ES2242387T3 - Lipopeptidos induxtores de citotoxicidad t linfocitaria que presentan por lo menos un epitopo t auxiliar, y sus usos parra la vacunacion. - Google Patents

Lipopeptidos induxtores de citotoxicidad t linfocitaria que presentan por lo menos un epitopo t auxiliar, y sus usos parra la vacunacion.

Info

Publication number
ES2242387T3
ES2242387T3 ES99911884T ES99911884T ES2242387T3 ES 2242387 T3 ES2242387 T3 ES 2242387T3 ES 99911884 T ES99911884 T ES 99911884T ES 99911884 T ES99911884 T ES 99911884T ES 2242387 T3 ES2242387 T3 ES 2242387T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
epitope
lipopeptide
auxiliary
lipopeptides
lipopeptide according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES99911884T
Other languages
English (en)
Inventor
Frederique Anne Le Gal
Jean Gerard Guillet
Hanne Gahery-Segard
Helene Gras-Masse
Oleg Melnyk
Andre Tartar
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9524959&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2242387(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Application granted granted Critical
Publication of ES2242387T3 publication Critical patent/ES2242387T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Lipopéptido que comprende al menos un epítopo T auxiliar, al menos un epítopo de CTL y al menos un resto lipídico, caracterizado porque los epítopos y la parte lipídica, por una parte, y los epítopos por otra parte, se separan independientemente mediante secuencias de aminoácidos, denominadas espaciadores, comprendiendo al menos uno de los espaciadores unos encadenamientos de 1 a 10 aminoácidos seleccionados de entre los aminoácidos de glicina, arginina, ácido glutámico y ácido aspártico.

Description

Lipopéptidos inductores de citotoxicidad T linfocitaria que presentan por lo menos un epítopo T auxiliar, y sus usos para la vacunación.
La presente invención se refiere a lipopéptidos inductores de citotoxicidad T linfocitaria, y que comprenden al menos un epítopo T auxiliar. Se refiere asimismo al uso de estos lipopéptidos como vacuna.
Existen dos tipos de respuestas inmunitarias: la respuesta humoral debida a los anticuerpos, y la respuesta citotóxica debida a los linfocitos T CD8^{+}.
Una respuesta citotóxica eficaz requiere la presentación de los antígenos a los linfocitos T citotóxicos CD8^{+} (CTL), en asociación con las moléculas de clase I del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC), pero también a los linfocitos T auxiliares CD4^{+} (HTL) en asociación con las moléculas de clase II del MHC.
Ya se ha descrito el uso de lipopéptidos para la inducción de una respuesta citotóxica, es decir, la generación in vivo de linfocitos T citotóxicos. En particular, la solicitud FR-90.15.870 (publicación 2.670.787) (Instituto Pasteur de Lille, Institut Pasteur, INSERM) describe lipopéptidos constituidos por una parte peptídica, que comprende de 10 a 40 aminoácidos, y por una parte lipídica, que puede derivar de ácidos grasos o de agrupamientos esteroideos.
Estos lipopéptidos muestran una buena capacidad para inducir una respuesta citotóxica. Sin embargo, era conveniente que fueran capaces de inducir igualmente una respuesta T auxiliar, de la que se conoce la importancia para la inducción y el mantenimiento de la respuesta citotóxica.
Según el conocimiento de los solicitantes, sólo un artículo a nombre de VITIELLO et al. (1995, J. Clin. Invest., 95, 341-349) ha evocado la posibilidad de combinar, sobre una misma molécula lipopeptídica, un epítopo CTL y un epítopo que induce una respuesta auxiliar (epítopo T-HELPER o HTL).
En este artículo se describe la síntesis de dos lipopéptidos. El primero está constituido por la parte 18-27 de la envoltura vírica del virus de la hepatitis B, como epítopo CTL, por la parte 830-843 de la toxina tetánica, como epítopo T auxiliar, y por dos cadenas palmitoílicas. Se observa la inducción de una citotoxicidad T linfocitaria.
El segundo lipopéptido está constituido por el epítopo NP 147-155 del virus de la influenza murina, por un epítopo T auxiliar y por cadenas lipídicas.
Sin embargo, los lipopéptidos descritos en este artículo presentan una baja solubilidad, debido a la presencia, por un lado, de la parte lipídica y, por otra parte, de motivos peptídicos hidrófobos. Se observará que los productos descritos por estos autores están almacenados en disoluciones madres en un DMSO concentrado, y se diluyen extemporáneamente en una disolución acuosa tamponada para inyección.
Esta fuerte hidrofobia hace difícil la fabricación de disoluciones de estos lipopéptidos, y por ello limita considerablemente las posibilidades de esterilización mediante filtración, que es el método generalmente utilizado por su facilidad de realización. Además, limita fuertemente cualquier posibilidad de caracterización.
El problema a resolver consistía, por lo tanto, en reducir la hidrofobia de los lipopéptidos de múltiples epítopos, manteniendo la accesibilidad al tratamiento necesario para encaminar el motivo del epítopo CTL hacia el CMH de clase I.
La presente invención tiene por objetivo resolver este problema.
Los inventores han descubierto ahora que es posible no sólo aumentar la hidrofilia de las moléculas lipopeptídicas, sino también limitar interacciones entre los diferentes epítopos, introduciendo secuencias hidrófilas de aminoácidos, denominadas espaciadores, en el seno de estas moléculas.
Por lo tanto, la presente invención tiene por objeto unos lipopéptidos que comprenden al menos un epítopo T auxiliar, al un menos un epítopo de CTL y al menos un resto lipídico, caracterizados porque los epítopos y la parte lipídica por una parte, y los epítopos por otra parte, están separados independientemente por secuencias de aminoácidos, denominadas espaciadores, comprendiendo al menos uno de estos espaciadores enlaces de 1 a 10 aminoácidos seleccionados de entre los aminoácidos glicina, arginina, ácido glutámico y ácido aspártico. Estos enlaces de aminoácidos globalmente cargados en medio neutro, aseguran la hidrofilia del lipopéptido.
Preferentemente, los espaciadores son accesibles a un tratamiento proteolítico mediante proteasoma, anterior a la liberación del motivo del epítopo de CTL. Esta accesibilidad se puede poner en evidencia como se describe por OSSENDORP et al. (1996, Immunity, 5, 115-124).
Preferentemente, los espaciadores comprenden entre 2 y 4 aminoácidos, siendo el número de aminoácidos suficiente para obtener espaciadores globalmente cargados en medio neutro. Preferentemente, al menos uno de los espaciadores comprende argininas y/o glicinas. Las argininas presentan la ventaja de estar cargadas a los pH fisiológicos, y de crear sitios de sensibilidad particular a la ruptura proteolítica durante el tratamiento de los epítopos.
Las glicinas presentan la ventaja de permitir la introducción, en el seno de la parte peptídica del lipopéptido, de un eventual sitio para una síntesis convergente por acoplamiento de fragmento.
Según un modo de realización particularmente ventajoso de la invención, al menos uno de los espaciadores presenta una de las siguientes secuencias:
GLY ARG o ARG GLY ARG.
El ácido glutámico y/o el ácido aspártico presentan igualmente propiedades interesantes, aplicables para la realización de espaciadores según la presente invención (acceso a la degradación proteolítica natural, e introducción de funciones carboxilato ionizadas en medio fisiológico a pH neutro).
Estos aminoácidos, que entran en la secuencia de los espaciadores, se pueden sustituir ventajosamente por sus derivados, o por otros aminoácidos funcionalmente equivalentes.
Estos aminoácidos se pueden separar, en el seno de los espaciadores, mediante aminoácidos poco voluminosos desde el punto de vista químico, es decir, que presentan cadenas laterales cortas, que pueden ser, además de la glicina, la alanina. La presencia de estos aminoácidos de cadena corta facilita la proteolisis.
También, en el espaciador se puede introducir una cisteína, o una cadena de alquilo funcionalizada por un grupo tiol, capaz de preparar un posible sitio de unión química sencilla entre dos fragmentos peptídicos, gracias a la formación de uniones covalentes no peptídicas. Así, es posible realizar una unión disulfuro entre dos péptidos diferentes, que comprenden cada uno una función tiol, o una unión tioéter (en este caso, uno de los dos péptidos debe estar funcionalizado mediante un halogenuro de alquilo).
Los dos péptidos también se pueden unir mediante formación de un heterociclo tiazolidínico, portando uno de los péptidos una función aldehído. Esta función aldehído se puede generar fácil y selectivamente en forma de un agrupamiento alfa-oxoacilo, obtenido mediante oxidación peryódica de una serina, de una treonina o de una cisteína, introducida en posición N-terminal de un fragmento peptídico.
Es posible también asociar los dos péptidos utilizando la reactividad de los aldehídos con bases débiles, o métodos de unión vía la formación de una oxima (mediante reacción entre una función aldehído y una función amino-oxiacetilo), de una hidrazona (mediante reacción entre una función aldehído y una hidrazida o una aril-hidrazina). Estas reacciones básicas se repasan en la revista de James Tam y Jane Spetzler (Biomed. Pep., Prot. And Nucleic Acids (1995), 1, 123-132).
