DE69924836T2 - Lipopeptide, die eine zytotoxische t-lymphozytenantwort induzieren, mit mindestens einem epitop einer t-helferzelle, und ihre anwendungen als impfstoff - Google Patents

Lipopeptide, die eine zytotoxische t-lymphozytenantwort induzieren, mit mindestens einem epitop einer t-helferzelle, und ihre anwendungen als impfstoff Download PDF

Info

Publication number
DE69924836T2
DE69924836T2 DE69924836T DE69924836T DE69924836T2 DE 69924836 T2 DE69924836 T2 DE 69924836T2 DE 69924836 T DE69924836 T DE 69924836T DE 69924836 T DE69924836 T DE 69924836T DE 69924836 T2 DE69924836 T2 DE 69924836T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
epitope
lipopeptide
lipopeptides
helper
lipopeptide according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69924836T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69924836D1 (de
Inventor
Anne Frederique LE GAL
Gerard Jean GUILLET
Hanne Gahery-Segard
Helène GRAS-MASSE
Oleg Melnyk
Andre Tartar
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9524959&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69924836(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of DE69924836D1 publication Critical patent/DE69924836D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69924836T2 publication Critical patent/DE69924836T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Lipopeptide, die eine Cytotoxizität von T-Lymphocyten induzieren und wenigstens ein Helfer-T-Epitop umfasst. Sie bezieht sich außerdem auf die Verwendung dieser Lipopeptide als Impfstoff.
  • Es gibt zwei Typen von Immunantworten: die humorale Antwort aufgrund von Antikörpern und die cytotoxische Antwort aufgrund von CD8-positiven T-Lymphocyten.
  • Eine wirksame cytotoxische Antwort erfordert die Präsentation der Antigene gegenüber den cytotoxischen CD8-positiven T-Lymphocyten (CTL) in Verbindung mit den Molekülen der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC), aber auch gegenüber den CD4-positiven Helfer-T-Zellen (HTL) in Verbindung mit den Molekülen der Klasse II des MHC.
  • Die Verwendung von Lipopeptiden für die Induktion einer cytotoxischen Antwort, d.h. die in-vivo-Erzeugung von cytotoxischen T-Lymphocyten, wurde bereits beschrieben. Insbesondere die Anmeldung FR-90 15 870 (Veröffentlichungs-Nr. 2.670.787) (Institut Pasteur de Lille, Institut Pasteur, INSERM) beschreibt Lipopeptide, die aus einem peptidischen Teil, der 10 bis 40 Aminosäuren umfasst, und aus einem lipidischen Teil, der von Fettsäuren oder Steroideinheiten abgeleitet sein kann, bestehen.
  • Diese Lipopeptide zeigen eine große Fähigkeit, eine cytotoxische Antwort zu induzieren. Es wäre jedoch zweckmäßig, wenn man sie in die Lage versetzen könnte, auch eine Helfer-T-Antwort zu induzieren, deren Bedeutung für die Induktion und Aufrechterhaltung der cytotoxischen Antwort bekannt ist.
  • Nach Kenntnis der Anmelder hat nur ein Artikel im Namen von Vitiello et al. (1995, J. Clin. Invest., 95, 341–349) die Möglichkeit beschrieben, ein CTL-Epitop und ein Epitop, das eine Helfer-Reaktion induziert (Helfer-T-Epitop oder HTL), auf einem einzigen Lipopeptidmolekül miteinander zu kombinieren.
  • In diesem Artikel ist die Synthese von zwei Lipopeptiden beschrieben. Das erste besteht aus dem Teil 18-27 des Kerns des Hepatitis-B-Virus als CTL-Epitop, dem Teil 830-843 des Tetanustoxins als Helfer-T-Epitop und zwei Palmitoylketten. Die Autoren beobachten die Induktion einer T-Lymphocyten-Cytotoxizität.
  • Das zweite Lipopeptid besteht aus dem Epitop NP 147-155 des Mäuseinfluenzavirus, einem Helfer-T-Epitop und Lipidketten.
  • Die in diesem Artikel beschriebenen Lipopeptide haben jedoch aufgrund der Anwesenheit von einerseits des Lipidteils und andererseits von hydrophoben Peptidmotiven eine schlechte Löslichkeit. Dazu ist anzumerken, dass die von diesen Autoren beschriebenen Produkte in Stammlösungen in konzentriertem DMSO aufbewahrt und für die Injektion kurz vor der Verwendung in einer gepufferten wässrigen Lösung verdünnt werden.
  • Wegen dieser starken Hydrophobie ist die Herstellung von Lösungen dieser Lipopeptide schwierig, und dadurch sind die Möglichkeiten der Sterilfiltration, die aufgrund ihrer leichten Durchführbarkeit das allgemein verwendete Sterilisationsverfahren ist, erheblich eingeschränkt. Die Hydrophobie schränkt außerdem jede Charakterisierungsmöglichkeit stark ein.
  • Das zu lösende Problem bestand also darin, die Hydrophobie der Multi-Epitop-Lipopeptide zu reduzieren und gleichzeitig die Zugänglichkeit für die Prozessierung, die zur Weiterleitung des CTL-Epitop-Motivs zum MHC der Klasse I notwendig ist, aufrechtzuerhalten.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, dieses Problem zu lösen.
  • Die Erfinder haben jetzt herausgefunden, dass es möglich ist, nicht nur die Hydrophilie von Lipopeptidmolekülen zu erhöhen, sondern auch Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Epitopen einzuschränken, indem man hydrophile Aminosäuresequenzen, die Spacer genannt werden, in diese Moleküle einführt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind also Lipopeptide, die wenigstens ein Helfer-T-Epitop, wenigstens ein CTL-Epitop und wenigstens einen Lipidrest umfassen und dadurch gekennzeichnet sind, dass die Epitope und der Lipidteil einerseits und die Epitope andererseits unabhängig durch Aminosäuresequenzen, die Spacer genannt werden, voneinander getrennt sind, wobei wenigstens einer der Spacer Verkettungen von 1 bis 10 Aminosäuren umfasst, die aus den Aminosäuren Glycin, Arginin, Glutaminsäure und Asparaginsäure ausgewählt sind. Diese Verkettungen von Aminosäuren, die in neutralem Milieu eine Nettoladung tragen, gewährleisten die Hydrophilie des Lipopeptids.
  • Vorzugsweise sind die Spacer einer proteolytischen Prozessierung durch das Proteasom zugänglich, die der Freisetzung des CTL-Epitop-Motivs vorausgeht. Diese Zugänglichkeit kann nachgewiesen werden, wie es von Ossendorp et al. (1996, Immunity, 5, 115–124) beschrieben ist.
  • Vorzugsweise umfassen die Spacer 2 bis 4 Aminosäuren, wobei die Zahl der Aminosäuren ausreicht, um Spacer zu erhalten, die in neutralem Milieu eine Nettoladung tragen. Vorzugsweise umfasst wenigstens einer der Spacer Arginin- und/oder Glycinreste. Die Argininreste haben den Vorteil, bei physiologischen pH-Werten geladen zu sein und Stellen mit einer besonderen Empfindlichkeit gegenüber proteolytischer Spaltung bei der Prozessierung der Epitope zu schaffen.
  • Die Glycinreste haben den Vorteil, dass sie die Einführung einer möglichen Stelle für eine konvergente Synthese durch Fragmentkopplung ermöglichen.
  • Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist wenigstens einer der Spacer eine der folgenden Sequenzen auf:
    Gly-Arg oder Arg-Gly-Arg.
  • Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure haben ebenfalls interessante Eigenschaften, die für die Realisierung von Spacern gemäß der vorliegenden Erfindung anwendbar sind (Zugang zum natürlichen proteolytischen Abbau und Einführung von dissoziierten Carboxylatfunktionen in physiologischem Milieu bei neutralem pH-Wert).
  • Diese Aminosäuren, die in der Sequenz der Spacer enthalten sind, können vorteilhafterweise durch ihre Derivate oder durch andere, funktionell äquivalente Aminosäuren ersetzt werden.
  • Diese Aminosäuren können innerhalb der Spacer durch Aminosäuren voneinander getrennt sein, die unter chemischen Gesichtspunkten wenig sperrig sind, d.h. kurze Seitenketten aufweisen; dies kann neben Glycin auch Alanin sein. Die Anwesenheit dieser Aminosäuren mit kurzer Kette erleichtert die Proteolyse.
  • Ein Cysteinrest oder eine mit einer Thiolgruppe funktionalisierte Alkylkette, die eine mögliche Stelle für eine einfache chemische Verknüpfung zwischen zwei Peptidfragmenten aufgrund der Bildung von nichtpeptidischen kovalenten Bindungen liefern kann, kann ebenfalls in den Spacer eingeführt werden. So ist es möglich, eine Disulfidbindung zwischen zwei verschiedenen Peptiden, die jeweils eine Thiolfunktion umfassen, oder eine Thioetherbindung zu schaffen; in letzterem Fall muss eines der beiden Peptide durch ein Alkylhalogenid funktionalisiert sein.
  • Die beiden Peptide können auch durch die Bildung eines Thiazolidin-Heterocyclus miteinander verbunden sein, wenn eines der Peptide eine Aldehydfunktion mitbringt. Diese Aldehydfunktion kann leicht und selektiv in Form einer alpha-Oxyacylgruppe erzeugt werden, die durch Periodat-Oxidation eines Serin-, Threonin- oder Cysteinrests erhalten wird, der in N-terminaler Position eines Peptidfragments eingeführt ist.
  • Es ist auch möglich, die beiden Peptide miteinander zu verbinden, indem man sich die Reaktivität von Aldehyden gegenüber schwachen Basen oder Verknüpfungsverfahren über die Bildung eines Oxims (durch Reaktion zwischen einer Aldehydfunktion und einer Aminooxyacetylfunktion) oder eines Hydrazons (durch Reaktion zwischen einer Aldehydfunktion und einem Hydrazid oder Arylhydrazin) zunutze macht. Diese Basenreaktionen sind in der Übersicht von James Tam und Jane Spetzler zusammengefasst (Biomed. Pep., Prot. and Nucleic Acids (1995), 1, 123–132).
  • Eine Verknüpfungsmethode, die darin besteht, eine Hydrazonbindung ausgehend von einem Alkylhydrazin (erzeugt durch N-Aminierung eines Amin-Vorläufers) und einem Partner, der durch eine alpha-Oxoacylgruppe funktionalisiert ist, zu erzeugen, wurde vor kurzem entwickelt.
