PT87857B

PT87857B - Processo para a preparacao de novos peptidos com propriedades imunossupressoras

Info

Publication number: PT87857B
Application number: PT87857A
Authority: PT
Inventors: John Leonard Krstenansky; Alan Douglas Cardin; Terry L Bowlin
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1987-06-29
Filing date: 1988-06-28
Publication date: 1992-10-30
Also published as: EP0297456A2; NZ225167A; JPS6426597A; CN1030917A; NO882856D0; ZA884504B; HU200479B; NO882856L; EP0297456A3; FI883092A; HUT47135A; DK355888A; IL86896A0; AU1841788A; FI883092A0; KR890000516A; DK355888D0; AU610900B2; PT87857A

Description

A presente invenção refere-se a novos pépt dos e às suas propriedades imunossupressoras.

Antecedentes da Invenção

O sistema imunológico é uma das principais defesas contra as doenças provocadas por micróbios e outros antigénos estranhos nas espécies animais superiores. Uma res posta imunológica é mediada pela acção de células imunológicas específicas que reagem com antigénos específicos. Antigjé nos potenciais podem ser constituídos por uma diversidade de substâncias, frequentemente proteínas, que são estranhas ao corpo do indivíduo em causa. Estas são na maior parte dos ca sos localizadas nas superfícies mais exteriores das células. Os antigénos potenciais podem ser encontrados nos grãos de pólen, enxertos de tecidos, parasitas animais, vírus e bactérias.

Nos seres humanos muitos dos potenciais an tigénos não ultrapassam as duas linhas de defesa principais, portanto, não atingem o corpo e portanto não desafiam o sistj ma imunológico. Estas duas linhas de defesa consistem, primeiro, na pele, membranas mucosas, lágrimas e suco ácido do /

i estômago; a segunda é constituída por glóbulos brancos sanguíneos especializados, granulócitos e monocitos e macrófagos que destroiem antígenos patogénicos e outros antígenos potenciais mediante fagocitose, que é realizada quando estes incor poram e destroem o material estranho.

Estes glóbulos brancos e macrófagos são designados por fagocitos. Quando substâncias patogónicas ou outras substâncias estranhas passam ao corpo do indivíduo as pri meiras duas linhas de defesa iniciam uma resposta imunológica.

Existem dois sistemas principais de defesa imunológica humoral e celular, os quais reagem ambos com os antígenos. A imunidade humoral ó devida aos anticorpos circulantes que são encontrados na fraeção gama globulina das proteínas plasmáticas. Quando o plasma ó centrifugado a velocidades elevadas as suas proteínas componentes separam-se de acor do com o peso em secções designadas por fracções. Os anticor pos são habitualmente encontrados na fraoção cujos componen tes apresentam um peso molecular aproximadamente de I56.OOO. Esta fraeção particular tem sido designada por fraeção de gama globulina. A imunidade humoral constitui a defesa principal contra as infecções bacterianas. A imunidade celular ó devida parcialmente aos produtos dos linfócitos designados por linf<> quinas. Este tipo de imunidade ó responsável pelas reacções alérgicas, rejeição de transplantes de tecidos estranhos e re jeição de células tumorais. Ela constitui a defesa principal contra infecções provocadas por vírus, fungos e por algumas bactérias, tais como, os bacilos de Koch.

Os globulos brancos especializados, designa . / dos por linfócitos são responsáveis pela imunidade humoral e pela imunidade celular. As células percursoras dos linfócitos formam-se na medula óssea dos seres humanos adultos que seguem por migração para os vários orgãos ou na membrana vitelina de um feto em desenvolvimento, seguida de migração para o feto e, em seguida para os vários órgãos.

Nos seres humanos algumas destas células percursoras migram para o timo que ó uma estrutura glandular de dois lóbulos localizada na parte superior do peito, exacta mente por trás do externo onde são transformados em linfócitos-T que estão envolvidos na imunidade celular. Nos seres hu manos o restante das células percursoras migra para o baço on de são transformadas em linfócitos-B que estão envolvidos na imunidade humoral. Os linfócitos T e B são estructuCalmente indistintos ainda que possuam funções diferentes e podem ser distinguidos por meio de diversos testes químicos.

Os linfócitos maduros circulam no sangue e podem também ser encontrados nos nódulos linfáticos, assim co mo no baço e timo.

A imunidade humoral ó mediada pelos linfóci. tos B que têm receptores para antígenos particulares à superfície das suas células. Estes parecem ser verdadeiramente específicos e cada tipo de linfócitos B reage apenas com um antígeno.

Quando bactérias ou vírus por exemplo invadem um organismo, os linfócitos B reagem e combinam-se com os antígenos da superfície bacteriana ou virai e o linfócito ó estimulado para entrar em divisão. As células filhas são trans formadas em células especializadas designadas por células pla_s máticas. Estas células produzem e a seguir segregam grandes quantidades de anticorpos para a circulação geral. Os anticor pos são específicos para os antígenos que são estimuladores da sua produção e reagem com aqueles antígenos. Os anticorpos conhecidos como aglutininas, originam diversos antígenos que contêm substâncias para os aglutinar ou aglomerar. Assim, evi ta a disseminação da substância nos tecidos e permite que os fagécitos capturem ou os nódulos linfáticos filtrem o material invasor. Outros anticorpos actuam abrindo cavidades nas paredes da célula bacteriana, portanto eliminando a bactéria. Estes são designados como lisinas. Os anticorpos designados por anti-toxinas associam-se com as toxinas produzidas pelas bactjí rias e portanto neutralizam-nas.

Quando um agente patogénico invade o organis mo e se inicia a resposta imunolégica, os anticorpos podem ser produzidos em várias horas.

