CH647789A5

CH647789A5 - Tripeptides, leur preparation et les medicaments qui les contiennent.

Info

Publication number: CH647789A5
Application number: CH4989/80A
Authority: CH
Inventors: Jean Bouchaudon; Daniel Farge; Claude James
Original assignee: Rhone Poulenc Ind
Priority date: 1979-06-29
Filing date: 1980-06-27
Publication date: 1985-02-15
Also published as: FR2460289A1; IT8023074A0; DK154434B; US4916119A; IT1131847B; SE8004791L; DE3024369A1; JPH0159275B2; NL8003761A; AU5969880A; DK154434C; IE49950B1; JPS5645447A; FR2460289B1; GB2053230B; BE884076A; DK277180A; GB2053230A; NZ194178A; LU82569A1

Description

La présente invention concerne de nouveaux tripeptides de formule générale:

r—NH—CH—CO—NH—CH—CO—rj

CH,

CH2CH2 - CO - NH - CH - R3 (ÇH2)3 R-NH-CH-R-,

(I)

dans laquelle, en particulier:

NAG = N-acétylglucosamine; NAM = acide N-acétyl-muramique;

R = radical alcoyle contenant 9 à 17 atomes de carbone.

Ces produits sont des adjuvants immunologiques de la production d'anticorps et de l'hypersensibilité retardée capables d'agir seuls, c'est-à-dire sans qu'il soit nécessaire de les administrer en solution huileuse.

Tous ces produits se caractérisent par la présence d'acide N-acétylmuramique qui, d'après Kasumoto et al., «Tetrahedron Letters», 49, 4899 (1978), est considéré comme lié à l'activité immu-nologique.

Il a maintenant été trouvé que les peptides de formule générale (I) présentent, malgré l'absence d'acide N-acétylmuramique, des propriétés adjuvantes et immunostimulantes remarquables. Par ailleurs, ces composés, qui sont bien définis, peuvent être obtenus aisément avec la pureté suffisante requise pour l'emploi en thérapeutique.

Dans la formule générale (I), les symboles R, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras, étant entendu que l'un au moins des symboles R représente un reste d'acide gras, le symbole R! représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, et les symboles R2 et R3, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que les symboles R2 et R3 ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, et étant entendu que l'alanine est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme D, la lysine, lorsque l'un des symboles R2 ou R3 représente un atome d'hydrogène, est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélique ou ses dérivés, lorsque les symboles R2 et R3, identiques ou différents,

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représentent un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle, est sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso).

Par reste d'acide gras, il faut entendre de préférence un radical alcanoyle contenant 1 à 45 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle, un radical alcé-noyle contenant 3 à 30 atomes de carbone et pouvant contenir plus d'une double liaison ou un reste d'acide mycolique tel que rencontré dans la structure de la paroi bactérienne des mycobactéries, des No-cardia ou corynébactéries.

Les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent être obtenus selon les méthodes généralement utilisées en synthèse pepti-dique. Les différentes réactions sont mises en jeu après blocage par des groupements protecteurs convenables des fonctions aminés ou acides qui ne doivent pas participer dans les réactions, et suivies du déblocage de ces fonctions.

Les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent être obtenus selon l'invention par action d'un dipeptide de formule générale:

r5-nh-ch-co-nh-ch-co-r4

I I (III)

ch3 ch2ch2-cooh dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine tel que le radical benzyloxycar-bonyle ou t-butyloxycarbonyle et R4 représente un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, sur un aminoacide de formule générale:

h2n-ch-r3 I

(ÇH2)3 (IV)

rs-nh-ch-r2

dans laquelle R2 et R3, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que R2 et R3 ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine tel que le radical benzyloxycarbonyle ou t-butyloxycarbonye, étant entendu que l'un au moins des symboles Rs des formules (III) et (IV) représente un reste d'acide gras, suivie du remplacement du radical Rs, lorsqu'il représente un groupement protecteur de fonction amine par un atome d'hydrogène, et éventuellement du remplacement du radical R4, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical hydroxy.

Généralement, il est nécessaire d'activer la fonction acide libre du dipeptide de formule générale (III) préalablement à son action sur l'aminoacide de formule générale (IV). De préférence, le dérivé activé du dipeptide de formule générale (III) est un anhydride mixte, préparé in situ par action d'un halogénoformiate d'alcoyle (tel que le chloroformiate d'isobutyle) sur le dipeptide de formule générale (III). La condensation du dérivé activé s'effectue dans un solvant organique tel que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, le chloroforme, le toluène ou le diméthylformamide ou dans un milieu hydroorganique en présence d'une base minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine, à une température comprise entre -10 et + 30° C.

Le remplacement du radical protecteur R5 par un atome d'hydrogène et des radicaux R4 par un radical hydroxy peut être effectué selon les méthodes connues suivant la nature des groupements protecteurs. Il est particulièrement avantageux de choisir les radicaux R4 et Rs de telle manière que leur remplacement par un radical hydroxy ou un atome d'hydrogène puisse s'effectuer en une seule phase. A cet effet, il convient de choisir le radical R4 parmi les radicaux benzyloxy ou nitrobenzyloxy et le radical R5 parmi les radicaux benzyloxycarbonyle ou nitrobenzyloxycarbonyle. Dans ces conditions, le remplacement de ces radicaux s'effectue par hydrogé-nolyse en opérant dans un solvant organique approprié tel que l'acide acétique (éventuellement en mélange avec un autre solvant tel que le métahnol) ou dans un solvant hydroorganique en présence d'un catalyseur tel que le palladium, par exemple le palladium sur noir, à une température voisine de 20° C et sous une pression voisine de 760 mm de mercure.

Le dipeptide de formule générale (III) peut être obtenu par action d'un dérivé activé de la L-alanine de formule générale:

Rs—NH —CH —COOH

I (V)

ch3

dans laquelle R5 est défini comme précédemment, sur un dérivé de l'acide D-glutamique de formule générale:

H2N-CH-CO-R4

I (VI)

CH2CH2-COOH

dans laquelle R4 est défini comme précédemment, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un dipeptide de formule générale (III) sur un aminoacide de formule générale (IV).

Le dipeptide de formule générale (III) dans laquelle Rs représente un reste d'acide gras peut être obtenu par action d'un dérivé activé d'un acide gras de formule générale:

R'-CO-OH (VII)

dans laquelle R'—CO — représente un reste d'acide gras tel que défini précédemment, sur un dipeptide de formule générale:

H2N-CH-CO-NH-CH-CO-R4

I I (VIII)

CH3 CH2CH2-COOH

dans laquelle R4 est défini comme précédemment.

Comme dérivé activé de l'acide de formule générale (VII), il est particulièrement avantageux d'utiliser un halogénure d'acide ou un anhydride mixte qui est généralement préparé in situ par action d'un halogénoformiate d'alcoyle, tel que le chloroformiate d'isobutyle, sur l'acide de formule générale (VII), en présence d'une base.

Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (VII) sous la forme d'un halogénure d'acide, plus particulièrement le chlorure, la réaction s'effectue dans un solvant organique tel que l'éther diéthyli-que ou le chlorure de méthylène, en présence d'une base (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine), à une température comprise entre 0 et 30° C. Généralement, le dipeptide de formule générale (VIII) est utilisé sous la forme d'un sel tel que le chlorhydrate.

Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (VII) sous forme d'anhydride mixte, la réaction s'effectue dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un dipeptide de formule générale (IV). Généralement, le dipeptide de formule générale (III) sur l'aminoacide de formule générale (VIII) est utilisé sous la forme d'un sel tel que le chlorhydrate.

L'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle R2 représente un radical carbamoyle, R3 représente un radical carboxy et R5 représente un radical benzoyloxycarbonyle, c'est-à-dire le (D)-monoamide de l'acide benzyloxycarbonyl-(D)-mésodiamino-2,6 pi-mélique, peut être préparé selon le procédé décrit dans le brevet belge N° 821385.

L'aminoacide de formule générale (IV), dans laquelle R2 représente un radical carbamoyle, R3 représente un radical carboxy et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine sous forme racémique, D,D ou L,L, peut être préparé à partir de l'acide diamino-2,6 pimélique correspondant. A cet effet, on prépare selon les méthodes connues l'ester benzylique de l'acide dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélique, qui est monosapo-nifié selon la technique décrite par A. Arendt et coll., «Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum», 48,1305 (1974), [«Chem.

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Abstr.», 82, 31497 g (1975)], puis transformé, par action du métha-nol ammoniacal, en monoamide de formule générale:

z-nh-ch-cooh

I

(ÇH2)3 (IX)

z-nh-ch-co-nh2

(dans laquelle Z représente un radical benzyloxycarbonyle) qui,

après hydrogénolyse en présence de palladium sur noir, fournit l'acide diamino-2,6 pimélamique. Par action d'un sel de cuivre, tel que le bromure cuivrique ou le carbonate basique de cuivre, sur l'acide diamino-2,6 pimélamique, il se forme un complexe qui peut être représenté par la formule:

h2n-ch-co-nh2

I

(ÇH2)3

h2n-ch-coo

(x)

oco-ch-nh2 I

(çh2)3

h2n-co-ch-nh2

dans lequel le reste amino en a du groupement carbamoyle peut être acylê par action d'un dérivé activé d'un acide de formule générale (VII) (de préférence un halogénure tel que le chlorure) ou protégé par action d'un halogénoformiate d'alcoyle ou de benzyle. Le complexe ainsi formé est déplacé par action de l'hydrogène sulfuré pour donner l'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle R2 représente un radical carbamoyle, R3 représente un radical carboxy et Rs est défini précédemment.

L'aminoacide de formule générale (IV), dans laquelle R2 représente un radical carboxy, R3 représente un radical carbamoyle et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso), peut être préparé à partir de l'acide diamino-2,6 pimélique correspondant. A cet effet, on prépare le complexe cuivrique de formule générale (X) dans lequel le reste amino en a du groupement carbamoyle peut être protégé par action d'un halogénoformiate d'alcoyle ou de benzyle. Le complexe ainsi formé est déplacé par action de l'hydrogène sulfuré pour donner l'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle R2 représente un radical carbamoyle, R3 représente un radical carboxy et R5 représente un groupement protecteur de la fonction amine. Le reste amino en a du groupement carboxy peut être protégé par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine différent de R5. Après élimination du groupement protecteur représenté par Rs, on obtient le produit de formule générale (IV) dans laquelle R2 représente un radical carboxy, R3 représente un radical carbamoyle et R5 représente un groupement protecteur de la fonction amine.

L'aminoacide de formule générale (IV), dans laquelle les symboles R2 et R3 sont identiques et représentent chacun un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle) et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso), peut être préparé à partir d'un aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle, R2 et R3 étant définis comme ci-dessus, R5 représente un atome d'hydrogène par monoblocage d'une des deux fonctions aminés selon la méthode décrite par E. Bricas et coll., «Biochemistry», 9, 823 (1970).