Recientemente, se ha desarrollado un método de unión que consiste en generar una unión de hidrazona a partir de una alquil-hidrazina (generada mediante N-aminación de un precursor de amina) y de una pareja funcionalizada mediante agrupamiento alfa-oxoacilo.
Los hidrazinopéptidos se sintetizan mediante N-aminación según Klinguer et al. (Tet. Lett. (1996), 37, 7259-7262). Esta metodología permite transformar cualquier función amina del péptido en una función hidrazina. Así, la función hidrazina se puede situar en posición N-terminal, o en la cadena lateral de un aminoácido situado en cualquier sitio de la secuencia. La función amina transformada puede ser una función amina alfa-épsilon de una lisina o del ácido aminocaproico, una función delta amino de una ornitina, o cualquier otra función amina primaria o
secundaria.
Los péptidos aldehídicos se generan como se ha descrito por Tam y Spetzler (Biomed. Pep., Prot. And Nucleic Acids (1995), 1, 123-132). Los restos de serina, treonina o cisteína, precursores del agrupamiento alfa-oxoacilo, se pueden situar en posición N-terminal o en cualquier función amina de una cadena lateral desde el momento en el que estos restos no estén presentes en posición N-terminal, en los epítopos considerados.
El agrupamiento lipídico se puede portar indiferentemente por el hidrazinopéptido o el péptido aldehídico.
Por epítopo T auxiliar se entiende, para la comprensión de la presente invención, una secuencia de aminoácidos capaz de asociarse a al menos un receptor HLA de clase II.
Por epítopo de CTL se entiende una secuencia de aminoácidos capaz de asociarse a al menos un receptor HLA de clase I.
Los epítopos T auxiliares capaces de asociarse a varios receptores HLA de clase II diferentes se denominan epítopos auxiliares multivalentes (HTL multivalentes).
Los lipopéptidos según la presente invención comprenden preferentemente el encadenamiento de:
-
una parte lipídica;
-
un primer espaciador;
-
un epítopo T auxiliar;
-
un segundo espaciador; y
-
un epítopo CTL.
También pueden comprender:
-
una parte lipídica;
-
un primer espaciador;
-
un epítopo T auxiliar;
-
un segundo espaciador;
-
un epítopo CTL;
-
un tercer espaciador; y
-
un segundo epítopo CTL.
Los diversos epítopos auxiliares y de CTL pueden estar presentes en distintos órdenes, en el encadenamiento de los aminoácidos. Así, un epítopo auxiliar puede estar comprendido entre dos epítopos de CTL, de los cuales estará separado mediante dos espaciadores.
La parte lipídica del lipopéptido se obtiene ventajosamente mediante adición de un motivo lipídico sobre una función alfa aminada de un péptido, o sobre una función reactiva de la cadena lateral de un aminoácido de la parte peptídica, tal como una función épsilon-amina o tiol. Puede comprender una o varias cadenas derivadas de ácidos grasos de C_{10} a C_{20}, eventualmente ramificadas o insaturadas, o un derivado de un esteroide.
De manera ventajosa, la parte lipídica comprende al menos dos cadenas derivadas de ácidos grasos o de alcoholes grasos de C_{10} a C_{20}, unidas también entre sí mediante uno o varios aminoácidos. Así, la parte lipídica puede estar constituida de dos cadenas de ácido palmítico unidas a los agrupamientos NH_{2}, en alfa y épsilon, de una lisina.
La parte lipídica puede también estar constituida de, o comprender, un resto de ácido palmítico, de ácido oleico, de ácido linoleico, de ácido linolénico, de ácido 2-aminohexadecanoico, de pimelautida o de trimexautida.
La parte no lipídica comprende entre 15 y 100, preferentemente entre 15 y 50, aminoácidos. El número de aminoácidos depende del número de epítopos que constituyen la parte no lipídica del lipopéptido, y de sus tamaños.
De manera ventajosa, el epítopo T auxiliar es un epítopo capaz de asociarse a varios receptores HLA de clase II distintos, es decir, un epítopo multivalente. El epítopo auxiliar está preferentemente constituido por el péptido 830-843 de la toxina tetánica, que presenta la secuencia siguiente:
QYIKANSKFIGITE
La glutamina (Q) de esta secuencia puede estar eventualmente acetilada.
Otros epítopos HTL multivalentes pueden ser el epítopo multivalente de la hemaglutinina (PREVOST-BLONDEL et al., 1995, J. Virol., vol. 62, nº 12, páginas 8046-8055), o también el epítopo PADRE (ALEXANDER et al., 1994, Immunity, 1, 751).
En cuanto al epítopo CTL, puede ser cualquier epítopo capaz de activar linfocitos T citotóxicos CD8^{+}.
Preferentemente, es un epítopo de CTL de una proteína presentada por una célula tumoral y, particularmente, por un melanoma, de una proteína del virus del VIH, del virus de la hepatitis B (VHB) o del papilomavirus, o también de la proteína p53.
En particular, puede ser uno de los epítopos siguientes:
- epítopos de la proteína BCR-ABL, que resulta de la translocación BCR-Abelson (leucemia mieloide crónica), tales como se mencionan en la tabla 1;
- epítopos de la proteína p53, tales como los mencionados en la tabla 2.
Además, los epítopos de la proteína p53 pueden estar recogidos en las secuencias 25-35, 63-73, 129-156, 149-156, 187-205, 187-234, 226-264 ó 249-264 de esta proteína.
- epítopos de las proteínas E_{6} o E_{7} del papilomavirus humano (VPH), tales como los mencionados en la tabla 3,
- epítopos de proteínas del virus del VIH-1, tales como los mencionados en la tabla 4,
- epítopos del melanoma o de otros tumores, tales como los mencionados en las tablas 5, 6 y 7, y en particular epítopos del antígeno melan-A/mart-1 del melanoma.
Otros epítopos de CTL plurivalentes que presentan una capacidad de asociación con HLA de clase I pueden ser los comprendidos en el péptido 43-57 de HPV (GQAEPDRAHNIVTF) que contiene epítopos HLA A2, A24, B7 y B18.
Los epítopos de CTL pueden ser también los de antígenos parasitarios, y en particular los de una proteína del estado intra-hepatocítico de Plasmodium falciparum.
La unión entre la parte lipídica y la parte no lipídica se efectúa preferentemente por medio del agrupamiento \varepsilon-NH_{2} del primer aminoácido de la parte no lipídica. Sin embargo, se puede efectuar por cualquier otro medio, y particularmente mediante el agrupamiento \alpha-NH_{2} de una lisina.
Los lipopéptidos según la presente invención se pueden administrar a los pacientes a tratar, en particular a las personas a vacunar, diluidos en un disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, un tampón fisiológicamente aceptable. Sin embargo, se pueden hacer en forma galénica, compatible con una administración por vía parenteral, sublingual, intrapulmonar o transdérmica.
Se pueden administrar mediante cualquier modo de administración que permita una acción eficaz. Este modo se elegirá en función de la enfermedad a tratar. A título no limitativo, los lipopéptidos se pueden administrar, particularmente, por inyección o por vía sublingual.
Por lo tanto, otro objeto de la presente invención es el uso de estos lipopéptidos para la fabricación de un medicamento o de una vacuna, preventivo o curativo, para la inducción de una respuesta inmunitaria específica y, particularmente, para la inducción de una respuesta inmunitaria contra los cánceres tales como el melanoma, los virus del VIH y del VHB, los papilomavirus, la p53 o la malaria.
La presente invención tiene también por objeto una composición farmacéutica caracterizada porque contiene una cantidad farmacológicamente activa de uno o varios de los lipopéptidos descritos aquí arriba, así como de los excipientes farmacéuticamente compatibles.
Por último, se observará que los epítopos de CTL descritos en la presente solicitud constituyen en sí objetos de la presente invención.
La presente invención se ilustra, sin por lo tanto estar limitada, mediante los siguientes ejemplos.
La figura 1 ilustra el reconocimiento de los lipopéptidos monopalmitoílico y dipalmitoílico según la invención, que comprenden el epítopo Mart 27-35, por medio de una línea de linfocitos T citotóxicos específicos de dicho epítopo, en un ensayo Elispot-interferon gamma (IFN-\gamma).
Las figuras 2A y 2B ilustran el reconocimiento de los lipopéptidos mencionados en la figura 1, por medio de dos clones de linfocitos infiltrantes de melanomas, LT8 y LT12 respectivamente, específicos del epítopo Mart 27-35.
La figura 3 ilustra la inducción de una actividad T auxiliar por el péptido TT 830-843 constitutivo de los lipopéptidos según la invención.
- Figura 3a: Secreción de interferón-\gamma por células de ganglios linfáticos de ratones transgénicos HLA-A2 a los cuales se les ha inyectado:
(A)
Tampón NaCl;
(B)
Lipopéptido Mp-MART;
(C)
Lipopéptido Dp-MART.
- Figura 3b: proliferación de las células de los ganglios linfáticos de ratones transgénicos HLA-A2 en respuesta a los mismos antígenos.
