DK154434B

DK154434B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af tripeptidderivater

Info

Publication number: DK154434B
Application number: DK277180AA
Authority: DK
Inventors: Jean Bouchaudon; Daniel Farge; Claude James
Original assignee: Rhone Poulenc Ind
Priority date: 1979-06-29
Filing date: 1980-06-27
Publication date: 1988-11-14
Also published as: JPS5645447A; IE801340L; LU82569A1; GB2053230B; IT1131847B; NZ194178A; SE448301B; DE3024369A1; JPH0159275B2; CH647789A5; ZA803886B; AU546524B1; AU5969880A; BE884076A; IE49950B1; SE8004791L; FR2460289A1; GB2053230A; FR2460289B1; IT8023074A0

Description

i

DK 154434 B

o

Den foreliggende opfindelse angår en analogifrem-gangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte tripeptidderivater med den almene formel I

- R - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R1

I I

CH3 CH2CH2 - CO - NH - CH - R3 (j) R - NH - CH - R2 10 hvori symbolerne R, der kan være ens eller forskellige, betyder et hydrogenatom eller en alkanoylgruppe med 1-16 carbonatomer, som eventuelt er substitueret med en hydr- oxygruppe, idet mindst et af symbolerne R betyder en al- 15 kanoylgruppe, R^ betyder en hydroxy-, amino- eller alkyl- oxygruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer og eventuelt er substitueret med en phenylgruppe, og symbo-2 3 lerne R og R , der kan være ens eller forskellige, betyder et hydrogenatom, en carboxygruppe, carbamoylgruppe el-20 ler alkyloxycarbonylgruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer og eventuelt er substitueret med en phenyl-. 2 3 gruppe, idet symbolerne R og R ikke samtidig kan betyde et hydrogenatom, og idet alaninet foreligger på L-form, glutaminsyren foreligger på D-form, lysinet, når et af 2 3 25 symbolerne R eller R betyder et hydrogenatom, foreligger på L-form, og 2,6-diaminopimelinsyren eller dens deri- 2 3 vater, når symbolerne R og R , der kan være ens eller forskellige, betyder en carboxygruppe, carbamoylgruppe eller alkyloxycarbonylgruppe, foreligger på D,D-form, 30 L,L-form, DD,LL-form (racemisk form) eller D,L-form (meso-form), eller farmaceutisk acceptable metalsalte deraf eller farmaceutisk acceptable additionssalte deraf med syrer eller nitrogenholdige baser, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne.

35 Bakteriecellevægge, f.eks. mycobakteriecellevæg- ge, består hovedsagelig af et af N-acetylmuraminsyre dan-

DK 154434B

O

2 net peptidoglycan, ved hvilket der er fikseret peptider indeholdende kæderne L-Ala-D-Glu-DAP (DAP = 2,6-diamino-pimelinsyre). Bakteriecellevæggene er desuden meget rige på lipider, hvoraf visse er frie og ekstraherbare, og 5 andre er forbundet med vægstrukturen og består af mycol-syrer (længkædede, a-forgrenede og β-hydroxylerede fedtsyrer) . De forskellige bestanddele i cellevæggen danner en covalent struktur bestående af et peptidoglucan og et arabinogalactanmycolat, der er forbundet med hinanden ved io phosphordiesterbindinger. Disse bakteriecellevægge udvi ser størstedelen af de hele cellers biologiske egenskaber, når de forenes med en uorganisk eller vegetabilsk olie og indgives suspenderet i en fysiologisk opløsning.

I belgisk patentskrift nr. 821.385, 852.348 og 15 852.349 beskrives peptider koblet med N-acetylmuramin- syre, hvilke peptider indeholder kæden L-Ala-D-Glu eller L-Ser-D-Glu og er virksomme som immunologiske adjuvanser og som anti-infektionsmidler.

I fransk patentskrift nr. 2.320.107, beskrives 2o produkter fremstillet ved kobling mellem en fedtsyre og et heptapeptidsaccharid isoleret fra en mycobakterie indeholdende en voks "D". Disse produkter kan gengives ved følgende formel:

25 NAG - NAM----— NAG - NAM

i — !

Ala Ala I 1

Glu Glu (R COOH) (II)

I I

DAP DAP

30 1

Ala-'^’^ _ m hvor NAG betyder N-acetylglucosamin, NAM betyder N-acetyl-muraminsyre, DAP betyder 2,6-diaminopimelinsyre, og R 35 betyder en alkylgruppe med 9-17 carbonatomer.

3 DK 154434B

0 Disse produkter er immunologiske adjuvanser for produktion af antistoffer og forsinket hypersensibilitet, og de kan virke alene, dvs. uden at det er nødvendigt at indgive dem i en olieopløsning.

Alle disse produkter er karakteriseret ved nær-5 værelsen af N-acetylmuraminsyre, som ifølge Kasumoto et al., Tetrahedron Letters, 49_, 4899 (1978) menes at have forbindelse med immunologisk aktivitet.

Det har nu vist sig, at peptiderne med formlen I trods fraværelsen af N-acetylmuraminsyre udviser bemær-10 kelsesværdige adjuvansegenskaber og immunostimulerende egenskaber. Forbindelserne med formlen I, der er veldefinerede, kan desuden let fremstilles med en sådan renhedsgrad, som kræves til terapeutisk anvendelse.

Ved fremgangsmådevariant a) ifølge opfindelsen 15 fremstilles de hidtil ukendte tripeptider med formlen I ved, at et dipeptid med den almene formel III

R1 - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R4 20 i I (HI)

CH3 CH2CH2 " C00H

35 25 hvori R betyder an alkanoylgruppe som ovenfor angivet eller en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, såsom en benzyloxycarbonylgruppe eller en tert.butyloxycarbonyl-gruppe, og R betyder en aminogruppe eller en alkyloxy-gruppe med 1-4 carbonatomer, der eventuelt er substitue-30 med en phenylgruppe, eller et aktiveret derivat

deraf, omsættes med en aminosyre med den almene formel IV

O

DK 154434B

4 H~N - CH - R3 (ch2)3 i 2 3 (iv) 5 i o R - NH- CH - R2 5 2 3 5 hvori R , R og R har den ovenfor angivne betydning, 5 idet mindst ét af symbolerne R i formlerne III og IV betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet. Efter om-10 sætningen erstatter man gruppen R5 med et hydrogenatom, når den er en beskyttelsesgruppe for aminogruppen. Endvidere erstatter man eventuelt gruppen R4 med en hydroxy-gruppe, når den er en alkyloxygruppe indeholdende 1-4 carbonatomer (eventuelt substitueret med en phenylgruppe).

15 Desuden erstatter man eventuelt grupperne R^ og R3 med en carboxygruppe, når de betyder en alkyloxycarbonylgruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer og eventuelt er substitueret med en phenylgruppe.

Det er sædvanligvis nødvendigt at aktivere den 20 frie syregruppe i dipeptidet med formlen III før omsætningen med aminosyren med formlen IV. Det aktiverede derivat af dipeptidet med formlen III er fortrinsvis et blandet anhydrid, der fremstilles' in' situ ved, at et alkyl-- halogenformiat (såsom isobutylchlorformiat) omsættes med 25 dipeptidet med formlen III. Kondensationen af det aktiverede derivat gennemføres i et organisk opløsningsmiddel, såsom dioxan, tetrahydrofuran, chloroform, toluen eller dimetylformamid, eller i et vandholdigt organisk medium i nærværelse af en base (enten en uorganisk base, såsom 30 natriumhydroxyd, eller en organisk base, såsom triethyl-amin) ved en temperatur mellem -10 og +30°C.

35

DK 154434 B

5 o 5

Den eventuelle erstatning af gruppen R med 4 et hydrogenatom, af gruppen R med en hydroxygruppe og 2 3 af grupperne R og R med en carboxygruppe kan gennemføres ifølge kendte metoder afhængigt af naturen af 5 beskyttelsesgrupperne. Det er særlig fordelagtigt at 2 3 4 5 vælge grupperne R , R , R og R på en sådan måde, at de i et enkelt trin kan erstattes med en carboxygruppe, en hydroxygruppe henholdsvis et hydrogenatom. Af denne 4 grund er det hensigtsmæssigt at vælge gruppen R blandt 10 benzyloxy- og nitrobenzyloxygrupper samt vælge grupperne 2 3 5 R , R og R blandt benzyloxycarbonyl- og nitrobenzyl-oxycarbonylgrupper. I sådanne tilfælde kan disse grupper* erstattes ved hydrogenolyse i et egnet organisk opløsningsmiddel, såsom eddikesyre (eventuelt i blanding med 15 et andet opløsningsmiddel, såsom metanol), eller i et vandholdigt organisk opløsningsmiddel, idet der arbejdes i nærværelse af en katalysator, såsom palladium, f.eks. palladium på carbon, ved en temperatur nær 20°C og under et tryk nær 760 mm Hg.

20 Dipeptidet med formlen III kan fremstilles ved,

at et aktiveret derivat av L-alanin med den almene formel V

R5 - NH - CH - COOH

25 ia3 <v) 5

hvori R har den ovenfor angivne betydning, omsættes med et derivat af D-glutaminsyre med den almene formel VI

30 4

H0N - CH - CO - R

2 | (VI)

CH2CH2 - COOH

35 6

DK 154434 B

0 4 hvori R har den ovenfor angivne betydning, idet omsætningen gennemføres under de betingelser, der er angivet ovenfor for omsætning af et dipeptid med formlen III med en aminosyre med formlen IV.

5 5 Dipeptidet med formlen III, hvori R betyder en

alkanoylgruppe som ovenfor angivet, kan fremstilles ved, at et aktiveret derivat af en fedtsyre med den almene formel VII

10 R' - CO - OH (VII)

hvori R’-CO- betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet, omsættes med et dipeptid med den almene formel VIII

H„N - CH - CO - NH - CH - CO - R1 15 2 | I (VIII)

CH3 CH2CH2 “ C00H

hvori R har den ovenfor angivne betydning.

20 Som aktiveret derivat af syren med formlen VII

er det særlig hensigtsmæssigt at anvende et syrehalogenid eller et blandet anhydrid, der sædvanligvis fremstilles in situ, ved at et alkylhalogenformiat, såsom isobutyl-, chlorformiat, omsættes med syren med formlen VII i nær-værelse af en base.

Når man anvender syren med formlen VII i form af et syrehalogenid, især syrechloridet, gennemføres omsætningen i et organisk opløsningsmiddel, såsom dietylether eller methylenchlorid,i nærværelse af en base (enten en 30 uorganisk base som natriumhydroxid eller en organisk base som triethylarain) ved en temperatur mellem 0 og 30°C. Dipeptidet med formlen VIII anvendes sædvanligvis i form af et salt, såsom hydrochloridet.

Når man anvender syren med formlen VII i form af 35 et blandet anhydrid, gennemføres omsætningen under de betingelser, der er. angivet ovenfor for omsætningen af et

O

7

DK 154434 B

dipeptid med formlen III med en aminosyre med formlen IV. Dipeptidet med formlen VIII anvendes sædvanligvis i form af et salt, såsom hydrochloridet.

2

Aminosyren med formlen IV, hvori R betyder en 3 5 carbamoylgruppe, R betyder en carboxygruppe og R bety-5 der en benzyloxycarbonylgruppe, dvs. (D)-monoamidet af benzyloxycarbonyl-(D)-meso-2,6-diaminopimelinsyre, kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives i belgisk patentskrift nr. 821.385.

. 2 10 Aminosyren med formlen IV, hvori R betyder en 3' 5 carbamoylgruppe, R betyder en carboxylgruppe, og R betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet, eller en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, og som foreligger i racemisk form, D,D-form eller L,L-form, kan fremstilles ud 15 fra den tilsvarende 2,6-diaminopimelinsyre. Man fremstiller herved ifølge kendte metoder benzylesteren af 2,6-di-benzyloxycarbonylaminopimelinsyre, der monoforsæbes ifølge metoden, der beskrives af A.Arendt et al., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum, 48_, 1305 (1974) [Chem.

20 Abstr., 8_2, 31497 g (1975] og derefter ved hjælp af am-moniakalsk methanol omdannes til et monoamid med den almene formel IX

Z - NH - CH - COOH

25 (CH2}3 {IX) Z - NH - CH - CO - NH2 hvori Z betyder en benzyloxycarbonylgruppe. Når dette 30 monamid hydrogeno ly sere s i nærværelse af palladium på carbon, fås 2,6-diaminopimelamsyre. Når 2,6-diaminopi-melamsyren omsættes med et kobbersalt, såsom kobber-(II)-bromid eller basisk kobbercarbonat, dannes et komplex, der kan gengives ved følgende formel 35

O

8

DK 154434 B

H0N - CH - CO - NH0 i | 2 (ch7)_

H„N - CH - COO

5 (X) OCO - CH - NH„ I 2 <“2 >3 H0N - CO - CH - NH0 10 * Δ hvor aminogruppen i a-stilling til carbamoylgruppen kan acyleres ved omsætning med et aktiveret derivat af en syre med formlen VII (fortrinsvis et halogenid, såsom chlorid) eller beskyttes ved omsætning med et alkylhalo-genformiat eller benzylhalogenformiat. Det således dannede kompleks sønderdeles ved omsætning med hydrogensulfid til dannelse af en aminosyre med formlen IV, hvori 2 3 R betyder en carbamoylgruppe, R betyder en carboxy- 5 gruppe, og hvor R har den ovenfor angivne betydning.

2

Aminosyren med formlen IV, hvori R betyder en 3 5 carboxygruppe, R en carbamoylgruppe, og R betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet eller en beskyttelses-' gruppe for aminogruppen, og som foreligger i D,D-form, 25 L,L-form, DD,LL-form (racemisk form) eller i D,L-form (meso-form) kan fremstilles ud fra en tilsvarende 2,6--diaminopimelinsyre. Man fremstiller herved kobberkomplekset med formlen X, hvori aminogruppen i α-stilling til carbamoylgruppen kan beskyttes ved omsætning med et alkyl-30 halogenformiat eller benzylhalogenformiat. Det således dannede kompleks sønderdeles ved omsætning med hydrogensulfid til dannelse af en aminosyre med formlen IV, hvori 2 3 R betyder en carbamoylgruppe, R betyder en carboxylgrup- 5 pe, og R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen.

35 Aminogruppen i α-stilling til carboxylgruppe kan beskyttes med en alkanoylgruppe som ovenfor angivet eller med 9

O

DK 154434 B

en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, der er forskellig 5 5

fra gruppen R . Efter fjernelse af beskyttelsesgruppen R

2 fås en forbindelse med formlen IV, hvori R betyder en 3 5 carboxygruppe, R betyder en carbamoylgruppe, og R bety- 5 der en beskyttelsesgruppe for aminogruppen.