Esta reacção inicial é designada por resposta primária ou imunização primária. Contudo, durante aquele tempo os agentes patogénicos também se foram dividindo e algumas vezes produzindo toxinas, do que resultam diversos sintomas de doença. Esta evolução pode ocupar dias ou semanas an tes que suficientes anticorpos sejam produzidos para eliminar todos os agentes patogénicos mas uma vez que estes desapareçam os sintomas da doença desaparecem igualmente. Os linfócitos, células plasmáticas e anticorpos, permanecem e circulam no sangue de tal modo que se os mesmos agentes patogénicos pene

-₅-/ trarem ο organismo por uma segunda vez, os linfócitos reagem imediatamente e iniciam a produção de anticorpos. A resposta dos linfócitos sensibilizados ó designada por resposta secun daria, A resposta secundária resulta na produção de níveis mais elevados de anticorpos do que os que foram produzidos durante a resposta primária. Assim, diversos anticorpos são produzidos tão rapidamente que os microrganismos são incapazes de se dividir e causar doenças. Este tipo de imunidade hu moral é designada como hiper sensibilidade imediata devido ao facto de que um organismo exposto previamente pode responder em minutos a um antigóno como no caso da febre dos fenos. Um outro exemplo de hiper-sensibilidade imediata consiste no cho que anafilático, uma reacção alérgica extrema que algumas vezes ocorre quando um indivíduo ó exposto a um antígeno, para o qual fora sensibilizado. Por vezes esta resposta humoral ao antígeno pode causar a morte.

A imunidade humoral pode ser natural ou ser induzida artificialmente. No caso de imunidade natural activa, os linfócitos do indivíduo continuam a circular e a activar a produção de anticorpos após uma infecção. Esta imunidade natural activa, permanece durante vários anos ou mesmo para toda a vida. Uma criança que recebe anticorpos através do colesterol, leite segregado pela mãe, nos primeiros dias após o nascimento, fornece-lhe imunidade durante o primeiro ano de vida. Esta imunidade ó conhecida como imunidade natural pass_i va uma vez que a criança não está envolvida na produção actual dos anticorpos. A imunidade artificial activa é induzida por injecção de micróbios mortos ou atenuados num indivíduo.

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Os seus antígenos de superfície podem ainda estimular a produção de anticorpos pelos linfócitos, mas estes micróbios não causarão os sintomas de doença como as suas formas mais virulentas o fazem.

Quando um indivíduo é posteriormente expos to ao micróbio virulento, está já sensibilizado e responde imediatamente com uma produção maciça de anticorpos. A imunidade artificial activa pode permanecer vários anos ou permanentemente com injecção de apoio, é também uma forma de imuni. dade artificial passiva que proporciona protecção durante cer ca de um mês. Esta imunidade temporária é provocada por inje£ ção de anticorpos no indivíduo, os quais foram obtidos de um outro indivíduo. Habitualmente é apenas utilizada em situações críticas e epidémicas. Devido ao desvio dos linfócitos, aqueles não produzem anticorpos nem lembram¹’ o antigéno, o que contribui para o efeito temporário deste método.

Na imunidade celular, em contraste com a imunidade humoral, os anticorpos circulantes não são detectá veis. Os linfócitos-T que medeiam este tipo de imunidade são activados quando encontram os antígenos nas células de um ou tro indivíduo como no caso de transplantes, tumores ou vírus. Tais como os linfócitos-B, os linfócitos-T são específicos e cada tipo reage com apenas um antígeno. Os linfócitos aumentam, dividem-se e produzem linfoquinas que participam num ataque ao antígeno estranho.

Aqueles também estimulam actividade fagoci tária dos macrófagos.

Ainda que exista memória imunológica como /

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com a imunidade hurnoral a resposta é muito mais lenta. Pode levar cerca de 10 ou 12 horas a desenvolver uma resposta no indivíduo previamente sensibilizado e a imunidade celular é portanto conhecida como hipersensibilidade retardada. A reac ção alérgica ao Toxidendro, carvalho e sumagre, a mancha ver melha provocada por uma reacção positiva do teste da pele a tuberculina e a rejeição de tecidos transplantados constituem todos respostas imunológicas celulares.

Os agentes imunoindutores activam ou inibem o processo de proliferação linfocitária, A proliferação de linfócitos normal ó devida a diversas acções entre antíger nos, macrófagos, linfócitos-T e linfócitos-B assim como a aj. guns agentes químicos. Por exemplo a presença de um antígeno especial activa um linfócito-T ou B especial. Além disso cer tos linfócitos-B podem ser activados por linfócitos-T activos enquanto que outros são independentes dos linfócitos-T e são activados apenas por antígenos. Os linfócitos-T activados podem provocar os macrófagos para produzirem uma molécula conhecida como interleuquina 1 (iL-l), que por sua vez activa quer os linfécitos-T quer os linfocitos-B.

Os linfócitos-T activados podem também produzir uma molécula designada por interleuquina 2 (lL-2), que posteriormente induz a activação dos linfécitos-T.

Agentes químicos, designados como mitogénicos que podem provocar a síntese de DNA e a mitose, são sinais de actividade dos linfécitos-T ou B. Alguns efeitos mito^ génicos atingem apenas um tipo de linfócitos enquanto que outros afectam vários tipos.

- / *

Os agentes imunoindutores de várias espécies e em diversas quantidades afectam as interacções complexas entre os componentes do sistema imunolégico. Como se demonstrará os compostos e composições da presente invenção actuam como supressores imunológicos e actuam quer nos linfóci. tos-T quer nos linfócitos-B.

Ainda que o sistema imunolégico constitua a principal defesa contra substâncias que podem causar doença, este não pode distinguir entre as substâncias estranhas favoráveis e as nocivas, e destrói ambas. Em muitas circunstâncias seria útil dispor de meios de regulação do sistema imunolégico sem prejudicar o indivíduo. Os péptidos da presente invenção exibem esses efeitos indutores ou reguladores e possuem poten ciai para serem utilizados no tratamento de várias perturbações imunologicas.

Existem circunstâncias em que a resposta imu nolégica de um indivíduo provoca maior dano ou desconforto que os micróbios invasores ou o material estranho como no caso das reacções alérgicas. A supressão desta resposta imunolégica nes tes casos será desejável.

Ocasionalmente o mecanismo imunolégico torna -se sensibilizado em algumas partes do indivíduo causando a in terferência ou mesmo a destruição dessas partes. A capacidade para distinguir entre próprio e não próprio ó reduzida e o organismo começa a destruir-se a eie proprio. Alguns exemplos destas doenças anto-imunes no homem são, a artrite reuma tóide, certas anemias hemolíticas, febre reumática, tiróidite, colite ulcerosa, miastenia grave, glomerulonefrite - uma doen /, ça renal - encefalomielite alérgica que continua a destruição do nervo e do fígado e que algumas vezes se segue à hepatite virai e possivelmente a esclerose múltipla e lúpus eritematoso sistémico.

Algumas formas de auto-imunidade são originadas como resultado de traumatismo numa área usualmente não exposta a linfócitos, tais como os tecidos nervosos ou do cristalino,

Quando os tecidos nestas áreas se tornam ex postos aos linfócitos as suas proteínas superficiais podem ac tuar como antígenos e provocar a produção de anti-corpos e respostas imunogónicas celulares que então começam a destruir aqueles tecidos. Outras doenças auto-imunes desenvolvem, após exposição do indivíduo aos antígenos que lhe são antigenicamente similares e com os quais apresentam reacção cruzada, os próprios tecidos do indivíduo. A febre reumática ó um exemplo deste tipo de doença em que o antígeno da bactéria estreptocó cica que causa a febre reumática tem reacção cruzada com partes do coração humano.

Os anti-corpos não podem diferenciar entre os antigénos bacterianos e os antígenos do músculo cardíaco e as células com qualquer destes antígenos podem ser destruídas.

A supressão do sistema imunológico nestas doenças de alta imunidade poderá ser útil para minimizar ou eliminar os efeitos da doença.

Os anti-corpos circulantes e as respostas /

/

-X* imunogénicas celulares desempenham um papel na rejeição dos tecidos transplantados e de órgãos. A menos que o dador seja um gémeo idêntico do receptor ou o próprio indivíduo, os lin fócitos do receptor reconhecem o transplante como não próprio e respondem imediatamente para o destruírem. As excepçóes a esta situação são os transplantes para áreas não vascu larizadas (sítios privilegiados) tais como a córnea do olho onde os linfócitos não circulam e portanto não são sensibilizados e não originam uma resposta imunogénia imediata. Ê difí cil correntemente suprimir a reacção imunogénia para impedir a rejeição do transplante sem grave dano do doente noutros as pectos. 0 doente deve ser administrado com doses maciças de antibióticos porque as suas próprias defesas quanto a infecção foram suprimidas. Os compostos e composições da presente invenção podem ser valiosos para estabelecer a tolerância aos transplantes mediante indução controlada do sistema imunológico.

Os compostos tais como os descritos nesta invenção que suprimem o sistema imunológico são importantes.

Estes são particularmente úteis quando a acção normal do sis^ tema foi perturbada, ou tenha causado a destruição de materiais estranhos prejudiciais tais como órgãos transplantados.

Resumo da Invenção

Péptidos de fórmula de estrutura geral 1:

Tn-A-B-C-D-Tc (1) r

na qual

Tn representa um resíduo de um aminoácido terminal escolhido entre o átomo de hidro génio, um ou dois grupos alquilo ou com um a seis átomos de carbono, um ou dois grupos acilo de 2 a 10 átomos de carbono, um grupo carbobenziloxi ou t-butiloxicarbonilo;

A representa um fragmento peptídico contendo de 4 a 12 resíduos de aminoácidos esco lhidos entre quaisquer aminoácidos;

B representa um fragmento peptídico contendo 2 a 3 resíduos de aminoácidos escolhidos entre Arg e Lys;

C representa um fragmento peptídico contendo 2 a 3 resíduos de aminoácidos escolhidos entre Gly, Leu, Ile e Thr;

D representa um fragmento peptídico contendo de 1 a 12 resíduos de aminoácidos escolhidos entre quaisquer aminoácidos;

Tc representa um grupo carboxi terminal escolhido entre o grupo OH, alcoxi (C^ , ami.

no, mono- ou di-alquilo (C^ ^), amino subs tituído, ou benzilamino,

São utilizáveis com agentes imunossupresso ί *

Descrição Detalhada da Presente Invenção

As abreviaturas comuns que se seguem dos aminoácidos de ocorrência natural, são utilizadas durante a descrição desta memória descritiva.

Gly - glicina

Ala	- alanina
Vai	- vaiina
Leu	- leucina
Ile	- isoleucina
Pro	- prolina
Phe	- fenilalanina
Trp	- triptofano
Met	- metionina
Ser	- serina
Thr	- treonina
Cys	- cisteína
Tyr	- tirosina
Asn	- asparagina
Gin	- glutamina
Asp	- ácido aspártico
Glu	- ácido glutâmico
Lys	- lisina
Arg	- arginina
His	- histidina
Nle	- norleucina Os aminoácidos naturais com excepção da

glicina contêm um átomo de carbono quiral. A menos que espe13 .· * cificado de um outro modo os aminoácidos opticamente activos aqui citados possuem a configuração-L.

Como é habitual a estrutura dos péptidos aqui representados é de modo a que a extremidade de amino terminal esteja no lado esquerdo da cadeia e a extremidade do carboxi terminal no lado direito.

Um grupo alquilo ou uma fracção alquílica de um grupo alcoxi incluem cadeias ramificadas ou lineares, grupos cicloalquilo, por exemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo, isopentilo, sec-penti. lo, ciclopentilo, hexilo, iso-hexilo, ciclo-hexilo e ciclopen tilmetilo.