\newpage
La figura 4 ilustra la inducción de la secreción de interferón-\gamma por células de los ganglios linfáticos de ratones transgénicos HLA-A2 en respuesta a:
(a)
mezcla de los péptidos MART 27-35 y TT 830-845;
(b)
lipopéptido Mp-MART;
(c)
lipopéptido Dp-MART.
La figura 5 representa la fórmula de un lipopéptido que comprende una unión hidrazona.
La figura 6 ilustra la antigenicidad de los epítopos de VIH y de sus lipopéptidos correspondientes.
Se incubaron PBMC de pacientes seropositivos por HIV con los péptidos seleccionados (barras llenas) o con los lipopéptidos correspondientes (barras discontinuas). Se siguió la activación de los CTL específicos utilizando el ensayo ELISPOT específico del Interferón-\gamma. Se indican los códigos asignados a cada paciente y su tipo de HLA. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
La figura 7 ilustra la inmunogenicidad de los epítopos restringidos al HLA-A2 y al HLA-A3, y los lipopéptidos correspondientes.
(a)
Los péptidos o lipopéptidos indicados se inyectaron a ratones transgénicos HLA-A2. Antes de la inyección en la base de la cola, los péptidos se mezclaron con el epítopo T auxiliar TT 830-843, y se emulsionaron en un adyuvante incompleto de Freund; simultáneamente, los lipopéptidos se diluyeron en un tampón fisiológico. La producción de CTL específicos se determinó con la ayuda del ensayo ELISPOT específico de Interferón-\gamma, tras incubación de las células de los ganglios linfáticos con células diana de tipo Jurkat-A2 K^{B} preincubadas en presencia (barra discontinua) o en ausencia (barra llena) del epítopo de CTL indicado.
(b)
Los péptidos o los polipéptidos indicados se inyectaron en la base de la cola de ratones transgénicos HLA-A3. La producción de CTL específicos se determinó mediante el ensayo ELISPOT específico de Interferón-\gamma, tras incubación de las células de los ganglios linfáticos con células diana EBV que expresan HLA-A3 preincubadas en presencia (barra discontinua) o en ausencia (barra llena) del epítopo NEF 73-81 del VIH.
Los resultados presentados son representativos de tres experimentos independientes.
La figura 8 ilustra la necesidad de un epítopo T auxiliar de tipo TT-830-843 para la inducción de CTL.
(a)
Lipopéptidos monopalmitoílicos, que comprenden el epítopo de CTL POL 476-484 de VIH, desprovistos (lipo POL 1) o no (lipo TT-POL 1) del epítopo T auxiliar TT 830-843, se diluyeron en un tampón fisiológico, y se inyectaron en la base de la cola de ratones transgénicos HLA-A2. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
(b)
Células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados con el lipopéptido monopalmitoílico TT-POL 1, o el lipopéptido monopalmitoílico TT 830-843 emulsionado en un adyuvante incompleto de Freund, o inyectadas en el adyuvante incompleto de Freund solo, se cocultivaron durante 72 horas en presencia (barra discontinua) o en ausencia (barra llena) de 30 \mug/ml del epítopo T auxiliar TT 830-843.
La proliferación celular se siguió mediante la medida de la incorporación de ^{3}H-timidina. Los resultados se expresan como la media de la radioactividad (cpm) de los cultivos (3 pocillos por punto) de al menos tres experimentos.
Ejemplo 1 Síntesis de lipopéptidos dipalmitoilados con y sin espaciador, y propiedades físico-químicas 1. Síntesis de los lipopéptidos
Se sintetizó la serie de los tres lipopéptidos siguientes.
Lipopéptido nº 1
Pam-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-AAA-AAGIGILTV
Lipopéptido nº 2
Pam-K(Pam)-SS-QYIKANSFKIGITE-RGR-AAGIGILTV
Lipopéptido nº 3
Pam-K(Pam)-GR-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
Estos lipopéptidos comprenden un extremo lipídico, constituido por dos restos palmitoílicos (Pam) unidos al agrupamiento NH_{2} de una lisina, el epítopo auxiliar de la toxina tetánica (peptido 830-843), y un epítopo CTL reconocido en mart-1 por el receptor HLA A2.1. El epítopo Hbc 18-27 descrito por VITIELLO et al. (citado anteriormente) también es reconocido por HLA A2.1, y presenta una hidrofobia similar al motivo elegido en la serie de lipopéptidos citada anteriormente.
La diferencia reside en las secuencias de aminoácidos comprendidas, por una parte, entre la parte lipídica y el epítopo auxiliar, y, por otra parte, entre el epítopo auxiliar y el epítopo de CTL. Esta serie se realizó para evaluar la posibilidad de obtener, en forma purificada y caracterizable, productos definidos por referencia al producto según VITIELLO, y que comprenden, como éste, dos cadenas palmitoílicas; los dos espaciadores de VITIELLO se reproducen o se modifican para uno o los dos espaciadores según la presente invención.
En el lipopéptido nº 1, estas secuencias son idénticas a las del lipopéptido descrito por VITIELLO et al. Se insertan dos serinas entre la parte lipídica y el epítopo auxiliar. Se disponen tres alaninas entre el epítopo auxiliar y el epítopo de CTL.
El lipopéptido nº 2 comprende las secuencias SS (serilo-serilo) y ARG-GLY-ARG.
El lipopéptido nº 3 se construye según la presente invención, y comprende espaciadores hidrófilos que presentan las secuencias GLY-ARG y ARG-GLY-ARG, respectivamente.
La síntesis se realizó según procedimientos "estándares" utilizados en fase sólida, según la estrategia Boc-bencilo descrita por Merrifield (1963 J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; 1986 Science 232, 341-347). La introducción en posición N-terminal de una di-Boc-Lisina permite, tras desproteger la resina peptidílica, la introducción simultánea de las dos cadenas palmitoílicas, para obtener el derivado esperado.
2. Purificación y propiedades físico-químicas de los lipopéptidos
El lipopéptido nº 1 es prácticamente insoluble en agua, o en una mezcla DMSO/agua 10% v/v. No es purificable, no es caracterizable mediante HPLC según métodos resolutivos, debido a la formación de agregados. La identidad de este lipopéptido se ha podido confirmar por medida de la masa mediante espectrometría PDMS-TOF, realizada sobre el producto bruto, inmediatamente tras la ruptura terminal mediante ácido fluorhídrico y antes de la liofilización. El producto se hace totalmente insoluble en agua tras la liofilización.
La medida de la masa por espectrometría PDMS-TOF del lipopéptido nº 2 es posible, y confirma que se ha obtenido perfectamente el producto esperado. Sin embargo, este producto adopta en agua un comportamiento parecido al lipopéptido nº 1, y por lo tanto no se puede analizar correctamente.
El lipopéptido nº 3 es soluble en ácido acético al 80%. Se puede esterilizar mediante filtración sobre un microfiltro de 0,22 \mum. Además, se puede disolver en una disolución de DMSO/agua al 10% v/v. La medida de la masa por espectrometría PDMS-TOF confirma la presencia del producto esperado. El producto se puede purificar tras inyección de una disolución concentrada de DMSO en columna Vydac C4, a 60ºC, utilizando un gradiente de acetonitrilo, en presencia del contra-ión de TFA. El producto se puede caracterizar por HPLC según varios métodos resolutivos convencionales, sobre columnas Vydac C4, Zorbax C3, Zorbax CN, Zorbax C1, a 60ºC, con la ayuda de gradientes de acetonitrilo, en presencia de un contra-ión de TFA, o utilizando un modificador orgánico, tal como isopropanol o butanol en modo isocrático.
El trifluoroacetato del lipopéptido nº 3 es soluble en DMSO (20-25 mg/ml), y sigue siendo soluble tras la dilución con agua (DMSO 10%). El intercambio del contra-ión trifluoroacetato por un contra-ión acetato se puede realizar mediante RP-HPLC sobre una columna C4; el producto disuelto en DMSO al 80% se inyecta sobre la columna equilibrada mediante el disolvente A (ácido acético al 5% en agua). Tras la eliminación de los productos no retenidos (contra-iones de TFA, sales), el producto se eluye con la ayuda de un gradiente del disolvente A hasta el disolvente B (acetonitrilo 80% - ácido acético 5% - agua 15%).
El acetato presenta una solubilidad comparable a la del trifluoroacetato. Se ha utilizado para inmunizar ratones transgénicos que expresan HLA-A2, y se sabe que es capaz de inducir una respuesta CTL satisfactoria en ausencia de adyuvante de inmunización.
Por lo tanto, estos resultados muestran que la inserción de espaciador hidrófilo entre la parte lipídica y el epítopo auxiliar por una parte, y, por otra parte, entre el epítopo auxiliar y el epítopo de CTL, permite solubilizar el lipopéptido, lo que no es el caso cuando las secuencias de aminoácidos son distintas.
