 및 5에 보고되어 있다. 도 2는 25주 후에 면역화된 이들 동물로부터의 비분획화 말초혈 단핵구(PBMC)에서의 rVSV N-특이적 IFN-νELISpot 반응을 도시한 것이다. 도 3은 동일한 샘플에 대한 HIVenv 6101-특이적 IFN-νELISpot 반응을 도시한 것이다. *는 p=0-.0001에서 발생한 통계학적 유의차를 나타낸다. 도 4는 ELISA에 의한 항-SIV gag p27 IgG 역가 및 ELISA에 의한 항-HIV-1gp160 env 역가를 측정한 경우의 혈청 항체 반응의 결과를 도시한 것이다. SIV gag 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드와 flu HA 단백질을 발현하는 VSV 벡터의 부스트에 의한 면역화 프로토콜은 (◆)로 나타낸다. 프라이밍 DNA gag 플라스미드 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV 부스트를 포함하는 본 발명의 프로토콜은 (■)로 나타낸다. 공 대조 DNA에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화는 (▲)로 나타낸다. 대조 DNA 플라스미드에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 flu HA 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜은 (●)로 나타낸다. 각 그룹은 5마리의 동물로부터의 결과를 나타낸다. 그룹들 간의 통계학적 유의차는 p=0.0073 (*); p=0.5941 (#) 또는 p=0.0027(￥)로서 제시한다.
도 5는 동일한 샘플에 대한 평균 SIV gag-특이적 IFN-γELISpot 반응을 도시한 것이다. SIV gag 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드와 flu HA 단백질을 암호화하는 벡터의 부스트에 의한 면역화 프로토콜은 (◆)로 나타낸다. 프라이밍 DNA gag 플라스미드 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV 부스트를 포함하는 본 발명의 프로토콜은 (■)로 나타낸다. 공 대조 DNA에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 HIV gag 및 env 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화는 (▲)로 나타낸다. (●)는 대조 DNA 플라스미드에 의한 프라이밍 면역화에 이어서 flu HA 단백질을 발현하는 VSV에 의한 면역화를 포함하는 프로토콜을 나타낸다. 각 그룹은 5마리의 동물로부터의 결과를 나타낸다. 그룹들 간의 통계학적 유의차는 p=0.0001 및 p=0.0002에 대해 괄호로 표시한다.
표 1에는 동일한 결과가 표 형태로 보고되어 있다.
SIV gag/레수스 IL-12 DNA 프라임 및 rVSV-SIVgag/rVSV-HIVenv 부스트 후의 레수스 마카크에서의 평균 SIV gag-특이적 IFN-감마 ELISpot 반응
그룹
프로토콜 번호/동물 수
프라임		 부스트 평균 SIV gag-특이적 IFNγ ELISpot 반응
(#SFC/106 PBL)a
1, 프라임 단독 (n=5) SIVgag/
IL-12 DNA		 VSV FluHA 471
2, 프라임/부스트 (n=5) SIVgag/
IL-12 DNA		 VSV-SIVgag/
HIVenv		 2,338
3, 부스트 단독(n=5) 공 DNA VSV-SIVgag/
HIVenv		 420
4, 대조군(n=5) 공 DNA VSV FluHA 55
a 평균 SIV gag-특이적 ELISpot 반응은 초기 DNA 면역화 후 25주째에 보고된다.
이러한 분석법의 결과는 다수의 프라이밍 조성물만을 투여한 결과 및 다수의 부스팅 조성물만을 투여한 결과와 비교하여 본 발명의 프라임/부스트 요법의 놀라운 상승작용 효과를 입증한다. DNA 플라스미드에 이어서 rVSV 부스트에 의한, 조합된 목적하는 항원 제시는 면역화된 피험체에서 항원-특이적 T 세포의 증가를 야기하는데, 이러한 증가는 임의의 부가적 반응을 상당히 초과하는 것이다. 마찬가지로, 목적하는 항원에 대한 체액성 반응의 증가는 면역화 프로토콜에서 DNA 플라스미드와 rVSV 면역원성 조성물을 둘다 사용한 경우에 예상밖으로 높다. 예를 들어, 하기 표 1과 도 4 및 5를 참조한다.
