DE69024230T2 - An fette gebundene aminosäuren, peptide oder deren derivate - Google Patents
An fette gebundene aminosäuren, peptide oder deren derivateInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Verbindungen, in denen Peptide, Aminosäuren und Derivate von diesen an andere Moleküle gebunden sind, was die Verwendung derartiger Peptide, Aminosäuren und Derivate von diesen erleichtert.
- In den letzten Jahren wurden beträchtliche Fortschritte auf dem Gebiet der Entwicklung reaktiver Peptide und von Verbindungen auf Peptidbasis erzielt. Eine der Hauptschwierigkeiten, denen man sich bei der Verwendung solcher Verbindungen gegenübersieht, ist das Fehlen eines wirkungsvollen Zufuhrsystems. Es wurde gezeigt, daß Antikörper, die gegen kleine Peptide gewonnen wurden, aktiv gegenüber großen Proteinen sind (z.B. das Maul- und Klauenseuche- Virus), jedoch sind derartige kleine Peptide in Abwesenheit eines geeigneten Adjuvans nur selten antigen.
- Die EP-A-0 325 160 beschreibt bestimmte Derivate Renin-inhibierender Peptide mit einer an das N-terminale Ende gebundenen Polyhydroxy-substituierten Alkylgruppe und diskutiert die Wirkung von Glyceriden auf die Resorptionseigenschaften von Inhibitoren des Angiotensin-umwandelnden Enzyms.
- Die EP-A-0 329 295 beschreibt Renin-inhibierende Peptide mit einem Insert aus einem nicht spaltbaren Übergangszustand, der der 10,11-Position des Reninsubstrates entspricht, und mit einer Polyhydroxy-substituierten Alkylgruppe, die über ein Kohlenstoff- oder ein Stickstoffatom direkt an das N-terminale Ende gebundenen ist.
- Der Urheber der vorliegenden Erfindung hat ein neuartiges Verfahren entdeckt, durch das Peptide und/oder eine Aminosäure bzw. Aminosäuren und Peptidderivate an andere Moleküle gebunden werden können, was die therapeutische Verwendung derartiger Peptide, Aminosäuren und Derivate von diesen erleichtert. Außerdem hat die vorliegende Erfindung neuartige Verbindungen mit diesen Charakteristika erzeugt.
- Dementsprechend betrifft ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Verbindung mit der folgenden Formel:
- Dabei steht Y für eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Derivat von diesen, und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; sind entweder gleich oder verschieden und entweder Wasserstoffe oder Acylgruppen, die von Fettsäuren abgeleitet sind, wobei zumindest eine der Gruppen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; eine von einer Fettsäure abgeleitete Acylgruppe ist.
- Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Verbindung der folgenden Formel:
- Y-NH-CH&sub2;-CH&sub2;O-R&sub4;
- Dabei steht Y für eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Derivat von diesen, und R&sub4; steht für eine von einer Fettsäure abgeleitete Acylgruppe.
- Wie von Fachleuten auf diesem Gebiet erkannt werden wird, besteht die Verbindung des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung aus einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Derivat von diesen, die bzw. das an ein Tromethamin-Derivat gebunden ist, an das wenigstens eine Fettsäure gebunden ist. Ähnlich ist klar, daß die Verbindung des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung aus einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Derivat von diesen besteht, die bzw. das an ein Ethanolamin-Derivat gebunden ist, an das eine Fettsäure gebunden ist.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung sind sowohl R&sub1;, R&sub2; als auch R&sub3; Fettsäuren, und insbesondere sind sie die gleichen Fettsäuren. Es wird derzeit bevorzugt, daß die Fettsäure eine Kohlenstoffkette von 3 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist, besser 10 bis 18 Kohlenstoffatome, am besten 16 Kohlenstoffatome. Auf die gleiche Weise wird bevorzugt, daß R&sub4; eine Fettsäure mit einer Kohlenstoffkette von 3 bis 18 Kohlenstoffatomen, besser 10 bis 18 Kohlenstoffatomen, am besten 16 Kohlenstoffatomen ist.
- Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des ersten und des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung besteht Y aus Cystein. Es wird angenommen, daß ein Cystein in dieser Position zur Erzeugung eines allgemeinen Reagenz bzw. allgemeiner Reagenzien verwendet wird, das bzw. die unter Verwendung von vernetzenden Standard-Reagenzien an freie Cysteine in Proteinen, Peptiden oder Derivaten von diesen gekoppelt werden könnte bzw. könnten.
- Die neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ermöglichen eine alternative Präsentation einer Aminosäure, eines Peptides oder von Derivaten von diesen aufgrund der Position der Befestigung der Fettsäuren. Einige potentielle Anwendungen der neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind:
- 1. Immunverstärkende Wirkungen von Fettsäure-Peptid-Konjugaten. Ein großer Forschungsaufwand wurde in die Potenzierung der Immunantwort durch Verwendung von Fettsäure-Peptid-Komplexen investiert. Es ist bekannt, daß die Anwesenheit von Fettsäuren zu einer verstärkten Immunantwort auf Peptide führt (Baschang 1989, Tetrahedron 45: 6331-6360; Floc'h et al. 1984, Drugs Future 9: 763-776; Jung et al. 1985, Angewandte Chemie Int. Ed. Eng. 24 (10): 872-873.
- 2. Zuführung von Peptiden durch langsame Freisetzung. Liposomem wurden als Vektoren für die Zuführung und die langsame Freisetzung verwendet (Moroder und Muriol 1989, in "Peptides Chemistry, Structure and Function", Hrsg. J.E. Rivier & G.R. Marshall, 811-812). Das Befestigen von Fettsäuren an Peptiden unterstütz ihre Inkorporation in Liposomen und ist ein Methode zur Inkorporation von Peptiden in "ölige Depots" (US 4 829 142; Gregoriades 1989, in "Targeting of Drugs: Implications in Medicine", Hrsg. F.H.D. Roerdinl & A.M. Kroon, 1-29).
- 3. Veränderung des Wirkungsmechanismus (De Vrije et al. 1990, J. Mol. Microbiol. 4:143- 150). Fettsäuren, die an Peptidhormonen etc. befestigt sind, können deren biologische Aktivität verändern, indem sie z.B. deren biologische Halbwertszeit verlängern.
- 4. Fette werden intakt aus dem Verdauungssystem resorbiert. Es ist möglich, daß ein Peptid/Fettsäure-Komplex oral appliziert werden könnte, um biologisch aktive Peptide und/oder antigene Peptide zuzuführen.
- 5. Tromethamin (TRIS) hat allgemein eine Vielzahl industrieller Anwendungen, zu denen sein Einsatz als ein emulgierendes Agens für kosmetische Cremes und Lotionen gehört. Es wird therapeutisch als Alkalisierer (Merck-Index, Band 11, Eintrag 1536) verwendet. Es ist möglich, daß einige dieser Anwendungen durch die Anfügung von Aminosäuren oder Peptiden, fakultativ mit Fettsäuren, verbessert werden können (Molinero et al. 1988, JAOCS 65: 975-978.
- Die Urheber der vorliegenden Erfindung stellen sich vor, daß es durch das Anhängen von Peptiden oder Peptidderivaten über ihre C-terminalen Enden entweder an TRIS-Tripalmitat (oder andere Mono-, Di- oder Trikonstrukte mit verschiedenen Fettsäuren) oder an Aminosäure-TRIS- Fettsäure-Konstrukte möglich sein wird, die Wechselwirkung der Peptid-Fette mit einer Vielzahl von Lipidstrukturen (sowohl natürlicher als auch künstlicher Art), z.B. Liposomen unterschiedlichen Typs, Zellwänden, Membranen etc. zu erleichtern. (Ethanolamin und ähnliche Verbindungen können anstelle von TRIS verwendet werden). Auf diese Weise können alternative Methoden für die Zuführung und in-vivo-Präsentation von Peptiden und für die Modifizierung ihrer Wirkungsweise und ihrer Antigenität erhalten werden. Zum Beispiel ist die Anwendung synthetischer Antigene in verschiedenen veterinär- oder humanpharmakologischen Bereichen mit dem sehr wichtigen Problem verbunden, einen geeigneten und kostengünstigen Trägerstoff, der keine Nebenwirkungen hat, zu finden. Trägerstoffe, die in Tierversuchen verwendet werden, wie z.B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), Rinderserumalbumin, Ovalbumin und das Tetanustoxoid sind allgemein aufgrund von Nebenwirkungen, wie z.B. einer Immunogenitat, für die Anwendung beim Menschen ungeeignet. Außerdem sind einige von ihnen (z.B. das KLH) aufgrund ihres hohen Preises problematisch.
- Potentiell akzeptablere synthetische Ersatzstoffe wurden von mehreren Laboratorien untersucht.
- Die chemische Totalsynthese des N-terminalen Lipopeptides der äußeren Membran von E. coli wurde von G. Jung und Mitarbeitern beschrieben (Bessler et al. 1984, Biochem. Biophys. Res. Commun. 121: 55-61, und Jung 1988 "Low Molecular Weight Lipopeptide Carrier-Adjuvant Systems for Immunisations: Developments and Results" in "Peptide Chemistry", Hrsg. T. Shiba und S. Sakakibara, 751-758), und es wurden intensive Untersuchungen der verschiedenen Peptidkonjugate beschrieben. Diese Verbindungen bestehen aus drei Fettsäuremolekülen, die an S-(Dihydroxypropyl)cystein gebunden sind, das an ein Tetrapeptid der Sequenz Ser-Ser-Asn-Ala gekoppelt ist. Dieser Konstrukttyp und Analoga davon weisen mitogene Aktivität auf und können verwendet werden, um verschiedene biologische Agenzien in Lipidmembranen zu verankern.
- Ein vollständig synthetischer Impfstoff niedrigen Molekulargewichtes gegen das Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV) wurde auf diese Weise entwickelt (Weismuller et al. 1989, Vaccine 1: 29-33). Ein Sequenzepitop des FMDV-Oberflächenglycoproteins (135-154), das an die Tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteinyl-Serin-Serin-Gruppe gekoppelt war, induzierte nach einer einzigen Applikation ohne jegliches Adjuvans oder einen Trägerstoff einen langanhaltenden hohen Schutz vor der Maul- und Klauenseuche-Erkrankung. Auf ähnliche Weise wurde ein Impfstoff gegen das Grippevirus hergestellt (Deres et al. 1989, Nature 342: 561-564).
- Zu anderen bekannten biologischen Wirkungen dieses Konstrukttyps gehören die Induktion cytotoxischer T-Lymphozyten (Deres et al., wie oben), die Freisetzung von Cytokinen wie Interferon und dem Tumornekrosefaktor alpha aus Makrophagen (Hauschildt et al. 1990, Eur. J. Immunol. 20: 63-68) und die Aktivierung von Neutrophilen (Seifert et al. 1990, Biochem. J. 267: 795-802).
- Ein zweites neuartiges Oligopeptid-Zufuhrsystem für schlecht absorbierte Peptide und Medikamente wurde von Toth et al. 1989 beschrieben ("A Novel Oligopeptide Delivery System for Poorly Absorbed Peptides and Drugs", in "Peptides, Chemistry, Structure and Function", 1078- 1079). Dieses System basiert auf der Entwicklung synthetischer, nicht naturlich vorkommender Aminosäuren mit langen Alkylseitenketten, sogenannten "fatty amino acids".
- Für das kovalente Befestigen dieser Verbindungen an verschiedenen Medikamenten wurde berichtet, daß es sowohl die orale Aufnahme erhöht als auch die Begrenzung des Übertrittes von z.B. GABA über die Blut-Hirn-Schranke überwunden habe.
- TRIS und Ethanolamin scheinen ideale bifunktionelle Moleküle zur Verbindung von Peptiden (über ihre Carboxylgruppe mit der NH&sub2;-Gruppe von TRIS oder Ethanolamin) und Fettsäuren (über eine Esterbindung mit der Hydroxylgruppe bzw. den Hydroxylgruppen von TRIS oder Ethanolamin) zu sein. Um die Machbarkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, wurden verschiedene Aminosäuren und Peptide mit TRIS umgesetzt, und die Produkte wurden charakterisiert. Vier davon, Z-Ala-TRIS, Z-Gly-Tris, Z-Leu-TRIS und BOC-Ala-Ile-Phe-TRIS, wurden erfolgreich palmitoyliert und gereinigt. Außerdem wurden auch Konstrukte von Z-Ala- TRIS mit kürzerkettigen Fettsäuren hergestellt. Nach Entfernung der N-Schutzgruppe würde das freie Amino-Ende für eine Umsetzung mit anderen Aminosäuren oder Peptiden entweder durch enzymatische Verfahren oder durch herkömmliche Verfahren der Peptidchemie zur Verfügung stehen.
- Zum Ermöglichung eines besseren Verständnisses des Wesens der vorliegenden Erfindung werden jetzt bevorzugte Ausführungsformen beschrieben unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren:
- Fig. 1 zeigt ein Zeitprofil von Z-Ala-OMe plus TRIS bei Inkubation bei 60ºC, pH 8, in 60% DMF; ( ) Prozent Ausbeute; ( ) Prozent Substrat verbraucht nach 7 Tagen;
- Fig. 2 zeigt die Substratabhängigkeit; Inkubation bei 60ºC für 18 Stunden; % Ausbeute ( ) und Substratverbauch ( ) hängen vom Typ des Esters und der Art der Schutzgruppe des aminoterminalen Endes ab;
- Fig. 3 zeigt das Temperaturprofil: Bz-Ala-OMe plus TRIS; 60% DMF, pH 8,0, 18 Stunden ( ) Prozent Substrat verbraucht; ( ) Prozent Ausbeute;
- Fig. 4 zeigt das pH-Profil für Z-Ala-TRIS; 60% DMF, 2 Tage Inkubation bei 60ºC; ( ) Ausbeute; ( ) Prozent Substrat verbraucht;
- Fig. 5 zeigt das DMF-Profil für Z-Ala-TRIS; pH 9, 2 Tage Inkubation bei 60ºC; ( ) Ausbeute; ( ) Prozent Substrat verbraucht;
- Fig. 6 zeigt die Aufnahme von ³H-Thymidin in RD10-Zellen; ( ) ATP3; ( ) ZATP3; und
- Fig. 7 zeigt die Aufnahme von ³H-Thymidin in U937-Zellen; ( ) ATP3; ( ) ZATP3.
- DC Dünnschichtchromatographie
- HPLC Hochleistungs-Flüssigchromatographie
- NMR Kernresonanz
- GLC Gas-Flüssig-Chromatographie
- DCM Dichlormethan
- DCC Dicyclohexylcarbodiimid
- DCU Dicyclohexylharnstoff
- DMAP Dimethylaminopyridin
- DMF Dimethylformamid
- Z Benzyloxycarbonyl
- Bz Benzoyl
- BOC Tertiäres Butyloxycarbonyl
- TRIS Tromethamin
- OMe, OEt, OBzl Methyl-, Ethyl- und Benzylester
- Ala, Leu, Gly, Ile, Phe, Tyr, Arg, Trp, Lys & Val die Aminosäuren Alanin, Leucin, Glycin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Arginin,Tryptophan, Lysin und Valin
- Alle Lösungsmittel waren von analytischer Reinheit, und diejenigen, die für die HPLC verwendet wurden, waren speziell für die Flüssigchromatographie gereinigt.
- a) vorbeschichtete DC-Platten, Kieselgel 60 (ohne Fluoreszenzindikator, Merck 5721) 20x20 cm, 0,25 mm dick
- b) DC-Aluminiumfolien, Kieselgel-beschichtet (mit Fluoreszenzindikator), "DC- Alufolien Kieselgel 60", 20x20 cm, 0,2 mm dick, Merck 5554.
- c) DC-Aluminiumfolien, vorbeschichtet mit Cellulose (20x20 cm, 0,1 mm dick, Merck 5552).
- a) Ninhydrin 0,1% (Merck 6758)
- b) 2,4-Dichlorfluorescein, 0,2% in Ethanol
- c) Iodatmosphäre
- a. Chloroform/Methanoi/Wasser 13:5:0,8*
- b. Chloroform/Methanol/Ammoniak 17% 70:35:10*
- c. Chloroform, wassergesättigt*
- d. Ether, wassergesättigt*
- e. Petrolether/Ether/Essigsäure 70:30:1*
- f. Butanol/Essigsäure/Wasser/Essigsäure 5:2:3*
- g. Petrolether/Ether/Essigsäure 50:50:1*
- h. Ethylacetat, wassergesättigt*
- i. Ethylacetat/Chloroform/Ammoniak 17% 98:6:1*
- j. Chloroform/Methanol 9:1*#
- k. Chloroform/Methanol 8:2*#
- l. Ether/Benzol/Ethanol/Essigsäure 40:50:2:0,2*
- *DC; #Säulenchromatographie;
- Rf-Werte wurden bei 20ºC bestimmt.
- Es wurden drei Methoden zur Trennung palmitoylierter (oder mit anderen Fettsäuren acylierter) TRIS-Konstrukte angewendet:
- SEPHADEX-LH-20 (PHARMACIA Feinchemikalien) wurde in Glassäulen von 1 x 25 cm gepackt und die Proben wurden mit Mischungen aus Chloroform/Methanol mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Es wurden Fraktion von 5 ml aufgefangen und ihr Inhalt durch DC analysiert. Die Trennung erfolgt nach der Größe.
- Die Proben wurden auf eine Kieselgelsäule (BDH 60-120, Größe 2,6 x 30 cm) aufgetragen und mit Mischungen aus Chioroform/Methanol (9:1 oder 8:2, je nach Bedarf) mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min eluiert. Das Eluat wurde kontinuierlich bei 260 nm analysiert (ETP KORTEC, K95-UV-Monitor), es wurden Fraktion von 5 ml gesammelt und durch DC analysiert. Die Trennung erfolgt nach Ladung und Hydrophobie.
- iii) FLORISIL-SÄULE zur Trennung neutraler Lipide (zur Verfügung gestellt von Dr. Fogarthy, CSIRO, Div. of Food Preservation). Die Chromatographie erfolgte in Glassäulen mit 12 g sauer gewaschenem FLORISIL, die Elution erfolgte mit Mischungen aus Hexan/Ethylether nach K.K. Carroll und B. Serdarevich (1967) in "Lipid Chromatography Analysis", Seite 205-237, Dekker, New York. Das Eluat wurde mittels DC untersucht.
- i) Elementaranalysen (CHN-Verhältnis) wurden durch die Analytical Unit des Chemistry Department, Research School of Chemistry, Australian National University, Postfach 4, Canberra, durchgeführt.
- ii) ¹³C- und Protonen-NMR-Spektren wurden von der CSIRO-Division of Biomolecular Engineering, Parkville, Victoria 3052, durchgeführt. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verhielten sich wie erwartet indem sie einen langsamen Protonenaustausch zeigten, was einen guten Hinweis auf Peptidbindungen darstellt.
- iii) GLC-Analysen des Fettgehaltes wurden von Analchem Consultants Pty. Ltd. durchgeführt.
- iv) HPLC. Die analytische HPLC der N-geschützten Aminosäure-TRIS-Verbindungen wurde unter Verwendung einer HPLC-Anlage der Serie 6000A von Millipore-Waters in Verbindung mit einem Lambda-Max-Spektralphotometer Modell 480, einem automatischen Gradientensteuerungsgerät und einem Datenmodul Modell 746 durchgeführt. Die analytische HPLC wurde auf einer Novapak-C&sub1;&sub8;-Reverse-Phase Radical-Pack-Säule von 100 x 8 mm durchgeführt, eluiert wurde mit einem Triethylaminphosphat, pH 3/Acetonitril-Gradienten mit einer Fließgeschwindigkeit von 2-3 ml/min. Die eluierten Substanzen wurden spektralphotometrisch bei 254 nm detektiert. Das verwendete Programm war 20-100(6)5'(2), wobei 20-100 die % Acetonitril zu Beginn und am Ende sind, (6) für das Gradientenprogramm steht (6 ist linear), 5' die Zeit in Minuten ist und (2) die Fließgeschwindigkeit in ml/min.
- Die Trennungen wurden auf einer Millipore-Waters Prep500-HPLC-Anlage durchgeführt. Als Säule diente eine PrepPAK 500-C&sub1;&sub8; (125A und 55-105 um Teilchengröße), und die Elution erfolgte mit verschiedenen Konzentrationen wäßrigen Ethanols und 100 ml/min. Einige Trennungen erforderten den Zusatz von 1 ml Essigsäure/L.
- Z-Gly-TRIS und Z-Ala-TRIS wurden mit Papain und Z-Leu-Arg-TRIS wurde mit Trypsin inkubiert um zu testen, ob die Wirkung proteolytischer Enzyme die Ausgangsverbindungen Z-Gly- OH, Z-Ala-OH bzw. Z-Leu-Arg-OH regenerieren kann.
- 50 ul einer Papain-Suspension (25 mg/ml, Sigma) wurden mit einer 20 mM wäßrigen EDTA-Lösung (50 ul), einer 1 M Mercaptoethanollösung (25 ul), 50 mM Triethylamin (25 ul) und Wasser (100 ul) 30 min bei 37ºC inkubiert.
- a) Papain. Z-Ala-TRIS in 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,5 (650 ul) plus 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure (100 ul) wurden mit Wasser auf 1 ml aufgefüllt. Aktiviertes Papain (5 mg/ml) wurde so zugegeben, daß ein Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:50 erreicht wurde. Die Reaktion wurde durch HPLC auf C&sub1;&sub8;-Reverse-Phase-Säulen verfolgt und das Hydrolyseprodukt durch Cochromatographie mit Standards identifiziert. Leerwerte, bei denen Wasser anstelle der Enzymlösung verwendet wurde, wurden wie oben beschrieben inkubiert.
- b) Trypsin. Z-Leu-Arg-TRIS wurde in einer Konzentration zwischen 2 und 10 mg/ml in 0,2 M Ammoniumhydrogencarbonat inkubiert. Frisch hergestelltes TPCK-Trypsin (1 mg/ml Wasser) wurde der Lösung bis zu einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:50 zugesetzt. Die Proben wurden bei 37ºC inkubiert und Aliquots durch Reverse-Phase-HPLC untersucht. Bei Bedarf wurde weiteres Enzym zugegeben.
- Es wurde die HPLC eingesetzt, um das Fortschreiten der enzymatischen Hydrolyse zu verfolgen. Sowohl Z-Ala-TRIS als auch Z- Gly-TRIS wurden durch Papain hydrolysiert, wenn auch sehr langsam. Die Hauptprodukte waren mit Z-Ala-OH und Z-Gly-OH identisch, wie durch Cochromatography (d.h. Spiken) gezeigt wurde. Das bedeutet eine Kontrolle, daß der Typ der Bindung zwischen der geschützten Aminosäure und TRIS in den Produkten, die durch die Methoden A und B (siehe unten) hergestellt wurden, der gleiche ist, und daß es sich höchstwahrscheinlich um eine Amidbindung handelt. Außerdem haben wir aus der NMR-Analyse von Z-Ala-TRIS (Inkubationsverfahren) einen Hinweis darauf, daß die Bindung eine Amidbindung ist. Auch ergaben Elemantar- und GLC-Analysen von Fettsäurederivaten drei Fettmoleküle pro TRIS-Molekül, was das Vorhandensein von drei OH-Gruppen in dem für die Veresterung verwendeten Aminosäure-TRIS-Derivat anzeigt.
- ii) Z-Leu-Arg-TRIS wurde langsam durch Trypsin hydrolysiert. Für das Hydrolyseprodukt wurde mittels HPLC durch Cochromatographie gezeigt, daß es mit einer authentischen Probe von Z-Leu-Arg-OH identisch war.
- Die Aminosäure-TRIS-Verbindungen wurden durch Inkubation der N-geschützten Aminosäureester und Peptidester mit TRIS in 60%igem wäßrigem DMF bei erhöhter Temperatur (siehe Inkubationsmethode) hergestellt. Ein typisches Reaktion-Zeit-Profil ist in der Figur 1 dargestellt, die Wirkung von Z gegenüber Bz plus Estertypen sind in der Figur 2 gezeigt, ein Temperaturprofil in der Figur 3, ein pH-Profil in der Figur 4 und das DMF-Profil in der Figur 5.
- Als zusätzlicher Beweis, daß es sich bei der Bindung der Aminosäure an TRIS tatsächlich um eine Amidbindung handelte, wurden Z-Ala-TRIS und Z-Gly-TRIS sowohl mittels des "Inkubationsverfahrens" als auch mittels normaler Methoden der organischen Chemie für einen Vergleich durch DC hergestellt. Außerdem wurden tri-palmitoylierte Formen dieser beiden Verbindungen hergestellt und durch DC verglichen. In einer kürzlich erschienenen Arbeit von Otvos et al. über die Festphasensynthese bestimmter Glycopeptide (Peptide Research, 1989, 2 362) wurde die Beobachtung gemacht, daß beim Koppeln von Aminosäuren an Kohlenhydrate nicht geschützte Hydroxylgruppen meistens unbeeinflußt bleiben, wenn die Methode des symmetrischen Anhydrids verwendet wird. Es wurden symmetrische Anhydride von Z-Ala-OH und Z-Gly-OH hergestellt und mit einem großen Überschuß TRIS umgesetzt. Die Hauptprodukte konnten durch HPLC, DC und über das CHN-Verhältnis nicht von Z-Ala-TRIS und Z-Gly-TRIS, die durch das Inkubationsverfahren hergestellt worden waren, unterschieden werden. Dementsprechend sind wir überzeugt, daß es bei dieser Methode nur zu einer Wechselwirkung mit der NH&sub2;-Gruppe des TRIS und nicht mit irgendeiner der CH&sub2;OH-Gruppen kommt. Es sollte auch beachtet werden, daß beim Inkubationsverfahren nur eine synthetische Verbindung auftritt.
- Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde aus Z-Ala-OH nach der Methode des symmetrischen Anhydrids hergestellt (H. Schussler und H. Zahn, Chem. Ber. 95, 1076 (1962) und M. Bodansky und A. Bodansky A. (1984) "The Practice of Peptide Synthesis", Seite 102, Springer Verlag).
- Z-Ala-OH (8 g) in DCM (50 ml) und einige Tropfen DMF wurden zur Bildung des symmetrischen Anhydrids mit DCC (4,2 g) umgesetzt. Das so gebildete DCU wurde abfiltriert, und das Lösemittel wurde im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wurde in DMF (50 ml) gelöst und zu einer Lösung von TRIS in DMF (10 g/80 ml) gegeben und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
- Die Reinigung der in der Überschrift angegebenen Verbindung erfolgte durch präparative HPLC, die zu einem analytisch reinen weißen Produkt führte; Ausbeute 2,90 g (49% der Theorie); Rf 0,49 (Laufmittel h) und 0,78 (Laufmittel b), und Rt 5,19 min bei der HPLC. Berechnete Zusammensetzung für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub6;: C 55,20, H 6,80, N 8,58; gefunden C 55,28, H 6,87, N 8,13. Die Verbinbdung wies Charakteristika auf, die mit denen der durch das "Inkubationsverfahren" - Methode B hergestellten Verbindung identisch waren (siehe Beispiel 3).
- Z-Gly-TRIS wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, d.h. aus Z-Gly-OH (7 g), und durch präparative HPLC gereinigt. Die Ausbeute betrug 1,50 g (29% der Theorie). Das resultierende Z-Gly-TRIS war chromatographisch mit der entsprechenden Verbindung identisch, die durch die Methode B hergestellt wurde (siehe Beispiel 4). Rf 0,36 (Laufmittel h) und 0,66 (Laufmittel b) und Rt 4,97 min bei der HPLC. Berechnete Zusammensetzung für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub0;N&sub2;O&sub6;: C 53,84, H 6,45, N 8,97; gefunden C 54,53, H 6,84, N 8,85.
- 5,04 g Z-Ala-OMe (50 mMol) wurden zu 20,37 g TRIS (400 mMol) in DMF (252 ml) und Wasser (168 ml) gegeben und bei 55ºC und pH 9,0 inkubiert. Die Reaktion wurde mittels HPLC verfolgt, was ergab, daß die Umwandlung in die in der Überschrift angegebene Verbindung nach vier Tagen abgeschlossen war, bei einer Ausbeute von 65%, wie durch HPLC bestimmt wurde.
- Die Reinigung durch präparative HPLC ergab analytisch reines Z-Ala-TRIS in Form eines weißen Pulvers. Rf 0,49 (Laufmittel h) und 0,79 (Laufmittel b); die HPLC-Rt betrug 4,97 min. Berechnete Zusammensetzung für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub6;: C 55,20, H 6,80, N 8,58; gefunden C 56,02, H 7,03, N 8,00. Die Struktur wurde durch eine NMR-Analyse bestätigt.
- 10,02 g Z-Gly-OBzl wurden zu 32,4 g TRIS in DMF (401 ml) und Wasser (267 ml) gegeben und bei 60ºC und pH 9,0 zwei Tage inkubiert. Die Reinigung durch präparative HPLC ergab analytisch reines Z-Gly-TRIS in Form eines weißen Pulvers; Ausbeute 3,98 g (38,3% der Theorie); Rf 0,36 (Laufmittel h) und 0,66 (Laufmittel b); die HPLC-Rt betrug 4,97 min. Berechnete Zusammensetzung für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub0;N&sub2;O&sub6;: C 53,84, H 6,48, N 8,97; gefunden C 54,15, H 6,56, N 8,68. Die Struktur wurde durch eine NMR-Analyse bestätigt.
- Z-Leu-OMe (5 g) und TRIS (16,2 g) in DMF (200 ml) und Wasser (134 ml) wurden bei pH 8,0 und 55ºC auf die oben beschriebene Weise inkubiert (Beispiel 3).
- Die Reiningung durch präparative HPLC ergab 3,60 g (54% der Theorie) des analytisch reinen, in der Überschrift angegebenen Produkts; Rf 0,62 (Laufmittel h) und 0,25 (Laufmittel i); HPLC-Rt 6,37 min.
- Z-Leu-Arg-OMe (5,17 g) und TRIS (10,67 g) in einer Lösung aus DMF (132 ml) und Wasser (88 ml) wurden bei 55ºC sieben Tage auf die oben beschriebene Weise inkubiert. Die Ausbeute der Reaktion, bestimmt durch HPLC, betrug 55%. Reines Produkt wurde durch HPLC isoliert. DC-Rf 0,70 (Laufmittel f) und 0,02 (Laufmittel b); Rt 5,37 min.
- 8,6 g BOC-Ala-Ile-Phe-OMe wurden zu 20 g TRIS in DMF (240 ml) und Wasser (160 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei 55ºC vier Tage inkubiert (Ausbeute 66%, HPLC), und die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch präparative HPLC gereinigt, wodurch das analytisch reine Produkt erhalten wurde (Ausbeute 1,49; 14% der Theorie); Rf 0,50 (Laufmittel h) und 0,85 (Laufmittel b); HPLC-Rt 6,55 min. Berechnete Zusammensetzung für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub5;N&sub4;O&sub8;: C 57,65, H 8,37, N 10,34; gefunden C 58,01, H 8,12, N 9,57.
- Z-Ala-OEt (5,73 g) wurde in DMF (273 ml) und Wasser (91 ml) bei 50ºC mit 91 ml Ethanolamin bei pH 11 inkubiert.
- Die Reaktion wurde durch HPLC verfolgt und nach 20 Stunden war die Bildung der in der Überschrift angegebenen Verbindung abgeschlossen, wobei die Ausbeute, bestimmt durch HPLC, 82% betrug. Präparative HPLC führte zu einem chromatographisch reinen Produkt (2,26 g; 38% der Theorie); Rf 0,50 (Laufmittel h) und 0,82 (Laufmittel b); HPLC-Rt 5,10 min.
- Für Vergieichszwecke wurden Reaktionen unter Verwendung von Z-Leu-OMe, Z-Ala-OMe, Bz-Tyr-OEt, Z-Ala-OBzl, Z-Arg-OMe, Z-Val-OMe und Bz-Arg-OMe durchgeführt. Die Ausbeuten der Reaktion dieser Verbindungen mit TRIS und die Geschwindigkeiten, mit denen die Reaktionen abliefen, sind in den Tabellen 1 bzw. 2 dargestellt. TABELLE 1 Subtrat Ausbeute tägige Inkubation TABELLE 2 Substrat Geschwindigkeit (verbraucht) tägige Inkubation
- 5,28 g Z-Leu-Arg-Trp-OMe wurden zu 7,6 g TRIS in 160 ml Lösemittel, das aus 60% DMF und 40% H&sub2;O bestand, gegeben. Man ließ die Reaktion vier Tage bei 60ºC und pH 10 ablaufen. Z-Leu-Arg-Trp-TRIS wurde durch präparative HPLC isoliert. Die Ausbeute (HPLC) betrug 43%; Rf 0,72 (Laufmittel f).
- 5,025 g Bz-Tyr-Arg-Lys-OEt wurden zu 7,275 g TRIS in 150 ml Lösemittel, das aus 60% DMF und 40% H&sub2;O bestand, gegeben. Man ließ die Reaktion vier Tage bei 60ºC ablaufen, sie ergab eine Ausbeute (HPLC) von 50%.
- Bz-Tyr-Arg-Lys-TRIS wurde durch präparative HPLC isoliert.
- Eine Lösung von Palmitinsäure (8,10 g) in Chloroform (100 ml) wurde zu einer gerührten Lösung von Z-Ala-TRIS (2,75 g) in Chloroform (60 ml) und DMF (15 ml) gegeben, und die Mischung wurde in Eis gekühlt. Nach tropfenweiser Zugabe von 6,50 g DCC in Chloroform (30 ml) gefolgt von 0,4 g DMAP in Chloroform (10 ml) wurde zwei Stunden bei 0ºC und dann 18 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Die Veresterungsreaktion wurde mittels DC verfolgt (Laufmittelsysteme b, h, i und j). Das resultierende DCU wurde abfiltriert und die Chloroformlösung wiederholt gewaschen mit Wasser, 10% wäßriger Citronensäure, Wasser, 10% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel unter reduziertem Druck abgezogen. Das rohe Produkt wurde chromatographisch mittels dreier verschiedener Methoden gereinigt: LH-Sephadex, Kieselgel und Florisil. Alle Techniken ergaben analytisch reine Produkte, die auf der DC einen einzigen Fleck ergaben; Rf 0,72 (Laufmittel g) und Rf 0,29 (Laufmittel e). Die Ausbeuten betrugen 62,0%, 63,8% bzw. 68,5%. Berechnete Zusammensetzung für C&sub6;&sub3;H&sub1;&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub9;: C 72,65, H 10,84, N 2,69; gefunden C 72,58, H 11,22, N 2,31.
- Der durch GLC-Analyse ermittelte Gehalt an Fettsäure (Palmitinsäure) betrug 70,1%, was eine vollständige Veresterung aller drei Hydroxylgruppen des Z-Ala-TRIS (Theorie 68,7%) anzeigte. Die NMR-Ergebnisse standen in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur. Produkte, die mit Z-Ala-TRIS erzeugt wurden, das sowohl mit der chemischen als auch mit der Inkubationsmethode hergestellt worden war, konnten analytisch nicht unterschieden werden.
- 0,94 g Z-Gly-TRIS wurden mit 3,30 g Palmitinsäure, 2,5 g DCC und 0,12 g DMAP (wie im Beispiel 12) umgesetzt wodurch eine rohe Probe des in der Überschrift angegebenen Produktes erhalten wurde (2,05 g, 67% der Theorie). Die Reinigung auf LH-Sephadex und Kieselgel ergab ein analytisch reines Produkt in einer Ausbeute von 43% bzw. 45%; DC-Rf 0,18 (Laufmittel e) und 0,85 (Laufmittel l).
- Der durch GLC-Analyse ermittelte Gehalt an Fettsäure (Palmitinsäure) betrug 70%, was eine vollständige Veresterung aller drei Hydroxylgruppen des Z-Gly-TRIS (Theorie 69,6%) anzeigte. Die NMR-Ergebnisse standen in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur. Produkte, die mit Z-Gly-TRIS erzeugt wurden, das sowohl mit der chemischen als auch mit der Inkubationsmethode hergestellt worden war, konnten analytisch nicht unterschieden werden.
- 1,10 g Z-Leu-TRIS wurden mit 3,30 g Palmitinsäure, 2,5 DCC und 0,12 g DMAP (wie im Beispiel 12) umgesetzt, wodurch eine rohe Probe des in der Überschrift angegebenen Produktes erhalten wurde. Die Reinigung auf einer Kieselgelsäule ergab 1,78 g (54,9% der Theorie) eines analytisch reinen Produktes; DC-Rf 0,90 (Laufmittel g) und 0,87 (Laufmittel k). Berechnete Zusammensetzung für C&sub6;&sub7;H&sub1;&sub2;&sub1;N&sub2;O&sub9;: C 73,08, H 11,06, N 2,58; gefunden C 73,74, H 11,52, N 2,29; Fettsäuregehalt 66,0% (Theorie 66,1%).
- Z-Ala-TRIS (326 mg) wurde mit Myristinsäure (914 mg) in Chloroform auf ähnliche Weise wie in Beispiel 10 umgesetzt. Es wurden DCC (825 mg) und DMAP (40 mg) in kaltem DCM (10 ml) zugefügt dann wurde zwei Stunden bei 0ºC und anschließend 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die anfängliche Reinigung ergab 720 mg Rohprodukt. Das Ausfällen aus DCM/Acetonitril ergab 640 mg (66,9% der Theorie) des in der Überschrift angegebenen Produktes. Die DC zeigte einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,63 (Laufmittel g) und 0,29 (Laufmittel e).
