CN88103015A

CN88103015A - 环状抗凝血剂肽

Info

Publication number: CN88103015A
Application number: CN198888103015A
Authority: CN
Inventors: 克斯坦安斯·约翰·李; 奥·西蒙杰·提
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis UK Holdings Ltd; Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1987-05-21
Filing date: 1988-05-21
Publication date: 1988-12-21
Also published as: ATE91490T1; KR880013976A; NZ224678A; FI89063B; CA1340646C; HU198513B; KR970010926B1; JPS63303996A; FI882358A0; DE3882279D1; JP2858249B2; NO882238D0; FI89063C; AU1634288A; EP0291982A3; IL86438A; FI882358A; DE3882279T2; AU613627B2; ZA883443B

Abstract

本发明涉及环状的肽衍生物，它们是有用的抗凝血剂。

Description

本发明有关于新的环状肽，它们是有用的抗凝血剂。

在用药剂治疗例如急性深度静脉血栓形成、肺栓塞、急性动脉末端栓塞形成、心肌梗塞以及散布性血管内凝固等病症时，抗凝血剂是有用的药剂。预防性地服用抗凝血剂相信能防止风湿病或动脉硬化性心服脏病患者栓塞的复发，并能防止某些外科的血栓栓塞的并发症。服用抗凝血剂也已用于治疗冠状动脉和脑血管疾病中。动脉血栓形成，特别是在为心肌和脑供血的动脉中，是致死的主要原因。

水蛭素是由水蛭的唾液腺中析离的一种含65个氨基酸的多肽。它是一种抗凝血剂，是凝血酵素特异性的抑制剂。虽然它很有效，但由于它的量少，很贵，以及在通常服用这样大小的外来蛋白质时导致的过敏性反应，使得临床应用由水蛭提取物中的离的水蛭素成为不太可能。

申请人发现水蛭素分子中的一个特别的部位，承担着、至少是部分地承担着它的抗凝血活性。这一部位已经化学合成，它的某些环状类似物看来是连接在凝血酵素的识别位置，但不是在酶催断裂位置上，后者在空间上是分隔开的。合成肽的竞争性连接防止了纤维蛋白元对凝血酵素识别位置的连接，而这是产生纤维蛋白和血凝块的先决条件。本发明的肽具有有效的抗凝血活性，并且它的不平常的只连接到凝血酵素的识别位置，而不连接到它的断裂位置的能力，可能在有关抗凝血疗法方面具有科学价值和治疗学的意义。

本发明有关于具有结构式1的水蛭素的衍生物：

其中X是氨基末端的残基，它选自氢、含1至6个碳原子的一个或二个烷基、含2至10个碳原子的一个或二个酰基、含2至10个碳原子的一个或二个酰基、苄氧羰基或叔丁氧羰基;

A₁是一个化学键或是一个由1至5个任意一种氨基酸残基组成的肽;

A₂是Phe、取代的Phe、β-（2-和3-噻吩基）丙氨酸、β-（2-和3-呋喃基）丙氨酸、β-（2-、3-和4-吡啶基）丙氨酸、β-（苯并噻吩-2-和3-基）丙氨酸、β-（1-和2-萘基）丙氨酸、Tyr或Trp;

A₃是Glu或Asp;

A₅是Ile、Val、Leu、Nle或Thr;

A₆是Pro、Hyp、3，4-去氢Pro、四氢噻唑-4-羧酸酯、Sar、NMe Pgl，或任意一种具有D构型的氨基酸;

A₈是任何一种氨基酸;

A₉是一种亲脂性的氨基酸，它选自Tyr、Tyr（SO₃H）、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、His和Pro，或者是含有至少一种上述亲脂性氨基酸的二肽;

A₁₀是一个化学键或是一个含有1至5个任意氨基酸残基的肽的片断;

Y是羧基末端的基团，它选自OH、（C₁-C₄）烷氧基、氨基、一或二（C₁-C₄）烷基取代的氨基或苄氨基;

R、R′、R₁和R^′ ₁各选自氢或（C₁-C₄）烷基;

B是选自-S-、-S-S-、或-S-Alk₃-S-的残基;

Alk₁、Alk₂、Alk₃各选自（C₁-C₈）亚甲基或亚乙基;“D”和“L”表示所指示的碳的立体化学各相应于D-半胱氨酸和L-半胱氨酸;

本发明也有关于这些肽衍生物的二聚体和它们的混合物，以及用这些衍生物、二聚体及混合物作为抗凝血剂。

在本专利说明书中采用了下列通用的氨基酸缩写符号：

Gly-甘氨酸

Ala-丙氨酸

Val-缬氨酸

Leu-亮氨酸

Ile-异亮氨酸

Pro-脯氨酸

Phe-苯丙氨酸

Trp-色氨酸

Met-蛋氨酸

Ser-丝氨酸

Thr-苏氨酸

Cys-半胱氨酸

Tyr-酪氨酸

Asn-天冬氨酸

Gln-谷氨酰胺

Asp-天冬氨酸

Glu-谷氨酸

Lys-赖氨酸

Arg-精氨酸

His-组氨酸

Nle-正亮氨酸

Hyp-羟基脯氨酸

3，4-dehydropro -3，4-去氢脯氨酸

Tyr（SO₃H）-酪氨酸硫酸盐

Pgl-苯基甘氨酸

NMe Pgl-N-甲基-苯基甘氨酸

Sar-肌氨酸（N-甲基甘氨酸）

P Sub Phe-对位取代的苯丙氨酸

Sub Phe-邻位、间位或对位，一或二取代的苯丙氨酸

DAla-D-丙氨酸

Ac-乙酰基

Suc-丁二酰基

p Cl Phe-对氯苯丙氨酸

p NO₂Phe-对硝基苯丙氨酸

Pen-青霉胺（β，β-二甲基半胱氨酸）

DCys-D-半胱氨酸

一个烷基或烷氧基的烷基部分是指包括直链、支链或环状的烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、环戊基、己基、异己基、环己基和环戊基甲基。2至10个碳原子的酰基是指每个基中含有1或2个羰基部分的直链、支链、环状、饱和的和不饱和的酰基，例如，乙酰基、苯甲酰基和丁二酰基。术语“（C₁-C₈）亚甲基或亚乙基”是指由一个含有1至8个碳原子的非环或环状的、饱和或不饱和的烷基，通过想象从烷基的某一个碳原子或相邻的两个碳原子上拿掉两个氢原子所衍生的两价基团。本发明中（C₁-C₈）亚甲基或亚乙基的实例有亚甲基（-CH₂-）、亚乙基（CH₃CH＜）、1-甲基亚乙基（CH₃C（CH₃）＜）、1-甲基亚丙基或第二亚丁基（CH₃CH₂-C（CH₃）＜）、2，2-二甲基亚丙基或新亚戊基（CH₃C（CH₃）₂CH＜）、1，2-亚乙基或二亚甲基（-CH₂CH₂-）、甲基-1，2-亚乙基（-CH₂-CH（CH₃）-）、乙基-1，2-亚乙基（-CH₂-CH（C₂H₅）-）、1，2-亚乙烯基（-CH＝CH-）、1，1-亚乙烯基（CH₂＝C＜）、1，1-亚环己基（C₆H₁₀＜）和1，2-亚环戊基（C₅H₈＜）。卤素基团是氟、氯、溴或碘等。

术语“任意氨基酸”在这里用来指天然存在的氨基酸以及别的“非蛋白质”α-氨基酸，后者通常被多肽化学领域中的工作者用来制备天然存在的多肽的类似物。天然存在的氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。“非蛋白质”α-氨基酸的实例有正亮氨酸、正缬氨酸、别异亮氨酸、高精氨酸硫代脯氨酸、去氢脯氨酸、羟基脯氨酸（Hyp）、高丝氨酸、环己基甘氨酸（Chg）、α-氨基-正丁酸（Aba）、环己基丙氨酸（Cha）、氨基苯基丁酸（Pba）、在苯环对位上取代有（C₁-C₄）烷基、（C₁-C₄）烷氧基、卤素或硝基的苯丙氨酸、β-（2-和3-噻吩基）丙氨酸、β-（2-和3-呋喃基）丙氨酸、β-（2-、3-和4-吡啶基）丙氨酸、β-（苯并噻吩-2-和3-基）丙氨酸、β-（1-和2-萘基）丙氨酸、O-烷基化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的衍生物、S-烷基化的半胱氨酸衍生物、酪氨酸的O-硫酸酯、3，5-二碘酪氨酸以及天然存在的氨基酸的D-构型异构体。

术语“亲脂性的氨基酸”包括Tyr、Tyr（SO₃H）、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、His和Pro。

除甘氨酸以外，天然的氨基酸都含有手性碳原子，除非特别指明，这里用的光活性氨基酸都具有L构型。例如，A₁或A₁₀基中的任意氨基酸可能是D或L构型。按照习惯，这里写出的多肽的结构式是把氨基末端写在链的左边，而把羧基末端写在链的右边。

术语“二聚物”是用来指那些在环化一步中，由两个分开的线型多肽或者按头对头的方式，或者按头对尾的方式连接而形成的多肽。在通过“B”基团完成所需的分子内环化一步的过程中，有些线型肽原料不是在自身内部连接，而是和别的线型肽连接。得到的产物是一种“二聚物”，意思是指它是由两分子线型原料肽形成的，而不是指那种分子式正好是单体两倍的二聚体。在本发明中，一种多肽衍生物的二聚体将具有下述结构式：

头对尾的二聚物

头对头的二聚物

其中取代基的定义和前述结构式1中的定义相同。在整个本说明书中，除非上下文的需要，否则所说的多肽衍生物都包括二聚体以及单体和二聚体的混合物。虽然由环化反应得到的单体和二聚体的混合物可以通过本专业中熟练技术人员所熟知的方法进行分离，不过本发明中的抗血栓形成的组合物中也可用未经分离的混合物。

结构式1所表示的多肽可以和任何无毒的有机或无机酸形成药用盐。能形成适当的盐的无机酸的例子有盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及酸式金属盐例如正磷酸氢二钠和硫酸氢钾。能形成适当的盐的有机酸的实例有一元、二元和三元羧酸。这类酸的实例有，例如：醋酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸类（诸如甲磺酸、2-羟基乙磺酸）。氨基酸的羧端部分的盐包括与适当的无机或有机碱形成的无毒的羧酸盐。作为说明，这些盐包括那些碱金属盐，例如，钠盐和钾盐;碱土金属盐，例如钙盐和镁盐;ⅢA族的轻金属的盐，例如铝盐;与有机一级、二级和三级胺形成的盐，例如，三烷基胺类，包括三乙胺、普鲁卡因、二苄胺、1-ethemamime、N、N′-二苄基乙二胺、二氢松香胺、N-（低级）烷基六氢吡啶以及任何别的适当的碱。

和任何化合物的普通基团一样，其中一些基团是优选性的。申请人优选那些具有通式1的多肽衍生物，其中：

X是氢、乙酰基或丁二酰基

也优选那些具有通式1的化合物，其中

A₁是-His-Asn-Asp-Gly-Asp、

-Asn-Asp-Gly-Asp、

-Asp-Gly-Asp、

-Gly-Asp、

-Asp、或者一个化学键。

A₂最好是Phe、β-（2-和3-噻吩基）丙氨酸、Tyr、Trp或p Cl Phe，;

A₃，Glu;

A₅，Ile;

A₆，Pro、Sar、DAla，Hyp或NMe Pgl;

A₈，Glu或Asp;

A₉，Tyr或一个二肽片断，其中至少有一个残基是Tyr或Tyr（SO₃H）;

A₁₀，Leu，Asp，Asp-Glu，Leu-Gln，或Leu-Pro;

Alk₁和Alk₂各是一个亚甲基

Y，OH或NH₂以及

B，-S-S-

特别优选的是那些具有式1的多肽衍生物，其中或者X是乙酰基，A是Gly-Asp或Asp，或者X是丁二酰基，A₁是一个化学键，并且其中

A₂是Phe、β-（2-噻吩基）丙氨酸或Tyr;

A₃，Glu;

A₅，Ile;

A₆，Pro;

A₈，Glu或Asp;

A₉，Tyr或Ala-Tyr;

A₁₀，Gln，Asp，Leu-Pro，一个化学键，-Leu-Gln-或-Asp-Glu;

R，R′，R₁和R^′ ₁各自是氢;

Alk₁和Alk₂各自是一个亚甲基;

B，-S-S-;以及

Y，OH。

本发明的多肽可用本专业熟练技术人员容易了解的多种实验程序来制备。这类实验程序包括固相顺序接肽法和分段合成、基团克隆以及这些技术的结合。固相顺序接肽的实验操作可用已建立的自动化方法来完成，例如可以用自动化多肽合成器来完成。在这种操作中，α-氨基已被保护的氨基酸被连接在一种树脂载体上。所用的树脂载体可以是任何一种合适的、通常用于固相制备多肽领域中的树脂，最好是用百分之0.5至大约百分之3的二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，它已被氧甲基化或羟甲基化以提供最初引入的α-氨基已被保护的氨基酸成酯的部位。

一种羟甲基化树脂的实例是Bodanszky等在Chem.Ind.（London）38，1597-98（1966）中叙述的。氯甲基化树脂可从市场买到，是Bio Rad Laboratories，Richmond，California的产品，并且这类树脂的制备已被Stewart等人在“固相法多肽合成”一书（Freeman & Co.，San Francisco 1969）第一章第1-6页中描述过。保护好的氨基酸可用Gisin在Helv.Chem.Acta，56，1476（1973）发表的实验操作方法连接到树脂上。许多种连接有保护好的氨基酸的树脂已有商品。作为一个实例，为制备本发明中羟基末端是Thr残基的多肽，可以用一种叔丁氧羰基（Boc）保护好的Thr连接在苄基化的羟甲基化的苯乙酰胺基甲基树脂（PAM）上的树脂，而这种树脂是一种商品。

在把α-氨基已经保护好的氨基酸偶联到树脂载体上之后，可用任何一种合适的实验程序除去保护基，例如可用溶于二氯甲烷中的三氟醋酸、单独用三氟醋酸或溶于二噁烷中的HCl等。脱保护基反应是在0℃和室温之间的温度条件下进行的。其它标准的除去特定α-氨基酸保护基的裂解试剂和条件也可应用。在除去α-氨基保护基之后，别的氨基已经保护好的氨基酸即可按照所希望的顺序逐步进行偶联。另外，对于多氨基酸基团可在与树脂载体上的氨基酸序列偶联之前，先通过溶液方法进行偶联。

用于引入到多肽序列中的每个氨基酸的α-氨基保护基可以是本专业领域内熟识的任何一种这类保护基，在这些α-氨基保护基类别中，可供考虑的有（1）酰基类型的保护基例如：甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基（tosyl）、苯磺酰基、硝基苯基亚磺酰基、三苯甲基亚磺酰基、邻-硝基苯氧乙酰基和α-氯代丁酰基;（2）芳香族氨基甲酸酯类型的保护基例如苄氧羰基和取代的苄氧羰基、例如对-氯苄氧羰基、对-硝基苄氧羰基、对-溴苄氧羰基、对-甲氧基苄氧羰基、1-（对-联苯基）-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基和二苯甲氧羰基;（3）脂肪族氨基甲酸酯类型的保护基例如叔丁氧羰基（Boc）、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基和烯丙氧羰基;（4）环烷基氨基甲酸酯类型的保护基例如环戊氧羰基、金刚烷基氧羰基和环己氧羰基;（5）硫代氨基甲酸酯类型的保护基例如苯硫羰基;（6）烷基类型的保护基例如三苯甲基（trityl）和苯基;以及（7）三烷基硅烷基例如三甲基硅基。优选的α-氨基保护基是叔丁氧羰基。

选择一种适当的偶联试剂是在本专业技术范围之内，当加入的氨基酸是Gln、Asn或Arg时，特别适用的偶联试剂是N，N′-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑。用这些试剂时可防止腈和内酰胺的形成。别的偶联试剂有（1）碳化二亚胺（例如，N，N′-二环己基碳化二亚胺和N-乙基-N′-（γ-二甲胺基丙基碳化二亚胺）;（2）氨基氰（如N，N-二苄基氨基氰）;（3）烯酮亚胺;（4）异噁唑鎓盐（例如，N-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3′-磺酸盐;（5）具有芳香性的含氮单环杂环酰胺，在环上含有1至4个氮原子，例如咪唑类、吡唑类和1，2，4-三唑类。有用的具体杂环酰胺包括N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;（6）烷氧基化的乙炔（例如乙氧基乙炔）;（7）与氨基酸的羧基部分形成混合酸酐的试剂（例如，氯甲酸乙酯和氯甲酸异丁酯），或者与被偶联的氨基酸形成对丝酸酐的试剂（例如Boc-Ala-O-Ala-Boc）以及（8）在一个环上氮原子上带有羟基的含氮杂环化合物（例如，N-羟基邻苯二甲酰胺、N-羟基丁二酰亚胺和1-羟基苯并三唑）。别的用于多肽偶联反应中的活化试剂曾被Kapoor在J.Pharm.Sci.，59，第1-27（1970）上描述过。除Arg、Asn和Gln以外，申请人优选使用对丝酸酐作为偶联试剂。

每种保护好的氨基酸或氨基酸序列以大约四倍过量引入固相接肽的反应器中，偶联反应是在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷（1∶1）的介质中，或单独用二甲基甲酰胺或最好是单独用二氯甲烷的介质中进行的。当偶联反应发生得不完全时，应在除去α-氨基保护基和在固相接肽反应器中进行下一个氨基酸的偶联反应之前，重复上述偶联的实验操作。在合成的每一步监测偶联反应是否成功可用E.Kaiser等人在Analyt.Biochem.34，595页（1970）所叙述的茚三酮反应。

在得到所期望的氨基酸序列之后，多肽即由树脂上转移下来。这可以通过水解来做到。例如把连接着多肽的树脂用二甲硫醚、对甲苯酚和硫代甲苯酚在氢氟酸的稀水溶液中进行处理。

如固相多肽合成领域中已知的那样，许多带有官能团的氨基酸在制备多肽链的过程中需要加以保护。利用并选择适当的保护基是在本专业熟练技术人员的能力范围之内的。这将取决于被保护好的氨基酸及以及在多肽分子中还存在着的其它保护好的氨基酸残基。选择这类测链保护基是关键性的，因为它必须是这样的一种保护基，即在α-氨基部分的保护基裂解时，它不会被裂解除去。例如，对于赖氨酸，合适的侧链保护基是苄氧羰基和取代的苄氧羰基，所说的取代基是选自卤素（例如氯、溴、碘）和硝基，（例如，2-氯苄氧羰基、对-硝基苄氧羰基、3，4-二氯苄氧羰基），对甲苯磺酰基、叔戊氧羰基、叔丁氧羰基和二异丙基甲氧羰基。苏氨酸和丝氨酸的醇羟基可用乙酰基、苯甲酰基、叔丁基、三苯甲基、2，6-二氯苄基或苄氧羰基进行保护。优选的保护基是苄基。

这些基团可以通过本专业熟知的方法除去，通常是在多肽链的合成完成之后除去保护基的，但保护基也可以在任何其它合适的时间除去。

一般，环状多肽是由适当的线型多肽衍生物制备的，这可以在线型多肽从固体载体上转移下来之前或之后进行。具有结构式1的化合物，其中B是-S-S-，可由相应的游离的含巯基的线型多肽，按照众所周知的氧化偶联技术来制备，例如按Stewart等人在“固相多肽合成”一书（Freeman.& Co.，San Francisco 1969），第一章第95页所叙述的方法，用铁氰化钾氧化线型的多肽来制备。具有结构式1的化合物，其中B是-S-Alk₃-S-基，并且这里Alk₃是（C₁-C₈）亚乙基，可以由游离的含巯基的线型多肽，按照H.I.Mosberg和J.R.Omnaas在J.Amer.Chem.Soc.107，2986-2987（1985）所描述的类似的方法，通过与合适的非环或环状的、饱和或不饱和的烷基的1，2-二溴衍生物进行反应制备。具有结构式1的化合物，其中B是-S-Alk₃-S-，并且这里Alk₃是（C₁-C₈）亚甲基，可以由游离的含巯基的线型多肽，按照J.Amer.Chem.Soc.76，1945页（1954）所描述的类似的方法，通过与合适的非环或环状的、饱和或不饱和的烷基酮或醛进行反应而制备。具有结构式1的化合物，其中B是-S-基，可按K.Jost在Collect.Czech.Chem.Commun.36，218页以及美国专利4161521号所阐明的方法来制得。

本发明的多肽衍生物用作抗凝血剂的剂量是从每天0.2毫克/公斤患者体重至250毫克/公斤患者体重，这取决于被处理的具体患者、血栓形成症状的严重程度以及所选择的多肽衍生物的种类。对一位特定患者的合适的剂量很容易测定。最好是每天给予1至4剂，通常每剂含5毫克至100毫克的活性化合物。

抗凝血疗法可用于许多血栓形成症，特别是冠状动脉和脑血管疾病的治疗和预防。本专业领域有经验的人员很容易意识到需要抗凝血疗法的情况。术语“患者”在这里用来泛指哺乳动物，例如灵长目（包括人类）、羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠。

虽然一些多肽衍生物在口服后可安全通过肠胃道而不被破坏，但申请者仍优选非口服的方式，例如皮下注射、静脉内注射、肌肉注射或腹膜内注射;通过长效注射剂给药;通过植入制剂给药;或以喷雾或干粉的形式，将含有本发明多肽衍生物的气雾剂向粘液膜施药，例如鼻、咽喉和支气管。

对于非肠胃道给药，化合物可以用它在一种生理上可接受的稀释剂中形成的溶液或悬浮液和一种药物载体所制成的可注射配药来给药，药物载体可以是例如水和油这类可被消毒的液体，其中加有或不加有表面活性剂和别的可药用辅药。用于这些制剂中的供说明用的油类是那些石油、动物油、植物油或合成品，例如花生油、大豆油和矿物油。一般，水、盐水、葡萄糖水溶液和有关的糖溶液、乙醇、二醇类如丙二醇或聚乙二醇等是优选的液体载体，特别是用于注射的溶液。

本发明混合物可以长效注射剂或植入剂的形式给药。这些制剂以这样的方式配制，使得它可以维持活性组份的不断释放。活性组份可压缩到小丸中或小圆柱体中，并作为长效注射剂或植入剂由皮下或肌内植入。植入剂可用能生物降解的高聚物或合成的聚硅氧烷作为惰性材料，例如可用Dow-Corning公司制造的硅橡胶Silastic。

实施例

本发明将由下述非限制性的实施例来加以阐明。

实施例1

此肽是用固相接肽方法合成的，用0.1毫摩尔的0.66毫摩尔/克的Boc-Gln-PAM树脂。除Boc-Gln的情况是用DCC/HOBT方法进行偶联以外，双对称酸酐偶联都是用2.0毫摩尔Nα-Boc-氨基酸（Peptides International的产品）完成的。所用的测链保护是：Asp（Chx），Cys（pMe Bzl），Glu（Bzl），Tyr（2-Br Z）。在合成完成之后，用在二氯甲烷中的50%三氟醋酸除去Nα-Boc保护基。树脂用二氯甲烷洗三次，用10%二异丙基乙胺在二氯甲烷中的溶液洗三次进行中和，再用二氯甲烷洗三次，用在二氯甲烷中的N-乙酰基咪唑进行乙酰化，用二氯甲烷洗三次，并在真空中干燥。多肽被脱去保护基并用水和少量30%醋酸水溶液由树脂上裂解下来。用水稀释提取液至体积为2升，并用氢氧化铵把pH调节到8.5。往溶液中加入铁氰化钾（0.01N）直到溶液保持黄色。将溶液搅拌30分钟后，用醋酸把pH值调节到4和5之间。混合物与Bio-Rad AG3-X4A离子交换树脂一起搅拌2小时，过滤，并把滤液冷冻干燥。

此多肽是在5%醋酸水溶液中，在一支92×2.6厘米的Sephadex G-15柱上通过脱盐纯化和冷冻干燥的。在一支C¹⁸Vydac 218 T P1010（250×10毫米）柱上完成制备性的HPLC，用24%乙腈在0.1%三氟醋酸水溶液中的溶液进行洗脱，流速5毫升/分。收集主峰并冷冻干燥得到24毫克所需的产品。二聚物则在较后的洗脱峰中被析离（14.2毫克）。均一性用HPLC和TLC测定。HPLC Vydac 218 T P54（250×4.6毫克）C¹⁸柱，流速2毫升/分，t₀＝1.8分：用25至50%乙腈在0.1%三氟醋酸中的溶液按1%/分作线性梯度洗脱（HPLC）的时间是9.3分钟。

FAB-MS（快原子轰击质谱）：（M+H）＝1414±1毫质量单位（计算值为1413）。氨基酸分析：（6N HCl;在106℃水解24小时）结果见下表1。62%（重量百分）多肽含量。

用同样的方法制备了下面实施例2-4中的多肽。

实施例2

实施例3

实施例4

实施例1至4的肽具有下述性质：

表1：

＊在水解过程中转化为别一异亮氨酸的部分未定量测定

物理性质

实施例编号 HPLCtr（分） FAB-MS（M+H）

1 9.3 1414

2 12.8 2826

3 9.2 1445

4 13.6 2883

Claims

1、一种具有下式通式的多肽衍生物：

其中X是氨基末端的基团，它选自氢、含1至6个碳原子的一个或二个烷基、含2至10个碳原子的一个或二个酰基、苄氧羰基以及叔丁氧基；

A₁是一个化学键或是一个由1至5个任意一种氨基酰残基组成的肽；

A₂是Phe、Sub-Phe、β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸、β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸、β-(2-、3-、和4-吡啶基)丙氨酸、β-(苯并噻吩-2-和3-基)丙氨酸、β-(1-和2-萘基)丙氨酸、Tyr或Trp；

A₃是Glu或Asp；

A₅是Ile、Val、Leu、Nle或Thr；

A₆是Pro、Hyp、3，4-去氢Pro、四氢噻唑-4-羧酸酯、Sar、Nme-Pgl，或任意一种具有D构型的氨基酸；

A₈是Glu或Asp；

A₉是一种亲脂性的氨基酸，可选自Tyr、Tyr(SO₃H)、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、His和Pro，或者是含有至少一种上述亲脂性氨基酸的二肽；

A₁₀是一个化学键或是一个含有1至5个任意氨基酸残基的肽的片断，

Y是羧基末端的基团，可选自OH、(C₁-C₆)烷氧基、氨基、-或二(C₁-C₄)烷基取代的氨基或苄氨基；

R、R′、R₁和R₁′各自选自氢或(C₁-C₄)烷基；

B选自-S-、-S-S-、或-S-AlK₃-S-；

AlK₁、AlK₂、AlK₃各选自(C₁-C₈)亚甲基或亚乙基；“D”和“L”表示所指示的碳的立体化学各相应于D-半胱氨酸和L-半胱氨酸；和一种多肽衍生物的二聚体或多肽衍生物及其二聚体的混合物。

2、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中A₂是Phe、β-（2-或3-噻吩基）丙氨酸，或Tyr。

3、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中A₃是Glu。

4、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中A₅是Ile。

5、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中A₆是Pro。

6、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中A₈是Glu或Asp。

7、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中A₉是Tyr、Ala-Tyr、Ala-Tyr（SOH）或Glu-Leu。

8、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中A₁₀是Gln、Leu、Asp、Asp-Glu、Leu-Pro、Leu-Gln、Leu-Ala或一个键。

9、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中X是H、Z酰基或丁二酰基。

10、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中Y是OH或NH₂。

11、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中R、R′、R₁、R^′ ₁各自是一个氢。

12、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中B是-S-S-基。

13、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中Alk₁和Alk₂各自是一个化学式为-（CH₂）-的亚甲基。

14、一种权利要求1中的多肽衍生物，其中A₁是：

His-Asn-Arp-Gly-Asp、

Asn-Asp-Gly-Asp、

Asp-Gly-Asp、

Gly-Asp、

Asp、

或一个键。

15、一种为患者所需要的降低血液凝固的方法，包括给予有效剂量的一种抗凝血剂，这种抗凝血剂是权利要求1至14中所指的一种肽衍生物和在药物上可接受的载体。

方法权利要求

1.一种制备具有下列通式的多肽衍生物的方法：

其中X是氨基末端的残基，它选自氢、含1至6个碳原子的一个或二个烷基、含2至10个碳原子的一个或二个酰基、苄氧羰基以及叔丁氧羰基;

A₁是一个化学键或是一个由1至5个任意一种氨基酰残基组成的肽;

A₂是Phe、SubPhe、β-（2-和3-噻吩基）丙氨酸、β-（2-和3-呋喃基）丙氨酸、β-（2-、3-、和4-吡啶基）丙氨酸、β-（苯并噻吩-2-和3-基）丙氨酸、β-（1-和2-萘基）丙氨酸、Tyr或Trp;

A₃是Glu或Asp;

A₅是Ile、Val、Leu、Nle或Thr;

A₆是Pro、Hyp、3，4-去氢Pro、四氢噻唑-4-羧酸酯、Sar、NMe Pgl或任意一种具有D构型的氨基酸;

A₈是Glu或Asp;

A₉是一种亲脂性的氨基酸，可选自Tyr、Tyr（SO₃H）、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、His和Pro，或者是含有至少一种上述亲脂性氨基酸的二肽;

Y是羧基末端的基团，它选自OH、（C₁-C₆）烷氧基、氨基、一或二（C₁-C₄）烷基取代的氨基或苄氨基;

R、R′、R₁和R^′ ₁各自选自氢或（C₁-C₄）烷基;

B选自-S-、-S-S-、或-S-Alk₃-S-;

Alk₁、Alk₂、Alk₃各选自（C₁-C₈）亚甲基或亚乙基;“D”和“L”表示所指示的碳的立体化学各相应于D-半胱氨酸和L-半胱氨酸;和一种制备多肽衍生物的二聚体或多肽衍生物及其二聚体的混合物的方法，其中包括通过固相顺序接肽或分段合成方法、基因克隆或这些方法的结合来制备游离的含巯基的线型多肽，然后使线型肽进行氧化偶联。

2.一种制备具有下列通式：

的肽衍生物的固相顺序接肽或分段合成方法，其中

X是氨基末端的残基，它选自氢、含1至6个碳原子的一个或二个烷基、含2至10个碳原子的一个或二个酰基、苄氧羰基或叔丁氧羰基;

A₂是Phe、SubPhe、β-（2-和3-噻吩基）丙氨酸、β-（2-和3-呋喃基）丙氨酸、β-（2-、3-和4-吡啶基）丙氨酸、β-（苯并噻吩-2-和3-基）丙氨酸、β-（1-和2-萘基）丙氨酸、Tyr或Trp;

A₃是Glu或Asp;

A₅是Ile、Val、Leu、Nle或Thr;

A₈是Glu或Asp;

Y是羧基末端的基团，可选自OH、（C₁-C₆）烷氧基、氨基、一或二（C₁-C₄）烷基取代的氨基或苄氨基;

R、R′、R₁和R^′ ₁各自选自氢或（C₁-C₄）烷基;

B选自-S-、-S-S-、或-S-Alk₃-S-;

Alk₁、Alk₂、Alk₃各选自（C₁-C₈）亚甲基或亚乙基;“D”和“L”表示所指示的碳的立体化学各相应于D-半胱氨酸和L-半胱氨酸;和一种制备多肽衍生物的二聚体或多肽衍生物及其二聚体的混合物的方法，它包括一种具有化学式A₁的已经适当地保护的氨基酸连结到一种活化的树脂载体上，然后把另一种α-氨基已经保护好的A₂至A₁₀的氨基酸连接到增长着的肽键的末端氨基上，此肽链已同时通过除去它的氨基保护基而暴露出游离的氨基;最后把得到的线型肽进行氧化偶联。