2

Aminosyren med formlen IV, hvori symbolerne R og 3 R er identiske og hver især betyder en carboxygruppe, en carbamoylgruppe eller en alkyloxycarbonylgruppe, hvis alky Idel indeholder 1-4 carbonatomer og eventuelt er substi-10 tueret med en phenylgruppe, og R betyder en alkanoyl-gruppe som ovenfor angivet eller en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, og som foreligger i D,D-form, L,L- -form, DD,LL-form (racemisk form) eller i D,L-form (meso-form), kan fremstilles ud fra en aminosyre med 15 formlen IV, hvori R og R har den ovenfor angivne be- c tydning, og R betyder et hydrogenatom, ved monoblokering af en af de to aminogrupper ifølge metoden, der beskrives af E. Bricas et al., Biochemistry, j), 823 (1970).

2

Aminosyren med formlen IV, hvori symbolerne R 20 og R er forskellige og betyder en carbamoylgruppe eller en alkyloxycarbonylgruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer og eventuelt er substitueret med en phenyl- 5 eller nitrophenylgruppe, og R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, og som foreligger i D,D-form, 25 L,L-form, DD,LL-form (racemisk form) eller i D,L-form (meso-form), kan fremstilles ud fra en aminosyre med form- 2 3 5 len IV, hvori symbolerne R , R og R har den ovenfor angivne betydning, og aminogruppen i α-stilling til gruppen 3 R er beskyttet med en beskyttelsesgruppe for aminogrup- 30 5 pen, der er forskellig fra gruppen R . Fremstillingen sker ved, at man fjerner den sidstnævnte beskyttelsesgruppe uden 5 at påvirke gruppen R .

Forbindelsen med formlen IV, hvori aminogruppen i 3 a-stilling til gruppen R er beskyttet med en aminobeskyt-35 tende gruppe, fremstilles ved forestring af en forbindelse 1 3 med formlen IV, hvori et af symbolerne R og R betyder en DK 154434 B .

10 o carboxygruppe, og det andet betyder en carbamoylgruppe, hvorefter aminogruppen blokeres under sædvanlige betingelser.

5

Aminosyren med formlen IV, hvori R betyder en 5 alkanoylgruppe som ovenfor angivet eller en beskyttelses- 2 gruppe for aminogruppen, og hvori enten R betyder et 3 hydrogenatom og R betyder en carboxylgruppe, en carbamoylgruppe eller en alkyloxycarbonylgruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer og eventuelt er substitueret 10 med en phenylgruppe, eller hvori R1 betyder en ca'rboxy-gruppe, en carbamoylgruppe eller en alkyloxycarbonyl-gruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer og

O

eventuelt er substitueret med en phenylgruppe, og R betyder et hydrogenatom, kan fremstilles ifølge kendte 15 metoder ud fra lysin.

. 5

Derivatet af L-alanin med formlen V, hvori R betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet, kan fremstilles ved, at en syre med formlen VII eller et aktiveret derivat af denne syre omsættes med L-alanin, hvis syre-20 gruppe eventuelt er beskyttet i form af en ester, hvorefter man i påkommende tilfælde fjerner beskyttelsesgruppen plus syregruppen.

Når syregruppen i L-alanin er beskyttet, gennem- 4 føres kondensationen med syren med formlen VII sædvanlig-25 vis i nærværelse af et kondensationsmiddel, såsom dicyclo-hexylcarbodiimid, idet der arbejdes i et organisk opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid eller dimethylformamid, ved en temperatur mellem -10 og +30°C.

Når syregruppen i L-alanin er fri, er det nødven-30 digt at aktivere syren med formlen VII før omsætningen med L-alanin. Som aktiveret derivat af syren med formlen VII er det særlig hensigtsmæssigt at anvende et syrehalogenid eller et blandet anhydrid. Omsætningen gennemføres derved under de betingelser, der er angivet ovenfor for omsætnin- gen af en syre med formlen VII med et dipeptid med formlen VIII.

35

DK 154434B

II

o

Dipeptidet med formlen VIII kan fremstilles ved, at L-alanin, hvis aminogruppe er beskyttet, kondenseres med D-glutaminsyre eller et derivat deraf ifølge metoder, der sædvanligvis anvendes inden for peptidkemien, hvorefter beskyttelsesgruppen for aminogruppen fjernes.

5

Ved fremgangsmådevariant b) ifølge opfindelsen fremstilles tripeptiderne med formlen I ved, at man på en egnet bærer valgt blandt chlormethylerede eller hydroxy-methylerede copolymere af styren og divinylbenzen fikserer 10 en aminosyre med den almene formel XIV

7 31

R - NH - CH - K

(XIV) 5 I 2' 15 R - NH - CH - R^ . 21 3' hvori et af symbolerne R og R betyder en carboxylgruppe, og det andet betyder et hydrogenatom, en carbamoylgruppe eller en alkyloxycarbonylgruppe, hvis alkyldel indeholder 2o 1-4 carbonatomer (eventuelt er substitueret med en 5 phenylgruppe), R betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet eller en beskyttelsesgruppe for amino- 7 gruppen, og R betyder en beskyttelsesgruppe for amino- 5 7 gruppen, idet grupperne R og R er forskellige, når de 25 begge er en beskyttelsesgruppe for aminogruppen. Efter afblokering af den aminogruppe, der er beskyttet med grup- 7 pen R , gennemføres en af følgende reaktioner: a) omsætning med et derivat af D-glutaminsyre med den almene formel XV 30 R7 - NH - CH - CO - R4 I (XV)

CH2CH2 - COOH

4 7 hvori R og R har den ovenfor angivne betydning, hvor- η 35 efter den aminogruppe, der er beskyttet med gruppen R , afblokeres, og der omsættes med enten

1) et derivat af L-alanin med den almene formel XVI

12 DK 154434B

O

R7 - NH - CH - COOH

| (XVI) ch3 5 hvor har den ovenfor angivne betydning, hvorefter den 7 aminogruppe, der er beskyttet med gruppen R , afblokeres, og der gennemføres om nødvendigt en omsætning med en fedtsyre med formlen VII, eller

2) med et derivat af L-alanin med den almene formel XVII

10

R' -CO - NH - CH - COOH

f (XVII) ch3 hvori R* -CO betyder en alkanoylcrruope som ovenfor ancrivet, 15 “

b) omsætning med et dipeptid med den almene formel XVIII

RS-NH - CH - CO - NH - CH - CO - R4 | | (XVIII)

20 CH3 CH2CH2 - COOH

4 8 hvori R har den ovenfor angivne betydning, og R betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet eller en beskyt-

O

telsesgruppe for aminogruppen, idet, når R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, denne beskyttelses- 25 gruppe er forskellig fra den ovenfor definerede beskyttel- 5 sesgruppe R , og, efter afblokering af den aminogruppe, g der er beskyttet med gruppen R. , om nødvendigt omsætning med en syre med formlen VII. Det fremstillede produkt skilles derefter fra bæreren, og om nødvendigt fjernes 30 beskyttelsesgrupperne for aminogrupperne og carboxylgrup-perne.

Som bærer anvendes fortrinsvis chlormethylerede copolymere af styren og divinylbenzen (98:2 eller 99:1).

35 13

O

DK 154434 B

Fikseringen af aminosyren med formlen XIV på den chlormethylerede bærer gennemføres ifølge sædvanlige metoder. Især gennemføres omsætning med aminosyren opløst i et organisk opløsningsmiddel, såsom ethanol, idet omsæt-5 ningen gennemføres i nærværelse af en syreacceptor, såsom triethylamin. Det er særlig fordelagtigt at opvarme reaktionsblandingen til en temperatur nær opløsningsmidlets kogepunkt.

De ovenfor beskrevne metoder til kondensation af 10 aminosyrer, peptider eller syrer med en aminosyre fikseret på en egnet bærer, gennemføres ifølge metoder, der er sædvanligt anvendte indenfor peptidkemien. Det samme gælder blokeringen af de grupper, der ikke skal deltage i omsætningerne og de efterfølgende afblokeringer.

15 Beskyttelsesgrupperne for aminogrupperne i amino syren med formlen XIV bør vælges på en sådan måde, at de kan fjernes, uden at bindingen mellem aminosyren og bære-ren påvirkes. Grupperne R' og R er forskellige fra c gruppen R , når den sidstnævnte er en beskyttelsesgruppe 20 for aminogruppen, og de bør være således beskafne, at de kan fjernes uden påvirkning af beskyttelsesgruppen

C

R og bindingen mellem peptidet og bæreren.

Λ Λ » Når symbolerne R , R eller R4 betyder estergrupper, vælges de sædvanligvis på en sådan måde, at de under 25 spaltningen af bindingen mellem peptidet og bæreren enten forbliver upåvirkede eller omdannes til en carboxygruppe eller en carbamoylgruppe, afhængigt af, om spaltningen gennemføres ved sur hydrolyse, alkoholyse eller ammono-lyse.

30 Bindingen mellem peptidet og bæreren, hvilken bin ding er af benzyltypen, spaltes især ved behandling med en blanding af hydrogenbromidsyre og trifluoreddikesyre.

De omhandlede tripeptider med formlen I kan eventuelt renses ved anvendelse af fysiske metoder (såsom kry-35 stallisation eller chromatografi) eller kemiske metoder (såsom dannelse af et salt, krystallisation af dette og efterfølgende sønderdeling).

O

14

DK 154434B

De her omhandlede forbindelser kan omdannes til farmaceutisk acceptable additionssalte med syrer eller til farmaceutisk acceptable metalsalte eller til farmaceutisk acceptable additionssalte med organiske baser, afhæn-5 gigt af substituenternes natur.

Syreadditionssalterne kan fremstilles ved, at de her omhandlede forbindelser omsættes med syrer i et egnet opløsningsmiddel. Forbindelsen opløses sædvanligvis i vand ved tilsætning af den teoretiske mængde syre, hvorefter 10 den fremkomne opløsning frysetørres.

Metalsalterne og additionssaltene med organiske baser kan fremstilles ved, at de omhandlede forbindelser omsættes med baser i et egnet opløsningsmiddel. Sædvanligvis opløses forbindelsen i vand ved tilsætning af den 15 teoretiske mængde base, hvorefter den fremkomne opløsning frysetørres.

De omhandlede forbindelser med formlen X er ad-juvanser og immunitetsstimulerende stoffer. De forøger hypersensibilitetsreaktionerne og/eller produktionen af 20 cirkulerende antistoffer mod de antigener, sammen med hvilke de indgives, og de stimulerer på uspecifik måde forsvarsreaktionerne mod visse infektioner (f.eks. infektion hos mus med den intracellulære bakterie Listeria monocytogenes) .

25 In vitro er de aktive i molære koncentrationer på —3 _g mellem 10 og 10 M, især ved følgende forsøg: - stimulering af syntesen af DNA (mitogen evne) ved metoden ifølge G. Marchal, Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125 C, 519 (1974), 30 - stimulering af allogen reaktion (histo-uforenelig hedsreaktion) ved metoden ifølge R. W. Dutton, J. exp. Med., 122, 759 (1966) og A.B. Peck og F.H. Bach, J. Immunol.

Methods, 3, 147 (1973), - stimulering af produktionen af antistoffer ved 35 metoden ifølge P.H. Klesius, Proc. Soc. exp. Biol. Med.

(N.Y.), 135, 155 (1970) og H. van Dijk og N. Bloksma, J. Immunol. Methods, 14, 325 (1977),,

O

15

DK 154434B

- forøgelse af antallet af phagocytære macrophager ved metoden ifølge J. Michl et al., J. exp. Med., 144, 1465 (1976), - stimulering af aktiviteten af sur phosphatase 5 og N-acetylglucosamidinase (lysosom-enzymer hos macrophager) uden en forøgelse af lactat -dehydrogenase ved metoden ifølge P. Davies et al., J. exp. Med., 139, 1262 (1974),

In vivo udviser de omhandlede forbindelser følgende egenskaber: 10 Hos mus forøger de i doser mellem 1 og 30 mg/kg den forsinkede hypersensibilitet og produktionen af antistoffer, især ved metoden ifølge T.E. Miller et al., J. Nath. Cancer Inst., 51, 1669 (1973).

Hos marsvin forøger de hypersensibilitetsreakti-15 onen og produktionen af antistoffer mod okse-gammaglobulin koblet med haptenet dinitrophenol ved metoden ifølge F.

Floc'h et al., Immunol. Communic., T_, 41 (1978).

Hos mus stimulerer de forsvarsreaktionerne mod infektion med Listeria monocytogenes i doser mellem 1 og 20 100 m/kg ved metoden ifølge R.M. Fauve og B. Hevin, C.R.

Acad. Sci. (D), 285, 1589 (1977).

Hos mus stimulerer de det reticulo-endotheliale systems evne til fjernelse af kolloidt carbon ved metoden ifølge B.N. Halpern et al., Ann. Institut Pasteur, 80, 582 25 (1951).

Hos kaniner stimulerer de i doser på mellem 0,1 og 3 mg/kg dannelsen af serum-antistoffer mod influenzavirus ved metoden ifølge G.H. Werner et al., Biomedicine, 22, 440 (1975).

30 Af ganske særlig interesse er de tripeptider med formlen I, hvori R^ betyder en hydroxygruppe eller en 2 alkyloxygruppe med 1-4 carbonatomer, R betyder et hydro- 3 genatom eller en carbamoylgruppe, R betyder en carboxy-gruppe eller en alkyloxycarbonylgruppe, hvis alkyldel 35 indeholder 1-4 carbonatomer, hvori symbolet R, der er forbundet med L-alanylgruppen, betyder en alkanoylgruppe med

O

DK 154434B

16 8-16 carbonatomer, og symbolet R, der er forbundet med 2 aminogruppen i a-stilling til gruppen R , betyder et hydrogenatom. Særlig interessante er de forbindelser med 1 2 formlen I, hvori R betyder en hydroxygruppe, R betyder 3 5 en carbamoylgruppe, R betyder en carboxygruppe, og symbolerne R har den ovenfor angivne betydning.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres ved de følgende eksempler.

De fremstillede forbindelser kan danne komplekser 10 med alkalimetaller og jordalkalimetaller. Som følge heraf kan de opnåede elementæranalyseværdier for de fremstillede forbindelser adskille sig betydeligt fra de teoretiske værdier. Forbindelsernes struktur er imidlertid bekræftet ved hjælp af forholdet C/N, der stemmer overis ens med det teoretiske forhold, ved hjælp af indholdet af aminosyrer og ved hjælp af homogeniteten ved tyndt-lagschromatografi på silicagel.