  • Die Hydrazinopeptide werden durch N-Aminierung nach Klinguer et al. synthetisiert (Tet. Lett. (1996), 37, 7259–7262). Diese Methode erlaubt es, eine beliebige Aminfunktion des Peptids in eine Hydrazinfunktion umzuwandeln. So kann sich die Hydrazinfunktion in N-terminaler Position oder auf der Seitenkette einer Aminosäure an irgendeinem Ort der Sequenz befinden. Die umgewandelte Aminfunktion kann eine alpha-Aminfunktion, eine epsilon-Aminfunktion eines Lysinrests oder von Aminocapronsäure, eine delta-Aminfunktion eines Ornithinrests oder jede andere primäre oder sekundäre Aminfunktion sein.
  • Die Aldehydpeptide werden so erzeugt, wie es von Tam und Spetzler beschrieben wurde (Biomed. Pep., Prot. and Nucleic Acids (1995), 1, 123–132). Die Serin-, Threonin- oder Cysteinreste, die die Vorläufer der alpha-Oxoacylgruppe bilden, können sich in N-terminaler Position oder auf jeder Aminfunktion einer Seitenkette befinden, solange diese Reste sich nicht in N-terminaler Position in den betrachteten Epitopen befinden.
  • Die Lipidgruppe kann ohne Unterschied vom Hydrazinopeptid oder vom Aldehydpeptid getragen werden.
  • Zum Verständnis der vorliegenden Erfindung: Unter "Helfer-T-Epitop" wird eine Aminosäuresequenz verstanden, die sich an wenigstens einen HLA-Rezeptor der Klasse II binden kann.
  • Unter "CTL-Epitop" wird eine Aminosäuresequenz verstanden, die sich an wenigstens einen HLA-Rezeptor der Klasse I binden kann.
  • Die Heifer-T-Epitope, die sich an mehrere verschiedene HLA-Rezeptoren der Klasse II binden können, werden mehrwertige Helfer-Epitope (mehrwertige HTL) genannt.
  • Die Lipopeptide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen vorzugsweise die Verkettung
    • – eines Lipidteils,
    • – eines ersten Spacers,
    • – eines Helfer-T-Epitops,
    • – eines zweiten Spacers und
    • – eines CTL-Epitops.
  • Sie können auch
    • – einen Lipidteil,
    • – einen ersten Spacer,
    • – ein Helfer-T-Epitop,
    • – einen zweiten Spacer,
    • – ein CTL-Epitop,
    • – einen dritten Spacer und
    • – ein zweites CTL-Epitop
    umfassen.
  • Die verschiedenen Helfer- und CTL-Epitope können in unterschiedlicher Reihenfolge in der Verkettung von Aminosäuren vorhanden sein. So kann sich ein Helfer-Epitop zwischen zwei CTL-Epitopen befinden, von denen es durch zwei Spacer getrennt ist.
  • Der Lipidteil des Lipopeptids wird vorteilhafterweise durch Addition eines Lipidmotivs auf eine alpha-Aminofunktion eines Peptids oder auf eine reaktive Funktion der Seitenkette einer Aminosäure des Peptidteils, wie einer epsilon-Amino- oder Thiolfunktion, erhalten. Sie kann eine oder mehrere Ketten, die von gegebenenfalls verzweigten oder ungesättigten C10- bis C20-Fettsäuren abgeleitet sind, oder ein Derivat eines Steroids umfassen.
  • Vorteilhafterweise umfasst der Lipidteil wenigstens zwei Ketten, die von C10- bis C20-Fettsäuren oder -Fettalkoholen abgeleitet sind, die auch untereinander mittels einer oder mehrerer Aminosäuren verknüpft sind. So kann der Lipidteil aus zwei Palmitinsäureketten bestehen, die mit der alpha- bzw. epsilon-NH2-Gruppe eines Lysinrests verknüpft sind.
  • Der Lipidteil kann auch aus einem Palmitinsäure-, Oleinsäure-, Linoleinsäure-, Linolensäure-, 2-Aminohexadecansäure-, Pimelautid- oder Trimexautidrest bestehen oder diese umfassen.
  • Der nichtlipidische Teil umfasst 15 bis 100 und vorzugsweise 15 bis 50 Aminosäuren. Die Zahl der Aminosäuren hängt von der Zahl der Epitope, die den nichtlipidischen Teil des Lipopeptids bilden, und ihrer Größe ab.
  • Vorteilhafterweise ist das Helfer-T-Epitop ein Epitop, das sich an mehrere verschiedene HLA-Rezeptoren der Klasse II binden kann, d.h. ein mehrwertiges Epitop. Es handelt sich vorzugsweise um das Helfer-Epitop, das aus dem Peptid 830-843 des Tetanustoxins mit der folgenden Sequenz besteht:
    QYIKANSFIGITE
  • Der Glutaminrest (Q) dieser Sequenz kann gegebenenfalls acetyliert sein.
  • Andere mehrwertige HTL-Epitope können das mehrwertige Epitop von Hämagglutinin (Prevost-Blondel et al. 1995, J. Virol., Vol. 62, Nr. 12, Seite 8046–8055) oder auch das PADRE-Epitop (Alexander et al., 1994, Immunity, 1, 751) sein.
  • Das CTL-Epitop kann jedes Epitop sein, das cytotoxische CD8-positive T-Lymphocyten aktivieren kann.
  • Es ist vorzugsweise ein CTL-Epitop eines Proteins, das von einer Tumorzelle und insbesondere von einem Melanom präsentiert wird, eines Proteins von HIV, des Hepatitis-B-Virus (HBV) oder des Papillomvirus oder aber des Proteins p53.
  • Es kann insbesondere eines der folgenden Epitope sein:
    • – Epitope des Proteins BCR-ABL, das aus der BCR-Abelson-Translokation (chronische myeloide Leukämie) resultiert, wie sie in Tabelle 1 erwähnt sind.
    • – Epitope des Proteins p53, wie diejenigen, die in Tabelle 2 erwähnt sind.
  • Die Epitope des Proteins p53 können außerdem aus den Sequenzen 25-35, 63-73, 129-156, 149-156, 187-205, 187-234, 226-264 oder 249-264 dieses Proteins genommen werden.
    • – Epitope der Proteine E6 oder E7 des humanen Papillomvirus (HPV), wie diejenigen, die in Tabelle 3 erwähnt sind.
    • – Epitope von Proteinen des Virus HIV-1, wie diejenigen, die in Tabelle 4 erwähnt sind.
    • – Epitome von Melanomen oder anderen Tumoren, wie diejenigen, die in den Tabellen 5, 6 und 7 erwähnt sind, und insbesondere Epitope des Melan-A/Mart-1-Antigens von Melanomen.
  • Andere mehrwertige CTL-Epitope, die die Fähigkeit zur Verbindung mit HLA der Klasse I aufweisen, können diejenigen sein, die im Peptid 43-57 von HPV (GQAEPDRAHNIVTF) enthalten sind, das die Epitope HLA A2, A24, B7 und B18 enthält.
  • Die CTL-Epitope können auch solche von Parasiten-Antigenen sein, insbesondere solche eines Proteins des intrahepatocytären Stadiums von Plasmodium falciparum.
  • Die Verbindung zwischen dem Lipidteil und dem nichtlipidischen Teil erfolgt vorzugsweise über die ε-NH2-Gruppe der ersten Aminosäure des nichtlipidischen Teils. Sie kann jedoch auch mit jedem anderen Mittel und insbesondere über die α-NH2-Gruppe eines Lysinrests durchgeführt werden.
  • Die Lipopeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können den zu behandelnden Patienten, insbesondere den zu impfenden Personen, verdünnt in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel einem physiologisch annehmbaren Puffer, verabreicht werden. Sie können jedoch auch in eine galenische Form gebracht werden, die mit einer parenteralen, sublingualen, intrapulmonalen oder transdermalen Verabreichung verträglich ist.
  • Sie können in jeder Verabreichungsweise verabreicht werden, die eine effiziente Wirkung erlaubt. Diese Verabreichungsweise wird in Abhängigkeit von der zu behandelnden Krankheit gewählt. Die Lipopeptide können unter anderem insbesondere durch Injektion oder auf sublingualem Weg verabreicht werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also die Verwendung dieser Lipopeptide für die Herstellung eines Medikaments oder eines Impfstoffs, präventiv oder kurativ, für die Induktion einer spezifischen Immunantwort und insbesondere für die Induktion einer Immunantwort gegenüber Krebserkrankungen, wie Melanom, die Viren HIV und HBV, Papillomviren, p53 oder Malaria.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine pharmakologisch aktive Menge eines oder mehrerer der oben beschriebenen Lipopeptide sowie pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen enthält.
  • Schließlich sei noch angemerkt, dass die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen CTL-Epitope selbst Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der vorliegenden Ansprüche erläutert, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
  • 1 zeigt die Erkennung von Monopalmitoyl- und Dipalmitoyl-Lipopeptiden gemäß der Erfindung, die das Epitop Mart 27-35 umfassen, durch eine Linie von für dieses Epitop spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten in einem Elispot-Interferon-gamma(IFN-γ)-Test.
  • Die 2A und 2B zeigen die Erkennung der für 1 genannten Lipopeptide durch zwei Klone von Lymphocyten, die Melanome infiltrieren, LT8 bzw. LT12, welche spezifisch für das Epitop Mart 27-35 sind.
  • 3 zeigt die Induktion einer Helfer-T-Aktivität durch das Peptid TT 830-843, das einen Bestandteil der Lipopeptide gemäß der Erfindung bildet.
  • 3a: Sekretion von Interferon-γ durch die Zellen von Lymphknoten von HLA-A2-transgenen Mäusen, denen Folgendes injiziert wurde:
    • (A) NaCl-Puffer;
    • (B) Mp-MART-Lipopeptid;
    • (C) Dp-MART-Lipopeptid.
  • 3b: Proliferation der Zellen der Lymphknoten von HLA-A2-transgenen Mäusen als Reaktion auf dieselben Antigene.
  • 4 zeigt die Induktion der Sekretion von Interferon-γ durch die Zellen der Lymphknoten von HLA-A2-transgenen Mäusen als Reaktion auf:
    • (a) Gemisch der Peptide MART 27-35 und TT 830-845;
    • (b) Mp-MART-Lipopeptid;
    • (c) Dp-MART-Lipopeptid.