Ejemplo 2 Síntesis de lipopéptidos monopalmitoilados según la invención, y propiedades físico-químicas
Se realizó una segunda serie de lipopéptidos para evaluar la posibilidad de obtener, en forma purificada y caracterizable, productos que comprenden esta vez una sola cadena palmitoílica; el espaciador utilizado se introduce según la presente invención (-RGR- por arginil-glicil-arginil-), mientras que el espaciador -SS-(seril-seril-) de VITIELLO se mantiene o se sustituye por uno o los dos espaciadores según la presente invención.
La introducción en posición N-terminal de una alfa-Fmoc-épsilon-Boc-Lisina permite, tras la desprotección selectiva del grupo Boc, la introducción de una sola cadena palmitoílica, para obtener el producto siguiente:
Lipopéptido nº 4
H-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
Este producto es difícilmente purificable. Es soluble en medio acuoso sólo en presencia de DMSO. Se puede obtener un perfil cromatográfico mediante RP-HPLC únicamente sobre una columna de tipo C1 utilizando un sistema disolvente "estándar" (acetonitrilo/agua/ácido trifluoroacético), según un método poco resolutivo, que no permite garantizar la pureza real del producto.
Se ha sintetizado el lipopéptido nº 5 siguiente.
Lipopéptido nº 5
H-K(Pam)-GR-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
Este producto se obtuvo como el lipopéptido nº 4 mediante acilación selectiva de la función épsilon-NH_{2} de la lisina N-terminal.
Este lipopéptido nº 5 satisface el criterio de purificación y de caracterización clásicos.
Esta comparación entre los lipopéptidos nº 4 y nº 5, que son lipopéptidos monopalmitoílicos, confirma los resultados obtenidos sobre los lipopéptidos dipalmitoílicos.
Los lipopéptidos 3 y 5 han sido los únicos en responder a los criterios definidos (acceso a un método de purificación y a criterios analíticos resolutivos). Su estudio se siguió mediante el estudio de su reconocimiento por diversos tipos celulares. Los resultados de este estudio figuran en el ejemplo 3.
Ejemplo 3 Actividad biológica de lipopéptidos dipalmitoílicos y monopalmitoílicos según la invención, que contienen un epítopo de CTL de melanoma
Se ensayaron el lipopéptido dipalmitoílico nº 3 y el lipopéptido monopalmitoílico nº 5, sintetizados como se ha indicado en los ejemplos 1 y 2, respectivamente.
1) Estudio del reconocimiento de los lipopéptidos mono- y dipalm-Mart 27-35 mediante una línea de linfocitos T citotóxicos humanos específicos de MART 27-35 en un ensayo Elispot Interferón-\gamma (IFN-\gamma). a) Materiales y métodos
La línea L28.3 de linfocitos T citotóxicos específicos de MART 27-35 se obtuvo a partir de células mononucleadas de la sangre periférica (PBMC) de donantes sanos HLA-A2^{+}. El protocolo de inducción de estas células efectoras a partir de PBMC de donantes sin tratamiento previo ha sido descrito por Ostankovitch et al. (Int. J. Cancer, 1997, 72, 987-994).
Método del ensayo Elispot
En este ensayo, las células diana son PBMC autólogas no estimuladas (sin tratamiento previo).
Se incuban 50 \mul/pocillo de anticuerpo murino anti-IFN\gamma humano, diluido en un tampón PBS con una concentración de 4 \mug/ml, en placas de 96 pocillos con un fondo de nitrocelulosa, durante la noche a 4ºC en habitación húmeda.
Las PBMC se descongelan, se mantienen en reposo durante 1 hora en un medio RPMI que contiene 10% de suero humano AB (SAB) a 37ºC en una atmósfera que contiene 5% de CO_{2}. Después, se incuban durante una noche con los péptidos a ensayar, con concentraciones distintas (10, 5 y 1 \mug/ml).
Los pocillos se lavan con PBS, y después se saturan con medio RPMI que contiene 10% de SAB, durante 2 horas a 37ºC.
Después, las células efectoras se reparten en las placas de 96 pocillos anteriormente incubadas con el anti-IFN\gamma a razón de 20.000 células por pocillo en 200 \mul final, y en presencia de las PBMC autólogas estimuladas con una relación efectora : diana (E:T) de 1:1. Como testigos positivos se utilizan la fitohemaglutinina (PHA), con una concentración de 4 \mug/ml, y el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)-ionomicina (150 y 500 ng/ml, respectivamente).
Tras 20 horas de incubación a 37ºC, en una atmósfera que contiene 5% de CO_{2}, los pocillos se lavan 5 veces con PBS, y después 1 vez con agua destilada, y después se incuban toda la noche a 4ºC con 100 \mul/pocillo de anticuerpo de conejo anti-IFN\gamma humano diluido al 1/250 en RPMI que contiene 10% de SAB. Después, los pocillos se lavan 5 veces con PBS que contiene 0,05% de Tween 20, y después se incuban durante 2 horas a 37ºC con 100 \mul de anticuerpos de cabra anti-inmunoglobulina de conejo biotinilados diluidos al 1/500 en PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y 1% de BSA (seroalbúmina bovina).
Nuevamente, los pocillos se lavan cinco veces con PBS-Tween, y después se incuban durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de extravidina-fosfatasa alcalina diluida al 1/600 en PBS-Tween-1% de BSA.
Tras cuatro lavados en PBS-Tween, los pocillos se incuban con 100 \mul de sustrato de revelación (kit de sustrato de conjugado de fosfatasa alcalina, ref. 170-6432, Biorad). A continuación, los pocillos se lavan con agua destilada, y se secan antes de la lectura de los resultados en el estereomicroscopio.
b) Resultados
La figura 1 ilustra los resultados obtenidos.
Los dos lipopéptidos de MART 27-35 estimulan de manera específica la secreción de IFN\gamma mediante la línea de los CTL anti-MART 27-35. Por lo tanto, se presentan mediante las PBMC y se reconocen mediante los CTL de una manera comparable al péptido nominal MART 27-35.
2) Estudio del reconocimiento de los lipopéptidos mono- y dipalmitoílico MART 27-35 mediante dos clones de linfocitos infiltrantes de melanomas humanos específicos de MART 27-35, mediante un ensayo de citotoxicidad por liberación de ^{51}Cr a) Materiales y métodos
LT8 y LT12 son dos clones HLA-A2^{+} obtenidos mediante la re-estimulación de linfocitos infiltrantes de melanoma (TILs), que reconocen específicamente el péptido MART 27-35.
Las células diana utilizadas en este ensayo son células humanas HLA-A2^{+} de tipo T2. Estas células están desprovistas de transportadores de péptido, y por lo tanto presentan sólo los péptidos exógenos sobre sus moléculas de clase I libres.
En este ensayo, las células diana se incuban durante una noche con el péptido a ensayar, a razón de 4 \mug/10^{6} células, en una atmósfera que contiene 5% de CO_{2}, a 37ºC. Después, se incuban durante una hora a 37ºC con 100 \muCi de cromato de sodio (^{51}Cr). A continuación, las células diana se lavan dos veces en un suero fisiológico que contiene 5% de suero de ternera fetal (SVF), se recogen en medio RPMI 5% SVF y se reparten en placas de 96 pocillos, a razón de 3000 ó 5000 células por pocillo en 100 \mul.
Después, las células efectoras (LT8 y LT12) se añaden en 100 \mul del mismo medio, con una relación efectora:diana de 10:1.
Se ha medido la liberación de cromo, obtenido durante la incubación de 4 horas a 37ºC, sobre un contador gamma. El porcentaje de lisis se determina mediante la fórmula siguiente (L = liberación):
% de lisis = (L. experimental - L. espontánea/L. total - L. espontánea) x 100
b) Resultados
Las figuras 2A y 2B ilustran los resultados obtenidos.
Los dos lipopéptidos de MART 27-35, mono- y dipalmítico, son reconocidos mediante células efectoras humanas, que provienen de melanomas y que son específicas del péptido MART 27-35. Estos dos tipos de lipopéptidos se reconocen de manera similar, y a un nivel al menos comparable al péptido original (MART 27-35), teniendo en cuenta que las células diana han sido expuestas a la misma concentración final de péptidos, mientras que la masa en peso de los lipopéptidos es aproximadamente 5 veces más elevada que la del péptido MART 27-35.
3. Caracterización del efecto "helper" del epítopo T auxiliar TT 830-843 a) Materiales y métodos
Se inmunizaron ratones transgénicos A2/Kb (3 a 4 por grupo) en IFA, por vía subcutánea en la base de la cola y en las almohadillas plantares, con (A) suero fisiológico, o (B) 200 \mug de Mp-MART, o (C) 200 \mug de Dp-MART. Los ratones se sacrificaron 11 días más tarde.
Se realizó un ensayo de proliferación de las células de los ganglios de drenaje mediante cultivo durante tres días en presencia de péptido TT 830-843 (10 \mug/ml), y después 18 horas de incorporación de timidina tritiada.
El sobrenadante se recolectó tras 36 horas de cultivo para la medición de IFN-\gamma mediante el método ELISA.
b) Resultados
A fin de definir la capacidad de inducción de una respuesta T auxiliar aportada por las construcciones de lipopéptidos según la invención, se ha estudiado la secreción de Interferón-\gamma así como la proliferación de linfocitos en respuesta al epítopo T auxiliar TT 830-843 en ratones inmunizados con Mp-MART o Dp-MART en presencia de adyuvante incompleto de Freund.