Eksempel 1 3 20 1,88 cm isobutylchlorformiat sættes til en op løsning af 3,03 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat 3 3 i en blanding af"280 cm dioxan og 2,0 cm triethylamin, hvilken opløsning holdes ved 10°C. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 10°C, hvorefter der tilsættes en 25 opløsning af 4,04 g Nr-benzyloxycarbonyl-L-lysin i en blan- 3 ^ 3 ding af 30 cm dioxan og 14,4 cm IN natriumhydroxidopløsning. Den fremkomne reaktionsblanding omrøres i 20 timer ved ca. 18°C. Det dannede uopløselige stof opløses ved 3 tilsætning af 280 cm vand. Den fremkomne opløsning om-30 røres i yderligere 1 time og gøres derefter sur til en pH-værdi på 3 ved tilsætning af 20 cm IN saltsyre. Det dannede uopløselige stof fraskilles ved filtrering, vaskes 3 med 20 cm vand og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg) ved 20°C. Der fås herved 7,72 g af et hvidt fast stof, 35 der chromatograferes på en søjle med en diameter på 3,5 cm indeholdende 230 g neutralt silicagel. Der elueres først 17

DK 154434 B

0 3 med 700 cm af en blanding af acetone og cyclohexan i vo-lumenforholdet 9:1, derefter med 1,1 liter acetone og til slut med 1,7 liter metanol, og der opsamles fraktioner med et 3 volumen på 100 cm . Fraktionerne 22-35 forenes og koncen-_ treres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved Φ i 45°C. Der fås herved 5,97 g N -[O -benzyl-N-(N-lauroyl--L-alanyl)-Y-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbonyl-L-lysin.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,84 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blan-10 ding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

1,77 g N -[O^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-γ-D-gluta- UG m ^ myl] -Ng-benzyloxycarbonyl-L-lysin opløses i 177 cin methanol. Efter tilsætning af 1,77 g palladium på carbon 15 (3% palladium) ledes en svag hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 4 timer. Efter filtrering koncentreres filtratet til tørhed. Den tilbageværende olie op- 3 tages i 20 cm acetone. Der fås herved 1,06 g af et hvidt 3 fast stof, der omkrystalliseres fra en blanding af 12 cm 3 20 ethanol og 24 cm acetone.Herved fås 0,9 g N -[N-(N-lau-royl-L-alanyl)-Y-D-glutamyl]-L-lysin, der smelter (overgår til en pasta) ved 180-186°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,29 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blan-25 ding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet, %: C 59,07 H 9,15 N 10,60 Fundet, %: C 58,4 H 8,8 N 10,0

Efter fuldstændig hydrolyse viser en analyse ved 30 hjælp af en Technicon Autoanalyzer tilstedeværelsen af følgende aminosyrer: Ala 1,02 (teoretisk = 1), Glu 1,00 (teoretisk = 1), Lys 0,89 (teoretisk = 1).

Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat kan fremstilles ved en af følgende metoder.

35 a) Til en opløsning af 12,75 g benzyl-L-alanyl- 3 -α-D-glutamat-hydrochlorid i 75 cm IN natriumhydroxidopløsning 18

DK 154434 B

O

sættes samtidig i løbet af 37 minutter dels en opløsning af 8 g 3 3 lauroylchlorid i 75 cm ether og dels 37,4 cm IN natrxum-hydroxidopløsning, idet reaktionsblandingens pH-værdi holdes mellem 8 og 9. Reaktionsblandingen omrøres derefter il time og 20 minutter. Efter dekantering gøres vandfasen 5 3 sur til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af 60 cm IN salt- 3 syre, hvorefter den extraheres 3 gange med ialt 300 cm ethylacetat.De forenede organiske extrakter vaskes med 25 3 cm vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentre-res til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C.

Der fås herved 7,4 g af et hvidt fast stof, der chromatograf eres på 80 g neutralt silicagel i en søjle med en dia- 3 meter på 2 cm. Der elueres først med 100 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 8:2 og 3 15 derefter med 200 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforhoIdet 1:1 og opsamles fraktioner 3 med et volumen på 50 cm . Fraktion 1 koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 2 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat med 20 et smeltepunkt på 130° C. Fraktionerne 2-4 koncentreres til tørhed, og den herved fremkomne remanens chromatograf eres på 100 g neutralt silicagel (0,063-0,20 mm) i en søjle med en diameter på 2 cm. Der elueres med 250 3 . cm acetone og opsamles fraktioner med et volumen på 25 3 25 cm . Fraktionerne 1 og 2 koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 4,07 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat med et smeltepunkt på 130°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,9· ved tyndtlags-30 chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet, S: C = 66,10 H = 8,63 N = 5,71 Fundet, %: C=66,3 H = 8,8 N=5,6 3 35 b) 31 cm isobutylchlorformiat sættes til en op- løsning af 47,75 g laurinsyre i 3 liter dioxan og 33,3 cm 3

O

19

DK 154434 B

triethylamin,hvilken opløsning holdes ved en temperatur nær 10°C. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 10°C, hvorefter der i løbet af 10 minutter tilsættes en til 10°C afkølet opløsning af 88,95 g benzyl-L-alanyl-a- -D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 1 liter dioxan, 5 3 3 476 cm vand og 476 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved 10°C og derefter i 18 timer ved en temperatur nær 20°C. Reaktionsblandingen fortyndes derefter ved tilsætning af 4 liter vand, gøres sur 10 til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 475 cm IN saltsyre og holdes i 2 timer ved 0°C. Det dannede bundfald fra- 3 skilles ved filtrering, vaskes med 500 cm vand og med 500 3 cm ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C. Det fremkomne produkt suspenderes i 800 cm^ ether, 15 omrøres i 1 time, fraskilles ved filtrering og vaskes 3 to gange med ialt 200 cm ether. Efter tørring under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C fås 71,79 g benzyl--N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat med et smeltepunkt på 130°C.

20 Produktet giver en Rf-værdi på 0,77 ved tyndt- lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 4:1 som elueringsmiddel.

Benzyl-L-alanyl-a-D-glutamat-hydrochlorid kan frem-25 stilles på følgende måde.

97,16 g benzyl-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-alanyl- 3 -α-D-glutamat opløses i 970 cm af en vandfri 1,7 N opløsning af hydrogenchlorid i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer, hvorefter der hurtigt tilsæt-30 tes 3,8 liter vandfri ether, og den fremkomne blanding henstilles ved 0°C i 2 timer. Det dannede olieagtige bundfald skilles fra den ovenstående væske ved dekante- 3 ring og opløses i 500 cm acetone. Den herved fremkomne opløsning koncentreres til tørhed under formindsket tryk 35 (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 88,9 g benzyl-L-alanyl- -α-D-glutamat-hydrochlorid.

O

20

DK 154434 B

Benzyl-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-alanyl-a-D--glutamat kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives af E. Bricas et al., Biochemistry j), 823 (1970).

N£-benzyloxycarbonyl-L-lysin kan fremstilles 5 ifølge metoden, der beskrives af A. Neuberger et al.,

Biochem. J., _37, 515 (1943).

Eksempel 2 3 0,65 cm isobutylchlorformiat sættes til en til .jQ -10°C afkølet opløsning af 2,45 g benzyl-N-lauroyl-L-ala- 3 nyl-a-D-glutamat i en blanding af 80 cm tetrahydrofuran 3 og 0,70 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -10°C, hvorefter der tilsættes en til -10°C afkølet opløsning af 2,24 g benzyl-Ng-benzyloxycar-15 bonyl-L-lysinat-hydrochlorid i en blanding af 40 cm^ tetra- “3 hydrofuran og 0,77 cm triethylamin. Den fremkomne reaktionsblanding omrøres i 2 timer ved -10°c og derefter i 2 døgn ved ca. 20°C. Derefter koncentreres reaktionsblanding til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20 40°C. Det fremkomne hvide faste stof optages i 100 crn"^ ethylacetat ved 40°C, udrives til pulverisering, fra- 3 skilles ved filtrering, udrives på ny i 50 cm 0,1N saltsyre, fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg). Der fås herved 2,69 g benzyl- 25 ”Na“(°1"fc,enzy1"N“lauroY1-L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-Ng- -benzyloxycarbonyl-L-lysinat.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,80 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 30 9:1 som elueringsmiddel.

2,65 g benzyl-N-[O^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-

Ut alanyl)-Y-D-glutamyl]-Nc-benzyloxycarbonyl-L-lysinat op- 3 c løses i 265 cm eddikesyre. Der tilsættes 2,65 g palladium på carbon (3% palladium) og ledes en svag hydrogen-35 gasstrøm gennem blandingen i 3 timer. Efter filtrering og koncentrering af filtratet til tørhed under formindsket

O

21

DK 154434 B

tryk (20 mm Hg) ved 50°C fås 1,81 g n -[N-(N-lauroyl-L--alanyl)-V-D-glutamyl]-L-lysin, der er identisk med det i eksempel 1 fremstillede produkt.

Benzyl-Ng-benzyloxycarbonyl-L-lysinat kan frem-5 stilles ifølge metoden, der beskrives af T. Shiba et al.,

Bull. Chem. Soc. Japan, 3J3, 1721 (1960) .

o.

Eksempel 3 3 3,17 cm isobutylchlorformiat sættes til en op-10 løsning, der holdes ved 10°C, af 11,96 g benzyl-N-lauroyl- 3 -L-alanyl-a-D-glutamat i en blanding af 490 cm dioxan og 3 3,43 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 10°C, hvorefter der tilsættes en opløsning ' g af 8,87 g 88,8%"s (perchlorsyrebestemmelse) N -benzyl- 15 oxycarbonyl-DD,LL-2,7-diaminopimelamsyre i en blanding 3 3 af 219 cm vand og 24,4 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved en temperatur nær 10°C og derefter i 15 timer ved en temperatur nær 20°C, hvorefter den filtreres. Til filtratet sæt- 3 20 tes 360 cm vand, hvorefter der ved filtrering fraskilles et dannet, let upløseligt stof. Filtratet gøres 3 surt til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af 49 cm IN saltsyre. Det dannede bundfald fraskilles ved filtre- 3 ring, vaskes 3 gange med ialt 750 cm vand og tørres.

25 Der fås herved 16,3 g af et hvidt pulver, der chromato-graferes på 800 g neutralt silicagel (0,0635-0,20 mm) i en søjle med en diameter på 6 cm. Til dette formål 3 opløses pulveret i 800 cm metanol, og til den fremkomne opløsning sættes 160 g Fontainebleau-sand. Den frem-30 komne blanding inddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C, og den herved fremkomne remanens anbringes på silicagelsøjlen. Der elueres successivt med 1 liter ethylacetat, 4 liter af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 9:1, 7 liter 35 af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 85:15 og 4 liter af en blanding af ethylacetat

O

22

DK 154434 B

og methanol i volumenforholdet 1:1,og der opsamles frak- 3 tioner med et volumen på 250 cm . Fraktionerne 45-60 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Der fås herved 9,4 g N -[O - g 5 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-Y-D-glutamyl]-N-benzyl- oxycarbony1-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,83 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i 10 volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

4,07 g N2-[O^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-

C

-Y-D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino- 3 pimelamsyre opløses i 200 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 4 g palladium på carbon (3% palladium) ledes 15 en svag hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 7 timer. Efter filtrering koncentreres filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Den herved fremkomne marengslignende masse optages i flere 3 omgange i ialt 45 cm methylcyclohexan, idet hver gang 20 inddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Det herved fremkomne pulver tørres under for mindsket tryk (0,3 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 2,76 2 g N -(N-lauroyl-L-alanyl-Y-D-glutamyl)-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre .

25 Produktet giver en Rf-værdi på 0,49 ved tyndt- lagschromatografi på silicagel under anvendelse af eddikesyre som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet, %: C 56,72 H 8,64 N 12,25

Fundet, %: C 53,4 H 8,5 N 10,9 30 Efter fuldstændig hydrolyse viser en analyse ved hjælp af en Technicon Autoanalyzer tilstedeværelsen af følgende aminosyrer: Ala 1,00 (teoretisk = 1), Dap 0,99 (teoretisk =1), Glu 1,05 (teoretisk = 1).

g N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelam- or syre kan fremstilles på følgende måde.

O

23

DK 154434 B

Til en opløsning af 9,7 g DD,LL-2,6-diaminopime- 3 lamsyre-dihydrochlorid i 63 cm vand indstilles pH-vær- 3 dien til 10 ved tilsætning af 37 cm IN natriumhydroxid-opløsning. Der tilsættes derefter en opløsning af 4,35 g 3 kobber(II)bromid i 44 cm vand. Reaktionsblandingen om-røres i 2 timer ved ca. 20°C. Et let, uopløseligt stof fraskilles derefter ved filtrering, og filtratet afkøles til en temperatur mellem -3 og 0°C. Der tilsættes 9,2 g natriumhydrogencarbonat og derefter dråbevis i løbet af 3 30 minutter 7,9 cm benzylchlorformiat. Reaktionsblandingen omrøres i 18 timer ved- en temperatur nær 20°C.

Det dannede blå bundfald fraskilles ved filtrering og 3 3 vaskes med 15 cm vand, to gange med ialt 30 cm etha- * 3 nol og med 15 cm ether. Efter tørring af bundfaldet under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C fås 9,6 g 15 kobber(II)-kompleks af N0-benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6- 3 -diaminopimelamsyre. Dette kompleks sættes til 60 cm IN saltsyre. Den fremkomne blanding omrøres i 1 time ved en temperatur nær 20°C. Et uopløseligt stof fraskil- 3 20 les ved filtrering. Til filtratet sættes 30 cm methanol hvorefter en strøm af hydrogensulfid ledes gennem blandingen i 1 1/2 time. Reaktionsblandingen henstår derefter i 16 timer. Den fremkomne sorte grød filtreres og 3 vaskes fire gange med ialt 160 cm vand. De forenede 3 25 filtrater koncentreres til et volumen på 30 cm under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratets pH- 3 -værdi indstilles på 9 ved tilsætning af 7,5 cm triethyl- 3 amin. Der fortyndes derefter ved tilsætning af 20 cm vand og pH-værdien indstilles til 6 ved tilsætning af 5,5 3 30 cm IN saltsyre. Det herved dannede hvide grød holdes ved 0°C i 2 timer. Det dannede produkt fraskilles ved fil- 3 3 trering, vaskes med 20 cm vand og med 20 cm ethanol og tørres under formindsket tryk. Der fås herved 5,8 g 96%'s 6 (perchlorsyrebestemmelse) N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-35 -diaminopimelamsyre.

O

24

DK 154434 B

DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre-dihydrochlorid kan fremstilles på følgende måde. 83 g DD,LL-2,6-dibenzyl-oxycarbonylaminopimelamsyre opløses i en blanding af 1,6 liter methanol og 14,6 cm koncentreret saltsyre (d = 1,19) 5 Efter tilsætning af 83 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en hydrogengasstrøm gennem blandingen i 10 timer.

Efter filtrering koncentreres filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Der fås herved 40,5 g DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre-dihydrochlorid i form af 10 et marengslignende produkt.

DD,LL-2,6-dibenzyloxycarbonylaminopimelamsyre kan fremstilles på følgende måde.

168 g DD,LL-2,6-dibenxyloxycarbonylaminopimelin-syre-monobenzylester opløses i 1,68 liter metanol. Den 15 fremkomne opløsning afkøles til 0°C og mættes med ammoniak.

Den mættede opløsning anbringes i tre autoklaver med et volumen på hver 1 liter. Efter lukning af autoklaverne holdes disse i 40 timer ved en temperatur nær ca. 20°C.

Efter afgasning koncentreres den således fremkomne opløs-20 ning under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Remanensen opløses i 2 liter vand, og den fremkomne opløsnings pH-værdi indstilles på 2 ved tilsætning af 4N saltsyre.