  • 5 zeigt die Formel eines Lipopeptids, das eine Hydrazonbindung umfasst.
  • 6 zeigt die Antigenität der HIV-Epitope und ihrer entsprechenden Lipopeptide.
  • PBMC von Patienten, die HIV-seropositiv sind, wurden mit den ausgewählten Peptiden (ausgefüllte Balken) oder den entsprechenden Lipopeptiden (punktierte Balken) inkubiert. Die Aktivierung von spezifischen CTL wurde unter Verwendung des für Interferon-γ spezifischen ELISPOT-Tests verfolgt. Die jedem Patienten zugeordneten Codes und ihr HLA-Typ sind angegeben. Die Daten geben zwei unabhängige Experimente wieder.
  • 7 zeigt die Immunogenität der Epitope, die auf HLA-A2 und HLA-A3 beschränkt sind, und die entsprechenden Lipopeptide.
    • (a) Die angegebenen Peptide oder Lipopeptide wurden HLA-A2-transgenen Mäusen injiziert. Vor der Injektion an der Schwanzbasis wurden die Peptide mit dem Helfer-T-Epitop TT 830-843 gemischt und in Freunds unvollständigem Adjuvans emulgiert; gleichzeitig wurden die Lipopeptide mit physiologischem Puffer verdünnt. Die Produktion von spezifischem CTL wurde nach der Inkubation der Zellen der Lymphknoten mit Targetzellen des Typs Jurkat-A2 KB, die in Anwesenheit (punktierter Balken) oder Abwesenheit (ausgefüllter Balken) des angegebenen CTL-Epitops vorinkubiert worden waren, mit Hilfe des für Interferon-γ spezifischen ELISPOT-Tests bestimmt.
    • (b) Die angegebenen Peptide oder Lipopeptide wurden HLA-A3-transgenen Mäusen an der Schwanzbasis Injiziert. Die Produktion von spezifischem CTL wurde nach der Inkubation der Zellen der Lymphknoten mit EBV-Targetzellen, die HLA-A3 exprimieren und in Anwesenheit (punktierter Balken) oder Abwesenheit (ausgefüllter Balken) des Epitops NEF 73-81 von HIV vorinkubiert worden waren, mit Hilfe des für Interferon-γ spezifischen ELISPOT-Tests bestimmt.
  • Die angegebenen Ergebnisse geben drei unabhängige Experimente wieder.
  • 8 zeigt die Notwendigkeit eines Helfer-T-Epitops des Typs TT 830-843 für die CTL-Induktion.
    • (a) Monopalmitoyl-Lipopeptide, die das CTL-Epitop POL 476-484 von HIV umfassen und denen das Helfer-T-Epitop TT 830-843 fehlt (lipo POL1) oder nicht (lipo TT-POL1), wurden mit einem physiologischen Puffer verdünnt und an der Schwanzbasis von HLA-A2-transgenen Mäusen injiziert. Die Ergebnisse geben zwei unabhängige Experimente wieder.
    • (b) Zellen von Lymphknoten von Mäusen, die mit dem Monopalmitoyl-Lipopeptid TT-POL1 oder dem Monopalmitoyl-Lipopeptid TT 830-843, emulgiert in Freunds unvollständigem Adjuvans, immunisiert wurden oder denen nur Freunds unvollständiges Adjuvans injiziert wurde, wurden 72 Stunden lang in Anwesenheit (punktierter Balken) oder Abwesenheit (ausgefüllter Balken) von 30 μg/ml des Helfer-T-Epitops TT 830-843 cokultiviert.
  • Die Zellproliferation wurde durch Messung des Einbaus von 3H-Thymidin verfolgt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert der Radioaktivität (CPM) der Kulturen (3 Näpfe pro Punkt) von wenigstens drei Experimenten ausgedrückt.
  • Beispiel 1: Synthese von dipalmitoylierten Lipopeptiden mit und ohne Spacer und ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften
  • 1. Synthese der Lipopeptide
  • Die Reihe der folgenden drei Lipopeptide wurde synthetisiert.
  • Lipopeptid Nr. 1
    • Pam-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-AAA-AAGIGILTV
  • Lipopeptid Nr. 2
    • Pam-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
  • Lipopeptid Nr. 3
    • Pam-K(Pam)-GR-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
  • Diese Lipopeptide umfassen ein Lipidende, das aus zwei Palmitoylresten (Pam) besteht, die mit der NH2-Gruppe eines Lysinrests verknüpft sind, das Helfer-Epitop des Tetanustoxins (Peptid 830-843) und ein CTL-Epitop, das in mart-1 vom Rezeptor HLA A2.1 erkannt wird. Das von Vitiello et al. (oben zitiert) beschriebene Epitop Hbc 18-27 wird ebenfalls von HLA A2.1 erkannt und weist eine ähnliche Hydrophobie auf wie das Motiv, das aus der vorgenannten Reihe von Lipopeptiden gewählt wurde.
  • Der Unterschied liegt in den Aminosäuresequenzen, die einerseits zwischen dem Lipidteil und dem Helfer-Epitop und andererseits zwischen dem Helfer-Epitop und dem CTL-Epitop enthalten sind. Diese Reihe wurde realisiert, um die Möglichkeit zu bewerten, Produkte, die unter Bezugnahme auf das Produkt nach Vitiello definiert sind und wie dieses zwei Palmitoyl-Ketten umfassen, in gereinigter und charakterisierbarer Form zu erhalten; die beiden Spacer von Vitiello werden für den einen oder die beiden Spacer gemäß der vorliegenden Erfindung reproduziert oder modifiziert.
  • Im Lipopeptid Nr. 1 sind diese Sequenzen mit denjenigen des von Vitiello et al. beschriebenen Lipopeptids identisch. Zwei Serinreste sind zwischen dem Lipidteil und dem Helfer-Epitop eingesetzt. Drei Alaninreste sind zwischen dem Helfer-Epitop und dem CTL-Epitop platziert.
  • Das Lipopeptid Nr. 2 umfasst die Sequenzen SS (Seryl-Seryl) und Arg-Gly-Arg.
  • Das Lipopeptid Nr. 3 ist gemäß der vorliegenden Erfindung aufgebaut und umfasst hydrophile Spacer, die die Sequenz Gly-Arg bzw. Arg-Gly-Arg aufweisen.
  • Die Synthese wurde gemäß den "Standard"-Verfahren realisiert, die bei der von Merrifield beschriebenen Festphasensynthese gemäß der Boc-Benzyl-Strategie verwendet werden (1963, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154; 1986, Science 232, 341–347). Die Einführung eines Di-Boc-Lysinrests in N-terminaler Position ermöglicht nach der Entfernung der Schutzgruppe vom Peptidylrest die gleichzeitige Einführung der beiden Palmitoylketten, wobei man das erwartete Derivat erhält.
  • 2. Reinigung und physikalisch-chemische Eigenschaften der Lipopeptide
  • Das Lipopeptid Nr. 1 ist in Wasser oder in einem DMSO/Wasser-Gemisch (10 Vol.-%) praktisch unlöslich. Es erweist sich aufgrund der Bildung von Aggregaten als durch HPLC gemäß hochauflösenden Verfahren nicht zu reinigen und nicht zu charakterisieren. Die Identität dieses Lipopeptids konnte durch Messung seiner Masse durch PDMS-TOF-Spektrometrie am rohen Produkt unmittelbar nach der terminalen Spaltung durch Fluorwasserstoffsäure und vor der Lyophilisierung bestätigt werden. Das Produkt wird nach der Lyophilisierung in Wasser völlig unlöslich.
  • Die Messung der Masse des Lipopeptids Nr. 2 durch PDMS-TOF-Spektrometrie ist möglich und bestätigt, dass das erwartete Produkt auch erhalten wurde. Dennoch nimmt dieses Produkt in Wasser ein ähnliches Verhalten wie Lipopeptid Nr. 1 an und kann daher nicht korrekt analysiert werden.
  • Lipopeptid Nr. 3 ist in Essigsäure zu 80% löslich. Es kann auf einem Mikrofilter von 0,22 μm sterilfiltriert werden. Es kann außerdem in einer DMSO/Wasser-Lösung (10 Vol.-%) gelöst werden. Die Messung der Masse durch PDMS-TOF-Spektrometrie bestätigt die Anwesenheit des erwarteten Produkts. Es erweist sich, dass das Produkt nach der Injektion einer konzentrierten Lösung in DMSO auf eine Vydac-C4-Säule bei 60°C unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten in Gegenwart des Gegenions TFA gereinigt werden kann. Das Produkt ist gemäß mehreren herkömmlichen hochauflösenden Verfahren durch HPLC auf Säulen mit Vydac C4, Zorbax C3, Zorbax CN, Zorbax C1 bei 60°C mit Hilfe von Acetonitrilgradienten in Gegenwart eines TFA-Gegenions oder isokratisch unter Verwendung eines organischen Modifikators, wie Isopropanol oder Butanol, charakterisierbar.
  • Das Trifluoracetat des Lipopeptids Nr. 3 ist in DMSO (20–25 mg/ml) löslich und bleibt nach Verdünnung durch Wasser (DMSO 10%) löslich. Der Austausch des Gegenions Trifluoracetat gegen ein Acetat-Gegenion kann durch RP-HPLC auf einer C4-Säule erfolgen: Das in 80% DMSO gelöste Produkt wird auf die mit Lösungsmittel A (5% Essigsäure in Wasser) äquilibrierte Säule injiziert. Nach der Entfernung der nicht zurückgehaltenen Produkte (TFA-Gegenionen, Salze) wird das Produkt mit Hilfe eines Gradienten von Lösungsmittel A zu Lösungsmittel B (80% Acetonitrii/5% Essigsäure/15% Wasser) eluiert.
  • Das Acetat weist eine Löslichkeit auf, die mit der des Trifluoracetats vergleichbar ist. Es wurde verwendet, um transgene Mäuse, die HLA-A2 exprimieren, zu immunisieren, und erwies sich als in der Lage, in Abwesenheit eines Immunisierungsadjuvans eine befriedigende CTL-Antwort zu induzieren.
  • Diese Ergebnisse zeigen also, dass der Einschub des hydrophilen Spacers zwischen dem Lipidteil und dem Helfer-Epitop einerseits und zwischen dem Helfer-Epitop und dem CTL-Epitop andererseits es erlaubt, das Lipopeptid löslich zu machen, was nicht der Fall ist, wenn die Aminosäuresequenzen verschieden sind.