실시예 4: HIV에 대한 면역화용 마카크 모델
레수스(Rh) 마카크를 실시예 3의 프라임/부스트 전략 및 실시예 3에 기술된 플라스미드와 VSV 벡터를 사용하여 동일한 프로토콜에 따라서 면역화시킨다. 제1 프라이밍 조성물을 투여한지 약 32주 후, 마카크에게 병원성 SIV/HIV 재조합 바이러스 SHIV89.6P를 50% 원숭이 감염량(MID50) 330의 용량으로 시험감염시켰다[참조: Reimann et al, 1996 J. Virol., 70:3198-3206; Reimann et al 1996 J. Virol ., 70:6922-6928].
시험감염 약 50 내지 70일 후, 동물을 질환에 대해 모니터링한다. 동물을 각각의 면역화 직전 및 1주 및 2주 후에 세포 매개성 반응 및 항체 반응의 유도에 대해 모니터링한다. 시험감염 전 및 시험감염 2주, 4주, 6주, 8주 및 12주 후에 수집한 혈청을 HIV-1 89.6, 89.6P, 6101 및 다른 클레이드 B 1차 분리체에 대한 중화 항체 반응에 대해 시험한다. 실험 중 면역화 기간 동안, 시험감염 직전 및 시험감 후 매 2주마다, CD4/CD8 계수를 모니터링한다. 시험감염 직전 및 시험감염 후 매주, 혈청중 바이러스 부하량을 분기 DNA 분석으로 측정한다. 동물의 다른 체액(질, 직장 및 비강 분비물 및 타액)을 세포성 및 체액성 면역반응에 대해 검사한다.
목적하는 항원에 대한 세포 매개성 면역반응을 51Cr-방출 CTL 분석법, 가용성 MHC I형 사량체 염색, ELISpot 분석법 및 세포내 사이토킨 분석법을 포함하는 가장 적절한 세포 기본 분석법 중 몇가지를 사용하여 분석한다. 점막 항체 반응은 점막 샘플과의 사용을 위해 최적화된 ELISA 기법으로 평가한다. 혈청 항체 반응은 표준 ELISA 기법으로 평가한다. 또한, 모든 면역화된 동물로부터의 혈청을 HIV Env 6101 및 다른 1차 클레이드 B 분리체에 대한 중화 항체 반응에 대해 검사한다. 도 6은 시험감염 후 적어도 250일째에 감소된 CD4 T-세포 손실로 측정한 바와 같이, 본 발명의 프라임/부스트 병용으로 유도된 상승된 면역반응이 AIDS로부터의 보호를 증가시켰음을 예시한 것이다.
당해 면역원성 조성물로 유도된 면역반응을 모니터링하는 것 이외에, 간 바이러스 벡터의 전파 잠재성을 이것이 방출되는 수준 및 방출되는 기간을 측정함으로써 평가한다. 각각의 면역화 후 처음 3주 동안 빈번한 간격으로 수득된 비강 세척액을 살아있는 VSV의 존재에 대해 시험한다. 혈장 바이러스 부하량도 또한 살아있는 바이러스 카피의 존재에 대해 검사한다. 도 7은 당해 프라임/부스트 병용으로 유도된 상승된 면역반응이 시험감염 후 적어도 250일째에 혈장중 순환 바이러스를 감소시켰음을 입증한다.
상기 실험의 결과는 대조군 동물과 달리, 본 발명에 따라서 면역화된 동물에서는 항원 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포가 매우 높을 가능성이 크다는 것이다. 본 발명의 프라임/부스트 방법론에 따라 면역화된 동물은 HIV 노출 후에도 건강한 상태를 유지하는 반면에, 면역화되지 않은 동물에서는 AIDS가 발병할 것으로 예상된다.
당해 프로토콜과 다른 공지된 프라임/부스트 방법론과의 비교는 본 발명의 방법이 면역화된 동물에 대한 안전성 및 단독의 하나 또는 다수의 DNA 프라이밍 조성물 면역화 또는 단독의 하나 또는 다수의 rVSV 벡터 면역화에 의해 제공된 것보다 높은 수준의 항-HIV CTL 및 항체를 유도한다는 점에서 유리함을 입증할 것으로 예상된다. 본 발명에 따른 반복적 프라임/부스트는 상승작용적이며 따라서 미리 노출된 피험체에게는 예방학적으로 유리하고 HIV로 이미 감염된 피험체에게는 치료학적으로 유리할 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 본원에서 참조로 인용된다. 당해 방법 및 조성물에서의 다양한 변형 및 약간의 변화는 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것으로 사료된다.
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Claims (45)

  1. (a) 항원을 암호화하는 DNA 서열을, DNA 플라스미드에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 제1 조성물; 및
    (b) 상기 항원을 암호화하는 핵산 서열을, 재조합 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus;VSV)에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 재조합 VSV를 포함하는 제2 조성물
    을 포함하는, 포유동물 피험체에서 항원-특이적 면역반응을 유도하기 위한 의약.
  2. 제1항에 있어서, VSV가 복제 적격성 또는 비-복제성인 의약.
  3. 제1항에 있어서, 사이토킨 조성물을 추가로 포함하는 의약.
  4. 제3항에 있어서, 사이토킨 조성물이, (i) 사이토킨을 암호화하는 DNA 서열을, DNA 플라스미드에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 핵산 조성물 또는 (ii) 단백질인 의약.
  5. 제4항에 있어서, 사이토킨이 IL-12, IL-15, GM-CSF 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 의약.
  6. 제4항에 있어서, 사이토킨 암호화 서열이 항원 암호화 서열과 동일한 DNA 플라스미드상에 존재하거나 상기 항원을 암호화하는 DNA 플라스미드와 상이한 DNA 플라스미드상에 존재하는 의약.
  7. 제1항에 있어서, 항원이 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 이의 단편 또는 융합체이고, 이때 상기 단백질이 세균, 바이러스, 진균, 기생충, 암세포, 종양 세포, 알레르겐 및 자가 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 구성원으로부터 유래되는 의약.
  8. 제7항에 있어서, 항원이 gag, pol, env, nef, vpr, vpu, vif 및 tat, 및 이들의 면역원성 단편 또는 융합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 또는 원숭이 면역결핍 바이러스 항원인 의약.
  9. 제1항에 있어서, 제1 조성물이 (i) 동일하거나 상이한 항원의 카피 1개 이상을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 하나의 DNA 플라스미드 또는 (ii) 각각의 DNA 플라스미드가 동일하거나 상이한 항원을 암호화하는 1개 이상의 DNA 플라스미드를 포함하는 의약.
  10. 제1항에 있어서, 면역반응이 (i) DNA 플라스미드 또는 재조합 VSV를 단독으로 투여함으로써 달성되는 것보다 큰, 당해 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응의 증가 또는 (ii) 제1 또는 제2 조성물을 단독으로 투여함으로써 달성되는 것보다 큰, 당해 항원에 대한 항체 반응의 상승작용적 증가를 포함하는 의약.
  11. 제1항에 있어서, 제2 조성물이 2종 이상의 재조합 VSV를 포함하는 의약.
  12. 제11항에 있어서, 각각의 재조합 VSV가 (i) 상이한 VSV G 단백질 및 상이한 VSV 혈청형을 갖지만, 동일한 항원 암호화 서열을 갖거나, (ii) 상이한 항원 암호화 서열을 갖지만, 동일한 VSV G 단백질을 갖거나, (iii) 상이한 항원 암호화 서열 및 상이한 VSV G 단백질을 갖는 의약.
  13. (a) 항원을 암호화하는 DNA 서열을, DNA 플라스미드에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 제1 조성물; 및
    (b) 상기 항원을 암호화하는 핵산 서열을, 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 하나 이상의 재조합 VSV
    를 포함하는, 포유동물 피험체에서 상기 항원에 대한 항원-특이적 면역반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물.
  14. 제13항에 있어서, VSV가 복제 적격성 또는 비-복제성인 면역원성 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 사이토킨 조성물을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 사이토킨 조성물이, 상기 사이토킨을 암호화하는 DNA 서열을, DNA 플라스미드에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 핵산 조성물을 포함하는 면역원성 조성물.
  17. 항원을 암호화하는 DNA 서열을, DNA 플라스미드에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 하나 이상의 제1 조성물;
    상기 항원을 암호화하는 핵산 서열을, 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 재조합 VSV를 포함하는 하나 이상의 제2 조성물; 및
    포유동물 피험체에서 항원-특이적 면역반응을 유도하는 방법의 실시에 관한 지침
    을 포함하는 키트.
  18. 제17항에 있어서, VSV가 복제 적격성 또는 비-복제성인 키트.
  19. 제17항에 있어서, 사이토킨 조성물을 추가로 포함하는 키트.
  20. 제19항에 있어서, 사이토킨 조성물이, 상기 사이토킨을 암호화하는 DNA 서열을, DNA 플라스미드에 의한 이의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 핵산 조성물을 포함하는 키트.
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Cell Vol.106(5):539-549 (2001. 9. 7.)

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