DE3024369A1 - Neue tripeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

SC 4678/47O6/47O7
Hr-nc

RIIONE-POULENC INDUSTRIES, Paris, Frankreich

Neue Tripeptide, Verfahren zu deren Herstellung und diese

enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft neue Tripeptide der allgemeinen Formel

R-NK-CH- CO -IH -CH- CO- R_±

Cf^CH₂ - CO - NH - CH -

R-NK-CH-R₂

gegebenenfalls deren nicht toxische Salze, sowie Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel.

Die bakteriellen Wandungen, beispielsweise die Wandungen von Mykobakterien, bestehen im wesentlichen aus einem Peptidoglycan gebildet aus N-Äcetylmuraminsäure, an die Peptide fixiert sind, die eine L-AIa-D-GIu-DAP- Kettenverknüpfung enthalten. Darüber hinaus sind die Bakterienwandungen sehr reich an Lipiden, von denen einige frei und extrahierbar sind und andere an die Struktur der Wandungen gebunden sind und gebildet sind aus Mykol-

030063/0 89 8

säuren (riesige Fettsäuren, die öl -verzweigt und ß-hydroxyliert sind). Die Gesamtheit der Bestandteile der Zellwandung bildet eine hovalente Struktur, die aas einem Peptidoglycan und einem Arabinogalactan-Mykolat besteht , die miteinander durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Die Bakterienwandungen weisen die Mehrzahl der biologischen Eigenschaften der Gesamtzellen auf, wenn sie an ein Mineralöl oder pflanzliches Öl assoziiert sind und nach der Suspension in einer physiologischen Lösung verabreicht werden.

In den BE-PSen 821 385, 852 348 und 852 349 werden Peptide beschrieben, die mit N-AcetyImuraminsäure gekuppelt sind, die die Verkettung L-Ala-D-Glu oder L-Ser-D-Gl¹! enthalten und wirksam sind als immunologische Adjuvantien, sowie als antiinfektiöse Mittel.

In der FR-PS 75.24440, veröffentlicht unter der Nt. 2 320 107, werden Kupplungsprodukte zwischen einer Fettsäure und einem Saccharid-neptapeptid beschrieben, isoliert, ausgehend von einem Mykobakterium, das ein Wachs "D" enthält,und dargestellt werden durch folgende Formel

ΜΛΗ MiG - NAH

Ala M

Clv

DAP <· .—'^DAP

(R CCOH) (I)

worin insbesondere:

NAG = N-Acetylglucosamin;

NAM = N-AcetyImuraminsäure,

R = Alkylrest mit 9-17 Kohlenstoffatomen.

030063/0898

Diese Produkte sind immunologische Adjuvantien bei der Erzeugung von Antikörpern und der verzögerten HypersensibiIitat, die dazu geeignet sind, allein zu wirken, d. h. ohne daß es notwendig ist/ sie in öliger Lösung zu verabreichen.

Alle diese Produkte sind charakterisiert durch die Anwesenheit von N-Acetylmuraminsäure, die nach Kasumoto et al., Tetrahedron Letters, 49, 4899 (1978) als verantwortlich für die immunologische Wirksamkeit angesehen wird.

Es wurde nunmehr gefunden, daß die Peptide der allgemeinen Formel I trotz der Abwesenheit von N-Acetylmuraminsäure beträchtliche Adjuvantien- und immunstimulierende Eigenschaften aufweisen. Darüber hinaus können diese Verbindungen, die wohl definiert sind, leicht in einer für die therapeutische Verwendung ausreichenden Reinheit erhalten werden.

In der allgemeinen Formel I

stellen die Symbole R, die gleich· oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest dar, wobei mindestens eines der Symbol«=- R einen Fettsäurerest bedeutet,

das Symbol R₁ stellt einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest substituiert ist, oar

und die Symbole R„ und R^, die gleich oder verschieden sein können_rstellen ein Wasserstoff at ">ra oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest dar, dessen Alkylreil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, wobei die Symbole R_? und R-. nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können

und wobei das Alanin in- der L-Form vorliegt, die Glutaminsäure

t, das Lysin, fa.'

030063/0898

in der D-Form vorliegt, das Lysin, falls eines der Symbole R_

oder R, ein Wasserstoffatom darstellt, in der L-Form vorliegt und die 2,6-Diamino-pimelinsäure oder ihre Derivate, w^nn die Symbole R₂ und R_, die gleich oder verschieden sein können, einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest darstellen, in der D₇D-; L,L-; DD,LL- (razemisch) oder D,L-(meso)-Form vorliegt.

Unter Fettsäurerest ist ein Alkanoylrest mit 1-45 Kohlentstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Hydroxy-, Phenyl- oder Cyclohexylrest), ein Alkenoylrest mit J - 30 Kohlenstoffatomen, der mehr als eine Doppelbindung enthalten kann oder ein Mykolsäurerest, wie er in die Struktur der Bakterienwandung von Mykobakterien, Wocardia oder Corynebakterien eingearbeitet ist, zu verstehen.

Erfindungsgemäß können die neuen Tripeptide der allgemeinen Formel I erhalten werden nach allgemein in der Peptidsynthese verwendeten bzw.üblichen Methoden. Die verschiedenen Reaktionen werden nach der Blockierung durch <7?^ignete Schutzgruppen der Amin- oder Säurefunktionen, die in die Reaktionen nicht eingreifen dürfen, durchgeführt, worauf eine Entblockierung dieser Funktionen folgt.

Insbesondere können die neuen Tripeptide der allgemeinen Formel I erhalten werden durch Einwirken eines Dipeptids der allgemeinen Formel

- NH - CfI - CO ·· ΝΉ -CK-CO-R.

I i * (in)

CIL CH„CH„ - COOH

worin Rr einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, wie den Benzyloxycarbonyl- odar t-Butyloxycarbonylrest darstellt, und R. einen Aminorest oder einen Alkyloxyrest mit 1-4

030063/0898

Kohlenstoffatomen( gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest), bedeutet/ auf eine Aminosäure der allgemeine" Formel

- CH - P

₅ - NH - CH · ft.

worin R₂ ^un<^ R^ äie g'leich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeuten, wobei R₂ und R₃ nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können und R₅ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion, wie den Benzyloxycarbonyl- oder t-Butyloxycarbonylrest darstellt, wobei mindescens eines der Symbole R₅ dor Formeln III und IV einen Fettsäurerest darstellt, worauf gegebenenfalls

- der Rest R₅, wenn er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, durch ein Wasserstoffatom ersetzt wird,

- der Rest R₄, wenn er einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen ( gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, durch eine Hydroxygruppe ersetzt wird und

- die Reste R₂ und R-,, wenn sie einen Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellen, durch einen Carboxyrest ersetzt werden.

030063/0898

Im allgemeinen ist es notwendig, die freie Säurefunktion des Dipeptids der allgemeinen Formel III vor ihrer Einwirkung auf die Aminosäure der allgemeiner Formel IV zu aktivieren. Vorzugsweise ist das aktivierte Derivat des Dipeptids der allgemeinen Formel III ein gemischtes Anhydrid, hergestellt in situ durch Einwirken eines Alkylhalogenformiats ^ie Isobutylchlorformiat) auf das Dipeptid der allgemeinen Formel III. Die Kondensation des aktivierten Derivats erfolgt in einem organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Chloroform, Toluol oder Dimethylformamid oder in einem wässrig-organischen Medium, in Anwesenheit einer Base (mineralisch bzw. anorganisch, wie Natriumhydroxid oder organisch wie Triäthylamin) und bei einer Temperatur von -10 bis +3O⁰C.

Der möglicherweise durchgeführte Ersatz eines Rests R^ durch ein Wasserstoffatom und der Reste R, durch einen Hydroxyrest und von R„ und R-j durch eine Carboxylgruppe kann nach bekannten bzw. üblichen Methoden je nach der Natur der Schutzgruppen erfolgen. Besonders vorteilhaft ist es, die n^te R₂, R , R. und R₅ derart zu wählen, daß ihr Ersatz durch eine Hydroxy- bzw. Carboxygruppe oder ein Wasserstoffatom in einer einzigen Phase erfolgen kann. Zu diesem Zweck ist es günstig, den Rest R. auszuwählen aus den Benzyloxy- oder Nitrobenzyloxyresten und die Reste R₂, R-, und R₅ auszuwählen aus den Benzyloxycarbonyl- oder Nitrobenzyloxycarbonylresten.

Unter diesen Bedingungen erfolgt der Ersatz dieser Reste durch Hydrogenolyse, wobei man in einem geeigneten organischen Lösungsmittel arbeitet, wie Essigsäure( gegebenenfalls im Gemisch mit einem anderen Lösungsmittel, wie Methanol) oder in einem wässrigorganischen Lösungsmittel in Anwesenheit eines Katalysators, wie Palladium, beispielsweise Palladium auf Kohle, bei einer Temperatur von etwa 20 C und unter einem Druck von etwa 1 bar bzw. <«76O mmHg. *

Das Dipeptid der allgemeinen Formel III kann erhalten werden durch

Q30063/0898

Einwirkung eines aktivierten Derivats des L-Alanins der allgemeinen Formel

NH - CH - COOH

■ L ■ ^(v)

Ch₅

worin R₁- wie vorstehend definiert ist, auf ein Derivat der D-Glutaminsäure der allgemeinen Formel

- CH - CO - R₄

I · (VI)

CH₃CH₂ - CCOH

worin R, w'.c vorstehend definiert ist/ unter den vorstehend für die Einwirkung eines Dipeptids der allgemeinen Formel III auf eine Aminosäure der allgemeinen Formel IV beschriebenen Bedingungeri.

Da Dipeptid der allgemeinen Formel III, worin R_n. einen Fettsäurerest darstellt, kann erhalten werden durch Einwirkung eines aktivierten. Derivats einer Fettsäure der allgemeinen Formel

R¹ - CO - OH (VII)

worin R'-CO- einen Fettsäurerest darstellt, wie vorstehend definiert, auf ein Dipeptid der allgemeinen Formel

Q30063/0898

H₂N - CH - CO - iW - CH - CO - R₄
■ L CH₂CH₂ - COOH

worin R. wie vorstehend definiert ist.

Als aktiviertes Derivat der Säure der allgemeinen Formel VII ist es besonders günstig/ ein Säurehalogenid oder ein gemischtes Anhydrid zu verwenden, das im allgemeinen in situ hergestellt wird durch Einwirken eines Alkylhalogenformiats, wie Isobutylchlorformiat, auf eine Säure der allgemeinen Formel VII in Anwesenheit einer Base.

Wenn man eine Säure der allgemeinen Formel VII in der Form des Säurehalogenids, insbesondere des Chlorids, verwendet, so erfolgt die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel, wie Diäthylather oder Methylenchlorid, in Anwesenheit einer Base (mineralisch bzw. anorganisch, wie Natriumhydrojcid, oder organisch, wie Triäthylamin)bei einer Temperatur von O bis 30 C. Im allgemeinen wird das Dipeptid der allgemeinen Formel VIII in der Form eines Salzes, wie des Hydrochlorids, verwendet.

Wenn man eine Säure der allgemeine*, Formel VII in der Form des gemischten Anhydrids verwendet, so erfolgt die Reaktion unter den vorstehend für die Einwirkung eines Dipeptids der allgemeinen Formel III auf eine Aminosäure der allgemeinen Formel IV beschriebenen Bedingungen. Im allgemeinen wird das Dipeptid der allgemeinen Formel VIII in der Form eines Salzes, wie des Hydrochlorids , verwendet.

Die Aminosäure der allgemeinen Formel IV, worin R„ einen Carbamoylrest darstellt, R_ einen Carboxyrest bedeutet und R^ einen Benzyloxycarbonylrest darstellt, d. h. das D-Monoamid der Benzyl-

Q30063/0898

~^2C~ 3024389

oxycarbonyl-D-meso-2/6-diamino-pinielinsäure kann hergestellt werden, nach dem in der BE-PS 821 385 beschriebenen Verfahren.

Die Aminosäure der allgemeinen Formel IV, worin R- einen Carbamoylrest darstellt, R^ einen Carboxyrest bedeutet und R_g einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminform darstellt, in der razemischen Form, der D,D- oder L/L-Fon?., kann hergestellt werden, ausgehend von der entsprechenden 2,6-Diaminopimelinsäure. Zu diesem Zwecke stelle man nach bekannten bzw. üblichen Methoden den Benzy!ester der 2,6-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäure her, der mono-verseift ist, nach der von A. Arendt et al., Rocziniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum, 48, 1305 (19 71), /~Chem. Abstr., 82, 31497 g (1975)7 beschriebenen Technik,anschließend umgewandelt wurde durch Einwirken von ammonxakalischem Methanol in das Monoamid der allgemeinen Formel

- CCOH

Z-NH-CH-CO-NH₂

(worin Z einen Benzyloxycarbonylrest darstellt) , das nach d«.r Hydrogenolyse in Anwesenheit von Palladium auf Kohle zum 2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamid führt. Durch Einwirken eines Kupfersalzes, wie des Kupfer-H-bromids oder des basischen Carbonats von Kupfer auf das 2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamid, bildet sich ein Komplex, der dargestellt werden kann durch die Formel

03006370898

3024389

- CH - CO -

CH - COO

(X)

OCO -CE-"

-.CO-CH-

worin der Aminorest in der o6-Stellung zur Carbamoylgruppe acvliert werden kann durch Einwirken eines aktivierten Derivats einer Säure der allgemeinen Formel νχΐ (vorzugsweise eines Halogenids, wie des Chlorids) oder geschützt werden kann durch Einwirken eines Alkyl- oder Benzylhalogenformi;i,;s. Der so gebildete Komplex wird durch Einwirken von Schwefelwasserstoff zersetzt, unter Bildung der Aminosäure der allgemeinen Formel IV, worin R~ einen Carbamoylrest bedeutet, R₃ einen Carboxyrest darstellt und Rr wie vorstehend definiert ist.

Die Aminosäure der allgemeinen Formel IV,worin R₀ einen Carboxyrest darstellt, R₃ einen Carbamoylrest bedeutet und R₅ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt, in der D,D-; L,L-; DD,LL-(razemisch)- oder D,L-(meso)-Form, kann hergestellt werden, ausgehend von der entsprechenden 2,6-Diamino-pimelinsäure, Zu diesem Zweck stellt man den Kupfer-II-komplex der allgemeinen Formel X dar, worin der Aminorest in der c£-stellung zur Carbamoylgruppe geschützt sein kann durch Einwirken eines Alkyl- oder Benzylhalogenformiats. Der so gebildete Komplex wird zersetzt durch Einwirken von

030063/0898

Schwefelwasserstoff unter Bildung der Aminosäure der allgemeinen Formel IV₇ worin R₀ einen Carbamoylrest darstellt, R-, einen Carboxyrest bedeutet und R₁. eine Schutzgruppe für die ürcinfunktion darstellt. Der Aminorest in der oL -Stellung zur Carboxygruppe kann geschützt sein durch einen Fettsäurerest oder durch eine Schutzgruppe für die Aminfunktion, die unterschiedlich von R₅ ist. Nach der Entfernung der durch R_n. dargestellten Schutzgruppe erhält man die Verbindung der allgemeinen Formel IV, worin R₀ einen Carboxyrest bedeutet, R₃ einen Carbamoylrest darstellt und R₁- eine Schutzgruppe für die Aminfunktion ist.