Um grupo acilo com dois a dez átomos de carbono abrange grupos de cadeia linear ramificada e cíclicos, grupos acilo eventualmente insaturados com um ou dois radicais carbonilo, por exemplo, acetilo, succinilo ou benzoilo .

termo qualquer aminoácido é utilizado para significar os aminoácidos de ocorrência natural assim Cjo mo C>(-aminoácidos não proteicos correntemente utilizados por técnicos em química dos péptidos quando se preparam análogos sintéticos dos polipéptidos de ocorrência natural.

Os aminoácidos de ocorrência natural são a glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, metionina, treonina, fenilalanina, tirosina, triptofan, cisteína, prolina, histidina, ácido aspártico, asparagina, ácido gluta mico, glutamina, arginina, ornitina e lisina.

1’-!

Exemplos de θζ-arninoácidos nao proteicos são, norleucina, norvalina, aloisoleucina, homo-arginina, tia prolina, desidroprolina, hidroxiprolina (Hyp), homo-serina, ciclo-hexilglicina (Chg), ácido ç/-amino-n-butírico (Aba), ci clo-hexilalanina (Cha), ácido aminofenilbutírico (Pba), fenil^ alaninas substituídas no radical fenilo com grupos alquilo, alcoxi, átomos de halogéneo ou grupos nitro derivados O-alquilados de serina, treonina ou tirosina, cisteína-S-alquila da, ésteres de O-sulfato de tirosina e D-isómeros dos aminoá eidos de ocorrência natural.

Tal como é válido para qualquer grupo de agentes que apresentam actividade farmacológica, são preferi, das certas definições dos vários grupos.

Aqui, péptidos que possuem um grupo Tn que representa hidrogénio e um grupo Tc que representa OH ou ami. no são preferidos. Também são preferidos aqueles péptidos em que A representa um fragmento peptídico contendo 3 a 6 resíduos de aminoácidos seleccionados entre os aminoácidos naturais. Também são preferidos os péptidos em que D representa um fragmento peptídico contendo 1 a 12 resíduos de aminoácidos escolhidos entre qualquer dos aminoácidos naturais. Mais preferidos são os péptidos em que C representa um fragmento peptídico contendo 2 a 3 resíduos de aminoácidos escolhidos entre Gly, Leu, Ile e Thr.

Os polipéptidos de fórmula geral (i) podem formar sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, com qualquer ácido orgânico ou inorgânico não tóxico, ácidos inorgânicos representativos que formam sais adequados são

ΙΑ

por exemplo ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico e sais de ácidos metálicos, tais como monohidrogeno, ortofosfato de sódio e hidrogeno sulfato de potássio, ácidos orgânicos representativos adequados para formarem sais incluem os ácidos mono- di- e tricarboxílicos.

São exemplos destes ácidos, por exemplo, o ácido acético, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido succinico, ácido glutárico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido ben zóico, ácido hidroxibenzóico, ácido fenilacético, ácido cinâ nico, ácido salicílico, ácido 2-fenoxibenzóico e ácidos sulfjó nicos, tais como ácido metanossulfónico e ácido 2-hidroxi-etano sulfónico. Sais de radicais de aminoácidos carboxi-termi. nal incluem os sais de ácidos carboxilicos não tóxicos formados com qualquer base orgânica ou inorgânica adequada.

Exemplos representativos destes sais incluem os sais de metais alcalinos como por exemplo de sódio e potássio; sais de metais alcalinoterrosos, tais como, de cálcio e magnésio; sais de metais leves do grupo IIIA incluin do alumínio; e aminas orgânicas, primárias, secundárias e ter ciárias, como por exemplo, trialquilaminas, incluindo trietij. amina, procaína, dibenzilamina, 1-etanamina, N,N’-dibenzil-etilenodiamina, di-hidroalietilamina, N-alquil inferior-pj. peridina e qualquer outra amina adequada. Os péptidos que se seguem são representativos dos péptidos da presente invenção.

H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-ThrAla-Leu-NH2;

- ιό

-/

H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-AspAsp-Leu-NH₂;

H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-A sp-Leu-Leu-Phe-Leu-LysGlu-Gly-Gly-Leu-NH₂; e

H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH.

As proteínas da presente invenção podem ser preparadas por uma variedade de processos facilmente conhecidos por especialistas. Estes processos incluem a síntese sequencial de fase sólida e a síntese de blocos, clonagem de genes e combinações destas técnicas. 0 processo sequencial de fase sólida pode ser realizado utilizando-se métodos auto matizados tais como por meio de um sintetizador de péptidos automatizado.

Neste processo um aminoácido protegido no grupo (X-amínico é ligado a uma resina de suporte. A resina de suporte utilizada pode ser qualquer resina apropriada uti. lizada correntemente nestas técnicas de preparação em fase sólida dos polipéptidos, preferivelmente uma resina de polistireno que foi formada com ligação cruzada com 0,5 ^a cerca de 3$ de divinil-benzeno que fora quer clorometilado quer hidroximetilado para proporcionar sítios para a formação de éster com o aminoácido protegido no grupo 2-amino e introduzido inicialmente.

Um exemplo de uma resina hidroximetílica está descrita por Bodanszky et al., Chem. Ind. (Londres) 38, 1597-98, 1966.

Os laboratórios Bio Rad, Richmond, CalifórÇpr^: nia comercializam uma resina clorometilada cuja preparação es tá descrita por Stewart et al., Solid Phase Peptides Syntesis, Freeman and Co., San Francisco 1969, Capítulo 1, pg 1-6. 0 aminoácido protegido pode ser ligado à resina de acordo com o método de Gisin, Helv. Chem. Acta 56, lUçô, 1973· Muitas resinas de ligação com aminoácidos protegidos estão disponíveis comercialmente.

Como um exemplo, para a preparação de um polipéptido da presente invenção com que a extremidade carboxi terminal é um resíduo Thr, pode utilizar-se uma resina ben zilada, fenil-acetamido-metilo (PAM) hidroximetilado a que e_s tá ligado um resíduo Thr protegido com um grupo terc-butiloxi. carbonilo (BOC), que é comercializada.