  • Beispiel 2: Synthese von monopalmitoylierten Lipopeptiden gemäß der Erfindung und ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften
  • Eine zweite Reihe von Lipopeptiden wurde realisiert, um die Möglichkeit zu bewerten, Produkte, die diesmal nur eine Palmitoyl-Kette umfassen, in gereinigter und charakterisierbarer Form zu erhalten; der eingesetzte zentrale Spacer wird gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt (-RGR- für Arginyl-Glycyl-Arginyl), während der Spacer -SS- (Seryl-Seryl) von Vitiello für den einen oder die beiden Spacer gemäß der vorliegenden Erfindung beibehalten oder ersetzt wird.
  • Die Einführung eines alpha-Fmoc-epsilon-Boc-Lysins erlaubt nach der selektiven Entfernung der Boc-Schutzgruppe die Einführung einer einzigen Palmitoylkette, wobei man das folgende Produkt erhält:
  • Lipopeptid Nr. 4
    • H-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
  • Dieses Produkt erweist sich als schwierig zu reinigen. Es ist in wässrigem Medium nur in Gegenwart von DMSO löslich. Ein chromatographisches Profil kann durch RP-HPLC nur auf einer Säule des Typs C1 unter Verwendung eines "Standard"-Lösungsmittelsystems (Acetonitril/Wasser/Trifluoressigsäure) gemäß einem Verfahren mit geringer Auflösung erhalten werden, das es nicht erlaubt, die wahre Reinheit des Produkts zu garantieren.
  • Das folgende Lipopeptid Nr. 5 wurde synthetisiert.
  • Lipopeptid Nr. 5
    • H-K(Pam)-GR-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
  • Dieses Produkt wurde wie das Lipopeptid Nr. 4 durch selektive Acylierung der epsilon-NH2-Funktion des N-terminalen Lysinrests erhalten.
  • Dieses Lipopeptid Nr. 5 genügt dem Kriterium der klassischen Reinigung und Charakterisierung.
  • Dieser Vergleich zwischen den Lipopeptiden Nr. 4 und Nr. 5, die Monopalmitoyl-Lipopeptide sind, bestätigt die Ergebnisse, die für die Dipalmitoyl-Lipopeptide erhalten wurden.
  • Die Lipopeptide 3 und 5 waren die einzigen, die den definierten Kriterien genügten (Zugänglichkeit gegenüber einem Reinigungsverfahren und gegenüber Kriterien der hohen analytischen Auflösung). Ihre Untersuchung wurde anhand der Untersuchung ihrer Erkennung durch verschiedene Zelltypen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung findet man in Beispiel 3.
  • Beispiel 3: Biologische Aktivität von Dipalmitoyl- und Monopalmitoyl-Lipopeptiden gemäß der Erfindung, die ein Melanom-CTL-Epitop enthalten
  • Das Dipalmitoyl-Lipopeptid Nr. 3 und das Monopalmitoyl-Lipopeptid Nr. 5, die so synthetisiert wurden, wie es in Beispiel 1 bzw. 2 angegeben ist, wurden getestet.
  • 1.) Untersuchung der Erkennung der Mono- und Dipalm-Mart-27-35-Lipopeptide durch eine Linie von für MART 27-35 spezifischen humanen cytotoxischen T-Lymphocyten in einem Elispot-Interferon-γ(IFN-γ)-Test.
  • a) Materialien und Methoden:
  • Die Linie L28.3 von für MART 27-35 spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten wurde ausgehend von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von einem gesunden HLA-A2-positiven Spender erhalten. Die Vorschrift für die Induktion dieser Effektorzellen ausgehend von PBMC eines naiven Spenders wurde von Ostankovitch et al. beschrieben (Int. J. Cancer, 1997, 72, 987–994).
  • Methode des Elispot-Tests:
  • In diesem Test sind die Targetzellen autologe unstimulierte (naive) PBMC.
  • 50 μl/Napf Maus-Anti-Human-IFNγ-Antikörper, verdünnt in PBS-Puffer in einer Konzentration von 4 μg/ml, werden über Nacht bei 4°C in 96-Napf-Platten mit Nitrocelluloseboden in einer feuchten Kammer inkubiert.
  • Die PBMC werden aufgetaut, während 1 Stunde in RPMI-Medium, das 10% AB-Humanserum (SAB) enthält, bei 37°C in einer Atmosphäre, die 5% CO2 enthält, ruhen gelassen. Anschließend werden sie über Nacht mit den zu testenden Peptiden in unterschiedlichen Konzentrationen (10, 5 und 1 μg/ml) inkubiert.
  • Die Näpfe werden mit PBS gewaschen und dann 2 Stunden lang bei 37°C mit RPMI-Medium, das 10% SAB enthält, gesättigt.
  • Die Effektorzellen werden anschließend auf 96-Napf-Platten verteilt, die zuvor mit dem Anti-IFNγ in einer Menge von 20 000 Zellen pro Napf in 200 μl Endvolumen und in Gegenwart der autologen PBMC, die mit einem Effektor:Target-Verhältnis (E:T) von 1:1 stimuliert wurden, inkubiert wurden. Phytohämagglutinin (PHA) in einer Konzentration von 4 μg/ml und Phorbol-12-myristat-13-acetat(PMA)/Ionomycin (150 bzw. 500 ng/ml) werden als positive Kontrollen verwendet.
  • Nach 20 Stunden Inkubation bei 37°C in einer Atmosphäre, die 5% CO2 enthält, werden die Näpfe fünfmal mit PBS und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen, dann über Nacht bei 4°C mit 100 μl/Napf Kaninchen-Anti-Human-IFNγ- Antikörpern inkubiert, die in RPMI, das 10% SAB enthielt, auf 1/250 verdünnt waren. Die Näpfe werden anschließend fünfmal mit PBS, das 0,05% Tween 20 enthält, gewaschen und dann 2 Stunden lang bei 37°C mit 100 μl biotinylierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin-Antikörpern inkubiert, die in PBS, das 0,05% Tween 20 und 1% BSA (Rinderserumalbumin) enthielt, auf 1/500 verdünnt waren.
  • Die Näpfe werden erneut fünfmal mit PBS-Tween gewaschen und dann 1 Stunde lang bei 37°C mit 100 μl ExtrAvidin/Alkalische Phosphatase inkubiert, das in PBS-Tween-1% BSA auf 1/600 verdünnt war.
  • Nach vier Waschschritten in PBS-Tween werden die Näpfe mit 100 μl chromogenem Substrat (Alkaline phosphatase conjugate substrate kit, Nr. 170-6432, Biorad) inkubiert. Die Näpfe werden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet, bevor man die Ergebnisse mit dem Stereomikroskop ausliest.
  • b) Ergebnisse:
  • 1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.
  • Die beiden MART-27-35-Lipopeptide stimulieren spezifisch die Sekretion von IFNγ durch die Linie der Anti-MART-27-35-CTLs. Sie werden also in einer Weise, die mit dem nominellen Peptid MART 27-35 vergleichbar ist, von den PBMC präsentiert und von den CTLs erkannt.
  • 2) Untersuchung der Erkennung der Mono- und Dipalmitoyl-MART-27-35-Lipopeptide durch zwei Klone von humanen melanominfiltrierenden Lymphocyten, die für MART 27-35 spezifisch sind, durch einen Cytotoxizitätstest durch 51Cr-Freisetzung
  • a) Materialien und Methoden:
  • LT 8 und LT 12 sind zwei HLA-A2-positive Klone, die durch die Restimulierung von melanominfiltrierenden Lymphocyten (TIL), die das Peptid MART 27-35 spezifisch erkennen, erhalten werden.
  • Die in diesem Test verwendeten Targetzellen sind humane HLA-A2-positive Zellen des Typs T2. Diese Zellen besitzen keine Peptidtransporter und präsentieren daher auf ihren freien Molekülen der Klasse I nur die exogenen Peptide.
  • In diesem Test werden die Targetzellen über Nacht mit dem zu testenden Peptid in einer Menge von 4 μg/106 Zellen in einer Atmosphäre, die 5% CO2 enthält, bei 37°C inkubiert. Sie werden anschließend eine Stunde lang bei 37°C mit 100 μCi 51Cr-Natriumchromat inkubiert. Die Targetzellen werden anschließend zweimal mit physiologischem Serum, das 5% fetales Kälberserum (FCS) enthielt, gewaschen, in RPMI-Medium mit 5% FCS aufgenommen und in einer Menge von 3000 oder 5000 Zellen pro Napf in 100 μl auf 96-Napf-Platten verteilt.
  • Die Effektorzellen (LT8 und LT12) wurden anschließend in 100 μl desselben Mediums mit einem Effektor:Target-Verhältnis von 10:1 gegeben.
  • Die während der Inkubation während 4 Stunden bei 37°C erhaltene Chromfreisetzung wurde auf einem Gammazähler gemessen. Der Prozentsatz der Lyse wird durch die folgende Formel bestimmt (R = Freisetzung): % Lyse = (experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung/Gesamtfreisetzung – spontane Freisetzung) × 100
  • b) Ergebnisse:
  • Die 2A und 2B zeigen die erhaltenen Ergebnisse.
  • Die beiden MART-27-35-Lipopeptide, ein Mono- und ein Dipalmitoyl-Lipopeptid, werden von humanen Effektorzellen, die aus Melanomen stammen und spezifisch für das Peptid MART 27-35 sind, erkannt. Diese beiden Typen von Lipopeptiden werden in ähnlicher Weise erkannt, und zwar auf einem Niveau, das mit dem ursprünglichen Peptid (MART 27-35) wenigstens vergleichbar ist, wenn man berücksichtigt, dass die Targetzellen derselben Endkonzentration von Peptiden ausgesetzt wurden, während die Molmasse der Lipopeptide ungefähr fünfmal so groß ist wie die des Peptids MART 27-35.
  • 3. Charakterisierung der "Helfer"-Wirkung des Helfer-T-Epitops TT 830-843.
  • a) Materialien und Methoden:
  • Die A2/Kb-transgenen Mäuse (3 bis 4 pro Gruppe) wurden mit IFA (Freunds unvollständigem Adjuvans) subkutan an der Schwanzbasis und in den Fußballen mit entweder (A) physiologischem Serum oder (B) 200 μg Mp-MART oder (C) 200 μg Dp-MART immunisiert. Die Mäuse wurden 11 Tage später getötet.
