DE2450355A1

DE2450355A1 - Aus n-acyl-muraminsaeurederivaten gebildete adjuvanzien und diese enthaltende impfstoffe

Info

Publication number: DE2450355A1
Application number: DE19742450355
Authority: DE
Inventors: Arlette Adam; Francoise Audibert; Louis Chedid; Jean Choay; Rita Ciorbaru; Farielle Ellouz; Dominique Juy; Edgar Lederer; Pierre Lefranciernte; Claude Merser; Jeanfrancois Petit; Pierre Sinay
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1973-10-23
Filing date: 1974-10-23
Publication date: 1975-05-28
Also published as: US4235771A; DE2450355C2; US4327085A; US4186194A; NL7413855A; US4323559A; GB1496332A

Description

Die Erfindung betrifft aus N-Acyl-muraminsäurederivaten gebildete Adjuvanzien und diese Adjuvanzien enthaltende Impfstoffe.

Die Erfindung ist auf lösliche Mittel gerichtet,die als immunulogische Adjuvanzien wirken und in den damit behandelten Wesen die Immunreaktionen auf Antigene unterschiedlicher Art stimulieren. Die Erfindung betrifft insbesondere Adjuvanzien, die die Wirkung der schwachen Immunogene ver-

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stärken und steigern.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere als Adjuvanzien geeignete Mittel, die für die Immunisierung von Menschen und warmblütigen Tieren gegen durch Bakterien, Viren und Parasiten hervorgerufene Infektionen und gegen verschiedene Gewebeantigene normalen oder pathologischen Ursprungs, insbesondere gegen Tumore, geeignet sind.

Man kennt bereits seit einiger Zeit Substanzen, die Adjuvanseigenschaften besitzen. Es ist beispielsweise gut bekannt, daß Materialien, wie die Zellen von Mycobakterien und die Zellwände der Mycobakterien die Bildung der Antikörper in dem Wirt bzw. den damit behandelten Wesen steigern und insbesondere die Resistenz des Wirts gegen Infektionen erhöhen, die durch zahlreiche Mikroorganismen verursacht werden. Die bekannten Substanzen dieser Art, wie das komplette Freundsche Adjuvans, das vollständige Mycobakterienzellen enthält, haben sich aufgrund der von ihnen hervorgerufenen nachteiligen Nebenreaktionen für die Verwendung in der Therapie als unerwünscht erwiesen. Sie können beispielsweise die Empfindlichkeit des Wirts gegenüber Endotoxinen erhöhen, eine Tuberkulinhypersensibilität verursachen und Granulome, Lymphoidgewebehyperplasien und bei der Ratte unter gewissen Bedingungen eine experimentelle Polyarthritis herbeiführen. Andererseits sind bisher die Adjuvanzien auf der Grundlage von Mycobakteriensubstanzen wegen ihrer Unlöslichkeit schwierig zu reinigen gewesen.

So ist insbesondere in der französischen Patentanmeldung Nr. -71 41610 (vom 19. November 1971) ein Verfahren beschrieben, das die Herstellung eines löslichen und im wesentlichen von den genannten Nachteilen freien Adjuvans ermöglicht. Insbesondere kann ein derartiges Adjuvans beispielsweise mit einem Verfahren bereitet werden, das im wesentlichen darin besteht, einen Mycobakterienstamm, Nocardia-Zellen oder verwandte Mikroorganismen

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zu züchten, die Zellen des kultivierten Stammes zu gewinnen, sie aufzubrechen, die aufgebrochenen Zellwände beispielsweise durch Differentialzentrxfugieren zu gewinnen, die Wachse, freien Lipide, Proteine und Nukleinsäuren abzutrennen und zu entfernen, das von den Zellwänden stammende, von Lipiden befreite Material mit einem murolytisehen Enzym, wie Lysozym, zu digerieren, den festen Rückstand zu beseitigen und die wässrige Fraktion zu gewinnen,die die genannten löslichen Mittel enthält. Man bewirkt anschließend eine Reinigung und, mindestens in gewissen Fällen in Abhängigkeit von der Natur des behandelten AusgangsStamms, eine Fraktionierung der erhaltenen Mittel, beispielsweise dadurch, daß man die wässrige Fraktion über eine Molekularsieb filtriert, beispielsweise über eine mit Polydextrangel oder einem analogen Material, wie

Cr> Cdi

dem unter der Bezeichnung "Sephadex^w G75" oder "Sephadex^ G5O"

bekannten Gel, gefüllte Säule.

Beispielsweise ergibt, wenn der anfänglich gezüchtete Stamm ein Stamm von Mycobacterium smegmatis ist, die Filtration der

Cr)

wässrigen Fraktion über "Sephadex~G 50" zwei aufeinanderfolgende Elutionsbanden, die beide Substanzen mit Adjuvanseigenschaften enthalten.

In der genannten Patentanmeldung ist angegeben, daß das fragliche Adjuvans und insbesondere das aus der ersten der beiden genannten Elutionsbanden gewonnene, wahrscheinlich aus einem Oligomeren besteht, dessen monomere Einheiten im wesentlichen jenen der Polymeren der Mikroorganismenzellwände, aus denen sie extrahiert worden sind, mit Ausnahme ihrer Lipidteile, die sehr klein und in gewissen Fällen nicht vorhanden sind, entsprechen. Es ist ebenfalls festgestellt worden, daß das in der zweiten der genannten beiden Elutionsbanden vorhandene Adjuvans aus einem an neutralen Zuckern armen oder sogar freien Oligomeren besteht, dessen monomere Einheit die Aminozucker und die Aminosäuren der die Zellwände der genannten Mikroorganismen bildenden Polymerisate und gegebenenfalls kleine Lipidteile enthält.

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Diese verschiedenen Adjuvanzien stellen sicherlich einen beträchtlichen Fortschritt gegenüber den unlöslichen Adjuvanzien dar, die zuvor beschrieben worden sind. Sie bestehen jedoch aus Gemischen und man kann in der Tat daran denken, daß diese Mittel, insbesondere durch die Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens, nur aus Mycobakterien, Nocardiae, und damit verwandten Mikroorganismen erhalten werden können.

Die Erfindung betrifft nun lösliche Adjuvanzien mit geringem Molekulargewicht, die chemisch wohldefiniert sind und die - mindestens was einen Teil dieser Mittel anlangt - synthetisch hergestellt werden können. Es hat sich andererseits gezeigt, daß mindestens ein Teil dieser wohldefinierten und niedermolekularen Adjuvanzien auf biochemischem Weg hergestellt werden können, wobei man nicht nur von den oben genannten Mikroorganismen , sondern auch von anderen Prokaryobakterien, beispielsweise den Enterobakterien, von denen einer der klassischen Repräsentanten Escherichia coli ist,oder Micrococcus roseus ausgehen kann,

Die erfindungsgemäßen Adjuvanzien bestehen aus einem Monomeren oder einem aus diesem Monomeren gebildeten Oligomeren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Monomere eine N-Acylmuraminsäure (N-Acyl-Mur) mit einer Acyl-Gruppe vom Glykolyl- oder Acetyl-Typ und eine 2 bis 8 Aminosäuren enthaltende Peptidkette umfaßt, wobei die erste dieser Aminosäuren, die an die N-Acyl-muraminsäure gebunden ist, Alanin, Serin oder Glycin ist und als zweite dieser Aminosäuren Glutamin oder Asparaginsäure vorhanden ist.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung dieser Mittel oder Adjuvanzien zur Herstellung von Impfstoffen, deren immunogene Wirkung sie durch ihre Fähigkeit verstärken, die Bildung von Antikörpern gegen das impfende Antigen in dem Wirtsorganismus zu begünstigen und zu steigern, und betrifft demzufolge auch ImpfstoffZubereitungen, die neben einem immunogenen oder antigenen Impfstoff ein derartiges Adjuvans enthalten.

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_ 5 —

Eine erste Gruppe von bevorzugten Adjuvanzien wird durch jene gebildet, die zusätzlich N-Acetylglucosamin (N-AcGIc) enthalten, und insbesondere diejenigen, deren Monomeres im wesentlichen aus mindestens einem Polysaccharid-polypeptid gebildet ist, das eine N-Acyl-muraminsäure-Einheit (N-Acyl-Mur) enthält, deren Acyl-Gruppe durch eine Acetyl- oder eine Glykolyl-Gruppe gebildet wird, und an die einerseits eine N-Acetylglucosamin-Einheit (N-AcGIc) und andererseits eine Peptidkette gebunden sind, deren erste Aminosäure, die an die N-Acyl-muraminsäure gebunden ist, Alanin, Serin oder Glycin ist und die als zweite Aminosäure Glutaminsäure oder Asparaginsäure enthält, wobei eine der Carboxyl-Gruppen dieser zweiten Aminosäure entweder in freier Form oder in der Amidform vorliegt und die andere Säure-Gruppe die Bindung mit einer anderen Aminosäure, wie meso-^-S-Diaminopimelinsäure, Lysin, ^-Aminobuttersäure oder 3-Hydroxydiaminopimelinsäure vermittelt.

Diese Adjuvanzien bestehen im wesentlichen aus löslichen Peptidoglykanfragmenten, die in dem Aufbau der Prokaryontenzellwände auftreten.

Von diesen Mitteln seien insbesondere die Polysaccharid-polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht genannt, die in ihren

Formeln Einheiten der folgenden Art enthalten:

N-Acetylglucosamin (N-AcGIc),

N-Acyl-muraminsäure (N-Acyl-Mur), die als Acyl-Gruppe vorzugsweise eine Gruppe vom Glykolyl- oder Acetyl-Typ enthält,

L-Alanin (L-AIa), D-Alanin (D-AIa), D-Glutaminsäure (D-GIu), deren Carboxyl-Gruppe in der

fcC -Stellung entweder in freier Form oder in substituierter Form und im letzteren Fall bevorzugt als Amid-Gruppe vorliegt,

meso-o(.-<5-Diaminopimelinsäure (meso-DAP) , deren eine Carboxyl-Gruppe entweder in freier Form oder in Form einer Peptid-Bindung vorliegt, und deren andere Carboxyl-Gruppe entweder in freier Form oder in substituierter

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Form vorliegt, wobei sie im letzteren Fall vorzugsweise in Form der Amid-Gruppe vorhanden ist.

Von den erfindungsgemäßen Mitteln seien insbesondere jene hervorgehoben, bei denen N-Acetylglucosamin, N-Acyl-muraminsäure, L-Alanin, D-Glutaminsäure, meso-^-cf-Diaminopimelinsäure und D-Alanin in den folgenden Molverhältnissen vorhanden sind (wobei es sich versteht, daß die Abwesenheit der sechsten Ziffer bei den im folgenden angegebenen Verhältnissen die Tatsache verdeutlicht, daß das entsprechende Mittel kein D-Alanin enthält) .

1:1:1:1:1 (Disaccharid-Tripeptid)

1:1:1:1:1:1 (Disaccharid-Tetrapeptid)

1:1:2:2:2:1 (Disaccharid-Heptapeptid)

1:1:2:2:2:2 (Disaccharid-Octapeptid)

2:2:2:2:2:1 (Tetrasaccharid-Heptapeptid)

2:2:2:2:2:2 (Tetrasaccharid-Octapeptid)

Im folgenden seien von den erfindungsgemäßen Adjuvanzien die Disaccharide und Tetrasaccharide mit ihren Formeln angegeben, wobei es sich versteht, daß die Abkürzungen D-GIu und meso-DAP auch für D-Glutaminsäure- und meso-n(-£~Diaminopimelinsäure-Einheiten stehen, die die Carboxyl-Gruppen sowohl in freier Form als auch in Form der Amide enthalten können (in dem Fall, wo diese Gruppen nicht an Peptid-Bindungen teilnehmen) .
Als Disaccharide seien genannt:

N-AcGlc-N-Acyl-Mur N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-AIa L-AIa

D-GIu D-GIu

I I

meso-DAP I meso-DAP II

D-AIa

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N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-Ala D-GIu

meso-DÄP

D-AIa III meso-DAP

D-GIu

L-AIa

wobei es sich versteht, daß das Disaccharxd der Formel III gegebenenfalls zusätzlich eine weitere D-Alanin-Gruppe trägt, die an die zweite meso-DAP-Einheit der Heptapeptid-Kette gebunden ist.