A seguir à ligação do aminoácido protegido no grupo o(-amino ao suporte de resina, o grupo de protecção é eliminado utilizando-se um processo adequado, tal como ácido trifluoroacético em cloreto de metileno ou ácido trifluoroacético isoladamente, ou ainda ácido clorídrico em dio xano.

A desprotecção é realizada a uma temperatura compreendida entre 0° e a temperatura ambiente.

Outros reagentes de cisão padrão e condições para eliminação de grupos de protecção do grupo oí-amino específicos também podem ser utilizados. Após remoção dos gru pos de protecção do grupo o(-amino os outros aminoácidos protegidos no grupo amino são ligados passo a passo na ordem desejada. De um modo alternativo grupos de aminoácidos múltiplos podem ser ligados pelo método de solução antes da ligaρ:·^; /

ção com a resina que suporta a sequência de aminoácidos.

grupo de protecção do grupo o(-amino utilizado para cada aminoácido introduzido na sequência poli, peptídica, pode ser qualquer grupo de protecção convencional.

Êntre as classes de grupos de protecção de grupos o(-amino consideradas estão (l) grupos de protecção tipo acilo, tais como: formilo, trifluoro-acetilo, ftalilo, toluenossulfonilo (torilo), benzenossulfonilo, nitrofenilssuJL fonilo, tritilsulfenilo, orto-nitrofenoxiacetilo e |)(-clorobu tirilo; (2) grupos de protecção do tipo uretano aromáticos tais como, benziloxicarbonilo e benziloxicarbonilo substituídos, tais como, p-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo, l-(p-bifenilil)-l-metiletoxicarbonilo, θ(, C(-dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarbonilo e benzidriloxicarbonilo; (3) grupos de protecção uretano alifáticos, tais como, terc-butiloxicarbonilo (BOC), diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonilo; (4) grupos de protecção tipo uretano cicloalquílicos tais como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbonilo;

(5) grupos de protecção tipo tio-uretano, tais como feniltiocarbonilo; (6) grupos de protecção tipo alquilo tais como tri. fenilmetilo (tritilo) e benzilo; (7) grupos trialquilsilano tais como trimetilsilano. Os grupos de protecção dos grupos e( -amino preferidos são os grupos butiloxicarbonilo-terciários.

A selecção dos reagentes de ligação apro priados é conhecida da técnica.

J«p-

Um reagente de ligação especialmente adequado em que o aminoácido a ser adicionado será Gin, Asp ou Arg é o NjW-diisopropilcarbodiimida e 1-hidroxibenzotriazol.

A utilização destes reagentes impede a formação de nitrilos e lactaraas. Outros agentes de ligação são (l) carboxidiimidas (por exemplo, Ν,Ν'-diciclo-hexilcarbodiimida e N-etilo-N*-(4-dimetilaminopropilcarbodiimida); (2) cianamida (por exemplo, Ν,Ν-dibenzilcianamida); (3) cetenirninas; (4) sais de isoxazolio (por exemplo, isoxazolio-3’-sulfonato de N-etilo-5-fenilo); (5) amidas heterocíclicas contendo azoto monociclico de cará£ ter aromático contendo um a quatro átomos de azoto no núcleo, ** tais como imidazolidas, pirazolidas e 1,2,4-triazolidas. Amidas heterocíclicas específicas são utilizáveis e podem incluir Ν,Ν'-carbonildiimidazol e N,N*-carbonil-di-1,2,4-triazol; (6) acetileno alcoxilado (por exemplo, etoxiacetileno); (?) reagentes que formam uma mistura de anidridos com radicais carbo xilo de aminoácidos (por exemplo, etilcloroformato e isobutil. cloroformato) ou anidridos simétricos dos aminoácidos a serem ligados (como por exemplo, Boc-Arg-O-Arg-Boc) e (8) compostos heterocíclicos contendo azoto com um grupo hidroxilo num azoto do anel (como por exemplo, N-hidroxiftalimida, N-hidroxi-succinimida e 1-hidroxibenzotriazol). Outros reagentes de a£ tivação e a sua utilização na utilização de péptidos estão descritos por Kapoor, J. Pharm. Sei, 59, pp 1-27, (1970).

Os requerentes preferem utilizar anidridos simétricos como reagentes de ligação.

Cada aminoácido protegido ou sequência de aminoácidos é introduzida num reactor de fase solida com cer20 ca de um excesso quatro vezes superior e, a ligação ó realizada em meio de dimetilformamida; cloreto de metileno a (l:l) ou apenas em dimetilformamida ou de preferência apenas em cloreto de metileno.

No caso em que ocorre uma ligação imcompleta o processo de ligação ó repetido antes da eliminação do grupo de protecção 0(-amino, antes de se ligar com o seguinte aminoácido no reactor de fase sólida.

sucesso da reacção de ligação em cada estádio da síntese é controlado pela reacção da ninidrina como descrito por E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970).

Após se obter a sequência de aminoácidos desejada, o póptido ó retirado da resina. Isto pode ser reali zado mediante hidrólise, tal como por tratamento do polipépti. do ligado à resina com uma solução de sulfureto de dimetilo, p-cresol e tiocresol e diluição com ácido clorídrico aquoso.

Como ó sabido a síntese dos péptidos de fase sólida origina muitos aminoácidos comportando grupos funcionais que requerem protecção durante a preparação da ca deia. A utilização e selecção de grupos de protecção apropria dos ó conhecida das técnicas nesta matéria e dependerá do ami noácido a ser protegido e da presença de outros resíduos de aminoácidos protegidos no póptido. Λ selecção de uma tal cadeia lateral com grupos de protecção é crítica porque estes não devem ser retirados por clivagem durante a clivagem dos grupos de protecção dos radicais qf-amino.