Los resultados se muestran en la figura 3.
Los resultados indican que la construcción Mp-MART y la construcción Dp-MART (B, C) inducen ambas una fuerte secreción de interferón-\gamma mediante las células de los ganglios linfáticos de los ratones transgénicos de tipo A2/K^{b}.
Igualmente, los lipopéptidos Mp-MART y Dp-MART (B, C) provocan una proliferación linfocítica importante en respuesta al péptido TT 830-843.
Estos resultados demuestran que el epítopo T auxiliar TT 830-843 es capaz de inducir una respuesta T auxiliar en los ratones transgénicos A2/K^{b}. Además, estos resultados muestran igualmente que la unión covalente del epítopo TT 830- 843, en el seno de la construcción lipopeptídica, no reduce su capacidad para ser presentada a las células T.
4. Estudio del efecto adyuvante de la parte lipídica de las construcciones de lipopéptidos MART 27-35 a) Materiales y métodos
Los ratones transgénicos A2/Kb (3 a 4 por grupo) se inmunizaron sin adyuvante, por vía subcutánea en la base de la cola y en las almohadillas plantares, con (A) una mezcla de péptido MART 27-35 (50 \mug) y de TT 830-843 (140 \mug), o bien con (B) 200 \mug de Mp-MART (para asegurar la equimolaridad del péptido MART 27-35 con relación a (A), o bien con (C) 200 \mug de Dp-MART. Los ratones se sacrificaron 11 días más tarde.
El número de células T CD8^{+} específicas de MART 27-35 se determinó mediante un ensayo ELISPOT IFN-\gamma, durante el cual las células se expusieron a células presentadoras de tipo Jurkat A2/Kb, ya sea no cargadas (como control negativo), o cargadas con el péptido MART 27-35 (30 \mug/ml). Los resultados se expresan en número de células que segregan IFN-\gamma por millón de células ensayadas.
b) Resultados
A fin de optimizar el uso de las construcciones colineales de lipopéptidos que comprenden el epítopo T citotóxico MART 27-35 para la vacunación humana, se ensayó la capacidad de estas construcciones lipopeptídicas para inducir una inmunización en ausencia de adyuvante exógeno.
Los resultados se presentan en la figura 4.
Más particularmente, se ensayó la inmunogenicidad de las dos construcciones colineales lipopeptídicas que comprenden una o dos cadenas palmitoílicas, respectivamente. Los ratones han recibido una sola inyección en ausencia de adyuvante, con cada lipopéptido, o también con la mezcla de epítopo MART 27-35 y TT 830-843 utilizado como control; después, se midió la secreción de interferón-\gamma mediante los esplenocitos tras una re-estimulación in vitro con el péptido MART 27-35.
Los resultados de la figura 4 indican que las construcciones colineales Mp-MART y Dp-MART son ambas capaces de inducir in vivo una respuesta celular citotóxica CD8^{+} específica del epítopo T citotóxico MART 27-35, en ausencia de cualquier adyuvante exógeno.
Se obtuvieron resultados similares con las células de los ganglios linfáticos.
Estos resultados demuestran que el efecto adyuvante de las construcciones lipopeptídicas colineales según la invención es suficiente para inducir una inmunización específica contra el epítopo T citotóxico, en ausencia de cualquier otro compuesto adyuvante.
Ejemplo 4 Preparación de un lipopéptido que comprende una unión de hidrazona
El hidrazinopéptido y el péptido aldehídico presentan las fórmulas siguientes:
hidrazinopéptido: K(NH_{2})ILKEPVHGV-OH / epítopo MHCI-POL VIH-1
péptido aldehídico: CHOCO-RTPPAYRPPNAPILK(Pam)-NH_{2}/epítopo MHCII-HBVc
El péptido aldehídico comprende el epítopo 128-140 de la proteína de la envoltura vírica del virus de la hepatitis B (HBVc), tal como se ha descrito por MILICH et al. (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1610-1614).
Se disuelven 16 mg (12 \mumoles) de hidrazinopéptido y 15 mg (7 \mumoles) de péptido aldehídico en 4 ml de tampón citrato/fosfato 0,01 M, pH 5,4, y 1 ml de DMSO. El pH se ajusta a 5,4 con Na_{2}HPO_{4} 0,2M.
Tras 24 h, el medio se diluye con 5 ml de ácido acético, y se purifica sobre una columna C18 (15 x 500 mm). Eluyente A: TFA 0,05% en H_{2}O; Eluyente B: TFA 0,05% en CH_{3}CN/H_{2}O (80/20). Gradiente 0-40% de B en 10 min., después 40-100% de B en 60 min. Las fracciones puras se recolectan y se liofilizan. Se obtienen 4,9 mg de producto puro (rendimiento 22%).
La fórmula del producto final se representa en la figura 5.
Ejemplo 5 Actividad biológica de las construcciones lipopeptídicas según la invención que contienen epítopos distintos de VIH a) Materiales y métodos 1. Síntesis peptídica y caracterización
Se sintetizaron lipopéptidos sobre una resina MBHA (Applied Biosystems, Foster City, USA) utilizando la estrategia clásica de BOC-bencilo (Merrifield, RB, 1986, Science: Volumen 232, páginas 341-343; Merrifield RB, 1963, J. Am. Chem. Soc., Vol. 85: 2149-2154) y hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio 0,33 M (HBTU) en N-metil-pirrolidinona (NMP), con una neutralización in situ mediante diisopropiletilamina (DIPEA) (Schnolzer et al., 1992, Int. J. Pept. Protein Res., Vol. 40, páginas 180-193), en un sintetizador automático de péptidos de tipo Applied Biosystem 430A (Foster City, USA). Se efectuó sistemáticamente un doble acoplamiento, utilizando cuatro equivalentes de aminoácidos protegidos, seguido de una etapa de acetilación sistemática utilizando anhídrido acético.
Para la síntesis de los péptidos dipalmitoílicos, se incorporó en el extremo N-terminal un grupo Boc-Lys(Boc)-OH (Senn Chemicals AG, Dielsdorf, CH); simultáneamente, los grupos Boc se eliminaron mediante tratamiento clásico con TFA. Para la síntesis de los péptidos monopalmitoílicos, se incorporó en el extremo N-terminal un grupo Boc-Lys(Fmoc)-OH (Senn Chemicals AG, Dielsdorf, CH), lo que ofrecía la posibilidad de una eliminación selectiva del grupo Fmoc mediante piperidina al 20% en NMP. En cualquier caso, se realizó una palmitoilación sobre resina utilizando una activación mediante HBTU en presencia de DIEA, como antes, sobre el péptido (por otra parte, totalmente protegido). Después, los lipopéptidos se desprotegieron y se separaron de la resina mediante un tratamiento con fluoruro de hidrógeno (Tam, J.P. 1995, Int. J. Pept. Protein Res., Volumen 26, páginas 262-273) en un aparato Teflon-Kel F (Asti, Courbevoie, Francia); se utilizó un protocolo "High HF" para los lipopéptidos TT-POL1 y TT-GAG, y se utilizó un protocolo de tipo "Low-High HF" para los lipopéptidos TT-POL2 y TT-NEF. Los lipopéptidos se purificaron parcialmente durante una etapa de precipitación mediante éter dietílico frío en 5 ml de una disolución de ácido trifluoroacético, y después se liofilizaron. Las purificaciones se realizaron mediante varios ciclos paralelos de RP-HPLC; para cada ciclo, se disolvieron 50 a 100 mg de lipopéptido bruto en 2 ml de DMSO, y después se diluyeron en 1 ml de agua antes de la inyección sobre:
- para los monopalmitoilpéptidos, una columna de dimensión 12,5 mm x 250 mm cargada con una fase estacionaria de tipo C18 (0,03, 5 \mum) Hyperprep Hypersil, eluida con 5 ml/min.;
- para los dipalmitoilpéptidos, una columna de 12,5 mm x 250 mm cargada con C3 (0,03, 5 \mum) Zorbax, y eluida con 4 ml/min.