  • Ein Test der Proliferation der Zellen der drainierenden Lymphknoten wurde durch drei Tage Kultur in Gegenwart des Peptids TT 830-843 (10 μg/ml) und dann 18 Stunden Einbau von 3H-Thymidin realisiert.
  • Der Überstand wurde nach 36 Stunden Kultur für die Bestimmung von IFNγ durch die ELISA-Methode geerntet.
  • b Ergebnisse:
  • Um die Fähigkeit zur Induktion einer Helfer-T-Antwort durch die Lipopeptid-Konstrukte gemäß der Erfindung zu definieren, wurde die Sekretion von Interferon-γ sowie die Proliferation von Lymphocyten als Reaktion auf das Helfer-T-Epitop TT 830-843 bei Mäusen untersucht, die in Gegenwart von Freunds unvollständigem Adjuvans mit Mp-MART oder Dp-MART immunisiert wurden.
  • Die Ergebnisse sind in 3 angegeben.
  • Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Konstrukt Mp-MART und das Konstrukt Dp-MART (B, C) alle beide eine starke Sekretion von Interferon-γ durch die Zellen der Lymphknoten der transgenen Mäuse des Typs A2/Kb induzieren.
  • Ebenso rufen die Lipopeptide Mp-MART und Dp-MART (B, C) eine starke Lymphocytenproliferation als Reaktion auf das Peptid TT 830-843 hervor.
  • Diese Ergebnisse beweisen, dass das Helfer-T-Epitop TT 830-843 in der Lage ist, bei den A2/Kb-transgenen Mäusen eine Helfer-T-Antwort zu induzieren. Außerdem zeigen diese Ergebnisse auch, dass die kovalente Bindung des Epitops TT 830-843 innerhalb des Lipopeptid-Konstrukts nicht dessen Fähigkeit reduziert, gegenüber T-Zellen präsentiert zu werden.
  • 4) Untersuchung der Adjuvanswirkung des Lipidteils der Lipopeptid-Konstrukte MART 27-35
  • a) Materialien und Methoden:
  • Die A2/Kb-transgenen Mäuse (3 bis 4 pro Gruppe) wurden ohne Adjuvans subkutan an der Schwanzbasis und in den Fußballen mit entweder (A) einem Gemisch des Peptids MART 27-35 (50 μg) und TT 830-843 (140 μg) oder (B) 200 μg Mp-MART (um die Äquimolarität des Peptids MART 27-35 in Bezug auf A zu gewährleisten) oder (C) 200 μg Dp-MART immunisiert. Die Mäuse wurden 11 Tage später getötet.
  • Die Zahl der für MART 27-35 spezifischen CD8-positiven T-Zellen wurde durch einen Ellspot-IFNγ-Test bestimmt, in dessen Verlauf die Zellen antigenpräsentierenden Zellen des Typs Jurkat A2/Kb ausgesetzt wurden, die entweder als negative Kontrolle nicht beladen oder mit dem Peptid MART 27-35 (30 μg/ml) beladen waren. Die Ergebnisse sind als Zahl der Zellen, die IFNγ sezernieren, pro eine Million getesteter Zellen ausgedrückt.
  • b) Ergebnisse:
  • Um die Verwendung der colinearen Lipopeptid-Konstrukte, die das T-cytotoxische Epitop MART 27-35 umfassen, für die menschliche Impfung zu optimieren, wurde die Fähigkeit dieser Lipopeptid-Konstrukte zur Induktion einer Immunisierung in Abwesenheit von exogenem Adjuvans getestet.
  • Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
  • Insbesondere wurde die Immunogenität der beiden colinearen Lipopeptid-Konstrukte, die eine bzw. zwei Palmitoylketten umfassen, getestet. Die Mäuse erhielten eine einzige Injektion in Abwesenheit von Adjuvans mit jedem der Lipopeptide oder auch mit dem Gemisch des Epitops MART 27-35 und TT 830-843, das als Kontrolle verwendet wurde, und dann wurde die Sekretion von Interferon-γ durch die Splenocyten nach einer erneuten Stimulation in vitro mit dem Peptid MART 27-35 gemessen.
  • Die Ergebnisse der 4 weisen darauf hin, dass die colinearen Konstrukte Mp-MART und Dp-MART alle beide in der Lage sind, in vivo eine Antwort von CD8-positiven cytotoxischen Zellen, die für das T-cytotoxische Epitop MART 27-35 spezifisch sind, in Abwesenheit von jedem exogenen Adjuvans, zu induzieren.
  • Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit den Zellen der Lymphknoten erhalten.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die Adjuvanswirkung der colinearen Lipopeptid-Konstrukte gemäß der Erfindung ausreicht, um eine spezifische Immunisierung gegen das T-cytotoxische Epitop in Abwesenheit jeder anderen Adjuvansverbindung zu induzieren.
  • Beispiel 4: Herstellung eines Lipopeptids das eine Hydrazonbindung umfasst
  • Das Hydrazinopeptid und das Aldehydpeptid weisen die folgenden Formeln auf:
    Hydrazinopeptid: K(NH2)ILKEPVHGV-OH/Epitop MHCI-POL HIV-1
    Aldehydpeptid: CHOCO-RTPPAYRPPNAPILK(Pam)-NH2/Epitop MHCII-HBVc
  • Das Aldehydpeptid umfasst das Epitop 128-140 des Kernproteins des Hepatitis-B-Virus (HBVc), wie es von Milich et al. beschrieben wurde (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1610–1614).
  • 16 mg (12 μmol) Hydrazinopeptid und 15 mg (7 μmol) Aldehydpeptid werden in 4 ml Citrat/Phosphat-Puffer, 0,01 M, pH 5,4, und 1 ml DMSO gelöst. Der pH-Wert wird mit 0,2 M Na2HPO4 auf 5,4 eingestellt.
  • Nach 24 h wird das Medium mit 5 ml Essigsäure verdünnt und auf einer C18-Säule (15 × 500 mm) gereinigt. Eluent A: 0,05% TFA in H2O, Eluent B: 0,05% TFA in CH3CN/H2O (80/20). Gradient 0–40% B in 10 min, dann 40–100% B in 60 min. Die reinen Fraktionen werden aufgefangen und lyophilisiert. Es werden 4,9 mg reines Produkt erhalten (Ausbeute 22%).
  • Die Formel des Endprodukts ist in 5 dargestellt.
  • Beispiel 5: Biologische Aktivität der Lipopeptid-Konstrukte gemäß der Erfindung, die verschiedene HIV-Epitope enthalten
  • a) Materialien und Methoden:
  • 1. Peptidsynthese und Charakterisierung
  • Lipopeptide wurden auf einem MBHA-Harz (Applied Biosystems, Foster City, USA) unter Verwendung der klassischen BOC-Benzyl-Strategie (Merrifield, R. B., 1986, Science: Band 232, S. 341 bis 343; Merrifield, R. B., 1963, J. Am. Chem. Soc. Vol. 85: 2149–2154) und 0,33 M 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) in N-Methylpyrrolidinon (NMP) mit einer in-situ-Neutralisation mit Diisopropylethylamin (DIPEA) (Schnolzer et al., 1992, Int. J. Pept. Protein Res., Vol. 40, S. 180–193) in einem automatischen Peptidsynthesizer des Typs Applied Biosystem 430A (Foster City, USA) synthetisiert. Eine doppelte Kopplung wurde systematisch durchgeführt, wobei man vier Äquivalente geschützte Aminosäuren verwendete, und danach erfolgte ein Schritt der systematischen Acetylierung unter Verwendung von Essigsäureanhydrid.
  • Für die Synthese der Dipalmitoylpeptide wurde eine Boc-Lys(Boc)-OH-Gruppe (Senn Chemicals AG, Dielsdorf, CH) am N-terminalen Ende eingebaut: Die Boc-Gruppen wurden gleichzeitig durch klassische Behandlung mit TFA eliminiert. Für die Synthese der Monopalmitoylpeptide wurde eine Boc-Lys(Fmoc)-OH-Gruppe (Senn Chemicals AG, Dielsdorf, CH) am N-terminalen Ende eingebaut, was die Möglichkeit einer selektiven Eliminierung der Fmoc-Gruppe mit 20% Piperidin in NMP bot. Auf jeden Fall wurde eine Palmitoylierung auf einem Harz realisiert, wobei man eine Aktivierung durch HBTU in Gegenwart von DIEA wie oben auf einem ansonsten vollständig geschützten Peptid verwendete. Die Lipopeptide wurden anschließend in einer Teflon-Kel-F-Apparatur (Asti, Courbevoie, Frankreich) durch eine Behandlung mit Fluorwasserstoff von Schutzgruppen befreit und vom Harz abgetrennt (Tam, J. P., 1985, Int. J. Pept. Protein Res., Band 26, S. 262–273): Eine "High-HF"-Vorschrift wurde für die Lipopeptide TT-POL1 und TT-GAG verwendet, ein Protokoll des Typs "Low-High-HF" wurde für die Lipopeptide TT-POL2 und TT-NEF verwendet. Die Lipopeptide wurden während eines Schrittes der Fällung durch kalten Diethylether in 5 ml einer Trifluoressigsäurelösung partiell gereinigt und dann lyophilisiert. Die Reinigungen erfolgten durch mehrere parallele Cyclen von RP-HPLC: Für jeden Cyclus wurden 50 bis 100 mg rohes Lipopeptid in 2 ml DMSO gelöst, dann in 1 ml Wasser verdünnt, bevor injiziert wurde:
    • – für die Monopalmitoylpeptide auf eine Säule mit den Abmessungen 12,5 mm × 250 mm, beladen mit einer stationären Phase des Typs C18 (0,03, 5 μm) Hyperprep Hypersil und eluiert mit 5 ml/min;
    • – für die Dipalmitoylpeptide auf eine Säule von 12,5 mm × 250 mm, beladen mit C3 (0,03, 5 μm) Zorbax und eluiert mit 4 ml/min.