L'aminoacide de formule générale (IV), dans laquelle les symboles R2 et R3, qui sont différents, représentent un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle) et R5 représente un groupement protecteur de la fonction amine sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso), peut être obtenu à partir d'un aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle les symboles R2, R3 et R5 sont définis comme ci-dessus et la fonction amine en a du symbole R3 est protégée par un groupement protecteur de fonction amine différent de R5, par élimination de ce groupement protecteur, sans toucher à Rs.

Le produit de formule générale (IV), dans laquelle la fonction amine en a du symbole R3 est protégée par un groupement protecteur de la fonction amine, est obtenu, après estérification d'un produit de formule générale (IV) dans laquelle l'un des symboles R2 ou R3 représente un radical carboxy et l'autre représente un radical carbamoyle, par blocage de la fonction amine dans les conditions habituelles.

L'aminoacide de formule générale (IV), dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, et

— R2 représente un atome d'hydrogène et R3 représente un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont 1a- partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle), ou bien ■

— R2 représente un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle) et R3 représente un atome d'hydrogène,

peut être préparé selon les méthodes connues à partir de la lysine.

Le dérivé de la L-alanine de formule générale (V), dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras, peut être obtenu par action d'un acide de formule générale (VII) ou d'un dérivé activé de cet acide sur la L-alanine dont la fonction acide est éventuellement protégée sous forme d'ester, suivie le cas échéant de l'élimination du groupement protecteur de la fonction acide.

Lorsque la fonction acide de la L-alanine est protégée, la condensation de l'acide de formule générale (VII) est effectuée généralement en présence d'un agent de condensation tel que le dicyclo-hexylcarbodiimide en opérant dans un solvant organique tel que le chlorure de méthylène ou le diméthylformamide à une température comprise entre —10 et +30°C.

Lorsque la fonction acide de la L-alanine est libre, il est nécessaire d'activer l'acide de formule générale (VII) préalablement à son action sur la L-alanine. Comme dérivé'activé de l'acide de formule générale (VII), il est particulièrement avantageux d'utiliser un halogénure d'acide ou un anhydride mixte. On opère alors dans les conditions décrites précédemment pour l'action d'un acide de formule générale (VII) sur le dipeptide de formule générale (VIII).

Le dipeptide de formule générale (VIII) peut être obtenu par condensation de la L-alanine dont la fonction amine est protégée sur l'acide D-glutamique ou ses dérivés selon les méthodes habituelles utilisées en chimie peptidique, suivie de l'élimination du groupement protecteur de la fonction amine.

Les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent également être obtenus, selon l'invention, par action d'un dérivé activé de la L-alanine de formule générale (V) sur un dipeptide de formule générale:

h2n-ch-co-r4

ch2ch2-co-nh-ch-r3 ,vt,

I (A*)

(çh2)3

Rs-NH-ch-r!

dans laquelle R2, R3, R4 et R5 sont définis comme précédemment, étant entendu que l'un au moins des symboles R5 des formules (V) et (XI) représente un reste d'acide gras, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un dipeptide de formule générale (III) sur un aminoacide de formule générale (IV), suivie du remplacement du radical R5, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, et éventuellement du remplacement du radical R4, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un

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radical phényle ou nitrophényle), par un radical hydroxy, selon les méthodes connues, sans toucher au reste de la molécule.

Le dipeptide de formule générale (XI) peut être obtenue par action d'un dérivé de l'acide D-glutamique de formule générale:

y-nh-ch-co-r4

i (xii)

ch2ch2-cooh dans laquelle R4 est défini comme précédemment et Y représente un groupement protecteur de la fonction amine tel que le groupement t-butyloxycarbonyle, sur un aminoacide de formule générale (IV), suivie du remplacement du groupement protecteur Y sans toucher au reste de la molécule.

Les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent également être obtenus, selon l'invention, par action d'un acide de formule générale (VII) sur un tripeptide de formule générale: R6-NH-CH-CO-NH-CH-CO-R4

ch3 ch2ch2-co-nh-çh-r3(xiii)

(çh2)3

r6-nh-ch-r2

dans laquelle les symboles R2, R3 et R4 sont définis comme précédemment et les symboles R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou le radical R5 défini précédemment, l'un au moins des symboles R6 représentant un atome d'hydrogène, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un acide de formule générale (VII) sur le dipeptide de formule générale (VIII), suivie du remplacement du radical R6, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, et éventuellement du remplacement du radical R4, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), par un radical hydroxy.

Les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent être éventuellement purifiés par des méthodes physiques (telles que cristallisation ou Chromatographie) ou chimiques (telles que formation d'un sel, cristallisation de celui-ci, puis décomposition).

Les nouveaux produits selon l'invention peuvent être transformés en sels d'addition avec les acides ou en sels métalliques ou en sels d'addition avec les bases organiques selon la nature des substituants.

Les sels d'addition avec les acides peuvent être obtenus par action des nouveaux composés sur des acides dans un solvant approprié. Généralement, on solubilise le produit dans l'eau par addition de la quantité théorique d'acide, puis on lyophilise la solution obtenue.

Les sels métalliques ou les sels d'addition avec les bases organiques peuvent être obtenus par action des nouveaux composés sur des bases dans un solvant approprié. Généralement, on solubilise.le produit dans l'eau par addition de la quantité théorique de base,

puis on lyophilise la solution obtenue.

Les nouveaux composés selon la présente invention sont des adjuvants et des stimulants de l'immunité: ils augmentent les réactions d'hypersensibilité et/ou la production d'anticorps circulants vis-à-vis des antigènes avec lesquels ils sont administrés, et ils stimulent de manière non spécifique des réactions de défense contre certaines infections (par exemple l'infection de la souris par la bactérie intracellulaire Listeria monocytogenes).

In vitro, ils sont actifs à des concentrations molaires généralement comprises entre 10~3 et 10~8, en particulier dans les tests suivants:

— stimulation de la synthèse de l'ADN (pouvoir mitogène) selon la technique de G. Marchai, «Ann. Immunol.» (Inst. Pasteur), 125C, 519 (1974);

— stimulation de la réaction allogénique (réaction d'histo-incompa-tibilité) selon la technique de R.W. Dutton, «J. Exp. Med.», 122, 759 (1966), et A.B. Peck et F.H. Bach, «J. Immunol. Methods», 3, 147 (1973);

— stimulation de la production d'anticorps selon la technique de P.H. Klesius, «Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (N.Y.)», 135,155 (1970), et H. Van Dijk et N. Bloksma, «J. Immunol. Methods», 14,325 (1977);

— augmentation du nombre de macrophages phagocytaires selon la technique de J. Michl et coll., «J. Exp. Med.», 144,1465 (1976);

— stimulation de l'activité phosphatase acide et N-acétylglucosami-dinase (enzymes lysosomiales des macrophages) en l'absence d'une augmentation de la déshydrogénase lactique selon la technique de P. Davies et coll., «J. Exp. Med.», 139,1262 (1974).

In vivo, chez la souris, à des doses comprises entre 1 et 30 mg/kg, ils augmentent l'hypersensibilité retardée et la production d'anticorps, en particulier selon la technique de T.E. Miller et coll., «J. Nath. Cancer Inst.», 51,1669 (1973).

Chez le cobaye, ils augmentent la réaction d'hypersensibilité et de production d'anticorps contre la gammaglobuline bovine couplée avec l'haptènedinitrophénol selon la technique de F. Floc'h et coll., «Immunol. Communie.», 7,41 (1978).

Chez la souris, ils stimulent les réactions de défense contre l'infection de la souris à Listeria monocytogenes à des doses comprises entre 1 et 100 mg/kg selon la technique de R.M. Fauve et B. Hevin, «C.R. Acad. Sc. (D)», 285,1589 (1977).

Chez la souris, ils stimulent le pouvoir d'élimination du carbone colloïdal par le système réticulo-endothélial selon la technique de B.N. Halpern et coll., «Ann. Inst. Pasteur», 80, 582 (1951).

Chez le lapin, à des doses généralement comprises entre 0,1 et 3 mg/kg, ils stimulent la formation d'anticorps sériques antivirus grippal selon la technique de G.H. Werner et coll., «Biomedicine», 22, 440 (1975).

D'un intérêt tout particulier sont les tripeptides de formule générale (I) dans laquelle R! représente un radical hydroxy ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle, R3 représente un radical carboxy ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone, le symbole R, lié au reste L-alanyl, est un radical alca-noyle contenant 8 à 16 atomes de carbone et le symbole R, lié à la fonction amine en a du radical R2, est un atome d'hydrogène. Plus particulièrement intéressants sont les produits de formule générale (I) dans laquelle Rt représente un radical hydroxy, R2 représente un radical carbamoyle, R3 représente un radical carboxy et les symboles R sont définis comme ci-dessus.

Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique.

Les nouveaux produits de formule générale (I) peuvent former des complexes avec les métaux alcalins ou alcalino-terreux. Il en résulte que les résultats de l'analyse élémentaire peuvent s'écarter sensiblement des valeurs théoriques. Cependant, les produits sont identifiés par leur teneur en aminoacides, par le rapport C/N et par leur homogénéité en Chromatographie sur couche mince de Silicagel.

Exemple 1:

On ajoute 1,88 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à 10° C, de 7,03 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 280 cm3 de dioxanne et 2,0 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à 10° C, puis on ajoute une solution de 4,04 g de N-e-benzyloxycarbonyl L-lysine dans un mélange de 30 cm3 de dioxanne et de 14,4 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 h à 18° C environ. L'insoluble formé est dissous par addition de 280 cm3 d'eau. La solution obtenue est agitée encore pendant 1 h, puis acidifiée à pH 3 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN. L'insoluble formé est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'eau et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20° C. On obtient ainsi 7,72 g d'un solide blanc que l'on Chromatographie sur une colonne de 3,5 cm de diamètre contenant 230 g de gel de silice neutre. On élue successivement par 700 cm3 d'un mélange acétone/cyclohexane (9/1 en volumes), 1,11 d'acétone et 1,71 de méthanol en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 22 à 35 sont réunies, concentrées à

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sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C. On obtient ainsi 5,97 g de N-a-jO^benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-gluta-myl] N-E-benzyloxycarbonyl L-lysine.

Rf = 0,84 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

On dissout 1,77 g de N-a-fO^benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N-e-benzyloxycarbonyl L-lysine dans 177 cm3 de mé-thanol. On ajoute 1,77 g de palladium sur noir (à 3% de palladium), puis on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 4 h. Après filtration, concentration à sec du filtrat, l'huile résiduelle est reprise par 20 cm3 d'acétone. On obtient ainsi 1,06 g d'un solide blanc que l'on recristallise dans un mélange d'éthanol (12 cm3) et d'acétone (24 cm3). On obtient ainsi 0,9 g de N-a-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] L-lysine fondant à 180-186° C (fusion pâteuse).