Los compuestos se eluyeron con un sistema disolvente de acetonitrilo/H2O/0,05% de TFA, a 60ºC. La homogeneidad se confirmó con la ayuda de una RP-HPLC sobre dos columnas analíticas distintas (una columna Vydac C18 de 4,6 x 250, y una columna C3 Zorbax de 4,6 x 150 mm); los lipopéptidos tenían una pureza mayor del 90%. La caracterización de los péptidos se verificó determinando la composición de aminoácidos tras la hidrólisis total y la determinación de la masa molecular mediante TOF-PDMS (espectrómetro de masas con desorción mediante plasma, Bio-Ion 20, Uppsala, Suecia). Las masas moleculares medidas han sido las siguientes: para derivados monopalmitoílicos TT-GAG: [M+H]^{+} calc., 3534, obt. 3523; TT-NEF: [M+H]^{+} calc. 4317, obt. 4318, TT-POL1: [M+H]^{+} calc. 3534, obt. 3535; TT-POL2: [M+H]^{+} calc. 4142, obt. 4143. Para los derivados dipalmitoílicos: TT-GAG: [M+H]^{+} cal. 3763, obt. 3762; TT-NEF: [M+H]^{+} calc. 4556, obt. 4553; TT-POL1: [M+H]^{+} calc. 3773, obt. nd; TT-POL2: [M+H]^{+} calc. 4380, obt. 4378. Todos los compuestos se obtuvieron en forma de polvo liofilizado. Los derivados monopalmitoílicos son solubles en agua. Los derivados dipalmitoílicos son solubles en una mezcla agua-DMSO. Los rendimientos de la purificación fueron:
- para los derivados monopalmitoílicos: TT-GAG: 16%, TT-NEF: 28%; TT-POL1: 33%; TT-POL2: 12%;
- para los derivados dipalmitoílicos: TT-GAG: 16%; TT-NEF: 39%; TT-POL1: 22%; TT-POL2: 4,5%.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos y lipopéptidos se representan en la tabla 8.
2) Ratones e inmunización
Se utilizaron ratones transgénicos HLA-A2 que expresan los dominios \alpha1 y \alpha2 de la molécula HLA-A2 (Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med., Vol. 173, páginas 1007-1015). El dominio \alpha3 de la cadena pesada corresponde al dominio murino H-2 K^{b}. Esta característica permite a la molécula de CD8^{+}, expresada por las células T murinas CD8^{+}, interaccionar con el dominio \alpha3 singénico de la molécula MHC de clase I híbrida.
Igualmente, se utilizaron ratones transgénicos HLA-A3.
Todos los péptidos y lipopéptidos se disolvieron en una disolución salina en presencia de 10% de DMSO. La inducción de células T citotóxicas en los ratones transgénicos HLA se realizó como se describe por SETTE et al., (1994) (J. Immunol., Vol. 153, páginas 5586-5592).
En resumen, se mezclaron epítopos de CTL (50 \mumg/ratón) con el epítopo T-auxiliar TT 830-843 (140 \mum/ratón), se emulsionaron en adyuvante incompleto de Freund (IFA), y se inyectaron en la base de la cola. Los lipopéptidos se inyectaron solos (150 \mum/ratón), diluidos en una disolución salina sin adyuvante incompleto de Freund (IFA). Once días tras la inyección, los ratones se sacrificaron, y los esplenocitos, así como las células de los ganglios linfáticos (LNC), se incubaron a razón de 3 x 10^{6}/ml en un medio completo en presencia de linfoblastos singénicos, estimulados mediante LPS, irradiados y recubiertos de los péptidos, utilizados como células estimuladoras. El medio completo comprende un medio RPMI 1640 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), 10% de SVF, 2 mM de glutamina, antibióticos y \beta2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5}M). Después de seis días, los esplenocitos y las células de los ganglios linfáticos se ensayaron para determinar la secreción de interferón-\gamma según la técnica ELISPOT, descrita en el ejemplo 3 para las células de ratones, y la técnica ELISPOT, más abajo, para las PBMC humanas.
3. Ensayo ELISPOT sobre las PBMC humanas
Se seleccionaron donantes seropositivos por VIH para su expresión en moléculas HLA de clase I según datos bien conocidos por el experto en la técnica en materia de restricción frente a péptidos y lipopéptidos.
Se incubaron microplacas de nitrocelulosa (Millipore, Bedford, MA) durante la noche a 4ºC con 1 \mug/ml de un anticuerpo de captura anti-Interferón-\gamma humano, diluido en un tampón carbonato/bicarbonato con pH 9,6 (100 \mul/pocillo). Después de cinco lavados, las placas se saturaron durante 2 horas a 37ºC con 200 \mul, y después se lavaron. Para los cultivos de células humanas, el medio completo estaba compuesto de RPMI 1640, 10% de seroalbúmina bovina, 2 mM de glutamina, antibióticos y \beta2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5}M). Para el ensayo con el péptido, se añadieron PBMC de pacientes directamente en las microplacas de nitrocelulosa (2 x 10^{5} células/pocillo), y se incubaron durante 24 horas a 37ºC en presencia de 10 mg/ml del péptido. Para el ensayo de los lipopéptidos, las PBMC se incubaron durante la noche a 37ºC con los lipopéptidos, y después se lavaron y se irradiaron (3000 rads). Estas células se utilizaron como células estimuladoras en un cocultivo (2 x 10^{5} células por pocillo) con PBMC singénicas (relación 1/1), en placas de nitrocelulosa durante 24 horas a 37ºC. Después de 24 horas, las placas que contenían el cultivo directo (péptido) o el cocultivo (lipopéptido) se lavaron y se incubaron durante 2 horas a temperatura del laboratorio en presencia de 100 \mul de un anticuerpo monoclonal anti-interferón-\gamma de ratón biotinilado diluido al 1 \mug/ml en un tampón de PBS-Tween (0,05%) y de seroalbúmina bovina (1%). Después de 5 lavados en PBS-Tween al 0,05%, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura del laboratorio en presencia de extravidina marcada con fosfatasa alcalina (Sigma, Alemania), diluidas al 1/5000 en un tampón de PBS-Tween (0,05%) y de suero de ternera fetal (1% de SVF). Las manchas ("spots") se revelaron añadiendo un sustrato conjugado cromógeno de la fosfatasa alcalina (Biorad, Hercules, CA), según las instrucciones del fabricante, y las células que forman manchas positivas para el Interferón-\gamma se contaron con la ayuda de una lupa
binocular.
4. Ensayo de proliferación
Las células de los ganglios linfáticos y los esplenocitos extraídos se cultivaron en microplacas de 96 pocillos, a razón de 5x10^{5} células por pocillo, en un volumen final de 200 \mul de medio completo. Las células se estimularon, o no, con 20 \mug/ml de un epítopo de CD4 restringido a las moléculas del MHC de clase II, el epítopo TT 830-843. Tras 72 horas de cultivo a 37ºC, las células se incubaron durante la noche con 0,25 \muCi de [^{3}H] timidina (Amersham, Life Technologie). Las células se recuperaron, y se analizó la incorporación de [^{3}H] timidina en un aparato "Microbetaplate" (Wallac, Turku, Finlandia).
5. Células y anticuerpos monoclonales
Células Jurkat-A2 (J A2/K^{b}), una línea de células T leucémicas humanas transfectadas con un plásmido que codifica la molécula híbrida HLA-A2/H2K^{b} (Irvin et al. 1989.
Los linfoblastos utilizados para estimular las células efectoras in vitro se prepararon de la manera siguiente: se cultivaron esplenocitos de ratones transgénicos HLA-A2 con 25 \mug/ml de LPS (E. coli) y 7 \mug/ml de sulfato de dextrano (Sigma). Después de 72 horas a 37ºC, las células se lavaron y se incubaron con el epítopo de CD8 durante 2 horas a 37ºC. Después, las células se irradiaron (3000 rad), se lavaron tres veces y se cocultivaron con las células efectoras.
Los anticuerpos monoclonales de captura y de detección anti-Interferón-\gamma de ratón (clones R4-6A2 y XMG1.2, respectivamente) se comercializan por Pharmingen (San Diego, CA). Los anticuerpos monoclonales de captura y de detección anti-Interferón-\gamma humano (clon 1-D1K y 7-B6-1-biotina, respectivamente) se comercializan por Mabtech (Estocolmo, Suecia).
b) Resultados 1) Antigenicidad de los péptidos y de los lipopéptidos en el ser humano
Se ensayó la capacidad de los péptidos seleccionados, que comprenden los epítopos de interés, para estimular eficazmente los linfocitos T citotóxicos específicos de donantes seropositivos por VIH. La activación de los CTL, específicos de epítopos, se siguió midiendo la secreción de Interferón-\gamma tras la incubación de las PBMC de pacientes con los péptidos, con la ayuda del ensayo ELISPOT. Cuando se estableció que los péptidos estimulaban eficazmente los CTL específicos, se estudió la capacidad de activación de estos CTL, específicos de epítopos, con los lipopéptidos correspondientes preincubados con las PBMC singénicas.
Los resultados presentados en la figura 6a muestran que los CTL del paciente Z77 (de tipo HLA-2; positivo por VIH) reconocen los péptidos POL 476-484 y GAG 77-85. Igualmente, los lipopéptidos TT-POL1 y TT-GAG han estimulado fuertemente estos CTL específicos. No se observó ninguna diferencia significativa de antigenicidad entre las construcciones monopalmitoílicas y dipalmitoílicas para estos dos lipopéptidos. Por otra parte, no hay ninguna activación de los CTL específicos de POL 346-354 en las PBMC del paciente Z77, ya sea con el péptido POL 346-354 o con los lipopéptidos correspondientes TT-POL2 (construcción monopalmitoílica y dipalmitoílica). Sin embargo, como se indica en la figura 6a, los CTL del paciente HLA-A2 Z108 reconocen débilmente el epítopo 346-354, y más fuertemente los lipopéptidos TT-POL2.