Als Tetrasaccharide seien genannt:

N-Ac-Glc-N-Acyl-Mur L-AIa D-GIu

meso-DAP D-AIa-

N-AcGlc-N-Acyl-Mur L-AIa D-GIu

meso-DAP D-AIa

N-AcGlc-N-Acy1-Mur L-AIa

D-GIu

meso-DAP D-AIa-

N-AcGlc-N-Acyl-Mur L-AIa D-GIu

meso-DAP

N-AcGlc-N-Acyl-Mur - N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-AIa D-GIu

meso-DAP D-AIa

L-AIa
D-GIu

-meso-DAP
D-AIa

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N-AcGlc-N-Acyi-Mur-N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-AIa D-GIu

meso-DAP D-AIa-

L-AIa D-GIu

mesο-DAP

VII

N-AcGlc-N-Acyl-Mur-N-AcGlc-N-Acyl-Mur L-AIa

D-GIu meso-DAP

D-AIa meso-DAP

D-GIu

L-AIa

oder

VIII

N-AcGlc-N-Acyl-Mur-N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-AIa D-GIu

meso-DAP D-AIa

meso-DAP D-GIu L-AIa

IX

hierbei versteht es sich, daß die Tetrasaccharxde der Formeln VIII und IX gegebenenfalls zusätzlich eine D-Alanin-Gruppe tragen können, die an eine der meso-DAP-Gruppen der Heptapeptid-Kette gebunden ist.

Die Erfindung betrifft ferner Oligomere, die von Monomeren der Formeln I bis IX abgeleitet sind, und insbesondere jene, die 3 bis 6 Monomereneinheiten dieser Art enthalten.

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Man erhält insbesondere ausgehend von Mycobakterien, beispielsweise Mycobacterium smegmatis, Disaccharide oder Tetrasaccharide, die den oben angegebenen Formeln entsprechen, in denen die Acyl-Einheiten Glykolyl-Gruppen sind, die Carboxyl-Gruppen der D-Glutaminsäureeinheiten in Form der Amido-Gruppen vorliegen und die meso-ßC-S-Diaminopimelinsäureeinheiten eine entweder in freier Form oder in Form einer Peptid-Bindung vorliegende Carboxyl-Gruppe aufweisen, während die andere Carboxyl-Gruppe dieser Art als Amid-Gruppe vorhanden ist. Ausgehend von den Mycobakterien erhält man auch Oligomere, deren monomeren Einheiten direkt von Disacchariden und Tetrasacchariden der eben,definierten Art abgeleitet sind.

Aus Escherichia coli erhält man Disaccharide oder Tetrasaccharide der Formeln I bis IX, vorzugsweise der Formeln I bis VII, in denen die Acyleinheiten Acetyl-Gruppen sind, die Carboxyl-Gruppen der D-Glutaminsäuren in freier Form vorliegen und die meso-^-£-Diaminopimelinsäureeinheiten eine freie oder in Form der Peptid-Bindung vorliegende Carboxyl-Gruppe aufweisen, während die andere in freier Form vorhanden ist. Es ist ferner möglich, Oligomere herzustellen, deren monomeren Einheitendirekt von den definierten Disacchariden und Tetrasacchariden abgeleitet sind.

Zum Beispiel erhält man derartige Adjuvanzien entweder aus der oben genannten "zweiten Bande", die man

ausgehend von Mycobacterium smegmatis (oder der zweiten Bande

Cr)

der Filtration über Sephadex^der löslichen Fraktion, die man durch die Einwirkung von Lysozym auf die von Lipiden befreiten Zellen von Mycobacterium smegmatis unter Einhaltung der in der ersten FR-Zusatzanmeldung Nr. 72 22120 vom 19.Juni 1972 angegebenen Bedingungen) erhalten hat,durch Chromatographie über DEAE-Cellulose, durch vorzugsweise schonende Behandlung der Hauptbande des Abstroms dieser Chromatographie mit einer Muramyl-L-Alanin-Amidase, durch anschließende Filtration über ein Molekularsieb, beispielsweise das unter der Bezeichnung

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"Sephadex G25" bekannte, und Gewinnen der die erfindungsgemäßen Adjuvanzien enthaltenden Filtrationsbanden; oder durch schonende saure Hydrolyse der löslichen Mittel, die beim Behandeln des Materials, das sich unter den in der oben genannten französischen Patentanmeldung Nr. 71 41610 angegebenen Bedingungen aus den vollständigen, von Lipiden befreiten Zellwänden von Mycobakterien oder Nocardia ergibt, oder der vollständigen Zellen von Mycobakterien, die zuvor unter Einhaltung der in der ersten französischen Zusatzanmeldung Nr. 72 22120 (vom 19. Juni 1972) angegebenen Bedingungen von Lipiden befreit worden sind, mit einem murolytischen Enzym, insbesondere Lysozym anfallen;

oder ausgehend von unlöslichen Peptidoglykanen von Escherichia coli, die beispielsweise nach der Methode von Pelzer (H.Pelzer, Arch, für Mikrobiol., 50 (1965) 334) bereitet worden sind, indem man diese Peptidoglykane mit einem murolytischen Enzym, wie Lysozym, behandelt, die erhaltene, löslich gemachte Fraktion über ein Molekularsieb, beispielsweise das im Handel unter der Bezeichnung "Sephadex^ G50" erhältliche, filtriert und die Filtrationsbanden gewinnt.

Bei den oben beschriebenen Beispielen für Adjuvanzien können die verschiedenen Aminosäuren der Peptidkette durch andere Aminosäuren ersetzt werden, die weiter oben angegeben sind.

Zum Beispiel kann die meso-DAP durch Lysin oder ein Lysin enthaltendes Peptidkettenfragment ersetzt werden, was sich aus dem Beispiel ergibt, das auf die Herstellung eines Peptidoglykans von Micrococcus roseus gerichtet ist, das kein meso-DAP enthält, jedoch dennoch eine erhebliche Adjuvans-Aktivität entfaltet.

Weiterhin fallen in den Rahmen der Erfindung Polysaccharidpolypeptide, die den Fragmenten der ebenfalls aktiven Peptidoglykane entsprechen, die ausgehend von gewissen Prokaryobakterien erhalten werden können, bei denen sich einige der

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Aminosäuren von jenen der Peptidoglykane mycobakteriellen Ursprungs unterscheiden und umfaßt insbesondere jene, bei denen die erste Aminosäure der Peptidkette Serin oder Glycin ist. Das gleiche trifft auch auf Polysaccharid-polypeptide zu, bei denen eine der Aminosäuren durch eine äquivalente Aminosäure ersetzt sein kann. Dies ist beispielsweise dann der FaIl₇ wenn die Glutaminsäure der Peptidkette durch Asparaginsäure ersetzt ist.

Eine zweite Gruppe von bevorzugten Adjuvanzien wird durch jene Materialien gebildet, die kein N-Äcety!glucosamin enthalten. Sie bestehen aus einer N-Acyl-muraminsäure-Einheit, an die eine kurze Peptidkette mit mindestens zwei Aminosäuren, insbesondere 2 bis 5 Aminosäuren, gebunden ist, und wobei als erste, mit der Carboxyl-Gruppe der N-Acyl-muraminsäure gebundene Aminosäure Alanin, Serin oder Glycin vorhanden ist, während als zweite Aminosäure dieser Kette Glutaminsäure oder Asparaginsäure vorhanden ist, wobei jede der Carboxyl-Gruppen dieser zweiten Aminosäure entweder in freier Form oder in Amid-Form (für den Fall, daß die Ketten nur zwei Aminosäuren enthalten) oder_; im Fall einer längeren Peptidkette, mit einer anderen Aminosäure gebunden vorliegt.

Vorzugsweise sind als erste Aminosäure L-Alanin und als zweite Aminosäure D-Glutaminsäure vorhanden. Wenn die letztere Säure in amidierter Form vorliegt, ist dies vorzugsweise bei der <i( -Carboxyl-Gruppe der Fall. Sie kann in der L- oder in der D-Form vorliegen. Sie kann auch durch Asparaginsäure ersetzt sein, deren chemische Struktur derjenigen von Glutaminsäure sehr ähnlich ist.

Die gegebenenfalls vorhandene Substitution durch eine zusätzliche Aminosäure erfolgt vorzugsweise an der JH-Carboxyl-Gruppe der Glutaminsäure (oder der Asparaginsäure). Als zusätzliche Aminosäure kann irgendeine Aminosäure vorhanden sein. Bevorzugte zusätzliche Aminosäuren sind meso-cC-^-Diaminopimelinsäure,

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Lysin, V^-Aminobuttersäure und ß-Hydroxy-diaminopimelinsäure.

Vorzugsweise wird die Acyl-Gruppe der N-Acyl-muraminsäure durch eine Acetyl-Gruppe gebildet. Sie kann jedoch auch eine andersartige Gruppe sein, beispielsweise eine Glykolyl-Gruppe.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der fraglichen Peptidoglykan-Fragmente, das darin besteht, daß man N-Acyl-muraminsäure, deren freie OH-Gruppen, mit Ausnahme derjenigen der Propionyl-Gruppe der Muraminsäure, zuvor geschützt worden sind, mit dem entsprechenden Peptid umsetzt, dessen freie OH-Gruppen ebenfalls zuvor geschützt worden sind.

Weitere Gegenstände, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den folgenden, auf bevorzugte erfindungsgemäße Adjuvanzien gerichteten Beispielen.

Beispiel 1

Man züchtet von Zellen von Mycobacterium smegmatis, von denen ein Stamm unter der Nummer ATCC NBR 21732 bei der "American Type Culture Collection" hinterlegt worden ist, während etwa 12 Tagen bei 37⁰C auf einem Sauton-Medium in Roux-Kolben. Man gewinnt sie durch Filtration über Filterpapier, wäscht sie mit destilliertem Wasser und bewahrt sie bis zur Verwendung bei -2O°C auf.

Man suspendiert 10Og der Zellen in 500 ml destilliertem Wasser, indem man sie in der Kälte in einem zuvor abgekühlten Waring-Mischer verknetet, bis man eine homogene Suspension erhalten hat. Anschließend bricht man die Zellen in einer zuvor abgekühlten French-Presse, die in einer Kühlkammer betrieben wird, bei einem Druck von 420 kg/cm² auf. Nach einem ersten Durchgang durch die Presse setzt man 1 mg DNAse zu, um die Viskosität zu

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vermindern, und führt die Suspension ein zweites Mal durch die French-Presse. Neben der Zerstörung der Zellen durch mechanischen Druck kann das Aufbrechen der'Zellen auch dadurch erreicht werden, daß man sie der Einwirkung von Schallwellen unterzieht, indem man 30 ml der Suspension während 25 Minuten (5x5 Minuten) in einem gekühlten Raytheon-Schalloszillator mit einer Frequenz von 10 kHz behandelt, indem man die Zellen durch Einfrieren und Auftauen aufbricht, indem man sie mit einem Zeolith behandelt, indem man sie in Gegenwart von Glaskügelchen rührt oder indem man irgendwelche klassischen Mittel anwendet, die für das Aufbrechen von Mikrobenzellen geeignet sind.

Die erhaltene Suspension wird dreimal während 15 Minuten bei 800 g in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Der aus nicht aufgebrochenen Zellen bestehende Bodensatz wird verworfen. Die zuletzt erhaltene überstehende Flüssigkeit wird während einer Stunde bei 2 7 500 g zentrifugiert. Der hierbei anfallende Festkörperanteil, der aus Zellwandmaterial besteht, wird in 750 ml eines 0,066 m-Natriumphosphat-Puffers (pH 7,8) suspendiert, wonach man 125 mg Trypsin, 125 mg Chymotrypsin und eine geringe Menge eines aseptischen Mittels, wie Toluol zugibt, um jegliche Bakterienverunreinigung zu verhindern. Dann behandelt man das Material über Nacht bei Raumtemperatur in einem Inkubator unter magnetischem Rühren und zentrifugiert die Mischung anschließend während einer Stunde bei 27 500 g. Der das Zellwandmaterial enthaltende Bodensatz wird dadurch gewaschen, daß man ihn dreimal mit kaltem Phosphatpuffer und dreimal mit kaltem, destilliertem Wasser in Suspension bringt und wieder zentrifugiert.

Das Zellwandmaterial wird anschließend mit neutralen Lösungsmitteln bei Raumtemperatur von Lipiden befreit. Hierzu bringt man das Material in etwa 30 Volumen des Lösungsmittels in Suspension und läßt dieses unter Rühren während etwa einem Tag einwirken. Das Zellwandmaterial wird in dieser Weise dreimal mit Aceton, dreimal mit einer Äthanol/Äther-Mischung (1/1),

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dreimal mit Chloroform und dreimal mit einer Chloroform/Methanol-Mischung (2/1) von Lipiden befreit. Anschließend trocknet man dieses Material mit Aceton. Das getrocknete, von Lipiden befreite Zellwandmaterial kann anschließend bis zur Verwendung bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.

