JP3057748B2 - 細胞毒性ｔリンパ球の特異的誘導用合成ワクチン - Google Patents
細胞毒性ｔリンパ球の特異的誘導用合成ワクチンInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は細胞毒性Ｔリンパ球の特異的誘導用の合成ワ
クチンに関する。
クチンに関する。
細胞毒性Ｔリンパ球（キラーＴ細胞）は細胞内感染に
対する温血動物の免疫応答の重要な部分である。細胞毒
性Ｔリンパ球は正常には感染性病原体のインビボワクチ
ン投与によってのみ誘導される（J.Bastin et al.,J.Ex
p.Med.,Vol 165,June 1987）。これには危険が伴うた
め、細胞毒性Ｔリンパ球特異的誘導用合成ワクチンは実
質的な改良となるであろう。驚くべきことに、細胞毒性
Ｔリンパ球の特異的インビボ誘導は、キラーＴ細胞エピ
トープを含むある種の膜アンカー／活性化合物結合体の
使用により可能であることを見出した。
対する温血動物の免疫応答の重要な部分である。細胞毒
性Ｔリンパ球は正常には感染性病原体のインビボワクチ
ン投与によってのみ誘導される（J.Bastin et al.,J.Ex
p.Med.,Vol 165,June 1987）。これには危険が伴うた
め、細胞毒性Ｔリンパ球特異的誘導用合成ワクチンは実
質的な改良となるであろう。驚くべきことに、細胞毒性
Ｔリンパ球の特異的インビボ誘導は、キラーＴ細胞エピ
トープを含むある種の膜アンカー／活性化合物結合体の
使用により可能であることを見出した。
膜アンカー／活性化合物結合体が中和抗体の生成に適
していることは既に知られているが（Angew.Chem.97（1
985）,No.10,p883 ff）、細胞毒性Ｔリンパ球特異的誘
導のための膜アンカー／活性化合物結合体を含む合成ワ
クチンは未だ報告されていない。
していることは既に知られているが（Angew.Chem.97（1
985）,No.10,p883 ff）、細胞毒性Ｔリンパ球特異的誘
導のための膜アンカー／活性化合物結合体を含む合成ワ
クチンは未だ報告されていない。
従って、本発明は少なくとも１つの膜アンカー化合物
と、ウイルス、細菌、寄生虫又は腫瘍抗原の少なくとも
１つのキラーＴ細胞エピトープを含むタンパク質、もし
くはウイルス、細菌、寄生虫タンパク質又は腫瘍抗原の
少なくとも１つのキラーＴ細胞エピトープを含む少なく
とも１つの部分配列との結合体からなる細胞毒性Ｔリン
パ球誘導用合成ワクチンに関する。
と、ウイルス、細菌、寄生虫又は腫瘍抗原の少なくとも
１つのキラーＴ細胞エピトープを含むタンパク質、もし
くはウイルス、細菌、寄生虫タンパク質又は腫瘍抗原の
少なくとも１つのキラーＴ細胞エピトープを含む少なく
とも１つの部分配列との結合体からなる細胞毒性Ｔリン
パ球誘導用合成ワクチンに関する。
前記膜アンカー化合物は好ましくは細菌リポタンパク
質である。下の式 （式中、Ａは硫黄、酸素、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ
−）、メチレン（−CH2−）又は−NH−であることがで
き； ｎは０〜５、ｍは１又は２であり； Ｃ＊はＲ又はＳ配置の不斉炭素原子であり、 Ｒ、Ｒ′及びＲ″は同一か又は異なり、水素又はヒド
ロキシル、アミノ、オキソ、アシル、アルキル又はシク
ロアルキル基で置換されることができる炭素原子数７〜
25のアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、式
IXのＥは水素又は天然もしくは合成アミノ酸の任意の所
望の側鎖であることができ、式VIのＢは式Ｉ〜Ｖに示す
各々の−（CH2）ｎ−（置換されたアルキル）基の意味
を持ち、R1とR2は同一か又は異なりＲ、Ｒ′及びＲ″と
同じ意味を持つのみならず、−OR、−Ｏ−COR、−COO
R、−NHCOR又は−CONHRであることもでき、Ｘはウイル
ス、細菌又は寄生虫タンパク質又は腫瘍抗原のタンパク
質又は部分配列が結合している10までのアミノ酸の鎖で
あるか、もしくはタンパク質又は部分配列自身である）
の化合物が膜アンカー化合物として特に好ましい。
質である。下の式 （式中、Ａは硫黄、酸素、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ
−）、メチレン（−CH2−）又は−NH−であることがで
き； ｎは０〜５、ｍは１又は２であり； Ｃ＊はＲ又はＳ配置の不斉炭素原子であり、 Ｒ、Ｒ′及びＲ″は同一か又は異なり、水素又はヒド
ロキシル、アミノ、オキソ、アシル、アルキル又はシク
ロアルキル基で置換されることができる炭素原子数７〜
25のアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、式
IXのＥは水素又は天然もしくは合成アミノ酸の任意の所
望の側鎖であることができ、式VIのＢは式Ｉ〜Ｖに示す
各々の−（CH2）ｎ−（置換されたアルキル）基の意味
を持ち、R1とR2は同一か又は異なりＲ、Ｒ′及びＲ″と
同じ意味を持つのみならず、−OR、−Ｏ−COR、−COO
R、−NHCOR又は−CONHRであることもでき、Ｘはウイル
ス、細菌又は寄生虫タンパク質又は腫瘍抗原のタンパク
質又は部分配列が結合している10までのアミノ酸の鎖で
あるか、もしくはタンパク質又は部分配列自身である）
の化合物が膜アンカー化合物として特に好ましい。
特に指摘することができるこれらの例は細菌リポタン
パク質に存在するＮ末端であり、例えばＹ−Ser−Ser−
Ser−Asn、Ｙ−Ile−Leu−Leu−Ala、Ｙ−Ala−Asn−As
n−Gln、Ｙ−Asn−Ser−Asn−Ser、Ｙ−Gly−Ala−Met
−Ser、Ｙ−Gln−Ala−Asn−Tgr、Ｙ−Gln−Val−Asn−
Asn、Ｙ−Asp−Asn−Ser−Ser（式中、Ｙは式Ｉ〜VIIで
示した基の１つである）である。これらのリポペンタペ
プチドの短い形体（リポジペプチド、リポトリペプチド
又はリポテトラペプチド）も膜アンカー化合物として使
用することができる。Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3
（ビスパルミトイルオキシ）プロピル〕−システイニル
−セリル−セリン（Pam2Cys−Ser−Ser）、Ｎ−パルミ
トイル−Ｓ−〔2,3（ビスパルミトイルオキシ）プロピ
ル〕−システイニル−セリル−グリシン及びＮ−パルミ
トイル−Ｓ−〔2,3（ビスパルミトイルオキシ）プロピ
ル〕−システイニル−アラニル−Ｄ−イソグルタミンが
特に好ましい。
パク質に存在するＮ末端であり、例えばＹ−Ser−Ser−
Ser−Asn、Ｙ−Ile−Leu−Leu−Ala、Ｙ−Ala−Asn−As
n−Gln、Ｙ−Asn−Ser−Asn−Ser、Ｙ−Gly−Ala−Met
−Ser、Ｙ−Gln−Ala−Asn−Tgr、Ｙ−Gln−Val−Asn−
Asn、Ｙ−Asp−Asn−Ser−Ser（式中、Ｙは式Ｉ〜VIIで
示した基の１つである）である。これらのリポペンタペ
プチドの短い形体（リポジペプチド、リポトリペプチド
又はリポテトラペプチド）も膜アンカー化合物として使
用することができる。Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3
（ビスパルミトイルオキシ）プロピル〕−システイニル
−セリル−セリン（Pam2Cys−Ser−Ser）、Ｎ−パルミ
トイル−Ｓ−〔2,3（ビスパルミトイルオキシ）プロピ
ル〕−システイニル−セリル−グリシン及びＮ−パルミ
トイル−Ｓ−〔2,3（ビスパルミトイルオキシ）プロピ
ル〕−システイニル−アラニル−Ｄ−イソグルタミンが
特に好ましい。
特に好ましい別な化合物は式ＩとIIIの化合物であ
り、とりわけ式Ｉの化合物が好ましい。
り、とりわけ式Ｉの化合物が好ましい。
置換基Ａは硫黄又はメチレンが好ましく、硫黄が特に
好ましい。
好ましい。
置換基Ｒ、Ｒ′及びＲ″は炭素原子数14〜18のアルキ
ル基が好ましく、炭素原子数16のアルキル基が特に好ま
しい。
ル基が好ましく、炭素原子数16のアルキル基が特に好ま
しい。
置換基Ｘは１〜２の極性アミノ酸残基から構成される
のが好ましく、セリン残基が特に好ましい。
のが好ましく、セリン残基が特に好ましい。
キラーＴ細胞により認識される細胞内に現れる病原
体、もしくはウイルス、細菌又は寄生虫タンパク質もし
くは腫瘍抗原の種々なタンパク質又は部分的タンパク質
配列は本発明のワクチン用として膜アンカー化合物と結
合させるのに適している。
体、もしくはウイルス、細菌又は寄生虫タンパク質もし
くは腫瘍抗原の種々なタンパク質又は部分的タンパク質
配列は本発明のワクチン用として膜アンカー化合物と結
合させるのに適している。
そのようなタンパク質又は部分配列（キラーＴ細胞エ
ピトープとも称する）は、MHC分子（主要組織適合遺伝
子複合体）と共に、それらが細胞毒性Ｔリンパ球により
認識されるという事実により区別される。
ピトープとも称する）は、MHC分子（主要組織適合遺伝
子複合体）と共に、それらが細胞毒性Ｔリンパ球により
認識されるという事実により区別される。
本発明のワクチンはＴ細胞エピトープを持つすべての
病原体例えばアデノウイルス、HIV、インフルエンザウ
イルス、LCMV、MCMV、肝炎ウイルス、HTLV、FELV、トレ
ポネマ・パリダム（Treponema pallidum）、ゴノコッカ
ス（gonococcus）、ボルデテラ・パーツシス（Bordetel
la pertussis）、プラスモジア（Plasmodia）、リステ
リア（listeria）、ミコバクテリア（mycobacteria）又
はリーシュマニア（leishmania）に対する免疫に適当で
ある。従来から知られているキラーＴ細胞エピトープは
下表に示す部分配列であり、インフルエンザ核タンパク
質P3CSS−NP 147−158（R-）とHIVエピトープが特別な
位置を占めている。
病原体例えばアデノウイルス、HIV、インフルエンザウ
イルス、LCMV、MCMV、肝炎ウイルス、HTLV、FELV、トレ
ポネマ・パリダム（Treponema pallidum）、ゴノコッカ
ス（gonococcus）、ボルデテラ・パーツシス（Bordetel
la pertussis）、プラスモジア（Plasmodia）、リステ
リア（listeria）、ミコバクテリア（mycobacteria）又
はリーシュマニア（leishmania）に対する免疫に適当で
ある。従来から知られているキラーＴ細胞エピトープは
下表に示す部分配列であり、インフルエンザ核タンパク
質P3CSS−NP 147−158（R-）とHIVエピトープが特別な
位置を占めている。
本発明のワクチンの助けを借りて、特定の標的に最適
に適応したワクチンを得るため、更に種々な部分配列に
結合した種々な膜アンカー化合物を混合することが可能
である。更に、相当する混合物は体液性免疫応答を刺激
し、付加的に中和抗体の生成につながる膜アンカー／活
性化合物複合体を付加的に含むことができる（Vaccine
7,29−33（1989）,Angew.Chem.,Int.Ed.24,872−873（1
989））。更に、種々な配列を共有結合させ、それらを
膜アンカー化合物と結合させることも可能である。
に適応したワクチンを得るため、更に種々な部分配列に
結合した種々な膜アンカー化合物を混合することが可能
である。更に、相当する混合物は体液性免疫応答を刺激
し、付加的に中和抗体の生成につながる膜アンカー／活
性化合物複合体を付加的に含むことができる（Vaccine
7,29−33（1989）,Angew.Chem.,Int.Ed.24,872−873（1
989））。更に、種々な配列を共有結合させ、それらを
膜アンカー化合物と結合させることも可能である。
更に、本発明は膜アンカー化合物に結合反応により病
原体のタンパク質又は部分配列を結合させることからな
る合成ワクチンの製造法に関する。結合反応は、例えば
縮合、付加、置換、酸化又はジスルフィド形成であるこ
とができる。好ましい結合法は実施例に示す。別の結合
法は上で引用したドイツ特許公開明細書第3,546,150に
記述されている。
原体のタンパク質又は部分配列を結合させることからな
る合成ワクチンの製造法に関する。結合反応は、例えば
縮合、付加、置換、酸化又はジスルフィド形成であるこ