  • Die Verbindungen wurden bei 60°C mit einem Lösungsmittelsystem von Acetonitril/H2O/0,05% TFA eluiert. Die Homogenität wurde mit Hilfe einer RP-HPLC auf zwei verschiedenen analytischen Säulen (einer Vydac-C18-Säule von 4,6 × 250 und einer C3-Zorbax-Säule von 4,6 × 150 mm) bestätigt: Die Lipopeptide waren zu mehr als 90% rein. Die Charakterisierung der Peptide wurde überprüft, indem man die Aminosäurezusammensetzung nach vollständiger Hydrolyse und die Molmasse durch TOF-PDMS bestimmte (Plasmadesorptions-Massenspektrometrie, Bio-Ion 20, Uppsala, Schweden). Die gemessenen Molmassen waren die Folgenden: Monopalmitoyl-Derivate TT-GAG: [M+H]+ ber. 3534, gef. 3523; TT-NEF: [M+H]+ ber. 4317, gef. 4318, TT-POL1: [M+H]+ ber. 3534, gef. 3535; TT-POL2: [M+H]+ ber. 4142, gef. 4143. Für die Dipalmitoyl-Derivate TT-GAG: [M+H]+ ber. 3763, gef. 3762; TT-NEF: [M+H]+ ber. 4556, gef. 4553; TT-POL1: [M+H]+ ber. 3773, gef. nb; TT-POL2: [M+H]+ ber. 4380, gef. 4378. Alle Verbindungen wurden in Form eines lyophilisierten Pulvers erhalten. Die Monopalmitoyl-Derivate sind in Wasser löslich. Die Dipalmitoyl-Derivate sind in einem Wasser-DMSO-Gemisch löslich. Die Reinigungsausbeuten waren:
    • – für die Monopalmitoyl-Derivate: TT-GAG: 16%, TT-NEF: 28%; TT-POL1: 33%; TT-POL2: 12%;
    • – für die Dipalmitoyl-Derivate: TT-GAG: 16%; TT-NEF: 39%; TT-POL1: 22%; TT-POL2: 4,5%.
  • Die Aminosäuresequenzen der Peptide und Lipopeptide sind in Tabelle 8 aufgeführt.
  • 2. Mäuse und Immunisierung
  • Es wurden HLA-A2-transgene Mäuse verwendet, die die Domänen α1 und α2 des Moleküls HLA-A2 exprimieren (Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med. Vol. 173, S. 1007–1015). Die Domäne α3 der schweren Kette entspricht der Mäusedomäne H-2 Kb. Dieses Merkmal erlaubt es dem CD8-Molekül, das von den CD8-positiven Mäuse-T-Zellen exprimiert wird, mit der syngenen Domäne α3 des Hybrid-MHC-Moleküls der Klasse I wechselzuwirken.
  • HLA-A3-transgene Mäuse wurden ebenfalls verwendet.
  • Alle Peptide und Lipopeptide wurden in einer Kochsalzlösung in Gegenwart von 10% DMSO gelöst. Die Induktion von cytotoxischen T-Zellen bei den HLA-transgenen Mäusen wurde so realisiert, wie es von Sette et al. (1994) beschrieben wurde (J. Immunol. Vol. 153, S. 5586–5592).
  • Kurz gesagt, die CTL-Epitope (50 μmg/Maus) wurden mit dem Helfer-T-Epitop TT 830-843 (140 μm/Maus) gemischt, in Freunds unvollständigem Adjuvans (IFA) emulgiert und an der Schwanzbasis injiziert. Die Lipopeptide wurden allein (150 μm/Maus), verdünnt in einer Kochsalzlösung ohne Freunds unvollständiges Adjuvans (IFA) injiziert. Elf Tage nach der Injektion wurden die Mäuse getötet, und die Splenocyten sowie die Zellen der Lymphknoten (LNC) wurden in einer Menge von 3 × 106/ml in vollständigem Medium in Gegenwart von syngenen, LPS-stimulierten, bestrahlten Lymphoblasten, die mit Peptiden bedeckt waren, als Stimulatorzellen inkubiert. Das vollständige Medium umfasst RPMI-1640-Medium (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), 10% SVF, 2 mM Glutamin, Antibiotika und β2-Mercaptoethanol (5 × 10–5 M). Nach sechs Tagen wurden die Splenocyten und die Zellen der Lymphknoten auf Sekretion von Interferon-γ getestet, und zwar bei den Mäusezellen gemäß der in Beispiel 3 beschriebenen ELISPOT-Technik und bei den humanen PBMC nach der im Folgenden beschriebenen ELISPOT-Technik.
  • 3. ELISPOT-Test mit humanen PBMC
  • HIV-seropositive Spender wurden anhand von Daten, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Restriktion gegenüber Peptiden und Lipopeptiden wohlbekannt sind, in Bezug auf ihre Expression an HLA-Molekülen der Klasse I ausgewählt.
  • Nitrocellulose-Mikroplatten (Millipore, Bedford, MA) wurden über Nacht bei 4°C mit 1 μg/ml eines Anti-human-Interferon-γ-Abfangantikörpers inkubiert, der in einem Carbonat/Hydrogencarbonat-Puffer bei pH 9,6 verdünnt war (100 μl/Napf). Nach fünf Waschvorgängen wurden die Platten 2 Stunden lang bei 37°C mit 200 μl gesättigt und dann gewaschen. Für die Kulturen von humanen Zellen bestand das vollständige Medium aus RPMI 1640, 10% Rinderserumalbumin, 2 mM Glutamin, Antibiotika und β2-Mercaptoethanol (5 × 10–5 M). Für den Test mit dem Peptid wurden PBMC von Patienten direkt in Nitrocellulose-Mikroplatten gegeben (2 × 105 Zellen/Napf) und 24 Stunden lang bei 37°C in Gegenwart von 10 mg/ml des Peptids inkubiert. Für den Lipopeptid-Test wurden die PBMC über Nacht bei 37°C mit Lipopeptiden inkubiert und dann gewaschen und bestrahlt (3000 rad). Diese Zellen wurden als Stimulatorzellen in einer Cokultur (2 × 105 Zellen/Napf) mit syngenen PBMC (Verhältnis 1/1) in Nitrocelluloseplatten während 24 Stunden bei 37°C verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Platten, die die direkte Kultur (Peptid) oder die Cokultur (Lipopeptid) enthielten, gewaschen und 2 Stunden lang bei der Temperatur des Labors in Gegenwart von 100 μl eines biotinylierten monoklonalen Anti-Maus-Interferon-γ-Antikörpers, der in einem PBS-Tween-Puffer (0,05%) auf 1 μg/ml verdünnt war, und Rinderserumalbumin (1%) inkubiert. Nach 5 Waschvorgängen in PBS-Tween (0,05%) wurden die Platten 1 Stunde lang bei der Temperatur des Labors in Gegenwart von Extravidin, das mit Alkalischer Phosphatase markiert (Sigma, Deutschland) und in einem PBS-Tween-Puffer (0,05%) und fetalem Kälberserum (1% FCS) auf 1/5000 verdünnt war, inkubiert. Die Flecken wurden gemäß den Herstellerangaben entwickelt, indem man ein chromogenes konjugiertes Substrat der Alkalischen Phosphatase (Biorad, Hercules, CA) hinzufügte, und die Zellen, die Interferon-γ-positive Flecken bildeten, wurden mit Hilfe einer binokularen Lupe gezählt.
  • 4. Proliferationstest
  • Die extrahierten Zellen der Lymphknoten und Splenocyten wurden in einer Menge von 5·105 Zellen/Napf in 96-Napf-Mikrgplatten in einem Endvolumen von 200 μl vollständigem Medium kultiviert. Die Zellen wurden mit 20 μg/ml eines auf MHC-Moleküle der Klasse II beschränkten CD4-Epitops, des Epitops TT 830-843, stimuliert oder auch nicht. Nach 72 Stunden Kultur bei 37°C wurden die Zellen über Nacht mit 0,25 μCi [3H]-Thymidin (Amersham Life Technology) inkubiert. Die Zellen wurden gewonnen, und der Einbau von [3H]-Thymidin wurde mit einer "Microbetaplate"-Apparatur (Wallac, Turku, Finnland) analysiert.
  • 5. Zellen und monoklonale Antikörper
  • Jurkat-A2-Zellen (J A2/Kb), eine Linie von humanen leukämischen T-Zellen, die mit einem Plasmid transfiziert sind, das das Hybridmolekül HLA-A2/H2Kb codiert (Irvin et al., 1989).
  • Die Lymphoblasten, die verwendet werden, um die Effektorzellen in vitro zu stimulieren, wurden in der folgenden Weise hergestellt: Splenocyten von HLA-A2-transgenen Mäusen wurden mit 25 μg/ml LPS (E, coli) und 7 μg/ml Dextransulfat (Sigma) kultiviert. Nach 72 Stunden bei 37°C wurden die Zellen gewaschen und 2 Stunden lang bei 37°C mit dem CD8-Epitop inkubiert. Die Zellen wurden anschließend bestrahlt (3000 rad), dreimal gewaschen und mit den Effektorzellen cokultiviert.
  • Die monoklonalen Anti-Maus-Interferon-γ-Abfang- und Nachweisantikörper (Klon R4-6A2 bzw. XMG1.2) werden von Pharmingen (San Diego, CA) vertrieben. Die monoklonalen Anti-human-Interferon-γ-Abfang- und Nachweisantikörper (Klon 1-D1K bzw. 7-B6-1-Biotin) werden von Mabtech (Stockholm, Schweden) vertrieben.
  • b) Ergebnisse
  • 1. Antigenität der Peptide und Lipopeptide beim Menschen
  • Die Fähigkeit der ausgewählten Peptide, die die interessierenden Epitope umfassen, zur effektiven Stimulation der spezifischen T-cytotoxischen Lymphocyten von HIV-seropositiven Spendern wurde getestet. Die Aktivierung der epitopspezifischen CTL wurde verfolgt, indem man die Sekretion von Interferon-γ nach Inkubation der PBMC von Patienten mit den Peptiden mit Hilfe des ELISPOT-Tests maß. Wenn festgestellt wurde, dass die Peptide die spezifischen CTL effektiv stimulieren, wurde die Aktivierungsfähigkeit, dieser epitopspezifischen CTL mit entsprechenden Lipopeptiden untersucht, die mit den syngenen PBMC vorinkubiert wurden.
  • Die in 6a vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die CTL des Patienten Z77 (Typ HLA-2, HIV-positiv) die Peptide POL 476-484 und GAG 77-85 erkennen. Die Lipopeptide TT-POL1 und TT-GAG stimulierten diese spezifischen CTL ebenfalls stark. Es konnte kein wesentlicher Unterschied in der Antigenität zwischen den Monopalmitoyl- und Dipalmitoyl-Konstrukten für diese beiden Lipopeptide beobachtet werden. Außerdem auch keine Aktivierung der für POL 346-354 spezifischen CTL bei den PBMC des Patienten Z77, weder mit dem Peptid POL 346-354 noch mit den entsprechenden Lipopeptiden TT-POL2 (Monopalmitoyl- und Dipalmitoyl-Konstrukt). Wie in 6a angegeben ist, erkennen die CTL des HLA-A2-Patienten Z108 dennoch schwach das Epitop 346-354 und stärker die Lipopeptide TT-POL2.