Man bringt 1 g des in dieser Weise erhaltenen, von Lipiden befreiten Zellwandmaterials in 250 ml einer 0,1 m-Ammoniumacetatlösung (pH 6,2) in Suspension. Man bewahrt das Material nach Zugabe einiger Toluoltropfen über Nacht in der Kälte auf. Dann filtriert man das Material über eine Glasfritte und wäscht mit Äthanol und Chloroform. Das in dieser Weise gewaschene Zellwandmaterial wird anschließend in 150 ml einer 0,1 m-Ammoniumacetatlösung (pH 6,2), die man mit 12 mg Lysozym und einigen Tropfen Toluol versetzt hat, in Suspension gebracht. Man bewahrt das Material unter Rühren über Nacht in einem Inkubator bei 37⁰C auf. Nach dem Abfiltrieren über eine Glasfritte behandelt man den unlöslichen Rückstand ein weiteres Mal unter den gleichen Bedingungen mit Lysozym. Dann werden die beiden Filtrate vermischt, gefriergetrocknet, erneut in Wasser gelöst und erneut gefriergetrocknet, bis kein Ammoniumacetat mehr vorhanden ist. Pro Gramm des getrockneten, von Lipiden befreiten Zellwandmaterials erhält man eine Ausbeute von etwa 90 mg des rohen, wasserlöslichen Produktes.

Das wasserlösliche Rohprodukt (500 mg) wird anschließend über eine mit "Sephadex^ G50" gefüllte Säule (Höhe 80 cm, Durchmesser 2,5 cm), die mit 0,1 n-Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist, filtriert.

Im folgenden wird das in der "ersten Elutionsbande" enthaltene Mittel als "Substanz A" bezeichnet, während die in der "zweiten Elutionsbande" enthaltenen Produkte als "Substanz B" bezeichnet werden.

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Man chromatographiert 300 mg der Fraktion, die der unter diesen Bedingungen erhaltenen "zweiten Bande" entspricht, über eine DE-p-Säule (DEAE-Cellulose von Whatman) mit einer Höhe von 32 cm und einem Durchmesser von 2 cm, wobei die Elution unter Anwendung eines linearen Pyridiniumacetat-Gradienten (insgesamt 1,6 1) erfolgt, der sich von einer 0,05 m-Pyridinlösung mit einem pH-Wert von 7,0 bis zu einer 2m-Pyridinlösung mit einem pH-Wert von 5,0 erstreckt.

Die Hauptbande des Abstroms, die im folgenden als Substanz BB bezeichnet wird, wird anschließend mit einer Muramyl-L-Alanin-Amidase (erhalten aus Myxobacter AL.) behandelt, wonach das Hydrolysat über eine mit Sephadex G25 gefüllte Säule mit einer Höhe von 80 cm und einem Durchmesser von 2,5 cm filtriert wird, die mit 0,1 n-Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist.

Die drei erhaltenen Fraktionen (F , F_TT und F_TTT) besitzen Adj uvans-Wirkung.

Die Analyse zeigt, daß

die Bande Fj_TT im wesentlichen Disaccharid-Tripeptide oder Disaccharid-Tetrapeptide enthält;

die Bande F_T Disaccharid-Heptapeptide oder Disaccharid-Octapeptide und Tetrasaccharid-Heptapeptide oder Tetrasaccharid-Octapeptide enthält und praktisch frei ist von sämtlichen anderen Bestandteilen,wenn man vonSpuren von Proteinaminosäuren absieht;

die Bande F_T Oligomere von Disaccharid-Tripeptiden oder Disaccharid-Tetrapeptiden enthält, und insbesondere 3 bis 6 Disaccharideinheiten aufweist. Die Bande F enthält zusätzlich 3 Gew.-% neutralen Zucker.

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Beispiel 2

Extraktion eines Adjuvans mit niederem Molekulargewicht aus der "Substanz A".

Man bringt die gefriergetrocknete "Substanz A" in einer O,1 η-Chlorwasserstoffsäurelösung in Lösung und bewahrt die

Lösung während 12 Stunden bei 60⁰C auf. Anschließend engt man die Lösung in einem Rotationsverdampfer ein und trocknet sie.

Man löst das erhaltene trockene Produkt in einer 0,1 η-Essig- .

säurelösung und filtriert die Lösung über ein Molekularsieb

(Sephadex^ G25)- Man fängt die erste_; Adjuvans enthaltende Band<

auf, die im folgenden als "Substanz G" bezeichnet wird.

Beispiel 3

Extraktion der Adjuvanzien aus Escherichia coli. Man bringt 500 g Zellen von Escherichia coli ß in 650 ml einer kalten 9%igen Natriumchloridlösung in Suspension. Zu dieser Lösung gibt man langsam eine dem lOfachen seines Volumens entsprechende Menge kalten Acetons. Dann rührt man während 5 Stunden bei O⁰C und läßt das Material sich absetzen. Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und der erhaltene weißliche Niederschlag während 10 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Der beim Zentrifugieren anfallende Bodensatz wird mit Aceton gewaschen, erneut zentrifugiert, mit Äther gewaschen und in einem Exsikkator getrocknet.

Man erhält 115 g eines acetonhaltigen Pulvers, das man in 5 1 einer 0,1 n-Ammoniumacetatlösung in Suspension bringt und homogenisiert. Dann gibt man 5 1 einer 4%igen Natriumdodecylsulfatlösung zu und rührt mit einem mechanischen Rührer während 20 Stunden bei Raumtemperatur. Dann setzt man ein gleich großes Volumen destillierten Wassers zu, rührt und zentrifugiert während 60 Minuten bei 27 000 g. Die beim Zentrifugieren als Bodensatz anfallenden Feststoffe werden mit einer 0,1 n-Ammoniumacetatlösung gewaschen und dann in 800 ml der gleichen Lösung

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erneut in Suspension gebracht. Dann setzt man 16 ml einer 0,15 m-Magnesiumsulfatlösung und eine Spatelspitze DNAse zu. Man beläßt während 60 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugiert dann während einer Stunde bei 27 000 g. Man behandelt den beim Zentrifugieren anfallenden Bodensatz zwei weitere Male mit DNAse und unterwirft ihn während 40 Stunden bei Raumtemperatur der Einwirkung einer 0,4%igen Natriumdodecylsulfatlösung.

Dann zentrifugiert man während 90 Minuten bei 27 000 g. Man nimmt den beim Zentrifugieren anfallenden Bodensatz in 600 ml destilliertem Wasser auf und behandelt ihn während 15 Stunden bei 37⁰C mit einem gleich großen Volumen eines 0,1 m-Phosphatpuffers (pH 7,8), der 0,02% Trypsin und 0,02% Chymotrypsin enthält. Man wäscht den Niederschlag einmal mit einem 0,05 m-Phosphatpuffer (pH 7,8) und dreimal mit destilliertem Wasser und gefriertrocknet ihn dann. Auf diese Weise erhält man 3 g Peptidoglykan.

Dieses Peptidoglykan wird mit Lysozymhydrolysiert, das es fast vollständig löslich macht. Hierzu inkubiert man 20 mg des Peptidoglykans in Gegenwart von 2 mg Lysozym in 2 ml eines 0,01 m-Phosphatpuffers (pH 6,0) während 15 Stunden bei 37⁰C in Gegenwart'von Verunreinigungen verhinderndem Toluol.

Das Lysat wird in 0,1 n-Essigsäurelösung gelöst und über eine mit Sephadex ^G50 gefüllte Säule (Höhe = 80 cm, Durchmesser = 2,5 cm) filtriert. Man erhält drei Banden, die jeweils die Bestandteile des Peptidoglykans enthalten, nämlich Alanin, Glutaminsäure, meso-Diaminopimelinsäure, N-Acetyl-glucosamin und N-Acetylmuraminsäure.

Die letzte Bande (Bande HO, die das geringste Molekulargewicht aufweist, besteht aus einer Mischung aus Disaccharid-Tetrapeptid und Disaccharid-Tripeptid.

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Die zweite Bande (Bande H-) besteht aus Tetrasaccharid-Heptapeptid und Tetrasaccharid-Octapeptrid.

Die geringe Menge des aus der ersten Bande (Bande H₁) erhaltenen Produktes besteht aus Oligomeren des Monomeren der dritten Bande,

Die Bestandteile dieser drei Banden sind Adjuvanzien, wie es die pharmakologisehen Granulom-Tests unter den weiter unten angegebenen Bedingungen verdeutlichen. Die Bande H₃ enthält das wirksamste Mittel.

Beispiel 4

Herstellung der Substanz der Formel III in praktisch reinem Zustand (N-glykolierte Muraminsäure und Glutaminsäure und meso-c(.-£- Diaminopimelinsäure in Amidform, wie weiter oben hinsichtlich der aus Mycobakterien gewonnenen Produkte angegeben). Diese Fraktion erhält man durch präparative Elektrophorese der Fraktion F_TT von Beispiel 1. Die Elektrophorese erfolgt auf Whatman-Papier (3MM) unter Anwendung eines Pyridin-Essigsäure-Puffers (pH 3,9) über eine Länge von 60 cm bei einer Spannung von 60 V/cm. Man arbeitet unter Testbenzin in einer Gilson-Vorrichtung. Die Substanz wandert pro Stunde 6 cm in Richtung auf die Kathode zu. Unter den gleichen Bedingungen wandern Alanin 5 cm und Glucosamin 25 cm ebenfalls in Richtung auf die Kathode zu.

Die Substanz wird mit 0,1 n-Essigsäurelösung aus dem Papier eluiert. Diese Substanz wird im folgenden als "Substanz I" bezeichnet.

Beispiel 5

Herstellung der "Substanz I",deren Formel weiter oben angegeben ist (N-Glykolyl-muraminsäure und Glutaminsäure und meso-i(-£- Diaminopimelinsäure in der Amidform, wie es weiter oben in Bezug auf die aus Mycobakterien gewonnenen Produkte angegeben ist).

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Diese Fraktion erhält man durch präparative Elektrophorese der Fraktion F von Beispiel 1. Die Elektrophorese erfolgt unter Anwendung der in Beispiel 4 angegebenen Bedingungen. In diesem Fall wandert die Substanz 7 cm zur Kathode hin. Die eluierte Substanz wird im folgenden als "Substanz J" bezeichnet,

Beispiel 6

Herstellung von Zellwänden von Micrococcus roseus.

Man züchtet Zellen von Micrococcus roseus (Stamm Nr. 5693 des Institut Pasteur de Paris) in 2 1-Erlenmeyer-Kolben, die 800 ml eines Nährmediums (Nutrient broth Difco) enthalten und die auf einem Rütteltisch (Biolafitte, Maisons-Lafitte) befestigt sind, bei 25°C und gewinnt das Material nach zwei Drittel der exponentiellen Wachstumsphase.

Die Bakterien werden durch Rühren in Gegenwart von kleinen Glaskügelchen aufgebrochen. Hierfür bringt man bei einem Laboratoriumsversuch Bakterien mit einem Frischgewicht von 30 g in 150 ml destilliertem Wasser in Suspension. Dann setzt man 150 ml kleiner Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 0,17 mm bis 0,18 mm zu und beschickt die 400 ml-Schale einer Kugelmühle (Omni-Mixer, Sorvall), die man durch Eintauchen in ein Eiswasserbad gekühlt hat, mit dieser Mischung. Die Mühle wird dann während 30 Minuten mit voller Geschwindigkeit betrieben. Nach dem Abdekantieren der Glaskügelchen wird die überstehende Flüssigkeit gewonnen. Man vermischt sie mit der überstehenden Flüssigkeit, die beim zweimaligen Waschen der Glaskügelchen mit 100 ml destilliertem Wasser anfällt. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden dreimal während 10 Minuten bei 800 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert, um die Bruchstücke der Glaskügelchen und die nicht aufgebrochenen Bakterien zu entfernen. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird dann während einer Stunde-bei 27 000 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Der aus den Zellwänden bestehende Bodensatz wird mit Hilfe einer Potter-Mühle mit einem Teflon-Kolben in

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150 ml eines 0,066 m-Phosphatpuffers (pH 7,8), der mit 30 mg Trypsin und 30 mg Chymotrypsin versetzt ist, in Suspension gebracht und dann über Nacht bei Raumtemperatur in Gegenwart einiger Tropfen Toluol inkubiert, die dazu dienen, Verunreinigungen zu verhindern. Nach dem Zentrifugieren während einer Stunde bei 27 500 g wird der aus deproteinisierten Zellwänden bestehende Feststoff dadurch gewaschen, daß man ihn dreimal mit 150 ml eines 0,066 m-Phosphatpuffers (pH 7,8) und dreimal mit 150 ml destilliertem Wasser mit Hilfe einer Potter-Mühle mit Teflon-Kolben in Suspension bringt und zwischendurch jeweils eine Stunde bei 4⁰C bei 27 Soo g zentrifugiert. Die Zellwände werden dann gefriergetrocknet. Sie sind, wie es die weiter unten angegebene Tabelle II verdeutlicht, als Adjuvanzien wirksam.