とができる。好ましい結合法は実施例に示す。別の結合
法は上で引用したドイツ特許公開明細書第3,546,150に
記述されている。
膜アンカー化合物の調製も同様に上で述べたドイツ特
許公開明細書に詳細に記述されている。
許公開明細書に詳細に記述されている。
必要となり得るジアステレオマーの分離は種種な方
法、例えばHoppe−Seyler′s Z.Physiolog.Chem.364（1
983）593に記述の方法で実行することができる。
法、例えばHoppe−Seyler′s Z.Physiolog.Chem.364（1
983）593に記述の方法で実行することができる。
膜アンカー／活性化合物結合体に使用する部分配列の
合成は文献に記述された種々な方法で実行することがで
き、前記文献は例えばＷnsch et al.,Houben−Weyl,V
ol.15/1.2,Stuttgart,Thieme−Verlag又はＷnsch,Ang
ew.Chem.83（1971）,E.Gross and J.Meienhofer（ed
s.）,The Peptides,Vol.1（1979）,2（1979）,3（198
1）及び５（1983）Academic Press,New York 7713又は
ドイツ特許公開明細書第3,546,150である。部分配列と
結合体の好ましい製造法は実施例１により詳細に示す。
合成は文献に記述された種々な方法で実行することがで
き、前記文献は例えばＷnsch et al.,Houben−Weyl,V
ol.15/1.2,Stuttgart,Thieme−Verlag又はＷnsch,Ang
ew.Chem.83（1971）,E.Gross and J.Meienhofer（ed
s.）,The Peptides,Vol.1（1979）,2（1979）,3（198
1）及び５（1983）Academic Press,New York 7713又は
ドイツ特許公開明細書第3,546,150である。部分配列と
結合体の好ましい製造法は実施例１により詳細に示す。
更に、本発明は少なくとも１つの膜アンカー化合物と
上述のタンパク質又は生物の１つの少なくとも１つの部
分配列との結合体を含む医薬製剤と動物薬製剤に関す
る。通常は本発明の製剤は溶媒の外に追加の助剤と賦形
剤、又はアジュバントを必要としない。しかしながら、
場合により本発明の製剤にこの種の助剤及び／又は賦形
剤、及び所望によりアジュバントを添加するのが賢明で
ある（Anton Mayr,Gerhard Eiβ−nen,Barbara Mayr−B
ibrack,Handbuch der Schutzimpfungen in der Tiermed
izin（Handbook of Vaccines in Veterinary Medicin
e）,1984,Verlag Paul Parey,Berlin−Hamburg）。
上述のタンパク質又は生物の１つの少なくとも１つの部
分配列との結合体を含む医薬製剤と動物薬製剤に関す
る。通常は本発明の製剤は溶媒の外に追加の助剤と賦形
剤、又はアジュバントを必要としない。しかしながら、
場合により本発明の製剤にこの種の助剤及び／又は賦形
剤、及び所望によりアジュバントを添加するのが賢明で
ある（Anton Mayr,Gerhard Eiβ−nen,Barbara Mayr−B
ibrack,Handbuch der Schutzimpfungen in der Tiermed
izin（Handbook of Vaccines in Veterinary Medicin
e）,1984,Verlag Paul Parey,Berlin−Hamburg）。
温血動物の免疫に必要なワクチンの量は温血動物の
種、膜アンカー化合物（１つ又は複数）と生物のタンパ
ク質又は部分配列（１つ又は複数）、意図する免疫に依
存し、個々の場合につき経験的に決めなければならな
い。
種、膜アンカー化合物（１つ又は複数）と生物のタンパ
ク質又は部分配列（１つ又は複数）、意図する免疫に依
存し、個々の場合につき経験的に決めなければならな
い。
次の実施例は更にこの発明を例証しようとするもので
ある。
ある。
合 成 実施例 １ Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3（ビスパルミトイルオキ
シ）−プロピル〕−システイニル−セリル−セリル−NP
147−158の合成 インフルエンザＡウイルス核タンパク質ペプチド配列
を固相ペプチド法により合成した。Fmoc−アミノ酸を使
用した。次の側鎖保護基、Thr（tBu）、Tyr（tBu）、Ar
g（Pmc）を使用した。0.5mmolのFmoc−Glyを結合した1g
のパラ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂を使用
し、次の合成サイクルによりペプチド配列を合成した。
DMF中50％ピペリジンによるＮ−活性化（１×10分）。
後続アミノ酸をDMF中BOP/HOBT〔ベンゾトリアゾール−
１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホ
ニウム・ヘキサフルオロホスフェート/1−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール〕とジイソプロピルエチルアミンを使
用して30分間結合。二重結合反応は各々の場合３倍過剰
のFmoc−アミノ酸と4.5倍過剰のジイソプロピルエチル
アミン（各々の場合、樹脂上の遊離アミノ酸に対して）
を使用して実行した。各々の二重結合反応の後、ペプチ
ド樹脂を各々の場合、Ｎ−メチルピロリジン、ジクロロ
メタン及びＮ−メチルピロリジンで３回洗浄した。
シ）−プロピル〕−システイニル−セリル−セリル−NP
147−158の合成 インフルエンザＡウイルス核タンパク質ペプチド配列
を固相ペプチド法により合成した。Fmoc−アミノ酸を使
用した。次の側鎖保護基、Thr（tBu）、Tyr（tBu）、Ar
g（Pmc）を使用した。0.5mmolのFmoc−Glyを結合した1g
のパラ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂を使用