- 326 mg Z-Ala-TRIS und 801 mg Laurinsäure wurden mit 825 mg DCC und 45 mg DMAP auf ähnliche Weise wie für Beispiel 12 beschrieben umgesetzt. Das Abdampfen des Lösemittels ergab 710 mg eines Rohproduktes der in der Überschrift angegebenen Verbindung. Dieses wurde auf einer Florisilsäule unter Verwendung der Hexan-Ethylether-Mischungen als Elutionsmittel weiter gereinigt. Es wurden 420 mg (49,9% der Theorie) des in der Überschrift angegebenen Produktes gewonnen; DC-Rf 0,59 (Laufmittel g) und 0,27 (Laufmittel e).
- 326 mg Z-Ala-TRIS und 464,7 mg Caprinsäure (n-Decansäure) wurden mit 825 mg DCC und 45 mg DMAP in DCM auf ähnliche Weise wie für Beispiel 13 beschrieben umgesetzt. Die Reinigung auf Florisil mit Hexan/Ether und Methanol ergab das chromatographisch reine in der Überschrift angegebene Produkt, Ausbeute 480 mg (61% der Theorie), Rf 0,54 (Laufmittel g) und 0,25 (Laufmittel e). Berechnete Zusammensetzung für C&sub4;&sub5;H&sub7;&sub6;N&sub2;O&sub9;: C 68,49, H 9,71, N 3,55; gefunden C 68,96, H 10,23, N 3,18. Der Fettgehalt, bestimmt durch GLC, betrug 63% (Theorie 58,9%).
- 700 mg Z-Ala-TRIS wurden mit 500 mg Palmitinsäure und 410 mg DCC und 20 mg DMAP auf ähnliche Weise wie für Beispiel 12 beschrieben umgesetzt, außer daß ein 1,3 molarer Überschuß der Reagenzien anstelle des üblichen 4molaren Überschusses eingesetzt wurde, um ein Konstrukt, das zum überwiegenden Teil eine angehängte Fettsäure aufwies, zu erzeugen; etwas di- und tri-palmitoyliertes Produkt wurde ebenfalls erwartet. Die Ausbeute der rohen, gemischten Produkte betrug 1,12 g (Theorie 1,20 g).
- Die Fraktionierung auf Florisil ergab drei Hauptprodukte im Verhältnis 0,27:1:1 mit Rf- Werten mit Laufmittel g von 0,73, 0,26 bzw. 0,0. Die Fraktionen 1 und 2 sind isomere Dipalmitat- Derivate, von denen durch GLC-Analyse gezeigt wurde, daß sie zwei Fettmoleküle pro Z-Ala- TRIS-Molekul enthalten (56% bzw. 59%; Theorie 59,6%), während die Fraktion 3 ein Monopalmitat-Derivat war (der Fettgehalt betrug 40%; Theorie 42,5%). Die Gewichtsausbeute an Fraktion 3 betrug 208 mg (24,5% der Theorie).
- BOC-Ala-Ile-Phe-TRIS-Tripalmitat wurde auf eine dem Beispiel 12 ähnliche Weise aus einer Lösung von BOC-Ala-Ile-Phe-TRIS (500 mg in 30 ml Chloroform; 5 ml DMF), Palmitinsäure (1,1 g in 20 ml Chloroform), 825 mg DCC in 10m Chloroform und DMAP (40 mg in 10 ml Chloroform) innerhalb 2 Stunden bei 0ºC und 16 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt.
- Nach der Entfernung des DCU wurde die Chloroformlösung wie oben beschrieben gewaschen (Wasser, Citronensäure, Wasser, Natriumhydrogencarbonat, Wasser). Nach der Entfernung des Lösemittels wurde der ölige Rückstand getrocknet (Rohausbeute 1,66 g).
- Das Rohprodukt wurde in Hexan gelöst und ein Teil der Lösung auf einer Florisilsäule gereinigt. Nichtumgesetzte Palmitinsäure und andere Verunreinigungen wurden durch Lösemittelmischungen aus Hexan:Ether entfernt. Das in der Überschrift angegebene Produkt wurde dann mit Chloroform:Methanol 50:50 (150 ml) eluiert. Das Produkt wurde in Form eines Öls gewonnen, das aus t-Butylalkohol gefriergetrocknet wurde. Die weiße flaumige Verbindung (770 mg, 66,4% Theorie) ergab bei der DC einen einzigen Fleck, Rf 0,44 (Laufmittel g) und 0,13 (Laufmittel e). Berechnete Zusammensetzung fur C&sub7;&sub4;H&sub1;&sub3;&sub5;N&sub4;O&sub1;&sub1;: C 70,71, H 10,83, N 4,46, gefunden C 70,72, H 10,78, N 4,14. Der Fettsäuregehalt, bestimmt durch GLC, betrug 58% (Theorie 56,9%).
- 540 mg Z-Ala-Ethanolamin wurden mit 670 mg Palmitinsäure, 540 mg DCC und 32 mg DMAP in DCM und DMF wie im Beispiel 12 umgesetzt. Die Mischung wurde zur Trockne eingedampft und auf Florisil gereinigt. Es wurden 219 mg (20% der Theorie) isoliert. DC-Rf 0,16 (Laufmittel g), 0,14 (Laufmittel c, zweimal) und 0,12 (Laufmittel d).
- Lipopeptide des Typs Pam&sub3;-Cys-Ser-(Lys)&sub4; und Pam&sub3;-Cys-Ala-Gly sind potente Aktivatoren von Lymphocyten und Macrophagen (z.B. Reitermann et al., Biol. Chem. Hoppe- Seyler 370, 343-352). Für diese Verbindungen wurde auch gezeigt, daß sie Cytotoxizität gegenüber Tumoren in Macrophagen aus dem Knochenmark der Maus induzieren (Hoffmann et al. 1989, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 370, 575-582).
- Die mitogenen Wirkungen von zweien unserer Konstrukte, Z-Ala-TRIS-Tripalmitat und Ala- TRIS-Tripalmitat, wurden wie folgt untersucht:
- Die Experimente zum Einbau von ³H-Thymidin wurden in Linbro-Titertek-Microtiterplatten (Flow Laboratories Inc., USA) nach der Methode von L. Bradley in "Selected Methods of Cellular Immunology" (1980), Hrsg. B.B. Mishell und S.M. Shiligi, Verlag W.H. Freeman und Co., USA, Seite 156, durchgeführt. Die Tests wurden extern durch Dr. D. Rathjen von Peptide Technology Ltd., Dee Why, NSW., durchgeführt.
- Bei den getesteten Zellinien handelte es sich um:
- 1. RD10; ein B-Zell-Lymphom (erhalten vom Centre for Immunology, Sydney University, Sydney, NSW).
- 2. U937; ein menschliches, monocytenartiges histiocytisches Lymphom (Herkunft: American Tissue Cuiture Collection).
- Die RD10-Zellen (mit einer Zelldichte von 5x10&sup5;/ml, 100ul/Loch) wurden 20 Stunden bei 37ºC mit 5% CO&sub2; in RPMI-1640-Medium, dem 10% fötales Kälberserum zugesetzt waren, kultiviert. Die Proben, die getestet werden sollten, wurden mit diesem Medium in Konzentrationen von 5000, 500, 50 und 5 ug/ml gemischt und sonifiziert, und Aliquots von 100 ul wurden zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden mit 0,5 uCi ³H-Thymidin/Loch pulsmarkiert, und die Platten wurden weitere vier Stunden inkubiert und dann geerntet (Titertek Skatron Harvester, Lier, Norwegen). Die eingebaute Radioaktivität wurde durch Flüssig-Szintillationszählung bestimmt. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt.
- Die Figuren 6 und 7 fassen die Ergebnisse zusammen.
- Die Aufnahme von ³H-Thymidin durch die RD10-Zellen zeigte eine 3-4fache Steigerung der Zellproliferation gegenüber der Kontrolle. Das liegt im Bereich anderer bekannter mitogener Verbindungen, z.B. führt Phytohämagglutinin unter diesen Bedingungen zu einer 5-10fachen Steigerung. Die Proben, die Ala-TRIS-Tripalmitat enthielten, bei dem das N-terminale Ende des Alanins frei ist, ergaben im Vergleich mit Z-Ala-TRIS-Tripalmitat eine leicht verminderte Antwort.
- Der Thymidineinbau in die U937-Zellen lag, in leichtem Gegensatz dazu, nahe bei der Kontrolle, und bei höheren Konzentrationen deutete er auf schwach cytotoxische Wirkungen hin. Wie bei den Experimenten unter Verwendung der B-Zellen ergaben die Ala-TRIS-Tripalmitat- Proben leicht verminderte Antworten im Vergleich mit Z-Ala-TRIS-Tripalmitat.
- Die Fachleute auf diesem Gebiet sind sich darüber im klaren, daß die Erfindung auf vielfältige Weise variiert und/oder modifiziert werden kann, wie in den jeweiligen Ausführungsformen gezeigt wurde, ohne daß vom Anwendungsbereich der Erfindung, wie er allgemein beschrieben wurde, abgewichen wird. Die vorliegenden Ausführungsformen sind deshalb in jeder Beziehung nur als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung zu betrachten.
Claims (26)
1. Eine Verbindung der folgenden Formel:
in der Y für eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Derivat
davon steht und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind
und entweder Wasserstoff oder von Fettsäuren abgeleitete
Acylgruppen sind, wobei wenigstens eine der Gruppen R&sub1;, R&sub2;
und R&sub3; eine von einer Fettsäure abgeleitetete Acylgruppe
ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der jede der Gruppen R&sub1;,
R&sub2; und R&sub3; von Fettsäuren abgeleitete Acylgruppen sind.
3. Verbindung nach Anspruch 2, bei der R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; die
gleiche von einer Fettsäure abgeleitete Acylgruppe sind.
4. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei
der die von einer Fettsäure abgeleitete Acylgruppe eine
Kohlenstoffkette von 3 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.
5. Verbindung nach Anspruch 4, bei der die von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe eine Kohlenstoffkette
von 10 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.
6. Verbindung nach Anspruch 5, bei der die von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe 16 Kohlenstoffatome
aufweist.
7. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, bei
der Y Cystein ist.
8. Eine Verbindung der folgenden Formel:
Y - NH - CH&sub2; - CH&sub2;O - R&sub4;
in der Y für eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Derivat
davon steht und R&sub4; für eine von einer Fettsäure
abgeleitete Acylgruppe steht.
9. Verbindung nach Anspruch 8, bei der R&sub4; eine von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe ist, die eine
Kohlenstoffkette von 3 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.
10. Verbindung nach Anspruch 9, bei der die von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe eine Kohlenstoffkette
von 10 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.
11. Verbindung nach Anspruch 10, bei der die von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe 16 Kohlenstoffatome
aufweist.
12. Verbindung nach irgendeinen der Ansprüche 8 bis 11, bei
der Y Cystein ist.
13. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der folgenden
Formel:
in der Y für eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Derivat
davon steht und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind
und entweder Wasserstoff oder von Fettsäuren abgeleitete
Acylgruppen sind, wobei wenigstens eine der Gruppen R&sub1;, R&sub2;
und R&sub3; eine von einer Fettsäure abgeleitete Acylgruppe
ist; das die Umsetzung einer Verbindung der Formel
Y-COOR&sub5;, bei der R&sub5; Alkyl oder Aryl ist, mit Tromethamin
und anschließend die Umsetzung mit einer oder mehreren
Fettsäuren umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem jede der Gruppen R&sub1;,
R&sub2; und R&sub3; von Fettsäuren abgeleitete Acylgruppen sind.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; die
gleiche von einer Fettsäure abgeleitete Acylgruppe sind.
16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 15, bei
dem die von einer Fettsäure abgeleitete Acylgruppe eine
Kohlenstoffkette von 3 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe eine Kohlenstoffkette
von 10 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe 16 Kohlenstoffatome
aufweist.
19. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18, bei
dem Y Cystein ist.
20. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 19, bei
dem R&sub3; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Methyl,
Ethyl und Benzyl besteht.
21. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der folgenden
Formel:
Y - NH - CH&sub2; - CH&sub2;O - R&sub4;
in der Y für eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Derivat
davon steht und R&sub4; für eine von einer Fettsäure
abgeleitete Acylgruppe steht; das die Umsetzung einer Verbindung
der Formel Y-COOR&sub5;, in der R&sub5; Alkyl oder Aryl ist, mit
Ethanolamin und anschließend die Umsetzung mit einer
Fettsäure umfaßt.
22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem R&sub4; eine von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe ist, die eine
Kohlenstoffkette von 3 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe eine Kohlenstoffkette
von 10 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die von einer
Fettsäure abgeleitete Acylgruppe 16 Kohlenstoffatome
aufweist.
25. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 24, bei
dem Y Cystein ist.
26. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 25, bei
dem R&sub5; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Methyl,
Ethyl und Benzyl besteht.
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