Aus den folgenden Veröffentlichungen:

1. J.F.Petit, E.Munoz und J.M.Ghuysen, Biochemistry, _5, 2764-2776 (1966);

2. E.Munoz, J.M.Ghuysen, M.Leyh-Bouille, J.F.Petit,

H.Heymann, E.Bricas und P.Lefrancier, Biochemistry, 5_, 3748-3764 (1966)

ist bekannt, daß das Peptidoglykan von M.roseus aus sich wiederholenden N-Acetylglucosaminyl-ß-1,4-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-lysyl-D-alanin-Einheiten besteht, dessen £~Aminogruppe des Lysins durch ein (L-AIa) .,-L-Thr-Peptid (wobei "Thr" für Threonin steht) substituiert ist. Die Interpeptid-Bindungen erfolgen durch eine Bindung zwischen dem endständigen D-Alanin eines Tetrapeptids und dem endständigen L-Alanin des Peptids (L-AIa)₃~L-Thr, das das Lysin eines anderen Tetrapeptids (1) substituiert. Um zu zeigen, daß die Adjuvans-Wirkung der Zellwände von M.roseus mit dem darin enthaltenen Peptidoglykan verbunden ist, wurde daraus ein Disaccharid-Pentapeptid durch enzymatisehen Abbau isoliert.

Beispiel 7

Isolierung eines Disaccharid-Pentapeptids aus dem Peptidoglykan der Zellwände von M.roseus.

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Man suspendiert 15O mg der Zellwände von M.roseus in 30 ml eines 0,05 m-Veronal-Puffers (pH 8,6) und versetzt die Suspension mit 20 ml eines S.a.Endopeptidase-Präparats aus Streptomyces albus G, das man nach der Methode von Ghuysen (J.M.Ghuysen, L.Dierickx, J.Coyette, M.Leyh-Bouille, M.Guinand und J.N.Campbell, Biochemistry, 8^, 213-222 (1969)) gewonnen hat und inkubiert das Material über Nacht bei 37⁰C in Gegenwart einiger Tropfen Toluol. Die inkubierte Mischung wird anschließend mit Ammoniumacetat auf eine Endammoniumacetatkonzentration von 0,2 m gebracht μηα der pH-Wert wird mit Essigsäure auf einen Wert von 6,2 eingestellt. Dann setzt man 3 mg Hühnereiwexßlysozym (Sigma) zu und inkubiert die Mischung während 24 Stunden bei 37⁰C. Anschließend gibt man 2% Pronase und Calciumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,01 m zu und beläßt die Lösung während 48 Stunden bei 37⁰C. Nach dem Einengen in einem Rotationsverdampfer auf 15 ml filtriert man das Lysat über eine mit

Cr)

Sephadex^w G25 gefüllte Säule (Höhe = 80 cm, Durchmesser =2,5 cm), die mit 0,1 m-Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Untersuchung der optischen Dichte des Abstroms bei 206 nm ermöglicht eine Auftrennung in vier Fraktionen. Die durchgeführten Analysen haben gezeigt, daß die zweite Fraktion aus Glucosamin, Muraminsäure, Alanin, Glutaminsäure, Lysin und Threonin in einem Molverhältnis von 1:1:2:1:1:1 besteht. Da die Morgan-Elson-Reaktion gezeigt hat, daß die Aminozucker in Form von Disacchariden vorhanden sind, ergibt sich die Formel der Verbindung aufgrund einer Herstellung wie folgt:

N-Acetylglucosaminyl-ß-1,4-N-Acetylmuramyl

L-AIa D-GIu-NH₉ L-Thr-t-L-Lys D-AIa

Dieses Disaccharid-Pentapeptid ist, wie es aus der Tabelle II hervorgeht, ein Produkt mit Adjuvans-Wirkung.

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Beispiel 8

Herstellung von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-meso-oi-odiaminopimelinsäure.

Man züchtet die Zellen des Bacillus cereus T in 2 1-Erlenmeyer-Kolben, die 800 ml des Nährmediums (Antibiotic Medium 3_f Difco) enthalten und die auf einem Rütteltisch (Biolafitte) befestigt sind. Nach zwei Dritteln der exponentiellen Wachstumsphase wird die Kultur mit 50 mg/ml D-Cycloserin (Roche) versetzt. Nach einer halben Stunde bei 37⁰C unter den gleichen Rührbedingungen zentrifugiert man die Kultur, deren optische Dichte nach der Zugabe von D-Cycloserin nicht mehr zunimmt. Die Zellenfeststoffe werden in der Kälte mit einer 4%igen Trichloressigsäure extrahiert. Hierzu verwendet man typischerweise 100 ml Trichloressigsäure auf 15g des Frischgewichts der Zellen. Dann homogenisiert man die Suspension der Zellen in Trichloressigsäure mit einer Potter-Mühle mit Teflon-Kolben, zentrifugiert eine Stunde bei 4⁰C bei 27 500 g, extrahiert die überstehende Flüssigkeit mehrfach mit Äther, um die Trichloressigsäure zu entfernen, neutralisiert mit Ammoniumhydroxid und engt dann in einem Rotationsverdampfer auf 10 ml ein. Das UDP-N-Acetylmuramyl-Tripeptid, dessen D-Cycloserin die Speicherung in der Zelle bewirkt (nach K.Izaki, M.Matsukashi und J.L.Strominger, J.Biol.Chem., 243, 3180-3192 (1968)) , befindet sich in diesem konzentrierten Extrakt, der über eine

(S)

mit Sephadex^v' G25 gefüllte Säule (Höhe = 80 cm, Durchmesser = 2,5 cm), die mit 0,02 m-Ammoniumacetatlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist, filtriert wird. Durch das Aufzeichnen der optischen Dichte des Abstroms bei 2 60 nm kann man diesen in vier Fraktionen aufteilen. Die dritte Fraktion enthält das gewünschte Produkt, das papierchromatographisch (auf Whatman 3MM-Papier) während 3 Tagen in einer Lösungsmittelmischung aus Äthanol und 1 m-AmmoniumacetatlÖsung (5/2, pH 7,5) gereinigt wird. Die Ultraviolettlicht am stärksten absorbierende Bande wird eluiert und dann während 20 Minuten bei 100°C in 0,02 n-Chlorwasserstoffsäurelösung hydrolysiert, um die Bindung zwischen dem Nukleotid und dem gewünschten Muramyl-Tripeptid zu spalten. Nach dem Gefriertrocknen wird das Hydrolysat 2 Stunden bei einem

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pH-Wert von 4 bei 40 V/cm auf Papier (Whatman 3MM) unter Testbenzin (White spirit) in einer Gilson-Vorrichtüng (Gilson Medical Electronics, Villiers-Le-Bel) elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Sichtbarmachen mit Ninhydrin-Collidin wird die Hauptbande eluiert, gefriergetrocknet und analysiert. Sie entspricht gut dem gewünschten Produkt. Ausgehend von 8 1 der mit D-Cycloserin vergifteten B.cereus-Kultur erhält man 1 mg dieses Produktes, das, wie die Tabelle II zeigt, Adjuvans-Wirkung besitzt.

Beispiel 9

Im folgenden wird die chemische Synthese der erfindungsgemäßen Adjuvanzien erläutert und insbesondere die der N-Acetyl-muraminsäure-Moleküle,an denen die Di-, Tri- bzw. Tetra-Peptidketten gebunden werden.

Im folgenden sei zunächst die Synthese der fraglichen Di-, Tri- und Tetra-Peptide vor deren Kupplung mit der N-Acetylmuraminsäure erläutert.

A) Synthese der Peptidketten

Im folgenden sind angegeben die Synthesen:

Des Hydrochlorids des Benzylesters von L-Alanyl-D-Isoglutamin:

L-Ala-D-Glu-O(-NH₂ , HCl,

des Hydrochlorids des Benzylesters von /7L-Alanyl-D-Isoglutaminyl7 -(L), Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(L), /Ö-Alanin/, (D)-Amid:

C L-AIa-D-GIu-CC-NH₂ J - (L)-, Z-(D)-m-DAP-(L) (O-Ala-OBzl),(D)-NH₂, HCl

des Hydrochlorids des Benzylesters von CL-Alanyl-D-IsoglutaminylJ7 -(L), Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(D)-amid:

Z""L-Ala-D-Glu-C(-NH₂J7 - (L), Z-(D)-m-DAP-(L)-/" (D)-NH₂, HCl.

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Die angegebenen Abkürzungen bedeuten:

Z = die Benzyloxycarbonyl-Gruppe, BOZ = die tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe, m-DAP = meso-tW—Diaminopimelinsäure, OSu = Succinimidester.

Die Schmelzpunkte sind in Kapillarröhrchen mit der Vorrichtung von Dr.Tottoli (Buchi, Flawil-Schweiz) bestimmt worden und nicht korrigiert. Die Bestimmungen der physikalischen Konstanten und die Elementaranalysen erfolgten an Proben, die im allgemeinen

_2 während 20 Stunden bei 78⁰C im Vakuum (10 mmHg) getrocknet

worden sind. Die Elementaranalysen wurden mit einer automatischen CHN-Mikroanalysenvorrichtung (Perkin-Elmer) durchgeführt. Die optischen Drehwerte wurden mit Hilfe eines elektronischen Polarimeters (Roussel-Jouan) bestimmt. Die Chromatographien erfolgten auf mit Kieselgel beschichteten Dünnschichtplatten (Merck) in einer Lösungsmittelmischung A, das'heißt einer n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser-Mischung (30/20/6/24 Volumen/Volumen) oder einer Lösungsmittelmischung B, das heißt einer Chloroform/Methanol/Ammoniak-Mischung (2/2/1 Volumen/Volumen) .

a) Diamid der BOC, Z-meso-Diaminopimelins'äure /TbOC, Z-m-DAP- (NH₉) ~J

Man setzt aus 6,12 g (7,80 mMol) des Dicyclohexylammoniumsalzes der BOC, Z-meso-Diaminopimelinsäure (das man nach den Methoden von P.Dezelee und E.Bricas (Biochem. 1970, 9_, 823) und P.Dezelee und E.Bricas ("Peptides 1969: Proceedings of the Tenth European Peptide Symposium"(E.Scoffone, Ed) Seiten 347 bis 355, North Holland, Amsterdam) hergestellt hat) mit einer 4 η-Chlorwasserstoffsäurelösung in Tetrahydrofuran die Säure frei. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit 25 ml Tetrahydrofuran aufgenommen und man versetzt die auf -1O°C abgekühlte Lösung mit 4,05 ml (15,6 mMol) Isobutylchlorcarbonat und 2,2 ml (15,6 mMol) Triäthylamin. Nach Ablauf von 10 Minuten leitet man

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während 30 Minuten bei Raumtemperatur einen trockenen Ammoniakstrom in die Lösung ein. Es bildet sich ein sehr voluminöser weißer Niederschlag, der nach dem Abdestillieren des Tetrahydrofurans mit einer Mischung aus Äthylacetat (60 ml) und Wasser (20 ml) aufgenommen wird. Die organische Lösung wird dann zweimal mit jeweils 20 ml einer 1 m-Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen. Anschließend trocknet man die Lösung über Magnesiumsulfat und engt sie zur Trockene ein. Der erhaltene feste Rückstand wird aus einer Äthylacetat/Hexan-Mischung umkristallisiert, wobei man 2,06 g (Ausbeute 63%) der Titelverbindung erhält. Schmelzpunkt: 169°C bis 172°C.