Los resultados de la figura 6b demuestran que el péptido NEF 73-82, un epítopo que se fija a la vez sobre las moléculas HLA-A11 y HLA-A3, y que forma complejos estables con estas moléculas, induce igualmente una fuerte respuesta CTL específica en las PBMC de los pacientes HLA-A11 y HLA-A3 (respectivamente, Z129 y P48). Además, el lipopéptido monopalmitoílico TT-NEF ha inducido igualmente una fuerte respuesta CTL de estas
PBMC.
Por último, los resultados de la figura 6c muestran que todos los péptidos seleccionados por su capacidad de fijación sobre moléculas purificadas de HLA-B35, así como por su capacidad para formar complejos estables HLA/péptido (véase figura 6c), eran muy antigénicos en el paciente HLA-B35 (P3). Los polipéptidos monopalmitoílicos y dipalmitoílicos TT-NEF, que comprenden los péptidos NEF 74-81, NEF 71-79 y NEF 68-76, eran igualmente antigénicos en el paciente P3.
Sin embargo, los lipopéptidos TT-POL1 (monopalitoílico y dipalmitoílico), aunque contienen el epítopo POL 342-350 bien reconocido, no eran antigénicos en los pacientes HLA-B35.
Los resultados de la figura 6c indican igualmente que el péptido NEF 68-76, un epítopo potencial de HLA-B7, ha inducido eficazmente una respuesta CTL específica en las PBMC del paciente HLA-B7 Z118. Además, los lipopéptidos TT-NEF eran también antigénicos en los pacientes HLA-B7.
Es importante subrayar que los resultados de las figuras 6b y 6c muestran que un lipopéptido multiepitópico puede ser eficazmente reconocido por individuos que expresan diferentes moléculas HLA de clase I.
El conjunto de estos resultados demuestra claramente que los lipopéptidos se pueden transformar eficazmente mediante las PBMC, y pueden activar los CTL específicos de epítopos.
\newpage
2. Estudio de la inmunogenicidad de los péptidos y de los lipopéptidos en ratones transgénicos HLA-A2 y HLA-A3
El objetivo de este estudio era determinar si los lipopéptidos podían inducir la producción de CTL específico en organismos sin tratamiento previo, que nunca han sido sensibilizados con un epítopo de VIH, y que no poseen ninguna célula preexistente de CTL específico de epítopos.
Los lipopéptidos y péptidos que comprenden los epítopos de interés se inyectaron a ratones transgénicos que expresan las moléculas HLA-A2 o HLA-A3. Los péptidos portadores de epítopos T citotóxicos se coinyectaron con el epítopo T auxiliar TT 830-843, y se emulsionaron en el adyuvante incompleto de Freund.
Los lipopéptidos se diluyeron en una disolución salina, y se inyectaron sin adyuvante incompleto de Freund. La producción de células de CTL, específicos de epítopos, en estos ratones, se siguió como se indica en la parte "Materiales y métodos".
Los resultados de la figura 7a muestran que los tres epítopos restringidos al HLA-A2, GAG 77-85, POL 476-484 y POL 346-354, respectivamente, inducían en los ratones transgénicos HLA-A2 una débil respuesta CTL específica, pero que los lipopéptidos monopalmitoílicos correspondientes era capaces de inducir una respuesta CTL más fuerte. En cualquier caso, los lipopéptidos dipalmitoílicos han inducido una respuesta CTL más débil que los lipopéptidos monopalmitoílicos.
Los resultados de la figura 7b indican que el epítopo NEF-73-82 induce en los ratones transgénicos HLA-A3 una fuerte respuesta CTL específica. Además, los lipopéptidos monopalmitoílicos TT-NEF eran capaces de inducir una respuesta CTL tan fuerte como el epítopo NEF 73-82.
3. Estudio de la necesidad de una respuesta de tipo T auxiliar para la inducción de células de CTL
A fin de determinar la importancia del efecto T auxiliar en la producción de células de CTL mediante los lipopéptidos según la invención, se construyeron lipopéptidos monopalmitoílicos que comprenden un epítopo de VIH, pero desprovistos del epítopo TT 831-843.
Los resultados de la figura 8a muestran que el lipopéptido POL1 desprovisto de epítopo T auxiliar no induce ninguna respuesta CTL específica, mientras que el lipopéptido TT-POL1 era capaz de inducir una respuesta CTL específica mucho más fuerte. Este resultado indica que el péptido T auxiliar es necesario a fin de inducir una fuerte respuesta CTL cuando los lipopéptidos se inyectan en la base de la cola de ratones transgénicos HLA-A2. Se realizaron experimentos de proliferación linfocítica a fin de determinar si el epítopo T auxiliar TT 831-843, incluido en los lipopéptidos, era capaz de inducir eficazmente una respuesta T auxiliar.
Los resultados presentados en la figura 8b demuestran que las células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados con el lipopéptido monopalmitoílico TT-POL1 proliferaban, en respuesta a los péptidos TT 830-843, tan fuertemente como las células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados con el epítopo T auxiliar TT 830-843, emulsionadas en el adyuvante incompleto de Freund.
Estos resultados demuestran que es necesaria una respuesta de tipo T auxiliar a fin de obtener una fuerte respuesta CTL específica, y que la respuesta T auxiliar es inducida mediante el epítopo T auxiliar contenido en las construcciones colineales lipopeptídicas.
TABLA 1 Epítopos de BCR-ABL
1
TABLA 1 (continuación)
2 
\newpage
TABLA 1 (continuación)
3 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Epítopos de la p53
4
TABLA 2 (continuación)
5 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Epítopos de las proteínas E_{6} y E_{7}
6 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Epítopos del virus VIH-1
7 
\newpage
TABLA 4 (continuación)
8 
\newpage
TABLA 4 (continuación)
9 
\newpage
TABLA 4 (continuación)
10 
\newpage
TABLA 4 (continuación)
11
TABLA 5 Epítopos de melanoma humano
12 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Epítopos de tumores que resultan de mutaciones
13 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 7 Antígenos comunes con diversos tumores
14
15
Referencias de la tabla 8
\bulletCULMANN-PENCIOLELLI, B., S. LAMHAMEDI-CHERRADI, I. COUILLIN, N. GUEGAN, J.P. LEVY, J.G. GUILLET, y E. GOMARD. 1994. Identification of multirestricted immunodominant regions recognized by cytolytic T lymphocytes in the human immunodeficiency virus type 1 Nef protein [published erratum appears in J. Virol. 1995 Ene: 69 (1):618]. J. Virol. 68: p7336-43.
\bulletHARRER, E., T. HARRER, P. BARBOSA, M. FEINBERG, R.P. JOHNSON, S. BUCHBINDER, y B.D. WALKER. 1996. Recognition of the highly conserved YMDD region in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase by HLA-A2- restricted cytotoxic T lymphocytes from an asymptomatic long-term nonprogressor. J. Infect Dis. 173: p476-9.
\bulletLUCCHIARI-HARTZ, M., M. BAUER, G. NIEDERMANN, B. MAIER, A. MEYERHANS, y K. ELCHMANN. 1996. Human immune response to HIV-1 Nef. Il. Induction of HIV-1/HIV-2 Nef cross-reactive cytotoxic T lymphocytes in peripheral blood lymphocytes of non-infected healthy individuals. Int Immunol. 8:p577-84.
\bulletROWLAND-JONES, S., J. SUTTON, K. ARIYOSHI, T. DONG, F. GOTCH, S. McADAM, D. WHITBY, S. SABALLY, A. GALLIMORE, T. CORRAH et al. 1995. HIV specific cytotoxic T-cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women. Nat Med. 1:59-64.
\bulletTSOMIDES, T.J. B.D. WALKER, y H.N. EISEN. 1991. An optimal viral peptide recognized by CD8^{+} T cells binds very tightly to the restricting class I major histocompatibility complex protein on intact cells but not to the purified class I protein. Proc. Natl Acad. Sci USA. 88: p11276-80.
\bulletWALKER, B.D. C. FLEXNER, K. BIRCH-LIMBERGER, L. FISHER, T.J. PARADIS, A. ALDOVINI, R. YOUNG, B. MOSS, y R. T. SCHOOLEY. 1989. Long-term culture and fine specificity of human cytotoxic T-lymphocyte clones reactive with human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl acad Sci USA. 86: p9514-8.

Claims (21)

1. Lipopéptido que comprende al menos un epítopo T auxiliar, al menos un epítopo de CTL y al menos un resto lipídico, caracterizado porque los epítopos y la parte lipídica, por una parte, y los epítopos por otra parte, se separan independientemente mediante secuencias de aminoácidos, denominadas espaciadores, comprendiendo al menos uno de los espaciadores unos encadenamientos de 1 a 10 aminoácidos seleccionados de entre los aminoácidos de glicina, arginina, ácido glutámico y ácido aspártico.
2. Lipopéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de los espaciadores comprende entre 1 y 10 glicinas y/o argininas.
3. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque al menos uno de los espaciadores presenta una de las siguientes secuencias:
GLY ARG o ARG GLY ARG.
4. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque al menos uno de los espaciadores comprende uno o varios ácidos glutámico y/o aspártico.
5. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los espaciadores integran una cisteína o una cadena alquilo funcionalizada mediante un grupo tiol y mediante uniones no peptídicas.
6. Lipopéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los espaciadores comprenden un grupo seleccionado de entre un grupo tiazolidina, oxima o hidrazona.
7. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende el encadenamiento:
-
de una parte lipídica,
-
de un primer espaciador,
-
de un epítopo T auxiliar,
-
de un segundo espaciador, y
-
de un epítopo de CTL.
8. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende el encadenamiento:
-
de una parte lipídica,
-
de un primer espaciador,
-
de un epítopo T auxiliar,
-
de un segundo espaciador,
-
de un primer epítopo de CTL,
-
de un tercer espaciador, y
-
de un segundo epítopo de CTL.
9. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la parte lipídica comprende una o varias cadenas derivadas de ácidos grasos o de alcoholes grasos de C_{10} a C_{20}, lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas, o un derivado esteroideo.
10. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la parte lipídica comprende al menos dos cadenas derivadas de ácidos grasos o de alcoholes grasos de C_{10} a C_{20}, unidas entre ellas mediante uno o varios aminoácidos.
11. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la parte lipídica está constituida de dos cadenas de ácido palmítico unidas a los grupos NH_{2} de una lisina.
12. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la parte lipídica comprende una o varias cadenas seleccionadas de entre el ácido palmítico, el ácido oleico, el ácido linoléico, el ácido linolénico, el ácido 2-aminohexadecanoico, la pilmelautida o la trimexautida.
13. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la parte no lipídica comprende entre 15 y 100 aminoácidos.
14. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el epítopo T auxiliar es un epítopo multivalente.
15. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el epítopo T auxiliar es el péptido 830-843 de la toxina tetánica que presenta la siguiente secuencia:
QYIKANSKFIGITE
16. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el epítopo T auxiliar es el epítopo de la hemaglutinina del virus de la influenza, o el epítopo PADRE.
17. Lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque contiene al menos un epítopo de CTL de una proteína específica del melanoma, de una proteína del VIH, del VHB, del papilomavirus, de la proteína p-53, o de una proteína del estado intra-hepatocítico de Plasmodium falciparum.
18. Uso de un lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 17, para la fabricación de un medicamento o de una vacuna para la inducción de una respuesta inmunitaria específica.
19. Uso de un lipopéptido según una de las reivindicaciones 1 a 17, para la fabricación de un medicamento para la inducción de una respuesta inmunitaria contra el VIH, el VHB, el papilomavirus, la p-53 del melanoma, o de la malaria.
20. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene una dosis farmacológicamente eficaz de uno o varios lipopéptidos según una de las reivindicaciones 1 a 17, y unos excipientes farmacéuticamente compatibles.
21. Medicamento o vacuna, caracterizado porque contiene uno o varios lipopéptidos según una de las reivindicaciones 1 a 17.
ES99911884T 1998-04-07 1999-04-06 Lipopeptidos induxtores de citotoxicidad t linfocitaria que presentan por lo menos un epitopo t auxiliar, y sus usos parra la vacunacion. Expired - Lifetime ES2242387T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9804323 1998-04-07
FR9804323A FR2776926B1 (fr) 1998-04-07 1998-04-07 Lipopeptides inducteurs de cytotoxicite t lymphocytaire portant au moins un epitope t auxiliaire, et leurs utilisations pour la vaccination

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2242387T3 true ES2242387T3 (es) 2005-11-01

Family

ID=9524959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES99911884T Expired - Lifetime ES2242387T3 (es) 1998-04-07 1999-04-06 Lipopeptidos induxtores de citotoxicidad t linfocitaria que presentan por lo menos un epitopo t auxiliar, y sus usos parra la vacunacion.

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1068226B1 (es)
JP (1) JP2002512941A (es)
AT (1) ATE293639T1 (es)
AU (1) AU3041399A (es)
CA (1) CA2328294A1 (es)
DE (1) DE69924836T2 (es)
ES (1) ES2242387T3 (es)
FR (1) FR2776926B1 (es)
HK (1) HK1038569A1 (es)
WO (1) WO1999051630A1 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9915074D0 (en) * 1999-06-28 1999-08-25 Cortecs Plc Ligand-binding composition
WO2001041797A2 (en) * 1999-12-09 2001-06-14 Institut Pasteur Systemic immune response induced by mucosal administration of l ipid-tailed polypeptides without adjuvant
CA2441809C (en) 2001-03-27 2014-07-22 Biomira, Inc. Liposomal vaccines comprising dilipopeptides for modulating t1 and t2 immune responses
JP4724000B2 (ja) * 2003-03-31 2011-07-13 株式会社林原生物化学研究所 ポリペプチド
TW201204410A (en) 2004-04-01 2012-02-01 Oncothyreon Inc Mucinous glycoprotein (MUC-1) vaccine
WO2007015171A2 (en) 2005-06-28 2007-02-08 Biomira, Inc. Method of treating patients with a mucinous glycoprotein (muc-1) vaccine
AU2012222188A1 (en) 2011-02-24 2013-08-15 Oncothyreon Inc. MUC1 based glycolipopeptide vaccine with adjuvant
FR3008099B1 (fr) 2013-07-05 2020-08-07 Commissariat Energie Atomique Peptides immunogenes de l'antigene tumoral cycline b1
FR3090319A1 (fr) 2018-12-21 2020-06-26 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Melanges d’epitopes t cd8+ immunogenes de la cycline b1
FR3091651A1 (fr) 2019-01-11 2020-07-17 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Peptides immunogènes issus de la nucléoprotéine du virus ebola zaïre
FR3096894A1 (fr) 2019-06-06 2020-12-11 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Melanges d’epitopes t cd8 immunogènes du virus ebola

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1238343B (it) * 1989-10-16 1993-07-13 Cesalpino Andrea Fond Procedimento per la preparazione di vaccini capaci di generare non solo la risposta immune dei linfociti t helper,ma anche un'efficace risposta di linfociti t citotossici,e vaccini con queste caratteristiche
FR2670787B1 (fr) * 1990-12-18 1995-06-23 Pasteur Institut Lipopeptides inducteurs des lymphocytes t cytotoxiques et utilisation comme vaccins.
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6419931B1 (en) * 1991-08-26 2002-07-16 Epimmune Inc. Compositions and methods for eliciting CTL immunity
GB2271995A (en) * 1992-10-15 1994-05-04 Merck & Co Inc HIV peptide conjugated via anionic spacer to protein

Also Published As

Publication number Publication date
DE69924836D1 (de) 2005-05-25
FR2776926A1 (fr) 1999-10-08
FR2776926B1 (fr) 2003-10-24
EP1068226A1 (fr) 2001-01-17
CA2328294A1 (fr) 1999-10-14
WO1999051630A1 (fr) 1999-10-14
EP1068226B1 (fr) 2005-04-20
ATE293639T1 (de) 2005-05-15
HK1038569A1 (en) 2002-03-22
AU3041399A (en) 1999-10-25
JP2002512941A (ja) 2002-05-08
DE69924836T2 (de) 2006-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3738395B2 (ja) Ｈｌａ−制限型ｂ型肝炎ウィルスのｃｔｌエピトープ
Defoort et al. Macromolecular assemblage in the design of a synthetic AIDS vaccine.
US4943628A (en) HIV peptide-inducted T cell stimulation
US6419931B1 (en) Compositions and methods for eliciting CTL immunity
ES2318848T3 (es) Peptidos que se unen a pan dr para potenciar la respuesta inmunitaria.
AU2009207806B2 (en) Hydrophobic modified preS-derived peptides of hepatitis B virus (HBV) and their use as HBV and HBV entry inhibitors
JP2006512300A (ja) Ｈｌａ結合ペプチド及びその使用
ES2265672T3 (es) Micelas mixtas de lipopeptidos para la induccion de una respuesta inmunitaria.
ES2262132T3 (es) Peptidos para la induccion de respuestas de los linfocitos t citoxicos al virus de la hepatitis b.
ES2242387T3 (es) Lipopeptidos induxtores de citotoxicidad t linfocitaria que presentan por lo menos un epitopo t auxiliar, y sus usos parra la vacunacion.
JP3616390B2 (ja) Ｂ型肝炎のウイルスに対する細胞障害性ｔリンパ球の応答を誘発するペプチド
JPH09501165A (ja) Ｂ型肝炎ウイルスに対する細胞毒性ｔリンパ球応答を誘発するためのペプチド
CN114028553A (zh) 包括免疫原性肽组合的药物组合物
Huang et al. Lipophilic multiple antigen peptide system for peptide immunogen and synthetic vaccine
JPH10503493A (ja) Ｈｌａ 結合性ペプチド及びそれらの使用
ES2326146T3 (es) Peptidos de union a hla y sus usos.
ES2322253T3 (es) Utilizacion de mezclas de lipopeptidos para la fabricacion de vacunas.
Nicoli et al. ORCA–Online Research@ Cardiff
AU727738B2 (en) Compositions and methods for eliciting CTL immunity