Por exemplo grupos de protecção de cadeia lateral apropriados para a lisina são os grupos benziloxicarbonilo e benziloxicarbonilo substituídos em que os substituin tes podem ser constituídos por halogeneo (por exemplo, cloro, bromo ou floro), ou grupos nitro (por exemplo, 2-clorobenzilo. xicarbonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, 3,4-diclorobenziloxicarbonilo), torilo, t-amiloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo e diisopropilmetoxicarbonilo. Os grupos hidroxi alcoólicos da treonina e serina podem ser protegidos com um grupo acetilo, benzoilo, butilo-terciário, tritilo, benzilo, 2,6-dicloroben zilo ou benziloxicarbonilo.

grupo de protecção preferido é o benzi.

lo .

Estes grupos são eliminados por processos tradicionais.

Grupos de protecção são retirados tipicamente após a síntese da cadeia peptídica estar completa, mas os grupos de protecção podem ser eliminados em qualquer momen to adequado.

Os péptidos da presente invenção são agen tes imunosupressores e podem ser utilizáveis no tratamento de doenças ou condições em que é desejável a supressão da imunidade humoral e/ou induzida por células, tal como no tratamento da artrite reumatóide e para impedir a rejeição após a transplantação de rim, fígado ou coração. Os péptidos da presente invenção produzem imunossupressão principalmente devido à sua capacidade para impedir a proliferação de linfócitos. 0 termo doente é utilizado aqui como referindo-se a mamíferos, _ 29 _ ' / *

tais como, primatas, incluindo os seres humanos, carneiros, cavalos, bois, vacas, touros, porcos, cães, gatos, ratos e murganhos.

Ainda que alguns dos péptidos da presente invenção possam sobreviver à passagem através do intestino a seguir à administração parentérica, por exemplo sub-cutânea, endovenosa, intramuscular ou intraperitoneal; a injecção depot” ou a preparação por implante.

Para administração parentérica os compos tos podem ser administrados sob a forma de doses injectáveis de uma solução ou suspensão do composto num solvente aceitável sob o ponto de vista fisiológico com um veículo farmaceu tico que pode ser um líquido estéril tal como água ou óleos, com ou sem adição de um agente tensioactivo ou outros adjuvan tes aceitáveis em farmácia.

Óleos exemplificativos que podem ser uti. lizados nesta preparação são o petróleo, animal ou vegetal ou de origem sintética, por exemplo, óleo de amendoim, de so. ja ou óleo mineral. Em geral preferem-se como veículos líqui dos, água, solução de cloreto de sódio, solução de dextrose aquosa e açúcares aparentados, etanol e glicois, tais como o propilenoglicol ou polietilenoglicol, em especial para soluções injectáveis.

Os compostos podem ser administrados sob a forma de uma injecção depot ou de uma preparação para im plante que pode ser composta de tal modo que permita a liber tação retardada do ingrediente activo. 0 ingrediente activo

f pode ser comprimido em grânulos ou em pequenos cilindros e im plantado de modo subcutâneo ou intramuscular sob a forma de injecções depot ou implantes. Os implantes podem incluir ma teriais inertes, tais como polímeros biodegradáveis ou silicones sintéticos, por exemplo, Silastic, borracha de silicone, preparados pela Dow-Corning Corporation.

A fim de maximizar os efeitos dos péptidos desta invenção, é preferível utilizar um veículo macromolecular, como por exemplo albumina de soro, isto é uma albumina de soro humano quando o doente é um ser humano. Outros veículos são por exemplo hemocianina de lapa Keyhole”, ou um polímero sintático tal como poli(D-Glu, D-Lys). A ligação do péptido ao veículo pode ser feita por diversos métodos que incluem a ligação através de uma lisina peptídica, utilizando-se glutaraldeído (Reich lin, Methods Enzymol, 70; 159-165, 1980) ou processos de DCC (por exemplo, Atassi et al., Biochem. Biophys Acta 670, 300-302 1981) através de um Asp ou Glu peptídico utilizando-se DCC (Bauminger et al., Methods Enzymol, 70, 151-159, 19θθ) através de um Tyr peptídico utilizando-se benzidina-bis diazotada (Walter, et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77: 5197-5200, 198θ) através de sítios de ligação fotoquímica (Parker et al., Cold Spring Harbor Symposium-Modern Approaches to Vaccines, Ed. Chanock & Lerner, Cold Spring Harbor Press, New York, 1983, a imprimir), ou através de Cys peptídico (Liu et al., Biochem 18: 690-697, 1979).

Os conjugados de veículo peptídico são separados do excesso de péptido livre por diálise ou filtração por gel.

t >

A preparação do péptido impregnado no veículo pode ser determinada utilizando-se um marcador radioactivo para estabelecer a taxa de ligação num processo particular, por HPLC de péptido não complexado versus péptido complexado, ou para análise quantitativa de aminoácidos do conjugado, com parativamente com o veículo não ligado. É conveniente quando se utilizar esta última técnica, incorporar um único aminoáci. do não natural no péptido, no sítio do N-terminal ou C-terminal tal como Nle, que pode então servir como um marcador quan titativo para a incorporação do péptido, como avaliado por análise de aminoácidos do conjugado.

Este resíduo Nle pode também funcionar como um espaçador entre a estrutura imunossupressora e qualquer aminoácido incorporado para facilitar a ligação, tal como Cys, Lys, ou Tyr, como referido antes.

Os péptidos da presente invenção sâo agentes imunossupressores e suprimem o sistema linfocitário de doentes mediante supressão da proliferação dos linfócitos. Enquanto os linfócitos da presente invenção impedem a proliferação das células-B e das células-T, um péptido particular pode suprimir de um modo preferencial ou os linfocitos-T ou os linfocitos-B. Contudo todos os péptidos da presente invenção suprimiram a proliferação dos linfocitos-T.

