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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verringerung
der Immunogenität
von Staphylokinase durch das Entfernen von T-Zell-Epitopen. Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Staphylokinase,
die eine verringerte T-Zell-Reaktivität besitzt, und so erhaltene
Staphylokinasevarianten. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf
die Verwendung modifizierter Staphylokinase bei der Therapie, Diagnose
und Prophylaxe.
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Eine
Immunantwort schließt
erstens die Erkennung von Fremdmaterial (Pathogen/Antigen) und zweitens
das Aufbauen einer Reaktion, um es zu beseitigen, ein. Allgemein
gesprochen können
zwei Arten von Reaktionen ausgelöst
werden; eine angeborene oder nicht-spezifische Antwort und eine
adaptive oder hoch antigen-spezifische Antwort. Es ist die letztere
Reaktion, die sich mit jeder folgenden Begegnung mit demselben Fremdmaterial
verbessert. Das Immunsystem erinnert sich an Fremdmaterial und bewältigt es
schneller, wobei es als Folge der anfänglichen Exposition eine lebenslange
Immunität
erzeugt.
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Lymphozyten
spielen bei einer adaptiven Immunantwort eine zentrale Rolle, da
sie spezifisch einzelne Pathogene/Antigene erkennen, ganz gleich
ob sie im Innern von Wirtszellen oder außerhalb in Gewebsflüssigkeiten
oder dem Blut vorkommen. Tatsächlich
gibt es mehrere verschiedene Arten von Lymphozyten, die aber in
zwei grundlegende Kategorien fallen, T-Lymphozyten (oder T-Zellen) und B-Lymphozyten
(oder B-Zellen).
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B-Zellen
bekämpfen
Antigene und Pathogene und ihre Produkte durch die Freisetzung von
spezifischen Antikörpern.
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T-Zellen
können
in verschiedene Typen unterteilt werden und zeigen einen größeren Aktivitätsbereich. Die
so genannten cytotoxischen T-Zellen sind für die Zerstörung von Wirtszellen verantwortlich,
die mit Viren oder anderen Pathogenen infiziert worden sind. T-Helferzellen
können
mit Phagozyten interagieren und dabei helfen Pathogene zu zerstören. Andere
T-Helferzellen sind an der Kontrolle der Entwicklung von B-Zellen
und der Antikörperproduktion
beteiligt.
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Jede
B-Zelle ist genetisch programmiert einen einzigartigen Oberflächenrezeptor,
der für
ein bestimmtes Antigen spezifisch ist, zu kodieren. Haben sie ihr
spezifisches Antigen erkannt, können
die B-Zellen proliferieren und zu Plasmazellen, die große Mengen
des Rezeptormoleküls
in einer löslichen
Form, die als Antikörper
bekannt ist, herstellen, differenzieren.
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Während B-Lymphozyten
konformationelle Epitope (3-D Oberflächenstrukturen) auf nativen
Antigenen erkennen, erkennen T-Zellen lineare Aminosäuresequenzen
(T-Zell-Epitope).
Das können
sie aber nur, wenn das T-Zell-Epitop durch so genannte humane Histokompatibilitäts Leukozytenantigen(HLA)-Moleküle auf der
Zelloberfläche
anderer Zellen präsentiert
wird. Das Antigen wird von den HLA-Molekülen nicht als intaktes Protein
präsentiert,
sondern vielmehr als prozessierte Peptide, die in ihrer Peptidbindungsfurche nicht-kovalent
gebunden sind. Diese Prozessierung und Präsentation kann von spezialisierten
antigen-präsentierenden
Zellen (APC) durchgeführt
werden, die in der Lage sind, T-Zellen zu stimulieren, oder durch
infizierte Zellen, die dann ein Ziel für cytotoxische T-Zellen werden. Die
T-Lymphozyten können
diese HLA-Peptidkomplexe
mittels eines spezifischen Rezeptors, der T-Zell-Rezeptor (TCR) genannt wird, erkennen.
Jeder TCR ist einzigartig, er erkennt ein in der Furche eines bestimmten
HLA-Moleküls
gebundenes spezifisches Peptid. Bei der Erkennung erhält die spezifische
T-Zelle ein Aktivierungssignal und dann wird um eine T-Zell-Antwort
zu induzieren, die Proliferation und Cytokinproduktion einschließt, ein
sekundäres
Signal benötigt.
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Wenn
ein Individuum auf ein Antigen trifft und das Immunsystem mit einer
humoralen Antwort reagiert, kommt es in einer geordneten Abfolge
zu einer Reihe von zellulären
und molekularen Wechselwirkungen. Die erste Wechselwirkung umfasst
antigen-spezifische T-Zellen und APCs. Dieses Ergebnis bestimmt
größtenteils den
folgenden Ablauf von Ereignissen. Eine ausreichende Anzahl von T-Helferzellen
muss angemessen aktiviert werden. Spezifische T-Zellen reagieren
dann mit Proliferation und Cytokinsekretion.
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Im
folgenden interagieren diese aktivierten T-Helferzellen mit spezifischen
B-Zellen, die ihnen das Antigen präsentieren. Dieser B-T-Zell-Kontakt
in Verbindung mit den sekretierten Cytokinen aktiviert die B-Zellen und
induziert im folgenden die Proliferation und die Differenzierung
zu Plasmazellen. Diese wiederum produzieren Antikörper und
differenzieren, abhängig
von den T-Zell-Signalen, die sie erhalten, über einen Klassenwechsel, Affinitätsreifung
und die Entwicklung eines immunologischen Gedächtnisses weiter.
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Daher
ist bei einer zweiten oder folgenden Begegnung mit dem Antigen eine
größere Anzahl
von antigen-spezifischen B-Zellen
vorhanden, was sie zur Hauptart von APCs werden lässt und
bedeutenderweise eine kürzere
Schaltung der immunologischen Antwort auslöst. Wenn jedoch die T-Helferzellen nicht
gleichzeitig ausgelöst
werden, kann sich eine Form von immunologischer Toleranz entwickeln,
und es folgen keine immunologischen Ereignisse.
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Basierend
auf diesen Überlegungen
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen,
dass die Beseitigung funktioneller T-Zell-Epitope in Staphylokinase
ebenfalls einen großen
Einfluss auf das Auslösen
einer humoralen Antwort haben wird. Wenn weniger oder keine spezifischen
T-Zellen ausgelöst werden,
da spezifische Peptide nicht länger
wirksam präsentiert
werden können,
werden B-Lymphozyten daran gehindert zu reifen und folglich wird
die Antikörperproduktion
außer
Kraft gesetzt.
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Im
Stand der Technik sind Verfahren zur Reduzierung der Immunogenität von therapeutischen
Proteinen durch das Aufspüren
und Entfernen von darin enthaltenen T-Zell-Epitopen bekannt, siehe Internationale Patentanmeldungen
WO 99/53038 und WO 98/52976.
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Auch
wird die die Herstellung von Staphylokinasevarianten mit veränderten
Immunreaktivitäten
beschrieben, in denen B-Zell-Epitope
entfernt sind, siehe Collen et al., „Thrombolytic properties of
poorly immunogenic variants of recombinant staphylokinase", Fibrinolysis and
Proteolysis, US, New York, NY, Band 12, Nr. SUPPL. 01, June 1998,
Seite 30 und Collen, D. et al., "Recombinant
staphylokinase variants with altered immunoreactivity. I: Construction
and characterization",
Circulation, US, American Heart Association, Dallas, TX, Band 94,
Nr. 2, 15 July 1996, Seiten 197–206.
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Daher
ist das erste Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Weg zur Verringerung
der T-Zell-basierten Immunogenität
von Staphylokinase bereitzustellen.
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Dieses
Ziel wird durch ein Verfahren zur Verringerung der Immunogenität von Staphylokinase
erreicht, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
- a) Entwurf einer Reihe von überlappenden
Testpeptiden, von denen jedes eine Aminosäuresequenz besitzt, die einem
Teil der Aminosäuresequenz
von Staphylokinase entspricht;
- b) Identifizieren welches der Testpeptide der Reihe ein oder
mehrere T-Zell-Epitop(e) umfasst;
- c) Modifizieren der Aminosäuresequenz
eines oder mehrerer Testpeptids/Testpeptide, das/die ein oder mehrere
T-Zell-Epitop(e) umfasst/umfassen;
- d) Wiederholen des Schritts b) und wahlweise Schritts c) mit
den modifizierten Testpeptiden bis ein oder mehrere T-Zell-Epitop(e),
das/die ursprünglich
darin enthalten ist/sind, deutlich verringert oder beseitigt ist/sind;
- e) Modifizieren der Aminosäuresequenz
von Staphylokinase gemäß den T-Zell-Epitop
beseitigenden Modifikationen, die in der Aminosäuresequenz der Testpeptide
durchgeführt
wurden, um eine modifizierte Staphylokinase herzustellen,
dadurch
gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Testpeptide, die ein T-Zell-Epitop
enthalten, durch eine Kombination der folgenden Tests durchgeführt wird: - 1) funktionaler T-Zell-Assay, in dem die Proliferation
von einem oder mehreren T-Zell-Klonen nach Stimulation der T-Zell-Klone
mit einem der Testpeptide bedeutet, dass das Testpeptid ein potentielles
T-Zell-Epitop umfasst; und/oder
- 2) funktioneller T-Zell-Assay, in dem die Proliferation von
einem oder mehreren T-Lymphozyten, wie sie in dem Kreislauf von
Menschen (PBMC) nach der Stimulation der PBMC mit einem der Testpeptide
vorhanden sind, bedeutet, dass das Testpeptid ein T-Zell-Epitop
enthält;
und
- 3) Bestimmen der Interaktionsenergie des Testpeptids mit der
Bindungsfurche eines oder mehrerer HLA-DR Haplotypen durch Computermodellierung,
in der das Testpeptid als ein potentielles T-Zell-Epitop enthaltendes
Peptid identifiziert wird, wenn es gemäß der Interaktionsenergie in
die HLA-DR Bindungsfurche passt,
wobei angenommen wird,
dass ein Testpeptid ein T-Zell-Epitop
umfasst, wenn es in Test 1) und/oder 2) und 3) identifiziert wird.