Der dannes herved et gummiagtigt bundfald, der isoleres ved dekantering, udrives med 2 liter ether, fraskilles 3 25 ved filtrering og vaskes to gange med ialt 400 cm ether 3 og to gange med ialt 400 cm vand. Efter tørring fås 83,5 g DD,LL-2,6-dibenzyloxycarbonylaminopimelamsyre med et smeltepunkt på 145-150°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,69 ved tyndt-30 lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, ethanol, vand og koncentreret ammoniak i volumenforholdet 4:4:1:1 som elueringsmiddel.

DD,LL-2,6-dibenzyloxycarbonylaminopimelinsyre--benzylmonoester kan fremstilles ifølge metoden, der be-35 skrives af A. Arendt et al., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim.

Polonorum 48, 1305 (1974) [Chem. Abstr., 82, 31497 g (1975)].

3 25

DK 154434 B

O

Eksempel 4 0/81 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C afkølet opløsning af 2,5 g N-lauroyl-L-alanyl-D-iso- 3 3 glutamin i 150 cm dimethylformamid og 0,87 cm triethylamin.

5 Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til +2°C afkølet opløsning af 2,02 g g N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre i en 3 3 blanding af 62,5 cm vand og 6,25 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved 0°C 10 og derefter i 18 timer ved ca. 20°C, hvorefter den filtre- 3 res. Filtratet fortyndes ved tilsætning af 300 cm vand 3 og gøres surt til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 15 cm IN saltysre. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes tre gange med ialt 30 cm vand og tørres. Der fås Ί5 herved 2,03 g af et hvidt fast stof, til hvilket der sættes 680 mg af et produkt fremstillet under de samme betin- 3 gelser. Den fremkomne blanding opløses i 30 cm eddikesyre, indeholdende 5 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Blandingen koncentreres til tørhed, og den fremkomne rema-20 nens anbringes på søjle med en diameter på 2 cm indeholdende 60 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres suc- 3 cessivt med 400 cm af en blanding af ethylacetat og 3 eddikesyre i volumenforholdet 9:1, 360 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 8:2, 240 3 25 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumen- 3 forholdet 7:3, 160 cm af en blanding af ethylacetat og 3 eddikesyre i volumenforholdet 1:1 og 480 cm eddikesyre, 3 og der opsamles fraktioner med et volumen på 40 cm . Fraktionerne 17-49 forenes og koncentreres til tørhed. Der fås 2 30 herved 1,78 g N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]- g -N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,65 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 35 3*1 som elueringsmiddel.

DK 154434 B

26 0 2 1,76 g N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]- g -N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre oplø- 3 ses i 80 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 1,76 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en hydrogengasstrøm 5 gennem blandingen i 2,5 timer. Efter filtrering koncen- 3 treres filtratet til et volumen på ca. 5 cm . Koncentra- 3 tet fortyndes ved tilsætning af 100 cm ether. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes to gange 3 med ialt 40 cm ether og tørres. Herved fås 1,37 g 2 10 N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]-DD,LL-2,6--diaminopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,40 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i vo-15 lumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamin kan fremstilles på følgende måde.

6,6 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamat 3 opløses i 330 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 6,6 g 20 palladium på carbon (3% palladium) ledes en langsom hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 2 timer. Efter filtrering af reaktionsblandingen hældes filtratet i 3 liter vand. Efter 2 timers henstand ved 0°C fraskilles det dannede bundfald ved filtrering, vaskes to gange med 25 ialt 80 cm vand og tørres. Der fås herved 5,16 g af et produkt, til hvilket der sættes 0,5 g af et produkt fremstillet på samme måde. Den. fremkomne blanding opløses i 3 90 cm kogende metanol, og til den herved fremkomne op- 3 løsning sættes 45 cm vand. Efter 2 timers henstand ved 30 en temperatur nær 20°C fraskilles de dannede krystaller 3 ved filtrering, vaskes to gange med ialt 60 cm vand og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg). Der fås herved 5,1 g N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamin med et smeltepunkt på 163°C.

35 Produktet giver en Rf-værdi på 0,18 ved tyndt- lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en

O

27

DK 154434 B

blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 4:1 som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet, %: C = 60,12 H = 9,33 N - 10,52

Fundet, %: C = 60,2 H = 9,5 N = 10,9 5 Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat kan fremstilles på følgende måde.

3 2,54 cm isobutylchlorformiat sættes til en til 0°C afkølet opløsning af 3,9 g laurinsyre i 156 cm^ vand- 3 fri toluen og 2,7 cm triethylamin. Reaktionsblandingen om-10 røres i 20 minutter ved 0°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 6,7 g benzyl-L-alanyl-D-iso- 3 glutamat-hydrochlorid i 52 cm vand og 2,7 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 65 timer ved en temperatur nær 20°C. Der fås herved en reaktionsmasse med et 3 15 gelatinøst udseende, til hvilken der sættes 150 cm ethylacetat. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes med 30 cm vand og tørres. Der fås herved 7,6 g benzyl-L-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamat i form af et hvidt pulver. Vandfasen af det ovenfor fremstillede fil- 3 2o trat extraheres to gange med ialt 100 cm ethylacetat.

Den fremkomne ethylacetatfase forenes med filtratets organiske fase, hvorefter de forenede organiske faser vas- 3 3 kes med 125 cm 0,1N saltsyre og med 120 cm vand, tørres over magnesiumsulfat og koncentreres til tørhed under for-25 mindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved yderligere 1,5 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamat.

3

Produktet (7,6 g + 1,5 g) omkrystalliseres fra 120 cm methanol,Herved fås 6,6 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D--isoglutamat med et smeltepunkt på 169°C.

30 Produktet giver en Rf-værdi på 0,13 ved tyndt- lagschromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat som elueringsmiddel.

Benzyl-L-alanyl-D-isoglutamat-hydrochlorid kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives af S. Kusumoto, 35 Bull. Chem. Soc. Japan, £9, 533 (1976).

3 28

DK 154434 B

O

Eksempel 5 0,91 cm isobutylchlorformiat sættes til en til 0°C afkølet opløsning af 3,04 g benzyl-N-octanoyl-L- 3 -alanyl-a-D-glutamat i 150 cm tetrahydrofuran og 0,98 3 5 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 0°C, hvorefter der tilsættes en til 2°C afkølet g opløsning af 2,26 g N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-dia- 3 3 minopimelamsyre i en blanding af 70 cm vand og 7 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres i 10 1 time ved 0°C og derefter i 20 timer ved en temperatur nær 20°C. Tetrahydrofuranet afdampes derefter under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet fortyn- 3 des ved tilsætning af 50 cm vand og gøres surt til en 3 pH-værdi på 1 ved tilsætning af 10 cm IN saltsyre. Det 15 fremkomne hvide bundfald fraskilles ved filtrering, va- 3 skes tre gange med ialt 75 cm vand og tørres. Der fås herved 4,73 g af et hvidt fast stof, der chromatografe-res på en søjle med en diameter på 2,2 cm indeholdende 100 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Man opløser 20 herved produktet i 20 cm eddikesyre. Til den fremkomne opløsning sættes 10 g neutralt silicagel, hvorefter blandingen koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg). ved 50°C. Den fremkomne remanens anbringes 3 på søjlen. Der elueres successivt med 280 cm ethylace- o 25 tat, 360 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre 3 i volumenforholdet 9:1, 200 cm af en blanding af ethyl- o acetat og eddikesyre i volumenforholdet 8:2 og 160 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 1:1, og der opsamles fraktioner med et volumen på 30 3 40 cm . Fraktionerne 13-23 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås en olie, der størkner i ether. Efter frafiltrering og tørring af produktet fås 2,84 g N^-[O^-benzyl-N-(N- -octanoyl—L-alanyl)-2-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbonyl-35 -DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre.

DK 154434B

O

29

Produktet giver en Rf-værdi på 0,68 ved tyndt- lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3:1 som elueringsmiddel.

2,82 g N^-[O^-benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl)-5 g -D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelam- 3 syre opløses i 80 cm eddikesyre. Der tilsættes 2,82 g palladium på carbon (3% palladium) og ledes en hydrogengasstrøm gennem blandingen i 2 1/2 time. Efter filtrering koncentreres filtratet til et volumen på ca. 5 cm under 10 o formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50 C. Koncentratet fortyn- 3 des ved tilsætning af 100 cm ether. Der fås herved et bundfald, der fraskilles ved filtrering, vaskes med 3 2 20 cm ether og tørres. Herved fås 2,0 g N -[N-(N-octanoyl--L-alanyl)- / -D-glutamyl]-DD,LL-2,6-diaminopmelamsyre,

Ί ^ Q

der smelter (overgår til en pasta) ved 160-164 C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,30 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 2o 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet, %: C = 53,58, H = 8,02, N = 13,58 Fundet, %: C = 53,05, H = 8,17, N = 13,06

Efter fuldstændig hydrolyse viser en analyse ved hjælp af en Technicon Autoanalyzer tilstedeværelsen af 25 følgende aminosyrer: Ala 1,00 (teoretisk 1), Dap 0,95 (teoretisk 1), Glu 1,02 (teoretisk 1).

Benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-a-D-glutamat kan fremstilles på følgende måde.

3 3,6 cm isobutylchlorformiat sættes til en til „ -1°C afkølet opløsning af 3,95 g octansyre i 140 cm^ 3 tetrahydrofuran og 3,8 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -1°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 9,45 g benzyl-L-alanyl-a- 3 -D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 54,8 cm IN na- 3 35 triumhydroxidopløsning og 30 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved -1°C og derefter i 20 timer ved 30

DK 154434B

0 ca. 20°C. Reaktionsblandingen gøres derefter sur til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 1 N saltsyre. Tetrahydro-furan afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C, 3 hvorefter koncentratet ekstraheres med 100 cm ethylacetat.

Den herved fremkomne organiske fase vaskes to gange med 5 3 3 i alt 50 cm 1 N saltsyre og med 25 cm af en mættet na- triumchloridopløsning, hvorefter den koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 10 g af en lysegul olie, der chromatograferes på en søjle med en diameter på 2,5 cm indeholdende 200 g neutralt 10 silicagel (0,063-0,20 mm), der elueres med ethylacetat og opsamles fraktioner med et volumen på 100 cm . Fraktionerne 7-9 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Remanensen udrives i 100 cm^ af en blanding af ether og petroleumsether (kogepunkt 35-60°C) 15 1 volumforholdet 1:4. Bundfaldet fraskilles ved filtrering og tørres. Der fås 3,27 g benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-a-D--glutamat i form af et hvidt pulver.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,56 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding 20 af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 8:2 som elueringsmiddel.

Eksempel 6 3 0,70 cm isobutylchlorformiat sættes til en til 25 0 2 C afkølet opløsning af 2,91 g benzyl-N-palmitoyl-L-alanyl- 3 3 -a-D-glutamat i 120 cm tetrahydrofuran og 0,75 cm triethyl-amin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 2°C, hvorefter der tilsættes en til 2°C afkølet opløsning af

C

1,726 g N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre 30 3 3 i en blanding af 53,4 cm vand og 53,4 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved 2°C og derefter i 18 timer ved en temperatur nær 20°C. Tetrahydrofuranet afdampes derefter under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet fortyndes ved tilsætning af 50 cm^ vand 35 3 og gøres surt til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 10 cm 1 N saltsyre. Det fremkomne hvide bundfald fraskilles ved 31

DK 154434 B

O 3 filtrering, vaskes tre gange med i alt 75 cm vand og tør res. Der fås herved 4,15 g af et hvidt fast stof, der chro-matograferes på en søjle med en diameter på 3 cm indeholdende 85 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Man opløser herved produktet i eddikesyre ved 60°C. Til den fremkomne opløsning 5 sættes 10 g neutralt silicagel, hvorefter blandingen koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den herved fremkomne remanens anbringes på søjlen.

3 3

Der elueres successivt med 320 cm ethylacetat, 360 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforhol-10 3 det 9:1 og 320 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 8:2, og der opsamles fraktioner med et volumen på 40 cm . Fraktionerne 14-22 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C.

15 3

Den fremkomne remanens udrives i 50 cm ether, hvorefter den fraskilles ved filtrering og tørres. Der fås herved 2,20 g N2-TO^-benzyl-N-(N-palmitoyl-L-alanyl)-j^-D-glutamyl]- g -N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre.

^ Produktet giver en Rf-værdi på 0,75 ved tyndtlags- chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3:1 som elueringsmiddel.

2,14 g N2-[O^-benzyl-N-(N-palmitoyl-L-alanyl)- j( - g -D-glutamy1]-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre ^ 3 opløses i 80 cm eddikesyre. Der tilsættes 2,14 g palladium på carbon (3% palladium) og ledes derefter en langsom hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 2,5 timer. Efter filtrering koncentreres filtratet til et volumen på ca.

A

„ 5 cmJ under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentra- 3ϋ 3 tet fortyndes ved tilsætning af 100 cm ether. Herved fås et bundfald, der fraskilles ved filtrering, vaskes to gange 3 2 med ialt 20 cm ether og tørres. Der fås 1,58 g N -[N-(N- -palmitoyl-L-alanyl)- X-D-glutamyl]-DD,LL-2,6-diaminopimelam-35 sYre·

O

32

DK 154434 B

Produktet giver en Rf-værdi pa 0,30 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Benzyl-N-palmitoyl-L-alanyl-a-D-glutamat kan frem-stilles på følgende måde.

3,6 an isobutylchlorformiat sættes til en til 0°C

3 afkølet opløsning af 7,03 g palmitinsyre i 140 cm tetrahydrofuran og 3,8 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 0°C, hvorefter der tilsættes 10 en til 0°C afkølet opløsning af 9,45 g benzyl-L-alanyl-a-D- 3 -glutamat-hydrochlorid i en blanding af 54,8 cm IN natrium- 3 hydroxidopløsning og 30 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved 0°C og derefter i 18 timer ved en temperatur nær 20°C, hvorefter den gøres sur til en pH-værdi på 15 3 1 ved tilsætning af 70 cm IN saltsyre. Det dannede bundfald 3 fraskilles ved filtrering, vaskes fem gange med ialt 500 cm vand og tørres. Der fås herved 12,11 g af et hvidt pulver, der chromatograferes på en søjle med en diameter på 2,5 cm indeholdende 20 g neutralt silicagel (0,063-0,20 mm). Der 20 3 3 elueres først med 200 cm ethylacetat, derefter med 300 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 9:1, derefter med 1,6 liter af en blanding af ethylacetat og 3 methanol i volumenforholdet 8:2 og til slut med 400 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet ^ 3 6:4, og der opsamles fraktioner med et volumen på 100 cm .

Fraktionerne 5-23 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 5,18 g 3 af et fast stof, der udrives i 50 cm kogende ether i 1/2 ti-3Q me. Efter afkøling til en temperatur på nær 20°C fraskilles det uopløselige stof ved filtrering, hvorefter det vaskes 3 tre gange med ialt 75 cm ether og tørres. Der fås herved 2,94 g benzyl-N-palmitoyl-L-alanyl-a-D-glutamat.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,77 ved tyndtlags-35 chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat som elueringsmiddel.

O

33

DK 154434 B

Eksempel 7 1,3 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C afkølet opløsning af 4,91 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl- ί-D- 3 -glutamat i en blanding af 250 cm tetrahydrofuran og 3 5 1,4 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minut ter ved —5qC, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 3,32 g methyl-N.. -benzyloxycarbonyl-L-lysinat- C 3 -hydrochlorid i en blanding af 10 cm IN natriumhydroxid- 3 opløsning og 10 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i iq 10 minutter ved -5°C og derefter i 4 døgn ved en temperatur på nær 20°C, hvorefter den gøres sur til en pH-værdi på 1 o ved tilsætning af 20 cm 1 N saltsyre. Tetrahydrofuranet afdampes ved koncentrering under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Koncentratet ekstraheres fem gange med i alt 3 15 150 cm chloroform. Chloroformfaserne forenes, vaskes med 3 40 cm 0,1 N saltsyre og tørres over natriumsulfat. Efter koncentrering til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C fås en lysegul olie, der opløses i 60 cm3 chloroform indeholdende 15 g neutralt silicagel (0,04-0,(163 mm).

20 Blandingen koncentreres til tørhed, og den fremkomne remanens anbringes på en søjle med en diameter på 3 cm indeholdende 150 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres med 3 2,5 liter ethylacetat og derefter med 400 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 95:5 og 25 opsamles fraktioner med et volumen på 100 cm . Fraktionerne 6-27 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 3,47 g methyl-N - 1 j α -[0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl) - \ -D-glutamyl] -N^. -ben- zyloxycarbonyl-L-lysinat i form af et hvidt pulver.

30 Produktet giver en Rf-værdi på 0,70 ved tyndt- lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 95:5 som elueringsmiddel, og det giver en Rf-værdi på 0,40 ved tyndtlagschromatografi på silicagel under anvendel-se af 35 ethylacetat som elueringsmiddel.

34

DK 154434 B

o 3,42 g methyl-IT -[O^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- α 3 - ^-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbonyl-L-lysinat opløses i 70 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 3,43 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en svag hydrogengasstrøm gennem reaktions-5 blandingen i 2 timer. Katalysatoren fraskilles ved filtrering og vaskes to gange med i alt 20 cm^ eddikesyre. De forenede filtrater koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den herved fremkomne remanens udrives i 50 cm ether. Der fås et pulver, der fraskilles ved 10 filtrering og tørres i luft. Herved fås 1,89 g methyl-Na~ -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-%-D-glutamyl]-L-lysinat.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,50 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 15 50:20:6:24 som elueringsmiddel, og det giver en Rf-værdi på 0,29 ved tyndtlagschromatografi på silicagel under;anvendelse af eddikesyre som elueringsmiddel.

Eksempel 8

20 1/6 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C

afkølet opløsning af 6,07 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a- 3 -D-glutamat i en blanding af 280 cm tetrahydrofuran og 3

1,74 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 3°C

r 25 afkølet opløsning af 4 g N -benzyloxycarbonyl-meso-2(L),6(D)- 3

-diaminopimelamsyre i en blanding af 12,4 cm 1 N natrium-hydroxidopløsning og 124 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 10 minutter ved 0°C og derefter i 70 timer ved en temperatur på ca. 20°C. Reaktionsblandingen gøres derefter 30 sur til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 20 cm 1 N

saltsyre. Tetrahydrofuranet afdampes ved koncentrering under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet indeholder et hvidt bundfald, der fraskilles ved filtrering, vaskes 3 tre gange med i alt 150 cm 0,1 N saltsyre og tre gange o 35 med i alt 150 cm vand og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C. Herved fås 9,15 g af et hvidt pulver, 35

DK 154434 B

0 3 der opløses i 100 cm eddikesyre indeholdende 20 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Blandingen koncentreres til tørhed, og den fremkomne remanens anbringes på en søjle med en diameter på 5 cm indeholdende 400 g neutralt silicagel (0,04- -0,063 mm). Der elueres successivt med 1,6 liter ethylacetat, ° 3 900 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i 3 volumenforholdet 97,5:2,5, 1200 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 95:5, 3 900 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i 3 volumenforholdet 92,5:7,5, 900 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 90:10, 300 cm^ af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforhol- 3 det 85:15 og 3200 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 80:20. Der opsamles fraktioner

O

med et volumen på 100 cm . Fraktionerne 61-90 forenes lo og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Det fremkomne hvide faste stof vaskes to gange med i alt 100 cm ether og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg) ved 60°C. Herved fås 6,3 g N1-[0^-berczyl- V fk 20 -N-(N-lauroyl-L-alanyl)- ( -D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl- -meso-2(L)-6(D)-diaminopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,77 ved tyndtiags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet .3:1 som elueringsmiddel.

8,2 g N2-[O^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /-D--glutamyl]-N6-benzyloxyearbonyl-meso-2(L>,6(D)-diamino-pimelamsyre opløses i 225 cm eddikesyre. Der tilsættes 8,2 g palladium på carbon (3% palladium) og ledes en svag 3Q hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 3,5 timer.

Efter filtrering koncentreres filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den fremkomne olie 3 udrives i 100 cm ether til fuldstændig pulverisering, hvorefter pulveret frafiltreres og tørres under formindsket 35 tryk (0,3 mm Hg) ved 50°C. Der fås 5,9 g pulver. .0,9 g af dette pulver opløses i eddikesyre, og opløsningen ledes 2

O

36

DK 154434 B

gennem en søjle af neutral silicagel (0,04-0,63 mm) (søjlediameter 2 cm, søjlehøjde 2 cm). Filtratet koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den fremkomne remanens optages i 50 cm ether, hvorefter produktet 5 fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg) ved 55°C. Der fås 0,75 g N^-[N-(N-lauroyl-L-ala-nyl)- ^ -D-glutamyl]-meso-2 (L) ,6 (D)-diaminopimelansyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,38 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding 10 af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet, %: C = 56,72, H = 8,64, N = 12,25 Fundet, %: C = 52,8, H = 8,1, N = 11,6

Sulfataske: 6,9%.

15 Efter fuldstændig hydrolyse viser en analyse ved hjælp af en Technicon Autoanalyzer tilstedeværelsen af følgende aminosyrer: Ala 1,02 (teoretisk 1), Dap 0,96 (teoretisk 1), Glu 1,00 (teoretisk 1).

N -benzyloxycarbonyl-meso-2(L),6(D)-diaminopimelam-20 syre kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives i belgisk patentskrift nr. 821.385.

Eksempel 9 2 0,65 cm isobutylchlorformiat sættes til en til 25 -5 C afkølet opløsning af 2,383 g benzyl-N-undecanoyl-L- -alanyl-a-D-glutamat i en blanding af 100 cm tetrahydro- 3 furan og 0,7 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres 1 2 3 30 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til o 6 2 0 C afkølet opløsning af 1,617 g N -benzyloxycarbonyl-LL,DD- 3 30 -2,6-diaminopimelamsyre i en blanding af 5 cm 1 N natrium- 3 hydroxidopløsning og 50 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres 1 nogle minutter ved 0°C og derefter i 40 timer ved ca.

20°C. Reaktionsblandingen gøres derefter sur til en pH-værdi 3 på 1 ved tilsætning af 10 cm 1 N saltsyre. Tetrahydrofuranet 35 afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncen tratet indeholder et bundfald, der fraskilles ved filtrering, 37

DK 154434 B

0 3 vaskes tre gange med i alt 60 cm 0,1 N saltsyre og med 3 20 cm vand og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg) ved 20°C. Herved fås 3,66 g af et hvidt fast stof, der 3 opløses i 20 cm eddikesyre indeholdende 10 g neutralt sili-5 cagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og remanensen anbringes på en søjle med en diameter på 3,5 cm indeholdende 75 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm).

Der elueres successivt med 600 cm^ af en blanding af ethyl- 3 iq acetat og cyclohexan i volumenforholdet 1:1, 600 cm af en blanding af ethylacetat og cyclohexan i volumenforholdet 3 3 3:1, 400 cm ethylacetat, 600 cm af en blanding af ethyl- 3 acetat og eddikesyre i volumenforholdet 95:5, 500 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 3 15 og 1200 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 85:15. Der opsamles fraktioner med et 3 volumen på 100 cm . Fraktionerne 22-32 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved Λ 50°C. Det fremkomne amorfe faste stof optages i 80 can ether 2o og udrives til fuldstændig pulverisering. Pulveret fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (O.,3 mm Hg).

2 1

Herved fås 2,58 g N -[0 -benzyl-N-(N-undecanoyl-L-alanyl)- - '( -D-glutamyl ] -N -benzyloxycarbonyl-LL,DD-2,6-diaminopimelam-syre.

25 Produktet giver en Rf-værdi på 0,62 ved tyndtlags- chromatografi på silicagel under anvendelse af en "blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmiddel.

2,55 g N^-[O^-benzyl-N-(N-undecanoyl-L-alanyl)- V - C.

30 -D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-LL,DD-2,6-diaminopimelam- 3 syre opløses i 35 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 2,55 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en svag hydrogengasstrøm gennem .reaktionsblandingen i 2,5 timer. Katalysatoren fraskilles ved filtrering og vaskes tre gange 3 35 med i alt 30 cm eddikesyre. Filtratet koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Det

DK 154434B

38 0 3 fremkomne amorfe faste stof optages i 50 cm ether. Efter frafiltrering af produktet og tørring under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C fås 1,87 g N2-[N-(N-undecanoyl-L-alanyl)-- V-D-glutamyl]-LL,DD-2,6-diaminopimelamsyre.

5 Produktet giver en Rf-værdi på 0,75 ved tyndtlags- chromatografi på silicagel under anvendelse af eddikesyre som elueringsmiddel.

Benzyl-N-undecanoyl-L-alanyl-a-D-glutamat kan fremstilles på følgende måde.

3 10 3,56 cm isobutylchloroformiat sættes til en til -5°C afkølet opløsning af 5,1 g undecansyre i en blanding 3 3 af 140 cm tetrahydrofuran og 3,84 cm triethylamin. Den fremkomne blanding omrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 9,45 g 15 benzyl-L-alanyl-a-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 54,8 cm2 1 N natriumhydroxidopløsning og 30 cm2 vand. Reaktionsblandingen omrøres i 10 minutter ved -5°C og derefter i 20 timer ved ca. 20°C, hvorefter den gøres sur 3 til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 60 cm 1 N saltsyre.

20 Tetrahydrofuranet afdampes ved koncentrering under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet ekstraheres 3 to gange med i alt 80 cm ethylacetat. Ethylacetatfaserne 3 forenes, vaskes med 40 cm vand og tørres over natriumsulfat. Efter filtrering og koncentrering til tørhed under formind-25 sket tryk (20 mm Hg) ved 50°C fås 11,89 g af en olie, der chromatograferes på en søjle med en diameter på 5,4 cm indeholdende 250 g neutralt silicagel (0,04-0,063imm).

Der elueres med ethylacetat og opsamles fraktioner med et volumen på 100 cm . Fraktionerne 3-5 forenes og koncen-* 3Q treres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C. Der fås herved 5,85 g af et dejagtigt fast stof, der chroma tograf eres på en søjle med en diameter på 3,2 cm indeholdende 115 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres successivt med 1 liter af en blanding af ethylacetat og 35 cyclohexan i volumenforholdet 1:1, 1,7 liter ethylacetat og 3 600 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumen- 39

DK 154434 B

® 3 forholdet 99:1 og opsamles fraktioner med et volumen på 100 cm .

Fraktionerne 11-30 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 2,47 g benzyl-N-undecanoyl-L-alanyl-a-D-glutamat i form af et hvidt 5 fast stof.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,71 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elueringsmiddel.

to

Eksempel 10 3 0,69 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C afkølet opløsning af 2,57 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl- 3 -α-D-glutamat i en blanding af 120 cm tetrahydrofuran og 3 15 0,74 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minut ter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet 6 opløsning af 1,7 g N -benzyloxycarbonyl-LL,2,6-diamino- 3 pimelamsyre i en blanding af 5,25 cm IN natriumhydroxid- 3 opløsning og 35 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 20 20 minutter ved -3°C og derefter i 22 timer ved ca. 20°C, hvorefter den gøres sur til en pH-værdi på 2 ved tilsætning 3 af 20 cm 1 N saltsyre. Det dannede bundfald fraskilles ved 3 filtrering, vaskes tre gange med i alt 60 cm 0,1 N saltsyre 3 og tre gange med i alt 60 cm vand. Efter tørring i.fri 25 luft fås 3,97 g af et hvidt pulver, der chromatograferes på 200 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en søjle med en diameter på 3,8 cm.

3

Der elueres successivt med 600 cm ethylacetat, 3 500 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i 3 30 volumenforholdet 95:5 og 8.00 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 og opsamles 3 fraktioner med et volumen på 50 cm . Fraktionerne 2:4-30 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den fremkomne olie optages i 100 cm^ 35 ether og udrives indtil fuldstændig pulverisering. ^Pulveret fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk

O

40

DK 154434 B

(0,3 mm Hg). Der fås herved 1,24 g N2-[O^-benzyl-N-(N-lauroyl-

C

-L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diami-nopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,85 ved tyndtlags-5 chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:4 som elueringsmiddel, og det giver en Rf-værdi på 0,76 ved tyndtlagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i 10 volumenforholdet 3:1 som elueringsmiddel.

1,36 g N2-[O^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-γ- r -D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-LL,2,6-diaminopimelamsyre 3 opløses i 40 cm eddikesyre. Der tilsættes 1,4 g palladium på carbon (3% palladium) og ledes en svag hydrogengasstrøm 15 gennem blandingen i 4 timer. Efter filtrering koncentreres filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) Λ ved 55°C. Den fremkomne olie optages i 100 cm"3 ether og udrives indtil fuldstændig pulverisering. Pulveret fraskilles ved filtrering og tørres i luften. Herved fås 0,96 g nr\ 2 .

Ν'-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-LL-2,6-diamxnopime-lamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,38 ved tyndtlagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i 25 volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

g N -benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diaminopimelamsyre kan fremstilles på følgende måde.

En opløsning af 5 g LL-2,6-diaminopimelamsyre- 3 -dihydrochlorid i 15 cm vand indstilles til en pH-værdi 30 3 på 10 ved tilsætning af 45 cm 1 N natriumhydroxidopløsning, hvorefter der tilsættes en opløsning af 2,14 g kobber(II)bro- 3 mid i 20 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved ca. 20°C. Ved filtrering fraskilles et let uopløseligt stof, og filtratet afkøles til en temperatur mellem -3 og 35

O

DK 154434B

41 0°C. Til filtratet sættes 4,8 g natriumhydrogencarbonat og derefter dråbevis i løbet af 30 minutter 4,1 cm benzyl-chlorformiat. Den fremkomne reaktionsblanding omrøres i 18 timer ved en temperatur nær 20°C. Det dannede blå bund- 5 fald fraskilles ved filtrering, vaskes tre gange med i alt 3 3 90 cm vand, tre gange med i alt 90 cm ethanol og tre gange med i alt 90 cm^ ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 4,18 g kobber(II)kompleks g af N -benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diaminopimelamsyre. Til 3 to dette kompleks sættes 28 cm 1 N saltsyre. Blandingen omrøres i 1 time ved en temperatur nær 20°C. Ved filtrering 3 fraskilles et uopløseligt stof. Til filtratet sættes 14 cm methanol, hvorefter en strøm af hydrogensulfid ledes gennem blandingen i 6 timer. Reaktionsblandingen henstilles derefter 15 i 16 timer. Den fremkomne sorte grød filtreres og vaskes o tre gange med i alt 15 cm vand. De forenede filtrater kon-centreres til et volumen på 10 cm under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet indstilles på en pH-værdi på 7 ved tilsætning af 5 cm triethylamin og derefter på 20 en pH-værdi på 6,8 ved tilsætning af 5 cm 1 N saltsyre.

Det herved fremkomne hvide bundfald holdes ved 0°C i 2 timer. Det dannede produkt fraskilles ved filtrering og vaskes 3 tre gange med i alt 30 cm vand, tre gange med i alt 3 3 30 cm ethanol og tre gange med i alt 30 cm ether.

25 Efter tørring ved 60°C under formindsket tryk (0,3 mm Hg) g fås 1,78 g N -benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diaminopimélamsyre.

[a]^°° = +11° (c = 1, HC1 IN)

Produktet giver en Rf-værdi på 0,45 vedrtyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding 30 af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

LL-2,6-diaminopimelamsyre-dihydrochlorid kan fremstilles på følgende måde..

17 g LL-2,6-difeenzyloxycarbonylaminopimeQ.amsyre oplø- Λ 35 ses i en blanding af 300 cm"3 methanol og 5,9 cm-3 -koncentreret saltsyre (d = 1,19)» Efter tilsætning af 17 g palladium

O

DK 154434B

42 på carbon (3% palladium) ledes en hydrogengasstrøm gennem blandingen i 4 timer. Efter filtrering koncentreres filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 55°C,

Der fås 8,8 g LL-2,6-diaminopimelamsyre-dihydrochlorid i form af et marengslignende produkt.

O

LL-2,6-dibenzyloxycarbonylaminopimelamsyre kan fremstilles på følgende måde.

2 6 19 g surt benzyl-LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-

O

-diaminopimelat i opløses i 190 cm methanol. Den frem-komne opløsning afkøles til 0°C og mættes med ammoniak.

Den mættede opløsning hældes i en autoklav med et volumen på 1 liter. Efter lukning af autoklaven holdes denne i 6 døgn ved ca. 20°C. Efter afgasning koncentreres den fremkomne opløsning under formindsket tryk (20 mm Hg) ved o 50°G. Remanensen opløses i 250 crn vand, og den fremkomne opløsnings pH-værdi indstilles på 2 ved tilsætning af 3 30 cm 4 N saltsyre. Opløsningen ekstraheres derefter 3 tre gange med i alt 300 cm ethylacetat. Den organiske 3 fase vaskes med 100 cm af en mættet natriumchloridopløsning, 20 tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 17 g LL-2,6-dibenzyloxycarbonylaminopimelamsyre i form af en olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,68 ved tyndtlags- 25 chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

2 6

Surt benzyl-LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-diamino- pimelat kan fremstilles på følgende måde.

2 6 30 55 g benzyl-LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-di- 3 aminopimelat opløses i 400 cm benzylalkohol opvarmet til 40°C. Opløsningen holdes ved 40°C i ca. 1 timef hvorefter der i løbet af 6,5 timer tilsættes en opløsning af 4,8 g 86%'s kaliumhydroxidpastiller i 400 cm benzylalkohol.

35 Den fremkomne reaktionsblanding omrøres ved ca. 20°C i 16 timer, hvorefter den koncentreres til tørhed under for-

DK 154434 B

O

43 mindsket tryk (0/5 mm Hg) ved 90°C. Der fås en olie, der opløses i 1 liter vand. Den fremkomne opløsning ekstra-heres tre gange med i alt 900 cm ethylacetat. Den således ekstraherede vandfase gøres sur til en pH-værdi på 2 ved 3 5 tilsætning af 45 cm 4 N saltsyre og ekstraheres tre gange med i alt 1,5 liter ethylacetat. Den herved fremkomne 3 ethylacetatfase vaskes med 500 cm af en mættet natrium-chloridopløsning og tørres over vandfrit natriumsulfat.

Efter fjernelse af natriumsulfatet ved filtrering tilsættes 3 10 17 cm dicyclohexylamin, hvorefter blandingen koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 40°C.

3

Herved fås en gul olie, der opløses i 100 cm ethanol, 3 hvorefter der tilsættes 100 cm vand. Efter 20 timer ved 0°C fås et hvidt fast stof, der fraskilles ved filtrering, 3 15 vaskes to gange med i alt 100 cm vand og optages i en bian- 3 3 ding af 200 cm ethylacetat og 200 crrr vand. Vandfasen gøres 3 sur ved tilsætning af 40 em af en 1 N opløsning af methan-sulfonsyre. Efter dekantering vaskes den organiske fase 3 to gange med i alt 100 cm vand, hvorefter den tørres over 20 vandfrit natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås Γ5 g 2 6 surt benzyl-LL-N ,N -dibenzyloxycarbony1-2,6-diaminopimelat i form af en olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,76 ved tyndt- 25 lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butandL, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

2 6

Dibenzyl-LL-N ,.Ή -dibenzyloxycarbony 1-2,'6-diaminopimelat kan fremstilles på følgende måde.

3 30 I en trehalset kolbe med et volumen på 500 cm for synet med en central omrører og et Dean-Stark-apparat ind- 2 6 føres en blanding af 44,7 g LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl- 3 -2,6-diaminopimelinsyre, 3 g p-toluensulfonsyre, ‘30 cm 3 benzylalkohol og 300 cm toluen. Reaktionsblandingen koges 35 under tilbagesvaling i 5 timer, hvorefter den omrøres ved 20°C i 16 timer. Et hvidt, uopløseligt stof fraskilles ved 44

DK 154434 B

0 3 filtrering og vaskes to gange med i alt 400 cm af en 5%'s natriumcarbonatopløsning og to gange med i alt 400 cm vand. Efter tørring i fri luft fås 55,4 g dibenzyl-2 6 -LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-diaminopimelat med et 5 smeltepunkt på 118°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,53 ved tyndtlags- chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af eddikesyre og ethylacetat i volumenforholdet 8:2 som elueringsmiddel.

2 6 10 LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-diaminopimelinsyre kan fremstilles ufølge metoden, der beskrives af A.Arendt et al., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, 635 (1974).

15 Eksempel 11 0,91 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til 0°C afkølet opløsning af 3,14 g benzyl-N-(3,5,5-trimethyl- 3 hexanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamat i en blanding af 150 cm 3 tetrahydrofuran og 0,98 cm triethylamin. Reaktionsblandin-2Q gen omrøres i 20 minutter ved 0°C, hvorefter der tilsættes a f en til 0 C afkølet opløsning af 2,263 g N -benzyloxycarbo- 3 nyl-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre i en blanding af 7 cm 1 N natriumhydroxidopløsning og 70 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved 0°C og derefter i 20 timer ved 25 ca. 22°C. Efter frafiltrering af et let uopløseligt stof gøres reaktionsblandingen sur til en pH-værdi på 1 ved til- 3 sætning af 12 cm IN saltsyre. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Det fremkomne koncentrat ekstraheres tre gange med i alt 150 cm ethyl- o 30 acetat. Ethylacetatfaserne forenes, vaskes med 20 cm 0,1 N saltsyre, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C.

Herved fås 5,14 g af et amorft fast stof, der opløses i 3 60 cm af en blanding af lige volumendele ethylacetat og 35 eddikesyre indeholdende 10 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Blandingen koncentreres til tørhed under formindsket

DK 154434 B

O

45 tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og den fremkomne remanens anbringes på en søjle med en diameter på 3 cm indeholdende 100 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres successivt 3 3 med 400 cm ethylacetat, 200 cm af en blanding af ethyl- 3 5 acetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1, 200 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3 8:2, 160 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre 3 i volumenforholdet 6:4 og 240 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 1:1, og der opsamles 10 fraktioner med et volumen på 40 cm . Fraktionerne .15-25 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den fremkomne olie optages i 50 cm3 ether og udrives indtil pulverisering. Pulveret fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg).

15 Herved fås 2,85 g N3- ^O^-benzyl-N-[N-(3,5,5-trimethylhexa-noyl)-L-alanyl]-γ-D-glutamyl l -N -benzyloxycarbonyl-DD,LL--2,6-diaminopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,32 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding 20 af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3:1 som elueringsmiddel.

2,76 g N^- iO^-benzyl-N-[N-(3,5,5-trimethylhexa- ^ v g noyl)-L-alanyl]-γ-D-glutamyl 1 -N -benzyloxycarbonyl-DD,LL- ' 3 -2,6-diaminopimelamsyre opløses i 100 cm eddikesyre.

25 Efter tilsætning af 2,76 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en svag hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 2 1/2 timer. Efter filtrering koncentreres filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C.

3

Den fremkomne olie udrives i 50 cm ether. Herved dannes 30 et bundfald, der fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg) ved 20°C. Der fås 2,07 g N3- £ N-[N-(3,5,5-trimethylhexanoyl)-L-alanyl]-γ-D-glutamyl J- --DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,32 vedttyndtlags-35 chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet

O

46

DK 154434 B

50:20:6:24 som elueringsmiddel, og det giver en Rf-værdi på 0,31 ved tyndtlagschromatografi på silicagel under anvendelse af eddikesyre som elueringsmiddel.

Benzyl-N-(3,5,5-trimethylhexanoyl)-L-alanyl-a-D-5 -glutamat kan fremstilles på følgende måde.

4,3 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -6°C afkølet opløsning af 7,59 g N-(3,5,5-trimethylhexanoyl)--L-alanin i en blanding af 400 cm tetrahydrofuran og 3

4,63 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i !0 20 minutter ved -6°C, hvorefter der tilsættes en til 3°C

afkølet opløsning af 9,06 g benzyl-a-D-glutamat-hydrochlorid 3 i en blanding af 66,2 cm 1 N natriumhydroxidopløsning 3 og 14 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 15 minutter ved -5°C og derefter i 66 timer ved ca. 18°C, hvorefter 3 15 den gøres sur til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 75 cm 1 N saltsyre. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet ekstraheres fem gange 3 med i alt 200 cm ethylacetat. Ethylacetatfaserne forenes, 3 vaskes med 40 cm 0,1 N saltsyre og tørres over magnesium-2o sulfat. Efter filtrering og koncentrering af filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C fås 3 14,8 g af en olie, der opløses i 50 cm ethylacetat indeholdende 30 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Blandingen koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) 25 ved 50°C. Remanensen anbringes på en søjle med en diameter på 2,8 cm indeholdende 280 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres successivt med 2 liter cyclohexan, 1 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 95:5, 1,5 liter af en blanding af cyclohexan og ethyΙ-ΒΟ acetat i volumenforholdet 90:10, 5 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 80:20, 1,5 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 70:30 og 3,5 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 50:50, og der opsamles fra-35 tioner med et volumen på 500 cm . Fraktionerne 23-29 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg)

O

DK 154434B

47 ved 50°C. Herved fås 10,,86 g benzyl-N-(3,5,5-trimethylhexanoyl)- L-alanyl-a-D-glutamat i form af en olie, der krystalliserer.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,37 ved tyndtlags- chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat _ som elueringsmiddel.

5 N- (3,5,5-trimethylhexanoyl)-L-alanin kan fremstilles på følgende måde.

3 6,5 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C afkølet opløsning af 7,912 g 3,5,5-trimethylhexansyre o 3 i en blanding af 125 cirr tetrahydrofuran og 7 cm triethyl- amin. Reaktionsbiåndingen omrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 5°C afkølet opløsning af •3 4,495 g L-alanin i 50 cm IN natriumhydroxidopløsning„ Reaktionsblandingen omrøres i 10 minutter ved 0°C og der-efter i 18 timer ved ca. 25°C. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet 3 ekstraheres to gange med i alt 40 cm ether og gøres surt til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 55 cm IN saltsyre.

Det dannede olieagtige bundfald ekstraheres fem gange 3 20 med i alt 250 cm ethylacetat. Ethylacetatfaserne forenes, vaskes med 25 crrf* af en mættet natriumchloridopløsning og tørres over magnesiumsulfat. Efter filtrering og koncentrering af filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C fås .11,79 g af en olie, der opløses i 3 25 40 cm ethylacetat indeholdende 20 g neutralt silicagel (0,063-0,20 mm). Den fremkomne blanding koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og remanensen anbringes på en søjle med en diameter på 3 cm indeholdende 120 g neutralt silicagel (0,063-0,20 mm).

3 3 30 Der elueres successivt med 600 cm cyclohexan, 3.00 cm af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforhol- 3 det 95:5, 300 cm af en blanding af cyclohexan og ethylace- 3 tat i volumenforholdet 90:10, 300 cm af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 80£20, 3 35 700 cm af en blanding af cyclohexan og ethylacétat i 3 3 volumentforholdet 50:5®, 300 cm ethylacetat og 300 cm

O

DK 154434B

48 af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforhol- , det 90:10, og der opsamles fraktioner med et volumen på 3 100 cm . Fraktioner med 17-28 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås 3 5 herved 10,16 g af en olie, der opløses i 25 cm ether.

Efter tilsætning af 150 cm petroleumsether fås en olie, der fraskilles ved dekantering. Efter tørring under formindsket tryk (0,2 mm Hg) fås 7,59 g N-(3,5,5-trimethy1-hexanoyl)-L-alanin.

10 Produktet giver en Rf-værdi på 0,43 ved tyndtlags- chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat som elueringsmiddel.

Eksempel 12 3 15 0,56 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C afkølet opløsning af 2,12 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl- 3 -a-D-glutamat i en blanding af 86 cm tetrahydrofuran og 3 0,6 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 30 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 2°C afkø- 2 20 let opløsning af 1,25 g N -tert.butyloxycarbonyl-DD,LL- 3

-2,6-diaminopimelamsyre i en blanding af 4,32 cm IN

3 natriumhydroxidopløsning og 43 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i nogle minutter ved -5°C og derefter i 18 timer ved ca. 20°C, hvorefter den gøres sur ved tilsætning af 25 50 cm af en mættet citronsyreopløsning. Tetrahydrofu- ranet afdampes ved koncentrering under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet ekstraheres fem gange 3 med i alt 200 cm ethylacetat. Ethylacetatfaserne fore- 3 nes, vaskes med 25 cm vand, tørres over natriumsulfat 30 og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herves fås en olie, der opløses 3 3 i en blanding af 50 cm ethylacetat og 10 cm eddikesyre indeholdende 10 g neutral silicagel (0,04-0,063 mm).

Den fremkomne blanding koncentreres til tørhed under 35 formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og den fremkomne remanens anbringes på en søjle med en diameter på 2 cm

DK 154434 B

O

49 indeholdende 50 g neutral silicagel (0,04-0,063 mm).