A quantidade de péptido administrada variará de acordo com o doente, via de administração, gravidade da doença ou sua condição e, pode ser qualquer quantidade eficaz. A administração diária repetitiva dos péptidos é desejável. A ί ' '⁵-f quantidade eficaz imunossupressora de um péptido da presente invenção e a quantidade eficaz para suprimir o sistema linfc) citário e a proliferação de linfócitos, pode estar compreendida entre cerca de 0,001 mg/kg e cerca de 10 mg/kg de massa corporal do doente por dia. De preferência o péptido será administrado sob a forma de uma dose unitária, uma ou quatro vezes por dia de, por exemplo, doses de 10 mg.

Exemplos

A presente invenção é ilustrada pelos exemplos seguintes que não sao limitativos.

Exemplo 1

Preparação de H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH^ péptido foi sintetizado pelos métodos de fase sólida utilizando-se 0,1 mmole de uma resina de p-metil-benzxdrilamina a 0,48 mmole/g. As ligações de anidrido simétrico duplas foram realizadas com 2,0 mmoles de N^-Boc-aminoácido (Peptides International). Utilizou-se Asp(Chx), Arg(Tos), Lys(2~ClZ) para protecção da cadeia lateral. Os grupos de protecção N^-Boc, foram eliminados com ácido trifluoro-acético em cloreto de metileno a 50 $· A resina foi lavada 3 vezes com cloreto de metileno, neutralizada por meio de três lavagens com diisopropiletilamina em cloreto de metileno, lavada 3 vezes com cloreto de metileno e seca sob vácuo. 0 péptido foi desprotegido e separado da resina em ácido fluorídrico contendo 2$ de anisol à temperatura de 0°C durante 35 minutos. 0

- 26 - / i *

HF foi eliminado sob vácuo à temperatura de 0°C, o péptido foi precipitado com éter dietílico, extraído da resina com solução aquosa de ácido acético a 30$ e liofilizado.

péptido foi purificado por dessalificação sobre uma coluna de Sephadex G-15 de 92 x 2,6 cm em solução aquosa de ácido acético a 5$ θ liofilizado. Submeteu-se a HPLC preparativa com uma coluna de 250 x 10 mm de Vydac C-^g 218TP1010 com acetonitrilo a 24$ em ácido trifluoroacético

I aquoso a 5 ml/minuto. Recolheu-se o pico principal e liofilizou-se.

CCF ((Merck 5715 20 x 20 em 60 placas de gel de Sílica de (0,25 mm de espessura))) n-butanol/ácido acético/água/ /piridina (6:1, 2:4, 8:6) (CCF i) Rf = 0,52; FAB-MS; (M+H)= s 1879+.1 ημ. (calculado 1879,2). Análise de aminoácidos: hidrólise por (HC1 6N: 24 h a 106°c). As x 3,06 (3); Ala 0,99 (l);

Leu 4,97 (5)» Lys 2,01 (2); Arg 4,01 (4). Contendo um peso de péptido 7²$.

I

Exemplos 2-4

De um modo substancialmente igual ao indicado no Exemplo 1, prepararam-se os seguintes péptidos.

Exemplo NS	Péptido
2	H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Glu-Leu-Lys-Leu- Ala-Thr-Ala-Leu-NHg
3	H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe- Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-NHg
4	H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH

/

- 27 Os peptidos dos Exemplos de 2-4 têm as propriedades físicas e análise de aminoácidos seguintes:

Exemplo Νβ.	Peso Molecular	HPLC tr(min) (15-40$ gradiente)
Teórico	FAB- ms(m + H) + 1 ταμ
2	1695	1696	9,8
3	1940	1940	17,6
4	1295	1297	10,8

Análise de aminoácidos

Arg	cn ο CJ ·» CM	X^-*k CM H 00 \ H	CM O O «k CM
	χ—S	X—S
	CNÍ	H
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- 29 Exemplo 5

Preparação do conjugado de BSA de H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NHg peptido foi ligado com Albumina de Soro Bovino (BSA) por meio de reacção com cloridrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC). 0 peptido, (imM) em 1,84 ml de água fez-se reagir entre (15-30 minutos) com 0,l6 ml de BSA (25 mg/ml) tratada previamente com 40 mg de EDAC durante 1-30 minutos em água. A amostra de BSA activada foi adicionada gota a gota sob agitação, à solução do peptido e, em seguida ipcubada 10 horas à temperatura ambiente. Segui, damente, adicionaram-se 2,0 ml de glicina 1,0 M e a solução foi agitada durante a noite à temperatura de 4°C. Para se retirar o excesso de reagente e o peptido não conjugado dializaram-se amostras extensivamente à temperatura de 4°C primeiro contra 15 x 4 L de mudanças de água destilada, a seguir ainda com duas mudanças de 2 x 4 L de meio de cultura de tecidos CELLGRO (Mediatech). As amostras foram submetidas a filtração estéril através de uma membrana de acetato de celulose de 0,45 pm exactamente antes da sua adição às culturas de células. A extensão do peptido ligado foi determinada por HPLC de fase inversa.

Os conjugados com BSA dos péptidos 1,3 θ 4 foram preparados primeiro com activação dos péptidos com EDAC do modo referido antes e em seguida com reacção com BSA.

Exemplo 6

Inibição da incorporação de ^H-timidina por diversos péptidos em culturas de linfócitos mistas

Removeram-se assepticamente os baços e inclui^ ram-se em meio de cultura RPMI l64o para se obter suspensões de células simples. Lisaram-se os eritrócitos por suspensão das células em tampão ACK (θ,155 M NH^Cl, 0,1 mM EDTA, 0,01 M KHCO^) e os leucócitos remanescentes foram lavados, Co-cultiva ram-se leucócitos C57BT/6 (5 ^x 10^ células e leucócitos DBA/2 (5 x 10^ células) em 0,1 ml de RPMI-1640, suplementado com 2# de soro de vitela fetal (FCS) em placas microtituladoras de 96 cavidades. Adicionaram-se concentrações diversas de péptidos no início da cultura de células. Após 120 horas de incuba ção à temperatura de 37°C, que incluiram uma vibração com 1 uCi de (₃H)TdR após 18 horas de cultura, as células foram recolhidas com um colector celular automatizado para tiras de papel de filtro e colocadas em líquido de cintilação ACS (Amersham, Oakville, Ontario). A quantidade de incorporação de (^HjTdR foi em seguida medida num contador de cintilação de líquido Beckman LS 7θθθ· ζ

Composto	^Péptido^^ yUM	Incorporação de 3H-Timidina (cpm)	% Inibição
â BSA controlo	nenhum	6621 + 442	--
nenhum	8023 + 444	—
Exemplo 3	24	1328 + 421	80
12	3417 + 263	57
Exemplo 1	18	1800 + 412	73
9	3267 + 457	59
Exemplo 2	28	2209 + 1471	67
14	4406 + 848	45
Exemplo 4	8	3063 + 372	54
	4	5751 + 407	28

^aBSA isolado conjugado com l-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiamida-HCl ^Concentração de póptido conjugado com BSA.

/

%

Exemplo 7

Inibição da incorporação de ,^Η-timidina por vários péptidos em linfócitos estimulados anti-T^

Leucócitos mononucleares de sangue periférico humano MNL foram isolados por sedimentação de densidade em meio de Ficoll-Hypaque. Os MNL (105) foram cultivados com anti-T^ (diluição a 1:10.000; Ortho Diagnostica) em 0,1 ml de meio DMEM, suplementado com 2% de FCS em placas microtituladoras de 96 cavidades. Após 72 horas de incubação a temperatura de 37°C, que inclui uma vibração com 1 pCi de (^H)TdR após 18 horas de cultura, as células foram recolhidas e contadas como se descreveu no Exemplo 6.

Composto	/”Péptido/^b	Incorporação de _H-Timidina (cpm)	% Inibição
BSA controlo^a	nenhum	43934 + 5076	«h ee
nenhum	57388 + 6153	—
Exemplo 3	24	14027 + 867	68
12	31667 + 4729	45
Exemplo 1	18	21984 + 3824	50
9	38521 + 5349	33
Exemplo 2	28	20041 + 3331	54
14	44151 + 2151	23
Exemplo 4	8	39248 + 5251	11
4	54331 + 4717	5

BSA isolado conjugado com l-etil-3(3-dimetilaminopropil-carbodiimida-HCl).

b_

Concentração de péptido conjugado com BSA.

Claims

Reivindicações

1.- Processo para a preparação de peptidos de fórmula geral

Tn-A-B-C-D-Tc I

Tn representa um resto amino terminal escolhido entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com

1 até 6 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo com
2 até 10 átomos de carbono, carbobenziloxi e T-butiloxicarbonilo;

A representa um fragmento peptídico com 3 até 12 resíduos de qualquer aminoácido;

B representa um fragmento peptídico contendo 2 ou 3 resíduos de aminoácidos escolhidos entre Arg e Lys;

C representa um fragmento peptídico contendo 2 a 3 resíduos de aminoácidos escolhidos entre Gly, Leu, Ile e Thr;

D representa um fragmento peptídico contendo de 1 até 12 resíduos de qualquer aminoácido; e

Tc representa um resíduo carboxílico terminal escolhido entre um grupo OH, alcoxi ^cj_g, amino, mono- ou di-alquil-(C^-C^) amino substituído ou benzilamino;

e dos seus sais aceitáveis em farmácia, caracterizado pelo facto de se realizar uma síntese sequencial de fase sólida, síntese de blocos, clonagem de genes ou uma sua associação.

2.- Processo de síntese sequencial de fase sólida ou síntese de blocos para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral

Tn-A-B-C-D-Tc I na qual Tn representa um resto amino terminal escolhido entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com

1 a 6 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo com

2 a 10 átomos de carbono, carbobenziloxi ou t-butiloxicarbonilo;

A representa um fragmento peptídico contendo de 3 até 12 resíduos de qualquer aminoácido;

B representa um fragmento peptídico contendo 2 ou 3 resíduos de aminoácidos escolhidos entre Arg e Lys;

C representa um fragmento peptídico contendo 2 ou 3 resíduos de aminoácidos escolhidos entre Gly, Leu, Ile ou Thr;

-35/

D representa um fragmento peptídico contendo de 1 até 12 resíduos de qualquer aminoácido; e

Tc representa um resíduo de carboxilo terminal escolhido entre um grupo OH, alcoxi C^-Cg, amino, mono- ou di-alquil(C^-C^)-amino substituído ou benzi lamino ;

e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se ligar um aminoácido protegido de um modo apropriado, que corresponde ao aminoácido de carboxilo terminal do grupo representado pelo símbolo A, a um suporte de resina activada e de se ligar depois os outros aminoácidos protegidos no grupo ^,-amino, dos grupos representados pelos símbolos A,3,C e D, para se formar, em seguida, uma cadeia peptídica em crescimento desde a extremidade de carboxilo terminal até à extremidade de amino terminal e de se eliminar, entretanto, os grupos amino-protectores para se libertar a cadeia peptídica.
3.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a preparação de péptidos de fórmula gerai I na qual C representa um fragmento peptídico contendo 2 ou 3'resíduos de aminoãcidos escolhidos entre Gly e Leu, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituído.
4.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual Τη representa um átomo de hidrogénio, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente subs tituídos.
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicaI ções 1 ou 2, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual Tc representa um grupo OH ou amino, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual A representa um fragmento peptídico contendo 3 a 6 resíduos de qualquer aminoácido natural, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

>
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual D representa um fragmento peptídico contendo 1 a 12 resíduos de qualquer aminoácido natural, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
8.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, para a preparação do composto H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-Ní^, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

/
9.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, para a preparação do composto H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-N^, caracterizado pelo facto de 'se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, para a preparação do composto H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-GlyLeu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-N^, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, para a preparação do composto H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-AsnArg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos,