PT1605971E - COMPOSIÆO IMUNOGéNICA E MéTODOS - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO IMUNOGÉNICA E MÉTODOS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Para aumentar a eficácia das composições imunogénicas têm sido descritos variadas composições e método imunogénicos utilizando composições proteicas, composições à base de plasmídeos e construções de vírus recombinantes como composições imunogénicas. Estudos anteriores demonstraram que as composições imunogénicas à base de plasmídeos, no caso de aplicação sistémica, estimulam o sistema imunitário sistémico para uma segunda imunização sistémica com um antigénio tradicional, tal como uma proteína ou um vírus recombinante (ver, por exemplo, Xiang et al., 1997 Springer Semin. Immunopathol, 19:257-268;

Schneider, J. et al, 1998 Nature Med., 4:397; e Sedeguh, M. et al. , 1998 Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 95:7648; Rogers, W. 0. et al, Infec. & Immun., 69 (9) :5565-72; Eo, S. K., et al, 2001 J. Immunol., 166 (9) :5473-9; Ramshaw I. A. e Ramsay, A. J., 2000 Immunol. Today, 21(4): 163- -5). Para uma consulta dos sistemas de administração de vacina conhecidos, relativamente ao HIVc ver Sutter et al. , 2001 AIDS 15(supplement 5): S139-S145.

Um regime de reforço com inoculação inicial com ADN/vector vivo frequentemente empregue envolve vírus vaccínia para o reforço. Exemplos na literatura recente incluem a imunização contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV) (Hanke T. et al, 2002 Vaccine. 20( 15):1995-8; Amara R.R. et al, 2002 Vaccine. 20(15): 1949-55; Wee E.G. et al, J. Gen. Virol., 83 (Pt 1) :75-80; Amara R.R. et al, 2 2 com dose vaccinia tais como a antigénio de de Plasmodium antigénios da têm sido especificas Meseda C.A. Amara R.R. R.M. et al, et al, 2001 al, 2001 J. H. et al, 2001 Infec. & et al 1999 Vaccine, 18(7— malária). os regimes de plasmideo-reforço especifica da suínos contra a febre Meng W. S. 2001 Câncer J. M. et al, 2001 Vet. patente norte-americana n°. regimes de dose inicial com Vide, por exemplo Matano T. (uma dose inicial com Foi descrita a vírus da varíola (ver, por exemplo Robinson, H. L. et 2001 Science. 292(5514):69- -74). As imunizações inicial-reforço com ADN e vectores de virus modificados que expressam antigénios glicoproteina D de virus de herpes simplex 2, Leishmania infantum P36/LACK, antigénio falciparum TRAP, antigénios de HIV/SIV, tuberculose de murino e antigénios da influenza descritas como capazes de desencadear respostas de anticorpos e citoquinas (ver, por exemplo, et al. , 2002 J. Infect. Dis., 186(8): 1065-73; et al, 2002 J. Virol., 76(15) :7625-31; Gonzalo 2002 Vaccine, 20(7-8): 1226-31; Schneider J.

Vaccine, 19 (32) :4595-602; Hei Z. et Immunol.,167 (12) :7180-91; McShane Immun., 69(2):681-6 e Degano P. 8):623-32 modelos da influenza e

Tem-se descrito, recentemente, que imunização genética com dose inicial de com adenovirus induzem imunidade tumoral alfa-fetoproteina e protecção de suina clássica (ver, por exemplo,

Res., 61(24):8782-6; Hammond,

Microbio., 80(2): 101-19; e 6,210,663). Têm sido descritos outros ADN plasmídico-reforço virai, et al, 2001 J. Virol., 75(23):11891-6 ADN/reforço com vector de vírus Sendai). iniciação com ADN com reforço com recombinante para o tratamento de HIV-1 S. J. et al, 1998 J. Virol., 72:10180-8; 3 al, 1999 Nat. Med., 5:526-34; e Tartaglia, J. et al, 1998 AIDS Res. Human Retrovirus., 14:S291-8).

Vectores de VSV recombinante foram descritos em Haglund et al., 2002 Journal of Virology 76 (6) :2730-2738,WO 96/34625, e WO 02/097091. Enquanto se avaliam vários regimes de dose inicial com ADN/reforço virai, os regimes de imunização actualmente descritos têm várias desvantagens. Por exemplo, alguns dos virus indicados anteriormente provocam sintomas de doença em sujeitos, outros podem ter como resultado recombinação in vivo. Ainda outros virus são difíceis de produzir e/ou têm uma capacidade limitada para aceitar genes exógenos. Outros vírus têm ainda desvantagens provocadas por imunidade ao vector pré-existente significativa no ser humano e outras preocupações de segurança.

Existe a necessidade de regimes de imunização novos e úteis que possam produzir níveis maiores de resposta imunitária e humoral aos antigénios em questão e cumprir os requisitos de segurança, facilidade de produção e capacidade de ultrapassar a resposta imunitária natural dos hospedeiros mamíferos aos vectores em caso de imunização de reforço.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se um novo método e composição e proporciona um kit para a indução num sujeito mamífero de uma resposta imunitária contra um antigénio patogénico ou outro antigénio através de um regime de dose inicial/reforço que revela uma estimulação sinergética surpreendente da resposta imunitária celular ao antigénio em comparação com os resultados obtidos com o componente ADN plasmídico ou o componente virai recombinante quando administrado individualmente. 4

Numa forma de realização, a invenção refere-se a um método de indução de uma resposta imunitária específica de antigénio num sujeito mamífero. 0 método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma primeira composição compreendendo ADN plasmídico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora de um antigénio sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão na célula de mamífero pelo ADN plasmídico. 0 método inclui ainda a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma segunda composição compreendendo um vírus da estomatite vesicular recombinante (rVSV), compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificadora do antigénio sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão na célula de mamífero pelo rVSV. Noutra forma de realização, o VSV recombinante é um vírus competente em relação à replicação, atenuado. Noutra forma de realização, o VSV recombinante é um vírus incapaz de replicação. As administrações da primeira e segunda composições pode obedecer a qualquer ordem. Além disso, a presente invenção contempla múltiplas administrações de uma das composições seguida de administrações múltiplas da outra composição. Numa forma de concretização é preferencialmente co-administrada uma citoquina.

Numa forma de realização, a invenção refere-se uma composição imunogénica para indução de uma resposta imunitária específica de antigénio num sujeito mamífero. A composição imunogénica inclui uma primeira composição compreendendo ADN plasmídico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora de um antigénio sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão pelo ADN plasmídico. Esta composição inclui ainda pelo 5 menos um vírus da estomatite vesicular (VSV) recombinante com capacidade de replicação, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificadora do mesmo antigénio sob o controlo das sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão pelo VSV recombinante.

Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um kit destinado a utilização num método terapêutico e profilático de indução de um nível superior de resposta imunitária específica de antigénio num sujeito mamífero. 0 kit inclui, entre outros aspectos, pelo menos uma primeira composição compreendendo um ADN plasmídico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora de um antigénio sob o controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão numa célula de mamífero, pelo menos uma segunda composição compreendendo um vírus da estomatite vesicular recombinante (sVSV), com capacidade de replicação, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificadora do antigénio mencionado sob o controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão nas células de mamífero mencionadas e instruções para por em prática o método anteriormente descrito.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona a utilização da composição imunogénica anteriormente descrita ou respectivos componentes na preparação de um medicamento destinado à indução de uma resposta imunitária num animal ao antigénio empregue na composição.

Esta e outras formas de realização da presente invenção serão apresentadas na descrição pormenorizada seguinte.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 6 A fig. IA é um diagrama esquemático de um ADN plasmidico ilustrativo codificador de um virus da imunodeficiência de simio (SIV) proteína gag p37. 0 diagrama revela que o plasmídeo contém uma expressão impulsionadora do promotor/intensificador do citomegalovírus humano (HCMV) da proteína gag, um local de poliadenilação da hormona do crescimento bovina (BGH polyA) , uma origem da sequência de replicação (ori) e um gne marcador da resistência à canamicina (kanR). A fig. 1B é um diagrama esquemático de um ADN plasmidico bicistrónico codificador das duas subunidades p35 e p40 da interleuquina rhesus 12. A subunidade p35 está sob o controlo do promotor HCMV e possui um local SV40 poly A. A subunidade p40 está sob o controlo do promotor citomegalovírus de simio (SCMV) e possui um local BGH poly A e está transcrita na direcção inversa. 0 plasmídeo contém também uma sequência ori e um gene KanR. A fig. 2 é um gráfico de barras que mostra respostas ELISpot do interferão gama (IFN-γ) específicas de N em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) não-fraccionadas de animais imunizados por um regime dose inicial/reforço da presente invenção. As barras escuras mais à esquerda representam um protocolo de imunização com o ADN plasmidico codificador da proteína SIV gag com um reforço de um vector VSV que expressa uma proteína hemaglutinina da influenza (flu HA). As barras cinzentas claras representam um protocolo da invenção, envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN gag plasmidico, seguida de um reforço com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env. As barras claras representam um protocolo da invenção, envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN plasmidico vazio ou de controlo, seguida de um reforço com VSV que expressa as 7

proteínas HIV gag e env. As barras escuras mais à direita representam um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN plasmídico seguida de imunização com um VSV que expressa a proteína HIV flu HA. Cada grupo representa os resultados de 5 animais. A fig. 3 é um gráfico de barras que mostra respostas ELISpot do interferão gama (lFN-γ) 6101-específicas HIV env (PBMC) não-fraccionadas de animais imunizados por um regime dose inicial/reforço da presente invenção. As barras cinzentas mais à esquerda representam um protocolo de imunização com o ADN plasmídico codificador da proteína SIV gag com um reforço de um vector VSV que expressa uma proteína flu HA. As barras riscadas representam um protocolo da invenção, envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN gag plasmídico, seguida de um reforço com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env. As barras quadriculadas representam um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN vazio de controlo, seguida de imunização com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env. As barras ponteadas representam um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN plasmídico de controlo, seguida de imunização com um reforço de VSV que expressa a proteína flu HA. Cada grupo representa os resultados de 5 animais. Os asteriscos indicam os pontos onde ocorreram diferenças estatisticamente significativas a p=0,0001 . A fig. 4 é um gráfico que mostra o título de anticorpos anti-SIV gag por ensaio imunoabsorvente com ligação enzimática (ELISA) de animais imunizados por um regime dose inicial/reforço da presente invenção. 0 ADN plasmídico foi administrado no dia 0, semana 4 e semana 8 e os reforços com VSV (serotipo Indiana G) e VSV (serotipo Chandipura G) foram administrados nas semanas 15 e 23, respectivamente. Um protocolo de imunização com o ADN 8 plasmídico codificador da proteína SIV gag com um reforço de um vector VSV que expressa uma proteína flu HA encontra-se representado por (♦) . Um protocolo da invenção, envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN gag plasmídico, seguida de um reforço com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env encontra-se representado por () . Um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN de controlo vazio, seguida de imunização com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env encontra-se representado por (A). Um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial com ADN plasmídico de controlo, seguida de imunização com VSV que expressa a proteína flu HA encontra-se representado por (·)· Cada grupo representa os resultados de 5 animais. As diferenças estatisticamente significativas entre os grupos encontram-se representadas como p=0,0073 (*); p=0,5941 (#) ou p=0,0027 (¥). A fig 5 é um gráfico que mostra as células formadoras de manchas específicas SIV gag por milhão de células avaliadas por análise ELISpot para animais imunizados por um regime dose inicial/reforço da presente invenção. O ADN plasmídico foi administrado no dia 0, semana 4 e semana 8 e os reforços com VSV (serotipo Indiana G) e VSV (serotipo Chandipura G) foram administrados nas semanas 15 e 23, respectivamente. Um protocolo de imunização com o ADN plasmídico codificador da proteína SIV gag com um reforço de um vector VSV que expressa uma proteína flu HA encontra-se representado por (♦) . Um protocolo da invenção, envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN gag plasmídico, seguida de um reforço com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env encontra-se representado por () . Um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial 9 de ADN de controlo vazio, seguida de imunização com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env encontra-se representado por (A). 0 (♦) representa um protocolo envolvendo uma imunização inicial com ADN plasmídico de controlo, seguida de imunização um VSV que expressa a proteína flu HA. Cada grupo representa os resultados de 5 animais. As diferenças estatisticamente significativas entre os grupos encontram-se representadas por parêntesis para p=0,0001 e p=0,0002. A fig. 6 é um gráfico que mostra as respostas imunitárias elevadas desencadeadas pelas combinações dose inicial/reforço indicadas pelos mesmos símbolos indicados na fig. 5, resulta num aumento da protecção contra a SIDA, conforme a medição de uma menor perda de células T CD4 nos dias seguintes ao desafio. A fig. 7 é um gráfico que mostra as respostas imunitárias elevadas desencadeadas pelas combinações dose inicial/reforço indicadas pelos mesmos símbolos indicados na fig. 5, resulta num aumento da protecção contra a SIDA, conforme a medição de uma diminuição do vírus circulante no plasma (cópias virais/ml) nos dias seguintes ao desafio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método novo de indução de uma resposta imunológica específica de antigénio num sujeito mamífero ou sujeito vertebrado, utilizando uma combinação de determinados componentes de composições imunogénicas descritas na técnica anterior, e optimizando os componentes de modo a produzir resultados surpreendentes e sinergéticos. Normalmente, o método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição que inclui um ADN plasmídico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora de um antigénio sob controlo 10 de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão na célula de mamífero ou vertebrado pelo ADN plasmídico. O método inclui igualmente uma fase de administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição que inclui um vírus da estomatite vesicular recombinante (rVSV) com capacidade de replicação. Este rVSV inclui uma sequência de ácidos nucleicos codificadora do antigénio sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a expressão na célula de mamífero ou vertebrado pelo rVSV. A primeira destas duas composições imunogénicas a ser administrada por ordem é referida como a composição de dose inicial. A segunda destas duas composições imunogénicas a ser administrada por ordem é referida como a composição de reforço. Deste modo, a composição de ADN pode ser administrada como composição de dose inicial e a composição do vector VSV administrada como composição de reforço ou vice-versa. Numa concretização, a composição de dose inicial é administrada ao sujeito pelo menos uma ou múltiplas vezes antes da administração da composição de reforço. Posteriormente, a composição de reforço é subsequentemente administrada ao sujeito, pelo menos, uma ou múltiplas vezes. Além disso, a presente invenção contempla múltiplas administrações, de uma das composições, seguida de administrações múltiplas da outra composição. O método contempla ainda a administração de uma quantidade eficaz de uma citoquina como uma fase no método.

Foi surpreendentemente descoberto que a prática deste método induz, num sujeito mamífero, uma resposta imunológica incluindo um aumento na resposta das células CD8 + T ao antigénio maior do que o obtido por administração de ADN plasmídico ou VSV recombinante isoladamente. Efectivamente, tal como indicado no exemplo 11 abaixo, a resposta imunológica é maior do que a resposta esperada por uma combinação aditiva de duas composições imunogénicas. Deste modo, a resposta imunológica induzida pelo novo método é um aumento dramático e sinergético em repostas celulares e/ou de anticorpos relativamente ao antigénio. Ver, por exemplo, Quadro 1 abaixo e Figuras 4 e 5, nas quais o pico da resposta celular especifica ao antigénio relativamente ao gag de HIV-1 é mais que 3 vezes superior comparativamente à resposta à administração de uma composição imunogénica de ADN plasmídico isolada ou quase 9 vezes superior à resposta à administração de uma composição de rVSV imunoqénico isolada.

Enquanto se observa que o sujeito mamífero é um primata, de preferência um ser humano, a presente invenção não está limitada à identificação de um sujeito mamífero. Os componentes deste método são presentemente descritos de modo detalhado, abaixo, e fazem referência aos documentos citados para facultar detalhes conhecidos aos especialistas na técnica. A. ADN. Composição Imunogénica de Plasmídeo

As composições imunogénicas da presente invenção incluem um ADN plasmídico que compreende uma sequência ADN codificadora de um antigénio seleccionado para o qual se deseja uma resposta imunológica. No plasmídeo, o antigénio seleccionado encontra-se sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão numa célula de mamífero ou vertebrado. Os componentes do próprio plasmídeo são convencionais.

Os vectores plasmídeos não virais úteis na presente invenção contêm sequências ADN isoladas e purificadas que incluem sequências ADN codificadoras do antigénio imunogénico seleccionado. A molécula de ADN pode derivar de 12 vectores não virais ou virais, por exemplo, espécies bacterianas que tenham sido concebidas para codificar uma sequência de ácido nucleico exógena ou heteróloga.

Estes plasmideos ou vectores podem incluir sequências a partir de virus ou fagos. São conhecidos, na técnica, inúmeros vectores não virais e que podem incluir, não se limitando a, plasmideos, vectores bacterianos, vectores bacteriofagos, ADN sem histoma e condensado com lipidos catiónicos e polímeros.

Exemplos de vectores bacterianos incluem, mas não se limitam a, sequências derivadas do bacilo de Calmette Guérin (BCG), Salmonella, Shigella, E. coli, e Listeria, entre outras. Os vectores plasmídicos apropriados incluem, por exemplo, pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUCl9, pLG339, pR290, pK37, pKClOl, pAC105, pVA51, pKH47, pUBllO, pMB9, pBR325, Col El, pSClOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl, RP4, pBAD18 e pBR328.

Exemplos de vectores de expressão de Escherichia coli induzíveis apropriados incluem pTrc (Amann et al., 1988

Gene, 69,301:301-315), os vectores de expressão arabinose (por exemplo, pBAD18, Guzman et al, 1995 J. Bacteriol., 177:4121-4130), e pETIId (Studier et al. , 1990 Methods in

Enzymology, 185:60-89). A expressão do gene alvo a partir do vector pTrc depende da transcrição hospedeira de ARN polimerase a partir de um promotor de fusão trp-lac híbrido. A expressão do gene alvo a partir do vector pETIId depende da transcrição hospedeira a partir de um promotor de fusão 77 gnlO-lac mediada por ARN polimerase T7 gnl virai co-expressa. Esta polimerase virai é fornecida por estirpes hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS 174 (D133) de um pró-fago residente que abriga um gene 77 gnl sob controlo transcricional do promotor lacUV5. O sistema pBAD depende 13 do promotor arabinose induzível que é regulado pelo gene araC. 0 promotor é induzido na presença de arabinose. 0 promotor e outras sequências reguladoras que conduzem a expressão do antigénio no hospedeiro mamífero ou vertebrado desejado podem ser semelhantemente seleccionados a partir de uma ampla lista de promotores, os quais se conhecem como úteis para este fim. É indicada abaixo uma variedade destes promotores. Numa concretização da composição imunogénica de ADN plasmídico abaixo descrito, os promotores úteis são o promotor/intensificador citemegalovirus humano (HCMV) (descritos, por exemplo, em Patentes EU Nos. 5,168,062 e 5,385,839, e o intensificador promotor SCMV.

Outras sequências adicionais para inclusão em uma sequência de ácido nucleico, molécula ou vector da presente invenção incluem, sem limitação, uma sequência intensificadora, uma sequência de poliadenilação, uma sequência dadora de splicing e uma sequência aceitador de splicing, um local para início de transcrição e terminação posicionado no início e no final, respectivamente, do polipeptídeo a ser traduzido, um local de ligação do ribossoma para tradução na região transcrita, um tag epítopo, uma sequência de localização nuclear, um elemento IRES, um elemento "TATA" de Goldberg-Hogness, um local de clivagem de restrição de enzimas, um marcador seleccionável e semelhantes. As sequências intensificadoras incluem, por exemplo, a repetição de tandem 72 bp de SV40 ADN ou as repetições de terminais longos retrovirais ou LTRs, etc. e são empregues para aumentar a eficácia transcripcional.

Estes outros componentes úteis em ADN plasmídicos, incluindo, por exemplo, origens de replicação, sequências de poliadenilação (por exemplo, BGH polia, SV40 poliA), 14 marcadores de resistência a fármacos (por exemplo, resistência a canamicina) e semelhantes podem igualmente ser seleccionados de entre inúmeras sequências conhecidas, incluindo as descritas nos exemplos e especificamente mencionados abaixo. A selecção de promotores e outros elementos vectores comuns são convencionais e muitas destas sequências encontram-se disponíveis e com as quais é possível delinear os plasmídeos úteis na presente invenção. Ver, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989) e referências citadas do mesmo nas, por exemplo, páginas 3.18-326 e 16.17-1627 e Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1989). Todos os componentes dos plasmídeos úteis na presente invenção podem ser rapidamente seleccionados por um especialista na técnica, de entre inúmeros materiais conhecidos na técnica e disponíveis por parte da indústria. A selecção dos componentes plasmídicos e sequências reguladoras não são considerados limitação desta invenção.

Exemplos de construções de ADN plasmídicos, apropriadas para utilização em composições imunogénicas, são descritos em detalhe nas seguintes publicações de patentes, por exemplo, Publicações de Patentes Internacionais Nos W098/17799, W099/43839 e W098/17799; e Patentes dos Estados Unidos Nos. 5,593,972; 5,817,637; 5,830,876; e 5,891,505 entre outras.

De modo semelhante, o antigénio seleccionado pode ser um antigénio identificado na discussão seguinte. Numa concretização das composições imunogénicas aqui presentes, o antigénio seleccionado é um antigénio HIV-1, tal como um expresso por gag, pol, env, nef, vpr, vpu, vif e tat. De 15 preferência, a sequência do antigénio e outros componentes do ADN plasmidico são optimizados, tais como a selecção do codão apropriado para o hospedeiro pretendido e remoção de qualquer presença inibidora, igualmente abaixo discutida no que respeita à preparação do antigénio.

Esta composição imunogénica pode incluir, deste modo, um plasmideo codificador de um único antigénio seleccionado para expressão no hospedeiro. De acordo com o método presente, a composição plasmidica inclui igualmente um ADN plasmidico que inclui uma sequência ADN codificadora mais do que uma cópia do mesmo antigénio seleccionado. Em alternativa, a composição pode conter um plasmideo que expresse múltiplos antigénios seleccionados. Cada antigénio pode encontrar-se sob controlo de elementos reguladores separados ou componentes. Alternativamente, cada antigénio pode encontrar-se sob o controlo dos mesmos elementos reguladores. Ainda em uma outra concretização, a composição do ADN plasmidico pode conter múltiplos plasmídeos, em que cada ADN plasmidico codifica o mesmo ou um diferente antigénio.

Ainda, em uma outra concretização, a composição imunogénica de ADN plasmidico pode ainda conter, como um componente individual de ADN plasmidico ou como parte do antigénio que contém ADN plasmidico, uma sequência nucleótica codificadora de uma citoquina desejada, linfoquina ou outro adjuvante genético. É, abaixo identificado, um hospedeiro destes adjuvantes apropriados, para os quais se encontram disponíveis sequências de ácido nucleico. Nas formas de realização exemplificadas na presente invenção, uma citoquina desejável para administração com a composição de ADN plasmidico da presente invenção é interleuquina-12. 16 A composição de ADN plasmídico é desejavelmente administrada num diluente, excipiente ou veiculo farmaceuticamente aceitável, tais como os abaixo indicados. Embora a composição possa ser administrada por qualquer via de administração seleccionada, numa concretização, o método de administração desejável é a co-administração intramuscular de uma composição que inclua os plasmídeos com bupivacaina como o agente facilitador, abaixo descrito. Numa concretização do método da presente invenção, em que a composição de ADN é a composição de dose inicial, o método inclui a administração de, pelo menos, um ADN plasmídico antes da rVSV, sendo que o plasmídeo compreende uma sequência codificadora de um antigénio para o qual se pretende que seja induzida uma resposta imunológica. Numa concretização, a composição inicial de ADN consiste ainda de um segundo plasmídeo codificador de uma citoquina seleccionada. Ainda, numa outra concretização, abaixo exemplificada, a composição de dose inicial de ADN inclui três plasmídeos, um plasmídeo que expressa um primeiro antigénio, o segundo plasmídeo que expressa o segundo antigénio diferente e um terceiro plasmídeo que expressa um adjuvante de citoquina seleccionado. Tal como detalhado nos exemplos, uma concretização de uma composição inicial de ADN contém três plasmídeos optimizados; (1) um plasmídeo codificador de um gene gag p37 de SIV com ARN optimizado (ver Figura 1 A), (2) um plasmídeo codificador das duas sub-unidades rhesus IL-12 p35 e p40, sob controlo individual de dois promotores (ver Fig. 1B) e (3) um plasmídeo codificador do gene gpl60 env de HIV-1. Quando utilizada como uma composição inicial, esta composição ADN plasmídico é administrada uma única vez ou, preferencialmente, mais do que uma vez antes da composição rVSV de reforço. Quando utilizada como uma composição 17 inicial, esta composição ADN plasmídico é administrada uma única vez ou, preferencialmente, mais do que uma vez antes da composição rVSV de reforço.

B. Composição Imunogénica rVSV

Outra composição imunogénica útil nos métodos e composições da presente invenção é um veiculo de administração vírus estomatite vesicular (VSV) atenuado e vivo com capacidade de replicação. Este VSV recombinante inclui uma sequência de ácidos nucleicos codificadora do antigénio sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão na célula de mamífero ou vertebrado. Têm sido descritos vectores VSV recombinantes em Haglund et al., 2002 Journal of Virology 76(6) :2730-2738, WO 96/34625, e WO 02/097091. Nos métodos da presente invenção, o antigénio utilizado na composição ADN plasmídico é o mesmo antigénio utilizado na composição imunogénica rVSV. VSV é um vírus bovino, o qual é um membro da ordem taxonómica designada por Mononegavírus e inclui um genoma ARN 11 kb de cadeia negativa não segmentado codificador de quatro proteínas de estrutura interna e uma proteína de transmembrana exterior. Na ordem 3' à 5', os genes codificam proteínas designadas nucleocapsida (N) , fosfoproteína (P) , proteína matriz (M) , glicoproteína transmembrana (G) e polimerase (L) . Um VSV vivo pode ser isolado e "recuperado" utilizando técnicas conhecidas. Ver, por exemplo, Patentes norte-americanas Nos. 6,044,886; 6,168,943 e 5,789,299; Publicação de Patente Internacional No. W099/02657; Conzelmann, 1998, Ann. Rev. Genet., 32:123-162; Roberts and Rose, 1998, Virol., 247:1-6; Lawson et al, 1995 Proc. Natl. Acad. Sei., USA 92:4477-4481. Para além disso, por exemplo, a sequência genómica de VSV (Indiana) 18 encontra-se estabelecida sob o No. Acesso NC001560 na base de dados do NCBI. Outras sequências para VSV, incluindo sequências VSV (Chandipura) estão disponíveis nessa base de dados; por exemplo, ver Nos Acesso Ay382603, Afl28868, V01208, V01207, V01206, M16608, M14715, M14720 e J04350, entre outros. As estirpes VSV, tais como Nova Jersey e Indiana, entre outras encontram-se igualmente disponíveis a partir de depositários tais como American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ver, por exemplo, Acessos Nos. VR-1238 e VR-1239). São descritas ou referenciadas outras sequências nos documentos citados ao longo desta especificação.

Os genomas VSV têm sido apresentados para demonstrar mais do que um gene exógeno, com expansão para, pelo menos, três quilobases. Os genomas destes vírus são bastante estáveis, não estão sujeitos a recombinação e raramente passam por mutações significativas. Para além disso, considerando que a sua replicação é citoplasmática e os seus genomas incluem ARN, estes são incapazes de se integrar em genomas de células hospedeiras infectadas. Igualmente, estes vírus ARN de cadeia negativa possuem sequências de controlo transcripcional relativamente simples, as quais são rapidamente manipuláveis no que respeita à inserção de genes exógenos eficazes. Finalmente, o nível de expressão do gene exógeno pode ser modulado alterando-se a posição do gene exógeno relativamente ao promotor de transcrição virai. 0 gradiente 3' a 5' da expressão do gene reflecte a probabilidade decrescente de a polimerase virai transcrita venha a percorrer com sucesso em cada sinal intergénico de paragem do gene / iniciação do gene encontrado à medida que esta progride ao longo do genoma modelo. Deste modo, os genes estrangeiros 19 posicionados na proximidade de um promotor de iniciação de transcrição terminal 3' são expressos de modo abundante, enquanto a expressão daqueles que são inseridos em posições genómicas mais afastadas é menor.

As réplicas do VSV a titulos elevados, num grande conjunto de diferentes tipos de células e proteínas virais são expressas em grande abundância. Este aspecto não só significa que o VSV irá actuar como um veiculo de administração potente de gene exógeno funcional, mas também que os vectores rVSV relevantes podem ser dimensionados para níveis de produção nas linhas celulares aprovadas para a produção de produtos biológicos humanos. 0 rVSV tem numa grande capacidade para administrar genes exógenos codificadores de imunogénios protectores críticos de patogénios virais para uma variedade imensa de diferentes tipos de células, e de subsequentemente causar a expressão abundante de proteínas imunogénicas autenticamente configuradas (Haglund, K., et al, 2000 Virol., 268:112-21; Kahn, J. S. et al, 1999 Virol., 254:81-91; Roberts, A. et al, 1999 J. Virol., 73:3723-32; Rose, N. F. et al, 2000 J. Virol., 74:.-10; e Schlereth, B. et al 2000 J. Virol., 74:4652-7). Os imunogénios assim expressos, desencadeiam simultaneamente tanto as respostas a anticorpos neutralizantes de vírus durodouros como os linfócitos T citotóxicos protectores (CTL)(Roberts, A. et al, 1998 J. Virol., 72:4704-11).

Para além da eficácia do rVSV, este veículo de administração de gene de vírus vivo é seguro, uma vez que o VSV do tipo selvagem produz poucos ou nenhuns sintomas de doenças ou patologia em seres humanos saudáveis, mesmo ao enfrentar replicações de vírus substanciais (Tesh, R. B. et al, 1969 Am. J. Epidemiol., 90:255-61). Para além disso, a 20 infecção humana com e, deste modo, imunidade pré-existente para VSV é rara. Considerando uma atenuação adicional, estas composições rVSV são apropriadas para utilização em sujeitos imuno-deprimidos ou menos robustos. Uma vantagem significativa da utilização do vector VSV, neste método reside na existência de uma série de serotipos de VSV devido à troca ou modificação da proteína G de ligação virai do VSV. Por conseguinte, serotipos diferentes do vector VSV que transportam o mesmo antigénio heterólogo podem ser utilizados para administração repetida, para evitar qualquer resposta de anticorpos neutralizantes, que possam interferir, gerados para a proteína G VSV pelo sistema imunitário do hospedeiro.

Um VSV recombinante pode ser concebido utilizando técnicas anteriormente descritas na técnica, o qual transporta o antigénio seleccionado e respectivas sequências reguladoras inseridas em qualquer posição do VSV sob o controlo do promotor de transcrição virai. Numa concretização, o gene heterólogo codificador do antigénio seleccionado é inserido entre as regiões codificadoras G e L do VSV. Numa outra concretização, o gene heterólogo pode ser fundido no local da proteína G. Ainda numa outra realização, o gene heterólogo é fundido no local, ou adjacente a qualquer outro dos genes VSV.

Ainda noutras concretizações, os genes são "baralhados" (shuffling) por diferentes posições no genoma. Em particular, o gene N é sujeito a shuffling para diferentes posições no genoma. A clonagem para produzir as sequências cADN recombinantes baralhadas envolve a modificação da estrutura VSV plasmídico original (pVSV-XNl). Três variantes deste vector original incluem plasmídeos que se afastam da ordem normal do gene (3'-N- P-M-G-L-5') como 21 segue: i) 3'-P-N-M-G-L-5’; ii) 3 ’ -P-M-N-G-L-5'; e iii) 3'-P-M- G-N-L-5'. A estratégia de clonagem utilizada para criar estes plasmideos emprega um método descrito por Bali, L.A. e tal. 1999 J. Virol., 73:4705-12. Esta técnica tira partido do facto de gue os sinais de terminação do gene /iniciação do gene encontrados entre cada sequência codificadora são quase idênticos e permitem a construção de rearranjos do gene sem introduzir substituições de nucleótidos. Alternativamente, podem ser introduzidas poucas mutações pontuais estratégicas em sequências não codificadoras para criar locais de restrição convenientes que facilitam a re-estruturação do genoma.

Ainda noutras concretizações destes vectores, a sequência codificadora do terminal carboxi para o dominio citoplasmático de 29 aminoácidos do gene G é truncada mediante eliminação de aminoácidos do terminal 5'C do gene G. Em alternativa, o gene G é eliminado por completo. Numa realização, o dominio citoplasmático total do gene G é removido. Numa outra realização, são removidos, pelo menos, 28 aminoácidos do dominio citoplasmático. Ainda numa outra concretização, são eliminados cerca de 20 aminoácidos do dominio citoplasmático. Ainda numa outra realização, são eliminados cerca de 10, ou menos, aminoácidos do dominio citoplasmático.

Tanto a abordagem do "shuffling" genómico assim como a abordagem de modificação da proteína G geram declaradamente defeitos de crescimento parcial (Flanagan, E. B., et al 2001 J. Virol. 75:6107-14; Schnell, M. J. et al. 1998 EMBO J., 17:1289-96). Prevê-se que estas modificações do VSV possam dar lugar a um fenotipo mais atenuado ou ainda a um VSV não replicante para utilização em diversas concretizações da presente invenção. Ver, por exemplo, 22

Johnson, J. E. et al, 1998 Virol., 251:244-52.37; Johnson, J. E., et al., 1997 J. Virol., 71:5060-8.

De modo semelhante, o antigénio seleccionado pode ser um antigénio identificado na discussão seguinte. Numa realização das composições imunogénicas da presente invenção, o antigénio seleccionado é um gene gag de HIV-1 e/ou env (gpl60) de isolado de vírus Clare B. Ainda noutras concretizações, o antigénio é um gene pol, nef, vpr, vpu, vif ou tat de HIV-1. De preferência, a sequência do antigénios é optimizada, tal como por selecção do codão apropriada ao hospedeiro desejado e/ou por remoção de qualquer sequência inibidora, igualmente abaixo abordada com respeito à preparação do antigénio.

Para ultrapassar qualquer problema potencial de eficácia reduzida da replicação do vector por meio de administração sequencial, um conjunto de vectores de estrutura semelhante, cada um transportando um gene G de um serotipo VSV diferente, permite imunizações de reforço bem sucedidas. As sequências de aminoácidos primárias das proteínas G da VSV Indiana, Nova Jersey e Chandipura, são suficientemente divergentes de tal forma que a imunidade pré-existente de uma não exclui a infecção e repetição das outras. Deste modo, a resposta ao anticorpo neutralizante gerada pelo rVSV (Indiana) não deve interferir com a replicação do rVSV (Nova Jersey) ou rVSV (Chandipura) . Um conjunto de vectores que permite imunizações sequenciais bem sucedidas pode ser preparado ao se substituir o gene G do VSV Indiana pelo homólogo divergente do VSV Chandipura ou pelo VSV Nova Jersey, formando três vectores imunologicamente distintos.

Esta composição imunogénica rVSV pode incluir, deste modo, um rVSV codificador de um único antigénio 23 seleccionado para expressão no hospedeiro. De acordo com o presente método, a composição imunogénica rVSV inclui um rVSV que compreende uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de mais do que uma cópia do mesmo antigénio seleccionado. Alternativamente, a composição pode conter um rVSV que expresse múltiplos antigénios seleccionados. Cada antigénio pode encontrar-se sob controlo de elementos reguladores separados ou componentes. Alternativamente, cada antigénio pode encontrar-se sob o controlo dos mesmos elementos reguladores. Ainda numa outra realização, a composição de rVSV plasmidico pode conter múltiplos rVSVs, em que cada rVSV codifica o mesmo ou um diferente antigénio.

Ainda numa outra realização, a composição imunogénica rVSV pode ainda conter ou ser administrada com uma citoquina, linfoquina ou adjuvante genético. A citoquina pode ser administrada como uma proteína ou num plasmídeo, tal como acima mencionado, ou ser codificada por inserção da sequência codificadora de citoquina num VSV recombinante. Por exemplo, a sequência codificadora da citoquina pode ser inserida em qualquer posição no genoma VSV e expressa a partir do promotor de transcrição virai. É, abaixo identificado, um hospedeiro destes adjuvantes apropriados, para os quais se encontram disponíveis sequências de ácido nucleico. Nas realizações exemplificadas na presente invenção, uma citoquina desejável para administração, com a composição de rVSV da presente invenção, é interleuquina-12. A composição do rVSV é desejavelmente administrada num diluente, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, tais como os abaixo indicados. Embora a composição possa ser administrada por qualquer via de 24 administração seleccionada, numa realização, um método de administração desejável é intranasal. Numa realização do método da presente invenção, na qual a composição de rVSV é a composição de reforço, o método inclui a administração de, pelo menos, uma composição imunogénica rVSV após administração de uma composição imunogénica de dose inicial ADN. A composição rVSV expressa o mesmo antigénio como expresso pela composição de dose inicial. Numa realização, a composição rVSV inclui um vírus recombinante adicional codificador de uma citoquina seleccionada. Ainda numa outra realização, o rVSV inclui uma sequência expressora de uma citoquina, por exemplo, IL-12 presente no mesmo rVSV como expresso no antigénio. Ainda numa outra realização, múltiplas composições de rVSV são administradas como reforços tardios. Numa realização, pelo menos, duas composições rVSV são administradas após as composições iniciais. Numa realização, pelo menos, três composições rVSV são administradas após as composições iniciais.

Desejavelmente, tal como acima discutido, cada composição rVSV subsequente possui um serotipo diferente, mas a mesma sequência codificadora de antigénio. Os serotipos diferentes são seleccionados a partir de serotipos conhecidos que ocorrem naturalmente e a partir de qualquer serotipo sintético fornecido por manipulação da proteína G VSV. Entre os métodos conhecidos para alterar a proteína G do rVSV encontra-se a tecnologia descrita na Publicação Internacional No. W099/3264 e Rose, N. F. et al. 2000 J. Virol, 74:10903-10.

Numa outra realização, cada rVSV possui uma sequência codificadora de antigénio diferente, mas a mesma proteína G VSV. Numa outra realização, cada rVSV possui uma sequência codificadora de antigénio diferente, e uma proteína G VSV 25 diferente. Como descrito nos exemplos, uma realização de uma série de composições de reforço rVSV inclui dois rVSVs optimizados que contêm um gene gpl60 env de HIV-1, sendo um rVSV um serotipo Indiana e o outro um serotipo Chandipura.

De acordo com a presente invenção, esta composição imunogénica rVSV pode ser administrada como uma composição de reforço subsequente à administração da composição imunogénica ADN de dose inicial que apresenta o mesmo antigénio ao hospedeiro. Em quaisquer destas realizações do método da presente invenção, a segunda e qualquer rVSV adicional é administrada como um reforço posterior à primeira administração de rVSV. Os reforços adicionais de rVSV, numa realização, são do mesmo serotipo que suporta o mesmo antigénio. Alternativamente, os reforços rVSV adicionais que possuem serotipos diferentes são seriamente administrados antes da administração da composição imunogénica de reforço de ADN. Ficou demonstrado que é útil administrar, pelo menos, três reforços. Quando utilizadas como composição de reforço, as composições rVSV são administradas em série, após as composições imunogénicas de dose inicial de ADN. Quando utilizada como composição de reforço, a composição imunogénica rVSV é administrada uma vez ou, preferencialmente múltiplas vezes. Os reforços adicionais de rVSV, numa realização, são do mesmo serotipo que suporta o mesmo antigénio. Alternativamente, os reforços rVSV adicionais que possuem serotipos diferentes são seriamente administrados antes da administração da composição imunogénica de reforço de ADN.

Exemplos de construções rVSV apropriadas com capacidade de expressar uma proteína HIV-1 in vivo são descritos em detalhe nos seguintes exemplos e nas seguintes publicações, por exemplo, Rose et al, 2000 Virol., 268:112-121; Rose et 26 al, 2000 J. Virol., 74:-10903-10910; Rose et al 2001 Cell, 106:539-549; Rose et al, 2002 J. Virol., 76:2730-2738; Rose et al, 2002 J. Virol., 76:7506-7517. Vectores rVSV adicionais podem ser ainda atenuados, por truncagens progressivas da proteína G VSV ou por shuffling do gene estrutural VSV, tal como acima mencionado. VSV não replicável pode igualmente ser utilizado de acordo com a presente invenção. Prevê-se que os rVSVs que apresentam um equilíbrio de atenuação desejado e imunogenicidade sejam úteis para a presente invenção.

Inúmeras construções rVSV ilustrativas exemplificadas nos Exemplos abaixo possuem os genomas recombinantes: (1) 3' N- P- M- G-HIV env-L-5' (2) 3' N- P- M- G-HIV gag-L-5' (3) 3 ' N- P- M- G-SIV gag- L-5'

Numa realização, um método e composição imunogénica da presente invenção empregam uma destas construções rVSV. Numa outra realização, um método e composição imunogénica da presente invenção emprega um env rVSV-HIV assim como um gag rVSV-HIV. Esta composição imunogénica posterior induz, simultaneamente, respostas imunitárias humorais potentes para gpl60, mais CTL (para Env e Gag) configurado autenticamente capazes de matar as células infectadas com o vírus HIV-1. O gpl60 HIV-1 expresso desta forma tem ligação ao CD4/co-receptor e sujeita-se a alterações conformacionais associadas à ligação ao receptor. interacções gpl60 / receptor apropriadas expõem os determinantes neutralizadores do vírus crípticos presentes no gpl60, que são necessários para a indução da protecção mediada por anticorpos contra a infecção (ver, Por exemplo, LaCasse, R. A. et al, 1999 Science. 283:357-62). 27 C. Antigénios para Utilização nas Composições Iminogénicas da Presente Invenção

As composições antigénicas ou imunogénicas úteis nos métodos e composições da presente invenção intensificam a resposta imunológica num hospedeiro vertebrado contra um antigénio seleccionado. 0 antigénio seleccionado, quando expresso pelo ADN plasmidico ou VSV pode ser uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, fragmento ou uma fusão do mesmo derivado de um vírus patogénico, bactérias, fungos ou parasita. Alternativamente, o antigénio seleccionado pode ser uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, fragmento ou fusão do mesmo derivado de uma célula cancerígena ou célula tumoral. Numa outra realização, o antigénio seleccionado pode ser uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, fragmento ou fusão do mesmo derivado de um alergénio de modo a interferir com a produção de IgE e de modo a moderar respostas alérgicas ao alergénio Ainda numa outra realização, o antigénio seleccionado pode ser uma proteína, polipetídeo, peptídeo, fragmento ou fusão derivada do mesmo a partir de uma molécula ou porção da mesma, a qual representa aquelas produzidas por um hospedeiro (uma molécula própria) numa forma, quantidade ou localização indesejada, tal como as provenientes da proteína precursora amilóide, de modo a prevenir ou tratar uma doença caracterizada pela deposição de amilóide num hospedeiro vertebrado. Numa realização da presente invenção, o antigénio seleccionado é uma proteína, polipeptídeo, peptídeo ou fragmento derivado do HIV-1. A presente invenção direcciona-se igualmente para métodos para aumentar a capacidade de uma composição imunogénica que contém um antigénio seleccionado (1) de um vírus patogénico, bactérias, fungos ou parasitas para 28 induzir uma resposta imunológica de um hospedeiro vertebrado, ou (2) de um antigénio cancerigeno ou antigénio associado ao tumor de uma célula cancerígena ou célula tumoral para induzir um efeito anti-cancerígeno terapêutico ou profiláctico num hospedeiro vertebrado, ou (3) de um alergénico de modo a interferir com a produção de IgE de modo a moderar respostas alérgicas ao alergénico, ou (4) de uma molécula ou porção da mesma (uma molécula própria) num modo, quantidade ou localização indesejado de modo a reduzir tal efeito indesejado.

Numa outra realização, composições imunogénicas virais desejáveis que utilizam o regime dose inicial/reforço da de acordo com a presente divulgação incluem as composições direccionadas para a prevenção e/ou tratamento de doença causada por, sem limitação, vírus da imunodeficiência humana, vírus da imunodeficiência dos Símios, vírus sincicial respiratório, vírus parainfluenza tipos 1-3, vírus influenza, vírus herpes simples, citomegalovírus humano, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, papilomavírus humano, poliovírus, rotavírus, calicivírus, vírus do Sarampo, vírus da parotidite, vírus da rubéola, adenovírus, vírus da raiva, vírus da cinomose canina, vírus peste bovina, metapneumovírus humano, pneumovírus aviário (anteriormente rinotraqueíte de perú), vírus de Hendra, vírus de Nipah, coronavírus, parvovírus, vírus da rinotraqueíte infecciosa, vírus da leucemia felina, vírus da peritonite infecciosa felina, o vírus da doença infecciosa bursal, vírus da doença de Newcastle, vírus da doença de Marek, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos, o vírus da arterite dos equinos e vários vírus de encefalite. 29

Numa outra realização, as composições imunogénicas bacterianas desejadas utilizam regimes iniciais/de reforço da presente divulgação incluem aquelas direccionadas para a prevenção e/ou tratamento de doença causada por, sem limitação, Haemophilus influenza (tanto tipável como não tipável), Haemophilus somnus, Moraxella catairhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus piogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Clamidia psittaci, Bordetella pertussis, Alloiococcus otiditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellular complex, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae e Micoplasma gallisepticum hylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae e Micoplasma gallisepticum.

Numa outra realização, as composições imunogénicas desejáveis contra patogénios fúngicos que utilizam o regime dose inicial / de reforço da presente divulgação incluem aquelas direccionadas para a prevenção e/ou tratamento de doença causada por, sem limitação, Aspergillis, Blastomices, Cândida, Coccidiodes, Criptococcus e Histoplasma. 30

Numa outra realização, as composições imunogénicas desejáveis contra parasitas que utilizam o regime inicial/de reforço da presente divulgação incluem aquelas direccionadas para a prevenção e/ou tratamento de doença causada por, sem limitação, Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii e Pneumocystis carinii.

Numa outra realização, as composições imunogénicas desejáveis para indução de um efeito anti-cancerigeno terapêutico ou profilático num hospedeiro vertebrado, que utilizam um regime dose inicial / de reforço da presente divulgação incluem aquelas que utilizam um antigénio cancerígeno ou associado a um tumor, incluindo, sem limitação, antigénio específico da próstata, antigénio carcino-embriónico, MUC-1, Her2, CA-125 e MAGE-3.

As sequências nucleótidas e de proteínas para os antigénios conhecidos, acima indicados, encontram-se publicamente disponíveis em bases de dados tais como a NCBI, ou pode encontrar-se disponíveis a partir de outras fontes tais como a American Type Culture Collection e universidades.

As composições imunogénicas desejáveis para moderar respostas a alergénios num hospedeiro vertebrado, o qual utiliza o regime dose inicial / de reforço incluem aquelas que contêm um alergénio ou fragmento do mesmo. Exemplos destes alergénios encontram-se descritos nas Patentes norte-americanas N° 5,830,877 e Publicação de Patente Internacional N° WO 99/51259. Estes alergénios incluem, sem limitação, pólenes, venenos de insectos, pêlos de animais, fungos e fármacos (tal como a penicilina) . Estas composições imunogenéticas interferem com a produção de anticorpos IGE, causa conhecida de reacções alérgicas. 31

Composições imunogénicas desejáveis para moderação das respostas a auto-moléculas num hospedeiro vertebrado que utilizam o regime dose inicial/reforço da presente divulgação incluem aquelas que contêm uma auto-molécula ou respectivo fragmento. Exemplos destas auto-moléculas incluem insulina de cadeia β envolvida no diabetes, a molécula G17 envolvida na doença do refluxo gastroesofágico e antigénios que subregulam as respostas autoimunes em doenças tal como esclerose múltipla, lúpus e artrite reumatóide. Está também incluído o peptídeo β-amilóide (também designado peptídeo Αβ) que é um fragmento interno de 39-43 aminoácidos da proteína precursora amilóide (APP), que é gerada pelo processamento de APP pelas enzimas β e γ secretase. 0 peptídeo Αβ1-42 possui a seguinte sequência SEQ ID NO: Asp Ala Gin Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gin Vai His His Gin Lys Len Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Vai Gly Gly Vai Vai lie Ala. É também desejável na selecção e utilização das sequências antigénicas para desenho dos plasmídeos de ADN e construções rVSV da presente invenção para alterar a utilização do codão da sequência genética codificadora do antigénio seleccionada, bem como os plasmídeos de ADN nos quais são inseridos e/ou para remover as sequências inibidoras. A remoção das sequências inibidoras pode ser efectuada utilizando a tecnologia discutida pormenorizadamente nas patentes norte-americanas n° 5,965,726; 5.972,596; 6,174,666; 6.291,664; e 6,414,132; Publicação de Patente Internacional no WO 01/46408. Em resumo, esta tecnologia envolve a mutação de sequências inibidoras/de instabilidade identificadas no gene 32 seleccionado, de preferência com múltiplos pontos de mutação.

Numa forma de realização especifica exemplificada abaixo, o plasmídeo imunogénico e composições rVSV da presente invenção empregam, de modo desejável, uma ou várias seguências optimizadas para codificar o antigénio HIV-1, tal como os antigénios gag, pol e nef ou respectivos fragmentos imunogénicos ou fusões. Os genes gag e env do vírus da imunodeficiência guimérico símio-humano (SHIV) (89.6P) são úteis para preparar rVSVs, de forma a poder ser demonstrada protecção contra a infecção e diminuição da carga virai e doença num modelo da doença em macaco Rhesus. Os exemplos seguintes demonstra a utilização de análogos SHIV, isto é gag SIV e env HIV 89.6P.

D. Promotores úteis nas construções imunogénicas de plasmídeo ADN ou rVSV

Promotores adequados para utilização em qualquer um dos componentes da presente invenção podem ser imediatamente seleccionados de entre os promotores constitutivos, promotores induzíveis, promotores específicos de tecidos e outros. Exemplos de promotores constitutivos que nãos inespecíficos quanto à actividade e empregues nas moléculas de ácido nucleico codificadoras de um antigénio da presente invenção incluem, sem limitação, o promotor retroviral do vírus do sarcoma Rous (RSV), promotor retroviral LTR (opcionalmente com o intensificador RSV), o promotor citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador CMV) (ver, por exemplo, Boshart et al, 1985 Cell, 41:521-530), o promotor SV40, o promotor di-hidrofolato redutase, o promotor β-actina, o promotor fosfoglicerol quinase (PGJ) e o promotor EFla (Invitrogen). Os promotores induzíveis que são regulados por compostos fornecidos exogenamente 33 incluem, sem limitação, o promotor arabinose, o promotor metalotionina (MT) da ovelha induzível por zinco, o promotor do vírus do tumor mamário de ratinho (MMMTV) induzível com dexametasona (Dex), o sistema promotor polimerase T7 (WO 98/10088); o promotor de insecto ecdisona (No et al, 1996 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93:3346-3351), o sistema tetraciclina repressível (Gossen et al, 1992 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:5547-5551), o sistema tetraciclina induzível (Gossen et al, 1995 Science, 268:1766-1769, ver também Harvey et al, 1998 Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518), o sistema RU486-induzível (Wang et al, 1997 Nat. Biotech., 15:239-243 e Wang et al, 1997 Gene Ther., 4:432-441) e o sistema rapamicina induzível (Magari et al, 1997 J. Clin. Invest., 100: 2865-2872).

Outros tipos de promotores induzíveis que podem ser úteis neste contexto são aqueles regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo a temperatura ou fase aguda ou em células replicantes. Promotores específicos de tecidos úteis incluem os promotores de genes codificadores de β-actina esquelética, miosina de cadeia leve 2A, distrofina, creatina quinase muscular, bem como promotores musculares sintéticos com actividades superiores aos promotores naturais (ver Li et al., 1999 Nat. Biotech., 17:241-245). São conhecidos exemplos de promotores que são específicos de tecidos para o fígado (albumina, Miyatake et al. 1997 J. Virol., 71:5124-32; promotor nuclear do vírus da hepatite B, Sandig et al, 1996 Gene Ther., 3: 1002-9; alfa-fetoproteína (AFP) , Arbuthnot et al, 1996 Hum. Gene Ther., 7:1503-14), osso (osteocalcina, Stein et al, 1997 Mol. Biol Rep., 24:185-96; sialoproteina óssea, Chen et al, 1996 J. Bone Miner. Res., 11:654-64), linfócitos (CD2, Hansal et al, 1988 J. Immunol, 161:1063-8; imunoglobulina 34 de cadeia pesada; cadeia α do receptor de células T) , neuronal (promotor enolase especifica dos neurónios (NSE), Andersen et al 1993 Cell Mol Neurobiol., 13:503-15; gene de cadeia leve neurofilamento, Piccioli et al, 1991 Proc. Natl Acad. Sei. USA, 88:5611-5; gene ngf especifico dos neurónios, Piccioli et al, 1995 Neuron, 15:373-84); entre outros. Ver, por exemplo a Publicação de Patente Internacional N° WO 00/55335 para listas adicionais de promotores conhecidos, úteis neste contexto. E. Veículos, excipientes, adjuvantes e formulações úteis para as composições imunogénicas da presente invenção

As composições imunogénicas úteis na presente invenção, plasmideo ADN ou composições rVSV, incluem ainda um diluente imunologicamente aceitável ou um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como água estéril ou soro fisiológico isotónico estéril. As composições antigénicas podem ainda ser misturadas com estes diluentes ou veículos de uma forma convencional. Tal como presentemente utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" pretende incluir qualquer e todo o solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes isotónicos e de absorção e semelhantes, compatíveis com administração em seres humanos ou outros hospedeiros vertebrados. O veículo apropriado é evidente para os peritos na especialidade e dependerá principalmente da via de administração.

Mais componentes adicionais que poderão estar presentes nas composições imunogénicas da presente invenção são adjuvantes, conservantes, agentes tensioactivos e estabilizantes químicos, agentes de suspensão ou dispersão. Tipicamente, os estabilizantes, adjuvantes e conservantes 35 estão optimizados para determinar a formulação mais eficaz no ser humano ou animal alvo. 1. Adjuvantes

Um adjuvante é uma substância que intensifica a resposta imunitária quando administrada em conjunto com um imunogénio ou antigénio. Várias citoquinas ou linfoquinas têm revelado possuir uma actividade moduladora imunológica e podem, assim, ser empregues como adjuvantes, incluindo mas sem constituir limitação, as interleuquinas 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (ver, por exemplo a patente norte-americana n° 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (e respectivas formas mutantes) os interferões α, β e γ, factor estimulante da colónia de granulócitos-macrófagos (ver, por exemplo patente norte-americana N° 5,078,996 e N° de acesso ATCC 39900), factor estimulante da colónia de macrófagos, factor estimulante da colónia de granulócitos, GSF, e factores da necrose do tumor α e β. Ainda outros adjuvantes úteis na presente invenção incluem uma quimioquina, incluindo, sem constituir limitação MCP-1, ΜΙΡ-Ια, MIP-1β e RANTES. Moléculas de adesão, tal como selectina, por exemplo, L-selectina, P-selectina e E-selectina podem também ser úteis como adjuvantes. Outros adjuvantes úteis incluem, sem constituir limitação, uma molécula tipo mucina, por exemplo CD34, GlyCAM-1 e MadCAM-1, um membro da família das integrinas, tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 e pl50.95, um membro da superfamília das imunoglobulinas, tal como PECAM, ICAMs, por exemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3, moléculas co- estimulantes, tal como CD40 e CD40L, factores de crescimento incluindo factor de crescimento vascular, factor de crescimento nervoso, factor de crescimento de fibroblastos, factor de crescimento endotelial, moléculas 36 receptoras incluindo Fas, receptor TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 e DR6. Ainda outra molécula adjuvante inclui Caspase (ICE). Ver, por exemplo,

Publicações de patente n°s W098/17799 e W099/43839.

Adjuvantes adequados utilizados para intensificar uma resposta imunitária incluem sem limitação, MPL™ (lipido A 3-0-desacilo-monofosforilo; Corixa, Hamilton, MT) , que é descrito na patente norte-americana n° 4,912,094. São também adequados como adjuvantes análogos sintéticos do lipido A ou compostos de fosfato de aminoalquilo glucosamina (AGP) ou respectivos derivados ou análogos que estão disponíveis junto da Corixa (Hamilton, MT), que estão descritos na patente norte-americana n° 6,113,918. Um AGP destes é 2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-deoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoioxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranosida, que é igualmente conhecido por 529 (anteriormente conhecido por RC529). Este adjuvante 529 encontra-se formulado sob forma aquosa ou emulsão estável.

Ainda outros adjuvantes incluem óleo mineral e emulsões em água, sais de aluminio (alum) , tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc. anfigénio, avridina 121/squaleno, D-lactide-polilactide/glicoside, polióis pluronic, dipeptídeo muramilo, Bordetella morta, saponinas, tal como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.) descritos na patente norte-americana n° 5,057,540, e partículas geradas a partir destes, tal como ISCOMS (complexos imunoestimulantes), Mycobacterium tuberculosis, lipossacáridos bacterianos, polinucleótidos sintéticos tal como oligonucleótidos contendo o motivo CpG (patente norte- 37 americana n° 6,207,646, presentemente incorporada por referência) um toxina pertussis (PT) ou uma toxina termicamente lábil de E. coli (LT) , particularmente LT-K63,LT-R7 2, PT-K9/G129; ver Publicações de Patente Internacional Nos WO 93/13302 e WO 92/19265.

São igualmente úteis como adjuvantes as toxinas da cólera e respectivos mutantes, incluindo os descritos na Pedido de Patente Internacional n° WO 00/18434 (em que o ácido glutâmico na posição 29 do aminoácido é substituído por outro aminoácido (que não seja ácido aspártico), de preferência histidina). Toxinas CT semelhantes ou mutantes encontram-se descritas no Pedido de Patente Internacional publicado número WO 02/098368 (em que a isoleucina na posição 16 do aminoácido é substituída por outro aminoácido, isoladamente ou em combinação com a substituição da serina na posição 68 do aminoácido por outro aminoácido; e/ou em que a valina na posição 72 do aminoácido é substituída por outro aminoácido) . Outras toxinas CT encontram-se descritas no pedido de patente internacional publicado número WO 02/098369 (em que a arginina na posição 25 do aminoácido é substituída por outro aminoácido; e/ou um aminoácido é inserido na posição 49 do aminoácido; e/ou dois aminoácidos são inseridos nas posições 35 e 36 do aminoácido) . Numa forma de realização exemplificada seguidamente, o adjuvante desejado é IL-12, que é expresso a partir de um plasmídeo. Ver, por exemplo patentes norte-americanas n°s 5,457,038; 5,648,467; 5,723,127 e 6,168,923. Este plasmídeo que expressa IL-12 é incorporado no plasmídeo ADN imunogénico contendo uma composição iniciadora dos exemplos. No entanto, deve-se ter em atenção que não foi possível administrar este plasmídeo no hospedeiro mamífero ou vertebrado com a composição rVSV 38 (ou expresso pelo rVSV) ou isoladamente entre as composições iniciais e de reforço. Numa forma de realização, a citoquina pode ser administrada como proteina. Numa forma de realização preferida, a citoquina é administrada como composição de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ADN codificadora da citoquina sob o controlo de sequências requladoras que orientam a respectiva expressão numa célula de mamifero. Ainda noutra forma de realização útil, o plasmideo expressor de citoquinas é administrado com a composição de ADN. Ainda noutra forma de realização, a citoquina é administrada entre as administrações da composição inicial e composição de reforço. Ainda noutra fase, a citoquina é administrada com a fase de reforço. Ainda noutra fase, a citoquina é administrada com as composições inicial e de reforço.

Quando a composição inicial é a composição de plasmideo ADN, tal como é o caso dos exemplos abaixo, a composição de plasmideo pode compreender uma sequência de ADN codificadora da citoquina sob o controlo de sequências reguladoras que orientam a respectiva expressão numa célula de mamifero. Nalgumas formas de realização, a sequência codificadora da citoquina encontra-se presente no mesmo plasmideo ADN que a sequência codificadora do antigénio. Nalgumas formas de realização, a sequência codificadora da citoquina encontra-se presente no mesmo plasmideo ADN que a sequência codificadora do antigénio. 2. Agentes ou co-agentes facilitadores

Para além de um veiculo descrito anteriormente, as composições imunogénicas constituídas por moléculas de polinucleótido contêm desejavelmente agentes facilitadores polinucleótidos opcionais ou "co-agentes", tal como um 39 anestésico local, um peptídeo, um lípido incluindo lipidos catiónicos, um lipossoma ou partícula lipídica, um policatião, tal como polilisina, um policatião tridimensional ramificado tal como um dendrímero, um hidrato de carbono, um anfífilo catiónico, um detergente, um surfactante benzilamónio ou outro composto que facilita a transferência de polinucleótida para células. Estes agentes facilitadores incluem o anestésico local bupivacaína ou tetracaína (ver patente U.S n° 5,593,972; 5,817,637; 5,380,876; 5,981,505 e 6,383,512 publicação de patente internacional n° WO 98/17799). Outros exemplos não exclusivos destes agentes facilitadores ou co-agentes úteis na presente invenção encontram-se descritos nas patentes U.S. n°s 5,703,055; 5,739,118; 5,837,533; publicação de patente internacional WO 96/10038, publicada a 4 de Abril de 1996 e publicação de patente internacional WO 96/10038, publicada a 8 de Agosto de 1994.

Mais preferencialmente, o anestésico local encontra-se presente numa quantidade que forma um ou vários complexos com as moléculas de ácido nucleico. Quando o anestésico local é misturado com as moléculas de ácido nucleico ou plasmídeos da presente invenção forma uma variedade de pequenos complexos ou partículas que envolvem o ADN e são homogéneas. Assim, numa forma de realização das composições imunogénicas da presente invenção, os complexos são formados por maior de mistura do anestésico local e pelo menos um plasmídeo da presente invenção. Qualquer complexo simples resultante desta mistura pode conter uma variedade de combinações dos diferentes plasmídeos. Em alternativa, noutra forma de realização das composições da presente invenção, o anestésico local pode ser previamente misturado com cada plasmídeo em separado. As misturas separadas são 40 depois combinadas com uma única composição para garantir a presença da proporção desejada dos plasmídeos numa única composição imunogénica se todos os plasmídeos forem administrados numa única administração em bolus. Em alternativa, o anestésico local e cada plasmídeo podem ser misturados separadamente e administrados separadamente para obter a proporção desejada.

Doravante, quando se empregar o termo "complexo" ou "um ou vários complexos" ou "complexos" para definir esta forma de realização da composição imunogénica, subentende-se que o termo engloba um ou vários complexos. Cada complexo contém uma mistura dos plasmídeos ou uma mistura de complexos formada discretamente. Cada complexo pode conter apenas um tipo de plasmídeo ou complexo ou uma mistura de plasmídeos ou complexos, contendo cada complexo um ADN policistrónico. De preferência, os complexos encontram-se entre cerca de 50 e cerca de 150 nm de diâmetro. Quando o agente facilitante utilizado é um anestésico local, de preferência bupivacaína, é preferida uma quantidade de cerca de 0,1 % em peso a cerca de 1,0 % em peso com base no peso total da composição de polinucleótidos. Ver, também a publicação de patente internacional n° WO 99/21591 e que explica a incorporação de surfactantes de benzilamónio como co-agentes, administrados de preferência numa quantidade entre cerca de 0,001 e 0,03 % em peso. De acordo com a presente invenção, a quantidade de anestésico local encontra-se presente numa proporção para as moléculas de ácido nucleico mencionadas de 0,01-2,5% p/v de anestésico local para 1-10 pg/ml de ácido nucleico. Outro intervalo é 0,05-1,25% p/v de anestésico local para 100 μ/ml para 1 mg/ml de ácido nucleico. 3.

Outros aditivos das composições imunogénicas 41

Outros aditivos podem ser incluídos nas composições imunogénicas da invenção, incluindo ingredientes conservantes, estabilizantes, tensioactivos e semelhantes.

Exemplos de conservantes adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, propil gaiato, os parabenos, etilvanilina, glicerina, fenol e paraclorofenol.

Ingredientes estabilizantes adequados que podem ser utilizados incluem, por exemplo, casaminoácidos, sucrose, gelatina, vermelho de fenol, N-Z amina, difostato monopotássico, lactose, hidrolisado de lactalbumina e leite em pó.

Substâncias tensioactivas adequadas incluem sem limitação adjuvante incompleto de Freund, análogos da quinona, hexadecilamina, octadecilamina, ésteres do aminoácido octadecilo, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamónio), metoxi-hexadecilglicerol e polióis poluronic, poliaminas, por exemplo pirano, dextranosulfato, poli IC, carbopol; peptídeos por exemplo peptídeo muramilo e dipeptídeo, dimetilglicina, tuftsina, emulsões em óleo e géis minerais, por exemplo, fosfato de alumínio, etc. e complexos imunoestimulantes (ISCOMS). Os plasmídeos e rVSVs podem também ser incorporados em lipossomas para utilização como composição imunogénica. As composições imunogénicas podem também conter outros aditivos adequados para o modo seleccionado de administração da composição. A composição da invenção pode ainda envolver polinucleótidos liofilizados que podem ser utilizados com outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para o desenvolvimento de formas de dosagem em pó, líquido ou suspensão. Vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19a edição 42 (1995), por exemplo capítulo 95 Aerosols; e publicação de patente internacional No. WO 99/45966.

As composições imunogénicas podem conter aditivos adequados para administração por qualquer via de administração convencional. Nalgumas formas de realização preferidas, a composição imunogénica da invenção é preparada para administração em sujeitos humanos sob a forma de, por exemplo, líquidos, pós, aerossóis, comprimidos, cápsulas, comprimidos ou cápsulas com revestimento entérico ou supositórios. Assim, as composições imunogénicas podem ainda incluir, sem se limitarem a, suspensões, soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquosos, pastas e formulações implantáveis de libertação sustentada ou biodegradáveis. Numa forma de realização da formulação para administração parentérica, o ingrediente activo é apresentado em forma seca (isto é pó ou granulado) para reconstituição com um veículo adequado (por exemplo água estéril apirogénica) antes da administração parentérica da composição reconstituída. Outras formulações úteis de administração parentérica incluem as que compreendem o ingrediente activo em forma microcristalina, numa preparação lipossomal ou como componente de um sistema polimérico biodegradável. As composições de libertação sustentada ou implante podem compreender materiais poliméricos ou hidrófobos farmaceuticamente aceitáveis, tal como uma emulsão, uma resina de permuta iónica, um polímero pouco solúvel ou um sal pouco solúvel.

As composições imunogénicas da presente invenção não são limitadas pela selecção dos veículos, adjuvantes ou outros ingredientes úteis fisiologicamente aceitáveis em preparações farmacêuticas do tipo descrito anteriormente. A 43 preparação destas composições farmaceuticamente aceitáveis a partir dos componentes anteriormente descritos, com o isotonicicidade do pH apropriada, estabilidade e caracteristicas convencionais está incluída na competência da técnica. F. Dosagens e Vias de Administração para Composições Imunogénicas da Presente Invenção.

Em geral, a selecção da "quantidade eficaz" ou dosagem apropriada para os componentes da(s) composição/composições imunogénica(s) da presente invenção irá basear-se também na identidade do antigénio na(s) composição/composições imunogénica(s) empregue, bem como na condição física do sujeito, principalmente incluindo o estado geral de saúde, idade e peso do sujeito imunizado. 0 método e vias de administração e a presença de componentes adicionais nas composições imunogénicas pode ainda afectar as dosagens e quantidades do plasmídeo e composições rVSV. Esta selecção e ajuste ascendente ou descendente da dose é abrangida pela competência na técnica. A quantidade do plasmídeo e rVSV necessários para induzir uma resposta imunitária, de preferência uma resposta protectora ou produzir um efeito exógeno no doente sem efeitos secundários adversos significativos varia conforme estes factores. As doses adequadas são facilmente determinadas pelos especialistas na técnica.

As composições antigénicas ou imunogénicas da presente invenção são administradas a um ser humano ou a um vertebrado não-humano por uma variedade de vias incluindo, sem constituir limitação a via intranasal, oral, vaginal, rectal, parentérica, intradérmica, transdérmica (ver, por exemplo, publicação de patente internacional WO 98/20734), 44 intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intravenosa e intra-arterial. A via apropriada é seleccionada conforme a natureza da composição imunogénica utilizada e uma avaliação da idade, peso, sexo e estado geral de saúde do doente e antigénios presentes na composição imunogénica e factores semelhantes por um médico assistente.

Nos exemplos apresentados seguidamente, as composições de ADN imunogénicas são administradas por via intramuscular (i.m.). Numa forma de realização é desejável administrar as composições rVSV por via intranasal em vez de im. No entanto, a selecção das dosagens e vias de administração não constituem limitações da presente invenção.

De modo semelhante, a ordem da administração da composição imunogénica e os períodos entre as administrações individuais podem ser seleccionados pelo médico assistente ou um perito na especialidade com base nas características físicas e respostas precisas do receptor da aplicação do método. Prevê-se que esta optimização esteja bem abrangida pela competência na técnica. G. componentes do conjunto

Ainda noutra forma de realização, a presente invenção proporciona um conjunto farmacêutico para pronta administração de um regime imunogénico, profilático ou terapêutico para tratamento de qualquer uma das doenças ou estados anteriormente indicados para os quais se deseja uma resposta imunitária a um antigénio. Este conjunto foi concebido para utilização num método de indução de um elevado nível de resposta imunitária específica do antigénio num sujeito mamífero ou vertebrado. 0 conjunto 45 contém pelo menos uma composição imunogénica compreendendo plasmídeo ADN, compreendendo uma sequência de ADN codificadora de um antigénio sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão na célula de mamífero ou vertebrado. De preferência, dosagens pré-embaladas múltiplas da composição imunogénica de ADN são apresentadas no conjunto para administrações múltiplas. Este conjunto inclui ainda pelo menos uma composição imunogénica compreendendo um vírus da estomatite vesicular (VSV) recombinante com capacidade de replicação, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificadora do mesmo antigénio sob o controlo das sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão numa célula de mamífero ou de vertebrado. De preferência, dosagens pré-embaladas múltiplas da composição imunogénica de rVSV são apresentadas no conjunto para administrações múltiplas.

Quando as composições imunogénicas anteriormente descritas não contêm também ADN plasmídico e/ou rVSV que expressa uma citoquina, tal como IL-2, o conjunto contém ainda opcionalmente uma composição de citoquina separada ou múltiplas dosagens pré-embaladas da composição de citoquina para múltiplas administrações. Estas composições de citoquina são geralmente composições de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ADN codificadora da citoquina seleccionada sob o controlo de sequências reguladoras que orientam a respectiva expressão numa célula de mamífero ou de vertebrado. 0 conjunto contém ainda instruções para utilização de composições imunogénicas num método dose inicial/reforço como presentemente descrito. Os conjuntos podem incluir ainda instruções para a realização de certas análises, 46 vários veículos, excipientes, diluentes, adjuvantes e semelhantes anteriormente descritos, bem como aparelhos para administração das composições, tal como seringas, dispositivos pulverizadores, etc. Outros componentes podem incluir luvas descartáveis, instruções de descontaminação, batons aplicadores ou recipientes, entre outras composições. A fim de proporcionar uma melhor compreensão desta invenção são apresentados os exemplos seguintes. Os exemplos destinam-se apenas a servir de ilustração e não se pretende que constituam uma limitação do âmbito da invenção. Todos os documentos, publicações e patentes citados nos exemplos seguintes são incorporados por referência. Como ficou demonstrado nos exemplos em seguida, um protocolo de dose inicial/reforço da presente invenção induz no sujeito imunizado um efeito sinergético surpreendente nas respostas imunitárias celulares e humorais específicas do antigénio. De facto, quando estas respostas induzidas por um protocolo dose inicial/reforço da presente invenção são comparadas com os resultados da administração apenas de múltiplas composições iniciadoras ou apenas múltiplas composições de reforço, a natureza sinergética da resposta das composições da presente invenção é dramaticamente evidente. A combinação da apresentação do antigénio desejado por uma administração de ADN plasmídico seguida de um reforço rVSV produz um aumento de células T específicas do antigénio no sujeito imunizado que é consideravelmente maior que qualquer resposta aditiva. De modo similar, o aumento demonstrado na resposta humoral ao antigénio desejado é inesperadamente elevada com a utilização das duas composições imunogénicas de ADN plasmídico e rVSV num protocolo de imunização. Ver, por exemplo, quadro 1 seguinte e figs 4 e 5. 47

Exemplo 1: Preparaçao de ADN plasmídico

Este exemplo descreve plasmídeo ilustrativos úteis numa forma de realização da presente invenção, tal como apresentado nos exemplos 2 e 3. Estes plasmideos não constituem uma limitação da presente invenção mas foram optimizados para utilização nas experiências seguintes. As composições imunogénicas de ADN seguintes foram concebidas utilizando técnicas de ADN recombinante padrão. 0 vector central do ADN que expressa os genes gag de HIV ou SIV utiliza o promotor HCMV, sequência de terminação BGH poli A, a origem bacteriana de ColEl da replicação (ori) e um gene da resistência à canamicina para selecção. A. ADN de gag p37 de SIV Plasmídeo 0 plasmídeo WLV102 é um plasmídeo bacteriano que expressa como o antigénio seleccionado, contra o qual se deseja uma resposta imunitária, o gag p37 de SIV. 0 plasmídeo WLV102 (4383 bp) consiste num gene gag truncado com ARN optimizado (p37) de SIV (Qiu et al, 1999 J. Virol., 73:9145-9152) inserido no vector de expressão do ADN plasmídico WLV001. 0 ARN do gene gag foi optimizado por inactivação das sequências inibidoras, permitindo assim expressão independente Rev de alto nível do gene gag utilizando a tecnologia discutida pormenorizadamente nas patentes norte-americanas n° 5,965,726; 5, 972,596; 6,174,666; 6,291,664; e 6,414,132; e na Publicação de

Patente Internacional no WO 01/46408. O cerne plasmídico de WLV102 consiste em três unidades genéticas. A primeira é uma unidade de expressão genética eucariota que contém elementos genéticos do promotor/intensificador precoce imediato HCMV (Boshart et 48 al. 1985, citado anteriormente) e o sinal de poliadenilação BGH (Goodwin EC e Rottman FM, 1982 J. Biol. Chem. 267: 16330-16334). O gene gag é clonado entre os locais Sall e EcoRI. Este segundo componente é um gene da resistência à canamicina quimérico gene (Km') 4'-nucleotidil transferase tipo la (ver, patente norte-americana n° 5, 851,804) . Este gene foi concebido para conferir resistência a um número limitado de aminoglicósidos enquanto permite a selecção de bactérias contendo o plasmideo. O terceiro componente é uma origem bacteriana de replicação ColEl que é necessária para a propagação do plasmideo durante a fermentação das bactérias. Este plasmideo encontra-se ilustrado na fig IA. B. plasmideos codificadores de um ADN de citoquina -rIL-12 O plasmideo WLV104 IL-12 Rhesus é uma construção promotora dupla que expressa a forma heterodimérica de rhesus IL-12. O plasmideo WLV103 é um plasmideo de expressão promotor duplo que consiste em dois genes codificadores das proteínas humanas IL12 p35 e p40. O plasmideo tem um total de 6259 nucleótidos. Cada cistrão em WLV103 contendo uma ou duas subunidades da interleuquina 12, p35 ou p4 0, está sob o controlo de elementos reguladores separados. A subunidade p35 está sob o controlo do promotor/intensificador HCMV e o sinal de poliadenilação SV40 (clonado entre os locais SaLL e MluI). A subunidade p40 está sob o controlo do promotor SCMV e possui um sinal de poliadenilação BGH (clonado no local Xhol).

O cerne do plasmideo consiste em vários componentes. O primeiro é uma unidade de expressão genética eucariota que contém elementos genéticos do promotor/intensificador precoce imediato HCMV e o sinal de poliadenilação SV40 (Fitzgerald M and Shenk T., 1981 Cell, 24: 251-260). O 49 segundo componente é uma unidade de expressão genética eucariota constituída pelo promotor SCMV (Jeang et al. 1987 J. Virol., 61: 1559-1570) e o sinal de poliadenilação BHG. Este terceiro componente é um gene da resistência à canamicina quimérico gene (Km') adenil 4'-nucleotidil transferase tipo la. O quarto componente é uma origem bacteriana de replicação ColEl que é necessária para a propagação do plasmídeo em bactérias.

Os vectores plasmídicos resultantes gag de SlV/gag de HIV e ADN de IL-12 foram analisados por digestão com enzima de restrição. Os plasmídeos foram transfectados transitoriamente em células de células de rabdosarcoma desenvolvidas em meio DMEM+10% soro fetal de vitela (FCS) e antibióticos. Estas células foram então analisadas para detectar a expressão apropriada das proteínas virais utilizando anticorpo monoclonal específico para gag de HIV (ABI) e soro policlonal de rhesus (de animais infectados com SIV) para gag de SIV em teste Western Blot. Foi detectado IL-12 no sobrenadante com conjuntos ELISA (R&D Systems) que detectam proteínas p70.

Os vectores plasmídicos foram expandidos em células DH10B transformadas, desenvolvidas em meio LB suplementado com canamicina e depois purificado com conjunto Qiagen de acordo com as especificações do fabricante. O ADN foi então analisado por electroforese em gel de agarose em comparação com um padrão conhecido.

Para utilização nas experiências seguintes cada plasmídeo foi formulado a uma concentração de 2,5 mg/mL em 0,25% de bupivacaína até atingir um volume total de 4,0 cc.

Exemplo 2: preparação de vectores vsv recombinantes 50 A. Clonagem de cADN genómico de VSV. 0 fundo genético da manipulação de cADN genómico de VSV é pVSV-XNl (Schnell, M. J., et al 1996 J. Virol., 70:2318-23) . Este clone contém uma forma modificada da sequência cADN da estirpe VSV Indiana (VSVi). As modificações incluem a adição de dois locais de reconhecimento endonuclease de restrição (Xhol e Nhel) e cópias adicionais de sinais de iniciação do gene VSV e de terminação do gene VSV. Quando genes exógenos, tais como env de HIV-1.6P gpl60 ou gag p55 de SIV ou gag de HIV-1, são convenientemente inseridos entre os locais Xhol e NheL, estes reside numa posição adequada para expressão controlada pelos sinais de controlo transcricionais VSV. Igualmente, a sequência cADN VSV é flanqueada por sequências de ADN com actuação cis, necessárias para promover a recuperação as réplicas do vírus vivas. 0 promotor de ARN polimerase T7 dirige a transcrição de uma transcrição primária pelo cADN virai. O ribossoma cliva a transcrição primária para formar a terminação do genoma ARN depois da ARN polimerase T7 terminar a transcrição.

Inicialmente, o clone genómico rVSVi (pVSV-XNl) foi modificado por inserção do gene gag (HIV Clade B) entre os genes G e L para produzir o plasmídeo prVSVi-gag. De modo semelhante, foi feito um clone rVSVi cDNA que contém o gene env de HIV (clone genómico prVSVi-env). As sequências gag e env de cADN foram preparadas por inserção no pVSV-XNl por amplificação das sequências da região codificadora a partir de modelos de plasmídeo que contêm o gene gag HXBc2 de HIV ou o gene env da estirpe HIV 6101. Os iniciadores utilizados para a amplificação PCR continhas locais de clivagem da enzima de restrição terminal apropriados para clonagem posterior; o iniciador 5' continha um local Xhol e 51 o iniciador 3' continha um local Nhel. As sequências de regiões codificadoras amplificadas foram inseridas separadamente em pVSV-XNl para gerar um clone contendo gag e um clone contendo env. 0 gene env inserido em pVSV-XNl foi uma forma modificada que codifica uma proteína de fusão Env HIV /G VSV. Provou-se que a expressão de Env à superfície da célula após infecção com um vector Env rVSV-HIV estava aumentada se a cauda citoplasmática de Env for a substituída pela cauda citoplasmática mais curta da proteína G VSV, utilizando um procedimento PCR de sobreposição (ver, por exemplo Johnson, et al, 1998 citado anteriormente; Johnson et al., 1997, citado anteriormente). 0 cerne do vector destes dois plasmídeos foi alterado alterando o gene G Indiana pelo dos serotipos Chandipura ou New Jersey de acordo com as técnicas publicadas. A troca de genes G foi realizada aproveitando um local Mlul único no gene M e o local Xhol que foi modificado nos clones cADN de VSV.

As sequências codificadoras do gene G VSV da estirpe Chandipura ou da estirpe New Jersey foram amplificadas por PCR, utilizando um iniciador 5' que se prolonga pelo local Mlul no gene M. Foi utilizado um iniciador PCR 3' que contém sequências homólogas do terminal 3' do gene G bem como sequências terminais adicionais correspondendo ao sinal terminação do gene/iniciação do gene e o local Xhol. As sequências codificadoras do gene G amplificadas com estes iniciadores foram utilizadas para substituir o gene G Indiana original depois de ter sido excisado do cerne do plasmídeo com Mlul e Xhol.

B. Recuperação de rVSV dos clones cADN 52 0 cADN plasmídico do genoma ou ARN transcrito a partir de um cADN plasmídico genómico não foi o suficiente para iniciar o ciclo de replicação virai depois de ter sido introduzido numa célula. Em si, o ARN genómico virai não era um modelo activo para tradução ou replicação. Assim, o vírus recombinante deve ser recuperado das várias construções de cADN genómico de VSV. Os procedimentos de recuperação conhecidos na técnica tornaram possível recuperar o vírus de ADNs clonados. Uma recuperação de vírus com êxito exigem a presença de ARN genómico de VSV na célula junto com proteína N de VSV para encapsidar o ARN genómico virai, bem como as proteínas P e L, que formam a polimerase ARN dependente do ARN virai necessária para a síntese de mARN virai e replicação do genoma. A produção de todos estes componentes virais em células cultivadas foi conseguida mediante plasmídeos de co-transfecção para o cADN genómico de VSV mais plasmídeo de expressão que codificam as proteínas N, P e L de VSV.

Todos estes plasmídeos foram concebidos para transcrição pela polimerase ARN T7 fágica; assim, células transfectadas foram também infectadas com um vírus vaccinia recombinante que expressa a polimerase fágica (MVA/T7 ou VTF7-3) . 0 procedimento padrão utilizado para a recuperação VSV encontra-se descrito em Lawson et al. 1995, citado anteriormente; e Schnell et al., 1996 J. Virol., 70:2318-23. Este procedimento foi modificado para o tornar mais eficiente na recuperação de vírus muito atenuados e ainda para tornar o procedimento consistente com as directivas reguladoras. O método é descrito resumidamente em seguida. Células Vero qualificadas em balões de 12,5 cm2 foram transfectadas com um clone genómico de rSVS e plasmídeos 53 compatíveis codificadores dos genes N, P e L de VSV utilizando um procedimento de transfecção de fosfato de cálcio. Quando foi iniciada a transfecção adicionou-se MVA/T7 certificado suficiente para proporcionar uma multiplicidade de infecção por 2 unidades de placa por célula. Três horas depois do início da transfecção, as células foram sujeitas a um choque térmico de 3 horas para melhorar a eficiência de recuperação de vários vírus com ARN de estirpe negativa (Parks, C. L. et al, 1999 J. Virol., 73:3560-6). Passadas 48-72 horas da transfecção, as células e o meio de cultura foram transferidos para um balão maior contendo uma monocamada estabelecida de células Vero e incubou-se por um ou mais dias para permitir a amplificação do vírus recuperado. O vírus colhido depois desta fase de amplificação foi filtrado para remover a maior parte de MVA/T7 contaminante e utilizados para isolamento clonal de uma estirpe de rVSV. A sequência de nucleótidos do ARN genómico virai foi determinada por um método de sequenciamento consensual para analisar os genomas virais de ARN. Resumidamente, ARN virai purificado foi transcrito inversamente para produzir cADN e depois, as regiões sobrepostas do genoma foram amplificadas por PCR, utilizando iniciadores específicos do gene. Os produtos de PCR foram purificados em gel, depois foram sujeitos a sequenciação cíclica utilizando terminadores com corante fluorescente. Os produtos da reacção de sequenciação foram purificados e analisados num sequenciador automático. C. Construções específicas utilizadas nos exemplos

Para produzir os vectores VSV recombinantes específicos utilizados nas experiências seguintes, fundiram-se VSVs recombinantes que expressas o gpl60 89.6P de HIV-1 com a 54 região transmembrana da proteína g VSV (rVSV HIV-lenvG) e SIVmac239 gag p55 (rVSV SlVgag) foram misturados e utilizados como composição imunogénica experimental. Um rVSV que expressa a proteína da hemaglutinina do influenza (rVSV fluHA) foi utilizado como composição de controlo. Vectores VSV recombinantes foram preparados como anteriormente descrito (Rose et al, 2000 J. Virol. 74:10903-10) com o gene codificador do antigénio desejado inserido entre as unidades de transcrição G e L de VSV. A construção seguinte foi descrita em Rose e tal, supra. 1. Construção do plasmídeo.

Um plasmídeo contendo o gene da glicoproteína de Chandipura [G(Ch)] (Masters, P. S., 1989 Virol., 171:285- 290) foi gentilmente fornecido pelo Dr. Amiya Banerjee, Cleveland Clinic. A construção do vector VSV contendo o gene G(Ch) em vez do gene da glicoproteína Indiana [G(I)] foi primeiro removido um local Xhol do gene G(Ch), utilizando mutagenese orientada para o oligonucleótico com os iniciadores complementares 5'- CCCCTAGTGGGATCTCCAGTGATATTTGGAC (SEQ ID NO: 2) e 5'- GTCCAAATATCACTGGAGATCCCACTAGGGG (SEQ ID NO: 3) e o conjunto de mutagenese da QuikChange da Stratagene. A mutação de CTCGAG (SEQ ID NO: 4) em CTCCAG (SEQ ID NO: 5) eliminou o local Xhol sem afectar a sequência de aminoácidos da proteína G(Ch) . O gene foi então amplificado por PCR, utilizando polimerase de ADN Vent (New England Biolabs). 0 iniciador de avanço foi 5'- GATCGATCGAATTCACGCGTAACATGACTTCTTCAG (SEQ ID NO: 6),

contendo um local Mlul (sublinhado) a montante do codão de iniciação ATG da proteína G(Ch). O iniciador inverso foi 5'-GAACGGTCGACGCGCC

TCGAGCGTGATATCTGTTAGTTTTTTTCATATCATGTTGTTGGGCTTGAAGATC (SEQ 55 ID NO: 7) e continha os locais Sall e Xhol (negrito) seguidos dos sinais de iniciação e terminação transcrição VSV (sublinhado), seguido pelo complemento da sequência codificadora 3' de G(Ch). 0 produto de PCR foi digerido com Mlul e Sall e clonado no vector pVSVXN-1 (Schnell, et al 40 J. Virol. 70:2318-2323) que tinha sido digerido com Mlul e Xhol para remover a sequência codificadora de G(I) de VSV (Sall e Xhol deixam terminais compatíveis para ligação). O plasmídeo derivado por este método foi designado pVSV(GCh)XN-1 e contém o local de expressão para genes exógenos flanqueados por locais Xhol e Nhel únicos entre o gene G(Ch) e o gene L.

Um procedimento idêntico ao anteriormente descrito foi utilizado para gerar o vector contendo o gene da proteína G(NJ) do plasmídeo pNJG (Gallione, C. J., e J. K.Rose. 1983 J. Virol. 46:162-169). O iniciador directo foi 5-GATCGATCGAA TTCACGCGTAATATGTTGTCTTATCTAATCTTTGC (SEQ ID NO: 8), e o iniciador reverso foi 5'-GGAACGGTCGACGCGCCTCGAGCGTGATATCTGTT AGTTTTTTTCATATTAACGGAAATGAGCCATTTCCACG (SEQ ID NO: 9) . Os locais indicador por letras a negrito e sequências sublinhadas são tal como descrito para a construção Chandipura anterior e as fases de clonagem seguintes foram também descritas anteriormente. O plasmídeo de vector final derivado foi designado pVSV(GNJ)XN-1 e contém o local de expressão para genes exógenos flanqueados por locais Xhol e Nhel únicos entre o gene G(NJ) e o gene L de VSV.

Para gerar os vectores contendo o gene 89.6 Env de HIV, o gene codificador da protein envelope 89.6 com a cauda citoplasmática G de VSV foi excisado com Xhol e Nhel de pVSV-89.6gpl60G (Johnson et al 1997, citado anteriormente) e clonado entre os locais Xhol e Nhel no vector 56 pVSV(GNJ)XN-1 ou pVSV(GCh)XN-1. Este gene gpl60G codifica todos os domínios gpl20 e os domínios ectomembrana e transmembrana de gp41 e possui quatro aminoácidos do domínio citoplasmático Env 89.6 (N-R-V-R) (SEQ ID NO: 10) fundido aos 26 aminoácidos C-terminais do domínio citoplasmático G de VSV, a começar na sequência I-H-L-C (SEQ ID NO: 11). 2. Recuperações de vírus recombinantes. VSVs recombinantes foram recuperados utilizando métodos estabelecidos (Lawson et al 1995 citado anteriormente). Resumidamente, células do rim de hamster bebé foram cultivadas até uma confluência aproximada de 60 % em placas de 10-cm. As células foram depois infectadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 com vTF7-3, um vírus vaccinia recombinante que expressa polimerase ARN T7 (Fuerst et al 1987 Mol. Cell Biol 7:2538-2544). Passada 1 hora, cada placa de células foi transfectada com 3 pg de pBS-N, 5 pg de pBS-P, 1 pg de pBS-L e 10 pg do plasmídeo codificador de um dos três recombinantes integrais descritos anteriormente. As transfecções foram realizadas com um reagente lipossoma catiónico contendo brometo de dimetildioctadecilamónio e dioleilfosfatidiletanolamina (Rose et al, 1991 Biotechniques 10:520-525). As células foram então incubadas a 37°C durante 48 h. Os sobrenadantes das células foram passados através de um filtro de 0,2 pm para remover a maioria dos vírus vaccinia e depois foram aplicados a células BHK frescas durante mais 48 horas a 37 °C. Para algumas recuperações, incluiu-se um plasmídeo adicional, codificador de G de VSV (pBS-G), 4 pg/placa, incluiu-se com os plasmídeos de suporte N, P e L. A recuperação de vírus infecciosos foi confirmada por detecção das monocamadas de células BHK para detectar o 57 efeito citopático VSV. Placas de vírus foram então isoladas em células BHK e estirpes virais de placas individuais foram cultivadas mediante adição de vírus de uma única placa numa placa de 10-cm de diâmetro de células BHK. Estas estirpes foram guardadas a 80 °C. Estes títulos obtidos por VSV(GI)-89.6G, VSV(GCh)-89.6G e VSV(GNJ)- -89.6G encontravam-se todos entre 107 e 108 PFU/ml após congelamento e descongelamento, um procedimento que reduz aproximadamente três vezes os títulos VSV.

Para utilizar nas experiências seguintes, cada construção rVSV foi diluído até atingir um volume final de 0,8 cc com DME estéril.

EXEMPLO 3: REGIME DE IMUNIZAÇÃO DOSE INICIAL/REFORÇO A. Protocolos de Imunização

Macacos Rhesus (5 por grupo) foram imunizados por injecção intramuscular com 5 mgs de um ADN plasmídico que expressa poliproteína p37 gag de SIV (grupos 1 e 2) ou 10 mgs de um ADN plasmídico vazio (grupos 3 e 4). Todos estes ADN plasmídicos e respectivas formulações encontram-se pormenorizadamente descritos no exemplo 1. A escala de imunização com ADN proporcionada pró uma imunização inicial no dia 0, seguida de uma primeira e segunda imunização de reforço nas semanas 4 e 8. As injecções foram realizadas em quatro locais nos deltoides e quadriceps com 1 cc por local, utilizando uma agulha e seringa. Os macacos receberam depois reforços na semana 15 via inoculação intranasal (0,4 cc/narina com pipeta manual) com o vírus da estomatite vesicular recombinante (rVSV) do serotipo Indiana (I) à base do vector do exemplo 2, contendo o gene env gpl60 HIV-1 (5 x 106 pfu) e um segundo rVSV(I) contendo 58 o gene ρ55 gag de SIV (5 x pfu) (grupos 2 e 3) our VSV(I) contendo o gene da hemaglut inina influenza (1 x 107 pfu) (grupos 1 e 4). Os macacos receberam novamente reforços na semana 23 via inoculação intranasal (0,4 cc/narina com pipeta manual) com o rVSV (serotipo Chandipuri, Ch) à base do vector do exemplo 2, contendo o gene env gpl60 HIV-1 (5 x 106 pfu) e um segundo rVSV(Ch) contendo o gene p55 gag de SIV (5 x 106 pfu) (grupos 2 e 3) our VSV (Ch) contendo o gene da hemaglut inina influenza (1 x 107 pfu) (grupos 1 e 4) .

Os macacos foram vigiados constantemente para detectar a indução de respostas imunitárias celulares e humorais no sangue periférico e respostas de anticorpos em várias superfícies da mucosa. A vigilância envolveu a realização do teste de titulação imunoenzimática com formação de manchas (ELISpot) para o grupo de peptideos gag p55 de SIV para interferão gama, um ELISpot para o grupo de peptideos env 6101 de HIV-1 e um ELISpot para o grupo de peptideos VSV N para interferão gama. O teste ELISpot detectou respostas imunológicas celulares no PBL.

As respostas imunológicas humorais foram examinadas mediante avaliação do soro (fig. 4), lavagem nasal, secreções rectais e saliva (dados não apresentados) para títulos de IgG anti-gag p27 de SIV em ELISA e títulos anti gpl60 env de HIV-1 por ELISA (dados não apresentados). Para o soro, os anticorpos empregues em ELISA foram anticorpos normais para os vírus quiméricos SHIV89.6 e SHIV89. B. Teste ELISPOT para detectar células humanas e murinas secretoras de citoquinas. O teste de filtração em imunoplaca, também chamado teste de titulação imunoenzimática com formação de manchas (ELISpot - enzyme-linked immunosorbent spot), foi 59 inicialmente desenvolvido para detectar e quantificar células B secretoras de anticorpos individuais. Originalmente a técnica fornecia uma alternativa rápida e versátil aos testes com placas formadoras de células convencionais. Modificações recentes melhoraram tanto a sensibilidade dos testes ELISpot que podem ser detectadas células produzindo apenas 100 moléculas de proteína específica por segundo. Estes testes tiram partido da concentração relativamente alta de uma dada proteína (tal como uma citoquina) no ambiente vizinho da célula secretora de proteína. Estes produtos das células são capturados e detectados usando anticorpos com alta afinidade.

Os testes ELISpot utilizam dois anticorpos de alta afinidade, específicos de citoquinas dirigidos contra epítopos diferentes na mesma molécula de citoquina: dois anticorpos monoclonais ou uma combinação de um anticorpo monoclonal e um anti-soro polivalente. o ELISpot gera manchas com base numa reacção colorimétrica que detecta a citoquina segregada por uma única célula. A mancha representa uma "pegada" da célula produtora de citoquina original. As manchas (isto é, células formadoras de manchas ou SFC) são permanentes e podem ser quantificadas visualmente, microscopicamente ou electronicamente. O teste ELISPot foi executado da seguinte forma: Foram revestidas placas ELISpot de noventa e seis poços de fundo plano (Millipore, Bedford, MA) de um dia para o outro com um anticorpo monoclonal rato anti-humano interferão γ (hIFN-γ) (clone 27, BD-Pharmingen, San Diego CA) a uma concentração de 1 pg/mL, lavadas dez vezes com lx de PBS suplementado com 0,25% de Tween-20, e bloqueadas durante 2 horas com PBS contendo 5% de soro fetal de bovino (FBS) . Foram isolados linfócitos de sangue periférico (PBLs) de 60 macaco rhesus a partir do sangue total heparinizado acabado de colher por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque e ressuspenso em meio de cultura completo (meio RPMI 164 0 suplementado com 5% de FCS, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 1 mM de HEPES, 100 μΜ de aminoácidos não essenciais) contendo ou 50 pg/mL de PHA-M (Sigma), um conjunto de peptídeos de aminoácidos sobrepostos em 11 aminoácidos estendendo-se pela totalidade da estrutura de leitura aberta do gag de SIV (1 pM de concentração final de peptideo), ou apenas meio. O número inicial de células foi de 2 x 105 PBLs em 100 pL/poço e testadas em poços duplicados. As células foram incubadas durante 16 horas a 37°C e depois removidas da placa através de lavagem primeiro com água desionizada e depois 10 vezes com lx de PBS contendo 0,25% de Tween-20. Seguidamente, as placas foram tratadas com um anticorpo detector biotinilado anti-hIFN-γ policlonal de coelho (0,2 pg/poço, Biosource, Camarillo, CA) diluído com lx de PBS contendo 1% de BSA e incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas. As placas foram lavadas 10 vezes com lx de PBS contendo 0,25% de Tween-20 e tratadas com 100 pL por poço de conjugado de estreptavidina com fosfatase alcalina (Southern Biotech, Birmingham AL) diluído a 1:500 com lx de PBS contendo 5% de FBS e 0,005% de Tween-20 e incubadas 2,5 horas adicionais à temperatura ambiente. Foi removido o conjugado não ligado através de enxaguação da placa 10 vezes com lx de PBS contendo 0,25% de Tween-20. Foi então adicionado substrato cromogénico (100 pL/poço, 1-step NBT/BCIP, Pierce, Rockford, IL) durante 3-5 minutos, enxaguado com água, a placa foi secada com ar e as manchas 61 resultantes foram contadas a olho usando um microscópio de dissecação invertido. 0 desempenho do teste ELISpot para a presente invenção mediu o número de células CD8+ T (CTLs) e células CD4+ T induzidas em resposta ao método de imunização dose inicial/reforço desta invenção tal como medido pela produção de interferão gama. Esta avaliação foi seguida até à semana 25 para os macacos tratados mencionados anteriormente (após 3 doses inicias com ADN e 2 reforços com VSV). C. Resultados

Após imunização primária com ADN, respostas de ELISpot de IFN-γ especifico de gag de SIV foram rapidamente detectadas em 8 de 10 macacos imunizados com ADN de gag de SIV/rIL-12 (média de 254 SFC/106 células) . Após a segunda imunização com ADN de gag/IL-12 de SIV, 10 de 10 macacos imunizados desenvolveram respostas de ELISpot de alto nível (média de 1133 SFC/105) e uma terceira dose de ADN de gag/IL-12 reforçou as respostas de ELISpot específicas de gag na maioria dos animais (média de 1506 SFC/106 células). Após o primeiro reforço de rVSV env HlV/rVSV gag SIV, a média de respostas de ELISpot de gag de SIV foram substancialmente mais altas (3772 SFC/106 células) do que as respostas que receberam apenas uma única imunização de rVSV env HlV/rVSV gag SIV (média de 386 SFC/106 células) . Estes resultados suportam o uso de uma dose inicial de ADN reforçada com citoquina para aumentar a imunogenicidade da imunização com rVSV.

Estes resultados são descritos na Tabela 1 em seguida e nas FIGs. 2, 3, 4 e 5. A FIG. 2 apresenta as respostas de ELISpot de IFN-γ específico de rVSV N em células mononucleares de sangue periférico não fraccionado (PBMC) 62 destes animais imunizados após a semana 25. A FIG. 3 apresenta as respostas de ELISpot do IFN-γ especifico de HlV env 6101 para as mesmas amostras. Os asteriscos indicam onde ocorreram diferenças estatísticas significativas em p=0-.0001. A FIG. 4 apresenta os resultados das respostas de anticorpos séricos medindo os títulos de IgG p27 anti gag de SIV através de ELISA e os títulos de anti-HlV-lgpl60 através de ELISA. Um protocolo de imunização com o ADN plasmídico codificador da proteína SIV gag com um reforço de um vector VSV que expressa uma proteína flu HA encontra-se representado por (♦) . Um protocolo da invenção, envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN gag plasmídico, seguida de um reforço com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env encontra-se representado por () . Um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN de controlo vazio, seguida de imunização com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env encontra-se representado por (A). Um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial com ADN plasmídico de controlo, seguida de imunização com VSV que expressa a proteína flu HA encontra-se representado por (·). Cada grupo representa os resultados de 5 animais. As diferenças estatisticamente significativas entre os grupos encontram-se representadas como p=0,0073 (*); p=0,5941 (#) ou p=0,0027 (¥). A FIG. 5 apresenta a média das respostas ELISpot do IFNy específico de gag de SIV para as mesmas amostras. Um protocolo de imunização com o ADN plasmídico codificador da proteína SIV gag com um reforço de um vector VSV que expressa uma proteína flu HA encontra-se representado por (♦) . Um protocolo da invenção, envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN gag plasmídico, seguida de um 63 reforço com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env encontra-se representado por () . Um protocolo envolvendo uma imunização com uma dose inicial de ADN de controlo vazio, seguida de imunização com VSV que expressa as proteínas HIV gag e env encontra-se representado por (A) . 0 (♦) representa um protocolo envolvendo uma imunização inicial com ADN plasmídico de controlo, seguida de imunização um VSV que expressa a proteína flu HA. Cada grupo representa os resultados de 5 animais. As diferenças estatisticamente significativas entre os grupos encontram-se representadas por parêntesis para p=0,0001 e p=0,0002. A tabela 1 descreve os mesmos resultados em forma de tabela.

Quadro 1: Média das respostas de ELISpot do IFN-gamma específico do gag de SIV em macaco rhesuss após uma dose inicial de ADN de gag do SlV/rhesus IL-12 e um reforço de gag de rVSV-SIV/env de rVSV-HIV

Grupo N°/Protocolo/N° de Animais Dose inicial Reforço Média de respostas ELISpot de iFNy específico de gag do SIV (N° SFC/106 PBLs)a 1, apenas dose inicial (n=5) ADN de gag do SIV/IL-12 VSV FluHA 471 2, dose inicial/reforço (n=5) ADN de gag do SIV/IL-12 Gag do VSV-SlV/env do HIV 2,338 3, apenas reforço (n=5) DNA vazio Gag do VSV-SlV/env do HIV 420 4, controlo (n=5) DNA vazio VSV FluHA 55 64 64 a A média das respostas de ELISpot de gag do SIV específico é descrita na semana 25 após a imunização inicial de ADN.

Os resultados destes testes demonstram um efeito sinergético surpreendente de um regime de dose inicial/reforço de acordo com esta invenção, quando comparados com os resultados da administração de apenas composições de dose inicial múltiplas e apenas composições de dose de reforço múltiplas. A combinação da apresentação do antigénio desejado por uma administração de ADN plasmidico seguida de um reforço rVSV produz um aumento de células T específicas do antigénio no sujeito imunizado que é consideravelmente maior que qualquer resposta aditiva. De modo similar, o aumento demonstrado na resposta humoral ao antigénio desejado é inesperadamente elevada com a utilização das duas composições imunogénicas de ADN plasmidico e rVSV num protocolo de imunização.

EXEMPLO 4: MODELO DE MACACO PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA HIV São imunizados Rhesus (Rh) macacos usando a estratégia de dose inicial/dose de reforço do Exemplo 3 e os plasmideos e os vectores VSV descritos neste de acordo com os mesmos protocolos. Cerca de 32 semanas após a primeira administração de composição de dose inicial, os macacos são desafiados com uma dose de 330 doses infecciosas de macaco a 50% (MID50) de vírus SHIV89.6P recombinante de SIV/HIV patogénico (Reimann et al, 1996 J. Virol., 70:3198-3206; Reimann et al 1996 J. Virol., 70:6922-6928).

Após 50-70 dias após o desafio, os animais são vigiados para detectar o aparecimento da doença. É vigiada a indução de respostas mediadas pelas células e de anticorpos nos 65 animais imediatamente antes de, e uma e duas semanas após cada imunização. 0 soro colhido antes do desafio e nas semanas 2, 4, 6, 8 e 12 após o desafio é testado para detectar respostas de anticorpos neutralizantes contra HIV-1 89,6, 89,6P, 6101 e outros isolados primários Clade B. Durante a fase de imunização da experiência, imediatamente antes de e de quinze em quinze dias após o desafio, são vigiadas as contagens CD4/CD8. Imediatamente antes e todas as semanas após o desafio, são determinadas as cargas virais no soro por análise de ADN ramificado. São examinados outros fluidos corporais (secreções vaginais, rectais e nasais e também saliva) dos animais para detectar respostas imunitárias celulares e humorais.

Respostas imunitárias mediadas por células ao antigénio desejado são analisadas usando vários dos testes baseados em células mais apropriados, os quais incluem o teste de CTL de libertação de 51Cr, coloração com tetrâmero de MHC de Classe I solúvel, o teste ELISpot e análise de citoquina intracelular. As respostas de anticorpos das mucosas são avaliadas através de técnicas de ELISA optimizadas para o uso com amostras de mucosa. As respostas de anticorpos no soro são avaliadas através de técnicas ELISA padrão. Adicionalmente, é examinado soro de todos os animais imunizados para repostas de anticorpos neutralizantes contra Env 6101 do HIV e outros isolados Clade B primários. A FIG. 6 é ilustrativa de que as respostas imunitárias elevadas provocadas pelas combinações de dose inicial/dose de reforço desta invenção resultam em protecção acrescida contra a SIDA, conforme medido por um decréscimo da perda de células T CD4 durante pelo menos 250 dias após o desafio. 66

Adicionalmente à monitorização das respostas imunitárias provocadas pela composição imunogénica, o potencial de transmissão dos vectores virais vivos é avaliado pela determinação do nivel e duração durante o qual é vertido. Lavagens nasais obtidas em intervalos frequentes durante as três primeiras semanas após cada imunização são testadas para a presença de VSV vivo. A carga virai do plasma é igualmente examinada para detectar a presença de cópias de vírus vivas. A FIG. 7 demonstra que as respostas imunitárias elevadas provocadas pela combinações de dose inicial/dose de reforço resultam num decréscimo no vírus circulante no plasma durante pelo menos 250 dias após o desafio.

Os resultados de tais exames são provavelmente também células T CD8+ e CD4+ do antigénio específico muito elevadas nos animais imunizados de acordo com esta invenção em contraste com animais de controlo. É antecipado que os animais imunizados de acordo com a metodologia dose inicial/dose de reforço desta invenção permaneçam saudáveis após exposição a HIV, enquanto os animais não imunizados irão desenvolver SIDA.

Antecipa-se que a comparação dos resultados deste protocolo com outras metodologias de dose inicial/dose de reforço conhecidas demonstre que o método da presente invenção tem vantagens em termos de segurança para os animais imunizados e em provocar níveis mais altos de CTLs anti-HIV e anticorpos do que os fornecidos por imunização com imunizações de composições de dose inicial única ou múltiplas de ADN ou com apenas imunizações com vectores rVSV única ou múltiplas. De acordo com esta invenção é provável que as dose inicial/dose de reforço repetidas sejam sinergéticas e portanto são igualmente benéficas 67 profilaticamente para os sujeitos pré-expostos e benéficas terapeuticamente para os sujeitos já infectados com HIV.

Acredita-se que várias modificações e alterações menores no método e componentes sejam evidentes para os peritos na especialidade.

Lisboa, 68

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Wyeth Eldridge, John H. Israel, Zimra R. Egan, Michael A. Udem, Stephen A. <120> Composição imunogénica e métodos

<130> AM-101319PCT <150> US 60/457,876 <151 >2003-03-26 <150> US 60/546,733 <151 >2004-02-23 <160> 11

<170> Patenteln versão 3,2 <210> 1 <211 >42 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> peptídeo beta-amilóide 1-42 <4 0 C i > 1 Asp Ala Glu Phe Arg HÍS Asp Ser Gly Tyr Glu Vai HÍS HÍS Gin Lys 1 5 10 15 Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp vai Gly Ser Asrt Lys Gly Ala ile ile 20 25 30 Gly Leu Met vai Gly Gly vai Vai lie Ala <210> 2 35 40 <211>31 69

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador complementar <400>2 ccoctagtgg gatctccagt gaíattlgga c 31

<210> 3 <211 >31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador complementar <4 0 0>3 gtccaaatat cactggagat occacíaggg g 31

<210> 4 <211> 6 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador complementar <400>4 ctcgag 8 <210> 5 <211> 6

<212> ADN 70 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador complementar <400>5 cfccag 6

<210> 6 <211>36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador directo <400> 6 gatcgatcga attcacgcgf aacatgactt cttcag 36

<210> 7 <211>7 0 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador inverso <400>7 gaacggtcga cgcgcctcga gcgtgatatc tgttagtttt tttcatatca tgttgttggg 60 cttgaagatc 70 <210> 8

<211>4 6 <212> ADN 71 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador directo <400>8 gatcgatcga attcacgcgt aatatgttgt cttatctaat ctttgc 46

<210>9 <211>73 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador inverso <400>9 ggaacggtcg acgegccttg agcgtgatat ctgttagttt ttttcatatt aacggaaatg 60 agccatttcc acg 73 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Gene G 89.6 Env HIV <400> 10

Asn Arg vai Arg 1

<210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Cauda citoplasmática G VSV <4 0 0> 11 72 lie His Leu Cys 1 73

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o EPO rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição:

US 6.210.663 B wo 9634625 A wo 02097091 A US 5168062 A US 5385839 A wo 9817799 A wo 9943839 A US 5593972 A US 5817637 A US 5830876 A US 5891505 A US 6044886 A US 6168943 A US 5789299 A wo 9902657 A wo 993264 A US 5830877 A wo 9951259 A

US 5965726 A 74

US 5972596 A US 6174666 A US 6291664 A US 6414132 A wo 0146408 A wo 9810088 A wo 0055335 A US 5723127 A US 5078996 A US 4912094 A US 6113918 A US 5057540 A US 6207646 B wo 9313302 A wo 9219265 A wo 0018434 A wo 02098368 A wo 02098369 A US 5457038 A US 5648467 A US 6168923 A US 5380876 A US 5981505 A US 6383512 A

US 5703055 A 75

75 5739118 A 5837533 A 9610038 A 9416737 A 9921591 A 9945966 A 9820734 A 5851804 A 60457876 ; B 60546733 1 B us us • wo • wo • wo • wo • wo us us • us

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Lisboa 23/07/2010

Claims (24)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma primeira composição compreendendo um ADN plasmídico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora de um antigénio sob o controlo de sequências reguladoras que orientam a respectiva expressão pelo ADN plasmídico mencionado na preparação de um medicamento destinado a induzir uma resposta imunitária específica do antigénio num sujeito mamífero, compreendendo a indução de resposta imunitária específica do antigénio mencionada (a) a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz da primeira composição mencionada e (b) a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma segunda composição compreendendo vírus da estomatite vesicular (VSV), compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificadora do antigénio mencionado sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão pelo VSV recombinante.

2. Utilização de uma segunda composição compreendendo um vírus da estomatite vesicular (VSV), compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de um antigénio sob o controlo de sequências reguladoras que orientam a respectiva expressão pelo VSV recombinante mencionado na preparação de um medicamento destinado a induzir uma resposta imunitária específica do antigénio num sujeito mamífero, compreendendo a indução de resposta imunitária específica do antigénio mencionada (a) administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma primeira composição compreendendo ADN plasmídico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora do antigénio mencionado sob controlo de sequências 2 reguladoras que dirigem a respectiva expressão pelo ADN plasmídico e (b) administração ao sujeito de uma quantidade eficaz da segunda composição mencionada e

3. Utilização de (a) uma primeira composição compreendendo ADN plasmídico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora de um antigénio sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão pelo ADN plasmídico. (b) uma segunda composição compreendendo um vírus da estomatite vesicular (VSV), compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de um antigénio sob o controlo de sequências reguladoras que orientam a respectiva expressão pelo VSV recombinante mencionado na preparação de um medicamento destinado a induzir uma resposta imunitária específica do antigénio num sujeito mamífero.

4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o VSV mencionado tem capacidade de replicação ou não tem capacidade de replicação.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira composição mencionada é administrada ao sujeito mencionado pelo menos uma vez antes da administração da segunda composição mencionada.

6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a segunda composição mencionada é administrada ao sujeito mencionado pelo menos uma vez.

7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a segunda composição mencionada é administrada ao sujeito mencionado pelo menos uma vez antes da administração da primeira composição mencionada. 3

8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a primeira composição mencionada é administrada ao sujeito mencionado pelo menos uma vez.

9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o medicamento mencionado inclui ainda uma citoquina e em que (a) ou (b) inclui ainda a administração de uma quantidade eficaz da citoquina mencionada ao mamífero mencionado.

10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a citoquina mencionada é administrada em (a) é uma composição de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ADN codificadora da citoquina mencionada sob controlo de sequências reguladoras que orientam a respectiva expressão pelo ADN plasmídico.

11. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a citoquina mencionada administrada em (b) é uma proteína.

12. Utilização de acordo com a reivindicação 10 ou a reivindicação 11, sendo a citoquina mencionada seleccionada do grupo constituído por IL-12, IL-15, GM-CSF e combinações destes.

13. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência codificadora da citoquina está presente no mesmo ADN plasmídico que a sequência codificadora do antigénio mencionada ou está presente num ADN plasmídico diferente do AND plasmídico codificador do antigénio mencionado.

14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o antigénio mencionado é uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, um fragmento ou fusão destes, sendo a proteína mencionada derivada de um membro seleccionado do grupo constituído por bactérias, vírus, fungos, parasitas, uma célula 4 cancerígena, uma célula de tumor um alérgeno e uma molécula própria.

15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o antigénio mencionado é um vírus da imunodeficiência humana ou do símio seleccionado do grupo constituído por gag, pol, env, nef, vpr, vpu, vif e tat, e fragmentos imunogénicos ou fusões destes.

16. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a primeira composição mencionada compreende (i) um ADN plasmídico compreendendo uma sequência de ADN codificadora de mais do que uma cópia de um antigénio igual ou diferente ou (ii) mais de um ADN plasmídico, em que cada ADN plasmídico codifica um antigénio igual ou diferente.

17. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o medicamento mencionado inclui ainda pelo menos dois VSVs recombinantes e em que (b) inclui ainda a administração de pelo menos dois VSVs recombinantes.

18. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que cada VSV recombinante mencionado possui uma (i) proteína VSV G diferente e um serotipo VSV diferente, mas a mesma sequência codificadora do antigénio, (ii) uma sequência codificadora do antigénio diferente mas a mesma proteína VSV G ou (iii) sequências codificadoras de antigénio e proteínas VSV G diferentes.

19. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a segunda composição mencionada compreende pelo menos dois rVSVs mencionados e em que cada rVSV possui um gene G de um serotipo VSV diferente.

20. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a administração da segunda 5 composição compreende a administração em série de pelo menos duas composições rVSV.

21. Kit de indução de uma resposta imunitária especifica do antigénio nu sujeito mamifero, compreendendo pelo menos um ADN plasmidico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora de um antigénio sob o controlo de sequências reguladoras que orientam a respectiva expressão pelo ADN plasmidico mencionado e pelo menos uma segunda composição compreendendo um vírus da estomatite vesicular recombinante (VSV) compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificadora do antigénio mencionado sob o controlo de sequências reguladoras que orientam a respectiva expressão pelo VSV recombinante mencionado.

22. Conjunto de acordo com a reivindicação 21, em que o VSV mencionado é capaz de replicação ou não é capaz de replicação.

23. Conjunto de acordo com a reivindicação 21 compreendendo ainda uma composição de citoquina.

24. Conjunto de acordo com a reivindicação 23, em que a composição de citoquina mencionada compreende uma composição de ácido nucleico compreendendo ADN plasmidico, compreendendo uma sequência de ADN codificadora da citoquina mencionada sob controlo de sequências reguladoras que dirigem a respectiva expressão pelo ADN plasmidico. Lisboa, 23/07/2010 gag p37 de SIV com ARN optimizado Promotor Rhesus IL12 duploo

i/v FiRlA SFC específico de VSV N/106 células 8 gag DNA/VSV flu (n=5) B gag DNA/VSV gag_env (n=5) D con DNA/VSV gag_env (n=5) S con DNAAfSV flu (n=5) SFC específico de Env/106 células

3/7 Week H- iQ Média Geométrica do título ELISA de Gag p27 de SIV

L·/^ SFC específico de Gag/106 células

L·/^

Fig.5

Dia seguinte ao desafio SHIV Z,/9 Carga virai no plasma (cópias/ml) +/- erro padrão

Fig.7 L^/L·