し、次の合成サイクルによりペプチド配列を合成した。
DMF中50％ピペリジンによるＮ−活性化（１×10分）。
後続アミノ酸をDMF中BOP/HOBT〔ベンゾトリアゾール−
１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホ
ニウム・ヘキサフルオロホスフェート/1−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール〕とジイソプロピルエチルアミンを使
用して30分間結合。二重結合反応は各々の場合３倍過剰
のFmoc−アミノ酸と4.5倍過剰のジイソプロピルエチル
アミン（各々の場合、樹脂上の遊離アミノ酸に対して）
を使用して実行した。各々の二重結合反応の後、ペプチ
ド樹脂を各々の場合、Ｎ−メチルピロリジン、ジクロロ
メタン及びＮ−メチルピロリジンで３回洗浄した。
樹脂結合インフルエンザＡウイルス核タンパク質配列
を合成した後、トリフルオロ酢酸で分解してペプチドの
一部分を分離し、HPLC、MS、アミノ酸分析、キラル相の
分析（analysis on chiral phase）及び配列分析により
純度を試験した。HPLC分析により90％以上の純度である
ことが明らかになった。２つのセリン残基〔Fmoc−Ser
（tBu）〕を樹脂結合ペプチドに結合した後、トリパル
ミトイル−Ｓ−グリセロールシステインの結合をDIC/HO
BT法で実行した。４時間後１当量のＮ−メチルモルホリ
ンを添加し、更に１時間後リポペプチド樹脂を洗浄し
た。リポペプチドを2mlのトリフルオロ酢酸（100μの
チオアニソールと100μｇのチオクレゾールを含む）を
使用して１時間かけて100mgの樹脂から分離した。Arg
（Pmc）保護基を完全に除くためトリフルオロ酢酸によ
る追加の引き続く処理を50℃で30分間行った。液を蒸
発し、残留物を酢酸に取り、冷エーテルに添加した。沈
殿したリポペプチドをエーテルで３回洗浄し、3:1の比
率のtert.−ブタノール／水から凍結乾燥した。
を合成した後、トリフルオロ酢酸で分解してペプチドの
一部分を分離し、HPLC、MS、アミノ酸分析、キラル相の
分析（analysis on chiral phase）及び配列分析により
純度を試験した。HPLC分析により90％以上の純度である
ことが明らかになった。２つのセリン残基〔Fmoc−Ser
（tBu）〕を樹脂結合ペプチドに結合した後、トリパル
ミトイル−Ｓ−グリセロールシステインの結合をDIC/HO
BT法で実行した。４時間後１当量のＮ−メチルモルホリ
ンを添加し、更に１時間後リポペプチド樹脂を洗浄し
た。リポペプチドを2mlのトリフルオロ酢酸（100μの
チオアニソールと100μｇのチオクレゾールを含む）を
使用して１時間かけて100mgの樹脂から分離した。Arg
（Pmc）保護基を完全に除くためトリフルオロ酢酸によ
る追加の引き続く処理を50℃で30分間行った。液を蒸
発し、残留物を酢酸に取り、冷エーテルに添加した。沈
殿したリポペプチドをエーテルで３回洗浄し、3:1の比
率のtert.−ブタノール／水から凍結乾燥した。
実施例 ２ Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3（ビスパルミトイルオキ
シ）−プロピル〕−システイニル−セリル−セリル−NP
（365−380）の合成 実施例１と同様の方法で合成を実行した。次の側鎖保
護基、Ser（tBu）、Glu（OtBu）、Thr（tBu）を持つFmo
c−アミノ酸を使用した。Asnは側鎖保護基を使用するこ
となくジイソプロピルカルボジイミド/HOBTを使用して
結合させた。使用した最初の樹脂は１％ジビニルベンゼ
ンを架橋したFmoc−Glu（OtBu）−ｐ−ベンジルオキシ
ベンジルアルコール−ポリスチレンであった。見出され
たFmoc−Glu（OtBu）の量は0.45mmol/gであった。ペプ
チドとPam3Cys−Ser−Serペプチドを、それぞれの場合
0.1mlのチオアニソールと100μｇのチオクレゾールを添
加した2mlのトリフルオロ酢酸を使用して90分間かけて1
00mlの樹脂から分離した。配列を遊離ペプチドの配列分
析により確認し、90％以上を含む均一なピークがHPLC分
析により測定された。アミノ酸分析とキラル相のエナン
チオマー純度の試験は予期した値を示す結果が得られ
た。
シ）−プロピル〕−システイニル−セリル−セリル−NP
（365−380）の合成 実施例１と同様の方法で合成を実行した。次の側鎖保
護基、Ser（tBu）、Glu（OtBu）、Thr（tBu）を持つFmo
c−アミノ酸を使用した。Asnは側鎖保護基を使用するこ
となくジイソプロピルカルボジイミド/HOBTを使用して
結合させた。使用した最初の樹脂は１％ジビニルベンゼ
ンを架橋したFmoc−Glu（OtBu）−ｐ−ベンジルオキシ
ベンジルアルコール−ポリスチレンであった。見出され
たFmoc−Glu（OtBu）の量は0.45mmol/gであった。ペプ
チドとPam3Cys−Ser−Serペプチドを、それぞれの場合
0.1mlのチオアニソールと100μｇのチオクレゾールを添
加した2mlのトリフルオロ酢酸を使用して90分間かけて1
00mlの樹脂から分離した。配列を遊離ペプチドの配列分
析により確認し、90％以上を含む均一なピークがHPLC分
析により測定された。アミノ酸分析とキラル相のエナン
チオマー純度の試験は予期した値を示す結果が得られ
た。
活性試験 Ａ） 特殊無菌条件（SPF）下で飼育した３月令のBALB/c近
親交配マウスを100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147
−158〕（100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−15
8〕を300μのPBSに取り、１分間超音波処理した）で
静脈内投与により免疫した。28日後インフルエンザウイ
ルスA/PR/8の0.2又は0.4ヘマグルチニン単位を鼻内感染
させた。同様に300μのPBSを静脈内投与したマウスを
対照として感染させた。感染の経過を毎日の体重管理と
生存率により監視した。0.4ヘマグルチニン単位を感染