3 3

Der elueres successivt med 200 cm ethylacetat, 280 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenfor- 3 holdet 95:5 og 320 cm af en blanding af ethylacetat og 5 eddikesyre i volumenforholdet 9:1 og opsamles fraktioner med et volumen på 40 cm . Fraktionerne 5-13 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 2,23 g N^-[01-benzyl-N-(N-lauroyl- 2 -L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-N -tert.butyloxycarbonyl-LL,DD-10 ~2' 6-diaminopimelamsyre i form af en olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,39 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elueringsmiddel.

15 2,19. g [O^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-γ-D- 2 -glutamyl]-N -tert.butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopime- 3 lamsyre opløses i 22 cm af en vandfri mættet opløsning af hydrogenchlorid i eddikesyre. Efter en kontakttid på 3 timer ved 20°C koncentreres reaktionsopløsningen :til tør-20 hed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 1,74 g N^-[0^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-Y-D-gluta-myl]-DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre-hydrochlorid i form af en delvis krystalliseret olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,47 ved tyndtlags-25 chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel, og det giver en Rf-værdi på 0,26 ved tyndtlagschromatografi på silicagel under anvendelse af eddikesyre som elueringsmiddel.

2 30 N -tert.butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelam- syre kan fremstilles på følgende måde.

2 G

4 g N -tert.butyloxycarbonyl-N-benzyloxycarbonyl- 3 -DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre opløses i 100 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 4 g palladium på carbon (3% palladium) 35 ledes en svag hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 3 timer. Katalysatoren .fraskilles ved filtrering og vaskes

DK 154434B

50 0 3 med 10 cm eddikesyre. De forenede filtrater koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den 3 herved fremkomne olieagtige remanens udrives i 50 cm ether indtil fuldstændig pulverisering. Efter frafiltrering og 2 5 tørring af pulveret fås 3 g N -tert.butyloxycarbonyl-DD,LL--2,6-diaminopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0/34 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af eddikesyre som elueringsmiddel.

10

Eksempel 13 - i 5

En opløsning af 1 g £0 -benzyl-0 -succinimido-N- [N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl]J· -D-glutaminsyre i 10 cm^ 1/2-dimethoxyethan sættes i løbet af 20 minutter til en til 8°C afkølet opløsning af 0,52 g DD,LL-N^-benzyloxycar-15 2

bonyl-2/6-diaminopimelamsyre i en blanding af 1,6 cmJ 1 N

3 natriumhydroxidopløsning og 5 cm .vand. Reaktionsblandingen omrøres i 24 timer ved 20°C og gøres derefter sur til en 3 pH-værdi på 1 ved tilsætning af 2 cm IN saltsyre. Efter 3 ti-2Q mers omrøring ved 20°C fraskilles det dannede bundfald ved filtrering, hvorefter det vaskes tre gange med i alt 30 cm^ vand og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C. Herved fås 1,1 g af et hvidt pulver, der chromatograferes på en søjle med en diameter på 1,7 cm indeholdende 22 g neutral 3 silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres successivt med 110 cm 25 λ ethylacetat, 60 cnr af en blanding af ethylacetat og eddike- 3 syre i volumenforholdet 95:5, 180 cm af en blanding af ethyl- 3 acetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 og 80 cm eddikesyre. Fraktionerne 24-38 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Det fremkomne 30 2 amorfe faste stof optages i 10 cm ether, hvorefter det fra- 3 skilles ved filtrering og vaskes med 10 cm ether. Efter tørring under formindsket tryk (20 mm Hg), ved 20°C fås 0,4 g N - ) O -benzyl-N-[N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl]- 3 6 -γ-D-glutamyl s-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopime-35 j lamsyre.

DK 154434 B

O

51

Produktet giver en Rf-værdi på 0,72 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elueringsmiddel.

_ 0,4 g N2 } O^'-benzyl-N-[N-(2-n-pentyl-3-hydroxy- 5 ^ \ g nonanoyl)-L-alanyl]-γ-D-glutamyl> -N -benzyloxycarbonyl- 1 3 -DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre sættes til 10 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 0,4 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en svag hydrogengasstrøm gennem blandingen i 1 time og 15 minutter. Efter filtrering af reaktionsblandingen koncentreres filtratet til tørhed under formindsket tryk ( 20 mm Hg) ved 5Q°C. Der fås herved en olie, der op- 3 tages i 20 cm isopropylether og udrives indtil fuldstændig pulverisering. Pulveret fraskilles ved filtrering og tørres 15 under fomindsket tryk (20 mm Hg). Herved fås 280 mg N2- £N-[N-(2-n-penty1-3-hydroxynonanoy1)-L-alanyl]-γ--D-glutamyl^ -DD,LL-2,6-diaminopimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,39 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en.blanding 20 af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

ci 5 jO -benzyl-0 -succinimido-N-[N-(2-n-pentyl-3-hy-droxynonanoyl)-L-alanyl] |-D-glutaminsyre kan fremstilles på følgende måde.

' 25 En opløsning af 7,4 g dicyclohexylcarbodiimid i 3 85 cm 1,2-dimethoxyethan sættes i løbet af 10 minuter til en til Q°C afkølet opløsning af 17,4 g benzyl-N-(2-n-pentyl--3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamat og 3,86 g 3 N-hydroxysuccinimid i 170 cm 1,2-dimethoxyethan. Reaktions-30 blandingen omrøres ved QGC i 3,5 timer og holdes derefter ved 4°C i 16 timer. Derefter tilsættes 2 cm2 eddikesyre, og den fremkomne blanding omrøres i 1 time ved 20‘°C. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering og vaskes 3 gange 3 med i alt 75 cm 1,2-dimethoxyethan. Filtratet koncentreres......

35 til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved !60°C. Re- 3 manensen optages i 300 cm ethylacetat. Efter 1 time ved o 52

DK 154434 B

O

20 C fraskilles det dannede bundfald ved filtrering og 3 vaskes to gange med i alt 50 cm isopropylether. Filtratet koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 22,8 g £ O1-benzyl-05-succinimido-5 -N-[N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl]-D-gluta-minsyre i form af en orangefarvet olie.

Produktet giver en Rf--værdi på 0,77 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylace-tat som elueringsmiddel.

10 Benzyl-N-(2-n-penty1-3-hydroxynonanoy1)-L-alanyl- -a-D-glutamat kan fremstilles på følgende måde.

I løbet af 1 time og 10. minutter sættes en opløsning af 27,5 g succinimid-2-n-pentyl-3-hydroxynonanoat i 644 cnr 1,2-dimethoxyethan til en til 7°C afkølet opløs- 15 ning af 27,8 g benzyl-L-alanyl-a-D-glutamat-hvdrochlorid i en blanding 3 3

af 245 cm vand og 22,9. cm triethylamin. Reaktionsblandingen holdes ved 20°C i 20 timer og derefter ved 60°C i 5 timer. Derefter afdampes 1,2-dimethoxyethanet under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og koncentratet gøres 20 surt til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 150 cm IN

saltsyre og ekstraheres fem gange med i alt 1,5 liter ethyl-acetat. De organiske faser forenes, vaskes tre gange med i 3 alt 750 cm vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Her-25 ved fås 38,6 g af en olie, der opløses i 2Q0 cm ethyl-acetat. Til den fremkomne opløsning sættes 13 g dicyclo-hexylamin, hvorefter blandingen henstilles ved 4°C i 20 timer. Det dannede hvide faste stof fraskilles ved fil- 3 trering, vaskes to gange med i alt 40 cm ethylacetat og 3 30 to gange med i alt 200 cm ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C. Der fås herved 22,4 g af et hvidt pulver, til hvilket der sættes 1,9 g produkt fremstillet på lignende måde. Blandingen opløses i 500 cm vand, og til den 3 3 fremkomne opløsning sættes 200 cm ethylacetat og 150 cm 35 af en mættet citronsyreopløsning. Den organiske fase fra- skilles, og vandfasen ekstraheres to gange med i alt 400 cm 3

DK 154434 B

O

53 ethylacetat. Ethylacetatfaserne forenes, vaskes to gange 3 med i alt 2Q0 cm vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk ( 20 mm Hg) ved 60°C. Herved fås 17,4 g benzyl-N-(2-n-pentyl-3-hy-5 droxynonanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamat i form af en beige-farvet pasta.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,25 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat som elueringsmiddel.

to Succinimid-2-n-pentyl-3-hydroxynonanoat kan frem stilles på følgende måde« I løbet af 40 minutter sættes en opløsning af 27 g 3 dicyclohexylcarbodiimid i 300 cm 1,2-dimethoxyethan til en til 0°C afkølet opløsning af 29,1 g 2-n-pentyl-3-hydroxy- 3 15 nonansyre og 14,1 g N-hydroxysuccinimid i 300 cm 1,2-dimethoxyethan. Reaktionsblandingen omrøres ved 0°C i 3 timer og holdes derefter ved 4°C i 21 timer. Det dannede bundfald 3 fraskilles ved filtrering og vaskes to gange med i alt 100 cm 1,2-dimethoxyethan. Filtratet koncentreres til tørhed under 20 formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet optages 3 3 i en blanding af 300 cm isopropylether og 3 cm eddikesyre. Efter 2 timer ved 20°C fraskilles det dannede bundfald ved 3 filtrering og vaskes to gange med i alt 40 cm isopropylether. Filtratet koncentreres til tørhed under formindsket 25 tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 42,6 g succinimid--2-n-pentyl-3-hydroxynonanoat i form af en gul olie.

2-n-pentyl-3-hydroxynonansyre kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives af E. Lederer et al., Bull. Soc.

Chim. 1952, 413.

30

Eksempel 14

Til en opløsning af 25 g N -tert.butyloxycarbonyl- α 3 -Νζ -benzyloxycarbonyl-ZL-lysin i 250 cm ethanol sættes 150 g af en chlormethyleret copolymer af styren og divinyl-35 benzen (98:2) indeholdende 1 milliækvivalent chlror pr. g.

Reaktionsblandingen omrøres i 3 minutter ved 20°C, hvorefter 3

O

54

DK 154434 B

der tilsættes 9,2 cm triethylamin, og den fremkomne reaktionsblanding omrøres i 48 timer ved 78°C. Polymeren fra- 3 filtreres, vaskes tre gange med i alt 750 cm ethanol og 3 tre gange med 750 cm methylenchlorid og tørres under for-5 mindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 160,9 g Na~tert.butyloxycarbonyl-N £ -benzyloxycarbonyl-L-lysyl--polymer.

D-glutaminsyre bindes til L-lysyl-polymer-derivatet ved, at man gennemfører følgende operationer i en reaktions-10 beholder forsynet med en omrører og ved bunden med et filter af frittet glas.

1) Der gennemføres tre successive vaskninger af 3 polymeren med 100 cm methylenchlorid hver gang. Efter hver tilsætning af opløsningsmiddel omrøres blandingen i 3 minut-15 ter, hvorefter polymeren frafiltreres.

2) Beskyttelsesgruppen tert.butyloxycarbonyl for 3 lysinet fjernes derefter ved tilsætning af 100 cm af en blanding af lige volumendele trifluoreddikesyre og methylenchlorid. Der omrøres i 20 minutter, hvorefter polymeren fra-20 filtreres.

3) Polymeren underkastes successivt følgende vaskninger: 3 a) 3 x 100 cm methylenchlorid 3 b) 3 x 100 cm methanol 3 25 c) 3 x 100 cm methylenchlorid.

Efter hver tilsætning af opløsningsmiddel omrøres blandingen i 3 minutter, hvorefter polymeren frafiltreres.

3 4) Polymeren neutraliseres ved tilsætning af 100 cm af en blanding af methylenchlorid og N-methylmorpholin i 30 volumenforholdet 9:1. Efter omrøring i 10 minutter frafiltreres polymeren.

3 5) Polymeren vaskes tre gange med 100 cm methylenchlorid hver gang. Efter hver tilsætning af opløsningsmiddel omrøres blandingen i 3 minutter, hvorefter polymeren frafil- 35 treres.

O

DK 154434B

55 6) Følgende stoffer tilsættes successivt: a) 5,4 g benzyl-N-tert.butyloxycarbonyl-a-D-gluta- 3 mat opløst i 50 cm methylenchlorid. Blandingen omrøres i 10 minutter efter tilsætningen.

O

5 b) 3,3 g dicyclohexylcarbodiimid opløst i 50 cm methylenchlorid. Blandingen omrøres i 20 timer efter tilsætningen og filtreres derefter.

7) Polymeren underkastes successivt følgende vask- ninger: 3 10 a) 3 x 100 cm methylenchlorid 3 bl 3 x 100 cm eddikesyre 3 c) 3 x 100 cm methylenchlorid.

15 Der fås herved N^-(O^-benzyl-N-tert.butyloxycarbo- nyl-Y-D-glutamyl)-N£-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-polymer.

Alanin bindes til denne dipeptidpolymer ved, at man gentager de ovenfor angivne operationer 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7, idet dog operation 6 modificeres på følgende måde.

20 Følgende stoffer tilsættes successivt: a) 3,03 g N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanin opløst 3 i 50 cm methylenchlorid. Blandingen omrøres i 10 minutter efter tilsætningen.

3 b) 3,3 g dicyclohexylcarbodiimid opløst.i 50 cm 25 methylenchlorid. Den fremkomne blanding omrøres i 20 timer efter tilsætningen og filtreres derefter.

Der fås herved :N -[O^-benzyl-N-(N-tert.butyl-oxycarbonyl-L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-N £-benzyloxycarbonyl--L-lysyl-polymer.

30 Palmitinsyre bindes til denne tripeptid-polymer ved, at man gentager de ovenfor angivne operationer 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7, idet operation 6 modificeres på/følgende måde.

Følgende stoffar tilsættes successivt: 3 35 a) 4,2 g palmitinsyre opløst i 50 cm methylen chlorid. Blandingen omrøres i 10 minutter efter tilsætningen.

56

DK 154434 B

0 3 b) 3,3 g dicyclohexylcarbodiimid opløst i 50 cm methylenchlorid. Den fremkomne blanding omrøres i 20 timer efter tilsætningen og filtreres derefter.

Der fås herved N -[O^-benzyl-N-(N-palmitoyl-L-ala-5 nyl)-γ-D-glutamyl]-N £ -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-polymer.

Den fremstillede polymer suspenderes i 130 cm^ trifluoreddikesyre i en reaktionsbeholder forsynet med omrører og ved bunden med et filter af frittet glas. Gennem den fremkomne suspension ledes en strøm af hydrogenbromid 10 i 90 minutter. Polymeren frafiltreres derefter og vaskes tre gange med i alt 300 cm^ edikesyre. Efter hver tilsætning af eddikesyre omrøres blandingen i 3 minutter, hvorefter polymeren frafiltreres. Filtraterne forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den 3 15 herved fremkomne olie optages i 50 cm ethylacetat. Herved dannes et bundfald, der fraskilles ved filtrering og vaskes 3 to gange med i alt 60 cm ether. Bundfaldet, der er hygro-skopisk, opløses i 50 cm eddikesyre indeholdende 7 g neutralt silicagel (0,04 —0,063 mm). Den fremkomne blanding 20 koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og den fremkomne remanens anbringes på en søjle med en diameter på 2,6 cm indeholdende 7 0 g neutral silica- 3 gel (0,04-0,063 mm). Der elueres successivt med 700 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforhol- 3 25 det 9:1, 1700 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre 3 i volumenforholdet 8:2, 600 cm af en blanding af ethylacetat 3 og eddikesyre i volumenforholdet 7:3, 2400 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 1:1, 3 600 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i 3 30 volumenforholdet 2:8 og 1100 cm eddikesyre. Der opsamles o fraktioner med et volumen på 100 cm . Fraktionerne 53-70 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 1,28 g af et amorft 3 fast stof, der opløses i 50 cm eddikesyre indeholdende 35 2,4 g neutral silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding koncentreres til tørhed under formindsket tryk

DK 154434B

57 0 (20 mm Hg) ved 50°Cr og den herved fremkomne remanens anbringes på en søjle med en diameter på 1,5 cm indeholdende 24 g neutral silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres 3 successivt med 300 cm af en blanding af ethylacetat og 3 eddikesyre i volumenforholdet 7:3, 150 cm af en blanding 5 af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 6:4, 3 300 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i 3 volumenforholdet 1:1, 250 cm af en blanding af ethylace- 3 tat og eddikesyre i volumenforholdet 4:6, 350 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet to 3 3:7, 350 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre 3 i volumenforholdet 2:8, 2ΘΌ cm af en blanding af ethyl- 3 acetat og eddikesyre i volumenforholdet 1:9 og 200 cm 3 eddikesyre. Der opsamles fraktioner med et volumen på 50 cm .

15 Fraktionerne 25-42 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Det fremkomne amorfe 3 faste stof optages i 30 cm ethylacetat, hvorefter det 3 fraskiles ved filtrering og vaskes med 20 cm ethylacetat 3 og 20 cm ether. Efter tørring under formindsket tryk 2o (0,3 mm Hg) ved 50°C fås 0,52 g N -[N-(N-palmitoyl-L-ala-nyl)-γ-D-glutamyll-L-lysin.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,30 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand.i 25 volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet-, %: C = 54,13, H = 8,63, JN = 8,42 Fundet, ft: .C =' 54,9, H = 8,6, JN = 8,7

Efter fuldstændig hydrolyse viser en analyse ved hjælp af en Technicon Autoanalyzer tilstedeværelsen :a£ 30 følgende aminosyrer: Ala 0*,99 (teoretisk 1), Glu 1/00 (teoretisk 1), Lys 1,02 (teoretisk 1).

Adjuvansegenskaberne og de immunostimulerende egenskaber af de her omhandlede tripeptider med formlen I fremgår af de følgende forsøgsbeskrivelser og -resultater.

35

O

58

DK 154434 B

1 - Adjuvansvirkning på retarderet hypersensibilitet (HSR) og produktion af antistoffer mod røde blodlegemer fra får (GRM) hos mus.

Prøve ifølge Mackaness.

5 Den anvendte metode er inspireret af metoden be- skrevet af T.E. Miller et al., J. Nat. Cancer Inst., 51, 1669 (1973).

OF^-Hunmus på 20-22 g (6-7 uger) fordeles tilfældigt i de forskellige forsøgsbure (8-10 mus/dosis og 30 10 kontroldyr).

På dagen J„ immuniseres musene subcutant ved nak- υ 7 kens basis med en suspension indeholdende 10 GRM (Institut Pasteur Production) i 0,1 ml isotonisk phosphatpuf-fer, hvortil der sættes 0,1 ml af fortyndinger af for-15 bindeisen, der skal undersøges.

O

På dagen Jg modtager musene 10 GRM i 0,05 ml i den venstre pote og et lige så stort volumen fortyndingsmiddel i den højre pote. Forskellen i tykkelsen af poterne i 1/100 mm måles med et semi-elektronisk apparat (H.

20 van Dijk et al., J. Immunol. Methods 12, 261 (1976)).

På dagen aflives musene ved dekapitation, og seraene fra hver serie blandes i lige dele til dannelse af en pool, og indholdet af antistof i hver pool bestemmes ved hæmolyse-metoden. 50 μΐ serum (i fortyndinger i 25 forholdet 1:2) + 25 μΐ GRM-suspension med 0,5% Mayer-puf-fer med 0,1% gelatine. Der tilsættes 25 μΐ komplement i overskud (marsvine-serum, 1/20). Der inkuberes i 30 min. ved 37°C, og hæmolysen registreres efter en nat ved 4°C ved tælling af antallet af huller, som udviser denne 30 reaktion, hvilket giver en titer udtrykt ved log9 til den reciprokke værdi af den højeste fortynding, der giver 100% hæmolyse.

Adjuvansaktiviteterne af péptiderne et sammenfattet i tabel I.

35

O

DK 154434B

59

TABEL I

Eksempel Kontrol % HSR1 og Ac HE-titer_^_——' ' nr. HSR ^———'

Ac^HE — ^dcisis af forbindelse 5 1/log * i mg/kq s.c. ____ ___^10 . 3 i 1 1 og 2 82,6 s' 98,2 103,6,/ 92,8y' s' 14 ./ 15 14 S 14 10 3 92,8 s' 132,4 >/ 105,5 s' 9 s' 11 11 / 5 95,6 s' 90,2 ,/ 126,3// s' s' ίο ^/ 10 sS' 12 s' 8 83,0 s' 114,4 >/ 113,3120,5 s' s' 9 ./ 9 sr 8 s' 9 14 83,0 s' 102,8 ./ 113,1//^ 13S,1 ./ 20 s' 9 ./ 8 s' 9 s' 8 % HSR = HSR-værdi i % af kontrol-HSR.

2 - Beskyttelse mod bakterieinfektioner.

Modstandsdygtighed hos mus mod infektion med 25 Listeria monocytogenes.

Ved dette forsøg, som er beskrevet af Macfcaness, J. Exp. Med·. 116, 381 (1962) , er bakterien normalt en in-tracellulær parasit i makrofager. De sidstnævnte er imidlertid i stand til at nedbryde mikroorganismerne når de er 30 "aktiveret" på passende måde.

CD^-Hunmus på 18—20 g (Charles River) podes intravenøst på dagen J med en normalt letal dosis bakterier 4 U

(ca. 2 x 10 kim, ca. 4 sl DL,-q) · Den anvendte stamme er stammen EGD (Mackaness).

35 Dødeligheden noteres hver dag indtil forsøgets afslutning (dagen J^q)· Dette tidspunkt svarer til lidt 0

DK 154434B

60 mere end 2 gange den gennemsnitlige overlevelsestid af kontroldyrene.

Resultaterne viser: - antallet af overlevende mus på dagen J^q i forhold til 5 antallet af mus i serien, - den procentiske forøgelse af den gennemsnitlige overlevelsestid af de behandlede mus i forhold til kontrolserien.

Resultaterne, der opnås med peptiderne, er sam-10 menfattet i tabel II.

TABEL II

Eksempel Dosis, Indgivelsesvej, Overlevende dyr, % Overlevelse i nr. mg/kg -tidspunkt på dagen J.. forhold til kontrol 15____±2__ 10 3/10 148 3 i.v.; J-l 2/10 112 1 0/10 84 0 1/20 100 (kontrol) 1 °g 2 ~30 4ΤΪ0 155 10 i.p.; J-l 3/10 130 20 3 3/10 130 0 0/20 100 (kontrol) Ϊ0 2/10 168 3 i.p.; J-l 4/10 200 1 3/10 178 0 0/20 100 (kontrol) 25 5 ~30 Ϊ7Ϊ0 128 10 i.p.; J-l 2/10 144 3 2/10 142 0 · 0/20 100 (kontrol) _ 0/30 97 2 i.p.; J-l 1/30 126 0 0/30 100 (kontrol) 30 8 lo 1/15 ' Ϊ18 5 i.p.; J-l 0/15 98 0 2/30 100 (kontrol) Ϊ0 2/15 155 2 i.p.; J-l 2/15 126 0 0/30 100 (kontrol) 35 14 2 6/15 133 0,4 i.p.; J-l 7/15 135 0 5/30 0

O

61

DK 154434 B

Modstandsdygtighed mod infektion med Klebsiella pneumoniae.

Ved denne metode, der er beskrevet og anvendt af Chedid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 2089 (1977) til påvisning af aktivitet af MDP (muramyldipeptid), frem-5 kalder bakterien en voldsom septikæmi efter i.v. eller i.p. injektion, men dødeligheden er mere udbredt tidsmæssigt ved intramuskulær infektion.

Beskrivelse af metoden.

Stammen Klebsiella Pneumoniae, serotype 2 (I.P.

!0 7823) fremkalder efter intramuskulær indpodning .i en dosis på 105 kim i løbet af nogle dage en dødelighed på 80-100% hos OFχ-mus (IPPA-CREDO) på 18-20 g.

Resultaterne angives og analyseres på samme måde som resultaterne af infektion af mus med Listeria mono- 15 cytogenes.

De opnåede resultater er sammenfattet i babel III.

TABEL III

20 Eksempel Dosis, Indgivelsesvej, Overlevende dyr % Overlevelse i nr. mg/kg -tidspunkt på dagen forhold til kontrol 2,5 4/15 148 1 og 2 0,5 s.c.; J-l 1/15 76 0 4/30 100 (kontrol) 25 0,5 10/15 194 14 0,1 s.c.; J-l 5/15 154 0 8/30 100 '(kontrol) 30 35

Claims

5 R - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R1 ^ CH3 CH2CH2 “ CO - NH - CH - R3 (ch2)3 R - NH - CH - R2 10 hvori symbolerne R, der kan være ens eller forskellige, betyder et hydrogenatom eller en alkanoylgruppe med 1-16 carbonatomer, som eventuelt er substitueret med en hydr- oxygruppe, idet mindst et af symbolerne R betyder en 15 alkanoylgruppe, R^ betyder en hydroxy-, amino- eller alk- yloxygruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer og eventuelt er substitueret med en phenylgruppe, og sym-2 3 bolerne R og R , der kan være ens eller forskellige, betyder et hydrogenatom, en carboxygruppe, carbamoylgruppe 20 eller alkyloxycarbonylgruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer og eventuelt er substitueret med en phe- 2 3 nylgruppe, idet symbolerne R og R ikke samtidig kan betyde et hydrogenatom, og idet alaninet foreligger på L- -form, glutaminsyren foreligger på D-form, lysinet, når 2 3 25 et af symbolerne R eller R betyder et hydrogenatom, foreligger på L-form, og 2,6-diaminopimelinsyren eller 2 3 dens derivater, når symbolerne R og R , der kan være ens eller forskellige, betyder en carboxygruppe, carbamoylgruppe eller alkyloxycarbonylgruppe, foreligger på D,D-30 -form, L,L-form, DD,LL-form (racemisk form) eller D,L- -form (mesoform), eller farmaceutisk acceptable metalsalte deraf eller farmaceutisk acceptable additionssalte deraf med syrer eller nitrogenholdige baser, kendetegnet ved, at man 35 a) omsætter et dipeptid med den almene formel III O DK 154434B R5 - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R4 CH3 CH2CH2 - COOH (ni) 5 5 hvori R betyder en alkanoylgruppe,. som ovenfor angivet, eller en beskyttelsesgruppe for aminfunktionen, og 4 R betyder en aminogruppe eller en alkyloxygruppe indeholdende 1-4 carbonatomer, der eventuelt er substitueret 10 med en phenylgruppe, eller et aktiveret derivat deraf, med en aminosyre med den almene formel IV H2N - CH - R1 2 3 15 „ <?H2>3 , (IV) R - NH - CH - R 35 3 5 hvori R , R og R har den ovenfor angivne betydning, idet mindst et af symbolerne R^ i formlerne III og IV 2o betyder en alkanoylgruppe R, som ovenfor angivet, hvorefter man 2 - erstatter gruppen R , når den er en beskyttelsesgruppe for aminfunktionen, med et hydrogenatom, 3 o - eventuelt erstatter gruppen R , nar den er en 25 alkyloxygruppe med 1-4 carbonatomer (eventuelt substitueret med en phenylgruppe), med en hydroxygruppe, - og eventuelt erstatter grupperne R og -R , ,når de betyder en alkyloxyearbonylgruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer (eventuelt substitueret med en 30 phenylgruppe), med en earboxygruppe, eller b) til en egnet bærer valgt blandt chlormethylerede og hydroxymethylerede copolymere af styren jog divinyl-benzen fikserer en .aminosyre med den almene Æormel XIV DK 154434 B O 7 3' R - NH - CH - RJ (CEL)o (XIV) C 1 z J 2' R - NH - CH - R 5 2' 3' hvori et af symbolerne R og R betyder en carboxygrup-pe, og det andet betyder et hydrogenatom, en carbamoyl-gruppe eller en alkyloxycarbonylgruppe, hvis alkyldel indeholder 1-4 carbonatomer (eventuelt substitueret med 10 en phenylgruppe), R^ betyder en alkanoylgruppe, som ovenfor angivet, eller en beskyttelsesgruppe for aminfunk- 7 tionen, og R betyder en beskyttelsesgruppe for amin-funktionen, idet, når R~* og R^ begge betyder en beskyttelsesgruppe for aminfunktionen, disse beskyttelses-15 grupper er forskellige, hvorefter man efter afblokering af aminfunktionen beskyttet af gruppen R^ kondenserer med a) et derivat af D-glutaminsyre med den almene formel XV 20 R7 - NH - CH - CO - R4 CH2CH2 - COOH (XV) 25 hvori R4 og R7 har den ovenfor angivne betydning, hvorefter man efter afblokering af aminfunktionen beskyttet med gruppen R^ kondenserer med 1. et derivat af L-alanin med den almene formel xvi
30 R7 - NH - CH - COOH ch3 (XVI) 7 hvori R har den ovenfor angivne betydning, og efter afblo- 7 kermg af aminfunktionen beskyttet med R om nødvendigt 35 med en fedtsyre med den almene formel O DK 154434B R'-COOH ( vil) hvori R'-CO- betyder en alkanoylgruppe, som ovenfor defineret eller 5 2. et derivat af L-alanin med den almene formel XVII R'-CO - NH - CH - COOH ch3 (XVII) 10 hvori R'-CO betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet, eller b) med et dipeptid med den almene formel XVIII R8 - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R4 (XVIII) CH-3 CH0CH0 - ,C00H 15 3 2 2 4 8 hvori R har den ovenfor angivne betydning, og R betyder en alkanoylgruppe som ovenfor angivet eller en beskyttel- O sesgruppe for aminfunktionen, idet, når R betyder en be-20 skyttelsesgruppe for aminfunktionen, denne er forskellig 5 fra den ovenfor definerede beskyttelsesgruppe R , og ef- g ter afblokering af aminfunktionen beskyttet med R om nødvendigt med en syre med den almene formel R'-COOH som defineret ovenfor, 25 hvorefter det fremkomne produkt skilles fra bæreren og beskyttelsesgrupperne tor amin- og carboxyfunktionerne om nødvendigt fjernes, hvorefter det fremkomne produkt isoleres, eventuelt i form af et farmaceutisk acceptabelt metalsalt deraf el-30 ler et farmaceutisk acceptabelt additionssalt deraf med en syre eller en nitrogenholdig base. 35