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Das
oben beschriebene Verfahren bezieht sich auf die minimale Menge
an notwendigen Schritten. Es ist möglich in nur einem Durchlauf
geeignete Modifikationen an den Testpeptiden durchzuführen. Falls
diese Modifikationen ausreichend sind, wird das bei der Wiederholung
von Schritt b) ersichtlich. Solche Modifikationen können dann
auf das Peptid oder Protein dessen Immunogenität reduziert werden soll, übertragen
werden. Es ist jedoch auch möglich,
bei der Wiederholung von Schritt b) herauszufinden, dass weitere
Modifikationen notwendig sind. Schritt c) kann sich ebenfalls auf
mehrere Modifikationsdurchläufe
ohne Zwischenüberprüfung auf
T-Zell-Epitope wie in Schritt b) beziehen.
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Zusätzlich zu
den obigen Schritten gibt es weitere bevorzugte Schritte, die Teil
des Verfahrens sein können.
Es ist zum Beispiel möglich,
die modifizierten Testpeptide oder das modifizierte Peptid oder
Protein auf sein Potential, T-Zellen zu aktivieren und die Proliferation
von T-Lymphozyten, wie sie im Kreislauf von Menschen (PBMC-Test) vorhanden sind,
zu testen. Das repräsentiert
eine ex vivo Situation und erlaubt Einsicht in die Wirkung der Modifikationen
auf die in vivo Immunogenität.
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Es
ist ferner möglich,
den gesamten Prozess der Identifikation, Modifikation (Schritte
b) und c)) und gegebenenfalls PBMC-Test mit dem bereits modifizierten
Peptid oder Protein wieder von vorne beginnend durchzuführen.
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Der
Schritt der Modifikation der Aminosäuresequenz von Staphylokinase
gemäß den T-Zell-Epitop
beseitigenden Modifikationen, die in der Aminosäuresequenz der Testpeptide
vorgenommen wurden, kann zum Beispiel durch die Expression einer
DNA-Sequenz, die die modifizierte Aminosäuresequenz kodiert, in einem geeigneten
Wirt durchgeführt
werden.
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Die
Identifikation von Peptiden, die ein T-Zell-Epitop umfassen, kann
auf verschiedenen Wegen durchgeführt
werden. In einer Ausführungsform
wird ein funktioneller T-Zell-Assay
verwendet, in dem die Proliferation von einem oder mehreren T-Zell-Klonen
nach der Stimulation der T-Zell-Klone
mit einem der Testpeptide bedeutet, dass besagtes Testpeptid ein
T-Zell-Epitop umfasst. In einer zweiten Ausführungsform wird ein funktioneller
T-Zell-Assay verwendet, in dem die Proliferation von einem oder
mehreren T-Lymphozyten, wie sie im Kreislauf von Menschen (PBMC)
nach der Stimulation der PBMC mit einem der Testpeptide vorhanden
sind, bedeutet, dass besagtes Testpeptid ein T-Zell-Epitop umfasst. In diesen Ausführungsformen
werden tatsächliche
Peptide verwendet, die auf der Basis der Aminosäuresequenz des Peptids oder
Proteins, dessen T-Zell-basierte
Immunogenität
reduziert werden soll, synthetisiert sind, verwendet.
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Alternativ
wird die Identifizierung von Peptiden, die ein T-Zell-Epitop umfassen,
durch Bestimmung der Interaktionsenergie des Testpeptids mit der
Bindungsfurche von einem oder mehreren HLA-DR Haplotypen mittels
Computermodellierung durchgeführt,
wobei ein Testpeptid oder Testpeptide als T-Zell-Epitop beinhaltend
identifiziert werden, wenn sie gemäß ihrer Interaktionsenergie
in die HLA-DR Bindungsfurche passen. In dieser Ausführungsform
werden die Peptide nicht tatsächlich
synthetisiert, sondern es werden virtuelle Peptide verwendet.
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Von
den Tests 1), 2) und 3) ist ein Test eine Überprüfung eines anderen. Nur ein
T-Zell-Assay kann Informationen über
die Funktionalität
des T-Zell-Epitops geben. Ein Peptid, das theoretisch in die HLA-Bindungsfurche
passt, könnte
nicht zur Proliferation der T-Zellen führen.
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Die
vorliegende Erfindung beschäftigt
sich daher mit der Identifikation von funktionellen humanen T-Zell-Epitopen
(immunogene Regionen) in Staphylokinase, vorzugsweise basierend
auf den kombinierten Ergebnissen aus der Computermodellierung von
Testpeptiden in die HLA-DR Bindungsfurche und der Analyse humaner
T-Zellen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf
ein Verfahren zur Berechnung der Interaktionsenergie zwischen zwei
Proteinen/Peptiden.
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Schritt
d) des oben beschriebenen Verfahrens der Erfindung beschäftigt sich
mit der erneuten Bewertung von neu in das modifizierte Protein eingeführten Epitopen,
vorzugsweise durch das Kombinieren der Ergebnisse aus der Computermodellierung
der modifizierten Testpeptide in die HLA-DR Bindungsfurche und das Screening
humaner T-Lymphozyten
mit dem modifizierten Protein.
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Der
Zweck des oben beschriebenen Verfahrens ist die Verringerung der
Immunogenität
von Staphylokinase durch die Beseitigung der identifizierten immunogenen
Regionen. Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung bezieht sich die Erfindung auf Verfahren
die immunogenen Regionen entweder durch Deletion oder Insertion
der kodierenden Sequenzen, oder durch Humanisierung der kodierenden
Sequenzen, oder durch in vitro Mutagenese der kodierenden Sequenzen,
um ein oder mehrere Codons für
Wild-Typ-Aminosäuren
durch ein Codon für
einen anderen Rest zu ersetzen, oder durch das Sensitivieren der
immunogenen Regionen für endosomale
proteolytische Enzyme zu entfernen. Die letztere Art von Modifikation
kann die Art und Weise beeinflussen, in der das T-Zell-Epitop auf
antigen-präsentierenden
Zellen präsentiert
wird. Zusätzlich
kann die Modifikation immunogener Regionen, um diese für proteolytische
Enzyme empfindlicher zu machen, zu der Bildung von Peptiden führen, die
zu kurz sind, um in die HLA-DR Furche zu passen und daran zu binden.
Es ist bekannt, dass 9 Aminosäuren
in die Furche passen aber ein Minimum von 11 Aminosäuren für die Bindung notwendig
ist. Die Veränderung
der Position von Angriffsstellen für endogene proteolytische Enzyme
kann in vivo zur Herstellung kürzerer
Peptide führen,
die nicht mehr an die HLA-DR Furche binden.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Verfahren zur Herstellung
einer modifizierten Staphylokinase gemäß der Erfindung durch das Herstellen
eines DNA-Fragments, das mindestens den Teil der strukturellen Information
des Peptids oder Proteins kodiert, der für dessen biologische Aktivität verantwortlich ist;
Mutieren des DNA-Fragmentes, um daraus die kodierende Information
für ein
oder mehrere T-Zell-Epitope zu
entfernen; Klonieren des mutierten DNA-Fragments in einen geeigneten
Vektor, Transformieren oder Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle
mit dem Vektor und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen,
die für die
Expression des DNA-Fragments geeignet sind.
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Insbesondere
bietet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids
oder Proteins, das im Vergleich zu dem Wildtyp-Peptid oder -Protein
eine verringerte Immunogenität
besitzt, umfassend die folgenden Schritte:
- a)
Bereitstellen einer DNA-Sequenz, die mindestens die Aminosäuresequenz
des Peptids oder Proteins kodiert, die für die dessen biologische Aktivität verantwortlich
ist;
- b) Identifizieren und Modifizieren eines oder mehrerer T-Zell-Epitops/T-Zell-Epitope,
die in der Aminosäuresequenz
von Wildtyp Staphylokinase enthalten sind durch:
- 1) Identifizieren welches der Testpeptide der Reihe ein oder
mehrere T-Zell-Epitop(e) umfasst mittels Test 1) und/oder 2) und
3), wie in Anspruch 1 definiert;
- 2) Modifizieren der Aminosäuresequenz
von einem oder mehreren Testpeptid/Testpeptiden, die ein oder mehrere
T-Zell-Epitop/T-Zell-Epitope
enthalten;
- 3) Testen der modifizierten Peptide auf ihre Fähigkeit
T-Zellen zu aktivieren und die Proliferation von entweder T-Zell-Klonen
oder T-Lymphozyten, wie sie im Kreislauf von Menschen (PBMC) vorhanden
sind, auszulösen;
- 4) Modifizieren der Aminosäuresequenz
der Staphylokinase, deren Immunogenität reduziert werden soll, gemäß den T-Zell-Epitop
beseitigenden Modifikationen, die in der Aminosäuresequenz der Testpeptide durchgeführt wurden;
- 5) Herstellung und Reinigung der modifizierten Staphylokinase,
deren Immunogenität
reduziert werden soll, in einem geeigneten Wirt, und Testen ihrer
biologischen Aktivität;
- 6) Wiederholen der Schritte 2–5) mit der modifizierten Staphylokinase,
bis ein oder mehrere T-Zell-Epitop/T-Zell-Epitope, die ursprünglich darin enthalten waren,
deutlich verringert oder beseitigt sind und Untersuchen der biologischen
Aktivität;
- c) Modifizieren der DNA-Sequenz, um die Modifikationen der T-Zell-Epitope
in die Aminosäuresequenz,
die dadurch kodiert wird, einzuführen;
- d) Einbringen der DNA-Sequenz in einen Wirtsorganismus;
- e) Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die die
Expression der modifizierten Staphylokinase erlauben; und
- f) Isolieren der Staphylokinase, die eine verringerte Immunogenität besitzt,
aus dem Wirtsorganismus.
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In
die obigen Verfahren können
wie oben für
das Verfahren zur Verringerung der Immunogenität von Staphylokinase beschrieben
weitere Schritte eingebunden werden.
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Die
Staphylokinasevarianten, die gemäß der Erfindung
hergestellt werden können,
und die verglichen mit ihren Wildtypgegenstücken eine verringerte T-Zell-basierte
Immunogenität
besitzen, sind neu und daher ebenfalls Teil dieser Erfindung. Die
Erfindung ist anwendbar, um die T-Zell-basierte Immunogenität aller
Arten von Proteinen und Glykoproteinen, entweder menschlichen Ursprungs
oder aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren stammend, zu verringern.
Ziele sind ebenfalls Fusionsproteine, die zum Teil aus einem Protein
des Wirts bestehen, in dem das Protein hergestellt wird, und zum
Teil aus Staphylokinase. Andere Ziele des Verfahrens der Erfindung
sind humanisierte Staphylokinasen.
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Wenn
ein Protein oder Peptid menschlichen Ursprungs ist, kann es, wenn
es einem Menschen verabreicht wird, immer noch immunogen sein. Ein
Beispiel dafür
ist die Verabreichung eines Proteins an ein menschliches Individuum,
welches das Individuum nicht besitzt. Der Körper des Individuums erkennt
das Protein nicht als „Selbst"-Protein, obwohl
es humanen Ursprungs sein kann, und entwickelt eine Immunantwort. Ein
anderes Beispiel ist, wenn ein Protein menschlichen Ursprungs nicht
länger
vollständig
menschlich ist, wie zum Beispiel humanes Interferon-Alpha, das in
E. coli hergestellt wird und nicht glykosyliert ist, und für das herausgefunden
wurde, dass es immunogen ist, oder wenn Proteine menschlichen Ursprungs
modifiziert werden, um bessere Eigenschaften zu erhalten, wie zum
Beispiel verbesserte Löslichkeit.
Insbesondere ist die Erfindung nützlich,
um die T-Zell-basierte Immunogenität des nicht-menschlichen Proteins
Staphylokinase, aber auch Streptokinase oder Antikörper aus
anderen Arten oder Fragmenten davon, oder chimären Proteinen oder Fusionsproteinen
oder De-Novo Proteinen für
die Diagnostik oder Behandlung von menschlichen Erkrankungen, zu
verringern. Gemäß der Erfindung
werden Staphylokinase-Derivate bereitgestellt, die verglichen mit Wildtyp
Staphylokinase eine verringerte T-Zell-basierte Immunogenität besitzen.
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Wenn
ein Protein oder Peptid zur Verringerung seiner Immunogenität modifiziert
wird, sollte darauf geachtet werden, dass die biologische Aktivität des Proteins
oder Peptids nicht stark verringert wird oder sogar verloren geht.
Es wird daher bevorzugt, dass nach der Herstellung einer modifizierten
Staphylokinase ihre biologische Aktivität bestimmt wird. Tests zur
Bestimmung der Aktivität
von Staphylokinase sind im Stand der Technik üblicherweise erhältlich.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine modifizierte
Staphylokinase für
die Verwendung bei der Behandlung, Diagnose oder Prophylaxe und
auf die Verwendung einer modifizierten Staphylokinase für die Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung, Diagnose oder
Prophylaxe bei einem Menschen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich die Erfindung
auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eines der
weniger immunogenen Derivate gemäß der Erfindung zusammen
mit einem geeigneten Hilfsstoff für die Diagnose oder Behandlung
in Menschen umfassen. Solche Zusammensetzungen können durch die Kombination
(zum Beispiel Mischen, Auflösen
etc.) der aktiven Verbindung mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen
mit neutralem Charakter (wie zum Beispiel wässrigen oder nicht-wässrigen
Lösungsmitteln,
Stabilisatoren, Emulgatoren, Detergenzien und Zusatzstoffen) hergestellt
werden. Die Konzentration des aktiven Inhaltsstoffs in einer therapeutischen
Zusammensetzung kann abhängig
von der Art der Krankheit und der Art der Verabreichung stark variieren.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die sogenannte „T-Zell-basierte
Immunogenität", was bedeutet, dass
gemäß der Erfindung
T-Zell-Epitope identifiziert, charakterisiert und modifiziert werden.
Die Erfindung bezieht sich nicht auf allgemeine Verfahren zur Identifikation,
Herstellung und Verwendung von Staphylokinasederivaten, die im Vergleich
zu Wildtyp Staphylokinase eine verringerte Antigenität zeigen,
und auf der Beseitigung von B-Zell-Epitopen basieren, wie zuvor in US-5,695,754,
US-5,951,980 und WO-9940198 beschrieben wurde. Diese Verfahren sind
von der vorliegenden Erfindung vollständig unterschiedlich und kein Gegenstand
davon, obwohl die antigenen Regionen (die durch Antikörper und
B-Zellen erkannt werden), die in diesen Patentveröffentlichungen
beschrieben werden, zufällig
mit immunogenen Regionen (die an der T-Zellantwort (T-Zellerkennung) beteiligt
sind) (teilweise) überlappen
können.
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In
dem Verfahren gemäß der Erfindung
ist das modifizierte Protein Staphylokinase. Staphylokinase, ein
Protein, das von bestimmten Stämmen
von Staphylococcus aureus hergestellt wird, und für das vor
mehr als 5 Dekaden gezeigt wurde, das es fibrinolytische Eigenschaften
besitzt, scheint in Patienten mit akutem Myokardinfarkt ein wirksames
thrombolytisches Mittel darzustellen. Das Staphylokinase-Gen wurde
aus den Bakteriophagen sakøC
(Sako and Tsuchida, 1983) und sak42D (Behnke and Gerlach, 1987)
sowie aus der genomischen DNA (sakSTAR) eines lysogenen Staphylococcus
aureus Stammes (Collen et al., 1992) kloniert. Das Staphylokinase-Gen
kodiert ein Protein aus 163 Aminosäuren, wobei Aminosäure 28 dem
NH2-terminalem Rest von reifer Volllängen Staphylokinase
entspricht. Die reife Proteinsequenz der Wildtypvariante SakSTAR ist
in 1 dargestellt. In den kodierenden Regionen der
sakøC,
sak42D und sakSTAR Gene wurden nur vier Nukleotidunterschiede gefunden,
von denen eine eine stumme Mutation darstellt.
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Insbesondere
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Staphylokinasevarianten,
in denen eine oder mehrere der folgenden immunogenen Regionen so
modifiziert ist/sind, das die T-Zell-Epitope, die darin enthalten
sind, beseitigt werden:
1-SSSFDKGKYKKGDDASY-17,
16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32,
56-TKEKIEYYVEWALDATA-72,
71-TAYKEFRVVELDPSAKI-87,
106-ITEKGFVVPDLSEHIKN-122,
und
120-IKNPGFNLITKVVIEKK-136, ausgenommen der Variante, die
die Kombination der folgenden Mutationen besitzt: K74A, E75A, R77A,
E80A, D82A.
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Ferner
bezieht sich die Erfindung auf Staphylokinasevarianten mit verglichen
zu Wildtyp Staphylokinase verringerter T-Zell-Reaktivität, die aber
die biologische Aktivität
beibehalten, wobei die Varianten die Aminosäuresequenzen, die in 1 dargestellt
sind, mit einer oder mehreren der folgenden Aminosäuresubstitutionen
in einer oder mehreren der folgenden immunogenen Regionen besitzen:
- a) in der immunogenen Region, die die SakSTAR
Reste 16–32
umfasset, die Substitutionen Y17L; F18L; F18E; E19D; P20Y, Y24A;
P20Y, Y24S; G22S; G22P, P23G; N28S;
- b) in der immunogenen Region, die die SakSTAR Reste 71–82 umfasst,
die Substitutionen F76W, V79Y, D82A; R77A, E80A; R77S, E80S; R77A,
E80A, D82A; K74Q, R77S, E80S; K74Q, R77S, E80S, D82G; K74Q, R77S,
E80S, D82A; K74Q, R77S, E80A, D82A; K74Q, R77A, E80S, D82A; K74Q,
R77S, E80S, D82S; V79Y, D82A;
- c) in der immunogenen Region, die die SakSTAR Reste 106–122 umfasst,
die Substitutionen V112T; V112S; D115N; E118S; H119A; H119S; V89L,
L116Y; V89L, L116T; V112T, H119S; V112T, H119A; V112T, E118S, H119S;
- d) in der immunogenen Region, die die SakSTAR Reste 120–136 umfasst,
die Substitution K130Y.
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Es
wird bevorzugt, dass solche Staphylokinasevarianten eine Kombination
von einer oder mehreren der oben aufgelisteten Mutationen besitzen,
insbesondere eine der folgenden Kombinationen von Mutationen V112T,
H119S, K130Y; R77E, E134R; V29L, L127V; K74Q, R77E, E80S, D82S,
E134R; R77S, E80S, V112T, H119S; R77S, E80S, V112T, H119S, K130Y;
R77A, E80A, V112T, H119S; R77A, E80A, V112T, H119S, K130Y; K74Q,
R77S, E80S, V112T, H119S; K74Q, R77S, E80S, V112T, H119S, K130Y;
K74Q, R77S, E80S, D82S, V112T, H119S; K74Q, R77S, E80S, D82S, V112T,
H119S, K130Y.
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Bevorzugte
Staphylokinasevarianten werden aus der Gruppe, die aus SakSTAR (P20Y,
Y24A), SakSTAR (P20Y, Y24S), SakSTAR (E18D), SakSTAR (Y17L), SakSTAR
(F18L), SakSTAR (F18E), SakSTAR (G22S), SakSTAR (G22S, P23G), SakSTAR
(N28S), und SakSTAR (V29L, L127V), SakSTAR (R77E, E134R), SakSTAR
(K74Q, R77S, E80S, D82S, E134R), SakSTAR (K74Q, R77E, E80S, D82S,
V112T, H119S, E134R), SakSTAR (K74Q, R77E, E80S, D82S, V112T, H119S,
E134R, K130Y); SakSTAR (R77S, E80S, V112T, H119S), sakSTAR (R77S,
E80S, V112T, H119S, K130Y), SakSTAR (R77A, E80A, V112T, H119S),
SakSTAR (R77A, E80A, V112T, H119S, K130Y), sakSTAR (K74Q, R77S,
E80S, V112T, H119S), SakSTAR (K74Q, R77S, E80S, V112T, H119S, K130Y),
sakSTAR (K74Q, R77S, E80S, D82S, V112T, H119S), SakSTAR (K74Q, R77S, E80S,
D82S, V112T, H119S, K130Y), SakSTAR (V112T, H119A), SakSTAR (V112T,
H119S), SakSTAR (V112T, E118S, H119S), SakSTAR (V112T, H119S, K130Y),
SakSTAR (V112T), SakSTAR (V112S), SakSTAR (H119A), SakSTAR (H119S),
SakSTAR (V89L, L116Y), SakSTAR (V89L, L116T), SakSTAR (V112T), SakSTAR
(V112S), SakSTAR (D115N), SakSTAR (E118S), SakSTAR (K130Y) besteht,
ausgewählt.
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Es
wurde gefunden, dass eine Staphylokinasevariante in der mindestens
der Rest K130 der Wildtyp Aminosäuresequenz
durch ein Y ersetzt ist, besonders bevorzugt ist.
-
Um
zu testen, ob die hergestellten Varianten noch ihre thrombolytische
Aktivität
behielten, kann ein Test wie der, der in Collen et al. (1996b) beschrieben
wird, verwendet werden.
-
Die
Staphylokinasevarianten können
bei der Behandlung, Diagnose oder Prophylaxe verwendet werden. Die
Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung einer Staphylokinasevariante
für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung,
Diagnose oder Prophylaxe eines menschlichen Probanden und auf eine
pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Staphylokinasevariante
zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen
umfasst.
-
Die
Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter erläutert, wobei
Staphylokinase als ein Modell eines immunogenen nicht-humanen Proteins
mit therapeutischem Potential verwendet wird, es ist aber nicht beabsichtigt,
dass dieses Beispiel den Umfang der Erfindung beschränkt, da
mehrere alternative Anwendungen für den Durchschnittsfachmann
offensichtlich sind.
-
In
den Beispielen wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen:
-
1.
Primärsequenz
von Staphylokinase (SakSTAR). Die Aminosäuren sind im Einbuchstabencode angegeben:
A, Alanin; D, Asparaginsäure;
E, Glutaminsäure;
F, Phenylalanin; G, Glycin; H, Histidin; I, Isoleucin; K, Lysin;
L, Leucin; M, Methionin; N, Asparagin; P, Prolin; Q, Glutamin; R,
Arginin; S, Serin; T, Threonin; V, Valin; W, Tryptophan; und Y,
Tyrosin.
-
2.
Analyse der minimalen Epitope einer repräsentativen Auswahl von Region(71–87)-spezifischen
T-Zell-Klonen. Die
T-Zell-Klone wurden mit antigenpräsentierenden Zellen und dem
SakSTAR Peptid 71-TAYKEFRVVELDPSAKI-87,
15 Peptiden mit einzelnen Alanin-Substitutionen
in der Region 71–87,
und zwei 11mer Peptiden (S1, S2), wie gezeigt, kultiviert. Wenn
gefunden wurde, dass die Proliferation eines T-Zell-Klons mit dem
entsprechenden Peptid vergleichbar mit der durch das Wildtyp-Peptid
(erste Säule)
induzierten ist, ist eine dunkle Füllung eingezeichnet. Eine hellgraue
Füllung
zeigt verglichen mit derselben Konzentration des SakSTAR-(71–81) Peptids
einen deutlich niedrigeren Proliferationswert an, während eine
weiße Box
für die
Kombination keine nachweisbare Proliferation bedeutet.
-
3. a: Modellierung von 13 Peptiden (11mer),
die die immunogene Region in SakSTAR umfassen. Eingezeichnet ist
die ungebundene Interaktionsenergie (kcal/mol) jedes Peptids mit
der HLA-DR1 Struktur. Längere
Balken zeigen eine stärke
HLA-DR1 Bindung an. Die zwei ausgewählten Peptide, S1 und S2 sind
als schwarze Balken gezeigt. b: Modellierte Struktur des repräsentativen
Peptids S2 in einer Banddarstellung (Koradi et al., 1996). Das S2
Peptid ist in hellgrau gezeigt, während die HLA-DR1 α- und β-Ketten mittel- bzw.
dunkelgrau farbkodiert sind. Die Seitenkette von R71 der β-Kette, das
mit Peptidrest D82 interagiert, ist hervorgehoben.
-
4. Alanin-Scanning-Experiment mit dem
S1 (a, b, c) und S2 (d, e, f) Peptid im Zusammenhang mit HLA-DR7.
a, d: Für
jede Alaninmutante ist der Verlust an Interaktionsenergie (kcal/mol)
verglichen mit dem Wildtyp-Peptid eingezeichnet. Längere Balken
bedeuten, dass das entsprechende Peptid weniger gut in der Peptidbindungsfurche
bindet. b, e: Balkendarstellung des Kontaktflächenverlustes (Å2) für
dieselbe Gruppe von Peptiden bezogen auf das Wildtyp SakSTAR Peptid.
c, f: Graphische Darstellung der lösungsmittelzugänglichen
und vergrabenen Oberfläche
für jeden
Rest des Peptids, der in der Furche gebunden ist. Positive Werte stellen
Seitenketten, die im Komplex dem Lösungsmittel ausgesetzt sind
und die potentiell für
die T-Zell-Erkennung
verfügbar
sind, dar. Negative Werte zeigen das Ausmaß des Vergrabenseins in den
entsprechenden HLA-DR Taschen, die mit 1 bis 9 nummeriert sind,
an.
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5.
Proliferationsantworten von Staphylokinase (SakSTAR-myc)-„primed" PBMCs auf SakSTAR-myc,
das SakStAR Peptid 71–81
oder Peptidderivate davon. PBMCs von zehn Spendern, die für die Region-(71–87) immunreaktiv
sind, wurden mit SakSTAR-myc geprimt und mit bestrahlten CD3-abgereicherten autologen
PBMCs und ohne Antigen, mit SakSTAR-myc, mit dem Wildtyp SakSTAR
(71–87)
Peptid TAYKEFRVVELDPSAKI, mit fünf
(71–87)
Peptiden mit Einzelmutationen (TAYAEFRVVELDPSAKI, TAYKAFRVVELDPSAKI,
TAYKEFAVVELDPSAKI, TAYKEFRVVALDPSAKI, TAYKFRVVELAPSAKI), und mit
vier (71–87) Peptiden
mit mehreren Mutationen (TAYKEFAVVALDPSAKI, TAYKEFAVVALAPSAKI, TAYQEFSVVSLSPSAKI,
TAYAAFAVVALAPSAKI) erneut stimuliert. Die zelluläre Antwort ist als Stimulationsindex
eingezeichnet. Jeder Einzelpunkt stellt die zelluläre Antwort
von einem einzelnen Spender auf die angezeigten Antigene/Peptide dar.
-
6.
Minimale Sequenzerfordernisse von epitop-spezifischen T-Zell-Klonen. Die T-Zell-Klone
wurden mit APCs kultiviert und gemäß ihrer Spezifität mit SakSTAR
Peptiden 16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32 (16–26, und 23–33), 56-TKEKIEYYVEWALDATA-72 (61–71), 71-TAYKEFRVVELDPSAKI-87
(72–82,
und 75–85),
106-ITEKGFVVPDLSEHIKN-122 (110–120)
oder 120-IKNPGFNLITKVVIEKK-136 (124–134) kombiniert mit Peptiden
mit einzelnen Alaninsubstitutionen, die von dem ursprünglichen
SakSTAR Peptid abgeleitet sind, kombiniert. Die Anzahl an analysierten
Klonen ist in der rechten Säule
eingezeichnet. Der Prozentsatz % an proliferierenden Klonen ist
bei einem alanin-substituierten Peptid für jeden Rest angegeben. Eine
dunkle Füllung
wird eingezeichnet, wenn mehr als 75% der epitop-spezifischen T-Zell-Klone
proliferierten, falls der angezeigte Rest zu einem Alanin verändert wurde.
Eine mittelgraue Füllung
zeigt an, dass eine Veränderung
zu Alanin weniger als 25% der epitop-spezifischen T-Zell-Klone in ihrer Proliferationsfähigkeit
beeinflusste. Eine hellgraue Box zeigt an, dass nur 25–50% der
epitop-spezifischen T-Zell-Klone proliferieren konnten und eine weiße Box stellt
eine proliferative Antwort von weniger als 25% der epitop-spezifischen
T-Zell-Klone dar. Somit gilt je weißer die Box, desto weniger
T-Zell-Klone proliferierten als Antwort auf ein Peptid mit einer
Alaninsubstitution an der angezeigten Position. Zusammenfassend
zeigt eine weiße
Box an, dass der Rest für
die HLA-DR Bindung oder TCR-Erkennung wichtig ist und das Ziel für Mutagenese-Experimente
sein wird.
-
Beispiele
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Beispiel 1
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Isolierung
von menschlichen Staphylokinase-spezifischen T-Zell-Klonen
-
Rekombinante
Wildtyp-Staphylokinase (SakSTAR) wurde wie zuvor beschrieben exprimiert
und gereinigt (Collen et al., 1996a; Schlott et al., 1994), gefolgt
von dem zusätzlichen
Schritt einer Größenausschlusschromatographie
unter Verwendung einer Superdex 75 Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Es wurde anhand einer SDS-PAGE Analyse bestimmt, dass die SakSTAR
Reinheit größer als
98% ist.
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Normale
gesunde Einzelpersonen wurden mit dem Inno-LiPa Verfahren HLA-DR
typisiert (Buyse et al., 1993) (Innogenetics, Gent, Belgien) und
ihre peripheren mononukleären
Blutzellen (PBMCs) gemäß dem Standardverfahren
unter Verwendung einer Ficoll-Hypaque Dichtegradienten-Zentrifugation
isoliert. Zehn gesunde Spender, die mehr als 95% der Haupt-HLA-DR
Haplotypen in den USA und Europa repräsentieren, wurden ausgewählt.
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Für die Klonierung
von SakSTAR-spezifischen T-Zell-Klonen wurden von jedem Spender
ungefähr
15 × 106 PBMCs mit einer optimalen Konzentration
von SakSTAR für
7–9 Tage
stimuliert. Die sichtbaren T-Zell-Klone wurden unter dem Mikroskop
geerntet und einzeln in einer 96-well Flachbodenplatte mit autologen
PBMCs als antigen-präsentierende
Zellen (APCs) erneut stimuliert. Diese wells wurden an Tag 1 mit
20 U/ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (IL-2) (Boehringer Mannheim,
Mannheim, Deutschland) versorgt und für 8–11 Tage wachsen gelassen.
Die erneute Stimulation wurde alle 8–11 Tage unter denselben Bedingungen
wiederholt. Nach 3 bis 6 Passagen wurden die autologen PBMCs durch
autologe Epstein-Barr-Virus(EBV)-immortalisierte
B-Zelllinien als antigen-präsentierende
Zellen ersetzt.
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Um
autologe APCs zu erhalten, die für
längere
Zeiträume
in Kultur gehalten werden können,
wurden mittels Standard-Zentrifugations-
und Filtrationsverfahren (Miller and Lipman, 1973) EBV aus Marmoset
B95-8 Zellen (ATCC#CRL1612) isoliert.
-
Konzentrierte
PBMCs aus den T-Zell-Klon-Spendern wurden für 2 Stunden mit EBV-enthaltenden Überständen infiziert.
Danach wurden sie verdünnt
und mit 5·106 PBMC/ml in RPMI1640 ergänzt mit 10% FCS, 10 μg/ml Gentamycin
und 1 μg/ml
Cyclosporin A kultiviert. Die mit EBV transformierten B-Lymphozyten
konnten nun in Kultur gehalten und unter flüssigem Stickstoff gelagert
werden. Diese Verfahren führten
zu der Isolation von über
100 SakSTAR-spezifischen T-Zell-Klonen (CD3+,
CD4+).
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Beispiel 2
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Lokalisation
und Charakterisierung von immunogenen Regionen in Staphylokinase
durch funktionelle T-Zell Assays
-
Um
immunogene Regionen auf dem SakSTAR Molekül zu identifizieren, wurden
die isolierten T-Zell-Klone unter Verwendung von von SakSTAR abgeleiteten
Peptiden auf ihre Spezifität
getestet. Insgesamt wurden 25 Peptide mit einer Länge von
17 Resten, mit jeweils 12 überlappenden
Resten, unter Verwendung eines Fluorenylmethoxy-Carbonyl-geschützten Aminosäure-Kopplungsverfahrens
(Hiemstra et al., 1997) synthetisiert. Jeder einzelne T-Zell-Klon
wurde durch das Mitkultivieren von T-Zellen, Mytocin C-behandelten autologen
EBV-B-Zellen und Antigen oder dem entsprechenden Peptid für 4 Tage
auf seine Spezifität
getestet. Danach wurden die T-Zell-Klone für 24 Stunden mit BrdU gepulst,
geerntet und auf ihren BrdU-Gehalt hin analysiert. Die Proliferation
nach der Stimulation mit einem spezifischen Peptid wurde als positiv
beurteilt, wenn die Proliferation mindestens drei Mal höher als
der Hintergrund war, was die Spezifität dieses bestimmten T-Zell-Klons zeigte.
-
Diese
Assays zeigten, dass in dem SakSTAR Molekül 6 unterschiedliche immunogene
Regionen vorhanden sind. Es wurde gefunden, dass die folgenden Peptide
(SakSTAR Restnummern und Sequenz) immunogen sind:
1-SSSFDKGKYKKGDDASY-17,
16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32,
56-TKEKIEYYVEWALDATA-72,
71-TAYKEFRVVELDPSAKI-87,
106-ITEKGFVVPDLSEHIKN-122,
und
120-IKNPGFNLITKVVIEKK-136.
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Beispiel 3
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Lokalisation und Charakterisierung
von humanen T-Zell-Epitopen
in Staphylokinase durch Computermodelle von Peptiden in der HLA-DR
Bindungsfurche
-
Die
Gesamtaminosäuresequenz
von SakSTAR wurde als 11mer Sequenzen, unter Verschiebung von jeweils
einem Rest, durch die HLA-DR Bindungsfurche der Haupt-Haplotypen
durchgefädelt
und die Interaktionsenergie von allen diesen Kombinationen unter
Verwendung des Dead-End Elimination Theorems (DEE) (De Maeyer et
al., 1997; Desmet et al., 1992), das in das Brugel molecular modeling
package eingebaut ist (Delhaise et al., 1984), berechnet.
-
Die
verwendete Energiefunktion (Wodak et al., 1986) umfasst die gewöhnlichen
Ausdrücke
für Streckung
der Bindung, Beugung des Bindungswinkels, eine periodische Funktion
der Torsionswinkel, ein Lennard-Jones Potential für die nichtgebundenen
Atompaare, ein 10–12
Potential für
Wasserstoffbrückenbindungen
und eine Coulomb Funktion für
geladene Atome. Die dielektrische Konstante wurde auf rij gesetzt,
die Distanz zwischen den i und j Atomen (Warshel and Levitt, 1976).
Die Energieparameter wurden aus der CHARMM Bibliothek abgeleitet
(Brooks et al., 1983).
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Alle
Modelle verwenden die obigen Energiefunktionen in der Gegenwart
aller eindeutigen Wasserstoffatome, wobei Carboxylat- und Imidazol-Gruppen
nicht protoniert waren.
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Diese
Berechnungen sagen voraus, dass SakSTAR mehrere T-Zell-Epitope enthält, die
in die meisten HLA-DR Haplotypen passen würden.
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Beispiel 4
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Identifizierung
von T-Zell-Epitopen in SakSTAR
-
Die
Kombination der Spezifitätsdaten
der isolierten T-Zell-Klone
mit den vorausgesagten T-Zell-Epitopen, die durch Computermodelle
erhalten wurden, ergab größtenteils überlappende
Ergebnisse. Die identifizierten SakSTAR T-Zell-Epitope sind in Tabelle I zusammengefasst.
-
Tabelle
I Überblick über die
identifizierten T-Zell-Epitope in Staphylokinase; SakSTAR
-
-
Die
Zahlen zeigen die Position der Reste in dem reifen Staphylokinasemolekül an, die
Aminosäuren sind
im Einbuchstabencode dargestellt.
-
Es
wurde berechnet, dass die SakSTAR Sequenzen 43-HYVEFPIKPGT-53 und 90-TYYDKNKKKEE-100
in die meisten HLA-DR Haplotypen passen, es wurden jedoch keine
T-Zell-Klone isoliert, die als Antwort auf Peptide, die diese Sequenzen
einschließen,
proliferierten. Es wurde gefunden, dass die verbleibenden 9 identifizierten
Epitope funktional sind, da epitop-spezifische T-Zell-Klone isoliert
wurden.
-
Beispiel 5
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Bestimmung der Präferenz der
Reste an jeder Position in der HLA-DR-Peptidbindungsfurche
-
Wie
oben beschrieben erlaubt die Computermodellierung in einem Protein
die Identifizierung von Aminosäuresequenzen
mit guter Interaktionsenergie mit der Bindungsfurche des HLA-DR
Moleküls,
was T-Zell-stimulierende Fähigkeiten
und daher Immunogenität
impliziert.
-
Dieselbe
Computertechnik kann verwendet werden, um Sequenzen zu modellieren,
die für
die Bindung an jeder Position der Peptidbindungsfurche weniger begünstigt sind.
Die Anwendung der DEE erlaubt die Berechnung der Interaktionsenergie
der Gesamtanzahl aller Sequenzkombinationen für ein 9mer Peptid, das in der
Furche gebunden ist. Der Durchschnittsfachmann ist in der Lage,
mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Berechnungsverfahren aus diesen
Ergebnissen eine Interaktionspräferenzmatrix
zu gewinnen. Diese Matrix enthält
für jede
Aminosäure
an jeder Position in dem Peptid die Interaktionsenergie mit dem
HLA-DR Molekül. Diese
Interaktionsenergie wird für
eine Aminosäure
als die Wahrscheinlichkeit interpretiert in einem bindenden Peptid
gefunden zu werden.
-
Daher
können
weniger gut bindende Reste wahrscheinlich die Affinität verringern
oder sogar die Bindung des Peptids an das HLA-Molekül stören. Diese
Matrix wurde für
jeden HLA-DR Haplotyp berechnet. Wenn die DR-Restriktion für eine immunogene
Region bekannt ist, können
diese Tabellen zu Rate gezogen werden, um alternative Sequenzen
zu entwickeln, die weniger gut in der Furche binden aber nicht mit
der 3D-Faltung des Proteins interferieren. Da die unterschiedlichen
DR-Matrizen ein gemeinsames Muster teilen, kann eine generalisierte
Matrix aufgestellt werden. Falls die DR-Restriktion nicht bekannt
ist, kann diese generalisierte Matrix zu Rate gezogen werden.
-
Beispiel 6
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Identifizierung von kritischen
Resten einer immunogenen Region durch Screening mit einer T-Zell-Klon
Bibliothek
-
Interessanterweise
stimulierte das Peptid mit der Sequenz 71-TAYKEFRVVELDPSAKI-87 von SakSTAR
9 von 10 aus Spendern isolierte T-Zell-Klone, was promiskuitive
Eigenschaften vermuten lässt.
Um für
jeden einzelnen T-Zell-Klon das minimale Epitop zu bestimmen, wurden
SakSTAR Peptidderivate der Region (71–87), jedes mit einer unterschiedlichen
einzelnen Alaninsubstitution, in T-Zell- Proliferationsassays verwendet. Eine
repräsentative
Auswahl ist in 2 gezeigt.
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Eine
Alaninsubstitution an den Positionen F76, R77, V78 oder E80 verhinderte
die Proliferation der Mehrzahl der für die Region (71–87) spezifischen
T-Zell-Klone. Das Entfernen der Seitenkette von K74 oder D82 durch
Mutation zu einem Alaninrest beeinflusste die proliferativen Eigenschaften
von ungefähr
der Hälfte der
für die
Region (71–87)
spezifischen T-Zell-Klone, während
für eine
Minderheit eine Sensitivität
gegenüber einer
Alaninsubstitution der Reste Y73, E75, V79, L81 oder P83 gefunden
wurde.
-
Beispiel 7
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Analyse einer
immunogenen Region durch Computeranalyse
-
Die
Proliferation von T-Lymphozyten erfordert sowohl richtige Peptidpräsentation
als auch T-Zell-Rezeptorerkennung.
Folglich können
T-Zell-Assays alleine innerhalb eines Peptids nicht zwischen HLA-DR
bindenden und Rezeptor-zugewandten Resten unterscheiden. Um die
molekulare Basis dieser Uneindeutigkeit zu entwirren, wurde ein
Computermodellierungsansatz verwendet, der mit den verfügbaren HLA-DR1
Röntgenkoordinaten
startete (Brown et al., 1993). Die verlängerte immunogene SakSTAR Sequenz
67-ALDATAYKEFRVVELDPSAKIEV-89
wurde als 11mer Peptide, jedes um einen einzelnen Rest verschoben,
durch die HLA-DR1 Peptidbindungsfurche gefädelt. Die Atome der Hauptketten
von sowohl HLA-DR als auch dem Peptid wurden fixiert, während alle
Seitenketten unter Verwendung des Dead-End Elimination Theorems
in die globale Minimumenergiekonformation gesetzt wurden (Desmet
et al., 1992). Modelle im Zusammenhang mit den anderen Haplotypen
ergaben im wesentlichen dieselben Ergebnisse. Für jedes Peptid wurde die Interaktionsenergie
mit der Furche berechnet und ist in 3a dargestellt.
-
Es
wurden zwei stark bindende Sequenzen AYKEFRVVELD (S1; SakSTAR Reste
72–82)
und EFRVVELDPSA (S2; SakSTAR Reste 75–85) identifiziert (3a;
schwarze Balken), wobei der zweite Rest beider Sequenzen in Tasche
1 von HLA-DR platziert wurde. Ein typisches Modell des S2 Peptids
innerhalb der Bindungsfurche ist in 3b gezeigt.
-
Das
Ausmaß von
sowohl der Lösungsmittelexposition
als auch dem Vergrabensein von jedem Rest des S1 und S2 Peptids
in der HLA-DR Furche ist in den 4c bzw. 4f gezeigt. Die große Bindungstasche 1 beinhaltet
einen aromatischen Rest Y73 (in S1) oder F76 (in S2) der vergrabene
aromatische Kontakte ausbildet. Tasche 4 wird entweder mit einem
aromatischen F76 (in S1) oder einem hydrophoben Rest V79 (in S2) ausgefüllt, während die
hydrophoben Reste V78 (in S1) und L81 (in S2) in Tasche 6 weisen.
Obwohl beide Reste V79 (in S1) und D82 (in S2) ihre Seitenkette
in Tasche 7 vergraben, ist der Beitrag zu der Interaktionsenergie
von S2 über
Rest 71 der HLA-DR β Kette,
welche in den meisten Haplotypen ein Arginin ist, mehr elektrostatischer
Natur. Der entsprechende Beitrag von L81 (in S1) zu der Kontaktfläche von
Tasche 9 ist für
das S2 Peptid, in dem ein Serin gefunden wird, weniger offensichtlich.
Ferner lassen diese Beobachtungen vermuten, dass, während die
vergrabenden Peptidreste hauptsächlich
zu der HLA-DR Verankerung beitragen, die exponierten Reste sowohl
T-Zell-Rezeptorerkennung als auch die Bindung an HLA-DR vermitteln.
-
Beispiel 8
-
Identifizierung der minimalen
Epitope, die durch die Region (71–87) T-Zell-Klone erkannt werden
-
Um
zu bestätigen,
dass beide vorhergesagte Sequenzen funktionelle T-Zell-Epitope sind,
wurden die minimalen S1 und S2 11mer Sequenzen synthetisiert und
in Proliferationsassays mit Region(71–87)-spezifischen T-Zell-Klonen verwendet.
-
2 zeigt,
dass die Klone Tc-1 bis Tc-6 nach der Reizung mit dem S1 Peptid
aber nicht mit dem S2 Peptid proliferierten. Tc-7 bis Tc-10 erkennen
das S2 Peptid, aber nicht das S1 Peptid. Diese Ergebnisse zeigen
an, dass beide, S1 und S2, funktionelle T-Zell-Epitope sind.
-
Beispiel 9
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In silico
Alanin-Scan immunogener Regionen
-
Der
Beitrag jedes Rests zu der HLA-DR Bindung wurde durch einen in silico
Alanin-Scan für
beide Sequenzen berechnet. Der Scan der S1 Reste zeigte eine Korrelation
zwischen dem Verlust der Interaktionsenergie und dem Ausmaß des Vergrabenseins
in HLA-DR Taschen 1, 4 und 6 (4a, c).
Die Reste E75 oder E80 an den Positionen 3 bzw. 8 der S1 Sequenz
sind nicht tief in der Furche vergraben, es wurde jedoch berechnet,
dass eine Alaninsubstitution zu einem deutlichen Verlust der Interaktionsenergie
führt.
Der größte Kontaktverlust
zwischen dem S1 Peptid und der Furche wurde durch ein Entfernen
der Seitenketten der Reste, die die Taschen 1, 4 oder 9 besetzen
(4b), erhalten. Durch eine Alaninsubstitution der
Reste F76, R77 und L81 an Positionen 1, 2 bzw. 6 im S2 Modus (4d–f)
wurde ein deutlicher Verlust an Interaktionsenergie und ein teilweiser
Verlust der Kontaktfläche
beobachtet. Die Alaninsubstitution in Tasche 7 der S2 Sequenz (D82) zeigte
keinen größeren Kontaktflächenverlust,
es wurde jedoch ein deutlicher Energieverlust gefunden, der möglicherweise
auf die Beseitigung der ionischen Interaktion mit dem Rest R71 der
HLA-DR-β Kette
zurückzuführen ist
(siehe ebenfalls 3b).
-
Beispiel 10
-
Mutagenese der immunogenen
SakSTAR Region 71–87
-
Zusammengenommen
zeigen diese Beobachtungen, dass Mutationen an einer Kombination
von Schlüsselpositionen
zu einer verringerten Immunogenität dieser Sequenz führen. Veränderungen
der wichtigen Verankerungsreste beider Epitope an Aminosäurepositionen
Y73, F76, V78 und L81 zu einem Alanin beseitigten die Fähigkeit
Plasminogen zu aktivieren.
-
Daher
wurden andere Reste die für
die T-Zellproliferation wichtig sind (2) und die
zu der HLA-DR Bindung beitragen, ins Visier genommen (4). Aufgrund ihres zweifachen Beitrages,
einmal bei der DR-Verankerung und im S1 Bindungsmodus dem TCR zugewandt
zu sein, wurden die Reste K74 und E80 ausgewählt. Dieser zweifache Beitrag
wurde im S2 Bindungsmodus ebenfalls für den Rest R77 gefunden. Ferner wurden
gefunden, dass die Reste R77 und E80 in dem S1 bzw. S2 Peptid an
einer wichtigen TCR Erkennungsposition (Tasche 5) lösungsmittelexponiert
sind. Schließlich
wurde D82 aufgrund seines Verankerungsbeitrages im S2 Bindungsmodus
ausgewählt.
-
Die
SakSTAR Mutanten wurden durch „Spliced-overlap-extension"-Polymerase Kettenreaktion (SOE-PCR)
(Horton et al., 1989) unter Verwendung von pMEX. SakSTAR-myc, das
die Wild-Typ SakSTAR Sequenz mit zusätzlichen drei Alaninresten
am Carboxy-Ende gefolgt von einer myc Sequenz (Evan et al., 1985) kodiert,
als Matrize erzeugt. Für
jede Mutante wurde das amplifizierte Produkt gereinigt und in den
pMEX Vektor ligiert (Schlott et al., 1994). Alle Konstrukte wurden
durch die Sequenzierung der gesamten kodierenden Region von SakSTAR-Myc
bestätigt.
-
Die
SakSTAR-Varianten wurden unter Verwendung beschriebener experimenteller
Bedingungen (Collen et al., 1996a) in transformierten E. coli TG1
exprimiert und gereinigt, gefolgt von Größenausschlusschromatographie
unter Verwendung einer Superdex 75 Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Es wurde mittels SDS-PAGE bestätigt,
dass die Reinheit der SakSTAR Varianten mindestens 98% betrug. Es
wurden die folgenden SakSTAR Mutanten hergestellt, SakSTAR (R77A,
E80A), SakSTAR (R77A, E80A, D82A) und SakSTAR (K74Q, R77S, E80S,
D82S). Die spezifische Aktivität
von allen diesen Mutanten betrug zwischen 50% und 100% der von Wild-Typ SakSTAR. Varianten
von Wild-Typ Staphylokinase werden hierin durch die substituierten
Aminosäuren
in Einbuchstabensymbolen gefolgt von ihrer Positionsnummer in der
reifen SakSTAR Sequenz (136 Aminosäuren) und durch die substituierenden
Aminosäuren
in Einbuchstabensymbolen identifiziert.
-
Beispiel 11
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Analyse der Immunogenität der umgestalteten
71–87
Region von SakSTAR
-
Der
S1 und S2 Bindungsmodus der obigen SakSTAR Mutanten wurde in der
HLA-DR Bindungsfurche neu modelliert. Für das S1 Peptid jeder dieser
Varianten wurde ein Verlust von mindestens 15 kcal/mol der Interaktionsenergie
und 40 Å2 der Kontaktfläche gefunden. Für den S2
Abschnitt wurde ein Verlust der Interaktionsenergie von mindestens
10 kcal/mol und über
100 Å2 in der Kontaktfläche gefunden (Daten nicht gezeigt),
was eine verringerte Bindung der mutierten Peptidsequenzen mit HLA-DR
anzeigt.
-
Zusätzlich wurde,
vergleichbar mit 4a, das Gebiet 69–89 der
SakSTAR Varianten durch die Bindungsfurche durchgefädelt, um
die Möglichkeit
neu eingeführter
Epitopen zu analysieren. Bedeutsamerweise wurden in keiner der SakSTAR
Varianten neuen Bindungsmotive. Alle Region(71–87)-spezifischen T-Zell-Klone wurden nach
Reizung mit den oben beschriebenen SakSTAR Mutanten auf ihre Proliferation
getestet und keiner von ihnen zeigte Proliferation. Das war nicht
auf Probleme bei der Präsentation
zurückzuführen, da T-Zell-Klone,
die ein anderes SakSTAR Epitop erkennen, perfekt in der Lage waren,
nach Stimulation mit jeder SakSTAR Variante der Region (71–87) zu
proliferieren.
-
Beispiel 12
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Zelluläre Immunantwort auf die neu
entworfenen Moleküle
-
Die
humanen T-Zellen, die in den funktionellen Assays verwendet wurden,
wurden durch Selektions- und Klonierungsverfahren erhalten. Folglich
stellen sie nur eine Unterauswahl von Region(71–87)-spezifischen T-Zellen
dar. Um zu untersuchen, ob eine neu entworfene Region tatsächlich zu
einem Protein mit reduzierter Immunogenität führt, sollte die zelluläre Immunantwort
auf ein neu entworfenes Protein mit der seines Wildtyp Gegenstücks verglichen
werden.
-
Die überwiegende
Mehrzahl von Menschen erkennt jedoch ebenfalls zusätzliche
immunogene SakSTAR Regionen (die in diesen SakSTAR Varianten nicht
erfasst sind), die ein solches Experiment entwerten würden. Daher
wurden 25 andere gesunde Spender auf SakSTAR Immunoreaktivität untersucht.
PBMCs wurden aufgetaut, vier Mal in 1% humanem Serum-Albumin gewaschen
und mit 1,8 × 106 Zellen/ml in RPMI 1640 ergänzt mit
5% humanem Serum (Biowitthaker, Walkersville, Maryland) und Gentamycin
mit oder ohne SakSTAR-Myc für
10 Tage in einem CO2 Inkubator mit erhöhter Luftfeuchtigkeit
kultiviert. Die nicht-adhärenten Zellen
wurden geerntet und ohne Antigen, mit SakSTAR-Myc oder verschiedenen
Peptiden erneut stimuliert. Für
antigen-präsentierende
Zellen wurden bestrahlte autologe PBMCs unter Verwendung von CD3-M450
Dynabeads (Dynal, Compiégne,
Frankreich) gemäß den Angaben
des Herstellers (FACS Analyse zeigte > 95% Nicht-T-Zellen an) T-Zell-abgereichert.
Die Platten wurden bei 37°C
bei hoher Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 für 5 Tage
inkubiert und für
die letzten 22 bis 24 Stunden mit BrdU gepulsed.
-
Danach
wurden die Zellen geerntet und auf ihren BrdU-Gehalt hin (BrdU ELISA,
Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) analysiert. Durch das
Teilen der OD, die von den PBMCs in Antwort auf ein Antigen/Peptid
erhalten wurde, durch die der Kontrolle mit spontaner Proliferation
(kein Antigen) wurde ein Stimulationsindex berechnet. Ein Wert,
der 3 überstieg,
wurde als positiv angesehen, was die Proliferation von spezifischen
T-Zellen als Antwort auf das bestimmte Antigen/Peptid anzeigt.
-
Eine
zelluläre
Immunantwort auf das SakSTAR Peptid (71–87) wurde in 80% der 20 identifizierten SakSTAR
positiven Spender beobachtet, was seinen immundominanten Charakter
bestätigt.
-
PBMCs
von den 10 Spendern mit der höchsten
Region(71–87)-spezifischen zellulären Antwort
wurden mit SakSTAR-Myc präpariert
und im folgenden mit verschiedenen SakSTAR Peptiden oder Peptiden
mit einer mutierten (71–87)-Region
gereizt, wie in 5 gezeigt.
-
Obwohl
die gesamte zelluläre
Antwort auf die einzelnen alanin-mutierten Peptide verglichen mit
dem Wildtyp Peptid (P ≤ 0,05)
deutlich verringert war, lösten
diese Peptide in mehreren der getesteten Spender eine zelluläre Antwort
aus. Die Peptide mit einem Alanin an Position R77 oder E80 behinderten
die Proliferation der Lymphozyten einer Mehrzahl der getesteten
Spender. Die relative Wichtigkeit dieser Reste wurde ebenfalls in den
Proliferationsassays mit den Region(71–87)-spezifischen T-Zell-Klonen
gefunden.
-
Wenn
SakSTAR-myc präparierte
Lymphozyten jedoch mit den doppelt (R77A, E80A), dreifach (R77A, E80A,
D82A), vierfach (K74Q, R77S, E80S, D82S) oder fünffach (K74A, E75A, R77A, E80A,
D82A) mutierten Peptiden erneut stimuliert wurden, zeigte keiner
der getesteten Spender eine positive zelluläre Immunantwort (P ≤ 0,001). Das
deutet darauf hin, dass in Menschen Region(71–87)-spezifische zirkulierende
T-Lymphozyten (die
durch frühere
Infektionen mit lysogenen Staphylococcus-Stämmen erzeugt worden sind) nicht
länger
in der Lage sind, die mutierte Region 71–87 irgendeiner der SakSTAR
Varianten zu erkennen. Folglich ist ihre Proliferation und die Helferfunktion,
B-Zellen bei der Antikörpererzeugung
zu unterstützen,
beeinträchtigt.
-
Beispiel 13
-
Identifizierung von kritischen
Resten in anderen identifizierten T-Zell Epitopen des SakSTAR Moleküls
-
T-Zell-Klone,
die verschiedene der anderen SakSTAR Epitope (siehe Tabelle I) erkennen,
wurden in einer ähnlichen
Weise wie die Region(71–87)-spezifischen
T-Zell-Klone, die in den vorangehenden Beispielen beschrieben wurden,
analysiert. Die minimalen Sequenzerfordernisse für die meisten SakSTAR-spezifischen T-Zell-Klone
wurden unter Verwendung von Peptiden, von denen jedes eine unterschiedliche
einzelne Alaninsubstitution enthielt, in T-Zell Proliferationsassays
bestimmt. Die Ergebnisse sind in 6 zusammengefasst.
-
Die
T-Zell-Klone, die nach einer Reizung mit dem Peptid 16-SYFEPTGPYLMVNVTGV-32
proliferierten, konnten in zwei Gruppen aufgeteilt werden, 8 T-Zell-Klone
erkannten das Epitop 16–26
und 10 Klone erkannten die SakSTAR Sequenz 23–33. Eine Alaninsubstitution
an Position F18 oder E19 beseitigt die Proliferation von allen isolierten
Region(16–26)-spezifischen
T-Zell-Klonen, wobei die meisten T-Zell-Klone auch nicht länger proliferieren konnten,
wenn Y17 oder Y24 zu einem Alanin mutiert waren. Das Entfernen der Seitenkette
von P20 oder G23 beeinflusste die T-Zell-Proliferation von mehr als der Hälfte dieser
Gruppe von T-Zell-Klonen.
Für alle
isolierten Region(23–33)-spezifischen
T-Zell-Klone wurde gefunden, dass sie gegenüber einer Alaninsubstitution
an den Positionen Y24, M26 oder N28 sensitiv sind, während eine
Alaninsubstitution von T30 oder G31 die Proliferation der Mehrzahl
der isolierten Region(16–26)-spezifischen
T-Zell-Klone aufhob.
-
Basierend
auf diesen Daten kombiniert mit den berechneten Präferenzmatrizen
der Reste wurden mehrere SakSTAR-Mutanten hergestellt: SakSTAR (P20Y,
Y24A), SakSTAR (P20Y, Y24S), SakSTAR (E19D), SakSTAR (Y17L), SakSTAR
(F18L), SakSTAR (F18E), SakSTAR (G22S), SakSTAR (G22S, P23G), SakSTAR (N28S),
und SakSTAR (V29L, L127V). Alle diese SakSTAR Mutanten besaßen ein
verringertes immunogenes Profil für Region(16–32)-spezifische T-Zell-Klone.
-
Es
wurde eine Analyse der 14 T-Zell-Klone, die für das SakSTAR Peptid 56-TKEKIEYYVEWALDATA-72
spezifisch sind, durchgeführt.
Eine Alaninsubstitution der Reste Y62, E65 oder W66 führte zu
dem Verlust der Proliferation der großen Mehrzahl dieser region-spezifischen
T-Zell-Klone. Für
ungefähr
die Hälfte
dieser T-Zell-Klone wurde gefunden, dass sie für die Entfernung der Seitenketten
der Reste E61, Y63, V64, L68 oder D69 sensitiv sind. Basierend auf
diesen Daten kombiniert mit den berechneten Präferenzmatrizen für Reste
wurden mehrere SakSTAR Mutanten erzeugt, alle hatten jedoch ihre
thrombolytische Aktivität
verloren. Die immunogene Region 56–72 von SakSTAR ist Teil des
Aktivierungsepitops, wie von Jespers et al. definiert. Mutation
eines der Reste des Aktivierungsepitops zu den meisten anderen Arten
von Resten erzeugt ein biologisch inaktives Molekül (Jespers
et al (1999)).
-
Neun
T-Zell-Klone, die spezifisch für
das SakSTAR Peptid 106-ITEKGFVVPDLSEHIKN-122 waren, wurden ebenfalls
analysiert. Alaninsubstitution an den Positionen P114, L116, E118
oder H119 beseitigten die Proliferation der Mehrzahl der Region(106–122)-spezifischen
T-Zell-Klone. Die Entfernung der Seitenketten von F111 oder D115
beeinflusste die proliferativen Eigenschaften von ungefähr der Hälfte dieser
T-Zell-Klone.
-
Basierend
auf diesen Daten kombiniert mit den berechneten Präferenzmatrizen
für Reste
wurden mehrere SakSTAR Mutanten hergestellt: SakSTAR (H119A), SakSTAR
(H119S), SakSTAR (V89L, L116Y), SakSTAR (V89L, L116T), SakSTAR (V112T),
SakSTAR (V112S), SakSTAR (D115N) und SakSTAR (E118S). Alle diese
SakSTAR Mutanten besaßen
für Region(106–122)spezifischen
T-Zell-Klone ein deutlich verringertes immunogenes Profil. Obwohl
eine Veränderung
der Position V112 zu Alanin nur auf 11% der Region-spezifischen
T-Zell-Klone eine
Wirkung besaß,
konnten interessanterweise die biologisch aktiven Mutanten SakSTAR
(V112T) und SakSTAR (V112S) in keinem der Region(106–122)-spezifischen
T-Zell-Klone Proliferation
auslösen.
Das war nicht auf die Herstellung (wie durch Sequenzierung bestätigt) oder
die Reinheit der isolierten SakSTAR Mutante zurückzuführen, da die T-Zell-Proliferation
von anderen SakSTAR-spezifischen T-Zell-Klonen unter Verwendung
dieser Mutanten zu der mit Wild-Typ SakSTAR vergleichbar induziert
werden konnte.
-
Die
folgenden kombinatorischen Mutanten wurden hergestellt und isoliert;
SakSTAR (V112T, H119A), SakSTAR (V112T, H119S), SakSTAR (V112T,
E118S, H119S), und SakSTAR (V112T, H119S, K130Y). Diese thrombolytisch
aktiven Mutanten verloren ihre Fähigkeit
bei den Region(106–122)-spezifischen T-Zell-Klonen Proliferation
zu induzieren, was anzeigt, dass die Immunogenität der SakSTAR Region 106–122 beseitigt
wurde.
-
Schließlich wurden
7 T-Zell-Klone, die das SakSTAR Peptid 120-IKNPGFNLITKVVIEKK-136
erkennen, auf ihre minimalen Sequenzerfordernisse hin analysiert.
Alaninsubstitution der Positionen G124, F125, N126 oder L127 beseitigte
die Proliferation der Mehrzahl der Region(120–136)-spezifischen T-Zell-Klone.
Die Entfernung der Seitenketten von I128, T129, K130, V131 oder
V132 beeinflusste die proliferativen Eigenschaften von ungefähr der Hälfte dieser
T-Zell-Klone. Basierend auf diesen Daten kombiniert mit den berechneten Präferenzmatrizen
für Reste
wurden zwei biologisch aktive SakSTAR-Mutanten hergestellt. Die
Mutante SakSTAR (R77E, E134R) wurde in Proliferationsassays unter
Verwendung von mehreren Region(120–136)-spezifischen T-Zell-Klonen
und einigen Region(71–89)-spezifischen
T-Zell-Klonen getestet. Es wurde gefunden, dass diese Mutante die
Proliferation von einigen, aber nicht allen T-Zell-Klonen beider
Spezifitäten
unterstützen
konnte, was anzeigt, dass beide SakSTAR Regionen ein verringertes
immunogenes Profil besitzen. Obwohl die Mutation des Rests K130
zu Alanin im SakSTAR 120–136
Peptid nur auf ungefähr
die Hälfte
der isolierten Region(120–136)-spezifischen
T-Zell-Klone eine Wirkung besaß,
wurde dieser Rest ausgewählt.
Computermodelle ergänzt
durch Präferenzmatrix
der Reste zeigte, dass, wenn innerhalb dieses Epitops ein Y den
Rest K130 ersetzt (GFLITYVVIE),
die Interaktionsenergie zwischen diesem mutierten Epitop und der
HLA-DR Bindungsfurche so hoch ist, dass vorhergesagt wird, dass
die Bindung innerhalb der Furche unmöglich ist. Daher wurde die
Mutante SakSTAR (K130Y) hergestellt, exprimiert und gereinigt und
es wurde gefunden, dass sie eine thrombolytische Aktivität ähnlich der
von Wild-Typ SakSTAR besitzt. Die Region(120–136)-spezifischen T-Zell-Klone wurden mit
dieser SakSTAR Mutante getestet und keiner von diesen konnte proliferieren,
was vermuten lässt,
dass das Epitop nicht länger
funktional war. Daher ist die Mutation des Restes K130 von SakSTAR
zu Y die ultimative Mutation, weil die Präsentation dieser neu entworfenen
Region vollständig
verloren geht.
-
Zusammengenommen
demonstrieren diese Analysen, dass die Immunogenität eines
heterologen Proteins durch die Entfernung funktioneller T-Zell-Epitope
verringert werden kann. Als Konsequenz verringert die Beseitigung
einer Kombination immunogener Regionen die T-Zell-Reaktivität weiter
und verringert daher auch die Gesamt-Immunogenität eines Proteins mit kombinierten
Mutationen. Ferner kann der rationale Ansatz, der funktionelle Assays
mit mathematischen Modellen kombiniert, zu der präzisen Entfernung
von HLA-DR verankernden Resten führen,
was die Präsentation
von T-Zell-Epitopen und das Auslösen
der T-Zell-Reaktivität beeinflusst.
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Literaturnachweise
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