させた12匹の対照区動物中11匹がウイルス感染後11日に
死亡したが、免疫した動物は12匹中４匹が死亡したのみ
であった。
親交配マウスを100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147
−158〕（100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−15
8〕を300μのPBSに取り、１分間超音波処理した）で
静脈内投与により免疫した。28日後インフルエンザウイ
ルスA/PR/8の0.2又は0.4ヘマグルチニン単位を鼻内感染
させた。同様に300μのPBSを静脈内投与したマウスを
対照として感染させた。感染の経過を毎日の体重管理と
生存率により監視した。0.4ヘマグルチニン単位を感染
させた12匹の対照区動物中11匹がウイルス感染後11日に
死亡したが、免疫した動物は12匹中４匹が死亡したのみ
であった。
別の対照群とPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158〕免
疫群に0.2ヘマグルチニン単位のインフルエンザウイル
スを感染させた。18日後、対照動物の40％（10匹中４
匹）はなお生き残り、一方免疫した動物の75％が生き残
った。18日目の免疫した動物と対照動物との間の体重差
は4gであった。対照群の生き残った動物は体重が減少し
続けたが、一方免疫した動物は感染からゆっくり回復し
た。
疫群に0.2ヘマグルチニン単位のインフルエンザウイル
スを感染させた。18日後、対照動物の40％（10匹中４
匹）はなお生き残り、一方免疫した動物の75％が生き残
った。18日目の免疫した動物と対照動物との間の体重差
は4gであった。対照群の生き残った動物は体重が減少し
続けたが、一方免疫した動物は感染からゆっくり回復し
た。
Ｂ） 遊離ペプチド、ウイルス又はPam3Cys−Ser−Ser−ペプ
チドで免疫した後のBALB/cマウスの脾臓細胞の細胞毒性
Ｔ細胞活性（第１図） BALB/cマウスが300μのPBS中 ａ） 1.6μＭの核タンパク質ペプチド147−158（Ｒ
−）と共に予めインキュベートした８×107先天性脾臓
細胞；（Ａ、Ｄ、Ｇ）、 ｂ） 160μＭのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158
（Ｒ−）〕リポペプチドと共に予めインキュベートした
８×107先天性脾臓細胞；（Ｃ、Ｆ）、 ｃ） 50ヘマグルチニン単位のインフルエンザＡウイル
スPR/8/34;（Ｂ、Ｅ、Ｈ）、 ｄ） 100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158
（Ｒ−）〕；（Ｉ） の静脈内投与を受けた。６日後、免疫又は感染した動物
から脾臓を除き、これらの脾臓細胞をペプチド（Ａ〜
Ｆ）又はウイルスPR8（Ｇ、Ｈ、Ｉ）を感染させた先天
性刺激体細胞（syngenicstimulator cells）で５日間再
刺激した。この目的のため各々の場合、10％ウシ胎児血
清、２−メルカプトエタノール、グルタミン及び抗生物
質を補添し、80nMのNP 147−158（Ｒ−）ペプチド
（Ａ、Ｆ）又は20Gyで照射した５×106ウイルスPR8感染
先天性脾臓細胞（Ｇ、Ｈ、Ｉ）のいずれかを添加した10
mlのａ−MEM培地（メーカー:Gibco）中で2.5×107細胞
を培養した。刺激体と標的細胞の感染は（Eur.J.Immuno
l.7,630−635（1977））に記述のように実行した。
チドで免疫した後のBALB/cマウスの脾臓細胞の細胞毒性
Ｔ細胞活性（第１図） BALB/cマウスが300μのPBS中 ａ） 1.6μＭの核タンパク質ペプチド147−158（Ｒ
−）と共に予めインキュベートした８×107先天性脾臓
細胞；（Ａ、Ｄ、Ｇ）、 ｂ） 160μＭのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158
（Ｒ−）〕リポペプチドと共に予めインキュベートした
８×107先天性脾臓細胞；（Ｃ、Ｆ）、 ｃ） 50ヘマグルチニン単位のインフルエンザＡウイル
スPR/8/34;（Ｂ、Ｅ、Ｈ）、 ｄ） 100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158
（Ｒ−）〕；（Ｉ） の静脈内投与を受けた。６日後、免疫又は感染した動物
から脾臓を除き、これらの脾臓細胞をペプチド（Ａ〜
Ｆ）又はウイルスPR8（Ｇ、Ｈ、Ｉ）を感染させた先天
性刺激体細胞（syngenicstimulator cells）で５日間再
刺激した。この目的のため各々の場合、10％ウシ胎児血
清、２−メルカプトエタノール、グルタミン及び抗生物
質を補添し、80nMのNP 147−158（Ｒ−）ペプチド
（Ａ、Ｆ）又は20Gyで照射した５×106ウイルスPR8感染
先天性脾臓細胞（Ｇ、Ｈ、Ｉ）のいずれかを添加した10
mlのａ−MEM培地（メーカー:Gibco）中で2.5×107細胞
を培養した。刺激体と標的細胞の感染は（Eur.J.Immuno
l.7,630−635（1977））に記述のように実行した。
細胞毒性Ｔ細胞の活性は51Cr放出標準試験（Eur.J.Im
munol.137,2.676−2.681（1986））により求めた。Ａ、
Ｂ、Ｃ及びＧ、Ｈ、Ｉは未処理（△）及びPR8感染
（▲）P815（MHC:H−2d）標的細胞に対するCTL活性を示
す。
munol.137,2.676−2.681（1986））により求めた。Ａ、
Ｂ、Ｃ及びＧ、Ｈ、Ｉは未処理（△）及びPR8感染
（▲）P815（MHC:H−2d）標的細胞に対するCTL活性を示
す。
Ｄ、Ｅ及びＦは種々な濃度の遊離ペプチドで37℃で30
分間処理したP815細胞に対するCTL活性を示す。この場
合エフェクター（effector）の標的細胞に対する比率は
30:1を使用した。
分間処理したP815細胞に対するCTL活性を示す。この場
合エフェクター（effector）の標的細胞に対する比率は
30:1を使用した。
Ｃ） Pam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158〕又はPam3Cys−Ser
