CN1030917A - 免疫抑制肽 - Google Patents

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Abstract

新的肽类，具有含2或3个Arg或Lys残基， 且在第一肽段的羧基终端相邻处有2或3个Gly、 Leu、Ile或Thr残基，并且具有由任何氨基酸组成的 链作为氨基和羧基尾端，这些肽是免疫抑制剂，可以 通过抑制淋巴细胞的增生而抑制淋巴系统。

Description

本发明涉及新的肽类以及它们的免疫抑制功能。
免疫系统是高等动物抵抗病菌和其它外来抗原的初级系统之一。免疫应答是通过与特异抗原相反应的特异性免疫细胞的作用来介导的。潜在的抗原可能是各种物质，但通常都是某一个体的外源蛋白质。它们大都经常存在于细胞的外表面。潜在的抗原可见于花粉粒，组织移植，动物寄生虫，病毒和细菌。
对人而言，有些抗原从未能突破人体的最初两道防线，因而，从未作用于免疫系统。在这两道防线中，第一道包括皮肤，粘膜，眼泪和胃酸，第二道包括特殊的白细胞，粒性白细胞和单核细胞，以及通过吞噬作用摧毁病原体和其它潜在抗原的巨噬细胞，即吞噬和摧毁外源物质。这些白细胞和巨噬细胞被称为吞噬细胞。当病原体或其它外源物质突破了最初的这两道防线后，免疫应答才启动。
主要存在的免疫防御系统有两个，即体液免疫和细胞免疫系统，它们均作用于抗原。体液免疫性由循环抗体所产生，这些抗原见于血浆蛋白的r球蛋白组分当血浆经高速离心，其蛋白成分按重量所分成的每一个部分称为组分。通常，抗体可在具有分子量为约156，000道尔顿的组分中发现到。该特殊的组分被称为r-球蛋白组分。体液免疫性是抗细菌感染的主要部分。细胞免疫性部分地取决于称作淋巴激活素的淋巴细胞产物。这种免疫性负责延迟的变异性反应，对移植的外源组织的排斥，以及对肿瘤细胞的排斥。它主要抵抗病毒、真菌和部分细菌如结核杆菌等的侵染。
称作淋巴细胞的特异化的白细胞对体液免疫和细胞免疫均起作用。淋巴细胞前体细胞首先产生于成年人的骨髓，然后迁移到其它器官，或者先产生于正在发育的胚胎的卵黄囊，然后迁移到胚胎并进而迁移到各个器官。在人类，某些这种前体细胞迁移到位于上胸腔中胸骨后面的两叶腺体结构的胸腺并转化为下淋巴细胞，它作用于细胞免疫性。在人体中，其它的前体细胞迁移到脾并转化成B-淋巴细胞，其作用于体液免疫性。虽然B-淋巴细胞和T-淋巴细胞的功能不同并可用化学方法区别开，但它们在结构上却无法分辨。成熟的淋巴细胞在血液中循环，并可见于淋巴结、脾和胸腺。
B-淋巴细胞介导体液免疫，其细胞表面上有特殊抗原的受体。它们的特异性似乎很强，每种B-淋巴细胞仅作用于一种抗原。例如，当细菌或病毒侵入生物体后，B-淋巴细胞与细菌或病毒表面上的抗原相结合并反应，从而刺激淋巴细胞的分生。其子代细胞转化成称作血浆细胞的特异性细胞。这些细胞产生大量的抗体，然后分泌到正常的循环中。这种抗体对刺激其产生的抗原为特异性，并仅与这些抗原相反应。称作凝集素的抗体导致一些含抗原的物质凝集或结块。这样就防止这些物质扩散到组织中去，并使吞噬细胞捕获这些侵入物质，或使淋巴结滤去这些物质，其它的抗体在细菌细胞壁上开口，从而杀死细菌。这种作用被称为溶胞。抗体引出抗毒素，其与细菌产生的毒素相结合，从而中和之。
当病原体侵入人体并启动免疫应答后，抗体可在几小时之内产生。这种初始的反应称作初级应答或初级免疫。然而，在这期间，病原体已经分生，有时还产生毒素，均会导致各种病症。产生足够消灭全部病原体的抗体可能需要几天甚至几周，但是，如果病原体消失，则病症立即消失。淋巴细胞、血浆细胞和抗体仍旧保留并在血液中循环，因此，如果相同的病原体第二次进入体内的话，淋巴细胞立即反应，并开始生产抗体。敏感化的淋巴细胞的应答称作次级应答，其结果是以比初级应答更高的水平生产抗体。因此，迅速大量地产生出抗体，就使得微生物无法分生和引起疾病。这种类型的体液免疫称作即时过敏性，其原因是预先受过攻击的生物可在几分钟内对抗原产生应答，如同对枯草热的情况。即时过敏性的另一例证是过敏性休克，这是一种极为敏感的反应，当个体暴露于以前曾经敏化过的抗原时，有时会发生。如果发生这种情况，这种对抗原的体液免疫会导致死亡。
体液免疫可以自然产生和人工诱导。如果是主动自然免疫，则在受侵染后，个体的淋巴细胞继续循环并激活抗体的生产。这种主动自然免疫可保持许多年乃至终生。婴儿出生后几天内从母亲的初乳中获取抗体，使其在头一年内具有免疫性。这被称为被动自然免疫，因为婴儿本身并不参与抗体的生产。主动人工免疫是将死亡的或弱化的微生物注入个体内所诱导出的。它们的表面抗原仍然能够启动淋巴细胞的生产，但这些微生物并不能象它们的更强形式那样引起病症。当该个体以后暴露于毒性微生物时，他已经敏化过了，并能立即产生应答，生产出大量的抗体。主动人工免疫可保持许多年，如果适当补种，可以保持终身。还有一种是被动人工免疫，其可以提供约一个月的保护。这种暂时的免疫，由注射取自其它的人或动物的抗体而带来。其仅在危急情况下或在疫区使用。因为淋巴细胞没有参加进来，因而它们不能制造带来该方法中暂时效应的抗体，也不能“记忆”该抗原。
在细胞免疫中的情况正与体液免疫相反，循环的抗体无法检测。介导这种类型免疫的T-淋巴细胞当遇到来自其它个体的细胞上的抗原时，如移植，肿瘤或病毒时，就被激活。同B-淋巴细胞一样，T-淋巴细胞是特异性的，每种该细胞仅与一种抗原反应。淋巴细胞放大，分生和产生参与对外源抗原进行攻击的淋巴细胞活素。它们还刺激巨噬细胞的吞噬活性。虽然其免疫记忆性与体液免疫相似，但应答则慢得多。在已经敏化过的个体中产生应答也许要10至12小时，因而，细胞免疫称作延迟的过敏性。对毒性常春藤，橡树和漆树的变应性反应，结核皮试阳性所见红斑点，对移植组织的排斥等，均是细胞免疫应答。
免疫调节剂激活或抑制淋巴细胞增生的过程。正常的淋巴细胞的增生归因于抗原、巨噬细胞、T型和B型淋巴细胞以及某些化学物质之间的相互作用。例如，特定抗原的存在激活特定的T型和B型淋巴细胞。此外，某些B-淋巴细胞可由活性T-淋巴细胞激活，而其它的则不依赖于T-淋巴细胞并只被抗原激活。被激活的T-淋巴细胞可以引起巨噬细胞产生出称作细胞介素1（IL-1）的一种分子，随后该分子再激活T型和B型淋巴细胞。被激活的T-淋巴细胞还可以生产出称作细胞介素2（IL-2）的分子，其进一步诱导T-淋巴细胞活化。称作促细胞分裂剂的化学物质可以触发DNA合成及有丝分裂，而这些正是T型和B型淋巴细胞活性的标志。有些促细胞分裂素只作用于一种淋巴细胞，而另一些则作用于许多种。不同的免疫调节剂或不同的剂量影响免疫系统内各成份之间的复合相互作用。正如将要表明的那样，本发明的组合物和化合物起着免疫抑制剂的作用，并且对T型和B型淋巴细胞均有影响。
虽然免疫系统是抗御致病物的主要部分，但它不能区分有益和有害外来物质，对它们一律摧毁。在某些情况下能调节免疫系统但又不伤害个体的方法是非常有用的。本发明的肽具备这种调节效应，并具有治疗各种免疫紊乱的潜力。
正如变应性反应，以往曾多次出现过个体的免疫应答所造成的损害及不舒适比外来物或侵入的微生物所造成的程度更大。在这些情况下就需要抑制免疫应答。
有时，免疫机制对个体自身的某些部分成为敏感性，干扰甚至摧毁该部分，区别“自身”和“非自身”的能力受损害，本身开始摧毁自己。人类中自体免疫病的一些例子有风湿性关节炎，某些溶血性贫血，风湿热，甲状腺炎，溃疡性结肠炎，重症肌无力，肾小球性肾炎，脑脊髓炎，连续性神经和肝损伤并可能转为病毒性肝炎，多发性硬化以及系统性红斑狼疮。有些自体免疫是那些不常具有淋巴细胞的部分如神经组织和晶状体受到创伤后的结果。当这些部分的组织暴露给淋巴细胞时，它们的表面蛋白可起抗原的作用并触发抗体的生产和细胞免疫应答，然后就开始摧毁这些组织本身。另外的自体免疫病是当个体暴露给那些抗原性相似于，也就是交叉作用于个体自身组织的抗原后而出现的。风湿热就是这种病的一例，在这种病中，造成风湿热的链球菌的抗原与人的心脏的某些部分交叉反应。抗体无法分别出细菌抗原和心脏抗原，因此，带有这两种抗原中任何一种的细胞就都可能被摧毁。在这些自体免疫病中对免疫系统的抑制将有助于减小或消除病症。
循环的抗体以及细胞免疫应答起着排斥移植的组织和器官的角色。除非供体取自受者本身或其孪生体，否则的话，受者本身的淋巴细胞就将移植体识别为“非自身”的并立即反应去摧毁之。其例外的情况是，移植发生在无血管区（特殊位点），如眼角膜，这些地方没有淋巴细胞循环，因而不被敏化，也不促进免疫应答。目前的困难是，在不严重损伤患者的同时又能抑制免疫反应从而防止对移植体的排斥。患者自身抗侵染的能力被抑制后，就必须给以大量的抗生素。本发明的化合物和组合物在控制调节免疫系统从而建立起对移植体的容忍性方面是很有价值的。
本发明揭示的抑制免疫系统的化合物是非常重要的。特别是当系统的正常作用被干扰及对无害外源物如移植的器官被摧毁时就更为重要了。
具下式1的肽类是有用的免疫抑制剂：
其中：
Tn是氨基终端残基，选自氢、1或2个具有1-6个碳原子的烷基，1或2个具有2-10个碳原子的酰基，苄氧羰基，或叔丁氧羰基;
A是含有4-12个任何氨基酸残基的肽段;
B是含有2或3个选自Arg和Lys的氨基酸残基的肽段;
C是含有2或3个选自Gly、Leu、Ile和Thr的氨基酸残基的肽段;
D是含有1-12个任何氨基酸残基的肽段;
Tc是羧基终端残基，选自OH、（C1-C6）烷氧基，
氨基，一或二（C1-C4）烷基取代的氨基，或苄氨基。
以下给出的天然氨基酸的常规缩写将用于本申请：
Gly-甘氨酸
Ala-丙氨酸
Val-缬氨酸
Leu-亮氨酸
Ile-异亮氨酸
Pro-脯氨酸
Phe-苯丙氨酸
Trp-色氨酸
Met-甲硫氨酸
Ser-丝氨酸
Thr-苏氨酸
Cys-半胱氨酸
Tyr-酪氨酸
Asn-天冬酰胺
Gln-谷氨酰胺
Asp-天冬氨酸
Glu-谷氨酸
Lys-赖氨酸
Arg-精氨酸
His-组氨酸
Nle-正亮氨酸
天然氨基酸中，除了甘氨酸，均含有手性碳原子。除非另外指明，本申请中所述的光学活性氨基酸均为L-构型。如习惯一样，本文中肽的结构是按氨基终端在左，羧基终端在右的方式写出的。
烷基或烷氧基的烷基部分包括直链、支链的烷基以及环烷基，例如，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基，异戊基、仲戊基，环戊基，己基，异己基，环己基或环戊甲基。
含2至10个碳原子的酰基包括直链的，支链的，环状的，饱和的和不饱和的具有1或2个羰基部分的酰基，如乙酰基，琥珀酰基，苯甲酰基。
用在本文中的术语“任何氨基酸”包括天然氨基酸，以及在肽化学领域中制备天然肽的类似物时所常用的其它的“非蛋白”α-氨基酸。
天然氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氮酸，丝氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸，脯氨酸，组氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，鸟氨酸和赖氨酸。“非蛋白”α-氨基酸的例子有正亮氨酸，正缬氨酸，别异亮氨酸，高精氨酸，硫脯氨酸，脱氢脯氨酸，羟基脯氨酸（Hyp），高丝氨酸，环己基甘氨酸（Chg），α-氨基-正丁酸（Aba），环己基丙氨酸（Cha），氨基苯基丁酸（Pba），在苯基部分被烷基、烷氧基、卤素或硝基取代的苯基丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的O-烷基化衍生物，S-烷基化的半胱氨酸，酪氨酸的O-硫酸酯，以及天然氨基酸的D-异构体。
正如任何具药理活性的基团一样，各基团的某些定义是优选的。在此，以Tn为氢、Tc为OH或氨基的肽是优选的。而且，A是含有3至6个任何天然氨基酸残基的肽段的肽类也是优选的。D是含有1至12个任何天然氨基酸残基的肽段的肽素也是优选的。更为优选的是，C为含2至3个选自Gly、Leu、Ile和Thr氨基酸残基的肽段的肽类。
式（1）的多肽可与任何无毒的有机或无机酸形成药理上可接受的盐。可形成适宜的盐的无机酸包括盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，酸性金属盐如正磷酸-氢钠、硫酸氢钾。可形成适宜的盐的有机酸有一、二和三羧酸。例如，乙酸，乙醇酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，琥珀酸，戊二酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，马来酸，羟基马来酸，苯甲酸，羟基苯甲酸，苯乙酸，肉桂酸，水扬酸，2-苯氧基苯甲酸，磺酸如甲磺酸，2-羟基乙磺酸。在氨基酸羧基终端所形成的盐包括与任何有机或无机碱所形成的无毒羧酸盐。这些盐包括与碱金属如钠，钾，与碱土金属如钙，镁，与轻金属如包括铝和第ⅢA族的金属，与有机的伯、仲、叔胺如三烷基胺，包括三乙胺，普鲁卡因，二苄基胺，1-乙酰胺，N，N′-二苄基乙二酰胺，二氢枞酰胺，（N-（低级）烷基-哌啶，以及任何其它适宜的胺所形成的盐。
以下给出本发明肽的示例：
H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2;
H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2;
H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-NH2;and
H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH.
本发明的蛋白质可以采用本专业领域的技术人员所熟知的方法来制备。这些方法包括，固相顺序合成法，固相部件合成法，基因克隆法以及它们的结合。固相顺序合成法可以用已建立起来的自动配对法如使用自动配对的肽合成器来完成。在该方法中，α-氨基受到保护的氨基酸接到树脂支持物上。所用树脂可以是在固相制备肽领域中常用的任何适宜的树脂，优选的是已经与约0.5-3%二乙烯基苯交联，并经过氯甲基化或羟甲基化从而为与开始引入的α-氨基受到保护的氨基酸成酯提供位点的聚苯乙烯。
羟甲基树脂的一例见Bodanszky    etal，Chem.Ind.（London）38，1597-98（1966）。氯甲基化的树脂是商品，可得自BioRad    Laborator-ies，Richmond，Colitornia，其制备方法见Stewart    et    al，“Solid    Phase    Pap-tide    Synthesis”（Freeman&Co，SanFrancisco1969），Chapter1，pp.1-6。被保护的氨基酸与树脂的接合可用如Gisin，Helv.Chem    Acta，56，1476（1973）所述的方法。许多接合被保护的氨基酸的树脂均是商品。例如，为制备本发明的羧基终端为Thr残基的多肽，可使用经叔丁氧羰基（Boc）保护的Thr接合到苄基化、羟甲基化苯乙酰氨基乙基（PAM）的树脂，该树脂是商品。
α-氨基被保护的氨基酸偶联到树脂支持物上后，可用任何适宜的方法将保护基去除，如可以使用溶在二氯甲烷中的三氟乙酸，三氟乙酸本身，或溶在二噁烷中的HCl。去保护在0℃至室温之间进行。可以使用其它的标准断裂剂和条件来去除特异的α-氨基保护基。去除了α-氨基的保护基后，其它氨基被保护的氨基酸按所需次序分步偶合起来。此外，在与树脂支持的氨基酸顺序偶合之前，也可用溶液法将众多氨基酸先偶合起来。
插入到多肽序列中的每个氨基酸的α-氨基酸保护基可以是任何该领域中熟知的保护基。各类α-氨基保护基有（1）酰基型氨基保护基如：甲酰基，三氟乙酰基，邻苯二酰基，甲苯磺酰基，苯磺酰基，硝基苯基亚磺酰基，三苯甲基亚磺酰基，邻-硝基苯氧基乙酰基，以及r-氯丁酰基;（2）芳香族氨基甲酸酯型保护基，如苄氧羰基、取代的苄氧羰基如对-氯苄氧羰基，对硝基苄氧羰基，对溴苄氧羰基，对甲氧基苄氧羰基，1-（对-联苯基）-1-甲基乙氧基羰基，2，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基和二苯甲氧基羰基;（3）脂肪族氨基甲酸酯型保护基，如叔丁氧基羰基（Boc），二异丙基甲氧基羰基，异丙氧基羰基，乙氧羰基和烯丙氧基羰基;（4）环烷基氨基甲酸酯型保护基，如环戊氧羰基，金刚烷氧羰基和环己氧羰基;（5）硫代氨基甲酸酯型保护基，如苯硫代羰基;（6）烷基型保护基，如三苯甲基和苄基;（7）三烷基硅烷基，如三甲基硅烷。优选的α-氨基保护基是叔丁氧羰基。
选择适宜的偶联剂是本专业熟知的。当要加入的氨基酸为Gln、Asp或Arg时;特别适宜的偶联剂是N，N′-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并噻唑。使用这些试剂可防止腈和内酰胺的形成。另外的偶联剂是（1）碳化二亚胺〔如N，N′-二环己基碳化二亚胺和N-乙基-N′-（r-二甲氨基丙基碳化二亚胺）〕;（2）氨基氰（如N，N-二苄基氨基氰）;（3）乙烯酮亚胺;（4）异噁唑鎓盐（如N-乙基-5-苯基异噁唑鎓-3-磺酸酯;（5）单环含氮杂环酰胺，在环上含1-4个氮的具芳族特性的杂环酰胺，如半唑烷基，吡唑烷基和1，2，4-三唑烷基。某些有用特定的杂环酰胺类包括N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;（6）烷氧基化的乙炔（如乙氧基乙炔）;（7）与氨基酸的羧基部分形成混合酐的试剂（如氯甲酸乙酯和氯甲酸异丁酯）或形成所要偶合的氨基酸的对称酐的试剂（如Boc-Arg-O-Arg-Boc）;（8）一个环中氮有羟基的含氮杂环化合物（如N-羟基邻苯二甲酰亚胺，N-羟基琥珀酰胺和1-羟基苯并三唑）。其它的用于肽类偶合的活性试剂参见Kappor，J.Pharm.Sci.，59，pp1-27（1970）。本申请人则优选对称酐作为偶联剂。
每个被保护的氨基酸或氨基酸序列以约4倍过量加到固相反应器中，偶联在介质中进行，介质可以是二甲基甲酰胺∶二氯甲烷为1∶1的介质，二甲基甲酰胺介质，优选的是二氯甲烷作介质。如果偶联不完全，则在进行下一步氨基酸偶联之前，重复去氨基保护基之前的偶联步骤，合成各阶段的偶联是否成功，按E.Kaiser    et    al，Analyt，Biochem，34，595（1970）所述用茚三酮反应监测。
当得到所需氨基酸序列后，将肽从树脂上除下来。这一步可用水解法，如用-二甲硫、对甲苯酸酚和硫代苯酚存在于稀氢氟酸中的溶液处理接有肽的树脂。
在固相合成肽的领域内，人们已知在合成链的过程中，有许多氨基酸所带的官能团均需受到保护。使用和选择适宜的保护基团，是本专业领域技术人员能力范围之内的事，并且与要保护的氨基酸和肽上存在的其它被保护的氨基酸残基有关。对侧链的保护基的选则是严格的，即应该是在去除α-氨基的保护基时不被去除掉的保护基。例如，对赖氨酸的适宜的侧链保护基是苄氧基和取代的苄氧羰基，而其取代基可以是卤素（如氯、溴、氟）和硝基（如2-氯苄氧羰基，对硝基苄氧羰基，3，4-二氯苄氧羰基），甲苯磺酰基，叔戊氧羰基，叔丁氧羰基，二异丙基甲氧基羰基。苏氨酸和丝氨酸的醇式羟基可用乙酰基，苯甲酰基，叔丁基，三苯甲基，苄基，2，6-二氯苄基或苄氧羰基保护起来，优选的保护基是苄基。
这些保护基可用已知的方法去除。一般是在肽链合成后去除保护基，但也可在任何其它适宜的时候去除。
本发明的肽类是免疫抑制剂，可以用于治疗任何需要抑制体液和（或）细胞免疫的疾病，例如治疗风湿性关节炎，防止肾、肝、心脏移植后的排斥反应。本发明的肽产生的免疫抑制主要是依靠其抑制淋巴细胞增殖的能力。本文中“患者”一词指的是动物如灵长目，包括人，羊，马，公牛和奶牛，猪，狗，猫，大鼠和小鼠。
虽然经口服本发明的肽也有一部分能完整通过消化道，但优选非肠道使用，如皮下，静脉，肌肉内，腹膜内使用;可为储藏针剂或植入剂形式。
非肠道使用时，化合物可以为注射溶液或悬浮液，即化合物与生理稀释液、药用载体如水和油等可消毒的液体，在有或没有其它表面活性剂或药理上可接受的辅剂而制成。在这些制剂中可用的油类有来源于石油、动物、植物或合成的油，例如，花生油，豆油，矿物油。一般而言，水、盐水、葡萄糖水和相关的糖溶液，乙醇和二元醇类如丙二醇或聚乙二醇均为优选的液体载体，特别对注射液更是如此。
化合物可用储存注射剂或植入剂的形式使用，将其制成持续释放活性成分的形式。活性物质可以压成小片或小圆柱，以储藏注射或植入剂的形式植入到皮下或肌肉内。植入时可以使用惰性材料如生物可降解聚合物或合成性硅，如硅橡胶，Dow-Corning    Corporation制备的硅橡胶。
要使本发明的肽起到最大效果，优选使用大分子载体，如血清球蛋白，当患者为人时，则使用人血清球蛋白。其它的载体可以是例如钥孔 血兰蛋白或合成聚合物如聚（D-Glu，D-Lys）。肽与载体的配合可用几种方式之一，如通过肽上Lys用戊二醛（Re-ichlin，Methods Enzymol，70：159-165，1980）连接或用DDC法（如Atassi et al，Biochem.Biophys Acta 670，300-302，1981）连接，或通过肽上Asp或Glu使用DDC法（Bauminger，Methods Enzymol，70，151-159，1980）连接，或通过肽上Tyr使用双-重氮化的联苯胺（Wolter，etal，Proc.Nat.Acad.Sci.USA77;5197-5200，1980）连接，或通过光化学配合位点（Parker et al，Cold Sp-ring Harbor Symposium-Modern Approaches to Vaccines，Ed.Cha-nobk & Lerner，Cold Spring Har-bor Press，New York，1983，in Pr-ess）连接，或通过肽上Cys连接（Liu et al，Biochem，18：690-697，1980）。用透析法或凝胶过滤法将肽与载体的结合物与剩余的游离肽分开。载体负载肽的水平可用放射性示踪法建立负载水平即用HPLC确定出未复合的肽与已复合的肽的比率后来确定，或对复合物进行定量氨基酸分析，与未负载的载体比较来确定。在后一种方法中，将一种独特的非天然氨基酸加入到肽上，如将NIe加到肽的N-终端或C-终端，则其就可以作为肽合成的定量标记物，通过对复合物的氨基酸分析得知载体的负载水平。NIe还可以起到免疫抑制结构与任何为促进配合而加入的氨基酸如上述Cys、Lys或Tyr之间的间隔物。
本发明的肽是免疫抑制剂，通过抑制淋巴细胞增殖来抑制患者的淋巴系统。虽然本发明的肽类对T-细胞的增殖均有抑制作用，但某些具体的肽则倾向于抑制T-淋巴细胞或B-淋巴细胞。然而，本发明所有的肽都抑制T-淋巴细胞的增殖。
使用肽时，则应依据患者的情况，使用方式，疾病的程度等条件来确定具体的有效量。每日坚持使用则更好。本发明肽的免疫抑制有效量及抑制淋巴系统和淋巴细胞增殖的有效量约为每天每公斤体重0.01mg-10mg。最好使用单位剂量形式的肽，每天1-4剂量，每10mg为-剂量。
以下各非限定性实施例将进一步说明本发明。
实施例1
制备H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2
以固相法用0.1mmol的0.48mmol/g对甲二苯甲基酰胺树脂合成肽。二倍的对称酐偶合物与2.0mmol Na-Boc-氨基酸（Peptiles International）反应。侧链的保护是：Asp（Chx），Arg（Tos），Lys（2-CIZ）。当合成完成后，用存在于二氯甲烷中的50%三氟乙酸去除Na-Boc保护。用二氯甲烷洗树脂三次，用存在于二氯甲烷中的10%二异丙基乙胺洗并中和三次，再以二氯甲烷洗三次，真空干燥。用含2%苯甲醚的HF于0℃历时35分钟对肽去保护并从树脂上分离下来。以0℃真空除去HF，肽与乙醚沉淀，用30%乙酸将其从树脂中萃取出来，冰冻干燥。
在92×2.6cm Sephadex G-15柱上以5%乙酸去盐纯化肽，冰冻干燥。进行制备性HPLC，使用C10Vydac218TP1010（250×10mm）柱，24%乙腈存在于0.1%三氟乙酸中流速为每分钟5毫升。收集主峰部分并冰冻干燥。
TLC：〔（Merck5715    20×20cm硅胶60板，（0.25mm厚）〕，正丁醇/乙酸/水/吡啶为6∶1.2∶4.8∶6。TLCI：Rf＝0.52;FAB-MS：（M+H）＝1879±1m.u。（理论值1879.2）。氨基酸分析：（6N    HCl水解：106℃24小时）。Asx3，06（3）;Ala0.99（1）;Leu4.97（5）;Lys2.01（2）;Arg4.01（4）。肽的含量为72%（重量）。
实施例2-4
按基本与实施例1相似的方法，制备下述的肽。
实施例2-4的肽的性质及氨基酸分析如下。
实施例5
制备H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2的BSA复合物。
通过与1-乙基-3（3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺盐酸化物（EDAC）反应，将肽与牛血清白蛋白（BSA）偶合。预先用40mgEDAC于水中处理0.16mlBSA（25mg/ml）30分钟，再将肽（1mM）在1.84ml水中与其反应（15-30分钟）。活化的BSA样品在搅拌条件下滴加到肽溶液中，然后室温下保温10小时。然后加入2.0ml1.0M甘氨酸，将该溶液在4℃摇振过夜。为了去除样品中过量的试剂和未复合的肽，对样品在4℃进行充分透析，先用15×4L蒸馏水，然后用2×4LCELLGRO（Mediatech）组织培养基。将样品加到细胞培养物之前，先用0.45μm乙酸纤维素消毒过滤。肽的偶合程度用反相HPLC测定。
肽1、3和4与BSA的复合物是按上述方式先用EDAC活化肽后再与BSA反应而制备的。
实施例6
各种肽对掺合有3H-胸苷的混合淋巴细胞培养物的抑制
用无菌法将脾取出，在RPMI1640培养基中挑开得到单个细胞的悬浮液。将细胞悬浮在ACK缓冲液（0.155M NH4Cl，0.1mM EDTA，0.01M KHCO3）中使红细胞溶胞，并洗剩下的白细胞。C57BL/6（5×105个细胞和DBA/2（5×105个细胞）两种白细胞共同培养于96孔微滴板小孔中的0.1mlRPIM-1640中，并补充以2%小牛血清（FCS）。开始细胞培养时，加入各种浓度的肽。以37℃保温120小时，其间在最后18小时给以（1微居〔3H〕TdR脉冲，然后用自动配合细胞收集器将细胞收集在滤纸条上并置于ACS闪烁液（Ame-rsham，Oakville，Ontario）。所掺入的〔3H〕TdR量用BeckmanLS7800型液体闪烁计数器测定。
Figure 881038997_IMG5
a仅用BSA与1-乙基-3（3-二甲氨基丙基）-碳化二亚胺-HCl复合
bBSA与肽复合物的量
实施例7
各种肽对掺入有3H-胸苷的被抗-T3激活的淋巴细胞的抑制
用Ficoll-Hypaque密度沉降法分离出人外周血中的单核白细胞MNL。在96孔微滴板的小孔中，以0.1ml DMEM并补以2%FCS将MNL与抗-T3一起培养。以37℃保温72小时，其间在最后18小时给以1微居〔3H〕TdR脉冲，按实施例6所述收获细胞并计数。
a    BSA与1-乙基-3（3-二甲氨基丙基）-碳化二亚胺-HCl的复合
b    BSA与肽复合物的浓度

Claims (40)

1、具有下式的肽，
其中：
Tn是氨基终端残基，可以选自氢、1或2个具1-6个碳原子的烷基，1或2个具2-10个碳原子的酰基，苄氧羰基，叔丁氧羰基；
A是含3-12个任何氨基酸残基的肽片段；
B是含2-3个选自Arg和Lys氨基酸残基的肽段；
C是含有2-3个选自Gly、Leu、Ile、Thr氨基酸残基的肽段；
D是含1-2个任何氨基酸残基的肽段；
Tc的羧基残基，可选自OH，(C1-C6)烷氧基，氨基，一或二(C1-C4)烷基取代的氨基，或苄氨基。
2、根据权利要求1所述的肽，其中C是含2或3个选自Gly或Leu的氨基酸残基的肽段。
3、根据权利要求1或2所述的肽，其中Tn是氢。
4、根据权利要求1或2所述的肽，其中Tc选自OH或氨基。
5、根据权利要求1或2所述的肽，其中A是含3至6个任何天然氨基酸残基的肽段。
6、根据权利要求1或2所述的肽，其中D是含1至12个任何天然氨基酸残基的肽段。
7、根据权利要求1所述的肽是H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2。
8、根据权利要求1所述的肽是H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2。
9、根据权利要求1所述的肽是H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Gly-Gly-Leu-NH2。
10、根据权利要求1所述的肽为H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH。
11、一种对所需患者进行淋巴系统抑制的方法，包括使用有效治疗量的下式的肽，
其中：
Tn是氨基终端残基，可选自氢、一个或二个具1-6个碳原子的烷基，1或2个具2-10个碳原子的酰基，苯氧基羰基，叔丁氧基羰基;
A是含3至12个任何氨基酸残基的肽段;
B是含2至3个选自Arg或Lys的氨基酸残基的肽段;
C是含2至3个选自Gly、Leu、Ile、Thr的氨基酸酸残基的肽段;
D是含1至12个任何氨基酸残基的肽段;
Tc是羧基终端残基，可选自OH，（C1-C6）烷氧基，氨基，一或二（C1-C4）烷基取代的氨基，和苄基氨基。
12、根据权利要求11的方法，其中C是含2至3个选自Gly或Leu的氨基酸残基的肽段。
13、根据权利要求11或12所述的方法，其中Tn是氢。
14、根据权利要求11或12所述的方法，其中Tc选自OH和氨基。
15、根据权利要求11或12所述的方法，其中A是含3至6个任何天然氨基酸残基的肽段。
16、根据权利要求11或12所述的方法，其中D是含1至12个任何天然氨基酸残基的肽段。
17、根据权利要求11所述的方法，其中的肽是H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2。
18、根据权利要求11所述的方法，其中的肽是H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2。
19、根据权利要求11的方法，其中的肽是H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-NH2。
20、根据权利要求11所述的方法，其中的肽是H-Glu-Val-Val-Leu-Glu-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH。
21、一种对所需患者进行淋巴细胞增殖抑制的方法，包括使用下式的肽，
其中：
Tn是氨基终端残基，可选自氢，1个或2个含1-6个碳原子的烷基，1个或2个含2-10个碳原子的酰基、苄氧基羰基、叔丁氧基羰基;
A是含3至12个任何氨基酸残基的肽段;
B是含2或3个选自Arg或Lys的氨基酸残基的肽段;
C是含2或3个选自Gly、Leu、Ile、Thr的氨基酸残基的肽段;
D是含1至12个任何氨基酸残基的肽段;
Tc是羧基终端残基，选自OH、（C1-C6）烷氧基、氨基、一或二（C1-C4）烷基取代的氨基，苄氨基。
22、根据权利要求21的方法，其中C是含2至3个选自Arg和Leu的氨基酸残基的肽段。
23、根据权利要求21或22所述的方法，其中Tn是氢。
24、根据权利要求21或22所述的方法，其中Tc选自OH和氨基。
25、根据权利要求21或22所述的方法，其中A是含3至6个任何天然氨基酸残基的肽段。
26、根据权利要求21或22所述的方法，其中D是含1至12个任何天然氨基酸残基的肽段。
27、根据权利要求21所述的方法，其中的肽是H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2。
28、根据权利要求21所述的方法，其中的肽是H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2。
29、根据权利要求21所述的方法，其中的肽是H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-NH2。
30、根据权利要求21所述的方法，其中的肽是H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH。
31、一种对所需患者进行免疫系统抑制的方法，包括使用下式的肽，
其中：
Tn是氨基终端残基，选自氢，一个或二个具1-6个碳原子的烷基，一个或二个具2-10个碳原子的酰基，苄氧羰基，叔丁氧羰基;
A是含3至12个任何氨基酸残基的肽段;
B是含2或3个选自Arg和Lys的氨基酸残基的肽段;
C是含2或3个选自Gly、Leu、Ile、Thr的氨基酸残基的肽段;
D是含1至12个任何氨基酸残基的肽段;
Tc是羧基终端残基，选自OH，（C1-C6）烷氧基，氨基，一或二（C1-C4）烷基取代的氨基，苄氨基。
32、根据权利要求31所述的方法，其中C是含2或3个选自Gly和Leu的氨基酸残基的肽段。
33、根据权利要求31或32所述的方法，其中Tn是氢。
34、根据权利要求31或32所述的方法，其中Tc选自OH和氨基。
35、根据权利要求31或32所述的方法，其中A是含3至6个任何天然氨基酸残基的肽段。
36、根据权利要求31或32所述的方法，其中D是含1至12个任何天然氨基酸残基的肽段。
37、根据权利要求31的方法，其中的肽是H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2。
38、根据权利要求31的方法，其中的肽是H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2。
39、根据权利要求31的方法，其中的肽是H-Leu-Gla-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-NH2。
40、根据权利要求31的方法，其中的肽是H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Gly-Leu-Leu-OH。
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