PT95824A

PT95824A - Processo para a preparacao de vacinas sinteticas para a inducao especifica de linfocitos t citotoxicos

Info

Publication number: PT95824A
Application number: PT95824A
Authority: PT
Inventors: Guenter Jung; Hans-Georg Rammensee
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1989-11-10
Filing date: 1990-11-08
Publication date: 1991-09-13
Also published as: EP0431327A1; GR3019859T3; IE74899B1; ES2087111T3; ES2087111T5; JP3057748B2; DE59010300D1; EP0431327B2; ATE137118T1; DK0431327T4; IE904051A1; DE3937412A1; PT95824B; JPH0454131A; EP0431327B1; DK0431327T3

Description

Descrição referente ã patente de invenção de HOECHST AKTIENGESEL-LSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frank furt am Main 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. GÚn-ther Jung e Dr. Hans-Georg Rammen see, residentes na República Fede ral Alemã), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE VACINAS SINTÉTICAS PARA A INDUÇÃO ESPECÍFICA DE LIN— FÕCITOS T CITOTÕXICOS".

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a uma vacina sintética para a indução específica de linfócitos T citotó xicos.

Os linfócitos T citotõxicos (células T assassinas;células T Killer) representam uma parte considerável da resposta imune dos animais de sangue quente contra infecções intracelulares. Os linfócitos T citotõxicos são normalmente induzidos apenas por meio de uma inoculação in vivo com agentes infecciosos (J. Bastin et ai., J. Exp. Med., Vol. 165, Junho de 1987). Em virtude dos riscos decorrentes daquela técnica, um inoculante sintético para a indução específica de linfócitos T citotõxicos representa um melhoramento considerável. Verificou--se agora surpreendentemente que por meio da utilização de epí-topos de células T assassinas que possuem conjugados de substân cias activas de ancoragem de membranas é possível a indução es- N. 1

pecífica in vivo de linfócitos T citotóxicos. É já conhecido que os conjugados de substâncias activas de ancoragem de membranas são apropriados para a obtenção de anticorpos neutralizantes (ver Angew. Chem. 97 (1985), nQ. 10, pãg. 883 e segs.); até agora no entanto não se tinha preparado uma vacina sintética para a indução específi ca de linfócitos T citotóxicos que contivesse conjugados de substâncias activas de ancoragem de membranas.

Por conseguinte, é um objectivo da presente invenção a preparação de uma vacina sintética para a indu ção de linfócitos T citotóxicos, a qual é caracterizada por ser constituída por um conjugado de pelo menos um composto de ancoragem de membrana e uma proteína de um vírus, de uma bactéria ou de um parasita ou de um antigene tumoral que contêm pelo menos um epítopo de uma célula T assassina ou pelo menos uma sequência parcial que contém pelo menos um epítopo de uma célula T assassina de uma proteína de um vírus, de uma bactéria ou de um parasita ou de um antigene tumoral. O referido composto de ancoragem de mem brana é de preferência uma lipoproteína bacteriana. É especialmente preferido para composto de ancoragem de membrana um composto de uma das fórmulas seguintes R -CO-O-CH-1 2 R -0-CH-1 2 R -0-C0-CHo 1 2 1 R' -CO-O-CH* j 1 R'-0-CH* 1 R' -O-CO-CH* Wn | (CH,) 1 2 n | (CH ) 1 2 1 A 1 A 1 A «jVn «ÇVn | (CH_) 1 2 R"-CO-NH-CH*-CO-X R"-CO-NH-CH*-CO-X R" -CO-NH-CH*-1 I. H H III. 2 R -NH-CO-CH- I R'-NH-CO-CH* I«fVn A I«ÇVm R"-CO-NH-CH*-CO-X IV. R -CO-CH. R' -CO-CH* (CH_) | 2 m R"-CO-NH-CH*-CO-V.

B A R"-NH-CO-CH*-CO-X VI.

R-CO-A R. -CH0 1 I 2 R0-CH* 2 i (CH0) I 2 m

Wm

R"-CO-NH-CH-CO-X

R-CO-NH-CH*-CO-X

R-CO-NH-CH-CO-X VII. VIII. em que A pode ser enxofre, oxigénio, di metileno (-CH2~) ou -NH-; n=0a5,m=lou2; C* é um átomo de carbono assimétrico coi R, R' e R" são iguais ou diferentes e s alquilo, alcenilo ou alcinilo com 7 a 2 quais podem ser substituídos com grupos acilo, alquilo ou cicloalquilo, E na fõ génio ou uma cadeia lateral de qualquer ou artificial, B na fórmula VI pode ter quer resíduo alquilo substituído por -( as fórmulas I a V e R^ e R2 são iguais os mesmos significados que R, R' e R", : -O-COR, -COOR, NHCOR ou -CONHR, em que ximo de 10 ácidos aminados à qual a pro ciai da proteína de um vírus, de uma ba ou do antigene tumoral se encontra liga< teína ou sequência parcial. IX. ssulfureto (-S-S-), ji a configuração R ou S, jio hidrogénio ou grupos [> átomos de carbono, os Ihidroxilo, amina, oxo, ijrmula IX pode ser hidro- j ácido aminado natural o significado de qual-S'H2^n- especificado para

Jm diferentes e possuem nas também podem ser -OR,| \ é uma cadeia com um má

Lteina ou a sequencia par wtéria ou de um parasita 5a, ou é a própria pro- 3

Destes são de referir como exemplos especialmente os seguintes:

As sequências N-terminais que ocorrem em lipoprotelnas bactéria nas, como por exemplo: Y-Ser-Ser-Ser-Ans, Y-Ile-Leu-Leu-Ala, Y-Ala-Asn-Asn-Gln, Y-Asn-Ser-Asn-Ser, Y-Gly-Ala-Met-Ser, Y-Gln-Ala-Asn-Tyr, Y-Gln-Val-Asn-Asn e Y-Asp-Asn-Ser-Ser, em que Y pode ser um resíduo de entre os definidos pelas fórmulas I a VII. Estes lipo-pentapeptídeos podem também ser introduzidos como compostos de ancoragem de membrana sob forma encurtada (lipodipeptídeos, li-potripeptídeos ou lipotetrapeptídeos). São especialmente preferidos os compostos N-palmitoíl-S-[2,3-(bispalmitoiloxi)-propil]--cisteinil-seril-serina (Pam^Cys-Ser-Ser) , N-palmitoíl-S-[2,3-- (bispalmitoiloxi)-propil]-cisteinil-seril-glicina e N-palmito-il-S-[2,3-(bispalmitoiloxi)-propil]-cisteinil-alanil-D-isogluta mina.

Para além disso são especialmente prefe ridos os compostos das fórmulas I e III, especialmente os compostos da fórmula I. 0 substituinte A é de preferência enxofre ou metileno, de modo especialmente preferido é enxofre.

Os substituintes R, R' e R" são de preferência resíduos alquilo com 14 a 18 átomos de carbono; de modo especialmente preferido são resíduos alquilo com 16 átomos de carbono. O substituinte X é de preferência forma do por 1 a 2 resíduos de ácidos aminados polares e de modo espe cialmente preferido é um resíduo de serina.

Para as vacinas de acordo com a presente invenção são apropriadas para o acoplamento no composto de ancoragem de membrana diferentes proteínas ou sequências parciais de proteínas de agenLes patogénicos intracelulares, proteínas de vírus, de bactérias ou de parasitas ou de antigenes turno rais, que podem ser reconhecidos por células T assassinas.

Estas proteínas ou estas sequências par ciais (também denominadas epítopos de células T assassinas) ca-racterizam-se por serem reconhecidas pelos linfócitos T citotó-xicos em conjunto com moléculas de MHC (major histacompatibili- - 4 -

ty complex = complexo de histocompatibilidade principal).

As vacinas da presente invenção são apro priadas para a imunização contra todos os agentes que apresentam epítopos de células T assassinas, como por exemplo contra adenovírus, HIV, vírus da gripe, LCMV, MCMV, vírus de hepatite , HTLV, FELV, Treponema pallidum, Gonococcus, Bordetella pertussis ou Plasmódios, listérias, micobactérias ou Leichmania. No quadro que se segue apresentam-se sequências parciais de epítopos de células T assassinas, das quais ocupam uma posição privilegie da a proteína nuclear da gripe PgCSS-NP 147-158 (R-) e o epíto-po do HIV.

5

Organismo Proteína de a Restr. Sequência Adenovírus - - Db PSNTPPEI Ad5ElA HIV env (gp 120) 381-392 HLA A2 (K)NCGGE-FFYCNS HIV env (gp 120) 308-322 Dd RIQRGPGRA- FVTIGK HIV env (gp 120) 410-429 DR4 GSDTITLPC- RIKQFINMW- QE HIV gag (pl7) 418-443 A2 KEGHQMKDC- TERQANF HIV gag (pl7) 446-460 A2 GNFLQSRPE- PTAPPA HIV gag (p24) 193-203 A2 GHQAAMEML- KE HIV gag (p24) 219-233 A2 HAGPLAPGQ- MREPRG HIV gag (p24) 265-280 B27 KRWIILGLN- KIVRMYC Gripe Nucleoproteína 82-94 HLA A2 MWKLGEFY- NQMM Gripe Matriz 57-68 HLA A2 KGILGFVFT- LTV Gripe Nucleoproteína 335-349 B37 B34 A2 Aw69 SAAFEDLRV- LSFIRG Gripe Hemaglutinina H3 58-73 H-2 Ad ILDGIDCTL- IDALLGD Gripe HEMAGLUTININA H3 58-73 H-2 Ad ILDGIDCTL- IDALLGD Gripe Hemaglutinina 181-204 103-123 H-2K;H-2K - Gripe Nucleoproteína 365-379 SDYEGRLIQ- NSLTI Gripe Nucleoproteína 335-349 H-2B IASNENMET- MESSTL Gripe Nucleoproteína 384-393 HLA B27 RYWAIRTRSG Gripe A/NT/60/68 Nucleoproteína 147-158 Kd TYQRTRALV-(R) TG LCMV Nucleoproteína 118-126 Ld Lq RPQASGVYM LCMV - 278-286 H-2b VENPGGYCL 277-293 H-2b GVENPGGYC- LTKWMILA 6

Organismo Proteína de a Restr. Sequência _ - 168-176 - YPHFMPTNL MCMV - 161-179 Ld GRLMYDMYPHFMP- TNLGPS P815 Antigene tumoral P91A 12-24 Ld ISTQNHRALDLVA Plasmodium falciparum Circumsporozoite prot. 368-390 H-2K KPKDELDYENDIE- KKICKMEKCSC berghei II 249-260 Kd NDDSYIPSAEKI yoelii - 276-288 Kd NEDSYVPSAEQI Hapatitis B HBsAg 21-28 — PLGFFPDH

Por meio das vacinas da presente invenção é possível a partir de agora misturar diferentes compostos de ancoragem de membrana acoplados a diferentes sequências parciais , a fim de se obter uma vacina determinada optimizada para um objectivo determinado. Para além disso, uma mistura como a referida pode conter adicionalmente conjugados de substâncias activas de ancoragem de membrana que estimulam a resposta imune e adicionalmente levam ã produção de anticorpos neutralizantes (Vaccine 7, 29 - 33 (1989), Angew. Chem., Int. Ed. 24, 872 - 87ϋ (1989)). A partir de agora é também possível acoplar por ligações covalentes sequências parciais diferentes e ligá-las com compostos de ancoragem de membrana. É também um objectivo da presente inven ção um processo para a preparação de uma vacina sintética carac terizado por se ligarem proteínas ou sequências parciais de agentes por meio de uma reacção de conjugação ao composto de an coragem de membrana. A reacção de conjugação pode por exemplo ser uma condensação, uma adição, uma substituição, uma oxidação ou uma formação de dissulfureto. São preferidos os métodos de conjugação apresentados nos exemplos. Outros métodos de conjuga ção encontram-se descritos na já citada publicação de pedido de Patente Alemã 35 46 150. A preparação dos compostos de ancoragem de membrana ê igualmente descrita pormenorizadamente na referi-• da publicação de pedido de patente. 7

A separação eventualmente necessária dos diastereõmeros pode ser efectuada de acordo com diversos mé todos, como por exemplo os descritos em Hoppe-Seyler1s Z. Phy-siolog. Chem. 364 (1983) 593. A preparação das sequências parciais a utilizar para os conjugados de substâncias activas de ancoragem de membrana pode ser efectuada de diferentes modos conhecidos da literatura, ver por exemplo Wunsch et al. em Houben-Weyl, Vol. 15/1.2, Estugarda, Thieme-Verlag ou Wunsch em Angew. Chem. 83/1971), E. Gross e J. Meienhofer (Editores), The Peptides, Vol. 1 (1979), 2 (1979), 3 (1981 e 5 (1983) Academic Press, Nova Iorque 7713 ou na publicação de pedido de Patente Alemã 35 46 150. No Exemplo 1 elucida-se mais em pormenor um processo preferido para a preparação de uma sequência parcial e de um conjugado.

Para além disso, são abrangidos pela presente invenção composições farmacêuticas ou veterinárias que apresentam um conteúdo de um conjugado de pelo menos um composto de ancoragem de membrana e pelo menos uma sequência parcial de uma das referidas proteínas ou dos referidos organismos. Nor malmente não são necessários, para além de um solvente, quaisquer aditivos, veículos ou adjuvantes para as preparações de acordo com a presente invenção. Em muitos casos pode no entanto ser indicado adicionar algum aditivo e/ou veículo bem como even tualmente adjuvantes ãs preparações de acordo com a presente in venção (Anton Mayr, Gerhard EiBnen, Barbara Mayr-Bibrack, Hand-buch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin, 1984, Verlag Paul Parey, Berlim-Hamburgo). A quantidade de vacina necessária para uma imunização segura num animal de sangue quente depende do ti po de animal, do composto ou dos compostos de ancoragem de membrana e da proteína ou da sequência parcial ou das sequências parciais do organismo, contra o qual se pretende imunisar e deve ser avaliada empiricamente em cada caso.

Os exemplos que se seguem destinam-se a elucidar mais completamente a presente invenção. 8

Síntese EXEMPLO 1 Síntese de N-palmitoíl-S-[2,3-(bispalmitoiloxi)-propil]-cistei-nil-seril-seril-NP 147-158

Sintetizou-se a sequência peptídica da nucleoproteína do vírus da A gripe por meio de síntese em fase sólida. Utilizaram-se ácidos aminados Fmoc. Foram usados na sín tese os seguintes grupos protectores da cadeia lateral: Thr(tBu), Tyr(tBu) e Arg(Pmc). Utilizou-se 1 g de álcool para-benziloxi-benzílico-resina, carregada com 0,5 mmol de Fmoc-Gly e construiu-se a sequência peptídica segundo o seguinte ciclo de síntese. N-Activação com piperidina a 50% em DMF (1 x 10 min). Aco plamento do ácido aminado seguinte durante 30 min com BOP/HOBT [hexafluorofosfato de benzotriazolil-l-oxi-tris-(dimetilamino)--fosfõnio/1-hidroxibenzo-triazil] e diisopropiletilamina em DMF. De cada vez efectuou-se um duplo acoplamento com um excesso de 3 vezes de ácido aminado Fmoc e um excesso de 4,5 vezes de diisopropiletilamina (sempre referido ao grupo amina livre na resi^ na). Após cada duplo acoplamento lavou-se a resina-peptídeo três; vezes com N-metilpirrolidona, diclorometano e N-metilpirrolidona

Após a síntese da sequência peptídica da nucleoproteína do vírus da A gripe ligada ã resina, recuperou-se uma parte do peptídeo por meio de cisão com ácido tri-fluoroacético e verificou-se a pureza por meio de HPLC, MS, aná lise de ácidos aminados, análise de fase quiral bem como de anã lise de sequência. A análise por HPLC uma pureza superior a 90%. Após acoplamento de dois resíduos de serina [Fmoc-Ser(tBU)] no peptídeo ligado à resina, seguiu-se o acoplamento de tripalmi-toíl-S-glicerinacisteína por meio do método de DIC/HOBT. Após quatro horas adicionou-se um equivalente de N-metilmorfolina e após mais uma hora lavou-se o conjunto lipopeptídeo-resina. Separou-se o lipopeptídeo de 100 mg de resina por meio de 2 ml de ácido trifluoroacético (com 100 μΐ de tioanisol e 100 pg de tio cresol) no decurso de uma hora. A fim de eliminar completamente o grupo protector Arg(Pmc), tratou-se ainda durante 30 min. a 50QC com ácido trifluoroacético. Evaporou-se o filtrado ã secura, retomou-se o resíduo com ácido acético e tomou-se em éter 9 frio. Lavou-se o lipopeptídeo precipitado 3 x com éter e liofili zou-se a partir de terc-butanol/ãgua numa proporção 3:1. EXEMPLO 2 Síntese de N-palmitoíl-S-[2,3-(bispalmitoiloxi)-propil]-cistei-nil-seril-seril-NP (365-380) A síntese foi efectuada de modo análogo ao do Exemplo 1. Foram usados na síntese ácidos aminados Fmoc com os seguintes grupos protectores da cadeia lateral: Ser(tBu), Glu(OtBu) e Thr(tBu). A Asn foi acoplada sem grupo protector da cadeia lateral por meio de diisopropilcarbodiimida/HOBT. Para resina de partida utilizou-se álcool Fmoc-Glu (OtBu) -p-benzilox_i benzilico-poliestireno, em que se tinham estabelecido ligações cruzadas com 1% de divinilbenzeno. A carga de Fmoc-Glu(OtBu) foi de 0,45 mmol/g. A cisão do peptídeo e do Pam^Cys-Ser-Ser--peptídeo de 100 mg de resina foi efectuada com 2 ml de ácido trifluoroacético a que se tinha adicionado 0,1 ml de tioanisol e 100 jug de tiocresol no decurso de 90 minutos. A sequência foi verificada por análise do peptídeo livre; por análise de HPLC oh teve-se um único pico correspondente a mais de 90%. A análise de ácidos aminados e a verificação da pureza em enantiómeros em fase quiral deram os resultados esperados.

Determinação da actividade A)

Imunizaram-se ratos BALB/c consanguíneos de 3 meses de idade criados sob condições SPF por via intra venosa com 100 (ug de Pam^Cys-Ser-Ser-[NP 147-158], (100 /ug de Pam^CYs-Ser-Ser-[NP 147-158] em 300 μΐ de PBS tratados por ultra-sons durante 1 min). Após 28 dias infectaram-se os ratos por via intranasal com 0,2 ou 0,4 unidades de hemaglutinação de vírus da gripe A/PR/8. De modo análogo infectaram-se ratos de um grupo de comparação a que se tinha aplicado 300 μΐ de PBS por via intravenosa. Controlou-se o curso da infecção por meio de pesagens diárias e da taxa de sobrevivência. 11 de 12 ani- 10

mais do grupo de comparação, que tinham sido infectados com 0,4 unidades de hemaglutinação, morreram após 11 dias da infecção virai, enquanto que dos animais imunizados apenas morreram 4 em 12.

Infectaram-se com 0,2 unidades de hemaglutinação de vírus da gripe outros dois grupos, um para comparação e outro imunizado com Pam^Cys-Ser-Ser-[NP 147-158]. Apôs 18 dias ainda viviam 40% dos animais do grupo de comparação (4 em 10 animais), enquanto que tinham sobrevivido 75% dos animais imunizados. No dia 18 a diferença de peso entre os animais imunizados e os animais do grupo de comparação era de 4 g. Os animais sobreviventes do grupo de comparação continuaram a perder peso, enquanto que os animais imunizados recuperaram lentamente da infecção. B)

Actividade cititóxica das células T de células do baço de ratos BALB/c após imunização com o peptídeo livre, com vírus ou com Pam^Cys-Ser-Ser-peptídeo (Fig. 1)

Administraram-se a ratos BALB/c por via intravenosa em 300 μΐ de PBS a) 8 x 10 células de baço singénicas pré-incubadas com peptídeo nucleoproteico 1,6 μΜ 147-158 (R-); (A, D, G). 7 , b) 8 x 10 células de baço singénicas pre-mcubadas com lipo- peptídeo Pam^Cys-Ser-Ser-[NP 147-158 (R-)] (C, F), c) 50 unidades de hemaglutinação de vírus da gripe PR/8/34; (B, E, H), d) 100 pg de Pam3Cys-Ser-Ser-[NP 147-158 (R-l)]; (I).

Apôs 6 dias retiraram-se os baços dos animais imunizados e infectados e infectaram-se as células de baço durante 5 dias com o peptídeo (A a F) ou com o vírus PR8 e em seguida reestimularam-se com células estimuladoras singénicas (G, Η, I). Para este fim cultivaram-se em cada caso 2,5 x 7 10 células em 10 ml de meio a-MEM (Fornecedor: Gibco) enriquecido com soro fetal de vitela a 10%, 2-mercaptoetanol, glutami-na e antibióticos, com adição de NP 147-158(R-)-peptídeo (A, f) * 80 nM ou de 5 x 106 células de baço singénicas irradiadas com ^ 20 Gy infectadas com vírus PR8 (G, Η, I). A infecção de estimu- 11

lador e de células alvo foi efectuada conforme descrito (Eur. J. Immunol. 7, 630 - 635 (1977) . A actividade das células T citotõxicas foi determinada por meio de um ensaio padrão de libertação de "^Cr (Eur. J. Immunol. 137, 2, 2676 - 2681 (1986)). Os Gráficos A, B, C e G, Η, I apresentam a actividade CTL sobre células alvo P815 (MCH:H-2^) não tratadas (|) ou infectadas com PR8 (4).

Os Gráficos D, E e F apresentam a activd dade CTL sobre células P815 que tinham sido pré-tratadas com di ferentes concentrações de peptídeo livre durante 30 minutos a 37QC. Neste caso utilizou-se uma proporção de efector para célu las alvo de 30 : 1. C)

Actividade de células T citotõxicas após imunização de ratos com Pam^Cys-Ser-Ser-[NP 147-158] ou Pam^CYS -Ser-Ser-[NP 365 - 380] (Fig. 2).

Imunizaram-se ratos BALB/c (Gráficos A e B) ou ratos (B6 x DBA/2)-Fl (C e D) com vírus de gripe A (A e C) ou com 100 ug de Pam^Cys-Ser-Ser-[NP 147-158] (Gráfico B) ou com 100 ug de Pam^Cys-Ser-Ser-[NP 365-380] (Gráfico D). Após 6 dias retiraram-se os baços e estimularam-se as células de baço conforme descrito em B), na presença de peptídeo NP 147-158 0,8 uM (A e B) ou de peptídeo NP 365-380 0,8 M (C e D). Em seguida verificou-se a actividade das células T citotõxicas sobre células alvo P815 não tratadas (Δ), sobre células alvo P815 infecta das com PR8 (4) e sobre células alvo P815 prê-incubadas durante 90 min a 37QC com peptídeo NP 147-158 () ; igualmente sobre cé- 2 lulas EL-4-(MHC H-2 ) nao tratadas (o), sobre células EL-4 infectadas com PR8 (·) e sobre células EL-4 pré-incubadas durante 90 min a 379C com peptídeo NP 365-380 (♦). D)

Verificação da restrição MHC de classe I e da especificidade da imunização com lipopeptídeo (Fig. 3).

Administraram-se por via i.v. a ratos BALB/c (Gráficos A, B e C) ou ratos (B6 x DBA/2)-Fl (Gráfico D--I) 100 )ig de Pam^Cys-Ser-Ser[NP 147-158(R-)] (Gráficos A, E e 12

H) ou 50 ug de Ser-Ser-[NP 147-158(R-)] (Gráfico B) ou 50 ug de [NP 147-158(R-)] (Gráfico C) ou 50 unidades de hemaglutinação de vírus da gripe PR8 (Gráficos D e G) ou 100 ug de PanigCys-Ser -Ser-[NP 365-380] (gráficos Fel) em 300 ul de PBS.

Seis dias apôs a injecgão cultivaram-se as células de baço conforme descrito no Exemplo 2 com adição de nucleoproteína 147-158(R-)-peptídeo (Gráficos A a F), ou núcleo proteína 365-380-peptídeo (Gráficos G a I). A actividade das cé lulas T citotóxicas obtidas foi determinada contra células alvo P815 não tratadas (/)) células alvo P815 pré-incubadas durante 90 min a 37QC com NP 147-158(R-) («) células alvo P815 pré-incubadas durante 90 min a 37QC com NP 365-380 (O) - células alvo EL-4 não tratadas (o) células alvo EL-4 pré-incubadas durante 90 min a 37SC com NP 147-158(R-) (0) células alvo EL-4 pré-incubadas durante 90 min a 37QC com NP 365-380 (♦). 13

Claims

REIVINDICAÇÕES - lã - Processo para a preparação de uma vacina sintética para a indução específica de linfócitos T citotõx_i cos constituída por um conjugado de pelo menos um composto de ancdragem de membrana e uma proteína de um virus, de uma bactéria, de vim parasita ou um antigene tumoral que contêm pelo menos vim epítopo de células T assassinas ou pelo menos uma sequên cia parcial de uma proteína de um vírus, de uma bactéria ou de um parasita ou de um antigene tumoral que contêm pelo menos um epitopo de células T assassinas, caracterizado por se sintetizar de acordo com métodos conhecidos um conjugado de substância activas de ancoragem de membrana. - 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto de ancoragem de membrana ser uma lipoproteína de membrana bacteriana. - 3â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto de ancoragem de membrana apresentar uma das seguintes fórmulas 14 R -CO-O-CH, R' -CO-O-CH* R -0-CH„I
2 R'-0-CH*

I R'-O-CO-CH* I Wn Wn Wn (CH_) | 2 m R"-CO-NH-CH*-CO-X I. R -NH-CO-CH„ (CH,) | 2 m R"-CO-NH-CH*-CO-X II. R -CO-CH^ <CH ) | 2 m R" -CO-NH-CH*-CO-X III. R' -NH-CO-CH* (yH2»n R'-CO-CH*I Wn B I Ά <CH,I | 2 m R"-CO-NH-CH*-CO-X IV. (CH,)_ | 2 m R"-CO-NH-CH*-CO-X V. (CH,) 2 m R"-NH-CO-CH*-CO-X VI. R.-CH„ 1 I 2 R--CH* 2 I Wn R-CO-A (CH~) | 2 m R"-CO-NH-CH-CO-X E I R-CO-NH-CH-CO-X (CH,) I 2 m R-CO-NH-CH*—CO-X VII. VIII. IX. em que A pode ser enxofre, oxigénio, dissulfureto (-S-S-), metileno (-CH2~) ou -NH-; n=0a5, m=lou2; C* é um átomo de carbono assimétrico com a configuração R ou S, R, R' e R" são iguais ou diferentes e são hidrogénio ou grupos alquilo, alcenilo ou alcinilo com 7 a 25 átomos de carbono, os quais podem ser substituídos com grupos hidroxilo, amina, oxo, acilo, alquilo ou cicloalquilo, E na fórmula IX pode ser hidrogénio ou uma cadeia lateral de qualquer ácido aminado natural ou artificial, B na fórmula VI pode ter o significado de qualquer resíduo alquilo substituído por -(C^^- especificado para 15

as fórmulas I a V e e R2 são iguais ou diferentes e possuem os mesmos significados que R, R' e R", mas também podem ser -0R, -O-COR, -COOR, NHCOR ou -CONHR, em que X é uma cadeia com um má ximo de 10 ácidos aminados ã qual a proteína ou a sequência par ciai da proteína de um virus, de uma bactéria ou de um parasita ou do antigene tumoral se encontra ligada, ou é a própria proteína ou sequência parcial. - 4â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto de ancoragem de membrana ser N--palmitoil-S-2,3-(bispalmitoiloxi)-propil-cisteinil-seril-serine e a sequência parcial se encontrar ligada ao resíduo de serina terminal. _ 5a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína ou a sequência parcial ser der^ vada de um adenovírus, HIV, vírus de gripe, LCMV, MCMV, vírus de hepatite, HTLV, FELV, Treponema pallidum, Gonococcus, Borde-tella pertussis ou Plasmodium spec. ou de um outro agente pato-génico que contêm um epítopo de células T assassinas. - 6ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma mistura de conjugados de substâncias activas de ancoragem de membrana com sequências par ciais diferentes. 16 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma vacina na qual existem para além dos conjugados de substâncias activas de ancoragem de membranas para indução de linfócitos T citotóxicos também conju gados de substâncias activas de ancoragem de membrana para a produção de anticorpos de neutralização. t A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 10 de Novembro de 1989, sob o NQ. P 39 37 412.2.

Lisboa, 8 de Novembro de 1990. 0 AGENTE OFICIAL DA PEOPEIEDADE IXDUSTBIAL

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