ES2322253T3 - Utilizacion de mezclas de lipopeptidos para la fabricacion de vacunas. - Google Patents

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Dominique Bonnet
Frederic Malingue
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Abstract

Utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos para la fabricación de una vacuna, caracterizada porque dichos lipopéptidos están constituidos por un compuesto peptídico unido mediante un enlace hidrazona por lo menos con un vector lipófilo de naturaleza no peptídica, y se ajustan a la siguiente fórmula general (I): en la que (R 1 )(R 2 )iD significa un vector lipófilo, en el que: - i significa el número 0 ó 1, - en el caso, en el que i sea igual a 0, D significa un enlace, [((R1 )(R2 )i )D H]P P (I) - en el caso, en el que i sea igual a 1, D significa un heterociclo saturado, insaturado o aromático, mono- o policíclico, - R 1 y R 2 , que pueden ser idénticos o diferentes, significan en cada caso un resto de la fórmula L-f-E-f'', en la que L significa el resto de un lípido, E significa un tramo espaciador y f y f'' significan grupos funcionales ligantes, respectivamente, L con E y E con D, y - P significa el compuesto peptídico, - H significa el enlace hidrazona formado por ligación en solución entre un grupo funcional aldehído perteneciente al vector lipófilo y un grupo funcional derivado de hidrazina perteneciente al compuesto peptídico, - j significa un número de 1 a 3.

Description

Utilización de mezclas de lipopéptidos para la fabricación de vacunas.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos para la fabricación de una vacuna, dichos lipopéptidos están constituidos por un compuesto peptídico, que se ha unido en solución, mediante un enlace hidrazona, por lo menos a un vector lipófilo de naturaleza no peptídica.
Ya se ha descrito la utilización para la fabricación de vacunas de lipopéptidos, por ejemplo en la solicitud de patente PCT/FR98/02605 se describen micelas mixtas de lipopéptidos para inducir una respuesta inmune. A partir de un producto de composición química determinada, esta utilización permite aportar al sistema inmune una colección diversificada de antígenos peptídicos, que serán presentados simultáneamente por las células presentadoras de antígenos (CPA) en asociación con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CMH) de la clase I y de la clase II. De este modo es posible activar las células específicas de los antígenos presentados: las células T auxiliares (linfocitos
T "helper", HTL), las células B productoras de anticuerpos o las células T citotóxicas (linfocitos T citotóxicos, CTL).
Para inducir en cada individuo vacunado la respuesta inmune policlonal protectora, el incremento de la diversidad de epítopes en la composición de la vacuna constituye una de las estrategias más prometedoras.
Diversas experiencias han demostrado que las respuestas celulares múltiples pueden inducirse de manera bastante eficaz mediante la inmunización con diversos péptidos que presenten múltiples epítopes modificados a nivel de su posición del extremo C con una N-\varepsilon-palmitoil-lisina.
Por ejemplo, se han empleado ciertos cócteles de lipopéptidos que contienen de 7 a 8 constituyentes diferentes para inducir la respuesta de células T específicas de un virus en los primates (Bourgault-Villada y colaboradores, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 19, 81-87, 1997; Mortara y colaboradores, J. Virol. 73, 4447-4451, 1999; Mortara y colaboradores, Virology 278, 551-561, 2000) y en el hombre (Gahéry-Ségard y colaboradores, J. Virol. 74, 1694-1703, 2000; Pialoux y colaboradores, AIDS 15, 1239-1249, 2001).
El estudio de Pialoux y colaboradores ha demostrado que es posible inducir respuestas HTL y CTL en la gran mayoría de voluntarios sanos que habían recibido una dosis de 600 \mug a 3 mg de una mezcla de 6 lipopéptidos cuya longitud era de 24 a 33 restos (100 \mug a 500 \mug por péptido) en el modelo de infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (virus de tipo 1, VIH-1). La tolerancia y la inmunogenicidad del cóctel de 6 lipopéptidos empleado para los ensayos de fase clínica de tipo I han confirmado que tales formulaciones sintéticas constituyen una estrategia alternativa prometedora frente a las vacunas convencionales y recombinantes.
Los lipopéptidos conocidos de la técnica anterior se construyen por síntesis peptídica en fase sólida a nivel del extremo C o del extremo N de los péptidos. Estos lipopéptidos presentan un carácter lipófilo y por ello tienden a agregarse en solución acuosa. Por consiguiente, la principal dificultad con la que se tropieza en el momento de su producción a escala industrial se sitúa en los pasos de purificación por HPLC-RP preparativa, cuya resolución es muy limitada. La separación de los productos deseados a partir de los productos secundarios solamente puede lograrse introduciendo en la columna una carga limitada. Por consiguiente, para preparar una vacuna a escala industrial y tomando en consideración a los lipopéptidos ramificados en posición del extremo C, la parte del león del trabajo se la lleva la repetición de los pasos cromatográficos. De modo que los rendimientos de la purificación son relativamente bajos y a nivel de laboratorio se sitúan normalmente en torno a 10, este rendimiento es probablemente más bajo a escala industrial (10-100 mg), del 1 al 2% o incluso menos cuando se aumenta el tamaño del lote o partida de vacuna en un factor de 10.
La preparación de micelas mixtas de lipopéptidos tiene por finalidad la obtención de una distribución equitativa de todos los ingredientes de la vacuna en cada célula presentadora del antígeno, con el fin de permitir la cooperación celular entre linfocitos T-auxiliares y T-citotóxicos por comunicación física con la célula presentadora del antígeno. Para conseguir una cooperación celular eficaz, los linfocitos deben reconocer simultáneamente en la superficie de una misma célula presentadora del antígeno los epítopes presentados con complejos principales de histocompatibilidad de tipo I y de tipo II. Los resultados obtenidos en los ensayos clínicos confirman experimentalmente que se puede obtener una respuesta inmune eficaz, durante la cual se identifica un epítope T-auxiliar en un antígeno lipopeptídico y un epítope T-citotóxico situado en otro lipopéptido de la misma composición (Gahéry-Ségard y colaboradores, J. Virol. 74, 1694-1703, 2000; Pialoux y colaboradores, AIDS 15, 1239-1249, 2001).
Para obtener micelas mixtas de lipopéptidos según la técnica anterior, es necesario purificar y caracterizar individualmente cada lipopéptido antes de realizar su mezcla. Para realizar la mezcla según la técnica anterior se tiene que disolver individualmente cada lipopéptido en condiciones que permitan obtener la solvatación completa de cada lipopéptido que forma parte de la vacuna (PCT/FR98/02605). Los estudios de resonancia magnética nuclear de las soluciones han puesto de manifiesto que este estado de disolución solo se consigue en concentraciones elevadas de ácido acético en agua (80%). El procedimiento de la técnica anterior implica, pues, una permanencia relativamente prolongada de los lipopéptidos en ácido acético del 80% en agua, con el fin de disolver individualmente cada ingrediente, preparar su mezcla, homogeneizar y después realizar la filtración esterilizante en un filtro de porosidad 0,22 \mum, antes de efectuar la dilución seguida por de la liofilización. La duración de la permanencia (residencia) de tal disolvente es poco compatible con ciertos enlaces peptídicos o con ciertos vectores lipófilos sensibles a los ácidos.
La empresa solicitante se plantea, pues, como objetivo la fabricación de vacunas a escala industrial, dicha fabricación no presenta los inconvenientes que tiene la fabricación de vacunas de la técnica anterior.
La invención tiene, pues, como objeto la utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos para la fabricación de una vacuna, dichos lipopéptidos se obtienen con preferencia por lipificación simultánea de una mezcla homogénea de compuestos peptídicos y están constituidos por un compuesto peptídico, unido mediante un enlace hidrazona, a por lo menos un vector lipófilo de naturaleza no peptídica, y se ajustan a la siguiente fórmula general
(I):
(I)[((R^{1})(R^{2})_{i})D-H]_{j}-P
en la que (R^{1})(R^{2})_{i}D significa un vector lipófilo, en el que:
- i significa el número 0 ó 1,
- en el caso, en el que i sea igual a 0, D significa un enlace,
- en el caso, en el que i sea igual a 1, D significa un heterociclo saturado, insaturado o aromático, mono- o policíclico,
- R^{1} y R^{2}, que pueden ser idénticos o diferentes, significan en cada caso un resto de la fórmula L-f-E-f', en la que L significa el resto de un lípido, E significa un tramo espaciador y f y f' significan grupos funcionales ligantes, respectivamente, L con E y E con D, y
- P significa el compuesto peptídico,
- H significa el enlace hidrazona formado por ligación en solución entre un grupo funcional aldehído perteneciente al vector lipófilo y un grupo funcional derivado de hidrazina perteneciente al compuesto peptídico,
- j significa un número de 1 a 3.
Cuando j significa el número 2 ó 3, la mezcla de lipopéptidos debe formar una solución o suspensión homogénea en medio acuoso y poseer el carácter inmunogénico deseado.
En una forma preferida de ejecución, la utilización por lo menos de una mezcla de lipopéptidos de la fórmula (I) será con ventaja tal que i sea igual a 0, j sea igual a 1 y el grupo L (de la fórmula L-f-E-f' definida antes con ocasión de R^{1} y R^{2}) significa por ejemplo un esterol, un derivado de esterol (por ejemplo un derivado del colesterol) o una cadena carbonada, saturada o insaturada, lineal o ramificada, que contiene de 4 a 30 átomos de carbono. Dicha cadena carbonada constituye la parte lipófila de un ácido graso, por ejemplo del ácido palmítico (cuando L se ajusta a la fórmula CH_{3}-(CH_{2})_{14}-) o del ácido oleico (cuando L se ajusta a la fórmula CH_{3}-(CH_{2})_{7}-CH=CH-(CH_{2})_{7}-).
En una forma muy preferida de ejecución de la invención, el derivado de esterol es un derivado del colesterol y la cadena carbonada se ajusta a la fórmula CH_{3}-(CH_{2})_{14}-.
Por otro lado, E significa con ventaja una cadena carbonada lineal, ramificada o cíclica, saturada o insaturada, que contiene de 1 a 18 átomos de carbono y, eventualmente, de 1 a 16 heteroátomos (par ejemplo nitrógeno u oxígeno) y/o de 1 a 7 grupos funcionales elegidos entre los grupos carbonilo, los heterociclos, los heteroarilos, los carbociclos y los arilos. E puede estar eventualmente sustituido por 1-8 grupos hidroxilo o amino y/o por 1-16 átomos de halógeno (por ejemplo cloro o flúor).