Rf = 0,29 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Analyse:

Calculé: C 59,07 H 9,15 N 10,60%

Trouvé: C 58,40 H 8,80 N 10,00%

Après hydrolyse totale, l'analyse sur auto-analyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants:

Ala 1,02 (théorie = 1)

Glu 1,00 (théorie = 1)

Lys 0,89 (théorie = 1)

Le N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle peut être préparé selon l'une des deux méthodes suivantes:

a) A une solution de 12,75 g de chlorhydrate de L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans 75 cm3 de soude IN, on ajoute simultanément, en 37 min, 8 g de chlorure de lauroyle dissous dans 75 cm3 d'éther et 37,4 cm3 de soude IN de façon à maintenir le pH du mélange réactionnel compris entre 8 et 9. Le mélange est agité pendant 1 h 20 min. Après décantation, la phase aqueuse est acidifiée à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique IN (60 cm3), extraite 3 fois par 300 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les extraits organiques réunis sont lavés par 25 cm3 d'eau, séchés sur du sulfate de sodium anhydre et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C. On obtient ainsi 7,4 g d'un solide blanc que l'on Chromatographie sur 80 g de gel de silice neutre contenus dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue successivement par 100 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (8/2 en volumes) et 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (1/1 en volumes), en recueillant des fractions de 50 cm3. La fraction 1 est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C. On obtient ainsi 2 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle fondant à 130° C. Les fractions 2 à 4 sont de même concentrées à sec et chromatographiées sur 100 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm) contenus dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue par 250 cm3 d'acétate en recueillant des fractions de 25 cm3. Les fractions 1 et 2 sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C. On obtient ainsi 4,07 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle fondant à 130° C dont les caractéristiques sont les suivantes:

Rf = 0,9 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Analyse:

Calculé: C 66,10 H 8,63 N5,71%

Trouvé: C 66,30 H 8,80 N 5,60%

b) On ajoute 31 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à une température voisine de 10° C, de 47,75 g d'acide laurique dans 3 1 de dioxanne et 33,3 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à 10° C, puis on ajoute en

10 min une solution, refroidie à 10° C, de 88,95 g de chlorhydrate de L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle, dans un mélange de 11 de dioxanne, de 476 cm3 d'eau et de 476 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h à 10° C, puis pendant 18 h à une température voisine de 20° C; il est ensuite dilué par addition de 41

d'eau, acidifié à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique IN (environ 475 cm3) et conservé pendant 2 h à 0° C. Le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé successivement par 500 cm3 d'eau et 500 cm3 d'éther, puis séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C. Le produit est mis en suspension dans 800 cm3 d'éther, agité pendant 1 h, séparé par filtration et lavé 2 fois par 200 cm3 au total d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C, on obtient 71,79 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle fondant à 130° C.

Rf = 0,77 [Silicagel; acétate d'éthyle/méthanol (4/1 en volumes)].

Le chlorhydrate de L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 97,16 g de N-t-butyloxycarbonyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans 970 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7N dans l'acide acétique. On agite pendant 2 h, puis on ajoute rapidement 3,81 d'éther anhydre et on laisse reposer pendant 2 h à 0° C. Le précipité huileux qui s'est formé, séparé du surnageant par décantation, est dissous dans 500 cm3 d'acétone; la solution ainsi obtenue est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 88,9 g de chlorhydrate de L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle.

Le N-t-butyloxycarbonyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle peut être préparé selon la méthode de E. Bricas et coll., «Biochemis-try», 9, 823 (1970).

La N-e-benzyloxycarbonyl L-lysine peut être préparée selon la méthode de A. Neuberger et coll., «Biochem. J.», 37, 515 (1943).

Exemple 2:

On ajoute 0,65 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à —10° C, de 2,45 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 80 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,70 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à —10° C, puis on ajoute une solution, refroidie à —10° C, de 2,24 g de chlorhydrate de N-e-benzyloxycarbonyl L-lysinate de benzyle dans un mélange de 40 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,77 cm3 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à —10° C, puis pendant 2 d à 20° C environ. On concentre ensuite le mélange réactionnel à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40° C. Le solide blanc obtenu est repris dans 100 cm3 d'acétate d'éthyle à 40° C, trituré jusqu'à pulvérisation, séparé par filtration, trituré à nouveau dans 50 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 2,69 g de N-a-fN^O'-benzyl N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N-e-benzyloxycarbonyl L-lysinate de benzyle.

Rf = 0,80 [Silicagel; acétate d'éthyle/méthanol (9/1 en volumes)].

On dissout 2,65 g de N-a-[01-benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N-e-benzyloxycarbonyl L-lysinate de benzyle dans 265 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,65 g de palladium sur noir (à 3% de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 3 h. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, on obtient 1,81 g de N-a-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] L-lysine identique au produit obtenu à l'exemple 1.

Le N-e-benzyloxycarbonyl L-lysinate de benzyle peut être préparé selon la méthode de T. Shiba et coll., «Bull. Chem. Soc. Japan», 33,1721 (1960).

Exemple 3:

On ajoute 3,17 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue vers 10° C, de 11,96 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 490 cm3 de dioxanne et de 3,43 cm3 de triéthylamine. La solution est agitée pendant 20 min vers 10° C, puis on ajoute une solution de 8,87 g d'acide N6-benzyl-oxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique à 88,8% (dosage perchlorique) dans un mélange de 219 cm3 d'eau et de 24,4 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à une tempé5

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rature voisine de 10° C, puis pendant 15 h à une température voisine de 20° C; il est ensuite filtré. Au filtrat, on ajoute 360 cm3 d'eau et on sépare par filtration un léger insoluble formé. Le filtrat est acidifié à pH 2 par addition de 49 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 750 cm3 au total d'eau et séché. On obtient ainsi 16,3 g d'une poudre blanche que l'on Chromatographie sur 800 g de gel de silice neutre (0,0635-0,20 mm) contenus dans une colonne de 6 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 16,3 g de poudre dans 800 cm3 de méthanol et, à la solution obtenue, on ajoute 160 g de sable de Fontainebleau. On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60° C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 11 d'acétate d'éthyle, 41 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (9/1 en volumes), 7 1 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (85/15 en volumes) et 41 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (1/1 en volumes) en recueillant des fractions de 250 cm3. Les fractions 45 à 60 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60° C. On obtient ainsi 9,4 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,83 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

On dissout 4,07 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 200 cm3 d'acide acétique. On ajoute 4 g de palladium sur noir (à 3% de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 7 h. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60° C, la meringue obtenue est reprise par 45 cm3 au total de méthylcyclohexane et amenée chaque fois à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60° C. La poudre ainsi obtenue est séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 50° C. On obtient 2,76 g d'acide N2-(N-lauroyl L-alanyl-y-D-glutamyl)-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique. Rf = 0,49 (Silicagel; acide acétique).

Analyse:

Calculé: C 56,72 H 8,64 N 12,25%

Trouvé: C 53,40 H 8,50 N 10,90%

Ala 1,00 (théorie = 1)

Dap 0,99 (théorie =1)

Glu 1,05 (théorie =1)

L'acide N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

A une solution de 9,7 g de dichlorhydrate de l'acide DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 63 cm3 d'eau amenée à pH 10 par addition de 37 cm3 de soude IN, on ajoute 4,35 g de bromure cuivrique dissous dans 44 cm3 d'eau. On agite le mélange réactionnel pendant 2 h à 20° C environ. On sépare par filtration un léger insoluble, puis on refroidit le filtrat à une température comprise entre —3 et 0° C. On ajoute 9,2 g de bicarbonate de sodium et ensuite, goutte à goutte en 30 min, 7,9 cm3 de chloroformiate de benzyle. Le mélange réactionnel est agité pendant 18 h à une température voisine de 20° C. Le précipité bleu formé est séparé par filtration, lavé par 15 cm3 d'eau, 2 fois par 30 cm3 au total d'éthanol et 15 cm3 d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, on obtient 9,6 g de complexe cuivrique de l'acide N6-benzyl-oxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique que l'on ajoute à 60 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On agite pendant 1 h à une température voisine de 20° C. Un insoluble est séparé par filtration. Au filtrat, on ajoute 30 cm3 de méthanol, puis on fait passer un courant d'hydrogène sulfuré pendant l'A h. On laisse reposer pendant 16 h. La bouillie noire obtenue est filtrée, lavée 4 fois par 160 cm3 au total d'eau. Les filtrats réunis sont concentrés jusqu'à un volume de 30 cm3 sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, amenés à pH 9 par addition de 7,5 cm3 de triéthylamine, dilués par addition de 20 cm3 d'eau et amenés à pH 6 par addition de 5,5 cm3 d'acide chlorhydrique IN. La bouillie blanche ainsi obtenue est conservée à 0° C pendant 2 h. Le produit qui se sépare par filtration est lavé successivement par 20 cm3 d'eau et 20 cm3 d'éthanol et séché sous pression réduite. On obtient ainsi 5,8 g d'acide Nö-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique à 96% (dosage perchlorique).

Le dichlorhydrate de l'acide DD,LL-diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 83 g d'acide DD,LL-dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 1,61 de méthanol et de 14,6 cm3 d'acide chlorhydrique concentré (d = 1,19). On ajoute 83 g de palladium sur noir (à 3% de palladium) et on fait passer un courant d'hydrogène pendant 10 h. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60° C, on obtient 40,5 g de dichlorhydrate de l'acide DD,LL-diamino-2,6 pimélamique sous forme de meringue.

L'acide DD,LL-dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 168 g d'ester monobenzylique de l'acide DD,LL-dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélique dans 1,68 1 de méthanol. On refroidit cette solution vers 0° C et on la sature d'ammoniac. Dès qu'elle est saturée, on la transvase dans 3 autoclaves de 11. Après avoir fermé ces autoclaves, on les conserve pendant 40 h à 20° C environ. Après dégazage, la solution ainsi obtenue est concentrée sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60° C. Le résidu est dissous dans 21 d'eau et la solution obtenue est amenée à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 4N. Il se forme un précipité gommeux qu'on isole par décantation, triture avec 21 d'éther, sépare par filtration, lave 2 fois par 400 cm3 au total d'éther et 2 fois par 400 cm3 au total d'eau. Après séchage, on obtient 83,5 g d'acide DD,LL-dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique fondant à 145-150° C.

Rf = 0,69 [Silicagel; n-butanol/éthanol/eau/ammoniaque concentrée (4/4/1/1 en volumes)].

Le monoester benzylique de l'acide DD,LL-dibenzyloxycar-bonylamino-2,6 pimélique peut être préparé selon la méthode de A. Arendt et coll., «Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum», 48,1305 (1974) [«Chem. Abst.», 82, 31497 g (1975)].