−Ser−〔NP 365−380〕でマウスを免疫した後の細胞毒
性Ｔ細胞の活性（第２図） BALB/cマウス（Ａ、Ｂ）又は（B6×DBA/2）F1−マウ
ス（Ｃ、Ｄ）をインフルエンザＡウイルス（Ａ、Ｃ）又
は100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158〕
（Ｂ）又は100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 365−38
0〕（Ｄ）で免疫した。６日後、脾臓を除き、脾臓細胞
をＢ）で記述したように0.8μＭのNP 147−158ペプチド
（Ａ、Ｂ）又は0.8μＭのNP 365−380ペプチド（Ｃ、
Ｄ）で刺激した。次いで未処理のP815標的細胞（△）、
PR8感染P815標的細胞（▲）及びNP 147−158ペプチドと
共に37℃で90分間予めインキュベートしたP815標的細胞
（■）に対する細胞毒性Ｔ細胞の活性を試験し、未処理
のEL−４−（MHC H−2d）細胞（○）、PR8感染EL−４標
的細胞（・）及びNP 365−380ペプチドと共に37℃で90
分間予めインキュベートしたEL−４細胞（◆）に対する
同様の活性を試験した。
−Ser−〔NP 365−380〕でマウスを免疫した後の細胞毒
性Ｔ細胞の活性（第２図） BALB/cマウス（Ａ、Ｂ）又は（B6×DBA/2）F1−マウ
ス（Ｃ、Ｄ）をインフルエンザＡウイルス（Ａ、Ｃ）又
は100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158〕
（Ｂ）又は100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 365−38
0〕（Ｄ）で免疫した。６日後、脾臓を除き、脾臓細胞
をＢ）で記述したように0.8μＭのNP 147−158ペプチド
（Ａ、Ｂ）又は0.8μＭのNP 365−380ペプチド（Ｃ、
Ｄ）で刺激した。次いで未処理のP815標的細胞（△）、
PR8感染P815標的細胞（▲）及びNP 147−158ペプチドと
共に37℃で90分間予めインキュベートしたP815標的細胞
（■）に対する細胞毒性Ｔ細胞の活性を試験し、未処理
のEL−４−（MHC H−2d）細胞（○）、PR8感染EL−４標
的細胞（・）及びNP 365−380ペプチドと共に37℃で90
分間予めインキュベートしたEL−４細胞（◆）に対する
同様の活性を試験した。
Ｄ） MHCクラスＩレストリクション及びリポペプチドによる
免疫の特異性に関する試験（第３図） BALB/cマウス（Ａ、Ｂ、Ｃ）又は（B6×DBA/2）F1−
マウス（Ｄ−Ｉ）は300μのPBS中 100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158（Ｒ
−）〕（Ａ、Ｅ、Ｈ）又は 50μｇのSer−Ser−〔NP 147−158（Ｒ−）〕（Ｂ）
又は 50μｇの〔NP 147−158（Ｒ−）〕（Ｃ）又は 50ヘマグルチニン単位のインフルエンザPR8ウイルス
（Ｄ、Ｇ）又は100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 365
−380〕（Ｆ、Ｉ）の静脈内投与を受けた。注射後６日
目に、脾臓細胞を実施例２に記述のように核タンパク質
147−158（Ｒ−）ペプチド（Ａ−Ｆ）、又は核タンパク
質365−380ペプチド（Ｇ−Ｉ）を添加して培養した。生
成する細胞毒性Ｔ細胞の活性を 未処理P815標的細胞（△） NP 147−158（Ｒ−）と共に37℃で90分間予めインキ
ュベートしたP815標的細胞（■） NP 365−380と共に37℃で90分間予めインキュベート
したP815標的細胞（□） 未処理のEL−４標的細胞（○） NP 147−158（Ｒ−）と共に37℃で90分間予めインキ
ュベートしたEL−４標的細胞（◇） NP 365−380と共に37℃で90分間予めインキュベート
したEL−４標的細胞（◆） に対して求めた。
免疫の特異性に関する試験（第３図） BALB/cマウス（Ａ、Ｂ、Ｃ）又は（B6×DBA/2）F1−
マウス（Ｄ−Ｉ）は300μのPBS中 100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 147−158（Ｒ
−）〕（Ａ、Ｅ、Ｈ）又は 50μｇのSer−Ser−〔NP 147−158（Ｒ−）〕（Ｂ）
又は 50μｇの〔NP 147−158（Ｒ−）〕（Ｃ）又は 50ヘマグルチニン単位のインフルエンザPR8ウイルス
（Ｄ、Ｇ）又は100μｇのPam3Cys−Ser−Ser−〔NP 365
−380〕（Ｆ、Ｉ）の静脈内投与を受けた。注射後６日
目に、脾臓細胞を実施例２に記述のように核タンパク質
147−158（Ｒ−）ペプチド（Ａ−Ｆ）、又は核タンパク
質365−380ペプチド（Ｇ−Ｉ）を添加して培養した。生
成する細胞毒性Ｔ細胞の活性を 未処理P815標的細胞（△） NP 147−158（Ｒ−）と共に37℃で90分間予めインキ
ュベートしたP815標的細胞（■） NP 365−380と共に37℃で90分間予めインキュベート
したP815標的細胞（□） 未処理のEL−４標的細胞（○） NP 147−158（Ｒ−）と共に37℃で90分間予めインキ
ュベートしたEL−４標的細胞（◇） NP 365−380と共に37℃で90分間予めインキュベート
したEL−４標的細胞（◆） に対して求めた。
第１図は遊離ペプチド、ウイルス又はPam3Cys−Ser−Se
r−ペプチドで免疫した後のBALB/cマウスの脾臓細胞の
細胞毒性Ｔ細胞活性を表し、Ａはペプチド、Ｂはウイル
ス、Ｃはリポペプチドでそれぞれ免疫した後、ペプチド
で刺激した後の、ウイルス感染標的細胞に対する活性、
Ｄはペプチド、Ｅはウイルス、Ｆはリポペプチドでそれ
ぞれ免疫した後、ペプチドで刺激した後の、種々な濃度
のペプチドで処理した標的細胞に対する活性、Ｇはペプ
チド、Ｅはウイルス、Ｆはリポペプチドでそれぞれ免疫
した後、ウイルスで刺激した後の、ウイルス感染標的細
胞に対する活性を表す。 第２図は２種類のリポペプチド（P3CSS−NP 147−158、
P3CSS−NP 365−380）でマウスを免疫した後の脾臓細胞
の細胞毒性Ｔ細胞活性を表し、Ａはウイルス、Ｂはリポ
ペプチドP3CSS−NP 147−158でそれぞれBALB/cマウスを
免疫した後、ペプチドNP 147−158で刺激した後の、ウ
イルス感染及びペプチド処理標的細胞に対する活性、Ｃ
はウイルス、ＤはリポペプチドP3CSS−NP 365−380でそ
れぞれ（B6×DBA/2）F1マウスを免疫した後、ペプチドN
P 365−380で刺激した後の、ウイルス感染及びペプチド
処理標的細胞に対する活性を表す。 第３図はMHCクラスＩレストリクション及びリポペプチ
ドによる免疫の特異性に関する試験結果を表し、Ａはリ
ポペプチドP3CSS−NP 147−158,R−、ＢはペプチドSS−
NP 147−158,R−、ＣはペプチドNP 147−158,R−でそれ
ぞれBALB/cマウスを免疫した後、ペプチドNP 147−158,
R−で刺激した後の、ペプチド処理標的細胞に対する活
性、Ｄはウイルス、ＥはリポペプチドP3CSS−NP 147−1
58,R−、ＦはリポペプチドP3CSS−NP 365−380で（B6×
DBA/2）F1マウスを免疫した後、ペプチドNP 147−158,R
−で刺激した後の、ペプチドNP 147−158,R−及びNP 36
5−380処理標的細胞に対する活性、Ｇはウイルス、Ｈは
リポペプチドP3CSS−NP 147−158,R−、Ｉはリポペプチ
ドP3CSS−NP 365−380で（B6×DBA/2）F1マウスを免疫
した後、ペプチドNP 365−380で刺激した後の、ペプチ
ドNP 147−158,R−及びNP365−380処理標的細胞に対す
る活性を表す。
r−ペプチドで免疫した後のBALB/cマウスの脾臓細胞の
細胞毒性Ｔ細胞活性を表し、Ａはペプチド、Ｂはウイル
ス、Ｃはリポペプチドでそれぞれ免疫した後、ペプチド
で刺激した後の、ウイルス感染標的細胞に対する活性、
Ｄはペプチド、Ｅはウイルス、Ｆはリポペプチドでそれ
ぞれ免疫した後、ペプチドで刺激した後の、種々な濃度
のペプチドで処理した標的細胞に対する活性、Ｇはペプ
チド、Ｅはウイルス、Ｆはリポペプチドでそれぞれ免疫
した後、ウイルスで刺激した後の、ウイルス感染標的細
胞に対する活性を表す。 第２図は２種類のリポペプチド（P3CSS−NP 147−158、
P3CSS−NP 365−380）でマウスを免疫した後の脾臓細胞
の細胞毒性Ｔ細胞活性を表し、Ａはウイルス、Ｂはリポ
ペプチドP3CSS−NP 147−158でそれぞれBALB/cマウスを
免疫した後、ペプチドNP 147−158で刺激した後の、ウ
イルス感染及びペプチド処理標的細胞に対する活性、Ｃ
はウイルス、ＤはリポペプチドP3CSS−NP 365−380でそ
れぞれ（B6×DBA/2）F1マウスを免疫した後、ペプチドN
P 365−380で刺激した後の、ウイルス感染及びペプチド
処理標的細胞に対する活性を表す。 第３図はMHCクラスＩレストリクション及びリポペプチ
ドによる免疫の特異性に関する試験結果を表し、Ａはリ
ポペプチドP3CSS−NP 147−158,R−、ＢはペプチドSS−
NP 147−158,R−、ＣはペプチドNP 147−158,R−でそれ
ぞれBALB/cマウスを免疫した後、ペプチドNP 147−158,
R−で刺激した後の、ペプチド処理標的細胞に対する活
性、Ｄはウイルス、ＥはリポペプチドP3CSS−NP 147−1
58,R−、ＦはリポペプチドP3CSS−NP 365−380で（B6×
DBA/2）F1マウスを免疫した後、ペプチドNP 147−158,R
−で刺激した後の、ペプチドNP 147−158,R−及びNP 36
5−380処理標的細胞に対する活性、Ｇはウイルス、Ｈは
リポペプチドP3CSS−NP 147−158,R−、Ｉはリポペプチ
ドP3CSS−NP 365−380で（B6×DBA/2）F1マウスを免疫
した後、ペプチドNP 365−380で刺激した後の、ペプチ
ドNP 147−158,R−及びNP365−380処理標的細胞に対す
る活性を表す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/21 Ａ６１Ｋ 39/21 39/235 39/235 39/29 39/29 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/015 A61K 39/02 A61K 39/10 A61K 39/12 A61K 39/145 A61K 39/21 A61K 39/235 A61K 39/29 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】少なくとも１つの膜アンカー化合物と、ウ
イルス、細菌、寄生虫又は腫瘍抗原の少なくとも１つの
キラーＴ細胞エピトープを含むタンパク質、もしくはウ
イルス、細菌又は寄生虫タンパク質又は腫瘍抗原の少な
くとも１つのキラーＴ細胞エピトープを含む少なくとも
１つの部分配列との結合体からなる細胞毒Ｔ−リンパ球
の特異的誘導用合成ワクチン。 - 【請求項２】膜アンカー化合物は細菌膜リポタンパク質
である請求項１記載の合成ワクチン。 - 【請求項３】膜アンカー化合物は次の式 （式中、Ａは硫黄、酸素、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ
−）、メチレン（−CH2−）又は−NH−であることがで
き； ｎは０〜５、ｍは１又は２であり； Ｃ＊はＲ又はＳ配置の不斉炭素原子であり、 Ｒ、Ｒ′及びＲ″は同一か又は異なり、水素又はヒドロ
キシル、アミノ、オキソ、アシル、アルキル又はシクロ
アルキル基で置換されることができる炭素原子数７〜25
のアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、式IX
のＥは水素又は天然もしくは合成アミノ酸の任意の所望
の側鎖であることができ、式VIのＢは式Ｉ〜Ｖに示す各
々の−（CH2）ｎ−（置換されたアルキル）基の意味を
持ち、R1とR2は同一か又は異なりＲ、Ｒ′及びＲ″と同
じ意味を持つのみならず、−OR、−Ｏ−COR、−COOR、
−NHCOR又は−CONHRであることもでき、Ｘはウイルス、
細菌又は寄生虫タンパク質又は腫瘍抗原のタンパク質も
しくは部分配列が結合している10までのアミノ酸の鎖で
あるか、又はタンパク質もしくは部分配列自身である）
の１つを持つ請求項１記載の合成ワクチン。 - 【請求項４】膜アンカー化合物はＮ−パルミトイル−Ｓ
−2,3（ビスパルミトイルオキシ）−プロピル−システ
イニル−セリル−セリンであり、部分配列は末端セリン
残基に結合している請求項１記載の合成ワクチン。 - 【請求項５】タンパク質又は部分配列はキラーＴ細胞エ
ピトープを含むアデノウイルス、HIV、インフルエンザ
ウイルス、LCMV、MCMV、肝炎ウイルス、HTLV、FELV、ト
レポネマ・パリダム（Treponema pallidum）、ゴノコッ
カス（gono−coccus）、ボルデテラ・パーツシス（Bord
etella pertussis）又はプラスモジウム・スペック（Pl
asmodiumspec.）又は他の病原体から得られる請求項１
〜４の１つ又は複数に記載の合成ワクチン。 - 【請求項６】膜アンカー／活性化合物結合体と種々な部
分配列との混合物が存在する請求項１〜５の１つ又は複
数に記載の合成ワクチン。 - 【請求項７】細胞毒性Ｔリンパ球誘導用膜アンカー／活
性化合物結合体のほかに、中和抗体生成用膜アンカー／
活性化合物結合体も存在する請求項１記載の合成ワクチ
ン。 - 【請求項８】膜アンカー／活性化合物結合体を公知の方
法で合成することからなる請求項１〜７の１つ又は複数
に記載の合成ワクチンの製造法。 - 【請求項９】請求項１〜７の１つ又は複数に記載の合成
ワクチンと、所望により慣用の助剤又は賦形剤と、及び
所望により別のワクチンとを含む細胞毒性Ｔリンパ球誘
導用医薬製剤又は動物薬製剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3937412.2 | 1989-11-10 | ||
| DE3937412A DE3937412A1 (de) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | Synthetische vakzine zur spezifischen induktion zytotoxischer t-lymphozyten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0454131A JPH0454131A (ja) | 1992-02-21 |
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2302820A Expired - Fee Related JP3057748B2 (ja) | 1989-11-10 | 1990-11-09 | 細胞毒性ｔリンパ球の特異的誘導用合成ワクチン |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3057748B2 (ja) |
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| DE (2) | DE3937412A1 (ja) |
| DK (1) | DK0431327T4 (ja) |
| ES (1) | ES2087111T5 (ja) |
| GR (1) | GR3019859T3 (ja) |
| IE (1) | IE74899B1 (ja) |
| PT (1) | PT95824B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5780036A (en) * | 1991-08-26 | 1998-07-14 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus |
| US6607727B1 (en) | 1991-08-26 | 2003-08-19 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus |
| US6322789B1 (en) | 1991-08-26 | 2001-11-27 | Epimmune, Inc. | HLA-restricted hepatitis B virus CTL epitopes |
| CA2081952A1 (en) * | 1991-11-08 | 1993-05-09 | John J. Donnelly | Recombinant dna sequences and plasmids for cellular immunity vaccines from bacterial toxin-antigen conjugates, and methods of their use |
| CA2085083A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-19 | Richard L. Tolman | Synthetic peptides comprising a cyclic hiv principal neutralizing determinant and a lipopeptide |
| US6235288B1 (en) | 1992-08-26 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
| EP0912195B1 (en) | 1996-06-25 | 2009-01-21 | Pepscan Systems B.V. | Vaccine comprising antigens bound to carriers through labile bonds |
| US6977074B2 (en) | 1997-07-10 | 2005-12-20 | Mannkind Corporation | Method of inducing a CTL response |
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