Die Aminosäure der allgemeinen Formel IV, worin die Symbole R₂ und R_ gleich sind und jeweils einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest), darstellen und Rc einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion bedeutet, in der D,D-; L₇L-; DD₇LL-(razemisch)- oder D₇L-(meso)-Form, kann hergestellt werden, ausgehend von einer Aminosäure der allgemeinen Formpi¹ IV, worin R₂ und R₃ wie vorstehend definiert sind, und R₅ ein Wasserstoffatom darstellt, durch Monoblockierung einer der 2 Aminfunktionen nach der Methode, beschrieben von E. Bricas et al., Biochemistry, 9, 823 (197G).

Die Aminosäure der allgemeinen Formel IV, worin die Symbole R₂ und R-j, die unterschiedlich sind, einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome aufweist (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellen und R₁. eine Schutzgruppe für die Aminfunktion bedeutet, in der D,D-; L,L-; DjJ₇LL- (razemisch)- oder D₇L-(meso)-Form, kann erhalten werden, ausgehend von einer Aminosäure der allgemeinen Formel IV, worin die Symbole R-, R₃ und Rj- wie vorstehend definiert sind und die Aminfunktion in der bl -Stellung zum Symbol R₃ geschützt ist durch eine Schutzgruppe für die Aminfunktion, die von Rg unterschiedlich ist, durch Eliminieren dieser Schutzgruppe, ohne R₅ anzugreifen.

030063/0898

-23- 3024389

Die Verbindung der allgemeinen Formel IV, worin die Aminfunktion in oC-Stellung zum Symbol R_ geschützt ist durch eine Schutzgruppe für die Aminfunktion, wird erhalten nach Verestern einer Verbindung der allgemeinen Formel IV, worin eines der Symbole R_ oder R_ e:nen Carboxyrest darstellt und das andere einen Carbamoylre^t bedeutet, durch Blockieren der Aminfunktion unter üblichen Bedingungen.

Die Aminosäure der allgemeinen Formel IV, worin R- einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt und

- R~ ein Wasserstoffatom bedeutet und R₃ einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält( gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, oder worin

- R„ einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoff atome auf\feist( gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) bedeutet und R., ein Wassersteif atom darstellt,

kann hergestellt werden nach bekannten bzw. üblichen Itethoden, ausgehend von Lysin.

Das Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel V, worin R₅ einen Fettsäurerest darstellt, kann hergestellt werden durch Einwirken einer Säure der allgemeinen Formel VII oder eines aktivierten Derivats dieser Säure auf das L-Alanin, dessen Säurefunktion gegebenenfalls geschützt ist in Form des Esters, worauf gegebenenfalls die Schutzgruppe der Säurefunktion entfernt wird.

Wenn die Säurefunktion des L-Alanins geschützt ist, wird die Kondensation der Säure der allgemeinen Formel VII im allgemeinen in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, durchgeführt, wobei man in einem organischen Lösungs-

030063/0898

mittel, wie Methylenchlorid oder Dimethylformamid bei einer Temperatur von -10 bis +30⁰C arbeitet.

Wenn die Säurefunktion des L-A.lanins frei ist, ist es nötig, die Säure der allgemeinen Formel VII vor ihrer Einwirkung auf das L-Alanin zu aktivieren. Als aktiviertes Derivat der Säure der allgemeinen Formel VII ist es besonders vorteilhaft, ein Säurehalogrnid oder ein gemischtes Anhydrid zu verwenden. Man arbeitet dann unter d>?:i vorstehend für die Einwirkung einer Säure der allgemeinen Formel VII auf das Dipeptid der allgemeinen Formel VIII beschriebenen Bedingungen.

Das Dipeptid der allgemeinen Formel VIII kann erhalten werden durch Kondensation des L-Alanins, dessen Aminfunktion geschützt ist, an D-Glutaminsäure oder ihre Derivatenach üblicher Weise in der Peptidchemie verwendeten Methoden, worauf die Eliminierung der Schutzgruppe von der Aminfunktion folgt.

Insbesondere können die neuen Tripeptide der allgemeinen Formel I erhalten werden durch Einwirken eines aktivierten Derivats des L-Alanins der allgemeinen Formel V auf ein Dipeptid der allgemeinen Formel

- CH - CO - R^

- 00 - NH - OH - R₅

I? - NH - CH -

worin R-, R-,, R. und R₁- wie vorstehend definiert sind, wobei mindestens eines der Symbole R^ der Formeln V und XI einen Fettsäurerest darstellt unter den vorstehend für die Einwirkung eines

030063/0898

Dipeptide der allgemeinen Formel III auf eine Aminosäure der allgemeinen Formel IV beschriebenen Bedingungen ^ worauf gegebenenfalls:

- der Rest R-, wenn er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt,durch ein Wasserstoffatom ersetzt wird,

- der Rest R., wenn er einen Alkyloryrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen ( gegebenenfalls substituiert durch ei-">on Phenyl- oder Nitrophenylrest) bedeutet, durch einen Hydroxyrest ersetzt wird, und

- die Reste R₂ und/oder R₃, wenn sie einen Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellen durch eine Carboxygruppe ersetzt werden,

wobei man sich üblicher Methoden bedient, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen.

Das Dipeptid der allgemeinen Formel XI kann hergestellt werden durch Einwirken eines D-Glutaminsäurederivats der allgemeinen Formel

γ - NH , CH - CO - R_4
2CH₂ - COOH

worin R₄ wie vorstehend definiert ist und Y eine Schutzgruppe der Aminfunktion, wie die t-Butyloxycarbonylgruppe, darstellt, auf eine Aminosäure der allgemeinen Formel IV, gefolgt von einem Ersatz der Schutzgruppe Y, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen.

030 0 6 3/8898

Insbesondere können die neuen Tripeptide der allgemeinen Formel I hergestellt werden durch Einwirken einer Säure der allgemeinen Formel VII auf ein Tripeptid eier allgemeinen Formel

R₆-Mi-CH-CO-NH-CH-CO-R₄

■ CE^CO -HH -CK

- NH - CH -

worin die Symbole Rp, R-. und R. wie verstehend definiert sind und die Symbole R_g, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoff atom oder den vorstehend definierten Rest R₁-darstellen, wobei mindestens eines der Symbole R_fi ein Wasserstoff atom darstellt, unter den vorstehend für die Einwirkung einer Säure der allgemeinen Formel VII auf das Dipeptid der allgemeine·.·! Formel VIII beschriebenen Bedingungen, gefolgt gegebenenfalls durch

- den Ersatz des Rests R,, wenn es sich um eine Schutzgruppe der Aminfunktion handelt, durch ein Wasserstoffatom,

- den Ersatz des Rests R₄, wenn es sich um einen Alkyloxyrest mit 1.-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest^ handelt, durch eine Hydroxygruppe und

- den Ersatz der Reste R„ und/oder R-., wenn es sich um einen Alkyloxycarbonvlrest mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) handelt, durch einen Carboxyrest, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen. · " ·

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von

030063/0898

Tripeptiden der allgemeinen Formel I durch Peptidsynthese von Merrifield in fester Phase.

Das Verfahren besteht im wesentlichen darin, an einen geeigneten Träger eine Aminosäure der allgemeinen Formel

R₇-Na-CH-R₅

zu fixieren, worin eines der Symbole R₂ ^un<^ ^Ro einen Carboxyrest darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohie.nstoffatome enthält (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, R^ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet und R_ eine Schivf-zgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei, falls R₁. und R₇ jeweils eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeuten, diese Schutzgruppen unterschiedlich sind, worauf man nach der Entblockierung der durch den Rest R_ geschützten Aminfunktion kondensiert:

a)-entweder D-Glutaminsäure, deren Aminfunktion und cd-Carboxyfunktion in geeigneter Weise geschützt sind, d. h. die Verbindung der allgemeinen Formel

-NH-CH-OO-R,.

I ⁴ (xv)

H₂ - COOH

worin R wie vorstehend definiert ist und R. einen Araino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest} darstellt,

030063/0898

■ ²⁸ - 3024389

worauf man nach der Entblockierung der durch den Rest R₇ geschützten Aminfunktion

- entweder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

- NH - CH - COOH

worin R₇ wie vorstehend definiert ist, kondensiert und nach der Entblockierung der Aminfunktion, die durch R₇ geschützL ist, gegebenenfalls die Fettsäure der allgemeinen Formel VII kondensiert,

oder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R - NH - CH - COOH

CH₅

worin R einen Fettsäurerest darstellt, kondensiert, -oder das Dipeptid der allgemeinen Formel

CH_ ' ^CH2^CH2 ' ^C00H

worin R. wie vorstehend definiert ist und R₀ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei,

030063/0898

falls R. eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet, diese unterschiedlich von der Schutzgruppe R₅ der Verbindung der allgemeinen Formel XIV ist und wobei in diesem Fall man ggf. anschließend die Säure der allgemeinen Formel VII nach der Entblockierung der durch den Rest R„ geschützten Aminfunktion reagieren läßt und anschließend das erhaltene Produkt von seinem Träger entfernt und gegebenenfalls Schutzgruppen de>Amin- und Carboxyfunktionen abspaⁿtet.

Nach einer Variante des Verfahrens ist es möglich, an einen geeigneten Träger das Dipeptid der allgemeinen Formel

R_n-NH-CH-CO-R,

CH₀CH₀ -CO-NH-CH-R, ^ ^ I ■* (XIX)

R₁^-NH-CH-R,

^l2

zu fixieren, worin R₀, R->, R und Rr- wie vorstehend definiert

2, ·3 ^ O

sind, und R„ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei, falle R₁. und R_f jeweils eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeuten, diese Schutzgruppen unterschiedlich sind, worauf man nach der Entblockierung der durch R_g geschützten Aminfunktion kondensiert:

- entweder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel XVI, und anschließend nach der E.^tblockierung der durch R₇ geschützten Aminfunktion gegebenenfalls die Fettsäure der allgemeinen Formel VII, oder

- ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel XVII, worauf man das erhaltene Produkt von seinem Träger abtrennt und gegebenenfalls Schutzgruppen der Amin- und Carboxyfunktionen abspaltet.

030063/0898

Gemäß einer weiteren Variante des Verfahrens ist es möglich, an einen geeigneten Träger das Tripeptid der allgemeinen Formel

ϊ- NH - CH - CO - NH - CH - CO - R_h

CH₂CH₂ - CO - PH - CH - Rj

zu fixieren, worin R„, R_, R. und R₁. wie vorstehend definiert sind und R. eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei, falls Rg und R₁₀ jeweils eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeuten, diese Gruppen unterschiedlich sind, worauf man nach Entblockieren der durch R₁₀ geschützten Aminfunktion die Säure der allgemeinen Formel VII kondensiert, und anschließend das erhaltene Produkt von seinem Träger entfernt und gegebenenfalls Schutzgruppen der Amin- und Carboxylgruppen abspaltet.

Die Träger, die besonders gut geeignet sind, sind die chlormethylierten oder hydroxymethylierLen Styro1-DivinyIbenζöl-Copolymer en. Vorzugsweise wird das chlormethylierte Styrol-Divinylbsnzol-Copolymere (98-2 oder 99-1) verwendet.

Die Fixierung der Aminosäure der allgemeinen Formel XIV oder des· Dipeptids der allgemeinen Formel XIX cder des Tripeptids der allgemeinen Formel XX an den chlormethylierten Träger erfolgt nach-üblichen Methoden, insbesondere durch Reaktion der Aminosäure, des Dipeptias oder des Tripeptids in Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie Äthanol und in Anwesenheit eines Säureakzeptors, wie Triäthylamin. Es ist besonders günstig, das Reaktionsgemisch bis auf eine Temperatur von etwa der Siedetemperatur des Lösungsmittels zu erwärmen.

In den vorstehend beschriebenen Verfahren erfolgt die Kondensation

030063/0898

der Aminosäuren, Peptide oder Säuren an eine Aminosäure oder ein Peptid, das an einen geeigneten Träger fixiert ist, nach üblicherweise in der Peptidchemie verwendeten Methoden. Dies trifft auch auf die Blockierung der Funktionen zu, die an den Reaktionen nicht teilnehmen sollen, gefolgt gegebenenfalls von deren Entblockierung.

Die Schutzgruppen der Aminfunktionender Aminosäure der allgemeinen Formel XIV, des Dipeptids der allgemeinen Formel XIX oder des Tripeptids der allgemeinen Formel XX sollten so gewählt werden, daß deren Entfernung erfolgt, ohne die Bindung Aminosäure-Träger anzugreifen. Insbesondere sollten die Reste R₇, Rg, R_Q und R.JQ verschieden sein vom Rest R₅, wenn letzterer eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt und sollten derart sein, daß ihre Entfernung erfolgt, ohne die Schutzgruppe Rj- und die Bindung Peptid-Träger anzugreifen.

Im allgemeinen werden, falls die Reste R₀, R_ oder R Ester-

Zj 4

funktioner, darstellen, diese derart gewählt, daß sie bei der Spaltung der Bindung Peptid-Träger entweder erhalten bleiben oder in Carboxy- oder Carbamoylreste umgewandelt werden, je nachdem ob die Spaltung eine saure Hydrolyse, eine Alkoholyse oder eine Ammonolyse darstelle.

Insbesondere wird die Bindung Peptid-Träger, die benzylischer Natur ist, gespalten durch Behandeln mittels eines Bromwasserstoff säure-Tiifluoressigsäuregemisehe.

Die neuen Tripeptide der allgemeinen Formel I können gegebenenfalls gereinigt werden nach physikalischen Methoden (wie die Kristallisation oder die Chromatographie) oder chemischen Methoden, wie die Salzbildung, dessen Kristallisation und anschließende Zersetzung.

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen können in Säureadditionssalze oder Metallsalze umgewandelt werden oder in Additions-

030063/0898

salze mit organischen Basen, je nach der Natur der Substituenten.

Die Additionssalze mit Säuren können erhalten werden darch Einwirken der neuen Verbindungen auf Säuren in einem geeigneten Lösungsmittel. Im allgemeinen löst man die Verbindung in Wasser durch Zusatz der theoretischen Säurem^nge und lyophilisiert anschließend die erhaltene Lösung.

Die Metallsalze oder d;.e Additionssalze mit organischen Basen können hergestellt werden durch Einwirken der neuen Verbindungen auf Basen in einem geeigneten Lösungsmittel. Im allgemeinen löst man die Verbindung in Wasser durch Zusatz der theoretischen Basenmenge, worauf man die erhaltene Lösung lyophilisiert.

Die rauen Verbindungen gemäß der Erfindung sind Immunitatsadjuvantien und -stimulant!en: sie steigern die Hypersensibilitätsreaktionen und/oder die Produktion von zirkulierenden Antikörpern gegenüber Antigenen, mit denen sie verabreicht werden, und sie stimulieren in unspezifischer Weise die Abwehrreaktionen gegen bestimmte Infektionen (beispielsweise die Infektion der Maus durch intrazelluläre Listeria monocytogenes-Ba\.terien) .

In vitro sind sie aktiv in molaren Konzentrationen., die im allgemeinen bei 10 b.
genden Untersuchungen:

— 3 —8
allgemeinen bei 10 bis 10 liegen und insbesondere bei fol-

- Stimulierung der Synthese von DNS (mitogene Wirkung) nach der Technik von G. Marchai, Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125 0, 519 (1974),

- Stimulierung der allogenen Reaktion (Histo-Unverträglichkeitsreaktion) nach der Technik von R. W. Dutton, J. exp. Med., 122, 759 (1966) und A. B. Peck und F. H. Bach, J. Immunol. Methods, 3, 147 (1973),

- Stimulierung der Produktion von Antikörpern nach der Technik

030063/0898

von P. H. Klesius, Proc. Soc., exp. Biol. Med. (N.Y.), 135, 155 (1970) und H. van Dijk und N. Bloksma, J^ Immunol. Methods, 14, 325 (1977),

- Vermehrung ^.er Anzahl der phagozytären Makrophagen nach der Technik von J. Michl et al., J. exp. Med., 144, 1465 (1976),

- Stimulierung der sauren Phosphatape und N-Acetylglucosamidinase (lysosomiale Enzyme der Makrophagen )ohno Vermehrung der Milchsauredehydrogenase nach der Technik von P. Davies et al., J. exp. Med., 139, 1262 (1974).

In vivo steigern sie bei der Maus in Dosierungen von 1-30 mg/kg die verzögerte Hypersensibilität und die Antikörperproduktion, insbesondere nach der Technik von T. E. Miller et al., J. Nath. Cancer Inst., 51, 1669 (1973).

Beim Meerschweinchen steigern sie die Hypersensibilitätsreaktion und die· Produktion von Antikörpern gegen Rinder-Gammaglobulin,, das mit Hapten-dinitrophenol gekoppelt ist, nach der Technik von F. Floc'h et al., Immunol. Communic., 7, 41 (1978).

Bei der Maus stimulieren sie die Abwehrreaktionen gegen Infektionen der Maus durch Listeria monocytogenes in Dosierungen von 1-100 mg/kg nach der Technik von R.M.Fauve und B. Hevin, CR. Acad. Sei. (D), 285, 1589 (1977).

Bei der Maus stimulieren sie das Eliminierungsvermögen von kolloidalem Kohlenstoff aus doTi retikulo-enrOthelialen System nach der Technik von B. N. Halpern et al., Ann. Institut Pasteur, 80, 582 (1951).

Beim Kaninchen stimulieren sie in Dosierungen im allgemeinen von 0,1-3 mg/kg die Serumantikorperbildung gegen den grippalen Virus nach der Technik von G. H. Werner et al., Biomedicine, 22, 440 (1975).

030063/0898

Besonders interessant sind die Tripeptide der allgemeinen Formel I, worin R^ einen Hydroxy- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen bedeutet, R₂ ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoylrest darstellt, R₃ einen Carboxy- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylr.p.il 1-4 Kohlenstoff atome enthält, bedeutet, das Symbol R, das an den L-Alanylrest gebunden ist, ein Alkanoylreot mit 8-16 Kohlenstoffatomen ist und das Symbol R, das an die Aminfunktion in e/--Stellung zum Rest R gebunden ist, ein Wasserstoffatom darstellt. Besonders interessant <?_nd die Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin R. einen Hydroxyrest darstellt, R₂ einen Carbamoylrest bedeutet, R_ einen Carboxyrest darstellt und die Symbole R wie vorstehend definiert sind.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I können Komplexe mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen bilden. Daraus folgt, daß die Ergebnisse der Elementaranalyse deutlich von den theoretischen Werten abweichen können. Jedoch.werden die Verbindungen durch ihren Gehalt an Aminosäuren, durch das C/N-Verhältnis und durch ihre Homogenität bei der Chromatographie an einer Siliciumdioxidcel-Dünncchicht identifiziert.

Beispiel 1

Man fügt 1,88 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei 1O°C gehaltenen Lösung von 7,03 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-o^-D-glutamat in einem Gemisch von 280 ecm Dioxan und 2,0 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 10°C gerührt, und anschließend fügt man eine Lösung von 4,04 g n£ -Benzyloxycarbonyl-L-lysin in einem Gemisch von 30 ecm Dioxan und 14,4 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 2o h bei etwa 18⁰C gerührt. Das gebildete unlösliche Produkt wird durch Zusatz von 280 ecm

030063/0898

Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird noch 1 h gerührt und anschließend durch Zusatz von 20 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 3 angesäuert. Das gebildete unlösliche Material wird durch Filtrieren entfernt, mit 20 ecm Wasser gewaschen und unter verringertem Druck (0,3mmHg; 0,04 kPa) bei 2O°C getrockn°t. Man erhält so 7,72 g eines weißen FesLstoffs, den man einer Säule von 3,5 cm Durchmesser, die 230 g nei^trales Siliciumdioxidgel enthält, cbromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 700 ecm eines Aceton-Cyclohex^r.gemischs (9-1 VoI), 1,1 1 Aceton und 1 ,7 1 Methanol, wobei man Fraktionen von 100 ecm gewinnt. Die Fraktionen 22 - 35 werden vereint, unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 5,97 g Τ&οί-£Ό> -Benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl) - ^-D-glutamyl_7~N£ -ben-yloxycarbonyl-L-lysin.

Rf = 0,84 l_ Siliciumdioxcrel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Man löst 1,77 g N</ -/~0¹ -Benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7-N£, -benzyloxycarbonyl-L-lysin in 177 ecm Methanol. Man fügt 1,77 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 4 h hindurch. Nach dem Filtrieren, Konzentrieren des Filtrats zur Trockne, wird der ölige Rückstand in 20 ecm Aceton aufgenommen. Man erhält so 1,06 g eines weißen Feststoffs, den man aus einem Gemisch von 12 ecm Äthanol und 24 ccrr Aceton umkristallisiert. Man erhält so 0,9 g No6~/ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7~ L-lysin vom Fp = 180 - 186°C (schmieriges Schmelzen).

Rf = 0,29 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:	C	59	,07	H	9	,14	N	10,	60
berechnet:	C	58	,4	H	8	,8	N	10,	0
gefunden:

030063/0898

Nach, der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa = 1,02 (Theorie =1)
GIu = 1,00 (Theorie = 1)
Lys =0,89 (Theorie = 1)

Das Bönzyl-N-lauroyl-L-alanyl-06-D-glutamat kann nach einer der folgenden beiden Methoden hergestellt werden:

a) Zu einer Lösung von 12,75 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl- oi- -D-glutamat in 75 ecm 1n-Natriumhydroxid fügt man gleichzeitig während 37 Minuten 8 g Lauroylchlorid, gelöst in 75ecm Äther und 37,4 ecm 1n-Natriumhydroxid, derart daß der pH-Wert des Reaktionsgemische bei 8-9 gehalten wird. Das Gemisch wird anschließend 1 h 20 Min. gerührt. Nach dem Dekantieren wird die wässrige Phase durch Zusatz von 60 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 angesäuert, dreimal mit insgamt 300 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte werden mit 25 ecm Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält zo 7,4 g eines weißen Feststoffs, den man an 80 g neutralem Siliciumdioxidgel, das in einer Säule von 2 cm Durchmesser enthalten ist, chromatographiext. Man eluiert nacheinander mit 100 ecm Äthylacetat-Methanolgeirn sch (8-2 VoI) und 200 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (1-1 VoI) wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Fraktion 1 wira unter verringertem Druck (ZO mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 2 g Denzyl-N-lauroyl-L-alanyld-D-glutamat vom Fp = 130°C. Die Fraktionen 2-4 werden in gleicher Weise zur Trockne konzentriert und an 100 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,063 - 0,20 mm), das in einer Säule von 2 cm Durchmesser enthalten ist, chrcmatographiert. Man eluiert mit 250 ecm Aceton, wobei man Fraktionen von 25 ecm gewinnt. Die Fraktionen 1 und 2 werden unter ver-

030063/0898

ringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält 4,07 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-o£-D-glutamat vom Fp = 13O°C, dessen Charakteristika im lolgenden angegeben sind:

Rf = 0,9 /"Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 66,10 H 8,63 N 5,71 % gefunden: C 66,3 H8,8 N5,6 %

b) Man fügt 31 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei einer Temperatur von etwa 1O°C gehaltenen Lösung von 47,75 g Laurinsäure in 3 1 Dioxan und 33.3 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 10⁰C gerührt, und anschließend fügt man während 10 Minuten eine auf 1O°C gekühlte Lösung von 88,95 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-*..¹ anyl-^-D-glutamat in einem Gemisch von 1 1 Dioxan und 476 ecm Wasser und 476 ecm InNatriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wi:rd 1 h bei 10°C gerührt und anschließend 1Sh bei einer Temperatur von etwa 20⁰C; es wird darauf durch Zusatz von 4 1 Wasser verdünnt, durch Zusatz von etwa 475 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 angesäuert und 2 h bei O⁰C belassen. Die erhaltene Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, nacheinander mit 500 ecm Wasser und 500 ecm Äther gewaschen und schließlich unter verringertem Druck (20 itimHg; 2,7 kPa) bex 2^°C getrocknet. Das Produkt wird■in 800 ecm Äther suspendiert, 1 h gerünrt und durch Filtrieren abgetrennt und zweimal mit insgesamt 200 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen unter verringertem Druck(20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20⁰C erhält man 71,79 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-&£ -D-glutamat vom Fp = 130°C.

Rf = 0,77 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol (4-iVol)_7

030063/0898

Das Hydrochlorid von Benzyl-L-alanyl- e<£ -D-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 97/16 g Benzyl-N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl-/*^-D-glutamat in 970 ecm einer wasserfreien Lösung von 1,7 n-Chlorwasserstoffsäure in Essigsäure. Man rührt 2 h und fügt anschließend rasch 3,8 1 wasserfreien Äther zu und beläßt 2 h bei 0⁰C. Di<=> ölige Ausfällung, die sich bildet, vrird von der überstehenden Flüssigkeit durch Dekantieren abgetrennt und in 500 ecm Aceton gelöst. Die so erhaltene Lösung wird unter verringertem Druck (20 EanHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 88,9 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-^-D-glutamat.

Das Benzyl-N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl- a^-D-glutamat kann hergestellt werden nach der Methode von E. Bricas et al., Biochemistry 9, 823 (1970).

Das N£ -Benzyloxycarbonyl-L-lysin kann hergestellt werden n~ch der Methode von A. Neuberger et al., Biochem. J., 37, 515 (1943).

Beispiel 2

Man fügt 0,65 ecm Isobutyl-chlorformiat zu einer bei -10⁰C gehaltenen Lösung von 2,45 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-ad-D-glutamat in einem Gemisch von 80 ecm Tetrahydrofuran und 0,70 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten boi -1O°C gerührt und anschließend fügt man eine auf -10⁰C gekühlte Lösung von 2,24 g des Kydrochlorids von Benzyl-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in einem Gemisch von 40 ecm Tetrahydrofuran und 0,77 ecm Triäthylamin zu. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei -1O°C und anschliessend 2 Tage bei etwa 20°C gerührt. Man konzentriert darauf da? Reaktionsgemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40°C zur Trockne. Der erhaltene weiße Feststoff wird in

030063/0898

302A369

100 ecm Äthylacetat von 40⁰C aufgenommen, bis zur Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgeschieden, erneut in 50 ecm 0,InChlorwasserstoff säure trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält 2,o9 g Benzy 1-Nt^ -/~N- (0 -benzyl-N-lauroyl-L-alanyl ϊ- I -D-glutamyl_7-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat.

Rf = 0,80 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol (9-1 Vol)_7

Man löst 2,65 g Benzyl-N^-^-(0-benzy 1-N- (N-lauroyl-L-alanyl)- 0 -D-glutamyl_7-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in 265 ecm Essigsäure. Man fü^'t 2,65 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h ein. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne erhält man 1,81 g No^-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7-L-lysin, das identisch mit dem im Beispiel 1 erhaltenen Produkt ist.

Das Benzy1-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat kann hergestellt werden nach der Methode 7on T. Shiba et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 33, 1721 (1960).

Beispiel 3

Man fügt 3,17 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei etwa 10⁰C gehaltenen Lösung von 11,96 c Benzy1-N-lauroyl-L-alanyl-od-D-glutamat in einem Gemisch von 490 ecm Dioxsn und 3,43 ecm Triäthylamin. Die Lösung wird 20 Minuten bei etwa 1O°C gerührt, und anschließend fügt man eine Lösung von 8,87 g N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid von 88,8 % (Perchlorsäurebestimmung) in einem Gemisch von 219 ecm Wasser und 24,4 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei einer Temperatur von etwa 10°C und anschließend 15 h

Q30063/0898

bei einer Temperatur von etwa 2O°C gerührt; es wird anschließend filtriert. Zu dem Filtrat fügt man 360 ecm Wasser und trennt durcn Filtrieren einen gebildeten geringen unlöslichen Anteil ab. Das Filtrat wird durch Zusatz von 49 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 angesäuert. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren entfernt, dreimal mit insgesamt 750 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 16,3 g eines weißen Pulvers, das man an 800 g neutralem Siliciumdioxxdgel (0,063 0,20 mm), die in einer Säule von 6 cm Durchmesser enthalten sind, chromatographiert. Hierzu löst man die 16,3 g des Pulvers in 800 ecm Methanol und fügt zu der erhaltenen Lösung 160 g Fontainebleau-Sand. Man verdampft das Gemisch unter verringertem Druck (20 nraiHg; 2,7kPa) bei 60⁰C zur Trockne und beschickt den so erhaltenen Rückstand auf die Siliciumdioxidsäule. Man eluiert nacheinander mit 1 1 Äthylacetat, 4 1 eines Gemischs von Äthylacet? c-Methanol (9-1 VoI) ,71 eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (85-15 VoI) und 4 1 eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 250 ecm sammelt. Die Fraktionen 45 - 60 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 9,4 g N²-/~C)¹-Benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl) - i -D-glutcunyl_7-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamJ no-pimelinsäuremonoamid.

Rf =0,83 / Siliciumdioxxdgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (5C-2O-6-24 VoI)J

Man löst 4,07 g N²-/~O¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_7~N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimfc.linsäuremonoamid in 200 ecm Essigsäure. Man fügt 4 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 7 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) zur Trockne bei 60⁰C wird die erhaltene Meringe mit insgesamt 45 ecm Methylcyclohexan aufgenommen und jedesmal unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60⁰C zur Trockne gebracht. Das so er-

030063/0 898

haltene Pulver wird unter verringertem Druck (0,3 itimHg; 0,04 kPa) bei 50°C getrocknet. Man erhält 2,76 g N -(N-Lauroyl-L-alanyl- /-D-glutamyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid. Rf=0,49(Siliziumdioxidgel ;Essigsäure) ;

Analyse: berechnet: %C 56,72 H 8,64 N 12,25 ' gefunden : .53,4 8,5 10,9

Nach der Gesamthydrol/se zeigt die Analyse am Tachnikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren: AIa 1,00 (Theorie = 1)

Dap 0,99 (Theorie = 1)
GIu 1,O5 (Theorie = 1)

Das N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

des Dihydrochlorids von Zu einer Lösung von 9,^7^ DD,LL-2,6-Dianino-pimelinsäure-monoamid in 63 ecm Wasser, die durch Zusatz von 37 ecm 1n-Natriumhydroxid auf den pH-Wert 10 gebracht worden war, fügt man 4,35 g Kupfer-II-bromid, gelöst in 44 ecm Wasser. Man rührt das Reaktionsgemisch 2 h bei etwa 20⁰C. Man trennt durch Filtrieren einen laichten unlöslichen Anteil ab und kühlt anschließend das Filtrat auf eine Temperatur von -3 bis 0⁰C. Man fügt 9,2 g Natriuitibicarbonat zu und anschließend trrpfenweise während 30 Minuten 7,y ecm Benzylchlorformiat, Das Reaktior.sgemisch wird 18 h bei einer Temperatur von etwa 20⁰C gerührt. Die gebildete blaue Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 15 ecm Wasser, zweimal mit insgesamt 30 ecm Äthanol und mit 15 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C erhält man 9,6 g des Kupfer-IX-komplexes von N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäurc-monoamid, der man zu 60 ecm InChlorwasserstoff säure fügt. Man rührt 1 h bei einer Temperatur von etwa 20⁰C. Ein unlöslicher Anteil wird durch Filtrieren abgetrennt. Zu dem Filtrat fügt man 30 ecm Methanol und leitet anschließend einen Schwefelwasserstoffstrom während 1,5 h durch. Man läßt 16h stehen. Die erhaltene schwarze Brühe wird filtriert und viermal mit insgesamt 160 ecm Wasser gewaschen. Die Filtrate werden vereint, bis auf ein Volumen von 30 ecm unter

030063/0 89 8

verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 5O°C konzentriert, durch Zusatz von 7,5 ecm Triäthylamin auf den pH-Wert 9 gebracht und mit 20 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 5,5 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 6 gebracht. Die so erhaltene weiße Brühe wird 2 h bei O⁰C stehengelassen. Das Produkt, das durch Filtrieren abgetrennt wird, wird nacheinander mit 20 ecm Wasser und 20 ecm Äthanol gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet. Man erhält so 5,8 g N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid von 96 % (Perchlorsäurebest-Lmmung) .

Das Dihydrochlorid von DD,LL-2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 83 g DD,LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäuremonoamid in einem Gemisch von 1,6 1 Methanol und 14,6 ecm konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (d = 1,19). Man fügt 83 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen Wasserstoff strom während 10h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60°C zur Trockne erhält man 40,5 g des Dihydrochlorids von DD,LL-2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamid in Form einer Meringe.

Das DD,LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 168 g Monobenzylester der DD,LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylamino7pimelinsäure in 1,68 1 Methanol. Man kühlt diese

Lösung auf etwa 0⁰C ab und sättigt sie mit Ammoniak. Wenn sie gesättigt ist, füllt man sie in drei Autoklaven von 1 1 um. Nach dem Schließen der Autoklaven läßt 40 h bei etwa 20°C stehen. Nach dem Entgasen wird die so erhalten Lösung unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60⁰C konzentriert. Der Rückstand wird in 2 i Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wird durch Zusatz von 4n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 gebracht.

030063/0898

Es bildet sich eine gummiartige Ausfällung, die man durch Dekantieren isoliert, mit 2 1 Äther trituriert, durch filtrieren abtrennt und zweimal mit insgesamt 400 ecm Äther und zweimal mit insgesamt 400 ecm Wasser wäscht. Nach dem'Trocknen erhält man 83,5 g DE,LL-2,e-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäure-monoamid vom Fp = 145-15O°C.

Rf = 0,69 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Äthanol-Wasser-konzentrierter Ammoniak (4-4-1-1 VoI)_7

Der Eanzylmonoester vco. DD,LL-2,6-Dibenzyloxycarbonyl-aminopimelinsäure kann hergestellt werden nach der Methode von A. Arendt et al.. Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, 1305 (1974) /"Chem. Abstr., 82, 31497 g (1975)_7-

Beispiel 4

Man fügt 0,81 ecm Isoljutylcl'ilorformiat in eine bei -5°C gehaltene Lösung von 2,5 g N-Lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamin in 150 ecm Dimethylformamid und 0.87 ecm Triätnylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5 C gerührt, and anschließend fügt man eine auf +2⁰C gekühlte Lösung von 2,02 g N⁶-Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6 diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 6 2,5 ecm Wasser und 6,25 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei O⁰C und anschließend 18 bei etwa 20⁰C gerührt. Es wird schließlich filtriert. D?s Filtrat wird durch Zusatz von 300 ecm Wasser verdünnt und d^rch Zusatz vo^ 15 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die erhaltene Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 30 ecm Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält so 2,03 g des weißen Feststoffs, zu dem man 680 mg einer Verbindung fügt, die unter analogen Bedingungen erhalten wurde. Das Gemisch wird in 30 ecm Essigsäure gelöst, die 5 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04 - 0,063 mm) enthält. Man konzentriert

030063/0898

zur Trockne und bringt anschließend den Rückstand auf eine Säule von 2 cm Durchmesser auf, die 60 g neutrales SiIiciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 400 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Essigsäure (9-1 VoI), 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (7-3 VoI), 1t>0 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI) und 480 ecm ITosigsäure, wobei man Fraktionen von 40 ecm gewinnt. Die Fraktionen 17-49 werden vereint

ο — und zur Trockne konzentriert. Man erhält se 1,78 g N-/ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl_/-N -benzyloxycarbonyl-DΌ,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,65 / Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure-(3-1- Vox)_7

2 — —

Man lost 1,76 g N-/ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl_/-N benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 80 ecm Essigsäure. Man fügt 1,76 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium} hinzu und leitet anschließend einen Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Nach dem Filtrieren wird das Filtrat auf etwa 5 ecm konzentriert und durch Zusatz von 100 ecm Äther verdünnt. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 40 ecm Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 1,37 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-aL
2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

hält 1,37 g N-/ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyi_/-DD,LL-

Rf = 0,40 /"siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoY)J

Das iT-Lauroyl-L-al?nyl-D-isoglutamin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 6,6 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat in 330 ecm Essigsäure. Man fügt 6,6 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu' und leitet einen leichten i.'asserstoffstrom während 2 h hindurch. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemischs gießt man das Filtrat in 3 1 Wasser. Nach 2 h Stehen bei 0⁰C

030063/0898

wird die erhaltene Ausfällung durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 80 ecm Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält so 5,16 <-j eines Produkts, zu dem man 0,5 g eines unter analogen Bedingungen erhaltenen Produkts fügt. Dieses Gemisch wird in 90 ecm siedendem Methanol gelöst und zu de·»- erhaltenen Lösung fügt: man 45 ecm Was:er. Nach 2stündigem Stehen bei einer Temperatur von etwa 20⁰C werden die erhaltenen Kristalle durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 60 ecm Wasser gewichen und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) getrocknet. Man erhält so 5,1 g N-Lauroyl-L-alanyl~D-isoglutamin vom Fp = 163°C.

Rf = 0,18 /"siliciumdioxidgelj Äthylacetat-Methanol (4-1 VoI)_7

Analyse:

berechnete C 60,12 H 9,33. N 10,52 % gefunden: C 60,2 H9,5 N 10,9 %

Das Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 2,54 ecm Isobutylchlcrformiat zu einer bei 0°C gehaltene.i Lösung von 3,9 g Laurinsäure in 156 ecm wasserfreiem Toluol und 2,7 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0°C gerührt und anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von 6,7 g des Hydrochlorids von Berzyl-L-alanyl-D-isoglutaminat in 52 ecm Wasser und 2,7 ecm Triäthylamin zu» Das Reaktionsgemisch wird 65 h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Man erhält eine Reaktionsmasse von gelatineartigem Aussehen, zu der man 150 ecm Äthyla^etat fügt.Die Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 30 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 7,6 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat in Form eines weißen Pulvers. Die wässrige Phase des vorstehenden FiI-trats wird zweimal mit insgesamt 100 ecm Äthylacetat extrahiert, diese Äthylacetatphase wird mit der organischen Phase des FiI-trats vereint, mit 125 ecm 0,in-Chlorwasserstoffsäure und 120 ecm

030063/0898

Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält erneut 1,5 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat. Das Produkt (7,6 g und 1,5 g) wird in 120 ecm Methanol umkristalPisiert. Man erhält so 6,6 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat vom Fp = 169°C.

Rf = 0,13 /"siliciumdioxidgel; Äthyl =icetat_7

Das Hydrochlorid von Benzyl-L-alanyi-D-isoglutaminat kann hergestellt werden nach S. Kusumoto, Bull. Chem. Soc. Japan 49, 533 (1976).

Beispiel 5

Man fügt 0,91 ecm Isobutylchlorformxat in eine bei 0°C gehaltene Lösung von 3,04 g Benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-od-D-glutamat in 150 ecm Tetrahydrofuran und 0,98 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 2°C gekühlte Lösuny von 2,26 g N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-ciamino-piirie.linsäure-monoAmid in einem Gemisch von 70 ecm Wasser und 7 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei 0°C gerührt und anschließend 20 h bei ein^ar Temperatur von etwa 20⁰C. Das Tetrahydrofuran wird schließlich unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C verdampft. Das Konzentrat wird durch Zus-j.cz von 50 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 10 ecm In-Chlorwasserscoff^äure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die erhaltene weiße Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 75 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 4,73 g eines weißen Feststoffs, der an einer Säule von 2,2 cm Durchmesser, die 100 g neutrales Sxliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, chromatographiert. Hierzu wird das Produkt in 20 ecm Essigsäure gelöst.

030063/0898

Zu der erhaltenen Lösung fügt man 10 g neutrales Siliciiimdioxidgel und konzentriert unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne. Der so erhaltene Rückstand wird auf die Säule aufgebracht und man eluiert nacheinander mit 280 ecm Äthylacetat, 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2-Vo];, 160 cera Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm gewinnt. Die Fraktionen 13-23 werden vereint und unter verringertem Eiuck (20 miTHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält ein Öl, das in Äther Test wird. Nach dem

2 Abtrennen durch Filtrieren und Trocknen erhält man 2,84 g N /~0 -Benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl)- J -D-glutamyl_7-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,68 / Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 Vol)_7

Man löst 2,82 g N²-/~0¹-Benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_7~N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid in 80 ecm Essigsäure. Man fügt 2,82 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu, und anschließend leitet man einen Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Nach clt-m Filtrieren wird das Filtrat auf etwa 5 ecm unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C konzentriert und durch Zusatz von 100 ecm Äther verdünnt. Man erhält eine Ausfällung, die durch Filtrieren abgetrennt, mit 20 ecm Äther gewaschen und schließlich getrocknet wird. Man erhält so 2,0 g N -/ N-(N-Octanoyl-L-alanyl)-. J -D-glutamyl_/-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid vom Fp = 160 - 164°C (schmieriges Schmelzen).

Rf = 0,30 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 52,58 H 8,02 N 13,58 % gefunden: C 53,05 H 8,17 N 13,06 %

030063/0898

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

Ala I₇OO (Theorie = 1)
Dap 0,95 (Theorie = 1)
GIu 1,02 (Theorie = 1)

Das Benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-ed-D-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 3,6 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -1 C gehaltenen Lösung von 3,95 g Octansäure in 140 ecm Tetrahydrofuran und 3,8 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -1°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0°C gekühlte Lösung von 9,45 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl- &£.-D-glutamat in einem Gemisch von 54,8 ecm 1n-Natriumhydroxid und 30 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei -1 C gerührt und anschließend 20 h bei etwa 20°C. Es wird anschließend durch Zusatz von 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Das Tetrahydrofuran wird unter verringertem Drack (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45 C verdtmpft, und anschließend wird das Konzentrat mit "\00 ecm Äthylacetat extrahiert. Die so erhaltene organic ehe Phase wird zweimal mit insgesamt 50 ecm In-Chlc^wasserstoffsäure und mit 25 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne kenzentriert. Man erhält so 10 g eines blaßgelben Öls, das man an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser chromatographiert, die 200 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,063-0,20 mm) enthält. Man eluiert mit Äthylacetat, wobei man Fraktionen von 100 ecm gewinnt. Die Fraktionen 7-9 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 100 ecm eines Äther-Petroläthergemischs (Kp = 35-60⁰C) (1-4 VoI) trituriert, durch Filtrieren abgetrennt and getrocknet. Man erhält so 3,27 g Benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-(/-D-glutamat in der Form eines weißen Pulvers.

030063/0898

Rf = 0,56 I Siliciuindioxidgel; Äthylacetat-Methanol (8-2 VoI) J

Beispiel 6

Man fügt 0,70 ecm Isobutylchlorformiat in eine bei 2°C gehaltene Lösung von 2,91 g Benzyl-N-palmitoyl-L-alanyl-oci -D-glutamat in 120 ecm Tetrahydrofuran und 0,75 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 2°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 2°C gekühlte Lösung von 1,726 g N -Benzyloxycar-

-monoamid bonyl-DD,LL-2, 6-diamino-pimelinsäureT"in einem Gemisch von 53,4 ecm Wasser und 5,34 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei 2°C und anschließend 18h bei einer Temperatur von etwa 20⁰C gerührt. Das Tetrahydrofuran wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7kPa) bei 50°C verdampft. Das Konzentrat wird durch Zusatz von 50 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 10 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die erhaltene weiße Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mJt insgesamt 75 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 4,15 g eines weißen Feststoffs, der an einer Säule von 3 cm Durchmesser, die 85 g .uautrales Siliciumdiox:.dgel (0,04-0,063 mm) enthält, chroma tographiert. Hierzu wird die Verbindung in Essigsäure von 60⁰C gelöst. Zu der erhaltenen Lösung fügt man 10 g neutrales Siliciumdioxidgel und konzentriert anschließend unter verringertem Druck (20 mmHg) bei 50°C. Der so erhaltene Rückstand wird auf die ' säule aufgebracht und man eluiert nacheinander .alt 320 ecm Äthylacetat, 360 ecm Äthylacetät-Essigsäure (9-1 VoI), 320 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm gewinnt. Die vereinten Fraktionen 14 - 22 werden unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert.

Der erhaltene Rückstand wird in 50 ecm Äther triturierr, durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Man erhält so 2,20g N ~{Q ■ Benzyl-N- (N-palmitoyl-L-alanyl)- <9-D~glutamyl_7-N -benzyloxycar-

030063/0898

bonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,75 /"Siliciumdioxidgelr Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI) J

Man löst 2,14 g N²-/~O¹-Benzyl-N- (N-palmitoyl-L-alanyl)- /^-D-glutamyl_7-N -benzyloxycarbony1-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid in 80 ecm Essigsäure. Man fügt 2,14 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu und leitet anschließend einen langsamen Wasserstoffstrow während 2,5 h hindurch. Nach dem Filtrieren wird das Filtrat unter einem verringertem Druck (20 mmHg;

2.7 kPa) bei 50°C auf etwa 5 ecm konzentriert und durch Zusatz von 100 ecm Äther verdünnt. Man erhält eine Ausfällung, die man durch. Filtrieren abtrennt, zweimal mit insgesamt 20 ecm Äther wäscht und trocknet. Man erhält so 1,58 g N -/ N-(N-Palmitoyl- L-alanyl)-\ -D-glutamyl_/-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,30 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das Benzyl-N-palmitoyl-L-alanyl-o^ -D-glutamat k.nnn auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 3,6 ecm Isobutylchlorformiat in eine bei 0 C gehaltene Lösung von 7,03 g Palmitinsäure in 140 ecm Tetrahydrofuran und

3.8 ecm Triäthylamin. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei

0 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf O⁰C gekühlte Lösung von 9,45 ο des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-o^-D-glutamat in einem Gemisch von 54,8 ecm 1n-Natriumhydroxid und 30 ecm Wasser zu. Pas Keaktionsgemisch wird 1 h bei O⁰C und anschließend 18h bei etwa 20⁰C gerührt. Es wird anschließend durch Zusatz von 70 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert

1 angesäuert. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, fünfmal mit insgesamt 200 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 12,11 g eines weißen Pulvers, das man an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser, die 200 g neutrales

030063/0898

Siliciumdioxxdgel (0,063-0,20 mm) enthält, chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 200 ecm Äthylacetat, 300 ecm Äthylaceta-c-Methanolgemisch (9-1 VoI), 1 ,6 1 Äthylacetat-Methanolgemisch (8-2 VoI), 400 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (6-4 VoI), wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 5-23 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2;7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 5,18 g eines Feststoffs, den man in 50 ecm siedendem Äther während 1/2 h trituriert. Nach dem Abkühlen auf eine Temperahur von etwa 20 C wird der unlösliche Anteil durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 75 ecm Äther gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält so 2,94 g Benzyl-N-palmitoyl-L-alanyl-oL-D-glutamat.

Rf = 0,77 l_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

Beispiel 7

Man fügt 1,3 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 4,91 g Benzyl-N-lauroyl-L-ala^yl-<^-D-glutamat in einem Gemisch von 250 ecm Tetrahydrofuran und 1,4 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von 3,32 g des Hydrochlorlds von Methyl-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in einen Gemisch von 10 ecm 1n-Natriumhydroxid und 10 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa -5°C gerührt und anschließend 4 Tage bei einer Temperatur von etwa 20°C. Anschließend wird das Reaktionsgemisch durch Zusatz von 20 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C. Das Konzentrat wird fünfmal mit insgesamt 150 ecm Chloroform extrahiert. Die Chloroformphasen werden vereint, mit 40 ecm 0,1-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrie-

0300S3/0898

ren unter verringertem Druck (20 ramHg; 2,7 kPa) bei 5O°C zur Trockne erhält man ein blaßgelbes Öl, das man in 60 ecm Chloroform löst, die 15 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthalten. Man konzentriert das Gemisch zur Trockne und bringt das Ganze auf: eine Säule von 3 cm Durchmesser auf, die 150 g neutrales Siliciumdioxidgel· (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 2,5 .L Äthylacetat und 400 ecm Äthylacetat-Essig έäuregemisch (95-5 VoI), wobei man Fraktionen von 100. ecm gewinnt. Die Fraktionen 6-27 werden vereint, unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 3,47 g Kethyl-Noc -/~0¹-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- ( -D-glutamyl_7-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in der Form eines weißen Pulvers.

Rf = 0,70 l_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (95-5VoI)_J

Rf = 0,40 j_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

— 1 J

Man löst 3,43 g Methyl-Nai-/ 0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyx)-/-D-glutamyl_/-N<£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in 70 ecm Essigsäure. Man fügt 3,43 gtalladium auf Kohle (3 % Pa^adium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2 h durch. Der Katalysator wird d^.rch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 20 ecm Essigsäure gewaschen, die Filtrate werden vereint und zur Trockne konzentriert unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C. Der so erhaltene Rückstand wird in 50 ecm Äther trituriert. Man erhält so ein Pulver, das man durch Filtrieren abtrennt und an der Luft trocknet. Man erhält so 1,89 g Methyl-No^-^~N-(N-:aviroyl-L-alanyl)- ζ -D-glutamyl_7-L-lysinat.

Rf = 0,50 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Rf = o,29 (Siliciumdioxidgel; Essigsäure)

030063/0898

Beispiel 8

Man fügt 1,6 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 6,07 g BenzyJ-N-lauroyl-L-alanyl-od-D-glutamat in einem Gemisch von 280 ecm Tetrahydrofuran und 1,74 ecm Tr iäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5 C gerührt. Anschließend fügt man eine auf 3 C gekühlte Lösung von 4 g N Benzyloxycarbonyl-meso-2 (L)^ 6 (D)-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 12,4 ecm 1n-Natriumhydroxid und 124 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa 0 C und anschließend 70 h bei etwa 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend durch Zusatz von 20 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C. In dem Konzentrat tritt eine weiße Ausfällung auf, die man durch Filtrieren abtrennt, dreimal mit insgesamt 150 ecm 0,1n-Chlorwasserstoffsäure und dreimal mit insgesamt 150 ecm Wasser wäsche und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C trocknet. Man erhält so 9,15 g eines weißen Pulvers, das man in 100 ecm Essigsäure, die 20 g neutrales Siliciumdioxidgel (Ο,Οί-0,063 mm) enthälc, löst. Man konzentriert das Genisch sur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säul? von 5 cm Durchmesser auf, die 400 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält.

Man eluiert nacheinander mit 1,6 1 Äthylacetat, 900 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (97,5-2,5 VoI), 1200 ecm Äthylacetat-Essi jiL-äuregemisch (95-5 VoI) _a 900 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (92,5-7,5 vol),, 900 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (90-10 VoI), 300 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (85-15 VoI), 3200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (80-20 VoI), wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 61-90 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene weife Feststoff wird zweimal mit insgesamt 100 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 60°C getrocknet. Man erhält

030063/0898

- 54 - . 3Q24369*

2-1 V-

so 6,3 g N -/ 0 -Benzyl-N-fN-lauroyl-L-alanyl)-i -D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-meso-2(L),6(D)-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf - 0,77 ^"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI) J

Man löst 8,δ g N -[O -Benzyl-N- (N-lauroyl-L-elanyl)- ί -D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-meso-2(L),6(D)-diamino-pimelinsäuremonoamid in 225 ecm Essigsäure. Man fügt 8,2 g Palladium auf Kohle (3 % Palladivjn) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffs trom während 3,5^-hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°c zur Trockne wird das erhaltene Öl in 100 ecm Äther bis zu völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmH.g; 0,04 kPa) bei 50°C getrocknet. Man erhält so 5,9 g eines Pulvers. 0,9 g dieses Pulvers werden gelöst in Essigsäure und über eine Säule von neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) von 2 cm Durchmesser und 2 cm Höhe filtriert. Das Filtrat wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird mit 50 cc*u Äther aufgenommen, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0.3 mmHg; 0,04 kPa) bei 55°C getrocknet. Man erhält so 0,75 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl) - Jf -D-glutair,yl_7-meso-2 (L) , 6 (D) -diamino-pimelinsäurc-monoamid.

Rf = 0,38 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (5O-2C-6-2V- VoI) J

Analyse:

berechnet: C 56,72 H 8,64 N 12,25 % gefunden: C 52,8 H8,1 N 11,6 %

Schwefelsäureasche = 6,9 %

Nach der Gesamthyclrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoana-

^; 030063/0898

lysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

Ala 1,02 (Theorie = 1)
Dap 0,96 (Theorie = 1)
GIu 1,00 (Theorie - 1)

Das N -Benzyloxycarbonyl-meso-2(L),0(D)-diamino-pimelinsäurexnonoamid kann hergestellt werden nach dem in der BE-PS 321 385 beschriebenen Verfahren.

Beispiel 9

Man fügt 0,65 ecm Isobutyl-chlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 2,383 g Benzyl-N-undecanoyl-L-alanyl-o^-D-glutamat in einem Gemisch von 100 ecm Tetrahydrofuran und 0,7 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 30 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0 C gekühlte Lösung von 1,617 gN Benzylox7carbonyl-Il,,DD-2,6-diainino-pinielinsäure-monoamid in einem Gemisch von 5 ecm 1n-Natriumhydroxid und 50 ccr.i Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei etwa 0 C und anschliessend ^c40 h bei etwa 20⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C. In dem Konzentrat tritt eine Ausfällung auf, dip man durch Filtrieren abtrennt, dreimal mit insgesamt 60 ecm 0,1n-Chlorwasserstoffsäure und ⁰O ecm Wasser wäscht. Nach dem Trocknen unter verringertem Druck (0,3 mmHg? 0,04 kPa) bei 20⁰C erhält man 3,66 g eines weißen Feststoffs, den man in 20 ecm Essigsäure löst, die 10 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg;2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3,5 cm Durchmesser auf, die 75 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 600 ecm

030063/0898

Äthylacetat-Cyclohexangemisch (1-1 VoI), 600 ecm Äthyiacetat-Cyclohexangemisch (3-1 VoI), 400 ecm Äthylacetat _t 600 ecm Äthylacet^t-Essigsäuregemisch (95-f VoI), 500 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 1200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (85-15 VoI),wobei man Fraktionen von 100 ecm gewinnt. Die Fraktionen 22 - i2 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mitiHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzer.triert. Der erhaltene amorphe Feststoff wird mit 80 ecm Äther aufgenommen _r bis zur völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und verringertem Druck (0,3 itimHg; 0,04 kPa) getrocknet.

2-1 /

Man erhält so 2,58 g N -£ 0 -.Benzyl-N- (N-undecanoyl-L-alanyl)-1 -D-glutamyl_7~N -benzyloxycarbonyl-LI^DD^^-diamino-pimelinsäuremonoamid.

Rf = 0,62 l_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (9-1 Vol)_7

2—1 J

Man löst 2,55 g N -/ 0 -Benzyl-N-(N-undecanoyl-L-alanyl)-^ -D-glutamyl_/-N -benzy.loxycarbonyl-LL,DD-2 ,6-diamino-pimelinsäuremonoamid in 35 ecm Essigsäure. Man fügt 2,55 g Palladium auf Kohle (3 % palladium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Der Katalysator wird durch Filtrieren abgetrennt und dreimal mit insgesamt 30 ecm Essigsäure gewaschen. Das FiItrat wird unter verringertem Druck (20 irimHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der

Äther
amorphe Feststoff wird mit 50 ccm/aufgenommen, filtriert und untei verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C getrocknet. Man erhält so 1,87 g N²-/~N-(N-Undecanoyl-L-alanyl)-0-D-glutamyl_/-LL,DD-2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid.

Rf = 0,75 (Siliciumdioxidgels; Essigsäure).

Das Benzyl-Lf-undecanoyl-L~alanyl-öi--D-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt*3,56 ecm loobutylchlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 5,1 g ühdecansäure in einem Gemisch von

030a&3/0898

140 ecm Tetrahydrofuran und 3,84 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5 C gerührt und anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von 9,45 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-cCD-glutamat in einem Gemisch von 54,8 ecm 1n-Natriumhydroxid und 30 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa -5°C und anschließend 20 h bei etwa 20 C gerührt. Das Keaktionsgemisch wird anschließend durch Zusatz von 60 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäu^e auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mrnHg; 2,7 kPa) bei 50°C. Das Konzentrat Wird zweimal mit insgesamt 80 ecm Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphasen werden vereint und mit 40 ecm Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man 11,89 g eines Öls, das man einer Säule von 4,5 cm Durchmesser chromatographiert, die 250 g neutrales Sxliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert mit Äthylacetat, wobei man Fraktionen von 100 ecm gewinnt. Die Fraktionen 3-5 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C zur Troclme konzentriert. Man erhält so 5,85 g eines pastenförmigen Fest&toffs, den man an einer Säule von 3 cm Durchmesser, die 115 g neutrales Silici.umdioxidgel (0,04-0,063 mm)enthält, Chromatographiert. ilan eluiert nacheinander mit 1 1 eines Gemischs von Äthylacetat-Cyclohexan (1-1 VoI), 1,7 1 Äthylacetat und 600 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (99-1 VoI), wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 11 - 30 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmllg; 2,7 kPa) bei 50°C zu. Trockne konzentriert. Man erhält so 2,47 g Benzyl-N-und'ecanoyl-L-alanyl-c^-D-gl itamat in der Form eines weißen Feststoffs.

Rf = 0,71 l_ Sxliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (9-1 Vol)_7

030063/0898

Beispiel 10

Man fügt 0,69 ecm Isobutylchlorformiat zu einer auf -5 C gehaltenen Lösung von 2,57 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl- id-D-in einem Gemisch von 120 ecm Tetrahydrofuran und 0,74 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0°C gekühlte Lösung von 1,7 g N -Benzyloii7carbonyl-JL-2, 6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 5,2:} ecm in-Natriumhydroxid und 35 ecm Wasser hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei etwa -3°C und anschließend 22 h bei etwa 20°C gerührt. Anschließend säuert man durch Zusatz von 20 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wext 2 an. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 60 ecm 0,1n-Chlorwasserstoffsäure und dreimal mit insgesamt 60 ecm Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen an der freien Luft erhält man 3,97 g eines weißen Pulvers, das man an 200 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm), das in einer Säule von 3,8 cm Durchmesser enthalten ist, chromatographiert.

Man eluiert nacheinander mit 600 ecm Äthyl ace te.-^, 500 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), 800 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm gewinnt. Die Fraktionen 24-30 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mitiFg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Das erhaltene öl wird mit 100 ecm Äther aufgenommen, bis zur völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 1,24 g N²-/~0 -T^nzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7-N ■ benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,85 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Rf = 0,76 /■ SilJciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI)_7

030063/0898

2 _ ι _

Das N -/ N-(-N-Lauroyl-L-alanyl)- J -D-glutamyl_/-LL-2,6-diaminopimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 1,36 g N²-/~O¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 40 ecm Essigsäure. Man fügt 1,4 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom 4 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 55°C zur Trockne wird das erhaltene öl mit 100 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und an der Luft getrocknet. Man erhält so 0,96 g N -/ N-(N- Lauroyl-L-alanyl)-t -D-glutamyl_7-LL-?,6-diamino-pimelinsäuremonoamid.

Rf = 0,38 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das N -Beni2Vloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Zu einer Lösung von 5 g des Dihydrochlorids von LL-2,6-Dianunopimelinsäure-monoamid in 15 ecm Wasser, das durch Zusatz von 45 ecm 1n-Natriumhydroxid auf den pn-Wert 10 gebracht worden v;ar, fügt man 2,14 g Kupfer-II-bromid, gelöst in 20 ecm Wasser. Man rührt das Reaktiopsgemisch 2 h bei etwa 20⁰C. Man trennt einen geringen unlöslichen Anteil durch Filtrieren ab und kühlt anschließend das Filtrat auf eine Temperatur von -3 C bis O⁰C ab. Man fügt 4,8 g Natriumbicarbonat und anschließend tropfenweise während 30 Minuten 4,1 ecm Benzylchlorformiat zu. Das Reaktionsgemisch wird 18h bei einer Temperatur von etwa 20 C gerührt. Die gebildete blaue Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 90 ecm Wasser, dreimal mit insgesamt 90 ecm Äthanol und dreimal mit insgesamt 90 ecm Äther gewaschen. Nach dein Trocknen unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C erhält man 4,18 g des Kupfer-II-komplexes, von

030 0 63/0898

- 6C -

N -Benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid, den man zu 28 ecm 1-n-Chlorwasserstoffsäure fügt. Mari rührt 1 h bei einer Temperatur von etwa 20⁰C. Ein unlösliches Material wird durch Filtrieren abgetrennt. Zu dem Filtrat fügt man 14 ecm Methanol und ιaitet anschließend.einen Schwefelwasserstoffstrom während 6 h durch. Man läßt. 16 h stehen. Die s.chwarze erhaltene Brühe wird filtriert .und dreimal mit insgesamt 15 ecm Wasser gewaschen. Die vereinten Filtrate werden bis auf ein Volumen von 10 ecm unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPaf bei 50°C konzentriert, durch Zusatz von 5 ecm Triäthylamin auf den pH-Wert 7 und durch Zusatz von 5 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 6,8 gebracht. Die so erhaltene weiße Brühe wird zwei Stunden bei 0°C stehengelassen. Das Produkt, das durch Filtrieren abgetrennt wird, wird nacheinander dreimal mit insgesamt 30 ecm Wasser, dreimal mit insgesamt 30 ecm Äthanol und dreimal mit insgesamt 30 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen bei 60°C unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) erhält man 1,78 g N -Benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

fuj ²° = +11° 'd = 1, In-HCl)

Rf = O_r45 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wass'er (50-20-6-24 VoI)J.

Das Dihydrochlorid von LL-2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden: .

-amino Man löst 17g LL-2,6-Dibenzyloxycarbonyl!^ir,:elinsäure-monoamid in 300 ecm Methanol und 5,9 ecm.konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (d = 1,19). Man fügt 17 g Palladium auf Kohle- (3 % Palladium) hinzu und leitet während 4 h einen Wasserstoffstrom durch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 55°C zur Trockne erhält man 8,8 g des Dihydrochlorids vor> LL-^^e-Diaraino-pimelinsäure-monoamid in der Form einer Meringe^.

Das LL-2/6-Dibenzyloxycarbonylamino-piinelinsäure-inonoainid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

2 6

Man löst 19g saures Benzyl-LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-diamino-pimelat in 190 ecm Methanol. Man kühlt diese Lösung auf etwa O⁰C ab und sättigt sie mit Ammoniak. Wenn sie gesättigt ict, bringt man sie in einen 1 1-Autoklaven ein. Nach dem Schließen diesea Autoklaven läßt man 6 Tage bei etwa 20°C Stehen. Nach dem Entgasen wird die so erhaltene Lösui.j unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 5ü°C konzentriert. Der Rückstand wird in 250 ecm Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wird durch Zusatz von 30 ecm 4n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-~Wert 2 gebracht, dreimal mit insgesamt 300 ecm Äthylacetat extrahiert; diese organische Phase wird mit 100 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 17 g LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylaminopimelinsäure-monoamid in Form eines Öls.

Rf = 0,68 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoIjJ.

Das saure Benzyl-LL-N ,N -dib3nzyloxycarbonyl-2,6-diamino-pimelat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 55 g Benzyl-LL-N ,N -dibenzyioxycarbonyl-2,6-diami^opimelat in 400 ecm Benzylalkohol, der auf 40 C angewärmt ist. Anschließend gießt man auf diese während etwa 1 h bei 40 C gehaltene Lösung eine Lösung vci 4,8 g Kalium als Plätzchen von 86 % in 400 ecm Benzylalkohol während 6,5 h. Man rührt das Reaktionsmedium weiter während 16h bei etwa 20°C und konzentriert anschließend unter verringertem Druck (0,5 mmHg; 0,07 kPa) bei 90 C zur Trockne. Man erhält so ein Öl, das man in 1 1 Wasser löst und dreimal mit insgesamt 900 ecm Äthylacetat extrahiert. Die so extrahierte wässrige Phase wird durch Zusatz von 45 ecm 4n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 angesäuert, dreimal

030063/0898

mit insgesamt 1,5 1 Äthylacetat extrahiert. Die so erhaltene Äthylacetatphase wird mit 500 ecm einer mit Natriumchlorid gesättigten Lösung gewaschen una über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abtrennen des Natriumsulfats durch Filtrieren fügt man 17 ecm Dicyclohexylamin -⁷U und konzentriert unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40°C zur Trockne. Man erhält ein aalbes Öl, das man in 100 ecm Äthanol löst, zu dem man 100 ecm Wasser fügt. Nach 2Ostündigem Stehen bei 0⁰C erhält man einen weißen Feststoff, den man durch Filtrieren abtrenne, zweimal mit insgesamt 100 ecm Wasser wäscht und in einem Gemisch von 200 ecm Äthylacetat und 200 ecm Wasser aufnimmt. Man säuert die wässrige Phase durch Zusatz von 40 ecm einer 1n-Lösung von Methansulfonsäure an. Nach dem Dekantieren wird die organische Phase zweimal mit insgesamt 100 ecm Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält

2 6
so 15 g saures Benzyl-LL-N ,N -dibenzylcxycarbonyl^^-diaminopimelat in der Form eines Öls.

Rf = 0,76 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyricin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol., J/

Das Dibenzyl-LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl^/o-axamino-pimelat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

In einen 500 ccm-Dreihalskolben, ausgerüstet mit einem zentralen Rührer und einer Dean-Stark-Vorrichtung, fügt man ein Gemisch von 44,7 g L₇L-N^,N -Dibenzyioxycarbonyl-2,6-diamino-pimelinsäure, 3 g p-Toluolsulfonsäure, 30 ecm Benzylalkohol und 300 rem Toluol. Man bringt das Reaktionsgemisch während 5 h zum Rückfluß. Anschließend trennt man 16stündigem Rühren bei 20°C das unlösliche weiße Material durch Filtrieren ab, wäscht es zweimal mit insgesamt 400 ecm einer 5 %igen Natriumcarbonatlösung und zweimal mit insgesaxat 400 ecm Wasser. Nach dem Trocknen an der Luft erhält man 55,4 g Dibenzyl-L,L-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-diamino-pimelat vom Fp = 118°C.

030063/0898

Rf = 0,53 /"siliciumdioxidgel; Essigsäure-Äthylacetat (8-2 Vol)_7

Die L,L-N ,N -Dibenzyloxycarbonyl-2, 6-diamino-pimelinsL"ure kann, hergestellt werden nach der Methode von A. · Arendt et al., Roczniki Chemii. Ann. Soc. Chira. Polonorum 48, 635 (1974).

Beispiel 11 - . '■ . ..

Man fügt 0,91 ecm Isobutylchlorformiat.zu einer bei 0°C gehaltenen Lösung von 3,-14 g Benzyl-N- (3,5,5-trimethylhexanoyl)-L-alanyl-^- D-glutamat in einem Gemisch von 150 ecm Tetrahydrofuran und 0,98 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0⁰C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von 2,26 3 g N -Benzyloxycarboriyl-DD,LL-2,6-diamino-pimc:linsäuremonoamid in oinem Gemisch von 7 ecm 1n*-Natri-umhydroxid und 70 ecm Wasser hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei etwa 0⁰C gerührt und anschließend 20 h bei etwa 22°C. Anschließend entlernt man einen geringen unLöslichen Anteil durch Filtrieren, säuert durch Zusatz von 12 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 an. Man verdampft dar Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 ranHg; 2,7 k?a) bei 50⁰C. Das Konzentrat wird dreimal mit insgesamt 150 ecm Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphasen werden vereint und mit 20 ecm 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man 5,14 g eines arnorphen Feststoffs, den man in 60 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI) , das 1.0- g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, löst. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser auf, die 100 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 400 ecm Äthylacetat, 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI),

030^063/0898

ORIGINAL INSPECTED

160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (6-4 VoI), 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm gewinnt. Die Fraktionen 15-25 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mitiHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Das erhaltene Öl wird mit 50 ecm Äther aufgenommen, bis zur Pulverisieruncf trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 irunHg; 0,04 kPa) getrocknet.

Man erhält so 2,85 g N²- / 0¹-Benzyl-N-/~N-(3,5,5-trimethylhexa-

— •776
noyl)-L-alanyl_/- 0 -D-c;lutamyl > -N -benzyloxycarbonyl-DDjLL^/ödiamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,32 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI)_7

9 Γ 1
Man löst 2,76 g N- J-O -Benzyl-N-/ N-(3,5,5-trimethylhexanoyl)-

j 7 6

L-als:iyl_/- fl -D-glutamyl C-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2 ,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 100 ecm Essigsäure. Man fügt 2,76 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unt°r verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne wird das öl in 50 ecm Äther trituriert. Man erhält eine Ausfällung, die durch nitrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20°C getrocknet wird. Man erhält so 2,07 g N²-/ N-/~N-(3,5,5-Trimethylhexanoyl)-L-alanyl_7-0 -D-glutamylJ -DD,LL-2,G-diaminopimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,32 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Rf = 0,31 (Siliciumdioxidgel; Essigsäure)

Man fügt 4,3 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -6°C gehaltenen Lösung von 7,59 g N-(3,5,5-Trimethylhexanoyl)-L-alanin in einem Gemisch von 400 ecm Tetrahydrofuran und 4,63 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -6°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 3°C gekühlte Lösung von 9,06 ς

030063/0898

des Hydrochloric!^ von Benzyl- ^6-D-glutamat in einem Gemisch von 66,2 ecm In-Natriumhydroxid und 14 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemiach wird 15 Minuten bei -D⁰C gerührt und anschließend 66 h bei etwa 18°C. Es wird anschließend durch Zusatz von 75 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH~W~rt 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C. Das Konzentrat wird fünfmal mit insgesamt 200 ecm Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphasen werden vereint und mit 40 ecm 0,1n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) zur Trockne bei 50°C erhält man 14,8 g eines Öls, das man in 50 ecm Äthylacetat, das 30 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, löst. Man konzentriert das Gemisch unter verringerte:.! Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 2,8 cm Durchmesser auf, die 28Og neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 2 1 Cyclohexan, 1 1 Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (95-5 VoI), 1,5 1 Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (90-10 VoI), 5 1 Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (80-20 VoI), 1,5 1 Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (7O--3O VoI) und 3,5 1 Cyclohexan-Äthylacetatgemiejh (50-50 VoI), wobei man Fraktionen von 500 ecm gewinnt. Die Fraktionen 23 - 29 werden vereint urd untex verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 10,86 g Benzyl-N-(3,5,5-trimethyl-hexanoyl)-L-alanyl-c*?-r-glutamat in der Form eines Öls, das kristallisiert.

Rf = 0,37 l_ Siliciumdioxidgel;Äthylacetat_7

Das N-(3,5,5-Trimethyl-hexanoyl)-L-alanin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 6,5 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 7,912 g 3,5,S-Trimethylhexansäure in einem Gemisch von 125 ecm Tetrahydrofuran und 7 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt

QIfI fl f¹ 'S ίΠΟΟΟ 30υο3/υοϊ3ο

man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 4,495 g L-Alanin in 50 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa O⁰C gerührt und anschließend 18 h bei etwa 25°C. Man verdampft darauf das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPal bei 50⁰C. Das Konzentrat wird zweimal mit insgesamt 40 ecm Äther extrahiert und durch Zusatz von 55 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die ölige Ausfällung, die sich bildet, wird fünfmal mit insgesamt 250 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Athylacetatphasen werden mic 25 ecm gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Troc];ne erhält man 11,79 g eines Öls, das man in 40 ecm Äthylacetat löst, die 20 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,063-0,20 mm) enthalten. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mriHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser auf, die 120 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,063-0,20 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 600 ecm Cyclohexan, 300 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (95-5 VcI), 300 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (90-10 VoI), 300 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (80-20 VoI), 700 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (50-50 VoI), 300 ecm Äthylacetat und 300 ccir. Äthylacetat-Methanolgemisch (90-10 VoI) , wobei man Fraktionen von 100 ecm gewinnt. Die Fraktionen 17-28 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 10,16 g ei^es Öls, das man in 25 ecm Äther löst. Durch Zusatz von 150 ecm Petroläther erhält man ein Öl, das man durch Dekantieren abtrennt. Nach dem Trocknen im Takuum (0,2 mmHg; 0,027 kPa) erhält man 7,59 g N-(3,5,5-Trimethylhexanoyl)-L-alanin.

Rf = 0,43 (Siliciumdioxidgel; Äthylacetat)

030063/089 8

Beispiel 12

Man fügt O₇56 ecm Isobutyl-chlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 2,12 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanin-tfi -D-glut.amat in einem Gemisch von 86 ecm Tetrahydrofuran und 0,6 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 30 Minuten bei -5°C gerührt, und anschliessend fügt man eine auf 2°C gekühlte Lösung von 1,25 g S -t-Butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 4,32 ecm 1n-Natriumhydroxid und 43 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei etwa -5°C geriShrt und anschließend 18h bei etwa 20⁰C. Anschließend säuert man durch Zusatz von 5 ecm einer gesättigen Zitronensäurelösung an. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7k?a) bei 50°C. Das Konzentrat wird fünfmal mit insgesamt 200 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatphasen werden mit 25 ecm Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man ein Öl, das man in einem Gemisch von 50 ecm Äthylacetat und 10 ecm Essigsäure, das 10 g neutrales Siliciumr'ioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, löst. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 2 cm Durchmesser iuif, die 50 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 200 ecm Äthylacetat, 280 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), 320 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm gewinnt. Die Fraktionen 5-13 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 2,23 g N⁶-/~0¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutarnyl_7-

2 ~

N -t-butyloxycarbonyl-LL,DD-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in Form eines Öls.

Rf = 0,39 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Lssigsäure (9-1 VoI)J

Man löst 2,19 g N⁶-/~O¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /"-D-gluta-

Q30063/0898

myl_7~N -t-butyloxycarbonyl-DD,LL-2_/6-diainino-pimelinsäuremonoamid in 22 ecm einer wasserfreien gesättigten Chlorwasser-

o Stoffessigsäurelösung. Man läßt 3 h bei 20 C im Kontakt und konzentriert anschließend unter verringertem Druck (20 mmHg; 2/7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne. Man erhält so 1,74 g des Hydrochlorids von N -£~0 -Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_/-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in der Form ei^os teilweise kristallisierten Öls.

Rf = 0/47 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (5o-20-6-24 VoI)J

Rf = 0,26 / Siliciumdioxidgel; Essigsäure_7

Das N -t-Butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

0 G

Man löst 4 g N -t-Butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DD/LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 100 ecm Essigsäure. Man fügt 4 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h hindurch. Der Katalysator wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 10 ecm Essigsäure gewaschen und die Filtrate werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene ölige Rückstand wird in 50 ecm Äther bis zur völligen Pulverisierung trituriert. Man erhält so nach dem .Filtrieren

2
und Trocknen 3 g N -t-Butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoarnid;

Rf =0,34 /"siliciumdioxidgel; Essigsäure_/

Beispiel 13

Man fügt w&hrend 20 Minuten 1 g j 0 -Benzyl-0 -succinimido-N-

030063/0898

/_ N-(2-n-pentyl-3-hydroxy-nonanoyl)-L-alanylJ| -D-glutaminsäure, gelöst in 10 ecm 1 , 2-Diriⁱ.ethoxyäthan zu einer bei 8°C gehaltenen Lösung von 0,52 g DD₇LL-N -Ber.zyloxycarbonyl-2,6-diami^o-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 1,6 ecm 1n-Natriumhydroxid und 5 ecm Wasser. Das Reaktionsgemisch wird 24 h bei 20⁰C gerührt und anschließend uurch Zusatz v°n 2 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Nach 3stündigem Rühren bei 20⁰C wird die gebildete Ausfällung durch Filtrieren abgetrennt und dreimal mit insgesamt 30 ecm Wasser gewaschen und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C getrocknet. Man erhält so 1,1 g eines weißen Pulvers, das man an einer Säule von 1,7 cm Durchmesser, die 22g· neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthalt, chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 110 ecm Äthylacetat, 60 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), 180 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 80 ecm Essigsäure. Die Fraktionen 24 - 38 werden unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60⁰C zur Trockne konzentriert. Der amorphe Feststoff, der so erhalten wird, wird in 10 ecm Äther aufgenommen, durch Filtrieren abgetrennt und mit 10 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen unter verringertem . Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C erhält man 0,1g N²- /θ¹-Benzyl-N/ N- (2-n-pentyl-3-hydT-oxy-nonanoyl) -L-alanyl_/- /-D-glutamyl (· -N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2 ,6-diamino-pimelinsäuremonoamid.

Rf =0,72 / Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (9-1 VoI)J

nonano-

2 Γ 1

Man fügt 0,4 g N - j 0 -Benzyl-N-/ N-(2-n-pentyl-3-hydroxy- yl)-L-alanyl_/-ξ -D-glutamylt -N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelinsäuro-monoamid in 10 ecm Essigsäure. Man fügt 0,4 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 1 1/4 h durch. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemischs und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) hai 50⁰C zur Trockne erhält man ein Öl, das man in 20 ecm Isopropylather aufnimmt, bis zur völligen Pulverisierung trituriert und durch Filtrieren abtrennt.

030063/0898

Nach dem Trocknen unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa)

2 Γ -

erhält man 280 mg N -/N-/ N- U-n-Pentyl-S-hydroxy-nonanoyl-)

L-alanyl_7- « -D-glutamyl( -DD/LL^/e
amid.

Rf = 0/39 /_ Silicxumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Die j 0 -Benzyl-0 -succinimido-N-/~N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl_/-D-glutaminsäure kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt während 10 Minuten 7,4 g Dicyclohexylcarbodiimxd, gelöst in 85 ecm 1 ,2-Dimethoxyäthan ¹ZU einer bei 0⁰C gehaltenen Lösung von 17,4 g Benzyl-N-(2-n-pentyl-3-hydroxy-nonanoyl)-L-alanyl-οέ -D-glucamat und 3,86 g N-Hydroxysuccinimid in 170 ecm 1,2-Dimethoxyäthan. Das Reaktionsmedium wird 2,5 h bei 0⁰C gerührt, und anschließend 16h bei 4°C gehalten. Anschließend fügt man 2 ecm Essigsäure zu und rührt 1 h bei 20°C. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt und dreimal mit insgesamt 75 ecm 1 ,2-Dime-^|-hoxyäthan gewaschen. Das Filtrat wird" unter verringertem Druck i20mmHg; 2,7 ]:Pa) bei 60°C zur Trockne konzentriert. Das Konzentrat wird in 300 ecm Äthylacetat aufgenommen. Nach 1 h Stehen bei 20⁰C wird die gebildete Ausfällung durch Filtrieren abgetrennt und zweimal mit insgesamt 50 ecm Isopropyläther gewaschen. DöiS Filtrat wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 5O°C zur Trockne konzentriert. Man erhält 22,8 g / 0 -3enzyl-0 -succinimido-N-/ N- (2-n-pentyl-3-hydroxy-nonanoyl)-L-alanyl_/ί -D-glutaminsäure

030063/0898

- 71 - 302A369

in Form eines orangefarbenen Öls.

Rf = 0,77 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

Das Benzyl-N-^-n-pentyl-S-hydroxy-nonanoylJ-L-alanyl-a^-D-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt während 1 h 10 Min. 27,5 g 3uccinimid-2-n-pentyl-3-hydroxy-nonanoat, gelöst in 644 ecm 1,2-Dimethoxyäthan zu einer bei 7°C gehaltenen Lösung von 27,8 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-^-D-glutamat in einem Gemisch von 245 ecm Wasser und 22,9 ecm Triäthylamin. Das Reaktionsgemisch wird 20 h bei 20⁰C und anschließend 5 h bei 60°C stehengelassen. Man verdampft darauf das 1,2-Dimethoxyäthan unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C. Das Konzentrat wird durch Zusatz von 150 ecm ^-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert angesäuert und fünfmal mit insgesamt 1,5 1 Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatphasen werden dreimal mit insgesamt 750 ecm Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 38,6 g eines Öls, -fas man in 200 ecm Äthylacetat löst. Man fügt 13g Dicyclohexylamin hinzu. Nach 20si;ündigem Stehen bei 4°C wird der gebildete weiße Feststoff durch Filtrieren abgetrennt,zweimal mit insgesamt 40 ecm Äthylacetat und zweimal mit insgesamt 200 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C getrocknet. Man erhält so 22,4 g eines weißen Pulvers, zu dem man 1,9 g eines Produkts fügt, das man in gleicher Weise erhielt. Man löst das Gemisch in 500 ecm Wasser und fügt zu der wässrigen Lösung 200 ecm Äthylacetat und 150 ecm gesättigter Zitronensäurelösung. Man trennt die organische Phase ab und extrahiert die wässrige Phase zweimal mit insgesamt 400 ecm Äthylacetat. Die vereinten Äthylacetatphasen werden zweimal mit insgesamt 200 ecm Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60°C zur Trockne konzentriert. Man erhält 17,4 g Benzyl-N-(2-n-pentyl-3-hydroxy-

030063/0898

nonanoyl)-L-alanyl-o6-D-glutamat in der Form einer beigen Paste. Rf = 0,25 /""siliciumdioxidgel: A"thylacetat_7

Das Succinimid-2-n-pentyl-3-hydroxy-nonanoat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt während 40 Minuten 27 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 300 ecm 1,2-Dimethc:.yäthan zu einer bei 0⁰C gehaltenen Lösung von 29,1 g 2-n-Pentyl-3-hydroxy-nonansäure und 14,1 g N-Hydroxysuccinimid in 300 ecm 1,2-Dimethoxyäthan. Das Reaktionsgemisch wird 3 h bei O⁰C gerührt und anschließend 21 h bei 4°C belassen. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt und zweimal mit insgesamt 100 ecm 1,2-Dimethoxyäthan gewaschen. Das Filtrat wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Das Konzentrat wird mit einem Gemisch von 300 ecm Isopropylather und 3 ecm Essigsäure aufgenommen. Nach 2stündigem Stehen bei 20⁰C wird die gebildete Ausfällung durch Filtrieren abgetrennt und zwciinal mit insgesamt 40 ecm Isopropylather gewaschen. Das Filtrat wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 42,6gSuccinimid-2-n-pentyl-3-hydroxy-nonanoat in der Form eines gelben Öls.

Die 2-n-Pentyl-3-hydroxy-nonansäure kann hergestellt werden nach der Methode von E. Lederer et al., Bull. Soc. Chim. 1952, 413.

Beispiel 14

Zu einer Lösung von 25 g No(-t-Butyloxycarbonyl-N£-benzyloxycarbonyl-L-lysin ir 250 ecm Äthanol fügt man 150 g chlormethyliertes Styrol-Divinylbenzol-Copolymeres (98-2), enthaltend 1 mSquivalent Chlor pro g. Man rührt das Reaktionsmedium 3 Minuten bei 20 C und fügt anschließend 9,2 ecm Triäthylamin zu und rührt

030063/0898

das Reaktionsmedium 48 h bei 78°C. Das Polymere wird filtriert, nacheinander mit dreimal insgesamt 750 ecm Äthanol und dreimal mit insgesamt 750 ecm Methylenchlorid gewaschen und schließlich unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C getrocknet. Man erhält se 160,9 g N M-t-Butyloxycarbonyl-Ni -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-Polymeres.

Die D-Glutaminsäure wird an das L-Lysyl-Polymere-Derivat gekuppelt, wobei man folgende Reaktionsfolge in cxnem mit einem Rührer und einer Glasfritte an seiner Basis ausgerüsteten Reaktor durchführt.

1. Man wäscht dreimal nacheinander das Polymere mit jeweils 100 ml Methylenchlorid. Auf jeden Lösungsmittelzusatz folgt 3 Minuten Rühren, worauf abgesaugt wird.

2. Die t-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe des Lysins wird anschließend durch Zusatz von 100 ecm eines Gemischs von Trifluoressigsäure-Methylenchlorid (1-1 VoI) entfernt, wobei 20 Minuten gerührt und anschließend abgesaugt wird.

3. Das Harz wird anschießend nacheinander gewaschen mit

a) dreimal 1Q0 ecm Methylenchlorid,

b) dreimal 100 ecm Methanol,

c) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

wobei man 3 Minuten nach jpder Lösungsmittelzugabe rührt und jedesmal absaugt.

4. Man neutralisiert darauf das Polymere durch Zusatz von 100 ecm eines Methylenchlorid-N-Methylmorpholingemisch (9-1 VoI),wobei man 10 "inuten rührt und anschließend absaugt.

5. Das Harz wird anschließend gewaschen, mit dreimal 100 ecm Methylenchlorid, wobei man 3 Minuten nach jeder Lösungsmittel-

030063/0898

zugabe rührt und jedesmal absaugt.

6. Man fügt anschließend nacheinander zu

a) 5,4 g Benzyl-N-t-butyloxycarbonyl-^-D-glutamat/ gelöst in 50 ecm Methylenchlorid,und rührt 10 Minuten,

b) 3,3 σ Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 50 ecm Methylenchloxxd, und ma.-> rührt 20 h und saugt ab.

7. Man wäscht das Harz nacheinander mit

a) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

b) dreimal 100 ecm Essigsäure,

c) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

wobei man 3 Minuten nach jeder Lösungsmittelzugabe rührt und jedesmal absaugt.

Man erhält so das N₁^-(O -Benzyl-N-t-butyloxycarbonyl-/-D-glutamyl)-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-Polymere.

Das .Alanin wird an das Dipeptid-Polymere gekuppelt, wobei man die Arbeitsgänge 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 wiederholt und den Arbeitsgang 6 wie folgt modifizxert:

Man fügt nacheinander zu:

a) 3,C3 g N-t-Butyloxycarbonyl-L-alanin, gelöst in 50 ecm Methylenchlorid und rührt 10 Minuten,

b) 3,3g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 50 ecm Methylenchlor id, und rührt 20 h und saugt ab.

Man erhält so das N^-/~0 -Benzyl-N- (N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl)-i -D-glutamyl_7~N <f -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-Polymere.

030063/0898

Die Palmitinsäure wird an die Tripeptid-Polymere gekuppelt unter Wiederholung der Arbeitsgänge 1, 2, 3/ 4, 5, 6 und 7. Der Arbeitsgang 6 wird wie folgt modifiziert:

Man fügt nacheinander zu:

a) 4,2 g Palmitinsäure, gelöst in 50 ecm Methylenchlorid und rührt 10 Minuten,

b) 3,3 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 50 ecm Methylenchlorid und rührt 20 h und saugt ab.

Man erhält so N₀^ ~l~0 -Benzyl-N-(N-palmitoyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7~N <£" -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-Polymeres.

Das Polymere wird in 130 ecm Trifluoressigsäure suspendiert, die in einem Reaktor enthalten ist, der mit einem Rührer und an seiner Basis mit einem Glasfrittenfilter ausgerüstet ist. In diese Suspension leitet man eine.? Bromwasserstoff strom während 90 Minuten ein. Anschließend saugt man das Harz ab und wäscht es dreimal mit insgesamt 300 ecm Essigsäure, wobei man 3 Minuten nach jeder Essigsäurezugabe rührt und jedesmal absaugt. Die Filtrate werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Das so erhaltene Öl wird in 5o ecm Äthylacetat aufgenommen. Es bildet sich eine Ausfällung, die man durch Filtrieren abtrennt und zweimal mit insgesamt 60 ecm Äther wäscht. Sie ist hygroskopisch und wird in 50 ecm Essigsäure gelöst, die 7 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthalt. Man konzentriert unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne und beschickt auf eine Säule von 2,6 cm Durchmesser, die 10 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält.

Man eluiert nacheinander mit 700 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 1700 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 600 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (7-3 VoI), 2400 ecm Äthyl-

030063/0898

acetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), 600 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (2-8 VoI) und 1100 ecm Essigsäure, wobei man Fraktionen von 100 ecm gewinnt. Die Fraktionen 53-70 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält to 1,28 g eines amorphen Feststoffs, aen man in 50 ecm Essigsäure, die 2,4 g neutrales Siliciumdicr:idgel (0,04-0,063 .um) enthält, löst. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne und bringt auf eine Säule vcn 1,5 cm Durchmesser auf, die 24 g neutrales Siliciumdioxidgel (O,04-O,o63 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 300 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (7-3 VoI), 150 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (6-4 VoI), 300 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), 250 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (4-6 VoI), 350 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (3-7 VoI), 350 ecm Äthyiacetat-Essigjäuregemisch (2-8 VoI) , 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregexnisch (1-9 VoI) und 200 ecm Essigsäure, wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Fraktionen 25 - 42 werden vereint und unter verringerleu\ Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C konzentriert. Der erhaltene amorphe Feststoff wird in 30 ecm Ätiylacetat aufgenommen, durch Filtrieren abgetrennt, mit 20 ecm Äthylacetat und mit 20 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen unter ver- ringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 50°C erhält nan 0,52 g Νί>ί ~^~N- (N-Falmitoyl-L-alanyl)- d -D-glutamyl]-L-lysin.

Rf = 0,30 £ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 54,13 H 8,63 N 8,42 % gefunden: C 54,9 H 8,6 N 8,7

Schwefelsäureasche = 1,7 %

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanaly-

030063/0898

sator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

Ala 0,99 (Theorie - 1)
GIu 1,00 (Theorie = 1)
Lys 1,02. (Theorie " 1)

Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eine Verbindung gemäß der Erfindung zusammen mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch brauchbaren Verdünnungsmitteln enthalten. Diese Zusammensetzungen können als Adjuvantien zu Vakzinen oder als unspezifische Stimulantien für die antiinfektiöse und antitumorale Immunität verwendet werden.

Zur Verwendung als Adjuvantien für Vakzinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen gleichseitig mit und auf dem gleichen Wege wie das Antigen (viral,bakteriell, parasität oder anderer Natur),gegen das man bei dem zu immunisierenden Patienten (Mensch oder Haustier) die zellulären Immunitätsreaktionen (Hypersensibilicät des verzögerten Typs) oder die Erzeugung von zirkulierenden oder lokalen Antikörpern zu erhöhen versucht, verabreicht.

Die Verbindungen werden in relativ geringen Dosierunger, (in der . Größenordnung von mg) verabreicht, vermischt mit dem Antigen und auf dem gleichen Wege (intravenös, suokutan, intramuskulär, transr.asal, bukal) . Falls notwendig, können die Verbindungen und das Antigen in einem geeigneten öligen Exzipienten emulgiert oder in Liposome eingearbeitet werden.

Als unspezifische Immunstimulantien werden sie in Dosierungen von 0,1 - 50 mg/kg auf parenteralero. Wege (intravenös, subkutan, intramuskulär), intranasal, bukal, rektal oder gegebenenfalls intratumoral verabreicht.

030063/0898

Als feste Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können Tabletten, Pillen Pulver oder Granulate verwendet werden. In diesen Zusammensetzungen wird das aktive Produkt mit einem oder mehreren Verdünnungsmittel, wie Saccharose, Lactose oder Stärke vermischt. Die Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als die Verdünnungsmittel enthalten, beispielsweise ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat.

Als flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung kann man pharmazeutisch brauchbare Emulsionen, Lösungen oder Suspensionen, Sirups oder Elixiere verwenden, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, wie Wasser oder Paraffinöl. Diese Zusammensetzungen können andere Substanzen als die Verdünnungsmittel enthalten, beispielsweise Befeuchtungsmittel, Süßstoffe oder aromatisierende Mittel.

Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können sterile wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Vehikel kann man im letzteren Fall Polyäthylenglykol, Propyj.englykol, pflanzliche Öle, insbesondere Olivenöl, und die injizierbaren organischen Ester, beispielsweise Äthyloleat verwenden. Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvantien bzw. Zusätze enthalten, insbesondere Benetzungsmittel, Emulgiermittel oder Dispergiermittel.

Die Sterilisation kann auf verschiedene Weise erfolgen, beispielsweise mit Hilfe eines bakteriologischen Filters, durch Einarbeiten von sterilisierenden Mitteln ?r. die Zusammensetzungen oder durch Erwärmen. Sie können auch hergestellt werden in der Form von festen Zusammensetzungen, die steril gemacht wurden durch beispielsweise Bestrahlen, die in sterilem Wasser gelöst oder in jedem anderen injizierbaren sterilen Milieu dispergiert werden können, gegebenenfalls zum Zeitpunkt der Verwendung.

Die Zusammensetzungen zur intranasalen Verabreichung können sterile wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein, die

030063/0898

gegebenenfalls zusammen mit einem verträglichen Treibmittel vorliegen können.

Die Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung sind Suppositorien, die außer dem wirksamen Produkt Exzipienten wie Kakaobutter oder Sapposxtorienwachs enthalten können.

Folgende Beispiele, die keine Einschränkung darstellen soller, dienen zur Erläuterung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen:

Formulierungsbeispiel 1

Man stellt in üblicher Technik eine auf intravenösem Wege verabreichbare Lösung folgender Zusammensetzung her:

2 J

N -(N-Lauroyl-L-alanyl- / -D-glutamyl)-

DD,LL-2,P-diamino-pimelinsäure-monoamid 0,5 g

injizierbares Lösungsmittel 5 ecm

Formulierungsbeispiel 2

Man stellt in üblicher Weise auf auf intravenösem Wege verabreichbare Lösung folgender Zusammensetzung her:

Methyl-N,y -/~N- (N-lauroyl-L-aianyl) -/ -D-glutamyl_7-L-lysinat 0,5 g

injizierbares Lösungsmittel 5 ecm

030063/0898

Z. u s. a ι ι e n f. a s sung

Neue Tripeptide, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft neue Tripeptide der allgemeinen Formel I, worin die Symbole R ein Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest (wobei mindestens eines ein Fettsäurerest ist) darstellen, R^ einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrest bedeutet, R und R_, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest bedeuten (wobei R„ und R^ nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom sein können), wobei das Alanin in der L-Form vorliegt, die Glutaminsäure in der D-Form vorliegt, das Lysin (wonn R„ oder R-. ein Wasserstoffatom darstellen) in der L-Form vorliegt und die 2,6-Diamino-pimelinsäure oder ihre Derivate (R~ und/oder R_ Carboxy, Carbamoyl oder Alkyloxycarbonyl bedeuten) in der D,D-; L,L--· DD,LL-(razemisch) - oder D,L- (meso) -Form vorliegen, sowie ihre Salze, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel.

Die neuen Tripeptide sind besonders geeignet als immunologische Adjuvantien und Immunstimulantien.

R - NH - CK - CO - HH - CH - CO -

H₂

CH₂CH₂ - CO - MH - CH -

030063/08Ϊ8Γ ^m ' ^CH " ^R2

ORIGINAL

INSPECTED

Claims (9)

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann - Dr. ir?. Ko-srigsberger DipL-Phys R. Holzbauer - Dipl.-Ing. F. Xlingseisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE 80O0 München 2 · BräuhausstraGe 4 · Telefon Sammel-Nr. 2253 41 · Telegramme Zumpat · Telex 529979 3024363 SC 4678/47O6/47O7 Hr/nc P a t. e n. t a η s ρ r ü c. h e

1.yNeues Tripeptid mit der allgemeinen Formel

H -. NH - CH - CO - NK - CK - CO - H₁

CH, ^CH2^CK2 - CO - NH - CH -

R-NH-CH-R₂

v,">vin die Symbole R, die gleich oder verschieden sein
können, ein Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest bedeuten, wobei mindestens eines der Symbole R einen Fettsäurerest darstellt/ das Symbol R₁ einen Hydroxy-, Aminoöder Alkyloxyrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darbteilt, die Symbole R

030063/0898

ORIGINAL INSPECTED

und R , die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder einen Carboyy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeuten, wobei dij Symbole R₂ und R₃ nicht gleich.zeit.ig ein Wasserstoffatom darstellen können und wobei das Alarj η in der L-Form vorliegt, die Glutaminsäure in der D-Form vorliegt, das Lysin, wenn eines der Symbole R- ode~ Ro ein Wasserstoffatom darstellt, in der L-Form vorliegt und die 2,6-Diamino-pimelinsäure oder ihre Derivate, wenn die Symbole R₂ und R₃, die gleich oder verschieden sein können, einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest darstellen, in der D,D-; L,L-? DD,LL- (razemisch) oder D,L- (meso) Form vorliegt, sowie deren Salze.

2. Neues Tripeptid nach Anspruch 1, in dem der Fettsäurerest • ein A13'3noylrest mit 1-45 Kohlenstoffatomen^ gegebenenfalls substituiert durch einen Hydroxy-, Phenyl- oder Cyclohexylrest), ein Alkenoylrest mit 3-30 Kohlenstoffatomen, der mehr als eine Doppelbindung enthalten kann, oder ein Mykolsäurerest ist.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Dipeptid der allgemeinen Formel

P-NH-CH-CO-NH-Ch-CO-R₁. CIL CH₂CH₂ - COOH

030063/0898

worin R₅ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt und R. einen Amino- oder einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Benzyl- oder Nitrobenzylrest, darstellt, mit einer Aminosäure der allgemeiner. Formel

- CH - IL

5
R₅-NH-CH-R₂

worin R₂ und R₃ wie in Anspruch 1 definiert sind unü R₅ einen Fettsäurerest oder eine -Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei zumindest eines der Symbole R₅ der Formeln des Dipeptids und der Aminosäure, wie vorstehend definiert, einen Fettsäurerest di?rrteilt, reagieren läßt, worauf man gegebenenfalls

- den Rest R₅, wenr. er eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt, durch ein Wasserstoffatom ersetzt,

- den Rest R₄,wenn er einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen/ gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, durch eine Hydroxygruppe ersetzt,

- die Reste R₂ und R₃, wenn sie einen Alkyloxycarbcr.ylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellen, durch einen Carboxyrest ersetzt

und die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in Salzform isolierb.

030063/0898

3024359

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein aktiviertes Derivat des L-Alanins der allgemeinen Forme]

- NH - CH - COOH

worin R₅ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunkticn darstellt, mit einem Dipeptid der allgemeinen Formel

H₀

N - CH -CO-Rj

- CO - NH - CH

- NH -'CH -

worin R„ und R^ wie im Anspruch 1 definiert sind, R,, einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, geaebenenfallo substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenyirest, bedeutet und R₅ einer. Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt, wcbei zumindest eines der Symbole R₅ der Formeln des Alaninderivats und des Dipeptids, wie vorstehend definiert, einen Fettsäurerest darstellt, umsetzt, worauf man gegebenenfalls

- den Rest R₁-, wenn er eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt, durch ein Wasserstoffatorn ersetzt,

030063/0 898

— D —*

- den Rest R., wenn er eine Alkyloxygruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch eiaan Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, durch einen Hydroxyrest ersetzt und

- die Reste R₂ und/oder R₃, wenn sie einen Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome (gegabenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) enthält, darstellen, durch einen Carboxyrest ersetzt, und

die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in Salzform isolier-L.

5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Sü.ure der allgemeinen Formel

R¹ - CO - OH

worin R'-CO- einen Fettsäurerest darstellt oder ein aktiviertes Derivat dieser Säure umsetzt mit einem Tripeptid der allgemeinen Formel

- NH - CH - CO - NH-- CH -CO-R..

! I ⁴

:n, ^0Ha^CH2 -

¹I

L ^CH2^CH2 CONHC

2 3 4

worin R und R wie im Anspruch 1 definiert sind, R einen

030063/0898

Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt unddie Symbole Rg, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoff atom oder einen Fettisäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellen, wobei mindestens eines der Symbole Rg ein Wasserstoffatom bedeutet, worauf man gegebenenfalls

- den Rest R_fi, wenn er eine Schutzgruppe file die Aminfunktion darstellt, durch ein Wasserstoffatom ersetzt,

- den Rest R₄, wenn er einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, durch eine Hydroxygruppe ersetzt und

- die Reste R- und/oder R-., wenn sie einen Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellen, uucch eine Carboxygrupoe ersetzt

und die erhaltene Vorbindung gegebenenfalls in Salzform isoliert.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man an einem geeigneten Träger die Aminosäure der allgemeinen Formel

R₇

JL

-NH-CH-R,

- HH - CH -

030063/0898

worin eines der Symbole R„ und R₃ einen Carboxyrest und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxvcarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, R^- eine-* Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion bedeutet und R₇ eine Schutzgruppe fi"r die Aminfunktion darstellt, wobei, falls R5- und R^ jedes eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt, d*ese Schutzgruppen unterschiedlich sind, fixiert, worauf man die durch den Rest R₇ geschützte Aminfunktion entblockiert und kondensiert:

a) - entweder ein D-Glutaminsäurederivat der allgemeinen Formel

R₇-NH-CH-CO-R₄
CH₂CH₂ - COOH

v/orin R- wie vorstehend definiert ist und R. einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, worauf man nach Entblockieren der durch R₇ geschützten Aminfunktion kondensiert:

- entweder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R- - NH - CH - COOH
CH₃

worin R- wie vorstehend definiert ist und anschließend

030063/0898

nach Entblockieren der durch R- geschützten Aminfunktion die Fettsäure der allgemeinen Formel

R¹ - COOH

i^ R¹-CO- einen Fettsäurerest, wie in den Ansprüchen 1 oder 2 definiert, darstellt,

- oder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R - NH - CH - COOH
CH₃

worin R einen Fettsäurerest darstellt, b) - oder das Dipeptid der allgemeinen Formel

- NH - CH - CO - HH - CH - CO - R..

i I

- COOH

worin R. wie vorstehend definiert ist und R„ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt, wobei, falls R„ eine Schutzgruppe für die Aminfunktion bedeutet, diese unterschiedlich ist von der vorstehend definierten Schutzgruppe R₅, worauf man nach Entblockieren der durch R_R geschützten Aminfunktion die Säure der vorstehend definierten allgemeinen Formel R¹-CO-OH kondensiert und schließlich das erhaltene Produkt von seinem Träger abtrennt, gegebenenfalls die Schutzgruppen von den Amin- und Carboxyfunktionen abspaltet und die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in Salzform isoliert.

030063/0898

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man an einem geeigneten Träger das Dipeptid der allgemeinen Formel

R_n - MH - CH - CO - R₄

⁹ !

CH-CH. - CO - HH -CH-R₅

R - NH - CH -

fixiert, worin eines der Symbole R_? und R_ einen Carboxyrest darstellt und das andere einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest bedeutet, dessen Alkylteil 1-4 Kohlonstoffatome (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) enthält, R. einen Amino- oder Alkyloxyrest rat 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt, R₁. einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunkticn bedeutet und Rg eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt, wobei, falls R₅ und R_g jedes eine Schutzgruppe für die Aminfunktion darstellt, diese Schutzgruppen unterschiedlich sind, worauf man nach Entblockierung der durch R„ geschützten Aminfunktion kondensiert:

- entweder ein Derivat det L-Alanins der al !.gemeinen Formel

R₇ - NH - CH - COOH

worin R₇ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die

030063/0898

Aminfunktion darstellt, worauf man die durch R_ geschützte Aminfunktion entblockiert, gegebenenfalls die Fettsäure der .allgemeinen Formel

R¹ - CO - OH

worin R'-CO- einen Fettsäurerest, wie in den Ansprüchen 1 oder 2 definiert, bedeutet, kondensiert,

- oder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R - NH - CH - COOH CH.,.

worin R einen Fettsäurerest darstellt,

worauf man das so erhaltene Produkt von seinem Träger abtrennt, gegebenenfalls Schutzgruppen der Min- und Carboxyfunktionen entfernt und die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in Salzform isoliert.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man an einem geeigneten Träger das Tripeptid der allgemeinen Formel

R_Q - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R,

I J

CIL CK₂CH₂ - CO - NH - CH-IU

R_ - NH - CH -

Q30063/0B98

fixiert/ worin eines der Symbole R„ und R, einen Carboxyrest dc.istellt und das andere einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest bedeutet, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest ) aufweist, R. einen Amino- oder Alkyloxyrest nit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellt., Rr einen Pettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet und R_1n eine Schutzgruppe der Aminianktion darstellt, wobei, falls R₅ und R_1n jeweils eine Schutzgruppe für die Aminfunktion bedeuten, diese Schutzgruppen unterschiedlich sind, wore/jf man nach der Entblockierung der durch R₁₀ geschützten Aminfunktion die Säure der allgemeinen Formel

R¹ - CO - OH

kondensiert, worin R¹-CO- einen Fettsäurerest, wie in de*. Ansprüchen 1 oder 2 definiert, darstellt,

worauf man die erhaltene Verbindung von ihrem Träger abtrennt und gegebenenfalls Schutzgruppen der Amin- und Carboxyfunktionen entfernt und die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in Salzform isoliert.

9. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1, im reinen Zustand oder in Anwesenheit eines oder mehrerer verträglicher und pharmazeutisch brauchbarer Verdünnungsmittel oder Zusätze.

030063/08 9 8