De igual manera, f significa con ventaja un enlace -CO-NH- o -CO-O- y f' significa un enlace -NH-CO u -O-CO-.
En el sentido de la presente invención, se entiende por:
- "carbociclo" (también llamado "cicloalquilo") un anillo carbonado mono- o policíclico, que tiene entre 3 y 8 átomos de carbono, por ejemplo el ciclopentilo o el ciclohexilo;
- "arilo" es un anillo carbonado aromático, mono- o policíclico, que tiene entre 5 y 14 átomos de carbono, por ejemplo el fenilo, el naftilo o el cresilo;
- "heterociclo" es un carbociclo que uno o varios heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre, por ejemplo la piperazina;
- "heteroarilo" es un arilo que tiene uno o varios heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre, por ejemplo la piridina, la pirimidina o la pirazina.
\newpage
Los ejemplos de vectores lipófilos preferidos según la invención se ajustan a las siguientes fórmulas (II) y (III):
1
en la que L tiene el significado definido anteriormente y es, por ejemplo, una cadena carbonada de la fórmula CH_{3}-(CH_{2})_{14}- (es decir, la parte lipófila del ácido palmítico).
El compuesto peptídico P de la fórmula (I) puede elegirse entre el grupo formado por uno o varios antígenos peptídicos y uno o varios glucomiméticos dendrímeros de naturaleza peptídica.
En el sentido de la presente invención, se entiende por "uno o varios" antígenos peptídicos o glucomiméticos dendrímeros, el hecho de que el compuesto peptídico P pueda estar formado por uno solo o por varios antígenos peptídicos o glucomiméticos dendrímeros unidos entre sí, sin que resulte modificada la actividad de la mezcla de lipopéptidos.
El antígeno peptídico se elige con ventaja entre el grupo formado por los péptidos y los derivados de péptidos que abarcan a los glucopéptidos y los pseudopéptidos.
En el sentido de la presente invención, se entiende por "péptido" cualquier serie de varios aminoácidos, con independencia de su naturaleza y de su número; el término "péptido" indica, pues, tanto a los oligopéptidos (dipéptidos o tripéptidos) como a los polipéptidos o las proteínas. Se entiende por "glucopéptidos" aquellos péptidos asociados mediante enlace covalente con glúcidos, tanto si son monosacáridos (por ejemplo las osas neutras) como polisacáridos. Se entiende por "pseudopéptidos" aquellos péptidos, en los que uno o varios enlaces peptídicos (-CO-NH-) se han reemplazado por enlaces no peptídicos (como son los enlaces -CO-NH-NH-, -CH_{2}-NH- o -CO-NH-O-).
En el sentido de la presente invención, se entiende por "glucomiméticos dendrímeros de naturaleza peptídica" a aquellos glucomiméticos, cuya estructura se basa en aminoácidos o de sus derivados y se presenta en forma muy ramificada, de tipo arborescente.
El glucomimético dendrímero de naturaleza peptídica se ajusta a la siguiente fórmula general (IV):
(IV)(B^{2}M)_{m}(XN)_{n}A
en la que:
- B^{2} se ajusta a una o varias de las siguientes fórmulas generales (a) o (b):
2
en las que R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} con independencia entre sí significan un átomo de hidrógeno o un grupo protector, y en la que W significa un enlace o una cadena carbonada lineal, ramificada o cíclica, saturada o insaturada, que tiene de 1 a 18 átomos de carbono y eventualmente de 1 a 12 átomos elegidos entre oxígeno, azufre y nitrógeno, dicha cadena carbonada está eventualmente sustituida por 1-16 átomos de halógeno,
- X significa el resto de un oligopéptido X' que contiene de 1 a 6 aminoácidos,
- A significa el resto de un compuesto A' por lo menos trifuncional que contiene una serie de aminoácidos, idénticos o diferentes, elegidos entre el grupo formado por la lisina, la hidroxilisina, la serina, la treonina, la cisteína, la ornitina, el ácido aspártico y el ácido glutámico
- m es un número entero comprendido entre 1 y 32,
- n es un número entero comprendido entre 0 y 32, y
- M y N representan en cada caso un grupo de enlace, respectivamente entre B^{2} y A cuando n = 0 o entre B^{2} y X cuando n es diferente de 0, y entre X y A cuando n es diferente de 0, y con independencia entre sí contienen un grupo funcional elegido entre oxima, hidrazona, amida, éster, tioéster, hidrazida, hidroxamato, éter, tioéter, amina, carbonato, carbamato, tiocarbonato, tiocarbamato, urea, tiourea y tiazolidina.
El compuesto de la fórmula (IV) se describe en la solicitud de patente internacional PCT/FR00/02194.
En el sentido de la presente invención, se entiende por grupo "protector" un grupo protector de un grupo funcional hidroxilo o de un diol (en tal caso, dos grupos elegidos entre R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} pueden estar unidos entre mediante enlace covalente para formar, juntos, un anillo), tal como se define en el manual Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. GREENE y P.G.M. WUTS, segunda edición, J. WILEY and Sons, 1991. A título ilustrativo y no limitante, se pueden citar los grupos trimetilsililo, trietilsililo, triisopropilsililo, tert-butildimetilsililo, tert-butildifenilsililo, éter de trimetilsililetilo, tert-butoximetilo, metoxi-metilo, benciloximetilo, 2-metoxietoximetilo, metiltiometilo, acetilo o 2',3'-dimetoxibutano-2',3'-diilo.
A título ilustrativo y no limitante, en las fórmulas generales (a) y (b):
- los átomos de halógeno convenientes son el bromo, el cloro y el flúor y
- las cadenas carbonadas convenientes son los grupos alquilo (metilo, etilo, propilo, isopropilo, tert-butilo, penti-
lo, ...), los grupos alquenilo (vinilo, alilo, butenilo, pentenilo, ...), los grupos alquinilo (etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, ...), los grupos cicloalquilo (ciclopentilo, ciclohexilo, ...), los heterociclos (piperazina, ...), los grupos arilo (fe-
nilo, cresilo, ...), los grupos heteroarilo (piridina, pirimidina, pirazina, ...), los grupos polietilenglicol o las poliaminas.
Las fórmulas (a) y (b) representan restos de los ácidos quínico y shikímico y de algunos de sus derivados, obtenidos por protección de los hidroxilos de las posiciones 1, 3, 4 y/o 5 del anillo.
En una forma preferida de ejecución de la invención, el compuesto de la fórmula general (IV) es aquel, en el que m es un número entero comprendido entre 4 y 16, n es un número entero comprendido entre 2 y 8, X significa el resto de un oligopéptido que contiene de 2 a 4 restos de aminoácidos, mientras que A significa el resto de un eslabonamiento que contiene de 2 a 8 restos de lisina y se presenta en forma de un dendrímero, y B^{2} significa el resto de uno o de varios compuestos elegidos entre el ácido (-)-shikímico y el ácido (-)-quínico.
En la mezcla de lipopéptidos de la fórmula (I), la presencia de compuestos peptídicos de la fórmula (IV) permite vectorizar selectivamente los lipopéptidos hacia las células que poseen receptores de manosa o receptores del grupo de las C-lectinas afines al receptor de la manosa. Por tanto, la mezcla de lipopéptidos que contiene compuestos peptídicos P constituidos por un antígeno peptídico y un glucomimético dendrímero de la fórmula (IV) permiten disparar dicha mezcla de lipopéptidos contra las células que expresan a los receptores del grupo de las C-lectinas afines al receptor de la manosa.
La utilización de una mezcla de lipopéptidos según la presente invención consta con ventaja de 1 a 20 lipopéptidos diferentes, con preferencia de 1 a 10 lipopéptidos diferentes.
La utilización según la presente invención de una mezcla de lipopéptidos para la fabricación de vacunas se entiende en el sentido de la utilización para la fabricación de cualquier tipo de vacunas, es decir, de manera clásica las vacunas profilácticas, pero también las "vacunas de uso terapéutico". Estas vacunas pueden dirigirse contra enfermedades infecciosas de origen bacteriano, vírico o parasitario o contra diferentes tipos de cáncer. La utilización según la invención permite además fabricar vacunas polivalentes que contienen una mezcla de antígenos peptídicos correspondientes a diferentes enfermedades infecciosas.
Las vacunas de la presente invención son, pues, activas no solo desde el punto de vista de la vacunación preventiva sino también desde el punto de vista terapéutico, en particular las vacunas lipopeptídicas de la presente invención pueden utilizarse para generar una respuesta contra nuevos epítopes y para polarizar o reforzar la polarización de una respuesta inmune establecida. Los resultados observados indican en efecto que los lipopéptidos son capaces de inducir nuevas respuestas inmunes anti-VIH, CD4, CD8, en los pacientes infectados.
El compuesto peptídico está constituido de modo ventajoso por antígenos peptídicos derivados de un agente infeccioso de tipo vírico, por ejemplo el VIH o el VHC.
La utilización para la fabricación de una vacuna con una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos de la invención se formula de modo preferido para la administración por vía transmucosal o transcutánea, pero también parenteral (intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa).
La mayor parte de las vacunas actualmente disponibles se administran por vía parenteral, lo que implica la intervención de un personal médico formado, costes elevados, puede provocar reacciones en el punto de inyección y, en ciertas circunstancias, puede ser el origen de infecciones por la utilización de jeringuillas contaminadas (por ej. transmisión del VIH, virus de las hepatitis).
La OMS considera además que, en los países en vías de desarrollo, el 50% de las inyecciones efectuadas con fines de vacunación no son seguras debido a la repetida reutilización de las jeringuillas no esterilizadas (Jodar, L. y col., Vaccine 19, 1594-1605, 2001; Kane, A. y col., Bull. WHO 77, 801-807, 1999). Además, la utilización de jeringuillas es en general, sobre todo para los niños, sinónimo de sufrimiento. Parece, pues, necesario desarrollar una nueva generación de vacunas, fáciles de administrar, económicas, con métodos de inmunización fáciles de llevar a la práctica.
Las vacunas aplicadas en mucosas y las transcutáneas representan una alternativa atractiva a las vacunas administradas por vía parenteral. La administración en las mucosas, por ejemplo por vía nasal, permite inducir respuestas inmunes en los sitios que son la puerta de entrada de numerosos patógenos, y constituye una alternativa eficaz a la administración por vía oral, que permanece asociada a un acceso difícil hasta las células presentadoras de antígenos, la degradación proteolítica se produce a nivel del tracto intestinal y, por tanto, la respuesta inmune es de poca amplitud.
La piel, nuestra principal interfase con el entorno exterior, es también una barrera inmune contra la entrada de numerosos patógenos. Posee células inmunocompetentes específicas, que son los queratinocitos y, sobre todo, las células de Langerhans, y está equipada con ganglios linfoides y con subgrupos de linfocitos T, el conjunto constituye "el tejido linfoide asociado a la piel" (Skin-associated lymphoid tissue, SALT) (Bos, J.D. y col., Immunol. Today 14, 75-78, 1993).
Su capacidad para atravesar las membranas celulares permite a los lipopéptidos actuar como vehículos de los epítopes a través de las superficies de las mucosas, permitiendo de este modo su transporte no solo a nivel del sistema inmunológico local, sino también del sistémico (solicitud internacional nº WO 01/41797).
La utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos de la presente invención para la fabricación de una vacuna, contempla además el uso de otros constituyentes de carácter anfífilos o de excipientes capaces de asegurar una buena solvatación en el agua gracias a una parte polar y la interacción de tipo Van der Waals con los lipopéptidos de carácter hidrófobo:
Estos excipientes o constituyentes anfífilos pueden estar formados en su mayor parte por aminoácidos polares o cargados.
En una forma preferida de ejecución de la invención, la mezcla de lipopéptidos contiene además uno o varios excipientes clínicamente aceptables.
De modo especialmente ventajoso, el excipiente clínicamente aceptable es la manita o el Polisorbato 80 o una mezcla de ambos.
La presente invención se refiere en especial a las vacunas, que, como antígenos peptídicos, llevan por lo menos dos secuencias procedentes de las proteínas Gag, Pol y Nef del virus VIH, en especial un mezcla de las secuencias Gag 17-35, Gag 253-284, Pol 325-355, Nef 66-97, Nef 116-147 y de modo muy especial los lipopéptidos descritos en el ejemplo 1.
En los lipopéptidos empleados se introduce con preferencia una lisina suplementaria en el extremo C de cada péptido y se amida el ácido carboxílico del extremo C. El grupo funcional amina (e-NH2) de la cadena lateral de esta lisina se modifica con un resto palmitoílo unido a través de un espaciador que contiene un enlace hidrazona. En otro modo de ejecución preferido, la utilización según la invención contiene como antígenos peptídicos, las secuencias peptídicas siguientes:
-
VHC 1 HzAc: H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
-
VHC 2 HzAC: H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
-
VHC 3 HzAc: H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2.
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La invención se refiere además a las secuencias nativas:
\quad
NS3 1007-1037: H-KGREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
\quad
NS3 1174-1195: H-KGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
\quad
NS3 1524-1553: H-KGAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2,
que presentan carácter inmunogénico.
Aparte de las disposiciones precedentes, la invención comprende además otras disposiciones que resultarán evidentes a partir de la descripción que sigue, que se refiere a ejemplos de ejecución de la utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos de la invención para la fabricación de una vacuna, así como a la figura 1 que ilustra los resultados del análisis de la inmunogenicidad en el macaco después de la inyección de dosis de la vacuna (VIS) del ejemplo 5.
En los ejemplos siguientes se emplean estas abreviaturas: eq.: equivalentes; Boc: tert-butiloxicarbonilo; Fmoc: 9-fluorenil-metoxicarbonilo; Mtt: 4-metil-tritilo; DMF: dimetilformamida; TFA: ácido trifluoracético; CH_{2}Cl_{2}: diclorometano; MeOH: metanol; EtOH: etanol; THF: tetrahidrofurano; AcOH: ácido acético; AcOEt: acetato de etilo; H_{2}O: agua; AcO-NH_{4}^{+}: acetato amónico; CDCl_{3}: cloroformo deuterado; EDT: etanoditiol; TIS: triisopropilsilano; DMSO-d6: sulfóxido de dimetilo-d6 (totalmente deuterado); NaIO_{4}: peryodato sódico; NaCl: cloruro sódico; Na_{2}SO_{4}: sulfato sódico; MgSO_{4}: sulfato magnésico; KH_{2}PO_{4}: dihidrogenofosfato potásico; PAL: "engarce péptido-amida"; Bop: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfonio; HOBt: N-hidroxibenzotriazol; HBTU: N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(1H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino)metileno]-N-metilmetanaminio; DIEA: diisopropiletilamina; TEAP: fosfato de trietilamina; HPLC: cromatografía de líquidos de alta eficacia; RP-HPLC: cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa; EM-ES: espectrometría de masas por nebulización electrónica; TOF-EM-PD: espectrometría de masas con desorpción de plasma; EM-LC: espectrometría de masas después de cromatografía de líquidos; RMN-H^{1}: resonancia magnética nuclear del protón; RMN-C^{13}: resonancia magnética nuclear del carbono.
Ejemplo 1 Preparación de dosis de vacuna (lipopéptidos VIH-HzPAM) utilizables en el hombre, modelo de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) 1) Síntesis de hidrazinopéptidos Síntesis peptídica
Se preparan cinco péptidos, derivados de las proteínas Gag, Pol y Nef del virus HIV-1, funcionalizadas con grupos \alpha-hidrazinoacéticos a nivel de la cadena lateral de una lisina introducida en el extremo C. Estos hidrazinopéptidos se sintetizan en fase sólida en forma de sales trifluoracetato. Se aplican las estrategias Fmoc/tert-butilo (convencional), y un procedimiento descrito recientemente (ácido N,N',N'-tri(tert-butiloxicarbonil)-hidrazinoacético) para introducir de modo específico un grupo hidrazinoacetilo en un grupo \varepsilon-amino desprotegido de un resto lisilamida en posición del extremo C (BONNET, D. y col., J. Org. Chem. 2001 y solicitud de patente PCT/FR00/02336). Según las secuencias, los rendimientos de la síntesis se sitúan entre el 10 y el 50%. Después de la disgregación y desprotección, se verifica la identidad de los péptidos por EM-ES. Se someten los hidrazinopéptidos a un análisis de la composición de aminoácidos después de la hidrólisis ácida total con ácido clorhídrico: HCl 6N/fenol = 10/1, a 110ºC durante 24 h.
Cromatografía
Se purifican los hidrazinopéptidos por RP-HPLC en una columna preparativa C3 (columna Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro = 12,5 mm y longitud = 250 mm, con columna previa) en un equipo HPLC Shimatzu 6A. Los análisis de RP-HPLC se realizan en una columna preparativa C3 (columna Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro = 4.6 y longitud = 250 mm) en un equipo HPLC Shimatzu 10A.
Los eluyentes (disolventes A y B) son los siguientes:
- disolvente A: agua desionizada que contiene un 0,05% de TFA,
- disolvente B (purificación): 0,05% de TFA en una mezcla propan-2-ol/H_{2}O (40:60).
- disolvente B (con reacción posterior, análisis): 0,05% de TFA en una mezcla acetonitrilo/H_{2}O (80:20).
El caudal de la elución es de 1 ml/min empleando un gradiente lineal del 10 al 100% del tampón B en 30 minutos, el 100% de tampón B durante 10 minutos, el 10% de tampón B durante 10 minutos (detección a 215 nm, temperatura: 50ºC).
Los péptidos obtenidos, en forma de sales trifluoracetato, se recogen en la siguiente tabla 1.
TABLA 1 Hidrazinopéptidos derivados de proteínas del virus VIH-1
3
En la siguiente tabla II se recogen los tiempos de elución de los hidrazinopéptidos obtenidos.
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TABLA II
4
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2) Síntesis del vector lipófilo Pam ([3-(2-oxo-acetilamino)-propil]-amida del ácido hexadecanoico, también presente en forma de "vector Pam hidratado": [3-(2,2-dihidroxi-acetilamino)-propil]-amida del ácido hexadecanoico)
La síntesis de este vector, compuesto por un grupo palmitoílo y por un grupo glioxililo, ha sido descrita por MELNYK y colaboradores en la solicitud de patente nº PCT/FR01/02787 (ejemplo 4: síntesis del vector lipófilo "IIIa") y por Bonnet y colaboradores (BONNET, D. y col., Tetrahedron Letters, 2000).
En un matraz de 500 ml se disuelven 10 g (66,6 mmoles) de ácido tartárico 1 en 200 ml de etanol absoluto, en presencia de un 1% en peso de resina Amberlyst 15. El matraz está equipado con un montaje soxhlet que contiene tamices moleculares activados de 4 \ring{A}. Se calienta el etanol a reflujo durante 48 h. Después se filtra la mezcla reaccionante a través de una frita de vidrio nº 4 para separar la resina. Se concentra a presión reducida el líquido filtrado, formándose un aceite amarillo claro. Se seca el residuo 2 con P_{2}O_{5} durante una noche y se emplea sin más purificación (m = 13,46 g, rendimiento = 98,0%).
El análisis del compuesto 2, representado a continuación, por cromatografía de capa fina arroja un índice migración Rf = 0,76 en el eluyente CH_{2}Cl_{2}/MeOH/H_{2}O/AcOH (90/10/0,1/0,05).
RMN-H^{1} (CDCl_{3}): 1,33 (t, 6H, H_{5,5'}, J_{5-4} = 7,2 Hz), 3,28 (s, 2H, H_{1,1'}), 4,33 (q, 4H, H_{4,4'}, J_{4-5} = 7,1 Hz), 4,54 (s, 2H, H_{2,2'}). RMN-C^{13}: 14,14 (C_{5,5'}), 62,48 (C_{4,4'}), 72,08 (C_{2,2'}), 171,62 (C_{3,3'}).
5
Se disuelven 13,46 mg (65,26 mmoles) del compuesto 2 en 155 ml de etanol absoluto y se añaden por goteo a 56 ml (665,26 mmoles) de 1,3-diamino-propano. Se agita la mezcla reaccionante a temperatura ambiente durante 3 h. Se elimina el exceso de 1,3-diaminopropano por evaporación a presión reducida y arrastre azeotrópico en presencia de etanol (3 x 200 ml). Se seca el aceite amarillo resultante con P_{2}O_{5} durante una noche, se recoge en una mezcla etanol/tolueno (1/1) y se concentra a presión reducida (3 x 200 ml). De este modo se obtiene un compuesto amarillo, de consistencia pastosa. Se precipita este compuesto en 50 ml de una mezcla de éter etílico/etanol (5/1), se filtra y se agita el precipitado blancuzco a 0ºC durante 1 h 30 min en presencia de éter etílico. Se filtra a través de una frita de vidrio y se lava 2 veces con la cantidad mínima de éter etílico frío. Se seca el sólido residual 3 con P_{2}O_{5} durante una noche (m = 13,92 g, rendimiento = 81,3%).
El análisis del compuesto 3, representado a continuación, arroja los valores siguientes: Rf = 0,34 en THF/AcOH/
H_{2}O/AcO-NH_{4}^{+} (35/20/10/1% en peso). RMN-H^{1} (DMSO-d6): 1,48 (q, 4H, H_{6 \ y \ 6'}, J_{6-5,6,7 \ y \ 6'-5',6',7'} = 6,65 H_{2}), 2,51 (m, 4H, H_{7-7'}), 3,14 y 3,16 (t, 4H, H_{5 \ y \ 5'}, J_{5-6 \ y \ 5'-6'} = 6,3 Hz), 4,19 (s, 2H, H_{2,2}), 7,75 (t, 2H, H_{4,4'}, J_{4,4'} = 5,97 Hz). RMN-C^{13}: 33,51 (C_{6,6'}), 36,98 (C_{7,7'}), 40,06 (C_{5,5'}), 73,43 (C_{2,2'}), 172,87 (C_{5,5'}).
6
Se disuelven 996,9 mg (3,8 mmoles) del compuesto 3 en 15 ml de agua. Se ajusta el pH de la solución, que es de 8,5, a 3,25 por adición de 1,46 g de ácido cítrico. Después se añaden en cuatro porciones 1,06 g (4,9 mmoles) de NaIO_{4}, durante 5 minutos, a la mezcla reaccionante mantenida a temperatura ambiente con un baño de agua. Después se agitar durante 10 minutos se añaden 570 mg de ácido tartárico (3,8 mmoles) para neutralizar el exceso de NaIO_{4} que no haya reaccionado.
Después de agitar a temperatura ambiente durante 10 minutos se ajusta el pH a 8,6 con 24 ml de N-metil-morfolina. Se diluye la mezcla reaccionante con 70 ml de 2-metil-propan-2-ol y 20 ml de agua. Entonces se añaden 2,16 g (1,6 eq.) de palmitoato de succinimidilo a la solución que se agita a temperatura ambiente durante una noche. Se ajusta el pH a 3,5 con 7,11 g de ácido cítrico. Se diluye la mezcla con 40 ml de una solución saturada de NaCl y se extrae con 140 ml de diclorometano, después con 100 ml de cloroformo. Se lava la fase orgánica dos veces con 100 ml de una solución saturada en KH_{2}PO_{4}, dos veces con 100 ml de una solución saturada de NaCl, se seca con Na_{2}SO_{4}, se filtra y se concentra a presión reducida. Se purifica el compuesto sólido residual a través de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla de CH_{2}Cl_{2}/AcOEt/EtOH (70/22/5). De este modo se obtienen 951,4 mg del vector lipófilo (IIIa), que equivalen a un rendimiento del 42,3%.
El análisis del compuesto (IIIa), representado a continuación en su forma hidratada, es la siguiente: RMN-H^{1} (DMSO-d6): 0,87 (t, 3H, H_{1}, J_{1,2} = 5,31 Hz), 1,25 (m, 24H, H_{2}), 1,83 (m, 4H, H_{3}, H_{8}), 2,39 (m, 2H, H_{4}), 3,57 (m, 4H, H_{7}, H_{9}), 4,41 (s, 2H, H_{14,15}), 5,50 (m, 1H, H_{12}). RMN-C^{13}: 14,31 (C_{1}), 22,96 (C_{2}), 26, 35 (C_{8}), 29,99 (C_{3}), 36, 79 (C_{4}), 37,14 (C_{7}), 92,18 (C_{12}), 173,42 (C_{5}), 175, 22 (C_{11}). EM-ES: [M+H]^{+} calculado = 387,5; hallado = 387, 2.
7
3) Síntesis de lipopéptidos
Se obtiene una mezcla homogénea de hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en agua o en ácido acético diluido, mezclado de las soluciones y liofilización posterior. Se realiza una primera síntesis empleando 9,6 mg de una mezcla equiponderal de cada uno de los 5 péptidos VIH (VIH 1 HzAc; VIH 2 HzAc; VIH 3 HzAc; VIH 4 HzAc y VIH 5 HzAc), correspondiente a un valor de 2,22 micromoles de péptidos (teniendo en cuenta los contraiones y de la concentración de los péptidos en el liofilizado). Se añaden a esta mezcla 85 \mul de agua, de ello resulta la formación de un gel. Entonces se añade el vector lipófilo IIIa (977 \mug, 2,52 \mumoles) con agitación magnética con esferillas de vidrio de 5 mm de diámetro, es decir, 1,14 equivalentes con respecto a los péptidos, en solución en 714 ml de 2-metil-propan-2-ol. Se alcanza el volumen total de la mezcla reaccionante (1,7 ml) por adición de 2-metil-propan-2-ol.
La desaparición de los hidrazinopéptidos con el tiempo lleva asociada la aparición paralela de los lipopéptidos correspondientes.
Se realiza un ensayo micropreparativo con el fin de identificar los productos: se saca una muestra para realizar la separación de los constituyentes por RP-HPLC en una columna C3 (Zorbax, 4,6 mm x 250 mm), con recogida de los picos principales con el fin de identificarlos por espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI 4192, modo positivo, reflector 25 kV, intervalo de extracción 300 ms, matriz de ácido \alpha-cianocinámico).
Después de 4 horas, la reacción ha finalizado, entonces se diluye la mezcla con agua, se congela y se liofiliza. Los lipopéptidos obtenidos se presentan en forma de polvo blanco. El tiempo de retención (ret.) de los lipopéptidos obtenidos se recoge en la siguiente tabla III.
TABLA III
8
4º) Preparación de las mezclas de lipopéptidos Intercambio iónico
Se disuelven los lipopéptidos en forma de sales de TFA en una solución acuoso de ácido acético de pH 3, se introducen en la columna de RP-HPLC (columna Nucleoprep C4, 25 mm x 100 mm), se lavan con el mismo disolvente (los lavados se efectúan con un volumen equivalente al de 5 columnas) y se eluyen mediante un paso sin transición hacia un disolvente ácido acético de pH 3 en agua/propan-2-ol (60:40).
Preparación final
Se disuelve la mezcla de lipopéptidos liofilizados en una solución de ácido acético al 10% y después se somete a una filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras (SLGV, Millipore).
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5) Preparación de las dosis de vacuna
Después de la incorporación de los excipientes clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p) y Polisorbato 80/lipopéptidos 2/7 (p/p)) se diluye la solución en agua y se divide en partes alícuotas en viales de vidrio estériles antes de la liofilización final.
Las dosis unitarias de vacuna destinadas al ensayo clínico de fase I para el hombre son de 2,5 mg de cóctel lipopeptídico.
Ejemplo 2 Preparación de dosis de vacuna (lipopéptidos VHC HzPam) utilizables en el hombre, modelo de virus de la hepatitis C (VHC) 1) Síntesis de los hidrazinopéptidos Síntesis peptídica
Se preparan tres péptidos, derivados de la proteína NS3 del virus VHC-1, funcionalizados con grupos \alpha-hidrazinoacéticos a nivel de su extremo N-terminal. Se sintetizan estos hidrazinopéptidos en fase sólida, en forma de sales trifluoracetato. Se aplican las estrategias Fmoc/tert-butilo (convencional) y el procedimiento descrito recientemente (ácido N,N',N'-tri(tert-butiloxicarbonil)-hidrazinoacético) para introducir de modo específico un grupo hidrazinoacetilo en el grupo \varepsilon-amino desprotegido del resto lisilamida en posición N-terminal del modo descrito en el ejemplo 1. Según las secuencias, los rendimientos de la síntesis se sitúan entre el 10 y el 50%.
Se verifica la identidad de los péptidos por EM-ES. Se someten los hidrazinopéptidos a un análisis para determinar la composición de aminoácidos después de una hidrólisis ácida total con ácido clorhídrico: HCl 6N/fenol = 10/1 a 110ºC durante 24 h.
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Cromatografía
Se purifican los hidrazinopéptidos por RP-HPLC en una columna preparativa C3 (columna Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro = 12,5 mm y longitud = 250 mm, con columna previa) en un equipo HPLC Shimatzu 6A. Los análisis de RP-HPLC se realizan en una columna preparativa C3 (columna Zorbax:300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro = 4,6 mm y longitud = 250 mm) en un equipo HPLC Shimatzu 10A.
Los eluyentes (disolventes A y B) son los siguientes:
- disolvente A: agua desionizada que contiene un 0,05% de TFA,
- disolvente B (purificación): 0,05% de TFA en un mezcla propan-2-ol/H_{2}O (40:60).
- disolvente B (con reacción posterior): 0,05% de TFA en una mezcla de n-propanol/H_{2}O (40:60).
El caudal de elución es de 1 ml/min empleando un gradiente lineal del 0 al 100% de tampón B en 30 minutos, 100% de tampón B durante 5 minutos, 0% de tampón B durante 10 minutos (detección a 215 nm, temperatura: 50ºC). Les hidrazinopéptidos obtenidos se recogen en la siguiente tabla IV.
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TABLA IV Hidrazinopéptidos derivados de la proteína NS3 del virus VHC-1
9
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Los tiempos de retención de los hidrazinopéptidos se indican en la siguiente tabla V.
TABLA V
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2) Síntesis del vector Pam
La síntesis de este vector IIIa, compuesto por un grupo palmitoílo y por un grupo glioxililo, se describe en el ejemplo 1.
3) Síntesis de lipopéptidos
Se obtiene una mezcla homogénea de hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en agua o en ácido acético diluido, mezclado de estas diluciones y después liofilización. Se realiza una primera síntesis empleando 41,8 mg de una mezcla equiponderal de cada uno de los 3 hidrazinopéptidos, correspondiente a un valor de 10,77 micromoles de hidrazinopéptidos (teniendo en cuenta los contraiones y la concentración de los péptidos en los liofilizados). A esta mezcla se le añaden 415 \mul de agua, formándose un gel. Entonces se añade el vector lipófilo IIIa (4757 \mug, 12,28 \mumoles, que corresponden a 1,14 equivalentes referidos a los péptidos) con agitación magnética con algunas esferillas de vidrio de 5 mm de diámetro y se solubilizan en 950 \mul de 2-metil-propan-2-ol. Se alcanza el volumen total de mezcla reaccionante (8,290 ml) por adición de 2-metil-propan-2-ol.
La desaparición de los hidrazinopéptidos a lo largo del tiempo va acompañada de la aparición paralela de los lipopéptidos correspondientes.
Se realiza un ensayo micropreparativo para identificar los productos: se saca una muestra para separar los constituyentes por RP-HPLC en una columna C3 (Zorbax, 4,6 mm x 250 mm), recogiendo los picos principales con el fin de identificarlos por espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI 4192, modo positivo, reflector 25 kV, intervalo de extracción: 300 ms, matriz de ácido \alpha-ciano-cinámico).
Pasadas 4 horas, la reacción ha finalizado, entonces se diluye la mezcla con agua, se congela y se liofiliza. Los lipopéptidos obtenidos se presentan en forma de polvo blanco.
Los lipopéptidos obtenidos tienen los tiempos de retención que se indican en la siguiente tabla VI.
TABLA VI
12
3') Síntesis de lipopéptidos con un glucomimético ramificado
Esta síntesis se realiza a partir de la mezcla de hidrazinopéptidos VHC obtenidos anteriormente con un glucomimético ramificado de cuatro valencias (árbol tetraquinoilado) obtenido a partir de un árbol de lisina sintetizado mediante una estrategia Fmoc/tert-butilo, al que se incorpora un grupo hidrazinoacetilo sobre el grupo \varepsilon-amino desprotegido del resto lisilamida C-terminal, de la fórmula (IV) de la invención.
La síntesis de este glucomimético, llamado [(Qui)_{4}AKHdz)], se describe en el ejemplo 2 de la solicitud de patente nº PCT/FR01/02787).
Se obtiene una mezcla homogénea de hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en agua o ácido acético diluido, mezclado de las soluciones y finalmente liofilización. Se añaden 8,9 mg de una mezcla equiponderal de cada uno de los 3 hidrazinopéptidos, equivalente a 2,14 micromoles de hidrazinopéptidos, a 2,3 mg (es decir, 1,6 \mumoles) del glucomimético hidrazina. Al gel formado después de la humidificación con 140 \mul de agua se le añade el vector lipófilo IIIa (1640 microgramos, es decir, 1,14 equivalentes de péptido) disuelto en 2-metil-propan-2-ol (410 \mul), con agitación magnética y con algunas esferillas de vidrio de 5 mm de diámetro, el volumen final es de 2,7 ml.
La desaparición de los hidrazinopéptidos a lo largo del tiempo va acompañada de la aparición paralela de los lipopéptidos correspondientes.
Pasadas 3 horas se diluye la mezcla con agua, se congela y se liofiliza. Los lipopéptidos obtenidos se presentan en forma de polvo blanco.
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4) y 4') Preparación de mezclas de lipopéptidos
Después del intercambio iónico descrito en el ejemplo 1 se disuelven las mezclas de lipopéptidos liofilizados obtenidas en 3) y 3') en una solución de ácido acético al 10% y después se someten a una filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras (SLGV, Millipore).
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5) y 5') Preparación de las dosis de vacuna 5) Formulación manita-Tween®: [3 lipopéptidos, vector Pam]
Después de la incorporación de los excipientes clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p) y Polisorbato 80/lipopéptidos 2/7 (p/p)) se diluye la solución con agua y se divide en partes alícuotas en viales de vidrio estériles antes de la liofilización final.
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5') Formulación manita-glucomimético lipidado: [3 lipopéptidos + glucomimético, vector Pam]
Se disuelve la mezcla liofilizada de lipopéptidos y glucomimético lipidado [(Qui)_{4}AKHdz)] en una solución de ácido acético al 10% y después se somete a una filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras (SLGV, Millipore).
Después de la incorporación de los excipientes clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p)) se diluye la solución con agua en un matraz estéril antes de la liofilización final.
Las dosis unitarias de vacuna destinadas al ensayo clínico de fase I para el hombre son de 2,5 mg de cóctel lipopeptídico.
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Ejemplo 3 Preparación de dosis de vacuna (lipopéptidos VHC HzCChol) utilizables en el hombre, modelo de virus de la hepatitis C (VHC) 1) Síntesis de los hidrazinopéptidos Síntesis peptídica
La síntesis es la misma que se ha descrito en el ejemplo 2.
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Cromatografía
Se purifican los hidrazinopéptidos por RP-HPLC en una columna preparativa C3 (columna Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro: 12,5 mm y longitud = 250 mm con columna previa) en un equipo HPLC Shimatzu 6A. Los análisis de RP-HPLC se realizan en una columna preparativa C3 (columna Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro = 4,6 y longitud = 250 mm) en un equipo HPLC Shimatzu 10A. Los eluyentes (disolventes A y B) son los siguientes:
- disolvente A: agua desionizada que contiene un 0,05% de TFA,
- disolvente B: 0,05% de TFA en una mezcla propan-2-ol/H_{2}O (40:60).
El caudal de elución es de 1 ml/min empleando un gradiente lineal del 0 al 100% de tampón B en 30 minutos, 100% de tampón B durante 5 minutos, 0% de tampón B durante 10 minutos (detección a 215 nm, temperatura: 50ºC).
2) Síntesis del vector CChol ([3-(2,2-dihidroxi-acetilamino)-propil]-carbamato de 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo, también en forma de "vector Cchol hidratado": [3-(2-oxo-acetilamino)-propil]-carbamato de 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,
10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo).
La síntesis de este vector ha sido descrita por MELNYK y colaboradores en la solicitud de patente nº PCT/FR01/
02787, ejemplo 4: síntesis del vector lipófilo "IIIc", correspondiente a la fórmula (II) de la presente invención.
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3) Síntesis de lipopéptidos
Se obtiene una mezcla homogénea de hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en agua o en ácido acético diluido, mezclado de las soluciones y después liofilización. Se realiza una primera síntesis empleando 12,2 mg de una mezcla equiponderal de cada uno de los 3 péptidos VHC (VHC 1 HzAc; VHC 2 HzAc y VHC 3 HzAc), equivalente a 2,96 micromoles de péptidos (teniendo en cuenta los contraiones y la concentración de los péptidos en los liofilizados). A esta mezcla se le añaden 115 \mul de agua, formándose un gel. Entonces se añade el vector lipófilo II (1926 \mug, 3,374 \mumoles, que corresponden a 1,14 equivalentes referidos a los péptidos) con agitación magnética con algunas esferillas de vidrio de 5 mm de diámetro, solubilizado en 292 \mul de 2-metil-propan-2-ol. Se alcanza el volumen total de la mezcla reaccionante (2,3 ml) por adición de 2-metil-propan-2-ol.
La desaparición de los hidrazinopéptidos en el curso del tiempo va acompañada de la aparición paralela de los lipopéptidos correspondientes.
Se realiza un ensayo micropreparativo para identificar los productos: se saca una muestra para separar los constituyentes por RP-HPLC en una columna C3 (Zorbax, 4,6 mm x 250 mm), recogiendo los picos principales con el fin de identificarlos por espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI 4192, modo positivo, reflector: 25 kV, intervalo de extracción 300 ms, matriz: ácido \alpha-ciano-cinámico). Pasadas 4 horas, la reacción ha finalizado, entonces se diluye la mezcla con agua, se congela y se liofiliza. Los lipopéptidos obtenidos se presentan en forma de polvo blanco.
En la siguiente tabla VII se recogen los tiempos de retención de los lipopéptidos obtenidos.
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TABLA VII
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3') Síntesis de lipopéptidos con un glucomimético ramificado
Se obtiene una mezcla homogénea de hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en agua o en ácido acético diluido, mezclado de las soluciones y después liofilización. Se realiza esta síntesis a partir de la mezcla de hidrazinopéptidos con el glucomimético ramificado de cuatro valencias [(Qui)_{4}AKHdz)]. Se añaden 12 mg de una mezcla equiponderal de cada uno de los 3 hidrazinopéptidos (descritos en 3)), correspondientes a 2,9 micromoles de hidrazinopéptidos, a 3,3 mg (es decir, 2,2 \mumoles) del glucomimético hidrazina. Al gel formado después de la humidificación con 200 \mul de agua se le añade el vector lipófilo (II) (3360 microgramos, es decir, 1,14 equivalentes de péptido) disuelto en 2-metilpropan-2-ol (510 \mul), con agitación magnética en unas pocas esferillas de vidrio de 5 mm de diámetro. El volumen final de la mezcla reaccionante es de 3,8 ml.
La desaparición de los hidrazinopéptidos en el curso del tiempo va acompañada de la aparición paralela de los lipopéptidos correspondientes.
Pasadas 4 horas se diluye la mezcla con agua, se congela y se liofiliza. Los lipopéptidos obtenidos se presentan en forma de polvo blanco.
Para los lipopéptidos CChol (con o sin glucomimético) según 3) y 3') es necesario un paso suplementario de purificación para eliminar una cantidad no despreciable de productos previos de síntesis hidrazina que no hayan reaccionado.
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Esta purificación de la mezcla reaccionante se realiza por RP-HPLC en un equipo Shimadzu 6A, con una columna C4 Deltapak WATERS 15 \muM 300 \ring{A}, 8 mm de diámetro y 100 mm de longitud.
Los eluyentes (disolventes A y B) son los siguientes:
- disolvente A: agua desionizada que contiene un 0,05% de TFA,
- disolvente B (purificación): 0,05% de TFA en una mezcla propan-2-ol/H_{2}O (40:60).
El caudal de la elución es de 2 ml/min empleando un gradiente lineal del 0 al 80% de tampón B en 12 minutos, después 100% de tampón B. La fracción de lipopéptido eluido se congela y se liofiliza.
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4) y 4') Preparación de mezclas de lipopéptidos
Después del intercambio iónico descrito en el ejemplo 1 se disuelve las mezclas de lipopéptidos liofilizados obtenidos en 3) y 3') en una solución de ácido acético al 10% y después se someten a una filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras (SLGV, Millipore).
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5) y 5') Preparación de dosis de vacuna 5) Formulación manita-Tween: [3 lipopéptidos, vector CChol]
Después de la incorporación de excipientes clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p) y Polisorbato 80/lipopéptidos 2/7 (p/p)) se diluye la solución de lipopéptidos con agua en un matraz estéril y después se realiza la liofilización final.
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5') Formulación manita-glucomimético lipidado: [3 lipopéptidos + glucomimético, vector CChol]
Después de la incorporación de los excipientes clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p)) se diluye la solución de lipopéptidos y glucomimético lipidado con agua en un matraz estéril y después se realiza la liofilización final.
Las dosis unitarias de vacuna destinadas al ensayo clínico de fase I para el hombre son de 2,5 mg de cóctel lipopeptídico.
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Ejemplo 4 Evaluación en el ratón de la capacidad de los lipopéptidos de potencial vacunador para inducir una respuesta inmune contra el virus de la hepatitis C (VHC) (ensayos preclínicos) A/ Respuesta linfo-proliferativa específica
Se lipidan con el vector Pam tres péptidos derivados de la proteína NS3 del virus VHC-1, funcionalizados con grupos \alpha-hidrazinoacéticos a nivel de su extremo N-terminal (véase el ejemplo 2) o de su extremo C-terminal (ver procedimiento de síntesis del ejemplo 1).
Se analiza la inmunogenicidad de estos lipopéptidos en ratones singénicos Balb/c y C57bl/6 por inyección subcutánea de los 3 lipopéptidos N-terminal o C-terminal vector Pam (1,2 mg de la mezcla para ratones, equivalentes a 100 \mug de lipopéptidos), o bien de 3 péptidos nativos (100 \mug para ratones) + montanida ISA 720, o bien 3 péptidos nativos solos (100 \mug para ratones).
La medición de la linfoproliferación se realiza después de cultivar las células de bazo murino, del modo indicado a continuación:
Se recuperan los bazos y se incuban a 4ºC en un medio RPMI 1640 (GIBCO BRL). A continuación se aplastan las células contra una membrana de poliamida (nylon). Se centrifugan las células a 1500 rpm a 4ºC durante 10 min. Se efectúa la lisis de los hematíes en presencia de tampón de lisis a 4ºC durante 10 minutos. Después se centrifugan las células y se recogen en un medio HL-1 (Biowhittaker) que contiene un 4% de suero de ratones autólogos. Después se reparten las células en placas de cultivo de 96 hoyos de poliestireno, de fondo en forma de U (Costar), a razón de 100 \mul por hoyo. Se diluyen los péptidos sintéticos nativos (Néosystem) en un medio HL-1 (Biowhittaker) y después se añade a razón de 100 \mul por hoyo hasta una concentración final de 25 \mug/ml. Se incuban las placas de cultivo a 37ºC durante 72 horas en atmósfera húmeda y un 5% de CO2. Se diluye la metil-timidina tritiada (Amersham) en un medio HL-1 (Amersham) y después se añade a cada hoyo a razón de 1 \muCurie en 25 \mul. Después de 16 horas de incubación se recogen las células en un filtro de fibra de vidrio (Wallac) con un equipo TOMTEC. La incorporación de la timidina tritiada se determina seguidamente con un contador beta (Wallac 140 microbeta).
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Los resultados de este análisis se recogen en la siguiente tabla VIII.
Tablas VIIIa y VIIIb: medición de la linfoproliferación (expresada como índice de estimulación).
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TABLA VIIIa Lipopéptido N-terminal
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TABLA VIIIb Lipopéptido C-terminal
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Los resultados de estos análisis indican que los dos tipos de construcciones (posición N-terminal y posición C-terminal) inyectados por vía subcutánea a ratones singénicos Balb/c y C57bl/6 son capaces de inducir una respuesta linfo-proliferativa específica de las secuencias peptídicas del VHC.
B/ Respuesta humoral
Se ensayan los 3 lipopéptidos en posición N-terminal empleados en A/para inducir una respuesta humoral en los ratones. Se ensayan también a título comparativo los 3 péptidos nativos y la montanida ISA 720.
Se inmunizan los ratones por administración subcutánea de 1,2 mg (equivalentes a 100 \mug de lipopéptidos, vector Pam + manita + Tween o 100 \mug de una mezcla de péptidos nativos en presencia de montanida). Se realiza la inmunización con un recordatorio los días d15 y d29. Se extraen los sueros los días d14, d28 y d42 después de la primera administración de los antígenos.
La dosificación de las inmunoglobulinas específicas de antígenos se efectúa del modo siguiente:
Se solubilizan los antígenos peptídicos en tampón fosfato 0,1 M, de pH 8,2, en una concentración de 10 \mug/ml. Se introducen 100 \mul de esta solución por hoyo, en una placa de 96 hoyos Maxisorb (NUNC). Después de la incubación a 4ºC durante una noche y dos lavados con tampón PBS-Tween 0,01%, se saturan los hoyos en presencia de un tampón PBS que contiene un 3% de albúmina de suero bovino (BSA). Después de incubar a temperatura ambiente durante 2 horas se realizan 2 lavados de los hoyos con tampón PBS-Tween. A continuación se añaden 100 \mul de de suero, diluido a razón de 1/100, y se incuban a 4ºC durante una noche. Después se realizan 3 lavados con PBS-Tween. Se incuba el anticuerpo secundario, marcado con peroxidasa (anti-IgG (H+L) de ratón, Sanofi Pasteur), en tampón PBS-BSA 1% a razón de 100 \mul por hoyo, a temperatura ambiente durante una hora. Después de 4 lavados con PBS-Tween, se realiza el revelado en presencia de diclorhidrato de ortofenildiamina (OPD, SIGMA) diluido en tampón de revelado (tampón fosfato-citrato con perborato sódico, SIGMA). Después de una incubación de 30 minutos en la oscuridad se interrumpe la reacción la reacción con HCl 1M, a razón de 50 \mul por hoyo.
La lectura se realiza a una longitud de onda de 492 nm.
Los resultados se recogen en la siguiente tabla IX.
TABLA IX Dosificación de anticuerpos totales a ratones Balb/c inmunizados (resultados expresados en densidad óptica)
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Los resultados demuestran que los lipopéptidos utilizados son incapaces de inducir una respuesta humoral caracterizada por la producción de anticuerpos específicos en los mismos modelos murinos después de una inmunización seguida por dos recordatorios. Este resultado es tanto más original por el hecho de que estas mismas secuencias, cuando se administran en presencia de un adyuvante aceitoso, como es la montanida ISA 720n, inducen una respuesta de anticuerpos muy importante, detectable a partir de la primera inmunización. Este resultado indica que los lipopéptidos orientan la inmunidad muy intensamente hacia una respuesta de tipo celular.
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C/ Comparación de los vectores Pam y CChol
Se ha evaluado la inmunogenicidad de las mezclas de lipopéptidos en los ratones. Se han comprobado diferentes formulaciones indicadas en los anteriores ejemplos 2 y 3 (3 lipopéptidos, vector Pam; 3 lipopéptidos + glucomimético, vector Pam; 3 lipopéptidos, vector CChol; 3 lipopéptidos + glucomimético, vector CChol).
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1) Procedimiento de inmunización sublingual
Se inmunizan los ratones por vía sublingual con 480 \mug de cada mezcla lipopeptídica disuelta en 5 \mul de agua para la preparación inyectable (H_{2}O ppi). Se administra una dosis de recordatorio a los 14 días de la primera inmunización en las mismas condiciones que antes. Después de 14 días se sacrifican los animales, se les extraen los bazos y se cultivan las células esplénicas en presencia de diferentes péptidos nativos, solos o en forma de mezcla, con una concentración de 10 \mug/ml.
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2) Dosificación de interleucina-2 (IL-2) producida en los sobrenadantes del cultivo
Se incuban los anticuerpos primarios específicos de la IL-2 murina (IL-2 de rata anti-ratón, Pharmingen 18161D) en tampón fosfato 0,1M, pH 8,2, en una concentración de 2 \mug/ml. Se añaden 50 \mul por hoyo de esta solución a una placa de 96 hoyos Maxisorb (NUNC). Después de una incubación a 4ºC durante una noche y dos lavados con tampón PBS-Tween 0,01%, se saturan los pozos en presencia de un tampón PBS que contiene un 3% de albúmina de suero bovino (BSA). Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente se realizan 2 lavados con tampón PBS-Tween. Se añaden a continuación 100 \mul de líquido sobrenadante del cultivo y se incuban a 4ºC durante una noche. Se prepara una gama de diluciones de la IL-2 murina recombinante en PBS-BSA 1% (de 20 ng a 0,3 \mug) y se depositan en cada hoyo 100 \mul de esta preparación. A continuación se efectúan 3 lavados con PBS-Tween.
Se incuba el anticuerpo secundario biotinilado específico de la IL-2 murina (IL-2 de rata biotininilada anti-ratón, Pharmingen 18172D) en tampón PBS-BSA 1% a razón de 100 \mul por hoyo a temperatura ambiente durante una hora. Después de 3 lavados con PBS-Tween, se añade a cada hoyo la estreptavidina-peroxidasa (Jackson Immunoresearch), diluida con PBS-Tween hasta 1 mg/ml, en un volumen de 100 \mul, a temperatura ambiente, durante 30 minutos. Después de 4 lavados con PBS-Tween, se realiza el revelado en presencia del diclorhidrato de la ortofenildiamina (OPD, SIGMA) diluido en tampón de revelado (tampón fosfato-citrato con perborato sódico, SIGMA). Después de una incubación de 30 minutos en la oscuridad se interrumpe la reacción con HCl 1M, a razón de 50 \mul por hoyo. Se realiza la lectura a una longitud de onda de 492 nm.
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3) Otro procedimiento de inmunización sublingual
Se inmunizan los ratones (Balb/c) por administración sublingual de 5 \mul de una mezcla de lipopéptidos (480 \mug de polvo, equivalentes a aprox. 40 \mug de lipopéptidos). Se realiza una administración de recordatorio a los 14 días de esta primera inmunización, con las mismas cantidades de la mezcla de lipopéptidos. Se forman grupos de 5 ratones Balb/c (IFFA-CREDO) a los que se administra cada una de las cuatro formulaciones: [3 lipopéptidos + glucomimético, vector CChol]; [3 lipopéptidos, vector CChol]; [3 lipopéptidos + glucomimético, vector Pam]; [3 lipopéptidos + glucomimético, vector Pam].
Se sacrifican los ratones 7 días de la administración del recordatorio, se les extraen los bazos y se reagrupan por grupos de animales.
Se reestimulan las células de cada grupo de ratones con diferentes péptidos nativos, ya sea a título individual, ya sea en forma de mezcla (concentración: 10 \mug/ml). 24 horas después del inicio del cultivo de las células, se sacan los líquidos sobrenadantes para efectuar la dosificación de su contenido en IL-2. Los resultados se expresan en picogramos de IL-2 por ml de líquido sobrenadante.
En la siguiente tabla X se recogen los resultados del análisis de la inmunogenicidad de diferentes mezclas lipopeptídicas en los ratones.
TABLA X Producción de la IL-2 después de la inmunización sublingual (expresada en \mug/ml)
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Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que los lipopéptidos, resultantes de la lipidación con el vector CChol, inducen una respuesta mejor que los lipopéptidos resultantes de la lipidación con el vector Pam.
Se constata que estos lipopéptidos CChol son especialmente inmunógenos cuando se administran por vía mucosa y muy especialmente por vía sublingual.
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Ejemplo 5 Evaluación en el macaco de la capacidad de las vacunas lipopeptídicas para inducir una respuesta de tipo CTL contra el virus de la inmunodeficiencia símica (VIS) 1) Síntesis de hidrazinopéptidos
En el ejemplo 1 de la solicitud de patente PCT/FR01/02787 se describe la síntesis de péptidos funcionalizados con grupos \alpha-hidrazinoacéticos, a partir de secuencias peptídicas derivadas de proteínas Nef y Gag del virus de la inmunodeficiencia símica (SIV).
Las secuencias peptídicas aquí utilizadas son las mismas que las descritas en la solicitud de patente PCT/FR01/
02787, excepto la secuencia SIV1 (véase la nueva secuencia en la siguiente tabla XI).
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TABLA XI
20
21
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2) Síntesis del vector lipófilo
El vector lipófilo que se emplea es el vector IIIa descrito en el ejemplo 1.
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3) Síntesis de los lipopéptidos
En el ejemplo 8 de la solicitud de patente PCT/FR01/02787 se describe el método de unión entre hidrazinopéptidos y vector lipófilo.
En la siguiente tabla XII se recogen las denominaciones y los pesos moleculares de los lipopéptidos sintetizados de este modo.
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TABLA XII
22
23
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4) Preparación de mezclas de lipopéptidos
Después del intercambio iónico descrito en el ejemplo 1 por RP-HPLC, empleando un gradiente corto, se disuelven las mezclas de lipopéptidos liofilizados resultantes de 3) en una solución de ácido acético al 5% y después se someten a una filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras (SLGV, Millipore).
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5) Preparación de las dosis de vacuna Formulación de manita-Tween
Después del paso 4) se introduce la manita y también el Tween 80 en una cantidad suficiente para la preparar 10 dosis unitarias, cuya composición por dosis es la siguiente:
\bullet 1 dosis contiene 3,5 mg de equivalente péptido (0,5 mg por péptido), es decir, aprox. 4,2 mg de lipopéptido.
\bullet manita libre de pirógenos: aprox. 42 mg por dosis.
\bullet Polisorbato 80: aprox. 1 mg por dosis.
\bullet cantidad total de polvo por dosis: aprox. 47 mg.
\bullet Conservar a -20ºC.
La posterior disolución de las dosis obtenidas según esta formulación permite obtener una solución ligeramente opalescente.
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Formulación de manita-glucomimético lipidado
Se prepara la mezcla por lipidación simultánea (descrita en el ejemplo 3, parte 3')) de una mezcla de hidrazinopéptidos (trifluoracetato) (5,8 mg por hidrazinopéptido) al que se añade un glucomimético ramificado ([(Qui)_{4}AKHdz)], 12,9 mg).
Después de la lipidación se diluye la mezcla y se liofiliza. Se reeemplaza el contraión trifluoracetato por un contraión acetato mediante RP-HPLC, aplicando un gradiente corto.
Después de la liofilización se disuelve el polvo en agua y ácido acético del 5%; después se somete la preparación a una filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras (SLGV, Millipore). Se introduce la manita en una cantidad suficiente para la preparación de 11 dosis unitarias, cuya composición por dosis es la siguiente:
\bullet 1 dosis contiene 3,4 mg de equivalente péptido + glucomimético (0,5 mg por péptido), es decir, 4,2 mg de lipopéptido.
\bullet manita libre de pirógenos: aprox. 42 mg por dosis.
\bullet cantidad total de polvo por dosis: aprox. 47 mg.
\bullet Conservar a -20ºC.
La posterior disolución de las dosis obtenidas con arreglo a esta formulación proporciona una solución ligeramente opalescente.
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7) Estudio de la formulación manita-Tween aplicada al macaco
Se emplea una dosis unitaria por animal, que se aplica por inyección. Se diluye la dosis en agua para preparar el inyectable (1 ml por dosis): se obtiene una solución opalescente.
Se administra el producto (sin adyuvante) por vía intradérmica en 10 puntos de inyección (100 \mul por punto) (4 macacos), por vía intramuscular (4 macacos). Se efectúan las 3 inyecciones a intervalos de 3 semanas y se practica una administración 2 meses después de la última inyección. Se comprueba la respuesta inmune con extracciones de sangre efectuadas en la fase de pre-inmunización, 15 días después la 3ª inmunización y 14 días después del recordatorio.
Se comprueba la eficacia de la inmunización evaluando el número de efectores circulantes y de sus precursores segregadores del interferón gamma (IFN-\gamma) mediante un ensayo ELISPOT después de una reestimulación previa "in vitro" de las células mononucleadas de sangre total (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) por acción de los péptidos.
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Preparación de las PBMC
Se aíslan las PBMC por centrifugación en gradiente en un medio de separación de linfocitos (Flow Laboratories, Glasgow, UK o Pharmacia, Upsala, Suecia) y se utilizan inmediatamente.
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Reestimulación "in vitro"
Se depositan las PBMC (16.106 células) en un medio RPMI 1640 completo a razón de 5 millones/ml; y se dividen en partes alícuotas en 4 tubos de 4 millones de células, que se incuban a 37ºC durante una noche con los lipopéptidos (10 \mug/ml).
Se establecen varias castas:
-
casta 0: sin péptidos;
-
casta 1: con VIS1 HzPam (LP1) y VIS2 HzPam (LP2);
-
casta 2: con VIS3 HzPam (LP3), VIS4 HzPam (LP4) y VIS5 HzPam (LP5);
-
casta 3: con VIS6 HzPam (LP6) y VIS7HzPam (LP7).
Después de 1 lavado al día siguiente se introducen las castas en placas de 24 hoyos, a razón de 2 millones de células por ml y a razón de 2 ml por hoyo. En los días 3 y 7 se añade la interleucina-2 (IL-2, 10 UI/ml) cambiando el medio en el día 7. Se comprueban estos efectores al cabo de 12 días de cultivo y se lavan 2 veces inmediatamente antes del ensayo.
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Ensayo ELISPOT-IFN
En primer lugar se estabilizan placas de 96 hoyos de nitrocelulosa (Millipore) a 4ºC durante una noche con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IFN-\gamma símico (clon GZ-4, de mabtech) (dilución 1/1000 en tampón fosfato (PBS): concentración 1 microgramo/ml al final). Después de los lavados con tampón PBS estéril y saturación con el medio completo a 37ºC en atmósfera de CO_{2} durante 2 horas, se disponen las células efectoras por duplicado (100000 células por hoyo) con los diferentes péptidos (ver párrafo siguiente), sin IL-2, con una concentración final de 5 microgramos por ml (o sin péptido para los controles negativos). Se mantiene la incubación a 37ºC durante 24 horas. Entonces se lavan las placas varias veces con PBS y después con PBS-Tween 0,05%. Después de estos lavados se incuban las placas a 4ºC durante una noche o a 37ºC durante 2 horas, con un anticuerpo monoclonal de ratón anti anti-IFN-\gamma símico biotinilado, diluido hasta 1/1000 con PBS-Tween 0,05%; BSA 1% (clon 7-B6-1, de mabtech, 1 microgramo/ml final).
Después de varios lavados se realiza el revelado mediante estreptavidina-fosfatasa alcalina (SIGMA) a razón de 2,5 microgramos por ml (incubación: 1 h a temperatura ambiente). Después de los lavados suplementarios se revela formándose una coloración medible con un sustrato de azul nitro de tetrazolio (BioRad) durante un tiempo de 15 a 30 minutos. Se enjuagan las placas con agua y se secan. Se realiza la lectura del ensayo contando las manchas (centro contrastado y contorno difuso) con un estereomicroscopio x 40 (Leica MZ6). Cada mancha violeta corresponde a una célula secretora de IFN-\gamma, es decir, una SFC (Spot Forming Cell).
Mezclas de péptidos pequeños empleados para el ensayo ELISPOT: (mezclas de 9-15-meros):
\quad
L3.P1 (epítopes de nef 155-178) = 156-165; 168-177; 165-174
\quad
L3.P2 (epítopes de nef 155-178) = 157-165; 169-178; 166-174
\quad
L3.P3 (epítopes de nef 155-178) = 158-167; 162-171; 167-175
\quad
L4.P1 (epítopes de nef 201-225) = 201-211; 205-213; 211-219; 215-225
\quad
L4.P2 (epítopes de nef 201-225) = 201-210; 205-212; 214-223; 210-219
\quad
L4.P3 (epítopes de nef 201-225) = 203-211; 206-215; 215-223; 204-212
\quad
L5.P1 (epítopes de nef 221-247) = 222-229; 236-244; 225-233
\quad
L5.P2 (epítopes de nef 221-247) = 224-233; 239-247. Mix6 (epítopes de nef 201-225) = 201-211; 205-213;
\quad
211-219; 215-225; 201-210; 205-212
\quad
L7P1 (epítopes de gag 246-281) = 250-257; 255-263; 261-269; 268-276; 253-262
\vskip1.000000\baselineskip
8) Resultados
En la siguiente tabla XIII se indican para cada animal las mezclas de péptidos que permiten detectar las SFC de manera significativa 15 días después de la 3ª inmunización o 14 días de la administración del recordatorio.
TABLA XIII
24
El 1er grupo (macacos nº 1053, 1059, 1060, 1066) recibe la mezcla de los 7 lipopéptidos administrada por vía intradérmica. Los resultados demuestran respuestas positivas de 2 macacos (1053 y 1066), que reconocen 1 conjunto (pool) de péptidos pequeños cada uno. Estas respuestas son visibles 15 días después de la última inmunización.
El 2º grupo (macacos nº 1051, 1062, 1068, 1077) reciben la mezcla de los 7 lipopéptidos administrada por vía intramuscular. Tres de los 4 macacos presentan respuestas CD8 contra 1 conjunto de péptidos pequeños (2 macacos nº 1051 y 1062), el 3º efectúa respuestas dirigidas contra 3 conjuntos (macaco nº 1077). Estas respuestas eran visibles 15 días después de la última inmunización en el caso de los macacos 1051 y 1062 y 15 días después del recordatorio en el caso de los macacos 1051, 1062 y 1077.
Los resultados detallados obtenidos con la casta 2 derivada del animal 1051 se representan en la figura 1.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> INSTITUT PASTEUR DE LILLE
\hskip1cm CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
\hskip1cm SOCIÉTÉ D'ÉTUDES ET DE DEVELOPPEMENT DES ANTIGÈNES
\hskip1cm COMBINATOIRES (SEDAC THERAPEUTICS)
\hskip1cm INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ y DE LA RECHERCHE MÉDICALE (INSERM)
\hskip1cm UNIVERSITÉ DE LILLE II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de mezclas de lipopéptidos para la fabricación de vacunas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D21144
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/FR 03/00 821
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2003-03-14
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 02/03 189
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2002-03-14
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 1 HzAc, derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 2 HzAc, derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 3 HzAc, derivado de la proteína Pol
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 4 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 5 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 1 HzAc, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 2 HzAc, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 3 HzAc, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 1 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 2 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 3 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 4 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 5 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acetilación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 6 HzAc, derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 7 HzAc, derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> INSTITUT PASTEUR DE LILLE
\hskip1cm CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
\hskip1cm SOCIÉTÉ D'ÉTUDES ET DE DEVELOPPEMENT DES ANTIGÈNES COMBINATOIRES (SEDAC THERAPEUTICS)
\hskip1cm INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ y DE LA RECHERCHE MÉDICALE (INSERM)
\hskip1cm UNIVERSITÉ DE LILLE II
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de mezclas de lipopéptidos para la fabricación de vacunas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D21144
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/FR 03/00 821
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 02/03 189
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 1 HzAc, derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
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<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 2 HzAc, derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 3 HzAc, derivado de la proteína Pol
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 33
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 4 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 5 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 1 HzAc, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 2 HzAc, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la proteína NS3
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 3 HzAc, derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 1 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 2 HzAc, derivado de la proteína Nef
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
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<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 3 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 4 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm57
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 5 HzAc, derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acetilación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 6 HzAc, derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm59
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 7 HzAc, derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm60

Claims (24)

1. Utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos para la fabricación de una vacuna, caracterizada porque dichos lipopéptidos están constituidos por un compuesto peptídico unido mediante un enlace hidrazona por lo menos con un vector lipófilo de naturaleza no peptídica, y se ajustan a la siguiente fórmula general (I):
(I)[((R^{1})(R^{2})_{i})D-H]_{j}-P
en la que (R^{1})(R^{2})_{i}D significa un vector lipófilo, en el que:
- i significa el número 0 ó 1,
- en el caso, en el que i sea igual a 0, D significa un enlace,
- en el caso, en el que i sea igual a 1, D significa un heterociclo saturado, insaturado o aromático, mono- o policíclico,
- R^{1} y R^{2}, que pueden ser idénticos o diferentes, significan en cada caso un resto de la fórmula L-f-E-f', en la que L significa el resto de un lípido, E significa un tramo espaciador y f y f' significan grupos funcionales ligantes, respectivamente, L con E y E con D, y
- P significa el compuesto peptídico,
- H significa el enlace hidrazona formado por ligación en solución entre un grupo funcional aldehído perteneciente al vector lipófilo y un grupo funcional derivado de hidrazina perteneciente al compuesto peptídico,
- j significa un número de 1 a 3.
2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque i es igual a 0, j es igual a 1 y porque L significa un esterol, un derivado de esterol o una cadena carbonada saturada o insaturada, lineal o ramificada, que contiene entre 4 y 30 átomos de carbono.
3. Utilización según la reivindicación 2, caracterizada porque dicho derivado de esterol es un derivado del colesterol y porque dicha cadena carbonada se ajusta al fórmula CH_{3}-(CH_{2})_{14}-.
4. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizada porque E significa una cadena carbonada lineal, ramificada o cíclica, saturada o insaturada, que lleva de 1 a 18 átomos de carbono y, eventualmente, 1 a 16 heteroátomos y/o de 1 a 7 grupos elegidos entre los grupos carbonilo, heterociclo, heteroarilo, carbociclo y arilo.
5. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizada porque f significa un enlace -CONH- o -CO-O- y f' significa un enlace -NH-CO- u -O-CO-.
6. Utilización según la reivindicación 5, caracterizada porque el vector lipófilo se ajusta a la fórmula (II):
61
7. Utilización según la reivindicación 5, caracterizada porque el vector lipófilo se ajusta a la fórmula (III):
62
en la que L tiene el significado definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3.
8. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque L significa una cadena carbonada de la fórmula
CH_{3}-(CH_{2})_{14}-
en la fórmula (III).
9. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizada porque el compuesto peptídico P se elige entre el grupo formado por un o varios antígenos peptídicos y un o varios glucomiméticos dendrímeros de naturaleza peptídica.
10. Utilización según la reivindicación 9, caracterizada porque el antígeno peptídico se elige entre el grupo formado por los péptidos y les derivados de péptidos que incluyen a los glucopéptidos y los pseudopéptidos.
11. Utilización según la reivindicación 9, caracterizada porque el glucomimético dendrímero de naturaleza peptídica se ajusta a la siguiente fórmula general (IV):
(IV)(B^{2}M)_{m}(XN)_{n}A
en la que:
- B^{2} se ajusta a una o varias de las siguientes fórmulas generales (a) o (b):
63
en las que R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} con independencia entre sí significan un átomo de hidrógeno o un grupo protector, y en la que W significa un enlace o una cadena carbonada lineal, ramificada o cíclica, saturada o insaturada, que tiene de 1 a 18 átomos de carbono y eventualmente de 1 a 12 átomos elegidos entre oxígeno, azufre y nitrógeno, dicha cadena carbonada está eventualmente sustituida por 1-16 átomos de halógeno,
- X significa el resto de un oligopéptido X' que contiene de 1 a 6 aminoácidos,
- A significa el resto de un compuesto A' por lo menos trifuncional que contiene una serie de aminoácidos, idénticos o diferentes, elegidos entre el grupo formado por la lisina, la hidroxilisina, la serina, la treonina, la cisteína, la ornitina, el ácido aspártico y el ácido glutámico,
- m es un número entero comprendido entre 1 y 32,
- n es un número entero comprendido entre 0 y 32, y
- M y N representan en cada caso un grupo de enlace, respectivamente entre B^{2} y A cuando n = 0 o entre B^{2} y X cuando n es diferente de 0, y entre X y A cuando n es diferente de 0, y con independencia entre sí contienen un grupo funcional elegido entre oxima, hidrazona, amida, éster, tioéster, hidrazida, hidroxamato, éter, tioéter, amina, carbonato, carbamato, tiocarbonato, tiocarbamato, urea, tiourea y tiazolidina.
12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque el compuesto de la fórmula general (IV) es tal que m es un número entero comprendido entre 4 y 16, n es un número entero comprendido entre 2 y 8, X significa el resto de un oligopéptido que tiene de 2 a 4 restos aminoácido, mientras que A significa el resto de un eslabonamiento que tiene de 2 a 8 restos lisina y se presenta en forma de dendrímero, y B^{2} significa el resto de uno o varios compuestos elegidos entre el ácido (-)-shikímico y el ácido (-)-quínico.
13. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 12, caracterizada porque la mezcla de lipopéptidos contiene de 1 a 20 lipopéptidos diferentes, con preferencia de 1 a 10 lipopéptidos diferentes.
\newpage
14. Utilización según la reivindicación 13, caracterizada porque los lipopéptidos están en forma de micelas mixtas.
15. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14, caracterizada porque el compuesto peptídico está formado por un antígeno derivado de un agente infeccioso o de un cáncer.
16. Utilización según la reivindicación 15, caracterizada porque el agente infeccioso es de tipo bacteriano, parasitario o vírico.
17. Utilización según la reivindicación 16, caracterizada porque el agente infeccioso de tipo vírico es el VIH o el VHC.
18. Utilización según la reivindicación 17, caracterizada porque el compuesto peptídico es una secuencia procedente de las proteínas Gag, Pol o Nef del virus VIH.
19. Utilización según la reivindicación 18, caracterizada porque la mezcla de lipopéptidos contiene por lo menos dos secuencias procedentes de las proteínas Gag, Pol y Nef del virus HIV.
20. Utilización según la reivindicación 19, caracterizada porque la mezcla de lipopéptidos contiene una mezcla de lipopéptidos, cuyos péptidos tienen las secuencias:
- Gag 17-35
- Gag 253-284
- Pol 325-355
- Nef 66-97 y
- Nef 116-147.
21. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la vacuna se formula para la administración a las mucosas, por vía transdérmica o por vía intramuscular.
22. Utilización según la reivindicación 21, caracterizada porque la mezcla contiene además uno o varios excipientes clínicamente aceptables.
23. Utilización según la reivindicación 22, caracterizada porque el excipiente es la manita o el Polisorbato 80 o una mezcla de ambos.
24. Utilización según la reivindicación 17, caracterizada porque los compuestos peptídicos P del agente infeccioso VHC están formados por las secuencias peptídicas siguientes:
- VHC 1 HzAc:
\quad
H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
- VHC 2 HzAc:
\quad
H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
- VHC 3 HzAc:
\quad
H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2.
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