Exemple 4:

On ajoute 0,81 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution maintenue à — 5° C, de 2,5 g de N-lauroyl L-alanyl-D-isogluta-mine dans 150 cm3 de diméthylformamide et 0,87 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à — 5° C, puis on ajoute une solution, refroidie à +2° C, de 2,02 g d'acide N6-benzyl-oxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 62,5 cm3 d'eau et 6,25 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h à 0° C, puis pendant 18 h à 20° C environ, et est ensuite filtré. Le filtrat, dilué par addition de 300 cm3 d'eau, est acidifié à pH 1 par addition de 15 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité apparu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 30 cm3 au total d'eau, puis séché. On obtient ainsi 2,03 g d'un solide blanc auquel on ajoute 680 mg d'un produit obtenu dans des conditions analogues. Le mélange est dissous dans 30 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec, puis on dépose le résidu sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 60 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes), 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (8/2 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/ acide acétique (7/3 en volumes), 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (1/1 en volumes) et 480 cm3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 17 à 49 sont réunies et concentrées à sec. On obtient ainsi 1,78 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-D-isoglutaminyl] N6-benzoyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

RF = 0,65 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (3/1 en volumes)].

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On dissout 1,76 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-D-isoglu-taminyl] N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,76 g de palladium sur noir (à 3% de palladium), puis on fait passer un courant d'hydrogène pendant 2 A h. Après filtration, le filtrat est concentré à 5 cm3 environ et dilué par addition de 100 cm3 d'éther. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 2 fois par 40 cm3 au total d'éther et séché. On obtient ainsi 1,37 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-D-isoglutaminyl]-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,40 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

La N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutamine peut être préparée de la façon suivante:

On dissout 6,6 g de N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminate de benzyle dans 330 cm3 d'acide acétique. On ajoute 6,6 g de palladium sur noir (à 3% de palladium), puis on fait passer un lent courant d'hydrogène pendant 2 h. Après filtration du mélange réactionnel, on verse le filtrat dans 3 1 d'eau. Après 2 h de repos à 0° C, le précipité apparu est séparé par filtration, lavé 2 fois par 80 cm3 au total d'eau, puis séché. On obtient ainsi 5,16 g de produit auquel on ajoute 0,5 g d'un produit obtenu dans des conditions analogues. Ce mélange est dissous dans 90 cm3 de méthanol bouillant et à la solution obtenue on ajoute 45 cm3 d'eau. Après 2 h de repos à une température voisine de 20° C, les cristaux apparus sont séparés par filtration, lavés 2 fois par 60 cm3 au total d'eau et séchés sous pression réduite (20 mm de mercure). On obtient ainsi 5,1 g de N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutamine fondant ä 163° C.

Rf = 0,18 [Silicagel; acétate d'éthyle/méthanol (4/1 en volumes)].

Analyse:

Calculé: C 60,12 H 9,33 N 10,52%

Trouvé: C 60,20 H 9,50 N 10,90%

Le N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminate de benzyle peut être préparé de la façon suivante:

On ajoute 2,54 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à 0° C, de 3,9 g d'acide laurique dans 156 cm3 de toluène anhydre et 2,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à 0° C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0° C, de 6,7 g de chlorhydrate de L-alanyl-D-isoglutaminate de benzyle dans 52 cm3 d'eau et 2,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 65 h à une température voisine de 20° C. On obtient une masse réactionnelle d'aspect gélatineux à laquelle on ajoute 150 cm3 d'acétate d'éthyle. Le précipité est séparé par filtration, lavé par 30 cm3 d'eau, puis séché. On obtient 7,6 g de N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminate de benzyle sous la forme d'une poudre blanche. La phase aqueuse du filtrat précédent est extraite 2 fois par 100 cm3 au total d'acétate d'éthyle, cette phase acétate d'éthyle est réunie avec la phase organique du filtrat, lavée par 125 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N, 120 cm3 d'eau, séchée sur sulfate de magnésium puis concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient à nouveau 1,5 g de N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminate de benzyle. Le produit (7,6 g et

1.5 g) est recristallisé dans 120 cm3 de méthanol. On obtient ainsi

6.6 g de N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminate de benzyle fondant à 169° C.

Rf = 0,13 (Silicagel; acétate d'éthyle).

Le chlorhydrate de L-alanyl-D-isoglutaminate de benzyle peut être préparé selon le procédé de S. Kusumoto, «Bull. Chem. Soc. Japan», 49, 533 (1976).

Exemple 5:

On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à 0° C, de 3,04 g de N-octanoyl L-alanyl-a-D-gluta-mate de benzyle dans 150 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à 0° C, puis on ajoute une solution, refroidie à 2° C, de 2,26 g d'acide N6-benzyl-

oxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 70 cm3 d'eau et de 7 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h à 0° C, puis pendant 20 h à une température voisine de 20° C. Le tétrahydrofuranne est ensuite évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le concentrât est dilué par addition de 50 cm3 d'eau et acidifié à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité blanc obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'eau, puis séché. On obtient ainsi 4,73 g d'un solide blanc qui est chromatographié sur une colonne de 2,2 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). Pour cela, le produit est dissous dans 20 cm3 d'acide acétique. A la solution obtenue, on ajoute 10 g de gel de silice neutre et concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 280 cm3 d'acétate d'éthyle, 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes», 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (8/2 en volumes), 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (1/1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 13 à 23 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient une huile qui se solidifie dans l'éther. Après séparation par filtration et séchage, on obtient 2,84 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-octanoyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N6-benzyl-oxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,68 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (3/1 en volumes)].

On dissout 2,82 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-octanoyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,82 g de palladium sur noir (à 3% de palladium), puis on fait passer un courant d'hydrogène pendant 2 lA h. Après filtration, le filtrat est concentré à 5 cm3 environ sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C et dilué par addition de 100 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'éther, puis séché. On obtient ainsi 2,0 g d'acide N2-[N-(N-octanoyl L-alanyl)-y-D-gluta-myl]-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique fondant à 160-164° C (fusion pâteuse).

Rf = 0,30 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Analyse:

Calculé: C 53,58 H 8,02 N 13,58%

Trouvé: C 53,05 H 8,17 N 13,06%

Ala 1,00 (théorie = 1)

Dap 0,95 (théorie = 1)

Glu 1,02 (théorie =1)

Le N-octanoyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante:

On ajoute 3,6 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution maintenue à — 1° C, de 3,95 g d'acide octanoïque dans 140 cm3 de tétrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à — 1° C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0° C, de 9,45 g de chlorhydrate de L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude IN et 30 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h à — 1° C, puis pendant 20 h à 20° C environ. Il est ensuite acidifié à pH 1 par addition d'acide chlorhydrique IN. Le tétrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C, puis le concentrât est extrait par 100 cm3 d'acétate d'éthyle. La phase organique ainsi obtenue est lavée 2 fois par 50 cm3 au total d'acide chlorhydrique IN et par 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C. On obtient ainsi 10 g d'une huile jaune pâle qui est chromato-graphiée sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue avec de l'acétate

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d'éthyle en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 7 à 9 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C. Le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 d'un mélange éther/éther de pétrole (p.é. = 35-60° C) (1/4 en volumes), séparé par filtration et séché. On obtient ainsi 3,27 g de N-octanoyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle sous la forme d'une poudre blanche.

Rf = 0,56 [Silicagel; acétate d'éthyle/méthanol (8/2 en volumes)].

Exemple 6:

On ajoute 0,70 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à 2° C, de 2,91 g de N-palmitoyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans 120 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,75 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à 2° C, puis on ajoute une solution, refroidie à 2° C, de 1,726 g d'acide N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 53,4 cm3 d'eau et de 5,34 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h à 2° C, puis pendant 18 h à une température voisine de 20° C. Le tétrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le concentrât est dilué par addition de 50 cm3 d'eau et acidifié à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité blanc obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'eau et séché. On obtient ainsi 4,15 g d'un solide blanc qui est chromatographié sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 85 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). Pour cela, le produit est dissous dans de l'acide acétique à 60° C. A la solution obtenue on ajoute 10 g de gel de silice neutre, puis on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 320 cm3 d'acétate d'éthyle, 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes), 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (8/2 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 14 à 22 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C.

Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther, séparé par filtration, et séché. On obtient ainsi 2,20 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-palmitoyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,75 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (3/1 en volumes)].

On dissout 2,14 g d'acide N2-[01-benzyl Nr(N-palmitoyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,14 g de palladium sur noir (à 3% de palladium), puis on fait passer un lent courant d'hydrogène pendant 254 h. Après filtration, le filtrat est concentré à 5 cm3 environ sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, puis dilué par addition de 100 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, lavé 2 fois par 20 cm3 au total d'éther et séché. On obtient ainsi 1,58 g d'acide N2-[N-(N-palmitoyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Le N-palmitoyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante:

On ajoute 3,6 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à 0° C, de 7,03 g d'acide palmitique dans 140 cm3 de tétrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à 0° C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0° C, de 9,45 g de chlorhydrate de L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude IN et de 30 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h à 0° C, puis pendant 18 h à 20° C environ; il est ensuite acidifié à pH 1 par addition de 70 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 5 fois par 200 cm3 au total d'eau et séché. On obtient ainsi 12,11 g d'une poudre blanche qui est chromatographiée sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre

(0,063-0,20 mm). On élue successivement par 200 cm3 d'acétate d'éthyle, 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (9/1 en volumes), 1,61 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (8/2 en volumes), 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (6/4 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 5 à 23 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C. On obtient ainsi 5,18 g d'un solide que l'on triture dans 50 cm3 d'éther bouillant pendant lA h. Après refroidissement à une température voisine de 20° C, l'insoluble est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'éther, puis séché. On obtient ainsi 2,94 g de N-palmitoyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle.

Rf = 0,77 (Silicagel; acétate d'éthyle).

Exemple 7:

On ajoute 1,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à — 5° C, de 4,91 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 250 cm3 de tétrahydrofuranne et de 1,4 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à —5° C, puis on ajoute une solution refroidie à 0° C de 3,32 g de chlorhydrate de N-s-benzyloxycarbonyl L-lysinate de méthyle dans un mélange de 10 cm3 de soude IN et de 10 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 min vers —5° C, puis pendant 4 d à une température voisine de 20° C. Ensuite, le mélange réactionnel est acidifié à pH 1 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45° C. Le concentrât est extrait 5 fois par 150 cm3 au total de chloroforme. Les phases chloroformiques, réunies, sont lavées par 40 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N et séchées sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, on obtient une huile jaune pâle que l'on dissout dans 60 cm3 de chloroforme contenant 15 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 150 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 2,5 1 d'acétate d'éthyle et 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (95/5 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 6 à 27, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 3,47 g de N-a-fO'-benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N-e-benzyloxycarbonyl L-lysinate de méthyle sous forme de poudre blanche.

Rf = 0,70 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (95/5 en volumes)].

Rf = 0,40 (Silicagel; acétate d'éthyle).

On dissout 3,43 g de N-a-fO^benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N-e-benzyloxycarbonyl L-lysinate de méthyle dans 70 cm3 d'acide acétique. On ajoute 3,43 g de palladium sur noir (à 3% de palladium), puis on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 h. Le catalyseur est séparé par filtration, lavé 2 fois par 20 cm3 au total d'acide acétique, les filtrats réunis sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le résidu ainsi obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther. On obtient ainsi une poudre que l'on sépare par filtration et que l'on sèche à l'air. On obtient ainsi 1,89 g de N-a-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] L-lysinate de méthyle.

Rf = 0,50 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Rf = 0,29 (Silicagel; acide acétique).

Exemple 8:

On ajoute 1,6 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à —5 C, de 6,07 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 280 cm3 de tétrahydrofuranne et de 1,74 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à — 5" C, puis on ajoute une solution refroidie à 3' C de 4 g d'acide N6-benzyloxycarbonylmésodiamino-2(L),6(D)-pimélamique dans un mélange de 12,4 cm3 de soude IN et 124 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 min vers 0" C, puis pendant 70 h

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vers 20° C environ. Le mélange réactionnel est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Dans le concentrât, on a un précipité blanc que l'on sépare par filtration, lave 3 fois par 150 cm3 au total d'acide chlorhydrique 0,1N et 3 fois par 150 cm3 au total d'eau et sèche sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C. On obtient ainsi 9,15 g de poudre blanche que l'on dissout dans 100 cm3 d'acide acétique contenant 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur une colonne de 5 cm de diamètre contenant 400 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).

On élue successivement par:

1,61 d'acétate d'éthyle,

900 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (97,5/2,5 en volumes),

1200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (95/5 en volumes),

900 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (92,5/7,5 en volumes),

900 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (90/10 en volumes),

300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (85/15 en volumes),

3200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (80/20 en volumes),

en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 61 à 90,

réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le solide blanc obtenu est lavé 2 fois avec 100 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 60° C. On obtient ainsi 6,3 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N°-benzyloxycarbonylmésodiamino-2(L),6(D)-pimélamique.

Rf = 0,77 [Silicagel: acétate d'éthyle/acide acétique (3/1 en volumes)].

On dissout 8,2 g d'acide N2[01-benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N6-benzyloxycarbonylmésodiamino-2(L),6(D)-pi-mélamique dans 225 cm3 d'acide acétique. On ajoute 8,2 g de palladium sur noir (à 3% de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 3 'A h. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, l'huile obtenue est triturée dans 100 cm3 d'éther jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 5,9 g de poudre. 0,9 g de cette poudre est mise en solution dans de l'acide acétique et filtrée sur une colonne de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) de 2 cm de diamètre et de 2 cm de hauteur. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le résidu obtenu est repris par 50 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 55° C. On obtient ainsi 0,75 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]mêsodiamino-2(L),6(D)-pi-mélamique.

Rf = 0,38 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Analyse:

Calculé: C 56,72 H 8,64 N 12,25%

Trouvé: C 52,80 H 8,10 NI 1,60%

Cendres sulfuriques = 6,9%.

Ala 1,02 (théorie = 1)

Dap 0,96 (théorie = 1)

Glu 1,00 (théorie = 1)

L'acide N6-benzyloxycarbonylmésodiamino-2(L),6(D)-piméla-mique peut être préparé selon le procédé décrit dans le brevet belge N» 821385.

Exemple 9:

On ajoute 0,65 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à — 5° C, de 2,383 g de N-undécanoyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 100 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 30 min à — 5° C, puis on ajoute une solution refroidie à 0° C de 1,617 g d'acide N6-benzyloxycarbonyl-LL,DD-diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 5 cm3 de soude IN et 50 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 0° C, puis pendant 40 h vers 20° C environ. Le mélange réactionnel est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Dans le concentrât, on a un précipité que l'on sépare par filtration, lave 3 fois par 60 cm3 au total d'acide chlorhydrique N/10 et 20 cm3 d'eau. Après séchage sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20° C, on obtient 3,66 g de solide blanc que l'on dissout dans 20 cm3 d'acide acétique contenant 10 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3,5 cm de diamètre contenant 75 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par:

600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/cyclohexane (1/1 en volumes),

600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/cyclohexane (3/1 en volumes),

400 cm3 d'acétate d'éthyle,

600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (95/5 en volumes),

500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes),

1200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (85/15 en volumes),

en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 22 à 32,

réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le solide amorphe obtenu est repris par 80 cm3 d'éther, trituré jusqu'à pulvérisation totale, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 2,58 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-undécanoyl L-alanyl)-y-D-gluta-myl] N6-benzyloxycarbonyl-LL,DD-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,62 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes)].

On dissout 2,55 g d'acide N2[0'-benzyl N-(N-undécanoyl L-alanyl)-y-D-glutamyl] N6-benzyloxycarbonyl-LL,DD-diamino-2,6 pimélamique dans 35 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,55 g de palladium sur noir (à 3% de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2'A h. Le catalyseur est séparé par filtration et lavé 3 fois par 30 cm3 au total d'acide acétique. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le solide amorphe est repris par 50 cm3 d'éther, filtré et séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C. On obtient ainsi 1,87 g d'acide N2-[N-(N-undêcanoyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-LL,DD-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,75 (Silicagel; acide acétique).

Le N-undêcanoyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante:

On ajoute 3,56 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à — 5° C, de 5,1 g d'acide undécanoïque dans un mélange de 140 cm3 de tétrahydrofuranne et de 3,84 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à — 5° C, puis on ajoute une solution refroidie à 0° C de 9,45 g de chlorhydrate de L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude IN et 30 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 min vers —5° C, puis pendant 20 h vers 20° C environ. Le mélange réactionnel est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 60 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le concentrât est extrait 2 fois par 80 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases

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acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 40 cm3 d'eau et séchées sur du sulfate de sodium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, on obtient 11,89 g d'huile que l'on Chromatographie sur une colonne de 4,5 cm de diamètre contenant 250 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue par de l'acétate d'éthyle en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 3 à 5, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C. On obtient ainsi 5,85 g d'un solide pâteux que l'on Chromatographie sur une colonne de 3,2 cm de diamètre contenant 115 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 11 d'un mélange acétate d'éthyle/cyclohexane (1/1 en volumes), 1,7 1 d'acétate d'éthyle et 600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (99/1 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 11 à 30, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 2,47 g de N-undécanoyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle sous la forme d'un solide blanc.

Rf = 0,71 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes)].

Exemple 10:

On ajoute 0,69 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à — 5° C, de 2,57 g de N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 120 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,74 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à —5° C, puis on ajoute une solution refroidie à 0° C de 1,7 g d'acide N6-benzyloxycarbonyl-LL-diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 5,25 cm3 de soude IN et 35 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 min vers —3° C, puis pendant 22 h vers 20° C environ. Ensuite, on l'acidifie à pH 2 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 60 cm3 au total d'acide chlorhydrique 0,1N et 3 fois par 60 cm3 au total d'eau. Après séchage à l'air libre, on obtient 3,97 g de poudre blanche que l'on Chromatographie sur 200 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenu dans une colonne de 3,8 cm de diamètre.

On élue successivement par:

600 cm3 d'acétate d'éthyle,

500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (95/5 en volumes),

800 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes),

en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 24 à 30, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. L'huile obtenue est reprise par 100 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 1,24 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N6-benzyloxycarbonyl-LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,85 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Rf = 0,76 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (3/1 en volumes)].

L'acide N2-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-LL-diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 1,36 g d'acide N2-[01-benzyl N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N6-benzyIoxycarbonyl-LL-diamino-2,6 pimélamique dans 40 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,4 g de palladium sur noir (à 3° C de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 4 h. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 55° C, l'huile obtenue est reprise par 100 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée à l'air. On obtient ainsi 0,96 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-LL-diamino-2,6 pimélamique.

L'acide N6-benzyloxycarbonyl-LL-diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

A une solution de 5 g de dichlorhydrate de l'acide-LL-diamino-2,6 pimélamique dans 15 cm3 d'eau amenée à pH 10 par addition de 45 cm3 de soude IN, on ajoute 2,14 g de bromure cuivrique dissous dans 20 cm3 d'eau. On agite le mélange réactionnel pendant 2 h à 20° C environ. On sépare par filtration un léger insoluble, puis on refroidit le filtrat à une température comprise entre —3 et 0° C. On ajoute 4,8 g de bicarbonate de sodium et ensuite, goutte à goutte en 30 min, 4,1 cm3 de chloroformiate de benzyle. Le mélange réactionnel est agité pendant 18 h à une température voisine de 20° C. Le précipité bleu formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 90 cm3 au total d'eau, 3 fois par 90 cm3 au total d'éthanol et 3 fois par 90 cm3 au total d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, on obtient 4,18 g de complexe cuivrique de l'acide N6-benzyloxycarbonyl-LL-diamino-2,6 pimélamique que l'on ajoute à 28 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On agite pendant 1 h à une température voisine de 20° C. Un insoluble est séparé par filtration. Au filtrat, on ajoute 14 cm3 de méthanol, puis on fait passer un courant d'hydrogène sulfuré ^pendant 6 h. On laisse reposer pendant 16 h. La bouillie noire obtenue est filtrée, lavée 3 fois par 15 cm3 au total d'eau. Les filtrats réunis sont concentrés jusqu'à un volume de 10 cm3 sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, amenés à pH 7 par addition de 5 cm3 de triéthylamine, et amenés à pH 6,8 par addition de 5 cm3 d'acide chlorhydrique IN. La bouillie blanche ainsi obtenue est conservée à 0° C pendant 2 h. Le produit qui se sépare par filtration est lavé successivement 3 fois par 30 cm3 au total d'eau, 3 fois par 30 cm3 au total d'éthanol et 3 fois par 30 cm3 au total d'éther. Après séchage à 60° C sous pression réduite (0,3 mm de mercure), on obtient 1,78 g d'acide N6-benzyloxycar-bonyl-L,L-diamino-2,6 pimélamique.

[a]p° = +11° (c = 1, HCl IN)

Rf = 0,45 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Le dichlorhydrate de l'acide L,L-diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 17 g d'acide L,L-dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 300 cm3 de méthanol et de 5,9 cm3 d'acide chlorhydrique concentré (d = 1,19). On ajoute 17 g de palladium sur noir (à 3% de palladium) et on fait passer un courant d'hydrogène pendant 4 h. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 55° C, on obtient 8,8 g de dichlorhydrate de l'acide L,L-diamino-2,6 pimélamique sous forme de meringue.

L'acide L,L-dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 19 g de L,L-N2,N6-dibenzyloxycarbonyldiamino-2,6 pimélate acide de benzyle dans 190 cm3 de méthanol. On refroidit cette solution vers 0° C et on la sature d'ammoniac. Dès qu'elle est saturée, on la transvase dans un autoclave de 11. Après avoir fermé cet autoclave, on le conserve pendant 6 d à 20° C environ. Après dégazage, la solution ainsi obtenue est concentrée sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le résidu est dissous dans 250 cm3 d'eau et la solution obtenue est amenée à pH 2 par addition de 30 cm3 d'acide chlorhydrique 4N, extraite 3 fois par 300 cm3 au total d'acétate d'éthyle; cette phase organique est lavée par 100 cm3 d'une solution saturéede chlorure de sodium, séchée sur sulfate de sodium et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 17 g d'acide L,L-dibenzyloxycarbonyl-amino-2,6 pimélamique sous forme d'huile.

Rf = 0,68 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Le L,L-N2,N6-dibenzyloxycarbonyldiamino-2,6 pimélate acide de benzyle peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 55 g de L,L-N2,Ne-dibenzyloxycarbonyldiamino-2,6 pimélate de benzyle dans 400 cm3 d'alcool benzylique tiédi à 40° C. Ensuite, on coule sur cette solution maintenue à 40° C pendant 1 h s

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environ une solution de 4,8 g de potasse en pastilles à 86% dans 400 cm3 d'alcool benzylique à 6 'A h. On continue d'agiter le milieu réactionnel à 20° C, environ pendant 16 h, ensuite on concentre à sec sous pression réduite (0,5 mm de mercure) à 90° C. On obtient ainsi une huile que l'on dissout dans 11 d'eau, extrait 3 fois par 900 cm3 au total d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse ainsi extraite est acidifiée à pH 2 par addition de 45 cm3 d'acide chlorhydrique 4N, extraite 3 fois par 1,51 au total d'acétate d'éthyle. La phase acétate d'éthyle ainsi obtenue est lavée avec 500 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et séchée sur sulfate de sodium anhydre.

Après séparation par filtration du sulfate de sodium, on ajoute 17 cm3 de dicyclohexylamine et on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40° C. On obtient une huile jaune que l'on dissout dans 100 cm3 d'éthanol auquel on ajoute 100 cm3 d'eau. Après 20 h de repos à 0° C, on obtient un solide blanc que l'on sépare par filtration, lave 2 fois par 100 cm3 au total d'eau et reprend dans un mélange de 200 cm3 d'acétate d'éthyle et 200 cm3 d'eau. On acidifie la phase aqueuse par addition de 40 cm3 d'une solution normale d'acide méthanesulfonique. Après décantation, la phase organique est lavée 2 fois par 100 cm3 au total d'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 15 g de L,L-N2,N6-dibenzyloxycarbonyldiamino-2,6 pimélate acide de benzyle sous forme d'huile.

Rf = 0,76 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Le L,L-N2,N6-dibenzyloxycarbonyldiamino-2,6 pimélate de di-benzyle peut être préparé de la façon suivante:

Dans un tricol de 500 cm3, muni d'une agitation centrale et d'un appareil Dean-Stark, on ajoute un mélange de 44,7 g d'acide L,L-N2,N6-dibenzyloxycarbonyldiamino-2,6 pimélique, 3 g d'acide p-toluènesulfonique, 30 cm3 d'alcool benzylique et 300 cm3 de toluène. On porte le milieu réactionnel au reflux pendant 5 h. Ensuite, après 16 h d'agitation à 20° C, on sépare l'insoluble blanc par filtration, le lave 2 fois par 400 cm3 au total d'une solution à 5% de carbonate de sodium et 2 fois par 400 cm3 au total d'eau. Après séchage à l'air libre, on obtient 55,4 g de L,L-N2,N6-dibenzyloxycarbonyldi-amino-2,6 pimélate de dibenzyle fondant à 118° C.

Rf = 0,53 [Silicagel; acide acétique/acétate d'éthyle (8/2 en volumes)].

L'acide L,L-N2,N6-dibenzyloxycarbonyldiamino-2,6 pimélique peut être préparé selon la méthode de A. Arendt et coll., «Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum», 48, 635 (1974).

Exemple 11 :

On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à 0° C, de 3,14 g de N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 150 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à 0' C, puis on ajoute une solution refroidie à 0 C de 2,263 g d'acide N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 7 cm3 de soude IN et 70 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h vers 0° C, puis pendant 20 h vers 22 C environ. Ensuite, on élimine un léger insoluble par filtration, on acidifie à pH 1 par addition de 12 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50' C. Le concentrât est extrait 3 fois par 150 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 20 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N, séchées sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50' C, on obtient 5,14 g de solide amorphe que l'on dissout dans 60 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (1/1 en volumes) contenant 10 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50' C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par:

400 cm3 d'acétate d'éthyle,

On dissout 2,76 g d'acide N2-{0I-benzyl-N-[N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl)-L-alanyl]-y-D-glutamyl}-N6-benzyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 100 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,76 g de palladium sur noir (3% de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2'A h. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, l'huile est triturée dans 50 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20° C. On obtient ainsi 2,07 g d'acide N2-{N-[N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl)-L-alanyl]-Y-D-glutamyl}-DD,LL-di-amino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,32 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Rf = 0,31 (Silicagel; acide acétique).

On ajoute 4,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à — 6°C, de 7,59 g de N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl)-L-alanine dans un mélange de 400 cm3 de tétrahydrofuranne et 4,63 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à — 6° C, puis on ajoute une solution refroidie à 3° C de 9,06 g de chlorhydrate de a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 66,2 cm3 de soude IN et 14 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 15 min vers — 5°C, puis pendant 66 h vers 18°C environ; il est ensuite acidifié à pH 1 par addition de 75 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le concentrât est extrait 5 fois par 200 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 40 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, on obtient 14,8 g d'huile que l'on dissout dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle contenant 30 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C et on charge l'ensemble sur une colonne de 2,8 cm de diamètre contenant 280 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par

21 de cyclohexane,

11 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (95/5 en volumes), 1,5 1 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (90/10 en volumes), 51 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (80/20 en volumes), *1,5 1 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (70/30 en volumes) et

3,5 1 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (50/50 en volumes), en recueillant des fractions de 500 cm3. Les fractions 23 à 29 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 10,86 g de N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle sous forme d'huile qui cristallise.

Rf = 0,37 (Silicagel; acétate d'éthyle).

La N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl)-L-alanine peut être préparée de la façon suivante:

On ajoute 6,5 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à —5° C, de 7,912 g d'acide triméthyl-3,5,5 hexanoïque dans un mélange de 125 cm3 de tétrahydrofuranne et de 7 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 min à — 5° C, puis on ajoute une solution, refroidie à 5° C, de 4,495 g de L-alanine dans 50 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 min vers 0° C, puis pendant 18 h à 25° C environ. On évapore ensuite le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le concentrât est extrait 2 fois par 40 cm3 au total d'éther, aicidifé à pH 1 par addition de 55 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité huileux qui se forme est extrait 5 fois par 250 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle sont réunies, lavées par 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, on obtient 11,79 g d'huile que l'on dissout dans 40 cm3 d'acétate d'éthyle contenant 20 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure)

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200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes),

200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (8/2 en volumes),

160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (6/4 en volumes),

240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (1/1 en volumes),

en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 15 à 25, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. L'huile obtenue est reprise par 50 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 2,85 g d'acide N2-{01-benzyl-N-[N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl)-L-alanyl]-y-D-glutamyl}-N6benzyl-oxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,32 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (3/1 en volumes)].

à 50° C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 120 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue successivement par:

600 cm3 de cyclohexane,

300 cm3 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (95/5 en volumes),

300 cm3 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (90/10 en volumes),

300 cm3 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (80/20 en volumes),

700 cm3 d'un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (50/50 en volumes),

300 cm3 d'acétate d'éthyle, et

300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/méthanol (90/10 en volumes),

en recueillant des frations de 100 cm3. Les fractions 17 à 28, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45 C. On obtient ainsi 10,16 g d'huile que l'on dissout dans 25 cm3 d'éther. Par addition de 150 cm3 d'éther de pétrole, on obtient une huile que l'on sépare par décantation. Après séchage sous vide (0,2 mm de mercure), on obtient 7,59 g de N-(triméthyl-3,5,5 hexa-noyl)-L-alanine.

Rf = 0,43 (Silicagel; acétate d'éthyle).

Exemple 12:

On ajoute 0,56 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à — 5e'C, de 2,12 g de N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 86 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,6 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 30 min à — 5" C, puis on ajoute une solution refroidie à 2° C de 1,25 g d'acide N2-t-butyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 4,32 cm3 de soude IN et 43 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers — 5° C, puis pendant 18 h vers 20e C environ. Ensuite, on l'acidifie par addition de 50 cm3 d'une solution saturée d'acide citrique. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50' C. Le concentrât est extrait 5 fois par 200 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 25 cm3 d'eau, séchées sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C, on obtient une huile que l'on dissout dans un mélange de 50 cm3 d'acétate d'éthyle et 10 cm3 d'acide acétique contenant 10 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C et on charge l'ensemble sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par:

200 cm3 d'acétate d'éthyle,

280 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (95/5 en volumes),

320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes),

en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 5 à 13, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 2,23 g d'acide N6-[01-benzyl-N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N2-t-butyloxycarbonyl-LL,DD-diamino-2,6 pimélamique sous forme d'huile.

Rf = 0,39 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes)].

On dissout 2,19 g d'acide N6-[01-benzyl-N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N2-t-butyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 22 cm3 d'une solution saturée anhydre d'acide acétique chlorhydrique. On laisse en contact pendant 3 h à 20° C, ensuite on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 1,74 g de chlorhydrate de l'acide N6-[01-benzyl-N-(N-lauroyl L-alanyl)-y-D-glutamyl]-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique sous forme d'huile partiellement cristallisée.

Rf = 0,47 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

Rf = 0,26 (Silicagel; acide acétique).

L'acide N2-t-butyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 4 g d'acide N2-t-butyloxycarbonyl N6-benzyloxy-carbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 100 cm3 d'acide acétique. On ajoute 4 g de palladium sur noir (à 3% de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 3 h. Le catalyseur est séparé par filtration, lavé par 10 cm3 d'acide acétique, les filtrats, réunis, sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le résidu huileux ainsi obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther jusqu'à pulvérisation totale. On obtient ainsi, après filtration et séchage, 3 g d'acide N2-t-butyloxycarbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,34 (Silicagel; acide acétique).

Exemple 13:

On ajoute en 20 min 1 g d'acide {01-benzyl-05-succinimido-N[N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl)-L-alanyl]}-D-glutamique dissous dans 10 cm3 de diméthoxy-1,2 éthane à une solution, maintenue à 8° C, de 0,52 g d'acide DD,LL-N6-benzyloxycarbonyldi-amino-2,6 pimélamique dans un mélange de 1,6 cm3 de soude IN et 5 cm3 d'eau. Le milieu réactionnel est agité pendant 24 h à 20° C, ensuite est acidifié à pH 1 par addition de 2 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Après 3 h d'agitation à 20°C, le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 30 cm3 au total d'eau et séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C. On obtient ainsi 1,1 g de poudre blanche que l'on Chromatographie sur une colonne de 1,7 cm de diamètre contenant 22 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par:

110 cm3 d'acétate d'éthyle,

60 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (95/5 en volumes),

180 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes),

80 cm3 d'acide acétique.

Les fractions 24 à 38, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60e C. Le solide amorphe obtenu est repris dans 10 cm3 d'éther, séparé par filtration, lavé par 10 cm3 d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C, on obtient 0,4 g d'acide N2-{0'-benzyl-N-[N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl)-L-alanyl]-y-D-glutamyl}-N6-benzyloxy-carbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,72 [Silicagel; acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes)].

On ajoute 0,4 g d'acide N2-{01-benzyl-N-[N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl)-L-alanyl]-y-D-glutamyl}-N6-benzyloxy-carbonyl-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 10 cm3 d'acide acétique. On ajoute 0,4 g de palladium sur noir (3% de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 1 V* h. Après filtration du milieu réactionnel et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50' C, on obtient une huile

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que l'on reprend par 20 cm3 d'oxyde d'isopropyle, triture jusqu'à pulvérisation totale et sépare par filtration. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure), on obtient 280 mg d'acide N2-{N-[N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl)-L-alanyl]-y-D-glutamyl}-DD,LL-diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,39 [Silicagel; n-butanol/pyridine/acide acétique/eau (50/20/6/24 en volumes)].

L'acide {0I-benzyl-05-succinimido-N-[N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl)-L-alanyl]}-D-glutamique peut être préparé de la façon suivante:

On ajoute en 10 min 7,4 g de dicyclohexylcarbodiimide dissous dans 85 cm3 de diméthyl-1,2 éthane à une solution, maintenue à 0° C, de 17,4 g de N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle et de 3,86 g de N-hydroxysuccinimide dans 170 cm3 de diméthoxy-1,2 éthane. Le milieu réactionnel est agité à 0° C pendant 3 'A h, puis conservé à 4° C pendant 16 h. Ensuite, on y ajoute 2 cm3 d'acide acétique et on agite 1 h à 20° C. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total de diméthoxy-1,2 éthane. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60° C. Le concentrât est repris par 300 cm3 d'acétate d'éthyle. Après 1 h de repos à 20° C, le précipité formé est séparé par filtration et lavé 2 fois par 50 cm3 au total d'oxyde d'isopropyle. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 22,8 g d'acide {01-benzyl-Os-succinimido-N-[N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl)-L-alanyl]}-D-glutamique sous forme d'huile orangée.

Rf = 0,77 (Silicagel; acétate d'éthyle).

Le N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante:

On ajoute en 1 h 10 min 27,5 g de n-pentyl-2 hydroxy-3 nona-noate de succinimide dissous dans 644 cm3 de diméthyl-1,2 éthane à une solution, maintenue à 7° C, de 27,8 g de chlorhydrate de L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 245 cm3 d'eau et 22,9 cm3 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est conservé à 20e C pendant 20 h, puis à 60e C pendant 5 h. On évapore ensuite le diméthoxy-1,2 éthane sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50e C; le concentrât est acidifié à pH 1 par addition de 150 cm3 d'acide chlorhydrique IN et extrait 5 fois par 1,5 1 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées 5 fois par 759 cm3 au total d'eau, séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60e C. On obtient ainsi 38,6 g d'huile que l'on dissout dans 200 cm3 d'acétate d'éthyle. On y ajoute 13 g de dicyclohexylamine. Après un repos de 20 h à 4' C, le solide blanc formé est séparé par filtration, lavé 2 fois par 40 cm3 au total d'acétate d'éthyle et 2 fois par 200 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C. On obtient ainsi 22,4 g de poudre blanche auxquels on ajoute 1,9 g obtenu dans une opération similaire. On dissout ce mélange dans 500 cm3 d'eau; on ajoute à la solution aqueuse 200 cm3 d'acétate d'éthyle et 150 cm3 d'une solution saturée d'acide citrique. On sépare la phase organique, extrait la phase aqueuse 2 fois par 400 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées 2 fois par 200 cm3 au total d'eau, séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60° C. On obtient ainsi 17,4 g de N-(n-pentyl-2 hydr-oxy-3 nonanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamate de benzyle sous forme de pâte beige.

Rf = 0,25 (Silicagel; acétate d'éthyle).

Le n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoate de succinimide peut être préparé de la façon suivante:

On ajoute en 40 min 27 g de dicyclohexylcarbodiimide dissous dans 300 cm3 de diméthoxy-1,2 éthane à une solution, maitenue à 0 C, de 29,1 g d'acide n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoïque et de 14,1 g de N-hydroxysuccinimide dans 300 cm3 de diméthoxy-1,2 éthane. Le mélange réactionnel est agité à 0 C pendant 3 h, puis conservé à 4 C pendant 21 h. Le précipité formé est séparé par filtration et lavé 2 fois par 100 cm3 au total de diméthoxy-1,2 éthane. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50" C.

Le concentrât est repris par un mélange de 300 cm3 d'oxyde d'isopropyle et 3 cm3 d'acide acétique. Après 2 h de repos à 20° C, le précipité formé est séparé par filtration et lavé 2 fois par 40 cm3 au total d'oxyde d'isopropyle. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 42,6 g de n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoate de succinimide sous forme d'huile jaune.

L'acide n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoïque peut être préparé selon la méthode de E. Lederer et coll., «Bull. Soc. Chim.», 1952, 413.

Exemple 14:

A une solution de 25 g de N-a-t-butyloxycarbonyl-N-e-benzyl-oxycarbonyl-L-lysine dans 250 cm3 d'éthanol, on ajoute 150 g de co-polymère styrène/divinylbenzène (98/2) chlorométhylé contenant 1 mEq de chlore par gramme. On agite le milieu réactionnel pendant 3 min à 20° C, ensuite on ajoute 9,2 cm3 de triéthylamine et on agite le milieu réactionnel pendant 48 h à 78° C. Le polymère est filtré,

lavé successivement par 3 fois 750 cm3 au total d'éthanol et 3 fois 750 cm3 au total de chlorure de méthylène, puis séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 160,9 g de N-a-t-butyloxycarbonyl-N-e-benzyloxycarbonyl-L-lysyl polymère.

L'acide D-glutamique est accroché sur le dérivé L-lysyl polymère en effectuant les opérations suivantes dans un réacteur muni d'un agitateur et, à sa base, d'un verre fritté.

1. On effectue 3 lavages successifs du polymère par 100 cm3 de chlorure de méthylène à chaque fois. Chaque addition de solvant est suivie d'une agitation de 3 min, puis d'un essorage.

2. Le groupement protecteur t-butyloxycarbonyle de la lysine est ensuite éliminé par addition de 100 cm3 d'un mélange acide trifluo-roacétique/chlorure de méthylène (1/1 en volumes), agitation pendant 20 min, puis essorage.

3. La résine est alors lavée successivement par:

a) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène,

b) 3 fois 100 cm3 de méthanol,

c) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène,

en agitant pendant 3 min après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois.

4. On neutralise alors le polymère par addition de 100 cm3 d'un mélange chlorure de méthylène/N-méthylmorpholine (9/1 en volumes), agitation pendant 10 min, puis essorage.

5. la résine est lavée ensuite par 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 min après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois.

6. On ajoute alors successivement:

a) 5,4 g de N-t-butyloxycarbonyl-a-D-glutamate de benzyle en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 min,

b) 3,3 g de dicyclohexylcarbodiimide en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 20 h et essore.

7. On lave la résine successivement par:

a) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène,

b) 3 fois 100 cm3 d'acide acétique,

c) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène,

On obtient ainsi le N-a-fO'-benzyJ-N-t-butyloxycarbonyl-y-D-glutamyl)-N-s-benzyloxycarbonyl-L-lysyl polymère.

L'alanine est accrochée sur le dipeptide polymère en répétant les opérations 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7. L'opération N° 6 est modifiée comme suit:

On ajoute successivement:

a) 3,03 g de N-t-butyloxycarbonyl-L-alanine en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 min,

On obtient ainsi le N-a-[01-benzyl-N-(N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N-s-benzyloxycarbonyl-L-lysyl polymère.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647 789

16

L'acide palmitique est accroché sur le tripeptide polymère en répétant les opérations 1, 2, 3,4, 5, 6 et 7. L'opération N° 6 est modifiée comme suit:

On ajoute successivement:

a) 4,2 g d'acide palmitique en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 min,

On obtient ainsi le N-a-[01-benzyl-N-(N-palmitoyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N-s-benzyloxycarbonyl-L-lysyl polymère.

Ce polymère est mis en suspension dans 130 cm3 d'acide trifluoroacétique contenu dans un réacteur muni d'un agitateur et, à sa base, d'un filtre en verre fritté. Dans cette suspension, on fait passer un courant d'acide bromhydrique pendant 90 min. Ensuite, on essore la résine et on la lave 3 fois par 300 cm3 au total d'acide acétique en agitant pendant 3 min après chaque addition de l'acide acétique et en essorant à chaque fois. Les filtrats sont réunis et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. L'huile ainsi obtenue est reprise dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle. Un précipité se forme, que l'on sépare par filtration et lave 2 fois par 60 cm3 au total d'éther. Il est hygroscopique et est dissous dans 50 cm3 d'acide acétique contenant 7 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C et on charge sur une colonne de 2,6 cm de diamètre contenant 70 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).

On élue successivement par:

700 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (9/1 en volumes),

1700 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (8/2 en volumes),

600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (7/3 en volumes),

2400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (1/1 en volumes),

600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (2/8 en volumes), et 1100 cm3 d'acide acétique,

en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 53 à 70, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. On obtient ainsi 1,28 g de solide amorphe que l'on dissout dans 50 cm3 d'acide acétique contenant 2,4 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C et charge Sur une colonne de 1,5 cm de diamètre contenant 24 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par:

300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (7/3 en volumes),

150 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (6/4 en volumes),

300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (1/1 en volumes),

250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (4/6 en volumes),

350 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (3/7 en volumes),

350 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (2/8 en volumes),

200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle/acide acétique (1/9 en volumes), et 200 cm3 d'acide acétique,

en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 25 à 42, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le solide amorphe obtenu est repris dans 30 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'acétate d'éthyle et 20 cm3 d'éther. Après séchage sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 50° C, on obtient 0,52 g de N-a-[N-(N-palmitoyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-L-lysine.

Analyse:

Calculé: C 54,13 H 8,63 N8,42%

Trouvé: C 54,90 H 8,60 N8,70%

Cendres sulfuriques = 1,7%.

Ala 0,99 (théorie = 1)

Glu 1,00 (théorie = 1)

Lys 1,02 (théorie = 1)

La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent au moins un composé selon l'invention en association avec un ou plusieurs diluants ou excipients compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Ces compositions peuvent être utilisées soit comme adjuvants de vaccins, soit comme stimulants non spécifiques de l'immunité anti-infectieuse et antitumorale.

Utilisés comme adjuvants de vaccins, les produits selon l'invention sont administrés en même temps et par la même voie que l'antigène (viral, bactérien, parasitaire ou d'autre nature) contre lequel on souhaite augmenter chez le sujet immunisé (homme ou animal domestique) les réactions d'immunité cellulaire (hypersensibilité du type retardé) ou la production d'anticorps circulants ou locaux.

Les produits sont administrés à des doses relativement faibles (de l'ordre de 1 mg), mélangés avec l'antigène et par la même voie (intramusculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intranasale, buccale). Si nécessaire, le produit et l'antigène peuvent être émulsifiés dans un excipient huileux approprié ou incorporés dans des liposomes.

En tant qu'immunostimulants non spécifiques, ils sont administrés à des doses comprises entre 0,1 et 50 mg/kg par voie parentérale (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), intranasale, buccale, rectale ou éventuellement intratumorale.

Comme compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions le produit actif est mélangé à un ou à plusieurs diluants tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant, tel que le stéarate de magnésium.

Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops ou des élixirs contenant des diluants inertes, tels que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, êdulcorants ou aromatisants.

Les compositions pour l'administration parentérale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme véhicule dans ces derniers cas, on peut employer le poly-éthylèneglycol, le propylèneglycol, les huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent contenir également des adjuvants, en particulier des agents mouillants, êmulsifiants ou dispersants.

La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants, ou par chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions solides, rendues stériles par exemple par irradiation, qui peuvent être dissoutes dans de l'eau stérile ou dispersées dans tout autre milieu stérile injectable, éventuellement au moment de l'emploi.

Les compositions pour administration intranasale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions qui peuvent être éventuellement associées à un agent propulseur compatible.

Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires qui peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients, tels que le beurre de cacao ou la suppocire.

Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent des compositions selon l'invention:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

17

647 789

Exemple 1:

On prépare selon la technique habituelle une solution adminis-trable par voie intraveineuse ayant la composition suivante:

acide N2-(N-lauroyl-L-alanyl-y-D-glutamyl)-DD,LL-

diamino-2,6 pimélamique 0,5 g soluté injectable 5 cm3

Exemple 2:

On prépare selon la technique habituelle une solution adminis-trable par voie intraveineuse ayant la composition suivante: N-a-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-

L-lysinate de méthyle 0,5 g soluté injectable 5 cm3

R

Claims

647 789

2

revendications

1. Tripeptide, caractérisé en ce qu'il répond à la formule géné-

(I)

raie:

r-nh-ch-co-nh-ch-co-r,

I I

ch3 ch2ch2-co-nh-ch-r3

(çh2)3 r-nh-ch-r2

dans laquelle les symboles R, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras, étant entendu que l'un au moins des symboles R représente un reste d'acide gras, le symbole Ri représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phênyle ou nitrophényle, les symboles R2 et R3, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que les symboles R2 et R3 ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, et étant entendu que l'alanine est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme D, la lysine, lorsque l'un des symboles R2 ou R3 représente un atome d'hydrogène, est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélique ou ses dérivés, lorsque les symboles R2 et R3, identiques ou différents, représentent un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle, est sous forme D,D; L,L; DD,LL, c'est à dire racémique, ou D,L, c'est-à-dire méso, ainsi que ses sels.
2. Tripeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le reste d'acide gras est un radical alcanoyle contenant 1 à 45 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle, un radical alcénoyle contenant 3 à 30 atomes de carbone et pouvant contenir plus, d'une double liaison, ou un reste d'acide mycolique.
3. Procédé de préparation d'un produit selon l'une des revendications 1 ou 2, pour lequel R, représente un radical amino ou alcoyloxy dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dipeptide de formule générale:

dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine et R4 représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, sur un aminoacide de formule gé-5 nérale:

(III)

Rs-nh-CH-co-nh-ch-co-R4 I I

ch3 ch2ch2-cooh dans laquelle Rs représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine et R4 représente un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, sur un aminoacide de formule générale:

h2n-ch-r3 I

(çh2)3

r5-nh-ch-r2

(iv)

dans laquelle R2 et R3 sont définis comme dans la revendication 1, et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles Rs des formules du dipeptide et de l'aminoacide définis ci-dessus repré-15 sente un reste d'acide gras, puis on remplace le radical Rs, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, et le radical R4 par un radical hydroxy, et on isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.
5. Procédé de préparation d'un produit selon l'une des revendi-20 cations 1 ou 2, pour lequel Ri représente un radical amino ou alcoyloxy dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé activé de la L-alanine de formule générale:

rs — nh—ch—cooh I

ch,

(v)

dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, sur un dipeptide de formule générale:

30

h2n-ch-co-r4

ch2ch2-co-nh-çh - r3 (çh2)3 r5-nh-ch-r2

(xi)

h2n-ch-r3 I

(çh2)3

(iv)

r5-nh-ch-r2

dans laquelle r2 et r3 sont définis comme dans la revendication 1, et r5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles rs des formules du dipeptide et de l'aminoacide définis ci-dessus représente un reste d'acide gras, puis on remplace le radical r5, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène et on isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.
4. Procédé de préparation d'un produit selon l'une des revendications 1 ou 2, pour lequel Rt représente un radical hydroxy; caractérisé en ce que l'on fait réagir un dipeptide de formule générale:

rs-nh-ch-co-nh-ch-co-r4

i i (iii)

ch3 ch2ch2-cooh

35 lx5"

dans laquelle R2 et R3 sont définis comme dans la revendication 1, R4 représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, et Rs représente un reste d'acide gras ou un groupement 40 protecteur de la fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles Rs des formules du dérivé de l'alanine et du dipeptide définis ci-dessus représente un reste d'acide gras, puis on remplace le radical Rs, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, et on isole le produit obtenu, 45 éventuellement sous forme de sel.
6. Procédé de préparation d'un produit selon l'une des revendications 1 ou 2, pour lequel Rj représente un radical hydroxy, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé activé de la L-alanine de . formule générale:

50

Rs—nh—ch-cooh i (v)

ch3

dans laquelle Rs représente un reste d'acide gras ou un groupement 55 protecteur de fonction amine, sur un dipeptide de formule générale:

h2n-ch-c0-r4

ch2ch2 - co -nh - ch - r3

(xi)

60

(çh2)3

rs-nh-ch-r2

dans laquelle R2 et R3 sont définis comme dans la revendication 1, R4 représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un radical phényle ou nitro-65 phényle, et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles R5 des formules du dérivé de l'alanine et du dipeptide définis ci-dessus représente un reste d'acide gras, puis on remplace le

3

647 789

'radical R5, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, et le radical R4 par un radical hydroxy, et on isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.
7. Procédé de préparation d'un produit selon l'une des revendi- 5 cations 1 ou 2, pour lequel R, représente un radical amino ou alcoyloxy dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, caractérisé en ce que l'on fait réagir un acide de formule générale:

R'-CO-OH

(vii)

dans laquelle R'—CO— représente un reste d'acide gras, ou un dérivé activé de cet acide, sur un tripeptide de formule générale:

R6-NH-CH-C0-NH-CH-C0-R4

ch,

(çh2)3

5 (xiii)

r6-nh-ch-r2

dans laquelle r2 et r3 sont définis comme dans la revendication 1, 20 r4 représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, et les symboles r6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, l'un au moins des symboles r6 représen- 25 tant un atome d'hydrogène, puis on remplace le radical r6, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, et on isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.
8. Procédé de préparation d'un produit selon l'une des revendi- 30 cations 1 ou 2, pour lequel r, représente un radical hydroxy, caractérisé en ce que l'on fait réagir un acide de formule générale:

r'-co-oh (vii)

dans laquelle r' — co — représente un reste d'acide gras, ou un 35 dérivé activé de cet acide, sur un tripeptide de formule générale:

rfi—nh—ch—co—nh—ch—co —r4

CH,

CH2CH2-CO-NH-CH-R,

(xiii).

R«

(ÇH2)3 -NH-CH-R,

ainsi que leurs sels, leur préparation et les médicaments qui les contiennent.

Les parois bactériennes, par exemple les parois de mycobactéries, sont constituées essentiellement d'un peptidoglycane formé d'acide N-acétylmuramique sur lequel sont fixés des peptides renfermant l'enchaînement L-Ala-D-Glu-DAP. Par ailleurs, les parois bactériennes sont très riches en lipides dont certains sont libres et extracti-bles et d'autres sont liés à la structure de la paroi et sont constitués par des acides mycoliques (acides gras géants, a-ramifiés et ß-hydroxylés). L'ensemble des constituants de la paroi cellulaire forme une structure covalente composée d'un peptidoglycane et d'un my-colate d'arabinogalactane liés entre eux par des liaisons phospho-diesters. Ces parois bactériennes présentent la plupart des propriétés biologiques des cellules entières lorsqu'elles sont associées à une huile minérale ou végétale et administrées après mise en suspension dans du soluté physiologique.

Dans les brevets belges Nos 821385, 852348 et 852349 sont décrits des peptides, couplés avec l'acide N-acétylmuramique, qui contiennent l'enchaînement L-Ala-D-Glu ou L-Ser-D-Glu et qui sont efficaces comme adjuvants immunologiques et comme agents anti-infectieux.

Dans le brevet français N° 75.24440, publié sous le numéro 2320107, sont décrits des produits de couplage entre un acide gras et un saccharide heptapeptide isolé à partir d'une mycobactérie contenant une cire D et qui peuvent être représentés par la formule suivante:

NAG-NAM NAG-NAM

Ala

I

Glu

I

DAP

I

Ala-

Ala I

Glu

I

-DAP

(R COOH)„ (II)

dans laquelle R2 et R3 sont définis comme dans la revendication 1, R4 représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de 4J

carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, et les symboles R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, l'un au moins des symboles R6 représentant un atome d'hydrogène, puis on remplace le radical R6, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, et le radical R4 par un radical hydroxy, et on isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.
9. Médicament, caractérisé en ce qu'il est constitué par un produit selon la revendication 1 à l'état pur ou en présence d'un ou j5 de plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutique-ment acceptables.

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