Analyse: ^C2o^H3O°6^N4 ^{= 422}'⁴⁹

C % H % N %

ber. :	56	,9	7	,2	13	,3
gef. :	56	,8	7	,5	13	,5

b) Hydrochlorid des Diamins der Z-meso-Diaminopimelinsäure C Z-m-DAP-(NH₂)₂, HClJ

Man löst 1,86 g (4,4 Mol) des Diamids der BOC, Z-meso-Diaminopimelinsäure in 14 ml einer 1 n-Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigsäure. Nach 30 Minuten bei 25⁰C engt man die Lösung zur Trockene ein und trocknet den Rückstand in Gegenwart von Natriumhydroxid in einem Exsikkator. Das Produkt wird schließlich aus einer Methanol/Äther-Mischung kristallisiert. Man erhält 1,5 g der Titelverbindung (Ausbeute 90,5%). Schmelzpunkt: 138°C bis 140°C. Rf (A) = 0,7.

c) Hydrochlorid des Z-(D)-meso-Diaminopimelinsäure-(D) monoamids /~Z-(D)-m-DAP-(D)-NH₂, HClJ

Dieses Produkt erhält man nach der von Dezelee und Bricas angegebenen Methode (Lefrancier und E.Bricas, Bull.Soc.Chim.Biol.,

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- 2C -

1967, 49, 1257) zur Herstellung des BOC-(D)-meso-Diaminopimelinsäure-(D)-monobutyloxycarbonylhydrazids /BOC-(D) m-DAP-(D)-NH-NH-BOCJ.

Man stellt den pH-Wert einer Lösung von 1,144 g (3,2 mMol) des Hydrochloride des Diamids der Z-meso-Diaminopimelinsäure in 100 ml destilliertem Wasser bei 37⁰C mit einer 1 n-Kaliumhydroxidlösung auf einen Wert von 8,6 ein. Dann gibt man

3 ml einer zuvor aktivierten Leucin-Aminopeptidase-Lösung zu (das heißt eine 90 Minuten auf 37⁰C gehaltene Mischung aus 0,8 ml einer Lösung von Leucinaminopeptidase, die 2 mg Protein pro ml enthält, 0,7 ml destilliertem Wasser, 1,5 ml eines 0,5 m-Tris-Puffers (pH 8,5) und 3 ml einer 0,025 m-Magnesiumsulfatlösung). Man hält den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer 0,1 n-H^SO^-Lösung mit Hilfe einer Vorrichtung zur Konstanthaltung des pH-Wertes auf einem Wert von 8,6. Nach etwa einer Nacht wird eine geringe Menge eines Niederschlags abfiltriert, das Filtrat mit einer 2 n-Chlorwasserstoffsäurelösung angesäuert und auf ein geringes Volumen eingeengt. Der erhaltene Niederschlag wird nach dem Aufbewahren über Nacht bei O⁰C abfiltriert (400 mg, Ausbeute 70%). Das Filtrat wird auf

4 ml eingeengt und über eine SE-Sephadex ^ (NH. ) gefüllte Kolonne (2 χ 20 cm) geführt, die zuvor mit einer 1 m-Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Hydrochlorid des Z-(D)-meso-Diaminopimelinsäure-(D)-monoamids wird mit einer 0,1 m-Ammoniumacetatlösung in 1m-Essigsäurelösung eluiert. Durch Gefriertrocknen erhält man 100 mg des Produktes. Die beiden Chargen werden aus einer Äthanol/Äther-Mischung umkristallisiert. Man erhält 480 mg des Produktes (Ausbeute 84%). Schmelzpunkt: 245°C bis 25O°C.

²⁵ = 5° (c = 0,5 HCl N). Rf (A) = 0,65.

d) Succinimidester von BOC-L-Alanyl-D-Isoglutamin /BOC-L-Ala-D-Glu(OSu)-N

Zu einer Lösung von 4,05 g (10 mMol) BOC-L-Alanyl-D-Isoglutamin (2) in 30 ml Dimethylformamid gibt man 1,15 g (10 mMol)

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N-Hydroxysuccinimid und 2,26 g (11 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur filtriert man den Dicyclohexylharnstoff ab und engt das Filtrat zur Trockene ein. Das Produkt wird aus einer Isopropylalkohol/Diisopropyläther-Mischung umkristallisiert, wobei man 4 g des Produktes (Ausbeute 100% ) erhält. Schmelzpunkt: 69⁰C bis 70°C (unter Zersetzung).

²⁵ = 12,2° ( c = 1 Dioxan) .

Es scheint, als ob sich dieses Produkt ziemlich schnell zersetzt. Es wird daher entweder in Gegenwart von PpO₁- im Exsikkator aufbewahrt oder unmittelbar vor seiner Verwendung hergestellt.

e) Hydrochlorid des Benzylesters von L-Alanyl-D-Isoglutamin

Man löst 1 g (2,5 mMol) des Benzylesters von BOC-L-Alanyl-D-Isoglutamin (2) in 30 ml einer 1n-Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigsäure. Nach 30 Minuten engt man die Lösung zur Trockene ein, nimmt den Rückstand in einer minimalen Menge Methanol auf und fällt das Produkt mit Äther aus. Man erhält 800 mg des Produktes (Ausbeute 94%). Schmelzpunkt: 153°C bis 157⁰C.

/~d(7_d ²⁵ = +8,1° (c = 1 Methanol). Analyse: C₁₅H₂₂O₄N₃Cl = 342,87

C % H % N %

ber. :	52	,5	6	,5	12	,3
gef. :	52	,5	6	,4	12	,2

f) /TBOC-L-Alanyl-D-IsoglutaminylJ-(L), Z-(D)-meso-DAP-(D)-NH₂

Man löst 1,18 g (3,3 mMol) des Hydrochlorids des Z-(D)-meso-Diaminopimelinsäure-monoamids in 5 ml destilliertem Wasser. Dann gibt man bei 0°C 0,72 ml (6,6 mMol) N-Methylmorpholin und dann eine Lösung von 1,2 g (3 mMol) des Succinimidesters von BOC-L-Alanyl-D-Isoglutamin in 15 ml Dimethylformamid zu. Der zu Beginn

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der Reaktion beobachtete Niederschlag löst sich nach 2 Stunden. Nach 48 Stunden wird die Reaktionsmxschung zur Trockene eingeengt und mit 50 ml n-Butylalkohol, den man zuvor mit einer 1m-Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebracht hat, und 20 ml einer 1m-Essigsäurelösung, die man zuvor mit n-Butylalkohol ins Gleichgewicht gebracht hat, aufgenommen. Die n-Butanol-Phase wird fünfmal mit kleinen Mengen der Essigsäurelösung extrahiert. Die vereinigten wässrigen Phasen werden dreimal mit 10 ml n-Butylalkohol gewaschen. Die organischen Phasen werden schließlich vereinigt und fast zur Trockene eingedampft. Durch Zugabe von Äther erhält man 1,8 g eines Niederschlags, den man in absolutem Äthanol aufnimmt. Das unlösliche Material wird abfiltriert und das Filtrat auf ein minimales Volumen eingeengt. Durch Ausfällen mit Äther erhält man 1,6 g der Titelverbindung (Ausbeute 80%), die einen Erweichungspunkt von 10⁰C bis 110⁰C und einen Schmelzpunkt von 115°C aufweist.

/DtJ₀ ²⁵ = -5° ( c = 1 Methanol)

Analyse: C_OQH „0_1rN,- = 623,09
Zo 42 ι υ ο

% C % H % N

ber.i 54,0 6,8 13,5

gef.: 54,1 6,7 13,5

g) /~"BOC-L-Ala-D-Glu-c(-NH₂ J7 ~ (L), Z-(D)-meso-DAP-(L)-D-AIa-OBzI, (D) NH₂

Man löst 570 mg (0,92 mMol) /BOC-AIa-D-GIu-^-NH₂IZ-(L), Z-(D)-meso-DAP-(D)-NH₂ in 30 ml Tetrahydrofuran. Bei -15⁰C gibt man 0,26 ml (1 mMol) Isobutylchlorcarbonat und 0,11 ml (1 mMol) N-Methylmorpholin zu. Nach 10 Minuten setzt man eine Lösung von 352 mg (1 mMol) D-Alanin-benzylester-p-toluolsulfonat in 10 ml Tetrahydrofuran und 0,11 ml (1 mMol) N-Methylmorpholin zu. Man erhält nach Ablauf einer Stunde bei Raumtemperatur einen solvatisierten Niederschlag. Die Reaktion wird während weiterer 24 Stunden fortgesetzt. Nach dem Einengen zur Trockene nimmt man

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den Rückstand mit 25 ml Äthylacetat und 10 ml destilliertem Wasser auf. Die organische Phase wird nacheinander mit einer iO%igen Zitronensäurelösung, mit destilliertem Wasser, mit einer Im-Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit destilliertem Wasser bis zu einem neutralen pH-Wert gewaschen. Die Äthylacetat-Phase wird eingeengt und der erhaltene Rückstand in einem Exsikkator in Gegenwart von P9O5 getrocknet. Das Produkt wird in einer Äthylacetat/Petroläther-Mischung kristallisiert. Man erhält 400 mg der Titelverbindung (Ausbeute 55%). Erweichungspunkt: 180°C, Schmelzpunkt: 215°C (der optische Drehwert einer methanolischen Lösung ( c = 1) kann wegen eines zu geringen Wertes außer Betracht bleiben).

Analyse: ^C ₃8^H53°11^N7 ^{= 783}/⁸⁹

% C % H % N

ber. :	58	,2	6	,8	12	,5
gef. :	58	,0	6	,7	12	,55

h) Hydrochlorid von /7L-AIa-D-GIu-CC-NH₂ J (L), Z-(D)-meso-DAP-(L) ZI L-AIa-OBz 1_7 , (D)-NH₃

Man löst 850 mg (1,1 mMol) BOC-L-AIa-D-GIu-I^-NH₂ (L), Z-(D)-DAP-(L)-L-AIa-OBzI, (D)-NH₂ in 5 ml einer In-Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigsäure. Nach 30-minütiger Umsetzung bei 25⁰C engt man die Lösung zur Trockene ein und kristallisiert den Rückstand aus einer Methanol/Äther-Mischung aus. Man erhält die Titelverbindung in einer Menge von 750 mg (Ausbeute 95%). Schmelzpunkt: 90°C bis 1OO°C (wenig deutlich).

_D ²⁵ = +3,5° ( c = 0,5 Methanol). Analyse: C₃₃H₄₆O₉N₇Cl, HCl 0,25 H₃O

% C % H % N

ber. :	52,	2	6,	3	12	,9
gef. :	52,	26	6,	14	12	,69

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Die Analyse der Aminosäuren von 0,5 mg des vollständig hydrolysieren Derivats (wobei die Hydrolyse in Gegenwart von 6n-Chlorwasserstoffsäurelösung während 24 Stunden bei 110⁰C in einem vakuumdichten Röhrchen erfolgt) ergibt folgendes Verhältnis: AIa 1,9 ; GIu 1; DAP 1.

i) Hydrochlorid des Benzylesters des Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(D)-monoamids.

Z-(D)-m-DAP-(L)-OBzl, (D)-NH₂, HCl

Das hierfür eingesetzte Di-Z-meso-diaminopimelyl-(D)-monoamid erhält man nach der von J-van Heijenhoort, E.Bricas und C.Nicot (Bull.Soc.Chim. 1969, 8, 2743) beschriebenen Methode.

Man bringt 4,57 g (10 mMol) dieses Derivats in 50 ml wasserfreiem Äther in Suspension. Dann gibt man im Verlaufe von 30 Minuten bei 0°C unter Rühren 10 mMol feinpulverisiertes Phosphorpentachlorid zu. Nach der vollständigen Lösung des Phosphorpentachlorids filtriert man die Reaktionsmischung und engt das Filtrat im Vakuum bei 40°C ein. Nach der Zugabe frischen Lösungsmittels wiederholt man das Einengen mehrfach. Der Rückstand wird dann in 10 ml Benzylalkohol aufgenommen und die Lösung bei 0°C in einen Kolben gegossen, in dem sich 50 ml zuvor mit Chlorwasserstoff gesättigten Äthers befinden. Unter Rühren der Lösung läßt man die Temperatur auf 25⁰C ansteigen. Unter Kohlendioxidentwicklung bildet sich ein Niederschlag. Man läßt über Nacht stehen, filtriert den Niederschlag ab und wäscht ihn mit Äther. Man erhält in dieser Weise die angegebene Titelverbindung.

j) C BOC-L-AIa-D-GIu-CC-NH₂ J - (L), Z-(D)-m-DAP-(L)-OBzI, -(D)-NH₂

Man löst 500 mg (2 mMol) Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(D)-monoamidbenzylester-hydrochlorid in 10 ml Dimethylformamid, Dann gibt man bei O⁰C 0,22 ml (2 mMol) N-Methylmorpholin und schließlich

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eine Lösung von 800 mg (2 mMol) BOC-L-Alanyl-D-Isoglutaminsuccinimidester in 10 ml Dimethylformamid zu.

Nach 48 Stunden engt man die Reaktionsmischung zur Trockene ein und nimmt sie mit 50 ml zuvor mit einer 1m-Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebrachtem N-Butylalkohol und 20 ml einer zuvor mit n-Butylalkohol ins Gleichgewicht gebrachten 1m-Essigsäurelösung auf. Die n-Butanol-Phase wird fünfmal mit kleinen Mengen der Essigsäurelösung extrahiert. Die vereinigten wässrigen Phasen werden dreimal mit 10 ml Butylalkohol gewaschen. Die organischen Phasen werden schließlich vereinigt und zur Trockene eingeengt. Durch Ausfällen mit Äther erhält man die angegebene Titelverbindung (j).

k) Hydrochlorid von /TL-AIa-D-GIu-^-NH₂ I/ (L), Z-(D)-meso-DAP-(L)-OBzI, (D)-NH₂

Man löst 712 mg (1 mMol) BOC-L-AIa-D-GIu-^-NH₂(L),Z-(D)-m-DAP-(L) OBzI, (D)-NH in 5 ml einer Lösung von Chlorwasserstoff in Essigsäure. Nach 30-minütiger Reaktion bei 25⁰C wird die Lösung zur Trockene eingeengt, der Rückstand mit Methanol aufgenommen und mit Äther ausgefällt. Man erhält 600 mg der Titelverbindung (98%).

Die Analyse der Aminosäuren eines durch vollständiges saures Hydrolysieren von 0,5 g des Derivats erhaltenen Hydrolysats (wobei die Hydrolyse mit 6n-Chlorwasserstoffsäurelösung während 24 Stunden bei 110⁹C in einem vakuumdicht verschlossenen Röhrchen erfolgt) ergibt folgende Zusammensetzung: AIa 0,95, GIu 1, DAP 0,90.

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B) Vollsynthese des Glycopeptide 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-0-D-glucopyranosyl) -D-propionyl-L-Ala- (|'-0Η) -D-c^-Glu-NH«

Die durchgeführten Reaktionen werden durch das folgende Reaktionsschema I verdeutlicht. In diesem Schema steht die Abkürzung "Ph" für die Phenyl-Gruppe und die Abkürzung "Ac" für die Acetyl-Gruppe.

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υ cn.

Ph·- CH'

- 33 - Schema I

₀ OCH₂Ph 2450355

(A)

2 ·

OH

NH Ac

.OCH₂

Ph-C-H

O_xOCH₂₁

CH₃-C-QOOH

NHAc

H.

Ph-CH

HAc

HCl, L-Ala-D-Glu--NHp

CIL₄-C-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COnH

COOCH₂Ph (ID

CH₂OPh

— Q

IK

VPCH₉Ph

NHAc

-C-CO-NH-CHCOMH-CHCONH.

CH₃ (CH₂)₂

COOCH₂Ph

(III)

(IV)

CH₂OH

J .0

H, Oil

Nil Ac

— C-COHN-CHCüHH-CH-COMH.

CH,, (CU₂) ₂

COOH

(V)

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a) Herstellung von Benzyl-2-acetamido-4,6-0~benzyliden-2-desoxy-ß-D-glucopyranosid (Verbindung A des Schemas I)

Man erhält diese Verbindung ausgehend von Benzyl-2-acetamido-3,4,ö-tri-O-acetyl^-desoxy-ß-D-glucopyranosid durch Desacetylieren mit Natriummethanolat und Einführen der 4,6-O-Benzyliden-Schutzgruppe nach der Methode von P.H.Gross und R.W.Jeanloz
(J.Org.Chem. 32 (1967), 2759).

b) Herstellung von Benzyl-2-acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0-(D-1-carboxyäthyl)-2-desoxy-ß-D-glucopyranosid (Verbindung I des Schemas I)

Man löst 4 g Benzyl-2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-desoxy-ß-D-glucopyranosid (A) bei 9O°C in 450 ml wasserfreiem und von
Peroxiden befreitem Dioxan. Nach der Zugabe einer 50%igen Suspension von Natriumhydrid in öl (wobei man 2,80 g der Suspension verwendet),rührt man die Mischung während 2 Stunden bei 9O°C.
Dann gibt man 1,840 g L-^-Chlorpropionsäure zu. 3 Stunden nach der Zugabe der Säure versetzt man ein zweites Mal mit Natriumhydrid (2,80 g der Suspension). Die Mischung wird anschließend unter mechanischem Rühren über Nacht bei 65⁰C bis 67⁰C stehengelassen. Nach dem Abkühlen in einem Eisbad zerstört man das
überschüssige Natriumhydrid vorsichtig durch Zugabe von Wasser (110 ml). Die Mischung trennt sich in zwei Phasen auf. Die untere Phase wird verworfen, während die obere Phase abgetrennt, filtriert und im Vakuum eingedampft wird. Der Rückstand wird mit
250 ml Wasser verdünnt, wonach man die erhaltene wässrige Lösung mit Chloroform wäscht. Diese wässrige Lösung wird anschließend auf O⁰C abgekühlt und bis zu einem pH-Wert von 3 mit 2,5m-Chlorwasserstoffsäurelösung versetzt. Die ausgefällte Verbindung
(der Formel I) wird sofort abgesaugt und gut mit kaltem Wasser gewaschen. Nach der Kristallisation aus Methanol erhält man die Verbindung (I) in reinem Zustand (3,64 g, 76% Ausbeute).
Schmelzpunkt: 264°C bis 265°C

/O(7_D ²⁰ = -52° (c = 0,41, Äthanol)

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^ = ^{3 32}O (NH) , 3 080 (Ph) , 1 760 (COOH) ,

max ι

1 660 (Amid I), 1 565 (Amid II), 740 und 695 cm"¹ (Ph).

c) Herstellung des Glycopeptids: 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-0-D-glucopyranosyl) -D-propionyl-L-Ala- (^p-OH) -D-(K-GIuNH₂ (Verbindung der Formel V des Schemas I).

Das allgemeine Prinzip der Herstellung ist das folgende: Man kondensiert Benzyl-2-acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-(D-1-carboxyäthyl)-2-desoxy-ß-D-glucopyranosid (I) nach Woodward et al. (Tetrahedron, Suppl. 8 (1966) 321) mit L-AIa- (^"-0-Benzyl) -D-GluNH^hydrochlorid. Als Lösungsmittel verwendet man eine Mischung aus N,N-Dimethylformamid und Acetonitril (1/2 Volumen/Volumen). In dieser Weise erhält man 2-(Benzyl-2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-desoxy-3-0-ß-D-glucopyranosyl) -D-propionyl-L-Ala- ( p-0-benzyl) -D-tC-Glu NH„ (III) in kristallinem Zustand mit einer Ausbeute von mehr als 80%. Das Woodward-Reagens K (N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat). ist ausgewählt worden, da es praktisch nicht zu einer Racemisierung führt und mit Amiden vom Glutamin-Typ sehr gute Ergebnisse erzielen läßt, und dies auch in N-N-Dimethylformamid. Der einzige Nachteil dieses zuletzt erwähnten Lösungsmittels besteht darin, daß es zu einer geringeren Ausbeute führt, was hier nicht der Fall ist, da eine Acetonitril/NfN-dimethylformamid-Mischung verwendet wird. Durch Behandeln des geschützten Glycopeptids (III) mit 60%iger Essigsäure erhält man . 2-(Benzyl-2-acetamido-2-desoxy-3-0-ß-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-^-O-benzyl)-D-K-Glu NH₂ (iV) in kristallinem Zustand mit einer Ausbeute von etwa 70%. Das gewünschte Glycopeptid (V) erhält man durch katalytisches Hydrieren der Verbindung der Formel IV in Eisessig in Gegenwart von Palladium-auf-Kohlenstoff. Die Verbindung konnte nicht in kristallinem Zustand erhalten werden und die sehr starke Hygroskopizität dieses Produktes erlaubte keine zufriedenstellende Elementaranalyse. Das Material ist jedoch dünnschichtchromatographxsch (Kieselgel,

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- 3G -

Propanol/Wasser-Mischung, 3/3 Volumen/Volumen) sowie papierchromatographisch (n-Butanol/Essigsäure/Wasser, 5/1/2 Volumen/Volumen/Volumen) homogen.

Die Synthese wird unter Anwendung der im folgenden angegebenen experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Allgemeine Bedingungen:

Die Schmelzpunkte wurden in Kapillarröhrchen mit Hilfe einer Büchi-Vorrichtung bestimmt und sind nicht korrigiert. Die Drehwerte sind mit Hilfe eines Polarimeters (Perkin-Elmer, Modell 141) bestimmt worden. Die Infrarotspektren wurden mit einem Spektrophotometer (Jouan Jasco IRA-1) aufgenommen. Die Homogenität der hergestellten Verbindungen wurden chromatographisch auf Glasplatten, die mit Kieselgel (Merck HF 254, mit einer Dicke von 0,25 mm) beschichtet sind, untersucht, wobei die Chromatogramme durch Verdampfen einer 50%igen Lösung von konzentrierter Schwefelsäure in Alkohol und Erhitzen mit Hilfe einer Heizeinrichtung (Epiradiateur) entwickelt wurden. Die Säulenchromatographien erfolgten auf Kieselgel (Merck 0,063 - 0,200 mm), Die Papierchromatogramme erfolgten nach der absteigenden Technik und werden auf Whatmann-Papier Nr. 1 durchgeführt. Die Elementaranalysen erfolgten durch den "Service Central de Micro-Analyse du Centre National de la Recherche Scientifique (Thiais).

2-(Benzyl-2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-desoxy-3-0-ß-D-glucopyranosyl) -D-propionyl-L-Ala- (jp-O-benzyl) -D-Sk-Glu NH₂ (III).

Man gießt eine Lösung von 157 mg Benzyl-2-acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0-(D-1-carboxyäthyl)-2-desoxy-ß-D-glucopyranosid (I) (0,33 mMol) in 5 ml einer Acetonitril/N^-Dimethylformamid-Mischung (2/1 Volumen/Volumen), die ein Äquivalent (0,33 mMol) Triäthylamin enthält, in eine bei 0⁰C gehaltene Suspension von 84,3 mg N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (Aldrich, Reagens K nach Woodward) in 5 ml Acetonitril. Die Mischung wird

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bei O⁰C gerührt, bis man eine klare Lösung erhält (wozu etwa eine Stunde und 30 Minuten erforderlich sind). Dann gibt man eine Lösung von 114,4 mg (0,33 mMol) L-AIa-(^O-Benzyl)-D-OC-GIu NHp-hydrochlorid (II) in 5 ml einer Acetonitril/NfN-Dimethylformamid-Mischung (2/1 Volumen/Volumen), die ein Äquivalent (0,33 mMol) Triäthylamin enthält, zu. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur über Nacht verdampft man die Lösungsmittel im Vakuum und extrahiert den erhaltenen festen Rückstand gut mit heißem Wasser, um die Nebenprodukte zu entfernen. Der Feststoff wird abgesaugt, getrocknet und aus Äthanol kristallisiert und man erhält 208 mg (82%) der Verbindung der Formel III (Schema I). Schmelzpunkt: 243°C bis 245°C.

/*7_D = -20° (c = 0,5, N ,N-Dimethylformamid)

IR-Spektrum: \/ ^NuJ^o1 3 440, 3 ₃₂o (NH), 3 080, 3 060 (Ph),

1 740 (Ester), 1 645 (Amid I), 1 540 (Amid II),

740 und 690 cm"¹ (Ph).

Analyse: C₄	%	8^N4°-	11	6	% H	7	%N
	63	C		6	,36	7	,36
ber. :	62	,15		,22		,49
gef. :	,96

2-(Benzyl-2-acetamido-2-desoxy-3-0-ß-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(p-O-benzyl)-D-c^-Glu NH₂ (IV).

Man bringt 200 mg der Verbindung III in 15 ml 60%iger Essigsäure in Suspension und erhitzt während einer Stunde auf 1OO°C. Nach dem Abkühlen der Lösung verdampft man die Essigsäure im Vakuum, wobei man die letzten Spuren der Säure durch Zugabe von Wasser und durch Eindampfen beseitigt, während man die Wasserspuren durch gleichzeitige Destillation von Toluol entfernt. Der erhaltene Rückstand wird über eine mit 15g Kieselgel beschickte Säule chromatographiert (wobei man mit

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einer Chloroform/Methanol-Mischung 85/15 Volumen/Volumen eluiert). Die reinen Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei man einen Rückstand erhält, der aus chromatographisch reiner Verbindung der Formel IV (siehe Schema I) besteht (129 mg, 73%). Man kristallisiert dieses Produkt aus einer Tetrahydrofuran/Petroläther-Mischung um. Man erhält 115 mg (Ausbeute 65%) der Verbindung IV, Schmelzpunkt 217⁰C bis 219°C.

foLJ_O ²⁰ = -1° (c = 0,45, N,N-Dimethylformamid) IR-Spektrum: ψ ^NuD^o1 3 _45O/ 3230 (OH,NH), 1 740 (Ester),

1 645 (Amid I, breite Bande), 1 545 (Amid II), 720 und 690 cm"¹ (Ph).

Analyse: C₃₃H₄₄N₄O_n

ber. :	58	,92	6	,59	8	,32
gef. :	58	,78	6	,50	8	,25

2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-0-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-AIa-(^-OH)-D-K-GIu NH₃ (V)

Man hydriert 69 mg der Verbindung IV katalytisch in 10 ml Eisessig in Gegenwart von 25 ml Palladium-auf-Kohlenstoff. Nach Ablauf von 3 Stunden saugt man den Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum ein. Man erhält in dieser Weise die Verbindung der Formel V in Form eines stark hygroskopischen glasigen Materials, das nicht kristallisiert werden kann,

Diese Verbindung ist dünnschichtchromatographisch (Kieselgel, n-Propanol/Wasser 7/3 Volumen/Volumen) sowie papierchromatographisch (n-Butanol/Essigsäure/Wasser, 5/1/2 Volumen/Volumen/ Volumen) rein: R_f = 0,30. Die Entwicklung der Chromatogramme erfolgt mit Hilfe des Sharon-Reagens (J.Biol.Chem.239 (1964)

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PC 2398) und mit Hilfe von Silbernitrat nach der Methode von Trevelyan et al. (Nature, 166 (1950) 444). Dies bestätigt die Hydrogenolyse der Glycosid-Funktion.

Eine mit einer sehr geringen Menge durchgeführte Untersuchung zeigt die vollständige und augenblickliche Reaktion mit einer Lösung von Diazomethan in Äther, was auf die Anwesenheit einer freien Carbonsäure schließen läßt.

Nach der Hydrolyse erhält man als einzige ,in der Aminosäure-Analysevorrichtung nachweisbare Bestandteile Alanin, Glutaminsäure und Muraminsäure.

Die schließlich erhaltene Verbindung (MUr-N-Ac-AIa-GIuNH₂) wird dann auf ihre Adjuvans-Wirkung untersucht.

Unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise kann man ausgehend von der Verbindung der Formel I N-Acetyl-muraminsäure-Dipeptid- und -Tripeptid-Derivate herstellen, in denen man anstelle des Hydrochlorids des Benzylesters von L-Alanyl-D-Isoglutamin (Verbindung der Formel II des Schemas I, die weiter oben auch als Verbindung e bezeichnet worden ist) das Hydrochlorid des Benzylesters von /L-Alanyl-D-Isoglutaminyl_7-(L), Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(D)-amid (Verbindung k) bzw. das Hydrochlorid des Benzylesters von £ L-Alanyl-D-Isoglutaminyly-(L), Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(L). /~D-Alanin_7, (D)-Amid (Verbindung h) einsetzt.

Pharmakologische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mittel.

Die erfindungsgemäßen Mittel besitzen eine starke Adjuvans-Wirkung und sind frei von ernsten Nebenwirkungen, die die therapeutische Anwendung der Mycobakterien und des Freundschen Adjuvans beschränken. Diese äußerst vorteilhaften Eigenheiten ergeben sich durch die folgenden pharmakologischen Untersuchungen.

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- 10 -

Die "Substanz BB" steht für die Substanz, die in der Hauptbande bei der Elution gemäß Beispiel 1 über DEAE-Cellulose enthalten ist.

Die Substanzen F , F₁₁ und F entsprechen den Fraktionen, die in den Banden F₁, F und F des Beispiels 1 enthalten sind.

Bei der Substanz G handelt es sich um die gemäß Beispiel 2 hergestellte.

Die Substanzen H , H und H sind aus den Banden H- , H„ und tu erhalten worden.

I) Demonstration der Adjuvans-Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mittel.

Man verabreicht weiblichen Meerschweinchen (Hartley) mit einem Gewicht von 300 bis 350 g in die Sohle jeder der beiden Hinterpfoten eine Emulsion, die aus gleichen Teilen des nicht kompletten Freundschen Adjuvans und einer Ovalbumin enthaltenden physiologischen Lösung besteht (5 mg pro Meerschweinchen) und das zu untersuchende Präparat. Man verwendet das nicht komplette (das heißt keine Mycobakterien enthaltende) Freundsche Adjuvans (AIF) und das komplette Freundsche Adjuvans (ACF), die von der Firma DIFCO in den Handel gebracht werden, als Vergleichssubstanzen.

Der Gehalt der Antiovalbumin-Antikörper wird 3 Wochen nach der Injektion bestimmt. Der Gehalt der Antikörper ist in μg des Antigen-Antikörper-Niederschlags am Äquivalenzpunkt pro ml Serum angegeben.

Das Granulom (das in der folgenden Tabelle I mit dem Zeichen + angegeben ist) wird 3 Wochen nach der Injektion beobachtet.

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Die verzögerte Hypersensibilität gegenüber Ovalbumin wird 4 Wochen nach der Injektion an der Hautreaktion bestimmt. Sie wird als Durchmesser des Erythems (E) in mm, die Induratio (I) oder die Nekrose (N) 48 Stunden nach der subkutanen Injektion von 10 μ§ oder 100 μg Ovalbumin angegeben.

Die in den folgenden Tabelle I und II angegebenen Ergebnisse verdeutlichen die bemerkenswerte Adjuvans-Aktivität der erfindungsgemäßen Präparate.

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Tabelle I

Adjuvans-Aktivitäten von Mycobakterien-Präparaten Antikörper/Antiovalbuitiin-Gehalte (mg/ml)

	Bakterienpräparat	( (	Dosis ^g pro Tier)	1.	Tiere 2. 3.	140	4.	Mittel wert
cn	0 (AIF)		O	200	320	2240	130	197
O (Λ		( (	50	3200	1600	5600 2480	4000	2760
OO N>	M.Butyricum (ACF)		10 2	5800 4000	4400 2400	5600	4800 2000	5150 2722
ro	Substanz BB		10	5800	4400	7120 3600	4800	5150
086	Substanz F₁		10 2	3600 2880	4800 2720	3200	5500 2800	5255 3000
O	Substanz F₁₁		10	3840	3600	4400	2800	3360
	Substanz F_TTJ		10	3600	5200	800	4800	4580
	Substanz G		25	1600	1360	2480	1200	1240
	Substanz H_T		25	1040	2000	4240	2080	1900
	Substanz H	50	5600	4960		4565	4840
	Substanz H₁₁	25			2800
	Substanz I	25	5200	4000	3600	3850
Substanz J

Anwesenheit eines
Granuloms an der
Inj ektionsstelle

Hautreaktion gegen
Ovalbumin (Mittelwert von 3 Tieren)
μς 100 μg

1 4 1
I 5=18 (N:E)

I 6=19 (N:E)

I 7=18 (N:E)

CD CO cn cn

Tabelle II

Dosis/Tier

co oo ro ro

CD CT) O

unvollständiges Freund'sches Adjuvans

komplettes Adjuvans

Zellwände von M.roseus

Disaccharid-pentapeptid von M.roseus

N-Acetylmuraiityl-Ir-Ala-D-Glu-meso-DAP

N-Acetylmuramyl-L-AIa-D-GIu-NH₂

25

25 μg

Antikörper/Antiovalbumin-Gehalt

(pg/rnl) Nurrrrer der Tiere

12 3 4

600 660 440

M.Butyricum 4800 6160 3200 4480 5040 50. μg

3200 2400 2000 2440 3200

2480 3360 3620 4640 7360

4880 2560 5440 1920 3840

5280 6000 2960 6880 4960

Mittel wert	verzögerte bilität pro injiziertes	Hypersensi- Ovalbumin
	10	100
600	10 E*	51*
4736	10 E	13 E 7 N*
2648	8 I	15 E 4 N
4292	7 E	14 E 7 N
3728	7 E	13 E 5 N
5210	9 E	17 E 5 N

* I = Induratio, E = Erythem, N = Nekrose

CD CaJ

Die in der obigen Tabelle II angegebenen pharmakologischen Untersuchungen zeigen:

a) daß die Abwesenheit des N-Acetyl-glucosamin-Restes in dem Zuckerrest (osidischen Rest) der fraglichen Peptidoglykan-Fragmente der Adjuvans-Aktivität dieser Fragmente nicht schadet und

b) daß die Anwesenheit einer me so-DAP-Gruppe, in der an den Zuckerrest der N-Acyl-muraminsäure, ob diese nun als solche vorliegt oder Teil eines längeren Glykans bildet, gebundene Peptid-Gruppe nicht wichtig ist für die Aufrechterhaltung der Adjuvans-Aktivität der fraglichen Peptidoglykan-Fragmente,

II. Nachweis der Unschädlichkeit der erfindungsgemäßen Mittel.

Die folgenden Untersuchungen zeigen, daß die erfindungsgemäßen Adjuvanzien keine Toxizität besitzen. Die Untersuchungen wurden an der Substanz BB durchgeführt. Die Erkenntnisse, die man hinsichtlich der Unschädlichkeit der Substanz BB gewinnen kann, erstrecken sich natürlich auch auf die Substanzen F , F und F , die lediglich Bestandteile dieser Substanz darstellen.

1. Hyperreaktivität gegenüber einem Endotoxin Man sensibilisiert Mäuse 14 Tage vor der Untersuchung durch intravenöse Injektionen von einerseits 300 μg mit Phenol abgetötetem BCG-Impfstoff (Bacillus Calmette-Guerin) und andererseits 300 μg_{ der Substanz BB. Am Tag der Untersuchung injiziert man das aus Salmonella enteritidis (Stamm Danysz) extrahierte Endotoxin in unterschiedlichen Dosierungen auf intravenösem Wege. Die DL₅ dieses Präparats, das in Form einer Suspension in isotonischer Lösung an normale Vergleichstiere verabreicht wird, beträgt 240 μg.

ι
Aus der folgenden Tabelle III ist zu ersehen, daß sämtliche mit 1,5 μg des Endotoxins behandelten und mit BCG geimpften Mäuse verendet sind, während von den mit dem erfindungsgemäßen Mittel behandelten Mäusen lediglich zwei von acht Tieren (obwohl das

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Endotoxin in einer Dosis von 50 μg injiziert worden ist) verenden.

	Tabelle III	Verendete Tiere	der Tiere	48	Stunden
Hyperreaktxvitat		Gesamtanzahl	im Verlaufe von		8/8
	gegenüber einem Endotoxin		24 Stunden		8/8
	Endotoxin		7/8		8/8
	^g/Maus)		8/8		2/8
		8/8
BCG (300 μg i.v.)		1/8
	1,5
	5
Substanz BB (300 μg i.v.)	15
50

2. Abwesenheit einer Leber- und Milz-Hyperplasie

Es ist gut bekannt, daß,wenn man Mycobakterien intravenös injiziert, diese eine Leber- und Milz-Hypertrophie verursachen. Sämtliche Injektionen erfolgen in Mengen von 0,2 ml intravenös, wonach die Tiere 14 Tage später getötet werden. Wie aus der folgenden Tabelle IV hervorgeht, wird durch 300 μg des BCG-Impfstoffes, der in Form einer Suspension in isotonischer Lösung verabreicht wird, eine erhebliche Milzvergrößerung herbeigeführt. Demgegenüber ergibt sich nach einer Injektion von 300 μg der Substanz BB kein derartiges Phänomen.

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- 46 Tabelle IV

Abwesenheit der Hypertrophie der Leber oder der Milz nach der Verabreichung der Substanz BB

Anzahl der Mäuse Gewicht (mg)

Milz Leber

Vergleichstiere

(isotonische Lösung) -10 143 1625

BCG (300 μg i.V.) 7 , 338 1767

Substanz BB (300 μg i.V.) 10 148 1572

3. Abwesenheit eines arthrogenen Effekts.

Die Injektion des kompletten Freund'sehen Adjuvans in die Fußsohle der Ratte oder der Maus verursacht ein sehr deutliches Gelenködem. Bei der folgenden Untersuchung werden Gruppen von jeweils 10 Mäusen mit entweder dem nicht kompletten Freund¹sehen Adjuvans (AIF) als solchem, oder dem nicht-kompletten Freund'sehen Adjuvans, das 250 μg Zellen von M.tuberculosis enthält, oder mit 250 μg der Substanz BB behandelt. Die Injektionen erfolgen mit einem Volumen von 0,05 ml in eine der Hinterpfoten. Die Mäuse werden 14 Tage später getötet. Es ist festzustellen, daß die Mischung aus dem nicht kompletten Freund'sehen Adjuvans und den Mycobakterien (AIF + Mycob.) eine starke Zunahme des Gewichts der durch die Injektion behandelten Pfote verursacht, während die Substanz BB, verglichen mit den Vergleichstieren, die lediglich mit dem nicht kompletten Freund'sehen Adjuvans behandelt worden sind, nur eine geringe Entzündung hervorruft (vgl. Tabelle V).

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- 47 Tabelle V

Abwesenheit einer anthrogenen Wirkung bei der Maus

Anzahl der Mäuse Gewicht der Pfote in mg

Injektion keine Injektion Unterschied

Kontrolle AIF

AIF + Mycob. (250 jjg)

AIF + Substanz BB (250 μg)

10	305	222	83
10	892	225	667 ^x
ua) 10	318	230	88

Man erhält erfindungsgemäß so mit Adjuvans-Substanzen, die zur Steigerung der Wirksamkeit von Impfstoffen bakteriellen oder viralen Ursprungs, insbesondere wenn sie schwache Immunogene darstellen, verwendet werden können. Sie können insbesondere dafür eingesetzt werden, die Immunisierung des Wirts (menschliche Patienten oder Tiere) gegen Bakterien- oder Virus-Infektionen, gegen Tumorantigene und gegen Protozoenantigene etc. zu begünstigen. Sie sind ebenfalls in wirksamer Weise zur Herstellung von Serum verwendbar. Sie können mit dem Antigen oder den genannten- Impfstoffen in pharmazeutisch verträglichen, sterilen Wasser-Öl-Emulsionen verabreicht werden.

Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Substanzen in dem nicht kompletten Freund'sehen Adjuvans oder in einem aus 8,5 Teilen Hexadecan, 1,5 Teilen Sorbitandilaurat (das unter der Handelsbezeichnung Arlacel erhältlich ist) oder Glycerinmonooleat und 10 Teilen isotonischer Lösung suspendiert werden.

Es ist ferner festzuhalten, daß die erfindungsgemäßen Substanzen bei geeigneten Verwendungsbedingungen ihre Adjuvans-Aktivität selbst dann entfalten, wenn sie zu dem in Salzlösung gelösten Antigen zugesetzt werden.

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Es ist schließlich zu bemerken, daß diese Substanzen in Form typischer Impfstoffzusammensetzungen verabreicht werden können, die intramuskulär, intradermal oder subkutan oder auch mit der Impflanzette verabreicht werden.

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Claims

Patentansprüche

'Λ\ Impfstoff, enthaltend ein immunogenes Mittel und ein Adjuvans, bestehend aus einem Monomeren oder einem von diesem Monomeren abgeleitetes Oligomeren, dadurch gekennz e i G h η e t, daß das Monomere eine N-Acyl-muraminsäure (N-Acyl-Mur) mit einer Acyl-Gruppe vom Glykolyl- oder Acetyl-Typ und eine 2 bis 8 Aminosäuren enthaltende Peptid-Kette umfaßt, wobei die erste dieser Aminosäuren, die an die N-Acyl-muraminsäure gebunden ist, Alanin, Serin oder Glycin ist und als zweite dieser Aminosäuren Glutaminsäure oder Asparaginsäure vorhanden ist.
2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomere zusätzlich N-Acetylglucosamin enthält.
3. Impfstoff nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß das Monomere im wesentlichen aus mindestens einem Polysaccharid-polypeptid besteht, das eine N-Acyl-muraminsäure-Einheit (N-Acyl-Mur) enthält, in der als Acyl-Gruppe eine Acetyl-Gruppe oder eine Glyk.olyl-Gruppe vorhanden ist, und an die einerseits eine N-Acetylglucosamin-Einheit (N-AcGIc) und andererseits eine Peptid-Kette gebunden ist, wobei die erste Aminosäure der Peptid-Kette, die an die N-Acyl-muraminsäure gebunden ist, Alanin, Serin oder Glycin ist und als zweite Aminosäure Glutaminsäure oder Asparaginsäure vorhanden ist, wobei eine der Carboxyl-Gruppen dieser zweiten Aminosäure entweder in freier Form oder in der Form des Amids vorliegt, während die andere Säurefunktion in Form einer Bindung mit einer anderen Aminosäure, wie meso-t<-£-Diaminopimelinsäure, Lysin, vWüninobutt er säure oder 3-Hydroxy-diaminopimelinsäure, vorliegt.

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-SO-
4. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomere aus einem Polysaccharidpolypeptid besteht, das im wesentlichen aus N-Acetylglucosamin-Einheiten (N-AcGIc), N-Acyl-muraminsäure-Einheiten (N-Acyl-Mur), die als Acyl-

Gruppe eine Gruppe vom Glykolyl- oder Acetyl-Typ enthält,

L-Alanin-Einheiten (L-AIa), D-Alanin-Einheiten (D-AIa),

D-Glutaminsäure-Einheiten (D-GIu), deren Carboxyl-Gruppe in cf.-Stellung entweder in freier Form oder in substituierter Form vorliegt, wobei sie im letzteren Fall vorzugsweise in Form der Amid-Gruppe vorhanden ist,

und meso-fc(.-S-Diaminopimelinsäure-Einheiten (meso-DAP) ,

deren eine Carboxyl-Gruppe entweder in freier Form oder in Form einer Peptid-Bindung gebunden vorliegt und deren andere Carboxyl-Gruppe entweder in freier Form oder in substituierter Form vorliegt, wobei sie in diesem Fall vorzugsweise in Form der Amid-Gruppe vorhanden ist,

aufgebaut ist.
5. Impfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polysaccharid-polypeptid im wesentlichen durch eines jener gebildet wird, bei denen N-Acetyl-glucosamin, N-Acyl-muraminsäure, L-Alanin, D-Glutaminsäure, rneso-«^-S-Diaminopimelinsäure und D-Alanin in den folgenden Molverhältnissen vorhanden sind (wobei die Abwesenheit der sechsten Zahl in den im folgenden angegebenen Mengenverhältnissen auf die Tatsache hinweist, daß das entsprechende Mittel kein D-Alanin.enthält):

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1:1:1:1:1 (Disaccharid-Tripeptid)

1:1:1:1:1:1 (Disaccharid-Tetrapeptid)

1:1:2:2:2:1 (Disaccharid-Heptapeptid)

1:1:2:2:2:2 (Disaccharid-Octapeptid)

2:2:2:2:2:1 (Tetrasaccharid-Heptapeptid)

2:2:2:2:2:2 (Tetrasaccharid-Octapeptid)
6. Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeich ne t, daß das Polysaccharid-Polypeptid im wesentlichen aus einem Disaccharid-Tetrapeptid der folgenden Formel I besteht:

N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-AIa

D-GIu

meso-DAP

D-AIa
7. Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennz e i c h ne t, daß das Polysaccharid-Polypeptid im wesentlichen aus einem Disaccharid-Tripeptid der folgenden Formel II besteht:

N-AcGlc-N-Acyl-Mur L-AIa

D-GIu II

meso-DAP
8. Impfstoff nach Anspruch 5,dadurch gek ennzeichnet, daß das Polysaccharid-Polypeptid im wesentlichen aus einem Disaccharid-Heptapeptid der folgenden Formel III besteht:

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N-AcGlc-N-Acyl-Mur L-AIa

D-GIu

meso-DAP D-AIa

meso-DAP D-GIu L-AIa

III

mit der Maßgabe, daß das Disaccharid der Formel III gegebenenfalls zusätzlich eine weitere D-Alanin-Gruppe aufweist, die an die zweite meso-DAP-Einheit der Heptapeptid-Kette gebunden ist.
9. Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennz e ic h η e t, daß das Polysaccharid-Polypeptrid im wesentlichen aus mindestens einem der Tetrasaccharid-Polypeptide der folgenden Formeln

N-Ac-Glc-N-Acyl-Mur
L-AIa
D-GIu

meso-DAP
D-AIa-

N-AcGlc-N-Acyl-Mur L-AIa D-GIu

-meso-DAP D-AIa

N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-AIa

D-GIu

meso-DAP

D-AIa-

N-AcGlc-N-Acyl-Mur L-AIa

D-GIu

meso-DAP

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N-AeGlc-N-Acyl-Mur-N-AcGlc-N-Acyl-Mur L-AIa L-AIa

D-GIu D-GIu VI

meso-DAP ^___^—meso-DAP D-AIa--""""^^ D-AIa

N-AcGlc-N-Acyl-Mur-N-AcGlc-N-Acyl-Mur

VII

L-AIa
D-GIu L-AIa
D-GIu meso-DAP ^^~ meso-DAP D-AIa —^""^

N-AcGlc-N-Acyl-Mur-N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-AIa

D-GIu
meso-DAP VIII

D-AIa
meso-DAP

D-GIu

L-AIa oder

N-AcGlc-N-Acyl-Mur-N-AcGlc-N-Acyl-Mur

L-AIa

D-GIu meso-DAP IX

D-AIa meso-DAP

D-GIu

L-AIa

besteht, wobei die Tetrasaccharide der Formeln VIII und IX gegebenenfalls zusätzlich eine D-Alanin-Gruppe aufweisen, die an eine der meso-DAP-Gruppen ihrer Heptapeptid-Ketten gebunden ist.

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- Ξ4 -
10. Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Oligomeren besteht, dessen Monomereneinheit direkt von einem Mittel gemäß einem der Ansprüche bis 9 abgeleitet ist.
11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomere 3 bis 6 Monomereneinheiten aufweist.
12. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans aus einer N-Acyl-muraminsäure besteht, an die eine mindestens 2 Aminosäuren enthaltende kurze Peptid-Kette gebunden ist.
13. Impfstoff nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die kurze Peptid-Kette mindestens 2 Aminosäuren enthält und als erste Aminosäure, die an die N-Acyl-muraminsäure gebunden ist, Alanin, Serin oder Glycin vorhanden ist, während als zweite Aminosäure Glutaminsäure oder Asparaginsäure vorhanden ist, wobei jede der Garboxyl-Gruppen dieser Aminosäure entweder in freier Form oder (wenn die Peptid-Kette nur 2 Aminosäuren enthält) in Form eines Amids oder (wenn eine längere Peptid-Kette vorhanden ist) in Form einer Bindung mit einer anderen Aminosäure vorliegen kann.
14. Impfstoff nach Anspruch 13, dadur ch gekennzeichnet, daß die Peptid-Kette des Adjuvans

2 bis 5 Aminosäuren aufweist.
15. Impfstoff nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Kette des Adjuvans nur 2 Aminosäuren enthält und als erste Aminosäure L-Alanin und als zweite Aminosäure D-Glutaminsäure vorhanden sind.

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16. Impfstoff nach Anspruch 15,dadurch gekennzeichnet, daß die o(-Carboxy 1-Gruppe der Glutaminsäure in Form des Amids vorliegt.
17. Impfstoff nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Kette des Adjuvans mehr als 2 Aminosäuren enthält und als dritte Aminosäure meso-*C-&-Diaminopimelinsäure vorhanden ist.
18. Impfstoff, nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Kette des Adjuvans mehr als 2 Aminosäuren enthält und als dritte Aminosäure Lysin vorhanden ist.
19. Impfstoff nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Kette des Adjuvans mehr als 2 Aminosäuren enthält, wobei als dritte Aminosäure y^-Aminobuttersäure oder 3-Hydroxy-diaminopimelinsäure vorhanden ist.
20. Impfstoff nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Acyl-Gruppe der N-Acyl-muraminsäure eine Acetyl-Gruppe vorhanden ist.
21. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Kette des Polysaccharid-Polypeptids mindestens 3 Aminosäuren enthält, wobei als erste, an die N-Acyl-muraminsäure gebundene Aminosäure L-Alanin, als zweite Aminosäure D-Glutaminsäure und als dritte Aminosäure Lysin vorhanden sind.

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