  • Die Ergebnisse der 6b zeigen, dass das Peptid NEF 73-82, ein Epitop, das sich gleichzeitig an die Moleküle HLA-A11 und HLA-A3 heftet und mit diesen Molekülen stabile Komplexe bildet, bei den PBMC der HLA-A11- und HLA-A3-Patienten (Z129 bzw. P48) ebenfalls eine starke spezifische CTL-Antwort induziert. Außerdem induzierte das Monopalmitoyl-Lipopeptid TT-NEF ebenfalls eine starke CTL-Antwort ausgehend von diesen PBMC.
  • Schließlich zeigen die Ergebnisse der 6c, dass alle Peptide, die anhand ihrer Fähigkeit zur Fixierung auf den gereinigten HLA-B35-Molekülen sowie anhand ihrer Fähigkeit zur Bildung von stabilen HLA/Peptid-Komplexen (vgl. 6c) ausgewählt wurden, bei dem HLA-B35-Patienten (P3) stark antigen waren. Die Monopalmitoyl- und Dipalmitoyl-TT-NEF-Lipopeptide, die die Peptide NEF 74-81, NEF 71-79 und NEF 68-76 umfassen, waren bei dem Patienten P3 ebenfalls antigen.
  • Dennoch waren die TT-POL2-Lipopeptide (Monopalmitoyl und Dipalmitoyl), obwohl sie das gut anerkannte Epitop POL-342-350 enthielten, bei den HLA-B35-Patienten nicht antigen.
  • Die Ergebnisse der 6c weisen ebenfalls darauf hin, dass das Peptid NEF 68-76, ein potentielles HLA-B7-Epitop, effektiv eine spezifische CTL-Antwort bei den PBMC des HLA-B7-Patienten Z118 induzierte. Außerdem waren die TT-NEF-Lipopeptide auch bei den HLA-B7-Patienten antigen.
  • Es ist wichtig, zu unterstreichen, dass die Ergebnisse der 6b und 6c zeigen, dass ein multiepitopisches Lipopeptid von Individuen, die verschiedene HLA-Moleküle der Klasse I exprimieren, wirksam erkannt werden kann.
  • Die Gesamtheit dieser Ergebnisse beweist eindeutig, dass die Lipopeptide durch PBMC wirksam transformiert werden können und die epitopspezifischen CTL aktivieren können.
  • 2. Untersuchung der Immunogenität der Peptide und der Lipopeptide bei HLA-A2- und HLA-A3-transgenen Mäusen.
  • Das Ziel dieser Untersuchung bestand darin, zu bestimmen, ob die Lipopeptide bei naiven Organismen, die nie mit einem HIV-Epitop sensibilisiert wurden und keinerlei bereits vorhandene epitopspezifische CTL-Zelle besitzen, die Produktion von spezifischen CTL induzieren können.
  • Die Lipopeptide und Peptide, die die interessierenden Epitope umfassen, wurden transgenen Mäusen injiziert, die die Moleküle HLA-A2 oder HLA-A3 exprimieren. Die Peptide, die T-cytotoxische Epitope tragen, wurden zusammen mit dem Helfer-T-Epitop TT 830-843, emulgiert in Freunds unvollständigem Adjuvans, injiziert.
  • Die Lipopeptide wurden in einer Kochsalzlösung verdünnt und ohne Freunds unvollständiges Adjuvans injiziert. Die Produktion von epitopspezifischen CTL- Zellen bei diesen Mäusen wurde verfolgt, wie im Teil "Materialien und Methoden" angegeben ist.
  • Die Ergebnisse der 7a zeigen, dass die drei auf HLA-A2 beschränkten Epitope, nämlich GAG 77-85, POL 476-484 und POL 346-354, bei HLA-A2-transgenen Mäusen eine schwache spezifische CTL-Antwort induzieren, dass aber die entsprechenden Monopalmitoyl-Lipopeptide in der Lage sind, eine stärkere CTL-Antwort zu induzieren. In allen Fällen induzierten die Dipalmitoyl-Lipopeptide eine schwächere CTL-Antwort als die Monopalmitoyl-Lipopeptide.
  • Die Ergebnisse der 7b weisen darauf hin, dass das Epitop NEF-73-82 bei HLA-A3-transgenen Mäusen eine starke spezifische CTL-Antwort induziert. Außerdem waren die TT-NEF-Monopalmitoyl-Lipopeptide in der Lage, eine ebenso starke CTL-Antwort zu induzieren wie das Epitop NEF 73-82.
  • 3. Untersuchung der Notwendigkeit einer Antwort des Helfer-T-Typs für die Induktion von CTL-Zellen
  • Um die Wichtigkeit des Helfer-T-Effekts bei der Produktion von CTL-Zellen durch die Lipopeptide gemäß der Erfindung zu bestimmen, wurden Monopalmitoyl-Lipopeptide konstruiert, die ein HIV-Epitop umfassen, denen aber das Epitop TT 831-843 fehlt.
  • Die Ergebnisse der 8a zeigen, dass das Lipopeptid POL1, dem das Helfer-T-Epitop fehlt, keinerlei spezifische CTL-Antwort induziert, während das Lipopeptid TT-POL1 in der Lage war, eine viel stärkere spezifische CTL-Antwort zu induzieren. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass das Helfer-T-Peptid notwendig ist, um eine starke CTL-Antwort zu induzieren, wenn die Lipopeptide an der Schwanzbasis von HLA-A2-transgenen Mäusen injiziert werden. Experimente zur Lymphocyten-Proliferation wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Helfer-T-Epitop TT 831-843, das in den Lipopeptiden eingeschlossen ist, in der Lage ist, wirksam eine Helfer-T-Antwort zu induzieren.
  • Die in 8b gezeigten Ergebnisse beweisen, dass die Zellen von Lymphknoten von Mäusen, die mit dem Monopalmitoyl-Lipopeptid TT-POL1 immunisiert wurden, als Reaktion auf die Peptide TT 830-843 genauso stark proliferierten wie die Zellen von Lymphknoten von Mäusen, die mit dem Helfer-T-Epitop TT 830-843, emulgiert in Freunds unvollständigem Adjuvans, immunisiert wurden.
  • Diese Ergebnisse beweisen, dass eine Antwort des Helfer-T-Typs notwendig ist, um eine starke spezifische CTL-Antwort zu erhalten, und dass die Helfer-T-Antwort durch das Helfer-T-Epitop induziert wird, das in den colinearen Lipopeptidkonstrukten enthalten ist.
  • Tabelle 1: Epitope von BCR-ABL
    Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Tabelle 1: Epitope von BCR-ABL
    Figure 00350001
  • Tabelle 2 – Epitope von p53
    Figure 00360001
  • Tabelle 3
    Figure 00370001
  • Tabelle 4: Epitope des Virus HIV-1
    Figure 00380001
  • Tabelle 4: Epitope des Virus HIV-1 (Fortsetzung,
    Figure 00390001
  • Tabelle 4: Epitope des Virus HIV-1 (Fortsetzung)
    Figure 00400001
  • Tabelle 4: Epitope des Virus HIV-1
    Figure 00410001
  • Tabelle 4: Epitope des Virus HIV-1
    Figure 00420001
  • Tabelle 5: Epitope des humanen Melanoms
    Figure 00430001
  • Tabelle 6: Epitope von Tumoren, die aus Mutationen resultieren
    Figure 00440001
  • Tabelle 7 Verschiedenen Tumoren gemeinsame Antigene
    Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Literatur zu Tabelle 8
    • • CULMANN-PENCIOLELLI, B., S. LAMHAMEDI-CHERRADI, I. COUILLIN, N. GUEGAN, J. P. LEVY, J. G. GUILLET, and E. GOMARD. 1994. Identification of multirestricted immunodominant regions recognized by cytolytic T lymphocytes in the human immunodeficiency virus type 1 Nef protein [published erratum appears in J. Virol. 1995 Jan: 69 (1): 618]. J. Virol. 68: p7336–43.
    • • HARRER, E., T. HARRER, P. BARBOSA, M. FEINBERG, R. P. JOHNSON, S. BUCHBINDER, and B. D. WALKER. 1996. Recognition of the highly conserved YMDD region in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase by HLA-A2- restricted cytotoxic T lymphocytes from an asymptomatic long-term nonprogressor. J. Infect Dis. 173: p476–9.
    • • LUCCHIARI-HARTZ, M., M. BAUER, G. NIEDERMANN, B. MAIER, A. MEYERHANS, and K. ELCHMANN. 1996: Human immune response to HIV-1 Nef. II. Induction of HIV-1/HIV-2 Nef cross-reactive cytotoxic T lymphocytes in peripheral blood lymphocytes of non-infected healthy individuals. Int Immunol. 8: p577–84.
    • • ROWLAND-JONES, S., J. SUTTON, K. ARIYOSHI, T. DONG, F. GOTCH, S. McADAM, D. WHITBY, S. SABALLY, A. GALLIMORE, T. CORRAH et al. 1995. HIV specific cytotoxic T-cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women. Nat Med. 1: 59–64.
    • • TSOMIDES, T. J. B. D. WALKER, and. H. N. EISEN. 1991. An optimal viral peptide recognized by CD8+ T cells binds very tightly to the restricting class I major histocompatibility complex protein on intact cells but not to the purified class I protein. Proc. Natl Acad. Sci USA. 88: p11276–80.
    • • WALKER, B. D. C. FLEXNER, K. BIRCH-LINIBERGER, L. FISHER, T. J. PARADIS, A. ALDOVINI, R. YOUNG, B. MOSS, and R. T.SCHOOLEY. 1989. Long-term culture and fine specifity of human cytotoxic T-lymphocyte clones reactive with human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl acad Sci USA. 86: p9514–8.

Claims (21)

  1. Lipopeptid, das wenigstens ein Helfer-T-Epitop, wenigstens ein CTL-Epitop und wenigstens einen Lipidrest umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Epitope und der Lipidteil einerseits und die Epitope andererseits unabhängig durch Aminosäuresequenzen, die Spacer genannt werden, voneinander getrennt sind, wobei wenigstens einer der Spacer Verkettungen von 1 bis 10 Aminosäuren umfasst, die aus den Aminosäuren Glycin, Arginin, Glutaminsäure und Asparaginsäure ausgewählt sind.
  2. Lipopeptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Spacer zwischen 1 und 10 Glycin- und/oder Argininreste umfasst.
  3. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Spacer eine der folgenden Sequenzen aufweist: Gly-Arg oder Arg-Gly-Arg.
  4. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Spacer einen oder mehrere Glutaminsäure- und/oder Asparaginsäurereste umfasst.
  5. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spacer einen Cysteinrest oder eine durch eine Thiolgruppe funktionalisierte Alkylkette und nichtpeptidische Bindungen beinhaltet.
  6. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spacer eine Gruppe umfassen, die aus einer Thiazolidin-, Oxim- oder Hydrazongruppe ausgewählt ist.
  7. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verkettung – eines Lipidteils, – eines ersten Spacers, – eines Helfer-T-Epitops, – eines zweiten Spacers und – eines CTL-Epitops umfasst.
  8. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verkettung – eines Lipidteils, – eines ersten Spacers, – eines Helfer-T-Epitops, – eines zweiten Spacers, – eines ersten CTL-Epitops, – eines dritten Spacers und – eines zweiten CTL-Epitops, umfasst.
  9. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Lipidteil eine oder mehrere Ketten, die von linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten C10- bis C20-Fettsäuren oder -Fettalkoholen abgeleitet sind, oder ein Steroidderivat umfasst.
  10. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Lipidteil wenigstens zwei Ketten umfasst, die von C10- bis C20-Fettsäuren oder -Fettalkoholen abgeleitet sind und durch eine oder mehrere Aminosäuren miteinander verbunden sind.
  11. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Lipidteil aus zwei Palmitinsäureketten besteht, die mit den NH2-Gruppen eines Lysinrests verbunden sind.
  12. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Lipidteil eine oder mehrere Ketten umfasst, die aus Palmitinsäure, Oleinsäure, Linolsäure, Linolensäure, 2-Aminohexadecansäure, Pimelautid oder Trimexautid ausgewählt sind.
  13. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Nichtlipidteil zwischen 15 und 100 Aminosäuren umfasst.
  14. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Helfer-T-Epitop ein mehrwertiges Epitop ist.
  15. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Helfer-T-Epitop um das Peptid 830-843 des Tetanustoxins mit der folgenden Sequenz handelt: QYIKANSKFIGITE
  16. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Helfer-T-Epitop um das Epitop des Hämagglutinins des Influenzavirus oder das Epitop PADRE handelt.
  17. Lipopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens ein CTL-Epitop eines spezifischen Melanomproteins, eines Proteins von HIV, HBV, Papillomvirus, eines p53-Proteins oder eines Proteins des intrahepatocytären Stadiums von Plasmodium falciparum enthält.
  18. Verwendung eines Lipopeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments oder eines Impfstoffs für die Induktion einer spezifischen Immunantwort.
  19. Verwendung eines Lipopeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments für die Induktion einer Immunantwort gegen HIV, HBV, Papillomvirus, Melanom-p53 oder Malaria.
  20. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine pharmakologisch wirksame Dosis eines oder mehrerer Lipopeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 und pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen enthält.
  21. Medikament oder Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass es bzw. er ein oder mehrere Lipopeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält.
DE69924836T 1998-04-07 1999-04-06 Lipopeptide, die eine zytotoxische t-lymphozytenantwort induzieren, mit mindestens einem epitop einer t-helferzelle, und ihre anwendungen als impfstoff Expired - Lifetime DE69924836T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9804323A FR2776926B1 (fr) 1998-04-07 1998-04-07 Lipopeptides inducteurs de cytotoxicite t lymphocytaire portant au moins un epitope t auxiliaire, et leurs utilisations pour la vaccination
FR9804323 1998-04-07
PCT/FR1999/000792 WO1999051630A1 (fr) 1998-04-07 1999-04-06 Lipopeptides inducteurs de cytotoxicite t lymphocytaire portant au moins un epitope t auxiliaire, et leurs utilisations pour la vaccination

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69924836D1 DE69924836D1 (de) 2005-05-25
DE69924836T2 true DE69924836T2 (de) 2006-02-23

Family

ID=9524959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69924836T Expired - Lifetime DE69924836T2 (de) 1998-04-07 1999-04-06 Lipopeptide, die eine zytotoxische t-lymphozytenantwort induzieren, mit mindestens einem epitop einer t-helferzelle, und ihre anwendungen als impfstoff

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1068226B1 (de)
JP (1) JP2002512941A (de)
AT (1) ATE293639T1 (de)
AU (1) AU3041399A (de)
CA (1) CA2328294A1 (de)
DE (1) DE69924836T2 (de)
ES (1) ES2242387T3 (de)
FR (1) FR2776926B1 (de)
HK (1) HK1038569A1 (de)
WO (1) WO1999051630A1 (de)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9915074D0 (en) * 1999-06-28 1999-08-25 Cortecs Plc Ligand-binding composition
WO2001041797A2 (en) * 1999-12-09 2001-06-14 Institut Pasteur Systemic immune response induced by mucosal administration of l ipid-tailed polypeptides without adjuvant
ES2424131T3 (es) * 2001-03-27 2013-09-27 Oncothyreon Inc. Vacuna para modular respuestas inmunitarias entre T1 y T2
EP1614695A4 (de) * 2003-03-31 2006-10-04 Hayashibara Biochem Lab Polypeptid
TWI395591B (zh) 2004-04-01 2013-05-11 Oncothyreon Inc 黏液性糖蛋白（ｍｕｃ-１）疫苗
BRPI0613510A2 (pt) 2005-06-28 2011-01-11 Biomira Inc processo de tratamento de pacientes com uma vacina de glicoproteìna mucinosa (muc-1)
US8889616B2 (en) 2011-02-24 2014-11-18 Oncothyreon Inc. MUC1 based glycolipopeptide vaccine with adjuvant
FR3008099B1 (fr) 2013-07-05 2020-08-07 Commissariat Energie Atomique Peptides immunogenes de l'antigene tumoral cycline b1
FR3090319A1 (fr) 2018-12-21 2020-06-26 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Melanges d’epitopes t cd8+ immunogenes de la cycline b1
FR3091651A1 (fr) 2019-01-11 2020-07-17 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Peptides immunogènes issus de la nucléoprotéine du virus ebola zaïre
FR3096894A1 (fr) 2019-06-06 2020-12-11 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Melanges d’epitopes t cd8 immunogènes du virus ebola

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1238343B (it) * 1989-10-16 1993-07-13 Cesalpino Andrea Fond Procedimento per la preparazione di vaccini capaci di generare non solo la risposta immune dei linfociti t helper,ma anche un'efficace risposta di linfociti t citotossici,e vaccini con queste caratteristiche
FR2670787B1 (fr) * 1990-12-18 1995-06-23 Pasteur Institut Lipopeptides inducteurs des lymphocytes t cytotoxiques et utilisation comme vaccins.
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6419931B1 (en) * 1991-08-26 2002-07-16 Epimmune Inc. Compositions and methods for eliciting CTL immunity
GB2271995A (en) * 1992-10-15 1994-05-04 Merck & Co Inc HIV peptide conjugated via anionic spacer to protein

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002512941A (ja) 2002-05-08
FR2776926A1 (fr) 1999-10-08
AU3041399A (en) 1999-10-25
DE69924836D1 (de) 2005-05-25
ES2242387T3 (es) 2005-11-01
EP1068226A1 (de) 2001-01-17
HK1038569A1 (en) 2002-03-22
ATE293639T1 (de) 2005-05-15
EP1068226B1 (de) 2005-04-20
CA2328294A1 (fr) 1999-10-14
FR2776926B1 (fr) 2003-10-24
WO1999051630A1 (fr) 1999-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69834574T2 (de) Miscmicellen aus lipopeptiden für induzierung einer immunantwort
DE69533594T2 (de) Präparate und verfahren zum auslösen von ctl-immunität
DE69733352T2 (de) Hla-a2.1 bindende peptide und deren verwendung
DE69518642T3 (de) Peptide zur induktion von immunantwort durch zytotoxischen t lymphocyten gegen das virus von hepatitis c
US4943628A (en) HIV peptide-inducted T cell stimulation
ES2318848T3 (es) Peptidos que se unen a pan dr para potenciar la respuesta inmunitaria.
DE69838486T2 (de) Hiv-1 tat oder deren derivate für prophylaktische und therapeutische impfung
DE69131882T3 (de) Asiloglycoproteine des hepatitis c-virus
DE69433007T2 (de) Peptide zum induzieren einer antwort der zytotoxischen t-lymphozyten gerichtet gegen das hepatitis b virus
JP3650110B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスに対する細胞毒性ｔリンパ球応答を誘発するためのペプチド
DE69924836T2 (de) Lipopeptide, die eine zytotoxische t-lymphozytenantwort induzieren, mit mindestens einem epitop einer t-helferzelle, und ihre anwendungen als impfstoff
DE69130071T3 (de) Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches mittel gegen chronische virale leberkrankheiten
JPH05500517A (ja) 後天性免疫不全症候群の予防および治療
DE69233607T2 (de) Peptide, die die zytotoxische T-Lymphozyte Antwort gegen Hepatitis-B-Virus induzieren
JPH08505625A (ja) 細胞毒性ｔリンパ球応答の誘導
DE69133242T2 (de) Peptide zur verwendung in impfung und anregung von antikörperbildung gegen menschliches immunschwäche virus
DE69728289T2 (de) Immunreaktive ctl-peptidepitope von humanem cytomegalovirus
AU775560B2 (en) Anti-HIV 1 vaccine comprising the entire or part of the TAT HIV-1 protein
AU765164B2 (en) T helper cell epitopes
JPH05500653A (ja) リウマチ様関節炎の処置法
US20050049197A1 (en) Induction of immune response against desired determinants
DE60221805T2 (de) Peptide mit affinität zu gp120, und ihre verwendungen
DE60028248T2 (de) Verfahren zur Reduzierung der Immunogenität von Staphylokinase durch Entfernen von T-Zell-Epitopen
JPH10503473A (ja) 細胞傷害性ｔリンパ球刺激およびｈｃｖ曝露診断用ｃ型肝炎ウイルスコアペプチド
DE60319990T2 (de) Mischung von peptiden aus den proteinen c und ns3 des hepatitis c-virus, und deren verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition