JP2009542196A - 小型の化膿連鎖球菌抗原およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、任意で付加的なアミノ酸残基からさらになる、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれか一項記載の化膿連鎖球菌(S. pyogenes)の1種類の抗原またはその機能的に活性な変種からなるペプチド；それをコードする核酸；該ペプチドまたは該核酸を含む薬学的組成物、特にワクチン；該抗原に特異的に結合する抗体またはその機能的に活性な断片；該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株；該抗体を作製するための方法；該抗体を含む薬学的組成物；対象の免疫化または治療のための医薬を製造するための前記ペプチドまたは前記核酸の使用；感染症を治療するための医薬を製造するための前記抗体またはその機能的断片の使用；化膿連鎖球菌感染症を診断する方法；前記ペプチドに結合することができるリガンドを同定するための方法；ならびに前記ペプチドの相互作用相手を単離および/または精製および/または同定するための前記ペプチドの使用に関する。
Description
本発明は、任意で付加的なアミノ酸残基からさらになる、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)(S. pyogenes)の1種類の抗原またはその機能的に活性な変種からなるペプチド；それをコードする核酸；該ペプチドまたは該核酸を含む薬学的組成物、特にワクチン；抗原に特異的に結合する抗体またはその機能的に活性な断片；該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株；該抗体を作製するための方法；該抗体を含む薬学的組成物；対象の免疫化または治療のための医薬を製造するための前記ペプチドまたは前記核酸の使用；感染症を治療するための医薬を製造するための前記抗体またはその機能的断片の使用；化膿連鎖球菌感染症を診断する方法；前記ペプチドに結合することができるリガンドを同定するための方法；ならびに前記ペプチドの相互作用相手を単離および/または精製および/または同定するための前記ペプチドの使用に関する。
A群連鎖球菌(GAS)とも呼ばれる化膿連鎖球菌は、重要なグラム陽性細胞外細菌性病原体であり、一般にヒトに感染する。GASは、咽頭または皮膚にコロニーを形成し、かつ、いくつかの化膿性感染症および非化膿性続発症に関与している。これは主として小児の疾患であり、ヒトにおける細菌性咽頭炎、猩紅熱、膿痂疹、および敗血症を含む様々な感染症を引き起こす。数十年に及ぶ疫学的研究により、特定の血清型がそれぞれ咽頭感染症または皮膚感染症にしばしば関連しているとする独特な咽頭菌株および皮膚菌株という概念がもたらされた(Cunningham, M.(2000). Clin Microbiol Rev 13：470-511(非特許文献1))。GASは、米国で最近復活している連鎖球菌毒素ショック症候群に関連した壊死性筋膜炎に関与していることが発見され(Cone, L., et al.(1987). New Engl J Med 317：146-9(非特許文献2)；Stevens, D.(1992). Clin Infect Dis 14：2-11(非特許文献3))、皮膚および軟部組織に侵入して組織または肢の破壊をもたらす「肉食性」細菌として説明されている。
急性リウマチ熱、急性糸球体腎炎、および反応性関節炎などいくつかの連鎖球菌感染後の続発症が、感染後にヒトにおいて発生し得る。急性リウマチ熱およびリウマチ性心疾患は、これらのうちで、最も重篤な自己免疫性続発症であり、世界中で小児の能力障害および死亡を招いている。化膿連鎖球菌はまた、猩紅熱および壊死性筋膜炎など重度の急性疾患も引き起こす場合があり、トゥレット症候群、チック、ならびに運動および注意の障害に関連付けられている。
A群連鎖球菌は、咽頭痛および咽頭炎の最も一般的な細菌性原因であり、季節によって、一般医療診療における診療室への電話全体の少なくとも16％を占める(Hope- Simpson, R.(1981). J Hyg(Lond) 87：109-29(非特許文献4))。これは、主として、年齢5歳〜15歳の間の学齢児童に発症する(Cunningham、前記)。すべての年齢が、例えば学校内など混雑した条件下での該菌の蔓延に影響されやすい。GASは常在菌叢とみなされていないが、A群連鎖球菌の咽頭保菌は、臨床症状を伴わずに発生し得る。
A群連鎖球菌は、その糖質に基づく血清学的タイピングのランスフィールド分類スキームによって区別するか、または、細菌を塩酸と共に煮沸することによって抽出できる表面タンパク質に基づいてMタンパク質血清型に分類することができる。これにより、80種を超える血清型が同定され、これはまた、分子的アプローチによって分類することもできる(emm遺伝子)。分子タイピングにより、150種を超える個別のemm型が同定された。化膿連鎖球菌のいくつかのMタンパク質血清型は、主として咽頭炎およびリウマチ熱に関連しているのに対し、他のものは、主として膿皮症および急性糸球体腎炎を引き起こすように思われる(Cunningham、前記)。
同様に、C群連鎖球菌およびG群連鎖球菌は、咽頭炎および時折毒素ショックを引き起こす際に関係があるとされており、これらは、咽頭培養後に区別されなければならない(Hope-Simpson、前記；Bisno, A., et al.(1987). Infect Immun 55：753-7(非特許文献5))。
現在、連鎖球菌感染症は、抗生物質療法によってのみ治療され得る。しかしながら、抗生物質で治療された人の25〜30％は、再発性疾患を示し、かつ/または粘膜分泌液中に菌を放出する。現在のところ、連鎖球菌感染症を回避するために利用可能な予防的治療(ワクチン)は無い。
したがって、連鎖球菌感染症を予防するか、または寛解させるのに効果的な治療が依然として必要とされている。ワクチンは、連鎖球菌による感染症を予防し得るだけでなく、より具体的には、宿主組織のコロニー形成を防止または改善し、それによって、咽頭炎および他の化膿性感染症の発病率を低下させ得る。リウマチ熱、急性糸球体腎炎、敗血症、毒素ショック、および壊死性筋膜炎などの非化膿性続発症の消失が、急性感染の発生率および保菌を減少させることの直接的な結果であると思われる。他の連鎖球菌に対する交差防御を示すことができるワクチンもまた、他のすべてのβ溶血性連鎖球菌種、すなわちA群、B群、C群、およびG群によって引き起こされる感染症を予防するか、または寛解させるために有用であると思われる。
ワクチンは、多種多様の様々な抗原を含んでよい。抗原の例は、完全に死滅させるか、または弱毒化した菌、これらの菌/組織の細画分、タンパク質、または最も単純な形態においてはペプチドである。また、グリコシル化されたタンパク質またはペプチドの形態の抗原は免疫システムによっても認識されることができ、また、多糖類または脂質であっても、またはそれらを含んでもよい。例えば、細胞障害性T細胞(CTL)は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)を伴う通常アミノ酸長8〜11の短いペプチドの形態の抗原を認識するため、短いペプチドが使用され得る。B細胞は、アミノ酸4〜5個の短さの直線状エピトープ、ならびに3次元構造体(コンフォメーショナルエピトープ)を認識することができる。
いくつかの状況において、アジュバントが、抗原特異的な免疫応答を維持するために有用な場合がある。主として、アジュバントは、いわゆる抗原提示細胞(APC)に対して作用するが、その作用様式は制限されていない。これらの細胞は、通常、最初に抗原に遭遇し、続いて、プロセッシングされた抗原または未改変の抗原を免疫エフェクター細胞に対して提示する。中間細胞型もまた、関与している場合がある。適切な特異性を有するエフェクター細胞のみが、生産力の高い免疫応答において活性化される。アジュバントはまた、抗原および同時注入された他の因子を局部的に保持することもできる。さらに、アジュバントは、他の免疫細胞に対する化学誘引物質として作用し得るか、または、免疫システムに対する刺激物質として局部的かつ/もしくは全身的に作用し得る。
A群連鎖球菌ワクチンを開発するためのアプローチは、化膿連鎖球菌の細胞表面Mタンパク質に主に焦点をあわせている(Bessen, D., et al.(1988). Infect Immun 56：2666-2672(非特許文献6)；Bronze, M., et al.(1988). J Immunol 141：2767-2770(非特許文献7))。80種を上回る化膿連鎖球菌の様々なM血清型が存在し、かつ、新しい血清型が絶えず現れているため(Fischetti, V.(1989). Clin Microbiol Rev 2：285-314(非特許文献8))、限られた数の血清型に特異的なMタンパク質またはMタンパク質由来のペプチドを接種することは、他のすべてのM血清型から防御するにあたって効果的である可能性は高くない。さらに、Mタンパク質の保存領域が、ヒト心臓組織と免疫学的に交差反応性であり、リウマチ熱に関連する心臓弁損傷の原因であると考えられているアミノ酸配列を含むことが示されている(Fenderson, P., et al.(1989). J Immunol 142：2475-2481(非特許文献9))。
発赤毒素、連鎖球菌発熱性外毒素A、および連鎖球菌発熱性外毒素Bなど他のタンパク質が、ワクチン開発のために検討されている(Lee, P. K.(1989). J Clin Microbiol 27：1890-2(非特許文献10))。これらの毒素に対する免疫性は、おそらくは、連鎖球菌毒素ショックの致命的な症状を予防し得るが、A群連鎖球菌によるコロニー形成を妨げることはできない。
潜在的なワクチン用の抗原としての前述のタンパク質ならびにいくつかのその他の候補の使用(Ji, Y., et al. (1997). Infect Immun 65：2080-2087(非特許文献11)；Guzman, C., et al. (1999). J Infect Dis 179：901-6(非特許文献12))は、主に、同定の平易さまたは利用可能性の見込みに基づいた選択の結果として行われた。化膿連鎖球菌に対して効率的かつ適切な抗原を同定することが要求されている。
WO 2004/078907(特許文献1)では、化膿連鎖球菌由来の過免疫血清反応性抗原を同定、単離、および作製するための方法を記述している。
Cunningham, M.(2000). Clin Microbiol Rev 13：470-511
Cone, L., et al.(1987). New Engl J Med 317：146-9
Stevens, D.(1992). Clin Infect Dis 14：2-11
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Bisno, A., et al.(1987). Infect Immun 55：753-7
Bessen, D., et al.(1988). Infect Immun 56：2666-2672
Bronze, M., et al.(1988). J Immunol 141：2767-2770
Fischetti, V.(1989). Clin Microbiol Rev 2：285-314
Fenderson, P., et al.(1989). J Immunol 142：2475-2481
Lee, P. K.(1989). J Clin Microbiol 27：1890-2
Ji, Y., et al. (1997). Infect Immun 65：2080-2087
Guzman, C., et al. (1999). J Infect Dis 179：901-6
本明細書において説明する抗原は、防御性であることが本出願において示される領域に焦点を合わせる。防御を得るのに適した抗原サイズは、防御エピトープのタイプ(例えば、立体配置的に対して直線状)およびあるレベルの防御を提供する防御エピトープの数など様々な因子に基づいて変動する。有用な防御を提供しない領域を含む大型抗原は、免疫化において不利益となる場合がある。第1に、より小型の抗原を提供することにより、組換え型のタンパク質の作製が容易になる。大型タンパク質を作製する方がより困難であることが、一般に認められている。小型タンパク質は、より経済的な様式で作製することができ、したがって、特に健康管理システムにおいてコストを節約し得る。第2に、ワクチン接種のために使用される抗原タンパク質のサイズを縮小することにより、より安全な製品がもたらされ得る。抗原タンパク質中の余分な配列は除去することが望ましい。これにより、ヒト組織との交差反応の原因となり得る抗体を誘導する確率が低くなるためである。第3に、ワクチン接種のために使用されるタンパク質は、より効果的なワクチン接種またはいくつかの疾患に対するワクチン接種を実現するために、複数の抗原を含んでよく、これらの抗原は、同じ疾患を対象とするか、または異なる疾患を対象とするかのいずれかである。しかしながら、単一の抗原が大きすぎる場合には、1つのタンパク質に組み合わせることは実現不可能である。
したがって、本発明に内在する1つの問題は、化膿連鎖球菌感染に対するワクチンのような医薬、特に、より小型のタンパク質を開発するための代替手段を提供することであった。
驚くべきことに、この目的は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：7の化膿連鎖球菌の1種類の抗原、またはSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：7の化膿連鎖球菌の1種類の抗原の機能的に活性な変種からなるペプチドによって解決された。これらのペプチドは、抗原ペプチドと呼ばれる。
SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7の配列は、本明細書の表1において特徴付けられる。基礎を成すアミノ酸配列は、添付の配列データにおいて開示される。SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のペプチドは、敗血症モデルおよび/または致死性モデルにおいて、免疫応答を誘導し、かつ/または化膿連鎖球菌に対する防御を示すことが示されている(実施例1を参照されたい)。機能的に活性な変種は、下記に定義する抗原の配列を変更することによって得られ、例えば、敗血症モデルおよび/または致死性モデルにおいて免疫応答を誘導し、かつ/または化膿連鎖球菌に対する防御を示す能力を含む、その由来元であるSEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7の配列のいずれかの抗原によって提示されるものと同様の生物活性を有することを特徴とする。
本発明のいくつかの態様において、本発明のペプチドは、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：7の化膿連鎖球菌の1種類の抗原、またはSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：7の化膿連鎖球菌の1種類の抗原の機能的に活性な変種、および以下からなる：
(a)抗原がSEQ ID NO：1である場合、1〜350個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜200個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、もしくは25個の付加的なアミノ酸残基；または
(b)抗原がSEQ ID NO：2である場合、1〜200個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜150個、より好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは、多くても1〜50個、なおより好ましくは、多くても1〜25個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の付加的なアミノ酸残基；または
(c)抗原がSEQ ID NO：3のものである場合、1〜100個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜75個、より好ましくは1〜50個、さらにより好ましくは、多くても1〜25個、なおより好ましくは、多くても1〜10個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、もしくは5個の付加的なアミノ酸残基；または
(d)抗原がSEQ ID NO：4のものである場合、1〜150個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜100個、より好ましくは1〜75個、さらにより好ましくは、多くても1〜50個、なおより好ましくは、多くても1〜25個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の付加的なアミノ酸残基；または
(e)抗原がSEQ ID NO：5である場合、1〜450個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜300個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個の付加的なアミノ酸残基；または
(f)抗原がSEQ ID NO：6もしくはSEQ ID NO：7である場合、1〜250個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜200個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、もしくは25個の付加的なアミノ酸残基。
(a)抗原がSEQ ID NO：1である場合、1〜350個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜200個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、もしくは25個の付加的なアミノ酸残基；または
(b)抗原がSEQ ID NO：2である場合、1〜200個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜150個、より好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは、多くても1〜50個、なおより好ましくは、多くても1〜25個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の付加的なアミノ酸残基；または
(c)抗原がSEQ ID NO：3のものである場合、1〜100個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜75個、より好ましくは1〜50個、さらにより好ましくは、多くても1〜25個、なおより好ましくは、多くても1〜10個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、もしくは5個の付加的なアミノ酸残基；または
(d)抗原がSEQ ID NO：4のものである場合、1〜150個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜100個、より好ましくは1〜75個、さらにより好ましくは、多くても1〜50個、なおより好ましくは、多くても1〜25個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の付加的なアミノ酸残基；または
(e)抗原がSEQ ID NO：5である場合、1〜450個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜300個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個の付加的なアミノ酸残基；または
(f)抗原がSEQ ID NO：6もしくはSEQ ID NO：7である場合、1〜250個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜200個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、もしくは25個の付加的なアミノ酸残基。
化膿連鎖球菌抗原は、上記に定義した、すなわち、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：7のいずれかにおいて定義した抗原のいずれか、または下記に定義するような、その機能的に活性な変種でよい。
抗原またはその機能的に活性な変種は、そのペプチドに対して異種または同種の少なくとも1つの付加的なアミノ酸残基を付加していてよい。相同とは、その抗原の由来元である化膿連鎖球菌タンパク質のアミノ酸配列と同一である任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を意味し、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7の配列は、以下のタンパク質に由来する。
1つの態様において、1つまたは複数の付加的なアミノ酸残基(特に、項目(a)〜(f)において定義したようなもの。上記を参照されたい)を有する抗原またはその機能的に活性な変種は、抗原に対して異種の少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む。「異種アミノ酸」または「抗原もしくはタンパク質に対して異種のアミノ酸」という特徴は、化膿連鎖球菌の任意の天然タンパク質中の抗原またはタンパク質に隣接して位置するアミノ酸と異なる、特に、化膿連鎖球菌SF370(血清型M1)のものとは異なる任意のアミノ酸を意味する。したがって、少なくとも1つの異種アミノ酸を含む本発明のタンパク質とは、化膿連鎖球菌の任意の天然タンパク質またはその断片と異なる、特に、化膿連鎖球菌SF370(血清型M1)のものとは異なるタンパク質を意味する。本発明の抗原の由来元であるタンパク質ならびにそれらの配列の参照は、上記に挙げている。
特定の態様において、ペプチドは、抗原、任意で、上記に定義した少なくとも1つの付加的なアミノ酸残基、およびマーカータンパク質を含む少なくとも1つの付加的な異種アミノ酸配列からなる。
上記に定義した付加的な配列またはアミノ酸残基は、任意のアミノ酸でよく、Lアミノ酸および/またはDアミノ酸のいずれかでよく、天然でもそうでなくてもよい、アミノ酸残基からなる。好ましくは、アミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンなど任意の天然アミノ酸である。
しかしながら、アミノ酸残基はまた、改変されたアミノ酸または異常なアミノ酸でもよい。これらの例は、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ-ヒドロキシリシン、3-ヒドロキシプロロイン(hydroxyproloine)、4-ヒドロキシプロロイン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、またはオルニチンである。
さらに、これらのアミノ酸は、翻訳後修飾のような修飾を受けてもよい。修飾の例には、アセチル化、アミド化、ブロッキング、ホルミル化、γ-カルボキシグルタミン酸水酸化、ヒドロキシル化、グリコシル化、メチル化、リン酸化、および硫酸化(sulfatation)が含まれる。
複数の付加的なアミノ酸残基または異種のアミノ酸残基がペプチド中に存在する場合、それらのアミノ酸残基は、同じであるか、または互いに異なってよい。
それらのアミノ酸残基は、抗原ペプチドのC末端、N末端、またはC末端およびN末端に隣接してよい。
さらなる態様において、ペプチドは、異なる態様において前述したとおりであり、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、またはSEQ ID NO：7の抗原のいずれかと本質的に同一である領域を含むが、それが、異なる血清型の化膿連鎖球菌の相同配列に由来し、具体的には、その血清型は、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370であるという点で、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、またはSEQ ID NO：7のいずれかの抗原とは異なる。
したがって、本発明はまた、様々な化膿連鎖球菌分離株の抗原に関する。このようなホモログは、本明細書において開示する核酸およびアミノ酸の配列に基づいて、容易に同定および単離することができる。血清型の異なる同種抗原は、例えば配列アライメントによって同定することができる。同種抗原の配列は、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または付加によって、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7の配列のいずれかの抗原とは異なる場合がある。好ましくは、同種抗原の配列は、添付のアミノ酸配列リストにおいて特定した同種変種のいずれかの配列を有する。
血清型の異なる相同配列の例は、添付の配列データにおいて詳述する。特に、本発明の各自のペプチドに相同な配列は、下記に挙げたものである。
今日までに150種を超えるemm型が区別されており、タイピングはemm遺伝子の5'末端の可変領域に基づいている(例えば、Vitali, L., et al. (2002) J. Clin. Microbiol 40：679-681を参照されたい)。したがって、同種抗原の存在は、すべてのemm型に関して決定することができる。さらに、sic遺伝子に関して説明されているように、様々なemm型における特定の抗原の変異性を決定することが可能である(Hoe N., et al. (2001) J. Inf. Dis. 183：633-9)。様々な M 血清型が、それが原因となる疾患の種類に対して与える影響は、最近の総説において要約されている(Cunningham、前記)。特に、以下の2つのグループの血清型が区別され得る：
1)咽頭炎および猩紅熱を引き起こすもの(例えば、M1型、M3型、M5型、M6型、M14型、M18型、M19型、M24型)。
2)膿皮症および連鎖球菌皮膚感染症を引き起こすもの(例えば、M2型、M49型、M57型、M59型、M60型、M61型)。
1)咽頭炎および猩紅熱を引き起こすもの(例えば、M1型、M3型、M5型、M6型、M14型、M18型、M19型、M24型)。
2)膿皮症および連鎖球菌皮膚感染症を引き起こすもの(例えば、M2型、M49型、M57型、M59型、M60型、M61型)。
これは、ワクチンとして、または一般に、特定の疾患を標的とする薬物として使用するための抗原の妥当性を確認するための基本原理として役立ち得る。
例えば、米国疾病予防管理センター(CDC；Centers for Disease Control and Prevention)のホームページ(http：//www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypes.htm)から得られる情報により、様々なemm型の関連性を示す樹状図が与えられる。その他の適切な参考文献は、Vitali et al.、前記(emm分子タイピング法)、Enright et al., Infection and Immunity 69：2416-2427.(2001)(代替分子タイピング法(MLST))、Hoe et al.、前記(多くの異なる血清型における1種類の抗原(sic)の変異の例)、およびCunningham、前記(GAS病原に関する総説)である。すべてのemm型が完全に列挙され、かつ公的に利用可能なデータベースにおいて(例えば、CDCを通して)入手可能である。
本発明の別の態様において、変種は断片である。この断片は、1つまたは複数のアミノ酸欠失により、上記に定義した抗原に由来することを特徴とする。これらの欠失は、C末端、N末端、および/または内部にあってよい。好ましくは、断片は、多くても10個、20個、30個、40個、50個、60個、80個、100個、150個、または200個、より好ましくは、多くても10個、20個、30個、40個、または50個、さらにより好ましくは、多くても5個、10個、または15個、なおより好ましくは、多くても5個または10個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸欠失によって得られる。本発明の機能的に活性な断片は、例えば、敗血症モデルおよび/または致死性モデルにおいて、免疫化を誘導し、かつ/または化膿連鎖球菌に対する防御を示す能力を含む、完全な抗原によって提示されるものと同様の生物活性を有することを特徴とする。断片の活性が、配列が変更されていない抗原の活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも70％、なおより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％に達する場合、抗原の断片は、本発明において機能的に活性である。これらの断片は、アミノ酸長約50〜80程度のものを含む、任意の所望の長さで設計するか、または得てよい。
機能的に活性な断片はまた、他の構造的特徴も特徴とする場合がある。したがって、本発明の1つの好ましい態様において、機能的に活性な断片は、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原のアミノ酸の少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、なおより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは99％からなる。上記に定義した機能的に活性な断片は、1つまたは複数のアミノ酸欠失によって、そのペプチドから由来してよい。これらの欠失は、C末端、N末端、および/または内部にあってよい。
本発明の別の好ましい態様は、先の態様において上記に定義したペプチドに関し、抗原は、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原の機能的に活性な変種であり、この変種は、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原に対して少なくとも50％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、機能的に活性な変種は、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原に対して、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、なおより好ましくは、少なくとも90％、さらにより好ましくは、少なくとも95％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する。
配列同一性のパーセンテージは、例えば、配列アライメントによって決定することができる。比較するために配列をアライメントする方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2：482, 1981、またはPearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85：2444- 2448, 1988において記述されている。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215：403-410, 1990)は、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI、ベセスダ、メリーランド州)およびインターネット上を含むいくつかの情報源から入手可能であり、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと共に使用される。SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7の配列のいずれかの抗原の変種は、典型的には、初期設定パラメーターに設定されたNCBI Blast 2.0、gapped blastpを用いて特徴付けられる。少なくとも35個のアミノ酸のアミノ酸配列を比較するために、初期設定パラメーターに設定された初期設定BLOSUM62マトリックスを用いて、Blast 2配列機能が使用される(ギャップ存在コスト11、および1残基当りのギャップコスト1)。短いペプチド(約35アミノ酸より少ない)を整列させる場合、Blast 2配列機能を用い、初期設定パラメーターに設定されたPAM30マトリックスを使用して(オープンギャップ9、伸長ギャップ1のペナルティ)、アライメントを実施する。15アミノ酸またはそれ以下などこのような短いウィンドウにおける配列同一性を決定するための方法は、メリーランド州ベセスダの国立バイオテクノロジー情報センターによって維持されているウェブサイト(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)で説明されている。
抗原の機能的に活性な変種は、抗原における配列変更によって得られ、配列変更された抗原は、未変更の抗原の機能を保持しており、例えば敗血症モデルおよび/または致死性モデルにおいて、免疫応答を誘導し、かつ/または化膿連鎖球菌に対する防御を示す能力を含む、完全な抗原によって提示されるものと同様の生物活性を例えば有する。このような配列変更には、保存的置換、欠失、変異、および挿入が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。機能的に活性な変種のこれらの特徴は、例えば、実施例1において詳述されているようにして、評価することができる。本発明において、変種の活性が、配列が変更されていない抗原の活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも70％、なおより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％に達する場合、変種は、具体的には、例えば、敗血症モデルおよび/または致死性モデルにおいて、免疫応答を誘導し、かつ/または化膿連鎖球菌に対する防御を示す能力を含む、変更されていない抗原によって提示されるものと同様の生物活性を有する。
「機能的に活性な変種」という用語は、天然の対立遺伝子変種、ならびに変異体または他の任意の非天然変種を含む。当技術分野において公知であるように、対立遺伝子変種は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的には変更しない1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するものとして特徴付けられる(ポリ)ペプチドの代替形態である。「生物学的機能」とは、たとえその機能が細胞の増殖にも生存にも必要ではない場合でも、天然に存在する場である細胞におけるポリペプチドの機能を意味する。例えば、ポーリンの生物学的機能は、細胞外媒体中に存在する化合物の細胞中への移行を可能にすることである。生物学的機能は、抗原機能とは異なる。ポリペプチドは、複数の生物学的機能を有し得る。
生物界の任意の種内で、対立遺伝子変異は、通例である。例えば、任意の細菌種、例えば化膿連鎖球菌の代表は、通常、軽微な対立遺伝子変異によって互いに異なる様々な株(クローン繁殖を特徴とする)である。実際、様々な株において同じ生物学的機能を果たすポリペプチドは、それらの各株において同一ではないアミノ酸配列を有してよい。このような対立遺伝子変異は、ポリヌクレオチドレベルで同等に反映される。
対立遺伝子変異は、化膿連鎖球菌種内で非常に一般的である。このような対立遺伝子変異はまた、前述のemmタイピングによるA群連鎖球菌株の分子タイピングの基本原理でもある(例えば、Facklam, R. et al. (1999) Emerg Infect Dis. 5：247-53またはhttp：//www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypes.htmを参照されたい)。さらに、sicのような遺伝子は、対立遺伝子変異を受けやすい(Hoe N., et al. (2001) J. Inf. Dis. 183：633-9)。しかしながら、対立遺伝子変異が大規模なタンパク質は、一般に、ワクチンの適切な候補ではない。これは、免疫化によって、すべての株による感染から保護されるとは思われないか、または、代替の免疫化によって、おそらく、ワクチンが対象としない新しい対立遺伝子変種の出現が誘導されると思われるためである。
好ましい態様において、アミノ酸の交換、欠失、または挿入によって抗原から誘導される機能的に活性な変種または断片はまた、(上記に定義した)活性を保存し得、またはより好ましくは、その活性を改善し得る。さらに、これらのペプチドはまた、同じまたは好ましくは改善したT細胞応答を誘発するエピトープも包含してよい。これらのエピトープは、「ヘテロクリティック」と呼ばれる。これらは、MHC/HLA分子に対する同様または好ましくはより強い親和性、および、同様または好ましくはより強力な様式で元のエピトープを対象とするT細胞受容体(TCR)を刺激する能力を有する。ヘテロクリティックなエピトープは、合理的設計によって、すなわち、TCRと潜在的に相互作用する残基の体系的な交換と組み合わせて、例えばRammensee, H. et al., 1999, Immunogenetics. 50：213-219によって説明されているように、MHC/HLAへの結合に対する個々の残基の寄与を考慮に入れ、かつ、元のエピトープを対象とするT細胞を用いて、結果として請じる配列を試験することによって、得ることができる。このような設計は、多くの実験をせずに、当業者が実施することが可能である。
本発明のなおより好ましい態様において、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原に対して少なくとも50％の配列同一性、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原に対して、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、なおより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原の機能的に活性な変種は、保存的置換によって、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7の配列のいずれかの抗原から誘導される。保存的置換は、側鎖および化学特性が同類であるアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。このようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、非極性脂肪族側鎖を有するアミノ酸、非極性芳香族側鎖を有するアミノ酸、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、小型側鎖を有するアミノ酸、大型側鎖を有するアミノ酸などである。1つの態様において、1つの保存的置換がペプチド中に含まれる。別の態様において、2つまたはそれ以下の保存的置換がペプチド中に含まれる。さらなる態様において、3つまたはそれ以下の保存的置換がペプチド中に含まれる。
保存的アミノ酸置換の例には、以下に列挙するものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
1つまたは複数のアミノ酸交換、欠失、および/または挿入によって得られる、本発明のペプチドの適切な変種の例は、表5〜7および表9において提供されるデータに由来してよい。特に、表5〜7および表9では、化膿連鎖球菌SF370と比較して、特定の位置における天然のアミノ酸変更(置換、挿入、欠失)を列挙する。
SEQ ID NO：1を有する(すなわち、上記に定義したように、特に、上記の項目(a)〜(f)において定義したように、SEQ ID NO：1からなるか、またはそれを含む)ペプチドの変種に関して、本発明の変種は、表5において特定する1つまたは複数の変更によって、SEQ ID NO：1を有するペプチドと異なり得る。
SEQ ID NO：2を有する(すなわち、上記に定義したように、特に、上記の項目(a)〜(f)において定義したように、SEQ ID NO：2からなるか、またはそれを含む)ペプチドの変種に関して、本発明の変種は、表6において特定する1つまたは複数の変更によって、SEQ ID NO：2を有するペプチドと異なり得る。
SEQ ID NO：3を有する(すなわち、上記に定義したように、特に、上記の項目(a)〜(f)において定義したように、SEQ ID NO：3からなるか、またはそれを含む)ペプチドの変種に関して、本発明の変種は、表6において特定する1つまたは複数の変更によって、SEQ ID NO：3を有するペプチドと異なり得る。
SEQ ID NO：4を有する(すなわち、上記に定義したように、特に、上記の項目(a)〜(f)において定義したように、SEQ ID NO：4からなるか、またはそれを含む)ペプチドの変種に関して、本発明の変種は、表7において特定する1つまたは複数の変更によって、SEQ ID NO：4を有するペプチドと異なり得る。
SEQ ID NO：5を有する(すなわち、上記に定義したように、特に、上記の項目(a)〜(f)において定義したように、SEQ ID NO：5からなるか、またはそれを含む)ペプチドの変種に関して、本発明の変種は、表7において特定する1つまたは複数の変更によって、SEQ ID NO：5を有するペプチドと異なり得る。
SEQ ID NO：6を有する(すなわち、上記に定義したように、特に、上記の項目(a)〜(f)において定義したように、SEQ ID NO：6からなるか、またはそれを含む)ペプチドの変種に関して、本発明の変種は、表7において特定する1つまたは複数の変更によって、SEQ ID NO：6を有するペプチドと異なり得る。
SEQ ID NO：7を有する(すなわち、上記に定義したように、特に、上記の項目(a)〜(f)において定義したように、SEQ ID NO：7からなるか、またはそれを含む)ペプチドの変種に関して、本発明の変種は、表9において特定する1つまたは複数の変更によって、SEQ ID NO：7を有するペプチドと異なり得る。
表5〜7および表9に従って、1つまたは複数の配列変更によって本発明のペプチドから得られた変種が好ましいことを理解すべきである。
本発明の別の局面は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、またはSEQ ID NO：7のうち少なくとも1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを説明する。異なる態様において、ペプチドは、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：7に少なくとも95％、少なくとも97％、もしくは少なくとも99％同一な領域を含むか、それからなるか、もしくは本質的にそれからなるか、または、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、もしくは20個のアミノ酸変更によって異なる。1つの態様において、「なる(consist)」という用語は、上記の項目(a)〜(f)において定義したとおりでよい。好ましくは、ペプチドは、完全長の天然のSpy0269も、Spy0292も、Spy0416A(アミノ酸33〜867)も、Spy0872も含まない。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、またはSEQ ID NO：7は、防御的免疫応答を生じさせるのに有用なコア配列を提供する。SEQ ID NO：1は、Spy0269のアミノ酸37〜488に由来するアミノ酸コアを提供する。SEQ ID NO：2は、Spy0292のアミノ酸23〜184からなるコア領域を提供する。SEQ ID NO：3は、Spy0292のアミノ酸23〜300からなるコアを提供し、これは、SEQ ID NO：2で提供されるSpy0292の23〜184からなる長さの短いコア配列を含む、長さのより長い配列である。驚くべきことに、図1に示すように、短い断片Spy0292-1(SEQ ID NO：2)の方が、より長い断片Spy0292-3(SEQ ID NO：3)と比べて、マウスモデルにおいて、さらに強い防御を示す。前述したように、小型ペプチドは、一般に、大型ペプチドより有利である。これは、小型ペプチドの方が、より経済的な様式で作製され得、ヒト組織との交差反応を引き起こし得る抗体を誘導する確率をそれらが低下させ、かつ、複数の抗原を含む混合ワクチンの調製をそれらが容易にするためである。SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、およびSEQ ID NO：6は、様々な活性を有する、異なるSpy0416Aコア配列を提供する。SEQ ID NO：5は、Spy0416Aのアミノ酸148〜458の共通のコアを提供し、かつ、活性は最低である。SEQ ID NO：6は、短いコアよりも大きな活性を有するSpy0416Aのアミノ酸72〜558を含むコア配列を提供する。SEQ ID NO：4は、同様に148〜458コアよりも大きな活性を有するSpy0416のアミノ酸34〜677を含むアミノ酸コアを提供する。
本明細書において提供される手引に基づき、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7において提供されるコア配列を考慮に入れて、様々なペプチドを設計することができる。このような手引は、(1)内部の変更、(2)アミノ末端および/もしくはカルボキシル末端の付加的なアミノ酸基、ならびに/または(3)本明細書において説明する付加的な改変、を含む構造的に関連したペプチドを含む。
構造的に関連したペプチドに関して、各アミノ酸変化は、独立に、付加、置換、または欠失のいずれかである。さらなる態様において、アミノ末端はメチオニンである。メチオニンの存在が、組換え発現のために有用な場合がある。場合によっては、メチオニンは、翻訳の結果として初めは存在し、続いて、切断されてよい。機能的な変種のような構造的に関連したペプチドに適用できるより広範な態様およびいくつかのさらなる説明を含む、さらなる実施例および態様は、特に、機能的に活性な変種の説明において上記に提供される。
本発明の別の主題において、前述のペプチドは、上記に定義したように、少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、より好ましくは少なくとも4個の抗原を含むか、またはそれらからなる。同じ完全長配列(例えば、Spy0292またはSpy0416)に由来する2個またはそれ以上のペプチドが結合されて1つのペプチドになる場合、これらの配列は、好ましくは、重複しない。1つの態様において、「からなる(consist)」という用語は、上記の項目(a)〜(f)において定義したとおりでよい。
本発明の別の態様において、1つまたは複数の様々な化学技術により、上記に定義したペプチドを改変して、改変されたペプチドと本質的に同じ活性(断片および変種に関して上記に定義したような活性)を有し、かつ、他の望ましい特性を任意で有する誘導体を作製することができる。例えば、C末端であれ側鎖であれ、タンパク質のカルボン酸基は、薬学的に許容される陽イオンの塩の形態で提供されてよく、または、エステル化されてエステルを形成してよく、または、アミドに変換されてよい。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端であれ側鎖であれ、HCl塩、HBr塩、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、および他の有機塩など薬学的に許容される酸付加塩の形態でよく、またはアミドに変換されてよい。ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、十分に認識された技術を用いて、アルコキシまたはエステルに変換することができる。ペプチド側鎖のフェニル環およびフェノール環は、フッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素など1つもしくは複数のハロゲン原子で、または、アルキル、アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、もしくはそのようなカルボン酸のアミドで置換されてよい。チオールは、アセトアミド基のような、いくつかの十分に認識された保護基のいずれか一つで保護され得る。
本発明のペプチドは、他の外表面タンパク質もしくは他のタンパク質、または他のタンパク質の抗原と組み合わせられてよい。このような組合せにおいて、抗原は、融合タンパク質の形態でよい。本発明の抗原は、任意で、他の微生物に由来する選択されたペプチドまたはタンパク質に融合されてよい。例えば、本発明の抗原またはポリペプチドは、N末端またはC末端で、別の病原体に由来するポリペプチド、または複数のポリペプチドに順に融合されていてよい。この目的のために有用であり得るペプチドには、先行技術によって同定されたポリペプチドが含まれる。
本発明の1つの態様において、本発明のペプチドは、抗タグ物質が選択的に結合できるエピトープを提供するエピトープタグに融合されている。エピトープタグは、一般に、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置されるが、生物活性が許容する場合は、内部の挿入物または置換物として組み込まれてもよい。このようなエピトープでタグ化された形態のペプチドの存在は、そのタグ化ペプチドに対する抗体のような物質を用いて検出することができる。また、エピトープタグを提供することにより、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別のタイプのアフィニティマトリックスを用いるアフィニティ精製によってペプチドを容易に精製することが可能になる。様々なタグポリペプチドおよびそれらの個別の抗体は、当技術分野において周知である。例には、ポリ-ヒスチジン(ポリ-his)タグ、ポリ-ヒスチジン-グリシン(ポリ-his-gly)タグ、HAタグポリペプチド、c-mycタグ、Strepタグ、およびFLAGタグが含まれる。
融合物はまた、脂質および糖質を含む、アミノ酸以外の部分に融合または結合された、本発明のペプチドまたは抗原を含んでよい。さらに、本発明の抗原は、先行技術によって説明されている他のワクチン物質、ならびに他の微生物に由来する他種のワクチン物質と組み合わせて使用され得る。このようなタンパク質は、広範な連鎖球菌分離株によって引き起こされる疾患の予防、治療、および診断に有用である。
これらの融合タンパク質は、本発明の方法および組成物において使用するために構築される。これらの融合タンパク質または多量体タンパク質は、組換えによって作製してもよく、または化学的に合成してもよい。
本発明のペプチドは、いくつかの従来技術のいずれかによって調製され得る。所望のペプチドを化学的に合成することができる。代替のアプローチは、酵素消化により、例えば、特定のアミノ酸残基で定義される部位でタンパク質を切断することが公知の酵素でタンパク質を処理することによって、または、適切な制限酵素でDNAを消化し、消化されたDNAを発現させ、かつ所望の断片を単離することによって、公知のペプチドの断片を作製することを含む。さらに別の適切な技術は、所望のペプチド断片をコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって単離および増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドが、PCRにおいて5'プライマーおよび3'プライマーとして使用される。DNA中、したがってタンパク質中の所定の部位で、公知の配列を有するように、欠失、挿入、および置換などの変異を起こさせるための技術は、周知である。PCRのような従来技術を用いる当業者は、本明細書において提供される抗原およびペプチドを容易に用いて、他の同様のタンパク質を同定および単離することができる。本明細書において提供される情報を考慮すれば、このような方法はルーチンであり、過度の実験を必要としないとみなされている。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘発(Carter et al., Nucl. Acids Res., 13：4431(1985)；Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10：6487(1987))、カセット変異誘発(Wells et al., Gene, 34：315(1985))、制限選択変異誘発(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317：415(1986))、PCR変異誘発を用いて変異を起こさせることができるか、または、他の公知の技術をクローン化DNAに対して実施して、本発明のペプチドを作製することができる。
本発明の別の主題は、本発明のペプチド、すなわち、上記に定義したような任意のペプチドをコードする核酸、またはそれに相補的な核酸に関する。本発明の核酸分子は、mRNAもしくはcRNAなどRNAの形態で、または、例えばcDNAおよびゲノムDNAを含む、DNAの形態でよく、例えばクローニングによって得られるか、または化学合成技術もしくはそれらの組合せにより作製される。DNAは、二本鎖または一本鎖でよい。一本鎖DNAは、センス鎖としても公知であるコード鎖でよく、またはそれは、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖でよい。本明細書において使用される核酸分子はまた、特に、一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、一本鎖RNAおよび二本鎖RNAの混合物であるDNA、ならびに、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物でよい、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を意味する。
核酸は、化膿連鎖球菌中、特に、化膿連鎖球菌血清型M1、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370中に天然に存在する核酸の断片でよい。好ましくは、核酸は、SEQ ID NO：11〜SEQ ID NO：17の配列のいずれかにおいて定義される配列、または核酸配列データの添付リストにおいて特定した同種変種のいずれかの配列を有する。様々な血清型の相同配列の例は、下記に列挙するものである。
核酸はまた、遺伝コードの縮重(degeneration)の結果である配列も含む。天然アミノ酸は20種類あり、その大半は、複数のコドンによって指定されている。したがって、上記に定義したペプチドを結果として生じるヌクレオチド配列はすべて、本発明に含まれる。
さらに、核酸は、1つまたは複数の修飾塩基を含んでよい。このような核酸はまた、生理学的環境におけるこのような分子の安定性を高め、かつ半減期を長くするために、例えばリボース-リン酸骨格中に修飾を含んでもよい。したがって、安定性または他の理由のために主鎖が修飾されたDNAまたはRNAは、その特徴が本明細書において意図される場合、「核酸分子」である。さらに、ただ2つの例を挙げてみると、イノシンのような珍しい塩基またはトリチル化塩基のような修飾塩基を含むDNAまたはRNAは、本発明の範囲内の核酸分子である。当業者には公知の多くの有用な目的に役立つ多種多様の修飾がDNAおよびRNAに施されていることが認識されると考えられる。核酸分子という用語は、本明細書において使用される場合、このように化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態の核酸分子、ならびに、とりわけて、単純な細胞および複雑な細胞を含む、ウイルスおよび細胞に特徴的な化学的形態のDNAおよびRNAを包含する。例えば、核酸によってコードされるポリペプチドに影響を及ぼさないヌクレオチド置換を実施することができ、したがって、上記に定義した抗原またはその断片もしくは機能的に活性な変種をコードする任意の核酸分子が、本発明によって包含される。
さらに、本発明の抗原またはその断片もしくは機能的に活性な変種をコードする核酸分子のいずれかを、標準的なクローニング技術のような標準技術を用いて、化膿連鎖球菌調節配列もしくは異種調節配列である任意の所望の調節配列、異種リーダー配列、異種マーカー配列、または異種コード配列に機能的に連結して、融合タンパク質を作製することもできる。
本発明の核酸は、一般に、エンドヌクレアーゼおよび/もしくはエキソヌクレアーゼおよび/もしくはポリメラーゼおよび/もしくはリガーゼおよび/もしくはリコンビナーゼ、または核酸を作製するための当業者に公知の他の方法による核酸操作によって、インビトロまたは培養状態の細胞において最初に形成させることができる。
本発明の1つの態様において、核酸は、ベクター中に配置される。ベクターはさらに、複製起点のような宿主細胞における複製を可能にする核酸配列、1つまたは複数の所望の遺伝子および/または選択マーカー遺伝子、ならびに転写、翻訳、および/またはコードされたタンパク質の分泌を指示する調節エレメントのような当技術分野において公知である他の遺伝子エレメントを含んでよい。ベクターを用いて、細胞に形質導入するか、細胞を形質転換するか、または感染させ、それによって、細胞に固有のもの以外の挿入された核酸および/またはタンパク質をその細胞に発現させることができる。ベクターは、任意で、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングなど、細胞中への核酸の移行を実現するのに役立つ材料を含む。標準的な分子生物学技術によってタンパク質を発現させるための非常に多くのタイプの適切な発現ベクターが当技術分野において公知である。このようなベクターは、昆虫、例えば、バキュロウイルスの発現システム、または酵母、真菌、細菌、もしくはウイルスの発現システムを含む従来のベクタータイプから選択される。非常に多くのタイプが当技術分野において公知である他の適切な発現ベクターもまた、この目的のために使用され得る。このような発現ベクターを得るための方法は周知である(例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク(1989)を参照されたい)。1つの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
この方法によってトランスフェクションするために適した宿主細胞または細胞株には、細菌細胞が含まれる。例えば、大腸菌(E. coli)の様々な株が、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。枯草菌(B. subtilis)、シュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、および他の桿菌などの様々な株もまた、この方法において使用され得る。当業者に公知である酵母細胞の多くの株もまた、本発明のペプチドを発現させるための宿主細胞として利用可能である。他の真菌細胞またはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugipedera)(Sf9)細胞のような昆虫細胞もまた、発現システムとして使用され得る。あるいは、ヒト293細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、サルCOS-1細胞株、またはSwissマウス、BALB/cマウス、もしくはNIHマウスに由来するマウス3T3細胞などの哺乳動物細胞が使用され得る。さらに他の適切な宿主細胞、ならびにトランスフェクション、培養、増幅、スクリーニング、作製、および精製のための方法が、当技術分野において公知である。
本発明のペプチドは、適切な宿主細胞において本発明の核酸を発現させることによって作製することができる。宿主細胞は、例えば、転写調節配列の制御下で本発明の核酸を含む少なくとも1つの発現ベクターを用いたエレクトロポレーションのような従来の手段によってトランスフェクトすることができる。次いで、トランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を、タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する。発現されたタンパク質を、当業者に公知の適切な手段によって、細胞から(または、細胞外で発現される場合には、培地から)回収し、単離し、かつ任意で精製する。例えば、タンパク質は、細胞溶解の後に可溶型で単離するか、または、例えば塩化グアニジン中で、公知の技術を用いて抽出する。所望の場合は、本発明のペプチドまたは断片は、融合タンパク質として作製される。このような融合タンパク質は、前述のものである。あるいは、例えば、選択された宿主細胞におけるタンパク質の発現を促進するために、または精製を改善するために、融合タンパク質を作製することが望ましい場合もある。本発明のペプチドおよび抗原を含む分子は、限定されるわけではないが、HPLCおよびFPLCなどを用いる順相または逆相などの液体クロマトグラフィー、(無機リガンドまたはモノクローナル抗体を用いたもののような)アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、ならびにゲル電気泳動などを含む、様々な従来の方法のいずれかを用いて、さらに精製することができる。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、最も適切な単離技術および精製技術を選択し得る。このような精製により、微生物の他のタンパク質性材料および非タンパク質性材料を実質的に含まない形態の抗原が提供される。
本発明の別の主題は、以下を含む薬学的組成物、特にワクチンである：
(i)本発明による少なくとも1種類のペプチド、および/または
(ii)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：10のいずれかの配列を含むか、もしくはそれからなる少なくとも1種類のペプチド、またはその機能的に活性な変種、ならびに
(iii)任意で、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤。
(i)本発明による少なくとも1種類のペプチド、および/または
(ii)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：10のいずれかの配列を含むか、もしくはそれからなる少なくとも1種類のペプチド、またはその機能的に活性な変種、ならびに
(iii)任意で、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤。
(ii)のペプチドの変種は、定義済みのものであり、かつ、(i)のペプチドとして得てもよい(本発明のペプチドに関する上記の説明を参照されたい)。SEQ ID NO：8またはSEQ ID NO：10の配列の好ましい変更は、それぞれ表8および表9に挙げたものである。
(i)および(ii)のペプチドは、本発明の薬学的ペプチドと呼ばれる。
(ii)のペプチドに関して、これらのタンパク質は、特に、生理学的に関連性の高い鼻腔内抗原接種モデルにおいて、致死的な化膿連鎖球菌接種に対する防御を提供できることが初めて示された（実施例1を参照されたい）。特に、タンパク質Spy0895(SEQ ID NO：9)は、表1に挙げた3種のモデルすべてにおいてA群連鎖球菌感染に対する防御を提供したため、ワクチン候補物として具体的な有望さを示す。
本発明の薬学的ペプチドは、化膿連鎖球菌の感染によって引き起こされる疾患を有するヒトおよび/または動物を免疫化または治療するための方法のために使用され得る。したがって、薬学的ペプチドは、薬学的組成物中で使用され得る。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体および/または賦形剤をさらに含んでよい。本発明において有用な薬学的に許容される担体および/または賦形剤は従来のものであり、緩衝剤、安定化剤、希釈剤、保存剤、および可溶化剤が含まれ得る。E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.、イーストン、ペンシルバニア州)、第15版(1975)では、本明細書において開示する（ポリ）ペプチドの薬学的送達に適した組成物および製剤を記述している。一般に、担体または賦形剤の性質は、使用される個々の投与様式に依存すると考えられる。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなどの薬学的かつ生理学的に許容される液体をビヒクルとして含む注射用液体を含む。固形組成物(例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態)の場合、従来の非毒性固形担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性な担体の他に、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラートなど少量の非毒性補助物質も含んでよい。
好ましい態様において、薬学的組成物は、アジュバントのような免疫賦活性物質をさらに含む。アジュバントは投与方法に基づいて選択することができ、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントなどの鉱油ベースのアジュバント、ISAのようなSeppic社製モンタニド不完全アジュバント、Ribiアジュバントシステムのような水中油型エマルジョンアジュバント、ムラミルジペプチドを含むシンタックス(syntax)アジュバント調製物、IC31(商標)(Intercell；ペプチドモチーフKLK[WO 02/32451]およびオリゴヌクレオチド[WO 01/93905]を含む合成アジュバント)、またはアルミニウム塩アジュバントが含まれ得る。好ましくは、アジュバントは、鉱油ベースのアジュバント、最も好ましくはISA206(SEPPIC、パリ、フランス)である。
他の態様において、免疫賦活性物質は、ポリカチオンポリマー、特にポリアルギニンのようなポリカチオンペプチド、免疫賦活性デオキシヌクレオチド(ODN)、特にオリゴ(dIdC)13、少なくとも2つのLysLeuLysモチーフを含むペプチド、特にKLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：55)、向神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン、ミョウバン、アジュバント、またはそれらの組合せを含む群より選択される。さらなる態様において、組合せは、ポリカチオンポリマーおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組合せ、または少なくとも2つのLysLeuLysモチーフを含むペプチドおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組合せのいずれかである。さらに別の態様において、ポリカチオンポリマーは、ポリカチオンペプチドである。
「オリゴ(dIdC)13」と言う用語は、本発明で使用される場合、13個のデオキシ(イノシン-シトシン)モチーフを含む、リン酸ジエステルを主鎖とする一本鎖DNA分子を意味し、[オリゴ-d(IC)13]という用語によっても定義される。正確な配列は、
である。例えば、WO 01/93903およびWO 01/93905において指定されるように、オリゴ(dIdC)13はまた、(オリゴ-dIC26)；オリゴ-dIC26量体；オリゴ-デオキシIC、26量体；またはオリゴ-dIC、26量体という用語によっても定義され得る。
ある態様において、免疫賦活性物質は、少なくとも1つの免疫賦活性核酸である。免疫賦活性核酸は、例えば、中性または人工のCpGを含む核酸、非脊椎動物に由来する長さの短い核酸、または(例えばWO 96/02555において記述されているように)所定の塩基状況で非メチル化シトシン-グアニンジヌクレオチド(CpG)を含む短いオリゴヌクレオチド(ODN)の形態である。あるいは、例えばWO 01/93903に記載されているような、イノシンおよびシチジンをベースとする核酸、または(WO 01/93905およびWO 02/095027に記載されている)デオキシ-イノシン残基および/もしくはデオキシウリジン残基を含むデオキシ核酸もまた、好ましくは、本発明の免疫賦活性核酸として使用され得る。好ましくは、様々な免疫賦活性核酸の混合物が本発明において使用される。さらに、前述のポリカチオン化合物は、前述の免疫賦活性核酸のいずれかと組み合わせてよい。好ましくは、このような組合せは、WO 01/93905、WO 02/32451、WO 01/54720、WO 01/93903、WO 02/13857、WO 02/095027、およびWO 03/047602に記載されているものに従う。
さらに、またはあるいは、このような薬学的組成物またはワクチン組成物は、向神経活性化合物を含んでよい。好ましくは、向神経活性化合物は、例えばWO 01/24822に記載されているように、ヒト成長因子である。また、好ましくは、向神経活性化合物は、上記に定義したようなポリカチオン化合物および/または免疫賦活性核酸のいずれかと組み合わせられる。
組成物は、例えば、対象の免疫化または治療のために使用され得る。薬学的組成物は、本発明の少なくとも1種類の薬学的ペプチドを含むが、これは、任意で他の病原体の様々な抗原タンパク質または抗原ペプチドと混合された、本発明の様々な薬学的ペプチド(断片および他の変種を含む)を含む反応混液(すなわち、単純な混合物)も含んでよい。これらのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはその断片もしくは変種のこのような混合物は、例えば、広範な連鎖球菌分離株に対する所望の抗体の作製において有用である。本発明の薬学的ペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で使用されてもよい。本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な酸および塩基は当業者に周知であり、無機および有機の酸および塩基が含まれる。
本発明のさらに別の主題は、以下からなる群より選択される核酸を含む薬学的組成物である：
(i)本発明の核酸および/もしくはそれに相補的な核酸、ならびに/または
(ii)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：10のいずれかの配列を含むか、もしくはそれらからなるペプチドをコードする核酸、特に、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、もしくはSEQ ID NO：20のいずれかのDNA配列、またはその機能的に活性な変種もしくはそれに相補的な核酸または対応するRNA配列、ならびに
(iii)任意で、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤。
(i)本発明の核酸および/もしくはそれに相補的な核酸、ならびに/または
(ii)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：10のいずれかの配列を含むか、もしくはそれらからなるペプチドをコードする核酸、特に、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、もしくはSEQ ID NO：20のいずれかのDNA配列、またはその機能的に活性な変種もしくはそれに相補的な核酸または対応するRNA配列、ならびに
(iii)任意で、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤。
(ii)の核酸の変種は定義したとおりであり、かつ、(i)の核酸として得ることができる(本発明の核酸に関する上記の説明を参照されたい)。(i)および(ii)の核酸は、本発明の薬学的核酸と呼ばれる。
薬学的核酸配列は、単独で、または抗原もしくは抗体をコードするか、または他の病原性微生物を対象とする他の核酸配列と組み合わせて、薬学的組成物の構成要素としてさらに使用され得る。組成物は、化膿連鎖球菌、特に化膿連鎖球菌血清型M1、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370による感染によって引き起こされる疾患に影響されやすいか、またはその疾患を有するヒトおよび/または動物を免疫化または治療するために使用され得る。薬学的に許容される担体または賦形剤は、上記に定義したとおりでよい。
別の態様において、本発明の薬学的核酸は、単独で、または他の病原性微生物に由来する他の抗原もしくは抗体をコードする核酸配列と組み合わせて、対象において病原体に対する防御的免疫応答を能動的に誘導することを対象とする組成物において、さらに使用され得る。本発明のこれらの構成要素は、化膿連鎖球菌、特に化膿連鎖球菌血清型M1、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370による感染に対してヒトおよび/または動物において防御的免疫応答を誘導するための方法において有用である。
治療組成物またはワクチン組成物の調製において使用する場合、当業者には公知である核酸送達組成物および方法が有用である。本発明の薬学的核酸は、本発明の方法において、または、本明細書において説明する組成物中でDNA配列として使用され得、裸DNAとして投与されるか、または薬学的に許容される担体と結合され、抗原、ペプチド、またはポリペプチドのインビボ発現を提供する。いわゆる「裸DNA」は、本発明の抗原、ペプチド、またはポリペプチドを患者においてインビボで発現させるのに使用され得る。(例えば、「裸DNA」の同様の用途を記述しているJ. Cohen, Science, 259：1691-1692を参照されたい)。例えば、調節配列と結合された「裸DNA」は、例えば注射によって、治療的に、またはワクチン組成物の一部として投与され得る。
あるいは、本発明の抗原またはペプチドをコードする本発明による核酸、特に薬学的核酸、またはそれに相補的な核酸は、例えば、本発明の抗原または(薬学的)ペプチドをインビボで発現させて、例えば抗体を誘導するために、薬学的組成物中で使用され得る。
本発明の好ましい態様は、本発明による薬学的核酸がベクターおよび/または細胞中に含まれている薬学的組成物に関する。本発明において適するベクターおよび細胞は前述したとおりである。ベクターは、特に、DNAワクチンのために使用される。送達に適したベクターは、当業者によって容易に選択され得る。インビボの遺伝子送達用の例示的なベクターは、様々な学術的供給者および商業的供給業者から容易に入手可能であり、例えば、アデノ随伴ウイルス(国際特許出願番号PCT/US91/03440)、アデノウイルスベクター(M. Kay et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91：2353(1994)；S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 92：883(1993))、または他のウイルスベクター、例えば、様々なポックスウイルス、ワクシニアなどが含まれる。レトロウイルスまたはアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターが、細胞の染色体中に外来性DNAを組み込むために好ましい。
本発明の別の主題は、本発明の抗原に特異的に結合する抗体またはその機能的に活性な断片に関する。本発明は、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにFab断片、またはFab発現ライブラリーの産生物を含む。
化膿連鎖球菌感染症は主として小児疾患であり、細菌咽頭炎および膿痂疹などの重度ではない疾患を引き起こすが、GASはまた、連鎖球菌毒素ショック症候群に関連した壊死性筋膜炎(Cone, L., et al. (1987). New Engl J Med 317：146-9；Stevens, D.(1992). Clin Infect Dis 14：2-11)、ならびに急性リウマチ熱、急性糸球体腎炎、および反応性関節炎などいくつかの連鎖球菌感染後の続発症にも関与している。化膿連鎖球菌抗原タンパク質を標的とし、かつ、感染症の治療法を支援するか、または病原体および疾患を一斉に無くす可能性を有するモノクローナル抗体療法またはポリクローナル抗体療法を提供することは非常に有益であると思われる。
好ましい態様において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体、またはその機能的に活性な変種である。別の好ましい態様において、機能的に活性な断片は、Fab断片を含む。
本発明の抗原、それらの断片または変種に対して作製される抗体は、抗原、それらの断片もしくは変種を動物に直接注射することによって、または抗原、それらの断片もしくは変種を動物、好ましくは非ヒトに投与することによって、得ることができる。このようにして得られる抗体は、次いで、抗原、断片、または変種に結合すると考えられる。次いで、このような抗体を用いて、反応性の抗原、それらの断片または変種を、それらを発現する組織から単離することができる。
モノクローナル抗体を調製する場合、連続的な細胞株培養物、例えばハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体を提供する、当技術分野において公知である任意の技術が使用され得る。
単鎖抗体の作製に関して説明されている技術(米国特許第4,946,778号)を適応させて、本発明による抗原、それらの断片または変種に対する単鎖抗体を作製することができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物のような他の生物も、本発明による抗原、それらの断片または変種に対するヒト化抗体を発現させるために使用され得る。
本発明のさらに別の主題は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関する。
望ましいモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は、周知の従来技術によって作製される。ハイブリドーマ細胞は、活性化された正常な抗体産生B細胞を骨髄腫細胞と融合させることによって作製することができる。本発明において、ハイブリドーマ細胞は、本発明の抗原に特異的に結合する抗体を産生することができる。
同様に、望ましい高力価抗体は、これらの抗原に対して開発されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に公知の組換え技術を適用することによって作製される(例えば、PCT特許出願PCT/GB85/00392；英国特許出願公開GB2188638A；Amit et al., Science, 233：747-753(1986)；Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：10029-10033(1989)；PCT特許出願 WO90/07861；Riechmann et al., Nature, 332：323-327(1988)；Huse et al., Science, 246：1275-1281(1988)を参照されたい)。
本発明はまた、以下の段階を特徴とする、本発明による抗体を作製するための方法も提供する：
(a)本発明によるペプチドの有効量を動物に投与する段階；および
(b)段階(a)の投与に応答して動物によって産生される抗体を動物から単離する段階。
(a)本発明によるペプチドの有効量を動物に投与する段階；および
(b)段階(a)の投与に応答して動物によって産生される抗体を動物から単離する段階。
本発明の別の主題は、以下の段階を特徴とする、本発明による抗体を作製するための方法に関する：
(a)本発明によるペプチドの有効量とB細胞を接触させる段階；
(b)段階(a)のB細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得る段階；および
(c)培養されたハイブリドーマ細胞によって産生される抗体を単離する段階。
(a)本発明によるペプチドの有効量とB細胞を接触させる段階；
(b)段階(a)のB細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得る段階；および
(c)培養されたハイブリドーマ細胞によって産生される抗体を単離する段階。
より具体的には、本発明のペプチドを動物に投与することにより、非ヒト動物において免疫応答を開始させ、抗体を含む体液を該動物から取り出し、かつ、抗体を含む該体液をさらなる精製段階に供することにより、抗体を作製することによって、抗体を作製することができる。あるいは、本発明において定義される抗原、その断片もしくは変種を該動物に投与することにより、非ヒト動物において免疫応答を開始させ、脾臓もしくは脾臓細胞を該動物から取り出し、かつ/または、該脾臓もしくは脾臓細胞のハイブリドーマ細胞を作製し、前記抗原、その断片もしくは変種に特異的なハイブリドーマ細胞を選択およびクローニングし、かつ、クローニングされた該ハイブリドーマ細胞の培養により抗体を作製することによって、抗体を作製することもできる。
好ましい態様において、本発明の方法によって作製される抗体は、さらに精製される。精製方法は、当業者に公知である。
抗体は、感染症を予防または治療するための方法において使用され得る。したがって、本発明のさらに別の主題は、本発明の抗体を含む薬学的組成物、特にワクチンに関する。薬学的組成物は、上記に詳述したように、さらなる構成要素を含んでよい。組成物は、T細胞を刺激する能力を増大させる物質をさらに含んでよい。これらには、Tヘルパー細胞エピトープ、脂質もしくはリポソーム、またはWO01/78767に記載されているような好ましい修飾物質(modification)が含まれる。エピトープのT細胞刺激能力を増大させる別の方法は、免疫刺激物質、例えば、インターロイキン-2、インターロイキン-7、インターロイキン-12、インターロイキン-18、クラスIおよびIIのインターフェロン(IFN)、特にIFN-γ、GM-CSF、TNF-α、およびflt3-リガンドなどのようなサイトカインまたはケモカインと配合することである。
本発明のさらなる主題は、感染症に対して対象を免疫化するためか、または感染症を有する対象を治療するための、本発明の薬学的ペプチドもしくは本発明の薬学的核酸または本発明の抗体もしくはその機能的断片を含む薬学的組成物であって、感染症が好ましくは化膿連鎖球菌感染症である薬学的組成物に関する。本発明の別の局面において、本発明の薬学的ペプチドもしくは本発明の薬学的核酸または本発明の抗体もしくはその機能的断片は、感染症に対して対象を免疫化するためか、または感染症を有する対象を治療するための医薬の製造のために使用され、その際、感染症は、好ましくは化膿連鎖球菌感染症、より好ましくは、化膿連鎖球菌血清型M1、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370による感染症である。あるいは、本発明の薬学的ペプチドもしくは薬学的核酸または本発明の抗体もしくはその機能的断片は、それを必要とする対象を免疫化または治療する方法において使用され、その際、本発明の薬学的ペプチドもしくは薬学的核酸または本発明の抗体もしくはその機能的断片の有効量が対象に投与される。対象は、感染症、特に化膿連鎖球菌感染症を予防するために免疫化されてもよく、または、感染症、特に化膿連鎖球菌感染症を寛解させるか、もしくは治癒させるために治療されてよい。投与されるべき有効量の決定は、当業者の知識の範囲内である。例示的な量を下記に挙げる。
本発明の薬学的ペプチドまたは薬学的核酸は、一般に、対象において免疫応答を誘導するために有用である。免疫化のために使用されるワクチンは、化膿連鎖球菌に感染しやすい対象、好ましくは哺乳動物、およびなおより好ましくは、ヒトに投与され得る。潜在的な投与様式には、経口、鼻腔内、筋肉内、リンパ節内、皮内、腹腔内、皮下、およびそれらの組合せが含まれるが、最も好ましくは、筋肉内注射である。筋肉内投与用の用量の体積は、好ましくは最大約5mL、例えば、0.3mL〜3mLの間、1mL〜3mLの間、約0.5〜1mL、または約2mLである。各用量中に抗原を含むタンパク質の量は、例えば、化膿連鎖球菌感染に起因する臨床徴候を示すようになるリスクを減少させるのに有効な免疫性を与えるのに十分であるべきである。異なる態様において、タンパク質の単位用量は、最高約5μgタンパク質/kg体重、約0.2〜3μgの間、約0.3〜1.5μgの間、約0.4〜0.8μgの間、または約0.6μgであるべきである。代替の態様において、タンパク質の単位用量は、最高約6μgタンパク質/kg体重、約0.05〜5μgの間、または約0.1〜4μgの間であってよい。異なる態様において、用量は、1〜3回、例えば、1〜3週間間隔で投与される。用量当たりの代表的なタンパク質量は、約1μg〜約1mg、より好ましくは約5μg〜約500μg、なおより好ましくは、約10μg〜約250μg、および最も好ましくは約25μg〜約100μgである。
本発明のさらに別の局面において、本発明の抗体またはその機能的断片は、感染症、好ましくは化膿連鎖球菌感染症、より好ましくは、化膿連鎖球菌血清型M1、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370による感染症を治療するための医薬の製造のために使用される。あるいは、本発明の抗体は、それを必要とする対象を治療する方法において使用され、その際、本発明の抗体の有効量が対象に投与される。対象は、感染症、特に化膿連鎖球菌感染症を寛解させるか、または治癒させるために治療され得る。投与されるべき有効量の決定は、当業者の知識の範囲内である。
治療は、本発明の抗体の有効量を、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与する段階を含む。したがって、本発明の抗原、その断片または変種に対する抗体は、感染症、特に細菌感染症、および特に、化膿連鎖球菌、特に化膿連鎖球菌血清型M1、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370に起因する感染症を抑制および/または治療するために使用され得る。
本発明の薬学的ペプチド、薬学的核酸、または抗体の「有効量」は、インビボでの効果を示す、例えば、感染症、特に化膿連鎖球菌感染症、特に化膿連鎖球菌血清型M1、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370の感染症の徴候または症状を予防するか、または寛解させることができる量として算出され得る。このような量は、当業者によって決定され得る。好ましくは、このような組成物は、非経口的に、好ましくは筋肉内または皮下に投与される。しかしながら、これは、経口的経路または局所的経路を含む他の任意の適切な経路によって投与するために調剤されてもよい。このような治療用組成物の送達経路および投薬量の選択は、当業者の技能の範囲内である。
本発明における治療とは、治療的処置と予防的手段または防止的手段との両方を意味し、標的とする病理学的状態または障害を予防するか、または遅らせる(減らす)ことが目的である。治療を必要とする者には、障害を既に有する者、ならびに障害を有する傾向がある者または障害を予防すべき者が含まれる。
本発明の別の主題は、以下の段階を含む、化膿連鎖球菌感染症を診断する方法に関する：
(a)対象から得た試料を本発明によるペプチドと接触させる段階、および
(b)該試料中の、化膿連鎖球菌に対する抗体の存在を検出する段階。
(a)対象から得た試料を本発明によるペプチドと接触させる段階、および
(b)該試料中の、化膿連鎖球菌に対する抗体の存在を検出する段階。
本発明のペプチドは、化膿連鎖球菌、特に、化膿連鎖球菌血清型M1、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118、特に化膿連鎖球菌SF370の検出のために使用され得る。好ましくは、このような検出は、診断のため、より好ましくは、疾患の診断のため、最も好ましくは、化膿連鎖球菌感染症の診断のためである。ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、対象から得た試料中の、化膿連鎖球菌に特異的な抗体またはその断片の存在を検出するために使用され得る。試料は、例えば血液試料でよい。あるいは、化膿連鎖球菌に特異的な抗原の存在を、本発明の抗体を用いて検出することもできる。
したがって、化膿連鎖球菌感染症を診断する代替の方法は、以下の段階を含む：
(a)対象から得た試料を本発明による抗体と接触させる段階、および
(b)試料中の化膿連鎖球菌抗原の存在を検出する段階。
(a)対象から得た試料を本発明による抗体と接触させる段階、および
(b)試料中の化膿連鎖球菌抗原の存在を検出する段階。
本発明はまた、正常レベルおよび異常レベルの決定を含む、細胞および組織または体液中の本発明のペプチドまたは抗体のレベルを検出するための定量アッセイ法および診断アッセイ法などの診断アッセイ法にも関する。宿主に由来する試料中のペプチドまたは抗体のレベルを決定するのに使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ法、競合的結合アッセイ法、ウェスタンブロット解析、およびELISAアッセイ法が含まれる。これらのうちで、ELISAがしばしば好ましい。ELISAアッセイ法は、最初に、ペプチド、特に抗原、好ましくはモノクローナル抗体に特異的な抗体を調製する段階を含む。さらに、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体が、一般に調製される。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬、または西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような酵素試薬など検出可能な試薬に結合される。
また、本発明のペプチドまたは抗体は、アレイのために、またはアレイに関連して使用されてもよい。より具体的には、本発明のペプチドまたは抗体の少なくとも1つが、支持体上に固定化されてよい。該支持体は、典型的には、様々な抗原およびその断片を含み、1つまたはいくつかの本発明のペプチドまたは抗体を用いることによって多様性を生じさせることができる。このようなアレイならびに一般的な任意のアレイを特色付ける特徴は、前記支持体またはその表面上の別個またはあらかじめ定義された領域または位置に、異なるポリペプチドが固定化されるということである。このため、アレイの別個の位置または領域における任意の活性は、個々のポリペプチドと相関関係があり得る。支持体上に固定化される本発明の様々なペプチドまたは抗体の数は、わずか10個〜数千個の本発明の様々なペプチドまたは抗体まで様々である。
このようなアレイの製造は当業者に公知であり、例えば、米国特許第5,744,309号に記載されている。アレイは、好ましくは、少なくとも第1の表面を有する平面状、多孔質性、または非多孔質性の固体支持体を含む。好ましい支持体材料は、特に、ガラスまたはセルロースである。このアレイが本明細書において説明する診断的用途のいずれかのために使用されることもまた、本発明の範囲内である。本発明のペプチドまたは抗体の他に、本発明による核酸分子もまた、前述のアレイの作製のために使用され得る。
本発明の別の局面は、以下の段階を含む、本発明によるペプチドに結合することができるリガンドを同定するための方法に関する：
(a)ペプチドを含む試験システムを提供する段階、
(b)試験システムを試験化合物と接触させる段階、および
(c)ペプチドへの試験化合物の結合に応答して生成されるシグナルを検出する段階。
(a)ペプチドを含む試験システムを提供する段階、
(b)試験システムを試験化合物と接触させる段階、および
(c)ペプチドへの試験化合物の結合に応答して生成されるシグナルを検出する段階。
より具体的には、この方法は、本発明による単離または固定化されたペプチドを、ペプチドへの候補リガンドの結合を可能にする条件下で候補リガンドと接触させる段階であって、試験システムが、前記ペプチドへの候補リガンドの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる構成要素を含む段階、およびペプチドへのリガンドの結合に応答して生成されるシグナルの有無を検出する段階によって実施することができる。リガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストでよい。
リガンドの結合を検出するための試験システムは当業者に公知であり、例えば、放射性リガンド、蛍光標識されたリガンド、または酵素標識されたリガンドなど標識されたリガンドを用いる結合アッセイ法が含まれる。
試験化合物は、天然に存在するか、または化学合成されるかいずれかの任意の試験化合物でよい。天然に存在する試験化合物には、特に抗体、好ましくは、本発明の抗体との類似性を示すものが含まれる。本発明の1つの好ましい態様において、試験化合物は、化学化合物ライブラリーの形態で提供される。化学化合物ライブラリーは、複数の化学化合物を含み、かつ、化学合成された分子および天然生成物を含む、複数の供給源のいずれかから集められているか、または、コンビナトリアルケミストリー技術によって作製されている。これらは、ハイスループットなスクリーニングに特に適している。これらは、特定の構造の化学化合物または植物のような特定の生物の化合物から構成されてよい。
リガンドを同定するための方法はまた、以下の段階も含んでよい：
(a)本発明によるペプチドを提供する段階、
(b)ペプチドの相互作用相手、特に本発明による抗体を提供する段階、
(c)ペプチドを該相互作用相手と相互作用させて、相互作用複合体を形成させる段階、
(d)試験化合物を提供する段階、
(e)試験化合物と相互作用複合体の間で競合反応を起こさせる段階、および
(f)試験化合物が、相互作用相手とのペプチドの相互作用活性を阻害するか、または減少させるかどうかを決定する段階。
(a)本発明によるペプチドを提供する段階、
(b)ペプチドの相互作用相手、特に本発明による抗体を提供する段階、
(c)ペプチドを該相互作用相手と相互作用させて、相互作用複合体を形成させる段階、
(d)試験化合物を提供する段階、
(e)試験化合物と相互作用複合体の間で競合反応を起こさせる段階、および
(f)試験化合物が、相互作用相手とのペプチドの相互作用活性を阻害するか、または減少させるかどうかを決定する段階。
同定されたリガンドは、例えば、連鎖球菌、特に化膿連鎖球菌の感染から起こる疾患を阻害するために使用することができ、したがって、薬学的組成物中に配合してよい。
最後の局面において、本発明によるペプチドは、ペプチドのリガンドの単離および/または精製および/または同定のために使用され、その際、リガンドの単離および/または精製および/または同定は、上記に詳述したように、または当業者に公知のように、実施することができる。本発明の好ましい態様において、アフィニティ装置が使用され得る。このアフィニティ装置は、少なくとも、支持体材料およびその支持体材料に結合された本発明による任意のペプチドを含んでよい。本発明によるペプチドは、その標的細胞もしくは標的分子または相互作用相手に対して特異的であるため、これらのペプチドでは、結合のための条件が見合うことを条件として、支持体材料に添加された任意の種類の試料から相互作用相手を選択的に除去することが可能である。試料は、生物学的試料または医学的試料でよく、発酵ブロス、細胞片、細胞調製物、組織調製物、器官調製物、血液、尿、リンパ液、および髄液(liquor)などを含むが、それらに限定されるわけではない。ペプチドは、共有結合の様式または非共有結合の様式でマトリックスに結合されてよい。適切な支持体材料は当業者に公知であり、セルロース、ケイ素、ガラス、アルミニウム、常磁性ビーズ、デンプン、およびデキストランを含む群より選択され得る。
本発明は、下記の図面、実施例、および配列データによってさらに例示され、これらから、さらなる特徴、態様、および利点が理解され得る。本発明の実施例が、単に例証として与えられるに過ぎず、本開示を制限するために与えられないことを理解すべきである。
図1は、マウス致死性モデルにおいて、選択された化膿連鎖球菌抗原および副構築物(sub-construct)による能動免疫化によって実現された防御を示す。
図2は、マウス致死性モデルにおいて、選択された化膿連鎖球菌抗原および副構築物による能動免疫化によって実現された防御を示す。
図3は、マウス致死性モデルにおいて、選択された化膿連鎖球菌抗原および副構築物による能動免疫化によって実現された防御を示す。
図4は、マウス致死性モデルにおいて、選択された化膿連鎖球菌抗原による能動免疫化によって実現された防御を示す。
表1は、感染症のマウスモデルにおける防御に関して評価した、化膿連鎖球菌の組換えタンパク質およびその断片を示す。
表2は、化膿連鎖球菌抗原タンパク質およびその断片をコードする遺伝子のクローニングのために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。
表3は、遺伝子保存調査のために使用される化膿連鎖球菌株を示す。
表4は、化膿連鎖球菌遺伝子のPCRおよび配列決定のために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。
表5は、化膿連鎖球菌株に由来するSpy0269の多様なアミノ酸位置を示す。
表6は、化膿連鎖球菌株に由来するSpy0292の多様なアミノ酸位置を示す。
表7は、化膿連鎖球菌株に由来するSpy0416の多様なアミノ酸位置を示す。
表8は、化膿連鎖球菌株に由来するSpy0488の多様なアミノ酸位置を示す。
表9は、化膿連鎖球菌株に由来するSpy0872の多様なアミノ酸位置を示す。
表10は、化膿連鎖球菌株に由来するSpy0895の多様なアミノ酸位置を示す。
表11は、化膿連鎖球菌株に由来するSpy1536の多様なアミノ酸位置を示す。
表12は、化膿連鎖球菌株に由来するSpy1666の多様なアミノ酸位置を示す。
実施例
実施例1：鼻腔内抗原接種モデルにおいて致死的敗血症に対する防御的免疫応答を誘導する、A群連鎖球菌抗原およびその断片。
実験手順
組換え肺炎球菌(pneumococcal)タンパク質のクローニングおよび発現
遺伝子/DNA断片のクローニング：
遺伝子特異的プライマー(表2を参照されたい)を用いたPCRによって、関心対象の遺伝子/DNA断片(表1を参照されたい)を化膿連鎖球菌SF370(血清型M1)のゲノムDNAから増幅させた。遺伝子特異的な部分の他に、これらのプライマーは、増幅されたPCR産物の方向性のあるクローニングに役立つ制限部位を有した。プライマーの遺伝子アニーリング(特異的)部分の長さは15塩基〜30塩基の間の範囲であった。得られたPCR産物を適切な制限酵素で消化し、Hisタグ付きタンパク質を得るためにpET28b(+)ベクター(Novagen)中にクローニングした。選択された抗原の完全長および断片を含む構築物を表1に列挙する。組換えプラスミドが関心対象の遺伝子を含むことを確認した後で、発現宿主となる大腸菌BL21 star(登録商標)細胞(Invitrogen)を形質転換させた。
実施例1：鼻腔内抗原接種モデルにおいて致死的敗血症に対する防御的免疫応答を誘導する、A群連鎖球菌抗原およびその断片。
実験手順
組換え肺炎球菌(pneumococcal)タンパク質のクローニングおよび発現
遺伝子/DNA断片のクローニング：
遺伝子特異的プライマー(表2を参照されたい)を用いたPCRによって、関心対象の遺伝子/DNA断片(表1を参照されたい)を化膿連鎖球菌SF370(血清型M1)のゲノムDNAから増幅させた。遺伝子特異的な部分の他に、これらのプライマーは、増幅されたPCR産物の方向性のあるクローニングに役立つ制限部位を有した。プライマーの遺伝子アニーリング(特異的)部分の長さは15塩基〜30塩基の間の範囲であった。得られたPCR産物を適切な制限酵素で消化し、Hisタグ付きタンパク質を得るためにpET28b(+)ベクター(Novagen)中にクローニングした。選択された抗原の完全長および断片を含む構築物を表1に列挙する。組換えプラスミドが関心対象の遺伝子を含むことを確認した後で、発現宿主となる大腸菌BL21 star(登録商標)細胞(Invitrogen)を形質転換させた。
タンパク質の発現および精製：
組換えプラスミドを含む大腸菌BL21star(登録商標)細胞を、必要とされる培養体積において対数期まで増殖させた。OD600nmが0.6に達した後で、37℃で3時間、0.5mM IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)で培養物を誘導した。遠心分離によってこれらの細胞を回収し、凍結融解法とそれに続くBugBuster(登録商標)(Novagen)による細胞破壊の組合せによって溶解させた。遠心分離によって溶解物を可溶性画分(上清)および不溶性画分(沈殿物)に分離した。タンパク質の位置に応じて、様々な精製戦略を適用した。
組換えプラスミドを含む大腸菌BL21star(登録商標)細胞を、必要とされる培養体積において対数期まで増殖させた。OD600nmが0.6に達した後で、37℃で3時間、0.5mM IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)で培養物を誘導した。遠心分離によってこれらの細胞を回収し、凍結融解法とそれに続くBugBuster(登録商標)(Novagen)による細胞破壊の組合せによって溶解させた。遠心分離によって溶解物を可溶性画分(上清)および不溶性画分(沈殿物)に分離した。タンパク質の位置に応じて、様々な精製戦略を適用した。
(A)Hisタグ付きタンパク質が可溶性画分中に存在した場合、上清をNi-セファロースビーズ(Ni-Sepharose(商標)6 Fast Flow、GE Healthcare)に結合させることによってタンパク質精製を実施した。発現されたタンパク質のC末端に6個のヒスチジン(6×HIS)が存在するため、このタンパク質はNi-セファロースに結合したのに対し、他の混入しているタンパク質は、洗浄緩衝液によってカラムから洗浄された。pH7.4で、20mM NaH2PO4、0.5mM NaCl緩衝液中500mMイミダゾールにより、このタンパク質を溶出させた。溶出液を濃縮し、Bradfordによってタンパク質濃度を分析し、かつ、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって検査した。
(B)タンパク質が不溶性画分中に存在した場合、8M尿素を含む適切な緩衝液中で沈殿物を可溶化し、かつ、前述したのと同じ材料および手順を用いて、(8M尿素を含む緩衝液中)変性条件下でNi-NTAカラム上に添加した。尿素を含まない洗浄緩衝液を用いて、混入しているタンパク質をカラムから洗浄した。タンパク質をNi-NTAマトリックス上に固定化する間に、Hisタグ付きタンパク質のリフォールディングを実施した。復元後、500mMイミダゾールを添加することによって、タンパク質を溶出させた。溶出液を透析して、微量の尿素を除去し、かつ、体積が大きい場合には濃縮し、SDS-PAGEによって検査し、かつBradford法によって測定した。
動物防御の研究
動物：
雌のCD-1マウスまたはBALB/cマウス(6〜8週齢)を使用した。
動物：
雌のCD-1マウスまたはBALB/cマウス(6〜8週齢)を使用した。
能動免疫(皮下経路)：
フロイント完全アジュバント(CFA、最終濃度50％)、水酸化アルミニウム(ALUM、最終濃度1％)、またはIC31(商標)(最終濃度：100nmol L-KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：55)、4nmolオリゴデオキシヌクレオチドODN1a(dIdC)13のPBS溶液(Intercell AG、ウィーン、オーストリア)で補強した、PBS中で緩衝化した組換えタンパク質50μgをCD-1マウスに皮下注射した(体積100μL)。同量のタンパク質およびアジュバント(フロイント不完全アジュバント(IFA)を追加免疫のために使用したCFAを除く、最終濃度50％)を用いて、14日目および28日目の2回、動物に追加免疫した。公開されている(Dale et al., J. Immunol. 151 ：2188(1993))防御性のM1タンパク質抗原またはM23タンパク質抗原を陽性対照として使用し、一方、アジュバントのみで免疫化したマウスが陰性対照としての機能を果たした。それぞれの組換えタンパク質を用いたELISAによって、35日目に抗体力価を測定した。
フロイント完全アジュバント(CFA、最終濃度50％)、水酸化アルミニウム(ALUM、最終濃度1％)、またはIC31(商標)(最終濃度：100nmol L-KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：55)、4nmolオリゴデオキシヌクレオチドODN1a(dIdC)13のPBS溶液(Intercell AG、ウィーン、オーストリア)で補強した、PBS中で緩衝化した組換えタンパク質50μgをCD-1マウスに皮下注射した(体積100μL)。同量のタンパク質およびアジュバント(フロイント不完全アジュバント(IFA)を追加免疫のために使用したCFAを除く、最終濃度50％)を用いて、14日目および28日目の2回、動物に追加免疫した。公開されている(Dale et al., J. Immunol. 151 ：2188(1993))防御性のM1タンパク質抗原またはM23タンパク質抗原を陽性対照として使用し、一方、アジュバントのみで免疫化したマウスが陰性対照としての機能を果たした。それぞれの組換えタンパク質を用いたELISAによって、35日目に抗体力価を測定した。
能動免疫化(鼻腔内経路)：
IC31(商標)(最終濃度：10nmol L-KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：55)、0.4nmolオリゴデオキシヌクレオチドODN1a(dIdC)13のPBS溶液(Intercell AG、ウィーン、オーストリア)で補強した、PBS中で緩衝化した組換えタンパク質30〜50μgをBALB/cマウスに鼻腔内注射した(体積20μL)。同量のタンパク質およびアジュバントを用いて、7日目、14日目、および28日目の3回、動物に追加免疫した。公開されている防御性のM1タンパク質抗原またはM23タンパク質抗原を陽性対照として使用し、一方、アジュバントのみで免疫化したマウスが陰性対照としての機能を果たした。それぞれの組換えタンパク質を用いたELISAによって、35日目に抗体力価を測定した。
IC31(商標)(最終濃度：10nmol L-KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：55)、0.4nmolオリゴデオキシヌクレオチドODN1a(dIdC)13のPBS溶液(Intercell AG、ウィーン、オーストリア)で補強した、PBS中で緩衝化した組換えタンパク質30〜50μgをBALB/cマウスに鼻腔内注射した(体積20μL)。同量のタンパク質およびアジュバントを用いて、7日目、14日目、および28日目の3回、動物に追加免疫した。公開されている防御性のM1タンパク質抗原またはM23タンパク質抗原を陽性対照として使用し、一方、アジュバントのみで免疫化したマウスが陰性対照としての機能を果たした。それぞれの組換えタンパク質を用いたELISAによって、35日目に抗体力価を測定した。
細菌接種：
新しく増殖させた化膿連鎖球菌株MA-A20またはMA-A147を使用した。それぞれの化膿連鎖球菌株の一晩(o/n)培養物に由来する細菌懸濁液1mLをTHY培地50mLに添加した。細菌懸濁液のOD600nmが0.4〜0.6の間に到達するまで、光学濃度を測定した。個別に確立した増殖曲線を用いて、細菌の総数を決定した。細菌細胞を遠心沈殿させ、かつPBSで調整して、所望のcfu計数値を得た。細菌接種物中に存在する生細胞数を決定するために、血液寒天プレート上へのプレーティングを経てcfuを決定した。個別に麻酔したマウスの鼻腔内に106〜108cfuを添加した(20μL)。免疫化による防御を菌血症/敗血症モデルを用いて測定した。その際、接種後2〜3週間、生存率を追跡し、かつ、生存を動物総数(マウス10匹/グループ)に対するパーセンテージで表した。
新しく増殖させた化膿連鎖球菌株MA-A20またはMA-A147を使用した。それぞれの化膿連鎖球菌株の一晩(o/n)培養物に由来する細菌懸濁液1mLをTHY培地50mLに添加した。細菌懸濁液のOD600nmが0.4〜0.6の間に到達するまで、光学濃度を測定した。個別に確立した増殖曲線を用いて、細菌の総数を決定した。細菌細胞を遠心沈殿させ、かつPBSで調整して、所望のcfu計数値を得た。細菌接種物中に存在する生細胞数を決定するために、血液寒天プレート上へのプレーティングを経てcfuを決定した。個別に麻酔したマウスの鼻腔内に106〜108cfuを添加した(20μL)。免疫化による防御を菌血症/敗血症モデルを用いて測定した。その際、接種後2〜3週間、生存率を追跡し、かつ、生存を動物総数(マウス10匹/グループ)に対するパーセンテージで表した。
結果
鼻腔内マウス敗血症/致死性モデルにおいて防御を示すA群連鎖球菌抗原および/またはそれらの断片を同定した。ヒトにおける予防的ワクチンの目標適応症は咽頭炎であるため、候補抗原を評価するための鼻腔内抗原接種モデルの方が、以前に説明されている静脈内モデルまたは腹腔内モデルよりも生理学的に関連していると考えられている(Guzman et al., J. Inf. Dis. 179：901 (1999)；Stalhammar-Carlemalm et al., Mol. Microbiol. 33：208 (1999))。したがって、3種の異なるモデルにおいて防御を評価した。すべて、鼻腔内経路を介して細菌接種を適用した。鼻腔内接種モデルにおいて、9種の異なるタンパク質に関して防御を観察し、これらの一部は、完全長組換えタンパク質の断片として試験した。
鼻腔内マウス敗血症/致死性モデルにおいて防御を示すA群連鎖球菌抗原および/またはそれらの断片を同定した。ヒトにおける予防的ワクチンの目標適応症は咽頭炎であるため、候補抗原を評価するための鼻腔内抗原接種モデルの方が、以前に説明されている静脈内モデルまたは腹腔内モデルよりも生理学的に関連していると考えられている(Guzman et al., J. Inf. Dis. 179：901 (1999)；Stalhammar-Carlemalm et al., Mol. Microbiol. 33：208 (1999))。したがって、3種の異なるモデルにおいて防御を評価した。すべて、鼻腔内経路を介して細菌接種を適用した。鼻腔内接種モデルにおいて、9種の異なるタンパク質に関して防御を観察し、これらの一部は、完全長組換えタンパク質の断片として試験した。
連鎖球菌接種に対する防御は抗体によって媒介されるため、非常に高いレベルの抗体を得るために、アジュバントとしてCFA/IFAを用いて、免疫化を最初に実施した。続いて、ミョウバンおよびIC31(商標)は、ヒトにおける使用に適しており、かつ、ヒトにおけるA群連鎖球菌感染症を予防するためのワクチンにとって好ましい選択であると考えられるため、これらのアジュバントをアジュバントとして用いて、同様に実験を実施した。図1に示される実験において確認し得るように、断片Spy0292-1は、完全長のSpy0292タンパク質と同程度の防御を成し遂げたのに対し、Spy0292-3は、より低いレベルの防御を示した。このことから、防御に有用な1つの領域が、Spy0292-1タンパク質を含む配列内に存在することが明瞭に示される。
同様の結果が、タンパク質Spy0269(Spy0269-1によっても十分な防御が観察された)、Spy0416(Spy0416A-1、Spy0416A-6、およびSpy0416A-7によっても十分な防御が観察された)、ならびにSpy0872(Spy0872-2によっても十分な防御が観察された)の場合にも得られた。
タンパク質Spy0488、Spy0895、およびSpy1727が致死的な化膿連鎖球菌接種に対する防御を提供できることが初めて示されたたため、これらのタンパク質の場合、完全長組換えタンパク質を使用した(表1)。特に、タンパク質Spy0895は、表1に記載した3種のモデルすべてにおいてA群連鎖球菌感染に対する防御を提供したため、ワクチン候補物として具体的な有望さを示す。
Spy1536およびSpy1666は、静脈内抗原接種モデルにおいて防御を提供することが以前に示されている(WO 2004/078907)が、重要なことには、それらがまた、生理学的な関連性がより高い鼻腔内抗原接種モデルにおいても防御を提供することが、現在示され得る。Spy1536は、GAS感染症の3種のモデルすべてにおいて顕著な防御を提供するという点で最も一貫性があった。これら2種の抗原、Spy0895およびSpy1536の他に、次のいくつかの抗原は、少なくとも2種のモデルにおいて防御を示した：Spy0269-1、Spy0292-1、Spy0416A-1、Spy0872-2、Spy1666、およびSpy1727。重要なことには、いくつかの抗原が、陽性対照のタンパク質M1(例えば、Spy0416A-1、Spy0488、Spy0895；表1)の場合に認められたレベルと同じくらい高いレベルの防御を示した。
これらのデータから、選択されたタンパク質がワクチン開発のための有望な候補であるという証拠がはっきりと提供される。さらに、タンパク質Spy0269、Spy0292、Spy0416、およびSpy0872は、それらの細断片が、完全長組換えタンパク質よりも同じレベルか、またはさらに優れたレベルの防御を提供することができたため、防御のために必須ではないアミノ酸配列を有することが示された。
(表１)感染症のマウスモデルにおける防御に関して評価した、化膿連鎖球菌の組換えタンパク質およびその断片
1長さ：アミノ酸および塩基対は、化膿連鎖球菌遺伝子に特異的な配列のみについて計算する。
2算出された分子量は、ベクターに由来するアミノ酸およびHis6タグを含む。
3防御は、以下に示すような動物モデルに基づいている：
A CFA/IFAをアジュバントとして用いて皮下注射により免疫化、化膿連鎖球菌A20による鼻腔内抗原接種。
B ALUMをアジュバントとして用いて皮下注射により免疫化、および化膿連鎖球菌A20による鼻腔内抗原接種。
C IC31(商標)または粘膜アジュバントを用いた鼻腔内免疫化、および化膿連鎖球菌A20またはA147のいずれかによる鼻腔内抗原接種。
括弧は、陰性対照(PBS+アジュバントのみ)および陽性対照(Mタンパク質)のそれぞれのモデルにおける防御を示す。複数のモデルにおいて防御が認められた場合、最初に挙げたモデルの防御データを示す。
2算出された分子量は、ベクターに由来するアミノ酸およびHis6タグを含む。
3防御は、以下に示すような動物モデルに基づいている：
A CFA/IFAをアジュバントとして用いて皮下注射により免疫化、化膿連鎖球菌A20による鼻腔内抗原接種。
B ALUMをアジュバントとして用いて皮下注射により免疫化、および化膿連鎖球菌A20による鼻腔内抗原接種。
C IC31(商標)または粘膜アジュバントを用いた鼻腔内免疫化、および化膿連鎖球菌A20またはA147のいずれかによる鼻腔内抗原接種。
括弧は、陰性対照(PBS+アジュバントのみ)および陽性対照(Mタンパク質)のそれぞれのモデルにおける防御を示す。複数のモデルにおいて防御が認められた場合、最初に挙げたモデルの防御データを示す。
(表２)化膿連鎖球菌抗原タンパク質およびそれらの断片をコードする遺伝子のクローニングのために使用されるオリゴヌクレオチド
1 プライマー、太字は遺伝子特異的配列を示し、下線を引いた文字は制限酵素部位を示し、通常フォントの文字はクローニングのために必要であるが、発現のために使用される最終のプラスミド構築物中に存在しない配列を示す。増幅のために使用されるコードされた遺伝子に関して、第1のプライマーは常にセンスオリゴヌクレオチドを指し、第2のプライマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。
実施例2：A群連鎖球菌抗原およびその変種
実験手順
連鎖球菌ゲノムDNAの調製
Todd-Hewittブロス培地5mLに、凍結した穿刺培養物(stab)に由来する(表3に記載したような)化膿連鎖球菌の各株を接種し、かつ、振盪せずに37℃で一晩増殖させた。次いで、Biofuge fresco(Haereus)中、13,000rpmで5分間遠心分離することによって培養物4mLを回収し、かつ、上清を除去した。Wizard(登録商標)ゲノムDNA精製キット(Promega)のプロトコルに従って、DNAを細菌細胞沈殿物から単離した。DNA沈殿物を最後に風乾し、かつ、2回蒸留水(ddH2O)70μl中に溶解した。
実験手順
連鎖球菌ゲノムDNAの調製
Todd-Hewittブロス培地5mLに、凍結した穿刺培養物(stab)に由来する(表3に記載したような)化膿連鎖球菌の各株を接種し、かつ、振盪せずに37℃で一晩増殖させた。次いで、Biofuge fresco(Haereus)中、13,000rpmで5分間遠心分離することによって培養物4mLを回収し、かつ、上清を除去した。Wizard(登録商標)ゲノムDNA精製キット(Promega)のプロトコルに従って、DNAを細菌細胞沈殿物から単離した。DNA沈殿物を最後に風乾し、かつ、2回蒸留水(ddH2O)70μl中に溶解した。
化膿連鎖球菌遺伝子のPCR解析および配列解析
種々の化膿連鎖球菌株に由来する抗原の配列を決定するために、関心対象の遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRを実施した。これらの解析のために使用される化膿連鎖球菌株を表3に示す。PCR用のプライマーとしてのオリゴヌクレオチド配列は、完全な遺伝子を増幅することができるように、選択された抗原に対して設計した。PCR産物を鋳型として使用して、専用のプライマーを用いて配列決定を実施した。オリゴヌクレオチドの配列は表4に記載する。すべての化膿連鎖球菌株のゲノムDNAを前述したようにして調製した。Taqポリメラーゼ(1U)、200nM dNTP、各オリゴヌクレオチド10pMol、およびキットを製造業者の取扱い説明書(Invitrogen、オランダ)に従って用いて、反応体積25μlでPCRを実施した。個々のプライマー対に対して条件を適応させなければならない場合を除いて、標準として、30サイクル(95℃で5分を1回、95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で120秒を30回、72℃で4分を1回)を実施した。表10に挙げるオリゴヌクレオチドを用いて、PCR試料を配列決定した。配列決定はAgowa(ドイツ)で実施した。
種々の化膿連鎖球菌株に由来する抗原の配列を決定するために、関心対象の遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRを実施した。これらの解析のために使用される化膿連鎖球菌株を表3に示す。PCR用のプライマーとしてのオリゴヌクレオチド配列は、完全な遺伝子を増幅することができるように、選択された抗原に対して設計した。PCR産物を鋳型として使用して、専用のプライマーを用いて配列決定を実施した。オリゴヌクレオチドの配列は表4に記載する。すべての化膿連鎖球菌株のゲノムDNAを前述したようにして調製した。Taqポリメラーゼ(1U)、200nM dNTP、各オリゴヌクレオチド10pMol、およびキットを製造業者の取扱い説明書(Invitrogen、オランダ)に従って用いて、反応体積25μlでPCRを実施した。個々のプライマー対に対して条件を適応させなければならない場合を除いて、標準として、30サイクル(95℃で5分を1回、95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で120秒を30回、72℃で4分を1回)を実施した。表10に挙げるオリゴヌクレオチドを用いて、PCR試料を配列決定した。配列決定はAgowa(ドイツ)で実施した。
(表３)本研究のために使用される化膿連鎖球菌の臨床分離株
(表４)配列保存解析のために使用されるオリゴヌクレオチド
ORFおよびプライマーの名称、遺伝子に対するプライマーの向き、配列、および遺伝子に対する位置を示す。オリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片のPCR増幅およびそれに続く配列解析の両方のために使用された。
ORFおよびプライマーの名称、遺伝子に対するプライマーの向き、配列、および遺伝子に対する位置を示す。オリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片のPCR増幅およびそれに続く配列解析の両方のために使用された。
結果
選択された連鎖球菌抗原の遺伝子保存解析
方法の箇所で説明したようにして、9種の選択された遺伝子のPCRおよび配列決定を実施した。表3は配列決定のために使用される株を示すのに対し、表4では、PCR解析および配列決定解析のために使用されるオリゴヌクレオチドを列挙する。
選択された連鎖球菌抗原の遺伝子保存解析
方法の箇所で説明したようにして、9種の選択された遺伝子のPCRおよび配列決定を実施した。表3は配列決定のために使用される株を示すのに対し、表4では、PCR解析および配列決定解析のために使用されるオリゴヌクレオチドを列挙する。
Spy0269の配列解析
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0269の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.7％〜100％の範囲であった。表5では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0269と比べた場合に異なるアミノ酸を示した36個のアミノ酸位置すべてを列挙する。
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0269の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.7％〜100％の範囲であった。表5では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0269と比べた場合に異なるアミノ酸を示した36個のアミノ酸位置すべてを列挙する。
(表５)Spy0269の遺伝子保存
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。
Spy0292の配列解析
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0292の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、97.3％〜100％の範囲であった。表6では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0292と比べた場合に異なるアミノ酸を示した36個のアミノ酸位置すべてを列挙する。
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0292の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、97.3％〜100％の範囲であった。表6では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0292と比べた場合に異なるアミノ酸を示した36個のアミノ酸位置すべてを列挙する。
(表６)Spy0292の遺伝子保存
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。2、各位置で観察される第2の存在し得るアミノ酸。3、各位置で観察される第3の存在し得るアミノ酸。
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。2、各位置で観察される第2の存在し得るアミノ酸。3、各位置で観察される第3の存在し得るアミノ酸。
Spy0416の配列解析
Schmitz 1/74株を除く50種の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0416の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.1％〜100％の範囲であった。表7では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0416と比べた場合に異なるアミノ酸を示した103個のアミノ酸位置すべてを列挙する。遺伝子はさらに、31番目の後にアミノ酸2個の挿入、ならびに表示された位置にいくつかのアミノ酸欠失を示した(例えば、Schmitz1/17株およびSchmitz1/39株)。
Schmitz 1/74株を除く50種の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0416の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.1％〜100％の範囲であった。表7では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0416と比べた場合に異なるアミノ酸を示した103個のアミノ酸位置すべてを列挙する。遺伝子はさらに、31番目の後にアミノ酸2個の挿入、ならびに表示された位置にいくつかのアミノ酸欠失を示した(例えば、Schmitz1/17株およびSchmitz1/39株)。
(表７)Spy0416の遺伝子保存
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。2、各位置で観察される第2の存在し得るアミノ酸。欠失または挿入とは、化膿連鎖球菌SF370のSpy0416と比べて欠けているか、または付加的なアミノ酸を指す。
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。2、各位置で観察される第2の存在し得るアミノ酸。欠失または挿入とは、化膿連鎖球菌SF370のSpy0416と比べて欠けているか、または付加的なアミノ酸を指す。
Spy0488の配列解析
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0488の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、85.4％〜100％の範囲であった。表8では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0488と比べた場合に異なるアミノ酸を示した49個のアミノ酸位置すべてを列挙する。いくつかの株(例えばSchmitz 1/55)に由来する遺伝子は、異なるN末端をさらに有し、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0488と比べてアミノ酸25個が付加され、かつ、最初の16個のアミノ酸に対してフレームシフトがある。
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0488の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、85.4％〜100％の範囲であった。表8では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0488と比べた場合に異なるアミノ酸を示した49個のアミノ酸位置すべてを列挙する。いくつかの株(例えばSchmitz 1/55)に由来する遺伝子は、異なるN末端をさらに有し、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0488と比べてアミノ酸25個が付加され、かつ、最初の16個のアミノ酸に対してフレームシフトがある。
(表８)Spy0488の遺伝子保存
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。2、各位置で観察される第2の存在し得るアミノ酸。挿入とは、化膿連鎖球菌SF370のSpy0488と比べて付加的なアミノ酸を意味する。
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。2、各位置で観察される第2の存在し得るアミノ酸。挿入とは、化膿連鎖球菌SF370のSpy0488と比べて付加的なアミノ酸を意味する。
Spy0872の配列解析
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0872の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.2％〜100％の範囲であった。表9では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0872と比べた場合に異なるアミノ酸を示した34個の酸位置すべてを列挙する。Schmitz 1/22株に由来する遺伝子は、587番目の後にアミノ酸2個の挿入をさらに示した。
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0872の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.2％〜100％の範囲であった。表9では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0872と比べた場合に異なるアミノ酸を示した34個の酸位置すべてを列挙する。Schmitz 1/22株に由来する遺伝子は、587番目の後にアミノ酸2個の挿入をさらに示した。
(表９)Spy0872の遺伝子保存
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。挿入とは、化膿連鎖球菌SF370のSpy0872と比べて付加的なアミノ酸を意味する。
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。挿入とは、化膿連鎖球菌SF370のSpy0872と比べて付加的なアミノ酸を意味する。
Spy0895の配列解析
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0895の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.9％〜100％の範囲であった。表10では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0895と比べた場合に異なるアミノ酸を示した13個のアミノ酸位置すべてを列挙する。
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0895の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.9％〜100％の範囲であった。表10では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy0895と比べた場合に異なるアミノ酸を示した13個のアミノ酸位置すべてを列挙する。
(表１０)Spy0895の遺伝子保存
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。
Spy1536の配列解析
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy1536の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、99.1％〜100％の範囲であった。表11では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy1536と比べた場合に異なるアミノ酸を示した8個のアミノ酸位置すべてを列挙する。Schmitz 2/14株に由来する遺伝子は、207番目の後にアミノ酸3個の挿入をさらに示した。
51種類の株すべてから配列を得た。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy1536の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、99.1％〜100％の範囲であった。表11では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy1536と比べた場合に異なるアミノ酸を示した8個のアミノ酸位置すべてを列挙する。Schmitz 2/14株に由来する遺伝子は、207番目の後にアミノ酸3個の挿入をさらに示した。
(表１１)Spy1536の遺伝子保存
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。挿入とは、化膿連鎖球菌SF370のSpy1536と比べて付加的なアミノ酸を意味する。
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。挿入とは、化膿連鎖球菌SF370のSpy1536と比べて付加的なアミノ酸を意味する。
Spy1666の配列解析
50種の株から配列を得た。RDN 120株に由来する配列は決定しなかった。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy1666の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.2％〜100％の範囲であった。表12では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy1666と比べた場合に異なるアミノ酸を示した18個のアミノ酸位置すべてを列挙する。
50種の株から配列を得た。RDN 120株に由来する配列は決定しなかった。化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy1666の配列と比べたアミノ酸配列の同一性のレベルは、98.2％〜100％の範囲であった。表12では、化膿連鎖球菌SF370に由来するSpy1666と比べた場合に異なるアミノ酸を示した18個のアミノ酸位置すべてを列挙する。
(表１２)Spy1666の遺伝子保存
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。
1、各化膿連鎖球菌株の配列決定された遺伝子のいずれかにおいて各位置で観察されるアミノ酸。
Spy1727の配列解析
列挙された化膿連鎖球菌株から得た、解析した51種類の遺伝子配列のいずれにおいても、アミノ酸配列レベルでの配列変異は観察されなかった。
列挙された化膿連鎖球菌株から得た、解析した51種類の遺伝子配列のいずれにおいても、アミノ酸配列レベルでの配列変異は観察されなかった。
アミノ酸配列に関する配列データ
Claims (30)
- SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：3の化膿連鎖球菌(S. pyogenes)の1種類の抗原、またはSEQ ID NO：4、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：3の化膿連鎖球菌の1種類の抗原の機能的に活性な変種からなる、ペプチド。
- SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：3の化膿連鎖球菌の1種類の抗原、またはSEQ ID NO：4、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、もしくはSEQ ID NO：3の化膿連鎖球菌の1種類の抗原の機能的に活性な変種、および以下からなる、ペプチド：
(a)該抗原がSEQ ID NO：1である場合、1〜350個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜200個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、もしくは25個の付加的なアミノ酸残基；または
(b)該抗原がSEQ ID NO：2である場合、1〜200個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜150個、より好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは、多くても1〜50個、なおより好ましくは、多くても1〜25個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の付加的なアミノ酸残基；または
(c)該抗原がSEQ ID NO：3のものである場合、1〜100個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜75個、より好ましくは1〜50個、さらにより好ましくは、多くても1〜25個、なおより好ましくは、多くても1〜10個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、もしくは5個の付加的なアミノ酸残基；または
(d)該抗原がSEQ ID NO：4のものである場合、1〜150個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜100個、より好ましくは1〜75個、さらにより好ましくは、多くても1〜50個、なおより好ましくは、多くても1〜25個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の付加的なアミノ酸残基；または
(e)該抗原がSEQ ID NO：5である場合、1〜450個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜300個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個の付加的なアミノ酸残基；または
(f)該抗原がSEQ ID NO：6もしくはSEQ ID NO：7である場合、1〜250個の付加的なアミノ酸残基、好ましくは1〜200個、より好ましくは1〜150個、さらにより好ましくは、多くても1〜100個、なおより好ましくは、多くても1〜50個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、もしくは25個の付加的なアミノ酸残基。 - 抗原に対して異種の少なくとも1つのアミノ酸残基、好ましくはマーカータンパク質を含む付加的なアミノ酸配列からさらになる、請求項1または2記載のペプチド。
- 付加的なアミノ酸残基が抗原のC末端、N末端、またはC末端およびN末端に隣接している、請求項2または3記載のペプチド。
- 機能的に活性な変種が、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、またはSEQ ID NO：3の抗原のいずれかと本質的に同一であるが、異なる血清型の化膿連鎖球菌の相同配列に由来し、具体的には、該血清型が、M2、M3、M4、M5、M6、M11、M12、M14、M19、M22、M24、M25、M28、M44、M49、M57、M59、M60、M61、M76、M83、M84、M87、M89、またはM118であるという点で、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、またはSEQ ID NO：3のいずれかの該抗原とは異なる、請求項1〜4のいずれか一項記載のペプチド。
- 機能的に活性な変種が、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原のアミノ酸の少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、なおより好ましくは、少なくとも90％、さらにより好ましくは、少なくとも95％、最も好ましくは99％からなるSEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの一部分である、請求項1〜5のいずれか一項記載のペプチド。
- SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原の機能的に活性な変種が、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの該抗原に対して少なくとも50％の配列同一性、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの該抗原に対して、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、なおより好ましくは、少なくとも90％、さらにより好ましくは、少なくとも95％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する、請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチド。
- 変種が、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換により、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：7のいずれかの抗原に由来する、請求項7記載のペプチド。
- SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、またはSEQ ID NO：7のうち少なくとも1種に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Spy0269でも、Spy0292でも、Spy0416Aでも、Spy0872でもない、ペプチド。
- 少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、より好ましくは少なくとも4個の抗原を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載のペプチド。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸、またはそれに相補的な核酸、特に、SEQ ID NO：11〜SEQ ID NO：17の配列のいずれかのDNA配列または対応するRNA配列。
- ベクター中に位置している、請求項11記載の核酸。
- 以下を含む薬学的組成物、特にワクチン：
(i)請求項1〜10のいずれか一項記載の少なくとも1種類のペプチド、ならびに/または
(ii)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：10のいずれかの配列を含むか、もしくはそれからなる少なくとも1種類のペプチド、またはその機能的に活性な変種、ならびに
(iii)任意で、薬学的に許容される担体または賦形剤。 - 以下を含む薬学的組成物：
(i)請求項11記載の核酸、および/もしくはそれに相補的な核酸、ならびに/または
(ii)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：10のいずれかの配列を含むか、もしくはそれからなるペプチドをコードする核酸、特に、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、もしくはSEQ ID NO：20のいずれかのDNA配列、またはその機能的に活性な変種もしくはそれに相補的な核酸または対応するRNA配列、ならびに
(iii)任意で、薬学的に許容される担体または賦形剤。 - 核酸がベクターおよび/または細胞中に含まれている、請求項14記載の薬学的組成物。
- 請求項1記載の抗原に特異的に結合する抗体またはその機能的に活性な断片。
- 抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体であるか、または機能的に活性な断片がFab断片を含む、請求項16記載の抗体またはその機能的に活性な断片。
- 請求項16または17記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
- 以下の段階を特徴とする、請求項16または17記載の抗体を作製するための方法：
(a)請求項1〜10のいずれか一項記載のペプチドの有効量を動物に投与する段階；および
(b)段階(a)の投与に応答して該動物によって産生される該抗体を該動物から単離する段階。 - 以下の段階を特徴とする、請求項16または17記載の抗体を作製するための方法：
(a)請求項1〜10のいずれか一項記載のペプチドの有効量とB細胞を接触させる段階；
(b)段階(a)の該B細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得る段階；および
(c)培養された該ハイブリドーマ細胞によって産生される前記抗体を単離する段階。 - 単離した抗体をさらに精製する、請求項19または20記載の方法。
- 請求項16または17記載の抗体を含む薬学的組成物、特にワクチン。
- 感染症に対して対象を免疫化するためか、または感染症を有する対象を治療するための、請求項13記載のペプチドまたは請求項14記載の核酸または請求項16もしくは17記載の抗体もしくはその機能的断片を含む薬学的組成物であって、該感染症が好ましくは化膿連鎖球菌感染症である、薬学的組成物。
- 感染症、好ましくは化膿連鎖球菌感染症に対して免疫化するためか、または感染症、好ましくは化膿連鎖球菌感染症を治療するための医薬を製造するための、請求項13記載のペプチドまたは請求項14記載の核酸または請求項16もしくは17記載の抗体もしくはその機能的断片の使用。
- 以下の段階を含む、感染症に対して対象を免疫化する、または感染症を有する対象を治療する方法：
(a)請求項13記載のペプチドまたは請求項14記載の核酸または請求項16もしくは17記載の抗体もしくはその機能的断片の有効量を該患者に投与する段階。 - 感染症が化膿連鎖球菌感染症である、請求項25記載の方法。
- 以下の段階を含む、化膿連鎖球菌感染症を診断する方法：
(a)対象から得た試料を請求項1〜10のいずれか一項記載のペプチドと接触させる段階、および
(b)該試料中の、化膿連鎖球菌に対する抗体の存在を検出する段階。 - 以下の段階を含む、化膿連鎖球菌感染症を診断する方法：
(a)対象から得た試料を請求項16もしくは17記載の抗体と接触させる段階、および
(b)該試料中の化膿連鎖球菌抗原の存在を検出する段階。 - 以下の段階を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のペプチドに結合することができるリガンドを同定するための方法：
(a)該ペプチドを含む試験システムを提供する段階、
(b)該試験システムを試験化合物と接触させる段階、および
(c)該ペプチドまたは機能的に活性な変種への該試験化合物の結合に応答して生成されるシグナルを検出する段階。 - ペプチドの相互作用相手を単離および/または精製および/または同定するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の任意のペプチドの使用。
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